TW201136601A - Methods of treating autoimmune diseases with dll4 antagonists - Google Patents

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201136601 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於使用類δ配位子4 (delta-like ligand 4, D114)拮抗劑治療一其中增加調節性τ細胞(Treg細胞或 Tregs)是有益的疾病、障礙或病況的方法。更特別地，本發 明之方法可藉由以D114拮抗劑阻斷D114結合至Notch受體 來治療各種自體免疫疾病以及器官移植排斥與移植物_抗_ 宿主疾病（graft-versus-host diseases，GVHD)，藉此增加 Tregs的數目。本發明更有關於在一傾向罹患或易罹患該等 疾病或障礙的個體中預防此等疾病或障礙發生或復發的方 法。 【先前技術】

Notch受體及其配位子之間的交互作用代表一個在演 化上保守的路徑，它不僅是對於細胞命運決定來說是重要 的’對於在造血作用中調節譜系決定與胸腺發育也是重要 的（Artavanis-Tsakonas ei fl/.，1999, 284:770-776 ; 81^)10)5^(3/.,20075^/^/7^^204:1525-1531 ;以及 Amsen eia/.，2004 Ο" 117:515-526)。近來顯示，D114-Notchl 抑制 會導致T細胞發育完全阻斷，伴隨著B細胞的異位外觀 (ectopic appearance)以及樹突狀細胞（dendritic cells，DC)擴 增，這些可能是因為原-T細胞(Pro-T cell)在胸腺内轉換命 運至 DC 所引起（Hozumi 扣 <3/.，2008，五X/? Med 205(11):2507-2513 ； Koch et al., 2008, J Exp Med 205(11):2515-2523 ;以及 Feyerabend a/” 2009, 4 201136601 30:1-13)。因此，Notch傳訊對於決定造血前驅細胞的細胞 命運決定來說是關鍵性的有了累積證據。再者，已顯示調 節性T細胞（Treg)恒定在活體内藉由DCs回饋控制 (Darrasse-JSze ei α/.，2009 «7五X/? Med 206(9):1853-1862)。但 是，Notch傳訊在控制DC來源與發育以及隨後的Treg恆 定中的角色仍未知。這在臨床上是一個重要的問題，因為 鑑定會誘導Treg擴增的新穎方法可用作為治療自體免疫疾 病以及障礙。 人類D114 (hDU4)的核酸以及胺基酸序列分別顯示於 SEQIDNO : 1以及2中。D114拮抗劑及其應用揭示於W0 2007/143689、WO 2007/070671、WO 2008/076379、W0 2008/042236 以及 WO/2008/019144 中。 【發明内容】 本發明一部分是基於發明人觀察到專一地結合D114並 且阻斷D114結合至Notch受體的抗體能夠在小鼠中完全預 防貫驗性自體免疫腦脊趙炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)(—種關於人類多發性硬化症的動 物模型）的進展，但對照抗體無法預防EAE。再者，發明人 發現，抗-D114抗體的這個作用是與Treg細胞的數目增加 有關。此外’進一步觀察到’抗-D114抗體在NOD/ShiLtJ 小鼠（一種關於第1型糖尿病的動物模型）的胰臟中會預防 血糖含量增加並且維持β-島的數目與型態，而這些作用至 少有一部分是由Tregs的擴增所媒介。 因此，在第一個方面，本發明是以一種增加Treg細胞 201136601 數目的方法為特徵，該方法包含有將一有效量的D114拮抗 劑投藥給有需要的個體’其中該D114拮抗劑會阻斷D114與 Notch受體之間的交互作用並且增加丁reg細胞的數目。 在第二個方面，本發明是以一種治療或改善其中增加 Treg細胞的數目是有益的疾病、障礙或病況的方法為特 徵’該方法包含有將一治療有效量的D114拮抗劑投藥給有 需要的個體。可為本發明之方法所治療的疾病或障礙是任 一種透過移除、抑制或減少D114活性，藉此在受治療個體 體内增加Treg細胞數目而受益（亦即，增進、改善、抑制或 預防）的疾病、障礙或病況。此等疾病、障礙或病況包括， 但不限於各種自體免疫疾病’諸如多發性硬化症、糖尿病、 類風濕性關節炎、克隆氏病（Crohn’s disease)、古巴士德氏 症候群（Goodpasture’s syndrome)、格雷氏病（Graves， disease)、格巴二氏症候群（Guillain_Barr6 syndrome，GBS)、 橋本氏病（Hashimoto’s disease)、特發性血小板減少性紫瘢 (idiopathic thrombocytopenic purpura)、腸躁症（irritable bowel syndrome)、紅斑狼瘡、混合性結締組織病、重症肌 無力（myasthenia gravis)、嗜睡病（narcolepsy)、天狼瘡 (pemphigus vulgaris)、惡性貧jk、多發性肌炎、原發性膽汁 肝硬化（primary biliary cirrhosis)、休格儉氏症候群 (Sj5gren’s syndrome)、潰瘍性大腸炎、血管炎、華格納氏 肉芽病（Wegener’s granulomatosis)以及類似者，還有器官移 植排斥與GVHD。 在一個具體例中，用於本發明之方法中的D114拮抗劑 6 201136601 是D114抗體或其片段(nDi14Ab，，或“D114 Ab，，），其以高親 和力專一地結合D114並且阻斷D114結合至Notch受體和/ 或阻斷D114-Notch傳訊路徑。該抗體可以是多株的、單株 的（mAb)、嵌合的、人類化的或完全人類抗體或其片段。抗 體片段可以是單鏈抗體、Fab或(Fab，)2。 在一個具體例中，D114 Ab或其抗原-結合片段結合 hD114 (SEQ ID NO : 2)的N-端領域(domain)的抗原決定位 (epitope)(殘基 S27-R172)，或 Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)領 域中的抗原決定位（殘基V173-C217)，或N-端-DSL領域中 的抗原決定位（殘基S27-C217)。在另一個具體例中，D114 Ab 或其抗原-結合片段結合egf領域之一者中的抗原決定 位，亦即約在hD114 (SEQ ID NO : 2)的胺基酸殘基 Q218-N251 (領域 1)、E252-D282 (領域 2)、D284-E322 (領 域 3)、E324-E360 (領域 4)、S362-E400 (領域 5)、K402-E438 (領域 6)、H440-E476 (領域 7)或 S480-E518 (領域 8)。在一 些具體例中，該抗體或抗體片段可結合涉及超過1個上列 抗原決定位的構形抗原決定位(conformational epitope)。當 藉由表面電漿共振(surface plasmon resonance)來測量時，用 於本發明之方法的D114 Ab或其片段能夠以高親和力結合 人類D114並且具有約1 nM或更少、約500PM或更少、約 300 pM或更少、約200 pM或更少、約10〇 PM或更少’或 約50pM或更少的平衡解離常數(KD)。 在一個具體例中，D114Ab或其片段包含一重鏈可變區 域(HCVR)，其包含3個分別具有SEQ ID NO : 22、24以 201136601 及26之胺基酸序列的重鏈互補決定區域HCDRl、HCDR2 以及HCDR3。在另一個具體例中，該抗體或其片段包含一 輕鏈可變區域(LDVR)，其包含3個分別具有SEQ ID NO : 3〇、32以及34之胺基酸序列的輕鏈互補決定區域LCDR1、 LCDR2以及LCDR3。在另一個具體例中，該D114 Ab或其 片段包含重鏈與輕鏈CDR序列，其含有SEQ ID NO: 22、 24、26、30、32以及34的CDR序列組合。在又另一個具 體例中，該D114 Ab包含一具有SEQ ID NO : 20或116之 胺基酸序列的HCVR，或包含一具有SEQ ID NO: 28或118 之胺基酸序列的LCVR。在又另一個具體例中，該D114Ab 包含有 SEQ ID NO: 20/28 (REGN281)或 116/118 (REGN421) 的 HCVR/LCVR 組合。 在某些具體例中，該D114 Ab包含一重鍵 CDR1/CDR2/CDR3 組合以及一輕鏈 CDR1/CDR2/CDR3 組 合，其是分別選自於下列：SEQ ID NO : 6/8/10以及SEQ ID NO : 14/16/18 ; SEQ ID NO : 38/40/42 以及 SEQ ID NO : 46/48/50; SEQ ID NO: 54/56/58 以及 SEQ ID NO: 62/64/66 ; SEQ ID NO : 70/72/74 以及 SEQ ID NO : 78/80/82 ; SEQ ID NO : 86/88/90 以及 SEQ ID NO : 94/96/98 ;與 SEQ ID NO : 102/104/106 以及 SEQ ID NO : 110/112/114。在另一個具體 例中，該 D114 Ab 包含一具有 SEQ ID NO : 4、36、52、68、 84或100之胺基酸序列的HCVR，或一具有SEQ ID NO : 12、44、60、76、92或108之胺基酸序列的LCVR。在又 另一個具體例中，該D114 Ab包含一選自於下列的 8 201136601 HCVR/LCVR 組合：SEQ ID NO : 4/12 (REGN279) ; SEQ ID NO ： 36/44 (REGN290) ； SEQ ID NO ： 52/60 (REGN306)； SEQ ID NO ： 68/76 (REGN309) ； SEQ ID NO ： 84/92 (REGN310);以及 SEQ ID NO : 100/108 (REGN289)。 編碼 SEQ ID NO : 4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、 74、76、78，80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、 100、102、104、106、108、110、112、114、116 以及 118 之胺基酸序列的核苷酸序列分別顯示為SEQID NO: 3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、 33、35、37、39、4卜 43、45、47、49、5卜 53、55 ' 57、 59、6卜 63、65、67、69、7卜 73、75、77、79、8卜 83、 85、87、89、9卜 93、95、97、99、1(Π、103、105、107、 109、111、113、115 以及 117。 在另一個具體例中，可用於本發明之方法中的D114拮 抗劑是一種融合蛋白質，其包含至少一能夠結合D114的可 溶性Notch受體或其片段，其融合至一多聚化組分 (multimerizing component)。在一個具體例中，該可溶性 Notch受體是人類Notchl或Notch4。在另一個具體例中， 本發明之D114拮抗劑是一個經修飾的D114蛋白質，其能夠 結合Notch受體（等），但是這樣的結合不會造成受體（等）活 化。在某些具體例中，本發明的D114拮抗劑是一種融合蛋 白質，其包含D114的細胞外領域或其片段融合至一個多聚 201136601 化組分(諸如免疫球蛋白領域，例如人類igG的Fc領域）。 在某些具體例中’該等D114拮抗劑包括可以阻斷 D114-Notch交互作用的小分子以及其他藥劑。 在第三個方面，本發明是以一種在傾向罹患或易罹串 上述自體免疫疾病或障礙之個體中預防或降低該疾病或障 礙發生或復發的方法為特徵’其包含將—預防有效量的 D114拮抗劑投藥給該個體。在一個相關具體例中，本發明 進一步是以一種在移植接受者體内預防或降低器官移植排 斥或GVHD之可能性的方法為特徵，其包含在移植之前和 /或之後將一預防有效量的D114拮抗劑投藥給該接受者。 在第四個方面’本發明是以預防、治療或改善自體免 疫疾病或障礙，或器官移植排斥的方法為特徵，其包含將 一有效量的D114拮抗劑組合額外的治療劑（例如，免疫抑制 劑（immunosuppressive agent)或免疫抑制劑 (immunosuppressant)、抗發炎劑、鎮痛劑、諸如胰島素的 降血糖劑以及類似物，它們之中的數者具有彼此重複的治 療效用）投藥給有需要的個體。與D114拮抗劑組合使用的適 當免疫抑制劑包括，但不限於糖皮質素(glucocorticoids)、 環孢素（cyclosporin)、胺曱喋呤（methotrexate)、干擾素β (IFN-β)、他克莫司（tacrolimus)、西羅莫司（sirolimus)、硫。坐 口票吟（azathioprine)、魏。票呤（mercaptopurine)、類鸦片 (opioids)、黴紛酸(mycophenolate)、TNF-結合蛋白（諸如因 福利美（infliximab)、依坦西普（eternacept)、阿達木單抗 (adalimumab)與類似物）、細胞毒性抗體（諸如放線菌素 201136601 (dactinomycin)、蔥環黴素（anthracyclines)、絲裂黴素 C (mitomycin C)、博來黴素（bleomycin)、米拉黴素 (mithramycin)與類似物）、標靶免疫細胞的抗體（諸如抗 -CD20抗體、抗-CD3抗體與類似者）。用於與抗①似拮抗 劑組合治療的適當抗發炎劑和/或鎮痛劑包括阿司匹靈，布 洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)與類似物、TNF-α拮抗 劑、IL-1拮抗劑、IL-6拮抗劑、乙酿胺紛(acetamin〇phen)、 類嗎啡肽(morphinomimetics)以及類似物。 在第五個方面，本發明是以一種包含D114拮抗劑、至 少一額外的治療劑以及一醫藥上可接受之載體的醫藥組成 物為特徵。在一個具體例中，該D114拮抗劑是以高親和力 專一地結合至D114並且中和D114活性的D114 Ab或其片 段，以及任一種上述免疫抑制劑、抗發炎劑、鎮痛劑、降 血糖劑與類似物。 在第六個方面，本發明是以一種包含一容器（含有本發 明之醫藥組成物）以及一包裝說明書（具有使用指弓丨）的套^ 為特徵。 0 其他目 清楚。 的以及優點將因為回顧隨後的詳細說明而變得 詳細說明 在說明本發明之前，要理解的是，本發明不限< 述的特定方法以及實驗條件，因為此等方法以及條j 會改變。也要理解的是，此處所使用的術語僅是作 11 201136601 特定具體例之用，而並非意欲為限制，因為本發明的範圍 僅會受到隨附申請專利範園所限制。 如同在本說明書以及隨付申請專利範圍中所用，除# 内文另有清楚指明，單數形‘‘^(a)，，、“一（an)，，以及‘‘該(the)” 包括所參照者的複數形。因此，例如提到“一方法’’包括一 或多種此處所述類型的方法，和/或步驟，和/或在閱讀本揭 示内容之後那些熟習此藝將會變得清楚。 除非另有定義，所有此處使用的技術以及科學術語具 有與本發明所屬技藝中具有通常技術者普遍理解相同的意 思。儘管任何類似或等同於此處所述方法以及材料可應用 於本發明的實施或測試，現將說明較佳的方法以及材料。 所有此處述及的公開文件以其整體併入此處做為參考文 件。 定義 術語“D114拮抗劑”，如此處所用，包括能夠阻斷Dli4 結合至Notch受體（諸如Notchl以及Notch4)和/或阻斷 D114-Notch傳訊路徑之針對D114的抗體及其片段(參見’例 如W0 2008/076379)、包含有融合至多聚化組分之0114的 細胞外領域的融合蛋白質或其片段(參見例如，美國專利公 開第2006/0134121號以及第2008/0107648號）、肽或肽體 (參見例如，美國專利第7,138,370號）以及類似物，它們會 阻斷D114與Notch受體之間的交互作用。因此，在某些具 體例中，該術語亦含括諸如小分子、抗體或其抗原-結合片 段以及類似物的拮抗劑，它們專一地結合Notch受體(例如 12 201136601 抗-Notchl抗體、抗_Notch4抗體等）並且阻斷DU4-Notch傳 訊路徑。 術語”抗體”，如此處所用，欲意指一個免疫球蛋白分 子’其含有4個多肽鏈，藉由雙疏鍵交互連結的2個重(η) 鏈以及2個輕(L)鏈。各個重鏈含有1個重鏈可變區域（此處 縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區域(cH)。重鏈恆 定區域含有3個領域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有 1個輕鏈可變區域(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈 恆定區域。輕鏈恆定區域含有1個領域，CL。VH與VL區 域可進一步分為具有超變異性的區域（命名為互補決定區 域(CDR))’散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區域(FR))。 各個VH與VL由3個CDRs以及4個FRs所構成，以下列 順序從胺基端往羧基端排列·· FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3 以及 FR4。 用於鑑定HCVR以及LCVR胺基酸序列中之CDRs的 方法以及技術在該技藝中是已知的並且可以應用於鑑定此 處揭示之特定HCVR和/或LCVR胺基酸序列中的CDRs。 可用來鑑定CDRs邊界的習知方法包括Kabat限定、Chothia 限定以及AbM限定。一般來說，Kabat限定是以序列變異 性為基礎，Chothia限定是以結構環區域的位置為基礎，而 AbM限定是介於Kabat以及Chothia法之間的折衷法。參 見，例如 Kabat，“Sequences of Proteins of Immunological Interest/5 National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ； Al-Lazikani et al, J. Mol Biol. 273:927-945 13 201136601 (1997);以及 Martin et al.，proc Nati Acad. Sci. 86:9268-9272 (1989)。關於鑑定抗體中的CDR序列，也可 使用公開資料庫。 置換一或多個CDR殘基或省略一或多個CDRs也是可 行的。在科學文獻中已說明過對於結合來說可免除丨或2 個 CDRs 的抗體。Padlan 等人(1995 FASEB J. 9:133-139)依 據已公開的晶體結構分析抗體及其抗原之間的接觸區域， 並推論僅有約五分之一至三分之一的CDR殘基實際接觸 到抗原。Pandlan也發現到，許多抗體在其i或2個CDRs 中:又有胺基酸與抗原接觸（亦參見Vajd〇s ei α/. 2002 J Mol Biol 320:415-428)。 未接觸到抗原的CDR殘基可以依據先前研究（例如 CDRH2中的殘基H60-H65通常是不需要的)從chothia CDs 以外的Kabat CDRs的區域藉著分子模型和/或憑經驗來鑑 定出。若忽略CDR或其（等）殘基，通常會以一個在另一個 人類抗體序列或此等一致序列的對應位置的胺基酸予以置 換。關於在CDRs内置換的位置以及要置換的胺基酸也可 以憑經驗來選定。憑經驗置換可以是守恆或非守恆置換。 術語“抗體”亦含括帶有經修飾之醣化形式 (glycosylationpattern)的抗體。在一些應用中，移除非所欲 醣化位置的修飾可能是有利的，或例如移除岩藻糠部分以 增加抗體依賴型細胞毒性(ADCC)功能（參見Shield W α/. (2002) JBC 277:26733)。在其他應用中，移除Ν-醣化位置 可降低非所欲的免疫反應對抗治療抗體，或增加抗體的親 14 201136601 和力。在又其他應用中，為了修飾補體依賴型細胞毒性 (CDC) ’可以做出半乳糖化的修飾。 術語抗體的“抗原-結合片段”(或簡化“抗體片段”），如 此處所用，意指維持專一地結合至hD1M或其他所欲標的 蛋白質之能力的抗體的一或多個片段。抗體片段可包括Fab 片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段單鏈Fv (scFv)分 子、dAb片段、由模擬抗體之超變異區域的胺基酸殘基所 構成的最小辨識單位(例如，含有CDR或分離CDR的片 段）。其他經工程化的分子，諸如雙鍵抗體(diab〇dies) '三 鍵抗體（triabodies)、四鍵抗體（tetrab〇dies)以及微抗體 (mnnboches)亦含括在如此處所用的詞句“抗原結合片段，， 内。在某些具體例中’纟發明之抗體或抗體片段可接合至 4 σ療。卩刀（免疫接合物”），諸如細胞毒素、化學治療藥 物、免疫抑制劑或放射性同位素。 …、 可變^的抗原·結合片段典型包含至少1個可變領域。該 少1個_1能是任何的大小或胺基酸組成並且通常包含至 CDR。在帶：或多個骨架序列或在一或多個骨架序列内的 中，與Vl領域缔合之Vh領域的抗原_結合片段 如，可變Λ領域可以任何適當的排列顺序彼此相對。例 VL-VL二來體^是二聚體並且含有、Vh-Vl或 %或另擇地’抗體的抗原'结合片段可含有單體 在某些具體 個共價連結至少 例中，抗體的抗原-結合片段可含有至少1 1個恆定領域的可變領域。可以在本發明 15 201136601 之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定領域的非 限疋例示性型態包括：⑴Vh_Ch1 ;(丨丨）; (m) Vh-Ch3 ; (iv) V『Ch1_Ch2 ; (v) Vh_Ch1Ch2 Ch3 ;⑽ VH-CH2_CH3 ; (vii) vH-CL ; (viii) VL-CH1 ;㈣ Vl_Ch2 ; (χ)

