TW201009337A - Analytical method to monitor vaccine potency and stability - Google Patents

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201009337 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於利用液相層析法評估疫苗是否已隨時間降 解之方法。本發明描述之方法亦關於利用液相層析法以評 估給定檢體中之抗原之效價。 【先前技術】 • 在疫苗製造之生產過程中有許多品質控制之考量。病 毒、細菌或寄生蟲疫苗必須從各批之間可能在許多方面有 所不同之培養物中調製。可能出現的品質控制問題包括如 何確保新批次之疫苗具有必要程度之效價。相關的問題包 括庫存批次或批量之抗原或疫苗之存量是否仍維持該必要 程度之效價或在分銷或使用之前已隨時間降解。 對每一批製造疫苗進行臨床試驗是不切實際的。該等 試驗不僅曠時費資，還需要不必要之人或動物測試。取而 • 代之的是，疫苗製造商依賴參照疫苗，以供新生產批量之 疫苗可與之比較。該參照疫苗通常儲存於非常低溫之條件 下（例如-70°C )，以減少或消除任何疫苗降解作用。 當該參照疫苗之效力經由人或動物之臨床試驗直接或 間接建立後，可利用活體外或活體內試驗建立其效力與其 效價之間的相關性。該新生產疫苗批次之相對效價可透過 例如ELISA試驗以與該參照疫苗之相對效價比較。同樣 的，該參照疫苗或該新生產疫苗批次之安定性變化亦可藉 由ELISA試驗監測。 201009337 然而，依賴參照疫苗來確保新生產疫苗之品質仍然存 在一些問題。如上所述，該參照疫苗可隨時間降解，因此 必需週期性地利用耗費時間之新的人或動物臨床試驗來重 新建立。即使該參照疫苗降解緩慢，政府法規要求通常強 制規定該參照疫苗物質之有效期限。因此，定期定性疫苗 或重新定性參照疫苗可能曠時費資，因爲定性通常需要人 或動物試驗以建立疫苗之效力。 另外，當使用免疫基底之試驗來評估多價疫苗之效價 @ 時可能產生抗原之間之干擾。該干擾會使新製造之多價疫 苗之相對效價評估變得困難或不可能。 因此，有避免這些問題之品質控制方法之需求。 【發明內容】 本發明提供一種方法，藉由該方法可利用液相層析法 測量抗原或疫苗之安定性或效價。 在一實施態樣中，本發明關於一種測量抗原安定性之 © 方法’該方法包含：i)收集第一檢體中所含之抗原的第 一液相層析測量値，該第一檢體係自抗原來源製備；ϋ) 收集第二檢體中所含之抗原的第二液相層析測量値，該第 二檢體係自該抗原來源製備；及iii)定量該第二液相層 析測量値相較於該第一液相層析測量値之變化，藉以測量 抗原之安定性。內標準物可被加至該檢體。該等測量値可 源自紀錄波峰，該波峰顯示抗原及內標準物之光吸收或螢 光散射之量。該第一液相層析測量値可爲該第一檢體中之 -6 - 201009337 抗原之波峰下面積對該第一檢體中之內標準物之波峰下常 態面積之比；且該第二液相層析測量値可爲該第二檢體中 之抗原之波峰下面積對該第二檢體中之內標準物之波峰下 常態面積之比。該抗原來源可爲疫苗批量。該檢體可藉由 令取自該疫苗批量之檢體中的抗原與佐劑分離而加以製備 。該抗原可被沉澱於取自該疫苗批量之檢體中。或者，該 佐劑可被沉澱於取自該疫苗批量之檢體中。 • 在另一實施態樣中，本發明關於一種測量疫苗批量效 價相對於對應參考疫苗之效價之方法，該方法包含i)收 集第一檢體中所含之抗原的第一液相層析測量値，該第一 檢體係自該參考疫苗製備；ii)收集第二檢體中所含之抗 原的第二液相層析測量値，該第二檢體係自該疫苗批量製 備；Hi)比較該第二液相層析測量値與該第一液相層析測 量値，藉以決定該疫苗批量效價相對於該對應參考疫苗之 效價。內標準物可被加至該檢體。該等測量値可源自波峰 Φ ，該波峰顯示抗原及內標準物之光吸收或螢光散射之量。 該第一液相層析測量値可爲該第一檢體中之抗原之波峰下 面積對該第一檢體中之內標準物之波峰下常態面積之比； 且該第二液相層析測量値可爲該第二檢體中之抗原之波峰 下面積對該第二檢體中之內標準物之波峰下常態面積之比 。該第一檢體及該第二檢體可分別藉由令取自該參考疫苗 及該疫苗批量之檢體中的抗原與佐劑分離而加以製備。該 抗原可被沉澱於取自該參考疫苗及該疫苗批量之檢體中。 或者，該佐劑可被沉澱於取自該參考疫苗及該疫苗批量之 201009337 檢體中。 在另一實施態樣中，本發明關於一種定性疫苗批量爲 參考疫苗之方法，該方法包含i)收集第一檢體中所含之 抗原的第一液相層析測量値，該第一檢體係自參考疫苗製 備；ii)收集第二檢體中所含之抗原的第二液相層析測量 値，該第二檢體係自該疫苗批量製備；iii)比較該第二液 相層析測量値與該第一液相層析測量値，藉以決定該疫苗 批量效價相對於該對應參考疫苗之效價；其中當該第二液 _ 相層析測量値係至少與該第一液相層析測量値相同時，該 疫苗批量被定性爲參考疫苗。 在另一實施態樣中，本發明關於一種再定性參考疫苗 之方法，該方法包含i)收集第一檢體中所含之抗原的第 一液相層析測量値，該第一檢體係自抗原來源製備；ii) 收集第二檢體中所含之抗原的第二液相層析測量値，該第 二檢體係自該抗原來源製備；及iii)定量該第二液相層 析測量値相較於該第一液相層析測量値之變化，藉以測量 @ 抗原之安定性；其中該抗原來源係先行定性之參考疫苗， 且當該第二液相層析測量値係至少與該第一液相層析測量 値相同時，該參考疫苗被再定性。 本發明之詳細說明 本發明提供一種利用液相層析法測量抗原或疫苗之安 定性或效價之方法。在一實施態樣中，本發明採用液相層 析法以觀察或監測一些抗原來源中之抗原有無任何隨時間 -8- 201009337 降解之情形。在另一實施態樣中，本發明採用液相層析法 以比較來自一來源之抗原效價與來自另一來源之抗原效價 〇 抗原來源可來自疫苗生產過程之任何階段。因此，抗 原來源可爲在培養過程中之物質。該抗原來源亦可爲已達 到細胞、寄生蟲或病毒密度之物質，以使得該產量被視爲 足以認定該培養已完成或最佳化。該抗原來源可自該培養 Φ 物濃縮或收集。或者，該抗原來源可爲來自該培養物之萃 取物或該培養物之部分或完全純化之成分。該抗原本身可 爲活的、活減毒或不活化的。該抗原之來源亦可爲部份或 完全完成之疫苗產物。該抗原來源可爲生產爲終形式及組 成物之儲存或終容器中之生物產物；可爲已經裝瓶、密封 、包裝及標示之產品；或上市銷售之完成產品。 來自相同來源之抗原代表所有因爲彼之均一性而可被 群組在一起之抗原。來自相同來源之抗原僅包括一培養批 • 量之抗原之單一容器中之物質。或者，來自相同來源之抗 原可包括已經被均勻混合在一起之多個批量之培養抗原， 或從分開批量之培養抗原製備且在個別包裝之前之調配期 間被均勻混合在一起之調配疫苗。單一均勻批量之培養物 質可被分割以製備分開之疫苗批量、批次或序列。從該培 養物質之不同分割部分製備之個別包裝之疫苗仍可被視爲 含有來自相同來源之抗原，只要它們的製劑係以相同或類 似之方式以相同或類似之物質製備。 不同之抗原檢體可來自相同來源但不同之製備階段。 -9- 201009337 舉例來說，一半培養批量之抗原可被收集和儲存，而另一 半經處理直到完成疫苗產品之最終階段。如下面進一步討 論，來自任一處理階段之抗原之效價或安定性可藉由本發 明描述之技術測量。來自疫苗產製過程之不同階段之抗原 檢體可被使用，只要相對抗原效價經過測量。事實上，當 欲測量的是相對抗原效價時，來自一來源之抗原檢體可與 來自另一來源之抗原檢體比較，且該二個檢體可來自疫苗 產製過程之相同或不同階段。然而不同的是，當欲測量抗 原安定性時，較佳的是使用來自相同來源且來自相同產製 過程階段之物質。 在進行液相層析法時，檢體被注入至固相中。該檢體 (或液相層析檢體）通常被製備爲液相檢體，如此才能盡 可能均勻地進入該固相中。相對於該固相之體積或通過該 固相之移動相之量而言，該液相層析檢體之體積通常很小 。該液相層析檢體之體積通常不超過該固相體積之5%， 且通常不超過該固相之1 %或2%。此處所使用之「液相」 及類似用語係指非氣體且非固體之液體物質。 在液相層析檢體中之成分（包括抗原或任何內標準物 )與固相結合。在進行液相層析方法之期間，藉由使用二 或多種液體之溶劑梯度，使該液體移動相在通過該固相時 改變。此梯度差異性地改變該液相層析檢體中之成分對該 固相之結合親和性。該梯度允許該檢體在該固相上分開， 以提供在不同的時間收集該檢體之組成部分（或餾份）。 因此，該液體移動相可被最佳化以造成該抗原或任何使用 201009337 之內標準物與該檢體內之其他成份分開通過該固相。 在本發明之一實施態樣中，該液相層析技術採用管柱 層析方法。該方法較佳地包括一幫浦和一光源及偵測器， 該幫浦導致該移動相以一致速率通過該固相，該光源及偵 測器係用於觀察及記錄通過及流出該固相之檢體餾份中之 光譜學變化（例如吸收、螢光、磷光等）。在本發明之一 實施態樣中，該液相層析法採用高壓液相層析法（HPLC ，亦稱爲高效液相層析法）。