TW201102086A - Antibodies against human CCN1 and uses thereof - Google Patents

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201102086 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種抗人類CCN1抗體（CCN1抗體）、其製 備方法、含有該等抗體之醫藥組合物、及其用途。 【先前技術】 CCN1(CYR61、GIG-1、IGFBP-10、SwissProt 000622) 為一種生長因子誘導之中早期基因，其係CCN蛋白質家族 之成員，且參與細胞黏附、血管新生、細胞凋亡及遏止生 長或刺激生長（參見Chen Y·及Xiao-Yan D_，J. Cell. Biochem. 100 (2007) 1337-1345 ;及 Kubota，K.及 Tagikawa， M·，Angiogenesis 10 (2007) 1_11)。CCN1係由模組結構體 組成，且含有38個保守性半胱胺酸殘基。CCN1具有與其 他CCN蛋白質（除了 CCN5缺少C末端模組以外）相同之模組 結構。CCN1包括胰島素樣生長因子結合蛋白質（IGFBP)樣 基序（第I結構域’ IGF-BP，第26-97位胺基酸）、溫韋伯氏c 型結構域（von Willebrand type C domain)(第 II結構域， VWC ’第98-164位胺基酸）、I型血小板反應蛋白結構域（第 III結構域，TSP，第228-273位胺基酸）及C末端模組（第IV 結構域，CT ’第286-360位胺基酸）。介於第II結構域與第 III結構域之間存在一個可變結構域（Var，第165-227位胺基 酸）。CCN1會與整合素ανβ3結合’並透過其發揮作用，增 強促血管生成活性（Chen, Ν.等人，J. Biol. Chem. 42 (20〇4) 44166-44176)。CCN1之整合素ανβ3結合位點位於第 116-135位胺基酸之間（Chen Ν_等人，J_ Biol. Chem. 42 148283.doc 201102086 (2004) 44166-44176)，及位於第 III結構域中（Leu, S.J.等 人，J. Biol. Chem. 278 (2003) 33801-33808)。整合素 及肝素結合位點位於第III及第IV結構域中（Chen等人，J. Biol· Chem. 276 (2001) 47329-47337)。 雖然CCN蛋白質於靠近N末端處與胰島素樣生長因子結 合蛋白質（IGFBP)-樣基序相同，但是無明確之實驗意義說 明其參與IGF信號轉導途徑（Grotendorst, G.R.等人， Endocrinology 14 1 (2000) 2254-2256)。溫韋伯氏 C型結構 域（VWC)、I型血小板反應蛋白結構域、及C末端模組（不 存在於WISP2/CCN5中）被認為對蛋白質-蛋白質交互作用 (募聚合（VWC)或與分子外基質分子及受體交互作用）而言 是重要的。 小鼠CCN1與人類CCN1之胺基酸序列有91%相同。齧齒 動物CCN1及針對齧齒動物CCN1之抗體可參見OTrien, T.P_等人，Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 3569-3577。CCN1 與 結缔組織生長因子-II(CTGF 2/CTGH 2)亦具有高度一致 性。亦發現與NOV與FISB-12具有一致性（但較低）。Babic, A.M.等人於 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 6355-63 60中闡述彼等之針對人類CCN1之抗體顯示出可與小鼠 CCN1交叉反應，但不會與FISB-12交叉反應。 CCN1及抗CCN1抗體闡述於如下文獻中：WO 96/001896(其係關於結締組織生長因子-II(CTGF-2)) ; WO 97/033995(其係關於人類CCN1); WO 01/55210(其係關於 CCN1組合物及方法）；WO 2005/040191(其係關於CCN1組 148283.doc 201102086 合物及方法）；WO 02/04480(其係關於結締組織生長因子_ II(CTGH-2)) ; WO 01/98359(其係關於CCN1作為治療及診 斷乳癌之標靶）；WO 02/26193(其係關於以CCN1於治療及 診斷人類子宮平滑肌瘤上之用途）。Grotendorst, G.R.及 Duncan，M.R.，FASEB J. 19 (2005) 729-738闡述一種針對 CTGF結構域之抗體，且發現該等抗體具有針對ν末端與c 末端結構域之一些活性。由於該等結構域係經纖溶酶裂解 產生，而裂解發生於可變結構域内部，因此會破壞該等結 構域。

Dong Xie 等人於 J. Biol· Chem. 276 (2001) 14187-14194 中闡述CCN1係與更嚴重之疾病相關，且於cancer Res. 64 (2004) 1987-1996中闡述CCN1在神經膠質瘤中會過度表 現，且參與與整合素相連之由激酶介導之akt及β_連環蛋白 (catenin)-TCF/Lef信號轉導途徑。

Schuetze，N.等人，Protein Expr. Purif. 42 (2005) 219- 225係關於重組體CCN1之表現、純化、及功能測試。 Schuetze將該開放閱讀框選殖入桿狀病毒表現載體，並將 該構柴體轉染至SF-2 1昆蟲細胞。重組體CCN1之表現為與 人類IgG之Fc -結構域形成融合蛋白質，並利用蛋白質〇_ Sepharose管柱進行親和層析法純化。由於ccni具有1 〇〇/〇 半耽胺酸殘基’因此其為黏附性極高之蛋白質，且其在純 化及處理期間可很容易流失。該蛋白質在純化期間及之後 亦易於形成凝集物並沉殿。添加Fc-標記可使該等困難降 至最低程度。作者並不確定rCCNl蛋白質之Fc_標記是否改 148283.doc 201102086 變或影響了該蛋白質之生物化學特性。Leu, S.J.等人，J. Biol· Chem. 278 (2003) 33801-33808 闡述標記六組胺酸之 如下CCN1片段：第I結構域（IGFBP)、第II結構域（VWC)及 第III結構域（TSP1)之重組表現《不可獲得未經標記之天然 蛋白質。