Vl-Ch3 ； (Xi) Vl-Ch1-Ch2 ； (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3 ； (xiii) VL-G2-CH3 ;以及(xiv) Vl-Cl。在可變與恆定領域的任一 種型態中（包括上面列示的任一種例示性型態），可變與恆定 領域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分枢紐或^接子 區域而連結。樞紐區域是由至少2個（例如5、1〇、15 2〇、 40、60或更多個）胺基酸所構成，它在單一多肽分子中的相 鄰可變和/或恆定領域間會產生彈性或半彈性鍵聯。此外， 本叙明之抗體的抗原-結合片段可包含有上列可變與怪定 湏域型態的任一者彼此和/或與一或多個單體Vh或領域 以非共價締合（例如藉由雙硫鍵（等）)所形成的同型二聚體 或異型一聚體（或其他多聚體）。 就完整的抗體分子而言，抗原-結合片段可以是單專一 性或多專一性(例如雙專一性）。抗體的多專一性抗原結合 片段典型包含有至少2個不同可變領域，其中各個可變領 域能夠專一地結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決 定位。任-衫專-性抗體形式，包括此處所揭示的例示 性雙專-性抗體形式，可使㈣技藝巾可取得之慣用技術 而改造成使用於本發明之抗體的抗原_結合片段中。 術語“人類抗體’’，如此處所用，欲包括帶有從人類生 殖細胞免疫球蛋白序列衍生而來之可變與恆定區域的抗 201136601 體。本發明的人類mAbs可包栝非由人類生殖細胞免疫球 蛋白序列所編碼的胺基酸殘基（例如在活體外藉由隨機或 位置-專一性突變誘發或藉由在活體内體突變引入的突 變），例如，在CDRs以及特別是在CDR3中。然而，術語 “人類抗體”，如此處所用，未意欲要包括自另一種哺乳動 物物種（諸如小鼠）之生殖細胞衍生而來的CDR序列（被接 枝至人類FR序列上）的mAbs。 當與對應的生殖細胞序列相較之下’此處揭示的完全 人類抗-D114抗體可包括一或多個在重鏈與輕鏈可變領域 之骨架和/或CDR區域中的胺基酸置換、插入和/或刪除。 此等突變可易於藉著將此處揭示的胺基酸序列拿來與生瘦 細胞序列（可得自於例如公開的抗體序列資料庫）比較而被 確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段，它們是由此處 揭示的胺基酸序列的任一者衍生而來，其中在一或多個骨 架和/或CDR區域中的一或多個胺基酸可以突變成抗體衍 生而來之生殖細胞序列的對應殘基（等），或突變成另一種人 類生殖細，序列的對應殘基(等)，或突變成對應生殖細胞殘 基（等）的寸恆'時級置換(此特列變化在此完全意指為 生殖細胞穴變”）。在該技藝中具有通常技術者從此處揭示 的重键以及輕鏈可變區域序列可易於做出許多含有一或多 個，立生殖細胞回復突變或其組合的抗體以及抗原 -結合 4 一具體例中，所有在¥}1和/或Vl領域中的骨架 I祕a殘基突變回復成在抗體衍生而來之生殖細胞序 歹，X現到的殘基。在其他具體例中，僅有某些殘基突 201136601 變回復成原來的生殖細胞序列， 胺基酸或FR4的最後8個胺基酸中被發現到有突變殘基 ’例如僅僅在FRl的前8個

再者，本發明 或僅僅在CDIU、CDR2或 其他具體例中，骨架和/或 不同生殖細胞序列（亦即’ 細胞序列的生殖細胞序列）的蚵應殘基（等）。 的抗體在骨架和/或CDR區域内可含有2或多個生殖細胞 突變的組合，例如，其中某些單獨殘基突變成特定生殖細 胞序列的對應殘基，而某些其他不同於原有生殖細胞序列 的殘基仍保留著或突變成不同生殖細胞序列的對應殘基。 在得到之後，含有一或多個生殖細胞突變的抗體以及抗原_ 結合片段可易於測试一或多個所欲特性，諸如增進結合專 一性、增高結合親和力、增進或增高拮抗或促效生物特性 (視情況而定）、降低免疫原性等等。以這樣一般方法所得到 的抗體以及抗原-結合片段含括在本發明中。

本發明亦包括包含此處揭示之HCVR、LCVR和/或 CDR胺基酸序列任一者之變異體的抗-D114抗體，其具有一 或多個守恆性置換。例如，本發明包括相對於此處揭示之 HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列任一者有例如1〇個 或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少、2個或1 個守恆性置換（等）之具有HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸 序列的抗-D114抗體。在一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO : 116的胺基酸序列，它有10個或更少個守恆性胺 基酸置換在其中。在另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID 201136601 NO : 116的胺基酸序列，它有8個或更少個守恆性胺基酸 置換在其中。在另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO : 116的胺基酸序列，它有6個或更少個守恆性胺基酸 置換在其中。在另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO : 116的胺基酸序列，它有4個或更少個胺基酸置換在 其中。在又另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO : 116的胺基酸序列，它有2個或1個守恆性胺基酸置換（等） 在其中。在一個具體例中，LCVR包含有SEQIDNO : 118 的胺基酸序列’它有1〇個或更少個守恆性胺基酸置換在其 中。在另一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO : 118 的胺基酸序列，它有8個或更少個守恆性胺基酸置換在其 中。在另一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO : 118 的胺基酸序列，它有6個或更少個胺基酸置換在其中。在 另一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO: 118的胺基酸 序列，它有4個或更少個胺基酸置換在其中。在又另一個 具體例中’LCVR包含有SEQ ID NO: 118的胺基酸序列， 它有2個或1個守恆性胺基酸置換（等)在其中。 “中和”或“阻斷”抗體欲意指一種結合至DU4會致使 D114之生物活性受到抑制的抗體。D114的這個生物活性抑 制可以藉由測量D114生物活性的一或多個指標來評估。 D114生物活性的這些指標可以藉由該技藝中已知的數種標 準活體外或活體内分析的一或多者來評估。例如，抗體中 和D114活性的能妓藉由抑制D1I4結合至受體來評 估。相同地，術語也適用於對抗其他標的（諸如與 201136601

