TW201110982A - Osteopontin antibodies - Google Patents

Description

201110982 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 、本發明係關於可結合於骨橋蛋白之抗體及其抗原結合部 刀。本發明亦關於編碼該等抗體及抗原結合部分之核酸分 子、製備骨橋蛋白抗體及抗原結合部分之方法包含該等 抗體及抗原結合部分之組合物、以及使用該等抗體、抗原 結合部分及組合物之方法。 相關申請案 本申請案主張2009年8月20曰申請之美國專利申請案第 61/235，542號之權益，該專利申請案係以全文引用的方式 併入本文中。 【先前技術】 人類骨橋蛋白（亦稱為SPP1)基因編碼具有3 14個胺基酸 殘基之前驅蛋白質’其中可裂解出具有16個胺基酸殘基之 預測彳§號肽而產生具有298個胺基酸殘基以及具有整合素 結合序列及N-糖基化位點及〇_糖基化位點之成熟蛋白質。 骨橋蛋白（OPN)為一種視磷酸化及/或硫酸化之轉譯後修飾 而定分子量在44 kDa與75 kDa之間的分泌型糖基化磷蛋白 (Sodek等人 仏〇/· Med. 11(3):279-303 (2000))。OPN含有已知在細胞黏附中起重要作用之典型 RGD基元。0PN在骨骼中之作用在此項技術中為熟知的。 破骨細胞為主要骨吸收細胞類型，其表現OPN之膜相關受 體整合素avp3(Dodds等人，*/. Bone Μ⑽r. 10(11): 1666-1680 (1995))。OPN能夠結合於若干細胞類型，包括 150155.doc 201110982 成骨細胞、破骨細胞、未轉型顱骨細胞株及許多轉型纖維 母細胞株（Somerman等人，Mair/x 9(1):49-54 (1989))。亦 已報導OPN與纖維結合蛋白（Singh等人，·/.价〇/· Chem. 265(30):18696-18701 (1990); Nemir等人，·/· Bb/· C/aem. 264(30):18202-18208 (1989))、I 型膠原蛋白（Chen等人， 价〇/· C/iew. 267(34):24871-24878 (1992))、及骨鈣化素 (Ritter等人M/wer. 7(8):877-885 (1992))締 合0 除細胞黏附以外，OPN亦可藉由以鈣依賴性方式與其受 體相互作用而影響細胞生理學。ΟΡΝ能夠以相對較低的親 和力結合多個Ca2+離子，且ΟΡΝ之構形對游離Ca2+濃度之 變化高度敏感。在RGD細胞結合序列周圍之高密度負電荷 表明蛋白質在該區域之摺疊取決於游離鈣含量，此表明鈣 可能影響OPN與整合素之相互作用。 亦已知OPN表現在惡性癌中具有重要作用。最初表明浸 潤腫瘤之巨嗟細胞，而非腫瘤細胞本身表現OPN(Furger等 人，Cwrr. Mo/· 1(5):621-632 (2001))。然而，最近已 報導某些腫瘤細胞直接表現OPN(Rittling等人，*/. 90(10):1877-1881 (2004))。在惡性乳房瘤 (Bellahcene等人，Jm. J. Ραί/ζο/· 146(1):95-100 (1995))、 惡性神經膠母細胞瘤（Takano等人，·/· Cimcer 82(12): 1967-1973 (2000))、侵襲性原發皮膚黑色素瘤（Zhou等人， J. /«ναί. Der/waio/. 124(5):1044-1052 (2005))及卵巢癌 (Brakora等人，G少《eco/. Onco/. 93(2):361-365 (2004))中偵 150155.doc 201110982 測到OPN含量升高且OPN含量升高與患者存活率低密切相 關（Bramwell 等人，C/i”. c_er ^ 12(1 1):3337 3343 (2006))。 【發明内容】 本發明之一目標為提供特異性結合骨橋蛋白之人類抗體 或人類化抗體。本發明之另一目標為提供可安全用於人類 投藥之抗體。本發明之一目標亦為提供藉由使用—或多種 本發明抗體來治療與骨橋蛋白上調有關之疾病及/或病狀 的方法。本發明之該等目標及其他目標在本文中有更全面 的描述。 在一態樣中，本發明提供一種經分離人類抗體或其抗原 結合部分，其特異性結合骨橋蛋白之Kd值為6〇〇 nM或以 下、100 nM或以下、50 nM或以下、1〇 nM或以下、5 nM 或以下、或1 nM或以下。在一態樣中，該骨橋蛋白為人類 骨橋蛋白。在另一態樣中，該骨橋蛋白為鼠類骨橋蛋白。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分’其中該抗體或抗原結合部 分包含.（a)如 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:29所示之 H-CDR1 ; (b)如 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:16 或 SEQ ID N〇:30所示之 H-CDR2 ;及（c)如 SEQ ID N0:3、 SEQ ID NO:17或 SEQ ID NO:31 所示之H-CDR3。在另一態

樣中’該等抗體或抗原結合部分進一步包含：（a)如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18或 SEQ ID NO:32所示之L. CDR1 ; (b)如 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19或 SEQ ID NO:33所示之 150155.doc 201110982 L-CDR2 ;及（c)如 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:75所示之 L-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含：（a)如 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18 或 SEQ ID NO:32所示之L-CDR1 ; (b)如 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19 或 SEQ ID NO:33 所示之 L-CDR2;及（c)如 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:75 所示之 L-CDR3。在另一態樣中，該等抗體或抗原結合部分進一步 &#:(a)WSEQIDNO:l、SEQIDNO:154SEQIDNO:29 所示之 H-CDR1 ; (b)如 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:16 或 SEQ ID NO:30 所示之 H-CDR2 ;及（c)如 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:17 或 SEQ ID NO:31 所示之 H-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如SEQ ID ΝΟ:1所示之H-CDR1、如SEQ ID NO:2所 示之 H-CDR2及如 SEQ ID NO:3 所示之 H-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如SEQIDNO:15所示之H-CDRl、如SEQIDNO:16 K*iH-CDR2&WSEQIDNO:17K*iH-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如 SEQ ID NO:29所示之H-CDR1、如 SEQ ID ΝΟ··30 150155.doc 201110982 K*iH-CDR2&WSEQIDNO:3im*iH-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如SEQ ID NO:4所示之L-CDR1、如SEQ ID NO:5所 *2L-CDR2&WSEQIDNO:6m*iL-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如 SEQ ID NO:18 所示之 L-CDR1、如 SEQ ID NO:19 K*iL-CDR2&WSEQIDNO:2C^；t*iL-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如 SEQ ID NO:32所示之 L-CDR1、如 SEQ ID NO:33 所示之L-CDR2及如SEQ ID NO:34所示之L-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如SEQ ID NO:4所示之L-CDR1、如SEQ ID NO:5所 *2L-CDR2&WSEQIDNO:75A*iL-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如SEQ ID ΝΟ:1所示之H-CDR1、如SEQ ID NO:2所 示之H-CDR2、如 SEQ ID ΝΟ··3所示之H-CDR3、如 SEQ ID NO:4所示之L-CDR1、如SEQ ID NO:5所示之L-CDR2及如 SEQ ID NO:6所示之 L-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 150155.doc 201110982 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如 SEQ ID NO:15 所示之 H-CDR1、如 SEQ ID NO:16 所示之H-CDR2、如 SEQ ID NO:17所示之H-CDR3、如 SEQ ID NO:18所示之 L-CDR1、如 SEQ ID NO:19所示之 L-CDR2 及如 SEQ ID NO:20所示之L-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如 SEQ ID NO:29所示之H-CDR1、如 SEQ ID NO:30 所示之H-CDR2、如 SEQ ID NO:31所示之H-CDR3、如 SEQ ID NO:32所示之 L-CDR1、如 SEQ ID NO:33所示之 L-CDR2 及如 SEQ ID NO:34所示之L-CDR3。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如SEQ ID ΝΟ:1所示之H-CDR1、如SEQ ID NO:2所 示之 H-CDR2、如 SEQ ID NO:3 所示之 H-CDR3、如 SEQ ID NO:4所示之L-CDR1、如SEQ ID NO:5所示之L-CDR2及如 SEQ ID NO:75所示之 L-CDR3。

在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:35、 SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48 或 SEQ ID NO:52K*iVH 鏈胺基酸序列。在一態樣中，該抗體或抗原結合部分進一 步包含如 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:36、 SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID 150155.doc 201110982 NO:56或SEQ ID NO:76所示之VL鏈胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之 經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部 分包含如 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:3 6、 SEQ ID NO:46、SEQ ID N〇:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:76所示之VL鏈胺基酸序列。在一實施 例中，該抗體或抗原結合部分進一步包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、 SEQ ID NO :48或SEQ ID NO :5 2所示之VH鏈胺基酸序歹ij。 在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分 包含如SEQ ID NO:7所示之VH鏈胺基酸序列及如SEQ ID NO:8所示之VL鏈胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分 包含如SEQ ID NO:21所示之VH鏈胺基酸序列及如SEQ ID NO:22所示之Vl鏈胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分 包含如SEQ ID NO:35所示之VH鏈胺基酸序列及如SEQ ID ΝΟ··36所示之VL鏈胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分 包含如SEQ ID NO:44所示之VH鏈胺基酸序列及如SEQ ID 150155.doc •9· 201110982 NO:46所示之VL鏈胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分 包έ如SEQ ID NO:48所示之vH鏈胺基酸序列及如SEq ID ΝΟ··50所示之VL鏈胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分’纟中該抗體或抗原結合部分 包含如SEQ ID NO:52所示之％鏈胺基酸序列及如seq⑴ NO:54所示之VL鏈胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分’其中該抗體或抗原結合部分 包s如SEQ ID NO:52所示之vH鏈胺基酸序列及如SEq ID NO:56所示之乂1鏈胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種特異性結合骨橋蛋白之經 分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分 包s如SEQ ID NO:7所示之γΗ鏈胺基酸序列及如SEq jd NC^76所示之VL鏈胺基酸序列。 在一態樣中，本文所述之任何抗體或抗原結合部分所特 異性結合的骨橋蛋白為人類骨橋蛋白。在另一態樣中，該 骨橋蛋白為鼠類骨橋蛋白。 在另一態樣中，本發明提供一種與本文所述之任何抗體 一致的抗體，其為IgG。舉例而言，該等抗體可為IgG1、

IgG2、IgG3 或 IgG4。 在另態樣中，本發明提供一種與本文所述之任何抗體 150155.doc -10· 201110982 一致的抗體，其為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。 在另一態樣中，本發明提供一種與本文所述之任何抗原 結合部分一致的抗原結合部分，其為Fab或scFv抗體片 段。 在一態樣中，所描述之本發明的任何抗OPN抗體之重鏈 的C端離胺酸已經裂解，且因此不存在。例如，在另一態 樣中，本發明提供一種經分離抗體，其包含如SEQ ID ΝΟ:11所示之重鏈胺基酸序列；及如SEQ ID NO:12所示之 輕鏈胺基酸序列，其限制條件為SEQ ID ΝΟ:11之C端離胺 酸殘基視情況不存在。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體，其包含如 SEQ ID NO:25所示之重鏈胺基酸序列：及如SEQ ID NO:26所示之輕鏈胺基酸序歹ij ，其限制條件為SEQ ID ΝΟ··25之C端離胺酸殘基視情況不存在。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體，其包含如 SEQ ID NO:39所示之重鏈胺基酸序列；及如SEQ ID NO:40所示之輕鏈胺基酸序列，其限制條件為SEQ ID NO:39之C端離胺酸殘基視情況不存在。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體，其包含如 SEQ ID NO:58所示之重鏈胺基酸序歹ij :及如SEQ ID NO:59所示之輕鏈胺基酸序列，其限制條件為SEQ ID NO:58之C端離胺酸殘基視情況不存在。

在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體，其包含如 SEQ ID NO:62所示之重鏈胺基酸序列；及如SEQ ID 150155.doc 201110982 NO:63所示之輕鏈胺基酸序列，其限制條件為SEQ ID NO:62之C端離胺酸殘基視情況不存在。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體，其包含如 SEQ ID NO:66所示之重鏈胺基酸序列；及如SEQ ID NO:67所示之輕鏈胺基酸序列，其限制條件為SEQ ID NO:66之C端離胺酸殘基視情況不存在。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體，其包含如 SEQIDNO:ll所示之重鏈胺基酸序列；及如SEQIDNO:78 所示之輕鏈胺基酸序列，其限制條件為SEQ ID ΝΟ:11之C 端離胺酸殘基視情況不存在。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結 合部分，其包含由以下編碼之VH鏈：（i)包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、 SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:53之核酸序列，或（ii)在高度 嚴格條件下與 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49 或 SEQ ID NO:53之 互補股雜交的核酸序列，其中該抗體或抗原結合部分特異 性結合骨橋蛋白。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結 合部分，其可與本文中所揭示之任何OPN抗體或抗原結合 部分競爭結合至OPN，及/或交叉競爭結合至OPN。舉例而 言，抗體或其抗原結合部分特異性結合至OPN且與選自 6990、6991及6993之單株抗體競爭結合至OPN，及/或交叉 競爭結合至OPN。在一態樣中，該經分離抗體為人類抗 150155.doc 201110982 體。在另一態樣中’該經分離抗體為人類化抗體。 在另一態樣中，提供一種經分離抗體或其抗原結合部 分’其結合於人類OPN上與本文中所揭示之任何抗體相同 的抗原決定基，及/或與該種抗體競爭結合至人類OPN。舉 例而言’抗體或其抗原結合部分特異性結合至OPN且結合 至人類OPN上與選自699〇 ' 6991及6993之單株抗體相同的 抗原決定基’及/或與選自6990、6991及6993之單株抗體 競爭結合至人類OPN。 本發明之另一態樣為一種經分離抗體或其抗原結合部 分’其包含作為人類VH 3-23基因產物的重鏈可變區或源自 於人類VH 3-23基因之重鏈可變區，其中該抗體特異性結合 OPN。 本發明之另一態樣為一種經分離單株抗體或其抗原結合 部分，其包含作為人類V]L λ34λ1_13基因產物的輕鏈可變 區或源自於人類λ3或λ1-13基因之輕鏈可變區，其中該 抗體特異性結合ΟΡΝ。 在另一態樣中’本發明提供一種包含本文所述之任何抗 體或其抗原結合部分連接於治療劑的免疫結合物。在一種 情況下，該治療劑為細胞毒素或放射性同位素。在另一態 樣中^本發明提供—種包含本文所述之任何免疫結合物及 邊藥干上可接文之載劑的組合物。本發明亦提供一種包含 抗體或其抗原結合部分連接於具有不同於該抗體或其抗原 〇 4刀之結合特異性的第二種功能性部分之雙特異性分 子0 I50155.doc •13- 201110982 在另一態樣中，本發明提供一種製備抗OPN抗體之方 法，其包含： (a) 提供：⑴包含選自由SEQ ID NO: 1、15及29組成之群 之H-CDR1序列、選自由SEQ ID NO:2、16及30組成之群之 H-CDR2序列及/或選自由SEQ ID N0:3、17及31組成之群 之H-CDR3序列的重鏈可變區抗體序列；及/或（丨丨）包含選自 由SEQ ID NO:4、18及32組成之群之L-CDR1序列、選自由 SEQ ID NO:5、19及33組成之群之L-CDR2序列及/或選自 由SEQ ID NO:6、20、34及75組成之群之L-CDR3序列的輕 鏈可變區抗體序列；及 (b) 將該抗體序列表現為蛋白質。 在另一態樣中’本發明提供一種製備抗OPN抗體之方 法，其包含： (a) 提供：⑴編碼包含選自由SEQ ID NO: 1、15及29組成 之群之H-CDR1序列、選自由SEq ID n〇:2、16及30組成之 群之H-CDR2序列及/或選自由SEq m n〇:3、17及31組成 之群之H-CDR3序列的重鏈可變區抗體序列之核酸序列； 及/或（ii)編碼包含選自由SEQ ID NO:4、18及32組成之群 之L-CDR1序列、選自由SEQ ID NO:5、19及33組成之群之 L-CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO:6、20、34及75組成 之群之L-CDR3序列的輕鏈可變區抗體序列之核酸序列； 及 (b) 表現該核酸序列以產生抗體或其抗原結合部分。 在另一態樣中’本發明提供一種製備抗OPN抗體之方 150155.doc -14· 201110982 法，其包含： (a) 提供：（i)包含選自由SEQ ID ΝΟ:1、15及29組成之群 之H-CDR1序列、選自由SEQ ID NO:2、16及30組成之群之 H-CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO:3、17及31組成之群 之H-CDR3序列的重鏈可變區抗體序列；及/或（ii)包含選自 由SEQ ID NO:4、18及32組成之群之L-CDR1序列、選自由 SEQ ID NO:5、19及33組成之群之L-CDR2序列及/或選自 由SEQ ID ΝΟ··6、20、34及75組成之群之L-CDR3序列的輕 鏈可變區抗體序列； (b) 改變該重鏈可變區抗體序列及/或該輕鏈可變區抗體 序列内之至少一個胺基酸殘基以建立至少一個經改變之抗 體序列；及 (c)將該經改變之抗體序列表現為蛋白質。 在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結 合部分，其包含由以下編碼之VL鏈： ' T · Λ __ _ ___ ___ _

部分特異性結合OPN。

:⑴包含SEQ ID

本文所述之任何抗體。 150155.doc 201110982 在另一態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼抗 體或其抗原結合部分之VH鏈，且該核酸包含（i)SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、 SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:53 ;或（ii)在高度嚴格條件下 與 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQIDNO:49或SEQIDNO:53之互補股雜交的核 酸序列；其中該抗體或抗原結合部分特異性結合OPN。 在另一態樣中，提供一種經分離核酸，其編碼抗體或其 抗原結合部分之Vl鏈，且該核酸包含（i)SEQ ID NO:10、 SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57 或 SEQ ID NO:77 ; 或（ii)在高度嚴格條件下與SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、 SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57 或 SEQ ID NO:77 之互補股 雜交的核酸序列；其中該抗體或抗原結合部分特異性結合 OPN。 在另一態樣中，本發明提供一種包含本文所述之任何核 酸的載體。在另一態樣中，本發明提供一種包含本文所述 之任何載體的宿主細胞。例如，該等宿主細胞可為細菌宿 主細胞或哺乳動物宿主細胞。 在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本 文所述之任何抗體或抗原結合部分、免疫結合物或雙特異 性分子及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 本發明進一步提供治療異常細胞生長之方法，其包含向 150155.doc •16- 201110982 有需要之個體投與有效量的本文所述之任何醫藥組合物。 本發明進-步提供減少個體之腫瘤細胞轉移的方法，苴包 含投與該個體有效量的本文所述之任何抗體、抗原結合部 分或醫藥組合物。 在另-態樣中，本發明提供—種本文所述之任何抗體、 抗原結合部分或醫藥組合物的用《，其係用於製造用以治 療有需要之個體之異常細胞生長的藥物。在另—態樣中， ^發明提供-種本文所述之任何抗體、抗原結合部分或醫 藥組合物的料’其係、用於製造用以治療有需要之個體之 腫瘤細胞轉移的藥物。 在另-態樣巾，本發明提供本文所述之抗體、抗原結合 部分或醫藥組合物用於治療有需要之個體的異常細胞生 長在另I、樣中，本發明提供本文所述之抗體、抗原結 合部分或醫藥組合物用於治療有需要之個體的腫瘤細胞轉 移。 在另—態樣中，本發明提供製備抗骨橋蛋白抗體或其抗 原、。刀之方法’其包含在本文所述之㈣宿主細胞中 表現該抗體或抗原結合部分。 在另-態樣中’本發明提供任何人類抗體或其抗原結合 部分’其中該等人類抗體或抗原結合部分為合成人類抗體 或抗原結合部分。 本發明進-步提供包含本文中所揭示之任何特定序列 (例如SEQ ID ΝΟ:1至42及44至69)之肽變異體的抗體或直 抗原結合部分。該等肽變異體可包括保守及非保守取代;、 150155.doc 17· 201110982 缺失及/或添加，且通常包括與本文中所揭示之任何特定 序列至少60%、至少65°/。、至少70%、至少75°/。、至少 80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少 91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的肽。 例如，在一態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗 原結合部分，其包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48 或 SEQ ID NO:52所示之VH鏈胺基酸序列或其肽變異體。在一態樣 中，該肽變異體包含對於SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48或 SEQ ID NO:52之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或1 5個保守取代或非保守取代及/或1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14或 15個添加及/或缺 失。在另一態樣中，該肽變異體與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48 或 SEQ ID NO:52至少 65%、至少 75%、至少 85%、至少 90%、 至少95°/。、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相 同，且其中該抗體或抗原結合部分特異性結合骨橋蛋白。

在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結 合部分，其包含如 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、 SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:76所示之VL鏈胺基酸序列或 其肽變異體。在一態樣中，該肽變異體包含對於SEQ ID 150155.doc •18- 201110982

NO:8、SEQ ID N〇:22、SEQ ID N〇:36、SEQ ID NO:46、 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56 或 SEQ ID NO:76之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15個保守取代或非保守取代及/或1、2、3、4、5、 6、7、8、9、1〇、^、η、b、14 或 15個添加及/或缺

失。在另一態樣中，該肽變異體與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID N〇:36、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、 SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56 或 SEQ ID NO:76至少 65%、 至少75%、至少85%、至少9〇%、至少95%、至少96%、至 J 97 /〇、至少98%或至少99%相同，且其中該抗體或抗原 結合部分特異性結合〇pN。 【實施方式】 本發明係基於以下發現：新穎抗體對骨橋蛋白具有高親 和力且可將治療益處傳遞給個體。可為人類抗體或人類化 抗體之本發明抗體可用於多種情形，其在本文中有更為全 面的描述。 為了可更容易地理解本發明，首先定義某些術語。貫穿 整個[實施方式]闡明其他定義。 示非本文另有疋義’否則結合本發明所使用之科學及技 術術語應具有-般熟習此項技術者通常所理解之含義。此 外’除非上下文另有要求’否則單數術語應包括複數且複 數術語應包括單數。—般而言’關於本文所述之細胞及組 織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白 質及核酸化學及雜交所用之命名以及本文所述之細胞及,且 150I55.doc •19· 201110982 織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白 質及核酸化學及雜交之技術為此項技術中熟知且常用之命 名及技術。 除非另作指示，否則本發明之方法及技術一般根據此項 技術中所熟知且如貫穿本說明書所引用及論述之各種一般 參考文獻及更特定之參考文獻中所述的方法來執行。該等 參考文獻包括例如 Sambrook 及 Russell，c/am«g， A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold

Spring Harbor，NY (2001) ; Ausubel等人，Cwrrewi /VoiocW in Mo/ecw/ar 价〇/〇幻;，John Wiley & Sons，NY (2002);以及

Harlow 及 Lane dj Cold

Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY (1990)。酶促反應及純化技術係根據製造商說明書，如此 項技術中通常所實現或如本文所述來執行。關於本文所述 之分析化學、合成有機化學及醫藥化學所用之命名以及本 文所述之分析化學、合成有機化學及醫藥化學之實驗室程 序與技術為此項技術中熟知且常用之命名及實驗室程序與 技術。使用標準技術來進行化學合成、化學分析、醫藥製 備、調配及傳遞、及治療患者。 如本文所用之以下各術語具有在此部分與其相關之含 義。 虺詞「一」在本文中用於指一個或一個以上（亦即至少 一個）該冠詞之語法目標《舉例而言，「一元件」意謂一個 元件或一個以上元件。 150155.doc -20- 201110982 本文中所使用之二十種習知胺基酸及其縮寫沿用習知用 法。參見W職⑽/〇(第2版，E. S. Golub及D. R. Gren編，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (:1991))。 如本文中所提及之術語「抗體」包括完整抗體及其任何 抗原結合片段（亦即「抗原結合部分」）或單鏈。抗體係指 包含藉由二硫鍵相互連接之至少兩個重（H)鏈及兩個輕（L) 鏈的酿蛋白、或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區 (本文中縮寫為Vh)及重鍵怪定區。重鍵怪定區包含三個结 構域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（本文縮 寫為Vl)及輕鏈恆定區。輕鏈悝定區包含一個結構域cl。 VH及VL區可進一步再分為高變區（稱作互補決定區 (CDR)) ’其間散佈有較保守之區域（稱作構架區（FR))。可 使用Kabat或Chothia編號系統來確定CDR區，兩種系統皆 為熟習此項技術者所熟知。參見例如Kabat，Ε· A.等人， (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest >

第五版，U.S. Department of Health and Human Services， NIH出版物第 91-3242 號；Chothia 及 Lesk,丄 Mo/. βί·〇/ 196:901-917 (1987)。每一 VH 及 VL係由三個 CDR及四個 FR 構成，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明通篇 中’重鍵之二個CDR被稱為H-CDR1、H-CDR2及H_ CDR3。類似地，輕鏈之三個CDR被稱為L-CDR1、L-CDR2 及L-CDR3。重鏈及輕鏈之可變區含有可與抗原相互作用 的結合域。抗體之恒定區可介導免疫球蛋白與包括免疫系 150155.doc 21 - 201110982 統之多種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第—組份 (Clq)的宿主組織或因子結合。在輕鏈及重鍵内，藉由具有 約12個或12個以上胺基酸之「j」區來連接可變區及悝定 區’其中重鏈亦包括具有約1 〇個或10個以上胺基酸之 「D」區。一般參見Fundamental Immunology 第 7章（paui W.編，第 2版。Raven Press, N.Y. (1989))。 「人類」抗體或其抗原結合部分據此被定義為並非為嵌 合（例如非「人類化」）且並非來自（無論整體或部分）非人 類物種之抗體。人類抗體或抗原結合部分可源自人類或可 為合成人類抗體。「合成人類抗體」在本文中被定義為具 有完全或部分地經由電腦模擬源自基於對已知人類抗體序 列分析之合成序列之序列的抗體。人類抗體序列或其片段 之電腦模擬設計可例如藉由分析人類抗體或抗體片段序列 之資料庫及利用自其獲得之資料設計多肽序列而達成。人 類抗體或抗原結合部分之另一實例為由自源於人類之抗體 序列文庫（亦即，該文庫基於取自人類天然源之抗體）分離 的核酸所編碼之抗體或抗原結合部分。 「人類化抗體」或其抗原結合部分在本文中被定義為⑴ 源自非人類源（例如攜帶異源免疫系統之轉殖基因小鼠）之 抗體或其抗原結合部分，該抗體係基於人類生殖系序列； 或（ii)欲合抗體或其抗原結合部分，其中可變域源自非人 類來源且恆定域源自人類來源；或（iii)CDR移植抗體或其 抗原結合部分，其中可變域之CDR來自非人類來源而可 變域之一或多個構架來自人類來源且恆定域（若存在時）來 150155.doc -22· 201110982 自人類來源。在CDR移植自非人類來源的情況下，該等 CDR可隨後經改變以便改良對相關標靶的結合親和力。 由於結合特異性並非為絕對性質而為相對性質，因此若 :-抗體能夠區別某一抗原(在本文中為骨橋蛋白)與一或 多個參考抗原，則如本文所用，該抗體「特異性纟士人」、 「特異性結合至」、「特異於」或「特異性識別:二。 $其最普通的形式中（且當未提及確定之參考時），「特異性 結合」係指抗體區別相關抗原與無關抗原之能力，其如例 如根據以下方法之一測定。該等方法包含(但不限於)西方 墨點法、EUSA-、RIA·、ECL_、IRMA_測試及肽掃描。例 如可進行標準ELISA檢定。可藉由標準顯色（例如二級抗體 與辣根過氧化物及四甲基聯苯胺與過氧化氯）進行記分。 在特定孔内之反應係根據例如在45〇㈣下之光密度記分。 典型背景（=陰性反應）可為(M 〇D;典型陽性反應可為ι ⑽。此意謂陽性/陰性差異可超過1〇倍。通常，結合特異 性之測定並非藉由使用單一參考抗原來進行，而是藉由使 用-組約三至五個無關抗原來進行，諸如奶粉、BSA、轉 鐵蛋白或其類似物。如以上所用，不同種類之相應抗原被 視為「相關」’且因而並非「無關」。例如，除非另外指 月否則將本文所述之結合鼠類〇pN與人類〇pN兩者之抗 體或抗原結合部分視為「特異性結合」於晴，其限制條 件為該抗體或抗原結合部分衫結合*上所狀「無關」 抗原。通常，特異性或選擇性反應將至少兩倍於背景信號 或雜訊且更通常超過背景1G倍，更特定而言，當平衡解離 15〇155.d0( -23· 201110982 常數（Kd)9 μΜ，例如S100 nM及更例如$10 nM時，抗體 被認為「特異性結合」抗原。 如本文所用之術語「k。。」意欲指特定抗體-抗原相互作 用之締合速率’而如本文所用之術語「Κοκ」意欲指特定 杬體-杬原相互作用之解離速率。如本文所用之術語 kd」意指解離常數，其係自k。"與u之比率（亦即 koff/kd獲彳于且以莫耳濃度（M)表示。抗體之值可使用此 項技術中充分確立之方法來測定。一種測定抗體Kd之方法 係藉由使用表面電漿子共振，通常使用生物感應器系統 (諸如Biacore®系統）來進行。 如本文中關於抗體所用之術語「競爭」係指當第一抗體 或其抗原結合部分與第二抗體或其抗原結合部分競爭結合 時第抗體與其同源抗原決定基之結合在第二抗體的存 在下相較於在不存在第二抗體的情況下第一抗體之結合可 偵測出有減少。或者，在第一抗體存在下，第二抗體與其 抗原決疋基之結合亦可彳貞測出有減少，其可（但無須）為一 種情況《亦即，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基 結合，而第二抗體不抑制第一抗體與其相應抗原決定基結 合。然而，當各抗體可經偵測出在相同、較大抑或較小程 度上抑制另一抗體與其同源抗原決定基或配位體結合時， 該等抗體被認為彼此「交又競爭」與其相應抗原決定基之 結合。舉例而言’交叉競爭抗體可結合於如本文中所揭示 之抗體所結合的抗原決定基或該抗原決定基之一部分。競 爭抗體與交叉競爭抗體兩者之使用涵蓋於本發明中。不考 150155.doc •24· 201110982 慮該競爭或交叉競爭發生之機制（例如位阻、構型變化、 或與常見抗原決定基或其部分之結合及其類似機制），熟 習此項技術者基於本文中所提供之教示應瞭解，該等競爭 及/或交又競爭抗體涵蓋於本文中且可適用於本文中所揭 示之方法。 同樣，如本文所用之「免疫球蛋白」（Ig)被定義為屬於 類別或同型IgG、IgM、IgE、IgA或IgD(或其任何子類）之 蛋白處，且包括所有習知抗體及其抗原結合部分。 如本文所用之「同型」或「類別」係指由重鏈恆定區基 因編碼之抗體類別（例如IgM* IgG) ^抗體之恆定域並不涉 及與抗原結合，但展現多種效應功能。視重鏈恆定區之胺 基酸序列而定，既定人類抗體或免疫球蛋白可歸屬於以下 五種主要免疫球蛋白類別之一：IgA、IgD、IgE、IgG及

IgM。不同類別的免疫球蛋白之結構及三維構型為熟知 的。在多種人類免疫球蛋白類別中，僅已知人類IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4及IgM可活化補體。已知人類匕⑴及 IgG3可介導人類中之ADCC。 如本文所用之「子類」係指重鏈恆定區基因同型内之進 一步分類，諸如IgG同型内之1§(}1、[gG2、匕⑺或“以子 類。 術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合免疫球蛋白或 T細胞受體的任何蛋白質決定子。抗原決定部位決定子通 常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子之化學活性表面群組成， 且通常具有特定三維結構特徵及特定電荷特徵。構形抗原 150155.doc -25· 201110982 決定基及非構形抗原決定基之區別在於在變性溶劑存在下 與前者（而非後者）之結合消失。 如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」（或簡稱 「抗體部分」）係指保留與抗原（例如〇PN)特異性結合之能 力的抗體之一或多個片段。已展示抗體之抗原結合功能可 由全長抗體之片段來執行。術語抗體之「抗原結合部分」 内所包含之結合片段之實例包括：（i)Fab片段：由vL、 Vh、CL及CHI結構域組成之單價片段；（u)F(abi)d段：包 含藉由位於鉸鏈區之二硫橋鍵所連接之兩個Fab片段之二. 價片段；（iii)由νΗ及CH1結構域組成之Fd片段；（iv)由抗體 單臂之vL及vH結構域組成之Fv片段；（幻由Vh結構域組成 之 dAb 片段（Ward 等人，iVaiwre 341:544-546 (1989));及 (vi)經分離之互補決定區（cdr)。此外，儘管fv片段之兩 個域（VL及VH)係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉 由使其能夠製備為VL及VH區配對以形成單價分子之單一蛋 白質鏈（稱為單鏈Fv(scFv))的合成連接子接合。該等單鏈 抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」内。該等 抗體片段可使用任何適當技術來獲得，包括熟習此項技術 者已知之習知技術，且可以與完整抗體相同之方式在效用 方面篩選該等片段。 如本文所用之「經分離抗體」意指實質上不含具有不同 抗原特異性之其他抗體的抗體（例如特異性結合OPN之經 分離抗體實質上不含特異性結合除OPN以外之抗原的抗 體）。然而’特異性結合OPN之經分離抗體可對其他抗原 150155.doc -26 · 201110982 (諸如來自其他物種之⑽分子）具有交叉反應性。此外， 經分離抗體可實質上*含其他細胞物質及/或化學物質。 如本文中所用，術語「單株抗體」或「單株抗體組份」 係指單-分子組份之抗體分子的製劑。單株抗體組份顯示 對於特定抗原決定基之單_結合特異性及親和力。 如本文所用之術語「重組人類抗體」包括所有經由重組 方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如⑷自人類 免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物（例如小鼠）或 由其製備之融合瘤分離之抗體（進一步描述於下文），由 經轉型以表現人類抗體之宿主細胞（例如由轉染瘤）分離之 抗體，（C)由重組組合人類抗體文庫分離之抗體及（d)經 由包含人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接之任 何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人 類抗體具有其中構架區及CDR區源自於人類生殖系免疫球 蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，該等重組性 人類抗體可接受活體外誘變（或當使用人_Ig序列之動物轉 殖基因抗體時，則為活體内體細胞誘變），因此重組性抗 體之νΗ及VL區之胺基酸序列雖然源自人類生殖系Vh及 序列且與人類生殖系\^及vL序列相關，但其可能不會天然 存在於活體内之人類抗體生殖系所有組成部分内。 如本文所用，兩種多肽序列間之「序列一致性」表示兩 序列間相同胺基酸的百分比。可照慣例使用諸如]3estfit、 FASTA或BLAST之已知電腦程式確定多肽的胺基酸序列一 致性（參見例如Pearson，MeAoA心叮卿/. 183:63-98 150155.doc -27· 201110982 (1990) ； Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)； Altschul等人，j. Mo/· 5z〇/· 215:403-410 (1990) ; Altschul 專 k ’ Nucelic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))。當使用 Bestfit或任何其他序列對準程式來測定特定序列是否（例 如）與參考胺基酸序列具有95%—致性時，需設定參數，以 便計算參考胺基酸序列之全長度之一致性百分比，且允許 同源性缺口占參考序列中胺基酸殘基總數之至多5%。該 上述測定多肽間一致性百分比之方法適用於本文中所揭示 之所有蛋白質、片段或其變異體。 「糖型（Glycoform)」係指包含多種碳水化合物單元之鍵 結的複雜寡II結構。該等結構描述於例如五“π如心 幻;，Varki等人編，Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY (1999)中，其亦提供標準糖 生物學命名法之綜述。該等糖型包括（但不限於）G2、G1、 GO、G-1及G-2。（參見例如國際專利公開案第w〇 99/ 22764號）。 「糖基化型態」之定義為共價連接至蛋白質（例如糖型） 及共價連接至糖型與蛋白質之肽主鏈共價連接之位點之碳 水化合物單元，更特定言之共價連接至免疫球蛋白的碳水 化合物單元型態。由不同細胞株或在轉殖基因動物中表現 之抗體彼此之間可能具有不同糖型及/或糖基化型態。然 而，由本文提供之核酸分子編碼之抗體或包含本文提供之 胺基酸序列的所有抗體仍為本發明之一部分，而與該等抗 體之糖基化無關。 I50l55.doc -28- 201110982 如本文中所用，術語「個體」包括任何人 類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎 或非人 ㈣物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、羊=哺 貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。 如本文中關於特定疾病病狀所用之術語「治療」意謂降 低個體經歷疾病症狀（亦即腫瘤生長及/或轉移’或由免疫 細胞之數目及/或活動所介導之其他效應及其類似症狀）= 出現頻率。此術語包括投與本發明之化合物或藥劑來預防 或延遲疾病之症狀、併發症或生物化學指標之出現，或減 輕症狀或阻止或抑制疾病、病狀或病症之進一步發展。户 療可為預防性（預防或延遲疾病之發作、或預防其臨床或 亞臨床症狀之顯現）或在疾病顯現之後治療性抑制或減輕 症狀。 如本文中所用之術語「化合物」或Γ醫藥化合物」包括 抗體、其抗原結合部分、免疫結合物及雙特異性分子。 本發明之抗體 本發明之抗體可源自重組抗體文庫，其係基於已經由電 腦模擬設計且藉由合成形成之核酸編碼之胺基酸序列。抗 體序列之電腦模擬設計係例如藉由分析人類序列資料庫且 利用自其所得資料設計多肽序列而達成。設計及獲得經由 電腦模擬建立之序列的方法摇述於以下文獻中··例如 Knappik等人，乂 Μο/· (2000) 296:57 ; Krebs等人，·/. immwnoi. Mei/jods· (2001) 254:67;及頒予 Knappik 等人之 美國專利第6,300,064號。 150155.doc -29- 201110982 貫穿本發明，提及以下本發明之代表性抗體：MOR-6990(6990)、MOR-6991 (6991) ' MOR-6993(6993)及 MOR-10475(10475)。如實例5中進一步所述，6990表示具有對應 於SEQ ID NO:7之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO:8之可 變輕鏈區的抗體；6991表示具有對應於SEQ ID NO:21之可 變重鏈區及對應於SEQ ID NO:22之可變輕鏈區的抗體；且 6993表示具有對應於SEQ ID NO:35之可變重鏈區及對應於 SEQ ID NO:36之可變輕鏈區的抗體。10475表示具有對應 於SEQ ID NO:7之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO:76之可 變輕鏈區的抗體。 6990、6991、6993及10475代表性抗體之胺基酸CDR序 列展示於下表1中。 表1 :抗體6990、6991及6993之CDR序列 H-CDR1 ： SNYVMH (SE〇 ID ΝΟ:1) H-CDR2 ： SIFGSGSDTYYADSVKG (SE〇 ID NO:2) MOR-6990 H-CDR3 ： RSASSGFGFAGYGIDS (SE〇 ID NO:3) L-CDR1 ： SGDSLRYYYAH (SE〇 ID NO:4) L-CDR2 ： DDNKRPS (SE〇 IDNO:5) L-CDR3 ： QSWDLFHSSV (SEQ ID NO:6) H-CDR1 ： NNYAVS (SEQ ID NO: 15) H-CDR2 ： GISYGGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 16) MOR-6991 H-CDR3 ： RTIGGDFDH (SEQ ID NO: 17) L-CDR1 ： SGSSSNIGSNYVN (SEQ ID NO: 18) L-CDR2 ： GNSKRPS (SEQ ID NO: 19) L-CDR3 ： QSFTQMLLV (SE〇 ID NO:20) MOR-6993 H-CDR1 : TTSSMH (SE〇 ID NO:29) H-CDR2 ： RISSHGSNTYYADSVKG (SE〇 ID NO:30) H-CDR3 : RDMYRGVYGFAL (SE〇 ID NO:31) 150155.doc -30- 201110982 L-CDR1 ： SGDAIRNYYVH (SEQ ID NO:32) L-CDR2 ： EDSDRPS (SEQ ID NO:33) L-CDR3 ： QSYDKSNW (SEQ ID NO:34) H-CDR1 ： SNYVMH (SEQ ID NO: 1) H-CDR2 ： SIFGSGSDTYYADSVKG (SEQ ID N0:2) MOR-10475 H-CDR3 : RSASSGFGFAGYGIDS (SEQ ID N0:3) L-CDR1 : SGDSLRYYYAH (SEQ ID N0:4) L-CDR2 ： DDNKRPS (SEQ ID N0:5) L-CDR3 ： QAWDLINSHV (SEQ ID NO:75) 在一態樣中，本發明提供具有可特異性結合於人類骨橋 蛋白之一或多個區域或對人類骨橋蛋白之一或多個區域具 有高親和力的抗原結合區之抗體，其胺基酸序列展示於 SEQ ID NO:43中及圖3中。若親和力量測值為至少100 nM(Fab片段之單價親和力），則抗體被認為具有「高親和 力」。本發明之抗體或抗原結合部分與人類骨橋蛋白結合 之親和力通常為約小於500 nM，例如小於約1 00 nM、小於 約60 nM、小於約30 nM、小於約1 0 nM、或小於約3 nM。 本發明之例示性抗體及其對骨橋蛋白之相應結合親和力進 一步描述於本文實例2及3中。 本發明亦提供抗體相對於骨橋蛋白之CDR部分（包括 Chothia及Kabat CDR)。CDR區之測定完全屬於此項技術之 技能。應瞭解，在一些實施例中，CDR可為Kabat CDR及 Chothia CDR(亦稱為「組合CDR」或「擴展CDR」）之組 合。在一些實施例中，CDR為Kabat CDR。在其他實施例 中，CDR為Chothia CDR。換言之，在具有一種以上CDR 之實施例中，CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR、組合 150155.doc -31 - 201110982 CDR或其組合中之任一者。 本發明之抗體可具有與人類及至少一種其他物種（其可 為鼠類或大鼠）之物種交叉反應性。與至少一種骨橋蛋白 物種父叉反應之抗體例如對於在具有相同抗體之多種物種 内進行活體内研究的目的，可提供優於已知抗骨 體之更大靈活性與益處。 ' 較佳的是，本發明之抗體不僅能夠結合於〇pN，而且能 夠減少腫瘤細胞轉移及/或減少異常細胞生長，諸如癌 症。 具有特定生殖系序列之抗體 在某些態樣中，本發明之抗體包含來自特定生殖系重鏈 免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定生殖系輕鍵 免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。 例如，在一態樣中，本發明提供一種經分離單株抗體或 其抗原結合部分’其包含作為人類Vh3_23基因產物的重鍵 可變區或源自於人類VH 3-23基因之重鏈可變區，其中該抗 體特異性結合OPN。在另-態樣甲，本發明提供一種經分 離單株抗體或其抗原結合部分，其包含作為人類Vl ^或 λΜ3基因產物之輕鏈可變區或源自於人類人3或人1_13基 因之輕鏈可變區，其中該抗體特異性結合〇pN。在另一例 示性態樣中，本發明提供一種經分離單株抗體或其抗原結 合部分，其中該抗體： (a)包含作為人類Vh 3-23基因產物的重鏈可變區或源自 於人類VH 3-23基因之重鏈可變區（該基因編碼seq⑴ 150155.doc ·32· 201110982 NO:7、21及35所示之胺基酸序列）； (b) 包含作為人類VL λ3或λ1-13基因產物之輕鏈可變區或 源自於人類VL λ3或λ 1 -13基因之輕鏈可變區（該等基因分別 編碼SEQ ID NO: 8、36或22所示之胺基酸序列）；及 (c) 特異性結合於OPN，較佳特異性結合於人類〇PN。 分別具有VH 3-23之VH及VL λ3之乂1的抗體之實例為699〇 及6993。分別具有Vh 3-23之VH及VL λ1-13之VL的抗體之實 例為6991。 如本文中所用’人類抗體包含重鏈可變區或輕鏈可變 & ’其為特疋生殖糸序列「之產物」或「源自於」特定生 殖系序列，其條件為該抗體之可變區係獲自使用人類生殖 系免疫球蛋白基因之系統。該等系統包括以相關抗原來使 帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫，或以相關 抗原來篩選.在噬菌體上呈現之人類免疫球蛋白基因文庫。 為人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「源自於」人 類生殖系免疫球蛋白序列的人類抗體可因而藉由將該人類 抗體之胺基駿序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列 相比較，及選擇在序列上最接近（亦即最大一致性％)該人 類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。為特 定人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「源自於」其 的人類抗體與該生殖系序列相比較可含有胺基酸差異此 係歸因於例如天然存在之體細胞突變或定點突變之意向弓丨 入。然而，選定之人類抗體通常與由人類生殖系免疫球蛋 白基因編碼之胺基酸序列至少9〇% 一致，且含有當與其他 150155.doc -33· 201110982 物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列（例如，鼠類生殖系 序列）相比較時識別該人類抗體為人類抗體的胺基酸殘 基。在某些情況下’人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系 免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少95%，或甚至至少 96°/。、97%、98%或99°/。一致。在某些情況下，人類抗體之 胺基酸序列與由生殖系Ig基因編碼之胺基酸序列一致。通 常’源自於特定人類生殖系序列之人類抗體與由人類生殖 系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列將呈現不超過丨〇個胺 基酸之差異。在某些情況下，人類抗體與由生殖系免疫球 蛋白基因編碼之胺基酸序列可呈現不超過5個，或甚至不 超過4個、3個、2個或1個胺基酸之差異。 與本發明之抗體結合相同抗原決定基之抗體 在另一態樣中，本發明提供與本發明之任何例示性〇pN 單株抗體結合於人類OPN上相同的抗原決定基之抗體（亦 即柷體具有與本發明之任何單株抗體交叉競爭結合於OPN 的能力）。舉例而言，用於交又競爭研究之參考抗體可為 單株抗體699〇(具有分別如SEQ ID NO:7及8所示之Vh&Vl 序列）、或單株抗體6991(具有分別如SEQ m n〇:21&22所 示之vL序列）' 或單株抗體6993(具有分別如⑴ N0.3 5及36所不之％及％序％ )。#交叉競爭抗體可在 t準ΟΡΝ結合檢;^中基於其與699()、州交叉競爭 的月t*力來鑑疋。例如’ ΒΙΑ_分析、elisa檢定或流動式 細胞測量術可用於證明與本發明之例示性抗體的交叉競 ^丨式抗體抑制例如6990、6991或6993與人類OPN結合 150155.doc •34- 201110982 之能力證明該測試抗體可與6 9 9 Ο、6 9 91或6 9 9 3競爭結合於 人類ΟΡΝ且因而與6990、6991或6993結合於人類ΟΡΝ上相 同的抗原決定基。在一種情況中，與699〇、6991或6993結 合於人類ΟΡΝ上相同的抗原決定基之抗體為人類單株抗 體。該等人類單株抗體可如實例中所述來製備及分離。 抗體變異體 本發明之抗體並不限於本文所提供之特定肽序列。相 反本發明亦k供此專多肽之變異體。參考本發明之揭示 内容與習知可用技術及參考文獻，熟習此項技術者將能製 備、測試及利用本文中所揭示之抗體的功能.性變異體，同 時應瞭解，具有特異性結合於〇PNi能力的變異體屬於本 發明之範缚内。 如本文中所使用之術語「肽變異體」或「抗體變異體」 涵蓋保守及非保守取代、添加及缺失，且可包括例如與本 文中所揭不之肽序列相比具有至少一個經改變之cdr(高 又）域/位置及/或構架（FR)(可變）域/位置之抗體。例如，在 此項技術中眾所周知，抗體之抗原結合部位係由一或多個 CDR所形成，而FR區提供CDR之結構構架且因此在抗原結 合中起重要作用。藉由改變（：]〇尺或1711區中之一或多個胺基 馱殘基，热習此項技術者可以常規方式產生已突變或多樣 化的抗體序列，該等抗體序列可例如為了獲得新穎或改良 性質而針對抗原進行筛選。 圖1及2展示本發明某些抗體之^及乂序列，其中藉由 加下劃線指出CDR區。熟習此項技術者可使用本文所述之 】5〇】55.doc -35- 201110982 序列資訊來設計屬於本發明範疇内之肽變異體。例如，變 異體可藉由改變一或多個CDR區内之胺基酸來建構；變異 體亦可能具有一或多個經改變之構架區。例如，肽FR域可 能在與生殖系序列相比在殘基中存在偏差的地方進行改 變° 為確定改變哪些胺基酸殘基，熟習此項技術者可使用例 如由Knappik等人，·/· Mo/·价〇/. 296:57 (2000)及美國專利 第6,3 00,064號所述之程序來比較本文中所揭示之胺基酸序 列與該等抗體相同類別之已知序列。 舉例而言，變異體可藉由使一或多個CDR中之一或多個 胺基酸殘基多樣化且藉由篩選所得抗體變異體集合中具有 改良性質之變異體來獲得。尤其較佳為L-CDR3、H-CDR3、L-CDR1及/或H-CDR2中一或多個胺基酸殘基的多 樣化。可藉由使用三核苷酸誘變（TRIM)技術合成DNA分子 的集合來進行多樣化（Virnekas等人，dcWi及认 22:5600 (1994))。例如 ’ MOR-10475係藉由使MOR-6990 之 L-CDR3中的胺基酸多樣化來獲得。 保守性胺基酸取代 可使多肽變異體保留本文所述之抗體肽序列的整體分子 結構。利用個別胺基酸的性質，熟習此項技術者將識別某 些合理之取代。保守胺基酸取代可在例如所涉及之殘基之 極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩性性質相 似的基礎上進行。 例如’（a)非極性（疏水性）胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、 150155.doc -36- 201110982 異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及曱硫胺 酸’（b)極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸 '半 胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸；（c)正電荷（鹼 性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；及（句負電荷（酸 性）胺基酸包括天冬胺酸及麵胺酸。通常’取代可在群（a)_ (d)中進行。此外，甘胺酸與脯胺酸可基於其分裂α螺旋之 能力彼此取代。同樣’某些胺基酸，諸如丙胺酸、半胱胺 酸、白胺酸、曱硫胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸及離 胺酸更通常發現於α螺旋中，而纈胺酸、異白胺酸、笨丙 胺酸、酪胺酸、色胺酸及蘇胺酸更通常發現於β摺疊甲。 甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸及脯胺酸通常發 現於翻轉中。可在以下群中進行某些較佳取代：（i)s及Τ ; (ii)P及G ;及（iii)A、V、L及I。利用已知遺傳密碼子及重 組與合成DNA技術’熟習此項技術之科學家可易於建構編 碼保守胺基酸變異體之DNA。 經工程化及修飾之抗體 本發明之抗體或其抗原結合部分可使用具有本文所示之 VH序列及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質以 使經修飾之抗體工程化來製備，該經修飾之抗體可具有與 起始抗體不同之特性。抗體可藉由修飾一或多個在一種或 兩種可變區（意即，VH及/或VL)内，例如在一或多個CDR區 内及/或在一或多個構架區内之殘基來工程化。或者或另 外’抗體可藉由修飾在恆定區内之殘基例如以改變該抗體 之效應功能來工程化。 150155.doc •37· 201110982 可進行之一種類型之可變區工程化為CDR移植。抗體主 要經由位於六個重鍵互補決定區（CDR)及輕鏈互補決定區 内之胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。為此，在個別抗體 之間’ CDR内之胺基酸序列比CDR外之序列差異更大。由 於CDR序列負責多數抗體-抗原相互作用，因此可能藉由 構築包括移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列 上的來自特異性天然存在之抗體之CDR序列的表現載體來 表現模仿特異性天然存在之抗體之特性的重組抗體（參見 m -ka Riechmann, L.等人，Nature 332:323-327 (1998)； Jones, P.等人，iVaiwre 321:522-525 (1986) ; Queen, C.等 A 5 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033 (1989)； 美國專利第5,225,539號及美國專利第5,530，101號、第 5,585,089號、第 5,693,762號及第 6，180,370號）。 因此，本發明之另一態樣係關於含有單株抗體6990、 6991及6993之Vh及Vl CDR序列，然而仍可能含有來自該 等抗體之不同構架序列的經分離抗體或其抗原結合部分。 可自包括生殖系抗體基因序列之公開DNA資料庫或已出 版文獻獲得此等構架序列。例如，人類重鏈及輕鏈可變區 基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列 資料庫（Kabat，Ε· A_ 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S_ Department of Health and Human Services，NIH 出版物第 91-3242 號 (1991) ; Tomlinson，I. M.等人，/. Μσ/. 5ί·ο/. 227:776-798 (1992) ;及 Cox，J. Ρ· L.等人，«/. /ww⑽〇/· 24:827-836 150155.doc -38· 201110982 (1994))。作為另一實例，人類重鏈及輕鍵可變區基因之生 殖系DNA序列可見於Genbank資料庫。 用於本發明抗體之構架序列包括（但不限於）在結構上類 似於本發明所選抗體使用之構架序列，例如類似於本發明 例示性抗體使用之VH 3-23構架序列及/或VL λ3或λ1-13構 架序列的彼等構架序列。例如，H-CDR1、H-CDR2與Η-CDR3序列及L_CDR1、L_CDR2與L_CDR3序列可移植於具 有與構架序列所源自之生殖系免疫球蛋白基因中所發現之 相同序列的構架區上，或該等CDR序列可移植於相較於生 殖系序列含有一或多個突變的構架區上。例如，已發現， 在某些情況下，使構架區内之殘基突變以保持或增強該抗 體之抗原結合能力為有益的（參見例如美國專利第 5,530，101 號、第 5 585,〇89 號、第 5,693,762 號及第 6，180,370號）。 另一類變異體為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3 區内之胺基酸殘基突變以由此改良相關抗體之一或多種結 合特性（例如親和力）。可進行定點突變誘發或PCR介導之 突變誘發以引入突變，且對抗體結合或其他受關注之功能 特性之影響可以如本文中所述及實例中所提供之活體外或 活體内檢定來評估。通常引入保守取代（如以上所討論）。 該等突變可為胺基酸添加及/或缺失。此外，通常CDR區 内不超過1個、2個、3個、4個或5個殘基發生改變。 本發明之工程化抗體包括已對vH及/或vl内之構架殘基 進行修飾（例如，以改良抗體特性）之彼等抗體。通常修飾 150155.doc 39· 201110982 s亥等構架變異體以降低該抗體之免疫原性。舉例而言，一 種方法為使一或多個構架殘基「回復突變（backmutate)」 成相應生殖系序列。更特定言之，已接受體細胞突變之抗 體可含有與該抗體所源自之生殖系序列不同的構架殘基。 §亥等殘基可藉由將該等抗體構架序列與該抗體所源自之生 殖系序列相比較來鑑別。為使該等構架區序列回復至其生 殖系構型，可藉由例如定點突變誘發或pCR介導之突變誘 發來使體細胞突變「回復突變」成生殖系序列。本發明之 右干OPN抗體如實例6中進一步所述經歷該等「回復突 變」而回復至特定生殖系序列。 另一類構架修飾包含使該構架區内，或甚至一或多個 CDR區内之一或多個殘基突變以去除τ細胞抗原決定基， 由此降低該抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免 疫」’且進一步詳細描述於美國專利公開案第 0153043號中。 為了產生工程化抗體，並非必需實際上製備（亦即表現 為蛋白質）具有本文中所提供之^^及/或、序列中之一或多 者，或其一或多個CDR區的抗體。相反地，該等序列中所 含有之資訊可用作起始物質以產生源自於原始序列之「第 二代」序列，且隨後製備「第二代」序列且表現為蛋白 質。標準分子生物學技術可用以製備及表現經改變之抗 體。經改變之抗體序列較佳為一種保留本文所述之〇pN抗 體的一種、一些或全部功能特性之抗體序列。經改變之抗 體的功能特性可使用此項技術中可用及/或本文中所述之 150155.doc •40. 201110982 標準檢定’諸如實例中所述之彼等標準檢定來評定。 在使本發明之抗體工程化之方法的某些態樣中，可沿所 有或部分OPN抗體編碼序列隨機或選擇性地引入突變，且 可對所得經修飾之OPN抗體就如本文中所述之結合活性及/ 或其他功能特性而言進行篩選。突變方法已於此項技術中 加以描述。舉例而言，PCT公開案WO 02/092780描述使用 飽和誘變、合成接合組裝或其組合產生及篩選抗體突變之 方法。或者，PCT公開案wo 03/074679描述使用計算篩選 法來優化抗體生理化學特性之方法。 除構架區或CDR區内所作之修飾以外，或取而代之，本 發明之杬體可經工程化以包括F c區内之修飾，通常為改變 該抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結 σ、Fc爻體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發 月之抗體可經化學修飾（例如，可將一或多個化學部分附 接於抗體上）或經修飾以改變其糖基化型態，再改變該抗 體之-或多種功能特性。以下進—步詳細描述此等態樣中 每者Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引之編號。 在種障况中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得該鉸鏈區中 之半胱胺酸殘基數目得以改變，例如增加或減少。該方法 進y描述於美國專利第5,677,425號中。⑶1絞鏈區中半 安夂殘基之數目經改變以例如有助於輕鏈與重鏈之組裝 或增加或降低抗體之穩定性。 在另It况中，抗體之Fe^鏈區經突變以減少該抗體之 物半衰期。更特定言之，將—或多種胺基酸突變引入& 150155.doc 41 201110982 鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區，使得該抗體所具有的葡萄 球菌蛋白protein A)(SpA)結合相對於原 生Fc鉸鏈域SpA結合削弱。該方法進一步詳述於美國專利 第 6，165,745號中。 在另一種情況中，該抗體經修飾以增加其生物半衰期。 多種方法均可行。例如，可如美國專利第6,277,375號中所 述引入以下一或多個突變：T252L、T254S、T256F。或 者，為增加生物半衰期，可如美國專利第5,869,〇46號及第 6，121，022號中所述，在〇：^11或(：[區内改變抗體以含有獲自 IgG Fc區CH2域之兩環的救助受體結合抗原決定基。 在其他情況中，藉由以不同胺基酸殘基置換至少一個胺 基k殘基來改變F c區以改變抗體之效應功能。例如，選自 胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及 322之 一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體對於 效應配位體具有經改變之親和力，但保留親本抗體之抗原 結合能力。改變親和力所針對之效應配位體可為例如以受 體或補體之C1組份。該方法進一步詳述於美國專利第 5,624,821 號及第 5,648,260號中。 在另一情況中，可以不同胺基酸殘基置換選自胺基酸殘 基329、33 1及322之一或多種胺基酸，以便使抗體具有改 變之Clq結合及/或減弱或消除之補體依賴細胞毒性 (CDC)。該方法進一步詳述於美國專利第6，194 551號中。 在另一實例中’胺基酸位置231及239内之一或多個胺基 酸殘基經改變以由此改變抗體固定補體之能力。該方法進 150155.doc -42- 201110982 一步描述於PCT公開案WO 94/2935 1中。 在另一實例中，修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴型細 胞毒性（ADCC)之能力及/或藉由修飾以下位置之一或多個 胺基酸來增加抗體對於Fey受體之親和力：23 8、239、 248 、 249 、 252 、 254 、 255 、 256 、 258 、 265 、 267 ' 268 、 269 ' 270 ' 272 ' 276 、 278 、 280 、 283 、 285 、 286 ' 289 、 290 、 292 、 293 ' 294 、 295 、 296 、 298 、 301 、 303 、 305 、 307 ' 309 ' 312 ' 315 ' 320 ' 322 ' 324 、 326 、 327 、 329 、 330 、 331 、 333 ' 334 、 335 、 337 、 338 ' 340 、 360 、 373 、 376 、 378 、 382 、 388 ' 389 、 398 、 414 、 416 、 419 、 430 、 434、43 5 ' 437、43 8或439。該方法進一步描述於PCT公 開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgGl上對於 FcyRl、FcyRII、FcyRIII及FcRn之結合位點且已描述具有 改良結合之變異體（參見Shields等人，J. β!·οί· C心m. 276:6591-6604 (2001)) ° 在位置 256、290、298、333、334 及339處之特異性突變經顯示可改良與FcyRIII之結合。另 外，已顯示以下組合突變體改良FcyRIII結合.：T256A/ S298A、S298A/E333A、S298A/K224A 及 S298A/E333A/ K334A。 在又一實例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可製 備無糖基化抗體（亦即，缺乏糖基化之抗體）。糖基化可經 改變以例如增加抗體對抗原之親和力。可藉由例如改變抗 體序列内之一或多個糖基化位點實現該等碳水化合物修 飾。例如，可進行一或多個胺基酸取代，其消除一或多個 150155.doc -43- 201110982 可變區構架糖基化位點以由此消除彼位點處之糖基化。該 無糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該種方法進一步詳 述於美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。 或者或另外，可製備糖基化類型改變之抗體，諸如海藻 糖基殘基量減少之低海藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增 加之抗體。已證明該等改變之糖基化型態將增加抗體之 ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由例如於糖基化機 構改變之宿主細胞中表現抗體來實現❶糖基化機構改變之 細胞已描述於此項技術中且可用作表現本發明之重組抗體 從而產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。例如，細胞株 Ms704、Ms705及Ms709缺乏海藻糖基轉移酶基因 FUT8(a(l，6)海蕩糖基轉移酶）’使得Ms704、Ms705及 M s 7 0 9細胞株中表現之抗體在其碳水化合物上缺乏海藻 糖。藉由使用兩個置換型載體（replacement vector)^&向破 壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因來產生Ms704、Ms705及 Ms709 FUT8細胞株（參見美國專利公開案第2004- 0110704 號及 Yamane-Ohnuki 等人，飢〇6叹 87: 614-22 (2004))。作為另一實例，歐洲專利公開案第 EP1，1 76,195號描述一種具有功能上被破壞的編碼海藻糖基 轉移酶之FUT8基因之細胞株’使得表現於該種細胞株中 之抗體藉由減少或消除αΐ，6鍵相關之酶顯示出低海藻糖基 化。EP 1，176,195亦描述對於將海藻糖添加至結合於抗體fc 區之N-乙醯葡萄胺糖具有較低酶活性或不具有該酶活性的 細胞株’例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/〇(ATCC CRL 1662)。 150155.doc -44- 201110982 ?(：丁公開案％0 03/03 5 835描述變異（：110細胞株、1^(：13細 胞’其使海藻糖附接於Asn(297)-鍵聯碳水化合物上之能力 降低’亦使得在彼宿主細胞中表現之抗體低海藻糖基化 (亦參見 Shields 等人，《/·价〇/. CAem. 277:26733-26740 (2002))。PCT公開案WO 99/54342描述經工程化而表現醣 蛋白修飾糖基轉移酶（例如β(1，4)-Ν-乙醯基葡糖胺基轉移 酶III(GnTIII))之細胞株，使得在工程化細胞株中表現之抗 體展現的二分GlcNac結構增加，此使得該等抗體之ADCC 活性增加（亦參見Umana等人，17:176-180 (1999))。或者，可使用海藻糖苷酶裂解去除抗體之海藻糖 殘基。例如’海藻糖苷酶α-L-海藻糖苷酶自抗體移除海藻 糖殘基（Tarentino 等人 ’ （1975)出14:5516-23(1975))。 本發明所涵蓋之本文抗體的另一種修飾為聚乙二醇化。 抗體可經聚乙二醇化以例如增加該抗體之生物（例如血清） 半衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常使該抗體或其片段與 聚乙二醇（PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物在其中 一或多個PEG基團附接於該抗體或抗體片段上之條件下反 應。通常，以反應性PEG分子（或類似反應性水溶性聚合 物）經由醯化反應或烷基化反應進行聚乙二醇化。如本文 所用之術s吾「聚乙二醇」意欲涵蓋用於衍生化其他蛋白之 任何形式的PEG(諸如單（Cl-Cl〇)烷氧基聚乙二醇或芳氧基 聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺））。在某些情況下，欲聚 乙二醇化之抗體為無糖基化之抗體。用於使蛋白質聚乙二 150155.doc -45- 201110982 醇化之方法在此項技術中為已知的且可應用於本發明之抗 體。參見例如歐洲專利第EP 0154316B1號及第Ep 0401384B1號。 製備本發明之單株抗體 本發明之單株抗體（mAb)可經由多種技術來製備，該等 技術包括習知單株抗體方法，例如K〇hler& ΜΑΜη，

