TW201109024A - Cyclohexenone compound of Antrodia cinnomomea that suppresses growth of tumor cell of bladder cancer - Google Patents

Description

201109024 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種化合物之新應用，尤其係關於一種 利用由牛樟芝（c/wzawomefl )萃取物中所分離純化 之化合物抑制膀胱癌腫瘤細胞生長之用途。 【先前技術】 根據流行病學的調查，膀胱癌(bladdercancer)為泌尿生殖系統 I .腫瘤中最常見的癌症，而且發生率有逐年增加的趨勢’常好發於 男性’男性的發生率通常是女性的二到五倍。膀胱癌之發生與許 多因素有關’而依據統計，與經常暴露於存在有化學致癌物如染 料中的本胺(aniline)或芳香胺amine)類化合物的環境下有 雄切關係’譬如油漆、皮革工人、卡車司機及錯管工人等較易 羅患膀胱癌，其他危險因子包括抽於、咖啡、茶、止痛藥、人工 甘味劑或慢性泌尿道發炎等也有可能導致膀胱癌的發生。 • 由於膀胱的位置是在下腹部的骨盆腔内，故膀胱癌初期多半 無法直接__ ’較難及早魏並耕給予治療，當患者出現 血尿、頻尿、解尿_、解尿频、尿急與尿液滯留、膀胱炎、 ^泌尿道感轉不適錄時，大多已非械癌症，常導致治療 =有限及預後狀況不佳。臨床上，膀胱癌之治療會健瘤的大小、 =程度及病患身體狀⑽獨，估後，進行 射線治療等，然而儘管隨著醫藥科技的 予〜、法或放射線療法在膀胱癌的治療成績都有明 201109024 顯的提升，但化療或放射線治療料發許多副作用或併發症，此 外，研究指出由於膀耽癌治療後常會有復發與轉移的情況，實隱 上其整體治療率(五年存活率)並沒有明顯的改善。因此可有效治療 膀胱癌且不易產生副作用之物質的研發係為迫切需要。 +牛樟芝咖咖漁鑛崎），在台灣民間又稱為掉益、 樟疏、、樟域、牛龍或紅樟，是本省獨有之藥職類，其係屬 於非褶菌目―一钟多孔菌科(户咖_—之 #多年生蕈菌類。由於樟芝在自然界中僅寄生於台灣特有的保育 類牛樟木樹幹之中空心材内壁組織上，加上人為的盜伐，使得 寄生於其中方能生長之野生牛樟芝數量更形稀少’且由於 在自然録下樟芝子實㈣生她#緩慢，所 少且價格昂貴。 牛樟之之子實體為多年生，無柄，呈木检質至木質， 其具強烈之樟樹香氣，且形態多變化，有板狀、鐘狀、馬 蹄狀或塔狀。初生時為扁平型並呈鮮紅色，之後其周邊會 捲狀，並向四周擴展生長’顏色亦轉變為淡紅 褐色或”褐色，並有許多細孔，且其 價值最豐富的部位。 卞悍之之樂用 由f台灣民俗料上，牛樟芝具有魏賴、化絲血、 溫^積、解毒_叹娜賴之触，趣社㈣解 凡食物中毒，_，料，農藥中毒均有解毒作用，此外對改盖 肝、胃機罐礙及血_環疾觸具捕助轉功效。牛掉^ 201109024 同一般食藥用之蕈菇類，具有許多複雜的成分，已知的生 理活性成分中’包括：三萜類化合物（tri terpen〇idS)、多 酶體（poly saccharides ’如 y5-D-葡聚醣）、腺苦（adenosine )、 維生素(如維生素B、菸鹼酸）、蛋白質（含免疫球蛋白）、 超氧歧化酵素（superoxide dismutase，SOD)、微量元素（如： 两、磷、鍺）、核酸、固醇類以及血壓穩定物質（如ant〇dia acid) 等，此些生理活性成分被認為具有抗腫瘤、增加免疫能力、 • 抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖及降膽固醇等多種功 效’且有助於護肝及肝臟相關疾病之治療。 肴關樟芝的成分研究，大多著重在大分子的多醣體 (polysaccharides)和小分子的三萜類（triterpenoids)和固醇類 (steroids)，其中，樟芝含有大分子之多醣體，以不同單糖組成存 在於其子實體及菌絲體中，但經光譜分析後皆含有具生理活性之 /5-D_葡聚酶(冷-D-glucans);三萜類化合物是由三十個碳元素 鲁 結合成六角形或五角形天然化合物之總稱，牛掉芝所具之 苦味即主要來自三萜類此成分，且其亦係被研究最多之成 份。從子實體得到的三萜類化合物有antrocin、4,7-二甲氧基-5· 甲基-1，3-苯並二氧環（（T-dimethoxy-S-methy-lJ-benzodioxole) 和 2,2’，5,5，-四 甲氧基-3,4,3’，4’-雙-亞曱 二氧基 -6,6’-二甲基聯苯（2,2'，5,5'-teramethoxy-3,4,3'，4'-bi_methyl enedioxy-6,6'- dimethylbiphenyl) (Chiangei<2/.，1995)，以麥角 甾燒（ergostane)為骨架之新三萜類化合物antcinA、antcinB、 201109024 antcin C antcin E、antcin F、methyl antcinate G 和 methyl antcinate Η (Chemg β iz/.，1995 ’ 1996)。子實體另含以麥角甾烷為骨架的化 合物包含Zhankuic acid A、B 及C zhankuic acid D 和 zhankuic acid E (Chen and Yang，1995 ; Yang 1996) ’ 以羊毛 g 烷（lanostane) 為骨架的新化合物15a -乙醯-去氫硫色多孔菌酸（i5 α -acetyl-dehydrosulphurenic acid )、去氫齒孔酸 (dehydroeburicoic acid )與去水硫色多孔菌酸 φ ( dehydrasulphurenic acid )。 雖然由目前諸多之實驗可得知牛樟芝萃取物具有前述 功效，且其所含成分亦陸續被分析出，但究竟萃取物中之 何種有效成分可促成牛樟芝之抑制癌症功效，並未發表具 體之相關有效成分，有待進一步實驗研究來釐清，故若能 找出該萃取物中所含真正有效抑制腫瘤生長之成分，將有 利於牛樟芝抑癌相關機轉的研究，並對牛樟芝應用於癌症 • 例如膀胱癌之治療與預防有莫大的助益。 【發明内容】 為明瞭牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌之彳 Ϊ化明由牛樟芝萃取物中分離純化出具下列結構式 201109024