然而，技藝人士所熟悉之其 他層析技術亦可被應用於本發明。液相層析檢體之餾份在 不同的時間點從固相中排出，因爲溶劑梯度導致移動相之 組成逐漸改變。與液相層析裝置配合之偵測器觀察任何給 定時間點從該固相排出之餾份是否具光譜學活性（例如吸 收光、螢光或磷光等）。具光譜學活性之餾份在層析圖上 產生一波峰（也就是從固相排出之光譜活性物質之紀錄； 見圖1至4、圖7至10、12和13)。對應抗原之波峰可 • 如本發明描述之方式被使用，以評估給定檢體中之抗原安 定性或效價。 在本發明之一態樣中，液相層析法係用於測量抗原之 安定性。抗原之安定性可藉由觀察光譜層析圖中之變化而 加以測量，該光譜層析圖係得自該抗原隨時間之液相層析 分析。測量安定性需要至少二個來自相同來源但不同時間 之抗原之液相層析測量値。第一測量値係於第一時間測量 ，然後爲在第二時間取得第二測量値。該等測量値可能相 隔數小時、數天、數月或數年測量》然而，爲了獲得安定 -11 - 201009337 性之測量値，該液相層析測量必須以相同之方式進行，且 必須取自源於相同抗原來源之液相層析檢體，較佳爲處理 之相同階段。較佳的是’各液相層析檢體均進行重複液相 層析測量，以獲得正確之測量値。 當無法獲得具有定量濃度或量之抗原之外標準物時， 必須使用內標準物（I.S·)以供比對才可測量抗原安定性 之變化。使用內標準物得以測量相對安定性：相對安定性 係指在一時間點之一檢體來源中之抗原之量相對於在另一 時間點之相同來源中之抗原之量。在該過程中，第一液相 層析檢體係從包括內標準物之抗原來源製備。該內標準物 產生一液相層析信號，該信號不干擾來自抗原之液相層析 信號。該內標準物之波峰面積係根據用於製備該液相層析 檢體之內標準物之重量進行常態化，且抗原對內標準物之 常態波峰面積比（NPAR)可被記錄。計算NPAR之公式 如下： NPAR=[(抗原之波峰面積）/ (I.S.之波峰面積）]x ( I.S. 之重量）/ ( I.S.之理想重量） 「I.S.之重量」係指用於製備該檢體之內標準物之實 際測量重量；「I.S.之理想重量」係指使層析圖具有與抗 原波峰面積類似或接近數量級之不飽和波峰面積之內標準 物之常態重量。此處所使用之「NPAR」及「重量常態波 峰面積比」係同義詞。NPAR及所有其他本發明描述之波 201009337 峰面積比係指.抗原產生之曲線下面積與內標準物產生之曲 線下重量常態面積之比。 較佳的是，紀錄從抗原來源製備之第一液相層析檢體 之NPAR之重複測量値以獲得正確的測量値。經過一段時 間之後（數小時、數天、數週、數月或數年），紀錄從該 相同抗原來源製備之第二液相層析檢體之NPAR之重複測 量値以獲得正確的測量値。較佳的是，液相層析檢體係於 Φ 使用之1至2天內製備。由於抗原波峰與抗原安定性直接 相關，該二個液相層析檢體之NPAR値可被用於決定該抗 原來源是否安定。隨時間經過仍顯安定之NPAR値表示抗 原來源並未降解。相反的，隨時間下降之NPAR値表示在 該抗原來源中之抗原係經降解。 此監測疫苗安定性之液相層析方法可被用來例如監測 新生產批量（或批次）之抗原或疫苗或參照疫苗之安定性 〇 • 本發明亦提供一種利用液相層析法以測量來自一些抗 原來源之抗原之效價之方法。不論是從培養批量收集之未 完成抗原原料或已完成之疫苗，測量抗原效價都是重要的 。在前例中，較佳的是在投入更多資源（例如材料、人力 或設備時間）至該材料之前知道原料之抗原效價，或計算 生產所欲強度或效價之終產物需要之量。在後例中，已完 成之疫苗產品除非顯示具有足夠效價否則無法發佈供配送 或銷售。 申請人在本發明中令液相層析效價測試成爲可行，該 -13- 201009337 測試比較從給定抗原來源製備之檢體之液相層析測量値與 從參照來源獲得之液相層析測量値。新鮮批量之疫苗效價 通常根據參照疫苗之效價加以測量。參照疫苗係已直接或 間接顯示對人或動物有效或具免疫性之疫苗。比較性效價 測量値亦可在尙未製成終疫苗產品之抗原與該參照疫苗之 間進行。或者，尙未製成終疫苗產品之抗原可與參照抗原 (或主要抗原標準物）而非參照疫苗比較。「參照抗原」 可指在生產過程中任何階段之抗原來源，該來源已知具有 @ 足以供進一步處理至終疫苗生產之量或品質之抗原。該「 參照來源」可爲該參照疫苗或該參照抗原。 如此處所使用，參照疫苗係指主要參照物或工作參照 物。主要參照物係一效價直接或間接與宿主動物免疫性相 關之參照物。主要參照物在活體外試驗可被用來作爲工作 參照物以測得相對效價。該主要參照物亦可被用來建立用 於再定性試驗中之系列產物之相對效價及建立工作參照物 之相對效價。主要參照物之非限制性實例包括：（1 )疫 Q 苗或菌苗之完整系列；（2)保護性免疫原或抗原之純化 製劑；或（3)微生物之不含佐劑之收集培養物。工作參 照物係用於活體外試驗以釋放系列產物之參照製劑。工作 參照物之非限制性實例包括：（1 )主要參照物；或（2 ) 根據動植物健康檢疫局（Animal and Plant Health Inspection Service)可接受之方式製備及定性以用來作爲 參照製劑之系列產物。 經過若干年之後參照疫苗通常失去它們作爲「參照疫 -14- 201009337 苗」之證明，因此需要被再建立爲「參照疫苗」。再建立 (或再定性）參照疫苗可藉由例如證明效用而加以進行。 然而如本發明所討論的，本發明提供另一種參照疫苗可藉 以被再定性之方法。 如上述測量安定性之例中，當無法獲得具有已知量或 濃度之外標準物以進行相對效價測量時採用內標準物。相 對效價測量提供一抗原來源之抗原效價相對於參照來源中 φ 之抗原效價。由於抗原波峰與存在該抗原來源中之抗原之 量直接相關，因此疫苗批量之效價可藉由比較從抗原來源 製備之液相層析檢體之NPAR與從參照來源製備之液相層 析檢體之NPAR而加以測量。具有與參照來源相同或更高 NPAR値之抗原來源具有供進一步處理（如在未完成產品 之例中）或供銷售/上市（如完成產品之例中）所必須之 效價程度。 當可獲得具有已知量之抗原之外標準物時，從任何抗 # 原來源製備之液相層析檢體之測量値可被用來決定抗原之 量，無須使用內標準物。該定量提供該抗原來源之效價或 安定性之測量値。在該例中，使用不同濃度之外標準物之 回歸分析可被進行以找出該抗原之液相層析波峰面積與該 抗原之濃度（或量）相關之圖形化曲線。在進行回歸分析 之後，存在於任何抗原來源中之抗原之濃度（或量）可藉 由測量存在於從該抗原來源製備之液相層析檢體中之抗原 之液相層析波峰面積而加以決定。存在於檢體中之抗原之 濃度（或量）之實際値與效價相關。存在於檢體中之抗原 -15- 201009337 之濃度（或量）之實際値的變化與安定性相關。如上所述 ，較佳之液相層析檢體係於使用1至2天內製備。 藉由使用蛋白質化學領域所熟知之技術，可從抗原來 源製備液相層析檢體。抗原來源可經過物理（例如離心、 超音波化等）或化學處理（鹽誘發沉積、pH之變化）以 製備該液相層析檢體。較佳的是，該處理之進行不致造成 抗原來源內之抗原之任何降解。舉例來說，可在水浴中進 行超音波化以防止加熱及其導致之檢體降解。 各種內標準物可被使用。較佳的是，該內標準物係安 定且從液相層析檢體被製備開始直到該檢體被注入液相層 析裝置之前不會產生任何變化。較佳之內標準物亦在獨特 時間從管柱中洗脫出來，遠離該抗原波峰之任何部分（也 就是不與其他物質共洗脫）。 下列實施例僅供說明目的，並不意圖限制本發明之範 圍。 【實施方式】 實施例 實施例1-犬新孢子蟲疫苗 下列描述一種被發展以定量不活化犬新孢子蟲疫苗中 之抗原量之逆相高效液相層析（HPLC )方法。該方法利 用梯度洗脫C-18管柱，並以210奈米之UV光檢測。利 用內標準物定量抗原之量以決定存在於疫苗中之抗原之相 對量。該方法經過專一性、線性、正確性和精確性實驗確 -16- 201009337 效。該HPLC試驗得到之結果證實與ELISA相對效價試驗 獲得之結果相關° 1.1苯硫噠唑（FBZ)內標準物儲存溶'液製備 由於無法取得用於定量該抗原蛋白質之外標準物，因 此利用內標準物定量抗原蛋白質之量。苯硫噠哩（FBZ) 內標準物儲存溶液之製備係藉由正確坪取50晕:克之苯硫 • 噠哩至50毫升之量瓶中。將該苯硫噠唑溶解於5毫升之 二甲基甲醯胺（DMF，HPLC等級）中。該FBZ/DMF溶液 經甲醇（HPLC等級）稀釋至50毫升之體積並混合均勻 1.2 HPLC檢體製備 犬新孢子蟲疫苗（德拉瓦州米爾斯波羅市英特威公司 )檢體係經磁力攪拌。在攪拌時，量吸4.0毫升之疫苗至 9 15毫升之離心管，接著加入2.0毫升之甲醇（HPLC等級 )。在蓋上離心管蓋子並均勻混合內容物後，該混合物於 保持在約20至25 °C之水浴中經超音波處理10分鐘，然 後以3000 rpm離心10分鐘。將1〇〇微升之苯硫噠唑內標 準物儲存溶液加入5毫升之量瓶中，並以該檢體之上清液 稀釋至總體積5毫升後混合均勻。 1.3 HPLC分析程序 HPLC係於HPLC裝置上進行，該儀器配備Agnent -17- 201009337 1100 HPLC 幫浦、Agilent 1100 HPLC 自動採樣器、