Wwe 256:495 (1975)之標準體細胞雜交技術。亦可使用 製備單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒性轉型 或致癌性轉型。 用於製備融合瘤之較佳動物系統為鼠類系統。於小鼠中 之融合瘤製備為完全確立之程序。分離經免疫脾細胞以供 融合之免疫方案及技術在此項技術中已知。亦已知融合搭 配物（例如鼠類骨髓瘤細胞）及融合程序。 本發明之人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗 體的序列來A備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之Dn a可使 用適當分子生物學技術由相關鼠類融合瘤獲得且可經工程 化以含有非鼠類（例如人類）免疫球蛋白序列。舉例而言， 為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知之方法來使鼠類 可變區與人類恆定區連接（參見例如美國專利第4,816,567 號）。為產生人類化抗體’可使用此項技術中已知之方法 將鼠類CDR區插入人類構架中（參見例如美國專利第 5,225,539號及美國專利第5,53〇，1()1號、第5,585，謂號、 第 5，693,762號及第 6,180,370號）。 在一些情況下，本發明之抗體為人類單株抗體。該等針 150155.doc •46· 201110982 對OPN之人類單株抗體可使用帶有部分人類免疫系統而非 小鼠系統的轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。參見例如 Taylor等人，（1992) vVwc/ez'c Jcz.c/·? iiesearc/z 20:6287-6295 (1992) ； Chen ^ A > International Immunology 5: 647-656 (1993) ; Tuaillon 等人，Proc. Λ^α". 5W. tASd 90: 3720-3724 (1993) ; Choi等人，TVaiwre 4:117-123 (1993) ； Chenf A > EMBO J. 12:821-830 (1993) ； Tuaillon 等人，/· /wwm«o/. 152:2912-2920 (1994) ; Taylor等人， International Immunology 6:579-591 (1994)；及 Fishwild 等 人，iVaiwre Sioiec/iwo/ogjv1 14:845-851 (1996)。進一步參見 美國專利第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號、第 5,789,650 號、第 5,877,397 號、第 5,661，016 號、第 5,814,318 號、第 5,874,299 號及第 5,770,429號、美國專利第5,545,807號及PCT公開案第WO 92/03918號、第 WO 93/12227號、第 WO 94/25585 號、第 WO 97/13852號、第 WO 98/24884號、第 WO 01/14424號及 第 WO 99/45962號。 在另一情況中’本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及 轉染色體上帶有人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如帶有人 類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠來培育。該等 小鼠詳述於PCT公開案WO 02/43478中。 另外’表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉瘦基因動物 系統可用於此項技術中且可用以產生本發明之OP N抗體。 例如，可使用稱為Xenomouse(Abgenix，Inc.)之替代性轉殖 150155.doc -47- 201110982 基因系統；該等小鼠描述於例如美國專利第5,939,598號、 第 6,075，181 E ' 第 6，114,598 號、帛 615〇 584 號及第 6，162,963號中。 此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物 系統可用於此項技術中且可用以產生本發明之〇pN抗體。 舉例而言，可使用稱為「TC小鼠」的帶有人類重鏈轉染色 體及人類輕鍵轉染色體之小鼠，該等小鼠描述於T〇mizuka 等人，iVoc. iVai/. Jcac?. Scz·. t/Sd 97:722-727 (2000)中。此 外’帶有人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛已描述於此項技術 中専尺，Nature Biotechnology 20:889-894 (2002))，且可用於產生本發明之OPN抗體。 亦可使用篩選人類免疫球蛋白基因文庫之噬菌體呈現方 法來製備本發明之人類單株抗體。該等用於分離人類抗體 之嗔菌體呈現方法（例如實例1及本文中進一步描述之 HuCAL®文庫）在此項技術中已被確立。參見例如：美國專 利第 5,223,409 號、第 5,403,484 號、第 5,571,698 號、第 5,427,908 號、第 5,580,717 號、第 5,969，108 號、第 6，172，197 號、第 5,885,793 號、第 6,521，404 號、第 6,544,731 號、第 6,555,313 號、第 6,582,915 號及第 6,593,081 號。 本發明之人類單株抗體亦可使用已重新組構人類免疫細 胞以使得可在免疫後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製 備。該等小鼠描述於例如美國專利第5,476,996號及第 5,698,767號中。 150155.doc -48· 201110982 本發明之核酸分子 本么明亦有關於編碼本文中所揭示之抗體的核酸分子。 該等序列包括（但不限於）圖1A ' 1C、1E、1G、II、1K、 2A、2C、2E ' 2G、21及2K所示之彼等核酸分子。該等核 酉欠可存在於整個細胞中、細胞溶胞物中或以部分純化或實 質上純的形式存在。當藉由任何適當技術（包括鹼性/SDs 處理、CsCl純化、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及其他技 術）來使核酸與其他細胞組分或其他污染物（例如其他細胞 核酸或蛋白質）分離而純化出來時，該核酸「經分離」或 「使得」該核酸「實質上為純的」。本發明之核酸可為例 如DNA或RNA，且可能含有或可能不含有内含子序列。通 常’該核酸為cDNA分子。 本發明之核酸可使用任何適當的分子生物學技術來獲 得。對於由融合瘤表現之抗體，由該融合瘤產生之編碼抗 體輕鏈及重鏈之cDNA可藉由PCR擴增或cDNA選殖技術獲 得。對於自免疫球蛋白基因文庫（例如使用噬菌體呈現技 術）獲得之抗體而言，編碼該抗體之核酸可自中該文庫回 收。 可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至另一編碼重鏈悝 定區（CHI、CH2及CH3)之DNA分子而將編碼VH區之經分 離DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因序列在 此項技術中為已知的（參見例如Kabat等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五 版’ U.S. Department of Health and Human Services, NIH 出 150155.doc -49· 201110982 版物第91-3242號）且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準 PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為Ig(}1或 IgG4恆定區。igGi恆定區序列可為任何已知出現於不同個 體中之各種對偶基因或異型’諸如Gm(!)、Gm(2)、 及Gm(17)。該等異型表示IgG1恆定區中天然存在之胺基酸 取代。對於Fab片段重鏈基因，可將編碼^之DNA可操作 地連接至另一僅編碼重鏈CH1 .!亙定區之DNA分子。 可藉由使編碼VL之DNA與編碼輕鏈恆定區（CL)之另一 DNA分子可操作地連接而將編碼Vl區之經分離DNa轉化成 全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人類輕鏈恆定區基因序 列在此項技術中為已知的（參見例如Kab at等人，（1991)

Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五 版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH出 版物第91-3242號）且包含此等區域之DNA片段可藉由標準 PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ*λ恆定區。 為產生scFv基因，使編碼νΗ之DNA片段及編碼vL之 DNA片段與編碼可撓性連接子（例如編碼胺基酸序列（Gly^_ Ser)3)之另一片段可操作地連接，使得vH& Vl序列可表現 為相鄰單鏈蛋白質，其中VL與VH區藉由可撓性連接子接合 (參見例如 Bird等人，Sc/wce 242:423-426 (1988); Huston 等人，#αί/· dcac?. tASd 85:5879-5883 (1988)及 McCafferty等人，348:552-554 (1990))。 核酸變異體 150155.doc -50- 201110982 本發明之核酸分子並不限於本文中所揭示之序列，而是 亦包括其變異體。屬於本發明之核酸變異體可參考其在雜 交中之物理性質來加以描述。例如’熟習此項技術者將認 識到可利用核酸雜交技術使用DNA來確定其補體（由於 DNA為雙鏈）' 其均等物或同系物。亦將認識到雜交可以 小於1 00°/。之互補性發生。然而，若對條件作適當選擇， 則雜交技術可基於DNA序列與特定探針的結構關聯性用於 區別DNA序列。關於該等條件之規則，參見。“⑺从及

Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold

Spring Harbor press，Cold Spring Harb〇r，Νγ (2〇〇1)及 A職M 蓴 &，Current Pr〇t〇c〇h in

John Wiley & Sons，NY (2002)。 兩個聚核苦酸序列之結構相似性可作為兩序列彼此雜交 條件之「嚴格度」的函數。如本文所用之術語「嚴格度」 係指^不利於雜交條件之程度。嚴格條件嚴重地不利=交 且在该寺條件下僅在結構上最相關之分子將彼此雜交。相 反丄非嚴格條件有利於展示更低程度之結構關驗的分子 :父：因此雜交嚴格度直接與兩核酸序列之結構關係相 P以下關係適於將雜交與關聯性聯繫起來（其ώ τ A仿 酸雙鏈體之熔化溫度）： m ’’’、乂 a· Tm = 69.3 + 0.41(G+C)% 雙鏈體DNA之 b·在錯配驗基對數目每增加1%時 Tm降低。 • (Tm)M2-(Tm)p 丨= l8.5I〇g 丨 〇μ2/μ1 150I55.doc 51 201110982 其中μ2及μΐ為兩種溶液之離子強度。 雜交嚴格度為多種因子之函數，包括總d二濃度、離子 強度、溫度、探針大小及分裂氫鍵之試劑的存在。促進雜 交之因子包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、更長之探 針大小及衫在分裂氫鍵之試#卜雜交通常在㈣段中進 行：「結合」階段及「洗滌」階段。 首先，在結合階段，在有利於雜交之條件下將探針結合 至目標。通常在此階段藉由改變溫度來控制嚴格度。對於 高嚴格度非使用短（<20個核苦酸）寡核#酸探針，否 則溫度通常在65°C與70t之間。代表性雜交溶液包含 6xSSC、〇.5% SDS ' 5x迪哈特（Denhardt)溶液及 1〇〇 ㈣非 特異性載體DNA。參見Ausubel等人，卜晰仏〜 M〇/eCW/似別〇/〇灯，John Wiley & Sons，NY (2002)。當然， 許多不同但在功能上等效之緩衝條件為已知的。其中關聯 性程度愈低，可選擇之溫度愈低。低嚴格度結合溫度在約 25 c與40 c之間。中等嚴格度在至少約40°c至小於約65。〇 之間。高嚴格度為至少約65。〇。 其次，藉由洗滌移除過量探針。在此階段通常應用更嚴 格之條件。因此，在經由雜交決定關聯性中此「洗滌」階 段最為重要。洗滌溶液通常含有更低之鹽濃度。一例示性 中等嚴格度溶液含有2xSSC&〇1% SDS。高嚴格度洗滌溶 液合有（在離子強度上）小於約0.2xSSC之等效物，且較佳 嚴格度之溶液含有約O.lxSSC。與各種嚴格度相關之溫度 與上文對於「結合」所討論者相同。在洗滌期間，亦通常 150155.doc -52· 201110982

