TW201204387A

TW201204387A - Anti-Trop-2 antibody

Info

Publication number: TW201204387A
Application number: TW100120485A
Authority: TW
Inventors: Miki Yamaguchi; Kazunori Kato; Hirofumi Hamada; Kazuyasu Nakamura; Yoshiyuki Sugimoto; Tsuguo Kubota; Masahiro Ikeda
Original assignee: Univ Sapporo Medical; Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2011-06-10
Publication date: 2012-02-01
Also published as: WO2011155579A1; EP2594589A1; JPWO2011155579A1; US20120237518A1

Description

201204387 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於如下者：以高親和性與人類Trop-2細胞外區域結合且發揮高抗體依賴性細胞毒殺活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity ，以下記為 ADCC 活性）、高抗腫瘤活性之單株抗體或該抗體片段；產生該抗體之融合瘤；編碼該抗體之DNA ;含有該DNA之載體；導入該載體而獲得之轉形體；使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法；使用抗體或該抗體片段之治療藥及診斷藥。【先前技術】已知Trop-2係別名為腫瘤相關鈣訊號轉導因子2 (Tumor associated calcium signal transducer 2 ，TACSTD2)、 GA733-1、gp50、T16之包含323個胺基酸之I型膜蛋白質。已發現Trop-2係與人類營養芽細胞反應之單株抗體162-25.3、162-46.2之識別蛋白質（非專利文獻1)。

Trop-2之基因於1989年獲得選殖（非專利文獻2)。Trop-2 之DNA序列、胺基酸序列及立體結構已於公共資料庫上公開，例如可參照NP_002344、NM_002353(NCBI)等登錄編號。Trop-2之胺基酸序列由包含N末端26個胺基酸之訊號序列、包含248個胺基酸之細胞外區域、包含23個胺基酸之跨膜區域、包含26個胺基酸之細胞内區域構成。已知 Trop-2之分子量之理論計算值為35 kDa，接受糖鏈附加而增加10 kDa左右。 156880.doc 201204387

Trop-2具有與作為家族分子之EpCAM(別名Trop-l)相同之半胱胺酸殘基之數量及位置，因此推測結構類似（非專利文獻2)。EpCAM之細胞外區域包含富含半胱胺酸殘基之 N末端側之連個區域、以及半胱胺酸殘基較少之C末端側之區域的3個區域（非專利文獻15)。已知於EpCAM中，N末端側之第一區域與細胞間之EpCAM彼此之接著相關，第二區域與同一細胞膜上之EpCAM彼此之相互作用相關（非專利文獻15)。

Trop-2於多種癌中可見表現，亦報告有表現與預後不良相關（非專利文獻3〜9)。又，對於大腸癌而言，報告有與非固著依賴性增殖（anchorage-independent growth)相關（非專利文獻10)。報告有正常組織中之Trop-2之表現僅限於若干組織之上皮細胞。於報告162-25.3、162-46.2之後，確立了複數種針對 Trop-2之單株抗體（非專利文獻11〜13、專利文獻1〜3)。亦有77220等以試劑形式市售之抗Trop-2單株抗體。目前正研究該等確立之抗Trop-2單株抗體於若干種癌治療方面之應用。作為抗Trop-2單株抗體之一的BR110(專利文獻1)於與細胞表面之Trop-2結合後，會内吞至細胞内，由此報告有與抗細胞藥劑之結合體之研究例。並且揭示有本結合體對 H2987、H3396、H3619、MCF-7等癌細胞顯示出細胞毒殺活性。作為抗Trop-2單株抗體之一的RS7(專利文獻2、非專利 156880.doc 201204387 文獻11、14、16)於與細胞表面之Trop-2結合後，會内吞至細胞内，由此報告有與抗細胞藥劑之結合體之研究例。並且揭示有該抗體之人類化抗體hRS7與放射性同元素（13 4、 131I-IMR-R4)之結合體於使用乳癌細胞株之人類癌細胞異位移植模型中顯示出抗腫瘤活性。作為抗Trop-2單株抗體之一的AR47A6.4.2(專利文獻3)及 AR52A301.5(專利文獻4)係藉由特異性毒殺作為標靶細胞之Trop-2表現癌細胞而發揮藥效之抗體。專利文獻3及4中揭示有該等抗體直接殺傷癌細胞之情況。又，揭示有AR47A6.4.2之人類化抗體huAR47A6.4.2(專利文獻5)抑制細胞内之細胞外訊號調節激酶（Extracellular-signal regulated kinase ， ERK)之活性化之情況。進而，於專利文獻5中，關於補體依賴性細胞毒殺活性（Complement-dependent Cytotoxicity ，以下記為 CDC 活性），揭示有 huAR47A6.4.2於使用補體價較高之兔血清之情形時對 Trop-2陽性之人類細胞株顯示出CDC活性。先行技術文獻專利文獻專利文獻1 :國際公開第97/14796號專利文獻2:國際公開第2003/074566號專利文獻3:國際公開第2007/095748號專利文獻4:國際公開第2007/095749號專利文獻5:國際公開第2008/144891號非專利文獻 156880.doc 201204387 非專利文獻 1 ]Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8，5147 (1981) 非專利文獻 2 : Int· J. Cancer，62, 610 (1995) 非專利文獻 3 : Mod· Pathol” 21，186 (2008) 非專利文獻 4 : Clin· Cancer Res.，12，3057 (2006) 非專利文獻 5 : Br. J. Cancer，99，1290 (2008) 非專利文獻 6 : J· Clin. Pathol” 62，152 (2009) 非專利文獻 7 : Eur. J. Cancer，46, 944 (2010) 非專利文獻 8 : Cancer Res.，62，5325 (2002) 非專利文獻 9 : Lab. Invest. 84, 320 (2004) 非專利文獻 10 : Mol. Cancer Ther.，7，280 (2008) 非專利文獻 11 : Int. J. Cancer，39, 297 (1987) 非專利文獻 12 : Cancer Res_’ 50, 1330 (1990) 非專利文獻 i3: Hybridoma，U，539 (1992) 非專利文獻 14 : Breast Cancer Res. Treat·，84，173，（2004) 非專利文獻 15 : Mol_ Cell. Biol·，21’ 2570 (2001) 非專利文獻 16 : Clin. Cancer Res·，17，3157 (2011) 【發明内容】發明所欲解決之問題然而，專利文獻1所記載之BR110於未與抗細胞藥劑結合之情形時不具有細胞毒殺活性。又，專利文獻2、非專利文獻11、I4及16所記載2RS7於未與抗細胞藥劑結合之情形時不顯示出細胞毒殺活性。又’並無關於專利文獻5 所記載之huAR47A6_4.2之ADCC活性之報告。進而，並無關於以高親和性與人類TroP-2之細胞外區域 156880.doc 201204387 結合之抗Trop-2單株抗體之報告。認為以高親和性與人類 Trop-2之細胞外區域結合之抗Trop_2單株抗體對人類Tr〇p_ 2陽性之人類細胞株顯示出尚ADCC活性及抗腫瘤活性。因此，本發明之課題在於提供如下者：針對以高親和性與人類Trop-2細胞外區域結合之人類Tr〇p_2的單株抗體或該抗體片段；產生該抗體之融合瘤；編碼該抗體之dNA ; 含有該DNA之載體；導入該載體而獲得之轉形體；使用該融合瘤或該轉形體之抗體或抗體片段之製造方法；或使用該抗體片段之治療藥或診斷藥。解決問題之技術手段即，本發明如以下所述。 1. 一種單株抗體或該抗體片段，其係針對與人類Tr〇p_2之細胞外區域中之至少區域I結合之人類Tr〇p_2者。 2. 如上述1之單株抗體或該抗體片段，其與序列編號1所表示之胺基酸序列中之第34號〜第72號之至少1個胺基酸結合。 3. 如上述1或2之單株抗體或該抗體片段，其中抗體對抗原之解離常數（KD)為5xl0*1DM以下。 4. 如上述1至3中任一項之單株抗體或該抗體片段，其具有高ADCC活性及抗腫瘤活性。 5. 如上述1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段，其含有互補鍵決定區域（complementarity determining region，以下記為CDR)1〜3分別含有序列編號13〜15所表示之胺基酸序列的抗體之重鏈（以下記為Η鏈），且含有CDR1〜3分別為 156880.doc 201204387 序列編號16〜18所表示之胺基酸序列的抗體之輕鍵（以下記為L鏈）。 6.—種單株抗體或該抗體片段，其與和含有包含序列編號 10所表示之胺基酸序列之Η鏈可變區域（以下記為VH)且含有包含序列編號12所表示之胺基酸序列之L鍵可變區域（以下記為VL)之抗體所結合之Trop-2之細胞外區域所存在之抗原決定位相同之抗原決定位結合。 7·—種單株抗體或該抗體片段，其與上述5或6之抗體競爭而與Trop-2之細胞外區域結合。 8.如上述1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段，其係基因重組抗體。 9·如上述8之單株抗體或該抗體片段，其係選自人類型嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。 10.如上述9之單株抗體或該抗體片段，其係人類化抗體，且含有以下（a) VH及（b) VL， (a) 含有序列編號24所表示之胺基酸序列、或進行將序列編號24所表示之胺基酸序列之第9號之Ala置換為ρΓ0、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為Ile、將第 38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67 號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸修飾中之至少1個修飾之胺基酸序列的VH ; (b) 含有序列編號26所表示之胺基酸序列、或進行將序 156880.doc 201204387 列編號26所表示之胺基酸序列之第15號之Leu置換為Ala、將第19號之Ala置換為Va卜將第21號之lie置換為Met、及將第84號之Leu置換為Val之胺基酸修飾中之至少1個修飾之胺基酸序列的VL。 11. 如上述10之單株抗體或該抗體片段，其係選自以下 (1)〜（5)之中： (1) 含有包含序列編號28所表示之胺基酸序列之抗體VH及包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體VL中之至少一者之人類化抗體； (2) 含有包含序列編號30所表示之胺基酸序列之抗體vh及包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體； (3) 含有包含序列編號32所表示之胺基酸序列之抗體VH及包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體； (4) 含有包含序列編號34所表示之胺基酸序列之抗體及包含序列編號36所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體； (5) 含有包含序列編號34所表示之胺基酸序列之抗體vh及包含序列編號38所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體。 12. 如上述1至u中任—項之抗體片段，其係選自、 Fab、（Fab')2、單鏈抗體（scFv)、二聚化 v區域（Diab〇dy)、一硫鍵穩定化V區域（dsFv)及含有CDR之肽中之抗體片 156880.doc 201204387 段。 13·-種DNA，其編碼上述】至12中任一項之翠株抗體或該抗體片段。 14.種重組體載體，其含有上述13之DNA。 15·-種轉形株’其係將上述14之重組體載體導入宿主細胞中而獲得。 16. 一種上述⑴之中任一項之單株抗體或該抗體片段之製造方法，其特徵在於：於培養基中培養上述Μ之轉形株，使上述1至U中任-項之抗體或該抗體片段純化蓄積於培養物中，it自培養物採料抗體或該抗體片段。 17. -種人類Trop_2之檢測或測定用試劑其含有上述工至 12中任一項之單株抗體或該抗體片段。 18. -種與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病之診斷藥，其含有上述1至12中任一項之單株抗體或該抗體片段作為有效成分。 19. 如上述18之診斷藥，其中丹甲與人類Tr〇P-2陽性細胞相關之疾病為癌。 20. —種與人類Tr〇p_2陽性細此相關之疾病之治療藥，其含有上述1至12中任一項之單抶始挪士 _ 早株抗體或該抗體片段作為有效成分。 21. 如上述20之治療藥，其中與兴人類ΤΓ0ρ·2陽性細胞相關之疾病為癌。 22. —種與人類τΓΟρ_2陽性細胞相 a , 相關之疾病之診斷方法，其包括使用上述1至12中任一項之罝 ¥株抗體或該抗體片段而 -10· 1 S6880.doc 201204387 檢測或測定人類Trop-2陽性細胞。 23.—種與人類Trop_2陽性細胞相關之疾病之診斷方法，其包括使用上述1至12中任一項之星姓> μ + 早株k體或該抗體片段而檢測或測定人類Trop-2。 * 24·如上述22或23之診斷方法，其中盥人相τ t 丹甲興人類Trop-2陽性細胞 . 相關之疾病為癌。 25·—種上述丨至12中任一項之單株抗體或該抗體片段之用途，其係用於製造與人類Trop_2陽性細胞相關之疾病之診斷藥。 26.如上述25之單株抗體或該抗體片段之用途，其中與人類Trop-2陽性細胞相關之疾病為癌。 27·—種上述丨至以中任一項之單株抗體或該抗體片段之用途，其係用於製造與人類Trop-2陽性細胞相關之疾病之治療藥。 28.如上述27之單株抗體或該抗體片段之用途，其中與人類Trop-2陽性細胞相關之疾病為癌。發明之效果本發明之針對人類Trop-2之單株抗體或該抗體片段可特 • 異性識別人類TroP-2之細胞外區域中之至少區域I，而以高 ^ 親和性與該細胞外區域結合。藉此，本發明之單株抗體或該抗體片段對人類Trop-2陽性細胞可具有高ADCC活性及抗腫瘤活性。因此’本發明之針對人類Trop_2之單株抗體或该抗體片段對於與人類ΤΓΟρ·2陽性細胞相關之疾病之治療及診斷等非常有用。 I56880.doc 201204387 又’本發明可提供產生上述抗體之融合瘤、編碼該抗體之DNA、含有該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該融合瘤或轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法、使用抗體或該抗體片段之治療藥及診斷藥。【實施方式】本發明係關於與人類Trop-2之細胞外區域特異性結合的針對人類Trop-2之單株抗體（以下簡記為本發明之單株抗體）或該抗體片段。本發明之單株抗體藉由以高親和性與人類Trop-2之細胞外區域結合，而具有高ADCC活性及抗腫瘤活性。作為本發明之人類Trop-2，可列舉：具有序列編號1或 NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列的多肽或包含序列編號1或NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列中1個以上胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列、且具有Trop-2之功能的多肽，以及與序列編號1或NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列具有60%以上、較佳為80°/。以上、更佳為90%以上之同源性的多肽，包含最佳為具有95%以上之同源性的胺基酸序列、且具有Trop-2 之功能的多肽等。具有序列編號1或NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列中1個以上胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列之多肽，可藉由使用部位特異性修劍5導入法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ' Current Protocols in 156880.doc 201204387

Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、 Nucleic acids Research, 10, 6487 (1982) ' Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene，34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13，4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)]等’於編碼具有例如序列編號1所表示之胺基酸序列之多肽的DNA中導入部位特異性修飾而獲得。缺失、置換或附加之胺基酸的數量並無特別限定，較佳為1個〜數十個、例如為1〜20個，更佳為1個〜數個、例如為 1〜5個之胺基酸》作為編碼人類Trop-2之基因，可列舉序列編號2或NCBI 登錄編號NM_002353所表示之鹼基序列。編碼本發明之 Trop-2之基因亦包括：含有編碼包含於序列編號2或NCBI 登錄編號NM_002353所表示之鹼基序列中1個以上鹼基缺失、置換或附加之鹼基序列、且具有Trop-2之功能的多肽之DNA的基因，含有編碼包含與序列編號2或NCBI登錄編號NM_002353所表示之鹼基序列具有至少60%以上之同源性的鹼基序列、較佳為具有80%以上之同源性的鹼基序列、更佳為具有95%以上之同源性的鹼基序列、且具有 Trop-2之功能的多肽之DNA的基因，以及編碼包含具有序列編號2或NCBI登錄編號NM_002353所表示之鹼基序列的 DNA及於嚴格條件下進行雜交的DNA、且具有Trop-2之功能的多肽之基因等。作為於嚴格條件下雜交之DNA，係指藉由將具有序列編 156880.doc -13- 201204387 號2或NCBI登錄編號NM_002353所表示之鹼基序列的DNA 用於探針之菌落·雜交法、噬菌斑·雜交法、南方點墨· 雜交法、或DNA微陣列法等而得的能雜交之DNA。具體可列舉：能藉由使用將源自經雜交之菌落或噬菌斑之DNA、或具有該序列之PCR產物或寡聚DNA固定化之濾片或載玻片，於0.7〜1.0 mol/L之氣化鈉存在下，於65°C下進行雜交[Molecular Cloning, A Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1 : Core Techniques， Apractical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)]後，使用0.1〜2倍濃度之SSC溶液（1倍濃度之SSC溶液之組成包含150 mmol/L氣化納、15 mmol/L檸檬酸納），於65°C條件下清洗濾片或載玻片而鑑定之DNA » 作為上述能雜交之DNA，可列舉：與序列編號2或NCBI 登錄編號NM_002353所表示之鹼基序列具有至少60%以上之同源性的DNA，較佳為具有80。/。以上之同源性的DNA，更佳為具有95%以上之同源性的DNA。於編碼真核生物之蛋白質的基因之鹼基序列中往往發現基因之多型。本發明中所用之基因中，藉由此種多型而使鹼基序列發生小規模修飾之基因亦包含於編碼本發明之 Trop-2之基因。本發明之同源性之數值除了特別說明之情形外，可為使用業者公知之同源性檢索程式而算出之數值，關於鹼基序 156880.doc -14· 201204387 列，可列舉：於 BLAST [J. Mol· Biol.，215，403 (1990)]中使用缺省之參數而算出之數值等，關於胺基酸序列，可列舉：於BLAST2 [Nucleic Acids Res.，25，3389 (1997)、 Genome Res., 7, 649 (1997) ' http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Education/BLASTinfo/information3.html]中使用缺省之參數而算出之數值等。作為缺省之參數，於G(Cost to open gap)為驗基序列時係5、為胺基酸序列時係11、為E (Cost to extend gap)為驗基序列時係2、為胺基酸序列時係1、-q (Penalty for nucleotide mismatch)係-3、-r (reward for nucleotide match) 係 1、-e (expect value)係 10、-W(wordsize)為驗基序列時係 11殘基、為胺基酸序列時係3殘基、-y [Dropoff (X) for blast extensions in bits]為 blastn時係 20、blastn以外之程式中係 7、-X (X dropoff value for gapped alignment in bits)係 15及-Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits)為blastn時係50、blastn以外之程式中係25 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。包含序列編號1或NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列之部分序列的多肽可藉由業者公知之方法而製作，例如可藉由使編碼序列編號1所表示之胺基酸序列的 DNA之一部分缺失，並培養導入了包含其之表現載體之轉形體而製作。又，根據上述方法所製作之多肽或DNA，可藉由與上述相同之方法，而獲得具有序列編號1或NCBI登錄編號 156880.doc 15 201204387 NP_002344所表示之胺基酸序列中1個以上胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽。進而，包含序列編號1或NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列之部分序列的多肽、或具有序列編號1或 NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列之部分序列中1個以上胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽，亦可藉由薙基甲氧基羰基（Fmoc)法、第三丁氧基羰基 (tBoc)法等化學合成法而製造。作為本發明中之人類Trop-2之細胞外區域，例如可列舉：使用公知之跨膜區域域預測程式SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/SOSUI/SOSUI_submit.)、 TMHMM ver.2 (http://www.cbs.dtu_dk/services/TMHMM-2.0/)或

ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/)等預測序列編號1所表示之該多肽之胺基酸序列的區域等。具體可列舉：SOSUI中所預測之細胞外區域即自N末起至第274號為止。作為本發明中之人類Trop-2之細胞外區域’若具有序列編號1或NCBI登錄編號NP_002344所表示之胺基酸序列且具有與Trop-2之細胞外區域於天然狀態下可取得的結構同等之結構，則可為任一結構。所謂Trop-2之細胞外區域於天然狀態可取得的結構，係指於細胞膜上表現之Trop-2之天然型立體結構。本發明中，人類Trop-2之細胞外區域分為3類，自N末側起依序表示為區域I、II、III。即’人類Trop-2之細胞外區 156880.doc 16· 201204387 域中，將與EpCAM之細胞外區域富有半胱胺酸殘基之2個區相同的區自N末側起依序分別表示為區域I、區域II，將半胱胺酸殘基較少之C末側之區表示為區域III。具體而言，於序列編號1所表示之人類Trop-2之胺基酸序列中，將第34號〜第72號表示為區域I、將第73號〜第145號表示為區域II，將第146號〜第274號表示為區域III。本發明之單株抗體或該抗體片段與人類Trop-2之細胞外區域中之至少區域I結合。本發明之單株抗體或該抗體片段特異性識別Trop-2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合，可調查使用固相三明治法等之放射免疫測定法、或使用酶免疫測定法（ELISA)等之針對表現Trop-2之細胞的公知之免疫學檢測法、較佳為螢光細胞染色法等之表現特定抗原的細胞、與針對特定抗原之抗體的結合性。例如可列舉：使用FMAT8100HTS系統（Applied Biosystems公司製造）等之勞光抗體染色法[Cancer Immunol. Immunother.，36，373 (1993)]、使用流式細胞儀之螢光細胞染色法、或使用Biacore系統（GE healthcare公司製造）等之表面離體子共振等方法。又，亦可將公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996) ' Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、單純抗體實驗手冊、Kodansha Scientific (1987)]等加以組合進行確認。 156880.doc -17- 201204387 作為表現人類Trop-2之細胞，若表現該Trop_2，則可為任意細胞，例如可列舉：人類體内天然存在之細胞、由人類體内天然存在之細胞確立之細胞株、或藉由基因重組技術獲得之細胞等。作為人類體内天然所存在之細胞，可列舉癌患者體内表現該多肽之細胞，例如可列舉：藉由生檢等而獲得之腫瘤細胞中表現該Trop-2之細胞等。作為由人類體内天然存在之細胞確立之細胞株，可列舉：將自上述癌患者獲得之表現該Τγ〇ρ·2之細胞株化而獲得之細胞株中’表現該Tr〇p_2之細胞株。例如可列舉：由人類確立之細胞株即人類胰腺癌細胞株BxpC_3 (AtcC編號.CRL-1687)、人類乳癌細胞株mcF-7 (ATCC編號： HTB-22)等。作為藉由基因重組技術獲得之細胞，具體可列舉：藉由將包含編碼該Trop-2之CDNA的表現載體導入至昆蟲細胞或動物細胞等而得的表現該Trpp·2之細胞等。本發明之單株抗體較佳為與Tr〇p_2高親和地結合之抗體。所謂與Trop-2高親和地結合之抗體，係作為治療用抗體而具有充分親和之抗體，抗體對於Tr〇p_2之解離常數（以下5己為Κ〇)較佳為1χ1〇·9 μ以下，更佳為7χ1〇_ 10 μ以下，尤佳為5χ10_1()Μ以下，特佳為1χ10·丨。Μ以下。藉由使KD為lxlO-9 μ以下，而可作為治療用抗體以充分的親和結合於人類Trop-2之細胞外區域，且可具有高 ADCC活性及抗腫瘤活性。抗體對於Tr〇p_2之解離常數kd 156880.doc • 18 - 201204387 例如可使用Biacore T100 (GE healthcare公司製造）等而算出，具體而言，可於實施例中藉由後述方法而測定。本發明之單株抗體於使用該測定法時，與抗Trop-2抗體 AR47A6.4.2相比，表現更低之值。所謂親和，係藉由反應速度論分析而測定者，例如可使用Biacore T100 (GE healthcare公司製造）等而測定。本發明中，所謂解離較慢，係指於Biacore T100中算出之抗體之解離速度常數kd之值表現更小之值。解離速度常數kd例如使用Biacore T100進行測定，可藉由附屬軟體 Biacore T100評價軟體（GE healthcare公司製造）而算出。又，本發明之單株抗體較佳為具有高ADCC活性及抗腫瘤活性，更佳為具有CDC活性。本發明中，所謂「具有高ADCC活性」，係指對於Trop-2 表現細胞使用公知之測定方法[Cancer Immunol. Immunother.，36, 373 (1993)]同時測定複數個抗體之ADCC 活性時，與抗Trop-2抗體AR47A6.4.2相比表現更高之 ADCC活性。本發明中，所謂「具有較高之抗腫瘤活性」，係指於表現Trop-2之癌細胞株之患癌動物模型中，同時測定複數個抗體之抗腫瘤活性時，與抗Trop-2抗體AR47A6.4.2相比，表現更高之抗腫瘤活性。抗腫瘤活性於實施例中藉由後述方法進行測定。本發明中作為單株抗體，可列舉：藉由融合瘤而產生之抗體、或藉由由包含抗體基因之表現載體轉形之轉形體而 156880.doc -19- 201204387 生產之基因重組抗體。所謂單株抗體，係單純之抗體產生細胞分泌之抗體，只識別一種抗原決定位（亦稱為抗原決定基），構成單株抗體之胺基酸序列（1次序列）較均一。所謂抗原決定位，可列舉：識別單株抗體並結合之單一胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、結合有糖鏈之胺基酸序列及包含結合有糖鏈之胺基酸序列之立體結構等。 ° 本發明之單株抗體識別的抗原決定位可藉由以下方式確定：使用使ΤΓ〇Ρ-2之一部分區與缺失或源自其他蛋白質之區置換之修飾體進行抗體之結合實驗。所謂本發明之單株抗體識別之抗原決定位，係與抗 Trop-2單株抗體AR47A6.4.2識別之抗原決定位不同的胺基酸序列或立體結構。並揭示AR47A6.4.2將第179號〜第187 號之胺基酸序列及、第252號〜第260號之序列識別為抗原決定位並進行結合（國際公開第2008/144891號）。作為本發明之單株抗體，可列舉：與和人類Trop-2之細胞外區域中抗Trop-2抗體AR47A6.4.2及77220結合之抗原決定位不同之部位結合之單株抗體及該抗體片段。作為本發明之單株抗體，具體可列舉：含有CDR1〜3分別含有序列編號13〜15所表示之胺基酸序列之抗體的重鍵可變區域（以下記為VH)、且含有CDR1〜3分別含有序列編號16〜18所表示之胺基酸序列之抗體的輕鏈可變區域（以下記為VL)之單株抗體。 156880.doc -20- 201204387 又作為本發明之單株抗體，更具體可列舉：含有包含序列編號10所表示之胺基酸序列之抗體VH、且含有包含序列編號12所表示之胺基酸序列之抗體VL的單株抗體。進而’作為本發明之單株抗體，可列舉：上述單株抗體以及與和上述單株抗體競爭而結合於Trop-2之細胞外區域的單株抗體所結合之存在於Tr〇p_2之細胞外區域上之抗原决疋位相同之抗原決定位結合的單株抗體。具體寸列舉：人類Trop-2之細胞外區域中至少識別區域〗之抗體及該抗體片段。融合瘤例如可藉由以下方式製備：將表現上述Trop-2之田胞等製備成抗原，自對該抗原免疫之動物誘導出具有抗原特異性之抗體生產細胞，進而使該抗體生產細胞與骨髓瘤細胞。並可藉由培養該融合瘤、或將該融合瘤投予給動物使該動物腹水癌化，將該培養液或腹水分離、純化，而取得抗Trop-2單株抗體。作為對抗原免疫之動物，若可製作融合瘤，則可使用任者，例如較佳為可列舉：小鼠、大白鼠、t鼠、雞或。自此種動物取得具有抗體產生能力之細胞，㈣細胞意兔於體外實施免疫後’與骨髓瘤細胞融合而製作之融合瘤所生產之抗體等’亦可包含於本發明之單株抗體。本發明中作為基因重組抗體，包含人翻 3人頰型嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或抗體片段等、获m t 精由基因重組而製造之抗體。基因重組抗體中’具有單株抗體之特徵、抗原性較低、血中半衰期延長者作為治療藥而較佳。&因重組抗 156880.doc •21 · 201204387 體例如可列舉使用基因重組技術改變上述本發明之單株抗體者。所謂人類型嵌合抗體，係指包含非人類動物之抗體VH 及VL與人類抗體之重鏈固定區域（以下記為CH)及輕鏈固定區域（以下記為CL)之抗體。本發明之人類型嵌合抗體可藉由以下方式表現、並製造：自產生特異性識別Tr〇p-2且與該細胞外區域結合之單株抗體之融合瘤取得編碼VH及 VL之cDNA，分另|J插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體，而構築人類型嵌合抗體表現載體，從而導入至動物細胞。作為人類型嵌合抗體之CH，若屬於人類免疫球蛋白（以下記為hlg)，則可為任意者，較佳為使用hlgG類者，進而可使用hlgGl、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞類之任一者。又，作為人類型嵌合抗體之CL，若屬於hlg，則可為任一者，可使用κ類或λ類者。作為本發明之嵌合抗體，具體可列舉：含有包含序列編號10所表示之胺基酸序列之抗體VH、且含有包含序列編號12所表示之胺基酸序列之抗體VL的嵌合抗體。進而，作為本發明之嵌合抗體，可列舉：與上述嵌合抗體競爭而與Trop-2之細胞外區域結合的嵌合抗體及與和上述嵌合抗體結合之Trop-2之細胞外區域上所存在之抗原決定位相同之抗原決定位結合之嵌合抗體。所謂人類化抗體，包括人類型互補鏈決定區域 (Complementarity Determining Region、以下記為 CDR)移 156880.doc -22- 201204387 植抗體。所謂本發明之人類化抗體，係指將非人類動物之抗體 VH及VL之CDR的胺基酸序列移植至人類抗體VH及VL之適當位置之抗體。本發明之人類化抗體可藉由以下方式表現並製造：將源自非人類動物之融合瘤產生並特異性結合於 Trop-2之單株抗體VH及VL之CDR的胺基酸序列分別移植至任意的人類抗體VH及VL之架構區域（Framework Region、以下記為FR)而設計可變區域（以下記為V區域）之胺基酸序列，進而構築編碼V區域之胺基酸序列之cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體而構築人類化抗體表現載體，從而導入至動物細胞。人類化抗體VH及VL之FR的胺基酸序列若為源自人類抗體之VH及VL之FR的胺基酸序列，則可使用任意者。例如可列舉：Protein Data Bank(蛋白質資料庫）等資料庫所收錄之人類抗體VH及VL之FR的胺基酸序列、或Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)等所記載之人類抗體VH及VL之FR 的各亞群之共通胺基酸序列等。作為本發明之人類化抗體，可列舉：含有CDR1〜3分別含有序列編號13〜15之胺基酸序列的抗體VH、且含有 CDR1〜3分別含有序列編號16〜18之胺基酸序列的抗體VL 之人類化抗體。作為本發明之人類化抗體，具體可列舉：包含以下（a) 156880.doc •23· 201204387 VH及（b) VL之至少一者之人類化抗體等，所導入之修飾之數量並無限制。 (a) 抗體VH，其包含將選自序列編號24之胺基酸序列、或序列編號24之胺基酸序列之第9號之Ala、第12號之Lys、第20號之Val、第38號之Arg、第48號之Met、第67號之 Arg、第68號之Va卜第70號之lie、第95號之Tyr、及第112 號之Val中的至少1種胺基酸殘基置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列； (b) 抗體VL，其包含將選自序列編號26之胺基酸序列、或序列編號26之胺基酸序列中第15號之Leu、第19號之Ala、第21號之lie、及第84號之Leu中的至少1種胺基酸殘基置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列。進而，作為本發明之人類化抗體所含之VH，較佳為以下⑴〜(11)。 (1) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第12 號之Lys、第20號之Va卜第38號之Arg、第48號之Met、第 67號之Arg、第68號之Va卜第70號之lie、第95號之Tyr、及第112號之Val置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的 VH ; (2) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第12 號之Lys、第20號之Va卜第38號之Arg、第48號之Met、第 67號之Arg、第68號之Va卜第70號之He、及第95號之Tyr 置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH; (3) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第20 156880.doc -24- 201204387 號之Val、第38號之Arg、第48號之Met、第67號之Arg、第 68號之Val、第70號之lie、及第95號之Tyr置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH ; (4) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第38 號之Arg、第48號之Met、第67號之Arg、第68號之Va卜及第95號之Tyr置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH ; (5) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第67 號之Arg、第68號之Val、第70號之lie、及第95號之Tyr置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH ; (6) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第38 號之Arg、第48號之Met、第67號之Arg、及第95號之Tyr置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH ; (7) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg、第 48號之Met、第67號之Arg、第68號之Va卜及第95號之Tyr 置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH; (8) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第38 號之Arg、第48號之Met、及第95號之Tyr置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH ; (9) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala、第67 號之Arg、及第9 5號之Tyr置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH ; (10) 包含將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg、第48號之Met、及第95號之Tyr置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH ; 156880.doc -25- 201204387 (11)包含將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg、及第48號之Met置換成其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH。作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉：導入有選自將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為lie、將第 67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70 號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、或將第112 號之Val置換為Leu之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列。作為導入了 10個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉：將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala 置換為Pro、將第12號之Lys置換為Va卜將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列。作為導入了 9個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜（10)之胺基酸序列。 (1)將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換 156880.doc -26- 201204387 為Leu之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之Ile置換為 Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第m號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為

Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第3 8號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lle置換為 Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第U2號之Val置換為Leu之胺基酸序列； . (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第2〇號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換 156880.doc -27- 201204387 為Leu之胺基酸序列； (6) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Va卜將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (7) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Va卜將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第70號之lie置換為 Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (8) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換為 Leu之胺基酸序列； (9) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lle置換為Leu、及將第112號之Val置換為 156880.doc -28 - 201204387

Leu之胺基酸序列； (10)將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列。作為導入了 8個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜（17)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之Ile置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； 156880.doc -29- 201204387 (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之He置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (6) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (7) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (8) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 156880.doc •30· 201204387

Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (9) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、及將第70號之lie置換為Leu之胺基酸序列； (10) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (11) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (12) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (13) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Va卜將第38號之Arg置換為 Lys、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 156880.doc -31- 201204387

Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (14) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (15) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (16) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第95號之Tyr置換為 Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列； (17) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸序列。作為導入了 7個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜(8)之胺基酸序列β 156880.doc -32- 201204387 (1) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys '將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 156880.doc •33· 201204387

Phe之胺基酸序列； (6) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (7) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (8) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、及將第70號之lie置換為 Leu之胺基酸序列。作為導入了 6個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜（13)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 156880.doc -34· 201204387

Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之ile置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (6) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (7) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、及將第70號之lie置換為Leu之胺基酸序列； (8) 將序列編號24之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 156880.doc •35· 201204387 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (9) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第20號之Val置換為lie、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (10) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (11) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第68號之Val置換為 Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (12) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (13) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、及將第68號之Val置換為Ala之胺基酸序列。作為導入了 5個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜（5)之胺基酸序列。 156880.doc -36- 201204387 (1) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為 Ala、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第68號之Val置換為Ala、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Va卜將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、將第67號之Arg置換為Lys、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、將第70號之lie置換為Leu '及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列。作為導入了 4個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜(5)之胺基酸序列。 (1)將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 156880.doc •37· 201204387 lie、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為 lie、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為 Lys、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第68號之Val置換為 Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、將第70號之lie置換為 Leu、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列。作為導入了 3個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜（12)之胺基酸序列。 (1) 將序列，編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第67號之Arg置換為Lys、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第12號之Lys置換為Val、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； 156880.doc -38 - 201204387 (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第48號之Met置換為lie、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (6) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第68號之Val置換為Ala、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (7) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第70號之lie置換為Leu、及將第95號之Tyr置換為 Phe之胺基酸序列； (8) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、將第38號之Arg置換為Lys、及將第48號之Met置換為 lie之胺基酸序列； (9) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之置換為 Va卜將第38號之Arg置換為Lys、及將第48號之Met置換為 lie之胺基酸序列； (10) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、及將第67號之Arg置換為 Lys之胺基酸序列； (11) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、及將第68號之Val置換為 Ala之胺基酸序列； 156880.doc -39· 201204387 (12)將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、將第48號之Met置換為lie、及將第70號之Ile置換為 Leu之胺基酸序列。作為導入了 2個修飾之VH之胺基酸序列’具體而言，例如可列舉以下（1)〜（18)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及將第48號之Met置換為lie之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、及將第38號之Arg置換為Lys之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Va卜及將第38號之Arg置換為Lys之胺基酸序列； (6) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及將第67號之Arg置換為Lys之胺基酸序列； (7) 將序列編號24之胺基酸序列中之第3 8號之Arg置換為 Lys、及將第68號之Val置換為Ala之胺基酸序列； (8) 將序列編號24之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及將第70號之lie置換為Leu之胺基酸序列； (9) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、及將第48號之Met置換為lie之胺基酸序列； (10) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 156880.doc -40- 201204387

Val、及將第48號之Met置換為lie之胺基酸序列； (11) 將序列編號24之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及將第67號之Arg置換為Lys之胺基酸序列； (12) 將序列編號24之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及將第68號之Val置換為Ala之胺基酸序列； (13) 將序列編號24之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及將第70號之lie置換為Leu之胺基酸序列； (14) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為 Pro、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (15) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Va卜及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (1 6)將序列編號24之胺基酸序列中之第67號之Arg置換為 Lys、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (17) 將序列編號24之胺基酸序列中之第68號之Val置換為 Ala、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列； (18) 將序列編號24之胺基酸序列中之第70號之lie置換為 Leua、及將第95號之Tyr置換為Phe之胺基酸序列。作為導入了 1個修飾之VH之胺基酸序列’具體而言’例如可列舉以下（1)〜（10)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號24之胺基酸序列中之第9號之Ala置換為pro 之胺基酸序列； (2) 將序列編號24之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為Val 之胺基酸序列； (3) 將序列編號24之胺基酸序列中之第20號之Val置換為lle 156880.doc • 41- 201204387 之胺基酸序列； (4) 將序列編號24之胺基酸序列中之第3 8號之Arg置換為Lys 之胺基酸序列； (5) 將序列編號24之胺基酸序列中之第48號之Met置換為lie 之胺基酸序列； (6) 將序列編號24之胺基酸序列中之第67號之Arg置換為Lys 之胺基酸序列； (7) 將序列編號24之胺基酸序列中之第68號之Val置換為Ala 之胺基酸序列； (8) 將序列編號24之胺基酸序列中之第70號之lie置換為Leu 之胺基酸序列； (9) 將序列編號24之胺基酸序列中之第95號之Tyr置換為Phe 之胺基酸序列； (10) 將序列編號24之胺基酸序列中之第112號之Val置換為 Leu之胺基酸序列。又’作為本發明之人類化抗體所含之VL，較佳為以下 ⑴〜(4)。 (1) 包含將序列編號26之胺基酸序列中第15號之Leu、第19 號之Ala、第21號之lie、及第84號之Leu置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL ; (2) 包含將序列編號26之胺基酸序列中第15號之Leu、第19 號之Ala、及第84號之Leu置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL ; (3) 包含將序列編號26之胺基酸序列中之第19號之Ala、第 156880.doc • 42· 201204387

21號之lie、及第84號之Leu置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL (4)包含將序列編號26之胺基酸序列中之第19號之Ala、及第84號之Leu置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL。作為上述VL之胺基酸序列，例如可列舉··導入有選自將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為Ala、將第19號之Ala置換為Va卜將第21號之lie置換為Met、及將第84號之Leu置換為Val之修飾中的至少1種修飾之胺基酸序列。作為導入了 4個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉：將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu 置換為Ala、將第19號之Ala置換為Val、將第21號之lie置換為Met、及將第84號之Leu置換為Val之胺基酸序列。作為導入了 3個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜(4)之胺基酸序列》 (1) 將序列編號26之胺基酸序列中之第19號之Ala置換為 Va卜將第21號之lie置換為Met、及將第84號之Leu置換為 Val之胺基酸序列； (2) 將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為 Ala、將第21號之lie置換為Met、及將第84號之Leu置換為 Val之胺基酸序列； (3) 將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為 Ala、將第19號之Ala置換為Va卜及將第84號之Leu置換為 Val之胺基酸序列； 136880.doc •43· 201204387 (4)將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為 Ala、將第19號之Ala置換為Val、及將第21號之Ile置換為 Met之胺基酸序列。作為導入了 2個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜(6)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為 Ala、及將第19號之Ala置換為Val之胺基酸序列； (2) 將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為 Ala、及將第21號之lie置換為Met之胺基酸序列； (3) 將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為 Ala、及將第84號之Leu置換為Val之胺基酸序列； (4) 將序列編號26之胺基酸序列中之第19號之Ala置換為 Val、及將第21號之lie置換為Met之胺基酸序列； (5) 將序列編號26之胺基酸序列中之第19號之Ala置換為 Val、及將第84號之Leu置換為Val之胺基酸序列； (6) 將序列編號26之胺基酸序列中之第21號之lie置換為 Met、及將第84號之Leu置換為Val之胺基酸序列。作為導入了 1個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下（1)〜(4)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號26之胺基酸序列中之第15號之Leu置換為Ala 之胺基酸序列； (2) 將序列編號26之胺基酸序列中之第19號之Ala置換為Val 之胺基酸序列； (3) 將序列編號26之胺基酸序列中之第21號之lie置換為Met 156880.doc -44· 201204387 之胺基酸序列； (4)將序列編號26之胺基酸序列中之第84號之Leu置換為Val 之胺基酸序列。又，作為本發明之人類化抗體之具體例，可列舉以下 (1)〜（3)之人類化抗體》 (1) 含有包含序列編號24所表示之胺基酸序列之抗體vh及包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體； (2) 含有包含序列編號24所表示之胺基酸序列之抗體VH及包含圖13所表示之任一種胺基酸序列之抗體VL中之至少一者之人類化抗體； (3) 含有包含圖12所表示之任一種胺基酸序列之抗體vh及包含序列編號26之胺基酸序列之抗體VL中之至少一者之人類化抗體。進而’作為本發明之人類化抗體，亦包括：與上述人類化抗體競爭而與Trop-2反應之人類化抗體、及結合於與上述人類化抗體反應之抗原決定位相同的抗原決定位之人類化抗體。人類抗體係指原本天然存在於人類體内之抗體，亦包括藉由最新的基因工程、細胞工程、發生工程之技術進步而製作的人類抗體噬菌體基因庫及由人類抗體產生基因轉殖動物獲得之抗體等。人類體内天然存在之抗體例如可藉由以下方式而取得：使EB病毒等感染人類末梢血淋巴球而不死化，並選殖，藉 156880.doc -45· 201204387 此將產生該抗體之淋巴球進行培養自該培養上清液中純化出該抗體。人類抗體嗟菌體基因庫係藉由將由人類B細胞製備之抗體基因插入至噬菌體基因而使Fab、scFv等抗體片段於噬菌體表面表現之基因庫。可自該基因庫回收以對將抗原固疋化之基質的結合活性為指標而使具有所需之抗原結合活性的抗體片段於表面表現之噬菌體。該抗體片段進而亦可基因工程的方法變換為包含2條完全的Η鏈及2條完全的l 鏈之人類抗體分子。人類抗體產生基因轉殖動物係指人類抗體基因併入細胞内之動物。具體而言，例如向小鼠ES細胞導入人類抗體基因，將該ES細胞移植至小鼠之初始胚後，產生個體，藉此可製作人類抗體產生基因轉殖小鼠。來自人類抗體產生基因轉殖動物之人類抗體可藉由以下方式製作：使用在通常之人類以外的動物中所進行之融合瘤製作方法，取得人類抗體產生融合瘤，並進行培養，而於培養上清液中產生堆積人類抗體。於構成上述抗體或抗體片段之胺基酸序列中，1個以上胺基酸缺失、附加、置換或插入，且具有與上述抗體或該抗體片段相同活性之單株抗體或該抗體片段，亦可包括在本發明之單株抗體或該抗體片段中。缺失、置換、插入及/或附加之胺基酸之數量為1個以上’該數量並無特別限定’係部藉由位特異性修飾導入法 [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor 156880.doc -46· 201204387

Laboratory Press (1989) ' Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) ' Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) ' Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982) ^ Gene, 34, 315 (1985) ' Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)' Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82，488 (1985)]等周知之技術，而可缺失、置換或附加之程度的數量。例如較佳為1〜數十個、更佳為丨〜⑼個、尤佳為1~10個' 特佳為1〜5個。所謂上述抗體之胺基酸序列中1個以上胺基酸殘基缺失、置換、插入或附加，表示如下情況。即，於同一序列中之任意、且1或複數個胺基酸序列中，存在t或複數個胺基殘基缺失、置換、插入或附加。又，亦存在缺失、置換、插入或附加同時發生之情形，還存在置換、插入或附加之胺基酸殘基為天然型與非天然型之任一情形。作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉：L_丙胺酸、L_天冬醯胺、L-天冬醢胺酸、L_麩醯胺、L_麵胺酸、甘胺酸、 L-組胺酸.、L-異白胺酸、L-白胺酸、L_離胺酸、L_甲硫胺酸、L-苯基丙胺酸、L_脯胺酸、l—絲胺酸、^蘇胺酸、^ 色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、或L-半胱胺酸等。以下表示可相互置換之胺基酸殘基之較佳例。同一群中所含之胺基酸殘基可相互置換。 A群：白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、绳胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁烷酸、甲硫胺酸、〇·曱基絲胺酸、第二丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸 156880.doc -47· 201204387 B群：天冬醯胺酸、麩胺酸、異天冬醯胺酸、異麩骇酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸 C群：天冬酿胺、麵酿胺 D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4_二胺基丁烷酸、 2,3·二胺基丙酸 E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4_羥基脯胺酸 F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸 G群：苯基丙胺酸、路胺酸本發明中，作為抗體片段，可列舉以1)、F(ab，)2、Fab,、 scFv、diabody(雙鏈抗體）、dsFv及含有CDR之肽等。

Fab係以作為蛋白質分解酶的木瓜蛋白酶對IgG進行處理而獲得之片段中（被Η鏈之第224號之胺基酸殘基切割），H 鏈之N末端侧約一半與L鏈整體以二硫鍵結合的分子量約5 萬之具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之Fab可藉由木瓜蛋白酶對本發明之單株抗體進行處理而得。又，亦可藉由將編碼該抗體之Fab之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該載體導入至原核生物或真核生物，使其表現而並製造Fab。 F(ab’）2係以作為蛋白質分解酶的胃蛋白酶將Ig(}之鉸鏈區域之2個二硫鍵的下部分解而獲得之2個Fab區域藉由鉸鏈部分結合而構成之分子量約1〇萬之具有抗原結合活性之片段。本發明之F(ab’)2可藉由胃蛋白酶對本發明之單株抗體進行處理而得。又，亦可使下述Fab，進行硫醚結合或二硫結 156880.doc •48· 201204387 合而製作。