Notch4)之抗體，此等抗體會抑制標的之生物活性，藉此抑 制D114-Notch交互作用或傳訊路徑。 術語“專一地結合，，或類似者表示抗體或其抗原_結合 片段與抗原形成一個在生理條件下相對穩定的複合物。專 一性結合的特徵可以是在於至少約1χ1〇-6 M或更低的 KD(例如較小的KD表示較為緊密的結合用於決定2個分 子是否專一地結合的方法在該技藝中為熟知的並包括，例 如，平衡透析、表面電漿共振以及類似者。但是，專一地 結合hD114的分離抗體可能會對其他抗原（諸如來自於其他 物種的D114分子）有交叉反應性。此外，結合至hDIU以及 一或多個額外抗原的多專一性抗體（例如雙專一性)仍被視 為是如此處所用的“專一地結合”hD114的抗體。 術語“KD” ’如此處所用，欲意指特定抗體_抗原交互作 用的平衡解離常數。 術語”高親和力”抗體意指當藉由表面電漿共振（例如 BIACORE™或溶液-親和力ELISA)來測量時，那些以約1 nM或更低、約500 pM或更低、約400 pM或更低、約300 pM或更低、約200 pM或更低，或約100 pM或更低、或 約50 pM或更低的KD結合D114的抗體。 術語“表面電漿共振”，如此處所用，意指一種容許藉 由在生物偵測器基質中偵測蛋白質濃度變化來分析即時生 物專一性交互作用的光學現象(例如使用BIACORE™系統 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.))。 20 201136601 術語“抗原決定位”是抗原被抗體所結合的一個區域。 抗原決定位可定義為結構性或功能性的。功能性抗原決定 位通常是結構性抗原決定位的一個次類並且具有那些直接 提供交互作用之親和力的殘基。抗原決定位也可能是構形 性的’意即，是由非線性胺基酸所構成。在某些具體例中， 抗原決定位可包括具有諸如胺基酸、糖側鏈、磷氧基基圑 或磺酿基基團之在化學上有活性的表面基團分子的決定 位’而在某些具體例中，可具有特定三維結構特性，和/或 特定電荷特性。一個抗原決定位在一個特有空間構形中典 型包括至少3個或更多個（通常至少是5個或8-10個）胺基 酸。 術語“治療(treatment)，，或“治療(treat)，，，如此處所用， 除非另有指明，欲表示預防性（prophylactic)(或預防性 (preventative))以及治療性步驟。需要治療的個體不只包括 那些患有特定病況、障礙或疾病者’也包括那些有傾向罹 患或懷疑會罹患此一病況、障礙或疾病且可受益於預.防性 步驟的人，而使得相較於那些沒有治療者會降低此一病 況、障礙或疾病（若有的話）之發生或復發，或進展。 依據詞組“治療有效量”、“預防有效量，，或“有效量，，表示 被投藥時會產生所欲效用的數量。確切數量將視治療目 的、治療個體的年紀以及身材、投藥路徑以及類似者而定， 並且將由習於該技蟄者使用已知技術來確認（參見例如， Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding) 〇 21 201136601 一般說明 本發明一部分是以發現到藉由DU4_專一性抗體來阻 斷DU4會導致Treg細胞的數目增加為基礎，換言之，其會 預防 '降低或延緩EAE或糖尿病在小鼠體内的進展。有關 於完全人類D114 Ab的說明（包括重組型人類D114 Ab)，參 見國際專利公開第WO 2008/076379號。 治療性投藥以及調配物 本發明提供預防、治療或改善其中增加Treg細胞的數 目會是有益的疾病或障礙的方法，其包含投與治療有效量 的醫藥組成物’該醫藥組成物包含D114拮抗劑（諸如D114 Ab)。包含D114拮抗物的醫藥組成物可進一步包含一或多 個額外的治療劑，諸如免疫抑制劑、抗發炎劑、鎮痛劑、 降血糖劑以及類似物（參見下段）。依據本發明的醫藥組成物 可與適當載體、賦形劑以及其他併入調配物中以提供增進 轉移、投遞、财受性以及類似者的藥劑一起投藥。許多適 當的調配物可以在所有藥化學家所熟知的處方書中找到： Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，Easton，PA.。這些調配物包括，例如粉末、糊劑、 軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質（陽離子或陰 離子)(諸如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊劑、 水中油與油中水乳劑、乳化卡波蠟(各種分子量的聚乙二 醇）、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見 Powell et al. ''Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA，（1998) JPharm Sci Technol 52:238-311 〇 22 201136601 ^全身減樂來說，㈣有效劑量最初可以由活體外 为析來估算。例如，在動物模型中劑量可以調配成達到包 括如同在細胞培養物中所測定之〜的循環濃度範圍。這 樣的貧訊可關來更為料地決定用於人類體内的劑量。 初L劑里也可以彳續内數據(例如動物模型）使用該技藝 中所熟知的技術來估算。在該⑽巾具㈣常技術者可易 於依據動物數據而將對人類的投藥最佳化。 劑置可以隨著要投藥的個體的年齡以及身材（例如體 重或體表面積）、標的疾病、病況、投藥路徑以及類似者而 改變二就DU4結抗劑的全身性投藥來說，特別是就D114抗 體來說，用於靜脈内投藥的典型劑量範圍是每日劑量為約 0.01至約100mg/kg體重、約〇」至約5〇mg/kg，或約〇 2 至約10 mg/kg。就皮下投藥而言，抗體可以約i mg至約 800 mg、約 1〇 mg 至約 500 mg、約 2〇 mg 至約 4〇〇 mg、約 30 mg至約300 mg或約50 mg至約200 mg來投藥，抗體 濃度為至少約25 mg/m卜約50 mg/m卜約75 mg/m卜約100 mg/m卜約 125 mg/m卜約 150 mg/m卜約 175 mg/m卜約 200 mg/ml或約250 mg/ml，每天至少1至5次、每週1至5次 或每月1至5次。另擇地，抗體在最初可以經由靜脈内注 射投藥，接著藉由連續皮下投藥。 不同的投遞系統是已知的並且可以用來投與本發明的 醫藥組成物’例如囊封在脂質體中、微粒、微谬囊、能夠 表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用（參見例 如 Wu 扣 α/. (1987) J. Biol· Chem. 262:4429_4432)。引入的 23 201136601 方法包括’但不限於皮内、肌肉内、腹膜内、靜脈内、皮 下、鼻内、硬膜上以及口服路徑。組成物可以藉由任一種 習知路徑投藥’例如藉由注入（infusi〇n)或球劑（b〇lus)注 射、藉由透過上皮或黏膜内襯(例如口腔黏膜、直腸與腸黏 膜％)的吸收並且可以與其他生物活性劑一起投藥。投藥可 以是全身性或局部的。 醫藥組成物也可以在囊泡中投遞，特別是在脂質體中 (參見 Langer (1990) Science 249:1527-1533 ; Treat d 0/. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds), Liss, New York, pp. 353-365 ; Lopez-Berestein，ibid” pp. 317-327 ;同前所述）。 在某些情況下，醫藥組成物可以在控制釋放系統中投 遞。在一個具體例中，可以使用泵（參見Langer，上文；Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。在另一個具體 例中，可以使用聚合物材料；參見Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds), CRC Pres., Boca Raton，Florida (1974)。在又另一個具體例中，控制釋放系 統可以位在組成物標的之鄰近處，因此僅需要全身性劑量 的一部分而已（參見，例如 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release，上文，vol. 2, pp.115-138, 1984)。 可注射製備物可包括用於靜脈内、皮下、皮内以及肌 肉内注射、滴注(drip infusions)等的劑型。這些可注射製備 物可以藉由公眾知悉的方法製備。例如，可注射製備物可 以例如藉由將上述抗體或其鹽類溶解、懸浮或乳化於習知 24 201136601 用於注射的益内 的水性媒介物媒介物或油性媒介物。作為用於注射 辅助劑等的等張溶^生理時鹽水、含有葡萄糖以及其他 乙醇）、多元醇(合u之’其可以與適當的助溶劑(諸如醇(例如 活性劑（例如聚山举一知艰乙一知）、非離子性介面 乙烯(5〇 m0l)加成物）=酉曰:、HC〇_5〇(氫化萬麻油的聚氧 例如芝麻油、大豆3一起使用。作為油性媒介物，採用 醋、铸等）#—4 ’它們可讀助_(諸如笨甲酸节 安親中來製備。本。目姐射純佳喊充填在適當 地以標準針頭以及;身 成物可以皮下地或靜脈内 筆遞。此外，關於皮下投遞， j裝置易於應用在投遞本發明的醫藥 =種筆型投遞裳置可以是重複使用或拋棄式的。重= 一筆f投遞裝置通常使时有醫藥組成物的可置換藥g。 旦藥E中的所有醫藥⑯成物已被投藥且藥ϋ空了，空藥 匣可易於拋棄並且置換一個含有醫藥組成物的新藥匣。那 麼就Τ以重複使用葦型投遞裝置。在拋棄式筆型投遞裝置 中，沒有替換式藥匣❶相反地，拋棄式筆型投遞裝置重新 填充保存在該裝置之聍器中的醫藥組成物。一旦目宁器沒有 醫藥組成物，丟棄整個裝置。 許多可重複使用的筆型以及自動注射投遞裝置已應用 於皮下投遞本發明之醫藥組成物。實例包括，但肯定不限 於 AUTOPENTM (Owen Mumford，Inc” Woodstock，UK)、 DISETRONICTM,(Disetronic Medical Systems，Burghdorf，

Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25™筆、HUMAL0GTM 25 201136601 筆、HUMALIN 70/30福筆(Eli Lilly and Co” Indianapolis, IN)、NOVOPENTMI、II 與 III (NOVO Nordisk，Copenhagen, Denmark)、NOVOPEN JUNIOR™ (NOVO Nordisk, Copenhagen，Denmark)、8〇顶筆阳6。1；011 Dickinson，Franklin v/jt jl ijrdN rivw *

Lakes，NJ)、OPTIPEN™ STARLET™ 以及 OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt， Germany)，僅列舉一些。應用於皮下投遞本發明之醫藥組 成物的拋棄式筆型投遞裝置包括，但肯定不限於 SOLOSTARtm 筆（san〇fj_aventis)、flexpeNtm (Novo

Nordisk)以及 KWIKPENTM (Eli Lilly)。 ,有利地，用於上述口服或非經口服用途的醫藥組成物 被製備成適於填充一次劑量的活性成分之單位劑量的劑量 $式。此等呈單位劑量的劑量形式包括，例如錠劑、丸劑、 膠囊/主射劑(安瓶）、栓劑等。所含有的腿枯抗劑(諸如 D114抗體）的數量通常是—個單位劑量中每劑型約ο.】至約 3在韋i 0 mg以及約10至約25G mg的抗體。 需要例中，將本發明的醫藥組成物局部投予至 藉由導管的方局樣主、局部施用，例如藉著注射、 孔性、料由移植物的方心郷植物可能是多 n—)、料’包括膜（諸如石夕橡膠膜⑽⑽ 組合療法截維或商用皮膚代用品）。 26 201136601 在本發明的治療方法中’ D114拮抗劑可單獨提供或與 一或多種額外的治療劑(諸如免疫抑制劑或免疫抑制劑、抗 發炎劑、鎮痛劑、直接或間接降血糖劑以及類似物）組合一 起提供。適當的免疫抑制劑包括，但不限於糖皮質素、環 孢素、胺曱喋呤、干擾素β(ΙΡΝ-β)、他克莫司、西羅莫司、 硫唑嘌呤、巯嘌呤、類鴉片、黴酚酸、TNF-結合蛋白（諸如 因福利美、依坦西普、阿遠木單抗與類似物）、細胞毒性抗 體(諸如放線菌素、蔥環黴素、絲裂黴素C、博來黴素、米 拉黴素與類似物）、標把免疫細胞的抗體（諸如抗-CD20抗 體、抗-CD3抗體與類似者）。用於與抗-D114拮抗劑的結合 療法的適當抗發炎劑和/或鎮痛劑包括皮質類固醇、非類固 醇抗發炎藥物(NSAIDs)，諸如阿司匹靈、布洛芬、萘普生 與類似物、TNF-α拮抗劑(例如Centocor Inc.的因福利美或 REMICADE™ ; Centocor Inc.的戈利木單抗（golimumab); Amgen/Wyeth 的依那西普或 ENBREL® ; Abbott Laboratories的阿達木單抗或HUMIRA®，與類似物）、IL-1 拮抗物（例如IL-1結合融合蛋白質，例如Regeneron Pharmaceuticals，Inc.的 ARCALYST®，參見美國專利第 6,927,044 號；Amgen 的 KINERET®，與類似物）、IL-6 拮 抗劑(例如像是美國專利第7,582,298號中所述的抗-IL-6受 體抗體，與Roche的 ACTEMRA®)、乙醯胺酚 (acetaminophen)、類嗎啡肽（morphinomimetics)以及類似 物。適當的降血糖劑包括，但不限於胰島素及其類似物、 雙脈、石黃醯胺及其脲衍生物、α-葡萄糖皆酶抑制劑、°塞°坐 27 201136601 烧一酮及其竹生物、一肽基肽酶-4抑制劑、瓜爾膠(guar gum)、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(⑽吨此此）、艾塞 那肽（exenatide)、普藍林肽（pramiintjde)、苯氟雷司 (benfluorex)、利拉魯肽(liraglutide)、米格列奈(mitigHnide)、 酸·糖(aldose)還原酶抑制劑以及類似物。 D114拮抗物（諸如hD114抗體或其片段）以及上述額外的 治療劑（4)可以一起或分開來共投藥。當使用個別的劑量調 配物時，本發明之抗體或其片段以及額外藥劑可以同時投 藥，或者在父錯時間分開投藥，意即以適當順序連續投藥。 套組 本發明進一步提供一種製品或套組，其包含有一包裝 材料、容器以及包含在該容器内的藥劑，其中該藥劑含有 至少一 D114拮抗劑（諸如DI14抗體）以及至少一額外的治療 劑’且其中s亥包裝材料含有一顯示關於使用之指引與用法 說明的標籤或包裝說明書。在一個具體例中，該DU4拮抗 劑以及額外治療劑可以包含在個別的容器内。 【實施方式】 實施例 提出下列實施例’以提供那些在該技藝中具有通常知 硪者完整的揭示内容與說明如何做出以及使用本發明的方 法以及組成物’且並非意欲要限定被發明人視為其發明的 範疇。已盡力確保有關所用數字(例如數量、溫度等等）的精 度，但會產生某些貫驗誤差以及偏差。除非另有指明，部 分為以重量計的部分，溫度為攝氏溫度，壓力為在大氣下 28 201136601 或接近大氣’而圖式誤差槓=平均值土SEM° 在下面的實施例中，使用配於補充有3% FCS之杜貝 可氏PBS (GIBCO® INVITROGENTM) IX中的下列抗體來 對細胞染色以供流動式細胞測量術之用：關於DCs’分別 為對抗傳訊-調節性蛋白α (Sirp-α ; cat# P84 ; BD Biosciences) ' B220 (cat# RA3-6B2) ' PDCA-1 (cat# eBio927)、CD8 (cat# 53-6.7)、CD1 lb (cat# Ml/70)、MHCII (cat# M5/114.15.2)、CDllc (cat# N418)以及 CD135 (cat# A2F10)的抗體；關於T、B與NK細胞，分別為對抗CD4 (cat# GK1.5 或 L3T4)、CD3 (cat# 145-2C11)、CD25 (cat# PC61 或 7D4)、CD44 (cat# IM7)、FoxP3 (cat#FJK16s)與 F4/80 (cat# BM8)、NK1.1 (cat# PK136)、IgM (cat# 11/41)、IgD (cat#26-llc) > CD43 (cat# S7) > CD21 (cat# eBio4E3) ' HSA (cat# Ml/69)以及CD23 (cat# B3B4)的抗體（全部來自於 eBioscience) ° 實施例1 : D114阻斷對於B細胞、樹突狀細胞以及τ細胞 的發育的影響 已顯示D114-Notchl抑制會完全阻斷τ細胞發育，伴隨 著B細胞的異位外觀以及樹突狀細胞(DC)擴增，可能是因 為原-T細胞在胸腺内轉換命運(fate)至dc所引起(Hozumi et al., 2008, JExp Med 205(11):2507-2513 ； Koch et al, 2008, 205(11):2515-2523 ·，以及 Feyerabend,^.，·、 30:M3)。但是，DC發育的哪個特定階段會直接 受到DU4阻斷所影響仍是未知。 29 201136601 為了回答這個問題，將5或25 mg/kg抗-D114 Ab (REGN577)(n=5)或人類Fc片段(對照）(n=5)皮下注射至6週 大C57B1/6小鼠(Jackson Labs)體内’ 1週2次，持續2週。

