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TWI811260B - 與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體 - Google Patents

與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體 Download PDF

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TWI811260B
TWI811260B TW107139622A TW107139622A TWI811260B TW I811260 B TWI811260 B TW I811260B TW 107139622 A TW107139622 A TW 107139622A TW 107139622 A TW107139622 A TW 107139622A TW I811260 B TWI811260 B TW I811260B
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Abstract

本發明之課題在於提供一種包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM(Epitherial Cell Adhesion Molecule，上皮細胞黏附分子)結合之抗原結合區域之雙專一性抗體。本發明係關於一種包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM結合之抗原結合區域之雙專一性抗體。

Description

與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體
本發明係關於一種包含與CD(Cluster of Differentiation，分化簇)40結合之抗原結合區域及與EpCAM(Epitherial Cell Adhesion Molecule，上皮細胞黏附分子)結合之抗原結合區域之雙專一性抗體、該雙專一性抗體片段、編碼該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、生產該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之融合瘤及轉形株、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之製造方法、包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷劑、使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷方法、以及包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之檢測或測定試劑。
抗體係存在於所有哺乳動物之血清或組織體液中之糖蛋白，識別機體內之外來抗原。抗體藉由補體系統之活化或與存在於細胞表面之受體(FcR)之結合，而激活FcR表現細胞之吞噬功能、抗體依賴性細胞毒殺功能、媒介物之游離功能及抗原提呈功能等效應功能，參與機體防禦。
一分子之抗體包含2條相同之輕鏈(L鏈)與2條相同之重鏈(H鏈)，具備2個抗原結合部位。抗體之類型及亞型取決於H鏈，各類型及亞型具有不同之固有功能。人類之抗體存在IgG、IgA、IgM、IgD及IgE該5個不同類型。進而，IgG分為亞型：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，IgA 分為亞型：IgA1及IgA2(Charles A.J.et.al.,Immunobiology,1997,Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.)。
多價抗體係一分子內具備複數個抗原結合部位之抗體。作為多價抗體之例，報告有首先使用雜交之融合瘤(hybrid hybridoma)使源自兩種不同抗體之H鏈及L鏈於1個細胞上進行表現，藉此製作分別以一價與不同之兩種抗原結合之二價抗體(非專利文獻1)。然而，藉由本法會產生10個左右之抗體之H鏈與L鏈之組合。因此，具有所需之H鏈與L鏈之組合之多價抗體之生成量較低，且亦難以對此種多價抗體進行選擇性之單離純化，故所需抗體之產量減小。
為了克服該問題點，報告有嘗試將複數個抗原結合部位連結而以單一多肽鏈之形式進行表現，藉此減少亞單位間之組合之變化，而生產具有所需組合之抗體。
作為一例，已知包含將H鏈與L鏈之抗原結合部位利用1個多肽連結而成之單鏈可變區抗體片段(scFv，single chain Fv)之抗體(非專利文獻2)。進而，報告有使用IgG1之H鏈恆定區之CH1區或該區域之部分片段及L鏈恆定區、或柔性連接子(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，將兩個抗原結合部位連結而成之抗體等(非專利文獻4、專利文獻1、專利文獻2)。
該等先前之多價抗體存在易凝集、穩定性或生產性較低之缺點。但於另一方面發現，於單一之H鏈多肽中具有複數個抗原結合部位、且抗體重鏈可變區經由具有免疫球蛋白區或其片段之胺基酸序列之連接子結合而成之多價抗體不僅穩定性較高，且生產性亦良好(專利文獻3)。
CD40經鑑定為於人B細胞表面表現之抗原(非專利文獻 4)，已知屬於TNF(Tumour Necrosis Factor，腫瘤壞死因子)受體家族之成員之一。TNF受體家族分子係根據細胞外區域之富含半胱胺酸之重複序列(cysteine-rich repeat)之存在而定義。作為TNF受體家族之成員，除CD40以外，亦已知有例如低親和性NGF(Nerve Growth Factor，神經生長因子)受體、TNF受體、CD27、OX40及CD30等。
TNF受體家族介導之訊號係藉由均三聚體之TNF家族分子與3個TNF受體家族結合而受到誘導，但藉由使針對TNF受體家族分子之特異性抗體彼此交聯(crosslink)，亦可向細胞內傳遞訊號，因此認為訊號傳遞離不開TNF受體家族分子之締合(非專利文獻5、6)。
已知CD40為I類之膜型糖蛋白，表現於B淋巴細胞、樹狀細胞、單核球上皮細胞及纖維母細胞等多種細胞類型，且於腫瘤性之人B細胞等某些腫瘤細胞上亦有表現。確認缺乏CD40之小鼠其胸腺依賴性免疫球蛋白之類型開關或生髮中心(germinal center)之形成受損，證實了CD40於細胞性與體液性免疫反應中之重要作用(非專利文獻7)。
CD40之訊號關係到免疫球蛋白之類型開關或CTL(Cytotoxic Lymphocyte，細胞毒性T淋巴細胞)之誘導，因此亦期待將其作為腫瘤免疫之活化或癌症疫苗之佐劑而應用於醫藥品(非專利文獻8)。
作為現有之以CD40作為靶點之抗體，可列舉：Chi-Lob 7/4、HCD-122、APX005M、SEA-CD40及CP870、893(21.4.1)等(非專利文獻9)。其中，CP870、893具有強力之CD40訊號誘導能力，已針對實體腫瘤實施有以全身性免疫活化作為藥效機制之臨床試験。然而，未能顯示有效性，且報告有細胞激素釋放綜合症、血栓標記物升高、肝臓參數升高等源於全身性免疫活化之毒性表現(非專利文獻10)。
CD40之生理學配體為CD40配體(CD40 Ligand)(CD154、gp39)。活化之T淋巴細胞上表現CD40配體，藉由與B淋巴細胞之表面上之CD40結合，而擔負促進B淋巴細胞之分化或增殖、避免生髮中心之B淋巴細胞發生自發性細胞凋亡等重要之調節機制(非專利文獻11)。
作為具有CD40之訊號誘導能力之分子，報告有使抗體之Fc區域與CD40配體進行融合而成之分子。進而，報告有著眼於腫瘤中高效CD40訊號誘導所製作之CD40配體與針對癌抗原之單鏈抗體scFv之融合抗體，其可以較CD40配體低20倍左右之低用量誘導CD40訊號(非專利文獻12)。
作為識別CD40之雙專一性抗體，已知具有異型二聚化重鏈之IgG型抗人GPC3/抗小鼠CD40雙專一性抗體(專利文獻4)。又，已知與黏連蛋白(nectin)-4、PSMA(Prostate-Specificmembraneantigen，前列腺特異性膜抗原)或EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生長因子受體)等癌抗原及CD40結合而使CD40活化之雙專一性蛋白質(專利文獻5)。進而，已知藉由對CD40及癌細胞表面抗原具有特異性之雙功能抗體(diabody)等雙專一性分子而於癌細胞附近激活CD40表現細胞之方法(專利文獻6)。
上皮細胞黏附分子(EpCAM、CD326、GA733-2、HEA(Human Erythrocyte Antigen，人類紅細胞抗原)125、KS(Kaposi's Sarcoma，卡波西肉瘤)1/4、MK(Midkine，中期因子)-1、MH99、MOC(Mucinous Ovarian Carcinoma，黏液性卵巢癌)31、323/A3、17-1A、CO-17A、ESA(Epithelial Specific Antigen，上皮特異性抗原)、EGP(Epithelial Glycoprotein，表皮糖蛋白)-2、EGP34、EGP40、KSA、 KS1/4、TROP(human trophoblast cell surface antigen，人滋養層細胞表面抗原)-1、TACST(Tumor-Associated Calcium Signal Transducer，腫瘤相關鈣離子信號轉換因子)-1)係與細胞黏著或細胞增殖、腫瘤進展相關之40kDa之跨膜型膜糖蛋白，發揮作為同型細胞黏著因子之功能。
EpCAM於源自上皮之多種癌細胞中有高表現，故作為一種已知之癌抗原，期待將其用於癌分子靶向醫藥品之靶分子或診斷標記物、癌症疫苗靶點(非專利文獻13、14)。
作為靶向EpCAM之醫藥之例，報告有使用與EpCAM蛋白或抗EpCAM抗體之抗原識別部位結合之抗遺傳型抗體的疫苗療法、Adecatumumab(MT201)、ING-1、3622W94等抗EpCAM抗體(非專利文獻15)。
進而，基於提高抗EpCAM抗體之細胞毒殺活性之目的，開發有使抗EpCAM抗體與綠膿桿菌外毒素融合而成之Proxiniums Vivendiums(VB4-845)、或與IL-2融合而成之EMD 273 066(huKS-IL2)。藉由具有抗CD3抗體而使T細胞與EpCAM陽性腫瘤細胞交聯以毒殺腫瘤細胞之雙專一性抗體Catumaxomab(Removab)已於歐州獲得批准(非專利文獻14、16)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：美國專利申請公開第2007/0071675號說明書
專利文獻2：國際公開第2001/077342號
專利文獻3：國際公開第2009/131239號
專利文獻4：國際公開第2015/156268號
專利文獻5：國際公開第2017/205738號
專利文獻6：國際公開第99/61057號
[非專利文獻]
非專利文獻1：Suresh et. al., Methods Enzymol. 121, 210-228, 1986
非專利文獻2：Kranz et. al., J. Hematother. 5, 403-408, 1995
非專利文獻3：Wu et. al., Nat. Biothech. 25, 1290-1297, 2007
非專利文獻4：Clark et. al., PNAS USA 1986; 83:4494-4498
非專利文獻5：Chuntharapai A et. al., J. Immunol. 166 (8), 4891, 2001
非專利文獻6：Ashkenazi A et. al., Nat Rev Cancer 2, 420, 2002
非專利文獻7：Kawabe et. al., Immunity 1994; 1: 167-168
非專利文獻8：Diehl L et. al., Nat Med. 1999 Jul; 5 (7): 774-9.
非專利文獻9：Beatty GL et. al., Expert Rev Anticancer Ther. 2017 Feb; 17 (2): 175-186.
非專利文獻10：Vonderheide RH et. al., Oncoimmunology. 2013 Jan 1; 2 (1): e23033.
非專利文獻11：Bridges et. al., J Immumol 1987; 139: 4242-4549
非專利文獻12：1541376565889_0 et. al., Mol Cancer. 2014 Apr 17; 13: 85
非專利文獻13：van der Gun BTet. al., Br J Cancer. 2011 Jul 12; 105 (2): 312-9.
非專利文獻14：Chaudry MA et. al., Br J Cancer. 2007 Apr 10; 96 (7): 1013-9.
非專利文獻15：Markus M et. al., Cancer Cell Int. 2010 Nov 2; 10: 44.
非專利文獻16：Linke R et. al., MAbs. 2010, Vol.2 (2), pp.129-136.
針對CD40及EpCAM之雙專一性抗體與其抗腫瘤效果尚不為業界所知。因此，本發明之目的在於提供一種包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM結合之抗原結合區域之雙專一性抗體、該雙專一性抗體片段、編碼該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、生產該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之融合瘤及轉形株、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之製造方法、包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷劑、使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷方法、以及包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之檢測或測定試劑。
作為用以解決上述課題之方法，本發明提供一種包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM結合之抗原結合區域之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段等。
即，本發明關於以下之(1)~(35)。
(1)一種雙專一性抗體，其包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM(Epitherial Cell Adhesion Molecule，上皮細胞黏附分子)結合之抗原結合區域。
(2)如(1)記載之雙專一性抗體，其分別以二價與CD40及EpCAM結合。
(3)如(1)或(2)記載之雙專一性抗體，其中與CD40結合之抗原結合區域包含與CD40特異性地結合之抗體(抗CD40抗體)之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，且與EpCAM結合之抗原結合區域包含與EpCAM特異性地結合之抗體(抗EpCAM抗體)之VH及VL。
(4)如(1)至(3)中任一項記載之雙專一性抗體，其具有：包含自N末端起依序為VH1-X-VH2-Y之式{式中，VH1表示第一抗體之VH，VH2表示第二抗體之VH，X及Y分別表示包含抗體之CH1之多肽(此處，X及Y之至少一者進而包含抗體之鉸鏈區)}所表示之多肽之相同之2條重鏈、及包含相同之VL之4條輕鏈，該第一抗體及該第二抗體之任一者為抗CD40抗體，另一者為抗EpCAM抗體。
(5)如(4)記載之雙專一性抗體，其中輕鏈為κ鏈。
(6)如(4)或(5)記載之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含人IgG之CH1之多肽，Y為包含人IgG之CH1、鉸鏈區、CH2及CH3之多肽。
(7)如(4)或(5)記載之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽，Y為包含序列編號77所表示之胺基酸序 列之多肽。
(8)如(4)或(5)記載之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含人IgG之CH1、鉸鏈區、CH2及CH3之多肽，Y為包含人IgG之CH1之多肽。
(9)如(4)或(5)記載之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽，Y為包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽。
(10)如(3)至(9)中任一項記載之雙專一性抗體，其中VL為含有分別包含序列編號23~25所表示之胺基酸序列之互補決定區(CDR)1~3之VL。
(11)如(3)至(10)中任一項記載之雙專一性抗體，其中VL為包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL。
(12)如(1)至(11)中任一項記載之雙專一性抗體，其具有CD40促效劑活性。
(13)如(1)至(12)中任一項記載之雙專一性抗體，其於不存在表現EpCAM之細胞之情況下不顯示CD40促效劑活性，僅於存在表現EpCAM之細胞之情況下顯示CD40促效劑活性。
(14)如(3)至(13)中任一項記載之雙專一性抗體，其中抗CD40抗體為不具有促效劑活性之抗CD40抗體。
(15)如(4)至(14)中任一項記載之雙專一性抗體，其中第一抗體為抗CD40抗體，第二抗體為抗EpCAM抗體。
(16)如(4)至(14)中任一項記載之雙專一性抗體，其中第一抗體為抗EpCAM抗體，第二抗體為抗CD40抗體。
(17)如(3)至(16)中任一項記載之雙專一性抗體，其中抗CD40抗體為包含選自由以下之(1a)至(1d)所組成之群中之任一個重鏈可變區(VH)之抗 CD40抗體。
(1a)含有分別包含序列編號28~30所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(1b)含有分別包含序列編號33~35所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(1c)含有分別包含序列編號38~40所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、及(1d)含有分別包含序列編號43~45所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH。
(18)如(3)至(17)中任一項記載之雙專一性抗體，其中抗CD40抗體為含有包含序列編號27、32、37及42任一者所表示之胺基酸序列之VH之抗CD40抗體。
(19)如(3)至(18)中任一項記載之雙專一性抗體，其中抗EpCAM抗體為包含選自由以下之(2a)至(2d)所組成之群中之任一個VH之抗EpCAM抗體。
(2a)含有分別包含序列編號52~54所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(2b)含有分別包含序列編號57~59所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(2c)含有分別包含序列編號62~64所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、及(2d)含有分別包含序列編號67~69所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH。
(20)如(3)至(19)中任一項記載之雙專一性抗體，其中抗EpCAM抗體為含有包含序列編號51、56、61及66任一者所表示之胺基酸序列之VH之抗EpCAM抗體。
(21)一種雙專一性抗體片段，其係如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體之雙專一性抗體片段。
(22)如(21)記載之雙專一性抗體片段，其為Fab型雙專一性抗體片段或F(ab')2型雙專一性抗體片段。
(23)一種DNA，其編碼如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段。
(24)一種重組載體，其含有如(23)記載之DNA。
(25)一種轉形株，其係向宿主細胞導入如(24)記載之重組載體而獲得。
(26)一種如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段之製造方法，其特徵在於：將如(25)記載之轉形株於培養基中進行培養，使培養物中生產蓄積如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段，自該培養物採取該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。
(27)一種與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病之治療及/或診斷劑，其含有如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段作為有效成分。
(28)如(27)記載之劑，其中與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病為癌。
(29)一種與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病之治療及/或 診斷方法，其使用如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段。
(30)如(29)記載之方法，其中與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病為癌。
(31)如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段，其用於治療及/或診斷與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病。
(32)如(31)記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段，其中與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病為癌。
(33)一種如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段之用途，其用於製造與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病之治療及/或診斷劑。
(34)如(33)記載之用途，其中與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病為癌。
(35)一種用以檢測或測定EpCAM及CD40之至少一者之試劑，其包含如(1)至(20)中之任一項記載之雙專一性抗體或如(21)或(22)記載之雙專一性抗體片段。
根據本發明，可提供一種包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM結合之抗原結合區域之雙專一性抗體、該雙專一性抗體片段、編碼該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、生產該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之融合瘤及轉形株、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之製造方法、包含該雙專一性抗體或 該雙專一性抗體片段之治療及診斷劑、使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷方法、以及包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之檢測或測定試劑。
圖1係表示本發明之雙專一性抗體之結構之一例。圖1(A)表示N末端型雙專一性抗體。圖1(B)表示C末端型雙專一性抗體。
圖2(A)係表示針對Ramos細胞、圖2(B)係表示針對Colo205細胞、圖2(C)係表示針對HEK293細胞、圖2(D)係表示針對人EpCAM/HEK293細胞，利用流式細胞儀評價各細胞中之CD40及EpCAM之表現所獲得之結果。縱軸顯示細胞數，橫軸顯示螢光強度。虛線表示抗CD40抗體21.4.1之結合性，點線表示抗EpCAM抗體3622W94之結合性，空心線條表示作為對照抗體之抗DNP抗體之結合性。
圖3(A)及圖3(B)係表示以Ramos細胞上之CD95表現誘導作為指標，評價抗CD40抗體單株抗體之CD40訊號誘導活性所獲得之結果。縱軸顯示螢光強度，表示以10、1或0.1μg/mL添加各抗體時抗CD95抗體對Ramos細胞之結合性。關於比較對象，使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體。
圖4係表示CD40-EpCAM雙專一性抗體對與HEK293細胞共培養之Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。縱軸顯示螢光強度，表示以10、1或0.1μg/mL添加各抗體時抗CD95抗體對Ramos細胞之結合性。關於比較對象，使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體，使用3622W94作為抗EpCAM抗體。
圖5係表示CD40-EpCAM雙專一性抗體對與人EpCAM/HEK293細胞 共培養之Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。縱軸顯示螢光強度，表示以10、1或0.1μg/mL添加各抗體時抗CD95抗體對Ramos細胞之結合性。關於比較對象，使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體，使用3622W94作為抗EpCAM抗體。
圖6係表示CD40-EpCAM雙專一性抗體對與Colo205細胞共培養之Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。縱軸顯示螢光強度，表示以10、1或0.1μg/mL添加各抗體時抗CD95抗體對Ramos細胞之結合性。關於比較對象，使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體，使用3622W94作為抗EpCAM抗體。
圖7(A)係於存在EpCAM陽性細胞之情況下CD40-EpCAM雙專一性抗體對CD40陽性細胞之作用之模式圖。CD40-EpCAM雙專一性抗體若與EpCAM陽性細胞及CD40陽性細胞兩者結合，則對CD40陽性細胞誘導CD40訊號。其結果，於CD40陽性細胞上誘導表現CD95。圖7(B)係於不存在EpCAM陽性細胞之情況下CD40-EpCAM雙專一性抗體對CD40陽性細胞之作用之模式圖。CD40-EpCAM雙專一性抗體於僅與CD40陽性細胞結合時不誘導CD40訊號。
圖8(A)表示利用經Alexa647螢光標記之HER2抗體對Ramos細胞及Colo205細胞進行螢光免疫染色所獲得之結果，圖8(B)表示利用經Alexa488螢光標記之Ct R1090S55A-Ep203對Ramos細胞及Colo205細胞進行螢光免疫染色所獲得之結果，圖8(C)表示該等之重合。箭頭表示觀察到較強螢光之部位。
圖9(A)~(C)表示使用小鼠進行之毒性試驗之結果。圖9(A)之縱軸顯示小鼠之體重(g)。圖9(B)之縱軸顯示小鼠之末梢血液中之AST(Unit/L)。 圖9(C)之縱軸顯示小鼠之末梢血液中之ALT(Unit/L)。於各圖中，灰色條柱表示投予前之測定值，黑色條柱表示投予24小時後之測定值。R1090(N)、R1090(C)及Epc112(C)分別指R1090S55A-Ep203、Ct R1090S55A-Ep203及Ct Epc112-R1066。使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體。21.4.1係投予1mg/kg，其他抗體係投予10mg/kg。
圖10(A)~(D)係表示使用小鼠進行之毒性試驗之結果。圖10(A)表示抗體投予24小時後之小鼠之白血球數。圖10(B)表示抗體投予24小時後之小鼠之淋巴細胞數。圖10(C)表示抗體投予24小時後之小鼠之單核球數。圖10(D)表示抗體投予24小時後之小鼠之血小板數。於各圖中，圖表之縱軸顯示各細胞之個數(1×103個)。R1090(N)、R1090(C)及Epc112(C)分別指R1090S55A-Ep203、Ct R1090S55A-Ep203及Ct Epc112-R1066。使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體。21.4.1係投予1mg/kg，其他抗體係投予10mg/kg。
圖11(A)係表示評價CD40-EpCAM雙專一性抗體對移植了mEpCAM/B16F10之小鼠之抗腫瘤效果所獲得之結果。圖11(B)係表示評價CD40-EpCAM雙專一性抗體對移植了B16F10之小鼠之抗腫瘤效果所獲得之結果。於各圖中，縱軸顯示腫瘤體積(mm3)，橫軸顯示將投予日設為第0天之天數。使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體。21.4.1係投予1mg/kg，其他抗體係投予10mg/kg。
圖12(A)係表示異質(hetero)IgG型雙專一性抗體之結構。圖12(B)係表示Fab型雙專一性抗體片段之結構。圖12(C)係表示F(ab')2型雙專一性抗體。
圖13係表示CD40-EpCAM雙專一性抗體對與人EpCAM/Expi293細胞共培養之Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。橫軸顯示螢光強度，表示以1μg/mL添加各抗體時抗CD95抗體對Ramos細胞之結合性。關於比較對象，使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體。
圖14係表示CD40-EpCAM雙專一性抗體對與Expi293細胞共培養之Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。橫軸顯示螢光強度，表示以1μg/mL添加各抗體時抗CD95抗體對Ramos細胞之結合性。關於比較對象，使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體。
圖15(A)係表示CD40-EpCAM雙專一性抗體片段對與人EpCAM/Expi293細胞共培養之Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。圖15(B)係表示CD40-EpCAM雙專一性抗體片段對與Expi293細胞共培養之Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。於各圖中，橫軸顯示抗體濃度。又，縱軸顯示螢光強度，表示添加各抗體時抗CD95抗體對Ramos細胞之結合性。關於比較對象，使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用21.4.1作為抗CD40促效性抗體。
本發明係關於一種包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM結合之抗原結合區域之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段(以下記為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段)。
本發明中使用之CD40其含義等同於TNF受體超家族成員5(TNFRSF5，TNF receptor superfamily member 5)、Bp50、CDW40、MGC9013及p50。作為CD40，例如可列舉：NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中之包含GenBank序列登錄號(GenBank accession No.)NP_001241或序列編號6所表示之胺基酸序列之人CD40、及包含GenBank序列登錄號XP_005569274或序列編號8所表示之胺基酸序列之猴CD40等。又，例如可列舉：包含於序列編號6、GenBank序列登錄號NP_001241或GenBank序列登錄號XP_005569274所表示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列、且具備CD40之功能的多肽。
本發明之CD40亦包括：包含與序列編號6、GenBank序列登錄號NP_001241或GenBank序列登錄號XP_005569274所表示之胺基酸序列具有通常70%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上之同源性之胺基酸序列的多肽，包含具有最佳為95%、96%、97%、98%及99%以上之同源性之胺基酸序列、且具備CD40之功能的多肽。
具有於序列編號6、GenBank序列登錄號NP_001241或GenBank序列登錄號XP_005569274所表示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸殘基經缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽可採用定點突變導入法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proceeding of the National Academy of Sciences in USA,82,488(1985)]等，例如藉由對編碼序列編號6、GenBank序列登錄號NP_001241或GenBank序列登錄 號XP_005569274所表示之胺基酸序列之DNA導入定點突變而獲得。缺失、置換或附加之胺基酸之個數並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個胺基酸，更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
作為編碼CD40之基因，例如可列舉：序列編號5或GenBank序列登錄號NM_001250所表示之人CD40之鹼基序列、及序列編號7或GenBank序列登錄號XM_011766922所表示之猴CD40之鹼基序列等。又，本發明之編碼CD40之基因亦包括例如：含有如下DNA之基因，該DNA編碼包含於序列編號5或GenBank序列登錄號NM_001250所表示之鹼基序列中有1個以上之鹼基經缺失、置換或附加之鹼基序列、且具備CD40之功能的多肽；含有如下DNA之基因，該DNA編碼包含與序列編號5或GenBank序列登錄號NM_001250所表示之鹼基序列較佳為具有60%以上之同源性之鹼基序列、更佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列、且具備CD40之功能的多肽；以及含有如下DNA之基因，該DNA編碼含有與包含序列編號5或GenBank序列登錄號NM_001250所表示之鹼基序列之DNA於嚴格條件下進行雜交之DNA、且具備CD40之功能的多肽；等。