Fab’係將上述F(ab，）2之鉸鏈區域之二硫鍵切割而得的分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之Fab，可藉由二硫代蘇糖醇等還原劑對本發明之以北}進行處理而得。又，亦可藉由將編碼該抗體之Fab，片段2DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該載體導入至原核生物或真核生物，使Fab,表現而製造。 scFv係使用適當的肽連結子（以下記為p)連結^条▽11與i 條VL之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段》本發明之scFv可藉由取得編碼本發明之單株抗體vh及 VL之cDNA ’構築編碼scFviDNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入至原核生物或真核生物，使其表現而製造。雙鏈抗體係scFv二聚化之抗體片段，係具有二價之抗原結合活性之抗體片段。二價之抗原結合活性既可為相同，亦可為使一者不同之抗原結合活性。本發明之雙鏈抗體可藉由取得編碼本發明之單株抗體VH及VL之cDNA，以肽連結子之胺基酸序列之長度為8殘基以下之方式構築編碼 scFv之DNA’將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入至原核生物或真核生物，使用其表現而製造。 dsFv係指使分別將VH及VL中之1胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基^r多肽經由該半胱胺酸殘基間之二硫鍵結合者。 1 S6880.doc • 49- 201204387 至於DsFv，置換為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可根據已知之方法[Protein Engineering，7，697 (1994)]，根據抗體之立體結構預測進行選擇。本發明之dsFv可藉由取得編碼本發明之單株抗體VH及 VL之cDNA，構築編碼dsFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入至原核生物或真核生物，使其表現而製造。含有CDR之肽係包含VH或VL之CDR的至少1區域以上而構成。含有複數個CDR之肽可直接或經由適當的肽連結子而結合。含有本發明之CDR之肽可藉由構築編碼本發明之單株抗體VH及VL之CDR的DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入至原核生物或真核生物，使其表現而製造。又，包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法而製造。本發明中，本發明之單株抗體或該抗體片段包括：藉由化學或基因工程之方式結合放射性同元素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質、或抗體醫藥等之抗體的衍生物。本發明中之抗體之衍生物可藉由以下方式製造：藉由化學方法[抗體工學入門，地人書館（1994)]，使放射性同元素、低分子藥劑、高分子藥劑、免疫活化劑、蛋白質或抗體醫藥等與本發明之單株抗體或該抗體片段之Η鏈或L鏈的Ν末端側或C末端側、抗體或該抗體片段中之適當的置換基或側鏈、進而單株抗體或該抗體片段中之糖鏈等結 156880.doc -50· 201204387 合ο 又，本發明之抗體之衍生物可藉由基因工程方法而製造，即，編碼使本發明之單株抗體或抗體片段2DNA、與編碼欲結合之蛋白質或抗體醫藥iDNA連結而插入至表現載體，將該表現載體導入至適當的宿主細胞使其表現。作為放射性同元素，例如可列舉：丨力、丨25丨、90γ “CU、”TC、”Lu、或Μ等。放射性同元素可藉由氣胺τ 法等而與抗體直接結合。又，可使螯合放射性同元素之物質與抗體。作為螯合劑，例如可列舉：丨·異硫氰酸酯基苄基-3-曱基二乙三胺五乙酸（MX-DTPA)等。作為低分子藥劑’例如可列舉：烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物生物鹼、拓撲異構酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑、p糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、Μ期抑制劑、或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學’癌與化學療法公司（1996)];或氫化可的松、強的松（prednisone)等類固醇劑，阿司匹林、吲哚美辛等非類固醇劑，硫蘋果酸金（gold thiomalate)'青黴胺（penicillamine)等免疫調節劑，環麟醯胺（cyclophosphamide)、硫唑嘌呤等免疫抑制劑，順丁烯二酸氣菲安明、或氣馬斯汀之類的抗組胺劑等消炎藥 [炎症與消炎療法，醫齒藥出版股份有限公司（1982)]等。作為抗癌劑’例如可列舉：胺填ί丁（amifostine) (Ethyol)、順鉑（cisplatin)、達卡巴畊（dacarbazine) (DTIC)、放線菌素（dactinomycin)、氮芥（mechlorethamine) 156880.doc •51 · 201204387 (nitrogen mustard)、鏈腺黴素（streptozocin)、環麟醢胺 (cyclophosphamide)、異環瑞醯胺（ifosfamide)、卡莫司汀 (carmustine)(BCNU)、洛莫司汀（lomustine)(CCNU)、阿黴素（doxorubicin)(adriamycin)、表柔比星（epirubicin)、吉西他濱（gemcitabine)(gemzar)、柔紅黴素（daunorubicin)、曱基苄肼（procarbazine)、絲裂黴素（mitomycin)、阿糖胞苷 (cytarabine)、依託泊苦（etoposide)、胺曱0票吟 (methotrexate)、5-敦尿嘲唆、氣尿嘴咬、長春驗 (vinblastine)、長春新驗（vincristine)、爭光黴素 (bleomycin)、道諾黴素（daunomycin)、培洛黴素 (peplomycin)、雌莫司汀（estramustine)、紫杉醇 (paclitaxel)(taxol)、多西紫杉醇（docetaxel)(taxotere)、阿地白介素（aldesleukin)、天冬酿胺酶（asparaginase)、白消安（busulfan)、卡始（carboplatin)、奥沙利銘（oxaliplatin)、奈達銘（nedaplatin)、克拉屈濱（cladribine)、喜樹驗 (camptothecin)、10-經基-7-乙基-喜樹驗（SN38)、氟尿普 (floxuridine)、氟達拉濱（fludarabine)、經基腺 (hydroxyurea)、異環罐酿胺、伊達比星（idarubicin)、美司納（mesna)、伊立替康（irinotecan)(CPT-ll)、拓撲替康 (nogitecan)、米托蒽 S昆（mitoxantrone)、拓撲替康 (topotecan)、亮丙瑞林（leuprolide)、.甲地孕酮 (megestrol)、美法侖（melphalan)、疏基嗓呤 (mercaptopurine)、經基脲（hydroxycarbamide)、普卡徽素 (plicamycin)、米托坦（mitotane) 、培門冬酶 156880.doc -52- 201204387 (pegaspargase)、喷司他丁（pentostatin)、痕泊漠烧 (pi.pobroman)、鏈腺黴素、他莫昔芬（tamoxifen)、戈舍瑞林（goserelin)、亮丙瑞林（leuprorelin)、氟他胺 (flutamide)、替尼泊苷（teniposide)、睾内醋 (testolactone)、硫鳥嘌吟（thioguanine)、塞替派 (thiotepa)、烏拉莫司汀（uracil mustard)、長春瑞濱 (vinorelbine)、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、氫化可的松、潑尼松（prednisolone)、甲基潑尼松、長春地辛 (vindesine)、尼莫司江（nimustine)、司莫司汀 (semustine)、卡培他濱（capecitabine)、雷替曲塞 (tomudex)、阿紫胞普（azacitidine)、UFT、奥沙利始 (oxaliplatin)、吉非替尼（gefitinib)(Iressa)、伊馬替尼 (imatinib)(STI571)、得舒缓（elrotinib)、類 FMS 酪胺酸激酶 3 (FMS-like tyrosine kinase 3，Flt3)抑制劑、血管内皮細胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)抑制劑、成纖維細胞生長因子受體 (fibroblast growth factor receptor，FGFR)抑制劑、 Iressa、Tarceva 等表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑、瑞迪士可黴素 (radicicol)、17-烯丙基胺基-17-去氧格爾德黴素、雷帕黴素（rapamycin)、安吖咬（amsacrine)、全反式視黃酸、沙利度胺（thalidomide)、阿那曲0坐（anastrozole)、法偏〇坐 (fadrozole)、來曲《坐（letrozole)、依西美坦（exemestane)、硫蘋果酸金、D-青黴胺、布西拉明（bucillamine)、硫。坐嗓 156880.doc -53- 201204387 吟、味。坐立賓（mizoribine)、環孢黴素（cyclosporine)、雷帕黴素、氫化可的松（hydrocortisone)、貝沙羅；丁 (bexarotene)(Targretin)、他莫昔芬、地塞米松 (dexamethasone)、孕酮（progestin)類、雌激素（estrogen) 類、阿那曲峻（Arimidex)、Leuplin、阿司匹林、0引0朵美辛、塞内昔布（celecoxib)、硫唾嘌吟、青黴胺、硫蘋果酸金、順丁稀二酸氣菲安明、氣苯0比胺（chlorpheniramine)、氯馬斯汀（clemastine)、維曱酸（tretinoin)、貝沙羅汀、石中’、硼替佐米（bortezomib)、別嗓吟醇（allopurinol)、卡奇黴素（calicheamicin)、替伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan)、 Targretin、吉妥單抗（ozogamine)、克拉黴素（clarithromycin)、甲酿四氫葉酸（leucovorin)、異環碳酿胺（ifosfamide)、酮康0坐（ketoconazole)、氨魯米特（aminoglutethimide)、舒拉明（suramin)、胺甲嗓吟、美登木素（maytansinoid)、或其衍生物等。作為使低分子藥劑與抗體結合之方法，例如可列舉：經由戊二醛使藥劑與抗體之胺基間結合之方法、或經由水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與抗體之羧基結合之方法等。作為高分子藥劑，例如可列舉：聚乙二醇（以下記為 PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯順丁烯二酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、或羥基丙基曱基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與抗體或抗體片段結合，而可期待（1)提高針對化學、物理或生物性各種因子之穩定性、 156880.doc • 54· 201204387 ^血中半衰期顯著延長、（3)抑制免疫原性之消失或抗體產生專效果[生物輛合物醫藥品，廣川書店（1993)]。作為使PEG與抗體結合之方法，例如可列舉：與㈣化修飾試劑反應之方法等[生物軛合物醫藥品，廣川書店 (1993)] 〇作為PEG化修飾試劑，可㈣：針對離胺酸之s· 胺基之修飾劑（日本專利特開昭61韻似號公報）、針對天冬酿胺酸及麩胺酸之„之”劑（日本專利特開昭％ 23587號公報）、或針對精胺酸之胍基之修飾劑（日本專利特開平2-117920號公報）等。作為免疫活化劑，可為作為免疫佐劑〇__咖观〇而已知之天然物’作為具體例，可列舉：使免疫亢進之藥劑、β(1—3)葡聚糖（香菇多糖（lentinan)、西佐喃 (schizophyllan))、或α半乳糖腦醯胺等。作為蛋白質，可列舉：使Νκ細胞、巨噬菌體、或嗜中性白血球等免疫作用細胞活性化之細胞激素或增殖因子、或毒素蛋白質等。作為細胞激素或增殖因子，例如可列舉：干擾素（以下記為 INF)-a、INF-β、ΙΝΡ_γ、介白素（以下記 IL) 2、IL_ 12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒球菌落刺激因子 (G-CSF)、顆粒球/巨噬菌體菌落刺激因子（GM_CSF)、或巨噬菌體菌落刺激因子（M-CSF)等。作為毒素蛋白質，例如可列舉、甘胺酸、白喉毒素、或 ONTAK等，亦包括為了調節毒性而於蛋白質中導入修飾之蛋白毒素。 156880.doc -55- 201204387 作為抗體醫藥，例如可列舉：針對藉由抗體之結合而誘導細胞凋亡之抗原、與腫瘤之病態形成相關之抗原或調節免疫功能之抗原、參與病變部位之血管新生之抗原的抗體。作為藉由抗體之結合而誘導細胞凋亡之抗原，例如可列舉：Cluster of differentiation(分化簇）（以下記為 CD)19、 CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、 CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、 CD79a、CD79b、CD80 (B7.1)、CD81、CD82、CD83、 CDw84、CD85、CD86 (B7.2)、human leukocyte antigen (人類白細胞抗原）（HLA)-Class II、或 Epidermal Growth Factor Receptor(表皮生長因子受體）（EGFR)等。作為與腫瘤之病態形成相關之抗原或調節免疫功能之抗體的抗原，例如可列舉：CD40、CD40配位子、B7家族分子（CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、或 B7-H4)、B7 家族分子之配位子（CD28、CTLA-4、ICOS、 PD-1、或 BTLA)、OX-40、OX-40 配位子、CD137、tumor necrosis factor(腫瘤壞死因子）（TNF)受體家族分子（DR4、 DR5、TNFR1、或 TNFR2)、TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor(腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體）(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子之受體家族 (TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、或 TRAIL-R4)、 receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(核因子受體活化因子配體）(RANK)、RANK配位子、CD25、葉酸 156880.doc •56- 201204387 受體 4、細胞激素[11>-1〇1、11^10、11^4、1[-5、比-6、11^ 10、IL-13、transforming growth factor(轉化生長因子）(TGF)P、或TNFct等]、該等細胞激素之受體、趨化激素 (SLC、ELC、1-309、TARC、MDC、或 CTACK 等）、或該等趨化激素之受體。作為抑制病變部位之血管新生之抗體的抗原，例如可列舉：vascular endothelial growth factor(血管内皮細胞生長因子）（VEGF)、Angiopoietin(血管生成素）、fibroblast growth factor(成纖維細胞生長因子）（FGF)、EGF、platelet-derived growth factor( 血小板源性生長因子）（PDGF) 、 insulin-like growth factor(類騰島素生長因子）(IGF)、 erythropoietin(促紅細胞生成素）（EPO)、TGFP、IL-8、 Ephilin、SDF-1、或該等之受體等。與蛋白質或抗體醫藥之融合抗體可藉由將編碼蛋白質之 cDNA連結於編碼單株抗體或抗體片段之cDNA，而構築編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至原核生物或真核生物用表現載體，將該表現載體導入至原核生物或真核生物，使融合抗體表現而製造。於使用上述抗體之衍生物作為檢測方法、定量方法、檢測用試劑、定量用試劑或診斷藥時，作為與本發明之單株抗體或該抗體片段結合之藥劑，可列舉通常之免疫學檢測或測定法中所用之標記體。作為標記體，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化物酶及螢光素酶等酶，吖啶酯及咯吩等發光物質，以及異硫氰酸 156880.doc •57· 201204387 榮光素（FITC)及異硫氰酸四甲基玫瑰紅（RITC)等螢光物質等。 &又’本發明係關於將含有本發明之單株抗體或該抗體片段作為有效成分之Τη)ρ_2陽性細胞參與之疾病的治療藥。作為Trop.2陽性細胞參與之疾病，例如若奸。ρ·2表現之細胞參與之疾病，則可為任意疾病，例如可列舉癌。作為癌’例如可列舉：血癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、印巢癌、肺癌、腎臟癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌或胰腺癌等，較佳為可列舉血癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌或前列腺癌。包含本發日月之單株抗體或該抗體片段、或料之衍生物之治療劑’可為僅包含作為有效成分之該抗體或該抗體片段、或該等之衍生物者’通常較理想為，以與藥理學上容許之1種以上載體-起混合，藉由製劑學之技術領域中公知之任意方法而製造的醫藥製劑之形式提供。至於投予途徑’於治療時，較佳為使用最有效者，例如可列舉經口投予，或口腔内、氣管内、直腸内、皮下、肌肉内或靜脈内等非經口投予。其中較佳為靜脈内投予。作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、貼劑等。 3 、治療時 ^g/kg~i〇投予量或投予次數因目標治療效果、投予方法間、年齡、及體重等而異，通常成人每日10 mg/kg。 156880.doc -58· 201204387 進而’本發明係關於含有本發明之單株抗體或該抗體片段作為有效成分之Trop_2之免疫學檢測或測定方法、Trop_ 2之免疫學檢測用或測定用試劑、Tr〇p_2表現之細胞的免疫學.檢測或測定方法、及Trop-2陽性細胞參與之疾病的診斷藥。本發明中作為檢測或測定Tr〇p_2量之方法，可列舉任意公知之方法。例如可列舉免疫學檢測或測定方法等。所謂免疫學檢測或測定方法，係使用實施標記之抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為免疫學檢測或測定方法，例如可列舉二放射免疫測定法（RIA)、酶免疫測定法（ElA或ELIS A)、螢光免疫測定法（FIA)、發光免&測疋法（l.uminescent immunoassay)、西方點墨法或物理化學方法等。藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段檢測或測定 Trop-2表現之細胞，而可診斷與Tr〇p_2關連之疾病。於該多狀表現之細胞之檢測中，可使用公知之免疫學檢測法’例如可較佳地列舉：免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法、或螢光抗體染色法等。又，亦可列舉 FMAT8 100HTS 系統（Applied Biosystems 公司製造）等螢光抗體染色法等。本發明中作為成為檢測或測定Trop-2之對象的生物樣本’若為組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液、或培養液等有可能包含Tr〇p_2表現之細胞者，則並無特別限定。 156880.doc •59- 201204387 之==單株抗體或該抗體“、或該等之衍生物反應之試#丨目的之#斷法，可包含^進行抗原抗體 =^劑、該反應之檢測用試劑。作為用以進行抗原抗體反應之試劑’例如可列舉緩衝劑、鹽等。作為㈣Μ劑，例如可列舉：識別該單株抗體或該抗體片段、或該等之衍生物之經標記的二次抗體、或與標記相對應之基質等通常的免疫學檢測或測定法所使用之試劑。以下對本發明之單株抗體之製造方法、疾病之治療方法、及疾病之診斷方法進行具體地說明。 1.單株抗體之製造方法 (1)抗原之製備成為抗原之Trop-2或使Trop-2表現之細胞可藉由以下方法獲得.將包含編碼Tr〇p_2全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等。又’可自大量表現Trop-2之各種人類腫瘤培養細胞、人類組織等純化出Tr〇p_2而獲得。又，亦可將該腫瘤培養細胞、或該組織等直接用作抗原。進而，亦可藉由Fm〇c 法、或tBoc法等化學合成法製備具有Trop-2之部分序列的合成狀’並用於抗原。本發明所用之Trop-2可使用Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1989)或 Current Protocols In Molecular

Biology，John Wiley & Sons (1987-1997)等所記載之方法 156880.doc -60- 201204387 等藉由例如以下方法，使編碼該Trop-2之DNA於宿主細胞中表現而製造。首先，藉由將包含編碼Trop-2之部分的完全長度cDNA 插入至適當的表現載體之啟動子之下游而製作重組載體。亦可使用以完全長度cDNA為基礎而製備的包含編碼多肽之。卩分的適當長度之DNA片段來代替上述完全長度 cDNA。繼而，藉由將所得之該重組載體導入至適合該表現載體之宿主細胞而獲得生產多肽之轉形體。作為表現載體’右為可進行於所使用之宿主細胞中的自我複製或併入至染色體上，並於可轉錄編碼多肽之DNA的位置含有適當啟動子者，則均可使用。作為宿主細胞，若為大腸桿菌等屬於大腸桿菌 (Escherichia)屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等可表現目標基因者，則均可使用。使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞時，重組載體較佳為可於原核生物中自我複製，同時包含啟動子、核糖體結合序列、含有編碼Trop-2之部分的DNA、及轉錄終止序列之載體。又，該重組載體未必需要轉錄終止序列，較佳為於結構基因之正下方配置轉錄終止序列。進而，該重址載體可包含控制啟動子之基因。作為該重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列的 Shine-Dalgarno序列（亦稱為SD序列）與起始密碼子之間調節為適當的距離（例如6〜18驗基）之質體。又，作為編碼該Trop-2之DNA之鹼基序列，能以成為最 156880.doc • 61 - 201204387 適合於宿主内表現之密碼子之方式之置換鹼基，藉此可提高目標Trop-2之生產率。作為表現載體，若為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者，可均可使用。例如可列舉：pBTrp2、pBTacl、 pBTac2(以上為 R0Che Diagnostics 公司製造）、pKK233-2 (Pharmacia 公司製造）、pSE280 (Invitrogen 公司製造）、 pGEMEX-1 (Promega 公司製造）、pQE-8 (QIAGEN公司製造）、pKYPIO(日本專利特開昭58-110600號公報）、 pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、pLSAl [Agric. Biol. Chem.，53，277 (1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82，4306 (1985)]、 pBluescript II SK(-) (Stratagene公司製造）、pTrs30[由大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2 (FERM BP-400)製備、曰本專利特開昭60-221091 號公報]、PGKA2[由大腸桿菌 IGKA2 (FERM BP-6798) 製備、日本專利特開昭 60_221091 號公報]、 pTerm2(美國專利第4686191號說明書、美國專利第 4939094號說明書、美國專利第5160735號說明書）、 pSupex > pUBll〇 ' PTP5 ' PC194 ' pEG400 [J- Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、PGEX (Pharmacia公司製造）、PET系統 (Novagen 公司製造）、或PME18SFL3 等。作為啟動子，若為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可為任意者。例如可列舉：trp啟動子（Ptrp)、lac啟 156880.doc -62- 201204387 動子、PL啟動子、PR啟動子、或T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可使用將2個Ptrp串接之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子、或let I啟動子等經人為設計改變之啟動子等。作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL 1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB 101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3 110、大腸桿菌 NY49、或大腸桿菌DH5ct等。作為於宿主細胞中導入重組載體之導入方法，若為於所使甩之宿主細胞中導入DNA之方法，則均可使用，例如可列舉：使用鈣離子之方法[Proc. Natl. Acad. Sci· USA，69, 2110 (1972)、Gene，17, 107 (1982)、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]。使用動物細胞作為宿主時，作為表現載體，若為可於動物細胞中發揮功能者，則均可使用，例如可列舉： pcDNAI、pcDM8 (Funakoshi 公司製造）、pAGE107[日本專利特開平 3-22979 號公報；Cytotechnology，3，133 (1990)]、 pAS3-3(曰本專利特開平2-227075號公報）、pCDM8 [Nature，329，840 (1987)]、pcDNAI/Amp (Invitrogen公司製造）、pcDNA3.1 (Invitrogen公司製造）、pREP4 (Invitrogen 公司製造）、PAGE103 [J. Biochemistry, 101，1307 (1987)]、 pAGE210、pME18SFL3、或 pKANTEX93(國際公開第 97/10354號）等。 156880.doc -63- 201204387 作為啟動子，若為可於動物細胞中發揮功能者，則均可使用，例如可列舉：巨細胞病毒（CMV)之immediate early(IE)基因之啟動子、SV40之初始啟動子、逆轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱驟變啟動子、SRa啟動子、或莫洛尼（Moloney)小鼠白血病病毒之啟動子或促進子。又，可將人類CMV之IE基因之促進子與啟動子一起使用0 作為宿主細胞，例如可列舉：人類伯基特氏淋巴瘤細胞 Namalwa、狼腎臟細胞COS、中國倉鼠卵巢細胞CHO (Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958) I Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968) ； Genetics, 55, 513 (1968) ； Chromosoma, 41, 129 (1973) ； Methodsin Cell Science, 18, 115 (1996) ； Radiation Research, 148, 260 (1997) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)； Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968) ； Cell, 6, 121 (1975) ； Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900) ; CHO/DG44、CHO-K1 (ATCC CCL-61)、DUKXB11 (ATCC CCL-9096)、Pro-5 (ATCC CCL-1781)、CHO-S (Life Technologies, Cat # 11619)、Pro-3、大白鼠骨髓瘤細胞丫82/31^.?2.〇11.16八£.20(或亦稱為丫82/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨趙瘤細胞SP2/0-Agl4、敍利亞倉鼠細胞BHK或人類白血病細胞HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報）等。作為導入至宿主細胞之重組載體之導入方法，若為於動 156880.doc -64 · 201204387 物細胞中導入DNA之方法，則均可使用。例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology，3, 133 〇99〇)]、磷酸鈣法（日本專利特開平2-227075號公報）、或脂轉染法[Pr〇c Nati Sci. USA，84, 7413 (1987)]等。將保有以上述方式獲得之併入編碼Tr〇p_2之DNA的重組載體之源自微生物或動物細胞等之轉形體於培養基中培養，使該Trop-2於培養物中生成堆積，並自該培養物進行採集，藉此製造Trop-2。將該轉形體於培養基中培養之方法可跟進宿主之培養時所用之通常的方法來進行。於源自真核生物之細胞中表現時，可獲得附加有糖或糖鍵之Trop-2。於培養藉由使.用誘導性啟動子之重組載體進行轉形之微生物時，可根據需要將誘導劑（inducer)添加至培養基中。例如於培養藉由使用lac啟動子之重組載體進行轉形之微生物時’可將異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等添加至培養基中’於培養藉由使用trp啟動子之重組載體進行轉形之微生物時’可將吲哚丙烯酸等添加至培養基中。培養將動物細胞作為宿主而得的轉形體之培養基可列舉：通常所使用之RPMI1640培養基[The Journal of the

American Medical Association，199, 519 (1967)]、Eagle(伊格爾）之 MEM 培養基[Science, 122, 501 (1952)]、

