TW201026239A - Probiotic infant products - Google Patents

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201026239 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明槪括關於益生菌嬰兒配方及兒童營養產品。 簡言之，本發明在具體實例中指向一種嬰兒配方或兒 童營養產品，其包含蛋白質源、脂肪源、碳水化合物源及 龍根雙歧桿菌AH 1 205。 在另一具體實例中，本發明指向一種減少在嬰兒或兒 ® 童中發炎之方法，其包含以龍根雙歧桿菌AH 1205施予嬰 兒或兒童。 【先前技術】 與益生菌嬰兒配方及兒童營養產品有關的參考資料可 包括頒予Dennen等人之美國專利第7，179,460號及頒予 Luchansky等人之美國專利第 5,922,375號。 β【發明內容】 爲了更完全瞭解本發明，現參考連同所附圖式的下列 敘述。 進行本發明的最佳模式 現將詳細參考陳述於下的一或多個實例的本發明具體 實例。每個實例係以解釋本發明的方式提供，而非限制本 發明。事實上，那些熟習所屬技藝者明白可在本發明達成 各種修改及變異而不違背本發明的範疇或精神。例如，以 201026239 一個具體實例的一部分所例證或敘述之特性可用於另一具 體實例上，得到又另一具體實例。 因此，意欲以本發明涵蓋此等修改及變異如同落於所 附之申請專利範圍及其同等物之範疇內。本發明的其他目 的、特性及觀點被揭示於或顯而易見於下列的詳細說明中 。一般熟習所屬技藝者應瞭解本發明的討論僅爲示例性具 體實例的說明而已，而無意限制本發明更寬闊的觀點。 如上所述，本發明槪括關於益生菌嬰兒配方及兒童營 @ 養產品。與益生菌嬰兒配方及兒童營養產品有關的參考資 料可包括頒予Dennen等人之美國專利第7,179,460號及頒予 Luchansky等人之美國專利第5,922,375號。 以本發明欲解決的技術問題係提供含有新穎益生菌之 嬰兒配方及兒童營養產品。因此，在具體實例中，本發明 指向含有龍根雙歧桿菌株AH 1 2 05之嬰兒配方或兒童營養 產品。龍根雙歧桿菌株AH1205係在2006年5月11日寄存在 National Collections of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB), Scotland, UK且授予存取編號 NCIMB 4 1 3 87。NCIMB爲在布達佩斯條約下認可之國際寄存機構 。菌株爲酸性且耐受於膽汁，並通過胃腸道。在本發明特 殊的具體實例中，龍根雙歧桿菌AH 1 205係從嬰兒糞便分 離出來。 在另一具體實例中，嬰兒配方或兒童營養產品含有龍 根雙歧桿菌株AH 1205或其突變體或變異體。突變體可爲 基因改造突變體。變異體可爲雙歧桿菌屬的自然生成之變 -6- 201026239 異體。在一些具體實例中，菌株可爲益生菌。在其他的具 體實例中，菌株可具有純生物培養菌形式。在又其他具體 實例中，菌株爲分離菌株。 如本文所使用之術語^突變體〃、"變異體〃及"基 因改造突變體〃包括其基因及/或表現型性質與母株相比 有變更之雙歧桿菌株。龍根雙歧桿菌的自然生成之變異體 包括經選擇分離靶定性質的自發變更。蓄意的母株性質變 β 更係以習知（試管內）的基因操控技術完成，諸如基因分 裂及接合轉移。 基因改造包括外源及/或內源DNΑ序列引入雙歧桿菌 株之基因組中，例如藉由載體（包括細胞質體DN A或噬菌 體）嵌入細菌株之基因組中。自然或誘發突變包括至少單 鹼基變更，諸如脫失、嵌入、異位或其他的DNA改造，其 可造成以DNA序列編碼之胺基酸序列的變更。 術語"突變體# 、"變異體"及"基因改造突變體" ® 亦包括經歷與所有微生物自然一致的速度累積在基因組中 的基因變更及/或經由自發突變及/或基因取得及/或基因損 失發生的基因變更的雙歧桿菌株，其不經由蓄意（試管內 )的基因組操控而達成，但是經由變異體及/或突變體的 自然選擇而達成，在暴露於環境壓力時（諸如抗生素）， 其提供選擇優勢以支持細菌存活。突變體可藉由蓄意（試 管內）的特異性基因嵌入基因組中而產生，該嵌入根本上 不變更生物的生化功能性，但是其產品可用於細菌的鑑定 或選擇，例如抗生素抗性。 201026239 熟習所屬技藝者理解雙歧桿菌的突變體或變異體菌株 可藉由與母株的DNA序列同源性分析予以鑑定。具有與母 株接近的序列一致性的雙歧桿菌株被認爲是突變體或變異 體菌株。與母體DN A序列具有96%或更高’諸如97%或更 高，或98%或更高，或99%或更高之序列一致性（同源性 )的雙歧桿菌株可被認爲是突變體或變異體。序列同源性 可使用在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/公開取得的 線上型同源性演算法a BLAST"程式測定。 @ 母株的突變體亦包括具有與母株的16s-2 3 s基因間分隔 區多核苷酸序列至少85%之序列同源性，諸如至少90%之 序列同源性，或至少95 %之序列同源性的衍生性雙歧桿菌 株。這些突變體可進一步包含在細菌基因組中的其他DN A 序列中的DNA突變。 在本發明的一個具體實例中，雙歧桿菌株具有活菌細 胞形式。或者’雙歧桿菌株具有失活細胞形式。術語*失 活"意謂菌株之代謝活性或複製能力已被降低或破壞。失 © 活可經由所屬技藝中目前已知或尙未發展的任何方法發生 。失活可例如經由熱處理、冷凍、紫外線、r輻射、壓力 、化學分裂、機械分裂或pH變化來完成。例如，益生菌可 經由貯存在80 °C到100 °C之範圍內10分鐘的熱處理而失活 。益生菌亦可經由在與30瓦UVC燈距離5公分處照射5分鐘 的紫外線而失活。或者’益生菌可經由在距離20公分處使 用姑-60源以2 kg-Gray ( kGy)照射的7輻射而失活。如本 文所使用之術語、失活〃與、非活菌〃爲同義字。 -8 - 201026239 在具體實例中，可將龍根雙歧桿菌株AH1205補充到 兒童或嬰兒配方中。術語a嬰兒〃意謂少於約1歲之新生 人類。術語 '"兒童〃意謂在約1到12歲之年齡範圍內的人 類。在某些具體實例中，兒童係在約1到6歲之年齡範圍內 。在其他的具體實例中，兒童係在約7到12歲之年齡範圍 內。 補充到本發明配方中的龍根雙歧桿菌AH 1 2 05量可相 β 當於每公克配方約lxl〇4到約lxlO12群落形成單位（cfu) 之範圍。在另一具體實例中，補充到本發明配方中的量可 相當於每公克配方約lxlO6到約lxlO9 cfu之範圍。在另— 具體實例中，補充到本發明配方中的量可相當於每公克配 方約lxlO9到約lxlO12 cfu之範圍。在另一具體實例中，補 充到本發明配方中的量可相當於每公克配方至少約lxl〇6 cfu 〇 在本發明中的龍根雙歧桿菌AH1205施予形式不重要 β ，只要以有效量施予兒童或嬰兒。在一些具體實例中，龍 根雙歧桿菌ΑΗ 1 205係經由片劑、九劑、包封劑、糖衣鍵 、膠囊錠、膠囊、油滴劑、囊袋、液體、液體濃縮劑、粉 劑、酏劑、溶液、懸浮液、乳液、錠劑、珠粒及其組合物 施予兒童或嬰兒。在另一具體實例中，將龍根雙歧桿菌 ΑΗ 1 20 5包封在糖、脂肪或多醣中。在又另一具體實例中 ，將龍根雙歧桿菌ΑΗ 1 205加到食物或飮食產品中且吸收 。食物或飮食產品可爲營養補充品或兒童營養產品，諸如 較大嬰兒配方、成長奶粉、飲料、牛奶、優格、果汁、水 -9- 201026239 果爲主之飲品、咀嚼錠、餅乾、薄脆餅乾或奶粉。 在其他的具體實例中，產品可爲嬰兒營養產品，諸如 嬰兒配方或人乳補強劑。如本文所使用之"嬰兒配方〃意 謂以人乳替代品滿足嬰兒的營養需求之組成物。術語、人 乳補強劑〃意謂可加到人乳中以增強人乳的營養價値之組 成物。在一些具體實例中，組成物爲酸化產品（如某些醫 學食物規定所要求）。 營養產品可爲用於足月嬰兒、足月前嬰兒、低出生體 參 重兒或非常低出生體重兒之產品。如本文所使用之術語、 足月前〃或a足月前嬰兒〃可包括低出生體重兒或非常低 出生體重兒。低出生體重兒爲那些從約32到約37週懷孕期 出生或在出生時重量從3.25到約5.5磅之嬰兒。非常低出生 體重兒爲那些約32週懷孕期之前出生或在出生時重量少於 約3.25磅之嬰兒。