Jedsadayanmata，A.等人，J. Biol. Chem. 274 (1999) 24321-24327闡述一種抗肽多株抗體，其係針對包括CCN1 之可變結構域（第163至229位胺基酸）及TSP1結構域（第228-273位胺基酸）部份的肽，用以研究人類血小板與活化作用 相關之黏附作用。多株抗血清之產生方法為：對兔免疫接 種於大腸桿菌（E. coli)中重組產生之Var-GST融合蛋白質 (Kireeva 等人，Exp. Cell Res. 233 (1997) 63-77)。US 7,521，540主張一種會與人類〇^61中之第163-229位胺基酸 及第210-225位結合之抗體的專利權。根據us 7,521,540 , 多株Cyr61-特異性抗血清之製法為：對紐西籣白兔免疫接 種具有Cyr61之第163至229位胺基酸與GST融合之構築 體。 【發明内容】 本發明包括一種於哺乳動物細胞中重組表現哺乳動物細 胞膜結合型人類CCN1或其CCN1結構域之方法，其特徵 為.以編碼C末端與哺乳動物跨膜結構域融合之ccn 1或其 CCN 1結構域（CCN 1融合蛋白質）的核酸載體轉形哺乳動物 宿主細胞’於該宿主細胞中表現該CCN1或CCN1結構域融 合蛋白質’並收集該膜結合型CCN1或其CCN1結構域。該 148283.doc 201102086 CCN1結構域較佳為CCN1之可變結構域。 本發明另外包括一種以哺乳動物細胞膜結合型CCN1或 CCN1結構域於產生針對CCN1之抗體上之用途。膜結合型 CCN1或CCN1結構域可用作免疫原及/或用於根據本發明篩 選抗體。該CCN1結構域較佳為CCN1之可變結構域。 本發明另外包括一種針對人類CCN1之抗體，其特徵為 其特異性結合CCN1可變結構域中第210至228位胺基酸及 由CCN1之可變結構域組成之融合蛋白質，其C末端與 PDGF -受體（人類β型血小板衍生之生長因子受體）之跨膜結 構域融合，該融合蛋白質係表現於哺乳動物（以人類較佳） 細胞表面上。該細胞可為例如哺乳動物腫瘤細胞株之細 胞，諸如ΗΕΚ293或NIH 3Τ3。該細胞較佳為ΗΕΚ293。 本發明包括一種與CCN1特異性結合之抗體，其特徵為 其包括如SEQ ID ΝΟ:1之CDR3區作為重鏈可變結構域 CDR3區。 較佳地，該與CCN1特異性結合之抗體的特徵為：其重 鏈可變結構域包括如SEQ ID ΝΟ:1之CDR3區、及如SEQ ID NO:2之 CDR2 區。 較佳地，該與CCN1特異性結合之抗體的特徵為：其重 鏈可變結構域包括如SEQ ID ΝΟ:1之CDR3區、如SEQ ID NO:2 之 CDR2 區、及如 SEQIDNO:3：^CDRlg。 較佳地，該與CCN1特異性結合之抗體的特徵為：其重 鏈可變結構域包括如SEQ ID ΝΟ:1之CDR3區、如SEQ ID NO:2之CDR2區、及如SEQ ID NO:3之CDR1區；且其輕鏈 148283.doc 201102086 可變結構域包括如SEQ ID NO:4之CDR3區、如SEQ ID NO:5 之 CDR2 區、及如 SEQIDN0:6 之 CDR1 區。 較佳地，該與CCN1特異性結合之抗體的特徵為：其重 鏈可變結構域包括SEQ ID NO:7。較佳地，該抗體之特徵 為：其重鏈可變結構域包括SEQ ID NO:7，且其輕鏈可變 結構域包括SEQ ID ΝΟ··8。重鏈可變結構域SEQ ID n〇:7 及輕鏈可變結構域SEQIDNO:8為人類λ同型。 較佳地，該與CCN 1特異性結合之抗體的特徵為：其重 鏈可變結構域為CDR移接型igGl亞型形式之重鏈可變結構 域SEQ ID NO:7，且其輕鏈可變結構域為CDR移接型λ同型 形式之輕鏈可變結構域SEQ ID ΝΟ:8。 較佳地，該抗體之特徵為：其與單株抗體420結合相同 之CCN1抗原決定基（SEQ ID ΝΟ:7及8)。 較佳地，根據本發明之抗體的特徵為：上述胺基酸序列 或胺基酸序列片段及性質。根據本發明之抗體較佳包括人 類來源之Fc部份。根據本發明之抗體較佳為人類IgG丨或 IgG4同型。IgGl及IgG4恒定鏈實例示於以下所列序列。抗 體較佳屬於人類IgGl種類。抗體較佳為人源化抗體或人類 抗體。 根據本發明之抗體會與CCN 1及與膜結合型CCN 1可變區 特異性結合，且親和力較佳為至少11至1 〇-12 M·1。根 據本發明之抗體在10 pg/ml下對EA-Hy-926細胞與重組體 CCN1之間交互作用的抑制作用可超過5〇%(黏附分析法）。 本發明另外包括一種以根據本發明之抗體於治療疾病， 148283.doc 201102086 較佳腫瘤疾病上之用途。 本發月另外包括種以根據本發明之抗體於製造用於治 療疾病，較佳腫瘤疾病之醫藥物上之用途。 本發月另外包括種製造醫藥物之方法，供治療疾病， 較佳腫瘤疾病（尤其為礼癌、原發性神經膠質瘤、姨癌、 膀耽乳頭狀瘤、結腸腺癌、里洛本^ …、色素瘤、神經官胚細胞瘤、 小兒腫瘤、纖維肉瘤），其牲 ^ }兵特被為包括根據本發明之抗 體。 【實施方式】 術語「抗體 包括但不限 」涵蓋多種形式之抗體結構體 據本發明之抗體較佳為人類抗 、或其他經遺傳工程處理之抗 之特性。「抗體片段」包括全 於完整抗體及抗體片段。根 體、人源化抗體、嵌合抗體 體，只要其保留根據本發明 長抗體之-部份，較佳為其可變結構域、或至少為其抗原 、.·。口位點。抗體片段實例包括雙功能抗體、單鏈抗體分 子、及自抗體片段形成之多特異性抗體。scFv抗體例如闡 述於Houston, J.S·，Methods in Enzymol· 203 (1991) 46-96 中。此外’抗體片段包括單鏈多肽，其具有％結構域之特 铽亦即此夠與Vl結構域組裝在一起；或具有可與CCN1 結合之Vl結構域的特徵，亦即能夠與VH結構域組裝在一 起’最終形成功能性抗原結合位點，且藉此提供根據本發 明之抗體的特性。如文中所用’術語「單株抗體」或「單 株抗體組合物」係指單一胺基酸组合物之抗體分子之製 知丨術人源化抗體」係指一種抗體，其中框架及/或 148283.doc •10* 201102086 「互補決定區」（CDR)經過改造而包括不同於母本免疫球 蛋白之不同物種之免疫球蛋白之CDR。於一項較佳實施例 中，係將小鼠CDR移接至人類抗體框架區，製得「人源化 抗體」。參見例如Riechmann，L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;及Neuberger, M.S.等人，Nature 3 14 (1985) 268-270 ° 本文在有關重組表現膜結合型CCN1結構域之方法及使 用該膜結合型CCN1結構域於產生針對CCN1之抗體之方法 中採用的術語「CCN1結構域」意指選自如下組成之群中 之CCN1結構域：胰島素樣生長因子結合蛋白質（IGFBP)樣 基序（第I結構域，IGF-BP，第26-97位胺基酸）、溫韋伯氏C 型結構域（von Willebrand type C domain)(第 II結構域， VWC，第98-164位胺基酸）、I型血小板反應蛋白結構域（第 III結構域，TSP，第228-273位胺基酸）、C末端模組（第IV 結構域，CT，第286-360位胺基酸）及可變結構域（Var，第 165-227位胺基酸）。有關重組表現膜結合型CCN1結構域之 方法及使用該膜結合型CCN1結構域於產生針對CCN1之抗 體之方法的術語CCN1結構域亦包括N末端及/或C末端刪除 1至8個胺基酸之CCN1結構域片段。 如文中所用，術語「與CCN1特異性結合」意指於細胞 結合分析中，利用重組表現膜結合型CCN1之細胞（數量為 每個細胞>100.000分子CCN1)及抗-人類IgG抗體（經FITC標 記，作為偵測抗體），藉由FACS測定抗體與人類CCN1結合 性。若以抗體濃度10 pg/ml之抗體所引起之螢光比僅以偵 148283.doc 11 201102086 測抗體（抗-人類IgG抗體，經FITC標記，相同濃度10 pg/ml)背景染色值增強至少10倍，則表示存在結合性。 如文中所用，術語「與CCN1可變結構域特異性結合」 意指於細胞結合分析中，利用重組表現膜結合型可變結構 域（數量為每個細胞>1〇〇.〇〇〇個分子可變結構域）之細胞及 抗-人類IgG抗體（經FITC標記，作為偵測抗體），藉由FACS 測定抗體與人類CCN1之可變結構域（Var，第165-227位胺 基酸）結合性。若以抗體濃度1 0 Hg/ml之抗體所導致之螢光 比於僅以偵測抗體（抗-人類IgG抗體、經FITC標記、相同 濃度1 〇 Mg/ml)背景染色值增強至少8倍，則表示存在結合 性。 定量FACS信號之方法為測定陽性與陰性（對照組，干擾 信號）螢光樣本的重疊區域之形態。一種適用工具為 MetaMorph成像軟體中之「Measuring Colocalization」算 法（www.moleculardevices.com) ° 利用包括VAR結構域（第163位胺基酸至第240位胺基酸） 之合成肽，藉由ELISA測定與CCN1線性片段之結合。其係 基於測定與由人類CCN1之第210至228位胺基酸所組成之 CCN1抗原決定基結合之重疊肽Mab420。 根據本發明之CCN1抗體可特異性結合CCN1之膜結合型 可變結構域、及抗體Mab420所結合之CCN1可變結構域上 之相同抗原決定基。藉由細胞結合分析法測定本發明 CCN1抗體之抗原決定基結合特性，其係藉由FACS，進行 活體外交叉阻斷結合分析法，以確定Mab420抗體阻礙測 148283.doc -12- 201102086 試抗體與膜結合型CCN1或膜結合型可變結構域結合之能 力於°亥刀析中，使Mab 420與重組表現膜結合型ccni或 CCN1之膜結合型可變結構域之細胞預先結合，且隨後添 加測試抗體。若測試抗體在相同濃度（1〇叩/〇11)之結合性 受到至少15%抑制（相對於相同濃度之測試抗體在未預先結 合Mab 420下之結合性）時，則抗原決定基「相同」。 如文中所用，「根據本發明抗體的可變結構域」（輕鏈之 可變結構域（VL)、重鏈之可變結構域（Vh))意指直接參與抗 體與抗原結合之每一對輕鏈與重鏈結構域。可變輕鏈及重 鏈結構域具有相同之一般結構，且各結構域包括序列高度 保守之四個框架（FR)區，其利用三個「高可變區」（或互 補決定區，CDR)連接。框架區採取片構形，且CDR可形 成連接β-片結構的環。各鏈中CDR的三維結構係由框架區 保持’且與另一條鏈中之CDr—起形成抗原結合位點。抗 體之重鍵及叙鍵CDR3區在根據本發明抗體的結合特異性/ 親和力中扮演非常重要之角色，且因此提供本發明之另一 標的。 文中所用之術語「抗體之抗原結合部份」係指抗體中負 責結合抗原之胺基酸殘基《抗體之抗原結合部份包括來自 「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架區」或 「FR區」為該等除了如上定義之高可變區殘基之外之可變 結構域之區域。因此，抗體之輕鏈及重鏈可變結構域包括 (自Ν末端至C末端）結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3、及FR4。特定言之，重鏈之CDR3為最主要 148283.doc •13· 201102086 之抗原結合區域，且定義抗體之性質。根據Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五 版 ’ Public Health Service，National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)之標準定義及/或「高可變環」中之該 等殘基確定CDR及FR區域。 如本申請案令所用，術語「胺基酸」係指由天然存在之 羧酸α-胺基酸組成之群，包括丙胺酸（三字母代碼：aia， 單字母代碼：A)、精胺酸（arg，R)、天冬醯胺（asn，N)、 天冬胺酸（asp，D)、半胱胺酸（cys，c)、麩胺醯胺（gin， Q)、麩胺酸（glu，E)、甘胺酸（gly，G)、組胺酸（his，Η)、 異亮胺酸（ile，I)、亮胺酸（ieu，L)、離胺酸〇ys , κ)、甲 硫胺酸（met ’ Μ)、苯丙胺酸（phe，F)、脯胺酸（pr〇，ρ)、 絲胺酸（ser，S)、蘇胺酸（thr，Τ)、色胺酸（trp，W)、酪胺 酸（tyr ’ Y)、及纈胺酸（vai，v)。 如文中所用，術語「核酸」或「核酸分子」意欲包括 DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，但以雙 股DNA較佳。當核酸與另一核酸存在功能關係時，稱其 「以操作方式連接」。例如，若前序列或分泌引導序列之 DNA之表現為參與多肽分泌之前蛋白質，則該dna與該多 肽之DNA以操作方式連接；若啟動子或增強子可影響序列 轉錄，則該啟動子或增強子與該編碼序列以操作方式連 接；或若核糖體結合位點所處之位點利於 體結合位點與該編碼序列以操作方式連接。「以== 連接」通常意指相連之DNA序列共線，且若為分泌^導序 148283.doc -14· 201102086 列，則為相鄰或在閱讀框中。缺 鄱。蕤士 *入— …而’增強子並不一定相 鄰。藉由在合宜之限制酶位點 和冲咕 黏接元成連接。若不存 在该等位點，則根據習知操作 彳噹拉7 便用&成性养核苷酸接頭 或連接子。如文中所採用表 A “ ^細胞」、「細胞株」、 及、、、田胞培養物」可相互交換使用，B ^ + 、便用且所有該等名稱均包 括子代。因此，字詞「轆报聛 轉九體」及「經轉形細胞」包括初 代私的細胞及自其衍生之養 〇贷初，而不官轉形之次數。亦 明瞭’由於有意或無意之突蠻， & 犬變所有子代之DNA内容物可 能不完全相同。且包括嫁K t, 枯左師選與原始經轉形細胞的功能或 生物學活性相同之多種子代。 根據本發明抗體之較佳特徵在於：恒錢為人類來源。 當前技術中已熟知該等恒定鏈，且其係闡述於例如 等人，Sequences of Proteins 〇f 洳则⑽⑽㈤ in㈣“， 第五版，Public Health Service, Nati〇nal Insthutes 〇f Health，Bethesda，MD (1991)中。 例如’適用之人類輕鏈恒定區包括如SEq ID n〇:9之λ_ 輕鏈恒定區胺基酸序列。例如，適用之人類重鏈恒定區包 括 SEQ ID ΝΟ..10至 13。 本發明之另一實施例為編碼根據本發明抗體重鏈及輕鏈 的核酸。 本發明包括一種治療需要治療之患者的方法，其特徵為 向該患者投與治療有效量之根據本發明抗體。本發明包括 一種以根據本發明抗體於療法中之用途。本發明包括一種 以根據本發明抗體於製備用於治療腫瘤疾病之醫藥物上之 148283.doc 15 201102086 用途。本發明包括一種以根據本發明抗體於治療腫瘤疾病 上之用途。 根據本發明抗體還包括彼等具有「保守性序列改造」之 抗體（變異抗體），該等改變為不影響或改變根據本發明抗 體的上述特徵之核苷酸及胺基酸序列改造。可藉由諸如定 點誘變及由PCR介導之誘變之標準技術進行改造。保守性 胺基酸取代包括其中胺基酸殘基由具有類似侧鏈之胺基酸 殘基取代。於相關技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘 基家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸（例如離胺 酸、精胺酸、組胺酸）；具有酸性側鏈之胺基酸（例如天冬 胺酸、麵胺酸）；具有不帶電荷之極性側鏈之胺基酸（例如 甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺 酸、半胱胺酸、色胺酸）；具有非極性側鏈之胺基酸（例如 丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺 酸、曱硫胺酸）；具有β-分支側鏈之胺基酸（例如蘇胺酸、 纈胺酸、異亮胺酸）；及具有芳香族側鏈之胺基酸（例如酪 胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。因此，人類抗-CCN1 抗體中認為非必要之胺基酸殘基較佳可由同一側鏈家族中 之另一胺基酸殘基取代。因此，文中之「變異」抗-CCN1 抗體係指與「母本」抗-CCN1抗體胺基酸序列有至多10 處’較佳約2至約5處不同之分子，其在母本抗體之一或多 個可變區上進行加入、刪除及/或取代。可如Riechmann， L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 及 Queen, C.等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033所述， 148283.doc .16- 201102086 藉由基於分子建模之誘變進行胺基酸取代。 本文中序列之一致性或同源性之定義為：候選序列經過 比對序列及引入間隙（若需要，以獲得最大之序列—致性 百分比）之後’與母本序列一致之胺基酸殘基的百分比。 抗體序列中之任何N末端、C末端、或内部之擴増、刪 除、或插入均不應視為會影響序列一致性或同源性。變異 體保留與人類CCN1之可變結構域結合之能力，且較佳具 有優於母本抗體之性能。例如，變異體在治療期間可能具 有減少的副作用。 「母本」抗體實例包括Mab420抗體之CDR區，且較佳用 於製備變異體。母本抗體較佳具有人類框架區，且如果可 能’則具有人類抗體恒定結構域。例如，母本抗體可為人 源化抗體或人類抗體。 較佳藉由重組方法產生根據本發明抗體。該等技術係相 關技術熟知者，且包括於原核及真核細胞中表現蛋白質， 隨後再分離出抗體多肽’且通常純化至醫藥上可接受之純 度。表現蛋白質時，藉由標準方法，將編碼輕鏈及重鏈或 其片段之核酸插入表現載體。於諸如CHO細胞、NS0細 胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母菌、或大 腸桿菌（E. coli)細胞之適宜原核或真核宿主細胞中表現， 且自該等細胞收集抗體（獲自上清液或細胞裂解之後）。相 關技術中已熟知重組產生抗體之方法，且其闡述於例如以 下文獻中· Makrides，S.C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse，S.等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 148283.doc -17- 201102086 271-282 ； Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ; Werner, R.G·，Drug Res· 48 (1998) 870-880 中。抗體 可存在於全細胞中、於溶胞產物中、或呈部份純化、或實 質上純化之形式。藉由標準技術進行純化，以排除其他細 胞組分或其他雜質（例如其他細胞核酸或蛋白質），該等標 準技術包括管柱層析術及相關技術中熟知之其他技術（參 見 Ausubel，F.等人編輯之 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New