Dulbecco(達爾伯克）改良MEM培養基[Virology, 8，396 (1959)]、199培養基[proc. s〇c. Exp. Biol. Med.，73，1 (1950)]、Iscove's Modified Dulbecco，s Medium (IMDM， 156880.doc -65· 201204387 伊思考夫改良達爾伯克培養基）培養基、或於該等培養基中添加胎牛血清（FBS)等之培養基等。培養通常於pH值 6~8、30〜40°C、5% C02存在下等條件下進行1〜7日。又，培養中視需要可將康黴素、青黴素等抗生素添加至培養基中。作為編碼Trop-2之基因之表現方法，除了直接表現以外’亦可使用分泌生產或融合蛋白質表現等方法 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]。作為Trop-2之生產方法，有使其於宿主細胞内生產之方法、使其於宿主細胞外分泌之方法、或使其於宿主細胞外膜上生產之方法，可根據改變所使用之宿主細胞、或所生產之Trop-2之結構，而選擇適當之方法。使Trop-2於宿主細胞内或宿主細胞外膜上生產時，可藉由使用 Paulson 等之方法[J. Biol. Chem.，264，17619 (1989)]、Lowe等之方法[Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，86, 8227 (1989)、Genes Develop·，4，1288 (1990)]、日本專利特開平05-336963號公報、或國際公開第94/23021號等所記載之方法，而使Trop-2於宿主細胞外積極地分泌。又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系 (曰本專利特開平2-227075號公報）而使Trop-2之生產量上升。所得之Trop-2例如可藉由以下方式進行單離、純化。於Trop-2在細胞内以溶解狀態表現時，於培養結束後藉 156880.doc -66- 201204387 由離心分離回收細胞，於水系緩衝液懸浮後，使用超音波破碎m細胞壓碎器（FRENCH ρ_)、μαντ〇ν· gaulin勻漿器、或戴諾磨（Dyn。Mi⑴等將細胞破碎，而獲得無細胞萃取液。自藉由心分離出上述無細胞萃取液而獲得之上清液中，單獨或組合使用通常之蛋白質的單離純化法、即溶劑萃取法、硫酸敍等之鹽析法、脫鹽法、有機溶劑之沈澱法、二乙基胺基乙基⑽AE)_ €脂糖、使謂AIQN HPA_ 75(二菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用 S-Sepharose FF⑽瞻心公司製造）等樹脂之陽離子交換層析法、使用T基瓊絲、苯基瓊脂料樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚隹法、或等電點電泳等電泳法等方法，而獲得純化標品。在Trop-2於細胞内形成不溶體而表現時，與上述同樣將細胞回收後破碎，進行離心分離，藉此以沈澱餾分之形式回收該Trop-2之不溶體。藉由蛋白質改性劑而使所回收: 該Trop-2之不溶體可溶化。藉由將該可溶化液稀釋或透析，而使該ΤΓ〇Ρ-2恢復至正常的立體結構後，可藉由與上述相同之單離純化法而獲得多肽之純化標品。於Trop-2或其糖修飾體等衍生物在細胞外分泌時，可於培養上清液中回收該Trop-2或其糖修飾體等衍生物。可與上述同樣藉由離心分離等方法對該培養物進行處理而取得可溶性餾分，並使用與上述相同之單離純化法，自該可^ 性餾分獲得純化標品。 156880.doc •67- 201204387 又，本發明中所用之Trop-2亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法而製造。又，亦玎利用AdVanCed ChemteC公司製造、PerkinElmer公司製造、pharmacia公司製造、 protein Technology Instrument公司製造、Synthecell-Vega 公司製造、PerSeptive公司製造、或島孝製作所公司製造等之肚>合成機進行化學合成。 (2)動物之免疫及融合用抗體產生細胞之製備於3~2〇週齡之小鼠、大白鼠或倉鼠等動物中，採集對 (1)所得之抗原免疫之該動物之脾臟、淋巴腺、末梢血中之抗體產生細胞。又，於免疫原性較低且於上述動物中未發現充分之抗體價上升時，亦可使用Trop_2基因剔除小鼠作為被免疫動物。免疫係於動物之皮下、靜脈内或腹腔内，與例如Freund 之完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠及百日咳菌疫苗等適當的佐劑一起投予抗原而進行。於抗原為部分肽時，製作與 BSA(牛血清白蛋白）、或KLH (Keyhole Limpet hemocyanin) 等載體蛋白質之結合體，並將其用作免疫原。抗原之投予係於第1次投予後，每隔1〜2週投予5〜10次。各投予後第3〜7日自眼底靜脈叢採血，使用酶免疫測定法 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等測定該血清之抗體價》將該血清對用於免疫之抗原表現充分的抗體價之動物作為融合用抗體產生細胞之供給源。於抗原之最後投予後第3〜7曰，自經免疫之動物摘出脾 • 68 - 156880.doc 201204387 臟等包含抗體產生細胞之組織，並採集抗體產生細胞。於使用脾臟細胞時，將脾臟切細、解開後，進行離心分離，進而去除紅血球取得融合用抗體產生細胞。 (3)骨髓瘤細胞之製備作為骨髓瘤細胞，係使用自小鼠獲得之株化細胞，例如可列舉：、8-氮鳥嗓11令耐性小鼠（源自B ALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [Current Topicsin Microbiology and Immunology, 18, 1 0^8)] ' P3-NS1/1-Ag41 (NS-1) [European J. Immunology，^ 511 (1976)] ^ SP2/0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)] ^ P3-X63-Ag8653 (653)[J. hnmunoiogy，123, 1548 0979)]、或 P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)]等。該骨髓瘤細胞藉M常培養基[添加了_胺、2-疏基乙醇、慶大黴素（gentamicin)、FBS、及8·氮鳥嗓吟之 RPMI1640培養基]進行繼代，於細胞融合之3〜4日則於正常培養基中繼代，而確保融合當日為2x1 〇7個以上之細胞數。 (4)細胞融合及單株抗體產生融合瘤之製備將（2)中所得之融合用抗體產生細胞與（3)中所得之骨髓瘤細胞於Minimum Essential Medium (MEM ’最低必需培養基）培養基或PBS(磷酸二鈉1·83 g、磷酸一鉀0.21 g、食鹽7.65 g、蒸餾水1升、pH值7.2)充分清洗，以細胞數成為融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5〜10:1之方式混合’ 進行離心分離後，而去除上清液。 156880.doc -69- 201204387 將經沈澱之細胞群充分解開後，於37°C下一面攪拌一面添加聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、MEM培養基及二甲亞砜之混液。進而，每1〜2分鐘添加MEM培養基1〜2 mL數次後，添加MEM培養基使總量成為50 mL。進行離心分離後，去除上清液。將經沈澱之細胞群緩慢解開後，使融合用抗體產生細胞於HAT培養基[添加了次黃嘌呤、胸苷、及胺喋呤之正常培養基]中緩慢地懸浮。將該懸浮液於5〇/〇 C02培養箱中於37°C下培養7〜14曰。培養後’抽出培養上清液之一部分，藉由後述結合分析等融合瘤之選擇方法，與包含Trop-2之抗原反應，選擇不與不含Trop-2之抗原反應之細胞群。繼而，藉由極限稀釋法重複2次選殖[第1次使用HT培養基（自HAT培養基去除胺嗓吟之培養基）、第2次使用正常培養基]，選擇穩定而確認較強抗體價者作為單株抗體產生融合瘤。 (5)純化單株抗體之製備對經姥紋院處理[將2,6,10,14 -四曱基十五烧（pristane)〇 5 ml投予腹腔内’飼養2週]之8〜1〇週齡的小鼠或裸毛小鼠，將（4)中所得之單株抗體產生融合瘤注射於腹腔内。於 10〜21日融合瘤使腹水癌化。自該小鼠採集腹水，進行離心分離去除固體成分後，藉由40〜50%硫酸銨進行鹽析，藉由辛酸沈澱法、DEAE-瓊脂糖管柱、蛋白質冬管柱或凝膠過濾管柱進行純化，收集IgG或IgM餾分，作為純化單株抗體。又，將（4)中所得之單株抗體產生融合瘤於添加了 1〇%濃 156880.doc 201204387 度之FBS的RPMI1640培養基等中培養後，藉由離心分離去除上清液，於Hybridoma SFM培養基中懸浮，並培養3〜7 曰。亦可將所得之細胞懸浮液離心分離，自所得之上清液藉由蛋白質A-管柱或蛋白質G-管柱進行純化，收集IgG餾分，而獲得純化單株抗體。再者，亦可於Hybridoma SFM 培養基中添加5%濃度之Daigo's GF21。抗體之亞類之確定可使用亞類分型套組藉由酶免疫測定法來進行。蛋白量之定量係根據洛利（Lowry)法或280 nm 之吸光度而算出。 (6)單株抗體之選擇單株抗體之選擇係藉由以下所表示之酶免疫測定法之結合分析、及Biacore之kinetics(動力學）分析來進行。除了該等方法以外，亦可藉由公知之方法（The Prostate, 67，1163 (2007))，藉由鑑定抗體之標靶抗原而選擇。 (6-a)結合分析作為抗原，係使用將（1)中所得之包含編碼Trop-2之 cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等而獲得之基因導入細胞、重組蛋白質、或由人類組織獲得之純化多肽或部分肽等。於抗原為部分肽時，製作與BSA或KLH等載體蛋白質之結合體，並加以使用。將抗原分注於96孔板等板進行固相化後，分注作為一次抗體的血清、融合瘤之培養上清液或純化單株抗體等被驗物質，並使其反應。藉由PBS或PBS-Tween等充分清洗後，分注作為二次抗體的經生物素、酶、化學發光物質或 156880.doc -71 - 201204387 放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體並使其反應。藉由PBS-Tween充分清洗後，進行與二次抗體之標記物質相對應之反應，而選擇對免疫原進行特異性反應之單株抗體。又，與本發明之單株抗體競爭而結合於Tr〇p_2之單株抗體，可藉由在上述結合分析系中添加被檢抗體使其反應而取得。即藉由篩選在添加被檢抗體時抑制單株抗體結合之抗體，而可於Trop-2之細胞外區域之結合中取得與所取得之單株抗體競爭的單株抗體。進而，本發明之單株抗體所識別之抗原決定位、及結合於該抗原決定位之抗體可藉由以下方式取得：鑑定上述結合釦析系中所取得之抗體的抗原決定位’製作經鑑定之抗原決定位之部分的合成肽、或模擬抗原決定位之立體結構之合成狀等，並進行免疫。 (6-b) Biacore之動力學分析使用Biacore T100測定抗原與被驗物間結合時之動力學，藉由設備附屬之分析軟體分析該結果。藉由胺偶合法將抗小鼠IgG抗體固定於感測片CM5後，流過融合瘤培養上清液或純化單株抗體等被驗物質，使其適當量結合，進而流過濃度已知之複數濃度之抗原，測定結合及解離。根據所得之資料，使用設備附屬之軟體，藉由1:丨結合模型進行動力學分析’取得各種參數。或者藉由例如胺偶合法將人類Trop-2固定於感測片上後，流過濃度已知之複數濃度之純化單株抗體’測定結合及解離。使用設備附屬 156880.doc •72· 201204387 之軟體對所得之資料進行二價結合模裂之動力學分析’而取得各種參數。 2.基因重組抗體之製作基因重組抗體之製作例，以下表承人類型嵌合抗體及人類型CDR移植抗體之製作方法。 (1)基因重組抗體表現用載體之構築基因重組抗體表現用載體係併入有編碼人類抗體之CH 及CL之DNA的動物細胞用表現載體，可藉由於動物細胞用表現載體中分別選殖編碼人類抗雜之CH&CL2DNA而構築。人類抗體之C區域可使用任意的人類抗體2CHACL。例如使用人類抗體之γΐ亞類之CH及κ類之<：1^等。編碼人類抗體之CH及CL之DNA係使用cDNA，亦可使用包含外顯子與内含子之染色體DNA。若為於動物細胞用表現載體中可併入編碼人類抗體之C 區域的基因並表現者，則可使用任意者。例如可使用： pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)] ' pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)] ' pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]、pKCR [Proc. Natl· Acad. Sci. USA，78，1527 (1981)]、pSGlbd2-4 [Cytotechnol·，4，173 (1990)]、或 pSElUKlSedl-3 [Cytotechnol·，13, 79 (1993)]等。動物細胞用表現載體中啟動子與促進子例如使用： SV40 之初始啟動子[J. Biochem·，101, 1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun.， -73· 156880.doc 201204387 149，960 (1987)]、或免疫球蛋白η鏈之啟動子[Cell，41， 479 (1985)]與促進子[Cell，33, 717 (1983)]等。至於基因重組抗體表現用載體，就基因重組抗體表現載體之構築的容易性、導入至動物細胞之容易性、動物細胞内之抗體Η鍵及L鍵之表現量平衡較均衡等方面而言，使用抗體Η鏈及L鏈存在於同一載體上之類型（串聯型）的基因重組抗體表現用載體[J. Immunol. Methods，167，271 (1994)] ’亦可使用抗體η鏈及L鏈存在於不同載體上之類型。串聯型之基因重組抗體表現用載體例如使用 pKANTEX93(國際公開第 97/10354 號公報）、PEE18 [Hybridoma，17, 559 (1998)]等。 (2)編碼源自人類以外之動物的抗體之v區域之CDNA的取得及胺基酸序列之分析編碼外人類抗體VH及VL之cDNA之取得及胺基酸序列之分析可藉由以下方式進行。自產生非人類抗體之融合瘤細胞萃取mRNA而合成cDNA。將所合成之cDNA選殖至噬菌體或質體等載體而製作cDNA基因庫》自上述基因庫使用編碼小鼠抗體之C區域部分或V區域部分之DNA作為探針，分別單離具有編碼VH或VL之cDNA 的重組噬菌體或重組質體。分別確定重組噬菌體或重組質體上之目標小鼠抗體VH或VL之全部鹼基序列，由鹼基序列分別判定VH或VL之全部胺基酸序列。製作產生非人類抗體之融合瘤細胞的人類以外之動物係使用小鼠、大白鼠、倉鼠、或兔等，若可製作融合瘤細 156880.doc • 74· 201204387 胞，則亦可使用任意動物》來自融合瘤細胞之全部RNA之製備係使用：硫氰酸胍-三 II 乙酸絶法[Methods in Enzymol·，154，3 (1987)]、或 RNeasy套組（QIAGEN公司製造）等套組等。來自全部RNA之mRNA之製備係使用：寡聚（dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual， Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]、或〇lig〇-dT30<Super> mRNA Purification Kit(純化套組）(TAKARABIO公司製造）等套組等》又，亦可使用Fast Track mRNA分離套組（Invitrogen公司製造）、或QuickPrep mRNA純化套組（Pharmacia公司製造）等套組，由融合瘤細胞製備mRNA。 cDNA之合成及cDNA基因庫之製作係使用公知之方法 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ' Current

Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)]、或 Super Script Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Invitrogen公司製造）、或ZAP_cDNA Synthesis Kit (Stratagene公司製造）等套組等。 cDNA基因庫之製作時，併入以自融合瘤細胞萃取之 mRNA為模板而合成之cDNA的載體若為併入該cDNA之載體，則可使用任意者。例如使用：ZAP Express [Strategies，5, 58 (1992)] ' pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 156880.doc -75- 201204387 17，9494 (1989)]、λΖΑΡΙΙ (Stratagene 公司製造）、 XgtlO、λ—gtll [DNA Cloning : A Practical Approach，I，49 (1985)]、Lambda BlueMid (Clontech 公司製造）、 λΕχΟβΙΙ ' pT7T3-18U (Pharmacia公司製造）、pcD2 [Mol. Cell. Biol.，3，280 (1983)]、或 pUC18 [Gene，33，103 (1985)]等。導入藉由噬菌體或質體載體構築之cDNA基因庫之大腸桿菌若為可導入該cDNA基因庫並表現及維持者，則可使用任意者。例如使用：XLl-Blue MRF' [Strategies，5，81 (1992)]、C600 [Genetics，39, 440 (1954)]、Y1088、Y1090 [Science, 222，778 (1983)]、NM522 [J. Mol. Biol.，166，1 (1983)]、K802 [J· Mol. Biol” 16，118 (1966)]、或 JM105 [Gene，38, 275 (1985)]等。編碼來自cDNA基因庫之非人類抗體VH或VL之cDNA選殖的選擇係使用：使用經同位素或螢光標記之探針的菌落 •雜交法、或嗟菌斑·雜交法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]等。

又，亦可藉由製備引子，將由mRNA合成之cDNA或 cDNA基因庫作為模板，進行Polymerase Chain Reaction(聚合酶鏈反應）法[以下記為PCR法，Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ' Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1，John Wiley & Sons (1987-1997)] ’ 156880.doc -76- 201204387 而製備編碼VH或VL之cDNA。藉由適當的限制酶等切割所選擇之cDNA後，於 pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造）等質體中進行選殖，藉由通常所用之鹼基序列分析方法等確定該cDNA之鹼基序列。鹼基序列分析方法係例如於進行雙去氧法 [Proc. Natl. Acad· Sci. USA，74，5463 (1977)]等反應後，使用 ABIPRISM3700 (PE Biosystems公司製造）或 A, L. F. DNA定序儀（Pharmacia公司製造）等驗基序列自動分析裝置等。根據所確定之鹼基序列分別判定VH及VL之全部胺基酸序列，並與已知之抗體VH及VL之全部胺基酸序列 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較，而分別確認所取得之cDNA是否編碼包含分泌訊號序列之抗體VH及VL 之全部的胺基酸序列。關於包含分泌訊號序列之抗體VH及VL之全部的胺基酸序列，藉由與已知之抗體VH及VL之全部胺基酸序列 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較，而可判定分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可知曉該等所屬之亞群。又，關於VH及VL之各CDR之胺基酸序列，亦可與已知之抗體VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]比較而可發現。 136880.doc -77- 201204387 又，使用所得之VH及VL之全部的胺基酸序列，對例如 SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的資料庫進行BLAST法 [J. Mol. Biol.，215，403 (1990)]等的同源性檢索，而可確認是否VH及VL之全部的胺基酸序列為新穎者。 (3) 人類型嵌合抗體表現載體之構築於（1)中所得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上流，分別選殖分別編碼非人類抗體VH或VL之cDNA，而可構築人類型嵌合抗體表現載體。為了連結編碼非人類抗體VH或VL之cDNA之3’末端側、與人類抗體之CH或CL之5’末端側’而製作以連結部分之鹼基序列編碼適當的胺基酸、且成為適當的限制酶識別序列之方式設計的VH及VL之cDNA。於（1)中所所得之人類型CDR移植抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上流’以該等以適當形態表現之方式分別選殖所製作之VH及VL之cDNA，而構築人類型嵌合抗體表現載體。又，亦可使用於兩端具有適當限制酶之識別序列的合成 DNA，藉由PCR法分別擴增編碼非人類抗體VH或VL之 cDNA，而選殖至（1)中所得之基因重組抗體表現用載體。 (4) 編碼人類型CDR移植抗體之V區域之cDNA之構築編碼人類型CDR移植抗體VH或VL之cDNA可藉由以下方式構築。分別選擇用以移植非人類抗體VH或VL之CDR的胺基酸 156880.doc •78- 201204387 序列之人類抗體VH或VL之FR的胺基酸序列。若所選擇之 FR之胺基酸序列為源自人類抗體者，則可使用任意者。例如使用：Protein Data Bank等資料庫所收錄之人類抗體之FR的胺基酸序列、或人類抗體之FR之各亞群的共通胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]等。為了抑制抗體之結合活性降低，而選擇與原抗體VH或 VL之FR之胺基酸序列的同源性儘可能高（至少60%以上）之 FR的胺基酸序列。繼而，於所選擇之人類抗體VH或VL之FR的胺基酸序列分別移植原抗體之CDR的胺基酸序列，並且分別設計人類型CDR移植抗體VH或VL之胺基酸序列。考慮到抗體之基因之驗基序列中所出現的密碼子之使用頻度[Sequences of

Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]而將所設計之胺基酸序列變換為 DNA序列，而分別設計編碼人類型CDR移植抗體VH或VL 之胺基酸序列的DNA序列。根據所設計之DNA序列，合成包含100鹼基左右之長度的數條合成DNA，使用該等進行PCR反應《此時，根據 PCR反應中之反應效率及可合成之DNA之長度，較佳為分別對VH、VX各設計6條合成DNA »進而藉由於位於兩端之合成DNA之各5'末端導入適當的限制酶之識別序列，而容易將編碼人類塑CDR移植抗體VH或VL之cDNA選殖至（1) 中所得之人類变CDR移植抗體表現用載體。 156880.doc -79· 201204387 PCR反應後，將擴增產物分別選殖至pBluescript SK㈠ (Stratagene公司製造）等質體，藉由與（2)所記載之方法相同的方法確定鹼基序列，而取得所需之具有編碼人類型 CDR移植抗體VH或VL之胺基酸序列的DNA序列之質體。或者，亦可根據所設計之DNA序列，分別將VH全長及 VL全長合成為1條長鏈DNA，使用所合成者代替上述PCR 擴增產物。進而，藉由於合成長鏈DNA之兩端導入適當的限制酶之識別序列，而可容易將編碼人類型CDR移植抗體 VH或VL之cDNA導入至（1)中所得之人類型CDR移植抗體表現用載體。 (5)人類型CDR移植抗體之V區域之胺基酸序列之修飾人類型CDR移植抗體藉由僅將非人類抗體VH及VL之 CDR移植至人類抗體VH及VL之FR，而其抗原結合活性與原非人類抗體相比降低[BIO/TECHNOLOGY，9，266 (1991)]。人類型CDR移植抗體中，於人類抗體VH及VL之FR的胺基酸序列中，維持與直接參與和抗原結合之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及抗體之立體結構，並鑑定與間接參與和抗原結合之胺基酸殘基，藉由將該等胺基酸殘基置換為原非人類抗體之胺基酸殘基，而可使已降低之抗原結合活性上升。為了鑑定與抗原結合活性有關之FR之胺基酸殘基，而使用X射線結晶分析[J. Mol. Biol.，112, 535 (1977)]或計算機建模[Protein Engineering, 7，1501 (1994)]等，藉此可進行 156880.doc -80- 201204387 抗體之立體結構之構築及分析。又，對各抗體製作數種修飾體，反覆研究與各抗原結合活性之相關性，並進行試誤，而可取得具有必需的抗原結合活性之修飾人類型CDR移植抗體。人類抗體VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用修飾用合成DNA進行（4)所記載之PCR反應而修飾。對於PCR反應後之擴增產物，藉由（2)所記載之方法，確定鹼基序列，而確認實施了目標之修飾。 (6) 人類型CDR移植抗體表現載體之構築可於（1)中所得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上流，分別選殖編碼所構築之基因重組抗體VH或VL的cDNA，而構築人類型CDR移植抗體表現載體.。例如構築（4)及（5)中所得之人類型CDR移植抗體VH或VL 時所用的合成DNA中，於位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當的限制酶之識別序列，而於（1)中所得之人類型CDR 移植抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上流，以該等以適當形態表現之方式分別選殖。 (7) 基因重組抗體之一過性表現可使用（3)及（6)中所得之基因重組抗體表現載體、或將該等修飾之表現載體，進行基因重組抗體之一過性表現，而有效地評價所製作之多種類之人類型CDR移植抗體之抗原結合活性。若導入表現載體之宿主細胞為可表現基因重組抗體之宿 156880.doc -81 - 201204387 主細胞，則可使用任意的細胞，例如使用COS-7細胞 [American Type Culture Collection (ATCC)編號：CRL1651] [Methods in Nucleic Acids Res·，CRC press, 283 (1991)] 〇於COS-7細胞中導入表現載體係使用：DEAE-葡聚糖法 [Methods in Nucleic Acids Res.，CRC press (1991)]、或脂轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等》於表現載體導入後，培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性使用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、單純抗體實驗手冊， Kodansha Scientific (1987)]等進行測定。 (8)穩定地表現基因重組抗體之轉形株之取得與基因重組抗體之製備藉由將（3)及（6)中所得之基因重組抗體表現載體導入至適當的宿主細胞，而可取得穩定地表現基因重組抗體之轉形株。於宿主細胞中導入表現載體係使用電穿孔法[日本專利特開平 2-257891 號公報、Cytotechnology，3，133 (1990)] 等。

若導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任意之細胞。例如使用：中國倉鼠卵巢細胞CHO-K1 (ATCC CCL-61)、DUKXB11 (ATCC CCL-9096)、Pro-5 (ATCC CCL-1781)、CHO-S 156880.doc • 82 _ 201204387 (Life Technologies, Cat #11619)、大白鼠骨髓瘤細胞 YB2/3HL.P2_G11.16Ag.20 (ATCC編號：CRL1662、或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Agl4 (ATCC編號：CRL1581)、小鼠骨髓瘤細胞P3X63-Ag8.653 (ATCC編號：CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因 (Dihydroforate Reductase、以下記為dhfr)缺失之 CHO 細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 4216 (1980)]等。又，亦可使用：參與細胞内糖核苷酸GDP-海藻糖之合成的酶等蛋白質或參與海藻糖之1位α結合於N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端的Ν-乙醯基葡糖胺之6位之糖鏈修飾的酶等蛋白質、或參與細胞内糖核苷酸GDP-海藻糖向高爾基體輸送的蛋白質等之活性降低或缺失的宿主細胞，例如al，6-海藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞（國際公開第 2005/035 586號、國際公開第02/3 1140號）、獲得凝集素耐性之 Lecl3 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)]等。於表現載體導入後，穩定地表現基因重組抗體之轉形株藉由以包含G41 8硫酸鹽（以下記為G418)等藥劑之動物細胞培養用培養基培養而選擇（日本專利特開平2-257891號公報）。動物細胞培養用培養基使用：RPMI1640培養基 (Invitrogen公司製造）、GIT培養基（日本製藥公司製造）、 EX-CELL301培養基（JRH公司製造）、IMDM培養基 (Invitrogen 公司製造）、Hybridoma-SFM培養基（Invitrogen 156880.doc • 83 · 201204387 公司製造）、或於該等培養基中添加了 FBS等各種添加物之培養基等。藉由將所得之轉形株於培養基中培養而使基因重組抗體於培養上清液中表現堆積。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等測定。又，可利用dhfr基因擴增系（曰本專利特開平2-257891號公報）等，而提高轉形株所產生之基因重組抗體之表現量。基因重組抗體係使用蛋白質A-管柱由轉形株之培養上清液進行純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice， Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]。又，亦可將凝膠過濾、離子交換層析及超過濾等蛋白質之純化所用之方法加以組合。經純化之基因重組抗體之Η鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature，227，680 (1970)]、或西方點墨法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、

Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory (1988)]等進行測定0 3.純化單株抗體或該抗體片段之活性評價經純化之本發明之單株抗體或該抗體片段之活性評價可藉由以下方式進行。針對Trop-2表現細胞株之結合活性係使用利用上述l-(6a)記載之結合分析及（6b)記載之Biacore 系統等的表面離體子共振法進行測定。 156880.doc -84- 201204387 又，該結合活性可使用榮光抗體法[Cancer Immunol. Immunother.，36, 373(1993)]等進行測定。針對抗原陽性培養細胞株之CDC活性、或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol. Immunother·，36，373 (1993)]進行測定。 4.控制抗體之效應活性之方法作為控制本發明之單株抗體之效應活性的方法，已知：控制在抗體之固定區域（Fragment, crystallizable、以下記為Fc區域）之第297號的天冬醯胺（Asn)所結合之N結合複合型糖鏈之還原末端所存在的N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc)進行 α-1，6結合之海藻糖（亦稱為核心海藻糖）的量之方法（國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/3 1140號、國際公開第00/61739號）；或藉由改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基而控制之方法等。本發明之單株抗體亦可使用任意方法而控制效應活性。所謂效應活性，係指經由抗體之Fc區域而引起之抗體依賴性之活性，已知抗體依賴性細胞毒殺活性（ADCC活性）、補體依賴性毒殺活性（CDC活性）、或者巨噬菌體或樹狀細胞等吞嗤細胞之抗體依賴性吞嗤性（Antibody-dependent phagocytosis, ADP活性）等。藉由控制於Fc區域上之N-結合型複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡糖胺所附加的海藻糖之含量，而可使抗體之效應活性增加或降低。作為使抗體之Fc區域所結合之N結合複合型糖鏈所附加的海藻糖之含量降低之方法，可藉由 156880.doc -85- 201204387 使用《Μ-海藻糖轉移酶基因缺失之CH〇細胞來表現抗體，而取得未結合海藻糖之抗體。未結合海藻糖之抗體具有高 ADCC活性。另方面作為使抗體之Fc區域所結合之N-結合複合型糖鏈所附加的海藻糖之含量增加之方法，可藉由使用導入了 cxM-海藻糖轉移酶基因之宿主細胞來表現抗體，而取得結合有海藻糖之抗體。結合有海藻糖之抗體具有較未結合海藻糖之抗體更低之ADCC活性。口又，可藉由改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基而使八^^匸活性或CDC活性增加或降⑯。例如可藉由使用$國專利申請公開第2007/0148165號說明書所記載之Fc區域之胺基酸序列，使抗體之CDC活性增加。又，亦可藉由進行美國專利第6,737,056號說明#、美國專利第7,297,775號說明書或美國專利第7,317,091號說明書所記載之胺基酸修飾，而使 ADCC活性或CDC活性增加或降低。進而’藉由組合上述方法而用於一種抗體，而可取得控制了抗體之效應活性的抗體。 5.使用本發明之單株抗體或該抗體片段之疾病的治療方法本發明之單株抗體或該抗體片段可用於治療Trop-2陽性細胞參與之疾病。含有本發明之單株抗體或該抗體片段、或該等之衍生物之治療劑可為僅包含作為有效成分的該抗體或該抗體片段、或該等之衍生物者，通常作為與藥理學上所容許的1 種以上载體一起混合，藉由製劑學之技術領域中公知之方 156880.doc • 86 - 201204387 法所製造之醫藥製劑而提供。作為投予途徑’例如可列舉：經於仅予，以及口腔內氣管内、直腸内、皮下、肌肉内及靜脈内等非經口投予、作為投予形態，例如可列舉：喷霧劑、膠囊劑勘 =、顆粒劑、糖激劑、乳劑、检劑、注射劑、軟膏及貼專。片4 嗯果作為適合於經口投予之製劑，例如可列舉：乳劑劑、膠囊劑、錠劑、散劑、或顆粒劑等。如乳劑或糖衆劑之液體製備物錢用水，絲、山梨糖醇或果糖等糖類1乙二醇或丙二醇等二醇類，芝麻油、撤視油或大且油等油類，斜敍其·田私守田頰對羥基本曱酸酯類等防腐劑草莓香料或薄荷等香料類等作為添加劑而製造。朴膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係、使用乳糖、葡萄糖、蔬糖或甘露醇等賦形劑，澱粉或海藻酸納等崩解劑，硬月匕酸鎂或滑石等潤滑劑1乙稀醇、經基丙基纖維素或明: 等結合劑，脂肪酸酯等界面活性劑或甘油等塑化劑等作為添加劑而製造。作為適合於非經口投予之製劑，例如可列舉注射劑、检劑或喷霧劑等。注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或該兩者之混合物之載體等而製造。检劑係使用可可油脂、氣化脂肪或羧酸等載體而製造。噴霧劑係使用不刺激接受者之口腔及氣管黏膜、且將本發明之單株抗體或該抗體片段製成微細粒子而分散而使吸 156880.doc -87- 201204387 收變得容易之載體等而製造。作為載體，例如使用乳糖或甘油等。又，亦可製造成氣霧劑或乾粉。進而，於上述非經口劑中，亦可添加在適合於經口投予之製劑中作為添加劑而例示之成分。 6.使用本發明之單株抗體或該抗體片段之疾病的診斷方法藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段，檢測或測定 Trop-2或Trop-2表現之細胞，而可診斷與Trop-2關連之疾病。作為與Trop-2關連之疾病之一的癌之診斷例如可藉由以下方式進行Trop-2之檢測或測定。可藉由使用流式細胞儀等免疫學方法檢測患者體内之癌細胞所表現之Tr〇p_2而進行診斷。所謂免疫學方法，係使用實施了標記之抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量之方法。例如使用放射免疫測定法、酶免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方點墨法或物理化學方法等。至於放射免疫測定法，例如於表現抗原或抗原之細胞等中使本發明之單株抗體或該抗體片段反應，進而使實施了放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，藉由閃爍計數器等進行測定。至於酶免疫測定法，例如於表現抗原或抗原之細胞等中使本發明之單株抗體或該抗體片段反應，進而使實施了標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，藉由吸光光度計測定顯色色素。例如使用三明治ELISA法等。作為酶免 156880.doc •88- 201204387 疫測定法中所用之標記體，可使用公知[酶免疫測定法，醫學書院（1987)]之_記，如使用驗性賴酶標記、過氧化物酶標記、螢光素酶標記、或生物素標記等。三明治ELISA法係成固相使抗體結合後.，捕獲作為檢測或測定對象之抗原’使第2抗體與所捕獲之抗原反應之方法。於該ELISA法中，準備識別欲檢測或測定之抗原之抗體或抗體片段，且抗原識別部位不同的2種抗體，其中預先使第1抗體或抗體片段吸附於板（例如96孔板），繼而藉由 FITC等螢光物質、過氧化物酶等酶、或生物素等預先標記第2抗體或抗體片段。於吸附有上述抗體之板上，使自生體内分離的細胞或其破碎液、組織或其破碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水、或眼液等反應後，使經標記之單株抗體或抗體片段反應，進行對應於標記物質之檢測反應。根據分階段稀釋濃度已知之抗原而製作之校正曲線，算出被驗樣品中之抗原濃度。作為三明治ELISA法所用之抗體，可使用多株抗體或單株抗體之任一種，可使用Fab、Fab，、或F(ab)2等抗體片段。作為二明治ELIS A法所用之2種抗體之組合，可為識別不同抗原決定位之單株抗體或抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株抗體或抗體片段之組合。螢光免疫測定法係藉由文獻[1^0110(；1〇1131八1^150(!丨63-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、單純抗體實驗手冊，K〇dansha Scientific (1987)] 156880.doc •89- 201204387 等所記載之方法進行測定。作為螢光免疫測定法所用之標記體，可使用公知[螢光抗體法，SOFT SCIENCE公司 (1983)]之螢光標記。例如使用FITC、或RITC等。發光免疫測定法係藉由文獻[生物發光與化學發光臨床檢査42，廣川書店（1998)]等所記載之方法進行測定。作為發光免疫測定法所用之標記體，巧·列舉公知之發光體標記，使用吖啶酯、咯吩等。至於西方點墨法，係藉由SDS(十二烷基硫酸鈉）_ PAGE(聚丙烯醯胺凝膠）[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]截留抗原或表現抗原之細胞等後，將該凝膠點墨於聚偏二氟乙烯（PVDF)膜或硝基纖維素膜上，使識別抗原之抗體或抗體片段與該膜反應，進而使實施了 FITC等螢光物質、過氧化物酶等酶標記、或生物素標記等之抗小鼠IgG抗體或結合片段反應後，將該標記可視化而測定。以下表示一例。將表現具有序列編號1所表示之胺基酸序列之多肽的細胞或組織溶解，藉由SDS-PAGE法於還原條件下將每泳道之蛋白量為0.1〜30 pg的蛋白質進行電泳。將經電泳之蛋白質轉移至PVDF膜上於包含1〜10% BSA之PBS(以下記為 BSA-PBS)中於室溫下反應30分鐘而進行阻斷操作。此處，使本發明之單株抗體反應，於包含〇.〇5〜0.1%之 Tween-20的PBS(以下記為Tween-PBS)下清洗，於室溫下使經過氧化物酶標記之山羊抗小鼠IgG反應2小時。藉由 Tween-PBS 清洗，使用 ECL Western Blotting Detection 156880.doc -90- 201204387

Reagents (Amersham公司製造）等檢測單株抗體結合之泳道’藉此檢測具有序列編號1所表示之胺基酸序列的多肽。作為西方點墨法之檢測所用之抗體’可使用能與未保持天然型立體結構之多肽結合的抗體。物理化學方法例如藉由使作為抗原的Tr〇p_2與本發明之單株抗體或該抗體片段結合而形成凝集體’從而檢測該凝集體來進行。此外作為物理化學方法，亦可使用毛細管法、一維免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢査法提要’金原出版（1998)]等。至於乳膠免疫比濁法，若使用使抗體或抗原致敏之粒徑〇.1〜1 μπι左右之聚苯乙烯乳膠等載體，藉由相對應之抗原或抗體引起抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，而透射光減少。藉由檢測該變化作為吸光度或積分球濁度而測定被驗樣品中之抗原濃度等。另一方面，表現Tr〇P-2之細胞的檢測或測定可使用公知之免疫學檢測法，較佳為使用免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。免疫沈降法係使表現Trop_2之細胞等與本發明之單株抗體或該抗體片段反應後，於蛋白質G_瓊脂糖等免疫球蛋白中添加具有特異性結合能力之載體而使抗原抗體複合體沈降。或者亦可藉由如以下之方法進行。於ELISA用96孔板上將上述本發明之單株抗體或該抗體片段固相化後，藉由 BSA-PBS進行阻斷。於抗體例如為融合瘤培養上清液等未純化之狀態時，將 156880.doc •91- 201204387 抗小鼠免疫球蛋白、抗大白鼠免疫球蛋白、蛋白質_八或蛋白質-G等預先於ELISA用96孔板上固相化，藉由BSA-PBS 阻斷後，分注融合瘤培養上清液使其結合。繼而，去除 BSA-PBS藉由PBS充分清洗後’使表現Trop-2之細胞或組織之溶解液反應。藉由SDS-PAGE用樣品緩衝液自充分清洗後之板萃取免疫沈降物，並藉由上述西方點墨法進行檢測。免疫細胞染色法或免疫組織染色法係如下之方法：視情況為使抗體之通過性達到良好而藉由界面活性劑或甲醇等對表現抗原之細胞或組織等進行處理後，使其與本發明之單株抗體反應，進而與實施了 FITC等螢光標記、過氧化物酶等酶標記或生物素標記等之抗免疫球蛋白抗體或其結合片段反應後’將該標記可視化，藉由顯微鏡進行放大。又，可使螢光標記之抗體與細胞反應，藉由使用流式細胞儀進行分析之營光抗體染色法[]\1〇110〇1〇11&1八11以130<^68-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、單純抗體實驗手冊，Kodansha Scientific (1987)] 進行檢測。特別是結合於Trop-2之細胞外區域的本發明之單株抗體或該抗體片段可藉由螢光抗體染色法檢測保持天然型立體結構並表現之細胞。又’螢光抗體染色法中，使用FMAT8100HTS系統 (Applied Biosystems公司製造）等時，可不使所形成之抗體-抗原複合體、與未參與抗體-抗原複合體之形成的游離抗體或抗原分離，而可測定抗原量或抗體量。 156880.doc -92· 201204387 實施例以下’藉由實施例具體地說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。 [實施例1] 抗Trop-2小鼠單株抗體之取得 (1) 免疫原之製備自人類前列腺癌確立癌細胞株Pc 1，並用作免疫原。 (2) 動物之免疫與抗體產生細胞之製備將lxlO6個Pci細胞以2週間隔投予5次給Balb/c小鼠，最後投予之3曰後摘出脾臟。將脾臟於RPMI 1640(以下記為 RPMI培養基）中切斷，磨碎進行離心分離（12〇〇 rprn、5分鐘）。於所得之沈澱餾分中添加Tris-氣化銨緩衝液（pH值 7.6)，於37°C下處理1分鐘而去除紅血球。進而將沈澱館分 (細胞餾分）藉由RPMI培養基清洗3次，並用於細胞融合。 (3 )小鼠骨髓瘤細胞之製備將8-氮鳥嘌呤耐性小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8U.l(P3-U1)藉由10%胎牛血清添加RPMI1640 (Invitrogen公司）進行培養，並用作細胞融合之親株。 (4) 腺病毒載體之製備在HI環中具有與IgG有結合性之蛋白質A的Z33基序 (motif)之修飾型類型5腺病毒中導入β_半乳糖苷酶基因，將所得之 Ax3CAZ3-FZ33 [Clin Cancer Res, 12, 3803 (2006)]用於導入至融合瘤。 (5) 融合瘤之製作 156880.doc •93- 201204387 將實施例1 (2)中所得之小鼠脾細胞與實施例1(3)中所得之骨髓瘤細胞以5:1進行混合，並進行離心分離（1200 rpm、5分鐘）。將所得之沈澱餾分之細胞群充分解開後進行攪拌，並歷時約1分鐘緩慢添加聚乙二醇-4000 (PEG-4000) 1 mL，然後於該細胞液中每1分鐘添加數次RPMI培養基1 mL後，添加RPMI培養基使總量為50 mL。將該細胞懸浮液離心分離（900 rpm、5分鐘），將所得之沈澱餾分之細胞緩慢地解開後，於HAT培養基[添加了 10%胎牛血清及 HAT培養基添加劑之MI1640培養基]100 mL中緩慢地懸浮。將該懸浮液以200 μυ孔分注於96孔培養用板上，於 37°C、5% C02之培養箱中，培養至50%融合為止。另一方面，自藉由96孔板培養之Pci細胞去除培養液，添加上述融合瘤之培養上清液。於4°C下培養1小時後，去除培養上清液藉由PBS將細胞清洗2次，以多重感染度 (MOI)為1000之方式添加實施例1(4)中所製作之Ax3CAZ3-FZ33。進而於4°C下培養1小時後，去除病毒液藉由PBS將細胞清洗2次。使用β-半乳糖基因檢測（β-Gal Reporter Gene Assay)，化學發光套組（Roche Diagnostics公司）進行β-半乳糖苷酶報告分析，選擇β-半乳糖苷酶活性較高之孔。對所選擇之孔的細胞重複2次利用極限稀釋法之選殖，而將產生與Pci細胞反應之抗體的融合瘤單離[The Prostate, 67，1163 (2007)卜 (6)抗體之標靶抗原之確定 156880.doc •94- 201204387 藉由公知之方法[The Prostate, 67，1163 (2007)]碟定實施例1 (5)中所確立之融合瘤的標輕抗原，而自融合瘤發現識別Trop-2之抗體KM4097。藉由Iso Strip小鼠單株抗體分型套組（Roche Applied Science公司）將本抗體之分型確定為 IgGl 及 κ 0 [實施例2] 抗Trop-2小鼠抗體AR47A6.4.2之IgGl型嵌合抗體及海藻糖型抗體之製作 (1)源自AR47A6.4.2之人類型嵌合抗體表現載體之構築為了與本發明之抗Trop-2單株抗體之活性比較，而製作已有之抗Trop-2小鼠單株抗體AR47A6.4.2之可變區域、與人類IgGl之Fc區域的嵌合抗體（以下簡記為 CAR47A6.4.2)。根據美國專利第7420040號說明書所揭示之序列資訊，作為編碼AR47A6.4.2之VH及VL之基因，係常規合成將序列編號3之DNA及序列編號4之DNA併入各pZErO-2載體之質體（IDT公司）。對於併入了 AR47A6.4.2之VH之質體，使用ApaI(New England Biolabs公司）及Notl (New England Biolabs公司）進行限制酶處理，取得包含VH之Notl-Apal片段。又，對於併入了 AR47A6.4.2之VL之質體，使用 BsiWI(New England Biolabs公司）及 EcoRI (New England Biolabs公司）進行限制酶處理，取得包含VL之EcoRI-BsiWI片段。另一方面，對於抗體表現載體PKANTEX93，藉由Notl 156880.doc -95- 201204387 及Apal、或EcoRI及BsiWI之2種組合進行限制酶處理。使用高效連接套組（Ligation high)(TOYOBO公司）’連結包含 VH之Notl-Apal 片段及源自 pKANTEX93 之Notl-Apal片段、以及包含VL之EcoRI-BsiWI片段及源自pKANTEX93之 EcoRI-BsiWI片段的2種組合。使用所得之該連結反應液，進行大腸桿菌DH5a株 (TOYOBO公司）之轉形。由轉形選殖體製備質體DNA，取得分另J選殖了編碼AR47A6.4.2之VH或VL之cDNA的 PKANTEX93載體。對於併入了 AR47A6.4.2之VH或VL之各pKANTEX93載體，使用EcoRI及Notl進行限制酶處理，取得併入了 VL之 EcoRI-Notl片段、及併入了 VH之Notl-EcoRI片段。使用高效連接套組（TOYOBO公司）連結所得之2種片段。使用所得之該連結反應液進行大腸桿菌DH5a株 (TOYOBO公司）之轉形。由轉形選殖體製備質體DMA，取得具有編碼AR47A6.4.2之VH及VL之cDNA的抗Trop-2人類型嵌合抗體表現載體》 (2)源自使用動物細胞之AR47A6.4.2之人類型嵌合抗體的表現藉由常法[Antibody Engineering，A Practical Guide，W. H. Freeman and Company (1992)]，將實施例2(1)中所得之抗體表現載體導入至動物細胞株，取得產生抗Trop-2人類型嵌合抗體之轉形株。作為宿主動物細胞株，使用 CHO/DG44細胞株、及基因剔除al，6-海藻糖轉移酶（FUT8) 156880.doc -96- 201204387 基因之CHO/DG44細胞株（以下記為FUT8基因剔除 CHO/DG44細胞株）。 (3) AR47A6.4.2純化嵌合抗體之取得對於實施例（2)中所得之各轉形株之細胞懸浮液，以 3000 rpm、4°C之條件進行20分鐘離心分離，藉此回收培養上清液，進而藉由0.22 μιη孔徑MillexGV濾片（Mmipore 公司）進行過濾滅菌。自所得之培養上清液，使用蛋白質A 大容量樹脂（Millipore公司）管柱將各抗Trop-2人類型嵌合抗體純化。將由源自CHO/DG44細胞株及FUT8基因剔除 CHO/DG44細胞株之各轉形株獲得之抗體分別稱為 CAR47A6.4.2及 CAR47A6.4.2-P。 (4) AR47A6.4.2嵌合抗體之海藻糖含量測定根據國際公開第2002/3 1140號所記載之方法，調查 CAR47A6.4.2及CAR47A6.4.2-P所存在之N結合複合型糖鏈中未結合海藻糖之糖鍵的比例。將其結果示於表1。 [表1] 抗Trop-2抗體之海藻糖含量_ CAR47A6.4.2 100% CAR47A6.4.2-P_0%_ 根據表1所表示之結果，確認到CAR47A6.4.2-P未附加海藻糖。 [實施例3] 抗Trop-2小鼠單株抗體KM4097之抗原結合活性評價 (1) KM4097對使用流式細胞儀（以下記為FCM)之人類Trop- 156880.doc -97- 201204387 2陽性細胞株之反應性將1〜2><105個人類胰腺癌細胞株8\?(：-3、人類乳癌細胞株MCF-7、卵巢癌細胞株CaOV-3及大腸癌細胞株C〇1〇205 懸浮於添加了 1%之BSA (Invitrogen公司）的PBS(以下記為 BSA-PBS)中，使細胞阻斷。然後，藉由BSA-PBS適當稀釋並添加抗Trop-2單株抗體 KM4097，使總量為100 μι。使該等細胞懸浮液於冰上反應60分鐘後，使用BSA-PBS清洗細胞。於該細胞中添加藉由BSA-PBS稀釋製備之FITC標記抗小鼠IgG山羊抗體 (DAKO Japan公司）100 pL，於冰上反應30分鐘。藉由BSA-PBS清洗細胞後，懸浮於PBS中，使用流式細胞儀 (Beckman Coulter公司）測定螢光強度。圖1(a)〜(d)及表2表示使KM4097以10 pg/mL反應時之柱狀圖及平均螢光強度（MFI值）。 [表2] 抗Trop-2單株抗體KM4097之MFI值

BxPC-3 124 CaOV-3 146 MCF-7 92.8 C〇1〇205 54.8 根據圖1(a)〜(d)及表2所表示之結果，確認到KM4097於抗體濃度依賴性方面均與Trop-2陽性細胞株結合。

(2) KM4097對使用Biacore之重組人類Trop-2之結合活性為了以反應速度論分析各抗Trop-2小鼠單株抗體對重組人類Trop-2之結合活性，而使用表面離體子共振法（SPR 156880.doc -98- 201204387 法）進行結合活性測定。再者，亦對作為已有之抗Trop-2單株抗體之 77220 (R&D 公司）及 MOvl6 (Alexis Biomedical 公司）進行分析，作為比較對照。以下操作全部使用Biacore T100 (GE HEALTHCARE BIQSCIENCE公司）進行。使用胺基偶聯（Amine Coupling Kit)(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE公司），使Tetra-His抗體（QIAGEN公司）以達到12000 RU(共振單元）之方式於CM5 感測片（GE HEALTHCARE BIOSCIENCE公司）上固相化。於感測片上捕捉重組Trop-2/Fc/His融合蛋白質（R&D公司）後，以30 pL/min之速度流過自5000 ng/mL起分5個等級稀釋之抗Trop-2抗體，取得各濃度之感測圖》藉由裝置隨附之分析軟體，使用Bivalent Analyte模型進行分析，算出各抗體對於重組人類Trop-2/Fc/His融合蛋白質之結合速度常數及解離速度常數。各抗體之結合速度常數（以下記為ka)、解離速度常數（以下記為kd)及解離常數KD (kd/ka)示於表3(2次之實驗的平均值）。 [表3]

Kd (1/Ms) Ka (1/s) Κ〇(ηΜ) KM4097 3.89x10s Ι.ΟΙχΗΓ4 0.261 77220 5.55x10s ό.ΙΟχΙΟ-4 1.10 MOvl6 1.83x10s 1.84X10-4 0.929 如表3所示般 ’ KM4097顯示比已有抗體高之親和。 (3)使用FCM之抗Trop-2單株抗體間之競爭活性評價