因此，足月前嬰兒可包括在約37週懷孕 期之前出生之嬰兒及/或那些在出生時重量少於約5.5磅之 嬰兒。 ⑩ 在某些具體實例中，配方可經腸或非經腸施予。如本 文所使用之’經腸"意謂經過或在胃腸道或消化道內，而 ^經腸施予"包括經口餵進、經胃內餵食、經幽門施予或 任何其他引入消化道中的方式。術語，非經腸〃意謂以除 了經過消化道以外的方式進入體內或施予，諸如以靜脈內 或肌肉內注射。 本發明配方可提供最少、部分或全部的營養支持。組 成物可爲營養補充品或代餐。在一些具體實例中，組成物 -10- 201026239 可連同食物或營養組成物施予。在此具體實例中，組成物 可在由受驗者消化之前與食物或營養組成物混合或可在食 物或營養組成物消化之前或之後施予受驗者。組成物可施 予接受嬰兒配方、母乳、人乳補強劑或其組合物之足月前 嬰兒。組成物可爲但非必要爲全營養。以術語^全營養" 意謂組成物含有維持長期健康的人類生命之適當營養。 在一些具體實例中，本發明可包含由懷孕婦女吸收的 ® 產前膳食補充品，藉此提供龍根雙歧桿菌AH 1 205予子宮 中的胎兒。在其他的具體實例中，本發明可包含由餵乳母 親吸收的產後膳食補充品，藉此經由母乳提供龍根雙歧桿 菌AH 1 205予產後嬰兒。 若龍根.雙歧桿菌AH 1 205係經由嬰兒配方或兒童營養 產品施予時，則配方可爲全營養且含有適合的脂質、碳水 化合物、蛋白質、維生素及礦物質類型及量。脂質或脂肪 量典型地可從約3改變到約7公克/100千卡。脂質源可爲所 ® 屬技藝中已知或使用的任何來源，例如乳脂、蛋黃脂質、 魚油、植物油（諸如棕櫚油、大豆油、軟質棕櫚油、棕櫚 油、棕櫚仁油、椰子油、中鏈三酸甘油酯、高油酸葵花油 、橄欖油、高油酸紅花子油）及脂肪酸酯。 蛋白質量典型地可從約1改變到約5公克/100千卡。蛋 白質源可爲所屬技藝中已知或使用的任何來源，例如牛奶 蛋白質 '脫脂奶粉固體、脫脂牛奶、乳清蛋白質、酪蛋白 、大豆蛋白質、動物蛋白質 '穀類蛋白質、植物蛋白質或 其組合物。配方可含有富含蛋白質及/或肽之麩醯胺酸/麩 -11 - 201026239 胺酸酯。蛋白質源可爲完整、部分水解或完全水解蛋白質 。在一些具體實例中，蛋白質源可爲完整蛋白質與水解蛋 白質之組合物。蛋白質源可爲分離物或濃縮物。 在某些具體實例中，本發明組成物可含有氮源（亦即 胺基酸及/或蛋白質），使得胺基酸或蛋白質總量可從約1 公克/100千卡到約10公克/100千卡總組成物，在一些具體 實例中約2公克/100千卡到約6公克/100千卡。每100千卡總 組成物的脂質源量可大於0公克到至多約6公克，在一些具 φ 體實例中約0.5公克到約5.5公克，而在其他的具體實例中 約2公克到約5.5公克；每1〇〇千卡總組成物的非纖維碳水 化合物源量可爲約5公克到約20公克，而在一些具體實例 中可爲約7.5公克到約15公克。在全營養組成物中的維生 素與礦物質量可足以符合約500到約3,000千卡的100 %之美 國每曰建議攝取量（RDI)，在一些具體實例中約1，000到 約3,000千卡。在特殊的具體實例中，組成物可不含蛋白 質。在此一具體實例中，組成物可含有包含1 00%之無脂肪 © 酸的蛋白質同效物源。 碳水化合物量典型地可從約8改變到約12公克/100千 卡。碳水化合物源可爲所屬技藝中已知或使用的任何來源 ，例如乳糖、果糖、葡萄糖、玉米糖漿、玉米糖漿固體、 麥芽糊精、蔗糖、澱粉、米糖漿固體、米澱粉、改造玉米 澱粉、改造樹薯澱粉、米粉、大豆粉及其組合物。配方可 包括佐劑、細菌組份、藥物實體或生物化合物中任何一或 多者。 -12- 201026239 習知且市售可取得的嬰兒配方及其他配方可用於本發 明的實際應用中。例如，Enfamil®、Enfamil®早產兒配方 、含鐵 Enfamil® 、 Lactofree® 、 Nutramigen® ' Pregestimil® 及 ProSobee® (可取自 Mead Johnson & Company, Evansville, IN. U.S.A.)可以適合的龍根雙歧桿 菌AH 1205水平補充且用於本發明的實際應用中。 本發明配方可隨意地包括下列維生素或其衍生物中之 © 一或多者，包括（但不限於此）生物素、維生素31、噻胺 、噻胺焦磷酸鹽、維生素B2、核黃素、黃素單核苷酸、黃 素腺嘌呤二核甘酸、吡哆醇鹽酸鹽、噻胺單硝酸鹽、葉酸 、維生素B3、薛驗、薛鹼酸、薛鹼醢胺（nicotinamide、 niacinamide)、菸鹼醯胺腺嘌呤二核甘酸、色胺酸、生物 素、泛酸、維生素86 、維生素8|2、鈷胺素、甲基鈷胺素 '脫氧腺嘌呤鈷胺素、氰基鈷胺素、泛酸鈣、泛酸、維生 素C、抗壞血酸、維生素A、視網醇、視網醛、視網酸、 ^ 泠-胡蘿蔔素、維生素D、維生素D3、促鈣醇、膽促鈣醇、 二羥基維生素D、1,25-二羥基膽促鈣醇、7-脫氫膽固醇、 膽鹼、維生素E、維生素E乙酸鹽、維生素K、甲萘醌、甲 基萘醌類、葉綠醌、萘酚醌及其混合物。 本發明配方可隨意地包括下列礦物質或其衍生物中之 一或多者，包括（但不限於此）磷、鉀、硫、鈉、多庫酸 鈉（docusate sodium)、氯化物、锰、鎂、硬脂酸鎂、碳 酸鎂、氧化鎂、氫氧化鎂、硫酸鎂、銅、硫酸銅、碘化物 、硼、鋅、氧化鋅、鉻、鉬、鐵、羰基鐵、三價鐵、富馬 -13- 201026239 酸鐵、多醣鐵、氟化物、硒、鉬、磷酸鈣或乙酸鈣、磷酸 鉀、硫酸鎂或氧化鎂、氯化鈉、氯化鉀或乙酸鉀、正磷酸 鐵、乙酸〇：-生育酚酯、硫酸鋅或氧化鋅、葡萄糖酸銅、 氯化鉻或2 -吡啶甲酸鉻、碘化鉀、硒酸鈉、鉬酸鈉、葉綠 醌、氰基鈷胺素、亞硒酸鈉、硫酸銅、肌醇、碘化鉀、鈷 及其混合物。礦物質化合物的非限制性示例衍生物包括任 何礦物質化合物的鹽類、鹼鹽類、酯類及螯合物。 本發明組成物亦可含有乳化劑及穩定劑，諸如大豆卵 @ 磷脂、角叉菜膠及其組合物。本發明組成物可隨意地含有 可具有益效果之其他物質，諸如乳鐵素、核苷酸、核苷、 免疫球蛋白及其組合物。 在本發明的一個具體實例中，龍根雙歧桿菌ΑΗ 1205 可與一或多種益生菌組合施予。術語益生菌〃意謂致力 於宿主健康的有益效果之微生物。所屬技藝中已知的任何 益生菌可爲此具體實例中所接受，其先決條件係達成意欲 的結果。在特殊的具體實例中，益生菌可選自LGG、龍根 參 雙歧桿菌物種及亞乳酸動物雙歧桿菌ΒΒ-12。在具體實例 中，額外的益生菌可爲活菌或非活菌。 在本發明的另一具體實例中，龍根雙歧桿菌ΑΗ 1205 可與一或多種益菌生組合施予。術語"益菌生〃( prebiotic)意謂刺激益生菌生長及/或活性的不可消化之食 物成分。所屬技藝中已知的任何益菌生可爲此具體實例中 所接受，其先決條件係達成意欲的結果。有用於本發明的 益菌生可包括寡醣、多醣及含有果糖、木糖、大豆、半乳 -14- 201026239 糖、葡萄糖及甘露糖的其他益菌生。更特定言之’有用於 本發明的益菌生可包括乳酮糖、葡萄寡糖（giuc〇-oligosaccharide)、菊糖、聚葡萄糖（polydextrose)、半 乳寡糖（galacto-oligosaccharide )、果寡糖（fructo-oligosaccharide ) 、異麥芽寡糖（isomalto-oligosaccharide)、大豆寡醣、乳果寡糖（lactosucrose) 、木寡糖（xyl〇-〇lig〇saccharide )及龍膽寡糖（gentio-⑩ oligosaccharide ) 。 在本發明的又另一具體實例中，配方可含有其他的活 性劑，諸如長鏈聚不飽和脂肪酸（LCPUFA)。適合的 LCPUFA包括（但不限於此）α -亞麻油酸、r -亞麻油酸 、亞麻油酸、次亞麻油酸、二十碳五烯酸（EPA )、花生 四烯酸（ARA )及/或二十二碳六烯酸（DHA)。在具體實 例中，龍根雙歧桿菌AH 1 2 05與DH A組合施予。在另一具體 實例中，龍根雙歧桿菌AH 1 2 05與AR A組合施予。在又另一 ® 具體實例中，龍根雙歧桿菌AH 1 205與DHA及ARA二者組合 施予。含有DHA、ARA或其組合物的市售可取得的嬰兒配 方可以龍根雙歧桿菌AH 1 205補充且用於本發明中。例如 ，含有效水平之DHA及ARA之Enfamil®LIPIL®係市售可取 得，並可以龍根雙歧桿菌AH1205補充且用於本發明中。 