York (1987))。於NS0細胞中之表現係闡述於例如Barnes， L.M·等人，Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ; Barnes， L.M.等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。過渡表 現係闡述於例如 Durocher，Y.等人，Nucl. Acids. Res· 30 (2002) E9中。選殖可變結構域係闡述於〇rlandi，R等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ； Carter, P. 專人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ; Norderhaug，L·等人，J· Immun〇i Methods 204 (1997) 77- 87中。較佳之過渡表現系統（HEK 293)係闡述於Schlaeger, E.-J·及 Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83 ; 及 Schlaeger，E._J·，J. Immunol. Methods 194 (1996) 191- 199中。適宜藉由諸如例如蛋白質A_瓊脂糖凝膠術、羥基 磷灰石層析術、凝膠電泳術、透析術、或親和層析術之習 知免疫球蛋白純化製程，自培養基中分離出單株抗體。利 用習知之製釭很谷易分離出編碼單株抗體的DNA& RNA， 並進行定序。融合瘤細胞可作為該DNA及RNA之來源。一 148283.doc -18. 201102086 旦分離時，可將DNA插至表現載體中，隨後使該表現載體 轉染至宿主細胞中（諸如HEK 293細胞、CHO細胞、或原本 不產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞），以在宿主細胞中合成 重組單株抗體。可獲自該等細胞株之抗體為本發明之較佳 實施例。 人類CCN1抗體之胺基酸序列變異體的製備方法為：在 編碼抗體之DNA中引入適宜核苷酸變化，或藉由肽合成 法。然而’該等改造法只可於例如如上所述之極有限的範 圍中進行。例如，該等改造法不會改變上述之抗體性質 (諸如IgG同型及抗原決定基結合性），反而會改良重組體 生產之產率、蛋白質安定性、或有利於純化。與維持抗_ CCN1抗體適當構形無關之任一半胱胺酸殘基亦可經取代 (通常係經絲胺酸取代）’以改善分子之氧化安定性，並防 止異常交聯。反之，可在抗體中加入一或多個半胱胺酸 鍵’以改善其安定性（尤其係當抗體為諸如F v抗體之抗體 片段時）。抗體之另一種胺基酸變異體會改變抗體之原始 醣基化模式’「改變」意指去除抗體中所存在之一或多個 碳水化合物部分及/或加入原本不存在於抗體中之一咬多 個醣基化位點。抗體之醣基化通常係與N鍵連，與N鍵連 係指碳水化合物部份係與天冬醯胺殘基之側鏈相連。三狀 序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X—蘇胺酸（其中χ為除 脯胺酸之外之任一胺基酸）為碳水化合物部份與天冬酿胺 側鏈經酶催化而連接之識別序列。因此，於多肽中存在任 一個該等三肽序列即產生一個潛在之醣基化位點。藉由改 148283.doc 201102086 變胺基酸序列而使得抗體中含有一或多個上述三肽序列 (用於與N相連之醣基化位點），以在抗體中加入醣基化位 點。 藉由相關技術中已知之多種方法製得可編碼抗_CCN1抗 體之.胺基酸序列變異體的核酸分子。該等方法包括但不限 於：自天然來源中分離（若為天然存在之胺基酸序列變異 體）或藉由寡核苷酸所介導（或由位點介導）之誘變、pcR誘 及對長1刖製传之人源化抗-CCN1抗體變異體或非變異 體進行卡匣誘變法製得。 另一種類型之抗體之共價改造法包括依於美國專利第 4,640,835 ； 4,496,689 ； 4,301,144 ； 4,670,417 ； 4,791,192 ； 4’179,337號中所述之方法’將抗體與多種非蛋白質聚合物 (例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚環氧烷）之其中一種2接 起來。 根據本發明之重鏈及輕键可變結構域係與啟動子序列 轉錄起始序列、恒定區序列、3,未經轉譯區序列、聚腺 酸化序列、及轉錄終止序列組合’形成表現載體構築體 重鏈及輕鏈表現構築體可組合進人單__載體巾、共㈣ 依序轉染、或分別轉染宿主細胞，其隨後融合，形成可: 現兩條鏈之單一宿主細胞。 於另一態樣中，本發明提供— ，、種組合物，例如醫藥組^ 物，其3有本發明單株抗體、或其㈣結合部份中之 :其組合’並醫藥上可接受載劑-起調配。如文中所用 「醫藥上可接受載體」包括# ^ t所用 戰體」匕括任—種及所有生理上相容之^ 148283.doc •20· 201102086 劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等渗及延遲 吸收/再吸收之製劑、及類似物質。載劑較佳適於注射或 輸液。可藉由相關技術t已知之多種方法投與本發明έ且人 物。如熟習此項技術者咸瞭解，投與途徑及/或方式# 隨所需結果而不同。醫藥上可接受載劑包括用於製備無菌b 可主射冷液或分散液之無菌水溶液或分散液及無菌粉末。 該等介質及製劑於㈣活性物f中之用途係相關技術中已 =。除了水之外，該載劑還可為例如等渗緩衝生理食鹽水 溶液。不論選擇何種投藥途徑，均可藉由熟習此項技術者 已知之習知方法，將本發明化合物(可呈適宜水合物形式 使用)及/或本發明醫藥組合物調配成醫藥上可接受之劑 型本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量可能變化， 錢活性成份之含量可有效達到特定患者、組合物、及投 藥方式所需之治療反應’且對患者無毒性(有效量)。所選 擇之劑量將取決於多種藥物動力學因t，包括所使用特定 本發月組合物之活性、投藥途徑、投藥時間、所使用特定 化合物之排泄速率、與所使用之特定組合物合併使用之直 他藥物、化合物及/或材料、計畫治療之患者之年齡、性 別、體重、病症、一般健康狀態及先前病史、及醫學技術 中已熟知之其他因素。 本發月包括一種以根據本發明抗體於治療腫瘤患者上之 用途® 本發月另外提供—種製備醫藥組合物之方法該醫藥組 口物包括有效量之根據本發明抗體及醫藥上可接受載體、 148283.doc -21· 201102086 並提供一種以根據本發明抗體於該方法上之用途。本發明 另外提供一種以有效量之根據本發明抗體於製備用於治療 罹患諸如以下癌症之患者的藥劑（較佳與醫藥上可接受載 劑一起）上之用途：乳癌、原發性神經膠質瘤、膀胱乳頭 狀瘤、結腸腺癌、黑色素瘤、神經管胚細胞瘤、小兒腫 瘤、纖維肉瘤、卵巢癌、騰癌或前列腺癌。 本發明亦提供一種以有效量之根據本發明抗體於製備用 於治療腫瘤患者之藥劑（較佳與醫藥上可接受載劑一起）上 之用途。 提供以下實例及序列表，以助於理解本發明，其真實範 圍示於附屬請求項中。應瞭解，在不偏離本發明精神之範 圍下，可修改所示製程。 序列表說明 SEQ ID ΝΟ:1 重鏈 CDR3 Mab420 SEQ ID NO:2 重鏈 CDR2 Mab420 SEQ ID NO:3 重鏈 CDR1 Mab420 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:ll 輕鏈 CDR3 Mab420 輕鏈 CDR2 Mab420 輕鏈 CDR1 Mab420 可變重鏈Mab420 可變輕鏈Mab420 人類λ型輕鏈 人類γΐ型（異型Glml,17)恒定區 人類γΐ(異型Glml7)恒定區 148283.doc -22- 201102086 SEQ ID NO:12 人類 IgG4 SEQ ID NO:13 人類 IgG4 SPLE-突變體 實例1 免疫接種 a) 以人類CCN1突變體對小鼠免疫接種 對Balb/c及NMRI小鼠免疫接種法係於第0天，使用完全 Freund佐劑；於第28天及第56天，均使用不完全Freund佐 劑經腹膜内注射50 pg含有單一胺基酸交換E173D或F185L 之人類CCN1重組體；且於第84天，使用不完全Freund佐 劑經腹膜内注射50 pg重組蛋白質。於第91天及第108天採 集血液，並製得血清，用於藉由ELIS A測定效價（參見下 文）。選出出現最高效價之動物，並於第112天，經靜脈内 追加注射50 pg人類CCN1重組體。 b) 以人類CCN1突變體對NZW兔免疫接種 對紐西蘭白兔免疫接種法係於第0天，使用完全Freund 佐劑接種100 pg含有單一胺基酸交換E173D或F185L的人 類CCN1重組體；於第21天、第43天、第65天及第85天， 使用不完全Freund佐劑接種100 蛋白質。所有免疫接種 均經皮下於若干位點進行。於第77及98天製備血清，並測 定效價。藉由經靜脈内注射100 pg重組蛋白質，完成最後 追加。 產生融合瘤並篩選 融合瘤之產生方法為：依據標準製程，使小鼠或兔脾細 胞與小鼠P3X63-Ag8653骨髓瘤細胞或240E-W2兔漿細胞瘤 148283.doc -23- 201102086 細胞融合。藉由ELIS A(參見下文）篩選出可與含有單一胺 基酸交換E173D或F185L之人類CCN1重組體、及與小鼠 CCN1重組體結合之融合瘤。進一步於結構域結合分析法 及肽ELISA中，採用來自可變結構域之兩段肽判別CCN1-結合型抗體之特徵（表1)。 表1 : 抗體 OD 450-620 nm 第3段肽 OD 450 -620 nm 第4段肽 CCN1 F24.006D12 2.0299 2.4151 CCN1 F23.004C10 3.3903 3.4760 CCN1 F23.004D2 3.3573 3.4232 CCN1 F23.004E2 3.3037 3.6838 CCN1 F23.004E41) 0.0259 3.5939 ":由於不與第3段肽結合，故並非為本發明之抗體 噬菌體展現術： 篩選攜帶單一胺基酸交換F185L之人類CCN1蛋白質突變 重組體，進行噬菌體展現術。分離出大量人類CCN1特異 性Fab純系，鑑定出其中一些亦可與重組表現於哺乳動物 細胞之細胞表面上之膜結合型CCN1結合。其中一些可明 顯抑制EA-Hy 926細胞黏附至人類CCN1。將13種不同Fab 抗體轉變成全長IgGl抗體，並於異種移植小鼠腫瘤模型中 進行活體内測試。 進一步例如：於結構域結合分析及肽ELISA中，採用來 自可變結構域之四段肽判別CCN1-結合型抗體（Mab395、 Mab396、Mab420、Mab434、及 Mab971)之特徵（參見以下 實例）。 實例2 148283.doc • 24- 201102086 重組表現膜結合型CCN 1及CCN1結構域 以編碼C末端已與PDGF-受體之跨膜結構域（人類β_ 生自jk小板之生長因子受體，UniProt登錄號ρ〇96ΐ9， 弟 513至561位胺基酸）融合之(：0川或各(：〇^1結構域的重纪 載體轉染貼壁生長之小鼠NIH 3Τ3細胞（CRL-1658TM)或經辩 • 浮馴化之人類HEK293(CRL-1573TM)細胞。 採用經懸浮馴化之HEK293細胞進行細胞結合分析， 藉由FACS測定。採用貼壁生長之NIH 3T3細胞進行細胞# 合分析，且於螢光顯微鏡中分析。 實例3