其中，X係氧（Ο)或硫（S)，Y係氧或硫；Ri係氫 基（Η)、甲基（CH3)或(CH2)m-CH3，R2係氩基、曱基或 (CH2)m_CH3，R3 係氫基、甲基或(CH2)m-CH3，m = 1 〜12 ; n= 1 〜12。 如式（1)結構式之化合物中，較佳者為如下所示式 (2)之化合物：

φ 式(2)之化合物，其化學名為4-羥基_2,3-二甲氧基-6· 甲基_5 ( 3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2_環己烯酿 (4-hydr〇xy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7，ll-trimethyl-do( eCa-2,6，10-trienyl)-CyCl〇hex-2-en〇ne)，分子式為 C24H38〇4， 外觀為淡黃色粉末狀，分子量為390。 本發明中式⑴、式(2)之化合物係分離純化自牛樟芝水萃取彩 或有機溶劑萃取物’有機溶劑可包括醇類（例如甲醇、 ' 醇）、酯類（例如乙酸乙醋）、縫（例如己燒）或 甲炫、氯乙烧），但並不以此為限，其中較佳者為醇類，^杀 201109024 乙醇。 上二二發明係將其應用於抑制腫瘤細胞生長 崎該化合物的應用範圍包括對於二 腫卢之料而#由抑制該等腫瘤細胞之迅速生長，進而抑制 4 _叙雜。其巾，健德合物係式(2)之 :羥土 -2,3-二甲氧基·6_甲基_5 ( 3,7，u_三甲基·2,，料二 石反二埽）-2-環己稀_。 另一方面，本發明中亦可將式（1)或/與式(2)之化合物 ^用於抑制膀胱癌腫瘤細胞生長之醫藥組成物的成分中。 刖述醫藥組成物除包括有效劑量之式G)或/與式（2)之化合 物外’尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑（如 良）填充劑（如蔗糖或殿粉）、黏合劑（如纖維素衍生物）、 稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑’但並未僅限於此。 本發明醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製 k ’將式（1)或/與式(2)有效成分劑量與一種以上之載體相 混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒 劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。 以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述 所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明 之範圍’任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範 圍内’當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當 視後附之申請專利範圍所界定者為準。 201109024 【實施方式】 經萃取過後之牛樟芝水萃取物 進-步藉由高效液相層析加以分#機〜取物’可 (fraction) r分液進，，將可=== ^-步做膀胱癌腫瘤細胞之抑制效果測試 胞生長之效果。 物係具有抑制膀胱癌腫瘤細 瞻衫便說明本發明，町將以式(2)之4_膝2 3 ^基冬曱基扣仙-三曱基从⑻十二碳三婦）^ 烯嶋合物進行說明。此外，為證實4_經基_2,3_二甲氧 =Γ(3,7，η·三甲基-2,6，1M'二碳三烯）-2·環己“ 化合物對膜瘤細胞生長之抑制效果，本發明中係以贿分 析法，根據美國國家癌症研究所（Nati〇nal NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對膀胱癌腫瘤細胞進行細胞 •存活率之測試。由該些測試證實，4_羥基_2,3二甲氧基·6_ 甲基-5 (3,7，11-三甲基_2,6，1〇十二礙三稀）·2_環己烯酮對 於膀胱癌腫瘤細胞：TSGH_83〇1細胞系可降低其存活率，相 對之下並可同時降低生長半抑制率所需濃度（即IC50值）， 因此得藉由4·經基_2,3·二曱氧基_6_曱基-5 (3,7，u_三甲基 _2,6，1〇_十二碳三烯）_2_環己烯_，應用於膀胱癌腫瘤細胞 之生長抑制上，而進一步可利用於膀胱癌之治療。茲對前 述實施方式詳盡說明如下： 實施例1 : 201109024