Agilent 1 100 HPLC UV 檢測器及 Agilent ChemStation HPLC 資料取得系統 e Agilent Zorbax Eclipse C18 HPLC 管柱被用於檢體分離（150x4.6毫米內徑，5微米平均顆 粒大小）。 管柱維持在30°C，交替注入100微升之檢體和空白 移動相B (含1毫升/升三氟乙酸（TFA，HPLC等級） 之HPLC等級乙腈）以進行管柱預平衡。檢體被注入以作 @ 爲預平衡檢體，直到五次重複檢體注射產生<3 %之波峰面 積比（PAR，新孢子蟲抗原/苯硫噠唑）之相對標準差百 分比（％RSD )。抗原係以2 1 0奈米之UV吸收値檢測。 每次注入檢體後注入（跑）移動相B，以防止檢體滯留。 當使用新管柱時，多次平衡注射被發現是必要的。 在注入100微升之檢體或空白物至管柱後（不論是預 平衡檢體或是管柱平衡後所注入之檢體），根據表1以流 速1毫升/分鐘之移動相梯度（A:含1毫升/升三氟乙酸 © (TFA，HPLC等級）之純水（ASTM I型或相同等級）； B :含1毫升/升TF A之HPLC等級乙腈）洗脫檢體或空白 物。三氟乙酸被加入至移動相以降低pH値並作爲離子對 反應劑。 -18- 201009337 表1 :犬新孢子蟲之洗脫梯度 時間（分鐘） 移動相A百分比 移動相B百分比 0 70 30 2 55 45 — 10 50 50 15 10 90 20 10 90 21 70 30 25 70 30 犬新孢子蟲抗原之滯留時間大約是3.7分鐘。苯硫噠 唑內標準物之滯留時間大約是5.0分鐘。該抗原波峰之滯 留可藉由改變移動相B之初速率來調整（例如較快速率縮 短該抗原波峰之滯留時間）。該苯硫噠唑波峰之滯留可藉 由改變移動相中TFA之濃度來調整（例如較高濃度之 TFA增加FBZ波峰之滯留時間）。 抗原蛋白質波峰之定量可藉由使用內標準物（苯硫噠 • 唑）達成，該結果可被報告爲波峰面積比或苯硫噠唑相等 物之濃度。這是必要的，因爲無法取得純化外標準物。苯 硫噠唑重量常態波峰面積比係利用下式計算： 波峰面積比=[(犬新孢子蟲抗原之波峰面積）/ (FBZ之 波峰面積）]x(FBZ之重量毫克/50) 「FBZ之重量毫克」係指用來製備該HPLC檢體之 FBZ以毫克測量之重量。或者，抗原之定量可利用下式以 -19- 201009337 苯硫噠唑相等物之濃度單位表示： 毫克/毫升之FBZ相等物=[(波峰面積比xl毫克/毫升）X (0.1 毫升）]/5 毫升 xO.65 ) 1.4 HPLC識別抗原及苯硫噠唑內標準物 爲了決定哪一個波峰是與該抗原有關之波峰，利用預 備性梯度HPLC方法以分離在該犬新孢子蟲疫苗中發現之 @ 大部分成份。收集各波峰或波峰群之餾份以進行ELISA 或聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE )試驗。只有一個餾份被 發現顯示ELISA陽性抗原之反應。 接著依據上表1所述調整HPLC條件，以最佳化此波 峰之分離及分辨率。利用最終HPLC條件（但不含FBZ標 準物）之犬新孢子蟲疫苗之代表性層析圖係顯示於圖1。 在ELISA試驗中顯示反應之HPLC餾份之代表性HPLC層 析圖係顯示於圖2，該餾份係利用表1之洗脫梯度分離。 φ 因此，利用該提議之HPLC條件將該感興趣之波峰在約 3.7分鐘時洗脫出來。利用上述最終HPLC條件所得到之 FBZ內標準物之代表性層析圖係顯示於圖3。因此，該 FBZ內標準物在大約5分鐘時洗脫出來。圖4顯示根據上 述方法製備之犬新孢子蟲疫苗檢體之代表性層析圖，該檢 體加入FBZ且利用如上述之管柱及梯度進行HPLC管柱層 析。該Agilent ChemStation HPLC資料取得系統分別在大 約3.7及5分鐘時提供該抗原波峰及該FBZ波峰之曲線下 -20- 201009337 面積値。 這些層析圖證明該等與犬新孢子蟲抗原及內標準物（ 苯硫噠唑）有關之感興趣之波峰係適當地和與該疫苗中其 他成份有關之波峰互相分離。因此，該提議之方法對其意 圖用途具專一性。 1.5 HP LC波峰面積比與抗原濃度之間之線性相關 利用不同濃度之犬新孢子蟲抗原進行線性試驗。製備 抗原濃度爲1%、2%、3%、4%及5% (體積/體積）之於 水中之溶液，其分別對應當其出現在疫苗中時約40至 2 0 0%之抗原濃度。該等溶液係根據該提議之方法製備及 進行HPLC分析。 利用 Microsoft® Office Excel 2003 SP2 中之線性迴 歸功能，進行以波峰面積比爲偵測器反應與抗原濃度比較 之線性迴歸分析，以產生下列統計資料：積差相關係數（ r) 、y截距、斜率和y截距之上下95 %信賴區間。 資料摘列於表2和圖5。相關係數（r )經測定爲 0.998 »該上下95%信賴區間包括零，表示該y截距與零 並無顯著差異。因此，本發明描述之HPLC方法提供抗原 濃度與波峰面積比之間之直接線性相關。 -21 - 201009337 表2:以測量之波峰面積比爲偵測器反應與犬新孢子蟲抗 原濃度之線性試驗所獲得之結果，採用該提議方法中具體 說明之層析條件 新孢子蟲濃縮 波峰 預測波峰 抗原百分比 面積比1 面積比2 1.0% 0.250 0.2 16 2.0% 0.489 0.505 3.0% 0.753 0.794 4.0% 1.080 1.083 5.0% 1.398 1.371 回歸統計資料 相關係數（R) : 0.998 斜率：0.289/zV· s Y 截距：-0 · 0 7 2 /z V · s 丫截距95%信賴下界：-0.190//¥.3 丫截距95%信賴上界：0.046“¥.3 1波峰面積比係以平均（n = 2 )檢體測量，藉由將該犬新孢 子蟲抗原波峰之波峰面積除以苯硫噠唑內標準物之波峰面 積。 2預測波峰面積比係指落在個別％新孢子蟲濃縮抗原値之 回歸曲線上之比値。 1.6 HPLC波峰面積比與以ELISA測量之抗原效價之間的 線性相關 藉由關聯波峰面積比與利用標準ELISA試驗所測量 之相對效價値，以評估HPLC測試方法正確偵測相對效價 -22- 201009337 之能力。此試驗採用先前已經受到緊迫以誘發降解之犬新 孢子蟲疫苗之檢體。檢體利用熱、酸、鹼、超音波及冷凍 /解凍循環加以緊迫。疫苗之非緊迫檢體亦進行分析以作 爲比較之用。 正確性試驗之結果摘列於表3。該提議之HPLC方法 及ELISA效價試驗之間的相關性曲線顯示於圖6。該提議 之方法能區別該受到緊迫之檢體，且顯示與該ELISA效 # 價試驗具有合理的相關性（r2 = 0.95 )。因此，該提議之 方法對其意圖用途而言似乎具有足夠之正確性。 表3:正確性試驗之結果及利用該提議之方法及EliSA試 驗分析緊迫檢體之比較 緊迫條件 利用提議方法與未 經緊迫之疫苗比較 之抗原百分比 由 ELISA 測定之 相對效價 m 0% NA1 酸 43% NA1 經中和之鹼 0% NA1 煮沸30分鐘 43% NA1 超音波30分鐘 1 1 % 0.35 經中和之酸 65% 0.60 冷凍/解凍6個循環 1 0 6 % 1.10 非緊迫 1 0 0 % 1.00 相關性回歸統計資料 相關係數（R) : 0.95 斜率：1.2 2 Y 截距：-0.23 -23- 201009337 P 値：0.03 1無法計算相對效價，因爲資料點不足、pH條件不相容或 檢體完全降解。 1.7 HPLC方法之精確性 精確性試驗係根據該提議之方法，藉由分析犬新孢子 蟲疫苗之批量加以進行。系統中之變異性（系統精確性） 藉由注射5次重複之相同檢體溶液至HPLC以決定。從特 定疫苗批量製備檢體之差異性（試驗內精確性）係藉由製 備及分析6次重複之該相同批量之疫苗而加以決定。操作 員之差異性（中間精確性）係藉由二位分析員在不同天及 不同之HPLC管柱上進行該試驗內精確性試驗以決定。 該系統精確性試驗之結果顯示於表4。該二位分析員 重複注射該相同檢體溶液之RSD値百分比爲1.1 %及2· 7% (n = 5 ) 〇 -24- 201009337 表4:以該提議方法中具體說明之方式分 溶液注射所得到之系統精確性之結果 Λ ^ —7~—~~~~面積比 对祈島 分析員2 0.85 1 0.798 0.867 0.77 1 0.876 0.8 10 0.876 0.787 0.866 0.828 0.87 0.80 1.1% 2.7% 注射__ 1 2 3 4 5 _