在一個具體實例中，DH A及ARA二者係與龍根雙歧桿 菌AH1205組合施予。在此具體實例中，ARA: DHA之重量 比可從約1 : 3到約9 : 1。在本發明的一個具體實例中，此 比爲從約1 : 2到約4 : 1。在又另一具體實例中，此比爲從 201026239 約2: 3到約2: 1。在一個特殊的具體實例中，此比爲約2 :1。在本發明另一特殊的具體實例中，此比爲約1: 1.5 。在其他的具體實例中，此比爲約1: 1.3。在又其他的具 體實例中，此比爲約1 : 1 .9。在特殊的具體實例中，此比 爲約1.5 : 1。在進一步的具體實例中，此比爲約1.47 : 1。 在本發明的某些具體實例中，DH A水平係在以重量計 約0.0%到1.00%之脂肪酸範圍內。DHA水平可爲約0.32重 量％。在一些具體實例中，DHA水平可爲約0.33重量％。在 φ 另一具體實例中，DHA水平可爲約〇.64重量％。在另一具 體實例中，DHA水平可爲約〇.67重量％。在又另一具體實 例中’ DHA水平可爲約0.96重量％。在進一步的具體實例 中，DHA水平可爲約1.00重量％。 在本發明的具體實例中，ARA水平係在以重量計〇.〇% 到0.67 %之脂肪酸範圍內。在另一具體實例中，ARA水平 可爲約〇·67重量％。在另一具體實例中，ARA水平可爲約 0.5重量％。在又另一具體實例中，AR A水平可在以重量計 @ 約0.47%到0.48%之範圍內。 若包括DHA’則在本發明的具體實例中的DHA有效量 典型地以每天每公斤體重計從約3毫克到以每天每公斤體 重計約150毫克。在本發明的—個具體實例中，此量係以 每天每公斤體重計從約6毫克到以每天每公斤體重計約1〇〇 毫克。在另一具體實例中’此量係以每天每公斤體重計從 約10毫克到以每天每公斤體重計約6〇毫克。在又另一具體 實例中’此量係以每天每公斤體重計從約丨5毫克到以每天 -16- 201026239 每公斤體重計約30毫克。 若包括ARA，則在本發明的具體實例中的ArA有效量 典型地以每天每公斤體重計從約5毫克到以每天每公斤體 重計約150毫克。在本發明的~個具體實例中，此量係以 每天每公斤體重計從約10毫克改變到以每天每公斤體重計 約120毫克。在另一具體實例中，此量係以每天每公斤體 重計從約1 5毫克改變到以每天每公斤體重計約9〇毫克。在 © 又另一具體實例中’此量係以每天每公斤體重計從約20毫 克改變到以每天每公斤體重計約60毫克。 若使用嬰兒配方’則在嬰兒配方中的DH A量可從約5 鼋克/100千卡改變到約80毫克/100千卡。在本發明的一個 具體實例中，DHA量係從約10毫克/1〇〇千卡改變到約5〇毫 克/100千卡；而在另一具體實例中從約15毫克/1〇〇千卡改 變到約20毫克/100千卡。在本發明的特殊具體實例中， DHA量爲約17毫克/100千卡。 胃若使用嬰兒配方’則在嬰兒配方中的AR A量可從約10 毫克/100千卡改變到約100毫克/100千卡。在本發明的一個 具體實例中，ARA量係從約IS毫克/1〇〇千卡改變到約70毫 克/100千卡。在另一具體實例中，ARA量係從約20毫克 /100千卡改變到約40毫克/100千卡。在本發明的特殊具體 實例中，ARA量爲約34毫克/100千卡。 若使用嬰兒配方，則嬰兒配方可使用所屬技藝中已知 的標準技術以含有DHA及ARA之油補充。例如，DHA及 ARA可藉由取代正常存在於配方中的等量油（諸如高油酸 -17- 201026239 葵花油）而加到配方中。含有DHA及ARA之油可藉由取代 正常存在於沒有DH A及AR A之配方中的等量其餘總脂肪摻 合物而加到配方中，作爲另一實例。 若使用DHA及ARA，則DHA及ARA源可爲所屬技藝中 已知的任何來源，諸如水產動物油、魚油、單細胞油、蛋 黃脂質及腦脂質。在一些具體實例中，DH A及AR A源自於 單細胞Martek油、DHASCO®或其變異體。DHA及ARA可具 有自然形式，其先決條件係LCPUFA源的剩餘部分不對嬰 @ 兒造成任何實質有害的效果。或者，DH A及ARA可以精製 形式使用。 在本發明的具體實例中，DH A及ARA源可爲單細胞油 ，如在美國專利第5,3 74,567號、第5,550，156號及第 5,397,591號中所教示，將其完整的揭示內容倂入本文以供 參考。然而，本發明不限於此等油而已。 在一個具體實例中，將含有EPA之LCPUFA源與龍根 雙歧桿菌AH 12 05組合使用。在另一具體實例中，將實質 參 上不含EP A之LCPUFA源與龍根雙歧桿菌AH 1205組合使用 。例如’在本發明的一個具體實例中，含有少於約1 6毫克 EPA/100千卡之嬰兒配方以龍根雙歧桿菌AH 1 205補充且用 於本發明的方法中。在另一具體實例中，含有少於約10毫 克EPA/100千卡之嬰兒配方以龍根雙歧桿菌AH1205補充且 用於本發明的方法中。在又另一具體實例中，含有少於約 5毫克ΕΡΑ/Ι00千卡之嬰兒配方以龍根雙歧桿菌AH 1 2 05補 充且用於本發明的方法中。本發明的另一具體實例包括以 -18- 201026239 龍根雙歧桿菌AH 1 205補充不含甚至微量EP A之嬰兒配方。 應理解龍根雙歧桿菌AH 1 205與益生菌、益菌生、 LCPUF A或其他活性成分之組合可以單一配方或在相同或 不同時間施予且使用相同或不同的施予途徑之單獨配方施 予。 在本發明的一個具體實例中，可將配方用於免疫及疫 苗接種流程中。使用益生菌作爲載體的經口免疫作用不僅 Φ 會保護宿主免於感染，並可取代正常會誘出病原體的免疫 刺激，因此有助於宿主的免疫訓練。 在本發明的具體實例中，配方有用於治療、減少及/ 或預防發炎。如本文所使用之術語"治療"意謂改良、改 善或醫治疾病、病症或疾病或症狀之徵候。術語^減少〃 意謂縮小範圍、量或程度。術語"預防〃意謂經由一些作 用停止或阻礙疾病、病症或疾病或症狀之徵候。 在特殊的具體實例中，本發明包含龍根雙歧桿菌 ® AH 12〇5供製造用於減少在嬰兒或兒童中的發炎之組成物 的用途。實例2-5各指出施予龍根雙歧桿菌AH 12 05可減 少或預防在嬰兒或兒童中的發炎。可減少在胃腸道、呼吸 道中的發炎，或可減少全身性發炎。減少發炎可改善過敏 或氣喘。 在此具體實例中，發炎可爲呼吸系發炎，諸如氣喘、 過敏性鼻炎、鼻寶炎、氣道組織發炎、上呼吸系感染、流 行性感冒 '喉炎、呼吸系融合細胞病毒、支氣管炎、細支 氣管炎、肺炎或氣道內腔發炎。同樣地，發炎可爲胃腸道 -19- 201026239 發炎，諸如腹瀉、發炎性腸道疾病、克隆氏（Crohn’s ) 病、腸結腸炎、潰瘍性結腸炎、過敏性結腸炎、刺激性腸 症候群、囊炎、感染後結腸炎、艱難梭菌（Clostridium difficile )引起的腹瀉、輪狀病毒引起的腹瀉或感染後腹 瀉，或由於感染劑（諸如大腸桿菌）的腹瀉病。在其他的 具體實例中，發炎可爲全身性，諸如類風濕性關節炎。如 本文所使用之術語'^全身性”意謂關於或影響全身。 在一些具體實例中，減少或預防發炎可改善或預防異 @ 位性症狀或疾病。例如，減少或預防發炎可改善或預防異 位性皮虜炎。在特殊的具體實例中，減少或預防發炎可改 善或預防常見的嬰兒或兒童病。例如，減少或預防發炎可 改善或預防腹瀉或急性中耳炎。在又另一具體實例中，減 少或預防發炎可改善或預防食物過敏。 咸信龍根雙歧桿菌ΑΗ 12 05係藉由拮抗及排除胃腸道 或發炎位置的發炎微生物而起作用。亦咸信龍根雙歧桿菌 AH1205係藉由減少前發炎細胞介素（cytokine)水平而起 〇 作用。 在特殊的具體實例中，菌株可修改在受驗者（subject )中的IL-10水平。IL-10係由T細胞、B細胞、單核細胞或 巨噬細胞所產生。此細胞介素擴大B細胞增生及分化成抗 體分泌細胞。IL-10主要展現抗發炎活性。其向上調節以 單核細胞的IL-1RA表現且抑制大部分的單核細胞發炎活性 。IL-10係經由反饋機制來抑制細胞介素的單核細胞生成 、反應性氧與氮中間物、主要組織相容性複合物（MHC ) -20- 201026239 類別Π表現、捕殺寄生蟲及IL-1 〇生成。亦經證明此細胞介 素係藉由干擾前列腺素Ε2-環腺苷單磷酸（PGE2-cAMP ) 依賴途徑來阻斷腸內膠原酶及第IV型膠原酶的單核細胞生 成’而因此可爲慢性發炎疾病中所見之結締組織破壞的重 要調節劑。