TW201127959A

TW201127959A - Method of producing immune killer cell

Info

Publication number: TW201127959A
Application number: TW099104629A
Authority: TW
Inventors: shun-lang Zhang
Original assignee: Ivy Life Sciences Co Ltd
Priority date: 2010-02-12
Filing date: 2010-02-12
Publication date: 2011-08-16
Also published as: US9222072B2; TWI403581B; US20110201114A1

Description

201127959 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種免疫殺手細胞(immune kiUer)之製造方法，尤指一種將免疫殺手細胞應用於抑制腫瘤之醫藥組成物。【先前技術】目前有關以免疫療法治療癌症的研究，包含以注射細胞激素春（cytokine) ’例如干擾素(interferon)或介白素(interleukin)，以直接刺激免疫力、^幵抗癌效果。但由於這些細胞激素本身之副作用過大，例如，包括干擾素和介白素在内的一些常用細胞激素，都會引發類似感冒的症狀，包括發燒、發冷、疲倦和消化道問題，血壓亦會受其影響。其中介白素-2 (interleukin-2，簡稱IL-2)所引發的副作用通常較嚴重’在治療過程中，醫師需格外仔細觀察患者。因此注射細胞激素雖曾為癌症治療帶來了一線曙光，但已逐漸被認為不完全可行。除此之外，目前仍在試驗當中之免疫療法包括癌症疫苗療法，此法也有可能改善免疫力，但由於癌症病人之免疫系統多已受到抑制，效果仍然有待討論。目前免疫療法中較快速、較有效的’應屬免疫細胞(immune cell)醫療技術。所謂免疫細胞醫療技術，就是抽取病人之白血球進行培養，大量增殖淋巴激素活化殺手細胞(lymphokine activate killer cell，簡稱 LAK 細胞）、殺傷性 T 淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，簡稱CTL細胞)或自然殺手細胞 201127959 (natural killer cell，簡稱NK細胞)後，再將其輸注回患者體内以產生抗癌功效。由於體内具有毒殺癌細胞能力之細胞，例如ΝΚ細胞及CTL 細胞(LAK細胞則非體内正常之族群，它是將CTL細胞在體外利用高濃度之細胞激素培養後大量繁殖之細胞），在一般人體内之 CTL細胞及NK細胞數量有限或活性受抑制，因此長期以來即有免疫學家試著在體外以細胞激素大量培養這些細胞後，再打入病人體内，直接提咼病人之抗癌活性。這方法的優點是效果迅速、不會有排斥現象(因細胞取自於病人本身），且由於注射前須先去除細胞激素，因此，也不致產生細胞激素之副作用。此法最重要的關鍵疋要月b夠增殖足夠的細胞並給予適當的活化，如此才能發揮充分的抗癌效果。此方法過去較無大量之臨床應用，主要就是一直無法犬破大量增殖之瓶頸，或所增殖之細胞活性不夠高之故。目前對於免疫細胞之體外培養方法，在培養過程中，往往因為必須使用動物來源之抗體蛋白作為刺激物，容易造成人畜共通疾病之傳染等副作用，危及病患之生命健康。例如，中國發明專利ZL 20031019565.5號，係使用植物血球凝集素 (phytohemagglutinin，簡稱 PHA)及抗 CD3 單株抗體(anti-CD3 monoclonal antibody，簡稱抗CD3mAb)二種有絲分裂原聯合活化細胞，增強對細胞的刺激強度，進而提高細胞的體外增殖能力。