平均： %RSD ： 該試驗內和中間精確性實驗之結果係顯不於表5。分 析員1和分析員2對該相同批量疫苗之重複檢體製劑分別 得到2.8%和2.5%之％尺80値（11 = 6)。所有檢體製劑之 %RSD 爲 5.2% ( n=12 )。 表5:以該提議方法中具體說明之方式分析6次重複犬新 φ 孢子蟲疫苗檢體製劑所得到之試驗內和中間精確性試驗之 結果 注射 微克/毫升 FBZ相等物 分析員1 分析員2 1 26.7 25.8 2 26.7 24.1 3 27.1 25.1 4 28.7 24.8 5 27.0 25.7 6 27.6 24.8 平均： 27 25 %RSD ： 2.8% 2.5% -25- 201009337 總平均=26微克/毫升 % RSD = 5.2% 這些資料證實該提議方法對其意圖用途來說具有足夠 之系統精確性、試驗內精確性及中間精確性。 1 . 8內標準物溶液安定性 該內標準物溶液在其使用期間係安定的。雖然疫苗檢 體可能被冷凍或儲存於寒冷溫度下數天至數年，但HPLC 檢體以及該內標準物溶液較佳係於一週內，及最佳係於1 至2天內製備及使用。該內標準物在該些供本發明所描述 之HPLC分析目的之期間內係安定的。 實施例2:豬肺炎黴漿菌疫苗 一種逆相高效液相層析（HPLC)方法係經發展及確 效以定量不活化之豬肺炎黴漿菌疫苗Myco Silencer® Once (德拉瓦州米爾斯波羅市英特威公司）中之抗原量 。該方法利用梯度洗脫C-18 HPLC管柱，並以210奈米 之UV光檢測。利用內標準物定量抗原之量以決定存在於 疫苗中之抗原之相對量。該方法經過專一性、線性、正確 性和精確性實驗確效。該HPLC試驗得到之結果證實與 ELISA相對效價試驗獲得之結果相關。 2.1酞酸二丙酯（DPP)內標準物溶液製備 201009337 酞酸二丙酯（DPP )內標準物儲存溶液之製備係藉由 正確秤取50毫克之酞酸二丙酯至50毫升之量瓶中。將該 DPP經甲醇溶解及稀釋至總體積50毫升並混合均勻。此 溶液之大約濃度爲1毫克/毫升。酞酸二丙酯工作標準溶 液係藉由將1〇.〇毫升等分之DPP內標準物儲存溶液轉移 至50毫升之量瓶中，以水稀釋至總體積50毫升並混合均 勻。該工作溶液之大約濃度爲0.2毫克/毫升。 2.2 HPLC檢體製備 豬肺炎黴漿菌疫苗（德拉瓦州米爾斯波羅市英特威公 司）係經磁力攪拌。在攪拌時，量吸2.0毫升之疫苗至15 毫升之離心管。該試管接著於以大約1 5000 rpm (大 約290 00 X g)離心30分鐘。離心將該乳化液分離成二層 。在離心後，將該含水（下）層小心量吸至分開之離心管 〇 將下列量吸至5毫升之量瓶：2毫升之tris緩衝溶液 (將12.1克之tris鹼（USP等級）溶解於1升之純水（ ASTM I型），以濃縮之HPLC等級之磷酸調整至pH値 6.8)，上述之1.〇毫升之離心後之含水檢體溶液及上述 之1·〇毫升之DPP工作標準溶液。此混合液以純水（ AS ΤΜΙ型）稀釋成總體積5毫升並混合均勻。 2.3 HPLC分析程序 HPLC係於如上節1.3所述之相同的HPLC儀器上進 -27- 201009337 行，該管柱亦維持在30°C，藉由交替注射50微升之檢體 和空白之甲醇/水（1/1，體積/體積）以進行管柱預平衡。 檢體被注入以作爲預平衡檢體，直到五次重複檢體注入產 生<3%之波峰面積比（PAR，豬肺炎黴漿菌抗原/DPP)之 相對標準差百分比（％RSD )。抗原係以210奈米之UV 吸收値檢測。每次注入檢體後注入（跑）空白之甲醇/水 (1/1，體積/體積）以防止檢體滯留。當使用新管柱時， 多次平衡注入被發現是必要的。 在每次注入50微升之檢體或空白物至管柱後（不論 是預平衡檢體或是管柱平衡之後所注入之檢體），根據表 6以流速1毫升/分鐘之移動相梯度（A:含1毫升/升三氟 乙酸（TFA，HPLC等級）之純水（ASTM I型或相同等級 );B :含1毫升/升HPLC等級TFA之HPLC等級乙腈） 洗脫檢體或空白物。三氟乙酸被加入至移動相以降低PH 値並作爲離子對反應劑。 表6:豬肺炎黴漿菌之洗脫梯度 時間（分鐘） 移動相A百分比 移動相B百分比 0 70 30 5 50 50 10 50 50 15 5 95 16 70 30 25 70 30 201009337 ELISA陽性之豬肺炎黴漿菌抗原之滯留時間大約是5 分鐘。DPP內標準物之滯留時間大約是15分鐘。該抗原 波峰之滯留可藉由改變移動相B之初速率來調整（例如較 快速率縮短該抗原波峰之滯留時間）。 該抗原蛋白質波峰之定量可藉由使用內標準物（DPP )達成，該結果可被報告爲波峰面積比或DPP相等物之 濃度。這是必要的，因爲無法取得純化外標準物。DPP重 • 量常態波峰面積比係利用下式計算： 波峰面積比=[(豬肺炎黴漿菌抗原之波峰面積）/ ( DPP 之波峰面積）]x(DPP之重量毫克/50) 「DPP之重量毫克」係指用來製備該HPLC檢體之 DPP以毫克測量之重量。或者，抗原之定量可利用下式以 苯硫噠唑相等物之濃度單位表示： • 毫克/毫升之DPP相等物=波峰面積比χθ.2毫克/毫升 2.4 HPLC識別抗原及DPP內標準物 爲了決定哪一個波峰是與該抗原有關之波峰，利用預 備性梯度HPLC方法以分離在該豬肺炎黴漿菌疫苗中發現 之大部分成份。收集各波峰或波峰群之餾份以進行ELISA 或聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE )試驗。只有一個餾份被 發現顯示ELISA陽性抗原之反應。 接著如上述調整HPLC條件，以最佳化此波峰之分離 -29- 201009337 及分辨率。在這些條件下，該感興趣之波峰被發現在約5 分鐘時洗脫出來。利用該最終HPLC條件（但不含DPP標 準物）所得到之豬肺炎黴漿菌疫苗之代表性層析圖係顯示 於圖7。另一在相同HPLC條件下，從經分離之電泳聚丙 烯醯胺凝膠電泳亮帶溶解出之抗原物質之檢體所得到之層 析圖，在相同時間產生波峰（圖8)。從該凝膠亮帶溶解 出之物質已知代表豬肺炎黴漿菌P44抗原。 無法取得用於定量該抗原蛋白質之外標準物。因此， 利用內標準物定量在該疫苗檢體中之抗原之量。由於該疫 苗含有大量會造成拖尾峰且在該抗原蛋白質之後洗脫之蛋 白質性物質，需選擇在所有蛋白質性物質之後洗脫之內標 準物。酞酸二丙酯（DPP )係經選擇，因爲它可輕易地在 商業上取得且在層析圖中在蛋白質性物質之後洗脫，如圖 9和10所示。圖9顯示利用上面2.1至2.3節描述之 HPLC儀器及移動相梯度所得到之DPP之HPLC層析圖。 圖10顯示被製備成HPLC檢體之豬肺炎黴漿菌疫苗之 HPLC層析圖，該層析圖係利用上面2.1至2.3節所描述 之HPLC儀器及移動相梯度獲得。 這些層析圖證明該等與豬肺炎黴漿菌抗原及內標準物 (DPP)有關之感興趣之波峰係適當地和與該疫苗中其他 成份有關之波峰分離。因此，該提議之方法對其意圖用途 具專一性。 2.5 HPLC波峰面積比與抗原濃度之間之線性相關 201009337 利用豬肺炎黴漿菌濃縮抗原進行線性試驗。製備抗原 濃度爲 1 %、3 %、6 %、9 %、1 2 %、1 5 %、1 8 % 及 2 4 % (體 積/體積）之於水中之溶液（8至200 %之目標濃度）。該 等溶液係根據該提議之方法製備及進行HPLC分析。 利用 Microsoft® Office Excel 2003 SP2 中之線性迴 歸功能，進行以波峰面積比爲偵測器反應與抗原濃度比較 之線性迴歸分析，以產生下列統計資料：積差相關係數（ φ r ) 、y截距、斜率和y截距之上下9 5 %信賴區間》 資料摘列於表7和圖1 1。相關係數（r )經測定爲 0.9 9 90。因此，該提議之方法似乎對其意圖用途具足夠線 性。 表7:以測量之波峰面積比爲偵測器反應與豬肺炎黴漿菌 抗原濃度之線性試驗所獲得之結果，採用該提議方法中具 體說明之層析條件 豬肺炎黴漿菌濃 縮抗原百分比 波峰面積比1 預測波峰 面積比 1 % 0.5904 0.5801 3% 1.2759 1.2997 6% 2.5930 2.3791 9% 3.3190 3.4585 12% 4.4855 4.53 79 15% 5.6147 5.6173 18% 6.5563 6.6967 24% 8.9899 8.8555