因此，在具體實例中，在攝取此菌株之嬰兒或 兒童中的菌株可向上調節或誘發分泌IL-10水平。 在其他的具體實例中，龍根雙歧桿菌AH 1 2 05向下調 © 節或降低TNF-α、IL-6、MCP-1及/或IFN-r或其他前發炎 細胞介素或趨化素的分泌。TNF- α (前發炎細胞介素）引 發梯瀑式（cascade)細胞介素及生物效應，造成發炎狀態 〇 在一些具體實例中，本發明配方有用於保持免疫系統 的恆定性。在其他的具體實例中，本發明配方有用於改善 或增強受驗者中的免疫性。 在一些具體實例中，增強免疫性或抑制發炎可包括刺 ® 激腸道健全；減少腸道滲透性；改善黏液素合成、分泌及 /或品質；改善腸道上皮的成熟及分化；改善營養吸收； 增加轉移抗微生物活性的可溶性因子的生成；刺激、改善 或支持抗感染性；支持對抗病毒或細菌感染的細胞或體液 反應；增加細胞毒性（抗病毒及抗腫瘤二者）：支持全身 性及/或黏膜疫苗接種反應；增加或支持細胞及/或體液免 疫性；增加或支持自然免疫性（包括嗜中性球、吞噬細胞 、巨噬細胞及自然殺手細胞活性）：增加或支持適應的T 及B細胞免疫性；刺激輔助T細胞1 ( Thl )細胞介素模式（ -21 - 201026239 增加 IL-l、IL-2、IFN-r、IL-12、TNF-α、人類白血球抗 原-Dr ( HLA-Dr )表現）；抑制發炎或全身性及黏膜發炎 介導體（包括細胞介素及/或趨化素）的生成；藉由減少 總IgE及/或過敏原特異性IgE而減少致敏作用；減少過敏性 細胞介素的生成；減少Th2支持之免疫球蛋白輪廓（ profile );及其組合。 於多種腫瘤類型中多功能細胞介素的生成暗示在患有 癌症的病患中有明顯的發炎反應進行。因此，在本發明的 @ 具體實例中，龍根雙歧桿菌AH1205可有用於治療癌症徵 候。由於龍根雙歧桿菌AH 1 205的抗發炎性質，此細菌株 可減少惡性細胞轉變的速度。此外，腸道細菌可從膳食化 合物、具有基因毒性、致癌性及促腫瘤活性之物質產生， 且腸道細菌可活化前致癌物成爲DN A反應劑。通常，雙歧 桿菌屬物種具有比腸道內的其他族群（諸如擬桿菌、真細 菌及梭菌）低的異型生物質代謝酵素活性。因此，增加腸 道內的雙歧桿菌屬細菌數量可有益於修改這些酵素水平。 @ 在特殊的具體實例中，龍根雙歧桿菌AH 1 205可與抗 發炎療法（諸如非類固醇抗發炎藥物（NS AID )或因福利 美（infliximab))組合施予。 嬰兒腸道微生物叢在出生後前幾週內快速建立。此腸 道菌落的本性最初係由早期暴露的微生物環境源與嬰兒健 康來決定。經由剖腹產出生之嬰兒、足月前嬰兒或其生命 最初期於無菌保溫箱中度過的其他嬰兒及/或在生命早期 施予抗生素之嬰兒可能在健康的腸道微生物叢發展有顯著 -22- 201026239 的遲緩。因爲這些嬰兒沒有機會從其母親或環境取得健康 的腸道微生物叢，所以龍根雙歧桿菌AH1205的吸收可有 助益於腸道免疫系統的適當發展及功能。 在本發明的一些具體實例中，嬰兒或兒童需要治療、 減少或預防發炎。受驗者由於遺傳傾向、膳食、生活方式 、疾病或病症而具有發炎風險。例如，足月前嬰兒或免疫 抑制之嬰而可具有發炎風險，而因此可能需要此等治療、 . 減少或預防。 可將本發明組成物包裝在所屬技藝中已知用於貯存營 養產品的任何類型容器中，諸如玻璃、加襯紙板、塑膠及 塗佈之金屬罐。在一些具體實例中，組成物係經由吹-塡-封包裝技術包裝。在其他的具體實例中，組成物係經提供 於單一劑量容器中。組成物的包裝係在滅菌條件下進行。 在一些具體實例中，組成物係經製備使得可接受其經由鼻 胃管、鼻十二指腸管或鼻空腸管而直接輸送給足月前嬰兒 本發明組成物可具有貨架上保存穩定性。”貨架上保 存穩定性'意謂具有可輕易吸收形式的組成物維持單一均 勻相（亦即在以目視檢査時未分離成一相以上），及/或 在冰箱中貯存隔夜之後以目視檢查時未發生沉降。 下列的實例敘述本發明的各種具體實例。在本文申請 專利範圍內的其他具體實例可從思考如本文所揭示之本發 明說明書或實際應用而爲熟習所屬技藝者明白。意欲以說 明書與實例一起被認爲是示例而已，本發明的範疇及精神 • 23 - 201026239 係由實例之後的申請專利範圍指定。在實例中，所有的百 分比係以重量爲基準提供，除非另有指示。 【實施方式】 實例1 此實例例證從嬰兒糞便分離的細菌特徵。 益生菌的分離 新鮮糞便係從餵母乳的3天大男嬰獲得且將稀釋液系 列覆蓋在補給0.05 %半胱胺酸及莫匹羅星 (mupirocin )的 TPY (胰化蛋白、腺及酵母萃取液）及MRS ( deMann、 Rogosa及Sharpe )培養基上。將平盤在厭氧瓶（BBL, Oxoid)中使用 C02產生套組（Anaerocult A，Merck )於 37 °C下培育2-5天。革蘭氏（Gram)陽性、催化酶陰性棒狀 或分叉/多形細菌分離物畫線純化培養在複合式非選擇性 培養基（MRS及TPY )上。分離物按慣例在37°C及厭氧條 件下栽培在MRS或TPY培養基中，除非另有陳述。將預定 之雙歧桿菌屬貯存在40%甘油中且貯存在-20°C及-80°C下 〇 在分離出經指定命名爲AH1205的純雙歧桿菌株之後 ，評定微生物特徵且總結於下列表1。AH1205爲革蘭氏陽 性、催化酶陰性多形狀細菌屬，其爲確認其身分爲雙歧桿 菌屬之果糖-6-磷酸磷酸酮酶陽性菌。使用其中嵌入單一碳 源之基礎培養基，AH 1 205能夠生長在所有測試之碳源上 201026239 (葡萄糖、乳糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、棉子糖、果 糖、麥芽萃取物、甘露糖、麥芽糖、蔗糖）。 表1.龍根雙歧桿菌AH1205之物理化學特徵 菌株特徵 龍根雙歧桿菌AH1205 革蘭氏菌株 + 催化酶 - 運動性 - F6PPK* + β 牛奶凝固作用 + 45〇C之厭氧培養物 - 45°C之需氧培養物 - 碳水化合物(CHO)發酵作用 葡萄糖 + 乳糖 + 核糖 + 阿拉伯糖 + 半乳糖 + 棉子糖 + 果糖 + 應麥芽萃取物 + 蠼甘露糖 + 麥芽糖 + 蔗糖_+__ *表示果糖-6·碟酸磷酸酮酶檢定法 物種鑑定 16s基因間分隔區（IGS)定序係經執行以鑑定分離之 雙歧桿菌物種。簡言之，DN A係使用1〇〇微升萃取溶液及 25微升組織製備溶液（Sigma, XNAT2套組）而從AH1205 分離出來。將樣品在95 °C下培育5分鐘及接著加入1〇〇微升 -25- 201026239 中和溶液（XNAT2套組）。基因組DNA溶液係使用超微量 分光光度計定量且貯存在4°C下。PCR係使用IGS引子， IGS L:5、GCTGGATCACCTCCTTTC-3，（序歹!]識別號 3)( 其係以序列識別號1爲基準）及IGS R:5’-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3’（序列識別號4 )(其係以序 列識別號2爲基準）執行。循環條件爲94 °C經3分鐘（1次 循環）、94°C經30秒、53°C經3 0秒' 72°C經3 0秒（28次循 環）°PCR反應含有4微升（50毫微克）DNA、PCR混合物 〇 (XNAT2套組）、0.4"M IGS L與 R 引子（MWG Biotech, Germany) 。PCR反應係在Eppendorf聚合酶連鎖反應器上 執行。PCR產物（10微升）係在參-乙酸鹽緩衝液（TAE ) 中以2%洋菜糖EtBr染色之凝膠上沿著分子量標記物（ 100bp Ladder, Roche)運轉，以測定IGS輪廓。雙歧桿菌 屬之PCR產物（單譜帶）係使用Promega Wizard PCR純化 套組純化。純化之PCR產物係使用基因間分隔區之引子序 列（如上）定序。接著比對美國國家生物科技資訊中心（ © NCBI )核苷酸資料庫捜尋序列數據，以核苷酸同源性決定 菌株身分。所得DN A序列數據呈交於NCBI標準核苷酸對核 苷酸同源性 BLAST搜尋引擎（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )。鑑定最接近相配的序列，並接著使用DNASTAR MegAlign軟體供比較排列出序列。可在序列表中查看所獲 得的序列（序列識別號1 [IGS正向序列]及序列識別號 2[IGS反向序列])。