將卜2χ105個人類胰腺癌細胞株BxPC-3懸浮於BSA-PBS 156880.doc -99· 201204387 中使細胞阻斷。另一方面，使用BSA-PBS使CAR47A6.4.2 成為0.3 pg/niL之濃度，將KM4097或77220分級稀釋。將所製備之各抗體溶液添加至細胞懸浮液中使總量成為100 pL 〇使該等細胞懸浮液於冰上反應60分鐘後，使用BSA-PBS 清洗細胞。於該細胞中添加藉由BSA-PBS稀釋製備之FITC 標記抗人類IgG山羊抗體（Jackson Immuno reserch Laboratories公司）l〇〇 pL，於冰上反應30分鐘。藉由BSA-PBS清洗細胞後，懸浮於PBS中，使用流式細胞儀 (Beckman Coulter公司）測定螢光強度。圖2表示使KM4097或77220之濃度變化時之顯示 CAR47A6.4.2與BxPC_3細胞結合之平均螢光強度（MFI值）。確認到，77220於濃度依賴性方面會抑制CAR47A6.4.2與細胞結合，另一方面，KM4097並不抑制CAR47A6.4.2與細胞結合。繼而，以與上述相同之方式，藉由BSA-PBS使BxPC-3細胞阻斷。另一方面，使用BSA-PBS，使KM4097或77220為 1 pg/mL之濃度，並且分級稀釋CAR47A6.4.2。將所製備之抗體溶液添加至細胞懸浮液，使總量為100 μί。使該等細胞懸浮液於冰上反應60分鐘後，使用BSA-PBS 清洗細胞。於該細胞中添加藉由BSA-PBS稀釋製備之FITC 標記抗小鼠IgG山羊抗體（DAKO Japan公司）100 pL，於冰上反應30分鐘。藉由BSA-PBS清洗細胞後，懸浮於PBS，使用流式細胞儀（Beckman Coulter公司）測定螢光強度。 156880.doc •100· 201204387 圖3表示使CAR47A6.4.2之濃度變化時之顯示KM4097及 77220與BxPC-3細胞結合之平均螢光強度（MFI值）。如圖3 所示，確認到CAR47A6.4.2並不抑制KM4097與BxPC-3細胞結合。根據以上結果，顯示KM4097識別與CAR47A6.4.2不同的抗原決定位。 (4)使用Trop_2結合ELISA之抗Trop-2單株抗體間之競爭活性評價將2 pg/mL重組人類Trop-2/Fc/His融合蛋白質（R&D公司）以50 pL/孔分注96孔ELISA用板（Greiner公司），於4°C下靜置一晚而固相化。將該板藉由PBS清洗後，以1〇〇 pL/孔添加BSA-PBS，於室溫下靜置1小時而進行阻斷。自該板去除BSA-PBS後，以總量為50 pL/孔分注作為一次抗體的0.3 pg/mL濃度之KM4097(亞類為小鼠IgGl)之 BSA-PBS稀釋溶液、及競爭抗體（小鼠IgGl以外之亞類的抗體）之BSA-PBS分級稀釋溶液，並靜置2小時。將該板藉由0.05%聚氧乙烯（20)山梨糖醇酐單月桂酸酯 [(ICI公司商標Tween 20相當品：和光純藥工業公司）]/ PBS(以下記為Tween-PBS)清洗後，以50 pL/孔添加作為二次抗體的過氧化物酶標記兔抗小鼠IgGl抗體（ZYMED公司），於室溫下靜置1小時。將該板藉由Tween-PBS清洗後’以50 gL/孔添加ABTS [2.2-聯氮二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）銨]基質液[1 mm〇l/L ABTS、0.1 mol/L 檸檬酸緩衝液（pH 值 4.2)、0.1«/。H2〇2]進 156880.doc -101 - 201204387 行顯色，進而以50 μί/孔添加5% SDS(月桂基磺酸鈉 (Sodium Lauryl Sulfate))溶液使顯色反應停止。使用讀板器 Emax (Molecular Devices 公司）測定 OD 415 nm之吸光度。圖4表示使77220之濃度變化時之KM4097與Trop-2/Fc/His融合蛋白質之結合。如圖4所示，確認到77220並不抑制KM4097與Trop-2/Fc/His融合蛋白質之結合。繼而，以與上述實驗相同之方式，於96孔之ELISA用板上將重組人類Trop-2/Fc/His融合蛋白質固相化，藉由PBS 清洗後，藉由BSA-PBS阻斷。於該板上以總量50 μί/孔分注作為一次抗體的0.3 pg/mL濃度之77220(亞類為小鼠 IgG2a)之BSA-PBS稀釋溶液、及競爭抗體（小鼠IgG2a以外之亞類之抗體）之BSA-PBS分級稀釋溶液，並靜置2小時。將該板藉由Tween-PBS清洗後，以50 pL/孔添加作為二次抗體的過氧化物酶標記兔抗小鼠IgG2a抗體（ZYMED公司），於室溫下靜置1小時。將該板藉由Tween-PBS清洗，以50 pL/孔添加ABTS基質液進行顯色，進而以50 gL/孔添加5% SDS溶液使顯色反應停止。使用讀板器Emax (Molecular Devices公司）測定 OD 415 nm之吸光度。圖5表示使KM4097、MOvl6之濃度變化時之77220與 Trop-2/Fc/His嵌合蛋白質之結合。如圖5所示，確認到 ΜΟν16抑制77220與Trop-2/Fc/His嵌合蛋白質之結合，另一方面，ΚΜ4097並不抑制77220與Trop-2/Fc/His嵌合蛋白質之結合。 156880.doc -102- 201204387 根據以上結果可明確，KM4097結合於與77220及MOvl6 不同的抗原決定位。 [實施例4] 編碼抗Trop-2小鼠單株抗體ΚΜ4097之可變區域的cDNA 之單離

(1) 由KM4097產生融合瘤細胞製備mRNA 由實施例1中所取得之融合瘤細胞5 X 1 〇7〜1 X1 〇8個，使用 RN easy迷你套組（QIAGEN 公司）及 OUgotex TM-dT30 <Super>mRNA純化套組（TaKaRa公司）製備KM4097之 mRNA。

(2) KM4097之Η鏈可變區域基因及L鏈可變區域基因之選殖由實施例4(1)中所取得之ΚΜ4097之mRNA，使用SMART RACE cDNA擴增套組（Clontech公司）取得cDNA。將所取得之cDNA作為模板，使用通用引子Amix(上述套組所隨附）、以及對小鼠IgGl為特異性之引子（序列編號5、6)，分別進行PCR，而將各抗體VH之cDNA片段擴增。又，使用小鼠Ig(K)特異性引子（序列編號7、8)代替抗體之各亞類特異性引子進行PCR，而將各抗體VL之cDNA片段擴增。與任一 PCR— 起使用 PTC-200 DNA Engine(BioRad公司），於 94°C下加熱2分鐘後，進行30次之包含94°C下15秒、68°C 下1分鐘之反應循環。藉由瓊脂糖凝膠電泳將所取得之PCR產物展開，取得包含VH之DNA片段及包含VL之DNA片段。繼而，使用 TArget Clone Plus (TOYOBO公司），於所得之各DNA片段 156880.doc -103- 201204387 之兩端附加去氧腺嘌呤後，分別併入至pTA2載體°使用如此所得之載體進行大腸桿菌DH5a株（TOYOBO公司）之轉形，自所得之轉形選殖體萃取質體。所選殖之各PCR產物之鹼基序列的分析係使用BigDye終止循環定序FS預配置反應套組（PE Biosystems公司）及該公司之定序儀ABI PRISM3700進行實施。其結果確認到，分別取得於cDNA 之5,末端存在判定為起始密碼子之ATG序列的包含VH之完全長度cDNA之質體及包含VL之完全長度cDNA之質體。 (3) KM4097可變區域之基因序列之分析將實施例4(2)中所得之質體所具有之KM4097之VH的全部鹼基序列表示為序列編號9，將包含根據該序列判定之訊號序列之VH的全部胺基酸序列表示為序列編號1〇，又，將VL之全部鹼基序列表示為序列編號11，將包含根據該序列判定之訊號序列之VL之全部胺基酸序列表示為序列編號12。. 根據與已知之小鼠抗體之序列資料[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest、US Dept. Health and Human Services (1991)]的比較可明確，經單離之各cDNA 係編碼包含KM4097之分泌訊號序列之可變區域（以下記為 V區域）的完全長度cDNA，進而關於KM4097之Η鏈，係序列編號10所記載之胺基酸序列之第1〜第19號為分泌訊號序列，關於ΚΜ4097之L鏈，係序列編號12所記載之胺基酸序列之第1〜第20號為分泌訊號序列。 156880.doc • 104· 201204387 準而，對KM4097之VH及VL之胺基酸序列的新穎性進行分析。使用 GCG Package (version 9.1、Genetics Computer Group公司）作為序列分析系統，藉由BLASTP法[Nucleic Acids Res.，25, 33 89 (1997)]檢索已有蛋白質之胺基酸序列資料庫。其結果確認到，由於資料庫内未發現與VH、VL 完全一致之胺基酸序列，因此KM4097之VH及VL具有新穎的胺基酸序列。又，藉由將KM4097之VH及VL之CDR與已知抗體之胺基酸序列進行比較而進行鑑定。將KM4097之VHi CDR1、 CDR2及CDR3的胺基酸序列分別示於序列編號13、14及 15，將VL之CDR1、CDR2及CDR3的胺基酸序列分別示於序列編號16、17及18。 [實施例5] KM4097人類型嵌合抗體之製作 (1) KM4097人類型嵌合抗體表現載體之構築本發明中所製作之嵌合抗體係於實施例4(2)中所得之 KM4097之重鏈及輕鏈的各可變區域分別連結人類IgGl之 Fc區域的重鏈固定區域及人類κ型輕鏈固定區域之嵌合抗體。作為方法，係使用抗體表現載體PKANTEX93 '及實施例4(2)中所得之具有VH或VL之各pTA2載體，按以下方式構築KM4097人類型嵌合抗體表現載體。將具有KM4097之VH或VL之pTA2載體作為模板使用100 ng ’使用分別含有l〇xExTaq緩衝液1.5 pL、2.5 mmol/L dNTP 1.2 pL、ExTaq DNA 聚合酶（TaKaRa 公司）1 μΐ^、10 156880.doc •105· 201204387 μηιοΙ/L濃度之對VH或VL為特異性之引子0.75 μί的總量為 15 pL之溶液進行PCR»將ΚΜ4097之VH之引子示於序列編號19及20，將VL之引子示於序列編號21及22。PCR係於 94它下加熱2分鐘後，進行30次之包含94°C下15秒、55°C 下30秒、72°C下1分鐘之反應的反應循環後，於72°C下反應10分鐘而進行》藉由瓊脂糖凝膠電泳將各PCR反應產物展開，取得包含 VH之DNA片段及包含VL之DNA片段。繼而，使用TOPO TA選殖定序套組（Invitrogen公司），將各DNA片段併入至 pCR4-T0P0載體。對於併入有KM4097之VH之質體，使用Apal (New England Biolabs公司）及Notl (New England Biolabs公司）進行限制酶處理，取得包含VH之Notl-Apal片段。又，對於併入有ΚΜ4097之VL之質體，使用BsiWI (New England Biolabs公司）及 EcoRI (New England Biolabs公司）進行限制酶處理，取得包含VL之EcoRI-BsiWI片段。另一方面，對於抗體表現載體pKANTEX93，藉由Notl 及Apal、或EcoRI及BsiWI之2種組合進行限制酶處理。使用高效連接套組（TOYOBO公司），連結包含VH之Notl-Apal 片段及源自？尺八]^丁£又93之>^(^1-八？&1片段、以及包含1^1^之 EcoRI-BsiWI 片段及源自 pKANTEX93 之 EcoRI-BsiWI 片段的2種之組合。使用所得之該連結反應液，進行大腸桿菌DH5(x株 (TOYOBO公司）之轉形。由轉形選殖體製備質體DNA，取 156880.doc •106- 201204387 得分別選殖編碼KM4097之VH或VL之cDNA的ρΚΑΝΤΕΧ93 載體。進而，對於併入有ΚΜ4097之VH或VL之各ρΚΑΝΤΕΧ93 載體，使用EcoRI及Notl進行限制酶處理，取得併入有VL 之EcoRI-Notl片段、及併入有VH之Notl-EcoRI片段。使用高效連接套組（TOYOBO公司）連結所得之2種片段。使用所得之該連結反應液，進行大腸桿菌DH5a株（TOYOBO公司）之轉形。由轉形選殖體製備質體DNA，取得具有編碼 KM4097之VH及VL之cDNA的抗Trop-2人類型嵌合抗體表現載體。 (2) 使用動物細胞之KM4097人類型嵌合抗體之取得以與實施例2相同之方式，將實施例5(1)中所得之抗 Trop-2嵌合抗體表現載體導入至CHO/DG44細胞株及FUT8 基因剔除CHO/DG44細胞株，自所得之各轉形株分別取得人類型嵌合抗體KM4590及KM4591。 (3) KM4097嵌合抗體之海藻糖含量測定根據國際公開第2002/3 1140號所記載之方法，調查 KM4590及KM4591所存在之N-結合複合型糖鏈中未結合海藻糖之糖鏈的比例。其結果示於表4。 [表4] 抗Trop-2抗體之海藻糖含量_ KM4590 100% KM4591_0%_ 根據表4所表示之結果可確認，實施例5(2)中所製作之 156880.doc -107- 201204387 人類型嵌合抗體KM4591未附加海藻糖。 [實施例6] 抗Trop-2人類型嵌合抗體KM4590及KM4591之活性評價對實施例5中所得之KM4590及KM4591、以及實施例2中所得之CAR47A6.4.2及CAR47A6.4.2-P進行活性評價。 (1)藉由Biacore之抗Trop-2人類型嵌合抗體與重組人類 Trop-2之結合活性評價以與實施例3相同之方式，評價KM4591、CAR47A6.4.2-P與人類Trop-2/Fc/His融合蛋白質（R&D公司）之親和性。各抗體之ka、kd及KD(kd/ka)示於表5(2次之實驗的平均值）。 [表5] _kd(l/Ms)_ka(I/s)_Kp(nM) KM4591 4.16x10s 5.8〇χ10'5 0.143 CAR47A6.4.2-P_2.21x10s_2.18x1ο-4_L〇l_ 如表5所示，KM4591表現出比CAR47A6.4.2-P高之親和。 (2)抗Trop-2人類型嵌合抗體對於人類癌細胞株之ADCC 活性之評價根據以下所表示之方法測定對於人類癌細胞株之 KM4590、及 CAR47A6.4.2-1 之 ADCC 活性。 (2)-1標靶細胞懸浮液之製備藉由PBS清洗人類癌細胞株MCF-7、C〇1〇205後，藉由包含5%胎牛血清（FBS)(Invitrogen公司）之不含盼紅之 156880.doc • 108 - 201204387 RPMI1640培養基（Invitrogen公司）（以下記為ADCC用培養基）進行清洗，藉由該培養基調整至最佳細胞密度而製成標細胞懸浮液。 (2)-2效應細胞懸浮液之製備藉由以下所表示之方法，自正常人末梢血分離末楷血單細胞（Peripheral blood mononuclear cell : PBMC)。使用添加了肝素鈉注（味之素公司）0.5 mL之注射器，自正常人採集正常人末梢血50 mL。於所採集之末梢血中添加同量生理鹽水（大塚製藥）進行稀釋並充分攪拌。於15 mL管（Greiner公司）中各分注了 4.5 mL之 Lymphoprep (Axis-Shield公司）上，將10 mL稀釋末梢血靜置重層，以2000 rpm、製動解除、室溫之條件離心分離20 分鏵，將單細胞層分離。使用ADCC用培養基將如此所得之單細胞餾分清洗2次，藉由該培養基調整至最佳細胞密度而製成效應細胞懸浮液。 (2)-3 ADCC活性之測定於96孔U底板（FALCON公司）之各孔中，各分注50 μί之將各抗體自3 pg/mL分級稀釋10倍之抗體溶液後，繼而以 lxlO4個/50 μυ孔分注（2)-1中所製備之標靶細胞懸浮液，最後以2.5xlO5個/50 μΐ^/孔分注（2)-2中所製備之效應細胞懸浮液，使總量為150 pL，並於37°C下反應4小時。使本體系中之效應細胞（E)與標靶細胞（T)之比設為25:1。反應後，使用LDH毒殺試驗（Cytotoxic Test)(和光純藥公司）測定各培養上清液之顯色。 156880.doc -109· 201204387 ADCC活性藉由下式而求得。將其結果示於圖6(a)及 (b)、圖 7(a)及（b)、圖 8(a)及（b)以及圖 9(a)及（b)。 (式） ADCC活性（％)={([檢體之吸光度]-[標靶細胞自然游離之吸光度]-[效應細胞自然游離之吸光度])/([標靶細胞全游離之吸光度]-[標靶細胞自然游離之吸光度])}χ 1〇〇如圖6(a)及（b)以及圖7(a)及（b)所示，ΚΜ4590對於人類癌細胞株MCF-7、C〇1〇205表現出ADCC活性，其活性高於已有之抗Trop-2人類型嵌合抗體CAR47A6.4.2。進而，如圖8(a)及（b)以及圖9(a)及（b)所示，KM4591對於人類癌細胞株MCF-7、C〇1〇205具有高於KM4590之ADCC活性。 (3) BxPC-3細胞株異位移植小鼠之抗Trop-2人類型嵌合抗體之抗腫瘤活性的評價藉由PBS將BxPC-3細胞調整為5xl07個/mL之密度，注入 100 pL至6週齡雄性SCID小鼠（CLEA Japan)之右腋下。6日後測定腫瘤徑，以各群之平均腫瘤體積[以長徑x(短徑）2x〇.5之方式計算]為100 mm3之方式進行分群（各群6 頭）。將PBS 或抗 Trop-2 嵌合抗體（KM4591 或CAR47A6.4.2-P)—週2次投予4週而評價抗腫瘤活性。將其結果示於圖10。如圖10所示，評價之結果係 KM4591表現出顯著的抗腫瘤活性，其活性高於 CAR47A6.4.2-P。 (4) C〇1〇205細胞株異位移植小鼠之抗Trop-2嵌合抗體之抗腫瘤活性的評價 156880.doc -110- 201204387 藉由PBS將C〇1〇205細胞調整為5xl07個/mL之密度，注入100 μΐ^至5週齡雄性SCID小鼠（CLEA Japan)之右腋下。5 日後測定腫瘤徑，以各群之平均腫瘤體積[以長徑x(短徑）2χ〇·5之方式計算]為100 mm3之方式進行分群（各群5 頭）。將PBS 或抗 Trop-2 嵌合抗體（KM4591 或CAR47A6.4.2-P)—週2次投予4週而評價抗腫瘤活性。其結果示於圖11。如圖11所示，評價之結果係KM4591 表現出顯著之抗腫瘤活性，其活性高於CAR47A6.4.2-P。 [實施例7] 抗Trop-2人類型嵌合抗體KM4590之抗原決定位分析 (1)對於Trop-2結合ELIS A之各種抗Trop-2單株抗體之競爭活性評價向96孔ELISA用板（Greiner公司）上，以50 μί/孔分注2 pg/mL之重組人類Trop-2/Fc/His嵌合蛋白質（R&D公司製造），於4°C下靜置一晚使其吸附。藉由PBS將該板清洗後，以100 pL/孔添加BSA-PBS，於室溫下靜置1小時而進行活性基之阻斷。然後，自該板去除BSA-PBS，以50 pL/孔分注作為一次抗體的0.3 pg/mL濃度之各種小鼠抗Trop-2抗體[77720(R& D 公司）、MOvl6 (ALEXIS BIOCHEMICALS 公司）、 MM0588-49D6 (Angio-Proteomie公司）、YY-01 (Santa Cruz 公司）或 162-46 (BD Pharmigen 公司）]之 BSA-PBS 稀釋溶液、及競爭嵌合抗體（KM4590或CAR47A6.4.2)之分級稀釋溶液，並靜置2小時。 156880.doc 201204387 藉由Tween-PBS清洗該板後，以50 μΐ^/孔添加作為二次抗體的過氧化物酶標記兔抗人類1gG抗體（American Qualex 公司）於室溫下靜置1小時。藉由Tween_PBS清洗該板’以 50 μΐ^/孔添加ABTS[2.2-聯氮二（3-乙基苯并噻唑-6_磺酸）銨]基質液[1 mmol/L ABTS、〇·1 mol/L檸檬酸緩衝液（pH值 4.2)、0.1% H202]進行顯色，以50 pL/孔添加5% SDS(月桂基磺酸鈉）溶液使顯色反應停止。使用讀板器Emax (Molecular Devices公司）測定該板之〇D 415 nm之吸光度。於圖14(a)〜（f)表示使KM4590及CAR47A6.4.2之濃度變化時之各種抗Trop-2小鼠單株抗體與Trop-2/Fc/His嵌合蛋白質之結合。如圖14(a)〜（f)所示可確認’ KM4097以外之抗Trop-2小鼠單株抗體與Trop-2/Fc/His嵌合蛋白質之結合，不會受到 KM4590抑制。另一方面可確認，KM4097以外之抗Trop-2 小鼠單株抗體與Trop-2/Fc/His嵌合蛋白質之結合受到 CAR47A6.4.2抑制》根據該等結果顯示，KM4097及其嵌合抗體之KM4590識別其他與抗Trop-2抗體不同的抗原決定位。 (2) Trop-2細胞外區域蛋白質及該區域之缺失體蛋白質之製作為了鑑定本發明之抗Trop-2單株抗體之抗原決定位，而製作Trop-2蛋白質之細胞外區域及該區域之缺失體[圖 15]。首先，製作於INPEP4載體（Biogen-IDEC公司）插入自 5'末端側向3'末端側依序配置FLAG標籤及編碼Fc區域之 156880.doc 112 201204387 DNA的 DNA(序列編號 39)之載體（INPEP4-FLAG-FC)。繼而，於INPEP4-FLAG-FC載體之FLAG標籤序列之5,末端側插入編碼於Trop-2之細胞外區域附加分泌訊號序列之蛋白質的DNA(序列編號40)，藉此構築Trop-2細胞外區域與FLAG標籤及Fc之融合蛋白質（記為Trop-2/FLAG/Fc)之表現載體。同樣，關於編碼僅Trop-2細胞外區域側之區域I缺失、區域I及區域II缺失、區域I及II之全長以及區域III之一部分缺失的3種蛋白質（分別記為突變體A、突變體B、突變體C) 之DNA(序列編號41、42、43)，亦構築FLAG標籤及Fc區域之融合蛋白質之表現載體。將Trop-2/FLAG/Fc、突變體 A、突變體B及突變體C之胺基酸序列示於序列編號44-47 ° 將HEK293F作為宿主細胞，使用FreeStyleTM 293基因導入系統（invitrogen公司），進行基因導入及蛋白質之表現。首先，將表現載體質體30 pg與OPTI-MEM I (invitrogen公司）混合製備為計 900 μ!>。繼而，將293fectinTM (invitrogen 公司）30 pL與OPTI-MEM I混合製備為計900 pL，並於室溫下靜置5分鐘。將該293fectinTM溶液與上述表現載體質體溶液混合，於室溫下靜置20〜30分鐘。藉由FreeStyleTM 293 SFM (invitrogen公司），對於以1.1 X 106 cells/mL之密度培養之 HEK293F細胞30 mL，添加上述質體混合液在總量後，於 37°C、5% C02、125 rpm之設定條件下進行4日浮動旋轉培 156880.doc -113- 201204387 養。培養後，將細胞懸浮液於3000 rpm、4°C之條件下供於 20分鐘之離心分離而回收培養上清液，並通過0.22 μιη孔徑Millex GV濾片進行過濾滅菌。於 Econo_Pac 管柱（BIO-RAD 公司）中填充 MabSelect (GE Healthcare公司）1 mL，將藉由上述操作進行回收之培養上清液通塔至管柱後，藉由PBS 10 mL進行清洗。清洗後，使用0_lmol/L檸檬酸緩衝液（pH值3.4)進行吸附於載體之抗體的洗脫》藉由1 mol/L Tris緩衝液（pH值8.5)中和洗脫餾分。繼而，將藉由SDS-PAGE分析確認到目標蛋白質洗脫之餾分合二為一，藉由 Amicon Ultra-10K (Millipore 公司）將該館分濃縮後，使用0.22 μιη孔徑Millex GV (MILLIPORE公司）進行滅菌過濾。使用吸光光度計（ThermoScientific公司製造之Nanodrop 2000)測定上述濃縮溶液之280 nm之吸光度 (OD 280 nm)，並算出各純化蛋白質之濃度。 (3)西方點墨法之抗原決定位分析將本實施例（2)中所製作之Trop-2/FLAG/Fc、突變體A、突變體B及突變體C之各蛋白質於還原狀態（將樣品於1〇 mmol/L DTT存在下於95°C下處理5分鐘）或非遠原狀態（於 DTT非存在下於室溫下處理10分鐘）下藉由SDS-PAGE展開後，使用半乾法，將200 mA之電流流通1小時’而將凝膠内之蛋白質轉錄至聚偏二氟乙烯（PVDF)膜上。藉由包含5% BSA之PBS將該PVDF膜於室溫下進行1小時 156880.doc -114· 201204387 阻斷後，浸潰於由包含0.1°/。BSA之TBST [將Nacalai Tesque公司製造之Tris緩衝生理鹽水（濃縮1〇倍）(pH值7 稀釋至10倍，進而添加0.1%濃度之0.05%聚氧乙稀（2〇)山梨糖醇酐單月桂酸酯（ICI公司商標之Tween 20相當品：和光純藥工業公司）之水溶液]製備之一次抗液中，於室溫下反應1小時或於4°C下反應一晚。將該PVDF膜藉由TBST清洗3〜4次後，將由包含〇 1% BSA之TBST製備之過氧化物酶標記山羊抗小鼠igG抗體 (GE Healthcare公司）或過氧化物酶標記山羊抗人類κ鏈抗體（Southern Biotech公司）作為二次抗體，於室溫下反應1 小時。將該PVDF膜藉由TBST清洗3〜4次後，添加 SuperSignal West Pico化學發光底物（ThermoScientiHc 公司），進行化學發光反應。使用成像系統LAS4000mini(富士膠片公司）取得發光像。另一方面，為了評價PVDF膜上之各FLAG/Fc融合蛋白質之量，亦實施如下實驗，不進行一次抗體反應，而使識別人類Fc之過氧化物酶標記兔抗人類IgG抗體（American Qualex公司）於室溫下反應1小時後’進行化學發光反應。圖16(a)表示於西方點墨法中使作為一次抗體的KM4590 反應之實驗結果。又，圖16〇)表示於西方點墨法中使作為一次抗體的CAR47A6.4.2反應之實驗結果° 如圖16(a)所示，於非還原狀態及還原狀態之任一狀態下，KM4590對於使Trop-2之區域1缺失之突變體A及突變體B之反應性均降低。另一方面’如圖16(b)所示’ 156880.doc -115- 201204387 CAR47A6.4.2僅對於缺失至區域III之一部分的突變體C之反應性降低。根據以上結果顯示，嵌合抗體KM4590及該小鼠單株抗體KM4097之抗原決定位存在於區域I，CAR47A6.4.2之抗原決定位存在於區域ΠΙ。繼而，將KM4590及CAR47A6.4.2對Trop-2/FLAG/Fc蛋白質之非還原狀態與還原狀態之反應性進行比較。圖17(a)及 (b)以及圖18表示實驗結果。自藉由西方點墨法分別使KM4590及CAR47A6.4.2反應之 PVDF 膜[圖 17(a)]，使用 RestoreTM PLUS Western Blot Stripping Buffer(西方點墨法抗體去除試劑） (ThermoScientific公司）剝離抗體，進行上述阻斷後，與過氧化物酶標記兔抗人類IgG抗體反應，藉此評價PVDF膜上之Trop-2/FLAG/Fc蛋白質之量。其結果如圖17(b)所示，於兩種PVDF膜間，所含之Trop-2/FLAG/Fc蛋白質之量未發現較大差。又，顯示KM4590對還原狀態之Trop-2/FLAG/Fc蛋白質之反應性非常弱，相對於此，CAR47A6.4.2對還原狀態之反應性較強。圖18表示使用圖像分析軟體Multi Gauge Ver3.0(富士膠片公司）對泳道之訊號強度進行分析並數值化之結果。根據以上所述顯示，KM4590識別Trop-2蛋白質之區域I内包含二硫鍵之結構。根據以上結果可明確，KM4590及該小鼠抗體KM4097係識別Trop-2之細胞外區域中與已有抗體不同的抗原決定位 156880.doc -116- 201204387 即區域i的抗體。 [實施例8] 抗Trop-2人類化抗體之製作 (1) KM4097人類化抗體VH及VL之胺基酸序列之設計按以下方式設計KM4097人類化抗體VH之胺基酸序列。按以下方式選擇適於KM4097VH之CDR1〜3之胺基酸序列 (序列編號13〜15)移植的人類抗體VH之FR之胺基酸序列。