：0.9990 回歸統計資料 相關係數（R ) -31 201009337 斜率：0.360 α V· s/%豬肺炎黴漿菌 Y 截距：0.2 2 0 // V · s 丫截距95°/〇信賴下界：0.012仁¥*3 丫截距95%信賴上界：0.42 8#乂.3 1波峰面積比係以平均（n = 2 )檢體測量，藉由將該豬肺炎 黴漿菌抗原波峰之波峰面積除以DPP內標準物之波峰面 積。 φ 2.6 HPLC波峰面積比與以ELISA測量之抗原效價之間之 相關性 2.6.1使用降解檢體之相關性 根據該提議之方法，分析先前已經受到緊迫以誘發降 解之豬肺炎黴漿菌疫苗之檢體以進行正確性試驗。未經緊 迫之疫苗檢體亦被分析以達比較之目的。這些檢體之前已 經以ELISA分析且顯示已經降解。檢體藉由煮沸及添加 各種濃度之蛋白酶K加以緊迫。未經緊迫之疫苗檢體亦 Q 被分析以達比較之目的。 在該降解試驗中獲得之結果摘列於表8。該結果證明 該提議之方法可檢測豬肺炎黴漿菌疫苗中當其降解時之變 化。 -32- 201009337 表8 :降解實驗之結果 以蛋白酶K 降解之檢體 以煮沸降解之檢體 利用提議方 利用提議方 檢體 法與未經緊 檢體 法與未經緊 迫之疫苗比 迫之疫苗比 較之抗原％ 較之抗原％ 未經處理 1 0 0 % 未經處理 1 0 0 % P K 1:16 稀釋 3 3% 煮沸 0.5分鐘 62% P K 1:8 稀釋 3 2% 煮沸 1分鐘 6 5% PK 1:4 稀釋 2 7% 煮沸 2分鐘 53% PK 1 :2 稀釋 18% 煮沸 5分鐘 4% PK 濃縮 12% 煮沸 10分鐘 3% 2.6.2使用添加標準物檢體之相關性 製備以該疫苗爲基底但不含抗原之溶液，以測試波峰 面積比與利用ELISA試驗測定之相對效價之間之相關性 。該溶液被製備以包含〇%、3.75%、7.5%及15%之豬肺炎 黴漿菌濃縮抗原。該檢體係利用實施例2所描述之HPLC 方法分析，並各自經由ELISA分析。 結果顯示於表9。含抗原之鹽水緩衝溶液之代表性層 析圖係顯示於圖12。該結果顯示與該ELISA結果具有相 對良好之相關性（r = 0.996 )，且證明在該疫苗基質中之 豬肺炎黴漿菌抗原之濃度差異可被正確決定。 -33- 201009337 表9:使用添加標準物安慰檢體之正確性試驗獲得之結果 ，以該提議方法中具體說明之方式分析 檢體 DPP相等物 毫克/毫升 得白HPLC 之相對效價 得自ELISA 之相對效價 安慰劑 ND ND ND 3.7 5 %抗原 0.439 0.48 0.44 7.5 %抗原 0.828 0.90 0.92 1 5.0 %抗原 1.444 1.57 2.01 相關係數（r ) = 0.996 ; ND =未檢測

