TW201004647A - Novel dual targeting antitumoural conjugates - Google Patents

Description

201004647 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於雙重靶向性細胞毒性衍生物類及彼等之製 備。所描述之化合物類擁有腫瘤特異性作用，其倂有3個 功能性單元：腫瘤識別部分和腫瘤選擇性酶催化作用受質 序列。設計此等共軛物以保證血清安定性及同時於腫瘤細 胞內因酶催化作用可剪切性所造成之所欲作用。 【先前技術】 傳統之癌症化學治療係基於假設迅速增生之癌細胞比 生理組織之靜止細胞更有可能被殺死。實際上，細胞毒性 劑具有極差之特異性，其引起嚴重之不良作用。於過去30 年內，業已探究各種不同之系統以於彼等之作用位置選擇 性地投遞藥物。近來對癌細胞增生期間過度表現之典型受 體的瞭解之進展容許選擇性配體之開發，該選擇性配體當 與細胞毒性劑共軛時能優先差別地將該細胞毒性劑導向腫 瘤處。不同於一般前藥，該配體與藥物間之連接子必須於 循環中安定且於整個共軛物內化至癌細胞後應能藉由化學 機轉或酶催化作用機轉易於被剪切以使該細胞毒性劑再生 〇 近來腫瘤靶向性藥物共軛物之進展需要單株抗體、多 不飽和脂肪酸、玻糖醛酸及作爲與腫瘤有關之受體的配體 之寡狀。 現今，數種免疫共軛物正在進行臨床試驗：美泰素（ -5- 201004647

Maytansin ； Liu C., et al_, Proc. Natl. Acad. Sci., 1 996, 93, 8 6 1 8 )、艾黴素（doxorubicin ; Saleh M.N., et al., J. Clin. Oncol., 2000, 1 8，LL, 2282 )、賀癌平（herceptin ; Baselga J., et a 1., J. Clin. Oncol., 1996，14，73 7 )、力口里 刹黴素（calicheamicin ; Bross P.F., et al., Clin. Cancer Res., 2001, 7, 1 4 9 0; Chan S.Y., et al., Cancer Immunol. Immunother·, 2003，52, 243)。關於後者，滅髓瘤（

Mylotarg，即與CD33抗體連接之加里剎黴素）已於西元 2000年經美國食品藥物管理局（FDA)核准上市以供治療 急性白血病(Hammann P . R ., et a 1., Bioconjugate C h e m ., 2002, 13, L, 47)。 免疫共軛物之實際使用僅適於高度有效之藥物，因爲 有限量之抗原在腫瘤細胞之表面上被過度表現，且在未降 低結合親和性及增加免疫原性之情況下，每個單株抗體（ mAb )上僅可負載有限數量之分子。 近來，業已硏究細胞毒性劑與導向被腫瘤細胞過度表 現之不同受體的寡肽之許多共軛物作爲可能之選擇性抗腫 瘤化學治療劑。於許多寡狀中，最有希望者似乎是促生長 素抑制素（somatostatin ; Poliak M_N.，et al·, Proc. Soc.

Exp. Biol. Med., 1 998, 2 1 7, 1 43; Fuselier J. A., et al.,

Bioorg. Med. Chem. Lett·，2003，13，799)、鈴蟾肽（ bombesin; Moody T.W., et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 2 3 5 8 0 )、整合蛋白（integrin ) 中介之RGD肽類 （ WO2001 17563, Ruoslahti E., Nature reviews Cancer, 2002, 201004647 2, 83; Dickerson E.B., et al., Mol. Cancer Res., 2004, 2, 12., 663 ； de Groot F.M., et al., Mol. Cancer Ther., 2002, 1, 90 1 ; Chen X·，et al., J. Med. Chem., 200 5, 48, 1 098 ) 。通常被實驗之介於腫瘤識別部分與抗癌藥物間之化學連 接子含括腙、二硫化物及溶酶體酶之肽受質。 連接子之本性係決定共軛物之活體內命運、安定性、 溶解性及生物可利用性之必要條件。 本發明之腫瘤靶向性共軛物係由藉由間隔子（連接子 )連接在一起之3個功能性單元（腫瘤識別部分和抗癌藥 物）所製成。 以本案申請人之名提出申請之W005111064描述呈現 RGD單元且擁有抗整合蛋白活性之環肽類。以本案申請人 之名提出申請之W Ο 0 5 1 1 1 0 6 3報導經由間隔子與識別整合 蛋白之環肽類共軛之7-亞胺基喜樹鹼衍生物類。 以本案申請人之名提出申請之WO0511 04 87報導於位 置20上與整合蛋白拮抗劑共軛之喜樹鹼衍生物類。 【發明內容】 本發明之目標係硏發含有藉由新穎之分子橋連與細胞 毒性藥物連接之整合蛋白α V β 3和α V β 5識別部分的腫瘤革巴向 性共軛物，該分子橋連含有3個單元。後者（即該分子橋 連）係由間隔子、可被與腫瘤有關之酶興切的肽及自我犧 牲功能性單元所構成。 所選擇之間隔子係由含有功能上作爲剛性部分之親水 -7- 201004647 性胺基酸或雜環結構的小撓性乙二醇替代物所製造’該間 隔子賦與整個共軛物溶解性且未妨礙與受體之結合。此等 特定之間隔子係優於被廣泛使用之高分子量乙二醇’該等 高分子量乙二醇雖具有極佳之溶解性質’但是因傾向形成 阻礙結合區之環而係不適當的。 業已揭示作爲組織蛋白酶B之受質的許多含有連接子 之肽類’例如 Phe-Lys、Val-Cit ( Dubowchick G. Μ., e t al, Bioconjugate Chem., 2002, 13, 4_, 855 ) ； Gly-Phe-Leu-

Gly ( Rejmanova P., e t a 1, Biomaterials, 1985, 6，L, 45) ;D-Ala-Phe-Lys ( de Groot et al., Mol. Cancer.