藉由ELISA判定抗體與人類CCN1及片段之結合 人類及小鼠CCN1 ELISA 藉由ELISA判定抗體與人類及小鼠CCN1之結合。 使2.5 pg/ml之含人類CCN1重組體（含有單一胺基酸交換 E173D或F185L)或小鼠CCN1重組體之PBS溶液，依25 孔，於2-8°C下培養過夜，固定於384-孔Nunc 八 析板上。於室溫下，利用PBS/l% BSA阻斷該分析板i h， 隨後洗蘇兩次（含〇. 1% Tween-20之PBS溶液），並於室溫 下，與含於阻斷緩衝液或融合瘤上清液中之不同濃度之 抗-CCN1抗體一起培養1 h。隨後經四次洗滌之後，於室溫 下，採用於阻斷緩衝液中稀釋1 : 5000之抗-小鼠-HRP (Amersham #NA9310)、抗兔-HRP (Jackson Immunoresearch #71卜036-152)或抗-人類 IgG-HRP(Jackson Immunoresearch #109-036-097)來偵測抗體1 h。再經四次洗滌之後，藉由 I48283.doc •25· 201102086 添加25 μΐ TMB(Calbiochem #CL07)使信號發展10分鐘。經 添加25 μΐ 1 N HC1之後，於450 nm下讀出吸光度。