搜尋NCIMB資料庫揭露AH 1 205具有最 接近於龍根雙歧桿菌之其序列同源性的獨特IGS (序列識 -26- 201026239 別號1 [ IG S正向序列]及序列識別號2 [ IG S反向序列])序列 。於此呈交表3的序列表之影本及電腦可讀格式且以其完 整內容倂入本文以供參考。在磁片上的電腦可讀格式命名 爲 AH1 205_ST25.txt，Size:3KB，2008年 9 月 1 2 日倉fj 建。 爲了發展AH 1 205之條碼PCR輪廓，故使用BOX引子執 行PCR。循環條件爲94°C經7分鐘（1次循環）、94°C經1分 鐘、65 °C經8分鐘（30次循環）及65 °C經16分鐘。PC R反應 Ο 含有50毫微克DNA、PCR混合物（XNAT2套組）及0.3 μ Μ BOXA1R 弓丨子（5，-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3,）( 序列識別號 5) (MWG Biotech, Germany) 。PCR 反應係 在Eppendorf聚合酶連鎖反應器上執行。PCR產物（1微升 )係使用 DNA 7500 LabChip® 在 Agilent 2100 生物分析儀（ Agilent Germany ) 上沿著分子量標記物 （DNA 7500 ladder, Agilent Germany)運轉。條碼（PCR 產物輪廓）係 使用鑑定波峰數量（PCR產物）及尺寸的Agilent生物分析 ® 儀軟體測定（圖1 )。 抗生素敏感性輪廓 龍根雙歧桿菌株的抗生素敏感性輪廓係使用^紙錠藥 物敏感性"檢定法測定。將培養物在適當的培養液培養基 中生長24-48小時，塗抹（100微升）於洋菜培養基上及將 含有已知濃度的抗生素紙錠藥物放在洋菜上。在3 7 °C及厭 氧條件下培育1-2天之後檢査菌株的抗生素敏感性。若察 看到1毫米或更大的抑制區帶時，則認爲是敏感的菌株。 -27- 201026239 獨立評定每個抗生素的最小抑制濃度（MIC )。氯潔黴素 (clindamycin)、萬古黴素（vancomycin)及咪哗尼達（ metronidazole)之 MIC分別爲 0.032、0.75及 > 256_。 腸道通過率 爲了測定龍根雙歧桿菌是否可存活於與那些在胃中所 發現相同的低pH値下，細菌細胞係穫自新鮮的隔夜培養物 ，以磷酸鹽緩衝液（pH 6.5 )清洗兩次及懸浮在調整到pH φ 2.5 (以1M HC1 )之TPY培養液中。將細胞在37°C下培育 ，並使用平盤計數法在5、30、60及120分鐘間隔測量存活 率。AH12〇5在pH 2.5下成功地存活5分鐘，但是在30分鐘 之後沒有回收到任何活菌細胞。 存在於胃中時，將推定的抗生素暴露於小腸中的膽鹽 中。爲了測定雙歧桿菌存活暴露於膽汁中的能力，故將培 養物畫線培養在以 0.3% ( w/v ) 、0.5%、1 %、2%、5°/〇、 7.5 %或1 0 %豬膽汁補給之TP Y洋菜盤上。在含有至多0.5 % Θ 膽汁之平盤上觀察到龍根雙歧桿菌AH 1 205生長。 在鼠科模式中評定龍根雙歧桿菌AH 12 05通過胃腸道 的能力。使小鼠每天攝取1x1 Ο9 AH 1205，並檢查糞便粒是 否有餵食之微生物存在。藉由分離出在TPY平盤中併入利 福平（rifampicin )之雙歧桿菌的自發性利福平抗性變異 體有助於AH 1 205的偵測，使用此倂入利福平來評定通過 率，確保僅培養所餵食之抗利福平之雙歧桿菌。收集每天 的糞便樣品且確認通過胃腸道的龍根雙歧桿菌（圖2)。 -28 - 201026239 抗微生物活性 將此硏究中所使用之指標病原微生物在下列的培養基 中在下列的生長條件下繁殖：在以0.6%酵母萃取液（ TSAYE，Oxoid )補充之胰化蛋白大豆培養液/洋菜中的沙 門氏鼠傷寒桿菌（Salmonella typhimurium) ( 3 7 °C，需 氧）、在血洋菜培養基上的空腸弧菌（Campylobacter © jejuni ) (37°C，厭氧）與大腸桿菌 〇157:H7(37°C，厭氧 )及在強化之梭菌培養基（RCM，Oxoid )中的艱難梭菌 (Clostridium difficile ) ( 3 7 °C，厭氧）。將所有的菌株 接種到新鮮的生長培養基中且生長隔夜，然後在實驗中使 用。 抗微生物活性係使用延遲法偵測。簡言之，將龍根雙 歧桿菌AH1 205培育36-48小時。將10倍稀釋液系列塗抹（ 1〇〇微升）於TPY洋菜培養基上。在隔夜培育之後，將具有 ® 明顯菌落的平盤以標識菌覆蓋。標識菌苔係藉由傾注於接 種之TPY平盤表面上的2% (v/v)隔夜標識培養物接種熔 融覆蓋物而製備。將平盤在適合於標識菌生長的條件下再 培育隔夜。具有抑制區帶大於1毫米半徑的標識培養物被 認爲對試驗菌具敏感性。龍根雙歧桿菌AH1205抑制所有 測試之病原微生物生長，沙門氏鼠傷寒桿菌、空腸弧菌、 大腸桿菌0157 :H7及艱難梭菌分別具有明確測得8.67、> 80、4.33及1 1 .67毫米之區帶。 -29 - 201026239 實例2 此實例例證藉由PBMC對龍根雙歧桿菌之回應的細胞 介素生成。PBMC係從健康的捐贈者藉由密度梯度離心分 離而來。將PBMC在37 °C下以益生菌株刺激72小時。在此 時收集培養物上清液，離心，分裝且貯存在-70 °C，直到 使用細胞球珠陣列法（CBA) (BD BioScience)評定IL-10水平爲止。AH1205誘發人類PBMC明顯分泌的IL-10，暗 示此益生菌株可於活體內誘發抗發炎反應（圖3)。其可 @ 在人類中用作爲減少及預防發炎的抗發炎劑。 實例3 此硏究調查益生菌龍根雙歧桿菌AH 12 05是否減弱在 氣喘之鼠科模式中的呼吸系疾病。更特定言之，調査龍根 雙歧桿菌AH 1 205以測定其是否會抑制在以OVA-致敏之過 敏性氣道發炎的小鼠中的過敏反應。簡言之，將雄性 BALB/c成鼠在第0天及第6天以腹膜內（IP )注射OVA而致 ® 敏。在第12及14天時，以OVA經鼻內挑戰小鼠。小鼠係在 最後挑戰（第15天）之後24小時接受氣道反應測量及接著 BAL程序。以OVA/alum致敏之食鹽水挑戰小鼠充當控制組 。動物在整個試驗期間接收益生菌或安慰劑。氣道發炎（ 細胞介素及細胞計數）係以BAL流體中的發炎細胞計數評 定。氣道反應亦使用Buxco全身體積變化描記器測量。亦 將脾臟細胞從OVA致敏小鼠分離出來且在抗-CD3及抗-CD28抗體存在下培育，然後以流動式細胞儀測量上清液中 -30- 201026239 的細胞介素水平。 當與餵食培養液之動物相比時，龍根雙歧桿菌 AH 1205未造成在OVA挑戰之後從BAL流體回收的細胞之明 顯減少（圖4 )。測量氣道反應，並在與食鹽水挑戰小鼠 相比時，以OVA之致敏小鼠的挑戰造成增強對甲基膽鹼之 AHR。AH1205未調節對甲基膽鹼的此增強之氣道反應，如 以增強暫停之變化所評定（圖5 )。 φ B AL細胞介素水平係以CB A測量且證明以AH 1 2 05餵食 之動物比OVA控制組明顯減少了 TNF- α水平（圖6C )。此 TNF- α水平的減少暗示龍根雙歧桿菌ΑΗ 1 2 05可減弱或預 防呼吸系疾病且抑制或預防過敏反應。未發現IL-10、 IFN- 7、IL-6及CCL-2水平有任何明顯差異（圖6 )。 實例4 此硏究調查攝取益生菌對健康小鼠中的調節Τ細胞數 β 量及活性的效果。將BALB/c小鼠（10隻/組）餵食龍根雙 歧桿菌ΑΗ 1205或安慰劑3週。在攝取益生菌/安慰劑之後， 將CD4 + CD25 + T調節細胞分離出來，且其在試管內抑制活 性係藉由使用流動式細胞儀測量抗-CD3/CD28刺激之CFSE 標記之CD4 +反應Τ細胞的增生來測定。CD4+反應Τ細胞與 作爲控制組的CD4 + CD25 — T細胞共同培育。在鼠科脾臟細 胞中的CD4 + CD25 +細胞（調節Τ細胞）（亦爲FoxP3正）百 分比係在益生菌或安慰劑餵食之小鼠的脾臟中測定。 將與來自益生菌/安慰劑餵食之小鼠的CD4 + CD25 +細胞 -31 - 201026239 共同培育時增生之CD4 +細胞百分比與來自相同試驗小鼠的 CD4 + CD25·細胞共同培育時增生之CD4 +細胞百分比相比。 