Ther.，2002，1 , 901 )。某些與抗體連接之該等肽已被成功 地應用，該抗體基於本身龐大性可保護該等肽免遭血漿肽 酶之作用。然而，當吾人對應用於含有小配體之共軛物的 此等肽序列（如爲寡肽者）進行實驗時，發現該等肽序列 立即被剪切而釋出細胞毒性劑至循環中，此結果係與其他 作者所描述者相反。特別地，含有Phe-Lys連接子之肽（ S T3 2 8 0 )於所進行之各種測定中皆顯現高度不安定性。前 揭引述之Dubowchick文獻處理組織蛋白酶B不安定之二肽 配體。該等相同之作者亦於4年前發表另一有關當Cit胺基 酸於P!位置上時於P2位置上之胺基酸的影響之硏究，其結 論爲基於組織蛋白酶B之結合部位內的疏水性交互作用， 於該P2位置上之最佳胺基酸係 Val ( Dubowchick G. Μ ., et al, Bioorg. Med. Chem，，1998，8，3341)，同時含有替代 Val之Ala的類似物成爲顯著緩慢艾黴素釋出之因素，此結 201004647 果係明確地與該硏究之目的相反。 令人驚訝地，現今已發現：意想不到地於鼠科動物之 血液中顯現安定且於腫瘤細胞內可被剪切之Ala-C it或D-Ala-Cit係特別適合作爲使細胞毒性模體基序（m〇tif )於 作用部位上釋出之工具。 爲提高內肽酶之作用，自我犧牲基團之存在亦係必要 的（Carl P.L., et al, J. Med. Chem., 1981, 24, 1, 479； S ham i s M.L., et al., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 6_, 1 726 )。此等新穎之連接子更佳地保證相關共軛物所需之 藥理性質（諸如代謝安定性和於細胞內內化後細胞毒性劑 之進一步釋出）及最適溶解性和生物可利用性。再者，該 等連接子已經設計以具有適合靶向性裝置與受體結合之大 小和構型。 該等新穎之連接子係易變之分子橋，其可應用於各種 不同之配體和不同之抗腫瘤藥物。 本發明包含通式I化合物

[(L-D)„E]m-F-D-PI-SI-CT 式I 其中 L係識別α-整合蛋白受體之式Π環肽 c(R! - Arg-Gly-Asp-R2)

式II R1 係 Amp、Lys 或 Aad; R2係呈R構型之Phe、Tyr或Amp ; 201004647 D於每次出現時可爲相同或不同且係不存在或式 價基

-SP^A^SP^A^SP3-式III SP1係不存在或係R3-(CH2)q-(〇CH2-CH2)q-〇-(CH2)ci-R4 ’ R3和R4係相同或不同且係不存在或係_c〇_、_c〇〇_、 -ΝΗ-、-Ο-或式IV、式VIII或式IX之二價基 0

式IV

q於每次出現時可爲相同或不同且係獨立地〇至6之整 數； A 1係不存在或含有親水性側鏈之天然或非天然（L ) 或（D )胺基酸； SP2係不存在或係與SP1者相同； A2係不存在或係與A1者相同； SP3係不存在或係與SP1者相同； m = 1 或 2 ; 1 或 2 ; E於每次出現時可爲相同或不同且係Glu、LyS或不存 在； F係與E相同或係不存在或式X之組胺酸類似物； -10- 201004647