REGN577是内部依據公開序列（W〇製備。 REGN577結合至人類與小鼠D114，但是在可偵測到的情況 下不會結合人類Dill與JAG1。注射之後第14天，收取胸 腺以及脾臟並且在37°C下於補充有10%胎牛血清(FCS)以 及含有膠原蛋白酶D (Sigma Aldrich)的完全RPMI 1640培 養基(Invitrogen)中予以分解。為了停止反應，加入2 mM EDTA並且令器官懸浮物通過70 mm細胞據網。藉由沖洗 股骨與脛骨將來自於各小鼠的骨髓(BM)收集於補充有10〇/〇 FCS的完全RPMI 1640培養基並且將細胞懸浮於rpmi培 養基中。在以對抗上述特定標記之抗體對細胞進行染色之 後，藉由流動式細胞測量術來評估T細胞、B細胞以及DC 次群。被染色的細胞在BD™ LSR II Flow Cyt〇metei· (bd Biosciences)上運行著並且使用FlowJo軟體(版本8.8.6;Tree

Star Inc.)分析數據。 第1A以及1B圖顯示胸腺中的T與B細胞群。如第 1A圖中所示’ D114阻斷在胸腺中會誘發雙陰性(“dn” ； CD4 CD8 ) T細胞的數目明顯增加，而雙陽性（“dp” ； CD4+CD8+) T細胞的數目降低。此外，相同的處理會誘發 胸腺内的B細胞有異位外觀，這是因為原-T細胞（亦即，在 DN1階段的CD44+CD25_CD4-CD8-細胞)所引起(參見第1B 圖）。相對地，DU4阻斷對於骨髓中的B細胞發育（第2A圖） 201136601 或週邊脾臟B細胞次群（第2B圖）沒有影響。此外，D114阻 斷會在胸腺中誘發習知樹突狀細胞(“cDCs” ； B220XD11 c+；) 以及漿細胞樣 DCs (“pDCs” ； PDCA+B220+CD11C+)擴增（參 見第3A圖），而在最初注射D114 Ab之後，從第7天〇<〇.〇〇1) 至第14天（ρ<0·001)有明顯擴增並且持續到第21天 〇<0.01)(第3Β圖）。第3Α圖的點狀圖中的數字表示在第 14天總細胞中的DCs平均百分比。再者，在以DU4 Ab (REGN577)處理的小鼠之週邊的DCs有擴增。與對照組小 鼠（以hFc-處理)相較之下，在以D114 Ab處理之後，DCs在 脾臟中的百分比與絕對數目增加倍數顯示於表1中。 表1 最初注射之後 的天數 百分比的 增加倍數 絕對數目的 增加倍數 3 1.0 1.0 7 1.1 1.1 14 1.6 2.0 21 1.3 1.7 已知淋巴樣組織cDCs、pDCs以及單核細胞擁有共同 的前驅細胞’稱為“巨嗤細胞與DC前驅細胞，，或“MDP”， 它們可以藉由表面表現型“Lin_cKithlCD 115+FLT3+，，被鑑定 出，而不同的前驅細胞稱為“共同DC前驅細胞，，或具有 “LiiTcKit丨。CD115+FLT3+”的“CDP”，受限於生成 cDCs 以及 pDCs。儘管單核細胞可以在發炎狀態下產生一些DCs的表 現型特徵，cDC、pDC以及單核細胞譜系依據它們到達組 31 201136601 織的時間而分開來，且在穩態狀態下不論是單核細胞或 pDCs都不會發育成cDCs。不同於單核細胞與pDCs，淋巴 樣組織中的cDCs被認為是有如不成熟細胞從骨髓而來，必 須在淋巴樣器官中進一步分化以及分裂。前_DCs (MHCII丨。CDllcintCD135+Sirp-aint)以及晚期前 _DCs (MHCII1(>CDllcint)主要是cDCs的前驅細胞，從骨髓而來 (Liu ei fl/·，2009, Sc/ence 324:392-397)。 為了鑑疋D114 Ab對於DC刚驅細胞怪定的影響，藉由 流動式細胞測量術評估MDP以及CDP在胸腺、骨髓以及 脾臟中的含量。僅在骨髓中偵測到MDP以及CDP，但是 在胸腺或脾臟中沒有债測到（數據未示出）。此外，相較於對 照處理的小鼠，D114阻斷不會誘發骨髓中的早期前驅細胞 擴增。因此，結果暗示，D114 Ab在要比MDP與CDP還晚 的DC發育階段(亦即前-DC階段)有作用。 因此，使用流動式細胞測量術研究胸腺與骨髓中的前 -DCs以及晚期前-DCs。如第3C圖中所示，通常出現在骨 髓中的MHCIlkCDllc^ DCs在D114 Ab處理之後第14天 僅會在胸腺中擴增〇<0.001)，而在相同小鼠的BM中偵測 到MHClfCDllcWDCs沒有擴增(數據未示出）。因此，源 自於前-DC階段的DC擴增被限制於胸腺。為了評估胸腺 中的MHCIIlQCDllcintDCs的來源，進行流動式細胞測量術 以鑑定DN1 (CD4-CD8-CD44+CD25-)原-T細胞群中的 MHail()CDllcintDCs。如第3D圖中所示，於第3天D114 阻斷時在DN1原-T細胞群中偵測到MHailc)CDllcint 32 201136601 DCs。在沒有DU4 Ab處理的情況下沒有偵測到 MHCIIl0CDllcint DCs，在 D114 Ab 處理時於 DN2、DN3 和 DN4 T細胞群中也沒有（數據未示出）。在D114 Ab處理時於 週邊DC恆定方面觀察到沒有改變（數據未示出）。因此， D114阻斷會在第3天於胸腺中誘發DN1原-T細胞群的 MHCIIl0CDllcintDCs 明顯擴增(ρ<〇.〇1)(第 3D 圖），同時在 第14天有擴增波峰出現(/?<0.001)(數據未示出）。同時，成 熟的DC次群於第7天(ρ<〇.〇〇1)至第21天(p<〇.〇l)在胸腺 中擴增，如上面所討論扳（參見第3B圖）。 為了調查DC擴增是否是源自於未定向τ_細胞前驅細 胞(uncommitted T-cell precursors)，分類為 DN1 CD45.1+Lin-的細胞被胸腺内地轉移到以抗-D114 Ab處理的CD45.2+宿 主小鼠體内。發現到，CD45.1+細胞累積在DN1階段(數據 未示出）而且未成熟DCs (imDCs)在胸腺中被積測到以及擴 增（第4圖）(/?<〇.〇1)。在以對照Ab處理的小鼠體内沒有偵 測到細胞，可能是由於大多數DN1·轉移的細胞會因為τ細 胞負向選擇(T cell negative selection)而被消除。推論D114 阻斷會促進源自於共同T/DC DN1前驅細胞的胸腺内另擇 DC譜系發育。 類Fms酷胺酸激酶3配位子(FU3-L)對於骨髓前驅細胞 分化成DCs以及週邊DCs的發育是需要並且不可或缺的。 Flt3-L的血清含里在以抗-D114 Ab處理的動物體内沒有 變化(數據未示出）。此外，如表2與3中所示，與那些以對 照Ab處理的小执相較之下，在野生型小鼠(wt)(表2與3)、 33 201136601 尸1^3丄剔除小鼠(？1丨3-1/)&<0.05)(表2)與卩113-11剔除小鼠 (Flt3-R / )(p<0.001)(表3)體内（這些小鼠全部以D114 Ab來處 理）’胸腺中的DC百分比增加。因此，dii4阻斷會在胸腺 中誘發Flt3-依賴型DC擴增。 表2 小鼠 在以下列處理的小鼠之 胸腺中的％DC： 對照Ab DI14 Ab WT 0.04±0.〇〇5 0.58±0.13 Flt3-L Λ 0.04±0.006 0.45±0.13 表3 小鼠 在以下列處理的小鼠之 胸腺中的％〇〇 對照Ab D114 Ab WT 0.03±0·003 0.37±0.03 Flt3-R_/ 0.06±0.01 0.44±0.02

已發現早期T細胞前驅細胞有往非-T細胞表現型再衍 生（re-derive)的能力（James P. Di Santo，2010，《Sczewce 329:44-45)。在胸腺細胞以及原-T細胞中進行基因陣列分析 以決定抗-D114 Ab處理在涉及Τ相對於Β與DC細胞-譜系 特化之基因的影響。發現到對於T細胞定向來說不可或缺 的基因（例如7b/7、與五以/)向下調節，而可以各自阻 斷T細胞發育的基因（1少/7、幼^7)向上調節（數據未示出； 參見Di Santo，2010，上文）。最令人吃驚的是，控制DC 34 201136601 的基因(m ;與如·』)以及控制B細胞發育的基因也向上 调希（數據未不出；參見μ Merad⑸从，2_，如μ 113:3418-3427)。此外’祕以及尬，還有干擾素調節 口子(册X) 2 4以及8 (涉及DC次群發育的關鍵性轉錄因 子）的，現增加(數據未示出；參見Merad打α/·，2009，上 文）最後’ CSF-l (M-CSF)(-種涉及DCs發育的關鍵性細 胞激素）的基因表現被發現到在抗七丨以Ab處理時會向上調 節(p<0.05 ;數據未示出）。此外，CSIM血清含量在抗腿 Ab處理時會增加（第5圖；p<〇 〇5)(參& B F娜心z， 2008,万W 111: i 5(M 59)。因而可以推論，DU4 N〇tch傳訊 阻斷會向下調節對於τ細胞譜系定向來說有專—性的轉錄 因子，同時向上凋節其他在Dc發育中的重要轉錄因子。 實施例2 : DU4刪除對於τ細胞發育的影響 為了評估D114在上面實施例i觀察到對於〇(：發育的 影響是否為D114所固有的，製備DLL4c〇IN小鼠(其中〇114 有條件地不活化）。“依據條件倒位"(Conditional-by-inversion，C0IN)”對偶基因是條件對偶基因，其仰賴於 可倒位要素（COIN要素，’)提供重組酶-媒介的條件突變。 DLL4COIN小鼠含有他莫西芬_誘發型Cre重組酶構築體 CreERT2，其編碼一個融合至一個突變雌激素配位子-結合 領域(ERT2)的Cre重組酶。CreERT2在他莫西芬不存在時 本來是不活化的而且也不會被内生性雌激素所活化。他莫 西芬處理小鼠將活化CreERT2並且使得C0IN要素倒位， 35 201136601 其取消com #入點下游的所有表現子的轉錄，藉此剔除 D114。關於CreERT2重組酶系統的細節，灸 9 1 參見 Fell β α/.， \99Ί， Biochemical and Biophysical 心謂ch