然而，其使用之抗CD3mAb ,來源大多來自實驗老鼠，且老鼠與 4 201127959 人類之基因非常接近’難保無人畜（鼠)共通疾病之病源菌污染的可能，而谷易造成危害人體生命之不良後果。【發明内容】本發明之主要目的係提供一種免疫殺手細胞之製造方法，其特徵為於包含刀豆球蛋白(concanavalin A)之培養基中進行該免疫殺手細胞謂導、_或獻培養之㈣，而不需朗任何抗體蛋白。上述之方法，其中該培養基中進一步包含介白素 (interleukin)、干擾素（interferon)或植物血球凝集素 (phytohemagglutinin)= 上述之方法，其中该培養基中不包含任何抗體蛋白作為刺激物。上述之方法，其中該刀豆球蛋白於培養基中之濃度為〇1〜1〇〇 pg/mL，較佳為 0.1 〜30 pg/mL。上述之方法，其中進一步包含分離周邊血液單核細胞 (peripheral blood mononuclear cell)之步驟。上述之方法，其中該周邊血液單核細胞於培養基中之濃度為 O.lxlO6〜ΙΟχΙΟ6 個/mL。本發明之另一目的係提供一種免疫殺手細胞’其係由上述之 201127959 方法所製造。上述之免疫殺手細胞，其包含：自然殺手細胞(natural kmer cel卜簡稱NK細胞）、自然殺手T細胞(natural killer T cell ’簡稱 NKT細胞）、gamma/delta T細胞(γδ T cel卜簡稱γδ T細胞)及殺傷性Τ細胞(cytotoxic T cell，簡稱Tc細胞或CTL)。上述之免疫殺手細胞，其組成比例為：5〜20°/°之自然殺手細 φ胞、I5〜5〇°/〇之自然殺手T細胞、1〇〜3〇%之gamma/deltaT細胞及 40〜70%之殺傷性τ細胞。本發明之另一目的係提供一種抑制腫瘤之醫藥組成物，其包含有效量的上述之免疫殺手細胞。本發明之另一目的係提供一種套組，其包含上述之醫藥組成物。更明確地’本發明係關於一種自體免疫殺手細胞的製備方法及其應用，其係從取得之病患血液中，於無菌狀態下將周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cel卜簡稱 PBMC)分離出，以培養基進行培養，該培養基中包含刀豆球蛋白(c〇ncanavalinA，簡稱ConA)、介白素_2(interleukin-2，簡稱IL-2)、干擾素 rfer〇n 丫）或植物血球凝集素(phytohemagglutinin τ簡稱 PHA)。其巾錢有使用來自老鼠或其他動物之抗紐自作為刺激物’可避免人畜共翻病錢顺，並且有效增加免疫殺手細胞 201127959 之數量及活性。本發明若在培養基中添加適量之ConA及IL-2等細胞因子作為刺激物，可以有效促成NK細胞、NKT細胞、Tc細胞及γδ T細胞等免疫殺手細胞之增殖及活化’且各細胞間之組成比例具有一定之百分比分佈時，可達到最好的活性效果。另外，當改變上述刺激物之濃度及比例時，可以調整上述各細胞間之組成比例百分比及增殖數量，以配合不同之應用。【實施方式】為充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明。以下實施例旨在進一步說明本發明之技術内容，並不用以限制本發明之申請專利範圍。 • 1.免疫盤手細胞之細胞接養實^ 以下為免疫殺手細胞之細胞培養步驟： ⑴將從周邊靜脈血巾分離抽出之PBMC移人細胞培養瓶中，並以培養基將細胞之漠度調整為G 5xlG6〜2xlG6個/mL，並放置於 -氧化碳培養箱中培養^上述之培養基可為处抓购培養基、 IMDM培養基、ALys培養基或AIM-V培養基中之任何一種，而且培養基中應含有以下成份：