其中該三唑環係與D-PI-SI-CT部分連接，該羰基部分係與 含有L之部分連接且SP1係如上述所定義者； PI係由選自Ala或Cit之（L)或（D)胺基酸所構成的 天然或非天然之寡肽； SI係二價基對胺基苄氧羰基； CT代表細胞毒性基團； 彼等之互變異構體、幾何異構體、光學活性型式（諸 如鏡像異構物、非鏡像異構物及彼等之消旋型式）及前述 彼等之藥學上可接受之鹽； 唯其= 至少一個D應存在；且 當E存在且係Lys時’ E係經由其胺基部分與含有L基之 部分連接’或當E存在且係Glu時’ E係經由其羧基部分與 含有L基之部分連接。 本發明之一較佳體系係式1化合物，其中07代表喜樹 鹼衍生物。 本發明之另一較佳體系係式1化合物’其*CT代表喜 樹鹼衍生物’ R1係Amp且R2係 本發明之另一較佳體系係式1化合物’其中PI代表包 -11 - 201004647 含2或3個胺基酸殘基之寡肽。 本發明之另一較佳體系係式I化合物，其中m=l且n=l 〇 本發明之另一更佳體系係式I化合物，其中m=l且n = 2 〇 利用熟習此技藝之人士習知之標準偶合方法可製得式 I化合物。應當瞭解的是除非另有說明，在給與典型或較 佳之實驗條件（即反應溫度、時間、反應試劑之莫耳數、 溶劑等）下，亦可使用其他之實驗條件。最適之反應條件 可能會依據所使用之特定反應物或溶劑而有所變化，但是 該等條件可被熟習此技藝之人士藉由慣用之最適化過程加 以決定。 本發明進一步提供一種製備通式1化合物之方法’其 係例如藉由令下式V化合物之PI片段的自由胺基 (CT-SI-PI)-NH2 (式 V) (其中CT、SI及PI係如上所述者） 與式VI之含有疊氮化物的衍生物 L-CSP^A'-SP^A^SP^-Ns (式 V1) (其中L、SP1、A1、SP2、A2及SP3係如上所述者且11係 CO)反應。 可替代地，如述於文獻R〇stovtsev ν·ν·，et al’ Angew’ Chem., 2002, 4 1，2596，製備式I化合物可藉由令式VH化 合物 (CT-SI-PI)-CO-C^CH (式 VII) -12- 201004647 (其中CT、si及PI係如上所述者） 與式VI化合物（其中該式VI化合物中之L、SP1、A1、 SP2、A2及SP3係如上所述者’唯其r4係不存在）反應。 亦可藉由令式XI化合物 (CT-SI-PI)-D-NHCH2-C = CH (式 XI) (其中CT、SI、PI及D係如上所述者） 與式XII化合物 [(L-D)„E]m-COCH2-N3 (式 XII) (其中L、D及E係如上所述者）反應以製得式I化合物。 可替代地，可藉由令式X111化合物 (CT-SI-PI)-D-N3 (式 XIII) (其中CT、SI、PI及D係如上所述者） 與式XIV化合物 [(L-D)„E]m-CO-CH(NHD)CH2-C = CH (式 XIV) (其中L、D及E係如上所述者）反應以製得式I化合物。 含有親水性側鏈之胺基酸係指選自精胺酸、天冬醯胺 、天冬胺酸、瓜胺酸、半胱胺酸、谷胺酸、谷胺醯胺、組 胺酸、離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸之胺基酸。 喜樹鹼衍生物或細胞毒性基團係指喜樹鹼，諸如以本 案申請人之名提出申請之woo〇/5 3607和WOO 4/0 83214中所 描述之衍生物類。 本發明之另一目標係一種治療哺乳動物罹患未受控制 之細胞生長、侵襲及/或轉移指徵之方法，其包含投服治 療上有效量之上述式（I )化合物。本發明所使用之“治療 -13- 201004647 上有效量”一詞係指供治療或減輕標的疾病或指徵或顯現 可被偵測之治療功效所需之治療劑的量。 對任一化合物’起初可藉由細胞培養測定或動物（通 常爲小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、狗或豬）模式以估計治療 上有效劑量。亦可使用該動物模式以決定適當之濃度範圍 和投藥途徑。該等資訊隨後可用於決定用於人體之有效劑 量和投藥途徑。於計算人體相當劑量（HED )時，建議使 用文獻〇111(131106€〇1"111(11151^丫311(1116乂16'\¥613( 2002,11.8· Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, USA )所提供之換算表。 用於人個體之精確有效劑量將取決於疾病狀態之嚴重 性、該個體之一般健康狀態、年齡、體重及性別、飲食、 投藥時間和頻率、藥物組合、反應敏感性及對治療之耐受 性/反應等。此劑量可由慣用之實驗方法決定且係由臨床 醫師判斷。通常’有效劑量將介於0.01至100 mg/kg (較佳 地0.05至50 mg/kg )。可將組成物各別地投服至病患體內 或可將組成物與其他藥劑、藥物或激素一倂投服。 爲投服治療劑，該藥物亦可含有藥學上可接受之載體 。該等載體包括抗體和其他多肽、基因及其他治療劑（諸 如脂質體）’唯其該等載體本身不會誘發產生對接受該組 成物之個體有害的抗體且可無過度毒性地被投服。 適當之載體可爲緩慢被代謝之巨大分子，諸如蛋白質 、多糖、聚乳酸、聚羥乙酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物及 失活病毒粒子。 -14 - 201004647 藥學上可接受之載體的完全討論係見於文獻 Remington’s Pharmaceutical Sciences ( Mack Pub. Co., N. J. 1991)。 治療性組成物中的藥學上可接受之載體可額外地含有 液體，諸如水、鹽水、甘油及乙醇。另外，該等組成物中 可存有輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝物及類似 者。爲供病患攝取，該等載體可使該等醫藥組成物經調製 成藥片、九、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿泥、 懸浮液及類似者。 一旦經調製後，本發明之組成物可被直接投服至個體 體內。欲被治療之個體可爲動物；特別地，可供治療人體 〇 本發明之藥物可經許多途徑投服，該等途徑包括但不 限於口服、靜脈內、肌內、動脈內、脊髓內、椎管內、心 室內、經皮施用、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌 下、陰道內、經直腸途徑或於外科手術後局部施用於受病 害之組織上。 劑量治療可爲單一劑量療程或多重劑量療程。 本發明之另一目標係含有作爲活性成分之至少一種式 (I)化合物的醫藥組成物’其中該式（I)化合物之量係 諸如產生顯著治療功效者。本發明所含括之組成物係完全 爲慣用者且係藉由使用製藥工業之一般實務方法所製得。 依據所採取之投藥途徑’該等組成物係呈固體或液體型式 且係適於口服、非經腸或靜脈內投藥。本發明之組成物含 -15- 201004647 有該活性成分和至少一種藥學上可接受之載體或賦形劑。 下述供說明之實施例絕非係本發明欲保護者之無遺漏 列示。 【實施方式】 簡稱：

Aad :胺基己二酸

Alloc :烯丙氧羰基

Amp :對胺基甲基苯基苯胺

Boc :特丁氧羯基

Cit :瓜胺酸 CPT :喜樹鹼 D C Μ :二氯甲烷 DIPEA :二異丙基乙胺 DMF:二甲基甲醯胺 equiv.：當量

Et20 :二乙醚

Fmoc : 9H-芴基甲氧羰基 HCTU ： ( 2- ( 6-氯-1H-苯並三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲 基銨六氟磷酸鹽） HOAt ： 1 -羥基-7-氮雜苯並三唑 HOBt ： 1-羥基苯並三唑 M A L D I :介質輔助雷射脫附離子化 MeOH :甲醇 -16- 201004647 Ν Μ P : N -甲基吡咯啶酮 PABA : 4-胺基苄醇 PABC :對胺基苄氧羰基