作為於嚴格條件下雜交之DNA，意指例如藉由如下方法所獲得之能夠進行雜交之DNA：將具有序列編號5或GenBank序列登錄號NM_001250所表示之鹼基序列之DNA用於探針之菌落雜交法、噬菌斑雜交法、南方墨點雜交法或DNA微陣列法等。具體而言，可列舉：使用固定有源自經雜交後之菌落或噬菌斑之DNA、或包含該序列之PCR產物或寡DNA的濾膜或載玻片，於存在0.7~1.0mol/L之氯化鈉之條件下，於65℃下進行雜交[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、DNA Cloning 1：Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University(1995)]後，使用0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成包含：150mmol/L氯化鈉及15mmol/L檸檬酸鈉)，於65℃條件下將濾膜或載玻片洗淨，藉此可鑑定之DNA。作為能夠進行雜交之DNA，例如可列舉：與序列編號5或GenBank序列登錄號NM_001250所表示之鹼基序列較佳為具有60%以上之同源性之DNA、更佳為具有80%以上之同源性之DNA、進而較佳為具有95%以上之同源性之DNA。
關於編碼真核生物之蛋白質之基因之鹼基序列，經常可見基因之多態性。本發明之編碼CD40之基因亦包括：於本發明所使用之基因因此種多態性而於鹼基序列中產生小規模突變而成之基因。
於無特別說明之情況下，本發明中之同源性之數值只要為採用業者公知之同源性檢索程式所算出之數值即可，關於鹼基序列，可列舉：於BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比對搜索工具)[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中使用預設參數(default parameter)所算出之數值等，關於胺基酸序列，可列舉：於BLAST2[Nucleic Acids Research,25,3389(1997)、Genome Research,7,649(1997)、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中使用預設參數所算出之數值等。
關於預設參數，G(Cost to open gap，開放空位罰分)於鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11；-E(Cost to extend gap，空位延伸罰分)於鹼基序列之情形時為2，於胺基酸序列之情形時為 1；-q(Penalty for nucleotide mismatch，核苷酸錯配罰分)為-3；-r(reward for nucleotide match，核苷酸匹配獎分)為1；-e(expect value，期望值)為10；-W(wordsize，序列長度)於鹼基序列之情形時為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基；-y[Dropoff(X)for blast extensions in bits，以位數表示之非空位延伸下降值]於blastn之情形時為20，於blastn以外之程式時為7；-X(X dropoff value for gapped alignment in bits，以位數表示之空位比對下降值)為15；及-Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits，以位數表示之最終空位比對下降值)於blastn之情形時為50，於blastn以外之程式時為25(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含CD40之胺基酸序列之部分序列之多肽可藉由業者公知之方法製作，例如可藉由如下方式製作：使編碼序列編號6、GenBank序列登錄號NP_001241或GenBank序列登錄號XP_005569274所表示之胺基酸序列之DNA之一部分缺失，對導入有包含該局部缺失DNA之表現載體之轉形體進行培養。又，基於藉由上述方法製作之多肽或DNA，利用與上述相同之方法，可獲得例如具有於序列編號6、GenBank序列登錄號NP_001241或GenBank序列登錄號XP_005569274所表示之胺基酸序列之部分序列中有1個以上之胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽。進而，包含CD40之胺基酸序列之部分序列的多肽、或具有於CD40之胺基酸序列之部分序列中有1個以上之胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽亦可藉由茀基甲氧基羰基(Fmoc)法、第三丁氧羰基(tBoc)法等化學合成法製造。
作為本發明中之CD40之細胞外區域，例如可列舉：採用公知 之跨膜區預測程式SOSUI(http：//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM ver.2(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http：//Ca.expasy.org/)等，對GenBank序列登錄號NP_001241所表示之人CD40之胺基酸序列進行預測所得出之區域等。具體而言，可列舉：序列編號6或GenBank序列登錄號NP_001241之第21號~第194號所表示之胺基酸序列。
作為CD40之功能，可列舉：於CD40配體或促效劑結合後誘導CD40訊號而引發各種作用。例如若於癌細胞中誘導CD40訊號，則會引起該癌細胞之細胞死亡或增殖抑制等。若於B淋巴細胞中誘導CD40訊號，則例如引起該B淋巴細胞之活化、促進CD95之表現、引起類型開關重組及體細胞超突變(somatic hypermutation)等，誘導產生抗原高親和性抗體等。若於樹狀細胞中誘導CD40訊號，則例如引起該樹狀細胞之熟化或產生IL-12。若於巨噬細胞中誘導CD40訊號，則例如引起M2巨噬細胞之表面標記物之減少，並誘導M1巨噬細胞之表面標記物之表現或產生促炎症(pro-inflammatory)細胞激素。
本發明中使用之EpCAM其含義等同於CD326、GA733-2、HEA125、KS1/4、MK-1、MH99、MOC31、323/A3、17-1A、CO-17A、ESA、EGP-2、EGP34、EGP40、KSA、KS1/4、TROP-1及TACST-1。
作為EpCAM，例如可列舉：包含GenBank序列登錄號AAH14785或序列編號16所表示之胺基酸序列之人EpCAM；包含GenBank序列登錄號NP_001035118或序列編號18所表示之胺基酸序列之猴EpCAM；或包含GenBank序列登錄號NP_032558或序列編號20所表示 之胺基酸序列之小鼠EpCAM等。又，例如可列舉：包含於序列編號16、GenBank序列登錄號AAH14785、GenBank序列登錄號NP_001035118或GenBank序列登錄號NP_032558所表示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列，且具備EpCAM之功能的多肽。
本發明之EpCAM亦包括：包含與序列編號16、GenBank序列登錄號AAH14785、GenBank序列登錄號NP_001035118或GenBank序列登錄號NP_032558所表示之胺基酸序列具有較佳為70%以上、更佳為80%以上、進而較佳為90%以上之同源性之胺基酸序列的多肽，包含具有最佳為95%、96%、97%、98%及99%以上之同源性之胺基酸序列、且具備EpCAM之功能的多肽。
具有於序列編號16、GenBank序列登錄號AAH14785、GenBank序列登錄號NP_001035118或GenBank序列登錄號NP_032558所表示之胺基酸序列所表示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸殘基經缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽可採用上述定點突變導入法等，例如藉由對編碼序列編號16、GenBank序列登錄號AAH14785、GenBank序列登錄號NP_001035118或GenBank序列登錄號NP_032558所表示之胺基酸序列之DNA導入定點突變而獲得。缺失、置換或附加之胺基酸之個數並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個胺基酸，更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
作為本發明中之編碼EpCAM之基因，例如可列舉：包含GenBank序列登錄號NM_002354或序列編號15所表示之鹼基序列之人EpCAM之基因；包含GenBank序列登錄號XM_015433685或序列編號17所表示之鹼基序列之猴EpCAM之基因；或者包含GenBank序列登錄號 NM_008532或序列編號19所表示之鹼基序列之小鼠EpCAM之基因。
又，本發明之編碼EpCAM之基因亦包括例如：含有如下DNA之基因，該DNA編碼包含於序列編號15、GenBank序列登錄號NM_002354、GenBank序列登錄號XM_015433685或GenBank序列登錄號NM_008532所表示之鹼基序列中有1個以上之鹼基經缺失、置換或附加之鹼基序列、且具備EpCAM之功能的多肽；含有如下DNA之基因，該DNA編碼包含與序列編號15、GenBank序列登錄號NM_002354、GenBank序列登錄號XM_015433685或GenBank序列登錄號NM_008532所表示之鹼基序列所表示之鹼基序列具有60%以上之同源性之鹼基序列、較佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列、且具備EpCAM之功能的多肽；及含有如下DNA之基因，該DNA編碼含有與包含序列編號15、GenBank序列登錄號NM_002354、GenBank序列登錄號XM_015433685或Gen accession No.NM_008532所表示之鹼基序列之DNA於嚴格條件下雜交之DNA、且具備EpCAM之功能的多肽；等。
作為本發明中之EpCAM之細胞外區域，例如可列舉：採用公知之跨膜區預測程式SOSUI(http：//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM ver.2(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http：//Ca.expasy.org/)等，對GenBank序列登錄號AAH14785所表示之人EpCAM之胺基酸序列進行預測所得出之區域等。具體而言，可列舉：序列編號10或GenBank序列登錄號AAH14785之第22號~第265號所表示之胺基酸序列。
作為EpCAM之功能，例如可列舉：非鈣離子依賴性細胞與細胞之黏著、及藉由上調C-Myc或細胞週期蛋白(Cyclin)A/E等而促進癌細胞增殖等。
所謂抗體係指源自編碼構成免疫球蛋白之重鏈之可變區及重鏈之恆定區、以及輕鏈之可變區及輕鏈之恆定區之全部或一部分之基因(稱為「抗體基因」)的蛋白質。本發明之抗體亦包括具有任意之免疫球蛋白類型及亞型之抗體或抗體片段。
所謂重鏈(H鏈)係指構成免疫球蛋白分子之2種多肽中之分子量較大一方之多肽。重鏈決定了抗體之類型與亞型。IgA、IgD、IgE、IgG及IgM分別具有α鏈、δ鏈、ε鏈、γ鏈及μ鏈作為重鏈，重鏈之恆定區係藉由不同之胺基酸序列來賦予特徵。所謂輕鏈(L鏈)係指構成免疫球蛋白分子之2種多肽中之分子量較小一方之多肽。於人類抗體之情形時，輕鏈存在κ鏈與λ鏈兩種。
所謂可變區(V區域)通常指存在於免疫球蛋白之N末端側之胺基酸序列內之富有多樣性之區域。可變區以外之部分由於採用多樣性較小之結構，故而稱為恆定區(C區域)。重鏈與輕鏈之各可變區締合而形成抗原結合部位，決定了抗體向抗原之結合特性。
於人類抗體之重鏈中，可變區相當於根據Kabat等人之EU索引(Kabat et.al.,Sequences of proteins of immunological interest,1991 Fifth edition)時之第1號至第117號之胺基酸序列，恆定區相當於第118號以後之胺基酸序列。於人類抗體之輕鏈中，可變區相當於根據Kabat等人之編號系統(Kabat numbering)時之第1號至第107號之胺基酸序列，恆定區相當於第108號以後之胺基酸序列。以下將重鏈可變區或輕鏈 可變區簡記為VH或VL。
抗原結合部位係抗體中識別並結合抗原之部位，指形成與抗原決定基(表位)互補之立體結構之部位。抗原結合部位會與抗原決定基之間產生較強之分子間相互作用。抗原結合部位係由包含至少3個互補決定區(CDR)之VH及VL所構成。於人類抗體之情形時，VH及VL分別具有3個CDR。該等CDR自N末端側起分別依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。
恆定區中之重鏈恆定區或輕鏈恆定區分別記為CH或CL。CH係根據重鏈之亞型(即，α鏈、δ鏈、ε鏈、γ鏈及μ鏈)進行分類。CH係由自N末端側起依序排列之CH1區、鉸鏈區、CH2區、CH3區所構成，將CH2區與CH3區並稱為Fc區域。另一方面，CL分為稱作Cλ鏈及Cκ鏈之2個亞型。
於本發明中，所謂抗CD40抗體係指特異性地識別CD40之細胞外區域並與其結合之單株抗體。又，於本發明中，所謂抗EpCAM抗體係指特異性地識別EpCAM之細胞外區域並與其結合之單株抗體。又，於本發明中，所謂抗體亦包括多株抗體及寡株抗體。
於本發明中，抗體或該抗體片段與CD40及EpCAM之至少一者之結合例如可藉由如下方式進行確認，即，使用公知之免疫學檢測法、較佳為螢光細胞染色法等來確認表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞與抗體之結合性。又，亦可將公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and Practice,Third Edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗手冊，Kodansha Scientific(1987)]等組合使用。
單株抗體係保持單一性(monoclonality)之抗體產生細胞所分泌之抗體，且識別單一之表位(亦稱為抗原決定基)。單株抗體分子彼此具有相同之胺基酸序列(1次結構)，結構單一。多株抗體係不同純系之抗體產生細胞所分泌之抗體分子之集團。寡株抗體係混合有複數個不同單株抗體之抗體分子之集團。
表位係指可被抗體識別並結合之抗原之結構部位。作為表位，例如可列舉：可被單株抗體識別並結合之單一之胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、結合有糖鏈之胺基酸序列、及包含結合有糖鏈之胺基酸序列之立體結構等。
作為本發明中之單株抗體，可列舉：利用融合瘤所產生之抗體、及利用經包含抗體基因之表現載體轉形而成之轉形體所產生之基因重組抗體。
融合瘤可藉由例如製備抗原，自經該抗原免疫之動物取得具有抗原特異性之抗體產生細胞，進而使該抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合而製備。藉由將該融合瘤進行培養，或藉由對動物投予該融合瘤使該融合瘤腹水癌化，將該培養液或腹水進行分離、純化而可取得所需之單株抗體。作為供抗原進行免疫之動物，只要能夠製作融合瘤，則可選用任意者，適宜採用小鼠、大鼠、倉鼠及兔等。又，亦可自此種被免疫動物取得具有抗體產生能力之細胞，於體外(in vitro)對該細胞實施免疫後，使之與骨髓瘤細胞融合而製作融合瘤。
作為本發明中之基因重組抗體，例如可列舉：重組小鼠抗體、重組大鼠抗體、重組倉鼠抗體、重組兔抗體、人類型嵌合抗體(亦稱為嵌合抗體)、人源化抗體(亦稱為CDR移植抗體)及人抗體等藉由基因重 組技術所製造之抗體。於基因重組抗體中，可根據對象動物種類或目的來決定採用源自何種動物之重鏈及輕鏈之可變區以及恆定區。例如，於對象動物種類為人之情形時，將可變區設為源自人或小鼠等非人動物，將恆定區及連接子設為源自人。
所謂嵌合抗體係指包含人以外之動物(非人動物)之抗體之VH及VL、與人抗體之CH及CL的抗體。作為非人動物，只要能夠製作融合瘤，則可選用小鼠、大鼠、倉鼠及兔等任意者。嵌合抗體可藉由如下方式製造：自生產單株抗體之源於非人動物之融合瘤取得編碼VH及VL之cDNA，分別插入至具有編碼人抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體而構建嵌合抗體表現載體，導入至動物細胞內使之表現。
所謂人源化抗體係指將非人動物抗體之VH及VL之CDR移植至人抗體之VH及VL之對應之CDR而獲得之抗體。VH及VL之CDR以外之區域稱為架構區(以下記為FR)。人源化抗體可藉由如下方式製造：構建編碼包含非人動物抗體之VH之CDR之胺基酸序列與任意之人抗體之VH之FR之胺基酸序列的VH之胺基酸序列之cDNA、以及編碼包含非人動物抗體之VL之CDR之胺基酸序列與任意之人抗體之VL之FR之胺基酸序列的VL之胺基酸序列之cDNA，分別插入至具有編碼人抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體而構建人源化抗體表現載體，導入至動物細胞內使之表現。
人抗體原本係指人體內天然存在之抗體，現今由於基因工程學、細胞工程學、發生工程學技術之進步，亦包括自人工製作之人抗體噬菌體庫(phage library)及產生人抗體之基因轉殖動物獲得之抗體等。
人體內天然存在之抗體可藉由以下方式取得：例如使人末 梢血液淋巴細胞感染EB病毒等而不死化，並進行選殖，藉此培養產生該抗體之淋巴細胞，自該培養上清液純化該抗體。
人抗體噬菌體庫係藉由將由人B細胞製備之抗體基因插入至噬菌體基因，使Fab、scFv等抗體片段於噬菌體表面表現所獲得之庫。可將對固定有抗原之基質之結合活性設為指標，從該庫中回收於表面表現具有所需抗原結合活性之抗體片段之噬菌體。進而可藉由基因工程方法將該抗體片段轉化為包含2條完整之H鏈及2條完整之L鏈之人抗體分子。
產生人抗體之基因轉殖動物意指於細胞內嵌入人抗體基因之動物。具體而言，例如藉由在小鼠ES細胞中導入人抗體基因，將該ES細胞移植入小鼠之初期胚後，使之成長為個體，而可製作產生人抗體之基因轉殖小鼠。源自產生人抗體之基因轉殖動物之人抗體可藉由如下方式製備：採用通常利用非人動物進行之融合瘤製作法取得融合瘤，進行培養，藉此於培養上清液中產生、蓄積抗體。
作為基因重組抗體之CH，只要屬於人免疫球蛋白則為任意，較佳為人免疫球蛋白(hIgG，human immunoglobulin G)類型者。進而，可使用屬於hIgG類型之hIgG1、hIgG2、hIgG3及hIgG4四種亞型之任一者。又，作為基因重組抗體之CL，只要屬於人免疫球蛋白則為任意，可使用κ類型或λ類型者。
於本發明中，所謂雙專一性抗體係指具有特異性不同之2種抗原結合區域、包含構成免疫球蛋白之重鏈之可變區及重鏈之恆定區以及輕鏈之可變區及輕鏈之恆定區之全部或一部分的蛋白質。雙專一性抗體之各抗原結合區域可與單一抗原之不同表位結合，亦可與不同抗原結合。
於本發明中，與CD40或EpCAM結合之抗原結合區域只要 為特異性地識別CD40或EpCAM並與之結合者則為任意。例如可為抗體、配體、受體、及天然存在之相互作用分子等藉由基因重組技術能夠製作之多肽、蛋白質分子及其片段、以及該蛋白質分子之低分子或與天然物之複合體等任意形態。
又，作為抗原結合區域，亦可為利用抗體、配體及受體等既知之結合分子之結合區域進行重組而成之結合蛋白質，具體而言，可列舉：包含與各抗原結合之抗體之CDR之重組蛋白質、包含CDR之抗體可變區、包含抗體可變區域及與各抗原結合之配體之結合區域的重組蛋白質等。其中，於本發明中，抗原結合區域較佳為抗體之可變區。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段可與於同一細胞上表現之CD40及EpCAM結合，亦可與於不同細胞上表現之CD40及EpCAM結合。
作為表現CD40之細胞，例如可列舉：B細胞、樹狀細胞(DC)、巨噬細胞及單核球等抗原提呈細胞、或Ramos細胞等癌細胞等。
作為表現EpCAM之細胞，例如可列舉：頭頸部癌、肺癌、消化系統癌、乳癌、泌尿系統癌等癌細胞。
作為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段，例如可列舉：具有CD40促效劑活性之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。作為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段，較佳為於不存在EpCAM分子或表現EpCAM之細胞之情況下不顯示CD40促效劑活性，僅於存在EpCAM分子或表現EpCAM之細胞之情況下顯示CD40促效劑活性的雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。此種雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段僅於存在表現EpCAM之細胞之癌等病變部位使CD40活化，因 此，不會產生伴隨全身性CD40活化而出現之副作用，於此點而言較佳。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段所具有之CD40促效劑活性係指藉由雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段與細胞上之CD40結合，而啟動該CD40介導之訊號，從而誘導抗原提呈細胞活化之活性、誘導腫瘤細胞死亡之活性等。
CD40促效劑活性可藉由例如評價Ramos細胞等表現CD40之細胞上之CD95表現量增加而進行確認。
即，作為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段，具體而言，可列舉：於存在表現EpCAM之細胞之情況下與EpCAM及CD40結合時，誘導表現CD40之抗原提呈細胞之活化及/或腫瘤細胞之細胞死亡的雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段等。
於本發明中，CD40拮抗劑活性係指對利用CD40配體或CD40促效劑之CD40活化產生抑制之活性等。例如對藉由CD40配體或CD40促效劑與CD40之結合而進行之訊號誘導產生抑制之活性等。
抗體之CD40拮抗劑活性可藉由例如利用CD40配體誘導之Ramos細胞等表現CD40之細胞上之CD95表現因抗體添加受到抑制而進行確認。
一分子之雙專一性抗體所具有之針對某抗原之結合區域之個數稱為結合之價數。例如，於本發明中，於一分子之雙專一性抗體具有2個與CD40結合之抗原結合區域及2個與EpCAM結合之抗原結合區域之情形時，該雙專一性抗體分別以二價與CD40及EpCAM結合。
於本發明中，每一分子之雙專一性抗體可以任意價數與CD40或EpCAM結合，但較佳為至少分別以二價與CD40及EpCAM結合。
又，本發明之雙專一性抗體亦包括：含有經由包含免疫球 蛋白區或其片段之連接子等適宜連接子結合之複數個抗原結合區域的抗體。
於本發明之雙專一性抗體中，與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM結合之抗原結合區域之位置可適當選擇。
本發明之雙專一性抗體可藉由現有製作技術([Nature Protocols,9,2450-2463(2014)]、國際公開第1998/050431號、國際公開第2001/7734號、國際公開第2002/002773號及國際公開第2009/131239號)等製作。
於本發明之雙專一性抗體中，相較於與EpCAM結合之抗原結合區域，與CD40結合之抗原結合區域可位於N末端側，亦可位於C末端側。
本發明之雙專一性抗體可使用抗體之V區域作為抗原結合區域，例如可列舉：含有於1條重鏈上包含複數個VH之重鏈之抗體、及含有兩條各包含1個VH之重鏈之抗體等。以下，有時將自含有於1條重鏈上包含複數個VH之重鏈之抗體之N末端起第1號VH表示為VH1、第2號VH表示為VH2、第n號VH表示為VHn。在含有於1條重鏈上包含2個VH之重鏈之抗體之情形時，將自N末端側起位於第1號之VH表示為VH1、位於第2號之VH表示為VH2。
作為含有於1條重鏈上包含複數個VH之重鏈之雙專一性抗體，更具體而言，可列舉：含有如下重鏈之抗體，該重鏈包含使用包含免疫球蛋白區或其片段之連接子所結合之2個以上之VH。
於使3個以上之VH結合之情形時，作為連接子，可使用不同之免疫球蛋白區或其片段，亦可使用相同之免疫球蛋白區或其片段。 又，於使2個以上之VH連結之情形時，可以各VH能夠特異性地與抗原結合之方式改變免疫球蛋白區或其片段之長度或種類。
本發明之雙專一性抗體具體而言具有下述(a)~(e)所示之至少1個特徵。
(a)1條重鏈多肽包含複數個(例如2~5個)不同之VH，且VH互不靠近；(b)VH經由10個胺基酸以上之多肽連接子而串聯(呈縱列狀)連結，更具體而言，VH係使用例如包含免疫球蛋白區之全部或一部分之胺基酸序列之連接子進行連結；(c)輕鏈與重鏈締合而形成抗原結合部位；(d)如圖1(A)或圖1(B)所示，具有包含2條重鏈多肽與至少4條輕鏈多肽之結構，且2條重鏈多肽間於鉸鏈區經由雙硫鍵而連結，輕鏈多肽與重鏈多肽之間亦經由雙硫鍵而連結；及(e)重鏈之恆定區包含例如天然型抗體重鏈之恆定區之全部或一部分(例如CH1片段、CH1、CH2、CH3、CH1-鉸鏈、CH1-鉸鏈-CH2及CH1-鉸鏈-CH2-CH3等)。
於本發明中，雙專一性抗體所含之抗CD40抗體之VH(意指源自抗CD40抗體之VH)與抗EpCAM抗體之VH(意指源自抗EpCAM抗體之VH)之位置可適當選擇。例如關於圖1(A)或圖1(B)所示結構之雙專一性抗體，相較於抗EpCAM抗體之VH，抗CD40抗體之VH可位於N末端側，亦可位於C末端側，但較佳為位於N末端側。
於本發明中，雙專一性抗體所含之VL為任意，可為相同或不同之VL。具有相同之VL、且可與兩個不同抗原或同一抗原上不同之兩 個表位結合的雙專一性抗體之VH只要為以各可變區能夠與各自之特異性抗原或表位結合之方式進行最佳化或改型之VH即可，例如可採用基於胺基酸改型之篩選、或噬菌體顯示等方法選擇適宜之VH。
本發明之雙專一性抗體所含之VL只要為抗CD40抗體或抗EpCAM抗體之VL，則可為任意者，較佳為含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL、以及含有序列編號22所表示之胺基酸序列之VL。
於本發明中，所謂連接子係指將複數個抗原結合區域進行結合之化學結構，較佳為多肽。作為本發明之雙專一性抗體所使用之連接子，例如可列舉：包含免疫球蛋白區之全部或一部分之胺基酸序列之連接子、及含有包含複數個免疫球蛋白區之多肽之全部或一部分之胺基酸序列之連接子等。
於本發明中，所謂C末端側多肽係指結合於複數個抗原結合區域中之最靠C末端側之抗原結合區域之C末端的多肽鏈。本發明之雙專一性抗體可具有或不具有C末端側多肽，較佳為具有C末端側多肽之雙專一性抗體。作為C末端側多肽，例如可列舉：包含免疫球蛋白區之全部或一部分之胺基酸序列之多肽、及含有包含複數個免疫球蛋白區之多肽之全部或一部分之胺基酸序列之多肽等。
關於包含免疫球蛋白區之一部分之胺基酸序列之連接子或C末端側多肽，選自免疫球蛋白中之胺基酸序列可為斷續亦可為連續，但較佳為連續之胺基酸序列。又，該胺基酸序列可包含鉸鏈區。
於本發明中，所謂免疫球蛋白區係以具有和免疫球蛋白類似之胺基酸序列、包含至少存在2個半胱胺酸殘基之約100個胺基酸殘基 之肽作為最小單位。於本發明中，免疫球蛋白區亦包括包含複數個上述最小單位之免疫球蛋白區之多肽。作為免疫球蛋白區，例如可列舉：免疫球蛋白重鏈之VH、CH1、CH2及CH3、以及免疫球蛋白輕鏈之VL及CL等。
免疫球蛋白之動物種類並無特別限定，較佳為人。又，免疫球蛋白重鏈之恆定區之亞型可列舉IgD、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2及IgE之任意者，較佳為源自IgG及源自IgM。又，免疫球蛋白輕鏈之恆定區之亞型可為κ及λ之任意者。
又，免疫球蛋白區亦存在於免疫球蛋白以外之蛋白質，例如可列舉：主要組織適合抗原(MHC(major histocompatibility complex，主要組織相容性複合體))、CD1、B7及T細胞受體(TCR)等屬於免疫球蛋白超家族之蛋白質所含之免疫球蛋白區。作為本發明之雙專一性抗體所使用之免疫球蛋白區，可選用任意適宜之免疫球蛋白區。
於人類抗體之情形時，CH1係指具有EU索引中所示之第118號至第215號胺基酸序列之區域。同樣地，CH2係指具有Kabat等人之EU索引中所示之第231號至第340號胺基酸序列之區域，CH3係指具有Kabat等人之EU索引中所示之第341號至第446號胺基酸序列之區域。CH1與CH2之間存在稱為鉸鏈(hinge)區域(以下有時亦記為鉸鏈)之富有柔軟性之胺基酸區域。鉸鏈區係指具有Kabat等人之EU索引中所示之第216號至第230號胺基酸序列之區域。
CL於為人類抗體之κ鏈之情形時，指具有Kabat numbering中所示之第108號至第214號胺基酸序列之區域，於為λ鏈之情形時，指具有第108號至第215號胺基酸序列之區域。
作為本發明之雙專一性抗體所使用之連接子及C末端側多 肽，可列舉：包含沿自N末端向C末端之方向依序排列之CH1-鉸鏈-CH2-CH3之免疫球蛋白區、包含CH1-鉸鏈-CH2之免疫球蛋白區、包含CH1-鉸鏈之免疫球蛋白區、包含CH1之免疫球蛋白區、CH1之N末端側之片段、包含第14號胺基酸殘基為Cys之14個胺基酸殘基之CH1片段、及包含自CH1之N末端起第1~14號胺基酸殘基之CH1片段、以及該等免疫球蛋白區片段之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸殘基經改型者，但並不限定於該等。
又，於本發明中，作為連接子及C末端側多肽之一例，可適當組合使用包含抗體之CH1、鉸鏈、CH2及CH3之胺基酸序列之整體或一部分片段。又，該等胺基酸序列可局部缺損，或可調換順序使用。又，用於連接子及C末端側多肽之抗體之亞型並無特別限定，較佳為IgM、或IgG4、或將IgG4之重鏈恆定區之第228號之Ser殘基置換為Pro、將第235號之Leu殘基置換為Asn並將第409號之Arg殘基置換為Lys的IgG4變異體(以下記為IgG4PE R409K)，更佳為IgG4及IgG4PE R409K。
於本發明中，作為連接子及C末端側多肽之例，可列舉：包含序列編號75所表示之IgG4之CH1之N末端第1~14號之14個胺基酸殘基之多肽、包含序列編號75所表示之IgG4之CH1之多肽、以及包含序列編號77所表示之IgG4PE R409K之CH(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)之多肽等，更佳為包含序列編號75所表示之IgG4之CH1之多肽及包含序列編號77所表示之IgG4PE R409K之CH之多肽。
本發明之雙專一性抗體所含之連接子與C末端側肽之組合可為任意者。作為本發明之雙專一性抗體，較佳為：包含如下連接子且包含如下C末端側肽之雙專一性抗體，該連接子含有包含序列編號75所表示 之胺基酸序列之IgG4之CH1，該C末端側肽含有包含序列編號77所表示之胺基酸序列之IgG4PE R409K之CH(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)；及包含如下連接子且包含如下C末端側肽之雙專一性抗體，該連接子含有包含序列編號77所表示之胺基酸序列之IgG4PE R409K之CH，該C末端側肽含有包含序列編號75所表示之胺基酸序列之IgG4之CH1。
本發明之雙專一性抗體之中，將如圖1(A)所示含有包含自N末端側起依序為VH1、CH1、VH2、CH1、鉸鏈、CH2及CH3之胺基酸序列之2條重鏈以及4條輕鏈的抗體稱為N末端型雙專一性抗體。又，將如圖1(B)所示含有包含自N末端側起依序為VH1、CH1、鉸鏈、CH2、CH3、VH2及CH1之胺基酸序列之2條重鏈以及4條輕鏈的抗體稱為C末端型雙專一性抗體。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段亦包括：構成本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸殘基缺失、附加、置換或插入，且具有與上述雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段相同之活性的雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。
缺失、置換、插入及/或附加之胺基酸之個數為1個以上，該個數係藉由Molecular Cloning,The Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Willy & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等中記載之定點突變導入法等周知技術能夠實現之缺失、置換、插入或附加程度之個數，並無特別限定。例如通常 為1~數十個，較佳為1~20個，更佳為1~10個，進而較佳為1~5個。
上述本發明之雙專一性抗體之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸殘基缺失、置換、插入或附加係表示如下情況。意指於同一序列中之任意、且一或複數條胺基酸序列中存在1個或複數個胺基酸殘基缺失、置換、插入或附加之情況。又，亦存在同時發生缺失、置換、插入或附加之情況，置換、插入或附加之胺基酸殘基有可能為天然型或非天然型之任意者。
作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉：L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-精胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯基丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸及L-半胱胺酸等。
以下例示能夠相互置換之胺基酸殘基之較佳例。同一群中包含之胺基酸殘基能夠相互置換。
A群：白胺酸、異白胺酸、甘白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、O-胺基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸
B群：天冬胺酸、麩胺酸、異天冬胺酸、異麩胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸
C群：天冬醯胺、麩醯胺
D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸
E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸
F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸
G群：苯基丙胺酸、酪胺酸
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段亦包括包含經轉譯後修飾之某種胺基酸殘基之抗體。作為轉譯後修飾，例如可列舉：H鏈之C末端之離胺酸殘基缺失[離胺酸‧剪切(lysine clipping)]、及多肽之N末端之麩醯胺殘基被置換為焦麩胺酸(pyroGlu)等[Beck et al,Analytical Chemistry,85,715-736(2013)]。
作為本發明之雙專一性抗體，具體而言，可列舉選自由下述(1)~(3)所組成之群中之任一種雙專一性抗體等。
(1)包含抗CD40抗體之V區域(意指源自抗CD40抗體之V區域)以及抗EpCAM抗體之V區域(意指源自抗EpCAM抗體之V區域)的雙專一性抗體、 (2)包含抗CD40抗體之VH之CDR1~3及VL之CDR1~3、以及抗EpCAM抗體之VH之CDR1~3及VL之CDR1~3的雙專一性抗體、以及 (3)包含抗CD40抗體之VH及VL、以及抗EpCAM抗體之VH及VL的雙專一性抗體。
