TW201118176A - Mammalian cell culture processes for protein production - Google Patents

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201118176 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係、關於培養產生蛋白f產物，較佳糖基化蛋白質 產物之哺乳動物細胞之新穎方法。實施該等細胞培養方法 ' 可獲得高細胞活力且亦可獲得高產物品質及生產率、延長 - 生長期並在死亡期期間降低死亡速率。 【先前技術】 較佳使用動物細胞培養，尤其哺乳動物細胞培養用於表 現用於治療性及/或預防性應用之以重組方式產生之糖基 化蛋白質。重組糖蛋白之糖基化模式具有重要意義，此乃 因糖蛋白之寡糖側鏈影響蛋白質功能，以及蛋白質令不同 區域間之分子内相互作用。糖蛋白之蛋白質構象及三級結 構中涉及該等分子内相互作用。（例如，參見A· wittwer等 人，1990，Biochemistry, 29:4175-4180 ; Hart，1992, Curr. Op. Cell Biol., 4.1017-1023 ; Goochee 等人，1991， Bio/Technol.，9:1347-1355 ;及 R.B. Parekh，1991，Curr. Op. Struct. Biol·，1:750-754)。此外，募糖可用於使特定多肽 靶向某些基於特定細胞碳水化合物受體之結構。（Μ.P. Bevilacqua等人，1993, J. Clin. Invest.，91:379-387 ; R.Μ. • Nelson等人，1993，J. Clin. Invest.，91:1157-1166 ; Κ.Ε.

Norgard等人，1993，Proc· Natl. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072及 Y. Imai 等人，1993, Nature，361-555-557)。 已知糖蛋白寡糖側鏈之末端唾液酸組份對糖蛋白之多個 態樣及特性有影響，包括吸收、溶解度、熱穩定性、血清 151112.doc 201118176 半衰期、血清清除率、以及其物理及化學結構/特徵及其 免疫原性。（A. Varki，1993，Glycobiology，3:97-100 ; R.B.

Parekh，同前，Goochee 等人，同前，j Pauls〇n 等人， 1989，TIBS，14:272-276 ;及 Α· K〇bata，1992, Eur ; Biochem.，209:483-501 ; E.Q. Lawson等人，1983, Arch Biochem. Biophys.，220:572-575 ;及 E. Tsuda等人，199〇, Eur. J. Biochem.，188:405-411)。 唾液酸在糖蛋白中之量受兩個相反過程影響：唾液酸藉 由唾液酸轉移酶活性進行之細胞内加成及唾液酸藉由唾液 酸酶裂解進行之細胞外移除。 唾液酸之細胞内加成係在轉運高爾基體中進行之糖基化 過程之最後階段。此涉及將唾液酸自核苷酸糖前體（CMp_ 唾液酸）酶促轉移至附接至新合成蛋白之新出現聚糖結構 上之可用半乳糖上。對該過程之可引起不完全唾液酸化之 可能的限制包括CMP-唾液酸之可用性、唾液酸轉移酶之 /舌性、半乳糖在新出現聚糖結構上之量及半乳糖基轉移酶 之活性。業内已對經由唾液酸轉移酶及糖基轉移酶之基因 過表現及酶活性增強來使唾液酸化最大化進行了大量研 九。Zhang# 人（Biochim Biophys Acta 1425(3):1998, 441_ 52)報導，人類α2,6·唾液酸轉移酶在產生組織纖溶酶原活 化劑（tPA)之CHO細胞中之表現可增強tpA之α2,6_唾液酸 化。Weikert 等人（Nat Biotechn〇1 17(11):1999, 1 1 16 21)報 導，α2,3-唾液酸轉移酶與…冷半乳糖基轉移酶之共表現 可使TNK-tPA及TNFR-IgG之唾液酸化大於9〇%。此外，補 151112.doc 201118176 加適當量之錳（Μη2 + )(β1，4-半乳糖基轉移酶之輔因子）可顯 著降低唾液酸化程度較低之部分中rHuEP〇之量，提高碳 水化合物位點佔有率，並將該等唾液酸化程度較低之物質 中之碳水化合物分支（Zhang等人，1998)限制為二天線（bi_ antennary)結構（Crowell等人，BiotechnolBioeng 96(3).538_ • 49, 2007) 〇 唾液酸在糖蛋白中之量亦受唾液酸藉由唾液酸酶裂解進 行細胞外移除之影響。Gramer及G〇〇chee (Bi〇techn〇1 pr〇g 9(4):366·73，1993)已證實，在CHO灌注培養中，乳酸脫氫 酶（LDH)之増加（其表示細胞裂解增加）與細胞外唾液酸酶 之活性提高有關。Gu 等人（Biotechnol Bioeng 55(2):390-8, 1997)亦表明，在整個長期分批培養期間，干擾素(iFN· γ)中末端唾液酸之顯著損失伴隨著CH〇細胞活力之降低及 同時死亡細胞之增加。 因此’為延遲細胞死亡之開始及提高細胞活力，必須降 低或避免此降解效應。 一般而言，在基於哺乳動物細胞培養之系統中蛋白質表 現程度顯著低於微生物表現系統（例如細菌或酵母表現系 • 統）。然而，細菌及酵母細胞之以下能力有限：以最適方 . 式表現高分子量蛋白質產物、正確摺疊具有複雜立體結構 之蛋白質、及/或提供所需翻譯後修飾以使所表現糖蛋白 成熟’由此影響產物之免疫原性及清除率。 由於培養動物或哺乳動物細胞，尤其可產生重組產物之 動物或哺乳動物細胞之限制，人們已研究了多種參數之操 151112.doc 201118176 縱’包括採用大規模培養容器；改變基本培養條件，例如 培育溫度、溶解氧濃度、pH、及諸如此類；使用不同類型 之培養基及培養基添加劑；及提高所培養細胞之密度。此 外，用於哺乳動物細胞培養之方法研發可受益於以下能力 之進步：延長運行時間從而在維持高產物品質的同時提高 終產物激度。重要產物品質參數係多狀產物中糖基化結構 之程度及完全性’其中-般使用唾液酸含量作為糖蛋白品 質之量度》 Μ 細胞培養方法，尤其非連續性方法之運行時間通常受限 於細胞之剩餘活力，而細胞活力通常隨運行過程進行而下 降。因此期望最大可能地延長高細胞活力。產物品質問題 亦為人們使活細胞密度之降低最小化及維持高細胞活力施 加了動力，此乃因細胞死亡可將唾液酸酶釋放至培養物上 清液中，從而可降低所表現蛋白中之唾液酸含量。蛋白質 純化問題為人們使活細胞密度之降低最小化及維持高細胞 活力施加了另一動力。培養物中細胞碎片及死細胞内含物 之存在可對在培養運行結束時分離及/或純化蛋白質產物 之旎力造成負面影響。在培養中使細胞活力保持較長時 間，由此可伴隨地降低培養基中由細胞蛋白及酶（例如細 胞蛋白酶及唾液酸酶）造成之污染，該污染可引發降格並 最終降低細胞所產生期望糖蛋白之品質。 人們已研究各種參數以在細胞培養中獲得高細胞活力。 一參數涉及在37°C下開始培養後單獨降低培養溫度（例 如，Roessler等人，1996, Enzyme and Micr〇bial Techn〇1〇gy， 151112.doc 201118176 18:423-427 ; 1998年頒予T. Etcheverry等人之美國專利第 5,705,364 號及第 5,721，121 號；1999 年頒予 K. Fimikawa 等 人之美國專利第5,976,833號；頒予L. Adamson等人之美國 專利第5,851，800號；頒予Genentech公司之WO 99/61650及 WO 00/65070 ;頒予 Biogen公司之 WO 00/36092 ;及頒予 ' Girard等人之美國專利第4,357,422號）。 所研究其他參數涉及向培養物中添加各組份。已顯示生 長因子抑制劑舒拉明（suramin)可在CHO K1 :CycE細胞之指 數生長期間防止細胞凋亡（Zhangi等人，Biotechnol. Prog. 2〇〇〇，16，3 19-325)。然而，舒拉明不能在死亡期期間防止 細胞〉周亡。因此，舒拉明能在生長期期間維持高活力，但 不此延長培養壽命。相同著者報導，對於Ch〇 1 π -10PF細 胞系而言’硫酸葡聚糖及聚乙烯硫酸鹽與舒拉明類似，可 相對於對照培養提高第3天之活細胞密度及活力。然而， 其未報導硫酸葡聚糖或聚乙烯硫酸鹽在死亡期期間之效 應°亦報導舒拉明、硫酸葡聚糖及聚乙烯硫酸鹽可有效防 止細胞聚集。 在見蟲細胞培養基中補加地塞米松（dexaniethasone)或N· 乙酿甘露糖胺對經由杆狀病毒表現載體系統（BEvS)製備之 • 蛋白質之複雜糖基化（包括將末端唾液酸殘基加成至N-連 接券糖上）之效應揭示於2〇〇2年頒予Boyce Thompson研究 所（Plant Research 公司（Ithaca, NY))之美國專利第 M72175 號中》 蛋白質治療藥物因其尺寸、結構複雜性、及生物產生之 151112.doc 201118176 性質而具有固有異質性（Chirino及Mire_SIuis, Nat Biotechnoi 2004; 22438^39^。甚至在「純」蛋白質溶液中，亦存在 一定百分比之低分子量片段、高分子量物質、及不同程度 之化學修飾。高分子量物質之形成通常係由於蛋白質聚集 所致，其係在製造生物製品期間遇到之常見問題。通常 認為聚集體之存在係不期望的，此乃因業内擔心聚集體可 引發免疫原性反應或可在投與後引發不良事件（Cr〇mwen 等人，AAPS J. 2006; 8:Ε572_579)β儘管某些類型之生物 製品聚集體可發揮正常功能，但維持產物品質之一致性仍 然很重要’此75因產品-致性係行政審批之先決條件。 蛋白質聚集體可因若干種機制而產生且可在製程期間之 每一 Ρ皆段發生。在細胞培養中’分泌蛋白可能會曝露於不 利於蛋白質穩定性之條件中；但更經常地，大量蛋白質之 積累可因未摺疊蛋白質分子之相互作用或因負責正確摺疊 之刀子伴侶對新生肽鏈之識別無效而導致細胞内聚集 (CromweU等人，AAPS 2〇〇6; 8:Ε572 579)。在細胞内質 網㈣）中’新合成蛋白在氧化性環境中形成二硫鍵。在正 常條件下，蛋白質疏基可逆氧化為蛋白質二硫化物及次項 酸’但更高氧化態（例如蛋白質半胱胺酸之亞靖酸及續酸 形式）係不可逆的（Th_及 MaUis，Exp Ger〇nt〇1. 2〇〇1; 36.1519_1526)。過氧化蛋白f可含有錯誤二硫鍵或具有與 "居蛋白之混合二硫鍵；任—情形都會導致蛋白質 (Nat Cell Biol. 錯誤指疊及聚集。因此在ER中維持適當受控之氧化性環境 至關重要。就此而言，Cu〇zz〇及 151112.doc 201118176 199W)首先證實，在酵母中麵胱甘肽可緩衝现 過氧化’且後來^请如及㈣㈣㈣⑹以⑽謂令 279:39872-39879)確認，在哺乳動物細胞中，亦需要麵胱 甘肽來調節進入分泌路徑之蛋白質内天然二硫鍵之形成。 隨著培養物巾產物濃度之增加，在細胞培養過程中可觀 • 冑到產物品質降低’如藉由量測寡糖糖基結構中之唾液酸 含量來確定。it常，如藉由藥物清除研究來確定，可接受 唾液酸含量存在下限。最佳地，培養中細胞所產生蛋白質 具有高豐度，同時最終回收用於既定用途之蛋白質具有高 品質。 ^ 以重組方式產生之經正確糖基化之蛋白質產4勿在醫學及 臨，上愈來愈重要，其用作治療性藥物、治療藥物及預防 性藥物。因此，研發可經濟有效地獲得提高之最終蛋白質 產物濃度以及高產物品質等級（例如藉由唾液酸含量來確 定）之可靠細胞培養方法可滿足業内期望及所需之目標。 【發明内容】 $ 本發明提供藉由動物或哺乳動物細胞培養來產生蛋白 質，較佳重·组蛋白質產物、更佳糖蛋白產物之新賴方法。 • 該等新賴方法可在後期獲得提高之活細胞密度、細胞活 . 力、生產率及唾液酸含量及降低之蛋白質聚集。 本發明一態樣係關於向培養基中添加糖皮質激素。在此 態樣中，本發明細胞培養方法可有利地獲得提高之比生產 率（例如糖蛋白）以及提高由所培養細胞產生之糖蛋白中之 唾液酸含量。更具體而言，根據本發明，在細胞培養期間 15I112.doc 201118176 添加糖皮質激素可使培養物中之細胞保持高細胞活力，且 可使所產生產物在整個培養運行期間保持較高產量及品 質。同樣，根據本發明一態樣，在培養過程中添加糖皮質 激素可有利地容許延長培養之生產期。在延長之生產期期 間’期望產物之效價提高；產物品質（如藉由唾液酸含量 所表徵）維持在較高等級；1白質聚集程度維持在較低程 度且細胞活力亦維持在較高程度。此外，與本發明培養方 法有關之經延長生產期使得產物產量可超過標準生產期期 間之產量。 在一具體態樣中，本發明提供一種製程（或方法），其中 藉由添加糖皮質激素來提高比生產率，降低蛋白質聚集程 度且k咼所產生糖蛋白中之唾液酸含量。糖皮質激素化合 物較佳係地塞米松。根據此具體態樣，添加糖皮質激素可 維持培養物之高細胞活力，由此使得可延長生產期，在此 期間產物，較佳重組產物之效價提高且產物品質（如藉由 唾液s文含里所表徵）維持在較高等級。在細胞培養過程期 間，添加糖皮質激素可使產物產生中之蛋白質效價與唾液 酸含量之間通行的折衷最小化。因此，添加糖皮質激素可 對培養方法中重要性能參數（即「終點（即最終）效價」X 「終點（即最終）唾液酸」X「單體含量」之數學乘積（「終 點效價X終點唾液酸」X「終點單體含量」））之提高產生正 面效應。 在本發明一態樣中，在接種時或在接種後開始初始死亡 期之前、或在初始生長期期間、或在初始生長期之後半部 151112.doc -10- 201118176 分期間、或在初始生長期結束時或結束前後某一時間點將 糖皮質激素化合物添加至培養物中。根據本發明之此態 樣，生長期延長一段時間及/或死亡期之開始延遲—段時 間，例如若干天。 在本發明之另一較佳態樣中且如本文進一步闡述，新研 發之細胞培養方法涉及添加糖皮質激素化合物，其尤其適 合於藉由經遺傳改造而可表現並產生可溶性CTLA4分子及 可溶性CTLA4突變分子（例如CTLA4Ig& L1〇4EA29Yiy之 宿主細胞來產生該等蛋白。本發明較佳實施例涵蓋培養產 生CTLA4Ig及L104EA29YIg之細胞，其涉及在培養運行期 間添加糖皮質激素化合物以獲得大量高品質CTLA4ig& L104EA29YIg產物（如藉由唾液酸量測及/或最終產物之低 蛋白質聚集來確定）。 在閱讀本發明詳細說明並參照圖示/圖表後可瞭解本發 明之其他態樣、特徵及優點。 【實施方式】 本發明闡述在哺乳動物或動物細胞培養中產生蛋白質， 較佳重組蛋白質產物、更佳糖蛋白產物之新穎方法。該等 方法達成提高之活細胞密度、細胞活力、生產率及唾液酸 含量以及降低之蛋白質聚集。 在一實施例中’本發明係關於細胞培養方法，其包含： 培養表現目標蛋白之宿主細胞；及將糖皮質激素化合物添 加至細胞培養物中。 糖皮質激素化合物包括（但不限於）氫化可的松（可購自 151112.doc 201118176

Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)、潑尼松（prednisone)(可購 自 Sigma-Aldrich)、潑尼松龍（可購自 Sigma-Aldrich)、曱潑 尼龍（methylprednisolone)(可購自 Sigma-Aldrich)、地塞米 松（可購自 Sigma-Aldrich)、倍他米松（betamethasone)(可購 自 Sigma-Aldrich)、曲安西龍（triamcinol〇ne)(可賭自 Sigma-