Pmc: 2,2,5,7,8-五甲基-色滿-6-磺醯基 RP-HPLC:逆相高效液相層析 RT :室溫 rt :滯留時間 SPPS :固相肽合成 TBTU : Ο-(苯並三哩-卜基）-N，N,N’，N’-四甲基脲鐵 四氟硼酸鹽 TEA ··三乙胺 TFA :三氟乙酸 Tof :飛行時間 一般註釋：4光譜係於所指之DMSO-D6、CDC13或 D2〇溶液中且於300 MHz下經Bruker儀器記錄。化學位移値 係以ppm表示且偶合常數係以Hz表示。閃爍管柱層析係利 用矽膠（Merck 23 0-400篩孔）實施。 實施例1 合成ST3 8 3 3 將溶解於DMF (2 ml)中之片段2(1當量）加入至含 有片段1(於原位製備，〇·32毫莫耳）和DIPEA(1當量） 之〇1^(71111)溶液中。利用〇1?£人將？11調整至約7.5並於 室溫和黑暗下攪拌該反應混合物。經2小時後，加入另一 -17- 201004647 當量之片段1，再次調整pH並令該反應混合物經隔夜攪拌 〇 經製備性HPLC (管柱，Discovery Bio Wide pore C18, Supelco, 250 x 2 1.2 mm, 10 μηι;流動相：29% CH3CN 水溶 液+0.1% TFA，λ = 220 nM )純化和冷凍乾燥後，得到 ST3 833 ( 365 mg, 97.6%純度）。產率 60% ° 分析級 HPLC ( Gemini, Phenomenex, C18, 250 X 4.6 m m, 5 μ m ;流動相：3 4 % C Η 3 C N 水溶液 + 0.1 % T F A , λ = 2 2 0 nm )。該共軛物於滯留時間7.9 6和1 0.4 3分鐘下顯現兩個 峰，其係基於原始細胞毒性分子之E/Z異構物的混合物。 Maldi-Tof質量·· 1 650.7 1 [M + H]+。 *H-NMR ( DMSO-D6 ),主要位移，δ : 9.28，8.57, 8.28, 8 .22, 8.14, 8 .07, 7.93, 7, .88, 7.75, 7.65, 7.55, 7.45, 7.36, 7 24, 7.15, 7 • 11, 7.03, 7. .02, 6.42, 5.95, 5.42, 4.94, 4.60, 4 .41, 4.28, 4. .09, 3.95, 3 . 89, 3.57, 3.48, 3.18, 3.00- 2.31，1.9 1, 1.75, 1.60- 1.3 0, 1.25, 0.90 ° 實施例2 (供比較用） 合成ST3280 在除去alloc保護基之前，依循實施例1所描述之方法 進行片段1與片段3之偶合反應。 將 Bu3SnH ( 0.172 毫莫耳）、AcOH ( 0.375 毫莫耳）及