Communications 1Ύ1，.Ί51-Ί5Ί。 以每隻小鼠3 mg/15G μΐ 油的方式將他莫西芬 (TAM)(cat# T-5648, Sigma)腹膜内（i.p.)注射至 DlL4c〇in 小鼠(n=6) ’每週3次，持續2週。DLL4c〇m對照組小鼠 (n=6)給予玉米油而沒有他莫西芬。同樣地，以他莫西芬 或僅僅玉米油(11=6)處理野生型C5B1/6小鼠。針對痛苦徵 兆(例如毛皮外觀、活動力低等）、感染或體重過度減少監測 小鼠。母週秤重小鼠約莫3次。任何體重減少超過2〇%的 小鼠要從貫驗屏除。處理2週之後，收取胸腺並且藉由流 動式細胞測量術分析胸腺細胞。 如第6圖中所示，與以玉米油處理的小鼠相較之下， 在D114不存在時（亦即以他莫西芬處理的小鼠），b細胞以 及pDCs與cDCs這兩者在胸腺中擴增，表示DU4在實施 例1中所觀察到的對於DC發育以及恒定的影響就DU4來 說綠貫是固有的。因此’ D114-Notch傳訊似乎會藉著抑制 非-T細胞譜系在原·Τ細胞群中的潛力來維持τ細胞定向。 實施例3 : D114阻斷或D114刪除對於Tregs恆定的影響 近來已顯示Tregs對於維持DCs的正常數目來說是报 重要的。在Treg耗竭時，DCs會有補償性類Fms酪胺酸激 酶3 (Flt3)_依賴型增加(Liu ei fl/.，2009，上文）。此外，2個 36 201136601 獨立的研究團隊證明’調節性τ細胞恆定在活體内會藉由 DCs回饋控制；亦即，增加DCs的數目而造成Treg增加分 裂與累積，其能防止自體免疫疾病生成(Darrasse-Jeze G. ei α/.，2009,五x/7. MW. 206(9):1853-1862;以及 Swee LK W0/.， 2009,万/⑽i 113(25):6277-6287)。 為了確定D114阻斷能否影響Treg恆定，藉由流動式細 胞測量術來測量在實施例1中以D114 Ab或人類Fc (對照組) 處理的小鼠的胸腺内Treg數目。如第7A圖中所示，D114 阻斷在最初注射之後第14天會造成胸腺中的Treg強烈擴 增。在最初注射之後，Treg在第7天(p<〇.001)開始於胸腺 中擴增ji且在第14天〇<〇.〇〇1)達到最高作用（參見第7B 圖），而Tregs在週邊（亦即脾臟)僅有在14與21天開始看 的到〇<0.05)(第7B圖以及表4)。在表4中顯示與對照組小 鼠(hFc-處理)相較之下’以D114 Ab處理時Tregs在脾臟内 的百分比與絕對數目的增加倍數。 表4 α注射之後 的天數 --------- 百分比的增加倍數 絕對數目的 增加倍數 3 1.0 1.0 7 1.0 1.2 14 1.1 1.7 21 1.1 1.2 為了評估觀察到的Treg擴增對於DU4分子來說是否為 固有的，藉由流動式細胞測量術來測量在實施例2的 37 201136601 DLL4COIN小氣的胸腺内Treg數目。如同藉由du4 Ab之 D114阻斷所觀察到的，與以玉米油處理的小鼠（參見第7C 圖）與以他莫西芬處理的野生型小鼠（數據未示出）相較之 下，D114因為他莫西芬處理而有條件不活化也會在胸腺中 造成Treg擴增。因此，D1i4_N〇tch傳訊會維持dCs以及之 後的Treg恆定與τ細胞定向。 使用抗-Dll4Ab(REGN421 ’具有分別為SEQIDNO : 116以及118的HCVR以及LCVR，已知會結合人類D114 的N-端-DSL領域)在表現人類DH4的小鼠(“人類化D114小 鼠”)體内進行類似的實驗。人類化D114小鼠是藉由在F1 C57BL/6 /129的胚胎幹(es)細胞中將小鼠D114基因的整個 細胞外領域置換為人類D114基因的對應細胞外區域(7 kb) 而製備。生育同型合子hD114小鼠並且育種成C57BL/6背 景。以 5 mg/kg 的 hFc (對照組，n=6)，或 1 mg/kg (n=6)或 5 mg/kg (n=6)的REGN421 Ab來處理人類化D114小鼠每週 2次，持續2週。在第7由各個處理組犧牲2隻小鼠而在 第14天每組又犧牲2隻小鼠。收取胸腺並且對細胞染色以 及藉由流動式細胞測量術來檢驗。剩餘的小鼠允許在沒有 任何處理的情況下復原歷時額外4週，並且在停止治療之 後第28天犧牲他們，而且使用流動式細胞測量術來分析胸 腺細胞。處理2週之後，在以抗-D114 Ab處理的小鼠的胸 腺中，cDC以及pDCs (第8A圖）增加，還有Treg群（第8B 圖）明顯增加(P<0.01)。在接受DU4 Ab歷時2週，接著不處 理歷時4週的小鼠胸腺中’ DC以及Treg數目在期間結束 38 201136601 時回復到正常含量（第8A與8B圖）。同時，與以hFc處理 的小鼠相較之下’在以D114-Ab處理小鼠的週邊也發現到 DCs以及Tregs擴增（數據未示出）。 實施例4 ·· Notch受體阻斷對於Tregs的影響 已證明DCs擴增會造成Tregs擴增(Darrasse-Jeze G.以 α/.，2009)。如同上面討論的，在D114阻斷時發現到DCs與 Tregs均會在胸腺中擴增（第3A與7A圖）。此外，在以 D114-Ab處理的小鼠的周邊中，也發現到DCs與Tregs的百 分比以及絕對數目會增加（表1與4)。為了確定阻斷Notch 受體能否造成與D114删除相同的表現型，研究Nicastrin剔 除(KO)小鼠(ΝϋΛ)。Nicastrin是一種涉及Notch傳訊路徑 的分子而且在缺乏nicastrin的小鼠體内遺傳去除nicastrin 會導致Notch受體1、2、3和4下游的訊息轉導被阻斷 (Aifantis以0/.，未公開的數據）。Nicastrin κ〇小鼠被證明 會表現出與D114-刪除/阻斷小鼠類似的表現型，Tregs的數 目增加(百分比與絕對數目均有），在胸腺中與在脾臟中是相 同的（參見表5)。 表5 胸腺 脾臟 Treg 對照組小1 Nicastrin KO小鼠 對照組小鼠 Nicastrin KO小鼠 CD3+CD4+ 細胞中的 3.3±〇.2 15.2±2.0 (ρ<〇·1) 16.0±1.3 33.9±2.1 (p<0.0001) 39 201136601

Treg (%) 絕對數目的 比值 (Treg/Teff) 〇.04±〇.〇〇2 〇.2±〇.〇3 (p<0.01) 0.2±0·01 〇·6 士 0.006 (ρ<0.0001) 袁後，當Nic /小鼠的骨趙細胞(bm)轉移至經致死照射 的WT小鼠時，在Nic-/-—WT嵌合體中觀察到胸腺Tregs 擴A 暗示运樣的擴增疋細胞·自主作用（cell-autonomous effect)，而以抗-D114 Ab來阻斷D114的接受者小鼠沒有力口 成效用（參見表6)。 表6 ΒΜ供給者 在以下列處理的接受者WT小鼠中之 CD3+CD4+細胞的 ％Treg 對照Ab 抗-D丨丨4 Ab WT 3.6±0.4 35±4 Nic'7' 37±2 41±2 這些結果暗示，藉由阻斷D114或Notch受體來中斷 D114-Notch傳訊會造成與Treg擴增類似的表現型。 為了確定在D114阻斷時Treg的擴增是否與DC數目相 關聯（Darrasse-Jeze G· ei α/” 2009，上文），製備缺乏 DCs 的小鼠並且如同在實施例1中使用D114Ab來進行試驗。表 現靈長動物白喉毒素受體(DTR)的轉殖基因小鼠被賦予白 喉毒素(DT)敏感性給它們的細胞’除此以外它們是DT-不 敏感。DT經由其B次單位與細胞DTR交互作用而進入細 201136601 胞，DT A次單位在胞吞作用時被釋出而催化延長因子2的 ADP-核糖苷化，在有絲分裂或末端分化細胞中造成蛋白質 合成受到抑制接而快速細胞凋亡。細胞切除的特異性與計 時可分別透過細胞類型-限定的啟動子/增強要素以及投予 毋素的攝生法來決定。為了標定DT對於DC的敏感性，Jung 等人(2002，/mmwm.O； 17:221-220)生育出帶有編碼類人猿 DTR-GFP (綠色螢光蛋白）融合蛋白質之轉基因（受鼠 CD 11 c啟動子所控制）的小鼠（cd 11 cre_DTR小鼠）。因為 CDllc會在所有DCs中編碼、表現CDllc的所有鼠DC次 群在DT投藥時被刪除。 依據實施例1中所述的操作步驟以D114 Ab或hFc對照 來處理製備出之缺少DCs的轉殖小鼠。治療之後的第14 天’收取胸腺以及脾臟並且製備供分析之用。藉由流動式 細胞測量術評估D114在特定DC或T細胞次群之表面上的 表現含量’以確定D114 Ab結合至哪個特定次群。結果顯 不’ DCs以及τ細胞不會在其表面表現可偵測到的D114含 量（數據未示出）。這個發現被D114表現在胸腺上皮細胞 (TECs)的表面的報導(K〇cheifl/. 2008，上文)所證實。但最 重要的是’發現以D114 Ab處理缺乏DCs的小鼠無法誘發 Treg擴增，而以DU4 Ab處理的野生塑小鼠（亦即DC未刪 除的小鼠）會明顯地增加Treg在CD3+CD4+細胞中的比例 (p<0.001)’暗示在DU4 Ab處理時Tregs的擴增至少於某種 程度上疋經由DC擴增所媒介。 201136601 實施例5:D114阻斷在實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)中的 影響 CD4 CD25 FoxP3天然調節性τ細胞（亦即Tregs)在維 持自我-耐受性扮演重要角色並且抑制自體免疫疾病，諸如 第1型糖尿病、自體免疫腦脊髓炎、GVHD與發炎性腸病 (Darrasse-Jeze G. ei α/_，2009 ’ 上文；Swee LK W α/.，2009， 上文；以及 McGreachyeia/.，2005, 175(5):3025-3032)。 為了瞭解因為D114阻斷導致Treg數目的增加能否預防 自體免疫疾病’在小鼠模型中研究D114阻斷對於EAE的影 響。EAE小鼠模型是藉由將髓鞘寡樹突狀細胞醣蛋白（M〇G) 肽(於傳氏完全佐劑（CFA)中乳化)注射至C57B1/6小鼠的腳 墊中接著(24小時之後）為注射百曰咳毒素(ΡΤχ)來誘發疾 病而被建立。疾病記分是依據下列症狀來決定：（〇)沒有症 狀；⑴尾巴不舉；（2)尾巴不舉加上後腳虛弱；（3)部分後腳 麻痒；（4)完全後腳麻痒；（5)四肢麻痒；以及(6)垂死。免疫 之前的12至24小時’前誘發組的小鼠(η=ι〇)也接受皮下 注射25 mg/kg的抗-D114 Ab (REGN577)或同位素對照Ab (對CD20有特異性的人類抗體，内部依據US 2008/0260641 中的揭示内容製備）或PS/2 (對抗鼠類整合素細胞附著分子 VLA-4的大鼠/小鼠IgG2b ; ATCC #CRL-1911)，而後誘發 組的小鼠(n=10)在症狀出現當天接受相同處理。PS/2 Ab已 知會在有關復發性實驗性自體免疫腦脊髓炎(R-EAE)的小 鼠模型中使疾病復發惡化並且增加CD4+T細胞累積在中樞 神經糸統(Theien BE ei α/.，2001, 107(8):995- 42 201136601