於上述(2)所記載之雙專一性抗體中，抗CD40抗體之VL之CDR1~3與抗EpCAM抗體之VL之CDR1~3分別可相同亦可不同，較佳為相同。
又，於上述(3)所記載之雙專一性抗體中，抗CD40抗體之VL與抗EpCAM抗體之VL可相同亦可不同，較佳為相同。
本發明之抗CD40抗體可具有或不具有CD40促效劑活性，較佳為不具有CD40促效劑活性之抗CD40抗體。又，本發明之抗CD40抗體可具有或不具有CD40拮抗劑活性，較佳為不具有CD40拮抗劑活性之抗 CD40抗體。
作為本發明之抗CD40抗體之一例，可列舉如下抗CD40抗體，其具有：含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL、以及選自以下之(1a)~(1d)中之任一個VH。
(1a)含有分別包含序列編號28、29及30所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH、(1b)含有分別包含序列編號33、34及35所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH、(1c)含有分別包含序列編號38、39及40所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH、(1d)含有分別包含序列編號43、44及45所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH。
本發明之抗CD40抗體亦包括：包含和上述(1a)~(1d)之任一者所表示之VH之CDR1~3之胺基酸序列及序列編號23~25分別所表示之VL之CDR1~3之胺基酸序列分別至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同之VH及VL之CDR1~3之胺基酸序列的抗CD40抗體。
本發明之抗CD40抗體亦包括下述(i)或(ii)記載之抗體。
(i)和具有含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL以及上述(1a)~(1d)之任一者所表示之VH的抗CD40抗體競爭與CD40結合之抗體。
(ii)和具有含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL以及上述(1a)~(1d)之任一者所表示之VH的抗CD40抗體於同一表位結合之抗體。
作為本發明之抗CD40抗體之另一例，可列舉：含有包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL及包含序列編號27、32、37或42所表示之胺基酸序列之VH的抗CD40抗體。
作為本發明之抗EpCAM抗體之一例，可列舉如下抗EpCAM抗體，其具有：含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL、以及選自以下之(2a)~(2d)中之任一個VH。
(2a)含有分別包含序列編號52、53及54所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH、(2b)含有分別包含序列編號57、58及59所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH、(2c)含有分別包含序列編號62、63及64所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH、(2d)含有分別包含序列編號67、68及69所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH。
本發明之抗EpCAM抗體亦包括：包含和上述(2a)~(2d)之任一者所表示之VH之CDR1~3之胺基酸序列及序列編號23~25分別所表示之VL之CDR1~3之胺基酸序列分別至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%相同之VH及VL之CDR1~3之胺基酸序列的抗EpCAM抗體。
本發明之抗EpCAM抗體亦包括下述(i)或(ii)記載之抗體。
(i)和具有含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL以及上述(2a)~(2d)之任一者所表示之VH的抗EpCAM抗體競爭與EpCAM結合之抗體。
(ii)和具有含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL以及上述(2a)~(2d)之任一者所表示之VH的抗EpCAM抗體於同一表位結合之抗體。
作為本發明之抗EpCAM抗體之另一例，可列舉：含有包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL及包含序列編號51、56、61或66所表示之胺基酸序列之VH的雙專一性抗體。
作為本發明之雙專一性抗體，更具體而言，可列舉如下雙專一性抗體，其具有：含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL、以及以下之(i)或(ii)所表示之VH1及VH2。
(i)含有包含序列編號28、29及30，序列編號33、34及35，序列編號38、39及40，或序列編號43、44及45分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的與CD40結合之VH1；以及含有包含序列編號52、53及54，序列編號57、58及59，序列編號62、63及64，或序列編號67、68及69分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的與EpCAM結合之VH2。
(ii)含有包含序列編號52、53及54，序列編號57、58及59，序列編號62、63及64，或序列編號67、68及69分別所表示之胺基酸序列之CDR1、 2及3的與EpCAM結合之VH1；以及含有包含序列編號28、29及30，序列編號33、34及35，序列編號38、39及40，或序列編號43、44及45分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的與CD40結合之VH2。
作為本發明之雙專一性抗體之另一具體例，可列舉：含有包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL以及以下之(i)或(ii)所表示之VH1及VH2的雙專一性抗體。
(i)包含序列編號27、32、37或42所表示之胺基酸序列的與CD40結合之VH1；及包含序列編號51、56、61或66所表示之胺基酸序列的與EpCAM結合之VH2。
(ii)包含序列編號51、56、61或66所表示之胺基酸序列的與EpCAM結合之VH1；及包含序列編號27、32、37或42所表示之胺基酸序列的與CD40結合之VH2。
作為本發明之一態樣，可列舉如下雙專一性抗體：其含有包含自N末端起依序為VH1-X-VH2-Y之式{式中，VH1表示第一抗體之VH(意指源自第一抗體之VH)，VH2表示第二抗體之VH(意指源自第二抗體之VH)，X及Y分別表示多肽(此處，X及Y之至少一者進而包含抗體之鉸鏈區)；以下記為式(I)}所表示之多肽之重鏈，該第一抗體及第二抗體之任一者為抗CD40抗體，另一者為抗EpCAM抗體。
作為上述式(I)中之X及Y，例如可列舉：包含各抗體之CH1、CH2、CH3及鉸鏈之任一者之多肽(此處，X及Y之至少一者進而包 含抗體之鉸鏈區)。
作為本發明之一態樣，可列舉：上述式(I)中之X及Y之任一者為CH1，另一者為CH1、CH2、CH3及鉸鏈之多肽。具體而言，例如可列舉：X為包含人IgG4或人IgG1之CH1、鉸鏈、CH2及CH3之多肽，且Y為包含人IgG4或人IgG1之CH1之多肽；X為包含人IgG4之恆定區中之第228號為Pro、第235號為Glu及第409號為Lys之恆定區之多肽，且Y為包含人IgG4或人IgG1之CH1之多肽；X為包含人IgG4或人IgG1之CH1之多肽，且Y為包含人IgG4或人IgG1之CH1、鉸鏈、CH2及CH3之多肽；X為包含人IgG4或人IgG1之CH1之多肽，且Y為包含人IgG4之恆定區中之第228號為Pro、第235號為Glu及第409號為Lys之恆定區之多肽；X為包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽，Y為包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽；X為包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽，Y為包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽。
作為本發明之一態樣，更佳為含有包含式(I)所表示之多肽之2條相同重鏈之雙專一性抗體，進而較佳為含有包含式(I)所表示之多肽之2條相同重鏈及4條相同輕鏈或兩種(每種各有相同之2條)輕鏈之雙專一性抗體，進而更佳為含有包含式(I)所表示之多肽之2條相同重鏈及4條相同輕鏈之雙專一性抗體。
於上述較佳態樣中，較佳為相同之2條重鏈經由鉸鏈區之半胱胺酸殘基進行雙硫鍵結而形成聚合物。又，較佳為1條重鏈經由CH1之半胱胺酸殘基與輕鏈之恆定區之半胱胺酸殘基進行雙硫鍵結而形成聚合物。因此，本發明之雙專一性抗體較佳為具有由2條重鏈與4條輕鏈聚合形成之雜六聚體(hetero-hexamer)結構。
作為本發明之一較佳態樣，可列舉如下雙專一性抗體，其含有：2條重鏈，該重鏈包含式(I){自N末端起依序為VH1-X-VH2-Y之式{式中，VH1表示第一抗體之VH，VH2表示第二抗體之VH，X表示包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽，Y表示包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽}}所表示之多肽，及4條輕鏈，該輕鏈具有含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL，並且上述VH1及VH2為下述(i)或(ii)所示之VH。
(i)VH1為含有包含序列編號28、29及30，序列編號33、34及35，序列編號38、39及40，或序列編號43、44及45分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人CD40抗體之VH；VH2為含有包含序列編號52、53及54，序列編號57、58及59，序列編號62、63及64，或序列編號67、68及69分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人EpCAM抗體之VH。
(ii)VH1為含有包含序列編號52、53及54，序列編號57、58及59，序列編號62、63及64，或序列編號67、68及69分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人EpCAM抗體之VH；VH2為含有包含序列編號28、29及30，序列編號33、34及35，序列編號38、39及40，或序列編號43、44及45分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人CD40抗體之VH。
此處，輕鏈可為λ鏈亦可為κ鏈，較佳為κ鏈。
又，此處，作為VH1為含有分別包含序列編號33、34及35所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人CD40抗體之VH，且VH2為含有分別包含序列編號57、58及59所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗 人EpCAM抗體之VH的雙專一性抗體之一例，可列舉R1090S55A-Ep203。
作為本發明之又一較佳態樣，可列舉如下雙專一性抗體，其含有：2條重鏈，該重鏈包含式(I){自N末端起依序為VH1-X-VH2-Y之式{式中，VH1表示第一抗體之VH，VH2表示第二抗體之VH，X表示包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽，Y表示包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽}}所表示之多肽，及4條輕鏈，該輕鏈具有包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL，並且上述VH1及VH2為下述(i)或(ii)所示之VH。
(i)VH1為包含序列編號27、32、37或42所表示之胺基酸序列的抗人CD40抗體之VH；VH2為包含序列編號51、56、61或66所表示之胺基酸序列的抗人EpCAM抗體之VH。
(ii)VH1為包含序列編號51、56、61或66所表示之胺基酸序列的抗人EpCAM抗體之VH；VH2為包含序列編號27、32、37或42所表示之胺基酸序列的抗人CD40抗體之VH。
此處，輕鏈可為λ鏈亦可為κ鏈，較佳為κ鏈。
又，此處，作為VH1為包含序列編號32所表示之胺基酸序列的抗人CD40抗體之VH，且VH2為包含序列編號56所表示之胺基酸序列的抗人EpCAM抗體之VH的雙專一性抗體之一例，可列舉R1090S55A-Ep203。
作為本發明之一較佳態樣，可列舉如下雙專一性抗體，其 含有：2條重鏈，該重鏈包含式(I){自N末端起依序為VH1-X-VH2-Y之式{式中，VH1表示第一抗體之VH，VH2表示第二抗體之VH，X表示包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽，Y表示序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽}}所表示之多肽；及4條輕鏈，該輕鏈具有含有分別包含序列編號23、24及25所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL，並且上述VH1及VH2為下述(i)或(ii)所示之VH。
(i)VH1為含有包含序列編號28、29及30，序列編號33、34及35，序列編號38、39及40，或序列編號43、44及45分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人CD40抗體之VH；VH2為含有包含序列編號52、53及54，序列編號57、58及59，序列編號62、63及64，或序列編號67、68及69分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人EpCAM抗體之VH。
(ii)VH1為含有包含序列編號52、53及54，序列編號57、58及59，序列編號62、63及64，或序列編號67、68及69分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人EpCAM抗體之VH；VH2為含有包含序列編號28、29及30，序列編號33、34及35，序列編號38、39及40，或序列編號43、44及45分別所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人CD40抗體之VH。
此處，輕鏈可為λ鏈亦可為κ鏈，較佳為κ鏈。
又，此處，作為VH1為含有分別包含序列編號33、34及35所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人CD40抗體之VH，且VH2為含有分別包含序列編號57、58及59所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人EpCAM抗體之VH的雙專一性抗體之一例，可列舉Ct R1090S55A- Ep203。
又，作為VH1為含有分別包含序列編號67、68及69所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人EpCAM抗體之VH，且VH2為含有分別包含序列編號28、29及30所表示之胺基酸序列之CDR1、2及3的抗人CD40抗體之VH的雙專一性抗體之一例，可列舉Ct Epc112-R1066。
作為本發明之又一較佳態樣，可列舉如下雙專一性抗體，其含有：2條重鏈，該重鏈包含式(I){自N末端起依序為VH1-X-VH2-Y之式{式中，VH1表示第一抗體之VH，VH2表示第二抗體之VH，X表示包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽，Y表示序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽}}所表示之多肽，及4條輕鏈，該輕鏈具有包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL，並且上述VH1及VH2為下述(i)或(ii)所示之VH。
(i)VH1為包含序列編號27、32、37或42所表示之胺基酸序列的抗人CD40抗體之VH；VH2為包含序列編號51、56、61或66所表示之胺基酸序列的抗人EpCAM抗體之VH。
(ii)VH1為包含序列編號51、56、61或66所表示之胺基酸序列的抗人EpCAM抗體之VH；VH2為包含序列編號27、32、37或42所表示之胺基酸序列的抗人CD40抗體之VH。
此處，輕鏈可為λ鏈亦可為κ鏈，較佳為κ鏈。
又，此處，作為VH1為包含序列編號32所表示之胺基酸序列的抗人CD40抗體之VH，且VH2為包含序列編號56所表示之胺基酸序列 的抗人EpCAM抗體之VH的雙專一性抗體之一例，可列舉Ct R1090S55A-Ep203。
又，作為VH1為包含序列編號66所表示之胺基酸序列的抗人EpCAM抗體之VH，且VH2為包含序列編號27所表示之胺基酸序列的抗人CD40抗體之VH的雙專一性抗體之一例，可列舉Ct Epc112-R1066。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段亦包括具有效應器活性之抗體或該雙專一性抗體片段。
所謂效應器活性係指經由抗體之Fc區域所引起之抗體依賴性之細胞毒殺活性，例如可列舉：抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性，Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity activity)、補體依賴性細胞毒殺活性(CDC活性，Complement-Dependent Cytotoxicity activity)、巨噬細胞或樹狀細胞等吞噬細胞之抗體依賴性吞噬活性(ADCP活性，Antibody-dependent cellular phagocytosis activity)及調理作用(opsonization)等。
於本發明中，ADCC活性及CDC活性可採用公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行測定。
所謂ADCC活性係指已與靶細胞上之抗原結合之抗體經由抗體之Fc區域而與免疫細胞之Fc受體結合，藉此使免疫細胞(自然殺手細胞等)活化，從而毒殺靶細胞之活性。
Fc受體(FcR)係與抗體之Fc區域結合之受體，藉由抗體之結合而誘發各種效應器活性。各FcR對應於抗體之亞型，IgG、IgE、IgA、IgM分別特異性地與FcγR、FcεR、FcαR、FcμR結合。進而，FcγR存在FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之亞型，各亞型存在 FcγRIA、FcγRIB、FcγRIC、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA及FcγRIIIB之同功異型物。該等不同之FcγR存在於不同之細胞上[Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)]。於人體中，FcγRIIIB特異性地表現於嗜中性球，FcγRIIIA表現於單核球、自然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞及一部分T細胞。藉由抗體向FcγRIIIA之結合，而誘發NK細胞依賴性之ADCC活性。
所謂CDC活性係指已與靶細胞上之抗原結合之抗體使包含血液中之補體相關蛋白群之一連串級聯反應(補體活化路徑)活化，而毒殺靶細胞之活性。又，藉由因補體活化而產生之蛋白質片段來誘導免疫細胞之趨化及活化。關於CDC活性之級聯反應，首先，C1q結合至Fc區域，繼而，與作為2個絲胺酸蛋白酶之C1r及C1s結合，藉此形成C1複合體而開始。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段對抗原表現細胞之CDC活性或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行評價。
作為控制本發明之雙專一性抗體之效應器活性之方法，已知如下方法：對與抗體之Fc區域(包含CH2及CH3區之恆定區)之第297號天冬醯胺(Asn)結合之N-結合複合型糖鏈之還原末端處存在之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)上以α-1,6結合之岩藻糖(亦稱為核心岩藻糖)之量進行控制之方法(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號及國際公開第00/61739號)，或者藉由抗體之Fc區域之胺基酸殘基之改型而加以控制之方法(國際公開第00/42072號)等。
藉由控制雙專一性抗體上加成之岩藻糖之量，可增強或減 弱抗體之ADCC活性。例如作為降低與抗體之Fc結合之N-結合複合型糖鏈上結合之岩藻糖之含量之方法，藉由使用缺失α1,6-岩藻糖基轉移酶基因之宿主細胞表現雙專一性抗體，可取得具有較高ADCC之雙專一性抗體。另一方面，作為增加與雙專一性抗體之Fc結合之N-結合複合型糖鏈上結合之岩藻糖之含量之方法，藉由使用導入α1,6-岩藻糖基轉移酶基因之宿主細胞表現抗體，可取得具有較低ADCC活性之雙專一性抗體。
又，藉由將雙專一性抗體之Fc區域之胺基酸殘基進行改型，可增強或減弱ADCC活性或CDC活性。例如藉由使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書中記載之Fc區域之胺基酸序列，可增強雙專一性抗體之CDC活性。又，藉由進行美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書或美國專利第7,317,091號說明書等中記載之胺基酸改型，可增強或減弱ADCC活性或CDC活性。
進而，藉由上述方法之組合，亦可取得效應器活性經控制之雙專一性抗體。
本發明之雙專一性抗體之穩定性可藉由測定於純化過程或一定條件下保存之樣本中形成之凝集體(寡聚物)量而進行評價。即，將同一條件下凝集體量減少之情形評價為抗體之穩定性提高。凝集體量可藉由採用包括凝膠過濾層析法之適宜層析法將凝集抗體與未凝集抗體加以分離而進行測定。
本發明之雙專一性抗體之生產性可藉由測定抗體產生細胞於培養液中產生之抗體量而進行評價。更具體而言，可藉由利用HPLC法或ELISA法等適宜方法測定自培養液去除產生細胞後之培養上清液中所含之抗體之量而進行評價。
於本發明中，所謂抗體片段係包含抗原結合區域而對該抗原具有結合活性之蛋白質。於本發明中，作為抗體片段，例如可列舉：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、diabody、dsFv或包含CDR之肽等。
Fab係利用蛋白質分解酶木瓜酶處理IgG抗體而獲得之片段中的(於H鏈之第224號胺基酸殘基部位被切斷的)H鏈之N末端側約一半與L鏈整體經由雙硫鍵(S-S鍵)結合之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
F(ab')2係利用蛋白質分解酶胃蛋白酶處理IgG而獲得之片段中的(於H鏈之第234號胺基酸殘基部位被切斷)的與Fab經由鉸鏈區之S-S鍵結合而成者相比稍大之分子量約10萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
Fab'係將上述F(ab')2之鉸鏈區之S-S鍵切斷而獲得之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
scFv係使用12個殘基以上之適宜之肽連接子(P)連結1條VH與1條VL而獲得之VH-P-VL或VL-P-VH多肽形式之具有抗原結合活性之抗體片段。
Diabody係抗原結合特異性相同或不同之scFv形成二聚物而成的對同一抗原具有二價之抗原結合活性或分別對不同抗原具有特異性抗原結合活性之抗體片段。
dsFv係使VH及VL中之各1個胺基酸殘基經半胱胺酸殘基置換之多肽經由該半胱胺酸殘基間之S-S鍵進行結合而成者。
包含CDR之肽係包含VH或VL之CDR之至少1個區域而構成。包含複數個CDR之肽可藉由使CDR彼此直接結合或經由適宜肽連接 子結合而製作。包含CDR之肽可藉由構建編碼本發明之雙專一性抗體之VH及VL之CDR之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，於原核生物或真核生物中導入該表現載體而使之表現、製造。又，包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法製造。
本發明之雙專一性抗體片段於本質上係由雙專一性抗體之局部結構所構成的包含雙專一性抗體之抗原結合部位特異性不同之2種抗原結合區域而對該2種抗原分別具有結合活性之蛋白質。
作為本發明之雙專一性抗體片段，例如可列舉：圖12(B)所示之Fab型雙專一性抗體片段、圖12(C)所示之F(ab')2型雙專一性抗體片段。
包含基於抗體之效應器活性之增強或減弱、抗體之穩定化、及血中半衰期之控制之目的而進行之胺基酸殘基改型的Fc區域亦可用於本發明之雙專一性抗體。
作為本發明之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段，包括藉由化學方法或基因工程方法於本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段上結合放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、蛋白質或抗體醫藥等而成之抗體之衍生物。
本發明中之抗體之衍生物可藉由採用化學方法[抗體工程入門，地人書館(1994)]，於本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或C末端側、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段中之適宜之置換基或側鏈、進而該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段中之糖鏈等上結合放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、免疫活化劑、蛋白質或抗體醫藥等而製造。
又，本發明中之抗體之衍生物可藉由如下基因工程方法製造，即，將編碼本發明之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段之DNA與編碼所需蛋白質或抗體醫藥之DNA進行連結後插入至表現載體，於適宜之宿主細胞中導入該表現載體而使之表現。
作為放射性同位素，例如可列舉：111In、131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位素可藉由氯胺T法等與抗體直接結合。又，亦可使螯合放射性同位素之物質與抗體結合。作為螯合劑，例如可列舉：1-異硫氰酸基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作為低分子之藥劑，例如可列舉：烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物鹼、拓樸異構酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學，癌與化學療法公司(1996)]、氫化可體松或潑尼松等類固醇劑、阿司匹林或吲哚美辛等非類固醇劑、硫代蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)或青黴胺等免疫調節劑、環磷醯胺或硫唑嘌呤等免疫抑制劑或馬來酸氯苯那敏或氯馬斯汀之類的抗組織胺劑等抗炎症劑[炎症與抗炎症療法，醫齒藥出版股份有限公司(1982)]等。
作為抗癌劑，例如可列舉：胺磷汀(amifostine)(ETHYOL)、順鉑、達卡巴嗪(DTIC)、放線菌素D(dactinomycin)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)(氮芥(nitrogen mustard))、鏈脲佐菌素(streptozocin)、環磷醯胺、異環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星(阿德力黴素)、表柔比星、吉西他濱(GEMZAR)、柔紅黴素、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂 黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春花鹼、長春新鹼、博來黴素、道諾黴素、培洛黴素、雌莫司汀、紫杉醇(泰克索(TAXOL))、歐洲紫杉醇(泰索帝(TAXOTERE))、阿地白介素(aldesleukin)、門冬醯胺酶、白消安、卡鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)、奈達帕汀、克拉屈濱、喜樹鹼、10-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、氟脲苷(floxuridine)、氟達拉濱、羥基脲(hydroxy urea)、依達比星、美司鈉(Mesna)、伊立替康(CPT-11)、nogitecan、米托蒽醌、拓朴替康(topotecan)、亮脯利特(leuprolide)、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、羥基脲(hydroxy carbamide)、普卡黴素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他汀(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林(leuprorelin)、氟他胺、替尼泊苷、睾內酯酮(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噻替派、尿嘧啶芥(uracil mustard)、長春瑞賓、苯丁酸氮芥、氫化可體松(hydrocortisone)、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀(semustine)、卡培他濱(capecitabine)、拓優得(tomudex)、阿紮胞苷、UFT、oxaloplatin、吉非替尼(IRESSA)、伊馬替尼(STI571)、埃羅替尼、FMS樣酪胺酸激酶3(Flt3，FMS-like tyrosine kinase 3)抑制劑、血管內皮生長因子受體(VEGFR，vascular endothelial growth factor receptor)抑制劑、成纖維細胞生長因子受體(FGFR，fibroblast growth factor receptor)抑制劑、特羅凱(tarceva)等表皮生長因子受體(EGFR，epidermal growth factor receptor)抑制劑、根赤殼菌素(radicicol)、17-烯丙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素、雷帕黴素(rapamycin)、安吖啶、全反式視黃酸、沙利竇邁、來那度胺、阿那曲唑、法倔唑、來曲唑、依西美坦、布西拉明 (bucillamine)、咪唑立賓、環孢素、氫化可體松(hydrocortisone)、蓓薩羅丁(bexarotene)(塔革雷汀(TARGRETIN))、地塞米松、助孕素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧德(ARIMIDEX))、leupirin、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、硫唑嘌呤、青黴胺、硫代蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)、馬來酸氯苯那敏、氯芬尼拉明、氯馬斯汀、維生素A酸、蓓薩羅丁(bexarotene)、砷、硼替佐米、別嘌呤醇、卡利奇黴素(calicheamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、塔革雷汀(TARGRETIN)、奧唑米星(ozogamine)、克拉黴素(clarithromycin)、亞葉酸、酮康唑(ketoconazole)、氨魯米特(aminoglutethimide)、蘇拉明(suramine)、甲胺喋呤(Methotrexate)或美登醇(maytansinoid)或其衍生物等。
作為低分子之藥劑與本發明之雙專一性抗體之結合方法，例如可列舉：使藥劑與該抗體之胺基間經由戊二醛而結合之方法、或使藥劑之胺基與該抗體之羧基經由水溶性碳二醯亞胺而結合之方法等。
作為高分子之藥劑，可列舉：聚乙二醇(PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-順丁烯二酸共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、吡喃共聚物、或羥基丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與本發明之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段結合，可期待(1)應對化學性、物理性或生物性之各種因子時之穩定性之提昇，(2)血中半衰期之顯著延長，或(3)免疫原性之消失或抗體產生之抑制等效果[生物軛合物(bioconjugates)醫藥品，廣川書店(1993)]。
例如，作為PEG與本發明之雙專一性抗體之結合方法，可列舉與PEG化修飾試劑進行反應之方法等[生物軛合物醫藥品，廣川書店 (1993)]。作為PEG化修飾試劑，可列舉：針對離胺酸之ε-胺基的修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、針對天冬胺酸及麩胺酸之羧基的修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)、或針對精胺酸之胍基的修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
作為免疫活化劑，可為已知作為免疫佐劑之天然物，作為具體例，可列舉免疫促進藥劑：β(1→3)葡聚糖(例如香菇多糖或裂襇菌素)、或α-半乳糖神經醯胺(KRN7000)等。
作為蛋白質，例如可列舉：使NK細胞、巨噬細胞或嗜中性球等免疫活性(適格)細胞活化之細胞激素或增殖因子或毒素蛋白質等。
作為細胞激素或增殖因子，例如可列舉：干擾素(以下記為IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、介白素(以下記為IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒球菌落刺激因子(G-CSF)、顆粒球/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)或巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)等。