Kabat等人將已知之各種人類抗體VH根據其胺基酸序列之同源性分類成亞群（HSG I〜III)，並對該等每個亞群報告共通序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept· Health and Human Services (1991)]。因此’實施人類抗體VH之亞群I-III之共通序列的FR之胺基酸序列與 KM4097VH之FR之胺基酸序列的同源性檢索。檢索同源性之結果係HSG I、HSG II、及HSG III之同源性分別為 74.7%、55_2〇/〇、59.8%。因此 ’ KM4097VH之FR 之胺基酸序列與亞群I具有最高之同源性。根據以上結果，於人類抗體VH之亞群I之共通序列的FR 之胺基酸序列之適當位置，移植KM4097VH之CDR之胺基酸序列（序列編號13〜15)。如此，設計序列編號24所表示之抗Trop-2KM4097人類化抗體VH之胺基酸序列 KM4097HV0。繼而，按以下方式設計KM4097人類化抗體VL之胺基酸序列。按以下方式選擇使KM4097VL之CDR1-3之胺基酸序列（序列編號16〜18)適於移植的人類抗體VL之FR之胺基酸 156880.doc -117- 201204387 序列。

Kabat等人將已知的各種人類抗體VL根據其胺基酸序列之同源性分類成亞群（HSG I-IV)，並對該等每個亞群報告共通序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest， US Dept. Health and Human Services (1991)]。因此，實施人類抗體VL之亞群I〜IV之共通序列的FR之胺基酸序列與 KM4097VL之FR之胺基酸序列的同源性檢索。檢索同源性之結果係HSG I、HSG II、HSG III、及HSG IV之同源性分別為 78.8%、73.8%、72.5%、83.8%。因此，KM4097VL之FR之胺基酸序列與亞群IV具有最高之同源性。根據以上結果，於人類抗體VL之亞群IV之共通序列的 FR之胺基酸序列之適當位置，移植KM4097VL之CDR之胺基酸序列（序列編號16〜18)。但，KM4097VL之胺基酸序列 (序列編號12)中之第110號之Leu於Kabat等人所列舉之人類抗體FR之胺基酸序列的相當之部位中並非使用頻度最高之胺基酸殘基，而是以相對較高之頻度使用之胺基酸殘基，因此使用於上述KM4097VL之胺基酸序列中所發現之胺基酸殘基。如此，設計抗Trop-2KM4097人類化抗體VL之胺基酸序列KM4097LV0(序列編號26)。上述所設計之KM4097人類化抗體VH之胺基酸序列 KM4097HV0、及VL之胺基酸序列KM4097LV0，係於所選擇之人類抗體之FR的胺基酸序列僅移植作為小鼠單株抗體 156880.doc •118- 201204387 之KM4097之CDR的胺基酸序列之序列。但是，通常製作人類化抗體時，僅向人類抗體之FR移植小鼠抗體之CDR之胺基酸序列時，多少情況是結合活性降低。為了避免此種結合活性降低，而於CDR之胺基酸序列移植之同時，改變人類抗體與小鼠抗體中不同的FR之胺基酸殘基中認為對結合活性造成影響之胺基酸殘基。因此，於本實施例中，按以下方式鑑定認為對結合活性造成影響之FR之胺基酸殘基，並進行修飾。首先，使用計算機建模之方法構築包含上述所設計之 KM4097人類化抗體VH之胺基酸序列KM4097HV0、及VL 之胺基酸序列KM4097LV0之抗體V區域（以下表示為 HV0LV0)之立體結構。於立體結構座標製作及立體結構之表示時，使用 Discovery Studio (Accelrys 公司）。又， KM4097之V區域之立體結構的計算機模型亦以相同方式進行構築。進而，於HV0LV0之VH及VL之FR的胺基酸序列中，選擇與KM4097不同的胺基酸殘基，製作修飾成KM4097之胺基酸殘基的胺基酸序列，以相同之方式構築立體結構模型。將該等所製作之KM4097、HV0LV0及修飾體之各V區域的立體結構進行比較，而鑑定預測對抗體之結合活性造成影響的胺基酸殘基。其結果，於HV0LV0之FR之胺基酸殘基中使抗原結合部位之立體結構發生變化，作為認為對抗體之結合活性造成影響之胺基酸殘基， 156880.doc -119- 201204387 於KM4097HV0中，選擇第9號之Ala、第12號之Lys、第 20號之Va卜第38號之Arg、第48號之Met、第67號之Arg、第68號之Va卜第70號之lie、第95號之Tyr、及第112號之

Val，於KM4097LV0中，選擇第15號之Leu、第19號之

Ala、第21號之lie '及第84號之Leu。將該等所選擇之胺基酸殘基中至少1種以上胺基酸序列修飾成KM4097之相同部位所存在之胺基酸殘基’而設計具有各種修飾之人類化抗體VH及VL。具體而言，對於VH，導入序列編號24之胺基酸序列之將第9號之Ala置換為Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第 48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68 號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸修飾中的至少1種修飾。又，對於VL，導入序列編號26之胺基酸序列之將第15號之Leu置換為Ala、將第19號之Ala置換為Va卜將第21號之lie置換為Met、及將第84號之Leu置換為Val之胺基酸修飾中的至少1種修飾。作為HV0LV0之FR所存在的改變了至少1種胺基酸殘基之KM4097人類化抗體之抗體V區域，分別設計： HV0LV0、HV0LV2、HV0LV3a、HV0LV3b、HV0LV4、 HV2LV0、HV2LV2、HV2LV3a、HV2LV3b、HV2LV4、 HV3aLV0、HV3aLV2、HV3aLV3a、HV3aLV3b、HV3aLV4、 •120- 156880.doc 201204387 HV3bLV0 、 HV3bLV2 、 HV3bLV3a 、 HV3bLV3b 、 HV3bLV4、HV4LV0、HV4LV2、HV4LV3a、HV4LV3b、 HV4LV4、HV5aLV0、HV5aLV2、HV5aLV3a、HV5aLV3b、 HV5aLV4、HV5bLV0、HV5bLV2、HV5bLV3a、HV5bLV3b、 HV5bLV4 、 HV5cLV0 、 HV5cLV2 、 HV5cLV3a 、 HV5cLV3b、HV5cLV4、HV6LV0、HV6LV2、HV6LV3a、 HV6LV3b、HV6LV4、HV8LV0、HV8LV2、HV8LV3a、 HV8LV3b、HV8LV4、HV9LV0、HV9LV2、HV9LV3a、 HV9LV3b、HV9LV4、HV10LV0、HV10LV2、HV10LV3a、 HV10LV3b、及HV10LV4。將 H鏈可變區域 HV2、HV3a、HV3b、HV4、HV5a、 HV5b、HV5c、HV6、HV8、HV9、HV10及 L鍵可變區域 LV2、LV3a、LV3b、LV4之胺基酸序列分別示於圖12及圖 13 ° (2) KM4097人類化抗體VH及VL之cDNA序列之設計編碼KM4097人類化抗體之可變區域之胺基酸序列的 DNA，於利用編碼KM4097VH及KM4097VL之胺基酸序列之DNA(序列編號23、25)中所用的密碼子來設計，並進行胺基酸修飾時，使用哺乳動物細胞中以高頻度使用之密碼子進行設計而分別製作。使用該等DNA序列，進行抗體表現載體之構築及人類化抗體之表現。 (3) 編碼KM4097人類化抗體VH之cDNA之構築藉由全合成製作編碼本實施例U)中所設計之KM4097人類化抗體VH之胺基酸序列KM4097HV0(序列編號24)、及 156880.doc • 121 - 201204387 藉由本實施例（1)之方法而設計之圖12所示的HV3a(序列編號28)、HV4(序列編號30)、HV5(序列編號32)、HV10(序列編號34)之各cDNA(序列編號23、27、29、31、33)。 (4) 編碼KM4〇97人類化抗體VL之cDNA之構築藉由全合成製作編碼本實施例（1)中所設計2KM4097人類化抗體VL之胺基酸序列LV0(序列編號26)、及藉由本實施例（1)之方法而設計之圖13所示的LV2(序列編號36)、 LV4(序列編號38)之各cDNA(序列編號25、35、37)。 (5) KM4097人類化抗體表現載體之構築於國際公開第97/10354號所記載之人類化抗體表現用載體PKANTEX93之適當位置，插入本實施例（3)及（4)中所得之編碼 HV0、HV3a、HV4、HV5、HV10 之任一種之 cDNA、及編碼LV0、LV2、LV4之任一種之cDNA，而構築各種KM4097人類化抗體表現載體。 (6) 使用動物細胞之KM4097人類化抗體之表現本實施例（5)中所構築之動物細胞用抗體表現載體之基因導入，係使用破壞CHO-K1細胞（理化學研究所Cellbank 登錄編號RCB0403)之al，6-海藻糖轉移酶（FUT8)基因之株 (以下記為FUT8基因剔除CHO細胞）》將FUT8基因剔除CHO細胞作為宿主細胞，根據 FreeStyleTM MAX CHO 表現系統（invitrogen 公司）之說明書，進行自基因導入起至抗體之表現。將312.5 pg表現載體質體與〇ptiProTM SFM(invitrogen公司）混合製備為計5 mL 〇 156880.doc -122· 201204387 將312.5 41^之？代€81丫161^]^八乂轉染試劑（11^七〇§611公司）與OptiProTM SFM混合製備為計5 mL。將表現載體質體溶液與上述FreeStyleTM MAX轉染試劑溶液混合，於室溫下靜置10分鐘。於FreeStyleTM CHO表現培養基（invitrogen公司）中以l.OxlO6 cells/mL之密度培養的FUT8基因剔除CHO 細胞250 mL中，添加上述載體溶液之總量後，於37°C、 8% C02、135 rpm之條件下浮動旋轉培養5日〜7日。培養後，將細胞懸浮液於3000 rpm、4°C之條件下供於 20分鐘之離心分離而回收培養上清液，並通過0.22 μηι孔徑Millex GV濾片進行過濾滅菌。 (7) KM4097人類化抗體之純化於0.8 cm徑之管柱中填充MabSelect SuRe (GE Healthcare公司製造）0.5 mL，依序通塔純化水3.0 mL、0.1 Μ擰檬酸緩衝液（pH值3.5)2.0 mL、及150 mM之NaCl、0.2 Μ棚酸鈉酸緩衡液（pH值7.5) 1.5 mL，進行載體之平衡化。繼而，將本實施例（6)中所回收之培養上清液通塔至管柱後，藉由150 mM之NaCl、0_2 Μ硼酸鈉酸緩衝液（pH值7.5)5.0 mL清洗。清洗後，使用0.1 Μ檸檬酸缓衝液（pH值3.5)2.0 mL進行吸附於載體之抗體之洗脫。

洗脫係將每5 00 pL分成4餾分而取得。繼而，進行所得純化餾分之SDS-PAGE分析，匯總確認到抗體之洗脫之餾分，使用150 mM之NaCl、10 mM檸檬酸鈉溶液（pH值 6.0)，於4°C下進行一晝夜透析。透析後，回收抗Trop-2KM4097人類化抗體溶液，使用0.22 μιη孔徑Millex GV 156880.doc • 123· 201204387 (MILLIPORE公司）進行滅菌過濾後，使用吸光光度計 (SHIMADZU UV-1700)測定 280 nm之吸光度（OD 280 nm)，算出各純化KM4097人類化抗體之濃度》根據以上所述，製作抗體VH包含HV0、VL包含LV0之 HV0LV0，抗體VH 包含 HV3a、VL 包含 LV0 之 HV3aLV0，抗體VH包含HV4、VL包含LV0之HV4LV0，抗體VH包含 HV5、VL 包含 LV0 之 HV5LV0，抗體 VH 包含 HV10、VL 包含LV2之HV10LV2，及抗體VH包含HV10、VL包含LV4之 HV10LV4之6種KM4097人類化抗體。 (8) KM4097人類化抗體之海藻糖含量測定根據國際公開第2002/31140號所記載之方法，調查本實施例（7)中所製作之6種KM4097人類化抗體所存在之N-結合複合型糖鏈中未結合海藻糖的糖鏈之比例。其結果可確認，本實施例（7)中所製作之6種KM4097人類化抗體未附加海藻糖^ [實施例9] KM4097人類化抗體之活性評價對實施例5中所得之KM4591、以及實施例8中所得之6種 KM4097 人類化抗醴（HV0LV0、HV3aLV0、HV4LV0、 HV5LV0、HV10LV2、及 HV10LV4)進行活性評價》 (1) KM4097人類化抗體對藉由Biacore之重組人類Trop-2之結合活性評價以與實施例3(2)相同之方式，評價KM4591、以及實施例8中所得之6種KM4097人類化抗體（HV0LV0、 156880.doc •124- 201204387 HV3aLV0、HV4LV0、HV5LV0、HV10LV2、及 HV10LV4) 對人類Trop-2/Fc/His融合蛋白質（R&D公司）之親和性。各抗體之ka、kd及KD(kd/ka)示於表6(2次之實驗的平均值)。 [表6] kd(l/Ms)_ka(l/s)_Κρ(ηΜ) KM4591 3.23 x10s 1.13X10·4 0.36 HV0LV0 3.3〇xl05 Ι.όΟχΙΟ*4 0.53 HV3aLV0 5.06x10s 1.60X10·4 0.30 HV4LV0 3.35x10s 1.26X10·4 0.42 HV5LV0 3.83x10s 1 ·9〇χ1 O'4 0.49 HV10LV2 3.75x10s 1.48X10·4 0.40 HV10LV4 3.42xl05 1.16X10·4 0.37 如表6所示，全部抗Trop-2KM4097人類化抗體 (HV0LV0、HV3aLV0、HV4LV0、HV5LVO、HV10LV2、及 HV10LV4)顯示lxl(T9 Μ以下之較高親和（KD)值。其中5種 KM4097 人類化抗體（HV3aLV0、HV4LV0、HV5LV0、 HV10LV2、及HV10LV4)顯示5xlO·10 Μ以下之較高KD值。 (2)抗Trop-2人類化抗體對人類Trop-2表現細胞株之ADCC 活性之評價 (2)-1標靶細胞懸浮液之製備於pKANTEX93之適當部位插入編碼於人類Trop-2之C末端側附加myc標記及His標記之序列（序列編號48)的DNA(序列編號49)，藉此構築標記附加人類Trop-2表現載體。使用將該表現載體導入至CHO/DG44細胞而獲得之轉形株作為本評價之標靶細胞。藉由PBS清洗標靶細胞後，藉由包含 156880.doc -125- 201204387 5%胎牛血清（FBS)(Invitrogen公司）之不含酚紅之RPMI1640 培養基（Invitrogen公司）（以下記為ADCC用培養基）進行清洗，藉由該培養基調整至最佳細胞密度作為標靶細胞懸浮液。 (2)-2效應細胞懸浮液之製備將自冷動狀態融解之末梢血單細胞[Peripheral blood mononuclear cell (PBMC) : AllCells 公司]懸浮於包含 DNasel (Roche Applied Science公司製造）及 10% FBS 之 RPMI1640培養基中，以1500 rpm離心分離10分鐘。去除上清液後，將細胞懸浮於包含DNase I及10% FBS之 RPMI1640培養基中，於37°C下培養20分鐘。將該懸浮液以1500 rpm離心10分鐘後，去除上清液，進而使用ADCC 用培養基清洗2次。藉由ADCC用培養基將細胞調整至最佳密度，作為效應細胞懸浮液。 (2)-3 ADCC活性之測定於96孔U底板（FALCON公司）之各孔中以50 μΐ^/孔分注自 3 pg/mL分級稀釋1〇倍之各抗體溶液。繼而，以lxlO4個/50 pL/孔分注（2)-1中所製備之標靶細胞懸浮液，進而，以 2.5xlO5個/50 μΐ^/孔分注（2)-2中所製備之效應細胞懸浮液使總量為150 μί/孔後，於37°C下反應24小時》本體系中之效應細胞（E)與標靶細胞（T)之比設為25:1。反應後’使用 LDH毒殺試驗（和光純藥公司）測定各培養上清液之顯色。 ADCC活性藉由下式算出。其結果示於圖19。 (式） 156880.doc • 126- 201204387 ADCC活性（％) = {([檢體之吸光度]•[標靶細胞自然游離之吸光度]-[效應細胞自然游離之吸光度])/([標無細胞全游離之吸光度]-[標靶細胞自然游離之吸光度])}Χ100 如圖19所示’所製作之人類化抗體HV3aLV0、HV4LV0 顯示與KM4591同等程度之ADCC活性。使用特定態樣詳細地說明了本發明，但業者明白只要不脫離本發明之意圖與範圍可進行各種變更及變形。再者本申請案係根據於2010年6月10曰申請之美國臨時申請案 (61/3 5343 0) ’其整體藉由引用而援用。產業上之可利用性根據本發明，可提供如下者：以高親性與人類ΤΓΟρ_2之細胞外區域結合且發揮較高之抗體依賴性細胞毒殺活性