2.6.1及2.6.2之資料證實，該提議方法正確地相關由本發 明描述之HPLC方法得到之波峰面積比與ELISA所測量之 疫苗效價。 2.7 HPLC方法之精確性 精確性試驗係根據該提議之方法，藉由分析豬肺炎黴 漿菌疫苗之批量加以進行。系統中之變異性（系統精確性 )藉由注射至少6次重複之相同檢體溶液至HPLC以決定 © 。從特定疫苗批量製備檢體之差異性（試驗內精確性）係 藉由製備及分析6次重複之該批量之疫苗而加以決定。操 作員之差異性（中間精確性）係藉由二位分析員在不同天 及不同之HPLC管柱上進行該試驗內精確性試驗以決定。 該系統精確性試驗之結果顯示於表10。該二位分析 員重複注射該相同檢體溶液之RSD値百分比爲0.73%及 1.73% ( n = 6 )。 -34- 201009337 表ι〇:以該提議方法中具體說明之方式分析5户 體溶液注射所得到之系統精確性之結果 A m -積比 注射 分析員1 分析員2 1 •一 - 1.535 1.554 2 1.558 1.563 3 1.537 1.537 4 1.534 1.562 5 1.525 1.534 6 1.540 1.492 平均： 1.54 1.54 %RSD ： 0.73% 1.73%

該試驗內和中間精確性實驗之結果係顯示於表u° 分析員1和分析員2對該相同批量疫苗之重複檢體製劑分 別得到3.3%和2.3%之％]£81)値（|1 = 6)。所有檢體製劑之 %RSD 爲 4.7% ( n=l2 )。

-35- 201009337 表11··以該提議方法中具體說明之方式分析6次重複豬 肺炎黴漿菌疫苗檢體製劑所得到之試驗內和中間精確性試 驗之結果 注射 毫克/毫升 分析員1 DPP相等物 分析員2 1 0.3 14 0.3 13 2 0.322 0.297 3 0.3 18 0.298 4 0.320 0.306 5 0.332 0.295 6 0.343 0.301 平均： 0.325 0.301 %RSD ： 3.3% 2.3% 總平均=0.3 1毫克/毫升 % RSD = 4.7% 這些資料證實該提議方法對其意圖用途來說具有足夠 之系統精確性、試驗內精確性及中間精確性。 2.8內標準物溶液安定性 該標準物溶液安定性係於環境條件中評估。在環境條 件中儲存2及8天後，根據該提議方法製備及分析標準物 溶液。該內標準物溶液在儲存8天後經顯示係安定的（ 101 %之初濃度）。雖然疫苗檢體可能被冷凍或儲存於寒 冷溫度下數天至數年’但HPLC檢體以及該內標準物溶液 較佳係於一週內，及最佳係於1至2天內製備及使用。該 內標準物在該些供本發明所描述之HPLC分析目的之期間 內係安定的。 -36- 201009337 2.9管柱清洗程序 該HPLC管柱應週期性清洗（建議在每次HPLC分析 之後），以避免佐劑及蛋白質殘留物累積在管柱上。這些 殘留物累積在管柱上會造成波峰形狀惡化及改變抗原從 HPLC管柱之回收。 爲了清洗管柱，於50°C中以2毫升/分鐘之移動相A/ 移動相B ( 5/95，體積/體積）沖洗該管柱30分鐘以移 • 除任何佐劑殘留物。接著，當該管柱維持在50°C時，注 射100微升之tris緩衝液，使用表12之洗脫梯度，流速 1毫升/分鐘（移動相A:含1毫升/升三氟乙酸（TFA， HPLC等級）之純水（ASTM I型）；移動相B:含1毫升 /升HPLC等級TFA之HPLC等級乙腈）。必要時重複該 管柱清洗程序。 -37- 201009337 表12:實施例2之清洗管柱之洗脫梯度 時間 (分鐘） 移動相A 百分比 移動相B 百分比 0 70 30 2 40 60 4 70 30 6 40 60 8 70 30 10 40 60 12 70 30 14 40 60 16 70 30 18 40 60 20 70 30 22 40 60 24 70 30 26 40 60 28 70 30 30 40 60