多次替換洗務溶液。遵L你丨；^ ^ , L 收舉例而& ’典型高嚴格度洗滌條件包 含在55。〇下洗膝兩次，歷時3Q分鐘及在紙下洗務三次歷 時1 5分鐘。 止 因此’本發明包括在高嚴格度結合及洗滌條件下與本文 所述之DNA分子雜交的核酸分子，其中該等核酸分子編碼 具有本文所述之特性的抗體或其功能片段。較佳分子為 (自mRNA角度）與本文所述2DNA分子之一具有至少乃％ 或80%(杈佳至少85%，更佳至少9〇%且最佳至少95%)序列 一致性的彼等分子。 另一類屬於本發明範疇内之核酸變異體可參考其編碼之 產物來加以描述。該等功能等效基因特徵在於以下事實： 其由於遺傳密碼子之簡併性而編碼本文中所揭示（例如圖i 及2所示）之相同肽序列。 認識到本文所提供之DNA分子之變異體可以多種不同方 式建構。例如，其可作為完全合成DNA建構。有效合成在 20至約150個核苷酸範圍之寡核苷酸的方法為方便易得 的。參見例如Ausubel等人，Cwrre价尸 心/〇狀 John Wiley & S〇ns，NY (2002)。可以由 Khorana等 人，·/_ Mo/.价〇/. 72··209_217 (1971)首先報導之方式合成 及組合重疊寡核苷酸。合成DNA較佳地利用在基因的5,與 3’端設計之便利限制點進行設計以幫助選殖入適當載體 内。 如所說明，產生變異體之方法為自本文所揭 之一者起始且隨後進行定點誘變。參見Ausubel等人， 150155.doc •53- 201110982

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，NY (2002)。在一典型方法中，將目標DNA選殖入單 鏈DNA噬菌體媒劑内。單鏈DNA經分離且與含有所需核苷 酸變更之寡核苷酸雜交。合成互補股且將雙鏈噬菌體引入 宿主中。某些所得子代將含有所需突變體，其可使用DNA 定序確定。此外，可利用增加子代噬菌體為所需突變體之 機率的各種方法。此等方法對於熟習此項技術者係熟知的 且用於產生該等突變體之套組為市售。 重組核酸之建構及表現 本發明進一步提供包含一或多個本發明之核苷酸序列的 重組DNA建構。本發明之重組建構結合載體使用，該載體 諸如質體、噬菌粒、噬菌體或病毒載體，其中編碼本發明 之抗體的DNA分子插入其内。 編碼基因可藉由 Sambrook 及 Russell, Mo/ecw/ar A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)A Ausubel» Current Protocols ζ·« Afo/ecw/ar John Wiley & Sons, NY (2002)中所述 之技術產生。或者，DNA序列可使用例如合成器化學合 成。參見例如 Oligonucleotide Synthesis(1984，Gait，編， IRL Press，Oxford)中所述之技術。舉例而言，為表現本發 明之抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之 DNA可經由標準分子生物學技術（例如，PCR擴增或使用表 現相關抗體之融合瘤或噬菌體之cDNA選殖）獲得，且該等 DNA可插入表現載體中使得該等基因與轉錄及轉譯控制序 150155.doc -54- 201110982 列可操作地連接。在此情形τ，術語「可操作地連接」意 謂抗體基因接合至載體中使得該載體内之轉錄及轉譯控制 序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。表現 載體及表現控制序列經選擇與所用表現宿主細胞相容。可 將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立載體中，或更通 常地，將兩種基因插入同一表現載體中。藉由任何適當方 法（例如，抗體基因片段及載體上互補限制性位點之接 合，或若不存在限制性位點則為鈍端接合）將抗體基因插 入表現載體中。本文中所述之抗體輕鏈及重鏈可變區可用 以產生任何抗體同型及子類之全長抗體基因其係藉由將 其插入已編碼所需同型及子類之重鏈恆定區及輕鏈恆定區 之表現載體中使得該νΗ區段與該載體内之Ch區段可操作 地連接且該VK區段與該載體内之Cl區段可操作地連接。或 者或另外，重組表現載體可編碼幫助自宿主細胞分泌抗體 鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中使得信號肽與 抗體鏈基因之胺基末端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白 信號肽或異源信號肽（亦即，來自非免疫球蛋白之信號 肽）。 除抗體鏈基因外，本發明之重組表現載體通常帶有控制 抗體鏈基因在宿主細胞中之表現的調節序列。術語「調節 序列」意欲包括啟動子、強化子及控制抗體鏈基因之轉錄 或轉譯的其他表現控制元件（例如，聚腺苷酸化信號）。該 等 S周節序列描述於例如 G〇eddel(Gene Expression Technology.

Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego, 150155.doc -55- 201110982 CA (1990))中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設 §十’包括調節序列之選擇’可視諸如欲轉型宿主細胞之選 擇、所需蛋白質表現量等因素而定。哺乳動物宿主細胞表 現之較佳調節序列包括引導哺乳動物細胞内高蛋白質表現 量的病毒元件，諸如源自於細胞巨大病毒（CMV)、猿猴病 毒40(SV40)、腺病毒（例如腺病毒主要晚期啟動子 (AdMLP))及多形瘤之啟動子及/或強化子。或者，可使用 非病毒性調節序列’諸如泛素啟動子或卜血球蛋白啟動 子。此外，調控元件包含不同來源之序列，諸如SR啟動子 系統，其含有來自SV40早期啟動子之序列及i型人類丁細 胞白血病病毒之長末端重複序列（Takebe，γ等人，（1988)

Mol. Cell. Biol. S:466-4T2)。 除抗體鏈基因及調節序列以外，本發明之重組表現載體 可帶有其他序列，諸如調節該載體在宿主細胞中複製之序 列（例如，複製起點）及可選擇性標記基因。該可選擇性標 記基因促進其+已引入載體之宿主細㈣選擇（參見例如 均為Axel等人之美國專利第4,399,216號、第（叫⑹號及 第5，179,017號）。舉例而言，通常選擇性標記基因賦予已 引入有載體之宿主細胞以對藥物（諸如G4l8、潮黴素 (hygromycin)或甲胺嗓吟）之抗性。可選擇性標記基因包括 二氫葉酸㈣酶（DHFR)基因（用於經甲㈣呤選擇/擴増之 dhfr-宿主細胞中）及neo基因（用於G418選擇）。 就輕鍵及重鍵之表現而言，藉由任何適當技術將編碼重 鏈及輕鍵之表現載體轉染至宿主細胞中。術言吾「轉染」之 150155.doc •56· 201110982 各種形式意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核或真核宿主 細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱葡 聚糖轉染及其類似技術。儘管可在原核或真核宿主細胞中 表現本發明之抗體，但在真核細胞中，且通常在哺乳動物 宿主細胞中表現抗體最典型。 本發明進一步提供含有至少一種本文中所揭示之的 宿主細胞。宿主細胞實際上可為表現載體可利用之任何細 胞。其可為例如高級真核宿主細胞（諸如哺乳動物細胞” 低級真核宿主細胞（諸如酵母細胞）或原核細胞（諸如細菌細 胞）。可藉由磷酸鈣轉染、DEAE、葡聚糖介導之轉染、電 穿孔或噬菌體感染實現將重組構築體引入宿主細胞。 細菌用途之適用表現载體藉由在可操作讀取階段使用功 能性啟動子插入編碼所需蛋白質之結構dna序列以及適當 轉譯起始及終止信號進行建構。載體將包含一或多個表現 型可選擇標記及複製起點以確保保持載體且（若冑要）在宿 主内提供擴增。用於轉化之適當原核宿主包括大腸桿菌 (五_ co/〇、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌 〖少如〜心謂）及在假單胞菌屬、鏈黴菌屬及葡 甸球函屬中之各種細菌。 細菌載體可例如基於噬菌體、質體或噬菌粒。此等載體 可含有可選擇標記及源自通常含有熟知選殖載體pBR322 之元件的市售質體（ATCC 3 7017)的細菌複製起點。在適當 宿主菌株之轉化及宿主菌株生長至適當細胞密度後，藉由 適當方法（例如溫度變化或化學誘發）去抑制/誘發所選啟動 I50I55.doc •57· 201110982 子且培育細胞一額外時期。通常藉由離心收集細胞，藉由 物理或化學方法破壞，並保留所得粗提取物用於進一步純 化。 在細菌系統中’取決於所表現之蛋白質的期望用途可宜 選擇多種表現載體。例如，當欲產生大量該種蛋白質時， 為了產生抗體或為了篩選肽文庫，例如指導易被純化之融 合蛋白質產物之高度表現的載體可為所需的。 用於表現本發明之重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括例 如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞（包括dhfr_CH〇細胞，描述於

Urlaub及 Chasin，Proc. TVai/. 77:4216-4220 (1980)中’其與DHFr選擇性標記一起使用，例如，如

Kaufman 及 Sharp，/. Mo/•价〇/. 159:601-621 (1982)中所 述）、NSo骨髓瘤細胞' c〇S細胞及Sp2細胞。詳言之，對 於與NSo骨髓瘤或CH〇細胞一起使用，另一表現系統為 WO 87/04462、W〇 89/01036 及 EP 338,841 所示之 GS(麩醯 胺酸合成酶）基因表現系統。當將編碼抗體基因之重組表 現載體引入哺乳動物宿主細胞時，藉由將該等宿主細胞培 養足以使抗體在宿主細胞内表現或將抗體分泌至宿主細胞 所生長之培養基内的一段時期來產生抗體。 可使用任何適當蛋白質純化方法自培養基回收抗體。 免疫結合物 在另一態樣中，本發明提供與諸如細胞毒素、藥物（例 如免疫抑制劑）或放射性毒素之治療部分結合的OPN抗體 或其片^又。此等結合物在本文中稱作「免疫結合物」。包 150155.doc • 58 - 201110982 括一或多種細胞毒素之免疫結合物稱作「免疫毒素」。細 胞毒素或細胞毒性劑包括任何對細胞有害（例如殺害細胞） 之藥劑。實例包括紫杉醇（taxol)、細胞鬆弛素 B(cytochalasin B)、短桿菌肽 D(gramicidin D)、漠化乙錠 (ethidium bromide)、吐根驗（emetine)、絲裂黴素 (mitomycin)、依託泊苷（etoposide)、特諾波賽（tenc，poside) ' 長春新驗（vincristine)、長春驗（vinblastine)、秋水仙驗 (colchicin)、阿黴素（doxorubicin)、道諾徽素（daunorubicin)、 二經基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽 酿（mitoxantrone)、光神徽素（mithramycin)、放線菌素 D(actinomycinD)、1-去氫睾酮（1-dehydrotestosterone)、糖 皮質激素（glucocorticoid)、普魯卡因（procaine)、丁卡因 (tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普萘洛爾（propranolol) 及嘌呤黴素（puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包 括例如抗代謝物（例如曱胺喋呤、6-酼嘌呤（6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤（6-thioguanine)、阿糖胞苷 (cytarabine)、5-氟尿嘧啶氮烯唑胺（5-fluorouracil dacarbazine))、烷基化劑（例如氮芥（mechlorethamine)、噻 替σ辰苯丁酸氮芥（thi〇epa chlorambucil)、美法余 (meiphalan)、卡氮芥（carmustine)(BSNU)及洛莫司汀 (lomustine)(CCNU)、環磷醯胺（cyclophosphamide)、白消 安（busulfan)、二溴甘露糖醇（dibromomannitol)、鏈腺菌素 (streptozotocin)、絲裂黴素C及順二氣乙二胺鉑（II)(cis-dichlorodiamine platinum(II))(DDP)順鉑（cisplatin))、蒽環 150155.doc -59- 201110982 徽素（anthracycline)(例如道諾徽素（daunorubicin，之前為 daunomycin)及阿黴素）、抗生素（例如放線菌素 (dactinomycin，之前為 actinornycin)、博萊黴素（bleomycin)、 光神黴素及氨茴黴素（anthrainycin)(AMC))及抗有絲分裂劑 (例如長春新驗及長春驗）。 可與本發明抗體或其抗原結合部分結合的治療細胞毒素 之其他實例包括多卡米素（duocarmycin)、卡奇黴素 (calicheamicin)、美登素（maytansine)及阿立他汀 (auristatin)及其衍生物。卡奇黴素抗體結合物之實例為市 售的（Mylotarg™; Wyeth-Ayerst)。 細胞毒素可使用各種連接子技術與本發明之抗體或其抗 原結合部分結合。已用以使細胞毒素與抗體結合之連接子 類型之實例包括但不限於含有腙、硫醚、酯、二硫化物及 肽之連接子。可選擇例如易於在低pH值下在溶菌體代謝區 内裂解或易於經諸如在腫瘤組織中優先表現之蛋白酶（諸 如組織蛋白酶（例如組織蛋白酶B、C、D))之蛋白酶裂解的 連接子。 關於細胞毒素類型、使治療劑與抗體結合之連接子及方 法的進一步討論，亦參見Saito等人，Drwg Z)e/iv. i?ev. 55:199-215 (2003) ; Trail等人，Career /mmwno/· /mmw⑽ 52:328-337 (2003) ； Payne, Cancer Cell 3:207-212 (2003)； Allen，TVai.及ev. Cancer 2:750-763 (2002) ; Pastan，I.及 Kreitman, Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091 (2002)； Senter，P.D.及 Springer, C.J. (2001) Jc/v. Drwg Dehv. 150155.doc -60- 201110982 53:247-264 。 本發明之抗體或其抗原結合部分亦可與放射活性同位素 結合以產生細胞毒性放射性藥物，亦稱為放射性免疫結二 物。可與抗體結合以達成診斷性或治療性用途之放射㈣ 同位素的實例包括（但不限於）碘m、銦m、釔儿及錄”7。 製備放射性免疫結合物之方法在此項技術中已被確立。放 射性免疫結合物之實例可在市面上購得，包括Ζ6ν^ηΤΜ (IDEC Pharmaceuticals)^BexxarTM(c〇rixa Pharmaceuticals)， 且可使用類似方法，使用本發明抗體來製備放射性免疫結 合物。 本發明之抗體結合物可用以使既定生物反應改質，且藥 物部分不應視為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部 分可為具有所需生物活性之蛋白質或多肽。該等蛋白質可 包括例如酶促活性毒素，或其活性片段，諸如相思豆毒素 (abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、綠膿桿菌外毒素 (pseudomonas exotoxin)或白喉毒素（diphtheria ωχίη);蛋 白質，諸如腫瘤壞死因子或干擾素_γ ;或生物反應改質 劑’諸如淋巴介質、介白素_1(「IL-1」）、介白素_2(「化_ 2」）、介白素·6(「IL-6」）、顆粒球巨噬細胞群落刺激因 子（「GM-CSF」）、顆粒球細胞群落刺激因子（「G_ CSF」），或其他生長因子。 使該等治療部分與抗體結合之技術為已知的。參見例如 Arnon寻人’「Monoclonal Antibodies For Immuno‘targeting Of Drugs In Cancer Therapy j > Monoclonal Antibodies And 150155.doc • 61 - 201110982

Cancer Therapy，Reisfeld 等人（編）’第 243-256 頁（Alan R.

Liss, Inc. 1985) ； Hellstrom 等人，「Antibodies For Drug Delivery」，Controlled Drug Delivery (第 2版）’ Robinson等 人（編），第 623-653 頁（Marcel Dekker，Inc. 1987); Thorpe， 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」，Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications，Pinchera等人（編）， 第 475-506 頁（1985) ;「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled

Antibody In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin 等人（編），第 303. 316 頁（Academic Press 1985);及 Thorpe 等人， i?ev_，62:119-158 (1982)。 雙特異性分子 在另一態樣中’本發明提供包含本發明之OPN抗體或其 抗原結合部分之雙特異性分子。本發明之抗體或其抗原結 合部分可經衍生化或連接至例如另一肽或蛋白質（例如受 體之另一抗體或配位體）之另一功能分子以產生與至少兩 個不同結合位點或目標分子結合之雙特異性分子。事實 - 上，本發明之抗體可經衍生化或連接至一個以上其他功能 . 分子以產生結合於兩個以上不同結合位點及/或目標分子 之多特異性分子；如本文所用之術語「雙特異性分子」亦 意欲涵蓋此等多特異性分子。為產生本發明之雙特異性= 子’可使本發明之抗體與諸如另一抗體、抗體片段、狀或 150155.doc •62· 201110982 結合核擬劑之_充夕ym $夕個其他結合分子功能性連接（例如經 由化學偶合、其SJ>人 土口 W合、非共價締合或其他方式）以產生 雙特異性分子。 因此，本名务明由k &人 乃匕枯包含至少一種針對OPN之第—結合特 ’、〖生及針對第_目標抗原決定基之第二種結合特異性的雙 =異f生刀|。在本發明之特线樣中，該第二目標抗原決 m 例如人類FcYRI(CD64)或人類Fq受體 (CD89)因此’本發明包括能夠結合於FcyR或表現以丫尺之 效應、、’田也（例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞（pMN)) 及OPN之雙特異性分子。&等雙特異性分子使ορΝ乾向效 應，”a胞且引發Fc受體介導之效應細胞活性’諸如OPN表現 ’’’田见之吞嗤作用、抗體依賴型細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、細胞激素釋放或超氧化陰離子的產生。 在雙特異性分子具有多特異性之本發明之一態樣中，該 分子可除抗FC結合特異性及ορν結合特異性之外，還包括 第二結合特異性。在一種情況下，該第三結合特異性為抗 增強因子（EF)部分，例如結合至參與細胞毒素活性之表面 蛋白質且藉此增加抵抗該目標細胞之免疫反應的分子。該 「抗增強因子部分」可為抗體、功能性抗體片段或結合至 既定分子（例如抗原或受體）且藉此導致對於Fc受體或目標 細胞抗原之結合決定子之效果增強的配位體。該「抗增強 因子部分j可結合F c受體或目標細胞抗原。或者，該抗增 強因子部分可結合至不同於第一及苐一結合特異性所結合 之實體的實體。舉例而言，該抗增強因子部分可結合細胞 150155.doc -63- 201110982 毒性T細胞（例如經由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、 CD40、ICAM-1或其他使得抗目標細胞之免疫反應增加的 免疫細胞）。 在一種情況下，本發明之雙特異性分子包含至少一個抗 體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單璉 Fv ’作為結合特異性。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體、 或其任何最小片段，諸如美國專利第4,946,778號中所述之 Fv或單鏈構築體。 在一種情況下，由單株抗體提供對Fey受體之結合特異 性，該單株抗體之結合不受人類免疫球蛋白G(IgG)阻斷。 如本文中所用’術語「IgG受體」係指位於染色體1上之八 個γ-鏈基因中之任一者。該等基因編碼總共十二個分為三 個 Fey 受體類別：FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)及 FcyRIII (CD16)之跨膜或可溶性受體同功異型物《在一種情況下， 該Fc*y受體為人類高親和力FcyRI。該人類Fc7RI為72 kDa 分子，其對單體IgG(108至Ιί^Μ·1)展示高親和力。 某些抗Fey單株抗體之產生及表徵描述於PCT公開案WO 88/00052及美國專利第4,954,617號中。該等抗體結合於與 受體之FcY結合位點不同的位點處FcyRI、FcyRII或FcyRIII 之抗原決定基，且因此其結合實質上並不由IgG之生理含 量阻斷。適用於本發明之特異性抗FcyRI抗體為mAb 22、 mAb 32、mAb 44、mAb 62 及 mAb 197。產生mAb 32 之融 合瘤可得自美國菌種保存中心（American Type Culture Collection)，ATCC寄存編號HB9469。在其他情況下，該 150155.doc -64· 201110982 抗Fey受體抗體為人類化形式之單株抗體22(H22、丨。該 抗體之產生及表徵描述於Graziano等人，j 155(10):4996-5002 (1995)及 PCT 公開案 WO 94/10332 中。 產生H22抗體之細胞株以HA022CL1之名稱寄存於美國菌 種保存中心且寄存編號為CRL 11177。 在其他情況下’對於Fc受體之結合特異性係由結合於人 類IgA受體（例如Fc-α受體（FcaRI(CD89)))之抗體提供，其 結合通常不受人類免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術語「IgA受 體」意欲包括一種位於染色體19之a-基因（FcaRi)之基因產 物。已知此基因編碼若干替代性拼接之55至i 1〇 kDa之跨 膜同功異型物。FcaRI(CD89)原構性表現於單核細胞/巨噬 細胞、嗜伊紅企球性粒細胞及嗜中性粒細胞上，而非於非 效應細胞群體上。？〇01尺1對1§八1及18八2具有中等親和力（約 5χ10 Μ ) ’其在暴露於諸如G-CSF或GM-CSF之細胞激素 後有所增加（Morton等人，CWiica/ Reviews in Immunology 16:423-440 (1996))。已描述鑑別為 A3、A59、A62及 A77 之四種FcaRI-特異性單株抗體，其結合IgA配位體結合域 以外之 FcaRI(Monteiro 等人，/所148:1764 (1992))。

FcaRi及FcyRI為用於本發明之雙特異性分子的例示性觸 ♦受體’因為其（1)主要表現於免疫效應細胞（例如單核細 胞、PMN、巨噬細胞及樹突狀細胞）上；（2)被高度表現（例 如每細胞5,0〇〇至1 〇〇,〇〇〇); (3)為細胞毒素活性（例如 ADCC、嗟胞作用）之介體；（4)介導以其為目標之抗原（包 150155.doc -65- 201110982 括自體抗原）的增強抗原呈遞。 雖然人類單株抗體較佳，但可用於本發明之雙特異性分 子的其他抗體為鼠科、嵌合及人類化之單株抗體。 本發明之雙特異性分子可藉由使用任何適當方法使構成 結合特異性（例如抗F c R結合特異性及抗〇 p N結合特異性） 結合來製備。舉例而言，該雙特異性分子之每一結合特異 性可單獨產生且隨後使其彼此結合。當結合特異性為蛋白 質或肽時’多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑 之貫例包括蛋白質A、碳化二醯亞胺、N-琥珀醯亞胺基_S-乙醯基-硫乙酸酯（SATA)、5，5·-二硫雙（2-硝基苯甲 酸）(DTNB)、鄰伸苯基二馬來醯亞胺（〇pDM)、Ν_號珀醯亞 胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸醋（SPDp)A 4_(Ν_馬來醯亞胺 曱基）環己烧-1-叛酸續酸基號珀醯亞胺酯（確酸基_ SMCC)(參見例如Karpovsky等人，乂五υ. ι60:1686 (1984) ; Liu等人，/Voc. CASd 82:8648 (1985) )。其他方法包括描述於Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78，118-132 ; Brennan等人，229:81-83 (1985);及 Glennie 等人，《/. /mmwwo/· 139:2367-2375 (1987))中之彼等方法。適當結合劑包括SATA及磺酸基-SMCC ’ 其均可自 Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)獲得。 當結合特異性為抗體時，其可經由兩條重鏈之C端鉸鏈 區之氫硫基鍵聯結合。在一種情況下，鉸鏈區在結合前經 修飾而含有奇數個氫硫基殘基，諸如一個殘基。 或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼且在同一宿 150155.doc -66 - 201110982 主細胞中表現及組裝。若該雙特異性分子為mAbxmAb、 mAbxFab、FabxF(ab')2或配位體xFab融合蛋白時’則此方 法尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗 體及一個結合決定子的單鏈分子，或包含兩個結合決定子 的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈 分子。用於製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利 第 5,260,203 號；第 5,455,030 號；第 4,881，175 號；第 5，132,405 號；第 5,091，513 號；第 5,476,786 號；第 5,013,653號；第 5,258,498號；及第 5,482,858號中。 雙特異性分子與其特異性標靶之結合可經由例如酶聯結 免疫吸附劑分析（ELISA)、放射免疫檢定（RIA)、FACS分 析、生物檢定（例如生長抑制）或西方墨點檢定來證實。此 等檢定中之每一者一般藉由使用對相關複合物具有特異性 的經標記之試劑（例如抗體）來偵測尤其受關注之蛋白質-抗 體複合物的存在。例如，FcR-抗體複合物可使用例如識別 抗體-FcR複合物且與其特異性結合之酶聯抗體或抗體片段 來偵測。或者，該等複合物可使用多種其他免疫檢定中之 任一者來偵測。舉例而言，可將抗體進行放射性標記且用 於放射免疫測定（RIA)(參見例如Weintraub，B.，Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on

Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society，1986 年3月）。放射活性同位素可經由諸如使用γ計數器或閃爍 計數器之方式或經由自動放射顯影術來偵測。 治療方法 150155.doc • 67· 201110982 治療方法涉及向需要治療之個體投與治療有效量或「有 效量」的本發明所涵蓋之抗體或抗原結合部分。如本文所 用’「治療有效」量或「有效」量係指抗體或其部分作為 單一劑量或根據多劑量方案，單獨或與其他藥劑組合使用 時，其用量足以使疾病症狀嚴重度降低、無疾病症狀階段 之出現次數及持續時間增加或預防歸因於疾病折磨之損傷 或殘疾。一般熟習此項技術者將能夠基於諸如個體尺寸、 個體症狀嚴重私度及所選特定組合物或投藥路徑之因素來 確疋该等量該個體可為人類或非人類動物（例如兔、大 鼠、小鼠、猴或其他低級靈長類動物）。 本發明之抗體或抗原結合部分可與已知藥劑共同投藥， 且在某些情況下抗體自身可經修飾。例如，抗體可與免疫 毒素或放射性同位素相結合以潛在地進一步提高功效。關 於與其他治療劑共同投藥，該等藥劑可包括細胞毒性劑、 放射毒性劑或免疫抑制劑。抗體可與藥劑連接（作為免疫 複合物）或可與該藥劑獨立投與。在後一種情況（獨立投與） 下，抗體可在藥劑投與前、投與後投與或與藥劑同時投 與，或可與其他已知療法（例如抗癌療法，例如放射療法） 共同投與。該等治療劑尤其包括抗贅生劑，諸如阿黴素 (阿德力黴素）' 順鉑博來黴素硫酸鹽、卡氮芥、苯丁酸氮 芥及環磷醯胺羥基脲，其自身僅在對患者有毒性或亞毒性 之含量下有效。順鉑可每四週一次靜脈内投與1〇〇 劑量 且阿黴素每21天一次靜脈内投與6〇至75 劑量。本發明 之Ο P N抗體或其抗原結合片段與化療劑共同投藥提供兩種 150I55.doc -68 - 201110982 抗癌劑，其經由不同機制運作，對人類腫瘤細胞產生細胞 毒性效應。該共同投藥法可解決由於形成抗藥性或腫瘤細 胞抗原性變化而可能導致對抗體無反應所帶來的問題。 本文中所揭示之抗體及抗原結合部分可在多種不希望表 現或出現OPN之情況中用作治療或診斷工具。由於有多種 不同腫瘤細胞會表現〇PN及_會影響腫瘤轉移，因此尤 本發明抗體或抗原結合部分治療的病症及病狀包 括異常細胞生長，例如間皮瘤、肝膽（肝及膽管）癌、原發 性或繼發性CNS腫瘤、原發性或繼發性腦腫瘤、肺癌 (NSCLC及SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮 膚或眼内黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、肛區癌、 月癌、胃腸（胃、結腸直腸及十二指腸）癌、乳癌、子宮 癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門 癌、霍奇金氏病（Hodgkin’s Disease)、食道癌、小腸癌、 内分泌系統癌、曱狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組 織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急 性白血病、慢性骨髓白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱 癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統 (CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（n〇n Hodgkins’s lymphoma)、脊椎軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、 垂體腺瘤、腎上腺皮質癌、膽囊癌、多發性骨髓瘤、膽管 癌、纖維肉瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤或一或多 種上述癌症之板合。 為治療任何前述疾病’可使用一或多種醫藥學上可接受 150155.doc -69- 201110982 之載劑或賦形劑，依習知方式調配根據本發明使用之醫藥 組合物。本發明之抗體或抗原結合部分可藉由任何適當方 法投藥，此可視所治療之疾病的類型而變化。可能投藥途 徑包括非經腸投藥（例如肌内、靜脈内、動脈内、腹膜内 或皮下）、肺内及鼻内，且（若需要）用於局部免疫抑制治 療、病灶内投藥。此外，本發明之抗體可藉由脈動輸液以 例如減小劑量之抗體投藥。較佳藉由注射給藥，最佳經靜 脈内或皮下注射，部分取決於投藥為短期或長期。投藥之 里將取決於多種因素，諸如臨床症狀、個體重量、是否投 與其他藥物。熟習此項技術者將認識到投藥途徑將視欲治 療之病症或病狀而變化。 確疋本兔明之抗體或抗原結合部分的治療有效量將主要 取决於特疋患者特徵、投藥途徑及所治療病症的特性。一 般才曰南可見於例如國際協調會議C〇nference

Harmonization)及百明頓製藥科學⑺⑽丨邮仙,s

Pharmaceutical Sciences)出版物，第 27 及 28章，第 484 528 頁中（第 18版 ’ Alfonso R. Gennaro，編，Easton，Pa.: Mack pub· Co.，1990)。更特定言之，治療有效量之確定將取決 於諸如該藥物毒性及功效之因素。毒性可使用此項技術中 ^知的且見於前述參考中之方法進行測^。可利用相同指 南結合在下文實例中所述之方法測定功效。 對於抗體投與，劑量可介於約〇 〇〇〇1爪以“至1〇〇 且更通常介於0.01 !^/!^至2〇 mg/kg宿主體重範圍内。舉 例而έ，劑量可為〇·3 mg/kg體重、i mg/kg體重、3 —kg 150155.doc 201110982 體重、5 mg/kg體重 ' l〇 mg/kg體重、15 mg/kg體重、2〇 mg/kg體重或在1 mg/kg至2〇 mg/kg範圍内。例示性治療方 案需要每週投與一次、每兩週投與一次、每三週投與— 次、每四週投與一次、每月投與一次、每3個月投與一次 或每3至6個月投與一次。本發明之抗〇pN抗體或其抗原結 合部分的給藥方案包括例如經靜脈内投與i mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重、1〇 mg/kg體重、15 mg/kg體重 或20 mg/kg體重之劑量，其中使用以下給藥進程中之—者 投與抗體：⑴每四週投與六個劑量，隨後每三個月投與； (11)母二週投與；（ui)投與丨-20 mg/kg體重之劑量一次，隨 後每二週投與1-2〇 mg/kg體重之劑量。 診斷方法 OPN咼度表現於各種腫瘤細胞中；因此，可使用本發明 之抗OPN抗體以便使患者中可能存在〇pN之部位成像或可 見。就此而言，可經由使用放射性同位素、親和力標記 (諸如生物素、抗生物素蛋白等）、螢光標記、順磁性原子 等可偵測地標記抗體。達成該標記之程序在此項技術中為 熟知的。抗體在診斷成像中之臨床應用如下综述： Grossman, Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)； Unger 等人，/㈣如及2〇:693_7〇〇 (1985)及 Khaw 等 人，toewce 209:295-297 (1980)。 该以可偵測方式標記之抗體之部位的偵測可例如指示某 些類型之癌症。在一實施例中，藉由移除組織或血液樣品 並在可彳貞測標記抗體之存在下培育該等樣品來完成此檢 150155.doc •71 · 201110982 驗。在-較佳實施例中，該技術係以非侵襲性方式經由使 用磁成像、螢光自顯影等來實現。該種診斷測試可用於監 測疾病治療之成果，其中目標0PNlt性細胞存在與否為相 關指標。 ~ 治療性及診斷性組合物 本發明之抗體及抗原結合部分可根據已知方法調配以製 備醫藥學上適用之組合物，其中至少一種本發明之抗體 (包括其任何抗原結合部分）與醫藥學上可接受之載劑組合 於混合物中。適當載劑及其調配物描述於例如⑺ns Pharmaceutical SCiences(第 18 版，Alf〇ns〇 R 赚〇 , 編 ’ Easton’ Pa.: Mack Pub c〇，199〇)。為 了形成適於有 效投藥之醫藥學上可接受之組合物，該等組合物將含有有 效量之一或多種本發明抗體，以及適當量之醫藥學上可接 受之载劑。 如本文中所使用之「醫藥學上可接受之載劑」包括生理 學可相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑 及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及其類似載劑。載劑 通常適於靜脈内、肌内、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與 (例如藉由注射或輸注）。視投藥途徑而定，活性化合物（亦 即杬體、其抗原結合部分、免疫結合物或雙特異性分子） 可包覆於材料中以保護該化合物免受可使該化合物失活之 酸及其他自然條件的作用。 在某些實施例中’本發明之抗體可以中性形式（包括兩 性離子形式）存在或可為正電荷或負電荷物質。在一些情 150155.doc •72- 201110982 況下’抗體可與相對離子複合形成醫藥學上可接受之鹽。 因此’本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接 受之鹽。 「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物（例如抗 體）之所需生物活性且不會賦予不當毒性效應之鹽（參見例 如 Berge，S.M.等人，（1977) J.尸/ζαη 66:1-19)。例 如’術語「醫藥學上可接受之鹽」包括包含一或多種抗體 及一或多種相對離子之複合物，其中該等相對離子源自於 醫藥學上可接受之無機酸及有機酸以及無機鹼及有機鹼。 該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括 由無毒性無機酸（諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫漠 酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物）以及由無毒性有機酸（諸 如脂族單及二羧酸、苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族 酸、脂族及芳族磺酸及其類似物）衍生之彼等鹽。鹼加成 鹽包括由鹼土金屬，諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物以及 由無毒性有機胺，諸如N，N，-二苄基乙二胺、冰甲基葡糖 胺、氣普魯卡因、膽驗、」乙醇胺、乙二胺、#魯卡因及 其類似物衍生之彼等鹽。 此外，醫藥學上可接受之無機鹼包括金屬離子，金屬離 子包括（但不限於）合適鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及其他生理 學上可接受之金屬離子。衍生自無機鹼之鹽包括鋁鹽、銨 鹽、辦鹽、钻鹽、鎳鹽、翻鹽、釩鹽、錳鹽、鉻鹽、石西 鹽、锡鹽、銅鹽、鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、三價錳 鹽、二價錳鹽、鉀鹽、铷鹽、鈉鹽及鋅鹽且為其常用：子 150155.doc •73· 201110982 價。 本發明抗體之醫藥學上可接受之酸加成鹽可由以下酸來 製備’該等酸包括（但不限於）甲酸、乙酸、乙醯胺基苯曱 酸、己二酸、抗壞血酸、硼酸、丙酸、笨曱酸、樟腦酸、 碳酸、環己胺績酸、去氫膽酸、丙二酸、依地酸、乙基硫 酸、芬地柞酸、偏磷酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳 酸、蘋果酸、酒石酸、丹寧酸、檸檬酸、硝酸、抗壞血 酸、葡糖醛酸、順丁烯二酸、葉酸、反丁烯二酸、丙酸、 丙酮酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯甲酸、鹽酸、氫溴酸、氫 碘酸、離胺酸、異檸檬酸、三氟乙酸、雙羥萘酸、丙酸、 鄰胺基苯曱酸、甲磺酸、乳清酸、草酸、酮基丁二酸、油 酸、硬脂酸、柳酸、胺基柳酸、矽酸、對羥基苯甲酸、菸 鹼酸、苯乙酸、扁桃酸、恩波酸、磺酸、甲磺酸、磷酸、 膦酸、乙磺酸、乙烷基二磺酸、銨、苯磺酸、泛酸、萘續 酸、甲苯續酸、2-經基乙續酸、對胺基苯確酸、硫酸、确 酸、亞硝酸、硫酸單曱酯、環己基胺基磺酸、對羥基丁 酸、甘胺酸、甘胺醯甘胺酸、麩胺酸、二曱胂酸、二胺基 己酸、樟腦磺酸、葡萄糖酸、硫氰酸、氧代戊二酸、5_磷 酸吡哆醛、氣苯氧基乙酸、十一酸、N-乙醯基-L-天冬胺 酸、半乳糖二酸及半乳糖搭酸。 醫藥學上可接受之有機鹼包括三甲胺、二乙胺、N，N，_ 二苄基乙二胺、氯普魯卡因、膽驗、二苄胺、二乙醇胺、 乙二胺、葡曱胺（N-甲基葡糖胺）、普魯卡因、環胺、四級 錢陽離子、精胺酸、甜菜鹼、咖啡鹼、克立咪唑、乙基 150l55.doc •74· 201110982 月女基乙醇、2-二乙基胺基乙醇、2-二甲基胺基乙醇、乙二 胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、N_乙基嗎啉、N_乙基哌啶、 乙基葡萄糖胺、葡萄糖胺、葡糖胺、組胺酸、海卓胺、咪 0坐、異丙胺、曱基葡糖胺、嗎喻、α底嗓、。比咬、。比哆酵、 敍、°底。定、多元胺樹脂、普魯卡因、嘌吟、可可豆驗、三 乙胺、三丙胺、三乙醇胺、緩血酸胺、曱胺、牛續酸、膽 酸鹽、6-胺基-2-曱基-2-庚醇、2-胺基-2-曱基-.1,3-丙二* 醇、2-胺基-2-甲基-1-丙醇、脂族單及二羧酸、笨基取代 之烧酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸、锶、三 (經甲基）甲基甘胺酸（tricine)、肼、笨基環己胺、2-(Ν-嗎 啉基）乙磺酸、雙（2-羥乙基）胺基-參（羥甲基）曱烷、(2-乙醯胺基）-2-胺基乙績酸、1，4-旅唤二乙確酸、3-嗎嘛基-2-經基丙磺酸、l，3-雙[參（羥甲基）甲基胺基]丙烷、4_嗎啉 丙烧石黃酸、4-(2-經乙基）旅。秦-1-乙續酸、2-[(2-經基-1,1-雙 (經甲基）乙基）胺基]乙確酸、N，N-雙（2-經乙基）-2-胺基乙 績酸、4-(N-嗎琳基）丁項酸、3-(_/V，iV-雙[2-經乙基]胺基）-2-羥基丙磺酸、2-羥基-3-[參（羥曱基）曱基胺基]-卜丙磺酸、 4-(2-羥乙基）哌嗪-1-(2-羥基丙磺酸）、哌嗪_丨，4-雙（2-羥基 丙％酸）一水合物、4-(2-經乙基）-1 -略嗪丙績酸、％#_雙（2_ 羥乙基）甘胺酸、N-(2-羥乙基）哌嗪_N，-(4-丁績酸）、N-[參 (經甲基）曱基]-3-胺基丙績酸、N-參（經甲基）甲基-4-胺基 丁確酸、N-(l，l-二甲基-2-經乙基）-3-胺基經基丙石黃酸、 2-(環己基胺基）乙磺酸、3-(環己基胺基）_2_羥基-1-丙磺 酸、3-(環己基胺基）-1-丙磺酸、乙醯胺基）亞胺二乙 150155.doc •75· 201110982 醯、4-(環己基胺基）j •丁磺酸、#_[參（羥甲基）甲基]甘胺 酸、2-胺基-2-(羥甲基）·ι，3_丙二醇及胺丁三醇。 本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化 劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑實例包括：（1)水溶性抗氧 化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞 硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；（2)油溶性抗氧化劑，諸 如棕櫚酸抗壞血酯、丁基化羥基大茴香醚（ΒΗΑ)、丁基化 羥基甲苯（ΒΗΤ)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α_生育酚及其 類似物；及（3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸 (EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及其類似物。 可用於本發明之醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑 的實例包括水、乙醇、多元醇（諸如甘油、丙二醇、聚乙 二醇及其類似物）及其適合混合物、植物油（諸如撖欖油）及 可注射有機酯（諸如油酸乙酯）。可例如藉由使用塗層物質 (諸如卵磷脂)在分散液之情況中藉由維持所需粒徑及藉由 使用界面活性劑來維持適當流動性。 此等組合物亦可含有佐劑’諸如防腐劑、濕潤劑、乳化 劑及分散劑。可經由前述滅菌程序及經由包括多種抗菌劑 及抗真菌劑(例如，對羥基苯曱酸酯、氣丁醇、笨酚山梨 酸及其類㈣）來確㈣止微生物存在。亦可需要在^ 物中包括等張劑’諸如糖、氣化鈉及其類似物。另外，可 注射醫藥形式之延長吸收可藉由包含延遲吸收之藥劑(諸 如單硬脂酸鋁及明膠）來達成。 邊藥子上可接文之載劑包括無菌水性溶液或分散液，及 150155.doc •76· 201110982 用於即時製備盔菌可 活性物質之… 散液之無菌散劑。醫藥 之该等介質及藥劑之用途在此項技術中已 非任何習知介質或試 ，、 在本發明之醫藥組合物中使用二=目谷，否則涵蓋其 活性化合物。 ’亦可在組合物中併入輔助 合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。 =物可調配為溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥 勿農度之規則結構。載劑可為 " 科y j两s有例如水、乙醇、多元醇 (例如甘油、丙二醇及液體聚 yV ,, ^ @ Λ —醇及其類似物）之溶劑或 分散介質及其合適混合物。 Γ例如精由使用諸如卵磷脂之 塗層，在为散液之狀況下藉由維持所需粒度及藉由使用界 面活性劑來維持適當流動性。 你°τ夕『月况下，組合物中較 ί包括等張劑，例如糖、多元醇（諸如甘露醇、山梨醇）或 亂化納。糟由將諸如單硬脂酸鹽及明膠之延遲吸收劑包括 在組合物中可實現可注射組合物之延長吸收。 無菌可注射溶液可藉由合併所需量之活性化合物於適當 溶劑中以及一種或一組上文所列舉之成份，若需要隨後進 订滅菌微過遽來製備。通常藉由將活性化合物併入無菌媒 劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自 上文所列舉之彼等成份之其他所需成份。在用於製備無菌 可注射溶液之無菌散劑的狀況下’製備方法包括（但不限 於)真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其由其先前經無菌過濾之 /合液產生活性成份加上任何其他所需成份的粉末。 可與載劑物質組合而產生單一劑型之活性成份的量應視 150155.doc •77- 201110982 所治療之個體及特定投藥模式而變化。可與載劑物質組合 而產生I齊]$之活性成份的量將一般為產生治療效應之 、-且α物的量❶一 I而言，在〗〇〇%中，該量範圍將介於約 0.01/。至約99%之活性成份，較佳介於約〇1%至約7〇%之活 I·生成伤’最佳介於約1%至約3G%之活性成份，與醫藥學上 可接受之載劑組合。 調整給藥方案以提供最佳所需反應（例如治療性反應）。 舉例而。，可投與單次大劑劑（single bolus) ·，可隨時間投 與右干刀-人劑里，或可如治療情況之緊急狀態所示按比例 減小或增加劑量。出於投藥簡便性及劑量均一性考慮，將 非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文中所用之 單位y型係心適合作為單一劑量用於欲治療個體的物理個 別早兀’每—單位含有經計算可產生所需治療效應之預定 量的活〖生化合物與所需醫藥載劑結合。本發明之劑量單位 形式的規格受下列因素支配或直接取決於下列因素：（a)活 性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效果，及（b)在此 項技術中為處理個體之敏感性而混配此活性化合物固有的 侷限性。 可適當地調配製劑以提供活性化合物之控制釋放。控制 釋放製劑可經由使用聚合物來錯合或吸收抗0PN抗體而達 成。可藉由選擇適當巨分子（例如聚酯、聚胺基酸、聚乙 烯、吡咯啶鲖、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖 維素或魚精蛋白、硫酸酯）及巨分子之濃度以及併入方法 以便控制釋放來實現控制傳遞。另一種利用控制釋放製劑 150155.doc •78· 201110982 來控制作用持續時間的可能方法為將抗〇pN抗體併入聚合 材料之顆粒内’該聚合材料諸如為聚酯、聚胺基酸、水凝 膠、聚（乳酸）或乙烯乙酸乙烯醋共聚物。或者，代替使該 等藥劑併人聚合顆粒中，有可能將該等材料包埋於例如藉 由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊(分別例如為 經甲基纖維素或明膠-微勝囊及聚(甲基丙烯酸甲脂)微膠 囊）中；或包埋於膠狀藥物傳遞系統（例如，脂質體、白蛋 白微球體、微礼液、奈米顆粒及奈米膠囊)中；或包埋於 巨乳液中。該等技術揭示於Remingt〇n，s pharmaceuticai Sciences(第 18 版，Alfons〇R.Gennar〇,編，E_n，pa:

Mack Pub. Co_，1990)中。 抗體製劑可經調配而用於藉由注射，例如藉由快速注射 或連續輸注來非經腸投藥。適於注射之調配物可以單位劑 型形式呈現’例如於安瓶内或多劑量容器β，且添加有防 腐劑^合物可呈諸如於練或錢媒财之懸浮液、溶 液或乳液之形式’且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分 散劑之調配劑。或者，活性成份可呈粉末形式以在使用之 前以合適之媒劑（例如無菌無熱原質水）復原。 若需要，該等組合物可呈現於封裝或分配器裝置内該 封裝或分配器裝置可含有—或多個含有活性成份之單位:丨 型。料可例如包含金屬或塑㈣，❹發泡包裝。料 或分配器農置可附有投藥用法說明書。 、 藉由以下實例來進-步說明本發明，該等實例不摩 為進一步限制本發明1穿本發明提及之所有圖及所有參 150155.doc -79- 201110982 考文獻、專利及公開專利申請案的内容明確地以全文引用 之方式併入本文中。 實例 如以下實例中所使用，以下縮寫具有以下含義，除非另 外指明，否則其易於自商業供應商購得：PBS :磷酸鹽緩 衝鹽水’ pH 7.4 ; IPTG :異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷； HSA:人血清白蛋白。 實例1:由HuCAL®文庫產生抗體 為了產生針對OPN之治療性抗體，使用MorphoSys HuCAL GOLD®噬菌粒文庫進行選擇。噬菌粒文庫係基於 HuCAL®相乂念（Knappik等人，J. Μο/· 5ί·ο/. 296:57 (2000))且 使用CysDisplay®技術來呈現噬菌體表面上之Fab(L5hnir^ WO 01/05950)。將不同構架之HuCAL GOLD®抗體-噬菌體 組合形成一個池（VH1-6)，或分成子池（例如VH1/5、 VH2/4/6、VH3)且隨後個別地對該等子池針對如下所述之 抗原進行數輪選擇。由超級噬菌體（Hyperphage) (Μ13Κ07ΔρΙΙΙ，獲自 Progen，Heidelberg，Germany)準備第 一輪淘選之嗤菌體。 針對OPN之固相淘選 使用重組人類OPN(R&D Systems #1433-OP/CF，無載 體）、重組小鼠〇PN(R&D Systems #44卜OP/CF，無載體）或 包含人類OPN或小鼠OPN之功能域的SPP1肽（27個胺基酸） 進行固相淘選。使用不同抗原進行3輪存在或不存在人類 OPN與小鼠OPN交替之淘選，以及包括人類/小鼠OPN抗原 150155.doc -80- 201110982 與SPP1肽交替之策略。為了使用OPN蛋白進行淘選，使用 不同緩衝條件。塗佈於PBS或補充有Ca2+及Mg2 + 〇〇〇 mg/L CaCl2; 100mg/LMgCl2)之 PBS 中的抗原。 使用於PBS或PBS(補充有Ca2 +及Mg2+)中稀釋至最終濃度 為50 pg/ml之人類/小鼠OPN來塗佈Maxisorp™板（F96 Maxisorp™，442402，Nunc，Rochester，NY)上適當數目之 孔’以供第一輪及第二輪淘選。對於第三輪，將25 μ§/ΐΏΐ 人類OPN及10 pg/ml小鼠OPN用於塗佈。隨後在4。〇下培育 各別板隔夜。次日，用P B S洗務各孔兩次，隨後在室溫下 用 MPBST(PBS ’ 0.05% Tween20(Sigma, St. Louis，MO, USA)，5%奶粉）阻斷2小時。使用loo μΐ^來自原始huCAL GOLD®子池（VH1-6、VH1/5及VH3 ’用超級。莖菌體製備）之 噬菌體。在含有2.5%奶粉、2_50/。BSA及0.05% Tween20之 PBS溶液中預阻斷噬菌體。在室溫下，在旋轉器上，於2 mL反應管中進行噬菌體之預阻斷達2小時。 在選擇過程中，自MaxisorpTM板移除抗原溶液且用pBS 洗滌各孔三次。添加預阻斷之噬菌體至相應孔中且在室溫 下’在微板震盪器上培育板2小時。隨後移除噬菌體溶液 且用PBST(PBS ’ 0.05% Tween20)洗滌各孔若干次（嚴格度 取決於淘選策略及選擇輪次），隨後用PBS進行相同洗滌步 驟。洗滌嚴格度逐輪提高。在最後的洗滌步驟後移除 PBS，隨後繼續溶離。為了溶離特異性結合之噬菌體，添 加於10 mM Tris/HCl(pH 8.0)中之20 mM DTT且在室溫下土立 育樣品1 0分鐘。 150155.doc -81· 201110982 使用溶離液來感染對數期的大腸桿菌TG1培養物。藉由 離心收集經感染之大腸桿菌且將其塗佈於補充有34 pg/ml 氣黴素及1 %葡萄糖之LB瓊脂板上。在30°C下培育瓊脂板 隔夜。第二天，刮去菌落且使其生長直至達到0.5之OD600 nm以進行輔助嗟菌體感染。輔助嗤菌體感染：在3 7 °C下以 輔助噬菌體VCSM13感染TG1細胞（至少20之感染倍率）。藉 由離心收集經感染細胞，且再懸浮於含有34 pg/mL氣黴 素、50 pg/mL卡那黴素及0.25 mM IPTG之2xYT培養基中 以用於誘導Fab表現。使細胞生長隔夜，用聚乙二醇 (PEG)/NaCl自上清液沈澱析出所產生之噬菌體，且使其再 懸浮於PBS中。藉由點滴定法（spot titration)測定輸入及輸 出效價。 針對OPN之溶液淘選 使用重組人類0PN、重組小鼠OPN或包含hOPN或mOPN 之功能域的SPP1肽（27個胺基酸）進行溶液淘選。使用不同 抗原進行3輪存在或不存在人類OPN與小鼠OPN交替之淘 選，以及包括h/m OPN抗原與SPP1肽交替之策略。為了使 用OPN蛋白進行淘選，使用不同缓衝條件。使用於PBS或 補充有 Ca2 +及 Mg2 + (100 mg/L CaCl2; 100 mg/L MgCl2)之 PBS中的抗原。 甩 ChemiBLOCKER(Chemicon，Temecula, CA，USA)預阻 斷用於選擇之所有試管。用ChemiBLOCKER(+0.05% Tween20)阻斷 HuCAL GOLD® 嗟菌體，且在 M-280 Streptavidin Dynabeads®(Dynal Biotech，Oslo, Norway)上 150155.doc -82- 201110982 預吸附兩次。在室溫下，在旋轉器上，於2紅試管中培育 預阻斷之嗤菌體及經生物素標記之〇pn蛋白或肽抗原2小 時：在第一輪選擇中’使用100 _之生物素標記抗原濃度 進行珠粒偶合。使用10 „河生物素標記抗原進行第二輪及 第三輪淘選。 將預吸附之Streptavidin Dynabeads®添加至噬菌體_抗原 溶液中，且在室溫在旋轉器上再培育1〇分鐘。使用磁性粒 子分離器 MPC-E(Dynal Biotech，Oslo, Norway)分離與所捕 獲之抗原結合的噬菌體。用PBST(PBS，〇 〇5% Tween 2()) 洗滌珠粒若干次，隨後用PBS洗滌若干次。洗滌嚴格度隨 每一輪淘選而增加。在最後的洗滌步驟後移除pBS，隨後 繼續溶離。如先前關於固相淘選所述進行溶離及其他步 驟0 所選Fab片段之次選殖及微表現 為了促進可溶性Fab之快速表現，將所G〇LD® 噬菌體之Fab編碼插入物經由义石以及芯“則次選殖於表現載 體pMORPH®X9_MH中。在將表現質體轉型至大腸桿菌 TGI F-細胞中之後，挑選抗氣黴素的單一純系至預填充有 2χΥΤ培養基（補充有34 pg/mL氯黴素及1%葡萄糖）之無菌 384孔微量滴定板的各孔中，且在37。〇使其生長隔夜。該 等板視為母板。在-80°C儲存母板之前，將大腸桿菌TG丨F_ 培養物接種至每孔預填充有4〇 2χΥΤ培養基（補充有34 pg/mL氣黴素及〇· 1%葡萄糖）的新的無菌384孔微量滴定板 中。該等微量滴定板在30。(：在微板震盪器上以4〇〇 rpm震 150155.doc •83· 201110982 盪培育直至培養物略顯混濁（約2至4小時），OD600為約 0.5。該等板視為表現板，且每孔添加10 μι 2χΥΤ培養基 (補充有34 pg/mL氣黴素及5 mM IPTG)(最終濃度為1 mM IPTG),以可透氣的膠帶密封微量滴定板，且在30°C以400 rpm震盪培育隔夜。 產生全細胞溶解物（BEL萃取物）：向表現板之各孔添加 15 μΐ BEL緩衝液，且在22°C在微量滴定板震盪器（400 rpm)上培育1小時。BEL緩衝液：24.7 g/L石朋酸、18.7 g NaCl/L、1.49 g EDTA/L，pH 8.0，補充有 2.5 mg/mL溶菌 酶。