Pd(PPh3 )4 ( 0.0 0 3 毫莫耳）加入至[A11oc-ST3280] ( 0.078 毫莫耳）之DMF (3 ml)溶液中。於室溫和氬氣下攪拌該 -18- 201004647 反應混合物1小時。於減壓下經蒸發溶劑後，令殘餘物經 製備性 HPLC (管柱，Alltima，Alltech，RP18, 10 μηι，250 X 22 mm;流動相：3 4% CH3 CN水溶液+ 0 . 1 % TF A )純化。經 冷凍乾燥後，得到共軛物（9 9.9 %純度）。產率5 5 %。 分析級Η P L C ( Gemini, Phenomenex, C18，2 5 0 x 4.6 mm, 5 μηι;流動相：3 5 % C H 3 CN水溶液 + 0.1 % TF A; λ = 3 6 0 11111)。£/2異構物之滯留時間：7.24和9.61分鐘。£81質量 :1 696[M + H]+。 1H-NMR ( DMS〇-D6)，主要位移，δ : 8.57, 8.28, 8.22, 8.14, 8.07-7.50, 7.36, 7.24, 7.20-6.90, 6.42, 5.42, 4.94, 4.60, 4.41, 4.28, 4.18-4.00, 3.95, 3.90, 3.57, 3.48, 3.12-2.25， 1,91， 1.55， 1.38， 0.90 。 實施例3 合成ST4 1 67 將抗壞血酸鈉（0.08 9毫莫耳）和CuS04_5H20 ( 0.009 毫莫耳）之水（5〇0 μΐ)溶液加入至片段4(0.09毫莫耳） 和片段5 (88 mg, 0.09毫莫耳）之DMF (2 ml)溶液中。 藉由加入NaOH將pH調整至pH 6並於室溫下令該懸浮液經 隔夜攪拌。於減壓下經蒸發溶劑後，令殘餘物經製備性 HPLC(管柱，Alltima C18，10 μιη, Alltech;流動相：33% CH3CN水溶液+0.1% TFA，λ = 220 nm)純化。經冷凍乾燥 後，得到所欲之加成物（72 mg，97%純度）。產率44%。 分析級 HPLC (管柱，Gemini C18，250 X 4.6 mm，5 μιη; -19- 201004647 流動相：34% CH3CN水溶液+〇· 1% TFA，λ = 220 nm )。滯留 時間：7_7 和 9_9 分鐘。ESI 質量：1 745.7 [M + H]+。 H-NMRCDMSO-De + Da)，主要位移，δ: 8.90, 8.44, 8.33, 8.18, 8.03-7.84, 7.8-7.69, 7.45, 7.39, 7.2-6.94, 5.48-5.30, 5.19, 4.89, 4.69, 4.6-4.24, 4.20, 4.13,4.02, 3.89-3.52, 3.5-3.37, 3.24, 3.10-2.62, 2.40-2.30, 1.93-1.25, 0.85。 實施例4 合成ST4215 依循實施例3所描述之方法進行片段4與片段6之偶合 反應。 令自環加成反應所得之粗反應產物經製備性HPLC ( 管柱，Alltima, C18, 10 μιη, Alltech;流動相：30% CH3CN 水溶液+ 〇 · 1 % T F A )純化。經冷凍乾燥後，得到所欲之加 成物（52 mg，98.6%純度）。產率41%。 分析級 HPLC ( Gemini，Phenomenex, C18，250 X 4.6 m m，5 μ m ;流動相：3 0 % C Η 3 C N 水溶液 + 〇 · 1 % τ F A, λ = 2 2 0 nm )。滯留時間：11·23和15.43分鐘。ESI質量： 2 1 06[M + H]+。 'H-NMR ( DMSO-D6 ),主要位移，δ : 9.79, 9.13 8.42, 8.15, 7.95, 7.86, 7.80-7.69, 7.45-7.39, 7.18-6.70, 5.47-5.24, 4.85, 4.60-4.30, 4.28-3.65, 3.64-3.31, 3 30- 2.61, 2.43-2.30, 1.91-1.38, 1.33, 0.84° -20- 201004647 實施例5 合成 ST5 54 8TF1 依循實施例3所描述之方法進行片段4與片段7之環加 成反應。經製備性HPLC純化後，得到所欲之加成物（ 1 0 0 %純度）。產率4 5 %。 分析級 HPLC ( Gemini, Phenomenex，C18, 250 X 4.6 m m，5 μ m ;流動相：2 9 % C Η 3 C N 水溶液 + 0 · 1 % T F A , λ = 2 2 0 nm)。滯留時間：10.84和15.22分鐘。1^1(1丨質量： 2 1 20.89[M + H]+。 i-NMRCDMSO-Dj 主要位移，δ: 9.94, 9.28，9.04, 8.58, 8.52, 8.27-8.17, 8.03, 7.93-7.73, 7.55, 7.37, 7.25, 7.11-7.07, 6.82, 6.56, 6.41, 5.90, 5.42-5.29, 4.95, 4.60-4.53, 4.46, 4.37, 4.25, 4.16, 4.01-3.96, 3.84, 3.65-3.37, 3.17, 3.10, 3.01-2.88, 2.42-2.36, 1.90-1.86, 1.75-1-71, 1.61-1.58, 1.50-1.30, 0.89° 實施例6 合成 ST5546TF1 依循實施例3所描述之方法進行片段4與片段8之偶合 反應。令自環加成反應所得之粗反應產物經製備性HPLC (Alltima, Alltech, RP1 8, 250 x 22 mm, l〇 μιη;流動相： 28% CH3CN水溶液+0_1% TFA，λ = 220 nm)純化。經冷凍 乾燥後’得到ST5546TF1 ( 100%純度）。產率38%。 -21 - 201004647 分析級 HPLC ( Gemini, Phenomenex, C 1 8, 2 5 0 x 4.6 mm，5 μιη;流動相：28% CH3CN水溶液 +0.1% TFA, λ = 220 n m )。滯留時間：1 1 . 