Concanavalin A 0 .1 〜30 pg/mL 201127959

Proleukin 200〜1000 IU/mL

Interferon-γ 600〜1500 units

Human Auto Serum 5〜12 % (2) 細胞在上述培養基中培養2至6天之後，以培養基或生理食鹽水洗滌1〜2次’再以新鮮的培養基將細胞打散並將細胞濃度調整為0.3χ106〜2χ106個/mL ’並放置於二氧化碳培養箱中培養。 _上述之培養基可為RPMI-1640培養基、IMDM培養基、ALys培養基或AIM-V培養基中之任何一種’而且培養基中應含有以下成份:

Interleukin-2 200-600 IU/mL

Interferon-γ 100-300 U/mL

Interleukin-15 10-50 ng/mL (3) 以後視細胞生長密度而定’大約每隔2至3天加入新鮮的 •培養基，並調整細胞之濃度使其介於0.3χ106〜2χ106個/mL，最後放置於二氧化碳培養箱中培養。上述之培養基可為^ρΜΙ_164〇培養基、IMDM培養基、ALys培養基或AIM-V培養基中之任何一種，而且培養基中應含有以下成份：

Interleukin-2 Interferon-γ Interleukin-15 100 〜500 IU/mL 80-150 U/mL 10-30 ng/mL 201127959 (4)以後每隔2至3天重復上述步驟(3)之操作，直至總共培養 14天為止。經過上述方法培養出來的免疫殺手細胞為混合細胞，其中包括：NK細胞(具CD3陰性、CD56陽性表型）、NKT細胞(具CD3 陽性及CD56陽性表型）、γδ T細胞(具有γδ型T細胞受器之T細胞)及Tc細胞(具αβ型Τ細胞受器之典型殺傷性Τ細胞），其為免疫系統中活性最強的殺手細胞。 • 利用上述方法培養出來的免疫殺手細胞，由於個體間之差異，各細胞間之組成比例分佈會因人而異，但總體而言，絕大多數人之組成百分比如下：ΝΚ細胞約佔5〜20%、ΝΚΤ細胞約佔 15〜50%、γδΤ細胞約佔10〜30%、Tc細胞約佔40〜70%。第1圖為本發明之免疫殺手細胞的培養生長曲線，其係自6 名自願者(以圖中之6種顏色表示)之上臂靜脈各抽出30 c.c.之血 •液，依上述方法進行處理、培養。培養後每隔1到3天則自細胞培養液中取樣並計算細胞總數，對照培養天數繪製成圖。圖中縱軸為免疫殺手細胞之數量，橫軸為培養天數，由圖中數據可知，免疫殺手細胞經培養後其總數明顯增加，至第14天時總數已經超過1〇9個。 2·免疫殺手細胞毒殺癌細胞 9 201127959 PBMC經過培養後變成免疫殺手細胞(簡稱IKC)，其抗肺癌及肝癌之活性大幅增加，如表1所示。其中六個志願者之免疫殺手細胞及PBMC在E/T=50時，其毒殺肺癌細胞(NCI-H23)及肝癌細胞(Hep3B)之活性(Specific release)。表1結果為利用標準的4h 51 Cr-release assay 分析所做成。表1 : ^活性 E=PBMC E=IKC E=PBMC E=IKC 志願者編 T=NCI-H23 T=NCI-H23 T=Hep3B T=Hep3B 1 2% 18% 2% 32% 2 0% 18% 1% 24% 3 0% 16% 3% 20% 4 0% 8% 3% 17% 5 6% 15% 6 8% 33% 3.免疫殺手細胞之動物實驗 Π)免疫殺手細胞之細胞致瘤性實驗(安全，14^^): 為了測試注射免疫殺手細胞（簡稱IKC)本身會不會引起腫瘤’將20隻BALB/C裸小鼠分成2組，每一組10隻，其中一組以皮下(s.c.)注射的方式打入免疫殺手細胞(每隻小鼠注射2χ1〇7個免疫殺手細胞），而另一組則以靜脈注射(i.v.)的方式打入免疫殺手細胞(每隻小鼠注射2χ107個免疫殺手細胞）。接種天後再犧牲 201127959 小鼠’檢查接種部位及主要臟ϋ是否有軸形成。另外以人類肝癌腫瘤細胞肌-7402作為正對照級，18隻小鼠每隻以皮下注射方式’注射5xl06個BEL-7402細胞，同樣的在3〇天之後觀察形成腫瘤的情形，實驗結果如表2所示。

表2 : 群組裸小鼠數目細胞數/隻 ----- 接種方法 IKC 10 2xl07 S.C. i.v IKC 10 2xl07 BEL-7402 18 5xl06 —— s.c. ----- 致瘤率主要臟器致瘤率 0 0 0 0 100% 0 表2之實驗結果顯示，在U隻接種BEL·肝癌細胞之裸小鼠全部形成腫瘤(致瘤率100%)，而接種免疫殺手細胞之裸小鼠’雖然接種劑量已達2xlG7個/隻，但無論是利収下或靜脈注射的方式’經過30天’在纟下接種部位或體内主要臟器，均未見腫瘤長出’說明免疫殺手細朗裸小鼠無致瘤侧，是非常安全的0