Aldrich) 、 乙 酸氟氫 可的松（fludrocortisone acetate)(可購自

Sigma-Aldrich)。該等化合物可容易地自所列示來源購 得，或可容易地經由熟習此項技術者已知之方式獲得。 較佳糖皮質激素化合物包括（但不限於）氫化可的松、潑 尼松龍、倍他米松及地塞米松。最佳者係地塞米松。 在本發明一實施例中，糖皮質激素化合物係在接種時添 加或可為基礎培養基中之組份。接種係在第〇天進行。 在本發明一實施例中’糖皮質激素化合物係在接種後某 一時間點添加’即其在基礎培養基中不存在且在接種時不 存在。較佳地’僅在培養第1天或之後添加糖皮質激素化 合物。 根據本發明’可在指定時間段期間經一次、兩次、三次 或任一次數將糖皮質激素化合物添加至細胞培養物中。可 聯合使用一或多種糖皮質激素化合物。亦即，任一給定單 次添加糖皮質激素化合物可包括添加一或多種其他糖皮質 激素化合物。類似地，若不止一次添加糖皮質激素化合 物，則可在不同添加中添加不同糖皮質激素化合物。可在 添加糖皮質激素化合物之前、同時或之後_即在指定時間 段期間或其他時間將額外化合物及物質（包括糖皮質激素 15II12.doc •12· 201118176 化合物）添加至培養物中。在一較佳實施例中單一（即一 次）添加糖皮質激素化合物。在一較佳實施例中，添加一 種糖皮質激素化合物。 根據本發明，可藉由任—方式將糖皮質激素化合物添加 至細胞培養物中。添加糖皮質激素化合物之方式包括（但 ' 不限於）以其所獲得之形式溶於DMSO中、溶於有機溶劑 中、洛於水中、溶於培養基中、溶於補料培養基中、溶於 適宜培養基中、或其任一組合。 車乂佳地，以溶液形式添加DEX，其中使DEx溶於乙醇 中隧後用水稀釋以供進一步使用（即例如將DEX添加至 補料培養基中）。 根據本發明，添加糖皮質激素化合物以使其在培養物中 之濃度達到適宜程度。作為非限制性實例，添加糖皮質激 素化5物至/辰度為1 nM-1 mM。較佳地，添加糖皮質激素 化&物至漢度為1 ηΜ-0.1 μΜ或〇· 1 μΜ- 1 0 μΜ ;更佳約5 ηΜ-15 ηΜ或0.5 μΜ-5 μΜ ;更佳約 1〇 ηΜ或 1 μΜ目標量。 根據本發明，培養可在添加糖皮質激素化合物後運行任 一時間長度。培養運行時間可由熟習此項技術者根據諸如 以下等相關因素來確定：可回收蛋白之量及品質、及上清 ' 液中因細胞裂解所產生之污染性細胞物質之含量（例如蛋 白質及DNA)，該等物質會妨礙目標蛋白之回收。 在本發明提咼細胞活力之細胞培養製程及方法之特定實 施例中，糖皮質激素化合物係在接種後在開始初始死亡期 之前某一時間點添加。較佳地’糖皮質激素化合物係在接 151112.doc -13- 201118176 種後在初始生長期期間某一時間點添加。更佳地，糖皮質 激素化合物係在初始生長期之後半部分期間添加。更佳 地，糖皮質激素化合物係在初始生長期結束時或結束前後 添加。 初始生長期係指在未指定添加糖皮質激素化合物時觀察 到之生長期。初始死亡期係指在未指定添加糖皮質激素化 合物時觀察到之死亡期。 初始生長期可在初始死亡期開始時結束，或在初始生長 期與初始死亡期之間可存在任一時間長度之靜止期。 舉例而言，在初始生長期係自第〇天至第6天且初始死亡 期始於第7天之細胞培養中，在一特定實施例中糖皮質激 素化合物係在接種後且在第7天之前某一時間點添加。在 一具體實施例中，糖皮質激素化合物係在接種後且在第6 天之前添加。在一具體實施例中，糖皮質激素化合物係在 第1天與第6天之間添加。在另一具體實施例中，糖皮質激 素化合物係與補料培養基一起在第3·6天添加。在其他具 體實施例中，糖皮質激素化合物係大約在第2天或在第2天 添加。 已發現（參見實例3) ’在實施本發明時細胞培養物之活 力延長。若在一條件（例如添加糖皮質激素化合物）存在下 之時間段中培養物之細胞活力高於不存在該條件時之細胞 活力’則該條件可使細胞活力延長。 因此，在其他實施例中，本發明係關於（1)細胞培養方 法，及（2)延長培養物中之細胞活力之方法，其包含：培養 151112.doc -14· 201118176 表現目標蛋白之宿主細胞；及將糖皮質激素化合物添加至 、.’田见培養物中’其中細胞培養物之細胞活力有所延長。 已發現（參見實例3) ’若糖皮質激素化合物係在接種後 且在開始初始死亡期之前某一時間點添加，則死亡期中之 死亡速率可降低至低於在未添加糖皮質激素化合物時於死 亡期中觀察到之死亡速率。 因此，在其他實施例中，本發明係關於（1)細胞培養方 法，及（2)降低細胞培養之死亡期中之死亡速率之方法，其 包含.培養表現目標蛋白之宿主細胞；及在接種後在開始 初始死亡期之前某—時間點將糖皮f激素化合物添加至細 胞培養物中；死亡期中之死亡速率有所降低。在其他 特定實施例令’本發明係關於（1)細胞培養方法，及（2)降 低細胞培養之死亡期中之死亡速率之方法，其包含：培養 才丁蛋白之伤主細胞，及在接種後在初始生長期期間 某一時間點將糖皮質激素化合物添加至細胞培養物中；其 中死亡期中之死亡速率有所延遲。在其他特定實施例中， 本發明係騎⑴細胞培養方法，及⑺降低細胞培養之死 =期中之死亡速率之方法，纟包含：培養表現目標蛋白之 胞及在初始生長期之後半部分期間將糖皮質激素 化合物添加至細胞培養物中；其中死亡期中之死亡速率有 =降低。在其他特定實施例中，本發明係關於降低細胞培 =之死:期中之死亡速率之方法，其包含：培養表現目標 :之：主細胞；及在初始生長期結束時或結束前後將糖 質，素化合物添加至細胞培養物中；其巾死亡期中之死 15im.doc •15· 201118176 亡速率有所延遲。 實例3亦證實，氫化可的松（HYC)、潑尼松龍（pRD)及地 塞米松（DEX)在經處理細胞培養物中與未經處理細胞培養 物相比皆顯示劑量依賴性細胞保護效應。然而，達成相同 程度之細胞保護效應需要較高濃度之HYC及prd，此與其 效能差異一致（即HYC及PRD之有效性僅為DEX之5%及 20%) 〇 細胞培養方法，尤其非連續性方法之運行時間通常受剩 餘活細胞密度限制，活細胞密度在死亡期期間降低。較長 運行時間可谷許獲得較高產物效價。產物品質問題亦為人 們降低死亡速率施加了動力，此乃因細胞死亡可將唾液酸 酶釋放至培養物上清液中，從而可降低所表現蛋白質中之 唾液酸含量。蛋白質純化問題為人們延遲或阻止死亡期施 加了另一動力。培養物中細胞碎片及死細胞内含物之存在 可對在培養運行結束時分離及/或純化蛋白質產物之能力 造成負面影響。 已發現（參見實例2)，將糖皮質激素化合物添加至細胞 培養物中可降低目標蛋白質之聚集。 因此，在其他實施例中，本發明係關於（1)細胞培養方 法，及（2)降低蛋白質聚集百分比之方法，其包含：培養表 現目標蛋白之宿主細胞；及將糖皮質激素化合物添加至細 胞培養物中；其中高分子量物質之百分比有所降低。 已發現（參見實例1)，將糖皮質激素化合物添加至細胞 培養物中可藉由提高總唾液酸含量及提高唾液酸化物質之 151112.doc 201118176 百分比來改良目標蛋白之唾液酸化。 實例1亦證實，氫化可的松（HYC)、潑尼松龍（pRD)及地 塞米松（DEX)在經處理細胞培養物中與未經處理細胞培養 物相比皆顯示劑量依賴性唾液酸化改良。然而，達成相同 程度之改良需要較高濃度之HYC及PRD，此與其效能差異 一致。 因此，在其他實施例中，本發明係關於（1)細胞培養方 法，及（2)提高唾液酸化物質之百分比之方法，其包含：培 養表現目標蛋白之宿主細胞；及將糖皮質激素化合物添加 至細胞培養物中；其中唾液酸化物質之百分比有所提高。 因此，在其他實施例中’本發明係關於（1)細胞培養方 法，及（2)提高總唾液酸含量之方法，其包含：培養表現目 標糖蛋白之宿主細胞；及將糖皮質激素化合物添加至細胞 培養物中；其中總唾液酸含量有所提高。 因此’在其他實施例中，本發明係關於（1)細胞培養方 法’及（2)降低細胞培養物中糖蛋白之去唾液酸化比率之方 法’其包含：培養表現目標糖蛋白之宿主細胞；及將糖皮 質激素化合物添加至細胞培養物中；其令去唾液酸化比率 有所降低。 關於糖蛋白純化及分析之技術與程序 在本發明所涵蓋之培養方法中，根據需要通常在總細胞 培養期結束時使用業内已知並實踐之分離及純化方法來收 集、回收、分離及/或純化、或實質性純化細胞所產生蛋 白。較佳地，自培養基或上清液中分離培養細胞所分泌之 151U2.doc -17· 201118176 蛋白質；然而，亦可使用業内已知並實踐之方法自宿主細 胞（例如細胞裂解物）回收蛋白質，且如下文進一步闡述。 若期望，可藉由習用碳水化合物分析技術以常規方式分 析藉由本發明方法產生之包含糖蛋白之複合碳水化合物。 舉例而言，業内熟知之諸如凝集素印跡等技術揭示末端甘 露糖或諸如半乳糖等其他糖之比例。單·、二-、三_或四_ 天線寡糖之唾液酸末端可藉由使用無水肼或酶促方法自蛋 白質釋放糖且藉由離子交換層析、尺寸排除層析或業内熟 知之其他方法對寡糖實施分級分離來確認。 亦可在用神經胺酸酶處理之前及之後量測糖蛋白之？1以 移除唾液酸。pI在神經胺酸酶處理後升高，表示唾液酸存 在於糖蛋白上。碳水化合物結構通常以N_連接或〇_連接碳 水化合物形式存於所表現蛋白質上。N_連接及〇連接碳水 化合物之不同之處主要在於其核心結構β N•連接糖基化係 指碳水化合物部分經由GlcNAC附接至肽鏈中之天冬醯胺 殘基上。N-連接碳水化合物皆含有共通之Manl_6(Man卜3) 心結構，其中尺在此核心 結構中代表天冬醯胺殘基。所產生蛋白質之肽序列可含有 天冬醯胺-X-絲胺酸、天冬醯胺_χ_蘇胺酸、及天冬醯胺_χ· 半胱胺酸，其中X係除脯胺酸以外之任一胺基酸。 反之，〇-連接碳水化合物之特徵在於共通之核心結構， 其係附接至蘇胺酸或絲胺酸之羥基上之GalNAc。在Ν_連 接及0-連接碳水化合物中’最重要者係複合Ν及〇_連接碳 水化合物。該等複合碳水化合物含有若干天線結構。單_ 151112.doc •18· 201118176 立―、二-、及四-外部結構對末端唾液酸之加成具有重要 義"亥等外。p鏈結構為包含蛋白質產物之碳水化合物之 特疋糖及連接提供額外位點。 所得碳水化合物可藉由業内已知之任-方法來分析。業 内已知右^種用於糖基化分析之方法且其可用於本發明背 景中。料方法提供關於附接至所產生肽之寡糖之屬性及 組成之資訊。適用於本發明之碳水化合物分析方法包括 (但:限於m集素層析法；HPAEC_PAD，其使用高pH陰離 子交換層析法，基於電荷來分離寡糖；nmr ;質譜： HPLC，GPC，單糖組成分析；及連續酶促消化。 此外’釋放寡糖之方法為業内已知且已操作之方法。該 等方法匕括1)酶促方法，其通常使用肽·Ν_糖苷酶内卜 半乳糖#酶來貫;’ 2) β消除方法’其使用強驗性環境來 釋放主要0-連接結構；及3)化學方法’其使用無水耕來釋 放Ν連接及〇_連接春糖二者。分析可使用以下步驟來實 施.1.相對於去離子水對樣品進行透析以移除所有緩衝 鹽，之後實施凍乾。2.用無水肼釋放完整寡糖鏈。3•用無 水曱醇HC1處理完整募糖鏈以釋放作為〇_甲基衍生物之個 別單糖。4.使任-_級胺基Ν•乙醯化。5•實施衍生以獲得 全0-二甲基甲矽烷基曱基糖苷。6藉由在Cp_SIL8管柱上 實施毛細氣液層析（GLC)來分離該等衍生物。7藉由將得 自GLC及質譜之保留時間與已知標準品對比來識別個別糖 苷衍生物。8,藉由FID使用内標（13-0-甲基-D-葡萄糖）來對 個別衍生物進行定量。 151112.doc -19- 201118176 中性糖及胺基糖可藉由高效陰離子交換層析與脈衝安培 檢測（HPAE-PAD碳水化合物系統；Dionex公司）之組合來 測定。例如，可藉由在100°C下於20% (v/v)三氟乙酸中水 解6小時來釋放糖。然後藉由凍乾或用Speed-Vac(Savant Instruments)來乾燥水解產物。然後將殘餘物溶於1 %三水 合乙酸鈉溶液中並在HPLC-AS6管柱上進行分析（如 Anumula 等人，1991，Anal. Biochem.，195:269-280 中所 述）。 或者’可實施免疫印跡碳水化合物分析。在此程序 中’使用市售聚糖檢測系統（Boehringer)來檢測結合蛋白 質之碳水化合物’該系統係基於Haselbeck等人（1993,

Glycoconjugate J.，7:63)所述之氧化性免疫印跡程序。遵 循製造商推薦之染色方案，只是將蛋白質轉移至聚偏二氟 乙婦膜上而非硝酸纖維素膜上’且封阻緩衝液含有存於i 〇 mM Tris緩衝液（ρΗ 7·4)中之5%牛血清白蛋白及〇9%氣化 鈉。用與驗性碟酸鹽偶聯物（B〇ehringer)相連之抗地高辛 配基抗體存於Tris緩衝鹽水中之1:1〇〇〇稀釋液來實施檢 測，其中使用存於100 mM Tris緩衝液（pH 9 5)中之磷酸酶 受質4-氣化硝基四氮唑藍（〇 〇3% (w/v))& 5•溴_4_氣-3_β引哚 基-磷酸鹽（0.03% (w/v))，且該緩衝液含有1〇〇 mM氣化鈉 及50 mM氣化鎂。含有碳水化合物之蛋白質區帶通常在約 10至15分鐘内顯影。 亦可藉由用肽-N_糖苦酶F消化來分析與蛋白質連接之碳 水化合物。根據此程序，使殘餘物懸浮於14吣緩衝液 151112. doc 201118176 中’其含有0.18% SDS、18 mM β-毓基乙醇、90 mM磷酸 鹽、3.6 mM EDTA，pH 8.6，且在100°C下加熱3分鐘。在 冷卻至室溫後，將樣品分為兩個等份。一份不再進行處 理，用作對照。將另一份調節至約1% NP-40去污劑中，隨 後添加0.2單位之肽-N-糖普酶F (Boehringer)。兩個樣品皆 在37°C下加熱2小時，且隨後藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電 泳來分析。 此外，藉由習用方法來評價糖蛋白產物之唾液酸含量。 舉例而言’可藉由直接比色法來單獨測定唾液酸（Ya〇等 人 ’ 1989, Anal. Biochem·，179:3 3 2-335)，較佳使用一式三 份樣品。另一唾液酸測定方法涉及使用硫代巴比妥酸 (TBA)，如 Warren 等人（1959，J. Biol. Chem·，234:1971- 1975)所述。另一方法涉及高效層析’例如如H K 〇gawa 等人（1993, J. Chromatography，612:145-149)所述。 例如’對於糖蛋白之回收、分離及/或純化而言，對細 胞培養基或細胞裂解物進行離心以移除細胞微粒及細胞碎 片。藉由適宜純化技術自污染性可溶蛋白及多肽分離或純 化出期望多肽產物。以下程序提供實例性（非限制性）蛋白 質純化方法：在免疫親和或離子交換管柱上進行分離或分 級分離；乙醇沉澱；反相HPLC ;在樹脂（例如二氧化矽）或 陽離子交換樹脂（例如DEAE)上進行層析；層析聚焦； SDS-PAGE ;硫酸銨沉澱；使用（例如）Sephadex G-75、

Sepharose進行凝膠過濾；實施蛋白A瓊脂糖層析以移除免 疫球蛋白污染物；及諸如此類。可使用諸如蛋白酶抑制劑 151112.doc •21- 201118176 (例如PMSF或蛋白水解酶κ)等其他添加劑來抑制純化期間 之蛋白降解。熟練從業者應理解，給定目標多肽之純化方 法可能需要改變，從而容許在細胞培養中重組表現之多肽 發生變化。彼等可選擇碳水化合物及富集唾液酸之純化程 序尤佳，例如離子交換軟凝膠層析或使用陽離子或陰離子 交換樹脂之HPLC，其中收集酸性較強之流份。 細胞、蛋白質及細胞培養 在本發明細胞培養製程或方法中，可將細胞維持在多種 業内習知之細胞培養基中，即基礎培養基。舉例而言，該 等方法適用於利用大量維持在細胞培養基中之細胞，該培 養基可補加有營養素及類似⑯。通f ’「細胞培養基」（亦 稱作培養基」）係業内從業者所理解之術語且已知可稱 作呂養液’其中生長細胞，較佳動物或哺乳動物細胞且其 般提供至少種或多種來自以下之組份：能源（通常呈 碳水化合物形式，例如葡萄糖)；所有必需胺基酸，且一 般係二十種基礎胺基酸加上半胱胺酸；維生素及/或其他 通常需要較低濃度之有機化合物；脂質或游離脂肪酸，例 如亞油^ ’及微1几素’例如通常需要極低濃度（通常係 微莫耳範圍）之無機化人私+工& >丄 … σ物或天然存在元素。細胞培養基 亦可經補加而含有多種可選組份，例如激素及其他生長因 子’例如騰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子、血清、及諸 如此類’鹽’例如辦鹽、糕瞄芬汾缺轴 鎂·°°•及磷駄鹽、及緩衝液（例如 HEPES);核苷及鹼，如l a 如腺苷、胸苷、次黃嘌呤；及蛋 白質及組織水解產物，办（1 u a 屋物例如水解動物蛋白（蛋白脒或蛋白 151112.doc •22- 201118176 脒混合物，其可得自動物副產物、純化明膠或植物材 料）；抗生素，例如慶大黴素（gentamycin);及細胞保護 劑，例如普流尼克多元醇（Pluronic polyol)(普流尼克 F68)。較佳者係細胞營養培養基’其不含血清且不含動物 源產物或成份。 如從業者所暸解，在適合所培養特定細胞之培養基中培 養動物或哺乳動物細胞且熟習此項技術者無需過多實驗即 可確定該等培養基。可採用市售培養基且其包括（例如）最 小必需培養基（MEM, Sigma，St. Louis, MO) ; Ham's F10培 養基（Sigma);達爾伯克氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's