作為毒素蛋白質，例如可列舉：蓖麻毒蛋白、白喉毒素或ONTAK(Denileukin Diftitox，地尼白介素)等，亦包括為了調節毒性而於蛋白質中導入變異之蛋白質毒素。
與蛋白質或抗體醫藥之融合抗體可藉由在編碼本發明之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段之cDNA上連結編碼蛋白質之cDNA而構建編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至原核生物或真核生物用表現載體，於原核生物或真核生物中導入該表現載體而使之表現、製造。
於使用上述抗體之衍生物作為檢測方法、定量方法、檢測用試劑、定量用試劑或診斷藥之情形時，作為與本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段結合之藥劑，可列舉通常之免疫學檢測或測定法所採 用之標記物。作為標記物，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶或螢光素酶等酶、吖啶鎓酯或咯吩等發光物質、或者螢光素異硫氰酸鹽(FITC)或四甲基若丹明異硫氰酸鹽(RITC)、Alexa(註冊商標)Fluor 488、R-藻紅素(phycoerythrin)(R-PE)等螢光物質等。
本發明包括具有CDC活性或ADCC活性等細胞毒殺活性之雙專一性抗體及該雙專一性抗體片段。本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段對抗原表現細胞之CDC活性或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行評價。
又，本發明係關於一種包含特異性地識別CD40及EpCAM並與其結合之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之組合物，或者含有該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段作為有效成分之與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病、較佳為與CD40及EpCAM之表現細胞相關之疾病之治療藥。
作為與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病，可為例如與CD40及EpCAM之至少一者存在關聯之任意疾病，例如可列舉惡性腫瘤及癌等。
於本發明中，作為惡性腫瘤及癌，例如可列舉：大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、神經膠質瘤、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、膽管癌、食道癌、肝癌、頭頸癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、前列腺癌、絨膜癌、咽頭癌、喉頭癌、間皮瘤、胸膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、星狀細胞瘤、神經 纖維瘤、少突神經膠質瘤、神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、膠質母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤及威爾姆斯瘤等。
含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段或該等之衍生物之治療藥可僅包含作為有效成分之該抗體或該雙專一性抗體片段或該等之衍生物，但通常較佳為以與藥理學上容許之1種以上之載體一起混合，藉由製劑學技術領域公知之任意方法所製造之醫藥製劑之形式提供。
投予路徑較佳為採用於治療時最具效果者，例如可列舉：經口投予、或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌肉內或靜脈內等非經口投予。其中，較佳為靜脈內投予。
作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
投予量或投予次數根據目標治療效果、投予方法、療程、年齡及體重等而異，通常成人每天10μg/kg~10mg/kg。
進而，本發明係關於一種含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段的CD40及EpCAM之至少一者之免疫學檢測用或測定用試劑，或者與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病、較佳為與CD40及EpCAM之表現細胞相關之疾病之診斷藥。又，本發明係關於一種使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段的CD40及EpCAM之至少一者之免疫學檢測用或測定用方法，或者與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病、較佳為與CD40及EpCAM之表現細胞相關之疾病之治療方法、或與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病、較佳為與CD40及EpCAM之表現 細胞相關之疾病之診斷方法。
於本發明中，作為檢測或測定CD40及EpCAM之至少一者之量之方法，可列舉任意公知之方法。例如可列舉免疫學檢測或測定方法等。
所謂免疫學檢測或測定方法係使用作有標記之抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為免疫學檢測或測定方法，例如可列舉：放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA(enzyme immune assay，酶免疫分析)或ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶聯免疫吸附分析))、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescent immunoassay)、西方墨點法或物理化學方法等。
藉由使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段來檢測或測定表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞，可診斷與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病、較佳為與CD40及EpCAM之表現細胞相關之疾病。
關於表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞之檢測，可使用公知之免疫學檢測法，例如可列舉：免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。又，亦可列舉例如FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等螢光抗體染色法等。
於本發明中，作為成為檢測或測定CD40及EpCAM之至少一者之對象的生物樣本，只要為有可能包含表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞者，則無特別限定，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰腺液、尿液、糞便、組織液或培養液等。
含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段或該等 之衍生物之診斷藥根據目標診斷法，亦可包含用以進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用以進行抗原抗體反應之試劑，例如可列舉：緩衝劑、鹽等。
作為檢測用試劑，例如可列舉：會與上述雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段或該等之衍生物結合之經標記之二次抗體，或者與標記物對應之基質等免疫學檢測或測定法中通常採用之試劑。
以下，具體地記載本發明之雙專一性抗體之製作方法、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之活性評價方法、以及使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之疾病之治療方法及診斷方法。
1.單株抗體之製作方法
本發明中之單株抗體之製造方法包括下述作業步驟。即，(1)純化用作免疫原之抗原及製作於細胞表面過度表現抗原之細胞之至少一個操作；(2)於動物免疫抗原後，採取血液，檢定其抗體效價而確定摘取脾臟等之時間，製備抗體產生細胞之步驟；(3)製備骨髓瘤細胞(myeloma)；(4)將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合；(5)篩選產生目標抗體之融合瘤群；(6)自融合瘤群分離單株(monoclonal)細胞(選殖)；(7)根據情況培養用以大量製造單株抗體之融合瘤，或飼育移植有融合瘤之動物；(8)對藉由以上方式製造之單株抗體之生理活性及其抗原結合特異性進行研究、或對作為標記試劑之特性進行檢定等。
以下，依據上述步驟，詳細說明用於製作本發明中之與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體的與CD40結合之單株抗體及與EpCAM結合之單株抗體之製作方法。該抗體之製作方法並不限定於此，亦可使用例如脾臟細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤細胞。
(1)抗原之純化
表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞可藉由在導入將包含編碼CD40及EpCAM之至少一者之全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得。又，可自大量表現CD40及EpCAM之至少一者之各種人腫瘤培養細胞或人組織等純化CD40及EpCAM之至少一者，而用作抗原。又，亦可將該腫瘤培養細胞或該組織等直接用作抗原。進而，亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法製備具有CD40及EpCAM之至少一者之部分序列之合成肽，而用於抗原。
本發明中使用之CD40及EpCAM之至少一者可採用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等中記載之方法等，例如利用以下之方法，藉由使編碼該CD40及EpCAM之至少一者之DNA於宿主細胞中表現而製造。
將包含編碼CD40及EpCAM之至少一者之部分的全長cDNA插入至適宜之表現載體之啟動子之下游，藉此製作重組載體。亦可使用基於全長cDNA所製備之包含編碼多肽之部分的適宜長度之DNA片段代替上述全長cDNA。其次，將所獲得之該重組載體導入至適合該表現載體之宿主細胞，藉此可獲得生產CD40及EpCAM之至少一者之轉形體。
作為表現載體，只要為所使用之宿主細胞中之自主複製或向染色體中之組入能夠實現、且於可轉錄編碼CD40及EpCAM之至少一者之DNA之位置含有適宜之啟動子者，則可使用任一種。
作為宿主細胞，只要為例如大腸桿菌等屬於埃希菌屬等之 微生物、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等能夠表現目標基因者，則可使用任一種。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，重組載體較佳為能夠於原核生物中進行自主複製，且包含啟動子、核糖體結合序列、包含編碼CD40及EpCAM之至少一者之部分之DNA、以及轉錄終止序列的載體。又，於該重組載體中，轉錄終止序列並非必需，但較佳為於結構基因之正下方配置轉錄終止序列。進而，該重組載體亦可包含控制啟動子之基因。
作為該重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之夏因-達爾加諾序列(SD序列，Shine-Dalgarno sequence)與起始密碼子之間調節成為適宜距離(例如6~18個鹼基)之質體。
又，作為編碼該CD40及EpCAM之至少一者之DNA之鹼基序列，可以成為最適於在宿主內進行表現之密碼子之方式置換鹼基，藉此可提高目標CD40及EpCAM之至少一者之生產率。
作為表現載體，只要能夠於所使用之宿主細胞中發揮功能，則可使用任意者，例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上由Roche Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(Qiagen公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600號公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、 pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pTerm2(美國專利第4,686,191號說明書、美國專利第4,939,094號說明書、美國專利第5,160,735號說明書)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET System(Novagen公司製造)或pME18SFL3(東洋紡織公司製造)等。
作為啟動子，只要能夠於所使用之宿主細胞中發揮功能，則可使用任意者。例如可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子或T7啟動子等源於大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可列舉例如由2個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子、或let I啟動子等經人為設計改型之啟動子等。
作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、或大腸桿菌DH5α等。
作為重組載體向宿主細胞之導入方法，只要能夠向所使用之宿主細胞中導入DNA，則可採用任意方法，例如可列舉使用鈣離子之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)、Molecular & General Genetics,168,111(1979)]。
於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要能夠於動物細胞中發揮功能，則可使用任意者，例如可列舉： pcDNAI(Invitrogen公司製造)、pcDM8(Funakoshi公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(國際公開第97/10354號)等。
作為啟動子，只要能夠於動物細胞中發揮功能，則可使用任意者，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之即刻早期(IE，immediate early)基因之啟動子、SV40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子或Moloney小鼠白血病病毒之啟動子或促進子。又，亦可將人CMV之IE基因之促進子與啟動子併用。
作為宿主細胞，例如可列舉：人伯奇氏淋巴瘤細胞Namalwa、源於非洲綠猴腎臟之細胞COS、源於中國倉鼠卵巢之細胞CHO、或人白血病細胞HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)等。
作為重組載體向宿主細胞之導入方法，只要能夠向動物細胞中導入DNA，則可採用任意方法，例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、或脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
將源於藉由以上方式獲得之保有組入了編碼CD40及EpCAM之至少一者之DNA之重組載體的微生物或動物細胞等之轉形體於培養基中進行培養，使該CD40及EpCAM之至少一者於培養物中生成蓄積，自該培養物進行採取，藉此可製造CD40及EpCAM之至少一者。於培 養基中培養該轉形體之方法可依據宿主培養通常採用之方法進行。
於在源自真核生物之細胞上表現之情形時，可獲得附加有糖或糖鏈之CD40及EpCAM之至少一者。
於培養利用使用誘導性啟動子之重組載體進行轉形後之微生物時，視需要可於培養基中添加誘導物(inducer)。例如，於培養利用使用lac啟動子之重組載體進行轉形後之微生物之情形時，可於培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，於培養利用使用trp啟動子之重組載體進行轉形後之微生物之情形時，可於培養基中添加吲哚丙烯酸等。
作為培養以動物細胞為宿主所獲得之轉形體之培養基，例如可列舉：一般使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、Eagle之MEM培養基[Science,122,501(1952)]、達爾伯克(Dulbecco)改良MEM培養基[Virology,8,396(1959)]、199培養基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、伊思柯夫改良達爾伯克培養基(IMDM，Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培養基、或於該等培養基中添加胎牛血清(FBS)等之培養基等。通常於pH值6~8、30~40℃、存在5%CO2等之條件下進行1~7天之培養。又，於培養過程中，視需要可對培養基添加康黴素、青黴素等抗生素。
作為編碼CD40及EpCAM之至少一者之基因之表現方法，除直接表現以外，亦可採用分泌生產或融合蛋白質表現等方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。作為CD40及EpCAM之至少一者之生產方法，例如可列舉：於宿主細胞內生產之方法、於宿主細胞外分泌之方法、或於 宿主細胞外膜上生產之方法，且可藉由改變所使用之宿主細胞或所生產之CD40及EpCAM之至少一者之結構，而選擇適宜方法。
例如，製作於編碼細胞外區域之胺基酸序列之DNA上連結有編碼抗體之Fc區域之DNA、編碼麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之DNA、或編碼FLAG標籤之DNA或編碼Histidine標籤之DNA等的DNA，使之表現，進行純化，藉此可製作抗原融合蛋白質。具體而言，例如可列舉：使CD40及EpCAM之至少一者之細胞外區域結合於人IgG之Fc區域而獲得之Fc融合蛋白質、CD40及EpCAM之至少一者之細胞外區域與麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白質。
於在宿主細胞內或宿主細胞外膜上生產CD40及EpCAM之至少一者之情形時，可藉由採用Paulson等人之方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、Law等人之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本專利特開平05-336963號公報、或國際公開第94/23021號等中記載之方法，而使CD40及EpCAM之至少一者積極地分泌至宿主細胞外。又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系統(日本專利特開平2-227075號公報)而提昇CD40及EpCAM之至少一者之生產量。
所生產之CD40及EpCAM之至少一者可藉由例如以下之方式進行單離、純化。
於CD40及EpCAM之至少一者於細胞內以溶解狀態表現之情形時，培養結束後藉由離心分離而回收細胞，使之懸浮於水系緩衝液中後，使用超音波破碎機、法式壓碎機(French press)、Manton Gaulin均質機或球磨機等破碎細胞，而獲得無細胞萃取液。對該無細胞萃取液進行離 心分離，自分離出之上清液，藉由單獨使用或組合使用通常之蛋白質之單離純化法，即，溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使用二乙基胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、聚焦色譜(chromato focusing)法、或等電點電泳等電泳法等方法，而可獲得純化蛋白質。
於CD40及EpCAM之至少一者於細胞內形成不溶體而表現之情形時，與上述同樣地回收細胞後加以破碎，進行離心分離，藉此回收作為沈澱組分之該CD40及EpCAM之至少一者之不溶體。利用蛋白質改性劑將所回收之該CD40及EpCAM之至少一者之不溶體變得可溶化。對該可溶化液進行稀釋或透析，藉此將該CD40及EpCAM之至少一者恢復成為正常之立體結構後，藉由與上述相同之單離純化法可獲得多肽之純化蛋白質。
於在細胞外分泌CD40及EpCAM之至少一者或其糖修飾體等衍生物之情形時，可於培養上清液中回收該CD40及EpCAM之至少一者或其糖修飾體等衍生物。與上述同樣地採用離心分離等方法處理該培養上清液，藉此取得可溶性組分，藉由採用與上述相同之單離純化法，可自該可溶性組分獲得純化蛋白質。
又，本發明中使用之CD40及EpCAM之至少一者亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法製造。具體而言，可利用例如Advanced Chemtec公司、Perkin Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、Perceptive或島津製作所公司等製造之肽合成機進行化學合成。
(2)抗體產生細胞之製備步驟
對3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物免疫(1)中所獲得之抗原，採取該動物之脾臟、淋巴結或末梢血液中之抗體產生細胞。又，作為動物，作為被免疫動物，例如可列舉：富塚等人之文獻[Tomizuka.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,97、722,(2000)]中記載之產生源於人之抗體之基因轉殖小鼠、用以提高免疫原性之CD40或EpCAM之條件性基因剔除小鼠等。
免疫係藉由一併投予抗原與Freund之完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠及百日咳菌疫苗等適宜佐劑而進行。小鼠免疫時之免疫原投予法可採用皮下注射、腹腔內注射、靜脈內注射、皮內注射、肌肉內注射或足蹠注射等任意方式，較佳為腹腔內注射、足蹠注射或靜脈內注射。於抗原為部分肽之情形時，製作與BSA(牛血清白蛋白)或匙孔螺血氰蛋白(KLH，Keyhole Limpet hemocyanin)等載體蛋白之複合體，將其作為免疫原使用。
抗原之投予係於第1次投予後，間隔1~2週再進行5~10次。於每次投予後之第3~7天自眼底靜脈叢採血，採用酶免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等測定其血清之抗體效價。若使用上述血清對用於免疫之抗原顯示充分之抗體效價之動物作為融合用抗體之產生細胞之供給源，則可提高後續操作之效果。
於最後一次投予抗原後之第3~7天，自經免疫動物摘取脾 臟等包含抗體產生細胞之組織，採取抗體產生細胞。抗體產生細胞為漿細胞及作為其前驅細胞之淋巴細胞，可自個體之任意部位取得，一般能夠自脾臟、淋巴結、骨髄、扁桃體、末梢血液、或該等之適宜組合者等中取得，最常用的是脾臟細胞。於使用脾臟細胞之情形時，將脾臟切碎並解離後，進行離心分離，進而去除紅血球，藉此取得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤細胞之製備步驟
作為骨髓瘤細胞，可使用源自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人等哺乳動物之無自行產生抗體能力之細胞，一般採用自小鼠獲得之株化細胞，例如8-氮鳥嘌呤耐性小鼠(源於BALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。將該細胞株於適宜之培養基，例如8-氮鳥嘌呤培養基[添加有麩醯胺、2-巰基乙醇、慶大黴素、FCS及8-氮鳥嘌呤之RPMI-1640培養基]、伊思柯夫改良達爾伯克培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium；以下稱為「IMDM」)或達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)等培養基中進行繼代培養。於細胞融合之前3~4天將上述細胞株於正常培養基(例如包含10% FCS之DMEM培養基)中進行繼代培養，確保於進行融合之當天細胞數達到2×107個以上。
(4)細胞融合
利用最低基礎培養基(MEM，Minimum Essential Medium)培養基或 PBS(磷酸二鈉1.83g、磷酸一鉀0.21g、食鹽7.65g、蒸餾水1L，pH值7.2)充分清洗(2)中獲得之融合用抗體產生細胞與(3)中獲得之骨髓瘤細胞，以融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5：1~10：1之方式進行混合，實施離心分離後，去除上清液。使沈澱之細胞集塊充分解離後，一面於37℃下攪拌一面添加聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基及二甲基亞碸之混合液。進而，每隔1~2分鐘添加MEM培養基1~2mL，如此數次添加後，添加MEM培養基使總量成為50mL。離心分離後，去除上清液，使沈澱之細胞集塊逐漸解離後，使細胞緩慢懸浮於HAT培養基[添加有次黃嘌呤、胸苷及胺基喋呤之正常培養基]中。將該懸浮液於5%CO2培養箱中於37℃下培養7~14天。
又，亦可藉由以下方法進行細胞融合。利用無血清培養基(例如DMEM)或磷酸緩衝生理鹽水(以下稱為「磷酸緩衝液」)充分清洗脾臟細胞與骨髓瘤細胞，以脾臟細胞與骨髓瘤細胞之細胞數之比成為5：1~10：1左右之方式進行混合，實施離心分離。去除上清液，使沈澱之細胞集塊充分解離後，一面攪拌一面滴加1mL之包含50%(w/v)聚乙二醇(分子量1000~4000)之無血清培養基。其後，緩慢添加10mL之無血清培養基後，實施離心分離。再次去除上清液，使沈澱之細胞懸浮於適量之包含次黃嘌呤‧胺基喋呤‧胸苷(HAT)液及人介白素-2(IL-2)之正常培養基(以下稱為HAT培養基)中，分注至培養用盤(以下稱為培養盤)之各孔，於5%二氧化碳、37℃之條件下培養2週左右。中途適當補充HAT培養基。
(5)融合瘤群之選擇
於用於融合之骨髓瘤細胞為8-氮鳥嘌呤耐性株之情形時，即為次黃嘌呤‧鳥嘌呤‧磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺陷株之情形時，未融合之骨髓 瘤細胞及骨髓瘤細胞彼此之融合細胞於HAT培養基中無法存活。另一方面，抗體產生細胞彼此之融合細胞及抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤於HAT培養基中能夠存活，但抗體產生細胞彼此之融合細胞不久便會達到壽命限度。因此，藉由在HAT培養基中繼續培養，僅會剩餘抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤存活，結果可取得融合瘤。
針對成長為菌落狀之融合瘤，將HAT培養基更換為自其中去除胺基喋呤之培養基(以下稱為HT培養基)。其後，採取一部分培養上清液，採用下述抗體效價測定法，而可選擇產生抗體之融合瘤。作為抗體效價之測定方法，例如可列舉：放射性同位素免疫定量法(RIA法)、固相酶免疫定量法(ELISA法)、螢光抗體法及被動血球凝集反應法等各種公知技術，就檢測感度、迅速性、正確性及操作自動化之可能性等觀點而言，較佳為RIA法或ELISA法。
將藉由測定抗體效價而判明產生所需抗體之融合瘤轉移至另一培養盤中進行選殖。作為該選殖法，例如可列舉：以培養盤每孔中包含1個細胞之方式進行稀釋培養之極限稀釋法、於軟瓊脂培養基中培養而回收菌落之軟瓊脂法、利用顯微操作儀單離1個細胞之方法、利用細胞分選儀單離1個細胞之方法等。
對確認到抗體效價之孔，反覆進行2~4次利用例如極限稀釋法之選殖，穩定後，選擇確認到抗體效價者作為產生針對人CD40或EpCAM之單株抗體之融合瘤株。
(6)單株抗體之製備
對經姥鮫烷處理[於腹腔內投予2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane)0.5mL，飼育2週]之8~10週齡之小鼠或裸小鼠，於腹腔內注射(5)中獲得之 單株抗體產生融合瘤。經過10~21天，融合瘤腹水癌化。自該小鼠採取腹水，實施離心分離而去除固形物成分後，利用40~50%硫酸銨進行鹽析，藉由辛酸沈澱法、DEAE-瓊脂糖凝膠管柱、蛋白質A管柱或凝膠過濾管柱進行純化，收集IgG或IgM組分，而製作純化單株抗體。又，藉由使該融合瘤於同系統之小鼠(例如BALB/c)或Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔等之腹腔內進行增殖，可獲得大量包含與CD40或EpCAM結合之單株抗體之腹水。
將(5)中獲得之單株抗體產生融合瘤於添加有10%FBS之RPMI1640培養基等中進行培養後，藉由離心分離而去除上清液，懸浮於GIT培養基、或添加有5% Daigo's GF21之Hybridoma SFM培養基等，藉由燒瓶培養、旋轉培養或倒置(back)培養等培養3~7天。對所獲得之細胞懸浮液進行離心分離，藉由蛋白質A管柱或蛋白質G管柱純化所獲得之上清液，於其中收集IgG組分，而亦可獲得純化單株抗體。作為純化之簡便方法，亦可利用市售之單株抗體純化套組(例如MAbTrap GII kit，Amersham Pharmacia Biotech公司製造)等。
抗體之亞型之確定係使用亞型分型試劑盒(subclass typing kit)藉由酶免疫測定法進行。蛋白量之定量可藉由洛利(Lowry)法及由280nm下之吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/mL]計算之方法進行。
(7)單株抗體對CD40或EpCAM之結合分析
單株抗體對CD40或EpCAM之結合活性可藉由歐氏雙向擴散法(Ouchterlony法)、ELISA法、RIA法、流式細胞法(FCM)或表面電漿子共振法(SPR)等之結合分析(binding assay)系統進行測定。
歐氏雙向擴散法雖然簡便，但於抗體濃度較低之情形時需 進行濃縮操作。另一方面，於採用ELISA法或RIA法之情形時，使培養上清液直接與抗原吸附固相反應，進而使用各種免疫球蛋白同型、亞型所對應之抗體作為二次抗體，藉此鑑定抗體之同型、亞型，且能夠測定抗體之結合活性。
作為操作程序之具體例，使經純化或部分純化之重組CD40及EpCAM之至少一者吸附於ELISA用96孔培養盤等固相表面，進而利用與抗原無關之蛋白質、例如牛血清白蛋白(BSA)阻斷(blocking)未吸附抗原之固相表面。利用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，phosphate buffer saline)及包含0.05% Tween20之PBS(Tween-PBS)等清洗ELISA培養盤後，與經階段稀釋之第1抗體(例如小鼠血清、培養上清液等)進行反應，而使抗體與培養盤上所固定之抗原結合。繼而，分注經生物素、酶(辣根過氧化物酶(HRP，horse radish peroxidase)、鹼性磷酸酶(ALP，alkaline phosphatase)等)、化學發光物質或放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體作為第2抗體，使第2抗體與培養盤上結合之第1抗體進行反應。利用Tween-PBS充分清洗後，根據第2抗體之標記物質而進行相應反應，選擇與靶抗原特異性地反應之單株抗體。
藉由FCM法可測定抗體對抗原表現細胞之結合活性[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]。抗體與於細胞膜上表現之膜蛋白質抗原結合意指該抗體識別天然存在之抗原之立體結構並與之結合。
作為SPR法，可列舉利用Biacore之動力學(kinetics)解析。例如使用Biacore T100，測定抗原與試驗物質之間之結合中之動力學，利用機器內置之解析軟體對該結果進行解析。作為操作程序之具體 例，藉由胺偶合法將抗小鼠IgG抗體固定於感測器晶片CM5後，流通融合瘤培養上清液或純化單株抗體等試驗物質而使適當量結合，進而流通濃度既知之多種濃度之抗原，對結合及解離進行測定。繼而，使用機器內置之軟體，對所獲得之資料進行利用1：1結合模型之動力學解析，而取得各種參數。或者例如藉由胺偶合法將CD40及EpCAM之至少一者固定於感測器晶片上後，流通濃度既知之多種濃度之純化單株抗體，對結合及解離進行測定。使用機器內置之軟體，對所獲得之資料進行利用二價(bivalent)結合模型之動力學解析，而取得各種參數。
又，於本發明中，和CD40或EpCAM之對應抗體競爭與CD40或EpCAM結合之抗體可藉由使之與試驗抗體共存於上述結合分析系統中進行反應而選擇。即，藉由篩選於添加有試驗抗體時其與抗原之結合受到抑制之抗體，可獲得對於與CD40或EpCAM之結合，和上述所取得之抗體進行競爭之抗體。
(8)針對CD40或EpCAM之單株抗體之表位之鑑定
於本發明中，抗體所識別並結合之表位之鑑定可藉由如下方式進行。
例如，製作抗原之部分缺陷體、經種間不同之胺基酸殘基改型之變異體、或特定區域經改型之變異體，若抗體對該缺陷體或變異體之反應性降低，則表明缺陷部位或胺基酸改型部位為該抗體之表位。此種抗原之部分缺陷體及變異體可使用適宜之宿主細胞、例如大腸桿菌、酵母、植物細胞或哺乳動物細胞等，以分泌蛋白質之形式取得，或於宿主細胞之細胞膜上表現而以抗原表現細胞之形式製備。於膜型抗原之情形時，為了使抗原於表現時保持立體結構，較佳為於宿主細胞之膜上表現。又， 亦可製作模擬抗原之一次結構或立體結構之合成肽而確認抗體之反應性。關於合成肽，可列舉使用公知之肽合成技術製作該分子之各種部分肽之方法等。
例如，針對人及小鼠之CD40或EpCAM之細胞外區域，將構成各區域之domain適當組合而製作嵌合蛋白質，確認抗體對該蛋白質之反應性，藉此可鑑定抗體之表位。其後，進一步細分，使用業者周知之寡肽合成技術合成各種其對應部分之寡肽或該肽之變異體等，確認抗體對該肽之反應性，藉此可特定表位。作為用於獲得多種寡肽之簡便方法，亦可利用市售之套組[例如SPOTs Kit(Genosys Biotechnologies公司製造)、使用多中心合成法之一系列多中心‧肽合成套組(Chiron公司製造)等]。
結合於和與CD40或EpCAM結合之抗體所結合之表位相同之表位的抗體可藉由如下方式，即，對藉由上述結合分析系統獲得之抗體之表位進行鑑定，製作表位之部分合成肽、模擬該表位之立體結構之合成肽或該表位之重組體等，進行免疫而取得。
例如，若表位為膜蛋白質，則使整個細胞外區域或一部分之細胞外區域與適宜標籤、例如FLAG標籤、Histidine標籤、GST蛋白質或抗體Fc區域等進行連結而製作重組融合蛋白質，免疫該重組蛋白質，藉此可更有效率地製作該表位特異性抗體。
2.基因重組抗體之製作