可變結構域肽ELISA 於室溫下，取5 ng/ml之含經生物素化之可變結構域第1 至4段肽及成熟人類CCNl之0.5MNa2CO3(pH9.5)溶液塗 布至經預先塗布抗生物鏈菌素之微滴定分析板（Nunc)上1 h。於室溫下，利用PBS/1% BSA阻斷該分析板1 h後，洗 務兩次（含0.1% Tween-20之PBS溶液），並與含於阻斷緩衝 液或融合瘤上清液中之不同濃度之抗-CCN1抗體一起培養 1 h。隨後洗滌四次，於室溫下，利用於阻斷緩衝液中稀 釋 1 : 5000 之抗-小鼠-HRP(Amersham #NA9310)、抗-兔-HRP(Jackson Immunoresearch #711-036-152)或抗-人類 IgG- HRP(Jackson Immunoresearch #109-036-097)偵測抗體 1 h。 經六次洗務之後，藉由添加25 μΐ TMB(Calbiochem #CL07)， 使信號發展10分鐘。添加25 μΐ 1 N HC1，隨後於45 0 nm下 讀出吸光度。結果示於表2中： 表2 : 肽 EC5〇Mab 420 ECs〇Mab395 第1段肽：第163-192位胺基酸 不結合 不結合 第2段肽：第183-212位胺基酸 不結合 不結合 第3段肽：第200-229位胺基酸 4.969 ng/ml 不結合 第4段肽：第210-239位胺基 酸，且Cys(229)突變成Ser 4.462 ng/ml 不結合 實例3 親和力測定（BIAcore) 148283.doc •26- 201102086 利用胺偶聯化學作用，使捕捉抗體（抗-人類-igG)固定於 CM5生物感測器晶片之表面。利用流速為5 之含〇 1 Μ N-羥基琥珀醯亞胺及〇4 M乙基_3_(3二甲基胺基丙 基）碳化二亞胺之ι··ι混合物，活化流槽。將抗·人類_igG稀 釋於乙酸鈉PH 5.0中，並注入，以達到特定數量之固定抗 體（此處為1000 RU)，導致表面密度為約1〇〇〇 Ru。留置流 槽1作為空白對照（FC1=對照流槽）。藉由注M乙醇胺/ HClpH8.5阻斷表面。 取抗-CCN1抗體（第！分析物）及人類CCN1(第2分析物）於 PBST追8 M NaC1中稀釋，並分別依流速1〇及3〇 μ丨/min注 入。與濃度為100 nM之抗-(^川抗體的接觸時間（締合期） 為6 min，且與8種自ο nM遞增至5〇〇 nM之濃度之人類 CCN1的接觸時間為5 min。隨後以pbst+〇8 μ NaC丨洗務 晶片表面10 min(解離期）。於準確25〇c (標準溫度）下進行 所有父互作用。每個結合循環之後，注入作為再生溶液之 40 μΐ之0.85% HJO4，以移除任何未共價連接之蛋白質。 依每秒鐘一個信號之偵測速率偵測信號。扣除對照流槽及 空白緩衝注入液之信號（「雙對照」），並利用軟體bia . evaluation第 4.1 版本、Scrubbei^2b版本+BiaFh 16評估數 據。採用1:1朗繆爾結合模型（Langmuir binding m〇del)計算結合 速率常數。所有結合曲線均擬合至該結合模型，其對應於 結合模型A+B=AB。計算重要之速率常數：ka(締合速率常 數）、kd(解離速率常數）&KD(解離平衡常數）^結果示於表 3中。 148283.doc -27- 201102086 表3 : 分析物 ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M] Mab971 8.76xl04 1.51xl0-3 1.73xl0'8 Mab395 4.78xl05 1.64xl0'3 3.43xl0-9 Mab434 7.70xl05 1.44xl0·3 1.87X10'9 Mab396 3.69xl05 1.52X10'1 4.13xl0·7 Mab420 4.76xl05 1.44X10'2 3.02X10'8 實例4 細胞結合分析（FACS及螢光顯微鏡） 以表現質體過渡轉染NIH 3T3或經懸浮馴化之HEK293細 胞，以表現與跨膜結構域偶聯之CCN1或其結構域。經48 小時之後，移除上清液，添加1 0 pg/ml含於染色緩衝液 (PBS、3% FCS、0.01%疊氮化鈉）中之測試抗體至ΙΟχΙΟ6個 經轉染之細胞中。置於冰上2小時之後，以不含抗體之染 色緩衝液洗條細胞3次。添加1 0 pg/ml含於染色緩衝液中之 第二（偵測）抗體（經FITC標記之抗-人類IgGl單株抗體），並 於冰上培養30 min。以不含抗體之染色緩衝液洗滌細胞3 次，保留於染色緩衝液中，並於螢光顯微鏡（NIH 3T3)下 觀察，或藉由FACS(HEK293 ;激發光48 8 nm，發射光520 nm)分析。 抗體與曝露之融合蛋白質的強力結合導致細胞外膜上出 現極明亮之綠色螢光（+++).。未經轉染之細胞為完全黑 色，且不顯示背景染色。中度陽性之細胞在細胞膜上顯示 明亮螢光（++及+)。不與曝露之融合蛋白質結合之抗體則 完全不出現螢光（-)。結果示於表4a及4b中。 148283.doc •28- 201102086 表4a :(於螢光顯微鏡下分析細胞結合分析法）：