Modified Eagles Medium) (DMEM，Sigma) ; RPMI-1640培 養基（Sigma) ; HyClone 細胞培養基（HyClone，Logan，UT); 及化學成份確定之（CD)培養基，其經調配用於特定細胞類 型’例如CD-CHO培養基（Invitr〇gen，Carlsbad, CA)。可根 據需要或期望以適宜濃度或量向上述實例性培養基中添加 上述補加性組份或成份（包括可選組份），且熟習此項技術 者可使用常規技術來瞭解並實踐。 此外，適合本發明方法之細胞培養條件係彼等通常用於 且已知用於分批、分批補料式、或連續培養細胞者，除溫 度外注意PH’例如約6·5至約75 ;溶解氧(〇2)，例如介於 、”勺5-90%之間之空氣飽和度及二氧化碳η);振盪及渴 度。在說明性而非限制性實例中，適合於本發明分批補 料式方法之細胎讲蓋装6 A , 蚕基包含經修改CD-CHO培養基 (Invitrogen，Carlsbad CA、。介-Γ p 土 ,LA)亦可採用補料培養基，例如經 151112.doc -23· 201118176 修改eRDF培養基（Invitrogen，Carlsbad，C A)。較佳者係亦 含有糖皮質激素（例如地塞米松）之補料培養基。 動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、動物或哺乳動物 宿主細胞、宿主細胞、重組細胞、重組宿主細胞、及諸如 此類係所有關於可根據本發明方法來培養之細胞之術語。 該等細胞通常係得自或源自哺乳動物之細胞系，且在置於 存於含有適宜營養素及/或生長因子之培養基中之單層培 養物或懸浮液培養物中時能生長或存活。熟習相關技術者 能憑經驗容易地確定生長及維持特定細胞培養所需生長因 子及營養素，例如以下文獻中所述：Barnes及Sat〇 (198〇,

Cell，22:649) ; Mammalian Cell Culture，J.p. Mather 編 輯，Plenum Press，NY，1984 ;及美國專利第 5,721，121 號。 根據本發明方法可培養多種類型之細胞。該等細胞通常 係可向培養基中表現並分泌、或可經分子改造而可表現並 刀/必大量特疋蛋白、更佳目標糖蛋白之動物或哺乳動物細 胞。因理解，宿主細胞所產生之糖蛋白對於宿主細胞可為 内源或同源。或者且較佳地，糖蛋白對於宿主細胞係異源 的（及外來糖蛋白），例如由中國倉鼠卵巢（CH〇)宿主細胞 產生並分泌之人類糖蛋白。同樣較佳地，哺乳動物糖蛋白 (即彼等最初得自或源自哺乳動物生物者）係藉由本發明方 法來獲得’且較佳係藉由細胞分泌至培養基中。 可有利地藉由本發明方法產生之哺乳動物糖蛋白之實例 包括（但不限於）細胞因子、細胞因子受體、生長因子（例如 EGF、HER-2、FGF-α、FGF-β、TGF-ot、TGF-β、PDGF、 151112.doc -24- 201118176 IGF-l、IGF-2、NGF、NGF-β);生長因子受體（包括融合 或嵌合蛋白）。其他非限制性實例包括生長激素（例如人類 生長激素、牛生長激素）；胰島素（例如胰島素A鏈及胰島 素B鏈）、胰島素原；紅細胞生成素（EPO);集落刺激因子 (例如 G-CSF、gm-CSF、M-CSF);白介素（例如 IL-1 至 IL-12);血管内皮生長因子（VegF)及其受體（VEGF-R);干擾 素（例如IFN-a、β、或丫）；經瘤壞死因子（例如TNF-α及 TNF-β)及其受體tnfR-Ι及TNFR-2 ;血小板生成素（TPO); 凝血酶；腦利鈉肽（BNP);凝血因子(例如因子VIII、因子 IX、〆馬威勒布蘭特因子（von Willebrands factor)、及諸如 此類）；抗凝血因子；組織纖溶酶原活化劑（ΤΡΑ)，例如尿 激酶或人尿或組織型ΤΡΑ ;卵泡刺激激素（FSH);促黃體激 素（LH);降鈣素；CD蛋白（例如CD3、CD4、CD8、 CD28、CD19等）；CTla蛋白（例如CTLA4) ; T細胞及B細 胞受體蛋白；骨形態形成性蛋白（BNP，例如BMP-1、 BMP-2、BMP-3等）；神經營養因子，例如骨源性神經營養 因子（BDNF);神經營養蛋白，例如3_6 ;腎素；類風濕因 子；RANTES ;白蛋白；鬆弛素；巨噬細胞抑制蛋白（例如 MIP-1、MIP-2);病毒蛋白或抗原；表面膜蛋白；離子通 道蛋白；酶；調節蛋白；抗體；免疫調節蛋白（例如 HLA、MHC、B7家族）；歸巢受體；運輸蛋白；超氧化物 歧化酶（SOD) ; G蛋白偶聯受體蛋白（GPCR);神經調節蛋 白；阿茲海默氏病（Alzheimer’s Disease)相關蛋白及肽（例 如Α-β)、及其他業内已知者。可藉由本發明方法產生之適 151112.doc -25· 201118176 宜蛋白、多肽及肽亦包括融合蛋白及多肽、嵌合蛋白及多 肽、以及上述蛋白及多肽中任一者之片段或部分、或突變 體、變體、或類似物。

適合具有、表現及產生用於後續分離及/或純化之蛋白 之動物或哺乳動物宿主細胞的非限制性實例包括中國倉鼠 卵巢細胞（CHO)，例如 CHO-Kl (ATCC CCL-61)、DG44 (Chasin等人，1986，Som. Cell Molec. Genet.，12:555-556 ；及 Kolkekar 等人，1997，Biochemistry，36:10901-10909)、CHO-Kl Tet-On細胞系（Clontech)、命名為 ECACC 85050302之CHO (CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)、CHO 純系 13 (GEIMG，Genova, IT)、CHO純系 B (GEIMG，Genova， IT)、命名為 ECACC 93061607 之 CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury，Wiltshire，UK)、命名為 ECACC 92052129 iRR-CHOK1 (CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)、二氫葉酸還原酶 陰性 CHO細胞（CHO/-DHFR，Urlaub及 Chasin，1980, Proc. Natl· Acad. Sci. USA, 77:4216)、及 dpl2.CHO 細胞（美國專 利第5,721，121號）；經SV40轉化之猴腎CV1細胞（COS細 胞，COS-7，ATCC CRL-1651);人胚腎細胞（例如293細 胞、或經亞選殖以供在懸浮液培養物中生長之293細胞， Graham等人，1977, J. Gen. Virol.，36:59);倉鼠嬰腎細胞 (BHK，ATCC CCL-10);狼腎細胞（CV1，ATCC CCL-70); 非洲綠猴腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587 ； VERO, ATCC CCL-81);小鼠睪丸支持細胞（TM4，Mather，1980, Biol· Reprod·，23:243-251);人類宮頸癌細胞（HELA，ATCC 151112.doc -26- 201118176 CCL-2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL-34);人類肺細胞 (W138，ATCC CCL-75);人類肝細胞瘤細胞（HEP-G2, HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤細胞（MMT 060562, ATCC CCL-51); 水牛鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL-1442) ; TRI細胞 (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68) ； MCR 5 細胞；FS4細胞。較佳者係CHO細胞，尤其CHO/-DHFR細 胞。 適合在本發明方法及製程中培養質細胞可含有經由（例 如）轉化、轉染、感染或注射引入之表現載體（構造物），例 如具有編碼序列之質粒及諸如此類或其部分，該等載體編 碼在培養過程中表現並產生之蛋白質。該等表現載體含有 轉錄及翻譯所插入編碼序列之必需元件。可使用熟習此項 技術者熟知並實踐之方法來構造表現載體，其含有編碼所 產生蛋白及多肽之序列，以及適宜轉錄及翻譯控制元件。 該等方法包括體外重組DNA技術、合成技術、及體内遺傳 重組。該等技術闡述於以下文獻中：j Sambr〇〇k等人， 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Press, Plainview, n.Y.;及 F.M. Ausubel 等 人，1989，Current Protocols in Molecular Biology，John

Wiley & Sons，New York，N.Y。 控制元件或調控序列係彼等與宿主細胞蛋白相互作用以 貫她轉錄及翻譯之非翻譯區，例如增強子、啟動子、5，及 3|非翻譯區。該等元件之濃度及特異性可各不相同。端視 所用載體系統及宿主，可使用任一數量之適宜轉錄及翻譯 151112.doc -27- 201118176 元件，包括組成型及誘導型啟動子。在哺乳動物細胞系統 中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒之啟動子較 佳。用於蛋白質表現系統之構造物經設計為含有至少一個 啟動子、㈣子序列(對於哺乳動物表現系統而言係可選 的）、及基因表現之正確轉錄及調節所需或所要求之其他 序列（例如轉錄起始及終止序列、複製起點、多腺苦酸化 序列（例如牛生長激素（BGH)多A序列））。 如熟習此項技術者可瞭解，用於正確轉錄、表現及分離 真核表現系統（例如哺乳動物）中所產生蛋白之適宜載體（例 如質粒）組份之選擇為熟習此項技術者已知且係以常規方 式確定及實踐。可將根據本發明方法培養之細胞進行之蛋 白質表現置於啟動子控制下，例如病毒啟動子，例如巨細 胞病毒（CMV)、R0US肉瘤病毒（RSV)、磷酸甘油激酶 (PGK)、胸苷激酶（TK)、或心肌動蛋白激動子。此外，經 調節啟動子藉由特定化合物或分子賦予可誘導性，例如小 鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV)之糖皮質激素反應元件⑴尺幻係 由糖皮質激素來誘導（V. Chandler等人，1983 Cell 33:489-499)。同樣，若需要或期望可使用組織特異性啟動 子或調節元件（G. Swift等人，1984, Cell, 38:639-646)。 可藉由多種熟習此項技術者已知之基因轉移方法將表現 構造物引入細胞中，該等方法例如習用基因轉染方法，例 如磷酸鈣共沉澱、脂質體轉染、顯微注射、電穿孔、及感 染或病毒轉導。業内熟練從業者能選擇該方法。熟習此項 技術者可瞭解’可將一或多個攜載用於在細胞中表現之 151112.doc -28- 201118176 DNA序列之構造物轉染至細胞中，從而使得隨後可在細胞 中產生及/或自細胞獲得表現產物。 在一特定態樣中，較佳用於本發明表現蛋白質之哺乳動 物細胞中者係含有適宜對照及調節序列之哺乳動物表現系 統。用於哺乳動物表現載體中之常用真核控制序列包括與 哺乳動物細胞相容之啟動子及控制序列，例如巨細胞病毒 (CMV)啟動子（CDM8載體）及禽肉瘤病毒（ASV)、（tiLN)。 其他常用啟動子包括來自猴腎病毒40 (Simian Virus 40) (SV40)之早期及晚期啟動子（Fiers等人，1973, Nature, 273 :1 13)或其他病毒啟動子，例如彼等源自多瘤病毒、腺 病毒2、及牛乳頭瘤病毒者。亦可使用誘導型啟動子，例 如 hMTII (Karin等人，1982, Nature, 299:797-802)。 適用於真核宿主細胞之表現載體之實例包括（但不限於） 用於哺乳動物宿主細胞之載體（例如BPV-1、pHyg、 pRSV、pSV2、pTK2 (Maniatis)) ； pIRES (Clontech)； pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFVl (Life Technologies)； pVPakc載體、pCMV載體、pSG5 載體（Stratagene)、逆轉錄 病毒載體（例如 pFB 載體（Stratagene))、pcDNA-3 (Invitrogen)、腺病毒載體；腺病毒相關病毒載體、杆狀病 毒載體、酵母載體（例如pESC載體（Stratagene))、或上述任 一載體之經修飾形式。載體亦可在啟動子區域序列上游或 下游含有增強子序列以優化基因表現。 在重組載體（例如質粒）中亦可使用可選擇標記以使具有 (較佳已穩定整合）該載體之細胞獲得耐受性，從而使得可 151112.doc -29- 201118176 在適宜選擇培養基中對其進行選擇。可使用多種選擇系 統，包括（但不限於）單純性皰療病毒（Herpes Simplex Virus)胸苷激酶（HSVTK)(Wigler等人，1977, Cell, 11:223)、 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT)(Szybalska及 Szybalski，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202)以及 腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（Lowy等人，1980, Cell, 22:817)基 因，該等基因分別可用於tk- ' hgprt-或aprt-細胞（APRT) 中〇 亦可使用抗代謝物耐受性作為選擇標記基因之以下非限 制性實例之基礎：dhfr，其賦予對胺甲嗓吟（methotrexate) 之耐受性（Wigler等人，1980，Proc_ Natl. Acad. Sci. USA， 77:357 ;及 O'Hare等人，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527) ; gpt，其賦予對黴酚酸之耐受性（Mulligan及 Berg，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，78:2072) ; neo， 其賦予對胺基糖苦G418之财受性（Clinical Pharmacy, 12:488-505 ； Wu 及 Wu，1991, Biotherapy, 3:87-95 ；

Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596 ； Mulligan, 1993, Science, 260:926-932 ； Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-21 ； May, 1993, TIB TECH, 11(5):155-215);及 hygro，其賦予對潮黴素（hygromycin)之 对受性（Santerre等人，1984，Gene，30:147)。可以常規方 式實施重組DNA技術之業内習知方法來選擇期望重組細胞 純系，且該等方法闡述於（例如）以下文獻中：Ausubel等人 (編輯），Current Protocols in Molecular Biology, John 151112.doc -30- 201118176

Wiley & Sons, NY (1993) ； Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY;第 12 及 13章，Dracopoli 等人（編輯），Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；