作為基因重組抗體之製作例，於P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS及J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies：principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS等中有概述，以下例示嵌合抗體、人源化抗體及人抗體之製作方法。又，基因重組小鼠、大鼠、倉鼠及兔抗體亦可藉由相同方法製作。
(1)自融合瘤取得編碼單株抗體之V區域之cDNA
編碼單株抗體之VH及VL之cDNA之取得可藉由例如以下方式進行。
首先，自產生單株抗體之融合瘤提取mRNA，合成cDNA。繼而，將所合成之cDNA選殖至噬菌體或質體等載體而製作cDNA庫。使用編碼抗體之C區域部分或V區域部分之DNA作為探針，自該庫中分別單離具有編碼VH或VL之cDNA之重組噬菌體或重組質體。確定單離出之重組噬菌體或重組質體內之VH或VL之全鹼基序列，根據該鹼基序列推測VH或VL之全胺基酸序列。
作為用於製作融合瘤之非人動物，使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔等，只要能夠製作融合瘤，可使用任意之動物。
於由融合瘤製備全RNA時，使用硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]或RNA easy kit(Qiagen公司製造)等套組等。
於由全RNA製備mRNA時，使用寡聚(dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、或Oligo-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TAKARA BIO公司製造)等套組等。又，亦可使用Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen公司製造)或QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia公司製造)等套組製備mRNA。
cDNA之合成及cDNA庫之製作可使用公知方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]或用於cDNA合成與質體選殖之SuperScript質體系統(SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning)(Invitrogen公司製造)或ZAP-cDNA合成套組(ZAP-cDNA Synthesis Kit)(Stratagene公司製造)等套組等。
於製作cDNA庫時，作為組入以自融合瘤提取之mRNA為鋳型所合成之cDNA的載體，可使用能夠組入該cDNA之任意載體。
例如使用ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning：A Practical Approach,I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
用於導入藉由噬菌體或質體載體構建之cDNA庫之大腸桿菌可使用能夠導入、表現及維持該cDNA庫之任意者。例如使用XL1-Blue MRF'[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]、或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
自cDNA庫中選擇編碼非人抗體之VH或VL之cDNA株時，採用使用經同位素或螢光標記之探針之菌落‧雜交法、或噬菌斑‧雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。
又，製備引子，將由mRNA所合成之cDNA或cDNA庫作為模板，進行聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction)法[以下記為PCR法，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]，藉此亦可製備編碼VH或VL之cDNA。
利用適宜之限制酶等切割所選擇之cDNA後，選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由通常採用之鹼基序列解析方法等確定該cDNA之鹼基序列。例如進行雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等之反應後，使用A.L.F.DNA定序儀(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等進行解析。
根據所確定之全鹼基序列分別推測VH及VL之全胺基酸序列，與既知之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，藉此確認所取得之cDNA是否編碼包括分泌訊號序列在內之抗體之VH及VL各自之完整之胺基酸序列。
關於包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL各自之完整之胺基酸序列，可藉由與既知之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較而推測分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可鑑定該等所屬之亞群。
又，VH及VL之各CDR之胺基酸序列可藉由與既知之抗體 之VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較而推測。
又，針對所獲得之VH及VL之完整之胺基酸序列，使用例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意之資料庫，藉由BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等進行同源性檢索，藉此可確認該VH及VL之完整之胺基酸序列是否為新穎序列。
(2)基因重組抗體表現用載體之構建
基因重組抗體表現用載體可藉由在動物細胞用表現載體中選殖編碼人抗體之CH及CL之至少一者之DNA而構建。
作為人抗體之C區域，可使用任意之人抗體之CH及CL，例如可使用人抗體之γ1亞型之CH及κ類型之CL等。作為編碼人抗體之CH及CL之DNA而使用cDNA，亦可使用包含外顯子與內含子之染色體DNA。
作為動物細胞用表現載體，可使用能夠組入並表現編碼人抗體之C區域之基因之任意載體者，例如可使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]、INPEP4(Biogen-IDEC公司製造)、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)、N5KG4PE R409K(記載於國際公開第2006/033386號)、N5KG2載體(記載於國際公開第2003/033538號)、轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
作為動物細胞用表現載體之啟動子與促進子，可使用SV40 之初期啟動子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、CMV啟動子(美國專利第5,168,062號說明書)或免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell,41,479(1985)]與促進子[Cell,33,717(1983)]等。
關於基因重組抗體之表現，就載體之易構建性、向動物細胞之易導入性、細胞內中之抗體H鏈及L鏈之表現量之均衡性等觀點而言，使用搭載抗體H鏈及L鏈兩者基因之載體(串聯型載體)[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，亦可組合使用分別搭載抗體H鏈或L鏈一者基因之複數個載體(分離型載體)。
作為串聯型之基因重組抗體表現用載體，使用pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)、N5KG4PE R409K(記載於國際公開第2006/033386號)、N5KG2載體(記載於國際公開第2003/033538號)、Tol2轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
(3)嵌合抗體表現載體之構建
藉由在(2)中獲得之基因重組抗體表現用載體內之編碼人抗體之CH或CL之基因之各自之上游分別選殖(1)中獲得之編碼非人抗體之VH或VL之cDNA，而可構建嵌合抗體表現載體。
首先，為了將編碼非人抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側與人抗體之CH或CL之5'末端側進行連結，而製作以連結部分之鹼基序列編碼適宜之胺基酸、且成為適宜之限制酶識別序列之方式設計的VH及VL之cDNA。繼而，將所製作之VH及VL之cDNA以該等以適宜形態表現之方式分別選殖至(2)中獲得之基因重組抗體表現用載體內之編碼人抗體之 CH或CL之基因之各自之上游，而構建嵌合抗體表現載體。
又，使用兩端具有適宜之限制酶之識別序列之合成DNA，藉由PCR法分別擴增編碼非人抗體之VH或VL之cDNA，選殖至(2)中獲得之基因重組抗體表現用載體，藉此亦可構建嵌合抗體表現載體。
(4)編碼人源化抗體之V區域之cDNA之製作
編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA可藉由如下方式製作。首先，分別選擇待移植(1)中獲得之非人抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列的人抗體之VH或VL之架構區(以下記為FR)之胺基酸序列。
選擇之FR之胺基酸序列只要源於人抗體，則可使用任意者。例如使用註冊於Protein Data Bank等資料庫中之人抗體之FR之胺基酸序列、或人抗體之FR之各亞群之共通胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]等。為了抑制抗體之結合活性之降低，選擇與原先之非人抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高之同源性(60%以上)之人FR之胺基酸序列。
繼而，對所選擇之人抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列分別移植原先之非人抗體之CDR之胺基酸序列，分別設計人源化抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮到可視作抗體基因之鹼基序列的密碼子之使用頻度[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]，將所設計之胺基酸序列轉換為DNA序列，藉此分別設計人源化抗體之VH或VL之cDNA序列。
基於所設計之cDNA序列，合成包含約100~150個鹼基長度之數條合成DNA，使用該等進行PCR反應。於該情形時，就PCR反應 中之反應效率及能夠合成之DNA長之觀點而言，較佳為針對H鏈及L鏈各設計4~6條合成DNA。又，亦可合成可變區全長之合成DNA而使用。
進而，藉由對位於兩端之合成DNA之5'末端導入適宜之限制酶之識別序列，可容易地於(2)中獲得之基因重組抗體表現用載體上選殖編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA。PCR反應後，將擴增產物分別選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由與(1)中記載之方法相同之方法確定鹼基序列，而取得具有所需之編碼人源化抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列的質體。
(5)人源化抗體之V區域之胺基酸序列之改型
若僅將非人抗體之VH及VL之CDR移植至人抗體之VH及VL之FR，則人源化抗體其抗原結合活性較原先之非人抗體降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。因此，鑑定人抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中的直接參與抗原結合之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構而間接參與抗原結合之胺基酸殘基，將該等胺基酸殘基置換為原先之非人抗體之胺基酸殘基，藉此可使降低之人源化抗體之抗原結合活性提昇。
為了鑑定與抗原結合活性有關之FR之胺基酸殘基，可藉由利用X射線結晶解析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或電腦模擬[Protein Engineering,7,1501(1994)]等，而進行抗體之立體結構之構建及解析。又，針對各抗體製作數種改型體，反覆研究各自與抗原結合活性之相關性，進行試誤，藉此可取得具有所需抗原結合活性之改型人源化抗體。
人抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用改型用合成DNA進行(4)中記載之PCR反應而實施改型。針對PCR反應後之擴增產 物，藉由(1)中記載之方法確定鹼基序列，而確認實現目標改型。
(6)人源化抗體表現載體之構建
於(2)中獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人抗體之CH或CL之各基因之上游分別選殖所構建之編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA，而可構建人源化抗體表現載體。
例如，藉由在(4)及(5)中獲得之構建人源化抗體之VH或VL時使用之合成DNA中的位於兩端之合成DNA之5'末端導入適宜之限制酶之識別序列，而以該等以適宜形態表現之方式分別選殖至(2)中獲得之基因重組抗體表現用載體內之編碼人抗體之CH或CL之各基因之上游。
(7)人抗體表現載體之構建
於使用產生人抗體之動物作為被免疫動物來建立產生單株抗體之融合瘤之情形時，於(1)中可獲得人抗體之VH及VL之胺基酸序列及cDNA序列。因此，藉由在(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人抗體之CH或CL之各基因之上游分別選殖(1)中所獲得之編碼人抗體之VH或VL之基因，可構建人抗體表現載體。
(8)基因重組抗體之短暫性表現
使用(3)、(6)及(7)中獲得之基因重組抗體表現載體、或該等經改型之表現載體短暫性表現基因重組抗體，可有效率地評價所獲得之多種基因重組抗體之抗原結合活性。
供導入表現載體之宿主細胞可使用能夠表現基因重組抗體之任意之宿主細胞，例如使用COS-7細胞[美國典型培養物保藏中心(ATCC，American Type Culture Collection)編號：CRL1651]。向COS-7細胞導入表現載體時採用DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press(1991)]或脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
導入表現載體後，採用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗手冊、Kodansha Scientific(1987)]等測定培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性。
(9)基因重組抗體之穩定表現株之取得與基因重組抗體之製備
藉由將(3)、(6)及(7)中獲得之基因重組抗體表現載體導入適宜之宿主細胞，可獲得穩定表現基因重組抗體之轉形株。
關於表現載體向宿主細胞之導入，例如可列舉：電穿孔法[日本專利特開平2-257891號公報、Cytotechnology,3,133(1990)]、鈣離子方法、電穿孔法、原生質球法、乙酸鋰法、磷酸鈣法、脂轉染法等。又，作為下述向動物導入基因之方法，例如可列舉：顯微注射法、採用電穿孔或脂轉染法向ES細胞導入基因之方法、及核移植法等。
作為供導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞，可使用能夠表現基因重組抗體之任意之宿主細胞。例如使用小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、中國倉鼠CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5細胞(ATCC CCL-1781)、CHO-S細胞(Life Technologies、Cat No.11619)、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)缺陷之CHO細胞(CHO/DG44細胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、獲得凝集素耐性之 Lec13細胞[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖基轉移酶基因缺陷之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC編號：CRL1662)等。
又，亦可使用：與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關之酶等蛋白質，與岩藻糖之1位以α結合於N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位的糖鏈修飾有關之酶等蛋白質，或與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖向高爾基體之輸送有關之蛋白質等之活性降低或喪失之宿主細胞、例如α1,6-岩藻糖基轉移酶基因缺陷之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)等。
導入表現載體後，將穩定表現基因重組抗體之轉形株於包含G418硫酸鹽(以下記為G418)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養，藉此選擇(日本專利特開平2-257891號公報)。
動物細胞培養用培養基係使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、EX-CELL302培養基(JRH公司製造)、EX-CELL325培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)或Hybridoma-SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或於該等培養基中添加有FBS等各種添加物之培養基等。藉由將所獲得之轉形株於培養基中進行培養，而使基因重組抗體於培養上清液中表現、蓄積。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等測定。又，可利用DHFR擴增系統(日本專利特開平2-257891號公報)等提昇轉形株所產生之基因重組抗體之表現量。
基因重組抗體可使用蛋白質A管柱自轉形株之培養上清液進行純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。又，亦可將凝膠過濾、離子交換層析法及超過濾等蛋白質純化方法加以組合而進行純化。
經純化之基因重組抗體之H鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature,227,680(1970)]或西方墨點法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等進行測定。
3.雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之製作
本發明之雙專一性抗體可藉由如下方式製作，例如，首先，採用上述1.中記載之方法取得與不同表位結合之複數個單株抗體，其次，採用上述2.中記載之方法確定各抗體之VH及VL之cDNA序列，而設計連結有各抗體之抗原結合部位的雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。
具體而言，可藉由如下方式製作：將各抗體之抗原結合部位與連接子適當進行組合而合成DNA，組入至上述2.(2)中記載之基因重組抗體表現載體，使表現該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。更具體而言，可藉由如下方式製作：合成編碼將各抗體之VH經由連接子連結而成之多肽之DNA，並合成編碼各抗體之VL之DNA，將該等DNA組入至上述2.(2)中記載之基因重組抗體表現載體，使表現該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。又，藉由使用導入有編碼任意多肽鏈之基因代替2.(2)之編碼CH或CL之基因的動物細胞用表現載體，可製作於最靠近C末端之抗原 結合部位之C末端側具有任意多肽鏈(C末端側多肽)之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。可將編碼任意多肽鏈之基因與編碼將各抗體之VH經由連接子連結而成之多肽之DNA加以結合後再組入至動物細胞用表現載體，亦可與編碼將各抗體之VH經由連接子連結而成之多肽之DNA分開地組入至不同之動物細胞用表現載體。
抗原結合部位除了上述1.中記載之使用融合瘤之方法以外，亦可藉由Phage Display法、Yeast display法等技術單離、取得[Emmanuelle Laffy et.al.,Human Antibodies 14,33-55,(2005)]。
作為上述連接子及C末端側多肽，例如可列舉多肽鏈。具體而言，例如由複數個抗原結合區域結合而成之多肽。例如可列舉：包含沿自N末端向C末端之方向依序排列之CH1-鉸鏈-CH2-CH3之免疫球蛋白區、包含CH1-鉸鏈-CH2之免疫球蛋白區、包含CH1-鉸鏈之免疫球蛋白區、包含CH1之免疫球蛋白區、CH1之N末端側之片段、包含第14號胺基酸殘基為Cys之14個胺基酸殘基之CH1片段、及包含自CH1之N末端起第1~14號胺基酸殘基之CH1片段、以及該等免疫球蛋白區片段之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸殘基經改型者。
作為上述連接子及C末端側多肽，更具體而言，例如可列舉：包含序列編號75所表示之IgG4之CH1之N末端第1~14號之14個胺基酸殘基之多肽、包含序列編號75所表示之IgG4之CH1之多肽、以及包含序列編號77所表示之IgG4PE R409K之CH(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)之多肽等。
又，於製作包含多個VH與單一VL之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之情形時，以雙專一性抗體所含之各抗原結合部位與各自 之特異性抗原反應之方式，進行使用噬菌體顯示法等之篩選，選擇最適於單一VL之各個VH。
具體而言，首先，採用上述1.中記載之方法，用第1抗原免疫動物，由其脾臟製作融合瘤，選殖編碼第1抗原結合部位之DNA序列。其次，用第2抗原免疫動物，由其脾臟製備cDNA庫，自該庫藉由PCR取得編碼VH之胺基酸序列之DNA。
繼而，製作表現藉由第2抗原之免疫而獲得之由VH與第1抗原結合部位之VL連結而成之scFv的噬菌體庫，藉由使用該噬菌體庫之平移(panning)，選擇提呈與第2抗原特異性地結合之scFv之噬菌體。根據所選擇之噬菌體而選殖編碼第2抗原結合部位之VH之胺基酸序列之DNA序列。
進而，設計編碼由第1抗原結合部位之VH與第2抗原結合部位之VH經由上述連接子連結而成之多肽之胺基酸序列的DNA序列，將該DNA序列與編碼單一VL之胺基酸序列之DNA序列插入至例如上述2.(2)中記載之基因重組抗體表現載體，藉此可構建本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之表現載體。又，藉由使用導入有編碼任意多肽鏈之基因代替2.(2)之編碼CH之基因的動物細胞用表現載體，可製作於第二抗原結合部位之VH之C末端側具有任意多肽鏈(C末端側多肽)之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。
4.本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之活性評價
經純化之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之活性評價可藉由如下方式進行。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段對表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞株的結合活性可使用上述1.(7)記載之結合分析系統進行測定。
針對表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞的CDC活性或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行測定。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之細胞死亡誘導活性可藉由以下方法測定。例如，將細胞接種於96孔培養盤，添加抗體，經過一定時間培養後，使之與WST-8試劑(Dojindo公司製造)進行反應，利用讀板儀測定450nm下之吸光度，藉此測定細胞之存活率。
5.使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之疾病之治療方法
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段可用於治療與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病、較佳為與CD40及EpCAM之表現細胞相關之疾病。作為CD40及EpCAM之至少一者之相關疾病，例如可列舉惡性腫瘤及癌等。
作為惡性腫瘤及癌，例如可列舉：大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、神經膠質瘤、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、膽管癌、食道癌、肝癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、前列腺癌、絨膜癌、咽頭癌、喉頭癌、胸膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、星狀細胞瘤、神經纖維瘤、少 突神經膠質瘤、神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、膠質母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤及威爾姆斯瘤等。
含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段或該等之衍生物之治療藥可僅包含作為有效成分之該抗體或該雙專一性抗體片段或該等之衍生物，但通常以與藥理學上容許之1種以上之載體一起混合，藉由製劑學技術領域公知之方法所製造之醫藥製劑之形式提供。
作為投予路徑，例如可列舉：經口投予、或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌肉內或靜脈內等非經口投予。作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。各種製劑可使用常用之賦形劑、增量劑、結合劑、浸潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩衝劑、保存劑、溶解助劑、防腐劑、著色料、香味劑及穩定化劑等藉由常規方法製造。
作為賦形劑，例如可列舉：乳糖、果糖、葡萄糖、玉米澱粉、山梨糖醇、結晶纖維素、殺菌水、乙醇、甘油、生理鹽水及緩衝液等。作為崩解劑，例如可列舉：澱粉、海藻酸鈉、明膠、碳酸鈣、檸檬酸鈣、糊精、碳酸鎂及合成矽酸鎂等。
作為結合劑，例如可列舉：甲基纖維素或其鹽、乙基纖維素、阿拉伯膠、明膠、羥丙基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮等。作為潤滑劑，例如可列舉：滑石、硬脂酸鎂、聚乙二醇及氫化植物油等。
作為穩定化劑，例如可列舉：精胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸等胺基酸、人血清白蛋白、明膠、葡聚糖40、甲基纖維素、亞硫酸鈉、偏亞硫酸鈉等。
作為其他添加劑，例如可列舉：糖漿、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、檸檬酸、氯化鈉、亞硝酸鈉及磷酸鈉等。
作為適於經口投予之製劑，例如可列舉：乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等。
乳劑或糖漿劑之類的液體製備物係使用水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等糖類、聚乙二醇或丙二醇等二醇類、芝麻油、橄欖油或大豆油等油類、對羥基苯甲酸酯類等防腐劑、或草莓香料(Strawberryflavor)或薄荷等香料類等作為添加劑而製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露糖醇等賦形劑、澱粉或海藻酸鈉等崩解劑、硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠等結合劑、脂肪酸酯等界面活性劑、或甘油等塑化劑等作為添加劑而製造。
作為適於非經口投予之製劑，例如可列舉：注射劑、栓劑或噴霧劑等。注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或該兩者之混合物之載體等製造。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體製造。噴霧劑係使用不會對受容者之口腔及呼吸道黏膜產生刺激、且可供本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段以微細粒子之形式分散於其中而使之易於吸收的載體等製造。作為載體，例如可列舉：乳糖或甘油等。又，亦可以氣溶膠或乾粉之形式製造。進而，亦可於上述非經口劑中添加作為適於經口投予之製劑中之添加劑所例示之成分。
以本發明之雙專一性抗體之有效量與適宜之稀釋劑及藥理學上可使用之載體的組合計所投予之有效量係每次每1kg體重為0.0001 mg~100mg，2天後間隔8週再投予。
6.使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之疾病之診斷方法
藉由使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段來檢測或測定表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞，可診斷與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病、較佳為與CD40及EpCAM之表現細胞相關之疾病。
作為與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病的惡性腫瘤或癌之診斷例如可藉由以下方式檢測或測定CD40及EpCAM之至少一者而進行。
首先，使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段或該等之衍生物，採用下述免疫學方法，對自複數個健常者生物體採取之生物樣本進行CD40及EpCAM之至少一者之檢測或測定，調查健常者之生物樣本中之CD40及EpCAM之至少一者之存在量。
其次，亦同樣地調查受驗者之生物樣本中之CD40及EpCAM之至少一者之存在量，將該存在量與健常者之存在量進行比較。於受驗者之CD40及EpCAM之至少一者之存在量較健常者而有增加之情形時，診斷該受驗者患癌。其他與CD40及EpCAM之至少一者相關之疾病之診斷亦可藉由相同方法進行。
所謂免疫學方法係使用作有標記之抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量之方法。例如可列舉：放射性物質標記免疫抗體法、酶免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方墨點法或物理化學方法等。
作為放射性物質標記免疫抗體法，例如可列舉如下方法： 使抗原或表現抗原之細胞等與本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段進行反應，進而與作有放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應後，利用閃爍計數器等進行測定。
作為酶免疫測定法，例如可列舉如下方法：使抗原或表現抗原之細胞等與本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段進行反應，進而與作有標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應後，利用吸光光度計測定呈色色素。例如可列舉三明治ELISA法等。
作為酶免疫測定法所使用之標記物，可使用公知之酶標記物[酶免疫測定法，醫學書院(1987)]。例如使用鹼性磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光素酶標記或生物素標記等。
三明治ELISA法係使抗體結合於固相後，捕捉作為檢測或測定對象之抗原，使捕捉到之抗原與第二抗體反應之方法。於該ELISA法中，準備抗原結合部位不同之2種抗體作為與欲檢測或測定之抗原結合之抗體或抗體片段，其後，預先使第一抗體或抗體片段吸附於培養盤(例如96孔培養盤)，繼而利用FITC等螢光物質、過氧化酶等酶或生物素等標記第二抗體或抗體片段。使上述吸附有抗體之培養盤與自生物體內分離之細胞或其破碎液、組織或其破碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水或眼液等進行反應後，再與經標記之抗體或抗體片段進行反應，根據標記物質進行相應之檢測反應。由將濃度既知之抗原進行階段稀釋而製作之校準曲線算出試驗樣本中之抗原濃度。
作為三明治ELISA法中使用之抗體，可使用多株抗體或單株抗體之任意者，亦可使用Fab、Fab'或F(ab)2等抗體片段。作為三明治ELISA法中使用之2種抗體之組合，可為與不同表位結合之單株抗體或該 抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株抗體或其抗體片段之組合。
作為螢光免疫測定法，例如藉由文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗手冊、Kodansha Scientifi(1987)]等中記載之方法測定。作為螢光免疫測定法中使用之標記物，可使用公知之螢光標記物[螢光抗體法，Soft Science公司(1983)]。例如使用FITC或RITC等。
作為發光免疫測定法，例如藉由文獻[生物發光與化學發光臨床檢查42，廣川書店(1998)]等中記載之方法測定。作為發光免疫測定法中使用之標記物，可列舉公知之發光體標記物，例如使用吖啶鎓酯或咯吩等。