實施例3:於雙價疫苗中之豬環狀病毒抗原 G 在雙價PCV第2型死桿狀病毒載體·豬肺炎黴漿菌菌 苗（Circumvent® PCV 疫苗及.Myco Silencer® Once 之組 合，德拉瓦州米爾斯波羅市英特威公司）中之豬環狀病毒 (PCV)抗原係以沉積、溶解分離，並以逆相高效液相層 析（HPLC )分析。存在測試品中之PCV抗原之量係利用 內標準物定量以獲得抗原之相對濃度。該結果係以常態波 峰面積比（NPAR )表示，也就是該PCV抗原波峰與該內 標準物波峰之波峰面積比，並以該測試中之內標準物之使 -38- 201009337 用量常態化。此結果係與使用參照疫苗之結果比較，以產 生該測試品之相對效價値。 3.1酞酸（PT A )內標準物儲存溶液製備 正確秤取大約25毫克之酞酸（ACS試劑級，299.5% )至250毫升之量瓶中。接著將該PTA以移動相A (含 1毫升/升三氟乙酸（TFA，HPLC等級）之純水（ASTM I # 型））溶解及稀釋至250毫升之體積，並混合均勻以產生 濃度大約0.1毫克/毫升之溶液。 3.2 HPLC檢體製備 HPLC檢體係從豬環狀病毒疫苗第2型死桿狀病毒載 體-豬肺炎黴漿菌菌苗參照疫苗製備，三份檢體係從豬環 狀病毒疫苗第2型死桿狀病毒載體-豬肺炎黴漿菌菌苗疫 苗之疫苗生產批量製備。在各例中，藉由翻轉將20至25 C之疫苗混合均句’接著量吸4.0毫升至15毫升之離心 管。所有檢體於4°C中以29,000 X g離心1〇分鐘。檢視 該檢體以確定它們分成二層。將離心機及轉子降溫至-10 °C ’該檢體於-10 °C中以29, 〇〇〇 X g離心20分鐘。檢視檢 體以確定下層（含水層）冷凍成固體。 該檢體接著被放置於碎乾冰中以保持冷凍。各檢體之 上層以真空抽吸移除’接著讓各檢體回溫至2〇至25t：。 接著在約20至25 °C超音波化檢體5分鐘，沉浸在至少檢 體之高度。添加0.5毫升之含水80%甲醇溶液（HPLC甲 -39- 201009337 醇混合純水）至檢體，翻轉各試管以混合均勻，於4°C以 29,000 X g離心30分鐘。將液體從試管中倒出，每支試 管用乾淨的棉花棒將殘留之水分及油自試管抹除，同時小 心不要破壞團塊。 量吸2.0毫升之PTA內標準物稀釋溶液至各檢體試管 。檢體經振盪以令團塊從試管壁鬆開，在20至25 °C之水 浴中超音波5分鐘，沉浸在至少檢體之高度。如果未看見 團塊碎裂及溶解，最多重覆此過程5分鐘3次循環。該檢 體在進行HPLC分析之前被儲存於20至25°C，通常在製 備後24小時內進行HPLC分析。 3.3 HPLC分析程序 HPLC係於HPLC裝置上進行，該儀器配有Agilent 1100 HPLC 幫浦、Agilent 1100 HPLC 自動採樣器、

Agilent 1100 HPLC螢光檢測器、Agilent 1100管柱加熱 器及 Agilent EZCHROM Elite 資料取得系統。YMC-Pack Q ODS-AQ管柱（250毫米x4.6毫米內徑，5微米顆粒大小 ，12奈米孔徑大小）被用於檢體分離。管柱維持在5 0°C ，注射1〇〇微升之檢體接著注射空白移動相A (含1毫 升/升三氟乙酸（TFA，HPLC等級）之純水（ASTM I型 ))至管柱以進行預平衡。連續注入檢體以作爲預平衡檢 體，直到三次連續注射產生<5%之波峰面積比（PAR)之 相對標準差百分比（％RSD )。每次注入檢體後注射（跑 )移動相A，以防止檢體滯留。當使用新管柱時，多次平 -40 - 201009337 衡注射被發現是必要的。 一旦管柱平衡後，100微升等份之檢體被注入管柱中 ，洗脫檢體係根據表13以流速1毫升/分鐘之移動相梯度 (A:含1毫升/升三氟乙酸（TFA，HPLC等級）之純水 (ASTM I型或相同等級）；B:含1毫升/升HPLC等級 TF A之HPLC等級乙腈）達成。三氟乙酸被加入至移動相 以降低pH値並作爲離子對反應劑》感興趣之抗原波峰係 • 經由激發波長（又）280奈米及散射波長（又）350奈 米之螢光偵測。 表13:豬環狀病毒/豬肺炎黴漿菌疫苗之洗脫梯度 時間（分鐘） 移動相A百分比 移動相B百分比 0 70 30 10 50 50 15 5 95 20 5 95 21 70 30 30 70 30

顯示PCV抗原在不含內標準物及含有內標準物之 HPLC檢體中分離之液相層析圖實例分別顯示於圖12及 13。豬環狀病毒抗原之滯留時間大約是6.7分鐘。PTA內 標準物之滯留時間大約是4.3分鐘。識別對應抗原之波峰 係藉由比較從HPLC管柱中洗脫出來之物質之PAGE模式 與生產等級抗原之PAGE模式加以證實。已知與該抗原結 合之單株抗體被用來染色該PAGE凝膠以進行比較目視法 -41 - 201009337 。經胰蛋白酶消化之物質之進一步氣相層析分析（例如 MALDI-TOF)提供結論，也就是在6.7分鐘從管柱流出之 物質對應PCV抗原ORF2。 該抗原波峰之滯留可藉由改變移動相B之初速率來調 整（例如較快速率縮短該抗原波峰之滯留時間）。該PTA 波峰之滯留可藉由改變移動相中TFA之濃度來調整（例 如較高濃度之TFA增加PTA波峰之滯留時間）。 抗原蛋白質波峰之定量可藉由使用內標準物（PT A ) 達成，該結果可被報告爲PTA重量常態波峰面積比或 PTA相等物之濃度。這是必要的，因爲無法取得純化外標 準物。PTA重量常態波峰面積比係利用下式計算： =]x 比 } 積積 面面 峰 峰 波波