Colberre-Garapin等人，1981. J. Mol. Biol., 150:1，該等文 獻係全文以引用方式併入本文中。 此外’可藉由載體擴增來提高所表現蛋白質分子之表現 程度（綜述參見 Bebbington 及 Hentschel，「The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning」，第3 卷，Academic Press，New York，1987)。在表現蛋白質之載 體系統中之標記可擴增時，增加存於宿主細胞培養物中之 抑制劑含量可增加標記基因之拷貝數。由於擴增區域與蛋 白質編碼基因相關’故蛋白質之產生可同時增加（Cr〇use等 人 ’ 1983, Mol. Cell. Biol.，3:257)。 具有編碼麩醯胺酸合成酶（GS)或二氫葉酸還原酶 (DHFR)之核酸作為可選擇標記之載體可分別在藥物曱硫 胺酸砜亞胺或胺甲喋呤存在下進行擴增。基於麩醯胺酸合 成酶之載體之優點在於麩醯胺酸合成酶陰性細胞系（例如 鼠類骨髓瘤細胞系，NS0)之可用性。麩醯胺酸合成酶表 現系統亦可藉由提供額外抑制劑來防止内源性基因發揮作 用而在麩醯胺酸合成酶表現細胞（例如CH〇細胞）中使用。 表現DHFR作為可選擇標記之載體包括（但不限於Μ% dhfr 質粒（Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. 1:854 (1981))。 351112.doc 201118176 表現麩醯胺酸合成酶作為可選擇標記之載體包括（但不限 於）Stephens及Cockett，1989, Nucl. Acids· Res., 17:7110 中所述 之pEE6表現載體°麩醯胺酸合成酶表現系統及其組份詳細 闡述於以下PCT公開案中：WO 87/04462、WO 86/05807、 WO 89/01036、W 0 89/10404、及 W0 91/06657 ’ 該等公開 案係全文以引用方式併入本文中。此外，可根據本發 明使用之麩醯胺酸合成酶表現載體可自供應商購得’ 供應商包括（例如）Lonza Biologies 公司（Portsmouth， NH)。 在一特定實施例中，可將編碼可溶性CTLA4分子或可溶 性CTLA4突變分子之核酸序列插入設計用於在真核宿主中 表現外來序列之載體。載體之調節元件可隨具體真核宿主 而變。在真核宿主細胞中表現可溶性CTLA4或可溶性 CTLA4突變體之載體可包括優化蛋白質表現之增強子序 列。 細胞培養類型 出於理解而非限制性目的，熟練從業者應瞭解，用於產 生蛋白質之細胞培養及培養運行可包括三種一般類型； 即，連續培養、分批培養及分批補料式培養。例如，在連 續培養中，在培養期間向細胞提供新鮮培養基補料（即補 料培養基），同時每天移除舊培養基且（例如）每天或連續收 穫產物。在連續培養中，補料培養基可每天添加且可連續 添加（即以滴注或輸注形式）。對於連續培養，只要期望’ 只要細胞保持活力且維持環境及培養條件’細胞即可保留 151112.doc -32- 201118176 在培養物中。 在分批培養中， 行期間或在培養運 不補加此培養基， 運行結束時收穫期 首先在培養基中培養細胞，且在培養運 行結束前既不移除、更換此培養基，亦 即不用新培養基「補給」細胞。在培養 望產物。 對於分批補料式培養，在運行期間藉由每天-或多次 (或連々地）用新鮮培養基補加培養基來延長培養運行時 間’即在培養期間用新培養基（「補料培養基」）「補給」 鸡刀批補料式培養可包括各種補料方案及時間，例如 每天'每隔-天、每兩天等、每天不止-次、或少於每天 一人、等等。此外，分批補料式培養可用補料培養基連續 補料。 ^ 然後在培養/生產運行結束時收穫期望產物。本發明較 佳涵蓋分批補料式細胞培養，其中在接種後某一時間點添 加糖皮質激素化合物。 根據本發明，可在用於大規模或小規模產生蛋白質之條 件下使用習用於動物或哺乳動物細胞培養之培養容器及/ 或培養裝置來貫施細胞培養，且可由細胞產生糖蛋白。如 熟習此項技術者所瞭解，對於實驗室規模通常使用組織培 養皿、T形瓶及旋轉瓶。對於大規模培養（例如5〇〇 [、 5000 L及諸如此類’例如如共同受讓之美國專利第 7,541，164號、美國專利第7,332,303號、及2006年12月19曰 申請之美國專利申請案第12/086786號中所述，該等專利 之内容係全文以引用方式併入本文中），可使用包括（但不 151112.doc •33· 201118176 限於）流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶培 養、或揽拌罐生物反應器系統之程序β在滾瓶或攪拌罐生 物反應器系統中可使用或可不使用微載體。該等系統可以 分批、連續或分批補料式模式作業。此外，培養裝置或系 統可配備有或不配備有使用濾器、重力、離心力、及諸如 此類之細胞分離器。 細胞培養各期及相關參數 術5吾接種」係指向啟動培養基中添加細胞以開始培 養。 培養之「生長期」係在任一時間點之活細胞密度皆高於 先前任一時間點之時期。 培養之靜止期」係在任一時間長度期間活細胞密度皆 大致恆定（即在量測誤差内）之時期。 培養之死亡期」係在生長期之後或在生長期及靜止期 後出見之時期，且在此期間任一時間點之活細胞密度皆 低於該時期中先前任一時間點。 在生長相關」培養方法中，例如在糖皮質激素化合物 引起生長—長之㈣下，生錢可在延長之生長期期間 開始。 在「非生長」相關培養方法中，細胞培養之生產期可』 靜止期。 較佳地’在生產期期間，尤其在延長之生產期中補力 (補給」）培養基以支持連續蛋白質產生，且獲得大量這 品質糖蛋白產物（如在蛋白質回收後藉由較高最終唾液: 151J12.doc •34· 201118176 含量量所例示及/或確定）。可每天或根據其他時間表進行 補料，以支持細胞活力及蛋白質產生。 本發明培養方法可使更多活細胞存活至培養過程結束。 因此，在些貫細例中，存活細胞愈多，產生期望產物之 細胞愈多。此繼而可在培養過程結束時產生更大積累量之 產物，其中個別細胞之蛋白質產生速率（即細胞比生產率） 保持不變。業内已知之細胞比生產率或細胞比速率通常係 指每個細胞、或每細胞質量或體積之量度所產生產物之比 表現速率。細胞比生產率係以（例如）每天每個細胞所產生 蛋白質之克數來量測，且可根據涉及下式之積分方法來量 測： dP/dt=qp X，或 P=qp ί〇ι Xdt 其中qP係細胞比生產率常數；X係細胞數或細胞體積或 細胞質量當量；且dP/dt係蛋白質產生速率。因此，&可得 自產物濃度對活細胞之時間積分（丨Qt Xdt「活細胞天數」） 之曲線。根據此式’在繪製所產生糖蛋白產物之量對活細 胞天數之曲線時’斜率等效於細胞比速率。活細胞可藉由 若干種量度來測定，例如生物量、〇2吸收速率、乳酸脫氫 酶（LDH)、壓積細胞容積或濁度（例如頒予T Etcheverry等 人之美國專利第5,705,364號）。 藉由本發明培養方法產生可溶性CTLA4分子及可溶性 CTLA4突變分子 在本發明所涵蓋其他實施例中，採用本發明細胞培養方 151112.doc -35- 201118176 法來產生可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突變分子，如 下文所述。可溶性CTLA4分子較佳係CTLA4融合蛋白，較 佳係CTLA4Ig。更佳者係CTLA4Ig，其包含胺基酸_1至357 或+1至357，如圖19中所示。可溶性CTLA4突變分子較佳 係L104EA29YIg，其包含胺基酸-1至357或+1至357，如圖 20中所示。涉及蛋白質產物之延長生產期之細胞培養方法 尤其適合於藉由其培養中之宿主細胞來產生大量高品質可 溶性CTLA4分子及可溶性CTLA4突變分子。 在一較佳實施例中，CTLA4Ig係藉由經重組改造之宿主 細胞來產生。CTLA4Ig融合蛋白可由經含有編碼CTLA4Ig 之DNA序列之載體轉染之CHO細胞以重組方式來產生。 (參見頒予P.S. Linsley等人之美國專利第5,844,095號）。在 根據本發明方法培養時，大量產生CTLA4Ig融合蛋白且其 經適宜唾液酸化。本發明可產生高等級可回收蛋白質產物 (例如唾液酸化CTLA4Ig蛋白質產物）。在另一較佳實施例 中，如圖20中所示包含胺基酸-1至357或+1至357之可溶性 CTLA4突變分子L104EA29YIg係藉由本發明細胞培養方法 來產生。 CTLA4之配體係B7分子。本文所用「配體」係指特異性 識別並結合一分子之另一分子。分子與其配體之間之相互 作用可由本發明培養方法之產物來調節。舉例而言， CTLA4與其配體B7之相互作用可藉由投與CTLA4Ig分子來 阻斷。在其他實例中，腫瘤壞死因子（TNF)與其配體TNF 受體（TNFR)之相互作用可藉由投與依那西普（etanercept)或 151112.doc •36· 201118176 其他TNF/TNFR阻斷分子來阻斷。 野生型CTLA4或「未突變CTLA4」具有如圖20中所述天 然存在之全長CTLA4之胺基酸序列（且亦如美國專利第 5,434，131號、第5,844,095號及第5,851，795號中所述，其 係全文以引用方式併入本文中），或其可識別並結合B7分 子、或可干擾B7分子從而阻斷其與CD28及/或CTLA4(例如 内源性CD28及/或CTLA4)之結合之任一部分。野生型 CTLA4包含特定部分，包括（例如）野生型CTLA4中始於+ 1 位置之甲硫胺酸且止於+124位置之天冬胺酸之細胞外結構 域，或野生型CTLA4中始於-1位置之丙胺酸且止於+ 124位 置之天冬胺酸之細胞外結構域，如圖2 1中所示。 天然存在之野生型CTLA4係細胞表面蛋白，其具有N-末 端細胞外結構域、跨膜結構域、及C-末端細胞質結構域。 細胞外結構域結合乾分子，例如B7分子。在細胞中，翻譯 出之天然存在之野生型CTLA4蛋白呈不成熟多肽形式，其 包括胺基末端或N-末端之信號肽。不成熟多肽進行翻譯後 處理，其包括裂解並移除信號肽以生成CTLA4裂解產物， 其具有與不成熟形式中之N-末端不同之新生成N-末端。熟 習此項技術者可瞭解，可能發生額外翻譯後處理，其自 CTLA4裂解產物之新生成N_末端移除一或多個胺基酸。成 熟CTLA4蛋白可始於+1位置之甲硫胺酸或-1位置之丙胺 酸。CTLA4分子之成熟形式包括細胞外結構域或其任一部 分，該成熟形式可結合B7。 本文所用CTLA4突變分子係指包含如圖2 1中所示野生型 151112.doc -37- 201118176 CTLA4、或野生型CTLA4序列中，較佳野生型CTLA4之細 胞外結構域中具有一個突變或多個突變之任一部分或衍生 物之分子，且該突變分子可結合B7。CTLA4突變分子具有 與野生型CTLA4分子之序列類似但不一致之序列，但其仍 可結合B7。該等突變可包括一或多個胺基酸殘基經具有保 守性（例如白胺酸取代異白胺酸）或非保守性（例如甘胺酸經 色胺酸取代）結構或化學特性之胺基酸取代，胺基酸缺 失、添加、移瑪或戴短。 CTLA4突變分子可包括所述突變分子中或與其附接之# CTLA4分子，即CTLA4突變體融合蛋白。突變分子可具有 可溶性（即循環性）或其可結合至細胞表面（膜結合）。 CTLA4突變分子包括L104EA29YIg及彼等闡述於以下文獻 中者：美國專利申請案第60/214,065號及第60/287,576號； WO 01/92337 A2 ;美國專利第 6,090,914號、第 5,844,095 號、第7,094,874號及第5,773,253號；及如11丄？63〇11等 人，1994, J Exp Med, 1 80:2049-2058 中所述。CTLA4突變 分子可以合成方式或重組方式產生。 CTLA4Ig係可溶性融合蛋白，其包含野生型CTLA4之細 胞外結構域或其結合B7之部分，且該結構域與免疫球蛋白 (Ig)分子或其部分體接合。CTLA4或其部分之細胞外結構 域與Ig部分體接合，該Ig部分包食全部或一部分免疫球蛋 白分子，較佳包含全部或一部分免疫球蛋白恒定區，例如 全部或一部分IgCyl (IgCgammal)、IgCy2 (IgCgamma2)、 IgCy3 (IgCgamma3)、IgCy4 (IgCgamma4)、IgCp (IgCmu)、 151112.doc -38 - 201118176

IgCal (IgCalphal)、IgCa2 (IgCalpha2)、IgC5 (IgCdelta)或 IgCs (IgCepsilon)，從而賦予融合分子以可溶性。Ig部分 可包括上述恆定區或其他恆定區中的鉸鏈、CH2及CH3結 構域，或CH1、鉸鏈、CH2及CH3結構域。較佳地，Ig部 分來自人或猴且包含鉸鏈、CH2及CH3結構域。Ig部分最 佳包含人類IgCyl之鉸鏈、CH2及CH3結構域，或由人類 IgCyl之鉸鏈、CH2及CH3結構域組成。在CTLA4Ig之Ig部 分中，Ig恆定區或其部分可突變，由此導致其效應子功能 降低（例如，參見美國專利第5,637,481號、第5,844,095號 及第5,434,131號）。本文所用術語Ig部分、Ig恆定區、Ig C (怪定）結構域、IgCyl (IgCgammal)、IgCy2 (IgCgamma2)、 IgCy3 (IgCgamma3)、IgCy4 (IgCgamma4)、IgCp (IgCmu)、 IgCal (IgCalphal)、IgCa2 (IgCalpha2)、IgC5 (IgCdelta)或 IgCe (IgCepsilon)包括天然序列及已突變序列二者，例如 在恆定區中具有可降低效應子功能之突變之序列。 一關於CTLA4之具體實施例包含野生型CTLA4之細胞外 結構域，其始於+ 1位置之甲硫胺酸且止於+ 124位置之天冬 胺酸，或始於-1位置之丙胺酸至+124位置之天冬胺酸； + 1 25位置之接合胺基酸殘基麩醯胺酸；及免疫球蛋白部 分，其涵蓋+126位置麩胺酸至+357位置離胺酸，如圖19中 所示。編碼此CTLA4Ig之DNA係根據布達佩斯條約 (Budapest Treaty)之規定在1991年5月31日儲存於美國模式 培養物保藏所（American Type Culture Collection) (ATCC) (10801 University Blvd·, Manassas, VA 20110-2209)中，且 151112.doc -39- 201118176 已給予 ATCC 登錄號 ATCC 68629; Ρ· Linsley等人，1994, Immunity 1:793-80。表現CTLA4Ig 之 CHO細胞系係在 1991 年5月31日以識別號CRL-10762儲存於ATCC中。根據本文 所述方法產生之可溶性CTLA4Ig分子可包括或不包括信號 (前導）肽序列。圖19及20包括信號（前導）肽序列之圖解。 通常，該等分子不包括信號肽序列。 L104EA29YIg係融合蛋白，其係可溶性CTLA4突變分子 且包含野生型CTLA4之細胞外結構域，該結構域具有胺基 酸變化A29Y(用酪胺酸胺基酸殘基取代29位置之丙胺酸）及 L104E(用麩胺酸胺基酸殘基取代+104位置之白胺酸）且與 Ig尾接合。圖20展示L104EA29YIg。如圖20中所示， L104EA29YIg之胺基酸序列包含-1胺基酸位置之丙胺酸至 + 357胺基酸位置之離胺酸。或者，如圖20中所示， L104EA29YIg之胺基酸序列包含+ 1胺基酸位置之甲硫胺酸 至+357胺基酸位置之離胺酸。L104EA29YIg包含+ 125位置 之接合胺基酸殘基麩醯胺酸且Ig部分涵蓋+ 126位置之麩胺 酸至+357位置之離胺酸。編碼L104EA29YIg之DNA係根據 布達佩斯條約之規定在2000年6月20日儲存於美國模式培 養物保藏所（ATCC)，且已給予ATCC登錄號PTA-2104。 104EA29YIg闡述於共同待決之美國專利申請案第 09/579,927 號、第 60/287,576 號及第 60/214,065 號以及 WO/01/923337 A2中，該等專利係全文以引用方式併入本 文中。藉由本發明培養方法產生之可溶性L104EA29YIg分 子可包括或不包括信號（前導）肽序列。通常，根據本發明 151112.doc •40- 201118176 產生之分子不包括信號肽序列。 本文所用術語「可溶性」係指未結合或附接至細胞之任 何分子或其片段，即循環性。舉例而言，可藉由使ig部分 附接至CTLA4之細胞外結構域來使CTLA4可溶。或者，可 藉由移除跨膜結構域來賦予諸如CTLA4等分子以可溶性。 通常，根據本發明產生之可溶性分子不包括信號（或前導） 序列。 可溶性CTLA4分子係指非細胞表面結合之（即循環性）分 子，其包含野生型CTLA4或結合B7之任一部分或衍生物， 包括（但不限於）可溶性CTLA4融合蛋白；可溶性CTLA4融 合蛋白，例如CTLA4Ig融合蛋白（例如ATCC 68629)，其中 CTLA4之細胞外結構域與Ig部分融合，該Ig部分係全部或 一部分I g分子，較佳係全部或一部分I g丨互定區，例如全部 或一部分IgCyl (IgCgammal)、IgCy2 (IgCgamma2)、IgCy3 (IgCgamma3)、IgCy4 (IgCgamma4)、IgCp (IgCmu)、IgCal (IgCalphal)、IgCa2 (IgCalpha2) ' IgC6 (IgCdelta)或 IgCe (IgCepsilon)，從而賦予該融合分子以可溶性；可溶性 CTLA4融合蛋白，其中細胞外結構域與生物活性或化學活 性蛋白之一部分融合或結合，該活性蛋白係例如乳頭狀瘤 病毒E7基因產物（CTLA4-E7)、黑色素瘤相關抗原p97 (CTLA4-p97)或 HIV env蛋白（CTLA4-env gpl20)，如美國 專利第5,844,095號中所述，該專利係全文以引用方式併入 本文中；雜合（嵌合）融合蛋白，例如CD28/CTLA4Ig，如美 國專利第5,43 4,13 1號中所述，該專利係全文以引用方式併 151112.doc -41 - 201118176 入本文中；跨膜結構域已移除以賦予蛋白以可溶性之 CTLA4 分子（例如，參見M.K_ Oaks等人，2000，Cellular Immunology，201:144-153，該文獻係全文以引用方式併入 本文中）；可溶性CTLA4突變分子L104EA29 Ylg。 可溶性CTLA4分子亦可為可溶性CTLA4突變分子。根據 本發明產生之可溶性CTLA4分子可包括或不包括信號（前 導）肽序列。信號肽可為可容許分泌分子之任一序列，包 括來自制瘤素（oncostatin)M之信號肽（Malik等人，1989, Molec. Cell. Biol” 9:2847-2853)、或 CD5(N.H. Jones 等 人’ 1986，Nature, 323:346-349)、或來自任一細胞外蛋白 之信號肽。藉由本發明培養方法產生之可溶性CTLA4分子 可包括連接在CTLA4細胞外結構域N-末端之制瘤素Μ信號 肽。通常，在本發明中該等分子不包括信號肽序列。 本文所用「CTLA4融合蛋白」係指包含野生型CTLA4之 細胞外結構域或其結合Β7之部分之分子，其與賦予該 CTLA4分子以可溶性之非CTLA4部分融合，例如Ig部分。 舉例而言，CTLA4融合蛋白可包括與全部或一部分Ig恆定 區融合之CTLA4細胞外結構域。可與CTLA4融合之Ig恆定 結構域（或其部分）之實例包括（但不限於）所有上文所列示 之彼等。CTLA4融合蛋白亦可為CTLA4突變分子。 本文所用「非CTLA4部分」係指不結合CD80及/或CD86 且不干擾CTLA4與其配體之結合之分子或其部分。實例包 括（但不限於）作為全部或一部分Ig分子之Ig部分、諸如乳 頭狀瘤病毒E7基因產物（CTLA4-E7)、黑色素瘤相關抗原 151112.doc -42- 201118176 p97(CTLA4-p97)或 HIV env蛋白（CTLA4-env gpl20)等生物 活性或化學活性蛋白之一部分（如美國專利第5,844,095號中 所述，該專利係全文以引用方式併入本文中）。Ig部分之實 例包括全部或一部分免疫球蛋白恆定結構域，例如IgCyl (IgCgammal)、IgCy2 (IgCgamma2)、IgCy3 (IgCgamma3)、 IgCy4 (IgCgamma4)、IgCp (IgCmu)、IgCal (IgCalphal)、 IgCa2 (IgCalpha2)、IgC§ (IgCdelta)或 IgCs (IgCepsilon)。Ig 部分可包括上述恆定區或其他恆定區之鉸鏈、CH2及CH3 結構域，或CH1、鉸鏈、CH2及CH3結構域。較佳地，Ig 部分來自人類或猴且包括鉸鏈、CH2及CH3結構域。最佳 地，Ig部分包括人類IgCyl之鉸鏈、CH2及CH3結構域，或 係人類IgCyl之较鏈、CH2及CH3結構域。在Ig部分中，Ig 恆定區或其部分可突變從而降低其效應子功能（例如，參 見美國專利第5,637,481號、第5,844,095號及第5,434,131 號）。 CTLA4之細胞外結構域係指野生型CTLA4中可識別並結 合B7之任一部分。舉例而言，CTLA4之細胞外結構域包含 + 1位置之甲硫胺酸至+124位置之天冬胺酸（圖21)。舉例而 言，CTLA4之細胞外結構域包含-1位置之丙胺酸至+124位 置之天冬胺酸（圖21)。 本文所用術語「突變」係指野生型分子中核苷酸或胺基 酸序列之變化，例如野生型CTLA4細胞外結構域之DNA及/ 或胺基酸序列中之變化。DNA中之突變可改變密碼子，從 而改變所編碼的胺基酸序列。DNA變化可包括取代、缺 151112.doc -43- 201118176 失、插入、選擇性剪接或截短。胺基酸變化可包括取代、 缺失、插入、添加、截短或處理或蛋白質之裂解錯誤。或 者，如業内所充分理解，核苷酸序列中之突變可在胺基酸 序列中造成沉默突變。業内亦理解，某些核苷酸密碼子編 碼相同胺基酸。實例包括核普酸密碼子CGU、CGG、CGC 及CGA，其編碼胺基酸精胺酸（R);或密碼子GAU及 GAC，其編碼胺基酸天冬胺酸（D)。 因此，可藉由一或多個在特定核苷酸序列中有所不同但 仍編碼具有相同序列之蛋白質分子之核酸分子來編碼蛋白 質。突變分子可具有一處或不止一處突變。作為引導，胺 基酸編碼序列如下所述：