HuCAL-Fab抗體在大腸桿菌中之表現及純化 在具有1 L 2χ補充有34 pg/mL氣黴素之TY培養基的震盪 器燒瓶培養物中進行由pMORPHX9_FH編碼之Fab片段在 TG-1 F-細胞中的表現。在用0.5 mM IPTG誘導之後，使細 胞在30°C生長20小時。準備細胞小球之全細胞溶解（溶菌 酶）且藉由HT-IMAC-純化分離Fab片段。藉由尺寸排阻層 析法（SEC)使用校準標準來測定表觀分子量。藉由UV分光 光度法測定濃度。 實例2 : OPN陽性純系之篩選 如下所述，使用ELISA檢定方法藉由關於抗原結合篩選 實例1中產生之純系來進一步鑑定OPN陽性純系。 針對直接塗佈之OPN的篩選 使用hOPN及mOPN蛋白以及SSP1肽進行初級篩選及二級 篩選。在4°C將hOPN以12.5 pg/mL之濃度（於PBS中稀釋）隔 150155.doc -84- 201110982 夜塗佈於Maxisorp®微量滴定板，mOPN係以5 pg/mL之濃 度塗佈。 在隔夜培育後，用PBST(PBS/0.05°/〇 Tween20)洗滌經塗 佈之板兩次，且在室溫在微板震盪器上以5% MPBST(5% 奶粉於PBST中）阻斷1小時。用PBST洗滌板兩次，隨後添 加一次抗體（微表現之HuCAL® Fab的粗提取物、經純化之 HuCAL® Fab、抗 OPN單株對照抗體 AKm2Al，1:200， Santa Cruz #SC-21742)。在室溫在微板震盪器上培育含有 一次抗體之板1小時。用PBST洗滌板兩次，且為了偵測 HuCAL® Fab，添加於0.5% MPBST中1:5000稀釋之二次抗 體（山羊抗人類F(ab)2片段特異性-AP標記之抗體，Jackson 目錄號109-055-097)。在室溫在微板震盪器上培育含有二 次抗體之板1小時。用TBST(TBS/0.05°/〇 Tween20)洗滌各孔 五次，添加 Attophos(AttoPhos Substrate Set, Roche, #11681982001)(於水中1:10稀釋）且在430 nm激發下記錄 535 nm下之勞光發射。 使用經生物素標記之OPN蛋白的捕獲篩選 用20微升/孔之於PBS(pH 7.4)中稀釋至最終濃度為10 pg/mL之NeutrAvidinTM生物素結合蛋白（Pierce，目錄號 #3 1000)塗佈 Maxisorp(Nunc, Rochester, NY, USA)384 孔 板，在4°C及450 rpm下在微板震盪器上培育隔夜。 第二天，使用TBST(TBS/0.05% Tween20)洗滌板兩次且 使用90微升/孔之Superb lock溶液（Pierce，目錄號#37545) 阻斷1小時。使用TBST洗滌經阻斷之板三次，隨後培育1 0 150155.doc -85- 201110982 微升/孔之經生物素標記之人類或小鼠θΡΝ蛋白（2 Pg/mL)2 小時。使用TBST洗滌板三次，隨後藉由培育9〇毫升/孔之 於TBS中之10% BSA阻斷1小時。最後使用TBST洗滌板五 次，隨後在室溫下培育40微升/孔之BEL提取物h5小時。 隨後使HuCAL® Fab片段結合至所捕獲之經生物素標記之 抗原OPN。用PBST洗滌板兩次，且為了偵測HuCAL® Fab ’添加於0.5% MPBST中1:5000稀釋之二次抗體（山羊抗 人類F(ab)2片段特異性-AP標記之抗體，jackson目錄號 #109-055-097)。在室溫在微板震盪器上培育含有二次抗體 之板1小時。用TBST洗蘇各孔五次，添加

Attophos(AttoPhos Substrate Set, Roche，#11681982001)(於 水中1:10稀釋）且在430 nm激發下記錄535 nm下之螢光發 射。 十二個所選Fab之EC5〇值（如上所述測定）展示於下表2 中〇 表2:十二個所選Fab之ELISA ECSG值的匯總表

Fab 蛋白質ELISA 肽 ELISA hOPN mOPN hOPN 0PN EC5〇 Std EC5〇 Std EC50 Std EC50 Std 6453 1.3 0.5 2.8 1.6 無結合 無 結合 6454 1.5 0.8 393.0 179.6 無結合 無結合 6455 0.7 0.4 n.d. n.d. 無結合 無結合 6989 1.8 2.4 3.7 3.5 0.7 0.4 0.5 0.4 6990 8.3 7.9 3.3 2.1 1.2 1.1 0.4 0.3 6991 3.4 3.3 327.2 214.1 0.3 0.1 49.0 37.00.5 6992 0.9 0.6 4.5 3.1 3.9 5.0 1.0 0.1 6993 1.2 0.8 0.9 0.7 0.4 0.3 0.3 7201 10.5 8.1 15.0 14.1 無結合 無結合 150155.doc • 86 - 201110982 7202 242.0 196.6 16.8 10.7 無結合 無結合 7203 1.7 2.0 12.2 9.8 1.2 n.d. 2.2 1.3 7212 5.2 0.8 9.8 2.1 無結合 無結合 n.d. =未測定；Std=標準差 七個所選IgG(如實例4中所述，將七個所選Fab轉化為全 長人類IgG2抗體）之EC5〇值（如上所述測定）展示於下表3 中〇 表3:七個所選IgG之ELISAEC5G值的匯總表

Fab 蛋白質ELISA 肽El JSA hOPN mO] PN hOPN m〇] PN EC5O Std EC5O Std EC5O Std EC5O Std 6454 1.7 0.4 248.7 45.4 無結合 無結合 6455 1.6 0.2 31.4 1.4 無結合 無結合 6990 2.7 0.5 1.6 0.5 1.1 0.5 1.1 0.3 6991 2.7 0.6 8.5 2.3 0.6 0.4 1.9 1.3 6993 7.1 6.9 2.0 1.5 1.8 1.5 0.9 0.8 7202 3.7 1.0 2.5 0.8 無結合 無結合 7212 3.7 0.4 5.3 0.1 無結合 無結合

Std=標準差 實例3 : HuCAL GOLD® Fab及IgG之表徵 使用如下所述之若干檢定以及如實例2中所述之ELISA 技術進一步表徵所選HuCAL GOLD® Fab及IgG。 細胞黏附檢定 測試HuCAL GOLD® Fab及IgG在Mn2+依賴型設置以及 Mn2+非依賴型設置中抑制OPN介導之轉移性乳癌細胞株 MDA-MB 435(ATCC #HTB-129)黏附的能力。在4°C 用 50微 升/孔之具有或不具有〇·5 mM MnCl2之1 Kg/mL於PBS +(補 150155.doc -87 - 201110982 充有 100 pg/mL CaCh、100 pg/mL MgCh 之 PBS)中稀釋之 hOPN 塗佈 MaxisorpTM 板（Nunc 目錄號 #43711)隔夜。第二 天，用PBS +洗滌板兩次，且在37°C、5% C02下用含有10% BSA之TBS阻斷2小時。在阻斷後，用PBS +洗滌板兩次且 用黏附緩衝液II(HBSS，Gibco #14025-100 ; 50 nM HEPES 緩衝溶液，Gibco #15630-056 ; 1 mg/ml BSA ； 1 mM MnCl2)洗滌一次。將HuCAL GOLD® Fab或IgG於黏附缓衝 液II中稀釋至指定濃度且添加50微升/孔。在37°C、5% C02 下培育板1小時。 使用 Accutase(PAA Laboratories #Lll-007)分離 MDA-MB453細胞。使lx 106個細胞/毫升再懸浮於黏附緩衝液 I(HBSS，Gibco #14025-100 ; 50 nM HEPES緩衝溶液， Gibco #15630-056 ; 1 mg/ml BSA)中，且在 37°C、5% C02 下與鈣黃綠素AM(calcein AM)(1 pg/mL/lO6個細胞， Invitrogen #C3 099)—起培育45分鐘。離心細胞且以ΙχΙΟ6 個細胞/毫升之濃度再懸浮於黏附緩衝液Π中。添加50叫 細胞（1 χΙΟ5個細胞/孔）至含有抗體之孔中，且在37°C、50/〇 C〇2下培育90分鐘。藉由用黏附緩衝液π溫和洗滌各孔5 次，隨後用PBS+洗滌兩次，在最後的洗滌步驟後每孔留 下100 μι PBS來終止黏附。在485 nm激發下記錄535 nm下 之榮光發射。 十二個所選Fab之細胞黏附資料（如上所述測定）展示於 下表4中。對於兩種Fab(7201及7202)未觀測到黏附活性。 未評估Fab 7212。對於Mn2+非依賴型黏附檢定，不能測定 150155.doc -88 - 201110982 IC5Q值。然而，對除7201及7202以外之所有Fab均觀測到抑 制效應（以（+)指示）。 表4:十二個所選Fab之細胞黏附資料的匯總表

Fab Mn2+依賴型黏附檢定 hOPN Mn2+非依賴型黏附檢定 hOFN IC5〇 (nM) Std 6453 117.3 13.7 ㈩ 6454 95.1 42.1 ㈩ 6455 131.4 45.5 (+) 6989 66.9 27.4 (+) 6990 156.8 47.3 ㈩ 6991 264.3 118.7 (+) 6992 98.5 40.1 ㈩ 6993 29.8 22.6 (+) 7201 無抑制 無抑制 7202 無抑制 無抑制 7203 56.1 15.6 (+) 7212 未評估 (+)

Std=標準差 七個所選IgG(如實例4中所述，將七個所選Fab轉化為全 長人類IgG2抗體）之細胞黏附資料（如上所述測定）展示於下 表5中。對於兩種IgG(6455及7202)未觀測到黏附活性。對 於Mn2+非依賴型黏附檢定，不能測定EC5Q值。然而，對除 645 5及7202以外之所有Fab均觀測到抑制效應（以（+)指 示）。 I50155.doc -89- 201110982 表5:七個所選IgG之細胞黏附資料的匯總表

IgG Mn2+依賴型黏附檢定 hOPN Mn2+非依賴型黏附檢定 hOPN ICsoinM) Std 6454 1.3 1.4 ㈩ 6455 無抑制 無抑制 6990 0.4 0.4 ㈩ 6991 0.6 0.1 ㈩ 6993 0.4 0.4 ㈩ 7202 無抑制 無抑制 7212 9.7 4.0 ㈩

Std=標準差 使用溶解平衡滴定（SET)進行親和力測定 為了藉由溶解平衡滴定（SET)測定KD，使用抗體蛋白之 單體部分（至少90%單體含量，藉由分析型SEC分析得知； 分別而言，對於Fab 為 Superdex75(Amersham Pharmacia)， 或對於 IgG 為 Tosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience))。在溶 液中之親和力測定基本上如文獻（Friguet等人，J. /mm /· Mei/zoc/·? 77:305 (1985))中所述來執行。為 了改良 SET方法之敏感性及精確性，將其由經典ELISA轉變為基 於 ECL 之技術（Haenel 等人，339:182-184 (2005))。根據製造商說明書，ffiMSDSulfo-TAG™NHS-Ester(Meso Scale Discovery，Gaithersburg, MD，USA)標記 1 mg/ml山羊抗人類（Fab)2片段特異性抗體（Dianova)。在聚 丙烯微量滴定板中進行實驗，以具有0.5% BSA及0.02% 丁\^61120之？88(?117.4)作為檢定缓衝液。以預期1<：〇至少 150155.doc •90· 201110982 10倍之濃度起始，按2η系列稀釋未經標記之骨橋蛋白。使 用無抗原之孔來測定Bmax值；使用具有檢定緩衝液之孔來 測定背景值。在添加例如25 pM Fab(在60 μί最終體積中之 最終濃度）後，在室溫培育混合物隔夜。所用Fab濃度類似 於預期KD或低於預期kd。 使用於PBS中之3% BSA(50微升/孔）阻斷經抗生蛋白鏈菌 素塗佈之MSD板，隨後棄去阻斷溶液且以〇 2 pg/mL於檢 定緩衝液中之經生物素標記之骨橋蛋白（3 〇微升/孔）塗佈板 1小時。在用檢定緩衝液洗滌經塗佈之MSD板後，轉移經 平衡之樣品至彼等板（30微升/孔）中且培育20分鐘。在洗務 後，添加30微升/孔之最終稀釋度為1:1〇〇〇之MSD磺基_標 飯標s己之偵測抗體（山羊抗人類（Fab)2)至MSD板中，且在

Eppendorf震盪器（700 rpm)上培育30分鐘。 在洗卩'1•、板且添加3 0微升/孔之具有界面活性劑之μ s D讀 取緩衝液 Τ 後’使用 Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD，USA)偵測電化發光信號 β 使用XLfit(IDBS)軟體應用定製擬合模型評估資料。為 了測定Fab分子之KD，根據Haenel等人，价oc/^所 339:182-184 (2005)使用擬合模型。 應用類似方案測定IgG分子之KD值，存在以下差異··添 加完整IgG分子而不是Fab分子至抗原之稀釋系列中，且在 室溫平衡隔夜。隨後如上所述處理樣品。隨後使用根據

Piehler等人，J· Mei/zoi/j 201:189-192 (1997)修改 之擬合模型測定IgG分子之KD值。 150155.doc •91 201110982

用Biacore針對直接塗佈之抗原測定KD 為了測定KD，使用單體Fab部分（至少90%單體含量，藉 由分析型 SEC 分析得知；Superdex75，Amersham Pharmacia) 作為分析物。使用BIAcore3000儀器（Biacore，Sweden)分析 與經固定抗原之結合。 為了固定抗原，使用兩種替代性策略：在人類OPN之情 況下，使經生物素標記之人類OPN結合於經抗生蛋白鏈菌 素塗佈之感測器晶片（Biacore，Sweden)至約300 RU之結合 程度。以相似量的經生物素標記之HSA塗佈參考流槽。在 鼠類OPN之情況下，使用標準EDC-NHS胺偶合化學品共價 固定抗原。以於10 mM乙酸鹽緩衝液（pH 3.5)中之鼠類OPN 塗佈CM5晶片（Biacore，Sweden)至400 RU之程度。對於參 考流槽，使用相應量之HSA。分別藉由注射兩次10 Gly/HCl，pH 1.5(5 μι)及 50 mM 構酸（5 μί)來實現再生。 在具有 0.05% Tween 20 之 Dulbeccos PBS(pH 7.4)(Gibc〇) 中，流動速率為20 pL/min，使用2n連續稀釋列之Fab樣品 進行動力學量測。Fab濃度介於15.6 nM至500 nM之範園 内。各濃度之注射時間為1分鐘，且解離時間設定為最少3 分鐘。將操作緩衝液之空白注射用於雙重參考。使用BIA 評估軟體3.2(Biacore，Sweden)全面擬合所有感測圖以測定 締合速率及解離速率常數（1^„及k。^)，其用於計算親和力 (KD=k0ff/k0n)。 十二個所選Fab之Biacore親和力及/或SET親和力KD資料 (如上所述測定）展示於下表6中。 150155.doc -92- 201110982 表6:十二個所選Fab之親和力的匯總表 Fab Biacore親和力 KD (nM) SET親和力(nM) hOPN mOPN hOPN 6453 373 9 n.d. 6454 16 10 0.4 6455 29 6 11 6989 120 2065 n.d. 6990 140 2272 ：i5 6991 300 1388 3 6992 100 2600 n.d. 6993 70 3985 0.2 7201 20 3300 n.d. 7202 220 9900 6 7203 210 1628 3 7212 n.d. 2463 13 n.d. =未測定

實例4 :使Fab轉化為IgG 為了表現全長IgG，自Fab表現載體次選殖重鏈（VH)及輕 鏈（VL)之可變域片段至人類IgG2a之適當pMorph®._hlg載體 中。使用適當的寡核苷酸（Fab_HC_正向：5'-CCT ACC GTT CGT CTT CAC CCC TG-3'(SEQ ID NO:70) ； Fab_LC_ 正向：5，-GGC ACT GGC TGG TTT CGC TAC-3'(SEQ ID NO:71) ; Fab_HC_反向：5，-CTC GGA GCC AGC GGA AAC AC-3'(SEQ ID NO:72) ; Fab_K_反向：5’-CGG AAA AAT AAA CAC GCT CGG A-3'(SEQ ID NO:73) ; Fab_>,_反向： 5，-GCT CAC ACT CGG TGC GGC TTT C-3'(SEQ ID NO:74))經由PCR擴增可變域，隨後分別使用M/el- 150155.doc -93- 201110982 5/pI(VH)、五coRV-//;?aI(VIA)或五coRV-5WWI(Vk)進行消 化。片段被用於次選殖至pMorph®_hlg2K_l、pMorph®_ 1^2λ_1 或 pMorph®_hIgG2 中 〇 人類IgG2之短暫表現及純化 在以IgG2重鏈及輕鏈表現載體轉染之HKB11細胞中進行 全長人類IgG2之短暫表現。在轉染後3天抑或在轉染後7天 收集細胞培養物上清液且分別增至3倍轉染體積。藉由離 心淨化上清液。 在過濾（0.22 μηι或0.45 μιη)後，對上清液進行標準蛋白 質Α親和性層析（MabSelect SURE, GE)。在pH 3下溶離蛋 白質且在3 M TRIS (pH 8)中進行中和。進一步的後續處理 涉及缓衝液交換成1 xDulbeccos· PBS(Invitrogen)及無菌過 遽（0.2 μηι; Millipore或 Sartorius)。 在變性還原及變性非還 原條件下’以SDS-PAGE或藉由毛細管電泳分析lgG2之純 度。進行ΗΡ-SEC以分析天然態之IgG2製劑。 使用上文在實例1至4中所述之程序產生若干全人類抗 OPN IgG2抗體，包括命名為「MOR-6990」（或6990)、 「MOR-6991」（或 6991)及「MOR-6993」（或 6993)之抗 體，該等抗體描述於本文中。 實例 5 :人類抗體MOR-6990、MOR-6991 及MOR-6993 之 結構表徵 使用標準PCR技術自各自融合瘤獲得編碼MOR-6990、 MOR-6991及MOR-6993單株抗體之重鍵及輕鏈可變區的 cDNA序列且使用標準DNA定序技術定序。 150155.doc • 94· 201110982 6990重鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列分別展示於圖ΙΑ 及1Β中以及SEQ ID ΝΟ:9及7中。6990輕鏈可變區之核苷 酸及胺基酸序列分別展示於圖1C及1D中以及SEQ ID NO:10及 8 中。 6991重鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列分別展示於圖1E 及1F中以及SEQ ID NO:23及21中。6991輕鏈可變區之核苷 酸及胺基酸序列分別展示於圖1 G及1Η中以及SEQ ID NO:24及 22 中。 6993重鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列分別展示於圖11 及1J中以及SEQ ID NO:37及35中。6993輕鏈可變區之核苷 酸及胺基酸序列分別展示於圖1K及1L中以及SEQ ID NO:38及 36 中。 如實例4中所述，6990、6991及6993人類抗體屬於同型 IgG2。6990全長重鏈之核苷酸及胺基酸序列分別展示於圖 2A及2B中以及SEQ ID NO: 13及11中。6990全長輕鏈之核 苷酸及胺基酸序列分別展示於圖2C及2D中以及SEQ ID NO:14及 12 中。 6991全長重鏈之核苷酸及胺基酸序列分別展示於圖2E及 2F中以及SEQ ID NO:27及25中。6991全長輕鏈之核苷酸及 胺基酸序列分別展示於圖2G及2H中以及SEQ ID NO:28及 26中。 6993全長重鏈之核苷酸及胺基酸序列分別展示於圖21及 2J中以及SEQ ID NO:41及39中。6993全長輕鏈之核苷酸及 胺基酸序列分別展示於圖2K及2L中以及SEQ ID NO:42及 150155.doc -95- 201110982 40中。 比較6990重鏈免疫球蛋白序列與已知人類生殖系免疫球 蛋白重鏈序列證明6990重鏈利用人類生殖系3-23之VH 區段、人類生殖系3-22之D區段及人類生殖系jh 4a之JH區 段。使用測定CDR區之Kabat系統進一步分析6990 VH序列 得到如圖1B所示以及分別如SEQ ID NO: 1、2及3所示之重 鍵CDR1 ' CDR2及CDR3區之圖示。 比較6990輕鏈免疫球蛋白序列與已知人類生殖系免疫球 蛋白輕鏈序列證明6990輕鏈利用人類生殖系之vL區段及 人類生殖系JL 3b之JL區段。使用測定CDR區之Kabat系統 進一步分析6990 VL序列得到如圖id所示以及分別如SEQ ID NO:4、5及6所示之輕鍵CDR1、CDR2及CDR3區之圖 示。 比較699 1重鏈免疫球蛋白序列與已知人類生殖系免疫球 蛋白重鏈序列證明699 1重鏈利用人類生殖系vH 3-23之VH 區段、人類生殖系2-2 1之D區段及人類生殖系JH 4a之JH區 段。使用測定CDR區之Kabat系統進一步分析6991 VH序列 得到如圖1F所示以及分別如SEQ ID NO:15、16及17所示之 重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之圖示。 比較6991輕鏈免疫球蛋白序列與已知人類生殖系免疫球 蛋白輕鏈序列證明6991輕鏈利用人類生殖系λΐ-13之VL區 段及人類生殖系JL 3b之JL區段。使用測定CDR區之Kabat 系統進一步分析6991 VL序列得到如圖1H所示以及分別如 SEQ ID NO:18、19 及 20 所示之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3 150155.doc -96- 201110982 區之圖示。 比杈6993重鏈免疫球蛋白序列與已知人類生殖系免疫球 蛋白重鏈序列證明6993重鏈利用人類生殖系Vh :3_23之 區又人類生殖系3-1 〇之D區段及人類生瘦系jh 4a之JH區 敫。使用測定CDR區之Kabat系統進一步分析6993 VH序列 得到如圖1J所示以及分別如SEq ID NO:29、30及31所示之 重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之圖示。 比較6993輕鏈免疫球蛋白序列與已知人類生殖系免疫球 蛋白輕鏈序列證明6993輕鏈利用人類生殖系乂3之％區段及 人類生殖系JL 3b之JL區段。使用測定CDR區之Kabat系統 進一步分析6993 VL序列得到如圖il所示以及分別如SEQ ID NO:32、33及34所示之輕鏈CDR1、CDR2及C DR3區之 圖示。 實例 6 :人類抗體 MOR-6990、MOR-6991 及 MOR-6993 之 生殖系形式 為了使6990、6991及6993抗體之免疫原性降至最低，如 下所述使若干突變回復至生殖系序列。藉由使可變重鏈之 FR1區中的兩個胺基酸回復至生殖系序列來製備6990之生 殖系形式（6990-GL)。該重鏈可變區中改變之兩個胺基酸 殘基（及相應核酸密碼子）可見於圖1M及1N中，其中該等突 變之殘基係藉由加框指示。在6990之輕鏈可變區中，使 FR1區中之五個胺基酸及FR3區中之一個胺基酸回復至生 殖系序列。該輕鏈可變區中改變之六個胺基酸（及相應核 酸密碼子）可見於圖1〇及1P中’其中該等突變之殘基係藉 150155.doc -97- 201110982 由加框指示。 藉由使可變重鏈之FR1區中的兩個胺基酸回復至生殖系 序列來製備6991之生殖系形式（6991-GL)。該重鏈可變區 中改變之兩個胺基酸殘基（及相應核酸密碼子）可見於圖1Q 及1R中’其中該等突變之殘基係藉由加框指示。在6991之 輕鏈可變區中，使FR1區中之兩個胺基酸及FR3區中之一 個胺基酸回復至生殖系序列。該輕鏈可變區中改變之三個 胺基酸（及相應核酸密碼子）可見於圖1S及1T中，其中該等 犬變之殘基係藉由加框指示。 藉由使可變重鏈之FR1區中的兩個胺基酸回復至生殖系 序列來製備6993之生殖系形式（6993-GL)。該重鏈可變區 中改變之兩個胺基酸殘基（及相應核酸密碼子）可見於圖1U 及IV中’其中該等突變之殘基係藉由加框指示。在6991之 輕鏈可變區中，使FR1區中之五個胺基酸、FR2區中之一 個胺基酸及FR3區中之一個胺基酸回復至生殖系序列。該 輕鏈可變區中改變之七個胺基酸（及相應核酸密碼子）可見 於圖1W及IX中，其中該等突變之殘基係藉由加框指示。 實例7 :製備突變體以改良溶解度 為了改良6993-GL之溶解度，在輕鏈可變區之FR2區中 引入點突變（V44K)。該點突變（及相應核酸密碼子）可見於 圖1Y及1Z中，其中該點突變係由粗體指示。 實例8:骨橋蛋白人類單株抗體（MOR6990、MOR6991及 MOR6993)之結合親和力的表徵 使用 Biacore 分析（General Electric Healthcare，Biaeore 150155.doc •98- 201110982 3000)測定單株抗體與骨橋蛋白之結合親和力。為了獲得 標稱親和力量測值，使用標準胺偶合將人類骨橋蛋白 (R&D Systems, 1 433-OP-050/CF)及小鼠骨橋蛋白（R&D Systems，441-OP-050/CF)固定於生物感測器晶片上且在 25.CTC 下在 10 mM HEPES pH 7.4、150 mM Naa、0.005% P20中，使各種濃度之單株抗體（MOR6990、MOR6991及 MOR6993)流過該表面。將結合資料全面擬合成簡單的一 對一結合模型。結果展示於表7中。 表7 : MOR6990、MOR6991及MOR6993之親和力的匯總表