(2)_免疫殺手細胞對早期腫瘤之泊年實皆：取人類肝癌腫瘤細胞BEL-7402，接種於BALB/C裸小鼠側背部皮下(0.1 mL/隻，内含5xl06個BEL-7402細胞）。在皮下接種後第2天開始以免疫殺手細胞(簡稱IKC)進行治療。在接種後之第 2、第4及第6天，分別以靜脈注射方式，自裸小鼠之尾靜脈注射免疫殺手細胞(每次打入2xl07個/隻）。對照組則注射磷酸鹽緩衝 201127959 液(PBS)而不做其他治療。30天後犧牲小鼠，觀察腫瘤形成之數目及記錄取下來腫瘤的重量，實驗結果如表3所示。表3 : 群組裸小鼠數目細胞數途徑/時間(天）平均瘤重 (公克）抑瘤率腫瘤消 (%) 退率 IKC 5 2χ107 i.v./2, 4, 6 0.25 土 0.31 84 ~~~--- (p<o.on^ 3/5 PBS 卜5 i.v./2,4, 6 1.57土 0.46 表3之實驗結果顯示，注射PBS之5隻小鼠身上皆形成腫瘤，而注射免疫殺手細胞之5隻小鼠只有2隻身上有形成腫瘤(腫瘤消退率為60〇/〇)。此外，在注射PBS之對照組小鼠身上之平均瘤重為 1.57公克，而注射免疫殺手細胞之實驗組小鼠身上之平均瘤重為 0.25公克。由此實驗可知’注料疫殺手細胞不僅可以抑制初期腫瘤之形成，也可以抑制腫瘤之生長，其腫瘤抑制率可達嫩，計其公式如下。抑瘤率(％卜[(對照組平均瘤重—實驗組平均瘤重y對照组平均瘤重]X100% 免疫殺手細胞可以抑觀期或較大_生長之實驗方法如 201127959 下：广人類肝癌_細胞BEL_7搬之裸小鼠模型的接種實驗中田腫瘤長至直㈣0.5 cm時開始治療。實驗設免疫殺手細胞(簡稱IKQ、PBMC，細胞及等3組，每組各5隻裸小鼠。打入之免疫殺手細胞及PBMC細胞之數量皆為2χΐ〇7俯t，體積為〇 ι mL ’以尾靜脈注射方式治療，而對照組只注射〇 ι祉之舰。每隔2天庄射1 _人’共注射3次。每2天觀察腫瘤生長情況，觀察天後犧牲J、鼠’取下腫瘤稱重並計算腫瘤抑制率，實驗結果如表4所示。

表4 :

腫瘤消退率

相較於PBS ’未經培養過的pBMC也有18%之抑瘤率，但腦c經過本發日_之方絲養14天之後，鱗之細胞統稱為免疫殺手細胞，其抑辭可提高至7G%，是培養前之Μ倍。如上所述，本發似全符合專利三要件，酿、進步性及產業上利雜。本翻係藉由刀域蛋自作為培養免疫殺手細胞 13 201127959 之刺激物，且培養過程當中不使用抗體蛋白作為刺激物，可避免人畜共通疾病之感染風險，且可有效增加免疫殺手細胞之數量及活性。又湘本發明所製造之免疫殺手細胞，可有效抑制腫瘤且具有良好之安全性。本發明在上述中以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是’該實施例僅用於描述本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應涵蓋於本發明之範疇内。因此，本發明之保護範圍當以下述之^ 請專利範圍所界定者為準。【圖式簡單說明】第1圖為本發明之免疫殺手細胞的培養生長曲線。【主要元件符號說明】

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Claims

201127959 七、申請專利範圍： h 一種免疫殺手細胞之製造找，其概為於包含刀豆球蛋白 (C_alinA)之培養基巾’進他免疫殺手細胞之誘導維持或擴大培養之步驟。 2. 如申料利細第丨項之方法，財鱗養基巾進—步包含介白素（interleukin)、干擾素（imerfer〇n)或植物血球凝集素 (phytohemagglutinin) ° 3. 如申請專利範圍帛2項之方法，其中該培養基中不包含抗體蛋白作為刺激物。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該刀豆球蛋白於培養基中之濃度為0.1〜100 pg/mL。 5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該刀豆球蛋白於培養基中之濃度為0.1〜30 pg/mL。 6. 如申請專利範圍第1至4項中一項之方法，其中進一步包含分離周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)之步 7. 如申請專利範圍第5項之方法’其中該周邊血液單核細胞於培養基中之濃度為O.lxlO6〜ΙΟχΙΟ6個/mL。 8. —種免疫殺手細胞，其係由如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法所製造。 9. 如申請專利範圍第7項之免疫殺手細胞’其包含：自然殺手細胞(natural killer cell)、自然殺手 T 細胞(natural killer T cell)、 201127959 gamma/delta T ^^Tcell^^^T^^ytotoxicTcell). 妓c 1首之条浐殺手細胞’其組成比例為：5〜20% 10.如申請專利範圍第8項之免焱紅于，之自然殺手細胞、I5〜5G%之自_手T細胞、10〜30%之 gamma/delta T細胞及〜7〇%之权傷性T細胞。 11. 一種抑制腫瘤之醫藥組成物，其包含有效量的如申請專利範圍第9項之免疫殺手細胞。 12. —種套組，其包含如申請專利範圍第10項之醫藥組成物。

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