1006)。1週注射抗體2次’持續2週。實驗結束時，小心 取出小鼠的脊髓、壓碎並且繼而培育在含有膠原蛋白酶D (Sigma Aldrich)的 RPMI 1640 培養基中。力口入 2 mM 的 EDTA以停止反應並且令混合物通過7〇-mm細胞滤網以及 藉著流動式細胞測量術分析細胞内含物。 如第9A以及9B圖中所示’在m〇G注射之後，以同 位素對照Ab處理的小鼠從約第1〇_14天起產生症狀.(亦 即，具有超過“0”的疾病記分)並且在第與21天之間達 到最高。相反地，與以對照Ab處理的小鼠相較之下，以 D114 A b處理的小鼠完全免於疾病進展。表7顯示與以對照 Ab處理的小鼠相較之下，在以D114 Ab處理的小鼠的胸腺 以及脾臟中的Tregs百分比與絕對數目的增加倍數。 表7 MOG注射 之後的天數 胸腺中 的 Treg 脾臟中的Tree 百分比的增 加倍數 絕對數目的 增加倍數 百分比的增 加倍數 絕對數目的 增加倍數 12 ------ 2.46 0.77_ 1.08 1.46 —18 4.88 2.67 ----- 1.23 1.89 21 1.41 1.01 1.85 A 77 η*. / / 在約第18天左右了哪似乎主要是在胸腺中擴增並且 ，、有在第21天之後於週邊(亦即脾臟)看到明顯擴增。 在這個特定的實驗條件下，在後誘發階段的刪Ab 處理未顯示出會明顯改善疾病進展。M4Ab投 43 201136601 /或頻率可以在習於該技藝者的知 Φ ΛΑ Θ . 識内被進一步调整。但重 要的疋，與以那些接受對昭Ah 矣U拉、 的錢相較之下（參見下面 表8)’接文前-誘發D114Ab的小畠於笛工—A A 卷贼士二R j鼠於苐18天在細胞浸潤至 面展現出明顯增加。在以對照Ab處理的小鼠脊髓中 所觀察_細胞制㈣些錢體岐疾 成因素。 如表8中所示，在第21天與以對照Ab處理的小鼠的 脊髓相較之下，以D114Ab處理的小鼠的脊髓中，巨噬細胞 (F4/80 )降低8倍（p<0.0001)，NK細胞降低2.7倍 〇<0.0001)，在 CDllb 細胞降低 1.7 倍(ρ<〇.〇〇ι)，而在 b 細胞降低2.5倍(pO.OOl)。 表8 MOG 脾臟中的浸潤性細胞的絕對數目（X106) CDllb+ 注射之 巨噬細胞 NK細胞 B細胞 後的天 骨髓細胞 D114 D114 D114 數 對照組 Ab 對照組 Ab 對照組 D1I4 Ab 對照組 Ab 0.4 0.3 0.2 0.1 0.3 0.2 0.9 0.6 12 土 0.05 ±0.01 土 0.03 ±0.004 ±0.005 ±0.006 ±0.09 ±0.02 18 1.7 0.2 0.2 0.1 1.8 1.0 4.7 1.8 ±0.5 ±0.02 ±0.06 ±0.005 士 0.2 ±0.08 ±0.07 ±0.1 1.6 0.2 0.8 0.3 1.5 0.6 4.8 2.9 21 土 0.1 ±0.01 土 0.07 ±0.03 土 0.1 ±0.02 ±0.1 ±0.2 201136601 此外’在以D114 Ab處理的小鼠體内，林巴節中的il- 17 以及IFN-γ的生成明顯減少（p<〇.〇〇i)(第10圖）。因此，D114 可能透過媒介Thl發育涉入EAE的致病機轉，而D114 Ab 處理可透過阻斷Thl與Thl7細胞激素分泌來防止誘發疾 病0 實施例6 : DIM阻斷對於糖尿病的影響 亦在NOD/ShiLtJ.小鼠(“NOD小鼠，，，一種有關第i型 糖尿病的多基因模型（Makino S心/·，1980, J施《仏如加 29 (1):1-13 ； Serreze DV et aL, 1997, J Immunol 158(8):3978-86))中測試D114阻斷對於糖尿病的影響。糖尿 病在NOD/ShiLtJ小鼠中的特徵在於胰島炎（insuHtis)以及 胰島的白血球浸潤。胰島素含量明顯降低，自發地在約12 週大時發生於雌性並且在數週之後發生於雄性。因此，血 漿葡萄糖含罝增加到超過250 mg/dL。使用ONETOUCH® mini (LifeScan, Inc.)檢驗NOD小鼠的血糖含量1週2次。 在連續2次讀值超過250 mg/dL血糖之後，小鼠被視為有 糖尿病。從連續糖尿病測量值的第丨次起註明日期為糖尿 病開始。自9週大時以hFc (n=5)或抗_D114 Ab (Regn577)(n=l〇) 25 mg/kg注射小鼠每週2次，歷時7週。 以取自於尾部的血液樣品監測血糖含量1週2次。 如第11A圖中所示，以hFc處理的小鼠在13週大之後 開始產生自發性糖尿病，血醣含量高於25〇 mg/dL(·)。相 對地，以抗-D114Ab(REGN577)處理的小鼠在25週大時未 45 201136601 顯示出有血糖含量增加的徵候（)，而且測量值又額外持續 了 10週。Dll4-Ab處理在糖尿病發病之前能預防糖尿病發 病，而經處理的動物似乎至今未發生糖尿病。有趣的是f 當在20週大以抗_CD25 (PC6丨）mAb來注射〗〇隻以D1M从 處理的小鼠中的5隻以使得Tregs耗竭（♦)時，牠們的血糖 含量在1-2週之後開始增加而且小鼠變成有糖尿病。這表 示D114Ab對於第1型糖尿病的預防效用至少在某個程度上 是由Tregs所媒介（第11A圖）。 人 胰島素以及GAD65是2種標準自體抗體，可以在糖尿 病NOD小鼠還有糖尿病個體的血清中發現到它們。因此， 藉由ELISA來測量自體抗體在以啦對照或刪Ab處理 之小鼠中的血清含量。如第UB圖中所示，DU4_Ab處 =於那些未處理WT C5鳩者(亦即，非 ..的生成。相反地，接受hFe對照的>1013 (糖尿 他們的血清中有高含量的自體抗體。此外，= 病症1W Ab處理並且未顯示糖尿 數目的β-島（生成腺\表騰臟切片進行染色時’觀察到正常 發病率直接相關)並且維 HD圖左區)。再者 等耆4^(第11C圖左區以及第 察到卜島有細胞浸潤(第以^，處理的小鼠體内沒有觀 相反地，卩hFe對照處圖左區以及第UD圖右區）。 明顯要比以D丨丨4 A b卢的糖尿病小鼠在其胰臟具有數目 &理之小鼠還低的β-島（第11C圖右區 46 201136601 以及f、UD左區）並且在剩餘極少的β-島中含有高含量的 ^胞，（第llc圖右區以及第11D圖右區因此，D114Ab 月b夠元王防止糖尿病歷時長時間而且它的影響至少在某個 乎是藉由擴增Tregs所媒介；但是，可能有額外 =入Dll4Ab對於β-島和/或胰島素之保護效用。 八測疋以D114 Ab處理的糖尿病小鼠的確切血糖含量並 且拿來與以hFc對照處理的小鼠做比較。在糖尿病發病時 (第 〇 天）以 25 mg/kg 的 D114 Ab (n=3)或對照 hFc (n=4)來處 ，糖尿病小鼠。在DI14 Ab處理時，糖尿病小鼠的葡萄糖含 量明顯從約350 mg/dL降低至正常含量（約12〇_13〇 mg/dL)(第11E圖）。這個效用持續平均4_5週。一般來說， 更觀察到當以D114 Ab來處理具有血糖少於3 5 0 mg/dL的糖 尿病小鼠時，牠們的血糖含量掉至正常含量且這個效用要 比在治療時具有血糖超過35〇 mg/dL的小鼠持續更久。這 表不就控制血糖含量來說，使用D114Ab來長時間以及有效 處理是有可能的。因此，在不受到此處所述的任何特定機 制園限的情況下，這些發現暗示：D114抗體對於第1型糖 展病具有極大的治療潛力。 上面貫驗的結果已揭示有前所未知的調節環存在，其 會在活體内控制Treg細胞以及DCs的數目。這個調節性迴 路對於免疫性以及耐受性之間的平衡可能是必要的，但最 為重要的是，首次推導出這個免疫系統的3個主要成員（亦 即D114-DCs-Tregs)之間的連結。因此，使用D114拮抗劑的 療法代表一種在活體内控制Treg數目而且因此控制自體免 201136601

第1A-1B圖顯示D114阻斷對於τ細胞以及B細胞發 月的影響。以抗-D114抗體(REGN577)或對照人類Fc片段 (hFc)注射小鼠》14天之後，收取胸腺並且藉由流動式細胞 測里術评估T細胞與B細胞次群。第1A圖：點狀圖顯示 CD4 CD8 (雙重陰性胸腺前驅細胞或“DN”）、CD4+CD8+ (雙 重陽性胸腺前驅細胞或“DP”）、CD4+或CD8+ (單陽性胸: 前=細胞或“SP”)以及爾⑽代肋-(在腦階段的胸 腺前驅細胞）τ細胞的數目。點狀圖中的數字表示τ細胞次 群在總胸腺細胞中的百分比（平均值±§£]^)。第1Β圖：桎 狀圖顯示Β細胞（Bn旳在Dm細胞（亦即在 CD4-CD8.CD44+CD25·圈出者）中的百分比(平均值彻）。 第2A-2B ®顯示題阻斷對於B細胞在骨髓中的發 階段（第2A圖）以及對於b細胞在脾臟中的恒定（第2b圖 的影響。點狀®巾的數字表示3細胞次群在㈣或脾臟的 總細胞中的百分比(平均值舰岣。Gc :生殖中心B細胎:

PDCA1+B220+CD11C+)在抗·Μ4 Ab 知 DCs (“cDCs” ； DCs (“pDCs” ； 處理時於胸腺中的擴 48 201136601 增。點狀圖中的數字表示DCs在苐14天時於總細胞中的 平均百分比（平均值土SEM)。第3B圖：柱狀圖顯示cDc以 及pDC擴增在以D114 Ab處理的小鼠（)與以hFc-對照處理 的小鼠(□)之胸腺中的動力學。第3C圖：點狀圖顯示从 對於胸腺中的前-DCs (MHCIIloCDllcintCDl35+Sirp-aint)u 及晚期前-DCs (MHCIIlc)CDllCint)的影響。點狀圖中的數字 表示前-DCs在第14天於總細胞中的平均百分比（平均值 土SEM)。第3D圖·點狀圖顯不在以DH4 Ab處理之小鼠胸 腺的 DN1 (CD4-CD8_CD44+CD25-；^ _T 細胞群十有 MHCIIlQCDllcmt DCs存在，但是在以hFc對照Ab處理的 小昧^胸腺中；又有。點狀圖中的數字表示MfJCII丨〇CDl Ιο*111 DCs在第3天於DN1原-T細胞群中的平均數目（平均值 土SEM)。 第4圖顯示D114阻斷對於胸腺内另擇DC譜系發育成 源自於共同T/DC DN1前驅細胞的不成熟DCs (imDCs)的 影響。分類為DNiCrMS.i+Lin·的細胞在胸腺内被轉移至以 DIM Ab (_)或hFc對照Ab (□)處理的CD45 2+宿主小鼠。 第5圖顯示D114阻斷對於CSIM (M_CSF)(一種涉及 DC發育的關鍵性細胞激素）的血清含量的影響。藉由酵素 結合免疫吸附分析法(ELISA)測量未經處理（四）或以同位 素對照Ab (□)或D114 Ab ()處理的小鼠的血清CSF_丨含量。

第6圖顯示在他莫西芬處理時，遺傳〇114刪除在含有 他莫西芬誘發型Cre纽酶構築義DLL4c〇IN小鼠體内 對於B細胞以及DC恆定的影響。點狀圖中的數字表示B 49 201136601 分比(平P:±=DC咖者在胸腺之總細财的平均百 響。第7Δ国.圖員示DU4阻斷/冊j除對於Treg恒定的影 &之 .，狀圖顯示與以hFe對照Ab處理的小鼠相 2 ^ ^ Η. , ΛΑ τ 默予表不Tregs在胸腺的CD3+CD4+ Τ細 ^一、/ 了均百分比(平均值±SEM)。帛7Β目：柱狀圖分別 、Γ At> (_)與hFc對照Ab⑼處理的小鼠之胸腺 品一’、脾臟(下區）中白勺Treg發育動力學。第7C圖：點狀 • ’、、、頁不與以玉米油對照處理的對照植DLL4C〇IN相較之 下Treg在以他莫西芬(TAM)處理的dll4c〇in小鼠胸腺 中的擴增。點狀圖中的數字表示丁哪在胸腺的CD3+CD4+ T細胞中的平均百分比(平均值规均。 第8A-8B圖顯示於表現人類DU4 (hD114)的小鼠胸腺 中’在 D114-Ab (REGNCl)處理〇 mg/kg 或 5 mg/kg)或 hFc 處理(5 mg/kg)每週2次、持續2週之後的第7和14天，以 及在停止處理之後第28天觀察到的D114阻斷對於DC (第 8A圖）以及Treg恆定（第8B圖）的影響。點狀圖中的數字表 示pDCs與cDCs (第8A圖）或Tregs (第8B圖）在胸腺的總 細胞中的平均百分比（平均值±SEM)。 第9A-9B圖顯示D114阻斷在實驗性自體免疫腦脊髓炎 (EAE)小鼠模型中的影響。第9A圖：該圖顯示每個處理組 的EAE疾病發病率（％)。第9B圖：該圖顯示EAE依據平 均疾病記分的進展。治療是使用抗_DU4 Ab (REGN577)前- 201136601 誘發（▼);同位素對照Ab前-誘發(♦) ; REGN577後-誘發 (▲);或抗-VLA-4 Ab (PS/2)前-誘發(_)。 第10圖顯示D114阻斷對於EAE小鼠的淋巴結中IL-17 以及IFN-γ生成的影響。在第12天以及第18天藉由ELISA 測量IL-17 (左區）以及lFN-γ (右區）在以D114 Ab ()或hFc 對照Ab (□)處理之EAE小鼠的淋巴結中的含量。 第11A-11E圖顯示D114 Ab在NOD小鼠糖尿病模型中 的影響。第11A圖顯示在9週大時接受hFc對照Ab (·)或 抗-D114 Ab (REGN577)(·)之小鼠中的％糖尿病發病率（連續 2次血糖含量的讀值高於250 mg/dL)。亦顯示以D114Ab處 理接著注射PC6lAb的5隻小鼠在20週時的％糖尿病發病 率（♦)。PC61 Ab是一種抗CD25抗體並且會使Treg細胞 耗竭。第11B圖顯示與未經處理的野生型（WT)小鼠相較之 下，抗-胰島素自體抗體（□)以及抗_麩胺酸去羧酶65 (GAD65)自體抗體()生成在以DU4 Ab或hFc對照處理的 NOD小鼠根據ELISA的測量值。第11C圖顯示以蘇木精 與伊紅(H&E)染色之經DU4 Ab (左區）或hFc對照（右區）處 理的NOD小鼠的胰臟切片。黑色箭頭表示個別的卜島而白 色箭頭表示P-島中的浸潤細胞(右區）。第11D圖顯示在以 hFc對照處理（□)或以D114 Ab處理小鼠的騰臟中β_島的數 目（左區）或％浸濶β-島（右區）。第11Ε圖顯示於疾病發病 時，血糠含量在以D114 Ab (·)或hFc對照（□)處理的小鼠體 内於治療之後42天的變化。 51 201136601 【主要元件符號說明】 無 52 201136601 序列表 <110>再生元醫藥公司 <120〉以D114拮抗劑治療自體免疫疾病之方法 <130> 6050A-WO <14 0>待指派 <141>隨之提申 <150〉 61/299,801 <151〉 2010-01-29 <150〉 61/361,687 <151> 2010-07-06 <150> 61/388,697 <151> 2010-10-01 <160> 118