3 8和1 6 .1 6分鐘。M a 1 d i質量： 24 8 0 [M + H]+。 iH-NMRCDzO)主要位移，δ: 8.73，8_52，7.83-7.74, 7.62, 7.39, 7.19, 7.05, 6.93, 6.87, 6.63, 5.58-5.49, 4.91, 4.68-4.26, 4.04, 3.85-3.42, 3.24-3.12, 2.93-2.87, 2.77, 2.65-2.60， 2_11, 1.93， 1.82， 1_72， 1_63， 1.58-1.49， 1.12。 實施例7 合成 ST5744TF1 將抗壞血酸鈉（0.014毫莫耳）和CuS04 5H20 ( 0.00 1 4毫莫耳）之水溶液（Μ μΐ )加入至含有片段9 ( 15 mg, 0.014毫莫耳）和片段10 (34 mg，0.016毫莫耳）之（ DMF/H20: 1/1, 2 ml)溶液中。室溫下擾拌所生成之反應 混合物1 .5小時。隨後於減壓下除去溶劑。經通過HPLC ( 管柱，Alltima, Alltech, C18, 10 μιη, 250 X 22 mm;流動相 :30% CH3CN水溶液+0.1% TFA)純化後，得到所欲之加 成物。產率3 7 %。 分析級HPLC (管柱Gemini,流動相2 9 % C H 3 C N水溶 液 +0.1% TFA)。滯留時間：9.2和 12.6分鐘。Maldi-TOF ：[M + H]+ 298 8.78。 iH-NMRCDMSO-De + DjO)主要位移，δ: 9.3 0, 8.5 6, 8.40, 8.22, 8.19, 8.01, 7.92-7.85, 7.83, 7.78-7.69, 7.53, -22- 201004647 7.37, 7.23， 7.08, 6.68， 5.42-5.3， 5.21， 5.10, 4.93， 4,74, 4.37-4.34, 4.23, 4.20-4.03, 3.89, 3.85, 3.61, 3.56-3.36, 3.29-3.16， 3.07， 3.00-2.73, 2.38, 2.10， 1_85, 1.72， 1.55, 1.40- 1.3 0，1 _23，〇_87。 實施例8 合成 ST5 745TF1 將抗壞血酸鈉（0.016毫莫耳）和CuS〇4 + 5H2〇( 0.0016毫莫耳）之水溶液（16 μ1)加入至含有片段11 ( 33.2 mg，0.032毫莫耳）和片段12 ( 84 mg，0·031毫莫耳） 之（DMF/H2〇: 4/3，3.5 ml)溶液中。令所生成之溶液經 微波（90W )照射2分鐘。觀察到最大溫度達120°C °經通 過 HPLC (管柱，Alltima, Alltech, C18, 10 μιη, 25 0 χ 22 mm;流動相：32% CH3CN水溶液+0.1% TFA)純化後，得 到所欲之加成物（97 %純度）。產率42%。 分析級HPLC (管柱Gemini，流動相29% CH3CN水溶 液+0.1% TFA)。滞留時間：10.2和12.5分鐘。Maldi質量 :[M + H]+ 3723。 h-NMRCDMSO-Ds + DaO)主要位移，5:9.05，8.34-8.09, 7.82-7.71, 7.42-7.24, 7.06-6.99, 6.66, 5.49, 5.55-5.11, 4.79, 4.57, 4.37-3.97, 3.70-3.38, 3.16, 3.01-2.87, 2.34-2.32， 2.00-1.55, 1.42-1.28， 1.19， 0.84。 實施例9 -23- 201004647 合成片段1 c{Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp[CO-CH2-(〇-CH2-CH2)2-〇-CH2-CO-N3]} 環肽醯基醯肼之微波輔助固相合成 令Fmoc-Gly-SASRIN® ( 2.53 g，2毫莫耳）懸浮於含有 2 0 %哌啶之D M F ( 4 0 m 1 )溶液中並經照射（2 5 W ) 3分鐘 。經過濾並沖洗該樹脂後，加入含有下一個胺基酸（2當 量）之溶液，隨後再加入含有2當量之HOBT和TBTU的 DMF ( 36 ml )溶液。最後，加入溶解於NMP ( 5 ml )中之 DIPEA ( 4當量）並於30W下照射該懸浮液5分鐘。經過濾 並經Fmoc去保護後，以相同之方式進行下一次偶合反應直 至該肽完成。胺基酸之加入順序係Fmoc-Arg(Pmc)-OH、 Fmoc-Amp構築團（參閱圖3a之合成）、Fmoc-D-Phe-OH及 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。 經最終之Fmoc去保護並經沖洗後’藉由1 % TFA之 D C Μ ( 6 0 ml )溶液處理1 5分鐘以自該樹脂進行剪切。經 過濾後，重複相同之操作5次。藉由加入吡啶以中和結合 之濾液並達至乾燥狀態。將HOBT和TBTU ( 3當量）及1% DIPEA加入至溶解於CH3CN( 1 5 00 ml)之殘餘物中並於室 溫下攪拌該反應混合物1小時。隨後於減壓下蒸發溶劑。 經閃爍層析（DCM/MeOH:94/6 — 92/8)純化後，得到所欲 之經保護的環肽（50%產率）。 令後者溶解於TFA/H20:9 5/5中並於室溫下經攪拌1小 時。隨後於減壓下蒸發溶劑並藉由自TFA/Et2〇沉澱純化後 -24- 201004647 ，得到該環肽（98%產率）。 分析級 HPLC (管柱，Purosphere STAR® Merck, RP18, 25〇乂4 1111：1,5 0111;流動相：2〇%(^3〇^水溶液+〇.1% TFA; λ = 220 nm)。滯留時間 9 _ 1 4 分鐘。Μ a 1 d i - Τ ο f 質量： 8 70.1 3 [M + H]+。 令該去保護之醯基醯肼（〇·32毫莫耳）和HO AT (1.91 毫莫耳）溶解於DMF (7 ml)中並加入亞硝酸特丁酯（ 0.38毫莫耳）。攪拌該反應混合物30分鐘。該醯基疊氮化 物係未經分離且未經任何純化而用於下一個步驟中。 實施例1 0 合成片段2