胺基酸 符號 單字母 符號 密碼子 丙胺酸 Ala A GCU、GCC、GCA、GCG 半胱胺酸 Cys C UGU、UGC 天冬胺酸 Asp D GAU ' GAC 麩胺酸 Glu E GAA ' GAG 苯丙胺酸 Phe F UUU ' uuc 甘胺酸 Gly G GGU、GGC、GGA、GGG 組胺酸 His H CAU、CAC 異白胺酸 lie I AUU ' AUC ' AUA 離胺酸 Lys K AAA ' AAG 白胺酸 Leu L UUA ' UUG ' CUU ' CUC ' CUA ' CUG 曱硫胺酸 Met M AUG 天冬醯胺 Asn N AAU ' AAC 脯胺酸 Pro P CCU、CCC、CCA、CCG 麩醯胺酸 Gin Q CAA ' CAG 精胺酸 Arg R CGU、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG 絲胺酸 Ser S UCU、UCC、UCA、UCG、AGU、AGC 蘇胺酸 Thr T ACU、ACC、ACA、ACG 纈胺酸 Val V GUU ' GUC ' GUA ' GUG 色胺酸 Tip w UGG 酪胺酸 Tyr Y UAU、UAC 151112.doc • 44- 201118176 本文所用「片段或部分」係分子之任一部分或區段。對 於CTLA4或CD28而言，片段或部分較佳係CTLA4或CD28 之細胞外結構域或其可識別並結合B7或干擾B7從而阻斷 其與CD28及/或CTLA4結合之部分或區段。同樣，本文所 用「相應的」意指共有序列一致性。 本文所用「衍生物」係與母體分子共有序列相似性及活 性之分子。舉例而言，CTLA4之衍生物包括胺基酸序列與 野生型CTLA4之細胞外結構域至少70%相似且可識別並結 合B7之可溶性CTLA4分子，例如CTLA4Ig或可溶性CTLA4 突變分子L104EA29YIg。衍生物意指對胺基酸序列及/或胺 基酸化學性質之任何改變，例如胺基酸類似物。 本文所用「調節免疫反應」係活化、刺激、上調、抑 制、阻斷、降低、減弱、下調或改變免疫反應。可藉由調 節免疫反應（例如調節功能性CTLA4-及/或CD28-陽性細胞 與B7陽性細胞的相互作用）來治療多種疾病（例如自身免疫 疾病）。舉例而言，調節免疫反應的方法包含使B 7陽性細 胞與可溶性CTLA4分子（例如彼等根據本發明產生者）接觸 以形成可溶性CTLA4/B7複合體，其中該可溶性CTLA4分 子干擾内源性CTLA4及/或CD28分子與B7分子之反應。本 文中所提及之「阻斷」或「抑制」受體、信號或分子抑制 干擾受體、信號或分子之活化，如藉由業内承認測試所檢 測。阻斷或抑制可為部分或完全的。 本文所用「阻斷B7相互作用」係指干擾B7與其配體（例 如CD28及/或CTLA4)之結合，由此阻礙T細胞及B7陽性細 151112.doc -45- 201118176 胞相互作用。阻斷B7相互作用之試劑之實例包括（但不限 於）識別並結合CTLA4、CD28或B7分子（例如Β7·1、B7-2) 中任一者之諸如抗體（或其部分）等分子；諸如可溶性 CTLA4等分子之可溶性形式（或其部分）；設計為可經由 CTLA4/CD28/B7介導之相互作用來干擾細胞信號之肽片段 或其他小分子。在一較佳實施例中，阻斷劑係可溶性 CTLA4分子，例如CTLA4Ig (ATCC 68629)或 L104EA29YIg (ATCC PTA-2104);可溶性 CD28分子，例如CD28Ig (ATCC 68628);可溶性 B7 分子，例如 B7-Ig (ATCC 68627);抗 B7 單株抗體（例如 ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341 及如美國專利 第 6,113,898 號或 Yokochi 等人，1982，J. Immunol·， 128(2):823-827中所述之單株抗體）；抗CTLA4單株抗體（例 如ATCC HB-3 04及如參考文獻82-83中所述之單株抗體）； 及/或抗CD28單株抗體（例如ATCC HB 11944及MAb 9.3, 如 Hansen 等人，1980，Immunogenetics，10: 247-260 或

Martin等人，1984，J· Clin. Immunol.，4(1):18-22 中所述）0 可藉由以下測試來檢測B7相互作用之阻斷：業内承認之測 試（例如測定免疫疾病（例如風濕性疾病）相關症狀之減 少）、測定T細胞/B7細胞相互作用之降低、或測定B7與 CTLA4/CD28之相互作用之降低》阻斷可為部分或完全阻 斷。 本文所用分子之有效量係指可阻斷該分子與其配體之相 互作用之量。舉例而言，可阻斷B7與CTLA4及/或CD28之 151112.doc -46- 201118176 相互作用之分子的有效量係該分子在與B7陽性細胞上之 B7分子結合時抑制B7分子結合諸如CTLA4及CD28等内源 性配體之量。或者，可阻斷B7與CTLA4及/或CD28之相互 作用之分子的有效量係該分子在與T細胞上之CTLA4及/或 CD28分子結合時抑制B7分子結合諸如CTLA4及CD28等内 源性配體之量。抑制或阻斷可為部分或完全的。 在臨床方案中，融合蛋白（例如CTLA4Ig或突變體 CTLA4Ig)之Ig部分在個體中較佳不激發有害免疫反應。較佳 部分係全部或一部分Ig恆定區，包括人類或.非人靈長類Ig恆 定區。適宜Ig區域之實例包括IgCyl (IgCgammal)、IgCy2 (IgCgamma2) ' IgCy3 (IgCgamma3) ' IgCy4 (IgCgamma4) ' IgCp (IgCmu)、IgCal (IgCalphal)、IgCa2 (IgCalpha2)、 IgC$ (IgCdelta)或 IgCs (IgCepsilon)，包括鉸鏈、CH2 及 CH3結構域，或CHI、鉸鏈、CH2及CH3結構域，其參與 效應子功能，例如與Fc受體結合、補體依賴性細胞毒性 (CDC)或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)。Ig部分 中可具有一或多處突變（例如在CH2中，從而降低效應子功 能，例如CDC或ADCC)，其中該突變藉由提高或降低Ig結 合Fc受體之能力來調節Ig結合其配體之能力。舉例而言， Ig部分中之突變可包括其鉸鏈結構域内任一或所有半胱胺 酸殘基中之變化。舉例而言，+130、+136及+ 139位置之半 胱胺酸經絲胺酸取代。Ig部分亦可包括+148位置之脯胺 酸，其經絲胺酸取代。此外，Ig部分中之突變可包括+144 位置之白胺酸經苯丙胺酸取代；+145位置之白胺酸經麩胺 151112.doc -47- 201118176 酸取代；或+147位置之甘胺酸經丙胺酸取代。 實例 以下實例闞述本發明之具體態樣以闡釋本發明，且為熟 習此項技術者提供關於本發明方法之說明。不應將該等實 例視為限制本發明，此乃因該等實例僅提供可用於理解及 實踐本發明及其各態樣之具體方法及範例。 下文所述實例1 -5闡述與細胞培養方法相關之實驗，該 等方法涉及在培養運行期間添加糖皮質激素。 實例1 在此研究中，研究地塞米松（DEX)對CH0細胞糖基化過 程之細胞内效應’及因唾液酸酶活性所致之細胞外效應。 此處首次證實，DEX能改良CHO所產生重組融合糖蛋白之 唾液酸化。然後在受控生物反應器中成功確認了在搖瓶培 養中測試時DEX在促進提高唾液酸化中之淨效應，且該等 效應在分批補料式培養中導致提高唾液酸含量以及降低去 唾液酸化比率。 細胞系及培養基 在此研究中使用之CHO細胞系最初亞選殖自DG44親代 細胞且在專利性無蛋白質生長培養基中培養。 搖瓶實驗 貫驗係在250 mL搖瓶（VWR international)中實施，起始 體積為100 mL且初始細胞密度為6χ105細胞/mL。將培養物 置於150 rpm振盪器平臺（VWR international)上且在37°C及 6°/〇 c〇2下維持十天。每天自培養物取樣並根據需要使用1 151112.doc • 48 _ 201118176 Μ碳酸鈉調節pH ’且每兩天補給葡萄糖及麩醯胺酸以維持 其充足含量。使用Cedex自動化細胞計數器（lnnovatis A(J， Bielefeld’ Germany)脫機量測細胞密度及活力。使用

Bioprofile 分析儀 400(Nova Biomedical 公司，Waltham， ΜΑ)脫機量測培養物pH及葡萄糖及麵醯胺酸之濃度β 生物反應器作業 在 5 L生物反應器（Sartorius AG，Goettingen, Germany)中 實施生物反應器實驗，且初始工作體積為丨.5 L。將振盈、 pH及溶解氧分別控制在15〇 rpm、7.05及50%空氣飽和度 下。最初將溫度控制在37。(：，但在培養期間變至較低溫度 以延長培養活力。生物反應器係以分批補料式模式作業且 在第3天開始每天補給專利性補料培養基以維持葡萄糖及 其他營養素之充足濃度。在細胞培養過程期間取樣並分析 細胞密度、細胞活力、受質及代謝產物。 對α2,3-唾液酸轉移酶（a2,3-ST)及pi，4-半乳糖基轉移酶 (P1，4-GT)之蛋白質印跡分析 用IX磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)洗滌約107個CHO細胞，用1 mL Laemmli樣品緩衝液（Bio-Rad Laboratories，Hercules， CA)裂解，然後在9〇°C下經5分鐘變性。在4-15。/。SDS-聚丙 烯醯胺凝膠上分離全細胞裂解物，印跡至0.45 μηι硝酸纖 維素膜（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)上，並用第一 及第二抗體來探測。第一抗體係抗人類a2,3-ST兔多株抗 體及抗人類 pl，4-GT 兔多株抗體（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。第二抗體係辣根過氧化物酶（HRP)偶聯 151112.doc -49- 201118176 之抗兔抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)° 剝離膜並用β-肌動蛋白抗體（Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz，CA)及HRP偶聯之抗小鼠第二抗體再次探測。 使用增強型化學發光蛋白質印跡檢測系統（GE Healthcare) 來實施免疫檢測，且用VersaDoc成像系統（Bio-Rad Laboratories， Hercules, CA)來進行可視化。 上清液中唾液酸酶活性之量測 使用Amplex Red神經胺酸酶（唾液酸酶）分析套組 (Invitrogen，Carlsbad，CA)來分析唾液酸酶活性。簡言之， 使用樣品中之神經胺酸酶來使胎球蛋白去唾液酸化。此分 析採用Amplex Red來檢測藉由半乳糖氧化酶氧化胎球蛋白 上之去唾液酸化半乳糖殘基而產生之H202。H2〇2在HRP存 在下以化學計量方式與Amplex Red試劑反應而生成紅色榮 光氧化產物試齒靈5 (resorufin 5)，然後以螢光計量方式或 分光光度計量方式對其進行分析。在各分析中，將50 μί 工作溶液（100 μΜ Amplex Red, 0.2 U/mL HRP，4 U/mL半乳 糖氧化酶及500 pg/mL胎球蛋白）添加至含有50 pL稀細胞 培養上清液之各微量滴定板孔中。在37°C下培育30分鐘 後，在560 nm下使用微量滴定板讀數器分析樣品之吸光 度。 唾液酸分析 藉由測定唾液酸及重組蛋白之濃度來計算唾液酸與重組 蛋白之莫耳比。藉由部分酸水解來釋放唾液酸（SA)，包括 N-乙醯神經胺酸（Neu5Ac)及N-羥乙醯神經胺酸（Neu5Gc)。 151112.doc -50- 201118176 然後藉由反相HPLC來分離衍生物以測定唾液酸含量。藉 由在280 nm下之UV吸光度來測定蛋白質濃度。以莫耳比 報告唾液酸含量，即每莫耳重組糖蛋白中Neu5Ac及 Neu5Gc之總莫耳數。以標準化數值報告唾液酸含量，即 實際值除以任意值。使用相同除數來標準化此處所報告研 究中之所有唾液酸含量數據。 N-連接寡糖量測 使用具有脈衝安培檢測之高pH陰離子交換層析（HPAEC_ PAD)來繒·;連接券糖之曲線（Basa及Spellman 1990 ; Townsend及Hardy 1991)，從而提供關於位點特異性N—連 接糖基化之資訊。自蛋白質裂解冰連接寡糖且在HpAEC_ PAD上根據存在的唾液酸之量將其分離至四個域中。域工代 表無唾液酸物質。域II、111及IV係唾液酸化物質且分別代 表單唾液酸化、二唾液酸化及三及四唾液酸化物質。以N_ 連接唾液酸化物質在總N-連接寡糖物質（包括無唾液酸物 質及唾液酸化物質二者）中之百分比來報告N_連接唾液酸 化物質比例。以標準化數值來報告N_連接唾液酸化物質比 例，即實際值除以任意值。使用相同除數來標準化此處所 報告研究中之所有N-連接唾液酸化物質比例數據。 連接寡糖量測 藉由對融合蛋白之參照標準品及蛋白八純化樣品之完整 質量分析來描述〇-連接糖基化之特徵（參考文獻）。將樣品