(antibody-dependent cellular cytotoxicity，以下記為 ADCC 活性）、較高之抗腫瘤活性的單株抗體或該抗體片段；產生該抗體之融合瘤；編碼該抗體之DNA ;含有該DNA之載體；導入該載體而獲得之轉形體；使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法；使用抗體或該抗體片段之治療藥及診斷藥。序列表自由内容序列編號1 :人類Trop-2胺基酸序列序列編號2 :人類Trop-2驗基序列序列編號3 : AR47A6.4.2VH鹼基序列序列編號4 : AR47A6.4.2VL鹼基序列序列編號5 :小鼠IgGl引子mGlal驗基序列 156880.doc •127· 201204387 序列編號6:小鼠IgGl引子mGla2鹼基序列序列編號7 :小鼠κ鏈引子Kal鹼基序列序列編號8 :小鼠κ鏈引子Ka2鹼基序列序列編號9 : KM4097VH鹼基序列序列編號10 : KM4097VH胺基酸序列序列編號11 : KM4097VL鹼基序列序列編號12 : KM4097VL胺基酸序列序列編號13 : KM4097VHCDR1胺基酸序列序列編號14 : KM4097VHCDR2胺基酸序列序列編號15 : KM4097VHCDR3胺基酸序列序列編號16 : KM4097VLCDR1胺基酸序列序列編號17 : KM4097VLCDR2胺基酸序列序列編號18 : KM4097VLCDR3胺基酸序列序列編號19 : KM4097嵌合抗體製作用VH鏈擴增前置引子鹼基序列序列編號20 : KM4097嵌合抗體製作用VH鏈擴增反置引子驗基序列序列編號21 : KM4097嵌合抗體製作用VL鏈擴增前置引子鹼基序列序列編號22 : KM4097嵌合抗體製作用VL鏈擴增反置引子鹼基序列序列編號23 : KM4097HV0可變區域鹼基序列序列編號24 : KM4097HV0可變區域胺基酸序列序列編號25 : KM4097LV0可變區域鹼基序列 156880.doc -128- 201204387 序列編號26 : KM4097LV0可變區域胺基酸序列序列編號27 : KM4097HV3a可變區域鹼基序列序列編號28 : KM4097HV3a可變區域胺基酸序列序列編號29 : KM4097HV4可變區域鹼基序列序列編號30 : KM4097HV4可變區域胺基酸序列序列編號31 : KM4097HV5可變區域鹼基序列序列編號32 : KM4097HV5可變區域胺基酸序列序列編號33 : KM4097HV10可變區域鹼基序列序列編號34 : KM4097HV10可變區域胺基酸序列序列編號35 : KM4097LV2可變區域鹼基序列序列編號36 : KM4097LV2可變區域胺基酸序列序列編號37 : KM4097LV4可變區域鹼基序列序列編號38 : KM4097LV4可變區域胺基酸序列序列編號39 : FLAG標籤及Fc之鹼基序列序列編號40 : Trop-2細胞外區域附加有訊號序列之鹼基序列序列編號41:自突變體A去除FLAG標籤及Fc區域之鹼基序列序列編號42 :自突變體B去除FLAG標籤及Fc區域之鹼基序列序列編號43 :自突變體C去除FLAG標籤及Fc區域之鹼基序列序列編號44 : Trop-2/FLAG/Fc胺基酸序列序列編號45 :突變體A胺基酸序列 156880.doc -129- 201204387 序列編號46 :突變體B胺基酸序列序列編號47 :突變體C胺基酸序列序列編號48 :附加C末端標籤之人類Trop-2胺基酸序列序列編號49 :附加C末端標籤之人類Trop-2鹼基序列【圖式簡單說明】圖1(a)表示藉由FCM分析KM4097對人類胰腺癌細胞株 BxPC-3之反應性而獲得之結果。圖1(b)表示藉由FCM分析 KM4097對人類卵巢癌細胞株CaOV-3之反應性而獲得之結果。圖1(c)表示藉由FCM分析KM4097對人類乳癌細胞株 MCF-7之反應性而獲得之結果。圖1(d)表示藉由FCM分析 KM4097對人類大腸癌細胞株C〇1〇205之反應性而獲得之結果。於圖1(a)〜(d)中，黑色部分表示添加10 pg/mL之 KM4097時之柱狀圖，白色部分表示陰性對照抗體之柱狀圖。圖2表示藉由FCM分析抗Trop-2小鼠單株抗體對 CAR47A6.4.2與人類胰腺癌細胞株BxPC-3之結合的拮抗作用之結果。橫軸表示各抗體之濃度，縱軸表示顯示 CAR47A6.4.2之結合的MFI值。•表示使KM4097共存時之 MFI值，□表示使77220共存時之MFI值。圖3表示藉由FCM分析CAR47A6.4.2對各抗Trop-2小鼠單株抗體與人類胰腺癌細胞株BxPC-3之結合的拮抗作用之結果。橫軸表示CAR47A6.4.2之濃度，縱軸表示顯示各競爭抗體之結合的MFI值。•表示使KM4097共存時之MFI值， □表示使77220共存時之MFI值。 156880.doc -130- 201204387 圖4表示藉由結合ELISA分析抗Trop-2單株抗體對 KM4097與重組Trop-2之結合的拮抗作用之結果。橫軸表示各抗體之濃度，縱轴表示KM4097之結合率（％) 〇表示使CAR47A6.4.2共存時之KM4097之結合率（％)，□表示使 77220共存時之KM4097之結合率（°/〇)。圖5表示藉由結合ELISA分析抗Trop-2單株抗體對77220 與重組Trop-2之結合的拮抗作用之結果。橫軸表示各抗體之濃度，縱轴表示77220之結合率（％)。·表示使KM4097共存時之77220之結合率（％)，表示使CAR47A6.4.2共存時之 77220之結合率（％)，△表示使MOvl6共存時之77220之結合率（％)。圖6(a)及（b)表示抗Trop-2抗體對人類乳癌細胞株MCF-7 細胞之抗體依賴性細胞毒殺活性（ADCC活性）。圖6(a)為供體1之結果，圖6(b)為供體2之結果*橫軸表示各抗體之濃度，縱軸表示細胞毒殺活性率（％)。·表示KM4590，◊表示CAR47A6.4.2。結果以3孔之平均值土標準誤差表示》* 表示學生t檢驗（Student's t-test)之結果，與cAR47A6.4.2相比有顯著差異（p<0.05)。圖7(a)及（b)表示抗Trop-2抗體對人類大腸癌細胞株 C〇1〇205細胞之抗體依賴性細胞毒殺活性（ADCC活性）。圖 7(a)為供體1之結果，圖7(b)為供體2之結果。橫軸表示各抗體之濃度，縱軸表示細胞毒殺活性率（％)。·表示 KM4590，◊表示CAR47A6.4.2。結果以3孔之平均值士標準誤差表示。*表示學生t檢驗之結果，與CAR47A6.4.2相比 156880.doc •13卜 201204387 有顯著差異（P<0.05)。圖8(a)及（b)表示抗Trop-2抗體對人類乳癌細胞株MCF-7 細胞之抗體依賴性細胞毒殺活性（ADCC活性）。圖8(a)為供體1之結果，圖8(b)為供體2之結果。橫軸表示抗體之濃度，縱軸表示細胞毒殺活性率（％)。·表示KM4590，〇表示KM4591。結果以3孔之平均值士標準誤差表示。圖9(a)及（b)表示對人類大腸癌細胞株C〇1〇205細胞之抗體依賴性細胞毒殺活性（ADCC活性）。圖9(a)為供體1之結果，圖9(b)為供體2之結果。橫軸表示各抗體之濃度，縱軸表示細胞毒殺活性率（％)。·表示KM4590，〇表示 KM4591。結果以3孔之平均值土標準誤差表示。圖10表示人類胰腺癌細胞株BxPC-3異位移植小鼠中之抗 Trop-2嵌合抗體之抗腫瘤結果。縱軸表示腫瘤體積，橫軸表示移植細胞株後之經過天數。〇表示PBS投予群，表示CAR47A6.4.2-P投予群，•表示KM4591投予群。結果以6 個體之平均值士標準誤差表示。*表示學生t檢驗之結果， KM4591投予群與PBS投予群相比存在顯著差異（p<0.05)。 #表示學生t檢驗之結果，CAR47A6.4.2-P投予群與PBS投予群相比存在顯著差異（p<0.05)。圖11表示人類大腸癌細胞株C〇1〇205異位移植小鼠中之抗Trop-2嵌合抗體之抗腫瘤結果。縱軸表示腫瘤體積，橫軸表示移植細胞株後之經過天數。〇表示PBS投予群，· 表示CAR47A6.4.2-P投予群，•表示KM4591投予群。結果以5個體之平均值土標準誤差表示。*、**、***表示 156880.doc •132· 201204387 學生t檢驗之結果，KM4591投予群與PBS投予群相比存在顯著差異（分別為Ρ<〇.〇5、Ρ<〇.〇1、ρ<〇.〇〇1)。#表示學生t 檢驗之結果，CAR47A6.4.2-P投予群與PBS投予群相比存在顯著差異（p<〇.〇5)。圖12表示所設計之KM4097人類化抗體之Η鏈可變區域 HVO、HV2、HV3a、HV3b、HV4、HV5a、HV5b、HV5c、 HV6、HV8、HV9、HV10之胺基酸序列。圖13表示所設計之KM4097人類化抗體之L鏈可變區域 LV0、LV2、LV3a、LV3b、LV4之胺基酸序列。圖14(a)〜(f)表示藉由結合ELISA分析KM4590或 CAR47A6.4.2對重組Trop-2與各種抗Trop-2小鼠單株抗體之結合的拮抗作用之結果。橫轴表示各嵌合抗體之濃度’縱軸表示各小鼠單株抗體之結合率（％)。·表示使 CAR47A6.4.2共存時之小鼠單株抗體之結合率（％)，〇表示使KM4590共存時之小鼠單株抗體之結合率（％)。圖15係表示Trop-2/FLAG/Fc、突變體A、突變體B、突變體C之結構之示意圖。圖16(a)〜(c)表示藉由西方點墨法使KM4590[圖16(a)]、 CAR47A6.4.2[圖 16(b)]或抗人類 IgG(Anti-Fc)[圖 16(c)]與 Trop-2細胞外區域蛋白質或該區域之缺失體進行反應而獲得之結果。泳道1、2、3、4分別表示Trop-2/FLAG/Fc、突變體A、突變體B、突變體C。圖17(a)及（b)表示根據還原處理之有無來比較西方點墨法中之 KM4590 或 CAR47A6.4.2對 Trop-2/FLAG/Fc之反應性 156880.doc -133- 201204387 而獲得之結果。圖17(a)表示使KM4590或CAR47A6.4.2與非還原狀態及還原狀態之Trop-2/FLAG/Fc進行反應而獲得之結果。圖17(b)表示自圖17(a)之各PDVF膜剝離抗體，與抗人類IgG(Anti-Fc)反應之結果。圖中泳道1、2均分別表示非還原狀態、還原狀態之Trop-2/FLAG/Fc。圖1 8表示對各PDVF膜中之3條泳道（非還原狀態之上下泳道及還原狀態之泳道）之訊號的強度進行定量，並算出使KM4590或CAR47A6.4.2反應之情形與使Anti-Fc反應之情形之比而獲得之結果。圖19(a)及（b)表示對人類Trop-2表現CHO細胞之ADCC活性。橫軸表示各抗體之濃度，縱軸表示細胞毒殺活性率 (%)。圖19(a)為供體1之結果，圖19(b)為供體2之結果。◊ 表示HV3aLV0，·表示HV4LV0，□表示KM4591。結果以3 孔之平均值士標準誤差表示。 156880.doc •134- 201204387 序列表 <110>北海道公立大學法人札幌發科大學：日本協和醱酵麒麟股份有限公司 <120>抗1^口-2 抗體 <130> W502515 <140> 100120485 <141> 2011-06-10 <150> US61/353.430 <151 >2010-06-10 <t60> <170> Patentln第 3.3版 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213〉智人 <400> 1

Met Ala Arg Qly Pro Qly Leu Ala Pro Pro Pro Uu Arg Leu Pro Leu 15 10 IS

Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Qly His Thr Ale Ala Gin Asp 20 25 30

Aen Cy« Thr Cys Pro Thr Asn Lye Met Thr Val Cys S«r Pro Asp Gly 35 40 45

Pro Qly Gly Arg Cye Gin Cys Arg Ala Leu G!y Ser Gly Met Ala Val 50 55 ¢0

Asp Cye Ser T>ir Leu Thr Ser Lys Cye Leu Leu Leu Lys Ala Arg Hat 65 70 75 80 $er Ala Pro Lys Asn Ala Ars Thr Leu Val Are Pro Ser Glu His Ala 85 90 95

Leu Val Asp Asn Asp Gly Ldu Tyr A$p Pro Asp Cys Asp Pro 6Iu 6ly 100 105 110

Arg Phe Lys Ala Arg Gin Cys Asn 6ln Thr Ser Val Cy« Trp Cys Val 115 120 125

Asn Ser Val Gly Val Are Arg Thr Asp Lys Qly Αερ Leu Ser Leu Arg 130 135 140

Cys Asd Glu Leu Val Arg Thr His Hi9 l【e Uu ] le Asp Leu Are His 145 150 155 160

Arg Pro Thr Ala Qly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Mp Ala Glu Leu 165 170 175

Arg Arg Uu Mio Are Glu Arg Tyr Arg Leu ΗΪ9 Pro Lys Phe Val Ala tdO 185 190

Ala Val His Tyr Glu Gin Pro Thr IΙθ 6ln Il9 Glu Leu Arg Gin Asn 195 200 205

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Tyr Pha Glu krg Asp (lo Lye Qly Qlu Ser Leu Phe Gin Gty Arg 6ly 225 230 235 240

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Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val I le Thr Asn Arg Arg Lye Ser Gly 290 295 300

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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 鼠 1 〇> D 家 ^^^^ i ^ 4— <2<2<2<2 <22〇> <221> CDS <222> (1)..(399) <400> 11 atg gaa toa oag aot cag gto cto ato tcc ttg ctg ttc tge gta tct

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Qly Thr Cy$ Gly Aep lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Lbu Ser 156880-序列表.doc 144 201204387 20 25 30 gtg tea gca gga gag a財 aot etg ac?〇 t£〇 aag tcc agt cas aet

Val Ser Ala 6ly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Qln Ser 3S 40 45 192 240 288 336 384 399 ctg tta aac sgt gga aat cad cag aae too ttg goo tgg tac cag cag

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Gly Thr Cys Gly Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro S»r Ser Leu Ser 20 2S 30

Val Ser Ala 6ly 6lu Lye Val Thr Met Thr Cys Lys Ser 5er Qln Ser 35 40 45

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Lys Ser Ser Gin Ser Leu Uu A^n Ser Gly Asn Bln Gin Asn Tyr Leu t 5 10 15

Ala

<210> 17 <211> 7 <212> PRT -10- 156880-序列表.doc 201204387 <213>家鼷鼠 <400> 17

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> tS <211> 9 <212> PRT <213>家駿鼠 <400> 18

Gin Ser Asp His Ile Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <21〇> 19 <211> 39 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成DNA <400> 19 aagg^aaaaa gcggccecao catgiaatgg agcg^ggtc <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成DNA <400> Z〇 cgatgggccc ttestg^agg otgag^agao t^tgagagtg gtg <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成DNA <400> 21

ccggaattcc aagatggaat oacagaotca ggtcc <21〇> ZZ -11 - 156880-序列表.doc 201204387 <21t> 31 <2t2> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成DNA <400> 22 aeeoaoogta cgttttattt ccagottggt o 鼠遇A跋 23MDNt豕 ^0^^ <220> <221> CDS <222> (1).. (34B) <23 cag gto cag ttg gti oag tct ggc get sag gte aas aag cct 辟s sot

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t 5 10 IS

Ser Val Lys Val Ser Cys Lye Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr lie Tyr 20 25 30

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Lys Gly Arg Val Thr I le Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr A!a Tyr 65 70 75 80

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Asp lie Val Mdt Thr Gin Sor Pro Asp Ser Leu Ala Val Sor Lou Gly 15 10 15 13- 156880-序列表.doc 201204387 gig cga gcc act ate aao tgQ eas too agt cag agt ctg tta aao ast Glu Arg Ala Thr I la Asn Cys Lys Ser Sdr Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 96 ggo 舳t cm oag aao tec ttg kgc tgg tac cag c时 aea cca eeg ceg Qly Asn Gin Gin Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Qln Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45 144 cct cot 8«a otg ttK ate tas ggs saz tcc act egg eag tot ggg ffto Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Qly Ala Sor Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 192 cct gat ego tto tea ggc agt ggo tot gEt aco gat tto act etc aco Pro Asp Arg Phe S$r Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Le« Thr 65 70 75 80 ato t仰 egt ttg cag get gaa gee gtg gca gtt tot tao tgt cag agt lie Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Ser 85 90 95 gat oat att tat ccg tac aeg tto ggt cma egg acc aag ctg gaa ata Asp His Me Tyr Pro Tyr Thr Phe Qly Qln Qly Thr Ly$ Leu Glu lie 100 10S 110 240 288 336 aaa

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Gly Asn Gin Gin Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr 6ln Gin Lys Pro Gly 6ln 14- 339 156880-序列表.doc 201204387 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Qly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

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Asp His lie Tyr Pro Tyr thr Pha Gly Glh Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110

Lys 113 <210> 27 <211> 348 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221> CDS m〇> (1)..(34B) <223>人工序列之說明：HV3a序列 <400> 27 oag sto cag i±g gtg cag tct gga cct gag etg aag eag cct ggg got

Gin Va| Gin Leu Val Qln Ser Gly Pro Glu Val Lye Lys Pro Gly Ala 15 to 15 tea gtg etag sta tco tgc aag get tct 辟c tac aoc ttc act att tao S«r Val Lys Val Ssr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr lie Tyr 20 25 30 tgg ota egt t£g gta ege gca oot gga cag g辟 ett gaa tsg ete

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Lys Qly Lys Val Thr I Ιθ Thr Ala A$p Thr 5er Thr Ser Thr Ala Tyr

$5 70 75 BO atg gag Qto agt age ctg ega tct gag gao eot set gtc tat ttt tgt

Met Qlu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Slu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga gag ggt dgt aat tcc gee tac tgs zsX aaa ggo acc ett gtc 156880-序列表.doc 15. 48 96 144 192 240 288 336 201204387

Ala Ar^ 6ίυ Qly Ser Asn Ser Qly Tyr Trp Qly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110 aoa sto tcc tea 348

Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211〉116 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221 > a <m> w.. aw <223>人工序列之說明：HV3a序列 <400> Z8

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Sar Val Lys Val Ser Cya Lye Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr lid Tyr 20 25 30

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Gly Asn lie Phe Pro Gly Ser Ma Tyr Ile Asn Tyr Asn Qlu Lys Phe SO 55 60

Lys 6ly Lye Val Thr I le Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Qlu leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cy$ 85 90 95

Ala Arg filu Qly Ser Asn Ser Qly Tyr Trp Qly Qln Qly Thr Leu Vel 100 105 110

Thr Val $er Ser ilS <210> 29 <211> 348 <212> ONA <213>人工序列 <220> <221 > CDS <220> (1).. (348) <223>人工序列之說明：HV4序列 <4〇0> 29

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Gin Val 6ln Leu Val Gin Ser Gly Pro G[u Val Lys Lys Pro Qly Ala 16- 156880-序列表.doc 201204387 15 10 15 tee gts 明ε ?ta tcc tgc eae get tct ggc tac acc ttc act ett taa

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Lys <210> 39 <211> 720 <Z12> DNA <213〉人工序列 <220> <221> COS <220> (D..O20) <223>人工序列之說明：FLAG/Fc序列 <40Q> 39 tot aga gca 辟〇 tao aag gac gtto get geo BBg aot agt gac aaa act

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Ala Leu dly $er Gly Hat Ala Val Asp Cy$ Ser Thr Leu Thr Ser Ly$ 50 55 60 -30- 144 192 240 288 336 363 156880-序列表.doe 201204387

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Val Val Val Asp Val Ser Hi$ Glu Asp Pro Slu Val Lys Phe A$n Trp 325 330 335

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Lys Ala leu Pro Ala Pro lie Glu Ly« Thr Ile Ser Lvs Ala Lys Gly 385 390 395 400

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Leu Thr Lys A$n Gin Val Ser Uu Thr Cye Leu Val Lye Gly Phe Tyr 420 425 430 • Pro Ser Asp Ile Ala Val Slu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 435 440 445 -31- 156880-序列表.doc 201204387

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Leu Tyr Ser Lye Leu Thr Val Asp Ly« Ser Arg Trp 6ln 6ln Gly Asn 465 470 475 480

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Leu Ser His Thr Ala Ala Gin Asp Asn Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg 20 25 30

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Val Leu Asp Ser Asp 6ly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430

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Hot Arg Val Leu I le Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile 15 10 15 . Lou Ser Hie Thr Ala Ala Qln Asp Aen Asp Glu Leu Val Arg Thr His 20 25 30 33- 156880-序列表.doc 201204387

His I Ιθ Leu I le Asp Leu Arg Hts Arg Pro Thr Ala Qly Ala Phe Asn 35 40 45 HI8 $or Asp Leu Asp Ala Glu Leu Are Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr 50 55 60

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Pro Ala Pro Qlu Leu Leu Qly 6ly Pro $er Val Phe Leu Phe Pro Pro 180 185 190

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Gin Ly« Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lye 385 390 <210> 47 34- 156880-序列表.doc 201204387 <2t1> 361 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221〉肽 <220> (1)..(361) <223>人工序列之說明：突變體C序列 <400> 47

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Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg Leu Thr Ser Arg Ala Asp Tyr Lye Aep IIS 120 125 A$p Asp Asp Lys Thr Ser Asp Lye Thr Hie Thr Cy« Pro Pro Gys Pro 130 135 140

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Ala Leu Pro Ala Pro Ile 6lu Lys Thr lie Ser Ly$ Ala Lys Gly Gin

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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 305 310 315 320

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Aep Lys Sar Arg Trp Qln Qln Qly Aen Val 325 330 335

Phe Ser Cye Ser Val Met His Qlu Ala Lou His bn His Tyr Thr Gin 340 345 350

Lys Sor Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lye 355 360 <210> 48 <211> 344 <212> PRT <213>人工序列 <220> C221> 肽 <220> (1)..(344) <223>人工序列之說明：myc/His-標記Trop*2序列 <400> 48

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Leu Val Asp Asn Asp 6ly Leo Tyr A$p Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly 100 105 110

Arg Phe Lys Ala Arg Gin Cye Asn Gin Thr Ser Val Cys Trp Cys Val 115 120 126

Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Qly A$p Leu Ser Leu Arg 130 丨3$ 140

Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr Hie His lie Leu Mb Asp Leu Arg His

145 t 50 155 1$Q

Arg Pro Tbr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Qlu L«u 165 170 175

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Ala Val His Tyr Glu 61n Pro Thr 11« Gin lie 6Iu Leu Arg Gin Asn 195 200 205

Thr Ser Gin Ly« Ala Ala Gly Asp Val Asp He Qly Asp Ala Ala Tyr 210 215 220 36- 156880-序列表.doc 201204387

Tyr Phe Glu Arg Asp lie Lys Gly Gtu Ser Leu Phe 6ln 6Iy Arg Sly 225 230 235 240

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Leu lie Tyr Tyr Uu Asp 6lu 11« Pro Pro Lys Phe Ser Hat Lya Arg 260 26S 270

Uu Thr Ala Gly Leu lie Ala Val Me Val Val Va丨 Va丨 Val Ala Leu 275 280 285

Val Ale 6ly Hot Ala Val Leu Val lie Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly 290 295 300

Ly$ Tyr Lys Lys Val Glu I le Lye Glu Leu Qly Glu Leu Arg Lys Glu 305 310 315 320

Pro Ser Leu Glu Gin Lys Leu lie Ser 6lu Qlu Asp Leu Asn Met His 325 330 335

Thr Gly His His His His His Hl9 340 <210> 49 <211> I032 <212> DNA <213>人工序列 <22〇> <221 > COS <220> (1)., (1032) <223>人工;j·列之說明：myc/His-標記Trop*2序列 <400> 4& atg get egg ggo ccc 路o etc gc客 ccg cca cce ctg c时 ctg ccg

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Asp Cys Ser Thr Uu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Het 65 70 75 80 -37- 156880-序列表.doe 201204387 ago fco coc aag aac gcc cge 此g otg gtg ore ccs agt gag cac £：cg 288

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Uu lie Tyr Tyr Leu Asp Qlu lie Pro Pro Lys Phe Ser Mdt Lys Arg 260 265 270 • 38 - 156880-序列表.doc 201204387 etc acc gee ggc cto etQ get gtc ate gtg £tc gtg gtg gee etc 864

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Pro Ser Leu Glu Gin Lys Leu lie Ser Olu Qlu Asp Leu Asn Uet Hie 325 330 335 a〇〇 ggt cat cat cac cat oao oat 1032

Thr 6iy ΗΙε His His His His His 340 -39- 156880·序列表.doc

Claims

201204387 七、申請專利範圍： 1. 一種單株抗體或該抗體片段’其係針對與人類了^^之之細胞外區域中之至少區域I結合之人類Trop-2者。 2. 如請求項1之單株抗體或該抗體片段，其與序列編號i所表不之胺基酸序列中之第34號〜第72號之至少1個胺基酸結合。 3·如請求項1或2之單株抗體或該抗體片段，其中抗體對抗原之解離常數（KD)為5xl〇-1()M以下。 4. 如凊求項1至3中任一項之單株抗體或該抗體片段，其具有高ADCC活性及抗腫瘤活性。 5. 如睛求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段，其含有CDR1〜3分別含有序列編號〖3 —丨5所表示之胺基酸序列的抗體之Η鏈’且含有CDR1〜3分別為序列編號16〜18所表示之胺基酸序列的抗體之L鍵。 6. 一種單株抗體或該抗體片段，其與和含有包含序列編號 10所表示之胺基酸序列之VH且含有包含序列編號12所表示之胺基酸序列之VL的抗體所結合之Tr〇p_2之細胞外區域所存在之抗原決定位相同之抗原決定位結合。 • 7. 一種單株抗體或該抗體片段，其與請求項5或6之抗體競爭而與Trop-2之細胞外區域結合。 Λ 8. 如請求項1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段，其係基因重組抗體。 9. 如凊求項8之皁株抗體或該抗體片段，其係選自人類型嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。 156880.doc 201204387 10. 如請求項9之單株抗體或該抗體片段，其係人類化抗體，且包含以下（a) VH及（b) VL中之至少一者： (a) 含有序列編號24所表示之胺基酸序列、或進行將序列編號24所表示之胺基酸序列之第9號之Ala置換為Pro、將第12號之Lys置換為Val、將第20號之Val置換為lie、將第38號之Arg置換為Lys、將第48號之Met置換為lie、將第67號之Arg置換為Lys、將第68號之Val置換為Ala、將第70號之lie置換為Leu、將第95號之Tyr置換為Phe、及將第112號之Val置換為Leu之胺基酸修飾中之至少1個修飾之胺基酸序列的VH ; (b) 含有序列編號26所表示之胺基酸序列、或進行將序列編號26所表示之胺基酸序列第15號之Leu置換為Ala、將第19號之Ala置換為Va卜將第21號之lie置換為Met、及將第84號之Leu置換為Val之胺基酸修飾中之至少1個修飾之胺基酸序列的VL。 11. 如請求項10之單株抗體或該抗體片段，其係選自以下 (1)〜(5)之中： (1) 含有包含序列編號28所表示之胺基酸序列之抗體 VH及包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體； (2) 含有包含序列編號30所表示之胺基酸序列之抗體 VH及包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體； (3) 含有包含序列編號32所表示之胺基酸序列之抗體 156880.doc 201204387 VH及包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體； (4)含有包含序列編號34所表示之胺基酸序列之抗體 VH及包含序列編號3 6所表示之胺基酸序列之抗體vl中 ‘ 之至少一者之人類化抗體； • (5)含有包含序列編號34所表示之胺基酸序列之抗體 VH及包含序列編號3 8所表示之胺基酸序列之抗體vl中之至少一者之人類化抗體。 12.如請求項1至11中任一項之抗體片段，其係選自Fab、 Fab'、（Fab')2、單鏈抗體（scFv)、二聚化v區域 (Diabody)、二硫鍵穩定化v區域（dsFv)及含有cDR之肽中之抗體片段。 13 · —種DNA，其編碼請求項1至丨2中任一項之單株抗體或該抗體片段。 14. 一種重組體載體，其含有請求項132dNA。 15. —種轉形株，其係將請求項14之重組體載體導入宿主細胞中而獲得。 16. —種請求項丨至12中任一項之單株抗體或該抗體片段之 . 製造方法’其特徵在於：於培養基中培養請求項14之轉形株’使請求項1至12中任一項之抗體或該抗體片段純化蓄積於培養物中，並自培養物採集該抗體或該抗體片段。 17· —種人類Trop_2之檢測或測定用試劑，其含有請求項丄至 12中任一項之單株抗體或該抗體片段。 156880.doc 201204387 18. -種與人類Trop-2陽性細胞相關之疾病之診斷藥，其含有請求項】至12中任—項之單株抗體或該抗體片段作為有效成分。 19. 如請求項18之診斷藥，其中與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病為癌。 20. —種與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病之治療藥，其含有請求項1至12中任一項之單株抗體或該抗體片段作為有效成分。 21. 如請求項20之治療藥，其中與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病為癌。 22. —種與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病之診斷方法，其包括使用請求項H2中任一項之單株抗體或該抗體片段而檢測或測定人類Tr〇p_2陽性細胞。 23. —種與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病之診斷方法，其包括使用請求項H2中任一項之單株抗體或該抗體片段而檢測或測定人類Tr〇p_2。 24. 如明求項22或23之診斷方法，其中與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病為癌》 25. —種请求項1至12中任一項之單株抗體或該抗體片段之用途，其係用於製造與人類Tr〇p_2陽性細胞相關之疾病之診斷藥。 26. 如請求項25之單株抗體或該抗體片段之用途，其中與人類Trop-2陽性細胞相關之疾病為癌。 27· —種請求項1至12中任一項之單株抗體或該抗體片段之 156880.doc 201204387 用途，其係用於製造與人類Trop-2陽性細胞相關之疾病之治療藥。 28.如請求項27之單株抗體或該抗體片段之用途，其中與人類Trop-2陽性細胞相關之疾病為癌。 156880.doc