作為西方墨點法，利用SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]分餾抗原或表現抗原之細胞等後，將該凝膠印跡(blotting)於聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝化纖維素膜，使該膜和與抗原結合之抗體或抗體片段進行反應，進而和經FITC等螢光物質、過氧化酶等酶標記或生物素標記等之抗IgG抗體或其抗體片段進行反應後，使該標記可視化，藉此進行測定。以下揭示一例。
首先，使表現具有所需胺基酸序列之多肽之細胞或組織溶解，於還原條件下以每區帶之蛋白質量為0.1~30μg之方式藉由SDS-PAGE法進行泳動。繼而，將經泳動之蛋白質轉移至PVDF膜，於包含1~10%BSA之PBS(以下記為BSA-PBS)中於室溫下反應30分鐘而實施阻斷操作。此處，與本發明之雙專一性抗體進行反應後，利用包含0.05~0.1%之Tween-20之PBS(Tween-PBS)洗淨，再與經過氧化酶標記之山羊抗小鼠 IgG於室溫下反應2小時。利用Tween-PBS洗淨，使用ECL西方墨點偵測試劑(ECL Western Blotting Detection Reagents)(Amersham公司製造)等檢測該抗體所結合之帶(band)，藉此檢測抗原。作為藉由西方墨點法檢測時使用之抗體，使用能夠與天然型之不保持立體結構之多肽結合之抗體。
作為物理化學方法，例如藉由使作為抗原之CD40及EpCAM之至少一者與本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段結合，而形成凝集體，對該凝集體進行檢測。此外，作為物理化學方法，亦可採用毛細管法、一維免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢查法提要，金原出版(1998)]等。
於乳膠免疫比濁法中，使用經抗體或抗原敏化之粒徑0.1~1μm左右之聚苯乙烯乳膠等載體，若利用對應之抗原或抗體引發抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，透過光減少。檢測體現該變化之吸光度或積分球濁度，藉此測定受檢樣本中之抗原濃度等。
另一方面，關於表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞之檢測或測定，可使用公知之免疫學檢測法，較佳為使用免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。
作為免疫沈澱法，使表現CD40及EpCAM之至少一者之細胞等與本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段進行反應後，添加蛋白質G瓊脂糖凝膠等對免疫球蛋白具有特異性結合能之載體，而使抗原抗體複合體沈澱。
或可藉由以下方法進行。首先，將本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段固相化於ELISA用96孔培養盤後，利用BSA-PBS實施阻斷。繼而，去除BSA-PBS，利用PBS充分清洗後，與表現CD40及 EpCAM之至少一者之細胞或組織之溶解液進行反應。利用SDS-PAGE用樣本緩衝液自經充分清洗後之培養盤萃取免疫沈澱物，藉由上述西方墨點法進行檢測。
所謂免疫細胞染色法或免疫組織染色法係指如下方法：視情況利用界面活性劑或甲醇等對表現抗原之細胞或組織等實施處理以優化抗體之透過性後，與本發明之雙專一性抗體進行反應，進而與經FITC等螢光標記、過氧化酶等酶標記或生物素標記等之抗免疫球蛋白抗體或其結合片段進行反應後，使該標記可視化，利用顯微鏡進行顯鏡觀察。又，可藉由使螢光標記之抗體與細胞反應後利用流式細胞儀解析之螢光抗體染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗手冊、Kodansha Scientific(1987)]進行檢測。尤其是本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段可藉由螢光抗體染色法檢測表現於細胞膜上之CD40及EpCAM之至少一者。
又，於使用螢光抗體染色法中之FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等之情形時，無需將所形成之抗體-抗原複合體和未參與形成抗體-抗原複合體之游離之抗體或抗原進行分離，即可測定抗原量或抗體量。
[實施例]
以下，藉由實施例而具體地說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。
[實施例1]可溶性人及猴CD40抗原、以及可溶性人、猴及小鼠EpCAM抗原之製備
1.人CD40及猴CD40之可溶性抗原之製備
分別藉由以下記載之方法製作於C末端附加有FLAG-Fc之人及猴CD40之細胞外區域蛋白質。將編碼人CD40細胞外區域之鹼基序列表示為序列編號1，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列表示為序列編號2，將編碼猴CD40細胞外區域之鹼基序列表示為序列編號3，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列表示為序列編號4。
(1)人及猴CD40-FLAG-Fc載體之製作
基於人CD40基因序列(GenBank序列登錄號：NM_001250、序列編號5；將由該基因編碼之胺基酸序列表示為序列編號6)，製作包含序列編號1所表示之鹼基序列之人CD40之細胞外區域之基因片段。
利用限制酶KpnI及XbaI消化包含FLAG-tag及人IgG之Fc區域之INPEP4載體(Biogen-IDEC公司製造)，將附加有包含序列編號1所表示之鹼基序列之第1~60號鹼基序列之人CD40訊號序列編碼區域的該細胞外區域之基因片段插入至適宜部位，而製作人CD40-FLAG-Fc表現載體。
藉由相同方法，基於自猴末梢血液單核球(PBMC)選殖之猴CD40基因序列(序列編號7；將由該基因編碼之胺基酸序列表示為序列編號8)，製作含有包含序列編號3所表示之鹼基序列之猴CD40之細胞外區域之基因片段的猴CD40-FLAG-Fc表現載體。
(2)人及猴CD40-FLAG-Fc蛋白質之製作
使用FreeStyle(商標)293表現系統(Expression System)(Thermo Fisher公司製造)向HEK293細胞導入1-(1)中製作之人CD40-FLAG-Fc表現載體並進行培養，利用短暫性表現系統來表現蛋白質。導入載體5天後， 回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾。
使用蛋白(Protein)A樹脂(MabSelect，GE Healthcare公司製造)對該培養上清液進行親和純化。將蛋白質A所吸附之抗體利用達爾伯克磷酸緩衝生理鹽水[不含鈣與鎂之D-PBS(-)液(D-PBS(-)without Ca and Mg,liquid)；以下記為D-PBS(-)。Nacalai Tesque公司製造]洗淨，利用20mM檸檬酸鈉、50mM NaCl緩衝液(pH值3.4)使之溶出，回收至包含1M磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之管內。
繼而，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超過濾而置換為D-PBS(-)後，利用孔徑0.22μm之膜濾器Millex-Gv(Millipore公司製造)進行過濾殺菌，製作人CD40-FLAG-Fc蛋白質。藉由相同方法，使用1-(1)中製作之猴CD40-FLAG-Fc表現載體，製作猴CD40-FLAG-Fc蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長280nm下之吸光度，使用根據各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數進行計算。
(3)人及猴CD40-GST載體之製作
利用限制酶BglII及KpnI消化包含GST區域之N5載體(Biogen-IDEC公司製造)，將1-(1)中記載之包含序列編號1所表示之鹼基序列之人CD40之細胞外區域之基因片段插入至適宜部位，而製作人CD40-GST表現載體。藉由相同方法，製作含有包含序列編號3所表示之鹼基序列之細胞外區域之基因片段的猴CD40-GST表現載體。
(4)人及猴CD40-GST蛋白質之製作
藉由與1-(2)相同之方法向HEK293細胞導入1-(3)中製作之人CD40-GST載體，將該細胞加以培養後，利用膜濾器過濾培養上清液。使該培養 上清液與麩胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose)4B(GE Healthcare公司製造)反應，利用D-PBS(-)洗淨，使用含10mM麩胱甘肽之50mM Tris-HCI(10mM Glutathione in 50mM Tris-HCI)(pH值8.0)作為溶出緩衝液進行親和純化。
藉由與1-(2)相同之方法對所溶出之融合蛋白溶液進行超過濾及利用膜濾器之過濾殺菌，而獲得人CD40-GST蛋白質。又，使用猴CD40-GST載體，藉由相同方法獲得猴CD40-GST蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長280nm下之吸光度，使用根據各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數進行計算。
2.人、猴及小鼠EpCAM之可溶性抗原之製備
分別藉由以下記載之方法製作於C末端附加有FLAG-Fc或GST之人、猴或小鼠EpCAM之細胞外區域蛋白質。將編碼人EpCAM細胞外區域之鹼基序列表示為序列編號9，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列表示為序列編號10，將編碼猴EpCAM細胞外區域之鹼基序列表示為序列編號11，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列表示為序列編號12，將編碼小鼠EpCAM細胞外區域之鹼基序列表示為序列編號13，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列表示為序列編號14。
基於序列編號15所表示之人EpCAM基因(GenBank序列登錄號：NM_002354，將由該基因編碼之胺基酸序列表示為序列編號16)、序列編號17所表示之猴EpCAM基因(GenBank序列登錄號：XM_015433685，將由該基因編碼之胺基酸序列表示為序列編號18)及序列編號19所表示之小鼠EpCAM基因(GenBank序列登錄號：NM_008532，將由該基因編碼之胺基酸序列表示為序列編號20)，與1-(1) 及(2)中記載之方法同樣地分別獲得人、猴及小鼠EpCAM-FLAG-Fc蛋白質。
再者，於EpCAM-FLAG-Fc表現載體中組入包含序列編號15所表示之鹼基序列之第1~63號之鹼基序列作為訊號序列編碼區域。又，與1-(3)及(4)中記載之方法同樣地，分別獲得人、猴及小鼠EpCAM-GST蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長280nm下之吸光度，使用根據各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數進行計算。
[實施例2]膜表現人EpCAM表現HEK293細胞之製作
使用pEF6/V5-His TOPO TA Expression Kit(Invitrogen公司製造)，對序列編號15所表示之人EpCAM之基因進行TOPO選殖，選擇正向插入人EpCAM基因之純系，藉此獲得膜表現用人EpCAM表現載體pEF6-人EpCAM full。
使用FreeStyle(商標)293表現系統(Thermo Fisher公司製造)向HEK293細胞導入所取得之表現載體pEF6-人EpCAM full並進行培養，利用短暫性表現系統表現蛋白質。基因導入後，進行24小時之振盪培養，藉由離心分離而獲得人EpCAM/HEK293細胞。
[實施例3]抗CD40抗體之取得
1.CD40免疫人抗體M13噬菌體庫之製作
對人抗體產生小鼠[Ishida & Lonberg,IBC's 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I.et al.,Cloning & Stem Cells 4,85-96(2002)及石田 功(2002)實驗醫學20,6,846-851]於腹腔內投予作為免疫原之實施例1中製作之人CD40-FLAG-Fc，共計投予4次。僅初次免疫時添加作為佐劑之Alum凝膠(2mg/隻)及百日咳疫苗(1×109個/隻)。
距初次免疫經過2週後進行第2次免疫，再過1週後進行第3次免疫，距第3次免疫經過10天後進行最終免疫，距最終免疫經過4天後實施解剖而外科摘取脾臟。將所摘取之脾臟置於細胞篩(Cell Strainer)(Falcon公司製造)上，一面用矽棒輕輕搗碎一面將細胞移至管內，進行離心分離而使細胞沈澱後，與紅血球去除試劑(Sigma-Aldrich公司製造)一起於冰中反應3分鐘，再次進行離心分離。
使用RNeasy微型試劑盒(Mini kit)(QIAGEN公司製造)自所獲得之脾臟細胞提取RNA，利用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech公司製造)擴增cDNA，進而利用PCR擴增VH基因片段。將該VH基因片段及含有作為人類抗體生殖系(germ-line)序列之包含序列編號21所表示之鹼基序列之L6序列的VL基因片段插入至噬菌粒(phagemid)pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司製造)，將大腸桿菌TG1(Lucigen公司製造)進行轉形而獲得質體。
再者，L6序列包含序列編號22所表示之胺基酸序列，編碼人抗體之輕鏈可變區(VL)，該VL之CDR1、2及3(分別亦表示為LCDR1、2及3)之胺基酸序列分別以序列編號23、24及25表示。
藉由使所獲得之質體感染VCSM13抗干擾輔助噬菌體(Interference Resistant Helper Phage)(Agilent Technologies公司製造)，而獲得具有包含L6序列之VL基因、且VH基因經庫化之CD40免疫人抗體M13噬菌體庫。
2.抗CD40單株抗體之取得
使用該CD40免疫人抗體M13噬菌體庫，藉由下述噬菌體顯示法取得具有由L6編碼之VL之抗CD40單株抗體。使將實施例1中所取得之人 CD40-GST固相化、並使用SuperBlock封閉緩衝液(Blockig Buffer)(Thermo Fisher公司製造)阻斷未結合人CD40-GST之部位的MAXISORP STARTUBE(NUNC公司製造)、與人抗體M13噬菌體庫於室溫下反應1~2小時，分別利用D-PBS(-)及含0.1% Tween20之PBS(以下記為PBS-T。和光純藥工業公司製造)各清洗3次後，利用0.1M之Gly-HCl(pH值2.2)使噬菌體溶出。
使所溶出之噬菌體感染TG1勝任細胞(competent cell)，擴增噬菌體，再次與固相化於MAXISORP STARTUBE上之人CD40-GST進行反應，分別利用D-PBS(-)及PBS-T各清洗5次後，利用0.1M之Gly-HCl(pH值2.2)使噬菌體溶出。
反覆實施2次或3次該操作，將提呈與人CD40特異性地結合之scFv之噬菌體進行濃縮。使經濃縮之噬菌體感染TG1，接種於SOBAG培養盤(2.0%胰蛋白腖、0.5%酵母提取物(Yeast extract)、0.05% NaCl、2.0%葡萄糖、10mM MgCl2、100μg/mL安比西林、1.5%瓊脂(agar))上形成菌落。
對菌落進行植菌培養後，使之感染VCSM13抗干擾輔助噬菌體，再次進行培養，藉此獲得單株之噬菌體。使用所獲得之單株之噬菌體，藉由ELISA選擇與人及猴CD40-GST兩者均結合之純系。
於ELISA時，使用將實施例1之人或猴CD40-GST固相化於各孔、並利用SuperBlock封閉緩衝液(Thermo Fisher公司製造)阻斷未結合人或猴CD40-GST之部位的MAXISORP(NUNC公司製造)。於各孔添加各噬菌體株，於室溫下反應30分鐘後，將各孔利用PBS-T清洗3次。
繼而，利用含10%Block Ace(大日本製藥股份有限公司製 造)之PBS-T將經辣根過氧化酶標記之抗M13抗體(GE Healthcare公司製造)稀釋5000倍，於各孔分別添加50μL，於室溫下培育30分鐘。將微盤利用PBS-T清洗4次後，於各孔分別添加TMB發色基質液(DAKO公司製造)50μL，於室溫下培育10分鐘。於各孔添加2N HCl溶液(50μL/well)而中止發色反應，利用微盤讀取器(Emax；Molecular Devices公司)測定波長450nm(參照波長570nm)下之吸光度。
對與人及猴CD40兩者均結合之純系進行序列解析，取得具有由L6編碼之VL之抗CD40抗體R1066、R1090S55A、R2089及R2178。表1中揭示所取得之各CD40抗體之編碼VH之全鹼基序列及根據該鹼基序列推測之胺基酸序列、以及VH之CDR1~3(以下有時記為HCDR1~3)之胺基酸序列。
Figure 107139622-A0305-02-0104-1
分別製作組入有所取得之抗CD40抗體R1066、R1090S55A、R2089及R2178之基因之可溶性IgG之表現載體。首先，將編碼R1066、R1090S55A、R2089及R2178之共通之VL的L6基因次選殖至N5KG4PE R409K(記載於國際公開第2006/033386號)之BglII-BsiWI位點(site)。
其後，將R1066、R1090S55A、R2089及R2178各自之VH 基因次選殖至N5KG4PE R409K之SalI-NheI位點，分別獲得作為具有人IgG4PE R409K之恆定區之抗CD40單株抗體R1066、R1090S55A、R2089及R2178之表現載體的N5KG4PE R409K_R1066、N5KG4PE R409K_R1090S55A、N5KG4PE R409K_R2089及N5KG4PE R409K_R2178。
又，為了製作國際公開第2003/040170號中記載之抗CD40單株抗體21.4.1作為抗CD40抗體之陽性對照抗體，而製作表現載體。將21.4.1之VH之鹼基序列表示為序列編號46，將根據該序列推測之VH之胺基酸序列表示為序列編號47。又，將21.4.1之VL之鹼基序列表示為序列編號48，將根據該序列推測之VL之胺基酸序列表示為序列編號49。
合成編碼21.4.1之VH及VL之基因，分別次選殖至N5KG2載體(記載於國際公開第2003/033538號)之SalI-NheI及BglII-BsiWI位點，而獲得具有人IgG2之恆定區之抗CD40單株抗體21.4.1之表現載體N5KG2_21.4.1。
[實施例4]抗EpCAM抗體之取得
1.EpCAM免疫人抗體M13噬菌體庫之製作
使用實施例1之人EpCAM-Fc，藉由與實施例3之1相同之方法，獲得具有包含L6序列之VL基因且VH基因經庫化之EpCAM免疫人抗體M13噬菌體庫。
2.抗EpCAM抗體之取得
使用將實施例1中所取得之小鼠EpCAM-GST固相化、並利用SuperBlock封閉緩衝液(Thermo Fisher公司製造)阻斷未結合小鼠EpCAM-GST之部位的MAXISORP STARTUBE(NUNC公司製造)、與EpCAM免疫 人抗體M13噬菌體庫，藉由與實施例3之2相同之方法，將提呈與小鼠EpCAM特異性地結合之scFv之噬菌體進行單株化。
再者，於一部分實驗批次中，代替第2次以後之使用小鼠EpCAM-GST之生物淘篩(biopanning)操作而進行如下操作：將所溶出之噬菌體添加至對實施例2之人EpCAM/HEK293進行CFSE(Carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester，羧基螢光素二乙酸鹽琥珀醯亞胺酯)染色後之細胞與EpCAM陰性之HEK293細胞中，於冰中反應1小時後洗淨，利用FACS Aria III(BD公司製造)分選(sorting)CFSE陽性細胞，藉由利用0.1M之Gly-HCl(pH值2.2)溶出噬菌體之操作而進行與人EpCAM特異性地結合之噬菌體之濃縮。藉由ELISA自單株化之噬菌體中選擇對人、猴及小鼠EpCAM-GST具有結合性之純系。
ELISA係使用將實施例1之人、猴或小鼠EpCAM-GST固相化、並利用SuperBlock封閉緩衝液(Thermo Fisher公司製造)阻斷未結合人、猴或小鼠EpCAM-GST之部位的MAXISORP(NUNC公司製造)，藉由與實施例3之2相同之方法進行。
對與人、猴及小鼠EpCAM三者均結合之純系進行序列解析，取得具有由L6編碼之VL之抗EpCAM抗體Ep59、Ep203、Epc051及Epc112。藉由與表1相同之表示方法於表2中揭示各EpCAM抗體之VH之序列資料。
Figure 107139622-A0305-02-0107-2
又，作為抗EpCAM抗體之陽性對照抗體，製作具有國際公開第2003/040725號中記載之抗EpCAM單株抗體3622W94之可變區之抗體。將3622W94之VH之鹼基序列表示為序列編號70，將根據該序列推測之VH之胺基酸序列表示為序列編號71。又，將3622W94之VL之鹼基序列表示為序列編號72，將根據該序列推測之VL之胺基酸序列表示為序列編號73。
合成編碼3622W94之VH及VL之基因，將VL次選殖至國際公開第2010/143698號中記載之Tol2轉位子表現載體pKTABEX-TC26之限制酶位點BglII-BsiWI，將VH次選殖至限制酶位點SalI-NheI，獲得具有人IgG1之恆定區之抗EpCAM單株抗體3622W94之表現載體pKTABEX-TC26_3622W94。
[實施例5]與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體之表現載體之構建
藉由以下方法製作具有圖1(A)及圖1(B)中記載之結構且與人及猴CD40之至少一者以及人、猴及小鼠EpCAM之至少任一者結合的雙專一性抗體。雙專一性抗體之形狀採用國際公開第2009/131239號中記載之形狀。
將該雙專一性抗體中之含有包含自N末端側起依序為VH1、CH1、VH2、CH1、鉸鏈、CH2及CH3之胺基酸序列之2條重鏈以及4條輕鏈的抗體稱為N末端型雙專一性抗體。又，將含有包含自N末端側起依序為VH1、CH1、鉸鏈、CH2、CH3、VH2及CH1之胺基酸序列之2條重鏈以及4條輕鏈的抗體稱為C末端型雙專一性抗體。VH1及VH2為抗CD40抗體之VH或抗EpCAM抗體之VH之任一者，若一方為抗CD40抗體之VH，則另一方為抗EpCAM抗體之VH。
於以下之記載中，將連接VH1與VH2之間之多肽稱為連接子，將編碼連接子之胺基酸序列之基因稱為連接子基因。又，將與VH2之C末端側結合之多肽稱為C末端側多肽，將編碼C末端側多肽之基因稱為C末端側序列基因。
藉由以下步驟製作之N末端型雙專一性抗體具有IgG4之CH1(鹼基序列表示為序列編號74，胺基酸序列表示序列編號75)作為連接子。又，具有包含國際公開第2006/033386號記載之IgG4PE R409K之CH(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)之多肽(鹼基序列表示為序列編號76，胺基酸序列表示為序列編號77)作為VH2之C末端側多肽。
C末端型雙專一性抗體具有包含IgG4PE R409K之CH之多肽(鹼基序列表示為序列編號76，胺基酸序列表示為序列編號77)作為連接子。又，具有IgG4之CH1(鹼基序列表示為序列編號74，胺基酸序列表示為序列編號75)作為C末端側多肽。又，藉由以下步驟製作之雙專一性抗體具有包含由L6編碼之VL之輕鏈。
於表3中揭示該雙專一性抗體之名稱、該雙專一性抗體之結構、用於製作該雙專一性抗體之抗CD40抗體之純系及抗EpCAM抗體之 純系。再者，以下有時於N末端型雙專一性抗體之名稱上標註Nt。
Figure 107139622-A0305-02-0109-3
Figure 107139622-A0305-02-0110-4
1.N末端型雙專一性抗體之表現載體之製作
藉由以下記載之方法製作有關表3中記載之雙專一性抗體中之N末端型雙專一性抗體的表現載體。
將編碼實施例3中所取得之R1066、R1090S55A、R2089及R2178以及實施例4中所取得之Ep59、Ep203、Epc051及Epc112之共通之VL的L6基因(序列編號21)次選殖至N5KG4PE R409K(記載於國際公開第2006/033386號)之BglII-BsiWI位點。
其後，編碼與作為連接子之人IgG4之CH1相同之胺基酸序列，合成變更使用密碼子之連接子基因(序列編號74)。將該連接子基因及實施例3中所取得之抗CD40抗體或實施例4中所取得之抗EpCAM抗體之VH基因作為模板，使用KOD FX Neo DNA聚合酶(KOD FX Neo DNA Polymerase)(東洋紡織公司製造)，藉由PCR擴增連接子基因及VH2部分之基因片段。將經擴增之基因片段連結至利用NheI切開之N5KG4PE R409K，藉此獲得N末端型雙專一性抗體表現質體載體。
2.C末端型雙專一性抗體之表現載體之製作
藉由以下記載之方法製作有關表3中記載之雙專一性抗體中之C末端型雙專一性抗體的表現載體。
將編碼實施例3中所取得之抗CD40抗體R1066、R1090S55A、R2089及R2178以及實施例4中所取得之抗EpCAM抗體Ep59、Ep203、Epc051及Epc112之共通之VL的L6基因(序列編號21)次選殖至N5KG4PE R409K(記載於國際公開第2006/033386號)之BglII-BsiWI位點。
其後，編碼與作為C末端側多肽之人IgG4之CH1相同之胺基酸序列，合成變更使用密碼子且包含終止密碼子之C末端側序列基因(序列編號78)。將實施例3中所取得之抗CD40抗體或實施例4中所取得之抗EpCAM抗體之VH基因及所合成之C末端側序列基因作為模板，使用KOD FX Neo(東洋紡織公司製造)藉由PCR擴增VH2及C末端側序列基因片段。
進而，將N5KG4PE R409K作為模板，使用KOD FX Neo(東洋紡織公司製造)藉由PCR擴增連接子基因片段。將經擴增之基因片段連結至利用NheI及BamHI切開之N5KG4PE R409K，藉此獲得表3中記載之C末端型雙專一性抗體表現質體載體。
[實施例6]與CD40結合之單株抗體、與EpCAM結合之單株抗體、以及與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體之製備
使於實施例3~實施例5中次選殖至抗體表現質體載體N5KG4PE R409K及N5KG2之任一者上之抗CD40單株抗體、抗EpCAM單株抗體、以及具有CD40及EpCAM之各結合部位之雙專一性抗體(CD40-EpCAM雙專一性抗體)分別進行表現，並實施純化。
1.抗CD40單株抗體及CD40-EpCAM雙專一性抗體之製作
藉由Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)於Expi293細胞中共基因導入抗CD40單株抗體之表現載體，經過16小時後，添加轉染 增強劑(Transfection Enhancer)，利用短暫性表現系統表現抗體。
距導入載體經過4天後，回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)過濾後，使用蛋白A樹脂(MabSelect，GE Healthcare公司製造)對抗體進行親和純化。使用D-PBS(-)作為清洗液。利用20mM檸檬酸鈉、50mM NaCl緩衝液(pH值3.0)使蛋白A所吸附之抗體溶出，回收至包含200mM磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之管內。
繼而，使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)進行濃縮，使用Nap柱(Nap Column)(GE Healthcare公司製造)將緩衝液置換為D-PBS(-)。進而，使用AKTA FPLC(GE Healthcare公司製造)及Superdex高效柱(High-performance Columns)(GE Healthcare公司製造)，自該抗體溶液分取單體組分。利用AKTA系統孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV，MILLIPORE公司製造)進行過濾殺菌，藉此獲得純化抗體。
測定抗體溶液於波長280nm下之吸光度，使用根據各抗體之胺基酸序列推測之吸光係數，計算純化抗體之濃度。亦藉由相同方法製作CD40-EpCAM雙專一性抗體。
2.抗EpCAM單株抗體之製作
藉由電穿孔法將實施例4中所製作之抗EpCAM單株抗體3622W94表現載體pKTABEX-TC26_3622W94與Tol2轉座酶(transposase)表現載體一起轉染(transfection)至CHO-K1細胞。利用添加有3μg/ml環己醯亞胺(Sigma-Aldrich公司製造)之培養基選擇耐性株。經過14-21天後，藉由可溶性IgG Fc三明治ELISA選擇抗體產生孔(well)。
對抗體產生量較多之孔(well)進行放大培養，進而，再次 測定抗體量，將表現量較多之株構建為3622W94表現株。將所構建之3622W94表現株於EXCEL302培養基(Sigma-Aldrich公司製造)中進行培養，回收上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)過濾後，使用蛋白A樹脂(MabSelect，GE Healthcare公司製造)對抗體進行親和純化。使用D-PBS(-)作為清洗液。
利用20mM檸檬酸鈉、50mM NaCl緩衝液(pH值3.0)使蛋白A所吸附之抗體溶出，回收至包含200mM磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之管內。繼而，使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)進行濃縮，使用Nap柱(GE Healthcare公司製造)將緩衝液置換為D-PBS(-)。
進而，使用AKTA FPLC(GE Healthcare公司製造)及Superdex高效柱(GE Healthcare公司製造)，自該抗體溶液分取單體組分。利用孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV，MILLIPORE公司製造)進行過濾殺菌，藉此獲得純化抗體。測定抗體溶液於波長280nm下之吸光度，使用根據各抗體之胺基酸序列推測之吸光係數，計算純化抗體之濃度。
[實施例7]利用流式細胞儀進行之細胞株之CD40及EpCAM表現評價
依據以下之操作程序，藉由螢光激活細胞分選(FACS，fluoresence activated cell sorting)法評價伯奇氏淋巴瘤細胞Ramos細胞(ATCC No.CCL-1596)、人大腸癌細胞Colo205細胞(ATCC No.CCL-222)、人胚性腎細胞HEK293細胞(ATCC No.CRL-1573)及實施例2中獲得之人EpCAM/HEK293細胞之細胞表面上之CD40及EpCAM之表現。評價時使用實施例6中獲得之抗CD40抗體21.4.1及抗EpCAM抗體3622W94。
使Ramos細胞以1×106cells/mL之濃度懸浮於含有0.1% NaN3、1% FBS之D-PBS(-)之染色緩衝液(SB，Staining Buffer)中，以100μL/well分注至96孔圓底培養盤(Falcon公司製造)。進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，向顆粒物中以50μL/well添加實施例6中獲得之10μg/mL之抗CD40抗體21.4.1及抗EpCAM抗體3622W94使之懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)去除上清液，將顆粒物利用200μL/well之SB清洗3次後，以50μL/well添加1μg/mL之山羊F(ab')2抗人IgG(γ鏈特異性)R-藻紅素複合體(Goat F(ab')2 Anti-Human IgG(γ chain specific)R-phycoerythrin(R-PE)Conjugate)(Southern Biotech公司製造)，於冰溫下培育30分鐘。利用SB清洗2次後，使之懸浮於200μL/well之SB中，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定各細胞之螢光強度。
藉由相同之方式分別評價Colo205細胞、HEK293細胞及人EpCAM/HEK293細胞。作為陰性對照使用如下者：使用Mol Immunol.1996 Jun；33(9)：759-68.中記載之編碼2,4-二硝基苯酚(DNP，2,4-dinitrophenol)抗體之VL及VH(GenBank序列登錄號：VL U16688、VH U116687)之載體，依據國際公開第2006/033386號之實施例5記載之方法所製作之IgG4抗體S228P、L235E、R409K變異體(以下記為抗DNP抗體)。
圖2(A)中顯示針對Ramos細胞之測定結果，圖2(B)中顯示針對Colo205細胞之測定結果，圖2(C)中顯示針對HEK293細胞之測定結果，圖2(D)中顯示針對人EpCAM/HEK293細胞之測定結果。
如圖2(A)所示，作為抗CD40抗體之21.4.1對Ramos細胞顯示結合活性，作為抗EpCAM抗體之3622W94對Ramos細胞不顯示結合活性。另一方面，如圖2(B)及圖2(D)所示，21.4.1對Colo205細胞及人EpCAM/HEK293細胞不顯示結合活性，3622W94對Colo205細胞及人EpCAM/HEK293細胞顯示結合活性。又，如圖2(C)所示，21.4.1及3622W94均對HEK293細胞不顯示結合活性。
藉此確認到：Ramos細胞為CD40陽性且EpCAM陰性，Colo205細胞及人EpCAM/HEK293細胞為CD40陰性且EpCAM陽性，HEK293細胞為CD40陰性且EpCAM陰性。
[實施例8]藉由基於流式細胞儀之CD95表現量解析而進行之CD40單株抗體之CD40訊號誘導活性之評價
以Ramos細胞上之CD95之表現量增加作為指標，藉由以下方式利用FCM法評價實施例6中獲得之CD40單株抗體之CD40訊號誘導能力。
將2×106cells/mL之Ramos細胞以50μL/well接種至U底96孔培養盤(Falcon公司製造)，以50μg/mL添加經包含10%FBS之RPMI1640培養基(Sigma-Aldrich公司製造)稀釋之0.2、2或20μg/ml(終濃度0.1、1或10μg/ml)之試驗抗體，於37℃、5.0%二氧化碳之條件下培養16小時。
進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，將顆粒物利用200μL/well之SB清洗3次。進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，對顆粒物添加PE小鼠抗人CD95(PE mouse anti-human CD95)(Becton Dickinson公司製造)使之懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)去除上清液，將顆粒物利用200μL/well之SB清洗3次後，使經100倍稀釋之7-胺基放射菌素(7AAD)(Becton Dickinson公司製造)懸浮於200μL/well之SB，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定Ramos細胞上之CD95之螢光強度。使用抗DNP抗體作為陰性對照。