石灰二师）·ζ-環己烯酮的分離 目絲體、子實體或二者之混合 加入適當比例的水與醇類 其中該醇類較佳為乙醇，於 ‘時以上，之後以濾紙及0.45

20〜25 C下擾摔萃取至少1小時以上， μπι濾膜過濾，收集濾液即得牛樟芝萃取液。 將則述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀 (High Performance Liquid chromatography)，以 RP18 的層析 管（column)進行分析，並以曱醇(a)及o.i%〜0.5%醋酸水溶 液(B)做為移動相（mobile phase)(其落液比例係：0〜10分 鐘，B比例為95%〜20%; 10〜20分鐘，B比例為20%〜10% ; 20〜35分鐘’ B比例為10%〜90%; 35〜40分鐘，B比例為 10%〜95%)，在每分鐘1 ml之速度下沖提，同時以紫外-可見光全波長偵測器分析。 將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色 粉末狀之固體產物，此即4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮。經分 析，其分子式為C24H3804，分子量390，熔點（m.p.)為 48°C〜52°C。核磁共振（NMR)分析值則如下所示： 1H-NMR(CDC13) (5 (ppm) ： 1.51 ' 1.67 > 1.71 ' 1.75 ' 1.94 ' 2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07 與 5.14。 13C-NMR(CDC13)6 (ppm): 12.3卜 16.1、16.12、17.67、25.67、 26.44、26.74、27.00、39.7卜 39.8卜 4.027、43.34、59.22、 201109024 60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、 138.05、160.45 與 197.12。 實施例2 : 體外抗膀胱癌腫瘤細胞之活性測試 為進一步測試實施例1中所發現化合物對腫瘤細胞之 抑制效果’本實施例將根據美國國家癌症研究所（National ❿ Cancer Institute，NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實施 例1中所分離之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三 曱基-2，6,10 -十*一破二稀）-2-¾己稀嗣化合物，加入含有人 類膀胱癌腫瘤細胞TSGH-8301的培養液中，進行腫瘤細胞 存活性之測試。其中，細胞存活性之測試可採習知之MTT 分析法進行分析，而膀胱癌腫瘤細胞TSGH-8301係為人類膀 胱癌細胞株(human bladder carcinoma cell line)。 MTT分析法是一種常見用於分析細胞增生（ceii proliferation)、存活率（percent of viable cells)以及細胞 毒性（cytotoxicity )的分析方法。其中，MTT ( 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide)為一 黃色染劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的破珀酸四嗤 還原酶（succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水性 且呈藍紫色的formazan，因此藉由formazan开少成與否，即 可判斷並計算細胞之存活率。 11 201109024 首先將人類膀胱癌細胞TSGH-8301於含有10%胎牛血 清(fetal bovine serum)之DMEM培養基進行培養，該培養基尚 包含100 IU/ml之盤尼希林(Penicillin) ’及1〇〇 mg/ml之鏈 黴素（Streptomycin) ’並於5 % C〇2，37 °C環境中培養24小時。 將增生後之細胞以PBS清洗一次’並以1倍之騰蛋白酶_edta處 理細胞，隨後於1,200 rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清 液。之後加入10 ml的新培養液’輕微搖晃使細胞再次懸浮，再將 細胞分置於96孔微量盤内。測試時’分別於每一孔内加入3〇、1〇、 3、卜0.3、0.1與0.03 pg/ml的牛樟芝萃取液作為對照組(未經純 化分離之總萃取物），以及於每一孔内加入30、1〇、3、1、〇3、 0.1與0.03 pg/ml的4-羥基-2,3-二甲氧基_6_曱基_5 (^，了^卜三甲基 -2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯謝乍為試驗組，於3rc、5% c〇2下 培養4M♦其後’於避光的環境下於每—孔内加人2 5 的MTT，反應4小時後再於每一孔内加入1〇〇 μ1的丨灿祕沉終 止反應。最後以酵素免疫分析儀在57〇nm吸光波長下測定其吸光 值’藉以計算細朗存活率，並轉丨其生長料卩 濃 (即IC5G值），其結果如表—所示。 ^ 由表-中可知’藉由4_羥基_2,3_二甲氧基_6_甲基 (3,7，11-三甲基_2,6，1〇_十二碳三婦）_2環己缔嗣的作用 其對於TSGH-83G1人類膀胱癌腫瘤細胞之1(^值為i.〔 12 201109024 pg/ml，相較於對照組牛樟芝萃取混合物所測得之1(：5()值（表 中未示)係低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中之4-羥基 -2,3-二曱氧基-6_甲基_5 ( 3,7，11·三曱基-2,6，10-十二碳三 烯）-2-環己烯_確實能夠利用於膀胱癌腫瘤細胞生長之抑 制。 综上所述，本發明分離自牛樟芝之4_羥基_2,3_二甲氧 基-6_曱基-5 (3,7，11-二甲基-2,6，10-十二碳三烯）環己烯 酮化合物，係可有效抑制膀胱癌腫瘤細胞之生 另一方 面’因牛樟芝環己_化合物係為天 $ 其 應用於抑制膀胱癌時，並不會⑽患 ==其他副作用’且其亦可與 二並 減少 :樂:使用劑量並降低該些弓 此外，亦可將其製備成治療膀 斤= 外，尚可包括藥之牛樟芝環己稀酮化合物 水）、填充劑又的载體。載體可為賦形劑（如 稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或如纖維素衍生物）、 本發明醫藥組成物可依—般此。 造，將有效成分劑量之牛樟广/之製備方法生產製 之載體相混合，製備出所需之二烯酮化合物與-種以上 粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製型可^錠劑、 達到治療膀胱癌腫瘤疾病之目的。^未以此為限。藉以 13