HCl.Ala-Cit-PABC-CPT 歩驟1 室溫下隔夜攪拌Boc-Cit-OH ( 1 g, 3·63毫莫耳）、 PABA ( 1 .3 g, 1 0.9毫莫耳）、Η O A T ( 0 · 7 4 g, 5 · 4 5 毫莫耳 )、DIPEA ( 0.93 ml, 5.45毫莫耳）及 DCC ( 1.12 g, 5.45 毫莫耳）之DMF ( 65 ml )溶液。經減壓下蒸發溶劑後， 令殘餘物經閃爍層析（DCM/MeOH: 90/10 —85/15)純化。 藉由令先前之中間產物與TFA/DCM: 1/1反應以進行B〇c去 保護，隨後於減壓下經除去溶劑後，生成TFA.Cit-PABA( 520 mg)。產率 73%。 步驟2 -25- 201004647 將 TFA.Cit-PABA 加入至於 0°C 下 Alloc-Ala-OH ( 472 mg, 2.68 毫莫耳）、DCC(272 mg，1.34 毫莫耳）及 DIPEA (460 μΐ，2.68 毫莫耳）之 DCM/DMF ( v/v=l/l，20 ml)混 合溶液中並攪拌該溶液6小時。減壓下除去溶劑並令殘餘 物於pH 2下溶解於水中。令所生成之溶液經Et〇Ac萃取2次 。藉由加入NaHC03以中和水相並於減壓下除去水。藉由 閃燦層析（EtOAc/MeOH = 85/15 )純化’生成 Alloc-Ala-Cit-PABA ( 3 9 8 mg )。產率 69 %。 步驟3 將溶解於D C Μ ( 2 0 m 1 )和吡啶（1 5 0 μ 1 )中之4 -硝 基-苯基氯甲酸酯（ 3 6 3 mg，1.8毫莫耳）加入至後者（392 mg, 0.9毫莫耳）之乾燥DMF( 5 ml)溶液中並攪拌該反應 混合物1小時。減壓下除去溶劑並令殘餘物經冰冷Et20碾 製數次。 步驟4 將7-(2-胺基乙氧基亞胺）-甲基-喜樹鹼.HC1(423.5 mg, 0.90毫莫耳）和TEA ( 150 μΐ，1.1毫莫耳）加入至先前 加成物之DMF ( 25 ml )溶液中並攪拌該反應混合物5小時 。減壓下除去溶劑並令殘餘物經水碾製數次以除去過量之 TEA。經閃爍層析（DCM/MeOH:90/10)純化後，得到被 保護之片段2 ( 320 mg, 0.36毫莫耳）。產率40% ( 2步驟） -26- 201004647 步驟5 將 Bu3SnH( 220 μΐ，〇·8 毫莫耳）之 DCM(3·8 ml)溶 液、水（40 μΐ)及最後 Pd[(PPh)3]4 ( 17 mg，0.014 毫莫耳 )加入至上述所得到之被保護之片段2的DMF ( 3 ·8 ml )溶 液中並攪拌所生成之反應混合物1 5分鐘。減壓下除去溶劑 以生成固體，其係被置入PH 3下之水（65 ml )中。令水 層經Et2〇( 25 ml X 3)萃取’隨後經濃縮以生成氨氣化物 鹽之純片段2。產率9 3 %。 HPLC ( Gemini, Phenomenex, C 1 8, 25 0 x 4.6 mm, 5 μ m ;流動相：2 8 % C H 3 C N 水溶液 + 〇 · 1 % T F A，λ = 2 2 0 n m ) 。滯留時間：8.9和12.3分鐘。1^1心質量：83 4 [!^ + ：^]+。 實施例1 1 合成片段3