圖3(A)顯示抗CD40抗體21.4.1、R1066、R2089及R2178之評價結果，圖3(B)顯示抗CD40抗體21.4.1、R1066及R1090S55A以及抗EpCAM抗體3622W94之評價結果。
根據該等評價結果可知，僅於添加試驗抗體21.4.1、R1066、R2089、R2178、R1090S55A及3622W94中之抗CD40促效性抗體21.4.1時，Ramos細胞上之CD95之表現升高。
即表明，僅21.4.1為誘導CD40之訊號之促效性抗體，實施例3中所取得之抗CD40單株抗體R1066、R2089、R2178及R1090S55A為不會誘導向CD40之訊號之非促效性抗體。又，於存在CD40配體之條件下進行相同試驗，結果抗CD40單株抗體R1066、R2089、R2178及R1090S55A均未對藉由CD40配體之Ramos細胞上之CD95之表現造成抑制(無資料記載)。即表明，抗CD40單株抗體R1066、R2089、R2178及R1090S55A均為不會對藉由CD40配體向CD40之訊號誘導造成抑制之非拮抗性抗體。
[實施例9]藉由Biacore進行之CD40-EpCAM雙專一性抗體對EpCAM之結合性之評價
為了確認實施例6中所獲得之CD40-EpCAM雙專一性抗體對人、猴及小鼠EpCAM各者之結合活性與種間交叉性，使用實施例1中所製作之 人、猴及小鼠EpCAM-GST，藉由表面電漿子共振法(SPR法)實施結合性試驗。作為測定機器，使用Biacore T100(GE Healthcare公司製造)。
使用人抗體捕捉套組(Human Antibody Capture Kit)(GE Healthcare公司製造)，依據隨附說明書，將抗人IgG抗體(Anti-human IgG antibody)固定於CM5感測器晶片(GE Healthcare公司製造)。以10μL/min之流速向流槽添加已調整至1~3μg/mL之試驗抗體10秒。
繼而，分別以30μL/min之流速添加自10或100nM起分5階段達成2倍稀釋之人、猴及小鼠EpCAM-GST蛋白質溶液(利用包含0.1%BSA之HBS-EP+(GE Healthcare公司製造)進行稀釋)作為分析物，對各抗體與分析物之結合反應進行2分鐘測定，對解離反應進行10分鐘測定。
測定係藉由單循環動力學(Single-Cycle Kinetics)法進行。利用BIA評估軟體(Bia Evaluation Software)(GE Healthcare公司製造)解析所獲得之感測圖，計算各抗體之動力學常數(kinetic constant)。
於表4中揭示所算出之各雙專一性抗體對人、猴及小鼠EpCAM各者之解離常數[kd/ka=KD]以及對人EpCAM之解離常數除以對猴EpCAM或小鼠EpCM之解離常數所得之值。
Figure 107139622-A0305-02-0117-5
Figure 107139622-A0305-02-0118-6
如表4所示，除R2178-Ep59及R2178-Ep203對小鼠EpCAM之結合以外，CD40-EpCAM雙專一性抗體對人、猴及小鼠EpCAM之KD值顯示10-8M級以下之強結合。
除R1066-Ep59、R1066-Epc051及R1090S55A-Epc051以外，CD40-EpCAM雙專一性抗體對猴EpCAM之KD值位於對人EpCAM之KD值之1/5~5倍之間，表明存在較高之人-猴EpCAM之種間交叉性。
又，除R2178-Ep59及R2178-Ep203以外，CD40-EpCAM雙專一性抗體對小鼠EpCAM之KD值位於對人EpCAM之KD值之1/5~5倍之間，表明存在較高之人-小鼠EpCAM之種間交叉性。
[實施例10]藉由Biacore進行之CD40-EpCAM雙專一性抗體對CD40之結合性之評價
為了確認實施例6中所獲得之CD40-EpCAM雙專一性抗體對人及猴CD40各者之結合活性與種間交叉性，使用實施例1中所製作之人及猴CD40-GST，藉由表面電漿子共振法(SPR法)實施結合性試驗。作為測定機器，使用Biacore T100(GE Healthcare公司製造)。
使用人抗體捕捉套組(GE Healthcare公司製造)，依據隨附說明書，將抗人IgG抗體固定於CM5感測器晶片(GE Healthcare公司製造)。以10μL/min之流速向流槽添加經調整為1~3μg/mL之試驗抗體10秒。
繼而，分別以30μL/min之流速添加自1.25nM起分5階段達成2倍稀釋之人及猴CD40-GST蛋白質溶液(利用包含0.1%BSA之HBS-EP+進行稀釋)作為分析物，對各抗體與分析物之結合反應進行2分鐘、解離反應進行10分鐘之測定。測定係藉由單循環動力學法進行。
利用BIA評估軟體(GE Healthcare公司製造)解析所獲得之感測圖，計算各抗體之動力學常數。於表5中揭示所算出之各雙專一性抗體對人及猴CD40各者之解離常數[kd/ka=KD]以及對人CD40之解離常數除以對猴CD40之解離常數所得之值。
Figure 107139622-A0305-02-0120-7
如表5所示，CD40-EpCAM雙專一性抗體R1066-Ep59、R1066-Ep203、R1066-Epc051、R1066-Epc112、R1090S55A-Ep59、R1090S55A-Ep203、R1090S55A-Epc051、R1090S55A-Epc112、R2089-Ep59、R2089-Ep203、R2089-Epc051、R2089-Epc112、R2178-Ep203、R2178-Epc051、R2178-Epc112、Ep59-R2089、Ep59-R2178、Ep203-R2089、Ct R1066-Ep59、Ct R1066-Ep203、Ct R1090S55A-Ep59及Ct R1090S55A-Ep203各者對人CD40及猴CD40之KD值均顯示10-9M級以下之強結合。
又，CD40-EpCAM雙專一性抗體R1066-Ep59、R1066-Ep203、R1066-Epc112、R1090S55A-Ep59、R1090S55A-Ep203、R1090S55A-Epc051、R1090S55A-Epc112、R2089-Ep59、R2089-Ep203、R2089-Epc051、R2089-Epc112、R2178-Epc051、R2178-Epc112、Ep59-R2089、Ep59-R2178、Ct R1066-Ep59、Ct R1066-Ep203、Ct R1090S55A-Ep59及Ct R1090S55A-Ep203各者對猴CD40之KD值位於對人CD40之KD值之1/5~5倍之間，表明存在較高之人-猴CD40之種間交叉性。
[實施例11]藉由基於流式細胞儀之CD95表現量解析而進行之CD40-EpCAM雙專一性抗體之CD40訊號誘導活性之評價
以Ramos細胞上之CD95之表現量增加作為指標，藉由以下方式利用FCM法評價實施例6中所獲得之CD40-EpCAM雙專一性抗體於與EpCAM陽性或陰性細胞共存之條件下對Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。
將4×106cells/mL之Ramos細胞以25μL/well接種至U底96孔培養盤(Falcon公司製造)，以50μg/mL添加經包含10%FBS之 RPMI1640培養基(Sigma-Aldrich公司製造)稀釋之0.2、2或20μg/mL(終濃度0.1、1或10μg/mL)之試驗抗體，進而以25μL/well添加4×106cells/mL之Expi293細胞、人EpCAM表現HEK293細胞或Colo205細胞，於37℃、5.0%二氧化碳之條件下培養16小時。
進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，將顆粒物利用200μL/well之SB清洗3次。進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，對顆粒物添加PE小鼠抗人CD95抗體(Becton Dickinson公司製造)及FITC小鼠抗人CD20(FITC mouse anti-human CD20)使之懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)去除上清液，將顆粒物利用200μL/well之SB清洗3次後，使經100倍稀釋之7AAD(Becton Dickinson公司製造)懸浮於200μL/well之SB，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定存在於CD20陽性組分之Ramos細胞上之CD95之螢光強度。使用抗DNP抗體作為陰性對照。
圖4顯示與HEK293細胞共培養之Ramos細胞之結果，圖5顯示與人EpCAM/HEK293細胞共培養之Ramos細胞之結果，圖6顯示與Colo205細胞共培養之Ramos細胞之結果。
如圖4所示，於存在實施例3中所製作之抗CD40抗體21.4.1之條件下將HEK293細胞、人EpCAM/HEK293細胞及Colo205細胞之任一種細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，Ramos細胞上之CD95之表現量增加，表明誘導CD40之訊號。
又，如圖4~6所示，於存在實施例4中所製作之抗EpCAM 抗體3622W94之條件下將人EpCAM/HEK293細胞或Colo205細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，Ramos細胞上之CD95之表現量等同於陰性對照，表明未誘導CD40訊號。
另一方面，如圖4所示於將EpCAM陰性之HEK293細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，各CD40-EpCAM雙專一性抗體純系均不誘導CD40之訊號，然而，如圖5及6所示於將EpCAM陽性之人EpCAM/HEK293細胞或Colo205細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，CD40-EpCAM雙專一性抗體使Ramos細胞上之CD95之表現量增加，表明誘導CD40之訊號。
該等結果暗示，如圖7(B)所示CD40-EpCAM雙專一性抗體於單獨與Ramos細胞上之CD40結合時不誘導CD40訊號，如圖7(A)所示僅於與EpCAM陽性細胞共存時誘導CD40訊號。
確認作為母抗體之抗CD40抗體及抗EpCAM抗體於與EpCAM陽性細胞共存時均不對Ramos細胞誘導CD40訊號[於圖3(A)及(B)中記載有關抗CD40抗體之資料。省略有關抗EpCAM抗體之資料]，但可知CD40-EpCAM雙專一性抗體具有母抗體所以不具備之CD40訊號誘導活性。
據此暗示，本發明之CD40-EpCAM雙專一性抗體特異性地於腫瘤等存在EpCAM表現細胞之病變部位對免疫細胞或腫瘤細胞等CD40陽性細胞誘導訊號。
又，如圖5所示，於hEpCAM/HEK細胞與Ramos細胞共培養時之CD40-EpCAM雙專一性抗體之CD40訊號誘導活性係VH1包含抗CD40抗體之VH且VH2包含抗EpCAM抗體之VH的C末端型雙專一性抗 體、VH1包含抗EpCAM抗體之VH且VH2包含抗CD40抗體之VH的C末端型雙專一性抗體、VH1包含抗CD40抗體之VH且VH2包含抗EpCAM抗體之VH的N末端型雙專一性抗體逐次減弱。
如圖6所示，於Colo205細胞與Ramos細胞共培養之情形時亦可確認到大致相同之傾向。另一方面，可知VH1包含抗EpCAM抗體之VH且VH2包含抗CD40抗體之VH的N末端型雙專一性抗體不具有CD40訊號誘導活性。
即，CD40-EpCAM雙專一性抗體依賴於EpCAM陽性細胞之存在而具有之CD40促效劑活性之強度取決於CD40-EpCAM雙專一性抗體之形狀以及抗CD40抗體之VH及抗EpCAM抗體之VH之配置，C末端型雙專一性抗體之活性強於N末端型雙專一性抗體。即表明，VH1包含抗CD40抗體之VH且VH2包含抗EpCAM抗體之VH的雙專一性抗體之活性強於VH1包含抗EpCAM抗體之VH且VH2包含抗CD40抗體之VH的雙專一性抗體。
[實施例12]螢光標記抗體之製作
為了藉由螢光免疫染色法解析CD40-EpCAM雙專一性抗體於細胞表面上存在情況，進行CD40-EpCAM雙專一性抗體及細胞表面標記抗體之螢光標記。
使用Alexa Fluor 488微型蛋白標記套組(Microscale Protein Labeling Kit)(Molecular Probes公司製造)，依據隨附說明書中記載之方法，製作於CD40-EpCAM雙專一性抗體Ct R1090S55A-Ep203標記有Alexa488之螢光標記抗體。
又，選擇HER2作為於Ramos細胞無表現且於Colo205細胞 有表現之表面標記物，使用Alexa Fluor 647微型蛋白標記套組(Molecular Probes公司製造)，依據隨附說明書中記載之方法，製作於公知之抗HER2抗體(記載於國際公開第1992/022653號)標記有Alexa647之抗體。
[實施例13]CD40-EpCAM雙專一性抗體向EpCAM陽性細胞及CD40陽性細胞之交聯部位之集聚之確認
為了確認CD40-EpCAM雙專一性抗體與Ramos細胞及EpCAM陽性細胞之結合狀態，使用Ct R1090S55A-Ep203-Alexa 488，藉由螢光免疫染色法進行評價。
將1×106cells/mL之Ramos細胞以50μL/well接種於平底96孔培養盤(GREINER公司製造)，利用不含酚紅之RPMI-1640培養基(Gibco公司製造)稀釋實施例13中所製備之Ct R1090S55A-Ep203-Alexa 488及HER2 Ab-Alexa 647，分別以2μg/ml(終濃度1μg/ml)及100μg/ml添加。
進而以50μL/well添加1×106cells/mL之Colo205細胞，於37℃、5.0%二氧化碳之條件下培養14小時，利用In Cell Analyzer 6000(GE Healthcare公司製造)進行觀察。
圖8(A)顯示利用標記於HER2抗體上之Alexa647檢測Colo205細胞所獲得之結果，圖8(B)顯示對標記於Ct R1090S55A-Ep203上之Alexa488進行檢測所獲得之結果，圖8(C)顯示該等之重合。
由於HER2於Ramos細胞無表現且於Colo205細胞有表現，故圖8(A)中僅自Colo205細胞觀察到螢光。因此，於圖8(A)中觀察到之細胞為Colo205細胞，於圖8(B)中觀察到且於圖8(A)中未觀察到之細胞為Ramos細胞。
於圖8(B)中，自Ramos細胞及Colo205細胞兩種細胞上觀察到Ct R1090S55A-Ep203-Alexa 488之螢光。藉此可確認Ct R1090S55A-Ep203於細胞表面上與CD40及EpCAM結合。
如圖8(B)及圖8(C)所示，Ct R1090S55A-Ep203-Alexa 488集聚於Colo205細胞與Ramos細胞之接觸面，觀察到發出較強螢光之狀態(箭頭部分)。該結果表明，CD40陽性細胞與EpCAM陽性細胞發生交聯，於其接觸面集聚有CD40-EpCAM雙專一性抗體。
已知包含CD40之TNFRSF若形成三聚物以上之締合體則會誘導訊號，認為藉由CD40-EpCAM雙專一性抗體集聚於細胞之接觸面，而亦使CD40-EpCAM雙專一性抗體所結合之CD40集聚，因此誘導CD40之訊號。
又，亦觀察集聚於細胞接觸面之CD40-EpCAM雙專一性抗體向細胞內進入之內在化，由此暗示，藉由誘導CD40訊號而促進了CD40之內在化。
[實施例14]抗體對小鼠之毒性試驗
CD40-EpCAM雙專一性抗體Ct R1090S55A-Ep203、Ct Epc112-R1066、R1090S55A-Ep203及抗CD40促效性抗體21.4.1均對小鼠CD40無交差反應性，故於使用小鼠模型進行研究時，使用對C17BL/6J Jcl小鼠導入包含人CD40之BAC(Bacterial Artificial Chromosome，細菌人工染色體)載體而獲得之人CD40 BAC Tg小鼠(以下稱為hCD40Tg小鼠)。
hCD40Tg小鼠係將BAC clone(CTD-2532I19)(Invitrogen公司)進行純化後導入受精卵而製作。使所製作之hCD40Tg小鼠與C17BL/6J Jcl小鼠交配，藉由PCR法確認具有人CD40基因後供於試驗。
於hCD40Tg小鼠各組5隻分別自尾靜脈投予CD40-EpCAM雙專一性抗體Ct R1090S55A-Ep203、Ct Epc112-R1066、R1090S55A-Ep203、抗CD40促效性抗體21.4.1及作為對照抗體之抗DNP抗體，測定投予前與投予24小時後之體重、投予24小時後之末梢血液細胞數、血漿中天冬胺酸胺基轉移酶(AST)、丙胺酸胺基轉移酶(ALT)濃度。關於抗體投予量，除21.4.1以外均設為10mg/kg，21.4.1由於毒性原因，難以以10mg/kg進行投予，故設為1mg/kg。
其結果如圖9(A)~(C)及圖10(A)~(D)所示，於21.4.1投予組中，投予後確認到體重減少、作為肝臟轉移酶之AST及ALT上升以及末梢血液中白血球、淋巴細胞、單核球及血小板減少，於Ct R1090S55A-Ep203、Ct Epc112-R1066及R1090S55A-Ep203投予組中，與作為陰性對照之DNP抗體投予群同樣地未確認到變化。
以上情況表明，與先前抗體相比，本發明之CD40-EpCAM雙專一性抗體顯著降低了全身性毒性。
[實施例15]抗體於小鼠同源(syngeneic)模型中之抗腫瘤效果
為了研究CD40-EpCAM雙專一性抗體Ct R1090S55A-Ep203、Ct Epc112-R1066、R1090S55A-Ep203及抗CD40促效性抗體21.4.1對於小鼠之抗腫瘤效果，使用小鼠同源模型進行研究。
1.腫瘤細胞mEpCAM/B16F10之製作
作為移植之腫瘤細胞，藉由以下方法，製作不表現小鼠EpCAM之小鼠黑色素瘤細胞株B16-F10(ATCC CRL-6475)及表現小鼠EpCAM之B16-F10即mEpCAM/B16F10。
利用BamHI/NotI自使用序列編號19所表示之小鼠EpCAM基因藉由與實施例2相同之方法所製作之膜表現用小鼠EpCAM表現載體pEF6-小鼠EpCAM full中切出mEpCAM(945bp)，連接(ligation)至同樣地經BamHI/NotI處理獲得之pcDNA3.1(+)，而獲得pcDNA3-小鼠EpCAM full。
使用lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific公司製造)，將所取得之表現載體pcDNA3.1-小鼠EpCAM full導入B16F10細胞進行培養，翌日利用3mg/ml之G418實施篩選(selection)。利用細胞分選儀，反覆分選高表現組分3次，而獲得高表現小鼠EpCAM之B16F10細胞。
2.使用小鼠同源模型之抗腫瘤試驗
於hCD40Tg小鼠皮下以1×106細胞移植(Day-8)B16-F10或mEpCAM/B16F10。於Day0、3及7，於各組5隻自尾靜脈投予各抗體。關於抗體投予量，除21.4.1以外均設為10mg/kg，21.4.1由於毒性原因，難以以10mg/kg進行投予，故設為1mg/kg。使用游標卡尺測量腫瘤之長徑、短徑，代入算式(短徑×短徑×長徑/2)算出腫瘤體積。將結果示於圖11(A)及圖11(B)。
如圖11(A)所示，CD40-EpCAM雙專一性抗體Ct R1090S55A-Ep203、Ct Epc112-R1066及R1090S55A-Ep203均對mEpCAM/B16F10顯示明顯藥效。另一方面，如圖11(B)所示，對不表現EpCAM之B16-F10不顯示藥效。以上情況表明，所製作之CD40-EpCAM雙專一性抗體具有依賴於EpCAM之藥效。
[實施例16]與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體或抗體 片段之表現載體之構建
1.雙專一性抗體或抗體片段之設計
(1)異質IgG型雙專一性抗體之設計
作為分別以一價與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體，設計具有圖12(A)記載之結構之雙專一性抗體(以下記為異質IgG型雙專一性抗體)。異質IgG型雙專一性抗體之Fc區域係採用國際公開第2016/071004號中記載之Fc區域。
異質IgG型雙專一性抗體具有2個不同之重鏈恆定區(CH)，以下分別記為CHa及CHb。將CHa之鹼基序列及胺基酸序列表示為序列編號79及80。又，將CHb之鹼基序列及胺基酸序列表示為序列編號81及82。於CHa及CHb之N末端側分別結合抗體之重鏈可變區而形成重鏈。以下，將與CHa及CHb結合之重鏈可變區分別記為VHa及VHb。異質IgG型雙專一性抗體包含：自N末端側起由VHa及CHa連結而成之1條重鏈、自N末端側起由VHb及CHb連結而成之1條重鏈以及相同之2條輕鏈。
(2)Fab型雙專一性抗體片段之設計
作為分別以一價與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體片段，設計具有圖12(B)記載之結構之抗體片段(以下記為Fab型雙專一性抗體片段)。Fab型雙專一性抗體片段之結構係採用國際公開第2009/131239號中記載之自抗體之N末端起至鉸鏈二分之一為止之結構，且於重鏈之C末端側連結有FLAG-Tag。即，Fab型雙專一性抗體片段包含：自N末端側起依序由VH1、CH1、VH2、CH1、鉸鏈之一部分及FLAG-Tag連結而成之1條重鏈以及2條輕鏈。將Fab型雙專一性抗體片段中之自結合於VH2之C末端側之CH1起至FLAG-Tag為止之基因序列記為序列編號83、胺基酸序列記為 序列編號84。
(3)F(ab')2型雙專一性抗體片段之設計
作為分別以二價與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體片段，設計具有圖12(C)記載之結構之抗體片段(以下記為F(ab')2型雙專一性抗體片段)。F(ab')2型雙專一性抗體片段之結構係採用國際公開第2009/131239號中記載之自抗體之N末端起至鉸鏈為止之結構，且於重鏈之C末端側連結有FLAG-Tag。即，F(ab')2型雙專一性抗體片段包含：自N末端側起依序由VH1、CH1、VH2、CH1、鉸鏈及FLAG-Tag連結而成之2條重鏈以及4條輕鏈。將F(ab')2型雙專一性抗體片段中之自結合於VH2之C末端側之CH1起至FLAG-Tag為止之基因序列記為序列編號85、胺基酸序列記為序列編號86。
藉由以下步驟製作之異質IgG型雙專一性抗體之VHa為抗CD40抗體之VH，VHb為抗EpCAM抗體之VH。又，Fab型及F(ab')2型雙專一性抗體片段之VH1為抗CD40抗體之VH，VH2為抗EpCAM抗體之VH。
藉由以下步驟製作之Fab型及F(ab')2型雙專一性抗體具有IgG4之CH1(將鹼基序列表示為序列編號74、胺基酸序列表示為序列編號75)作為VH1與VH2之間之連接子。
又，藉由以下步驟製作之異質IgG型雙專一性抗體、Fab型雙專一性抗體片段及F(ab')2型雙專一性抗體片段具有包含由L6編碼之VL之輕鏈。
於表6中揭示該雙專一性抗體/抗體片段之名稱、雙專一性抗體/抗體片段之結構、用於製作該抗體/抗體片段之抗CD40抗體之純系 及抗EpCAM抗體之純系。
Figure 107139622-A0305-02-0131-8
2.雙專一性抗體或抗體片段之表現載體之製作
(1)異質IgG型雙專一性抗體之表現載體之製作
藉由以下記載之方法製作有關表6中記載之異質IgG型雙專一性抗體之表現載體。
合成於實施例3中所取得之編碼R1066、R1090S55A或R2089之VH之鹼基序列上連結有序列編號79所表示之編碼CHa之鹼基序列的基因，連結至pCI-Hygro2.01(基於Promega公司製造之pCI載體所合成)之BglII-BamHI位點。
又，將實施例4中所取得之Ep59、Ep203及Epc112各者之VH基因次選殖至實施例3中所取得之N5KG4PE R409K_R1066之SalI-NheI位點。其後，藉由使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)(TAKARA BIO公司製造)之PCR反應擴增自編碼VL之L6基因(序列編號21)起至VH區域為止之基因片段，連結至將序列編 號81所表示之編碼CHb之合成鹼基序列次選殖至pCI-Hygro2.01之NheI-BamHI位點而獲得之質體之XbaI-NheI位點，藉此獲得表6中記載之異質IgG型雙專一性抗體表現質體載體。
(2)Fab型雙專一性抗體片段之表現載體之製作
藉由以下記載之方法製作有關表6中記載之Fab型雙專一性抗體片段之表現載體。
以實施例5-1中所製作之N末端型雙專一性抗體R1066-Ep203及R1090S55A-Ep203表現載體作為模板，藉由使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)之PCR反應擴增於自VL起至鉸鏈區之N末端側之4個殘基為止之序列上附加有FLAG-Tag之基因片段，連結至pCI-Hygro2.01之XbaI-BamHI位點，藉此獲得表6中記載之Fab型雙專一性抗體片段表現質體載體。將Fab型雙專一性抗體片段中之自結合於VH2之C末端側之CH1起至FLAG-Tag為止之基因序列記為序列編號83、胺基酸序列記為序列編號84。
(3)F(ab')2型雙專一性抗體片段之表現載體之製作
藉由以下記載之方法製作有關表6中記載之F(ab')2型雙專一性抗體片段之表現載體。
以實施例5-1中所製作之N末端型雙專一性抗體R1066-Ep203及R1090S55A-Ep203表現載體作為模板，藉由使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)之PCR反應擴增於自VL起至鉸鏈為止之序列上附加有FLAG-Tag之基因片段，連結至pCI-Hygro2.01之XbaI-BamHI位點，藉此獲得表6中記載之F(ab')2型雙專一性抗體片段表現質體載體。將F(ab')2型雙專一性抗體片段中之自結合於VH2之C末端側之 CH1起至FLAG-Tag為止之基因序列記為序列編號85、胺基酸序列記為序列編號86。
[實施例17]與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體之製備
藉由以下方法分別表現次選殖至實施例16中所製作之抗體表現質體載體pCI-Hygro2.01上之具有CD40及EpCAM之各結合部位之雙專一性抗體或抗體片段，並進行純化。
1.異質IgG型雙專一性抗體之製作
藉由Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)於Expi293細胞中共基因導入實施例16-2(1)中製作之編碼包含VHa及CHa之重鏈之表現載體以及編碼包含VHb及CHb之重鏈之表現載體，經過16小時後添加轉染增強劑，利用短暫性表現系統表現抗體。
距導入載體經過4天後，回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)過濾後，使用蛋白A樹脂(MabSelect，GE Healthcare公司製造)純化對抗體進行親和。使用D-PBS(-)作為清洗液。利用100mM檸檬酸鈉、50mM NaCl緩衝液(pH值3.5)使蛋白A所吸附之抗體溶出，回收至包含1M Tris-HCl緩衝液(pH值9.0)之管內。
繼而，使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)進行濃縮，使用Nap柱(GE Healthcare公司製造)將緩衝液置換為D-PBS(-)。進而，使用AKTA FPLC(GE Healthcare公司製造)及Superdex高效柱(GE Healthcare公司製造)，自該抗體溶液分取單體組分。利用AKTA系統孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV，MILLIPORE公司製造)進行過濾殺菌，藉此獲得純化抗體。
測定抗體溶液於波長280nm下之吸光度，使用根據各抗體之胺基酸序列推測之吸光係數，計算純化抗體之濃度。又，對所製備之異質IgG型雙專一性抗體之糖鏈進行酶消化後，利用Synapt G2(Waters公司製造)實施質譜分析，確認其為具有1條包含VHa及CHa之重鏈以及1條包含VHb及CHb之重鏈之異質IgG型雙專一性抗體。
2. Fab型雙專一性抗體片段及F(ab')2型雙專一性抗體片段之製作
藉由Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)於Expi293細胞中基因導入實施例16-2(2)中製作之Fab型雙專一性抗體片段表現載體，經過16小時後添加轉染增強劑，利用短暫性表現系統表現抗體片段。
距導入載體經過4天後，回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)過濾後，使用蛋白L樹脂(Protein Express公司製造)對抗體片段進行親和純化。使用D-PBS(-)作為清洗液。利用100mM甘胺酸緩衝液(pH值2.5)使蛋白L所吸附之抗體片段溶出，回收至包含1M TrisHCl緩衝液(pH值8.0)之管內。
繼而，使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)進行濃縮，使用Nap柱(GE Healthcare公司製造)將緩衝液置換為D-PBS(-)。進而，使用AKTA FPLC(GE Healthcare公司製造)及Superdex高效柱(GE Healthcare公司製造)，自該抗體片段溶液分取按各Fab型雙專一性抗體片段之分子量溶出之組分。利用AKTA系統孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV，MILLIPORE公司製造)進行過濾殺菌，藉此獲得純化抗體片段。
又，使用實施例16-2(3)中製作之F(ab')2型雙專一性抗體片段表現載體，藉由與上述相同之方法獲得F(ab')2型雙專一性抗體片段。藉 由SDS-PAGE評價經純化之F(ab')2型雙專一性抗體片段，確認重鏈之間之雙硫鍵經還原之Fab'體之含量較低。
測定抗體片段溶液於波長280nm下之吸光度，使用根據各抗體片段之胺基酸序列推測之吸光係數，計算純化抗體片段之濃度。
[實施例18]人EpCAM表現Expi293細胞之製作
藉由Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)於Expi293細胞中基因導入實施例2中所獲得之膜表現用人EpCAM表現載體pEF6-人EpCAM full進行培養，利用短暫性表現系統表現蛋白質。基因導入後，進行24小時之振盪培養，藉由離心分離而獲得於細胞膜上表現人EpCAM之Expi293細胞(以下記為人EpCAM/Expi293細胞)。
[實施例19]藉由基於流式細胞儀之CD95表現量解析而進行之異源(hetero)雙專一性抗體之CD40訊號誘導活性之評價
以Ramos細胞上之CD95之表現量增加作為指標，藉由以下方式利用FCM法評價實施例17-1中所獲得之異質IgG型雙專一性抗體於與EpCAM陽性或陰性細胞共存之條件下對Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。
將添加之試驗抗體濃度設為2μg/mL(終濃度1μg/mL)，進而將與Ramos細胞共培養之細胞株變更為Expi293細胞或實施例18中所獲得之人EpCAM/Expi293細胞，除此以外，藉由與實施例11相同之方法進行評價。
圖13顯示與人EpCAM/Expi293細胞共培養之Ramos細胞之結果，圖14顯示與Expi293細胞共培養之Ramos細胞之結果。
如圖13及圖14所示，於存在實施例3中所製作之抗CD40抗體21.4.1之條件下將Expi293細胞及人EpCAM/Expi293細胞之任一種細胞 與Ramos細胞進行共培養之情形時，Ramos細胞上之CD95之表現量增加，確認誘導CD40之訊號。
如圖14所示，於將EpCAM陰性之Expi293細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，異質IgG型、N末端型及C末端型CD40-EpCAM雙專一性抗體各者之純系均不誘導CD40之訊號。
另一方面，如圖13所示，於將EpCAM陽性之人EpCAM/Expi293細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，大部分之CD40-EpCAM雙專一性抗體均使Ramos細胞上之CD95之表現量增加，表明誘導CD40之訊號。其訊號誘導活性之強度根據抗CD40抗體之VH及抗EpCAM抗體之VH之組合而異，於相同之抗CD40抗體之VH及抗EpCAM抗體之VH之組合之雙專一性抗體之中，自高至低依序為強度C末端型CD40-EpCAM雙專一性抗體、N末端型CD40-EpCAM雙專一性抗體、異質IgG型CD40-EpCAM雙專一性抗體。
藉此表明，分別以二價與CD40及EpCAM結合C末端型及N末端型CD40-EpCAM雙專一性抗體具有強於分別以一價與CD40及EpCAM結合之異質IgG型雙專一性抗體的依賴於EpCAM之CD40訊號誘導活性。
[實施例20]藉由基於流式細胞儀之CD95表現量解析而進行之Fab型及F(ab')2型雙專一性抗體片段之CD40訊號誘導活性之比較
以Ramos細胞上之CD95之表現量增加作為指標，藉由以下方式利用FCM法評價實施例17-2中所獲得之Fab型及F(ab')2型雙專一性抗體片段於與EpCAM陽性或陰性細胞共存之條件下對Ramos細胞之CD40訊號誘導活性。
利用3倍稀釋系列將添加之試驗抗體自133.3nM(終濃度66.7nM)起於6個濃度點下取得資料，除此以外，藉由與實施例19相同之方法實施評價。圖15(A)顯示與人EpCAM/Expi293細胞共培養之Ramos細胞之結果，圖15(B)顯示與Expi293細胞共培養之Ramos細胞之結果。
如圖15(A)及圖15(B)所示，於存在實施例3中所製作之抗CD40抗體21.4.1之條件下將Expi293細胞及人EpCAM/Expi293細胞之任一種細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，Ramos細胞上之CD95之表現量增加，確認誘導CD40之訊號。
如圖15(B)所示，於存在Fab型及F(ab')2型CD40-EpCAM雙專一性抗體片段之條件下將EpCAM陰性之Expi293細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，各純系均不誘導CD40之訊號。另一方面，如圖15(A)所示，於將EpCAM陽性之人EpCAM/Expi293細胞與Ramos細胞進行共培養之情形時，各Fab型及F(ab')2型CD40-EpCAM雙專一性抗體片段均使Ramos細胞上之CD95之表現量增加，表明誘導CD40之訊號。其訊號誘導活性根據抗CD40抗體之VH及抗EpCAM抗體之VH之組合而異，F(ab')2型CD40-EpCAM雙專一性抗體片段強於Fab型CD40-EpCAM雙專一性抗體片段。
F(ab')2型雙專一性抗體片段具有和Fab型雙專一性抗體片段藉由鉸鏈區所含之半胱胺酸之雙硫鍵進行二聚物化而成之結構類似的形狀。於VH1與VH2之組合相同之情形時，Fab型及F(ab')2型雙專一性抗體片段之胺基酸序列除鉸鏈以外均相同。F(ab')2型雙專一性抗體所具有之鉸鏈更長，但鉸鏈區除二聚物化以外不具有直接結合抗原等功能。因此，認為於VH1與VH2之組合相同之情形時，Fab型及F(ab')2型雙專一性抗體之 依賴於EpCAM之CD40訊號誘導活性之差異取決於結合價數之差異。
若將Fab型及F(ab')2型CD40-EpCAM雙專一性抗體之依賴於EpCAM之CD40訊號誘導活性進行比較，則F(ab')2型CD40-EpCAM雙專一性抗體更強，據此暗示，就依賴於EpCAM之CD40訊號誘導活性而言，分別以二價與CD40及EpCAM結合抗體片段與分別以一價與CD40及EpCAM結合之抗體片段相比具有更強力之活性。