Mab 人類 CCN1 小鼠 CCN1 食蟹猴 (Cyno)- CCN1 hlGF- BP- 結構域 hVAR- 結構域 hlGF- BP-vWF 結構域 hlGF- BP-vWF- VAR 結構域 hlGF-BP- vWF- VAR-TSP 結構域 420 +++ + +++ + • Ή-f +++ 395 •H-+ +-H- -KH- -H-+ +++ -HH- Ή*+ 396 +++ -H-+ -H-l· -HH- - +-H- +++ -H-+ 434 -H-+ -H-+ -H-f • +++ +-H- -H-+ 表 4b : (FACS) 細胞 測試抗體 偵測抗體 平均值 293+人類 CCNl 不結合 不結合 2.6 293+人類 CCN1 不結合 結合 3.7 293+人類 CCNl Mab420 結合 49.8 293+人類CCN1之可 變結構域 不結合 不結合 2.7 293+人類CCN1之可 變結構域 不結合 結合 3.8 293+人類CCN1之可 變結構域 Mab420 結合 31.3 293+pmaxGFP 未檢測 未檢測 GFP ： 85.7% 293+人類CCN1 :經膜結合型全長CCN1融合物過渡轉染之HEK293細 胞0 293+人類CCN1之可變結構域：經膜結合型CCN1可變結構域過渡轉染之 HEK293細胞。 293+pmaxGFP :經驅動表現綠色螢光蛋白之表現載體過渡轉染之 HEK293細胞。 實例5 抗原決定基結合分析（Biacore) 為判定抗原決定基區域，利用胺偶聯化學作用’使不同 抗-CCN1抗體固定於CM5生物感測器晶片表面。利用流速 148283.doc •29· 201102086 為5 μΐ/min之含〇·ι Μ N-羥基琥珀醯亞胺及0.4 Μ 1-乙基-3-(3-二曱基胺基丙基）碳化二亞胺之1:1混合物活化流槽。注 入10 pg/ml之含抗-CCN1抗體之乙酸鈉（pH 5.0)溶液，12分 鐘’導致表面密度為約15000 RU。藉由注入1 Μ乙醇胺/ HC1 pH 8·5阻斷表面。取可溶性人類CCN1(第1分析物）及 抗-CCN1抗體（第2分析物）於PBST+0.8 M NaCl中稀釋，並 依流速30 μΐ/min注入。與濃度為250 nM之人類CCN1的接 觸時間（締合期）為150秒，且與濃度為100 nM之抗-CCN1抗 體的接觸時間為300秒。隨後，以PBST+0.8 M NaCl洗滌晶 片表面3 min(解離期）。於準確25°C (標準溫度）下進行所有 相互反應。於每個結合循環之後，注入再生溶液（1〇 mM 甘胺酸，pH 2.0) 150秒，以移除任何未共價結合之蛋白 質。依每秒鐘一個信號之偵測速率偵測信號。為判定不同 之抗原決定基區域，注入人類CCN1，並使其與固定之抗 體結合。結合之後不久，注入具有未知抗原決定基之抗 體。未顯示結合信號（抑制）之抗體屬於相同抗原決定基 組。有結合信號表示具有不同抗原決定基區域。藉由SPR 技術發現三種不同抗原決定基區域（參見表5)。 表5 : 抗原決定基A區 抗原決定基B區 抗原決定基C區 Mab395 Mab420 MAB40551) Mab396 Mab434 ” ：R&D Systems之抗-CCN1 抗體MAB4055 (http://www.mdsystems.com) 實例6