稀釋於 100 mM Tris (25 mM NaCl，pH 7_6)中且與 PNG 酶 F 一起培育過夜以酶促移除所有氺連接寡糖。然後在與胰島 151112.doc 51 201118176 素内標混合後注入樣品進行完整物質分析。以莫耳比報告 0-連接唾液酸含量，即每莫耳重組糖蛋白中之〇-連接唾液 酸數。 結果 地塞米松提高Ν -連接寡糖中之唾液酸含量及唾液酸化物 質之百分比 用不同量之DEX處理表現融合糖蛋白之CHO DG44細胞 系以評價DEX是否可影響唾液酸含量及不同唾液酸化物質 之百分比。此研究係使用上述培養條件於250 mL搖瓶中以 一式兩份來實施。在接種後第二天，以介於0.01 μΜ至10 μΜ DEX之終濃度將DEX添加至CHO細胞培養物中。在第 1 〇天收穫培養物，且使用蛋白Α管柱純化融合蛋白，並分 析總唾液酸含量、Ο-連接唾液酸含量及N-連接特徵。唾液 酸化在DEX處理之培養物中以濃度依賴性方式增加（表1)。 表1 SA增加 百分比 (%) 9.3 13.0 13.0 20.4 DEX處理 (μΜ) 0.01 0.1 1.0 10 Ν-連接無 唾液酸物 質之增加 百分比 (%) -8.6 -9.6 -10.0 -15.6 Ν-連接單 唾液酸化 物質之增 加百分比 (%) 6.6 7.3 4.3 7.3 Ν-連接二 唾液酸化 物質之增 加百分比 (%) 13.9 13.9 19.4 24.3 Ν-連接三 及四唾液 酸化物質 之增加百 分比(％) 4.5 13.6 15.9 20.5 0-連接SA 之增加百 分比(％) 0.01 μΜ至10 μΜ之DEX濃度使唾液酸含量自9.3%增加至 20.4%，在10 μΜ下產生最大效應。與對照相比，經DEX處 理之培養物之Ν-連接寡糖層析顯示，單唾液酸化、二唾液 酸化及三唾液酸化加四唾液酸化比例分別自4.3%提高至 151112.doc -52- 201118176 7.3%、自13.9%提高至24.3%及自4.5%提高至2〇·5%。與之 相比，與對照相比，補加DEX之培養基中無唾液酸在寡糖 分佈中之比例降低8.5%至15.6%。N-連接層析圖亦在1〇 μΜ DEX下顯示最大效應。該等結果表明，在經DEX處理 之培養物中，唾液酸化有所改良。然而，在經DEX處理之 樣品中，未觀察到〇_連接唾液酸莫耳比出現顯著變化。 DEX促進ρι，4-半乳糖基轉移酶（p14_GT)及α2 3唾液酸 轉移酶（a2,3-ST)表現 採用蛋白質印跡藉由研究兩種酶pi，4_GT及a2,3_ST之表 現來闡釋DEX對唾液酸化之作用的可能機制，該兩種酶參 與唾液酸添加途徑。在此實驗中，在接種後第二天以〇1 μΜ至10 μΜ之濃度將DEX添加至培養物中並在三天後收穫 細胞進行蛋白質印跡分析。使用管家蛋白ρ肌動蛋白來比 較樣品負載量。如圖丨八及⑺中所示，與未經dex處理之 培養物相比，在經DEX處理之培養物中 之表現水平顯著提高。兩種酶之表現強度一般隨DEx濃度 而升同。s玄等結果證實，DEX能刺激唾液酸轉移酶p 1，4_ GT及a2,3-ST在CHO細胞中之表現。 DEX之細胞保護性效應導致培養物上清液中之唾液酸酶 活性降低 在實例3中，顯示DEX處理可提高抗細胞凋亡蛋白 表見仅·而使CHO細胞培養物之活力增強。為確定因 EX所改良之細胞活力是否會減弱唾液酸酶對重組融合蛋 白之降解效應，實施搖瓶試驗，以比較含有或不含丨 151112.doc -53- 201118176 DEX之培養物之細胞活力及上清液唾液酸酶活性特徵。如 圖2Α及圖2Β中所示，在DEX處理組培養物及未處理組培 養物中’唾液酸酶活性提高均與細胞活力下降相關。在 DEX處理組培養物中，細胞活力自第4天之98·〇±〇·ι%降低 至第10天之85.0±2.7%，與之相比對照組在第丨0天之活力 為70.2±4,6%。在DEX處理組培養物中，唾液酸酶活性之 吸光度量測值自第4天之0.006±0.〇〇2升高至第1〇天之 0·024±0·003 ’與之相比對照組在第10天之數值為〇 〇47±〇 〇〇4。 因此，在DEX處理組培養物中，培養物細胞活力降低以及 唾液酸酶活性升高之速率顯著較慢，該等結果顯示，DEx 能經由其細胞保護性效應來抑制唾液酸酶釋放。 比較地塞米松與其他兩種糖皮質激素，即氫化可的松及 潑尼松龍 亦評估其他糖皮質激素化合物（氫化可的松（HYC)及潑尼 松龍（PRD)) ’以確定CHO細胞中DEX對提高唾液酸化之效 應是否可擴展至其他糖皮質激素化合物。在接種後第二 天，依0、0.1、1及10 μΜ之終濃度添加DEX、HYC及PRD 至細胞培養基中。圖3Α及圖3Β展示在不同糖皮質激素條 件下培養10天後之標準化總唾液酸含量及標準化Ν_連接唾 液酸化物質比例。在介於〇· 1 μΜ至1 〇 μΜ之間之糖皮質激 素濃度下，與對照組之10.2±0.2相比，DEX组之總唾液酸 含量為 12.4±0·4 至 14.0±0.5 ，HYC 組為 11.2±0.1 至 13.0±0.2，且 PRD組為 11.8±0.2至 13.4±0.8。在介於0.1 μΜ 至10 μΜ之間之糖皮質激素濃度下，與對照組之77.1±〇 7 151112.doc •54· 201118176 相比，DEX組之N-連接唾液酸化物質比例為85·6± 1.6至 88.8±0.9，HYC 組為 79.8±1.6 至 89.6±0.1 ，且 PRD 組為 83.7±0.1至 89.0±0.2。因此，與DEX 組相似，HYC 組與PRD 組二者亦顯示唾液酸化提高，且所有三種糖皮質激素化合 物在試驗濃度範圍内，皆在10 μΜ下觀察到最大效應。然 而，HYC組及PRD組需要較高濃度才能達成與DEX組相同 之增強唾液酸化程度。 地塞米松增強唾液酸化之機制涉及糖皮質激素受體。 為確定因添加DEX所致的唾液酸化改良是否係經由糖皮 質激素受體（GR)來介導，在DEX處理之前將GR拮抗劑米 非司酮（mifepristone)(RU-486)添加至細胞培養基中。具體 而言，在接種後48小時添加1 μΜ RU-486且隨後在24小時 後以0.1 μΜ、1 μΜ及10 μΜ之濃度添加DEX。亦將DEX添 加至不含RU-486之培養物中作為對照。對於含有及不含 RU-486之條件，由DEX誘導之標準化總唾液酸含量及標準 化Ν-連接唾液酸化物質比例分別展示於圖4Α及圖4Β中。 DEX促進產物唾液酸化之能力在1 μΜ RU-486存在下顯著 降低且在0.1 μΜ DEX條件下最為明顯。在0.1 μΜ DEX條 件下，總唾液酸含量及Ν-連接唾液酸化物質比例分別自 15·1±0·1 及 92.2±2.0(不含 RU-486)降低至 12.7±0.1 及 81.5士0.8(含有1 μΜ RU-486)。該等結果表明，DEX提高唾 液酸化之機制具有GR依賴性，此乃因RU-486與DEX競爭 GR之配體結合結構域（Raux-Demay等人，1990)。 DEX在分批補料式生物反應器培養中之應用 151112.doc -55- 201118176 然後在分批補料式培養中使用受控5 L·生物反應器測試 DEX促進存於搖瓶中之融合蛋白唾液酸化的效應。生物反 應器係如方法部分中所述來作業。在添加有1 μΜ DEX濃 /主物之培養物中觀察到較高總唾液酸含量（圖5Α)及Ν-連接 唾液酸化物質比例（圖5Β)。含有DEX時之總唾液酸含量為 16.5土0.1 ’與之相比’對照為14·2±0·1(提高16.2%)。類似 地’含有DEX時之Ν-連接唾液酸化物質比例為9〇.2±1.3， 與之相比，對照為77.9±ι 6(提高15 8%)。與在搖瓶唾液酸 8^活隹研九中之觀察結果（圖3 a及3 Β) —致，含有DEX時在 第8至14天之間總唾液酸含量自17.9±0.1降低至16.5±0.1 (-7.8%) ’與之相比對照自16 3±〇丨降低至14 2±〇丨（_12 9%))。 類似地’含有DEX時唾液酸化比例之百分比在第8至14天 之間自97·7±0.9降低至9〇·2±1.3 (-7.7°/。），與之相比對照自 91.3±0.9降低至 77.9±1.6 (-14.7%)。 進一步以不同生物反應器規模確認DEX導致之糖蛋白唾 液酸化的提高。來自不同運行之標準化最終唾液酸含量及 標準化唾液酸化比例百分比歸納於圖6中。在該等運行 中，DEX條件包括以濃注物形式添加有〇ΕΧ或補料培養基 中包括DEX之運行。如圖6中所示，DEX顯示可顯著改良 唾液酸化，其增強最終唾液酸含量（Ρ值<0.00 1，測試）及 最終唾液酸化物質比例（P值<〇.〇〇 1，t_測試）。 結論 將地塞米松添加至產生重組融合糖蛋白之CHO培養物中 可改良唾液酸化。此研究首次證實，地塞米松能促進糖基 151112.doc •56· 201118176 轉移酶a2,3-ST及pl，4-GT之表現且地塞米松之效應係經由 糖皮質激素受體來介導。總之，地塞米松在改良唾液酸化 中之效應涉及經由糖基轉移酶產生之細胞内效應以及經由 延長培養物活力產生之細胞外效應，該延長之培養物活力 減少經由細胞裂解釋放至培養物上清液中之唾液酸酶之存 在。人們發現地塞米松可為改良唾液酸化之便捷方法。 實例2 細胞系及培養基 在此研究中使用之CHO細胞系最初亞選殖自DG44輯代 細胞且在專利性無蛋白質生長培養基中培養。對宿主細胞 進行遺傳改造以在CMV啟動子控制下分泌IgG•融合蛋白。 搖瓶實驗 貫驗係在250 mL搖瓶（VWR international)中實施，起始 體積為100 mL且初始細胞密度為6 X 1 〇5細胞/mL〇將搖瓶置 於具有150 rpm旋轉速度之振盪器平臺（VWR internati〇nal) 上。在37°C及6% C〇2之標準加濕條件下將細胞培養丨〇天之 持續時間’其中每天使用1 Μ碳酸納調節pH，且每兩天補 給葡萄糖及筵醯fe酸以維持其一定含量。藉由自動化細胞 計數系統 Cedex (Innovatis AG，Bielefeld, Germany)及 Bioprofile 分析儀 400(Nova Biomedical公司，Waltham，ΜΑ) 脫機分析細胞密度、細胞活力及受質/代謝產物。自各培 養收穫物收集上清液進行SEC分析。 尺寸排除層析（SEC) 根據先前公開之方法來實施SEC分析（periC0等人， 151112.doc -57· 201118176 2〇08)，其中作出一些修改。簡言之，在Agilent 1100 HPLC 系統（Agilent Technologies公司，Palo Alto，CA)中於 Tosoh Bioscience TSK-Gel G3000 SWxl管柱（7.8 IDx30 cm，5 μπι 顆粒）上運行蛋白A純化樣品。流動相含有pH 7.4之1 x磷酸 鹽緩衝鹽水（PBS)。流速為0.5 mL/min，且將管柱溫度控制 在25°C。藉由280 nm波長下之吸光度來監測信號。 對麩胱甘肽還原酶及糖皮質激素受體之蛋白質印跡分析 在用1 X PBS洗務後，用1 mL Laemmli樣品緩衝液（Bio-Rad Laboratories)裂解約 107 個 CHO細 胞且在 90°C 下經 5 分 鐘變性。在4-15% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離全細胞裂解 物’印跡至0.45 μπι石肖酸纖維素膜（Bio-Rad Laboratories) 上’並用第一抗體及第二抗體來探測。用於檢測麩胱甘 肽還原酶之第一抗體係針對位於人源麩胱甘肽還原酶C 末端附近之胺基酸391-510產生之單株抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。儘管製造商並未列出中 國倉鼠來源用於使用此抗體來檢測楚胱甘肽還原酶，但初 步實驗顯示’在來自CHO細胞及人源HL60細胞之裂解物 中僅檢測出一條區帶在印跡上具有相同的表觀分子尺寸。 用於檢測糖皮質激素受體之第一抗體係抗人類單株抗體 (Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。第二抗體係

辣根過氧化物St (HRP)偶聯之抗小鼠抗體（santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA)。剝離膜並用β·肌動蛋白抗 體（Santa Cruz Biotechnology)及HRP偶聯之第二抗體再次 探測。用增強型化學發光蛋白質印跡檢測系統（GE 151112.doc -58 - 201118176

Healthcare)來實施免疫檢測並用VersaDoc成像系統（Bio-Rad Laboratories)來 進行可 視化。 結果 地塞米松（DEX)在較寬濃度範圍内降低CHO產生之 IgG-融合蛋白之聚集 圖7A展示在用DEX以培養基中之1 μΜ終濃度處理CHO 細胞後IgG-融合蛋白中顯著降低之高分子量（HMW)物質百 分比。HMW物質中之主要組份係以共價或非共價方式形 成之二聚體及三聚體且可明確視為蛋白質聚集體。考慮到 蛋白質聚集降低15%係在已優化培養條件下獲得，故此改 良實際上在製造製程中甚為重要。為建立DEX對蛋白質聚 集之效應的劑量反應曲線及時間進程，在不同DEX濃度下 培養細胞’或在相同濃度（1 μΜ)下培育不同時間。如圖7C 中所示，DEX以時間依賴性方式降低蛋白質聚集比率，此 與先前觀察到之DEX對細胞活力及蛋白質糖基化特徵之時 間依賴性改良一致（表1及圖11)。然而，DEX對蛋白質聚集 程度之濃度依賴性降低並不明顯（圖7B)，表明抗聚集效應 並不僅係由於改良細胞活力所致，此乃因先前結果顯示， CHO細胞之活力隨培養基中DEX之濃度自〇.〇1 μΜ提高至 10 μΜ而增加。 地塞米松上調CHO細胞中之麩胱甘肽還原酶表現 實施蛋白質印跡以檢測自不同濃度DEX處理之Ch〇細胞 製備之全細胞裂解物中之麩胱甘肽還原酶表現。如圖8中 所示’ DEX促進麩胱甘肽還原酶之表現，此結果甚至可在 151112.doc -59- 201118176 1 nM藥物下觀察到。使用對肌動蛋白之檢測來比較樣品 負載量’以消除麵胱甘肽還原酶區帶增強係由於巧合性地 提高樣品負載量所致的可能性。 GSH在體外降低純化igG·融合蛋白聚集 為確定GSH自身是否可藉由與蛋白質相互作用來影響蛋 白質聚集’實施以下體外研究：將Gsh添加至在Tris-乙酸 鹽緩衝液中重構之蛋白A純化igG-融合蛋白中，並分析 SEC特徵。如圖9中所示，高分子量物質之百分比顯著降 低，降低比率在1 mM及3 mM GSH存在下分別為15.3°/〇及 27.3%。數據明確顯示，GSH可直接抑制IgG_融合蛋白聚 集。 地塞米松效應係經由糖皮質激素受醴來介導 DEX係具有多種藥理性作用之有效糖皮質激素。為確定 DEX對IgG-融合蛋白聚集之抑制性效應是否係經由糖皮質 激素受體之活化來特異性介導，首先確認糖皮質激素受體 (GR)在所用細胞系中具有内源性表現，此展示於圖1〇A 中。由於在蛋白質印跡中使用之抗體係針對人類GR之保 守區域產生的’故出於抗體驗證目的亦載入HepG-2細胞之 全細胞裂解物樣品作為人源樣品。儘管該抗體可檢測GRa 及GRp ’但本分析僅顯示單一區帶。此可係由於該兩種亞 型之分子量（95 kDa對90 kDa)過於接近而在5-15%梯度凝膠 上不能分離’或更可能係由於樣品中僅存在一種亞型。 由於發現DEX可上調麩胱甘肽還原酶在CHO細胞中之表 現（參見圖8) ’實施進一步評價以確定此效應是否係藉由活 151112.doc -60- 201118176 化GR受體來誘導。RU-486係GR拮抗劑且經常在多種GR相 關研究中用作工具藥物。初步實驗顯示，RU-486在濃度不 高於1 μΜ時不影響CHO細胞活力及代謝參數；在10 μΜ下 觀察到細胞活力及細胞生長速率顯著降低。在後續實驗 中，因此以1 μΜ或更低濃度使用RU-486且將其引入培養 物中以預處理CHO細胞，一天後添加DEX。圖10B顯示， 在1 μΜ RU-486存在下，DEX對麩胱甘肽還原酶表現之上 調效應減弱，從而確認涉及GR。 最後，評估HMW物質在經0.1 μΜ DEX及其與不同濃度 RU-486之組合處理之CHO細胞所產生IgG-融合蛋白中之百 分比。與圖7B中之結果一致，在單獨用0.1 μΜ DEX處理 培養物時HMW物質之百分比降低約1 7%，且此效應隨RU-486濃 度之增 加而逐 漸減小 （圖 10C) 。 在使用 等濃度 DEX 及 RU-486之條件下，對HMW物質之抑制率為單獨使用DEX 時獲得之比率的大約一半，表明作為激動劑之DEX及作為 拮抗劑之RU-486在彼此競爭CHO細胞中之GR時具有相似 親和力。因此，將圖9中所有三份數據匯總在一起，結果 明確顯示，對IgG-融合蛋白聚集之介導係經由GR來介導。 結論 作為便宜但有效的糖皮質激素且由於其三種益處的組合 (改良細胞活力，如實例3中所述；及改良糖基化，如實例 1中所述；及抑制蛋白質聚集，如此處所述），地塞米松可 提供有成本效益的簡單有效方式來總體促進細胞培養過 程。 151112.doc -61 · 201118176 實例3 此研究首次證實，地塞米松能在無血清條件下以濃度及 時間依賴性方式防止CHO細胞出現細胞凋亡。DEX誘導 CHO細胞GILZ(糖皮質激素誘導之白胺酸拉鏈）基因表現。 DEX在10-L生物反應器CHO培養中成功用於改良細胞活力 及Fc-融合蛋白生產率及唾液酸含量。此研究證實，在工 業細胞培養中施加DEX可改良重組蛋白生產率及糖基化。 細胞系及培養基 此研究中所用CHO細胞系係自DG44親代細胞亞選殖且 在化學成份確定之專利性生長培養基中培養。 搖瓶實驗 實驗係在250 mL搖瓶（VWR international)中實施，起始 體積為100 mL且初始細胞密度為6 X 105細胞/mL。將培養物 置於150 rpm振盪器平臺（VWR international)上且在37°C及 6% C02下維持十天。每天自培養物取樣且使用1 Μ碳酸鈉 來調節pH，且每兩天補給葡萄糖及麩醯胺酸以維持其一定 含量。使用 Bioprofile 分析儀 400(Nova Biomedical 公司， Waltham，ΜΑ)脫機量測細胞密度及活力。 生物反應器作業 在 10 L生物反應器（Sartorius Stedim Biotech, France)中 實施生物反應器實驗，起始工作體積為5 L。將振盪、pH 及溶解氧分別控制在150 rpm、7.05及50%空氣飽和度下。 最初將溫度控制在37°C，但在培養期間變至較低溫度以延 長培養活力。生物反應器係以分批補料式模式作業且在第 151112.doc -62- 201118176 3天開始每天補給專利性補料培養基以維持葡萄糖及其他 營養素之充足濃度。在細胞培養過程期間取樣並分析細胞 密度、細胞活力、受質及代謝產物。 qRT-PCR 分析 實施TaqMan® 5'-核酸酶即時定量RT-PCR分析以驗證 DEX對GILZ之上調。如上所述使用RNeasy® midi套組自含 有或不含1 μΜ DEX之一式三份培養物中的每一份純化總 RNA。用無RNA酶DNA酶I (Qiagen)處理純化RNA且隨後 使用其作為模板使用RT2第一鏈套組（SA Biosciences, Frederick, MD)來合成第一鏈cDNA。使用GILZ特異性 TaqMan MGB探針（6-FAM-AGAGGACTTCACGTGT)及引物 (正向：5-CCTCCCTCATCTGTCCACTGA-3 及反向：5-TGGTGGGTTTGGCATTCAA-3)定量測定GILZ之表現。在 lxTaqMan Fast Universal PCR 基質混合物（Applied Biosystems, Carlsbad, CA)中使用 900 nM引物及 250 nM探 針擴增 20 ng cDNA。在 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系統中 使用共 通之循 環參數（在 95°C 下 20 s ， 40 個在95°C下3 s之循環，在60°C下30 s)—式三份運行反 應。在分析各樣品中之β-肌動蛋白之相同板上建立平行反 應作為内源性對照。將各基因之閾值循環相對於「管家基 因」β-肌動蛋白之閾值循環進行標準化。使用δ-δ閾值循環 方法（Livak及Schmittgen, 2001)來計算基因表現相對於對 照之標準化變化。 GILZ之蛋白質印跡分析 151112.doc -63- 201118176 用IX磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)溶液洗滌約107個CHO細胞， 用 1 mL Laemmli 樣品緩衝液（Bio-Rad Laboratories, Hercules，CA)裂解，且隨後在90°C下經5分鐘變性。在4-15% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離全細胞裂解物，印跡至 0.45 μιη石肖酸纖維素膜（Bio-Rad Laboratories)上，並依次用 針對GILZ之第一小鼠單株抗體（Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz, CA)及辣根過氧化物酶（HRP)偶聯之抗小鼠第 二抗體（Santa Cruz Biotechnology)來探測。剝離膜並用β-肌動蛋白抗體（Santa Cruz Biotechnology)及HRP偶聯之 抗小鼠第二抗體再次探測。用增強型化學發光蛋白質印 跡檢測系統（GE Healthcare UK Limited Little Chalfont， Buckinghamshire，UK)實施免疫檢測，且用VersaDoc成像 系統（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)進行可視化。 效價分析 藉由親和層析使用HPLC幫浦及UV檢測（Agilent Technologies, Santa Clara, CA)及 Applied Biosystems Poros A/20蛋白A管柱（100x4.6 mm)來測定效價。使用10級標準 曲線來量化所洗脫蛋白。 結果 地塞米松對CHO細胞生長之效應 在接種後兩天以介於0.01 μΜ至10 μΜ之間之終濃度將糖 皮質激素地塞米松（DEX)添加至搖瓶培養物中以評價糖皮 質激素對CH細胞活力之效應及延長細胞培養期之可能 性。劑量-反應研究中之活細胞密度（VCD)曲線（圖11Α)顯 151112.doc •64- 201118176 示’對細胞生長之抑制在DEX處理後一天以劑量依賴性方 式增強。在未經處理之對照培養物中，峰值VCD達到 8·5χ106細胞/mL，而在經10 μΜ DEX處理之培養物中，峰 值VCD為6.5 xlO6細胞/mL。在第6天後細胞活力快速下降 (圖11B)且活力百分比在第丨〇天僅為42 · 1 %。與之相比，使 用〇·〇1 μΜ及10 μΜ DEX時，最終細胞活力分別為53.1 %及 64.0°/。。在DEX處理之培養物中，活力損失在第6天開始以 濃度依賴性方式增加，最大效應出現在10 μΜ處（圖11Α及 11Β)。 然後在搖瓶培養物中對添加DEX實施時間進程研究，其 中將DEX添加至最終DEX濃度為1 μΜ且在接種當天至接種 後六天之間進行添加。如圖11C及11D中所示’在所有DEX 處理之培養物中最終VCD及細胞活力增加，且VCD及細胞 活力二者以時間依賴性方式隨DEX添加時間提前而提高。 在第10天，未經處理之CHO細胞培養物之活力降低至 50。/。，而在第〇、2、4及6天添加DEX之培養物之活力分別 為 63%、68%、72%及 740/〇。 DEX降低細胞比生長速率但增加細胞比生產率 量化並比較經DEX處理細胞與未處理細胞之比生長速 率、標準化體積生產率及標準化細胞比生產率。比較使用 與不使用1 μΜ DEX之細胞比生長速率及標準化生產率特 徵之數據展示於圖12Α及12Β(η=5)中。在第2天添加DEX， 與添加DEX後一天之對照相比，DEX使細胞生長速率降低 約30%。然而，此生長抑制效應隨培養時間而降低。在培 151112.doc •65· 201118176 養期結束時，在含有經DEX處理細胞之培養物中細胞死亡 速率較慢。此外，DEX誘導之早期細胞生長抑制不影響體 積生產率（所有培養物皆為6_5);然而’經DEX處理之培養 物之比生產率顯著高於未經處理之細胞’其中最大比生產 率為（7.0±0.6)χ10·9。 藉由qRT-PCR及蛋白質印跡分析來確認DEX對GILZ2 上調 使用qRT-PCR分析GILZ以驗證藉由微陣列分析獲得之基 因表現特徵。在TaqMan® qPCR定量中使用在第5天及第8 天來自一式三份經DEX處理培養物與未經處理培養物之 RNA樣品。在分析各樣品中之β·肌動蛋白之相同板上建立 平行反應作為内源性對照。如圖1 3 Α中所示，在第5天及第 8天藉由qRT-PCR自樣品獲得之GILZ之標準化表現特徵變 化分別為 7.66±1.08及 10.48±2.16。 藉由蛋白質印跡分析在第5天來自經1 μΜ DEX處理及未 經處理之培養物之細胞裂解物以測試GILZ在經DEX處理之 培養物中是否過表現。亦使用β-肌動蛋白抗體作為對照再 次探測印跡，以評價等量凝膠負載量。如圖13Β中所示， 與未經處理樣品相比’ GILZ蛋白之表現在經DEX處理之樣 品中顯著增加。此外，由DEX引起之GILZ之倍數變化在第 8天之樣品中稍高於第5天之樣品，此與qRT-PCR結果一 致。 比較地塞米松與其他兩種糖皮質激素，即氫化可的松及 潑尼松龍 151112.doc •66· 201118176 然後在搖瓶中進行實驗以測試DEX對CHO細胞活力之保 護性效應是否僅限於DEX或可擴展至其他糖皮質激素化合 物，例如氫化可的松（HYC)及潑尼松龍（PRD)。在接種後 兩天以0 μΜ、0.1 μΜ、1 μΜ及10 μΜ之終濃度（該三種化合 物中之每一種）添加DEX、HYC及PRD (Sigma-Aldrich，St.