在此情況中，在含有CD4 + CD25 +細胞之培養物中的T細胞 增生少於僅含CD4+細胞且耗盡CD25 +細胞之培養物（圖7 )° 測定在亦爲CD25+之CD4+族群中的細胞百分比（圖8 )。龍根雙歧桿菌AH 1 2 05餵食組具有比其對應之安慰劑 餵食組明顯更多亦爲CD25 +的CD4 + T細胞（亦即T-調節細 〇 胞）。此暗示在CD4 +族群內的T-調節細胞百分比係藉由餵 食AH 1 205而明顯增加。此結果顯示施予AH 1 205可減少或 預防在人類中的發炎。 亦測定在益生菌或安慰劑餵食之小鼠的整個脾臟細胞 族群中的CD4 + CD25 + FoxP3 +細胞數量。在以益生菌餵食之 小鼠的脾臟中表現FoxP3之CD4 + CD2 5 + T-調節細胞數量相 對於安慰劑或未餵食之小鼠而言沒有改變。 φ 實例5 購買6週大無菌小鼠且將其保持在UCC中的生物維護 單位的無菌單位中。使動物攝取益生菌株龍根雙歧桿菌 AH1 205 9天或維持無菌（控制組）。以流動式細胞儀評定 T調節細胞的誘發及以CB A定量細胞介素水平。 AH1 205通過率係藉由測量在硏究期間在選擇之洋菜 上的雙歧桿菌計數來評定。AH 1 205不以可測量數量通過 無菌小鼠腸道，即使每天施予約lxlO9個生物體。此結果 -32- 201026239 暗示在腸道內的雙歧桿菌存活需要額外的微生物或宿主因 素。 雖然AH 1 205不以可偵測之數量通過腸道，但是細菌 確實與宿主免疫系統交互作用。在以AH1205餵食之無菌 動物的腸繫膜淋巴結及脾臟中的CD4 + CD25 + Fo?tP3 +細胞數 量在餵食9天之後明顯增加了 （圖9)。總CD3/CD4或 CD3/CD28計數維持不變。 β 將分離之MLNC及脾臟細胞在試管內以抗CD3/CD28抗 體或LPS刺激或維持未經刺激（作爲負控制組）。當小鼠 以AH1205預餵食時，在CD3/CD28刺激之後，實質上降低 了在培養物上清液中的MLNC之IL-6及IFN· r分泌，且 MCP-1水平受到明顯抑制（圖1 0 ) 。IL- 1 0水平在各組之間 維持相似。當以AH12〇5預餵食時，實質上（但是不明顯 )降低了脾臟細胞的IL-6及TNF-α釋放（圖11)。未觀察 到未經刺激或以LP S刺激之培養物有明顯的差異，但是從 ® 龍根雙歧桿菌AH 1 205餵食之動物觀察到大體上較少的前 發炎細胞介素生成。此結果再次顯示施予AH1205可減少 或預防在人類中的發炎。 實例6 此實例例證龍根雙歧桿菌AH 1 205的穩定性。AH 1205 的穩定性在3 0 °C下經3個月有改變（圖1 2 )。經過試驗期 的LGG爲差的益生菌，經3個月期間下降100倍，反之，菌 株AH 1205經相同的試驗期衰退至多約1〇倍的生存力。 -33- 201026239 於此說明書中引述的所有參考資料，包括（而非限制 )所有論文、公報、專利、專利申請案、報告書、教科書 、報導、手稿、小冊子、書籍、網路貼文、雜誌文章及期 刊皆以其完整內容倂入本說明書以供參考。本文中參考資 料討論僅意欲總結由該等作者提出的主張，並非承認任一 參考資料構成先前技藝。申請者保留挑戰所引述之參考資 料的準確性與切題性之權利。 這些及其他對本發明的修改及變異可由那些一般熟習 @ 所屬技藝者以不違背更特別陳述於所附申請專利範圍中的 本發明精神及範疇達成。另外，應瞭解各種具體實例的觀 點可全部或部分地交換。此外，那些一般熟習所屬技藝者 應理解前述說明僅爲實例方式而已，而無意限制以所附申 請專利範圍中如此進一步敘述的本發明。因此，所附之申 請專利範圍的精神及範疇應不受限於其中所含版本的說明 【圖式簡單說明】 圖1爲龍根雙歧桿菌AH1205之BOX聚合酶鏈反應（ BOX PCR)(生物分析儀）條碼輪廓。鹼基對尺寸係使用 Agilent 2100軟體測定； 圖2爲例證經8天餵食期之龍根雙歧桿菌AH 1 2 05的糞 便回收率之圖形，其證明AH 1205通過鼠科胃腸道的能力 » 圖3爲顯示龍根雙歧桿菌AH1205對藉由人類末梢血液 -34- 201026239 單核細胞（PBMC)的介白素（IL) -10細胞介素生成的效 果之條形圖。將結果以測量之平均±標準誤差（SEM )( n = 6 )表示； 圖4A及B爲顯示（A)龍根雙歧桿菌AH 1 205及（B) 安慰劑對在致敏性動物中以卵白蛋白（OVA )挑戰之後的 支氣管肺泡灌洗（BAL )流體中的總細胞數量的效果之圖 形（n=10/組，*表示與單獨的OVA挑戰相比之p< 0.05); Φ 圖5A及B爲顯示（A )龍根雙歧桿菌AH 1 205治療及（ B)安慰劑對甲基膽鹼之氣道反應的效果之圖形，如藉由 在以OVA或食鹽水的鼻內挑戰之後24小時於OVA-致敏小 鼠中的增強暫停（Penh )之變化所評定。每個數據點代表 平均土SEM ( n=l 0/組，*表示與單獨的OVA相比之ρ=<0·05 )； 圖6Α至Ε爲顯示在來自OVΑ-致敏小鼠的BAL流體中的 (A) IL-10、（ B )干擾素（IFN ) - r、（C)腫瘤壞死因 ® 子（TNF) -α、（ D) IL-6及（E)趨化素（C-C模組）配 體2 ( CCL2 )水平之圖形。每個柱狀圖代表平均土SEM ( η=10，*表示與OVA-挑戰之食鹽水治療控制組相比之ρ < 0.05 )； 圖7爲例證來自AH1205餵食之小鼠的CD4 + CD25 +細胞 明顯減少反應CD4 + T細胞增生之圖形（n = 7 ); 圖8爲顯示在亦爲CD25+之CD4+族群中的派爾塊（ Payer's patch)細胞百分比之圖形，如以流動式細胞儀所 評定； -35- 201026239 圖9A及B爲顯示表現轉錄因子FoxP3之CD4 + /CD25 +細 胞的百分比之圖形。此圖顯示在攝取龍根雙歧桿菌 AH 1205之無菌小鼠中FoxP3明顯向上調節。（A)=脾臟細 胞，（B)腸繫膜淋巴結細胞（MLNC )(脾臟檢定n = 4/組 ，MLNC檢定組的n = 2/3 ); 圖10爲顯示以CD3/CD28刺激之MLNC培養物分泌之細 胞介素IL-6、單核細胞化學趨附蛋白質（MCP) -1及IFN-7*水平在攝取龍根雙歧桿菌AH 1 205的無菌小鼠中減少之 圖形。結果係以每組平均±SEM表示（n = 4/組）： 圖丨1爲顯示以CD3/CD28刺激之脾臟細胞培養物分泌 之細胞介素IL-6及TNF- α水平在攝取龍根雙歧桿菌 ΑΗ 1 205的無菌小鼠中減少之圖形。結果係以每組平均土 SEM表示（η = 4/組）：及 圖12爲例證與鼠李醣乳酸桿菌GG ( LGG )相比之龍根 雙歧桿菌ΑΗ1205經3個月的穩定性之圖形。 201026239 mm

<110> Russell, Michael Ceddia, Michael <120> Probiotic Infant Formulas <130> MJE00253 <160> 5 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 494 <212> IM <213> Bifidobacterium longum <220> <221> misc feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (15)7.(15) <223> n is a， c， g， or t <220> <221> misc feature <222> (48)7.(48) <223> n is a, c, g， or t <220> <221> misc feature <222> (50)7.(50) <223> n is a, c, g， or t <220> <221> misc feature <222> (139)..(139) <223> n is a, c， g， or t <220> <221> misc feature <222> (144),.(144) <223> n is a, c， g， or t <220> <221> misc feature <222> (170)..(170) <223> π is a, c， g, or t <220> <221> misc feature <222> (176)..