小鼠骨橋蛋白 人類骨橋蛋白 Aa(l/Ms) 幻（1/s) 知(親和力） yui/Ms) 而(親和力） MOR6990 1.83E+05 8.64E-04 4.7nM 9.69E+04 2.03E-03 20.9 nM MOR6991 N/A N/A N/A 4.91 E+05 9.33E-03 19.0 nM MOR6993 6.64E+06 4.96E-03 746_7pM 6.14E+06 4.62E-03 752.0 pM N/A=MOR6991與小鼠骨橋蛋白無可偵測之結合 實例9 :藉由MOR-6993抑制活體内腫瘤生長及轉移 以下研究證明MOR-6993在臨床前乳癌模型中之抗轉移 功效。 MDA-MB-43 5-Luc為以螢光素酶基因轉染之人類乳癌細 胞株。當植入小鼠乳腺脂肪墊（MFP)中時，其誘使形成可 藉由生物發光成像（BLI)量測之腫瘤。 在該研究中，將MDA-MB-435-Luc細胞注射（每個動物注 射3x106個）至在植入前24小時已接受MOR-6993抗體之預 投與（30 mg/kg，每組n=10)的免疫功能不全之SCID BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中。在植入後，每週向動物皮 150155.doc -99- 201110982 下投與6993(10 mg/kg)—次，持續6週。每週量測個別動物 之生物發光一次，持續10週。在自植入起的第40天手術移 除腫瘤’且再監測動物之轉移的出現以及總存活率，持續 50天。 投與6993產生顯著TGI(腫瘤生長抑制），如圖5A所示， 3 0%腫瘤重量減輕。此外，該處理防止或延遲轉移出現（圖 5B)且改良總存活率。在移除後對腫瘤之rnA分析顯示用 6993處理使得OPN mRNA表現降低。 實例10:循環骨橋蛋白之活體内中和 以下研究證明Mor-6990及Mor-6993對内源性小鼠骨橋蛋 白與腫瘤產生之骨橋蛋白的中和作用。 將MDA-MB-43 5-Hal/Luc細胞注射（每個動物注射3χl06 個）至免疫功能不全之SCID B ALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中以 誘發腫瘤形成。當腫瘤達到5 00 mm3時，隨機選擇動物且 靜脈内投與25 mg/kg之Mor-6990或Mor-6993。在給藥後1 小時及24小時收集血液。使用市售ELISA套組（R&D systems)分析血漿中之小鼠及人類骨橋蛋白總量。為了分 析游離骨橋蛋白，用蛋白質G磁珠處理血漿隔夜以移除與 IgG結合之骨橋蛋白。使用市售ELISA套組（R&D systems) 測定游離骨橋蛋白含量。結果證明Mor-6990及Mor-6993均 有效中和小鼠（圖6A)及人類（圖6B)血漿骨橋蛋白。 實例11 : MOR-10475 Fab之ELISA ECS0值及結合親和力 使用人類與小鼠骨橋蛋白兩者以與實例2及3中所述之程 序類似的方式測定MOR-10475之蛋白質ELISA EC5〇值、肽 150155.doc •100- 201110982 ELISAEC50值及BiacoreKD值，且結果展示於表S:中。 表8 : MOR-10475 之 ELISA ECs〇 值及 Biacore KD 值

Fab 10475 蛋白質ELISA 肽 ELISA Biacore hOPN EC5〇 (nM) mOPN ECs〇 (nM) hQPNEC5〇 (nM) mOPN EC.n (nM) hOPN KD (nM) mOPN Kn (nM) 0.6 0.6 0.7 0.7 80 41 序列列表之概要（H-CDR1=重鏈CDR1 ; L-CDR1=輕鏈 CDR1等；6990 =如本文所述之抗體MOR-6990; 6991=如本 文所述之抗體MOR-6991 ; 6993 =如本文所述之抗體MOR-6993 ; VH=可變重鏈區；VL=可變輕鏈區；重鏈=全長重 鏈；輕鏈=全長輕鏈；6990-GL =如本文所述之MOR-6990的 生殖系形式；6991-GL =如本文所述之MOR-6991的生殖系 形式；6993-GL =如本文所述之MOR-6993的生殖系形式； 6993_GL-V44K>如本文所述之包括V44K點突變之MOR-6990的生殖系形式；a.a.=胺基酸；n.a.=核酸）

SEQ ID NO: 描述 SEQ ID NO: 描述 1 H-CDR1 a.a. 6990 41 重鏈n.a· 6993 2 H-CDR2 a.a. 6990 42 輕鍵n.a. 6993 3 H-CDR3 a.a. 6990 43 全長人類OPN a.a.同功異型物b 4 L-CDR1 a.a. 6990 44 VH a.a. 6990-GL 5 L-CDR2 a.a. 6990 45 VH n.a. 6990-GL 6 L-CDR3 a.a. 6990 46 VL a.a. 6990-GL 7. Vh a.a. 6990 47 VL n.a. 6990-GL 8 VL a.a. 6990 48 VH a.a. 6991-GL 9 Vh n.a. 6990 49 VH n.a. 6991-GL 10 Vl n.a. 6990 50 VL a.a. 6991-GL 11 重鍵a.a. 6990 51 VLn.a. 6991-GL 12 輕鏈a.a. 6990 52 VH a.a. 6993-GL 150I55.doc -101 - 201110982 13 重鍵n.a. 6990 53 VH n.a. 6993-GL 14 輕鍵n.a. 6990 54 VL a.a. 6993-GL 15 H-CDRl a.a. 6991 55 VL n.a. 6993-GL 16 H-CDR2 a.a. 6991 56 VL a.a. 6993-GL-V44K 17 H-CDR3 a.a. 6991 57 VLn.a. 6993-GL-V44K 18 L-CDR1 a.a. 6991 58 重鍵6990-GL a.a· 19 L-CDR2 a.a. 6991 59 輕鏈6990-GL a.a. 20 L-CDR3 a.a. 6991 60 重鍵6990-GL n.a. 21 Vh a.a. 6991 61 輕鍵6990-GL n.a· 22 VL a.a. 6991 62 重鏈6991-GL a.a. 23 VH n.a. 6991 63 輕鍵6991-GL a.a. 24 VL n.a. 6991 64 重鍵6991-GL n.a. 25 重鍵a.a· 6991 65 輕鍵6991-GL n.a. 26 輕鏈a.a. 6991 66 重鏈6993-GL a.a. 27 重鏈n.a. 6991 67 輕鍵6993-GL a.a. 28 輕鍵n.a. 6991 68 重鍵6993-GL n.a. 29 H-CDRl a.a. 6993 69 輕鏈6993-GL n.a. 30 H-CDR2 a.a. 6993 70 Fab重鏈正向引子 31 H-CDR3 a.a. 6993 71 Fab輕鏈正向引子 32 L-CDR1 a.a. 6993 72 Fab重鏈反向引子 33 L-CDR2 a.a. 6993 73 Fab κ反向引子 34 L-CDR3 a.a. 6993 74 Fab λ反向引子 35 VH a.a. 6993 75 L-CDR3 a.a. MORI 0475 36 VL a.a. 6993 76 VL a.a. MORI 0475 37 Vh n.a. 6993 77 VL n.a. MORI 0475 38 VLn.a. 6993 78 輕鍵a.a. MORI 0475 39 重键a.a. 6993 40 輕键a.a. 6993 【圖式簡單說明】 圖1A展示MOR-6990重鏈可變區之DNA序列-相應CDR區 加有下劃線（SEQ ID NO:9);

圖1B展示MOR-6990重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID 150155.doc -102- 201110982 NO:7)-CDR區加有下劃線； 圖1C展示MOR-6990輕鏈可變區之DNA序列-相應CDR區 加有下劃線（SEQ ID NO:10); 圖ID展示MOR-6990輕鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO:8)-CDR區加有下劃線； 圖1E展示MOR-6991重鏈可變區之DNA序列-相應CDR區 加有下劃線（SEQ ID NO:23); 圖IF展示MOR-6991重鏈可變區之胺基酸序列（SEq id NO:21)-CDR區加有下劃線； 圖1G展示MOR-6991輕鏈可變區之DNA序列-相應CDR區 加有下劃線（SEQ ID NO:24); 圖1H展示MOR-6991輕鏈可變區之胺基酸序列（SEq ID NO:20)-CDR區加有下劃線； 圖II展示MOR-6993重鏈可變區之dnA序列-相應CDR區 加有下劃線（SEQ ID NO:37); 圖1J展示MOR-6993重鏈可變區之胺基酸序列（SEq ID NO:35)-CDR區加有下劃線； 圖1K展示MOR-6993輕鏈可變區之dna序列-相應CDR區 加有下劃線（SEQ ID NO:38); 圖1L展示MOR-6993輕鏈可變區之胺基酸序列（SEq ID NO:36)-CDR區加有下劃線； 圖1M展示MOR-6990-GL重鏈可變區之DNA序列，其中 藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線（SEQ ID NO:45)； 150155.doc -103. 201110982 圖IN展示MOR-6990-GL重鏈可變區之胺基酸序列，其 中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線 (SEQ ID NO:44)； 圖10展示MOR-6990-GL輕鏈可變區之DNA序列，其中 藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線（SEQ ID NO:47)； 圖IP展示MOR-6990-GL輕鏈可變區之胺基酸序列，其中 藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線（SEQ ID NO:46)； 圖1Q展示MOR-6991-GL重鏈可變區之DNA序列，其中 藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線（SEQ ID NO:49)； 圖1R展示MOR-6991-GL重鏈可變區之胺基酸序列，其 中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線 (SEQ ID NO:48)； 圖IS展示MOR-6991-GL輕鏈可變區之DNA序列，其中藉 由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線（SEQ ID NO:51)； 圖IT展示MOR-6991-GL輕鏈可變區之胺基酸序列，其中 藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線（SEQ ID NO:50)； 圖1U展示MOR-6993-GL重鏈可變區之DNA序列，其中 藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線（SEQ ID NO:53)； 150155.doc -104- 201110982 圖IV展示MOR-6993-GL重鏈可變區之胺基酸序列，其 中藉由加框展示生殖系突變’且相應CDR區加有下書彳線 (SEQ ID NO:52)； 圖1W展示MOR-6993-GL輕鏈可變區之DNA序列，其中 藉由加框展示生殖糸突變’且相應C D R區加有下劃線（s e q ID NO:55)； 圖IX展示MOR-6993-GL輕鏈可變區之胺基酸序列，其 中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有下劃線 (SEQ ID NO:54)； 圖1Y展示MOR-6993-GL-V44K輕鏈可變區之DNA序列， 其中藉由加框展示生殖系突變，V44K突變係以粗體展 示，且相應CDR區加有下劃線（SEQIDNO:57); 圖1Z展示MOR-6993-GL_V44K輕鏈可變區之胺基酸序 列，其中藉由加框展示生殖系突變，V44K突變係以粗體 展示，且相應CDR區加有下劃線（SEQIDNO:56); 圖 2A 展示 MOR-6990 重鏈之 DNA 序列（SEQ ID NO:13)， 其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示恆定 區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖2B展示MOR-6990重鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 11) ’其中以大寫字母展示可變區序列’而以小寫字母展 示怪定區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖 2C展示 MOR-6990輕鏈之 DNA序列（SEQ ID NO:14)， 其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示恆定 區序列’且相應C D R區加有下劃線； 150155.doc -105- 201110982 圖2D展示MOR-6990輕鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 1 2)，其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展 示恒定區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖 2E展示 MOR-6991 重鏈之 DNA序列（SEQ ID N0.27)， 其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示恆定 區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖2F展示MOR-6991重鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 25) ，其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展 示恆定區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖 2G 展示 MOR-6991 輕鏈之 DNA 序列（SEQ ID NO:28)， 其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示恆定 區序列’且相應C D R區加有下劃線， 圖2H展示MOR-6991輕鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 26) ，其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展 不惶定區序列’且相應C D R區加有下劃線， 圖 21 展示 MOR-6993 重鏈之 DNA序列（SEQ ID NO:41)， 其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示恆定 區序列’且相應C D R區加有下劃線， 圖2J展示MOR-6993重鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 3 9)，其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展 示恆定區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖 2K展示 MOR-6993 輕鏈之 DNA序列（SEQ ID ΝΟ··42)， 其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示恆定 區序列，且相應CDR區加有下劃線； 150155.doc -106- 201110982 圖2L展示MOR-6993輕鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 40)，其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展 示恆定區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖 2M展示 MOR-6990-GL 重鏈之 DNA序列（SEQ ID NO: 60) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CI)R區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 十互定區序列， 圖2N展示MOR-6990-GL重鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 5 8)，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 恒定區序列； 圖 20展示 MOR-6990-GL輕鏈之 DNA序列（SEQ ID NO: 61) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 怪定區序列； 圖2P展示MOR-6990-GL輕鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 59)，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 怪定區序列， 圖 2Q 展示 MOR-6991-GL 重鏈之 DNA 序列（SEQ ID NO: 64)，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 十亙定區序列， 圖2R展示MOR-6991-GL重鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 150155.doc -107- 201110982 62) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 十互定區序列， 圖 2S 展示 MOR-6991-GL 輕鏈之 DNA 序列（SEQ ID NO: 65) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 怪定區序列， 圖2T展示MOR-6991-GL輕鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 63) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 恒定區序列， 圖 2U展示 MOR-6993-GL 重鏈之 DNA序列（SEQ ID NO: 68) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 恆定區序列； 圖2V展示MOR-6993-GL重鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 66) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 十亙定區序列， 圖 2W展示 MOR-6993-GL輕鏈之 DNA序列（SEQ ID NO: 69) ，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展示 恆定區序列； 圖2X展示MOR-6993-GL輕鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 150155.doc -108- 201110982 67)，其中藉由加框展示生殖系突變，且相應CDR區加有 下劃線；以大寫子母展示可變區序列，而以小寫字母展示 恆定區序列； 圖3展示人類OPN同功異型物b(Genbank NP_000573)之 胺基酸序列（SEQ ID NO:43)。 圖4A展示MOR-10475輕鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO:76)-CDR區加有下劃線； 圖4B展示MOR-10475輕鏈可變區之DNA序列-相應CDR 區加有下劃線（SEQ ID NO:77); 圖4C展示MOR-10475輕鏈之胺基酸序列（SEQ ID NO: 7 8)，其中以大寫字母展示可變區序列，而以小寫字母展 示恆定區序列，且相應CDR區加有下劃線； 圖5A展示MOR-6993在乳癌臨床前模型中對腫瘤重量之 影響； 圖5B展示MOR-6993在乳癌臨床前模型中對轉移之影 響； 圖6A展示MOR-6990及MOR-6993對小鼠骨橋蛋白之中 和；及 圖6B展示MOR-6990及MOR-6993對人類骨橋蛋白之中 和0 150155.doc -109- 201110982 序列表 <110>美商輝瑞大藥廠 <120>骨橋蛋白(OSTEOPONTIN)抗體 <130> PC33873 <140> 099127862 <141> 2010-08-19 <150> 61/235,542 <151> 2009-08-20 <160> 78 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213>智人 <400> 1

Ser Asn Tyr Val Met His <210> 2 <211> Π <212> PRT <213>智人 <400〉 2

Ser lie Phe Gly Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213>智人 <400> 3

Arg Ser Ala Ser Ser Gly Phe Gly Phe Ala Gly Tyr Gly lie Asp Ser 15 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213>智人 <400> 4

Ser Gly Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 5

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213>智人 150155-序列表.doc 201110982 <400> 6

Gin Ser Trp Asp Leu Phe His Ser Ser Val 1 5 10 4T人 712? 0>1>12>3> <21<21<21<21 <400> 7

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ser lie Phe Gly Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Ala Ser Ser Gly Phe Gly Phe Ala Gly Tyr Gly lie Asp 100 105 110

Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 8 <211> 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 8

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Asp Leu Phe His Ser Ser 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 150155-序列表.doc 201110982 100 105 <210> 9 <211> 372 <2\2> DNA <213>智人 <400> 9 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg agctgcgcgg cctccggatt taccttttct aattatgtta tgcattgggt gcgccaagcc cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct atctttggtt ctggtagcga tacctattat gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcggtctgct tcttctggtt ttggttttgc tggttatggt attgattctt ggggccaagg caccctggtg acggttagct ca <210> 10 <211> 321 <212> DNA <213>智人 <400> 10 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc tcgtgtagcg gcgattctct tcgttattat tatgctcatt ggtaccagca gaaacccggg caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aataagcgtc cctcaggcat cccggaacgc tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa gacgaagcgg attattattg ccagtcttgg gatctttttc attcttctgt gtttggcggc ggcacgaagt taaccgtcct a <210〉 11 <211> 450 <212> PRT <213>令人 <400> 11

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ser lie Phe Gly Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Ala Ser Ser Gly Phe Gly Phe Ala Gly Tyr Gly He Asp 100 105 110 150155-序列表.doc 201110982

Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Va] His Thr 165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 210 215 220

Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Giu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 .Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro GIu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 -4- 150丨55-序列表.doc 201110982

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys 450 <210> 12 <211> 213 <212> PRT <213>智人 <400> 12

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Asp Leu Phe His Ser Ser 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala loo 105 no

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala 115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 180 185 190

Ser Cys Gin Val Thr His Glu Giy Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 13 <211> 1350 <212> DNA <213>智人

C 150155-序列表.doc 201110982 <400> 13 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct aattatgtta tgcattgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagctct atctttggtt ctggtagcga tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcggtctgct 300 tcttctggtt ttggttttgc tggttatggt attgattctt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct cagccagcac caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc ctgcagcaga 420 agcaccagcg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc 480 gtgaccgtga gctggaacag cggagccctg accagcggcg tgcacacctt ccccgccgtg 540 ctgcagagca gcggcctgta cagcctgagc agcgtggtga ccgtgcccag cagcaacttc 600 ggcacccaga cctacacctg caacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 accgtggagc ggaagtgctg cgtggagtgc cccccctgcc ctgcccctcc tgtggccgga 720 ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgca gtttaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga acagttcaac 900 agcaccttcc gggtggtgtc cgtgctgacc gtggtgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gaatacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aagacaaagg gccagcccag ggaaccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggaa 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc £agaacaact acaagaccac cccccccatg 1200 ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagcCga cagtggacaa gagccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgtc ccccggcaaa 1350 <210> 14 <211> 639 <212> DNA <213>智人 <400> 14 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgattctct tcgttattat tatgctcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggc£ccag ttcttgtgat ttatgatgat aataagcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttgg gatctttttc attcttctgt gtttggcggc 300 ggcacgaagt taaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg 360 ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 420 tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600 agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttca 639 <210> 15 150155·序列表.doc 201110982 <211> 6 <212> PRT <213>智人 <400> 15

Asn Asn Tyr Ala Val Ser b > > > > I 0 12 3 o ' · -_* · 11Λ) 2222 4 1 < < < < < G1

Ly a 5 VI Γ e s p s na Γ Ty Γ yo T1 Γ Th n s Γ e s y y G 5 Γ Ty Γ c s y G1 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213>智人 <400> 17

Arg Thr Leu Gly Gly Asp Phe Asp His <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213>智人 <400> 18

Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn Tyr Va] Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 19

Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213>智人 <400> 20

Gin Ser Phe Thr Gin Met Leu Leu Val <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213>智人 <400> 21 G y G1 Γ 6 s u G, a VC u Le n G, va n Gl1 y —5 G1 o pr Πmva u Le y n Gl 150155-序列表.doc 201110982

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30

Aia Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Aia Arg Thr Leu Gly Gly Asp Phe Asp His Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 22

Asp lie Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Giy Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Aia Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Phe Thr Gin Met Leu S5 90 95

Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 23 <211> 351 <212> DNA <213>智人 <400> 23 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg agctgcgcgg cctccggatt tacctttaat aattatgctg tttcttgggt gcgccaagcc cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcggt atctcttatg gtggtagcaa tacctattat gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 150155-序列表.doc 300201110982 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtactctt ggtggtgatt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 24 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 24 gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaattatg tgaattggta ccagcagttg cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat ggtaattcta agcgtccctc aggcgtgccg gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa agcgaagacg aagcggatta ttattgccag tcttttactc agatgcttct tgtgtttggc ggcggcacga agttaaccgt ccta 60 120 180 240 300 324 <210> 25 <211> 443 <212> PRT <213>智人 <400> 25 Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 SO