Mab420與食蟹猴（Cynomolgus monkey)CCNl之交叉反應性 148283.doc -30· 201102086 利用經重組表現之膜結合型食蟹猴CCNl，並利用 Mab420染色，於FACS中證實Mab420與食蟹猴CCN1之交 叉反應。結果示於表6中。 表6 : 細胞 測試抗體 偵測抗體 平均值 293+食蟹猴CCN1 不結合 不結合 2.96 293+食蟹猴CCN1 MOR420 結合 95.22 實例7 由CCN1介導之黏附分析 進行黏附分析，以研究針對CCN1之抗體或Fab片段是否 可阻斷重組體CCN1之特定活性。 於37°C下，依50 μΐ/個孔，以濃度為0、0.625、1.25、 2.5、5、10μg/ml之含於PBS(GIBCO目錄號20012)中之重 組體CCN1蛋白質塗布96-孔平底分析板（NUNC目錄號 439454)過夜。依200 μΐ/個孔之洗滌緩衝液（PBS/0.1% BSA)洗滌分析板三次。收集EA-Hy-926細胞，並以黏附介 質（(F12 營養液 HAM，Gibco 目錄號 217650297)/0.05% BSA) 洗滌，並依濃度為每ml含2χ105個細胞再懸浮於相同介質 中。向孔中添加100 μΐ細胞懸浮液，使最終濃度為每個孔 20000個細胞，進行三重複。於37°C下，與5% C02—起培 養分析板2-3小時，並以200 μΐ/個孔之PBS洗滌兩次，並抽 乾。添加100 μΐ含2 μΜ4弓黃綠素-AM(Molecular Probe目錄 號 C-3100，MW=994.87，儲備溶液。含 1 mM之 DMS0溶 液，50 pg/50 μΐ)之黏附介質溶液，並於37°C及5% C02下 148283.doc 31 · 201102086 培養0.5至1小時。於485/535 nm下進行分析。 以重組體CCN1塗布分析板，並以洗滌緩衝液洗滌分析 板，隨後添加抗體。依濃度0.5至10 pg/ml添加抗體，並於 3 7 °C下，於分析板中培養1小時。隨後以洗滌緩衝液洗滌 分析板兩次。如上所述添加EA-Hy-926細胞。若抗體抑制 EA-Hy-926細胞黏附至CCN1，貝1導致鈣黃綠素染色度降 低。 結果： 鈣黃綠素染色度係與黏附至CCN1之細胞數量相關。幾 種抗體與塗布於細胞培養分析板上之CCN1的結合導致黏 附至CCN1的細胞數量減少。最強力之抗體示於表7中。抗 體可使黏附至CCN1的EA-Hy-926細胞數減少54%至83%。 表7 : 抗體 抑制黏附分析 395 81% 396 79% 420 54% 434 83% 實例8 抗-CCN1抗體抵抗MDA-MB-231(ATCC HTB-26)人類乳癌 異種移植生長之抗腫瘤效力 研究設計：於研究第0天，使用基質膠（1:1)，對SCID米 色小鼠之乳腺脂肪層區域植入MDA-MB-231細胞（lxlO7個 細胞/小鼠）。於植入後第22天開始治療，且於第5 1天終止 研究。表8顯示TGI(與載劑處理組動物比較抑制之腫瘤生 長）0 148283.doc -32- 201102086 組別 •載劑經腹腔内，2x/週，n=10 • 20 mg/kg Mab420，經腹腔内，2x/週，n=10 • 20 mg/kg Mab971，經腹腔内，2x/週，n=10 • 20 mg/kg Mab 396，經腹腔内，2x/週，n = 10 ' · 20 mg/kg Mab395 > 經腹腔内，2x/週，n=l 0 • 20 mg/kg Mab434，經腹腔内，2x/週，n=10 表8(結果）： 抗體 所結合之結構域 TGI (%) Mab395 IGFBP 73 Mab 396 IGFBP 54 Mab 434 IGFBP 56 Mab 420 VAR 74 Mab 971 VWF 0 實例9 抗-CCN1抗體抵抗SKOV-3(ATCC HTB-77)卵巢癌異種移 植生長之抗腫瘤效力 研究設計：於研究第0天，使用基質膠（1:1)，對SCID-米 色小鼠經皮下植入SKOV3細胞（lxlO7個細胞/小鼠）。於植 入後第17天開始治療，且於第44天終止研究。 研究組 •載劑，經腹腔内，2x/週，n=10 • 20 mg/kg Mab420，經腹腔内，2x/週，n=l 0 • 20 mg/kg Mab395，經腹腔内，2x/週，n=10 148283.doc -33· 201102086 表9(結果）： 抗體 所結合之結構域 TGI (%) Mab395 IGFBP 32 Mab420 VAR 62 實例10 SCID米色小鼠於Panc-Ι胰腺癌模型中之抗-CCN1抗體研究 研究設計：於研究第0天，使用基質膠（1:1)，對SCID米 色小鼠經皮下植入Panc-Ι細胞（ATCC CRL-1469，5xl06個 細胞/小鼠）。於植入之後第14天開始治療，且於第46天終 止研究。 研究組 •載劑，經腹腔内，2x/週，n=10 • 20 mg/kg Mab395，經腹腔内，2x/週，n=10 • 20 mg/kg Mab396，經腹腔内，2x/週，n:=10 • 20 mg/kg Mab420，經腹腔内，2x/週，n=10 20 mg/kg Mab434，經腹腔内，2x/週，n=10 表10(結果）： 抗體 所結合之結構域 TGI (%) Mab395 IGFBP 5 Mab396 IGFBP 13 Mab434 IGFBP 8 Mab420 VAR 68 實例11 抗-CCN1抗體抵抗CCN1-陰性細胞株MDA-MB-435(ATCC HTB-129)乳癌異種移植生長之抗腫瘤效力 研究設計： 148283.doc -34- 201102086 於研究第0天，使用基質膠（1:1)，對SCID灰棕色小鼠經 皮下植入MDA-MB-435細胞（lxlO7個細胞/小鼠）。於植入 之後第15天開始治療，且於第44天終止研究。 研究組 •載劑，經腹腔内，2x/週，n=10 • 20 mg/kg Mab420，經腹腔内，2x/週，n=10 表11(結果）： 抗體 所結合之結構域 TGI (%) Mab420 VAR 10 實例12 抗CCN1抗體於Panel動物模型中之活體内成像分析 於Pane 1小鼠模型中，於研究開始時，對動物經皮下注 射1 ΧΙΟ7個Panel細胞。經靜脈内注射標記Cy5之抗體（對 SCID小鼠靜脈注射（2 mg/kg))之後24小時，利用Maestro™ 活體内成像系統（LOT-Oriel GmbH & Co. KG，Germany)測 定近紅外線螢光（NIRF)。Mab 420產生最顯著之螢光信 號。 148283.doc -35- 201102086 序列表 <110>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120>抗人類CCN1抗體及其用途