狀之 環 A 豬PT N1/ 積 面 峰 波 之 原 抗 毒 病

之 A 克 毫 量 重 「PTA之重量毫克」係指用來製備該HPLC檢體之 @ PTA以毫克測量之重量。 參照疫苗及各個疫苗檢體之三次重複測試檢體之 NPAR値經過平均，並計算％RSD。結果可被紀錄爲平均 NPAR値。測試品之相對效價（RP )可被計算爲該測試品 之平均NPAR與該參照疫苗之平均NPAR之比。 3.4管柱清洗程序 該HPLC管柱應週期性清洗（建議在每組測試檢體之 -42- 201009337 後），以避免殘留物累積在管柱上。這些殘留物累積在管 柱上會造成波峰形狀惡化及改變抗原從HPLC管柱之回收 〇 爲了清洗管柱，於50°C中以2毫升/分鐘之移動相A/ 移動相B ( 5/95，體積/體積）沖洗該管柱30分鐘以移 除任何佐劑殘留物。接著，當該管柱維持在50°C時’注 射100微升之移動相A，使用表14之洗脫梯度，流速1 φ 毫升/分鐘（移動相A:含1毫升/升三氟乙酸（TFA， HPLC等級）之純水（ASTM I型）；移動相B:含1毫升 /升HPLC等級TFA之HPLC等級乙腈）。必要時重複該 管柱清洗程序。 -43- 201009337

表14:實施例3之清洗管柱之洗脫梯度 時間 (分鐘） 移動相A 百分比 移動相B 百分比 0 70 30 2 40 60 4 70 30 6 40 60 8 70 30 10 40 60 12 70 30 14 40 60 16 70 30 18 40 60 20 70 30 22 40 60 24 70 30 26 40 60 28 70 30 30 40 60 ♦ ♦孝♦幸♦幸本孝本♦幸奉孝幸幸本參本孝幸亦本氺聿幸芈幸幸 ❹ 本發明指出之所有美國專利或公開美國專利申請案藉 此以參照方式被整體納入。 【圖式簡單說明】 圖1 :利用實施例1之方法得到之代表性HPLC層析 圖，HPLC檢體係從添加苯硫噠唑內標準物之前之犬新孢 子蟲疫苗製備。 圖2 :利用實施例1之方法得到之犬新孢子蟲之分離 -44- 201009337 餾份之代表性HPLC層析圖，其證實利用ELISA試驗所顯 示之反應。該約3.7分鐘之波峰對應該抗原。 圖3 :利用實施例1之方法得到之苯硫噠唑內標準物 之代表性HPLC層析圖。該約5分鐘之波峰對應該內標準 物。 圖4:利用實施例1之方法得到之犬新孢子蟲疫苗與 苯硫噠唑內標準物之代表性層析圖。該約3.7分鐘之抗原 φ 波峰與該約5分鐘之內標準物波峰之間並無重疊。 圖5 :以測量之波峰面積比爲檢測器反應與在1.0%至 5.0 %濃縮抗原之範圍內之犬新孢子蟲抗原濃度比較之圖。 圖6 :個別檢體利用實施例1之HPLC方法測定之常 態波峰面積比與ELISA效價試驗之相關性。 圖7 :利用實施例2之方法得到之代表性HPLC層析 圖，HPLC檢體係從添加DPP內標準物之前之豬肺炎黴漿 菌疫苗製備。 Φ 圖8:利用實施例2之方法得到之純化豬肺炎黴漿菌 抗原（P44)之代表性層析圖。用於此檢體中之蛋白質係 從經聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE )分離之亮帶溶出。在 約5分鐘出現之波峰對應抗原。在約15.5分鐘出現之非 常大的波峰對應該抗原位於其中之緩衝液，但該緩衝液正 常不存在於疫苗中。 圖9 :利用實施例2之方法得到之DPP內標準物之代 表性層析圖。該DPP波峰出現在約15分鐘。 圖10:利用實施例2之方法得到之豬肺炎黴漿菌疫 -45- 201009337 苗與DPP內標準物之代表性層析圖。該約5分鐘之抗原 波峰與該約15 ( 14.8 )分鐘之內標準物波峰之間並無重 疊。 圖1 1 :以測量之波峰面積比爲檢測器反應與在1.0% 至24%濃縮抗原之範圍內之豬肺炎黴漿菌抗原濃度比較之 圖。 圖12:顯示豬環狀病毒（PCV)抗原波峰在約6.7分 鐘出現於從PCV/豬肺炎徽漿菌組合疫苗檢體製備之HPLC 檢體之代表性層析圖中。此層析圖不包含任何酞酸內標準 物。 圖13:顯示豬環狀病毒（PCV)抗原波峰在約6.7分 鐘出現於從PCV/豬肺炎黴漿菌組合疫苗檢體製備之HPLC 檢體之代表性層析圖中。酞酸內標準物被加至此檢體，其 波峰出現在約4.3分鐘。 -46-

Claims (1)

1. 201009337 七、申請專利範圍： ι-®測量抗原安定性之方法，該方法包含 i) 收集第一檢體中所含之抗原的第一液相層析測量 値’該第一檢體係自抗原來源製備； Η)收集第二檢體中所含之抗原的第二液相層析測量 値’該第二檢體係自該抗原來源製備；及 iii )定量該第二液相層析測量値相較於該第一液相層 〇 析測量値之變化，藉以測量抗原之安定性。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中將內標準物加 至該檢體。 3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該等測量値係 源自記錄波峰，該波峰顯示抗原及內標準物之光吸收或螢 光發射之量。 4. 如申請專利範圍第3項之方法’其中該第一液相層 析測量値係該第一檢體中之抗原之波峰下面積對該第一檢 Φ 體中之內標準物之波峰下常態面積之比；且其中該第二液 相層析測量値係該第二檢體中之抗原之波峰下面積對該第 二檢體中之內標準物之波峰下常態面積之比。 5. 如申請專利範圍第1項之方法’其中該抗原來源係 疫苗批量。 6. 如申請專利範圍第5項之方法’其中該檢體係藉由 令取自該疫苗批量之檢體中的抗原與佐劑分離而加以製備 〇 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該抗原係沉澱 -47- 201009337 於取自該疫苗批量之檢體中。 8. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該佐劑係沉澱 於取自該疫苗批量之檢體中。 9. 一種測量物質中之抗原效價相對於對應參考物之效 價之方法，該方法包含： i) 收集第一檢體中所含之抗原的第一液相層析測量 値，該第一檢體係自該參考物製備； ii )收集第二檢體中所含之抗原的第二液相層析測量 0 値，該第二檢體係自該物質製備；及 iii )比較該第二液相層析測量値與該第一液相層析測 量値，藉以決定該物質中之抗原效價相對於該對應參考物 之效價。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中將內標準物 加至該檢體。。 1 1.如申請專利範圍第10項之方法，其中該等測量値 係源自波峰，該波峰顯示抗原及內標準物之光吸收或螢光 © 發射之量。 12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該第一液相 層析測量値係該第一檢體中之抗原之波峰下面積對該第一 檢體中之內標準物之波峰下常態面積之比；且其中該第二 液相層析測量値係該第二檢體中之抗原之波峰下面積對該 第二檢體中之內標準物之波峰下常態面積之比。 13. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該物質係疫 苗批量且該參考物係參考疫苗。 -48 - 201009337 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其 及該第二檢體係分別藉由令取自該參考疫苗及 之檢體中的抗原與佐劑分離而加以製備。 15.如申請專利範圍第14項之方法，其中 澱於取自該參考疫苗及該疫苗批量之檢體中。 I6·如申請專利範圍第14項之方法，其中 澱於取自該參考疫苗及該疫苗批量之檢體中。 Φ 17· —種定性疫苗批量爲參考疫苗之方法 含如申請專利範圍第1 3項之方法，其中當該 析測量値係至少與該第一液相層析測量値相同 批量被定性爲參考疫苗》 18· —種再定性參考疫苗之方法，該方法 專利範圍第1項之方法，其中該抗原來源係先 考疫苗’且當該第二液相層析測量値係至少與 層析測量値相同時，該參考疫苗被再定性。 ❿ 該第一檢體 該疫苗批量 該抗原係沉 該佐劑係沉 ，該方法包 第二液相層 時，該疫苗 包含如申請 行定性之參 該第一液相 -49-