基於特定態樣詳細地說明了本發明，但作為業者應明瞭可於不脫離本發明之主旨與範圍之情況下實施各種變更及變化。再者，本申請案係基於2017年11月8日提出申請之日本專利申請(日本專利特願2017-215834號)，將其整體以引用之形式援用於此。
[序列表非關鍵文字]
序列編號23-人工序列之說明：L6 LCDR1之胺基酸序列
序列編號24-人工序列之說明：L6 LCDR2之胺基酸序列
序列編號25-人工序列之說明：L6 LCDR3之胺基酸序列
序列編號28-人工序列之說明：R1066 HCDR1之胺基酸序列
序列編號29-人工序列之說明：R1066 HCDR2之胺基酸序列
序列編號30-人工序列之說明：R1066 HCDR3之胺基酸序列
序列編號33-人工序列之說明：R1090S55A HCDR1之胺基酸序列
序列編號34-人工序列之說明：R1090S55A HCDR2之胺基酸序列
序列編號35-人工序列之說明：R1090S55A HCDR3之胺基酸序列
序列編號38-人工序列之說明：R2089 HCDR1之胺基酸序列
序列編號39-人工序列之說明：R2089 HCDR2之胺基酸序列
序列編號40-人工序列之說明：R2089 HCDR3之胺基酸序列
序列編號43-人工序列之說明：R2178 HCDR1之胺基酸序列
序列編號44-人工序列之說明：R2178 HCDR2之胺基酸序列
序列編號45-人工序列之說明：R2178 HCDR3之胺基酸序列
序列編號52-人工序列之說明：Ep59 HCDR1之胺基酸序列
序列編號53-人工序列之說明：Ep59 HCDR2之胺基酸序列
序列編號54-人工序列之說明：Ep59 HCDR3之胺基酸序列
序列編號70-人工序列之說明：3622W94 VH之鹼基序列
序列編號71-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
序列編號72-人工序列之說明：3622W94 VL之鹼基序列
序列編號73-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
序列編號74-人工序列之說明：IgG4 CH1之鹼基序列
序列編號75-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
序列編號76-人工序列之說明：IgG4PE R409K CH之鹼基序列
序列編號77-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
序列編號78-人工序列之說明：包含終止密碼子之IgG4 CH1之鹼基序列
序列編號79-人工序列之說明：異質IgG型雙專一性抗體CHa之鹼基序列
序列編號80-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
序列編號81-人工序列之說明：異質IgG型雙專一性抗體CHb之鹼基序列
序列編號82-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
序列編號83-人工序列之說明：Fab型雙專一性抗體之CH1-tag之鹼基 序列
序列編號84-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
序列編號85-人工序列之說明：F(ab')2型雙專一性抗體之CH1-tag之鹼基序列
序列編號86-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
<110> 日商協和醱酵麒麟有限公司(Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd.)
<120> 與CD40及EpCAM結合之雙專一性抗體
<130> W525807
<150> JP2017-215834
<151> 2017-11-08
<160> 86
<170> PatentIn第3.3版
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(522)
<400> 1
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
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<221> CDS
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
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<213> 智人
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<210> 6
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<213> 食蟹獼猴
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<213> 食蟹獼猴
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<213> 智人
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<210> 10
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<213> 智人
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
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<400> 11
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<210> 12
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<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
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<213> 小家鼠
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<210> 14
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<213> 小家鼠
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<210> 16
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<213> 智人
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Figure 107139622-A0305-02-0163-42
Figure 107139622-A0305-02-0164-43
<210> 17
<211> 945
<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(945)
<400> 17
Figure 107139622-A0305-02-0164-44
Figure 107139622-A0305-02-0165-45
Figure 107139622-A0305-02-0166-46
<210> 18
<211> 314
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 18
Figure 107139622-A0305-02-0166-47
Figure 107139622-A0305-02-0167-48
Figure 107139622-A0305-02-0168-49
<210> 19
<211> 948
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(948)
<400> 19
Figure 107139622-A0305-02-0168-50
Figure 107139622-A0305-02-0169-51
<210> 20
<211> 315
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
Figure 107139622-A0305-02-0170-52
Figure 107139622-A0305-02-0171-53
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> L6 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 21
Figure 107139622-A0305-02-0171-54
Figure 107139622-A0305-02-0172-55
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 22
Figure 107139622-A0305-02-0172-56
Figure 107139622-A0305-02-0173-57
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> L6 CDR1胺基酸
<400> 23
Figure 107139622-A0305-02-0173-58
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> L6 LCDR2胺基酸
<400> 24
Figure 107139622-A0305-02-0173-59
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> L6 LCDR3胺基酸
<400> 25
Figure 107139622-A0305-02-0174-60
<210> 26
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 26
Figure 107139622-A0305-02-0174-61
<210> 27
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Figure 107139622-A0305-02-0175-62
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R1066 HCDR1胺基酸
<400> 28
Figure 107139622-A0305-02-0175-63
Figure 107139622-A0305-02-0176-64
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R1066 HCDR2胺基酸
<400> 29
Figure 107139622-A0305-02-0176-65
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R1066 HCDR3胺基酸
<400> 30
Figure 107139622-A0305-02-0176-66
<210> 31
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 31
Figure 107139622-A0305-02-0176-67
Figure 107139622-A0305-02-0177-68
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Figure 107139622-A0305-02-0177-69
Figure 107139622-A0305-02-0178-70
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R1090S55A HCDR1胺基酸
<400> 33
Figure 107139622-A0305-02-0178-71
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R1090S55A HCDR2胺基酸
<400> 34
Figure 107139622-A0305-02-0178-72
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R1090S55A HCDR3胺基酸
<400> 35
Figure 107139622-A0305-02-0179-73
<210> 36
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 36
Figure 107139622-A0305-02-0179-74
Figure 107139622-A0305-02-0180-75
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Figure 107139622-A0305-02-0180-76
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R2089 HCDR1胺基酸
<400> 38
Figure 107139622-A0305-02-0181-77
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R2089 HCDR2胺基酸
<400> 39
Figure 107139622-A0305-02-0181-78
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R2089 HCDR3胺基酸
<400> 40
Figure 107139622-A0305-02-0181-79
<210> 41
<211> 384
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(384)
<400> 41
Figure 107139622-A0305-02-0182-80
<210> 42
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Figure 107139622-A0305-02-0182-81
Figure 107139622-A0305-02-0183-82
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R2178 HCDR1胺基酸
<400> 43
Figure 107139622-A0305-02-0183-83
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R2178 HCDR2胺基酸
<400> 44
Figure 107139622-A0305-02-0184-84
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R2178 HCDR3胺基酸
<400> 45
Figure 107139622-A0305-02-0184-85
<210> 46
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 46
Figure 107139622-A0305-02-0184-86
Figure 107139622-A0305-02-0185-87
<210> 47
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Figure 107139622-A0305-02-0185-88
Figure 107139622-A0305-02-0186-89
<210> 48
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 48
Figure 107139622-A0305-02-0186-90
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Figure 107139622-A0305-02-0187-91
<210> 50
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 50
Figure 107139622-A0305-02-0187-92
Figure 107139622-A0305-02-0188-93
<210> 51
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Figure 107139622-A0305-02-0188-152
Figure 107139622-A0305-02-0189-95
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Ep59 HCDR1胺基酸
<400> 52
Figure 107139622-A0305-02-0189-96
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Ep59 HCDR2胺基酸
<400> 53
Figure 107139622-A0305-02-0189-97
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Ep59 HCDR3胺基酸
<400> 54
Figure 107139622-A0305-02-0190-98
<210> 55
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 55
Figure 107139622-A0305-02-0190-99
Figure 107139622-A0305-02-0191-100
<210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Figure 107139622-A0305-02-0191-101
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Ep203 HCDR1胺基酸
<400> 57
Figure 107139622-A0305-02-0192-102
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Ep203 HCDR2胺基酸
<400> 58
Figure 107139622-A0305-02-0192-103
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Ep203 HCDR3胺基酸
<400> 59
Figure 107139622-A0305-02-0192-104
<210> 60
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 60
Figure 107139622-A0305-02-0192-105
Figure 107139622-A0305-02-0193-106
<210> 61
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 107139622-A0305-02-0193-107
Figure 107139622-A0305-02-0194-108
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Epc051 HCDR1胺基酸
<400> 62
Figure 107139622-A0305-02-0194-109
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Epc051 HCDR2胺基酸
<400> 63
Figure 107139622-A0305-02-0194-110
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Epc051 HCDR3胺基酸
<400> 64
Figure 107139622-A0305-02-0195-112
<210> 65
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 65
Figure 107139622-A0305-02-0195-113
Figure 107139622-A0305-02-0196-114
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 107139622-A0305-02-0196-115
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Epc112 HCDR1胺基酸
<400> 67
Figure 107139622-A0305-02-0197-116
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Epc112 HCDR2胺基酸
<400> 68
Figure 107139622-A0305-02-0197-117
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Epc112 HCDR3胺基酸
<400> 69
Figure 107139622-A0305-02-0197-118
<210> 70
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 3622W94 VH DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(348)
<400> 70
Figure 107139622-A0305-02-0198-119
<210> 71
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 71
Figure 107139622-A0305-02-0199-120
<210> 72
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 3622W94 VL DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 72
Figure 107139622-A0305-02-0199-121
Figure 107139622-A0305-02-0200-122
<210> 73
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 73
Figure 107139622-A0305-02-0200-123
Figure 107139622-A0305-02-0201-124
<210> 74
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> IgG4 CH1 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(294)
<400> 74
Figure 107139622-A0305-02-0201-125
Figure 107139622-A0305-02-0202-126
<210> 75
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 75
Figure 107139622-A0305-02-0202-127
<210> 76
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> IgG4PE R409K DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(981)
<400> 76
Figure 107139622-A0305-02-0203-128
Figure 107139622-A0305-02-0204-129
<210> 77
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 77
Figure 107139622-A0305-02-0205-131
Figure 107139622-A0305-02-0206-132
<210> 78
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 包含終止密碼子之IgG4PE R409K DNA
<400> 78
Figure 107139622-A0305-02-0206-133
Figure 107139622-A0305-02-0207-134
<210> 79
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 異質IgG BsAb CHa
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(993)
<400> 79
Figure 107139622-A0305-02-0207-135
Figure 107139622-A0305-02-0208-136
Figure 107139622-A0305-02-0209-137
<210> 80
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 80
Figure 107139622-A0305-02-0209-138
Figure 107139622-A0305-02-0210-139
Figure 107139622-A0305-02-0211-140
<210> 81
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 異質IgG BsAb CHb
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(993)
<400> 81
Figure 107139622-A0305-02-0211-141
Figure 107139622-A0305-02-0212-142
<210> 82
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 82
Figure 107139622-A0305-02-0213-143
Figure 107139622-A0305-02-0214-144
<210> 83
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Fab BsAb CH1-標籤
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<400> 83
Figure 107139622-A0305-02-0215-145
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 84
Figure 107139622-A0305-02-0215-146
Figure 107139622-A0305-02-0216-147
<210> 85
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> F(ab')2 BsAb CH1-標籤
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 85
Figure 107139622-A0305-02-0216-148
Figure 107139622-A0305-02-0217-149
<210> 86
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 86
Figure 107139622-A0305-02-0217-150
Figure 107139622-A0305-02-0218-151

Claims (28)

  1. 一種雙專一性抗體，其包含與CD40結合之抗原結合區域及與EpCAM(Epitherial Cell Adhesion Molecule，上皮細胞黏附分子)結合之抗原結合區域，且分別以二價與CD40及EpCAM結合；與CD40結合之抗原結合區域包含與CD40特異性地結合之抗體(抗CD40抗體)之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，且與EpCAM結合之抗原結合區域包含與EpCAM特異性地結合之抗體(抗EpCAM抗體)之VH及VL；VL為含有分別包含序列編號23~25所表示之胺基酸序列之互補決定區(CDR)1~3之VL；抗CD40抗體為包含選自由以下之(1a)至(1d)所組成之群中之任一個VH之抗CD40抗體，抗EpCAM抗體為包含選自由以下之(2a)至(2d)所組成之群中之任一個VH之抗EpCAM抗體：(1a)含有分別包含序列編號28~30所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(1b)含有分別包含序列編號33~35所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(1c)含有分別包含序列編號38~40所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、及(1d)含有分別包含序列編號43~45所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH； (2a)含有分別包含序列編號52~54所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(2b)含有分別包含序列編號57~59所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、(2c)含有分別包含序列編號62~64所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、及(2d)含有分別包含序列編號67~69所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH。
  2. 如請求項1之雙專一性抗體，其具有：包含自N末端起依序為VH1-X-VH2-Y之式{式中，VH1表示第一抗體之VH，VH2表示第二抗體之VH，X及Y分別表示包含抗體之CH1之多肽(此處，X及Y之至少一者進而包含抗體之鉸鏈區)}所表示之多肽之相同之2條重鏈、及包含相同之VL之4條輕鏈，該第一抗體及該第二抗體之任一者為抗CD40抗體，另一者為抗EpCAM抗體。
  3. 如請求項2之雙專一性抗體，其中輕鏈為κ鏈。
  4. 如請求項2之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含人IgG之CH1之多肽，Y為包含人IgG之CH1、鉸鏈區、CH2及CH3之多肽。
  5. 如請求項2之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽，Y為包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽。
  6. 如請求項2之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含人IgG之CH1、鉸鏈區、CH2及CH3之多肽，Y為包含人IgG之CH1之多肽。
  7. 如請求項2之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含序列編號77所表示之胺基酸序列之多肽，Y為包含序列編號75所表示之胺基酸序列之多肽。
  8. 如請求項1之雙專一性抗體，其中VL為包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL。
  9. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其具有CD40促效劑活性。
  10. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其於不存在表現EpCAM之細胞之情況下不顯示CD40促效劑活性，僅於存在表現EpCAM之細胞之情況下顯示CD40促效劑活性。
  11. 如請求項2之雙專一性抗體，其中第一抗體為抗CD40抗體，第二抗體為抗EpCAM抗體。
  12. 如請求項2之雙專一性抗體，其中第一抗體為抗EpCAM抗體，第二抗體為抗CD40抗體。
  13. 如請求項1之雙專一性抗體，其中抗CD40抗體為含有包含序列編號27、32、37及42任一者所表示之胺基酸序列之VH之抗CD40抗體。
  14. 如請求項1之雙專一性抗體，其中抗EpCAM抗體為含有包含序列編號51、56、61及66任一者所表示之胺基酸序列之VH之抗EpCAM抗體。
  15. 如請求項2之雙專一性抗體，其中上述式中之X為包含人IgG之CH1、鉸鏈區、CH2及CH3之多肽，Y為包含人IgG之CH1之多肽，第一抗體為抗CD40抗體，第二抗體為抗EpCAM抗體，VL為包含序列編號22所表示之胺基酸序列之VL，抗CD40抗體為含有包含序列編號32所表示之胺基酸序列之VH之抗CD40抗體，抗EpCAM抗體為含有包含序列編號56所表示之胺基酸序列之VH之抗EpCAM抗體。
  16. 一種雙專一性抗體片段，其係如請求項1至15中任一項之雙專一性抗體之雙專一性抗體片段。
  17. 如請求項16之雙專一性抗體片段，其為Fab型雙專一性抗體片段或 F(ab')2型雙專一性抗體片段。
  18. 一種DNA，其編碼如請求項1至15中任一項之雙專一性抗體或如請求項16或17之雙專一性抗體片段。
  19. 一種重組載體，其含有如請求項18之DNA。
  20. 一種轉形株，其係向宿主細胞導入如請求項19之重組載體而獲得。
  21. 一種如請求項1至15中任一項之雙專一性抗體或如請求項16或17之雙專一性抗體片段之製造方法，其特徵在於：將如請求項20之轉形株於培養基中進行培養，使培養物中生產蓄積如請求項1至15中任一項之雙專一性抗體或如請求項16或17之雙專一性抗體片段，自該培養物採取該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。
  22. 一種與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病之治療及/或診斷劑，其含有如請求項1至15中任一項之雙專一性抗體或如請求項16或17之雙專一性抗體片段作為有效成分。
  23. 如請求項22之劑，其中與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病為癌。
  24. 如請求項1至8及11至15中任一項之雙專一性抗體或如請求項16或17 之雙專一性抗體片段，其係用於治療及/或診斷與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病。
  25. 如請求項24之雙專一性抗體或如請求項16或17之雙專一性抗體片段，其中與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病為癌。
  26. 一種如請求項1至15中任一項之雙專一性抗體或如請求項16或17之雙專一性抗體片段之用途，其係用於製造與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病之治療及/或診斷劑。
  27. 如請求項26之用途，其中與人CD40及人EpCAM之至少一者相關之疾病為癌。
  28. 一種用以檢測或測定EpCAM及CD40之至少一者之試劑，其包含如請求項1至15中任一項之雙專一性抗體或如請求項16或17之雙專一性抗體片段。
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