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Thr Leu Gly Gly Asp Phe Asp His Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn 180 185 190 150155-序列表.doc -9- 201110982

Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro 210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn 260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285

Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300

Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys 325 330 335

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 26 <211> 214 <212> PRT <213>智人 <400> 26

Asp lie Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn •10- 150155-序歹丨J表.doc 201110982

Tyr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Phe Thr Gin Met Leu 85 90 95

Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys 100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin 115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190

Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 27 <211> 1329 <212> DNA <213>智人 <400> 27 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agetgegegg cctccggatt tacctttaat aattatgctg tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcggt atetettatg gtggtagcaa tacctattat 180 geggatageg tgaaaggccg ttUaccatt teaegtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeggaagat acggccgtgt attattgege gcgtactctt 300 ggtggtgatt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agccagcacc 360 aagggcccca gcgtgttccc cctggccccc tgcagcagaa gcaccagcga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgag ctggaacagc 480 ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540 agcctgagca gcgtggtgac cgtgcccagc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 600 aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga ccgtggagcg gaagtgctgc 660 -11 - 150155·序列表.doc 201110982 gtggagtgcc ccccctgccc tgcccctcct cccaagccca aggacaccct gatgatcagc gacgtgagcc acgaggaccc cgaggtgcag cacaacgcca agaccaagcc ccgggaggaa gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg aacaagggcc tgcctgcccc catcgagaaa gaaccccagg tgtacaccct gccccccagc ctgacctgtc tggtgaaggg cttctacccc ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cccggcaaa <210> 28 <211> 642 <212> mk <213>智人 <400> 28 gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgaagacg aagcggatta ttattgccag ggcggcacga agttaaccgt cctaggtcag ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac gggagcaccg tggagaagac agtggcccct gtggccggac cctccgtgtt cctgttcccc 720 cggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 780 tttaattggt acgtggacgg cgtggaggtg 840 cagttcaaca gcaccttccg ggtggtgtcc 900 aacggcaaag aatacaagtg caaggtgtcc 960 accatcagca agacaaaggg ccagcccagg 1020 cgggaggaaa tgaccaagaa ccaggtgtcc 1080 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1140 ccccccatgc tggacagcga cggcagcttc 1200 agccggtggc agcagggcaa cgtgttcagc 1260 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc 1320 1329 agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc 60 tctaattatg tgaattggta ccagcagttg 120 ggtaattcta agcgtccctc aggcgtgccg 180 agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa 240 tcttttactc agatgcttct tgtgtttggc 300 cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 aaggccacac tggtgtgtct c'ataagtgac 420 aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 acagaatgtt ca 642 T人 296即智 > > > > 012 3 11 li 11 <1· 2 2 2 2 < < < < <400> 29

Thr Thr Ser Ser Met His <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <400> 30

Arg He Ser Ser His Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly -12· 150155-序列表.doc 201110982 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213>智人 <400> 31

Arg Asp Met Tyr Arg Gly Val Tyr Gly Phe Ala Leu 1 5 10 T人 3211PR智 10>11>12>13> 222 2 <400> 32

Ser Gly Asp Ala lie Arg Asn Tyr Tyr Val His 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 33

Glu Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213>智人 <400> 34

Gin Ser Tyr Asp Lys Ser Asn Val Val OT人 3512PR智35 <210> <211> <212> <213> <400>

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Ser 20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Arg lie Ser Ser His Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 -13 - 150155-序列表.doc 201110982

Ala Arg Asp Met Tyr Arg Gly Val Tyr Gly Phe Ala Leu Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 106 <2I2> PRT <213r>智人 <400> 36

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Ser Cys Ser Gly Asp Ala lie Arg Asn Tyr Tyr Val 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Glu Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Lys Ser Asn Val Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 37 <211> 360 <212> mh <213>智人 <400> 37 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg agctgcgcgg cctccggatt tacctttact acttcttcta tgcattgggt gcgccaagcc cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagccgt atctcttctc atggtagcaa tacctattat gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt Uacgtgata attcgaaaaa caccctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatatg tatcgtggtg tttatggttt tgctctttgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca <210> 38 <211> 318 <212> DNA <213>智人 <400> 38 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc tcgtgtagcg gcgatgctat tcgtaattat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg caggcgccag ttcttgtgat ttatgaggat tctgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc tttagqggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gataagtcta atgttgtgtt tggcggcggc • 14- 150155·序列表.doc 318 201110982 acgaagttaa ccgtccta <210> 39 <211> 446 <212> PRT <213>智人 <400> 39

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Ser 20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Arg lie Ser Ser His Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Met Tyr Arg Gly Val Tyr Gly Phe Ala Leu Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro 245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 -15- 150155-序列表.doc 201110982

Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val GIu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300

Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser 325 330 335

Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415

Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210〉 40 <211> 212 <212> PRT <213>智人 <400> 40

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Ser Cys Ser Gly Asp Ala lie Arg Asn Tyr Tyr Val 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Glu Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Lys Ser Asn Val Val 85 90 95

Phe G]y Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala Ala 100 105 110 -16· 150155-序列表.doc 201110982

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn 115 120 125

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val 130 135 140

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu 145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser 180 185 190

Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro 195 200 205

Thr Glu Cys Ser 210 <210〉 41 <2U> 1338 <212> DNA <213>智人 <400> 41 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttact acttcttcta tgcattgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagccgt atctcttctc atggtagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatatg 300 tatcgtggtg tttatggttt tgctctttgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccct gcagcagaag caccagcgag 420 agcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 480 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcaacttcgg cacccagacc 600 tacacctgca acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtggagcgg 660 aagtgctgcg tggagtgccc cccctgccct gcccctcctg tggccggacc ctccgtgttc 720 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc gaggtgcagt ttaattggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggaac agttcaacag caccttccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt ggtgcaccag gactggctga acggcaaaga atacaagtgc 960 aaggtgtcca acaagggcct gcctgccccc atcgagaaaa ccatcagcaa gacaaagggc 1020 cagcccaggg aaccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gggaggaaat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccatgct ggacagcgac 1200 ggcagcttct tcctgtacag caagctgaca gtggacaaga gccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1320 •17- 150155·序列表.doc 201110982 agcctgtccc ccggcaaa 1338 <210> 42 <211> 636 <212> DNA <213>智人 <400> 42 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgatgctat tcgtaattat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttatgaggat tctgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gataagtcta atgttgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa ccgtcctagg tcagcccaag gctgccccct cggtcactct gttcccgccc 360 tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 420 ccgggagccg tgacagtggc ct^gaaggca gatagcagcc ccgtcaasgc gggagtggag 480 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg 540 acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc 600 accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttca 636 <210> 43 <211> 300 <212> PRT <213>智人 <400> 43

Met Arg lie Ala Val lie Cys Phe Cys Leu Leu Gly lie Thr Cys Ala 1 5 10 15 lie Pro Val Lys Gin Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gin Leu 20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro 35 40 45

Ser Gin Lys Gin Asn Leu Leu Ala Pro Gin Thr Leu Pro Ser Lys Ser 50 55 60

Asn Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp 65 70 75 80

Asd His Val Asp Ser Gin Asp Ser lie Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp 85 90 95

Val Asd Asp Thr Asp Asp Ser His Gin Ser Asp Glu Ser His His Ser loo 105 no

Aso Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala y 115 120 125

Thr Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly 130 135 140

Are Glv Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe 145 150 155 160 -18 - 150155-序列表.doc 201110982

Arg Arg Pro Asp lie Gin Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp He Thr 165 170 175

Ser His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala lie Pro 180 185 190

Val Ala Gin Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys 195 200 205

Asp Ser Tyr Glu Thr Ser Gin Leu Asp Asp Gin Ser Ala Glu Thr His 210 215 220

Ser His Lys Gin Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser 225 230 235 240

Asn Glu His Ser Asp Val lie Asp Ser Gin Glu Leu Ser Lys Val Ser 245 250 255

Arg Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val 260 265 270

Val Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg lie 275 280 285

Ser His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Set Glu Val Asn 290 295 300 <210> 44 <211> 124 <212> PRT <213>智人 <400> 44

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Scr Gly Phe Thr Phe Scr Asn Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Scr lie Phe Gly Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu G.„ Met Asn Ser Leu Arg Ala G,u Asp A,a Va, Tyr Tyr Cys

Ala Arg Ser Ala Ser Ser Gly Phe Gly Phe Ala Gly Tyr Gly lie Asp 100 105 110

Ser Trp Gly G.n G.y T.r Leu Val T.r Val Ser Ser <210> 45 19· 150〗55·序列表.doc 201110982 <211> 372 <212> DNA <213>智人 <400> 45 gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg tcctgcgccg ccagcggctt caccttcagc aactacgtga tgcactgggt gaggcaggcc cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcttcggca gcggcagcga cacctactac gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagcgcc agcagcggct tcggcttcgc cggctacggc atcgacagct ggggccaggg caccctggtg accgtgagct ca <210> 46 <211> 107 <2\2> PRT <213>智人 <400> 46

Scr Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Asp Leu Phe His Ser Ser 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 47 <211> 321 <212> DNA <213>智人 <400> 47 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg agcgtgagcc ccggccagac cgccagcatc acctgcagcg gcgacagcct gaggtactac tacgcccact ggtaccagca gaagcccggc cagagccccg tgctggtgat ctacgacgac aacaagaggc ccagcggcat ccccgagagg ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccatg gacgaggccg actactactg ccagagctgg gacctgttcc acagcagcgt gttcggcggc ggcaccaagt taaccgtcct a 012 3 · · 1i * 2 2 ΛΖ 2 < < V < 7'T人 48HP 智 -20- 150155-序列表.doc 201110982 <400> 48

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Yal 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 SO

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Thr Leu Gly Gly Asp Phe Asp His Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 351 <212> DNA <213> %人 <400> 49 gaggtgcaat tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttaat aattatgctg tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcggt atctcttatg gtggtagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtactctt 300 ggtggtgatt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210〉 50 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 50

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin •21 · 150155·序列表.doc 201110982 65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Phe Thr Gin Met Leu 85 90 95

Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 51 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 51 cagagcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc 60 tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaattatg tgaattggta ccagcagttg 120 cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat ggtaattcta agcgtccctc aggcgtgccg 180 gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa 240 gccgaagacg aagcggatta ttattgccag tcttttactc agatgcttct tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt ccta 324 <210> 52 <211> 120 <212> PRT <213>智人 <400> 52

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Ser 20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Arg lie Ser Ser His Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Met Tyr Arg Gly Val Tyr Gly Phe Ala Leu Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 360 <212> DNA . <213>智人 <400> 53 gaggtgcaat tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttact acttcttcta tgcattgggt gcgccaagcc 120 -22- 150155·序列表.doc 201110982 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagccgt atctcttctc atggtagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg uttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatatg 300 tatcgtggtg tttatggttt tgctctttgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213>智人 <400〉 54

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Scr Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 1 5 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Ala He Arg Asn Tyr Tyr Val 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyi 35 40 45

Glu Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Lys Ser Asn Val Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 8 A人 5531s智 0717赛 11 11 1» <2<2<2<2 <400> 55 agctacgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttagcc caggtcagac cgcgagcatc 60 acctgtagcg gcgatgctat tcgtaattat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 cagagcccag ttcttgtgat ttatgaggat tctgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcgatg 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gataagtcta atgttgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa ccgtccta 318 <210> 56 <211> 106 <212> PRT <213>智人 <400> 56

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Scr Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Ala lie Arg Asn Tyr Tyr Va! 20 25 30 -23- 150155-序列表.doc 201110982

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Val lie Tyr 35 40 45

Glu Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr He Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Lys Ser Asn Val Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 57 <211> 318 <212> DNA <213>智人 <400> 57 agctacgagc tgacccagcc ccctagcgtg tccgtgagcc ctggccagac cgccagcatc acatgcagcg gcgacgccat ccggaactac tatgtgcatt ggtatcagca gaagcccggc cagagcccca agctggtcat ctacgaggac agcgacagac ccagcggcat ccccgagaga ttcagcggca gcaacagcgg caataccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccatg gacgaggccg actactactg ccagagctac gacaagagca acgtggtgtt cggcggaggg accaagctga ccgtccta <210> 58 <21i> 450 <212> PRT <213>智人 <400> 58

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ser lie Phe Gly Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Ala Ser Ser Gly Phe Gly Phe Ala Gly Tyr Gly lie Asp 100 105 110

Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 •24· 60 120 180 240 300 318 150155-序列表.doc 201110982

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 210 215 220

Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro -25 · 150155-序列表.doc 201110982 435 440 445

Gly Lys 450 <210> 59 <211> 213 <212> PRT <213>智人 <400> 59

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Asp Leu Phe His Ser Ser 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala 100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala 115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 180 185 190

Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser 210 3135ΓΛ <210〉 <211> <212> <213> <400> 60 gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg -26- 150155-序列表.doc 201110982 tcctgcgccg ccagcggctt caccttcagc aactacgtga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcttcggca gcggcagcga cacctactac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagcgcc 300 agcagcggct tcggcttcgc cggctacggc atcgacagct ggggccaggg caccctggtg 360 accgtgagct cagccagcac caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc ctgcagcaga 420 • agcaccagcg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc 480 gtgaccgtga gctggaacag cggagccctg accagcggcg tgcacacctt ccccgccgtg 540 ctgcagagca gcggcctgta cagcctgagc agcgtggtga ccgtgcccag cagcaacttc 600 ggcacccaga cctacacctg caacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 accgtggagc ggaagtgctg cgtggagtgc cccccctgcc ctgcccctcc tgtggccgga 720 ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgca gtttaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga acagttcaac 900 agcaccttcc gggtggtgtc cgtgctgacc gtggtgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gaatacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aagacaaagg gccagcccag ggaaccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggaa 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccatg 1200 ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga cagtggacaa gagccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgtc ccccggcaaa 1350 <210> 61 <211> 639 <212> DNA <213>智人 <400> 61 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg agcgtgagcc ccggccagac cgccagcatc 60 acctgcagcg gcgacagcct gaggtactac tacgcccact ggtaccagca gaagcccggc 120 cagagccccg tgctggtgat ctacgacgac aacaagaggc ccagcggcat ccccgagagg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccatg 240 gacgaggccg actactactg ccagagctgg gacctgttcc acagcagcgt gttcggcggc 300 ggcaccaagt taaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg 360 ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 420 tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600 agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttca 639 <210> 62 <211> 443 <2U> PRT <213>智人 •27· 150155-序列表.doc 201110982 <400> 62

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Thr Leu Gly Gly Asp Phe Asp His Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn 180 185 190

Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro 210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn 260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285

Giu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 •28- 150155-序列表.doc 201110982

Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys 325 330 335

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 63 <211> 214 <212> PRT <213>智人 <400> 63

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Phe Thr Gin Met Leu 85 90 95

Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys 100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin 115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 •29- 150155-序列表.doc 201110982

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190

Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 64 <211> 1329 <2\2> DNA <213>智人 <400> 64 gaggtgcaat tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttaat aattatgctg tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcggt atctcttatg gtggtagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtactctt 300 ggtggtgatt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agccagcacc 360 aagggcccca gcgtgttccc cctggccccc tgcagcagaa gcaccagcga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgag ctggaacagc 480 ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540 agcctgagca gcgtggtgac cgtgcccagc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 600 aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga ccgtggagcg gaagtgctgc 660

Stggagtgcc ccccctgccc tgcccctcct gtggccggac cctccgtgtt cctgttcccc 720 cccaagccca aggacaccct gatgatcagc cggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 780 gacgtgagcc acgaggaccc cgaggtgcag tttaattggt acgtggacgg cgtggaggtg 840 cacaacgcca agaccaagcc ccgggaggaa cagttcaaca gcaccttccg ggtggtgtcc 900 gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg aacggcaaag aatacaagtg caaggtgtcc 960 aacaagggcc tgcctgcccc catcgagaaa accatcagca agacaaaggg ccagcccagg 1020 gaaccccagg tgtacaccct gccccccagc cgggaggaaa tgaccaagaa ccaggtgtcc 1080 ctgacctgtc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1140 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccatgc tggacagcga cggcagcttc 1200 ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag agccggtggc agcagggcaa cgtgttcagc 1260 tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc 1320 cccggcaaa 1329

<210> 65 <211> 642 <212> DNA 30- J50155-序列表.doc 201110982 <213>智人 <400> 65 cagagcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc 60 tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaattatg tgaattggta ccagcagttg 120 cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat ggtaattcta agcgtccctc aggcgtgccg 180 gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa 240 gccgaagacg aagcggatta ttattgccag tcttttactc agatgcttct tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210> 66 <211> 446 <212> PRT <213>智人 <400> 66

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Ser 20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Arg lie Ser Ser His Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Sex Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Met Tyr Arg Gly Val Tyr Gly Phe Ala Leu Trp Gly Gin 100 丨 05 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Lr Val Ser

Trp Asn Ser Gly Ala Leu TT,r Ser G.y Val His Lr Phe Pro Ala Val

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Scr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 150155-序列表.doc -31 - 201110982 180 185 190

Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro 245 250 255

Giu Vai Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270

Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300

Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Oly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 325 330 335

Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Va] Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415

Gin Gin Gly Asa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <2i0> 67 <211> 212 <212> PRT <213>智人 <400> 67

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15 -32- 150155-序列表.doc 201110982

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Ala lie Arg Asn Tyr Tyr Val 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Glu Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly lie Pro G)u Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Lys Ser Asn Val Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn 115 120 125

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val 130 135 140

Thr Val Ala Ττρ Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu 145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Scr Ser 165 170 - 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser 180 185 190

Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro 195 200 205

Thr Glu Cys Ser 210 <210> 68 <211> 1338 <212> DNA <213>智人 <400> 68 gaggtgcaat tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg agctgcgcgg cctccggatt tacctttact acttcttcta tgcattgggt gcgccaagcc cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagccgt atctcttctc atggtagcaa tacctattat gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatatg tatcgtggtg tttatggttt tgctctttgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccct gcagcagaag caccagcgag agcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcaacttcgg cacccagacc -33- 150155-序列表.doc 201110982 tacacctgca acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtggagcgg 660 aagtgctgcg tggagtgccc cccctgccct gcccctcctg tggccggacc ctccgtgttc 720 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc gaggtgcagt ttaattggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggaac agttcaacag caccttccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt ggtgcaccag gactggctga acggcaaaga atacaagtgc 960 aaggtgtcca acaagggcct gcctgccccc atcgagaaaa ccatcagcaa gacaaagggc 1020 cagcccaggg aaccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gggaggaaat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccatgct ggacagcgac 1200 ggcagcttct tcctgtacag caagctgaca gtggacaaga gccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1320 agcctgtccc ccggcaaa 1338 <210> 69 <211> 636 <212> DNA <213>智人 <400> 69 agctacgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttagcc caggtcagac cgcgagcatc 60 acctgtagcg gcgatgctat tcgtaattat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 cagagcccag ttcttgtgat ttatgaggat tctgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcgatg 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gataagtcta atgttgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa ccgtcctagg tcagcccaag gctgccccct cggtcactct gttcccgccc 360 tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 420 ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag 480 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg 540 acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc 600 accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttca 636 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 70 cctaccgttc gtcttcaccc ctg 23 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400〉 71 ggcactggct ggtttcgcta c 21 34· 150155-序列表.doc 201110982 <210〉 72 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 72 ctcggagcca gcggaaacac <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 73 cggaaaaata aacacgctcg ga <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 74 gctcacactc ggtgcggctt tc <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <400> 75

Gin Ala Trp Asp Leu lie Asn Ser His Val 1 5 10 <210> 76 <211〉 107 <212> PRT <213>智人 <400〉 76

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp Leu lie Asn Ser His 85 90 95 -35 150155-序列表.doc 201110982

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 77 <211> 321 <212> DNA <213>智人 <400> 77 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc tcgtgtagcg gcgattctct tcgttattat tatgctcatt ggtaccagca gaaacccggg caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aataagcgtc cctcaggcat cccggaacgc tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa gacgaagcgg attattattg ccaggcttgg gatcttatta attctcatgt gtttggcggc ggcacgaagt taaccgtcct a <210> 78 <211> 213 <212> PRT <213>智人 <400> 78

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Fro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr He Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp Leu lie Asn Ser His 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala 100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Π5 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 180 185 190 •36· 60 120 180 240 300 321 150155-序列表.doc 201110982

Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser 210 -37· 150155-序列表.doc

Claims (1)

1. 201110982 七、申請專利範圍： 1. 一種特異性結合於骨橋蛋白（osteopontin)之經分離抗體 或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分包含： (a) 如 SEQ ID N0:1 所示之H-CDR1、如 SEQ ID N0:2所 示之 H-CDR2、如 SEQ ID NO:3 所示之 H-CDR:;、如 SEQ ID NO:4所示之L-CDR1、如 SEQ ID N0:5所示之L-CDR2 及如 SEQ ID N0:6所示之L-CDR3 ; (b) 如 SEQ ID N0:15所示之H-CDR1、如 SEQ ID N0:16 K*iH-CDR2、WSEQIDNO:17K*iH-CDR3、W SEQ ID N0:18所示之 L-CDR1、如 SEQ ID N0:19所示之 L-CDR2及如 SEQ ID NO:20所示之 L-CDR3 ; (c) 如 SEQ ID N〇:29所示之 H-CDR1、如 SEQ ]:D NO:30 所示之H-CDR2、如SEQ ID N0:31所示之H-CDR3、如 SEQ ID NO:32所示之L-CDR1、如 SEQ ID NO:33所示之 L-CDR2及如 SEQ ID NO:34所示之L-CDR3 ;或 (d) 如 SEQ ID NO:l 所示之H-CDR1、如 SEQ ID NO:2 所 示之 H-CDR2、如 SEQ ID NO:3 所示之 H-CDR3、如 SEQ ID NO:4所示之 L-CDR1、如 SEQ ID NO:5所示之 L-CDR2 &WSEQIDNO:75K*iL-CDR3。 2. —種特異性結合於骨橋蛋白之經分離抗體或其抗原結合 部分，其中該抗體或抗原結合部分包含如SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID ΝΟ_·48 或 SEQ ID NO:52所示之 VH鏈胺基 酸序列。 150155.doc 201110982 3. 如請求項2之抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原 結合部分進一步包含如SEQ ID ΝΟ··8、SEQ ID ΝΟ··22、 SEQ ID ΝΟ:36、SEQ ID ΝΟ:46、SEQ ID ΝΟ:50、SEQ ID NO :54或SEQ ID NO :76所示之Vl鏈胺基酸序歹4。 4. 一種特異性結合於骨橋蛋白之經分離抗體，其中該抗體 包含如 SEQ ID NO:ll、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:5 8、SEQ ID NO:62 或 SEQ ID NO:66所示之重 鏈胺基酸序列，其限制條件為該重鏈胺基酸序列之C端 離胺酸殘基視情況不存在。 5. 如請求項4之經分離抗體，其進一步包含如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:59、SEQ ID N〇:63、SEQ ID NO:67或 SEQ ID NO:78 所示之輕鏈胺基酸序列。 6. 一種經分離抗體或其抗原結合部分，其包含由以下編碼 之 VH 鏈：（i)包含 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49或 SEQ ID NO:53 之核酸序列，或（ii)在高度嚴格條件下與SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:53之互補股雜交的核酸序列，其 中該抗體或抗原結合部分特異性結合於骨橋蛋白。 7. 如請求項6之經分離抗體或抗原結合部分，其進一步包 含由以下編碼之VL鏈：⑴包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO··51、SEQIDNO:55或SEQIDNO:77之核酸序列，或 150155.doc 201110982 (11)在高度嚴格條件下與SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:24、SEQ id NO:38、SEQ ID NO:47、SEQ ID N〇:51、SEQ ID NO:55 或 SEQ ID NO:77 之互補股雜交的 核酸序列’其中該抗體或抗原結合部分特異性結合於骨 橋蛋白。 8. 如請求項1至7中任一項之抗體，其為igGl或IgG2。 9. 如請求項1至8中任一項之抗體，其為人類抗體、人類化 抗體或嵌合抗體。 10. 如請求項9之抗體，其為合成人類抗體。 11. 如請求項1至7中任一項之抗原結合部分，其為Fab或“π 抗體片段。 12. 種核I，其編瑪如請求項1至11中任一項之抗體或抗 原結合部分。 13·種載體’其包含如請求項1 2之核酸。 14· 種伤主細胞’其包含如請求項13之載體。 15_如請求項14之宿主細胞，其中該細胞為細菌細胞。 16.如請求項14之宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。 1 7· 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之抗 體或抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 18. -種治療異常細胞生長之方法其包括向有此需要之個 體投與有效量的如請求項17之醫藥組合物。 19. :種減少個體之腫瘤細胞轉移的方法，其包括向該個體 投與有效量的如請求項17之醫藥組合物。 20· -種製備抗骨橋蛋白抗體或其抗原結合部分之方法，其 150155.doc 201110982 包括在如請求項14之宿主細胞中表現該抗體或抗原結合 部分。 150155.doc