<130〉 26155 FT <140〉 099117631 ' <141> 2010-06-01 <150〉 EP09007389 <151> 2009-06-04 <150〉 EP09164765.1 <151> 2009-07-07 <150> EP09165886.4 <151> 2009-07-20 <160> 13 <170> Patentln version 3.5 <210〉 1 <211〉 8 <212> PRT <213〉人類 <400〉 1

Gly Arg Phe Tyr Asn Phe Asp Tyr 1 <210〉 2 <211> 17 <212〉 PRT <213> 人類 <400〉 2

Leu He Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213〉人類 <400> 3

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 1 5 148283-序列表.doc 201102086 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213>人類 <400〉 4

Gin Ser Tyr Gly Tyr Ser Ser lie Val 1 5 <210〉 5 <211> 7 <212> PRT <213>人類 <400> 5

Glu Asp Ser Asn Arg Pro Ser <210〉 6 <211〉 11 <212> PRT <213>人類 <400> 6

Ser Gly Asp Ser Leu Gly Lys Lys Tyr Ala His 1 5 10 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213>人類 <400〉 7

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Val Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Leu lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 148283-序列表.doc 201102086

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Arg Phe Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 8 <211> 108 <212> PRT <213>人類 <220> <221> Xaa <222〉 (108)..(108) 。 <223>可爲Gin或不存在 <400〉 8

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Gly Lys Lys Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Glu Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Gly Tyr Ser Ser lie Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Xaa 100 105 148283-序列表.doc 201102086 <210> 9 <211> 105 <212> PRT <213>人類 <400> 9

Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 15 10 15

Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe 20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 65 70 75 . 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210〉 10 <211〉 330 <212> PRT <2I3>人類 <400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 148283-序列表.doc 201102086

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 148283-序列表.doc 201102086

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210〉 11 <211> 330 <212> PRT <213>人類 <400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 -6 - 148283-序列表.doc 201102086

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210〉 12 <211〉 327 <212> PRT <213>人類 <400〉 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15 148283-序列表.doc 201102086

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala-Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 148283-序列表.doc 201102086

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210〉 13 <211> 327 <212〉 PRT <213>人類 <400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 148283·序列表.doc 201102086

Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 -10- 148283-序列表.doc

Claims (1)

1. 201102086 七、申請專利範圍： 1. 一種於喷乳動物細胞中重組表現哺乳動物細胞膜結合型 人類CCN1或其CCN1結構域之方法，其特徵為：以編碼 c末端已與哺乳動物細胞跨膜結構域融合之ccN1或其 CCN1結構域（CCN1融合蛋白質）之核酸載體使哺乳動物 宿主細胞轉形’於該宿主細胞中表現該CCN1或CCN1結 構域融合蛋白質’並收集該膜結合型CCN1或該其CCN1 結構域。 2. 如請求項1之方法’其特徵為：該CCN1結構域為CCN1之 可變結構域》 3. 一種以哺乳動物細胞膜結合型人類CCN1或CCN1結構域 於產生針對人類CCN1之抗體上之用途。 4. 如請求項3之用途，其特徵為：該CCNU#構域為^^川之 可變結構域。 5 _如凊求項3或4之用途，其特徵為：以哺乳動物細胞膜結 合型CCN1或CCNi結構域免疫接種非人類動物，並收集 針對該CCN 1或針對該CCN 1結構域之抗體。 6. 一種針對人類CCN1之抗體，其特徵為：其可特異性結 合CCN1可變結構域中第21〇至228位置處胺基酸或結合 由CCN1之可變結構域組成之融合蛋白質，其c末端已與 PDGF-受體（人類β型血小板衍生之生長因子受體）之跨膜 結構域融合，該融合蛋白質係表現於人類細胞表面上。 7· 一種針對人類CCN1之抗體，其特徵為：其包括作為重 鍵 CDR 區之如 SEQ ID N〇:aCDR3區、如 seq 出 ν〇 2 148283.doc 201102086 之CDR2區、及如SEQ ID NO:3之CDR1區，且其特徵為 具有作為輕鏈可變結構域之如SEQ ID NO:4之CDR3區、 如 SEQ ID NO:5 之 CDR2區、及如 SEQ ID NO:6 之CDR1 區。 8. 如請求項7之抗體，其特徵為：該重鏈可變結構域包括 SEQ ID NO:7。 9. 如請求項7之抗體，其特徵為：該輕鏈可變結構域包括 SEQ ID NO:8。 10_ —種針對CCN1之抗體，其特徵為：與單株抗體420結合 相同之CCN1抗原決定基（SEQ ID NO:7及8)。 11. 一種如請求項6至10中任一項之針對人類CCN1之抗體於 製備用於治療疾病之醫藥物上之用途。 1 2.如請求項11之用途，其中該疾病為腫瘤疾病。 148283.doc 201102086 四、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 148283.doc