<170> 用於 Windows 版本 4.0 的 FastSEQ <210> 1 <211> 2058 <212> DNA <213>智慧人 <400> 1 atggcggcag cgtcccggag cgcctctggc tgggcgctac tgctgctggt ggcactttgg 60 cagcagcgcg cggccggctc cggcgtcttc cagctgcagc tgcaggagtt catcaacgag 120 cgcggcgtac tggccagtgg gcggccttgc gagcccggct gccggacttt cttccgcgtc 180 tgccttaagc acttccaggc ggtcgtctcg cccggaccct gcaccttcgg gaccgtctcc 240 acgccggtat tgggcaccaa ctccttcgct gtccgggacg acagtagcgg cggggggcgc 300 aaccctctcc aactgccctt caatttcacc tggccgggta ccttctcgct catcatcgaa 360 gcttggcacg cgccaggaga cgacctgcgg ccagaggcct tgccaccaga tgcactcatc 420 agcaagatcg ccatccaggg ctccctagct gtgggtcaga actggttatt ggatgagcaa 480 accagcaccc tcacaaggct gcgctactct taccgggtca tctgcagtga caactactat 540 ggagacaact gctcccgcct gtgcaagaag cgcaatgacc acttcggcca ctatgtgtgc 600 cagccagatg gcaacttgtc ctgcctgccc ggttggactg gggaatattg ccaacagcct 660 atctgtcttt cgggctgtca tgaacagaat ggctactgca gcaagccagc agagtgcctc 720 tgccgcccag gctggcaggg ccggctgtgt aacgaatgca tcccccacaa tggctgtcgc 780 cacggcacct gcagcactcc ctggcaatgt acttgtgatg agggctgggg aggcctgttt 840 tgtgaccaag atctcaacta ctgcacccac cactccccat gcaagaatgg ggcaacgtgc 900 tccaacagtg ggcagcgaag ctacacctgc acctgtcgcc caggctacac tggtgtggac 960 tgtgagctgg agctcagcga gtgtgacagc aacccctgtc gcaatggagg cagctgtaag 1020 gaccaggagg atggctacca ctgcctgtgt cctccgggct actatggcct gcattgtgaa 1080 1 201136601 cacagcacct tgagctgcgc cgactccccc tgcttcaatg ggggctcctg ccgggagcgc 1140 aaccaggggg ccaactatgc ttgtgaatgt ccccccaact tcaccggctc caactgcgag 1200 aagaaagtgg acaggtgcac cagcaacccc tgtgccaacg ggggacagtg cctgaaccga 1260 ggtccaagcc gcatgtgccg ctgccgtcct ggattcacgg gcacctactg tgaactccac 1320 gtcagcgact gtgcccgtaa cccttgcgcc cacggtggca cttgccatga cctggagaat 1380 gggctcatgt gcacctgccc tgccggcttc tctggccgac gctgtgaggt gcggacatcc 1440 atcgatgcct gtgcctcgag tccctgcttc aacagggcca cctgctacac cgacctctcc 1500 acagacacct ttgtgtgcaa ctgcccttat ggctttgtgg gcagccgctg cgagttcccc 1560 gtgggcttgc cgcccagctt cccctgggtg gccgtctcgc tgggtgtggg gctggcagtg 1620 ctgctggtac tgctgggcat ggtggcagtg gctgtgcggc agctgcggct tcgacggccg 1680 gacgacggca gcagggaagc catgaacaac ttgtcggact tccagaagga caacctgatt 1740 cctgccgccc agcttaaaaa cacaaaccag aagaaggagc tggaagtgga ctgtggcctg 1800 gacaagtcca actgtggcaa acagcaaaac cacacattgg actataatct ggccccaggg 1860 cccctggggc gggggaccat gccaggaaag tttccccaca gtgacaagag cttaggagag 1920 aaggcgccac tgcggttaca cagtgaaaag ccagagtgtc ggatatcagc gatatgctcc 1980 cccagggact ccatgtacca gtctgtgtgt ttgatatcag aggagaggaa tgaatgtgtc 2040 attgccacgg aggtataa 2058 <210> 2 <211> 685 <212> PRT <213>智慧人 <400> 2

Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Val Ala Leu Trp Gin Gin Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gin Leu 20 25 30

Gin Leu Gin Glu Phe lie Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45

Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60

Phe Gin Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80

Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95

Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gin Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110

Gly Thr Phe Ser Leu lie lie Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 2 201136601 115 120 125

Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu lie Ser Lys lie Ala 130 135 140 lie Gin Gly Ser Leu Ala Val Gly Gin Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gin 145 150 155 160

Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val lie Cys Ser 165 170 175

Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190

Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gin Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205

Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gin Gin Pro lie Cys Leu Ser 210 215 220

Gly Cys His Glu Gin Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240

Cys Arg Pro Gly Trp Gin Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys lie Pro His 245 250 255

Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gin Cys Thr Cys 260 265 270

Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gin Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285

Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300

Gin Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320

Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335

Gly Ser Cys Lys Asp Gin Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350

Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365

Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gin Gly Ala 370 375 380

Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400

Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gin 405 410 415

Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 3 201136601 420 425 430

Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445

Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460

Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 工le Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495

Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510

Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525

Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540

Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gin Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560

Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gin Lys 565 570 575

Asp Asn Leu lie Pro Ala Ala Gin Leu Lys Asn Thr Asn Gin Lys Lys 580 585 590

Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gin 595 600 605

Gin Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620

Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640

Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg lie Ser 645 650 655

Ala lie Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gin Ser Val Cys Leu lie 660 665 670

Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val He Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 3 <211> 372 <212> DNA <213>人工序列 4 201136601 <220> <223>合成的 <_> 3 caggtgcagc tggtgcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagaa cctctcactc 60 acctgtgcca tctccggaga cagtgtctct agtgatagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccttca acccagatac atccaagaac 240 cacatctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatcta ttactgtgca 300 agagaggggg ataattggaa ttacggctgg ctcgacccct ggggccaggg aaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 4

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Asn Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg lie Thr Phe Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

His lie Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala lie 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Asn Trp Asn Tyr Gly Trp Leu Asp 100 105 110

Pro Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 30

<212> DNA 5 201136601 <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 5 ggagacagtg tctctagtga tagtgctgct 30 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成的 <400> 6

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp Ser Ala Ala 15 10 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 7 acatactaca ggtccaagtg gtataat 2Ί <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 8

Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn 1 5

<210> 9 <211> 42 <212> DNA 6 201136601 <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 9 gcaagagagg gggataattg gaattacggc tggctcgacc cc 42 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 10

Ala Arg Glu Gly Asp Asn Trp Asn Tyr Gly Trp Leu Asp Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400〉 11 gacatccagt tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctt cttagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttggtttc tagtcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatccggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga ttttggaatt tattattgta tgcaagctct acaaactccg 300 tacacttttg gccgggggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 12

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 201136601 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Leu Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly He Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95 Leu Gin Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 13 cagagcctcc ttcttagtaa tggatacaac tat 33 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成的 <400> 14

Gin Ser Leu Leu Leu Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr 15 10 <210> 15 <211〉 9 <212> DNA <213>人工序列 <220> 201136601 <223>合成的 <400> 15 ttggtttct 9 <210> 16 <211> 3 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 16 Leu Val Ser 1 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 17 atgcaagctc tacaaactcc gtacact 27 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 18

Met Gin Ala Leu Gin Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 19 <211> 369 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 9 201136601 <223>合成的 <400〉 19 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcattt ttatggtatg atggaactaa taaaaactat 180 gtagagtccg tgaagggccg attcaccatc tcaagagaca attccaagaa tatgctgtat 240 ctggaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcac 300 gattttagga gtggttatga ggggtggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 20

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Phe Leu Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Asn Tyr Val Glu Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp His Asp Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 10 201136601 <220> <223〉合成的 <400> 21 ggattcacct tcagtagtta tggc <210> 22 <211〉 8 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 22

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 23 ttatggtatg atggaactaa taaa <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 24

Leu Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys 1 5 <210> 25 <211> 48 <212〉 DNA <213>人工序列 201136601 <220> <223>合成的 <400> 25 gcgagagatc acgattttag gagtggttat gaggggtggt tcgacccc 48 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 26

Ala Arg Asp His Asp Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro 15 10 15 <210> 27 <211> 321 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 27 gaaatagtga tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacac cgtagcaact ggcctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 28

Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 12 201136601

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 29 cagagtgtta gcagctac 18 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 30

Gin Ser Val Ser Ser Tyr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 13 201136601 <400> 31 gatgcatcc 9 <210> 32 <211> 3 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 32 Asp Ala Ser 1 <210〉 33 <211> 27 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 33 caacaccgta gcaactggcc tcccact 27 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 34

Gin His Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr 1 5 <210> 35 <211> 357 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 14 201136601 <400> 35 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctgatgg ctccatcaac agtgttgaat cctactggac ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacatca aatacactgg gggcatccac 180 tataacccgt ccctcaagag tcgacttgcc atatcagtgg acacgtcaaa gaaccagttc 240 tccctgaaaa tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagca 300 cgtggaagtc atacttttga tgtctggggc caggggacaa tggtcaccgt ctcttca 357 <210> 36 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成的 <400> 36

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Sex Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Gly Ser lie Asn Ser Val 20 25 30

Glu Ser Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Lys Tyr Thr Gly Gly lie His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Ala lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ala Arg Gly Ser His Thr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 15 201136601 <400> 37 gatggctcca tcaacagtgt tgaatcctac 30 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 38

Asp Gly Ser lie Asn Ser Val Glu Ser Tyr 15 10 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 39 atcaaataca ctgggggcat c 21 <210> 40 <211〉 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 40 lie Lys Tyr Thr Gly Gly lie 1 5 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 16 201136601 <400> 41 gcgagagcac gtggaagtca tacttttgat gtc 33 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 42

Ala Arg Ala Arg Gly Ser His Thr Phe Asp Val 15 10 <210> 43 <211> 324 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 43 gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtcttggt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agtaactact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccagact cctcatttat ggtgcatcca gcagggtcac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcactgta ttattgtcag cagtatagta ggtcaccgat caccttcggc 300 caagggacca aagtggatat caaa 324 <210> 44 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 44 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu 15 10 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin 20 25

Ser Trp 15 Ser He 30

Ser Pro Gly

Ser Ser Asn 17 201136601

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Val Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Arg Ser Pro 85 90 95 lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 100 105 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 45 21 cagagtatta gcagtaacta c <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 46

Gin Ser lie Ser Ser Asn Tyr 1 5 <210> 47 <211〉 9 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 47 ggtgcatcc 9 18 201136601 <210> 48 <211> 3 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 48 Gly Ala Ser 1 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 49 cagcagtata gtaggtcacc gatcacc 27 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 50

Gin Gin Tyr Ser Arg Ser Pro lie Thr 1 5 <210> 51 <211> 357 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 51 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 19 201136601 acctgcactg tctctggtgg ctccatcaac agtgttactt actactggac ctggatccgc 120 cagcacccag ggaggggcct agagtggatt gggtacatca aattcagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaaggg tcgagtcacc atatcagtgg acacgtctaa gaaccaattc 240 tcccttaaaa ttaactctgt gactgccgcg gacacggccg tgttttactg tgcgagagct 300 tctggaagtc atacttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 52

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser 工le Asn Ser Val 20 25 30

Thr Tyr Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin His Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Lys Phe Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Gly Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys lie Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Phe Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ala Ser Gly Ser His Thr Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 53 ggtggctcca tcaacagtgt tacttactac 30 20 201136601 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 54

Gly Gly Ser lie Asn Ser Val Thr Tyr Tyr 15 10 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 55 atcaaattca gtgggagcac c 21 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 56 lie Lys Phe Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 57 33 gcgagagctt ctggaagtca tacttttgat ate 21 201136601 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 58

Ala Arg Ala Ser Gly Ser His Thr Phe Asp lie 1 5 10 <210> 59 <211> 324 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 59 gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aacagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctct ggtgcgtcca gcagggtcac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttggaatgta ttactgtcag cagtatagta ggtcaccgat caccttcggc 300 caagggacca agctggagat caaa 324 <210> 60 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成的 <400> 60

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 22 201136601 lie Ser Gly Ala Ser Ser Arg Val Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Gly Met Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Arg Ser Pro 85 90 95 lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 61 <211〉 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400〉 61 cagagtgtta gcaacagcta c 21 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 62

Gin Ser Val Ser Asn Ser Tyr 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 63 ggtgcgtcc 9 <210> 64 23 201136601 <211> 3 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 64 Gly Ala Ser 1 <210> 65 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 65 cagcagtata gtaggtcacc gatcacc 27 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 66