(176) <223> n is a， c， g, or t <220〉 <221> misc feature <222> (185)..(185) <223> n is a, c， g， or t <220> 201026239 <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> mi sc feature <222> (193)..(193) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (203T..(203) <223> n is a, c, gf or t <220> <221> raise feature <222> (211)..(211) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (237)..(237) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> raise feature <222> (259)..(259) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (263)..(263) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (275T..(275) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (289)..(289) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_fcature <222> (294)..(294) <223> n is af c, g, or t <220> <221> misc-feature <222> (309)..(309) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (329)..(329) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (339)..(339) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (351)..(351) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (369)..(369) <223> n is a, c, g, or t -2 <220> 201026239 <221> misc.feature <222> (373)..(373) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (386)..(386) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_fcature <222> (394)..(394) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_fcature <222> (405)..(405) <223> n is a, c, g, or ΐ <220> <221> mi sc feature <222> (417)..(417) <223> n is a, c, g, or t

<220> <221> misc_feature <222> (427T..(427) <223〉 n is a, c, g, or t <220> <221> mi sc一feature <222> (442)..(442) <223> n is a， c, g, or t <220> <221> mi sc feature <222> (452)..(452) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (456)..(456) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (460)..(460) <223> n is a, c, g, or t

<220> <221> misc_feature <222> (463)..(463) <223> n is a, c， g, or t <220> <221> misc_fcature <222> (465)..(465) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (470)..(470) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (485)..(485) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc feature <222> (487)..(487) <223〉 n is a, c, g, or t <220> 201026239 <221> niisc_feature <222> (489)..(491) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc^fcature <222> (493)..(493) <223> n is a, c, g， or t <400> 1 gcctagnctt ctagcaaatt aacactaaaa ccgtnttgnt acsggaccag gtggcgatnc acgcaccgna sacsccnggg cccancnann ncngncacac cccaggacga atagagttng tgngtccact cccgccatna gggagcccaa agnccatgat ctcgcaccgc ncng gtcaccacac caaatcatca attngaaatt atncastttt ignacgatgg aagcgcatnc tttttncaca cngacgaaca ggtgtcgcat cactaaaatg aacagcaaga naagccacca gcatngaatc acaccactnc ccancagccc tncggncgtn gsccccgntn atcacaaaac acgaggaatn cgcaccacca gcgccaggnc cgcggaacat caagncgccg ttntncgtan ggcatccttc gatcgaaaca aaaggnaacc cgccgtncgg aaancctggg nccacgacgg cgactgncgc aaaggaggtt 120 180 240 300 360 420 494 <210> 2 <211> 479 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum <220> <221> misc feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c， g， or t <220> <221> misc.feature <222> (5)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc-feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc^featurc <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g， or t <220> <221> misc^fcature <222> (108)..(108) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_featurc <222> (134)..(134) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> miscwfeature <222> (147)..(147) <223> n is a, c， 2, or t <220> <221> mi sc一feature <222> (164)..(164) <223> n is a， c， g， or t -4- 201026239