Louis，MO)。培養細胞之峰值VCD、最終VCD及最終活力 展示於表2中。 表2 處理濃度(μΜ) 峰值VCD (X 106 細胞/mL) 最終VCD (X 106細胞/mL) 活力(％) 地塞米松(DEX) 0.1 7.99 7.64 72.3 1 9.02 8.40 75.8 10 7.49 7.38 82.3 氫化可的松(HYC) 0.1 10.06 7.86 60.1 1 9.51 8.15 65.1 10 8.44 7.80 75.5 潑尼松龍(PRD) 0.1 8.99 8.26 69.4 1 9.25 8.79 76.8 10 8.05 8.27 77.5 對照 Ν/Α 8.69 7.56 56.6 與 DEX類似，HYC(60.1-75.5%最終活力）及 PRD(69.4- 75.5%最終活力）亦顯示劑量依賴性細胞保護效應。在第1〇 天，對照之活力為56.6%，與之相比，在第10天，〇_1 μΜ 及10 μΜ濃度之DEX之活力分別為72.3%及82.3% ; HYC分 別為60.1 %及75.5% ;且PRD分別為69.4%及77.5%。因此， 所有三種糖皮質激素化合物皆可改良培養物活力且所有三 種糖皮質激素化合物之最大效應皆出現在1 〇 μΜ處。 地塞米松之死亡抑制作用涉及GILZ及糖皮質激素受體 為確定因添加DEX所致之活力改良是否係經由GILZ及糖 皮質激素受體（GR)來介導，在DEX處理前將GR拮抗劑米 151112.doc -67- 201118176 非司酮（RU-486)添加至細胞培養基中。對於使用及不使用 RU-486之條件，由DEX誘導之最終細胞活力之提高百分比 展示於圖14A中。DEX改良細胞活力之能力在1 μΜ RU-486存在下顯 著降低 。由 0.1 μΜ及 1 μΜ DEX誘導之細胞活 力之增加百分比分別自30.5%及32.6%(不含RU-486)降低至 4.7% 及 5.7%(含有 1 μΜ RU-486)。同時，qRT-PCR 分析（圖 14B)顯示’在1 μΜ RU-486存在下，DEX對GILZ表現之上 調效應顯著減弱。由〇·1 μΜ及1 μΜ DEX誘導之倍數變化 分別自9.0±1.9及11.3±3.0(不含RU-486)降低至1.8±0.9及 2.3士1.〇(含有10厘111；-486)»蛋白質印跡分析（圖14〇進一 步確認，GILZ蛋白之過表現在1 μΜ RU-486存在下顯著降 低。該等結果表明，DEX提高活力之機制涉及GILZ且具有 GR依賴性，此乃因RU-486與DEX競爭GR之配體結合結構 域。 地塞米松在10 L分批補料式生物反應器培養中之應用 在10 L生物反應器中實施分批補料式培養以確定在搖瓶 中觀察到之DEX效應是否可按比例放大至生物反應器中。 DEX之總體目標係在生物反應器製程中抑制細胞死亡，延 長培養壽命及由此促進糖蛋白生產。在此研究中，三個生 物反應器使用上述相同條件作業；其中分別在第2天或第7 天將1 μΜ DEX添加至兩個生物反應器中》與搖瓶運行不 同，生物反應器運行延長至14天，培養溫度在培養之指數 末期變至較低溫度，且使用專利性補料培養基而非僅補給 葡萄糖及麩醯胺酸。 151112.doc -68- 201118176 在第2天或第7天添加DEX之生物反應器在第8天達到約 8.3 X 1 06細胞/mL之最大細胞密度，與之相比未添加DEX之 生物反應器為7.8><106細胞/1111^(圖15八）。〇£又添加降低生物 反應器中之細胞死亡速率。在第6天所有條件下之細胞活 力皆為94°/。活力（圖15Β)。截至第14天，未添加DEX之生物 反應器之活力百分比降低至29%，與之相比，在第2天或 第7天添加DEX之生物反應器之活力分別為55%及39°/。。在 第I4天’在第2天或第7天添加DEX之生物反應器之最終 VCD分別為4.1及3·5χ1〇6細胞/mL，與之相比未添加DEX之 生物反應器為2.8xlO6細胞/mL。在第7天達到最大VCD之 前，標準化蛋白效價為約5.5(圖15C)。之後，在培養靜止 期及死亡期期間’蛋白質產生在添加有DEX之生物反應器 中較高。在兩個添加有DEX之生物反應器中，第14天收穫 物之標準化效價為12.5，相對於未添加DEX之生物反應器 (10.5)增加 20%。 結論 吾人在優化培養基的努力中意外地發現，在CHO細胞之 分批補料式培養中，糖皮質激素可顯著減弱細胞活力降 低。在此現象之機制研究中，經由qRT_PCR及蛋白質印跡 分析確定其涉及抗細胞凋亡基因GILZ之上調。藉由研究 DEX類似物及拮抗劑對ch〇細胞生長之效應來確定GILZ及 糖皮質激素受體在介導DEX活性中之作用。分批補料式生 物反應器實驗證實，此糖皮質激素類似物係在細胞培養中減 弱活力降低之有效的、可行的且具有成本效益的化學物質。 151112.doc -69· 201118176 實例4 在此研究中，在具有不同糖蛋白（CTLA4Ig)分泌之另一 CHO細胞系中研究地塞米松（DEX)對CHO細胞生長、蛋白 質唾液酸化及聚集之效應。 細胞系及培養基 在此研究中使用之CHO細胞系最初亞選殖自DG44親代 細胞且在化學成份確定之專利性生長培養基中培養。 搖瓶實驗 實驗係在250 mL搖瓶（VWR international)中實施，起始 體積為100 mL且初始細胞密度為6X 105細胞/mL。將培養物 置於150 rpm振盪器平臺（VWR international)上且在37°C及 6% C02下維持十天。每天自培養物取樣並根據需要使用i Μ碳酸鈉調節pH，且每兩天補給葡萄糖及麩醯胺酸以維持 其充足含量。在第2天以介於0.001 μΜ-10 μΜ之間之終濃 度添加糖皮質激素地塞米松（DEX)。使用Cedex自動化細胞 計數器（Innovatis AG，Bielefeld, Germany)脫機量測細胞密 度及活力。使用Bioprofile分析儀400(Nova Biomedical公 司，Waltham, ΜΑ)脫機量測培養物pH及葡萄糖及麵醯胺酸 之濃度。自培養收穫物收集上清液進行唾液酸含量及 HMW含量之分析。 唾液酸及HMW含量分析 唾液酸及HMW含量分析係如先前實例t所述來實施。 結果 地塞米松對CHO細胞生長之效應 151112.doc -70- 201118176 在接種後兩天以介於0.001 μΜ至10 μΜ之間之終濃度將 糖皮質激素地塞米松（DEX)添加至搖瓶培養物中，以評價 DEX對CHO細胞活力之效應及延長細胞培養期之可能性。 劑量-反應研究中之活細胞密度（VCD)特徵（圖16Α)顯示， 在DEX處理後對細胞生長之抑制出現提高，但在研究範圍 内濃度依賴性並不明顯。在未經處理之對照培養物中，峰 值VCD達到13.9xl06細胞/mL，而在經0.001 μΜ至10 μΜ DEX處理之培養物中，峰值VCD介於10·6χ106至12·7χ106 細胞/mL範圍内。未經處理培養物之細胞活力在第6天後快 速降低（圖16B)，且在第10天活力百分比僅為64.5%。與之 相比，經0.001 μΜ及10 μΜ DEX處理之最終細胞活力分別 為 75.5%及 82.3%。 地塞米松（DEX)促進糖蛋白CTLA4Ig之唾液酸化且降低 其HMW含量 除細胞生長外，亦評價DEX對唾液酸含量及HMW含量 之效應。經由與未經處理培養物進行對比，由不同濃度 DEX誘導之唾液酸含量之增加百分比（圖17A)及HMW物質 之降低百分比（圖17B)展示於圖17中。顯然，甚至在0.001 μΜ濃度下，DEX亦能提高糖蛋白之唾液酸化並減少HMW 物質，從而表明其可改良蛋白質品質。在DEX之濃度高於 0.01 μΜ時，DEX對唾液酸含量及HMW物質之濃度依賴性 並不明顯。 該等結果證實，DEX在細胞活力改良、糖蛋白唾液酸化 改良及聚集降低方面之作用並不僅限於單一細胞系或培養 151112.doc 201118176 基配方。 實例5 在此研究中，在500 L及5000 L規模之生物反應器中證 實在大規模重組糖蛋白生產之細胞培養基中採用DEX之可 行性。 細胞系及培養基 此研究中所用CHO細胞系係自DG44親代細胞亞選殖且 在專利性生長培養基中培養。 生物反應器作業 在7 L、500 L·及5000 L生物反應器中實施生物反應器實 驗，起始工作體積分別為約3 L、300 L及3000 L。所有生 物反應器運行皆始於37°C且在細胞進入生產期時變至較低 溫度以延長細胞培養期。將pH及溶解氧維持在7.05及50% 空氣飽和度下。7 L、500 L及5000 L規模之振盪速率分別 為180、75及60 rpm。所有生物反應器實驗皆係以分批補 料式模式來實施，其中每天補給無蛋白培養基以維持葡萄 糖及其他營養素之一定含量。出於提高細胞活力及蛋白質 唾液酸化之目的’在所有生產規模之補料培養基中皆包括 地塞米松。在細胞培養過程期間取樣並分析細胞密度、細 胞活力、受質及代謝產物。 如先前實例中所述來實施效價、唾液酸及HMW含量分 析。 結果 圖1 8 A及18B展示關於細胞生長及活力之生物反應器性 15I112.doc •72· 201118176 能。在細胞生長通量自7 L按比例放大至5〇〇〇 L後觀察到 類似的介於12至13X106細胞/mL之間之峰值活細胞密度， 且誤差棒代表在特定規模下運行之標準偏差在每個時間點 有所重疊。對於5000 L規模，細胞密度在第7天達到峰 值’且對於7 L及500 L規模在第8天達到峰值。在7 l、5〇〇 L 及5000 L生物反應器規模下，培養物在第14天之平均活力