Gin Gin Tyr Ser Arg Ser Pro lie Thr 1 5 <210> 67 <211> 360 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成的 <400> 67 gaagtgcagc tggtgcagtc tgggggagcc ttggtacaac ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaac aactttgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaact attagtggta gtggcgttga cacatactgc 180 24 201136601 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgttc gaaagatggc 300 gccttctata gtggctacga acactactgg ggccagggaa ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 68 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 68

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Ala Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe 20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Thr He Ser Gly Ser Gly Val Asp Thr Tyr Cys Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ser Lys Asp Gly Ala Phe Tyr Ser Gly Tyr Glu His Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 69 ggattcacct ttaacaactt tgcc 24 <210> 70 25 201136601 <211> 8 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 70

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe Ala 1 5 <210> 71 <211〉 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 71 attagtggta gtggcgttga caca 24 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 72 lie Ser Gly Ser Gly Val Asp Thr 1 5 <210> 73 <211> 39 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 73 tcgaaagatg gcgccttcta tagtggctac gaacactac <210> 74 26 39 201136601 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 74

Ser Lys Asp Gly Ala Phe Tyr Ser Gly Tyr Glu His Tyr 1 5 10 <210> 75 <211> 324 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400〉 75 gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca acagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 tctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggagat caaa 324 <210> 76 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 76

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 27 201136601

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 77 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 77 cagagtgtta gcagcagcta c 21 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 78

Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 79 ggtacatcc 9

<210> 80 <211> 3 <212> PRT 28 201136601 <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 80 Gly Thr Ser 1 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 81 cagcagtatg gtagctcacc tcggacg 27 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 82

Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 83 <211> 357 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 83 gaagtgcagc tggtgcagtc tcctgcaagg cttctggtta cctggacaag ggcttgagtg gcacagaagt tccaagacag atggaactga ggagcctgag tggacctgag gtgaagaagc cacctttacc tactatggta gatgggatgg atcagcgctt aatcaccatg accacagaca atctgacgac acggccgtct ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcagttggat acgacagacc 120 acgatggtaa cacagactat 180 catcctcgac cacagcctac 240 attactgtgc gaggtatagt 300 29 201136601 357 tggaacaagc actggttcga cccctggggc cagggaacca tggtcaccgt ctcttca <210> 84 <211〉 119 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 84

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr 20 25 30

Gly lie Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Ser Ala Tyr Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Asp Arg lie Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Ser Trp Asn Lys His Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 85 ggttacacct ttacctacta tggt 24

<210> 86 <211> 8 <212> PRT 30 201136601 <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 86

Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr Gly 1 5 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 87 atcagcgctt acgatggtaa caca 24 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 88 lie Ser Ala Tyr Asp Gly Asn Thr 1 5 <210> 89 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 89 36 gcgaggtata gttggaacaa gcactggttc gacccc

<210〉 90 <211〉 12 <212> PRT 31 201136601 <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 90

Ala Arg Tyr Ser Trp Asn Lys His Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 91 <211> 324 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 91 gaaattgtga tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga cagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttacc ggcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccagact cctcatctat ggtgcatcca acagggccac tggcatccca 180 gacaggttca ctggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta tttctgtcaa cagtctgctt tctcaccgtg gacgttcggc 300 caggggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 92 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 92

Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Thr Gly Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Thr 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 32 201136601

Ser Pro

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Ala Phe 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 93 <211〉 21 <212> D1S1A <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 93 21 cagagtgtta ccggcagcta c <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成的 <400> 94

Gin Ser Val Thr Gly Ser Tyr 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 95 ggtgcatcc <210> 96 <211> 3 <212> PRT <213>人工序列 <220> 33 201136601 <223>合成的 <400> 96 Gly Ala Ser 1 <210> 97 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 97 caacagtctg ctttctcacc gtggacg 27 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 98

Gin Gin Ser Ala Phe Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 99 <211> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 99 caggtgcagc tgcaggagtc acctgcactg tctctggtgg cagcacccag ggaagggcct tacaatccga ccctcaagag tcccttgagg tgaactctgt atggttcggg gagttcactg tea gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 ctccatcagc agtggtggtt actactggag ttggatccgc 120 ggagtggatt gggtacatcc attatagtgg gaacacccac 180 tcgaattacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 gactgccgcg gacacggccg tatactactg tgcgaggaat 300 gttcgacccc tggggccagg gaaccacggt caccgtctcc 360 363 34 201136601 <210〉 100 <211> 121 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 100

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie His Tyr Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Pro Thr 50 55 60

Leu Lys Ser Arg lie Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Glu Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Asn Met Val Arg Gly Val His Trp Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 101 ggtggctcca tcagcagtgg tggttactac 30 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 35 201136601 <220> <223>合成的 <400> 102

Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr 15 10 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 103 atccattata gtgggaacac c 21 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 104 lie His Tyr Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 105 <211> 39 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 105 gcgaggaata tggttcgggg agttcactgg ttcgacccc <210> 106 <211〉 13 <212> PRT <213>人工序列 36 39 201136601 <22〇> <223>合成的 <400> 106

Ala Arg Asn Met Val Arg Gly Val His Trp Phe Asp Pro 15 10 <210〉 107 <211> 324 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <_> 107 gaaatagtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga gagagccacc 60 ctcttctgtt gggccagtcg gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctct ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtata tttctgtcaa cagtatagta gttcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca agctggagat caaa 324 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 108

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Phe Cys Trp Ala Ser Arg Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Ser Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Ser Pro 37 201136601 85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 109 cggagtgtta gcagcagcta c 21 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 110

Arg Ser Val Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 111 <211> 9 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成的 <400> 111 ggtgcatcc 9 <210〉 112 <211> 3 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 38 201136601 <400> 112 Gly Ala Ser 1 <210> 113 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 113 caacagtata gtagttcacc gctcact 27 <210> 114 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 114

Gin Gin Tyr Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 115 <211> 369 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 115 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcattt ttatggtatg atggaactaa taaaaactat 180 gtagagtccg tgaagggccg attcaccatc tcaagagaca attccaagaa tatgctgtat 240 ctggaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcac 300 gattttagga gtggttatga ggggtggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 39 201136601 <210> 116 <211> 123 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成的 <_> 116

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Phe Leu Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Asn Tyr Val Glu Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp His Asp Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 117 <211> 321 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的 <400> 117 gaaatagtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacac cgtagcaact ggcctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 40 201136601 <210> 118 <211> 107 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 118

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 41

Claims (1)

1. 201136601 七、申請專利範圍： 1. 一種類δ配位子4 (D114)拮抗劑，其用於預防、治療或改 善其中增加調節性T (Treg)細胞是有益的疾病或障礙，其 中該拮抗劑阻斷D114與Notch受體之間的交互作用，藉此 增加Treg細胞的數目而預防、治療或改善該疾病或障礙。 2. —種預防、治療或改善其中增加調節性T (Treg)細胞是有 益的疾病或障礙之方法，該方法包含將—治療有效量的類 δ配位子4(D114)拮抗劑投藥給有需要的個體，豆中該#抗 劑阻斷_與N〇tch受體之間的交互作用，藉此 細胞的數目並且預防、治療或改善該疾病或障礙。 3. 如申請專利範圍第1項的D114拮抗劑或如申請專利範圍第 2項的方法，其中該疾病或障礙是自體免疫疾病。 4. 如申請專利範圍第項中任—項的應枯抗劑或方 法，其中該疾病或障礙是選自於多發性硬化症、第丨型糖 尿病、類風濕性關節炎、克隆氏病、古巴士德氏症候群、 格雷氏病、格巴二氏症候群(GBS)、橋本氏病、特發性血 小板減少性紫瘢、腸躁症、紅斑狼瘡、混合性結締組織病、 重症肌無力、嗜睡病、天狼瘡、惡性貧血、多發性肌炎、 原發性膽汁肝硬化、休格倫氏症候群、潰癌性大腸炎、血 管炎以及華格納氏肉芽病。 5. 如申請專利範圍第！至4項中任_項的刪拮抗劑或方 法，其中§亥疾病或障礙是多發性硬化症。 6·如申請專利範圍第u 4項中任_項的腦枯抗劑或方 法，其中該疾病或障礙是第1型糖尿病。 53 201136601 7. 如前述申請專利範圍中任一項的DU4拮抗劑或方法，其中 該D114拮抗劑是專一地結合人類DU4 (hDU4)並且阻斷 D114-Notch傳訊路徑的抗體或其片段，或融合蛋白質，該 融合蛋白質包含融合至人類IgG<Fc領域(d〇main)的dim 的細胞外領域或其片段。 8. 如前述申請專利範圍中任一項的D114拮抗劑或方法，其中 該DU4拮抗劑是專一地結合人類DU4 (hDU4)以及阻斷 D114-Notch傳訊路徑的抗體或其片段，並且包含一重鏈可 變區域(HCVR)以及一輕鏈可變區域(LCVR)，該重鏈可變 區域包含分別為SEQ ID NO : 22、24以及26的重鏈 CDR1、CDR2以及CDR3序列’該輕鏈可變區域包含分別 為SEQ ID NO : 30、32以及34的輕鏈CDR1、CDR2以及 CDR3序歹丨J。 9_如申請專利範圍第8項的D114拮抗劑或方法，其中該抗體 或其片段包含 SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO: 116 之 HCVR 序列。 10. 如申請專利範圍第8項的D114拮抗劑或方法，其中該抗體 或其片段包含 SEQ ID NO:28 或 SEQ IDNO: 118 之 LCVR 序列。 11. 如申請專利範圍第8至10項中任一項的D114拮抗劑或方 法，其中該抗體或其片段包含SEQ ID NO:20/28或116/118 之 HCVR/LCVR 組合。 12. 如申請專利範圍第1項及第3至11項中任一項的DU4结 抗劑’其係與至少一種選自於降血糖劑、免疫抑制劑、抗 54 201136601 發炎劑以及鎮痛劑的額外治療劑組合。 13. 如申請專利範圍第12項的D114拮抗劑，其中該額外治療 劑是選自於下列的至少一者：騰島素及其類似物、糖皮質 素、環孢素、胺曱喋呤、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、 TNF-α拮抗劑、IL-1拮抗劑、IL-6拮抗劑以及類鴉片。 14. 如申請專利範圍第2至11項中任一項的方法，其進一步 包含共投藥一治療有效量的至少一種額外治療劑，其是選 自於降血糖劑、免疫抑制劑、抗發炎劑以及鎮痛劑。 15. 如申請專利範圍第14項的方法，其中該額外治療劑是選 自於下列的至少一者：胰島素及其類似物、糖皮質素、環 孢素、胺曱喋呤、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、TNF-a 拮抗劑、IL-1拮抗劑、IL-6拮抗劑以及類鴉片。 16. 如申請專利範圍第丨2至15項中任一項的D114拮抗劑或方 法’其中該D114拮抗劑以及至少一額外治療劑是用於同時 或連續投藥。 17. —種如申請專利範圍第1、7-13及16項中任一項的類δ 配位子4 (D114)拮抗劑之用途，其用於預防、治療或改善 如申請專利範圍第1及3-6項中任一項所界定之疾病或障 礙。 18. —種類δ配位子4 (DU4)拮抗劑在製造用於預防、治療或 改善其中增加調節性T (Treg)細胞是有益的疾病或障礙之 醫藥品的用途，其中該拮抗劑阻斷D114與Notch受體之間 的交互作用，藉此增加Treg細胞的數目並且預防、治療或 改善該疾病或障礙。 55 201136601 19.如申請專利範圍第 體免疫疾病。 18貝的途’其中該疾病或P章礙是自 20. 如申凊專利範圍第18或19項的用诠# ’㈣’其中該疾病或障礙 =:多發性硬化症、第1型糖尿病、類風濕性關節炎、 巴士德氏症候群、格雷氏病、格巴二氏症候 群(哪）、橋本氏病、特發性血小板減少性紫瘋、腸躁症、 紅斑狼瘡·、混合性結締組織病、重症肌無力、嗜睡病、天 狼瘡、惡性貧血、多發性肌炎、原發性膽汁肝硬化、休格 倫氏症候群、潰躲大腸炎、血管炎以及祕納氏肉芽病。 21. 如申請專利範圍第18至20項中任一項的用途，其中該疾 病或障礙是多發性硬化症。 22. 如申請專利範圍第18至20項中任一項的用途，其中該疾 病或障礙是第1型糖尿病。 23. 如申請專利範圍第18至22項中任一項的用途，其中該 DIM拮抗劑是專一地結合人類Dii4 (hD114)並且阻斷 D114-Notch傳訊路徑的抗體或其片段，或融合蛋白質，該 融合蛋白質包含融合至人類IgG之Fc領域的D114的細胞 外領域或其片段。 24. 如申請專利範圍第18至23項中任一項的用途，其中該 D114拮抗劑是專一地結合人類D114 (hD114)以及阻斷 D114-Notch傳訊路徑的抗體或其片段，並且包含一重鏈可 變區域(HCVR)以及一輕鏈可變區域(LCVR)，該重鏈可變 區域包含分別為SEQ ID NO : 22、24以及26的重鏈 CDIU、CDR2以及CDR3序列，該輕鏈可變區域包含分別 56 201136601 為SEQ ID NO : 30、32以及34的輕鏈CDIU、CDR2以及 CDR3序列。 25.如申請專利範圍第24項的用途，其中該抗體或其片段包 含 SEQ ID NO : 20/28 或 116/118 之 HCVR/LCVR 組合。 57