Claims (1)

1. 201109024 七、申請專利範圍： 1、一種將具有下列結構式之化合物利用於製備抑制膀胱癌 腫瘤細胞生長之藥物的應用：

   其中，X係氧（〇)或硫（S)，Υ係氧或硫；R〗係氫 • 基（Η)、曱基（CH3)或(CH2)m-CH3，R2係氫基、甲 基或(CH2)m-CH3，R3 係氫基、曱基或(CH2)m-CH3，m =1〜12 ; n= 1 〜12。 2、 如申請專利範圍第1項所述之應用，其中該化合物係 4-羥基_2,3_二甲氧基-6·甲基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十 一碳 三烯） -2- 環 己稀酮

   (4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,l 1- trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone )。 3、 如申請專利範圍第2項所述之應用，其中該化合物係由 牛樟芝萃取物所分離製得。 4、 如申請專利範圍第3項所述之應用，其中該化合物係由 牛樟芝之水萃取物所分離製得。 5、 如申請專利範圍第3項所述之應用，其中該化合物係由 牛樟芝之有機溶劑萃取物所分離製得。 6如申凊專利範圍第5項所述之應用，其中該有機溶劑係 選自酯類、醇類、烷類及鹵烷所組成的族群。 ’、 201109024 7、 如申請專利範圍第6項所述之應用，其中該醇類係乙醇。 8、 如申請專利範圍第丨項所述之應用，其中該膀胱癌腫瘤 細胞係TSGH-8301細胞系。 9、 一種用於抑制膀胱癌腫瘤細胞生長之醫藥組成物，包括 -有效劑量如中請專職㈣丨項所述之化合物以及 一藥學上可接受之載體。 10、 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中該化 合物係4-羥基-2,3·二曱氧基_6_甲基·5 (3,7，U-三甲X基 -2,6，10-十二碳三烯）_2_環己烯二 (4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,l 1- trimethyl-dodeca_2,6,1 〇-trienyl)_cyclohex，2-enone )。 11、 如申請專利範圍第10項所述之醫藥組成物，其中該化 合物係由牛樟芝萃取物所分離製得。 人 12、 如申請專利範圍第U項所述之醫藥組成物，其中該化 合物係由牛樟芝之水萃取物所分離製得。 13、如申請專利範圍第11 合物係由牛樟芝之有機溶解取物所分離製得。

   項所述之醫藥組成物，其中該化 ^〜请樂組成物，其中該有 燒類及#烷所組成的族群。 述之醫藥組成物，其中該醇 ’其中該膀 、如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物 胱癌腫瘤細胞係TSGH-8301細胞系。 15 201109024 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：