分別為88%、84%及91%。圖18C及18D展示在7 L、500 L 及5000 L生物反應器規模下之生產率及唾液酸特徵。在 7、500及5000 L規模下，第14天之效價（以標準化數值報 告）分別為13.2、11_6及13.6。在遞增規模下，峰值唾液酸 含量（以標準化數值報告）為16.〇、18 〇及19 〇。在所有規模 下’截至運行結束時，唾液酸降低約2.6單位。 結論 總之，在所有規模下在補料培養基中包括地塞米松時皆 性此良好，從而表明採用地塞米松作為培養基添加劑用於 工業規模之生產具有可行性。 【圖式簡單說明】 圖1顯示，在經DEX處理之CHO細胞中，β1，4-半乳糖基 轉移S#(1A)及α2,3-唾液酸轉移酶（1Β)之表現一般隨地塞米 松（DEX)之濃度而增加，如實例1中所述。DEX係在接種後 第2天以0.1 μΜ至1 0 μΜ之濃度添加至培養物中。在接種後 第五天’收集細胞樣品並製備全細胞裂解物，在4_ 1 5%梯 度凝膠上分離並用針對各糖基轉移酶之抗體進行探測。然 後用β-肌動蛋白抗體再次探測印跡以評價等量負載量。 151112.doc -73· 201118176 圖2展示DEX之細胞保護效應，其導致培養物上清液中 之唾液酸酶活性降低，如實例1中所述。圖中展示在培養 期間經DEX處理培養物與未經處理培養物之細胞活力（2A) 及上清液唾液酸酶活性分析中之吸光度（2B)特徵。以1 μΜ 濃度進行之DEX處理係在第2天開始。各數值反映五次實 驗之數據之平均值及標準偏差。 圖3展示經糖皮質激素類似物（氫化可的松（hydrocortisone) (HYC)及潑尼松龍（prednisolone)(PRD))處理之培養物中糖 蛋白唾液酸化之改良，如實例1中所述。圖中展示在分別 經DEX、HYC及PRD處理之培養物中標準化總唾液酸含量 (3A)及標準化N-連接唾液酸化物質之比例（3B)。處理是在 接種後第二天以0.1 μΜ、1 μΜ及10 μΜ之濃度在各化合物 之培養基中開始。各參數之數值係以平均值土差值/2(η=2) 之形式報告。 圖4顯示，糖皮質激素拮抗劑RU-486可阻斷DEX對唾液 酸化之增強，如實例1中所述。圖中展示在存在及不存在 RU-486時之標準化總唾液酸含量（4Α)及標準化Ν-連接唾液 酸化物質比例（4Β)。RU-486係在接種後48小時以0或1 μΜ 引入細胞培養懸浮液中。在24小時後將0.1 μΜ、1 μΜ及10 μΜ之DEX添加至培養物中。各參數之數值係以平均值土 差值/2(n=2)之形式報告。 圖5顯示，在5 L生物反應器中分批補料式培養經DEX處 理之CH0細胞可提高唾液酸含量及唾液酸化物質比例，如 實例1中所述。圖中展示未經處理培養物及經處理培養物 151112.doc -74- 201118176 在1個培養期間之標準化總唾液酸含量（5A)及標準化連 接唾液酸化物質比例（5B)。各參數之數值係以平均值土標 準偏差（n=3)之形式報告。標準化數值等於實際值除以 意值。 圖6展不DEX在7、10及20 L規模之生物反應器中改良糖 蛋白唾液酸化之能力，如實例丨中所述。圖中概述不同運 行中經DEX處理培養物與未經處理培養物之標準化最終總 唾液酸莫耳比對標準化唾液酸化比例。標準化數值等於實 際值除以任意值。 圖7顯示’高分子量（HMW)物質在經地塞米松（DEX)處 理之CHO細胞所產生igG-融合蛋白中之百分比降低，如實 例2中所述。7A，首先使所有細胞在相同搖瓶中一起培養 兩天，且隨後將其分為兩組，其中一半在基礎培養基中以 1 μΜ之終濃度接受單一劑量之〇ΕΧ。在第10天收集上清液 並純化，之後實施SEC-HPLC分析以測定HMW物質之百分 比。數據點係五個搖瓶在單一實驗中之結果的平均值 (土S.D.)。**與對照（CON)相比，ρ<〇.〇1。7Β，在第2天將 DEX以不同濃度添加至CHO細胞培養物中並在第10天收集 上清液。數據點係自兩個相同燒瓶獲得之結果之平均值。 7C，所有培養皆係在相同時間開始，但在不同天數添加1 μΜ DEX，且在第1 〇天之相同時間收穫細胞，從而獲得所示不 同培育時間。數據點係得自兩個相同燒瓶之結果之平均 值。 圖8顯示，麩胱甘肽還原酶在經地塞米松（DEX)處理之 151112.doc -75· 201118176 CHO細胞中之表現增加’如實例.2中所述。在接種當天將 DEX以不同濃度添加至細胞培養物中，且在第5天收集細 胞樣品。在4-15%梯度凝膠上分離全細胞裂解物。在檢測 麩胱甘肽還原酶後’使用相同印跡來檢測β·肌動蛋白以比 較樣品負載量。 圖9顯示，HMW物質在與GSH —起在體外培育之以匕融 合蛋白中之百分比降低’如實例2中所述。以〇、1 3 mM之終濃度將減少之麵胱甘肽（GSH)添加至經純化igG-融 合蛋白之Tris-乙酸鹽缓衝溶液（pH 7.5)中，且將GSH與蛋 白質之混合物在37°C下培育1 h，之後實施sec_hplc分 析。數據點係兩個實驗中四次測定之平均值（± S.D.)。*與 對照（0 mM GSH)相比，Ρ<〇·〇5。 圖10顯示’地塞米松（DEX)之效應在糖皮質激素受體枯 抗劑RU-486存在下減弱’如實例2中所述。1〇Α，自未經 處理之HepG-2及CHO細胞製備全細胞裂解物且在4_15。/〇梯 度凝膠上分離。使用HepG-2樣品作為用於第一抗體驗證目 的之人源對照。10B，在接種後一天（第1天）將111;_486以i μΜ引入培養物中且在第2天分開經ru_486預處理之ch〇細 胞’其中一半在基礎培養基中以〇 1 μΜ之終濃度接受單一 齊J量之DEX。在第1 〇天收集細胞樣品；所有其他程序都與 圖2相同。10C，在第1天將Ru_486wl μΜ引入培養物中且 隨後在第2天以0.1 μΜ或1 μΜ之終濃度將DEX添加至經RU-6預處理之培養物中。在第1〇天收集上清液。數據點係 得自兩個相同燒瓶之結果之平均值。 151112.doc -76· 201118176 圖11顯示’在CH0細胞存於無血清培養基中之培養物中 DEX可抑制細胞死亡’如實例3中所述。圖中展示dex對 活細胞密度（11A)及活力（UB)之效應之劑量反應曲線，其 中在第2天開始處理。圖中展示dex在1 μΜ處理濃度下對 /舌細胞岔度（11C)及活力（1丨D)之效應之時間進程曲線。各 數值係得自一式兩份實施之實驗之數據的平均值。 圖12顯示，DEX可降低CHO細胞比生長速率，同時提高 細胞比生產率’如實例3中所述。圖中展示DEX對CHO細 胞比生長速率（12A)、標準化體積生產率（12B)及標準化細 胞比生產率（12B)之效應。DEX處理是在第2天開始。數值 反映得自五個實驗之數據的平均值及標準偏差。標準化數 值等於實際值除以任意值。 圖13顯示’藉由qRT-PCR及蛋白質印跡（western blot)分 析來確認抗細胞凋亡基因GILZ在經DEX處理CHO細胞中之 上調’如實例3中所述。（13 A)在接種後第2天分別以0及1 μΜ之終濃度將DEX添加至一式三份培養物中。在接種後 第5天及第8天提取mRNA樣品。各參數之數值係以平均值 土標準偏差（n = 3)之形式報告。（13B)在接種後第2天分別以0 及1 μΜ之終濃度將DEX添加至一式三份培養物中。收集細 胞樣品且在接種後第5天及第8天製備全細胞裂解物。 圖14顯示地塞米松之死亡抑制作用涉及GILZ及糖皮質 激素受體，如實例3中所述。圖中展示在存在及不存在RU-486時由DEX誘導之最終活力之百分比增加（與未經DEX處 理相比）（14A)、GILZ基因表現（14Β)及GILZ蛋白表現（14C) 151112.doc -77- 201118176 之倍數變化。在接種後48小時將RU-486以〇或1 μΜ引入細 胞培養懸浮液中，在24小時後將〇、0.1 μΜ及1 μΜ之DEX 添加至培養物中。收集細胞進行活力、qRT_pCR&蛋白質 印跡分析。圖A中所報告之各數值係得自一式兩份實驗之 數據之平均值。圖B中所報告之各數值係得自一式三份實 驗之數據之平均值及標準偏差。 圖15顯示’在1〇 l生物反應器中分批補料式培養經dex 處理之CHO細胞可改良VCD、活力、效價及唾液酸莫耳 比，如實例3中所述。圖中展示未經處理培養物及經處理 培養物之活細胞密度（15A)、活力（15B)及標準化效價（15C) 特徵’其中DEX處理是在第2天及第7天開始。標準化數值 等於實際值除以任意值。 圖1 6展示在具有CTLA4Ig分泌之CHO細胞培養物中DEX 對細胞生長之效應。圖中展示在分別以〇 μΜ、〇 〇〇 1 μΜ、 0.01 μΜ、0.1 μΜ、1 μΜ及10 μΜ之終濃度經DEX處理之培 養物中，DEX對活細胞密度（16A)及活力（16B)之效應之劑 量反應曲線。處理係在接種後第二天開始，且各數值係得 自一式兩份實施之實驗之數據之平均值。 圖17展示DEX對CTLA4Ig中唾液酸莫耳比及HMW含量之 效應。該圖展示分別以〇 μΜ、0.001 μΜ、0.01 μΜ、0.1 μΜ、 1 μΜ及10 μΜ之終濃度經DEX處理之培養物中之最終總唾 液酸莫耳比（17A)及HMW物質（17B)。處理係在接種後第二 天開始’且各數值係得自一式兩份實施之實驗之數據之平 均值。圖A中所報告之數值係標準化數值，其等於實際值 151112.doc -78 - 201118176 除以任意值。 圖18展示在大規模重組糖蛋白生產中包括DEX之可行 性，如實例5中所述。該圖展示分別以7 L(n= 16)及500 L (n=6)及5000 L(n=3)規模產生之重組糖蛋白之活細胞密度 (18A)、活力（18B)、標準化效價（18C)及標準化唾液酸含量 (1 8D)。數值反映得自以各規模實施之多個實驗之數據的 平均值及標準偏差。標準化數值等於實際值除以任意值。 在所有規模中使用相同除數來進行標準化。 圖19繪示CTLA4Ig之核苷酸序列（SEQ ID ΝΟ··1)及所編 碼胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:2) ’其具有信號肽、CTLA4細 胞外結構域之野生型胺基酸序列（始於+1位置之曱硫胺 酸’止於+ 124位置之天冬胺酸；或始於位置之丙胺酸， 止於+ 124位置之天冬胺酸）、及ig區域。 圖20繪示CTLA4突變分子（L104EA29YIg)之核苷酸序列 (SEQ ID NO:3)及所編碼胺基酸序列（SEq id NO:4)，其具 有信號肽、CTLA4之突變細胞外結構域（始於+ 1位置之曱 硫胺酸且止於+124位置之天冬胺酸，或始於_丨位置之丙胺 酸且止於+ 124位置之天冬胺酸）、及1§區域。 圖21繪示與制瘤素M信號肽（_26位置至_2位置）融合之人 類CTLA4受體（在本文中稱作「野生型」CTLA4)之核酸 序列（SEQ ID NO:5)及所編碼完整胺基酸序列（SEq m NO:6)。（美國專利第5,434，131號及第5 844,〇95號）。 I51112.doc -79- 201118176 序列表 <11〇> 美商必治妥美雅史谷比公司 <X20>用於製造蛋白質之哺乳動物細胞培養方法

<130> 11400 NP <140> 099134097 <141> 2010-10-06 <150> 61/278,343; 12/897,857 <151> 2009-10-06; 2010-10-05 <160> 6

<X70> Patentln version 3.S <210> X <211> 1152 <212> DNA <213> 智人 <220> <22l> CDS <222> (1) . . (U49) <400> 1 atg ggt gta ctg etc aca cag agg aeg ctg etc agt ctg gtc ett gca 48

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Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30 get gtg gta ctg gee age age ega ggc ate get age ttt gtg tgt gag 144

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 tat gca tet cca ggc aaa gee act gag gtc egg gtg aca gtg ett egg 192

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt geg gca acc tac atg atg 240

Gin Ala Aep Ser Gin Val Thr Glu Val Cys hla Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 ggg aat gag ttg acc ttc eta gat gat tee ate tgc aeg ggc acc tec 288

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr QXy Thr Ser 85 90 95 agt gga aat caa gtg aac etc act ate caa gga ctg agg gee atg gac '336

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Tyr Leu Gly lie Gly Asn OXy Thr Gin lie Tyr Val He Asp Pro Glu 130 135 140 ccg tgc cca gat tct gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac 480

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160 aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa etc ctg ggt gga ccg tea gtc 528

Thr Ser Pro Pto Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175 ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc egg acc S76

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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 672

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Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro hye Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160 151112·序列表.doc 201118176

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Oly Ser Ser Val 165 170 175

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Hie Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 3 4- 151112-序列表.doc 201118176 <2ll> 1152 <212> DNA <213>智人 <220> <221> CDS <222> (1) . . (1149) <4〇0> 3 atg ggt gta ctg etc aca cag agg aeg ctg etc agt ctg gtc ett gca 48

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Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly bys Glu Tyr Lys 245 250 255

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Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 3〇 151112-序列表.doc 96 201118176 get gtg gta ctg gee age age ega ggc ate gee age ttt gtg tgt gag 144 Ala val val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 tat gca tet cca ggc aaa gee act gag gtc egg gtg aca gtg ett egg 192 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt geg gca acc tac atg atg 240 Qln Ala Asp Ser Gin val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 ggg aa.t sag ttg acc ttc eta gat gat tee ate tgc aeg ggc acc tee 288 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95 agt gga aat caa gtg aac etc act ate caa gga ctg agg gee atg gac 336 Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110 aeg gga etc tac ate tgc aag gtg gag etc atg tac cca ccg cca tac 3Θ4 Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Le'u Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125 tac ctg ggc ata ggc aac 9ga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432 Tyr Leu Gly He Gly Asn Gly Tlir Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 130 135 X40 ccg tgc cca gat tet gac ttc etc etc tgg ate etc gca gca gtt agt 480 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp He Leu Ala Ala Val Ser 145 150 155 160 teg 999 ttg ttt ttt tat age ttt etc etc aca get 9tt tet ttg age 526 Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 165 170 175 aaa atg cca aag aaa aga age cct ett aca aca ggg gtc tat gtg aaa 576 l.ys Met; Leu by 3 hys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly val Tyr Val Lys 180 185 190 atg ccc cca aca gag cca gaa tgt gaa aag caa ttt cag cct tat ttt 624 Met Pro Pro Thr Olu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 195 200 205 att ccc ate aat 626 lie Pro lie Asn 210 <210> 6 <211> 212 <212> PRT <2X2> 智人 <400> 6 151112-序列表.doc ·9· 201118176

Met Oly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu1 Ser Leu Val Leu Ala 15 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met Hie Val Ala Gin Pro 20 25 30

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Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 195 200 205 lie Pro lie Asn 210 •10- 151112·序列表,doc

Claims (1)

1. 201118176 七、申請專利範圍： 1· 一種用於製造糖蛋白之細胞培養方法， 开巴含：a)在細 胞培養中，在容許製造蛋白質之條件下培養製造糖蛋白 之宿主細胞；及b)添加非毒性量之糖皮質激素。 2. 如請求項1之細胞培養方法，其中該糖蛋白之唾液酸化 相對於未添加糖皮質激素之培養物中之唾液酸化有所增 加。 3. 如請求項1之細胞培養方法，其中其細胞死亡相對於未 添加糖皮質激素之培養物中之細胞凋亡有所抑制。 4. 如請求項1之細胞培養方法，其中其細胞活力相對於未 添加糖皮質激素之培養物中之細胞活力有所提高。 5. 如請求項1之細胞培養方法，其中其糖蛋白效價相對於 未添加糖皮質激素之培養物中之糖蛋白效價有所提高。 6. 如請求項1之細胞培養方法，其中糖蛋白聚集相對於未 添加糖皮質激素之培養物中之糖蛋白聚集有所降低。 7. 如請求項1至6中任一項之細胞培養方法，其中該糖皮質激 素選自由以下組成之群：地塞米松（dexamethasone)、倍他 米权（betamethasone)、乙酸氟虱可的松（血办沉⑽丨犯批acetate)、 氫化可的松（hydr〇C〇rtisone)、甲潑尼龍（methylprednis〇i〇ne)、 潑尼松龍（prednisolone)、潑尼松（prednis〇ne)及曲安西龍 (triamcinolone) 〇 8. 如請求項1至6中任一項之細胞培養方法，其中該等宿主 細胞係哺乳動物細胞。 9. 如請求項8之細胞培養方法，其中該等哺乳動物細胞選 151112.doc 201118176 自由CHO、骨髓瘤及c〇s細胞組成之群。 10·如請求項1至6中任—項之細胞培養方法其中將該細胞 培養物t之該糖皮質激素含量維持在i ηΜ至i mM之濃 度。 11. 如請求項1至6中任-項之細胞培養方法，其中在該培養 過程期間之任何時間’將該糖皮質激素添加至基礎培養 基、補料培養基中或作為濃注物添加。 12. 如明求項!至6中任一項之方法’其中該糖皮質激素係在 接種後且在開始初始死亡期之前的某個時間點添加。 13. 如請求項12之方法，其中該糖皮f激素係在接種後且在 初始生長期期間的某個時間點添加。 14. 如請求項13之方法，其中該糖皮質激素係在初始生長期 結束時或約在結束前後添加。 15. —種用於製造可溶性CTLA4分子之細胞培養方法，其包 含：a)在細胞培養中，在容許製造蛋白質之條件下培養 製造可溶性CTLA4分子之CHO細胞；及b)向該等細胞補 給含有地塞米松（dexamethasone)之補料培養基。 16. 如凊求項15之細胞培養方法，其中該可溶性c丁LA4分子 之唾液酸化相對於未向該等細胞補給含有地塞米松之補 料培養基之培養物中的唾液酸化有所提高。 1 7.如晴求項15之細胞培養方法，其中該可溶性CTLA4分子 係可溶性CTLA4突變分子，其包含如seq id NO:3中所 示’以+1位置之甲硫胺酸或_ 1位置之丙胺酸開始且以丨24 位置之天冬胺酸結束且與包含狡鏈、CH2及CH3結構域 151112.doc 201118176 之免疫球蛋白部分體接合之胺基酸序列，其中在該細胞 培養物中將地塞米松保持或維持在0丨μM至10 μΜ之濃 度下’且其中該細胞培養物體積為至少5 〇〇升。 1 8 ·如叫求項15之細胞培養方法，其中該可溶性c丁分子 係可溶性CTLA4突變分子，其包含該如SEQ m N〇:3* 所不以+ι位置之甲硫胺酸或_丨位置之丙胺酸開始且以i24 位置之天冬胺酸結束且與包含鉸鏈、CH2及ch3結構域 之免疫球蛋白部分體接合之胺基酸序列，其中向該等細 胞補給含有地塞米松之補料培養基，且其中該細胞培養 物體積為至少500升。 19.如胡求項15之細胞培養方法，其中該可溶性分子 包含如SEQ m NO:1中所示以+1位置之甲硫胺酸或# 置之丙胺酸開始且以124位置之天冬胺酸結束且與包含 鉸鏈、CH2及CH3結構域之免疫球蛋白部分體接合之胺 基酸序列，其中在該細胞培養物中將地塞米松保持或維 持在i nM至(Μ μΜ之濃度下，且其中該細胞培養物體積 為至少500升。 20_如請求項15之細胞培養方法，其中該可溶性ctla4分子 包含該如SEQ ID N0:1中所示以+1位置之曱硫胺酸或] 位置之丙胺酸開始且以124位置之天冬胺酸結束且與包 含鉸鏈、CH2及CH3結構域之免疫球蛋白部分體接合之 胺基酸序列，其中向該等細胞補給含有地塞米松之補料 培養基，其中該細胞培養物體積為至少5〇〇升。 21·如請求項15、19及20中任一項之細胞培養方法，其中該 151112.doc 201118176 可溶性CTLA4分子包含如SEQ ID ΝΟ:1中所示以+1位置 之甲硫胺酸或-1位置之丙胺酸開始且以+357位置之離胺 酸結束之胺基酸序列。 22.如請求項1 7及18中任一項之細胞培養方法，其中該可溶 性CTLA4突變分子包含如SEQ ID NO:3中所示以+1位置 之甲硫胺酸或-1位置之丙胺酸開始且以+357位置之離胺 酸結束之胺基酸序列。 151112.doc