<220> <221> misc feature <222> (232丁.，(232) <223> n is a, c， g， <220> <221> misc feature <222> (281)..(281) <223> n is a, c, g, <220> <221> misc feature <222> (337)..(337) <223> n is a, c, g, <220> <221> misc feature <222> (344)..(344) <223> n is a， c， g， <220> <221> misc_feature <222> (361)..(361) <223> n is a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (375)..(375) <223> n is a, c， g， <220> <221> misc_feature <222> (378)..(378) <223> n is a， c， g， <220> <221> misc_feature <222> (400)..(400) <223> n is a, c, g, <220> <221> misc.feature <222> (404)..(404) <223> n is a, c， g， <220> <221> misc feature <222> (407T..(407) <223> n is a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (413)..(414) <223> n is a， c, g, <220> <221> misc_feature <222> (419)..(419) <223> n is a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (422)..(422) <223> n is a， c， g， <220> <221> misc_feature <222> (427)..(427) <223> n is a, c, g， <220> <221> misc.feature <222> (43〇T..(431) <223> n is a, c, g, or t or t or t or t or t or t or t or t or t or t or t or t or t or t or t 201026239 <220> <221> misc_feature <222> (433)..(434) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> raisc_feature <222> (449)..(449) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc一feature <222> (454)..(454) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc.feature <222> (456)..(456) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222〉 (459)..(459) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> raisc_feature <222> (473)..(473) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 aananaaacg ccgcngttct ccgcggtgcg tgccccgtcg tcncggcagt cgcggcggcc tggggctgct ggtgtggaag agatcatggg ctttcggtgc gtccgtcntg ggatgttccg cgggagtggt gtgnatgcgc ttttggnctc ccggatcgcc accncaggct ttggcctggc gcgattcgat gcccatcgtg cctgatggcg ggctggtccc gtccggacgg cntggtggtg cgtggtggct tgagaactgg atagtggacg cgagcaagac ngggtttcct ttgattcctc ttcttgctgt tgatttcgaa tcgaactcta tttttantgt ttgnttccat cgttttgtga ncattttaat gtgangantt gtcctctggg aatttgctan gaangancct tgnngccang cncaccntgn ngnncctgtt gcctgcaang gcgnanggng gaagcccttg canccagaa <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Synthesized <400> 3 gctggatcac ctcctttc ^ > > > 1A 1i IX 1A 2ΛΖ22 < V < < 4 18

DNA

Unknown <220> <223> Synthesized <400> 4 ctggtgccaa ggcatcca <210> 5 <211> 22 <212> Wk 201026239 <213> Unknown <220> <223> Synthesized <400> 5 ctacggcaag gcgacgctga eg

Claims (1)

1. 201026239 餐 七、申請專利範圍： 1. 一種嬰兒配方，其包含蛋白質源、脂肪源、碳水化 合物源及龍根雙歧桿菌（5. /ongw/n) AH1205。 2. 根據申請專利範圍第1項之嬰兒配方，其中該嬰兒 配方包含以每公克嬰兒配方計約lxlO4 cfu至約lxl01() cfu 之範圍內的龍根雙歧桿菌AH 1205。 3. 根據申請專利範圍第1項之嬰兒配方，其中該龍根 〇 雙歧桿菌AH1205爲活菌。 4. 根據申請專利範圍第1項之嬰兒配方，其中該龍根 雙歧桿菌AH1 205爲非活菌。 5. 根據申請專利範圍第1項之嬰兒配方，其進一步包 含額外的益生菌。 6. 根據申請專利範圍第5項之嬰兒配方，其中該額外 的益生菌包含鼠李醣乳酸桿菌GG ( LGG )。 7 .根據申請專利範圍第1項之嬰兒配方，其進一步包 β 含益菌生（prebiotic )。 8. 根據申請專利範圍第7項之嬰兒配方，其中該益菌 生係選自乳酮糖、葡萄寡糖（gluco-oligosaecharide )、 菊糖、聚葡萄糖（polydextrose}、半乳寡糖（galacto-oligosaccharide )、果寡糖（fr u c t ο - ο 1 i g 〇 s a c ch ar i d e )、 異麥芽寡糖（isomalto-oligosaccharide)、大豆寡醣、乳 果寡糖（lact〇sucr〇se)、木寡糖（xylo_olig〇saccharide) 及龍膽寡糖（gentio-oligosaccharide)。 9. 根據申請專利範圍第1項之嬰兒配方，其進一步包 201026239 含至少一種長鏈聚不飽和脂肪酸（lcpufa ) ^ 10·根據申請專利範圍第1項之嬰兒配方，其進一步包 含花生四烯酸（ARA )及二十二碳六烯酸（DHA)。 U.—種兒童營養產品，其包含蛋白質源、脂肪源、 碳水化合物源及龍根雙歧桿菌AH 1205。 12· —種減少或預防在嬰兒或兒童中發炎之方法，其 包含以龍根雙歧桿菌AH1205投予嬰兒或兒童。 13.根據申請專利範圍第12項之方法，其中以減少或 參 預防發炎來改善過敏。 I4·根據申請專利範圍第12項之方法，其中以減少或 預防發炎來改善氣喘。 I5·根據申請專利範圍第12項之方法，其中以減少或 預防發炎來改善選自腹瀉、呼吸感染及中耳炎之疾病。 -2-