TFA.Phe-Lys(Alloc)-PABC-CPT 依循實施例1〇所描述之方法，起始自B〇C-Lys(All〇C)-OH以替代Boc-Cit-OH且於第2步驟中使用Boc-Phe-ΟΗ以替 代All〇c-Ala-OH，得到標的化合物。 分析級 HPLC(Purosphere STAR, Merck, 5 μΐη;流動 相：35% CH3CN水溶液+0.1% TFA，λ = 220 nm)。滯留時間 :18.00 和 25_29 分鐘。Maldi 質量：965 [M + Na]+。 實施例1 2 -27- 201004647 合成片段 4 ( HCsC-CO-AIa-Cit-PABC-CPT) 將DIPEA (0.31毫莫耳）、丙炔酸（0.18毫莫耳）及 HOAT(0_18毫莫耳）加入至片段2(0.12毫莫耳）之DMF (3 ml)溶液中並令該溶液於下冷卻，隨後加入DC C ( 0.2 1毫莫耳）。室溫下攪拌該反應混合物1 · 5小時。經減壓 下除去溶劑後，令殘餘物經閃爍層析（DCM/MeOH: 9 / 1 — 8 / 2 )純化。產率 7 2 %。 分析級 HPLC ( Gemini, Phenomenex, C 1 8, 2 5 0 x 4.6 mm，5 μιη;流動相：31% CH3CN水溶液 +0.1% TFA，λ = 220 nm )。滯留時間：1 1.46和1 6.1 4分鐘。Maldi質量： 863·8[Μ + Η] +和 885.8[M + Na] +。 實施例1 3 合成片段 5 c{Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-[CO-(CH2)2-(〇- CH2-CH2)2_〇_(CH2)2-N3] } 依循實施例9所描述之方法，於SPPS之第2步驟中倂入 構築團 Fmoc-Amp[CO-(CH2)2-(0-CH2-CH2)2-0-(CH2)2-N3] 以合成標的環肽。 分析級 HPLC( Gemini, Phenomenex, C18, 250 X 4.6 mm, 5 μιη;流動相：30% CH3CN水溶液 + 0.1% TFA, λ = 220 nm)。滞留時間 8.3 分鐘。Maldi 質量·· 881[Μ + Η]+。 實施例1 4 合成片段 6 c{Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-[CO-(CH2)2-(〇-CH2 -28- 201004647 -CH2)2-〇-(CH2)2-NH-Cit-C0-(CH2)2-(0-CH2-CH2)2-0- (CH2)2-N3]} 依循實施例9所描述之方法，於SPPS之第2步驟中倂入 構築團 Fmoc-Amp-[CO-(CH2)2-(0-CH2-CH2)2-0-(CH2)2-NH-Cit-C0-(CH2)2-(0-CH2-CH2)2-0-(CH2)2-N3]}以替代 Fmoc-Amp[C0-CH2-(O-CH2-CH2)2-O-CH2-CO-N3]，合成該環肽 〇 分析級 HPLC ( Gemini, Phenomenex, C 1 8, 2 5 0 x 4.6 mm, 5 μιη;流動相：2 5 % C H 3 C N 水溶液 + 0 · 1 % T F A )。滯 留時間 10.79 分鐘。Maldi-Tof 質量：1241[M + H]+。 實施例1 5 合成片段7 c{Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Amp[CO-(CH2)2-(〇-CH2-CH2)2-0- (CH2)2-NH-Cit-C〇-(CH2)2-(0-CH2-CH2)2-0-(CH2)2-N3]} 依循實施例14所描述之方法，於SPPS之第3步驟中倂 入Fmoc-D-Tyr-(t-Bu)-〇H以合成標的環肽。 分析級 HPLC ( Gemini, Phenomenex，C18，250 X 4.6 mm，5 μιη;流動相：22 % CΗ3 CN水溶液 + 0.1 % ΤF A , λ = 220 nm)。滯留時間8.87分鐘。\1&1以質量：1 2 5 6.9 6 [ M +Η ]+。 H-NMRCDjO)主要位移，δ: 7.43，7.29，7.19，6.94, 4.93, 4.59, 4.53-4.37, 4.01-3.65, 3.57, 3.35, 3.27, 3.14-3.07， 2.95-2.87， 2.79-2.72, 2.03-1.60 。 -29- 201004647 實施例1 6 合成片段8 c{Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Amp[CO-(CH2)2-(〇-CH2-CH2)2-〇- (CH2)2NH-Cit]2-CO-(CH2)2-(〇-CH2-CH2)2-0-(CH2)2N3} 依循實施例15所描述之方法，於SPPS之第2步驟中倂 入 Fmoc-Amp-[CO-(CH2)2-(0-CH2-CH2)2-0-(CH2)2NH-Cit]2 -c〇-(ch2)2-(o-ch2-ch2)2-o-(ch2)2n3以合成標的環肽。 分析級 HPLC ( Gemini, Phenomenex, C 1 8, 2 5 0 x 4.6 mm, 5 μιη;流動相：21% CH3CN, λ = 220 nm)。滯留時間 11.62 分鐘。Maldi 質量：1617.31[M + H]+。 1H-NMR(D20),主要位移，δ: 7.23，7.10, 7.05, 6.73, 4.58, 4.40, 4.33-4.17, 3.82-3.47, 3.40, 3.38, 3.16-3.05, 2.96-2.82, 2.75, 2.69, 2.58, 1.84-1.40° 實施例1 7 合成片段9 步驟1 將DCC(97.2 mg, 0_47毫莫耳）、對硝基酚（437 mg， 0.31毫莫耳）、丁£八（1.311111，9.43毫莫耳）及〇1\/1八？（7.7 mg，〇.〇6毫莫耳）加入至於〇°C下之無水3,6,9 -三氧雜--- 碳烷二酸（2.1 g, 9.43毫莫耳）的DCM (63 ml)懸浮液中 。經30分鐘後，令該反應混合物經水、0.1 N HC1及水沖洗 並置於硫酸鈉上乾燥，隨後經濃縮爲小體積且置入冰箱1 小時後再經過濾。對該濾液加入炔丙基胺氫氯化物（1 4 4 -30- 201004647 mg, 1_57毫莫耳）和ΤΕΑ(262 μΐ，1.88毫莫耳）並經數分 鐘後減壓下除去溶劑。令所生成之殘餘物溶解於水（20 ml)中並經通過Dowex 50 W X8過濾。令母液經DCM萃取2 次以除去殘餘之硝基酚並經濃縮後生成白色固體之所欲 炔-PEG-C02H。產率 72%。 步驟2 將 DCC ( 25 mg, 0.1 2毫莫耳）加入至 Ala-Cit-P ABC-CPT (片段 2，56 mg, 0.06毫莫耳）、炔-Peg-C02H ( 22 mg，0.08 5 毫莫耳）、HOAT ( 16 mg, 0· 12 毫莫耳）及 DIPEA ( 41 μΐ，0.24 毫莫耳）之 DMF(1.5 ml)的冰冷（ )溶液中。隨後於室溫下隔夜攪拌該反應混合物。經 過濾後，濃縮濾液至乾燥狀態並令所生成之殘餘物經閃爍 層析（DCM/MeOH: 85/15 )純化以最終得到黃色固體之所 欲加成物（40 mg)。產率63.5 %。 分析級 HPLC (管柱 Gemini Phenomenex C18; 2 5 0 χ 4_6 mm, 5 μιη; 32% CH3CN水溶液+0.1% TFA )。滯留時間 11.6和 16.3分鐘。ESI質量：[M + H]+ 1053.42。 實施例1 8 合成片段10 (參閱圖3e) 步驟1 將DCC ( 84 mg, 0_41毫莫耳）加入至L-谷胺酸二特丁 酯氫氯化物（1〇〇 nxg，0.34毫莫耳）、疊氮基乙酸（41 -31 - 201004647 mg, 0.41 毫莫耳）、HOAT ( 0.41 毫莫耳）及 DIPEA ( 127 ml, 0.74毫莫耳）之DCM(4.6 ml)的冰冷（0t)溶液中 。室溫下攪拌該反應混合物2 _ 5小時。經過濾後’令該有 機溶液經DCM稀釋至30 ml並經水、IN HC1、5% NaHC03 及水沖洗。減壓下除去溶劑並令所生成之殘餘物溶解於 TFA ( 3 ml )中且經攪拌1小時。隨後於減壓下除去TFA以 生成2- (2-疊氮基·乙醯胺基）-戊二酸。 步驟2 令2-(2-疊氮基-乙醯胺基）-戊二酸溶解於0€]^1/01^? (8/1，45 ml)混合液中。與特丁基-12-胺基-4,7,10-三氧 雜十二碳烷酸酯（281 mg，1.01毫莫耳）、HOAT(137 mg, 1_〇1 毫莫耳）、DIPEA ( 174 μΐ )及 DCC ( 209 mg, 1 .0 1 4毫莫耳）進行標準偶合反應得到粗產物，其係經閃 爍層析（DCM/MeOH__ 95/5 )純化以生成所欲之雙羧酸酯 中間產物固體產物（175 mg)。產率68.4%。 ^-NMR ( CDC13 ) δ ： 7.54, 7.23, 6.74, 4.42, 4.0 1， 3.70, 3.61，3.41, 2.50，2_35，2.08，1.44。 步驟3 利用TF Α於標準條件下使上述所得之化合物去保護。 一旦所有起始物消失，於減壓下除去TFA以得到雙羧酸中 間產物，其係未經任何進一步純化而用於下一個步驟中。 -32- 201004647 步驟4 於〇°C下將N-羥基琥珀醯亞胺（63 mg，0.55毫莫耳） 之DMF溶液加入至上述所得中間產物之溶液中，隨後加入 〇(：(：(115 11^,0.5 5毫莫耳）。室溫下隔夜攪拌該反應混 合物。經標準操作後得到粗所欲之產物，其係未經任何進 一步純化而用於下一個步驟中。 步驟5 令上述所得中間產物溶解於DCM ( 2 ml )中並於室溫 下且於DIPEA(153 μΐ，0.93毫莫耳）之存在下與溶解於 DMF ( 3 · 5 ml )中之環肽 c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-TvrrtBu)-Amp I ( 725 mg, 0.69 毫莫耳）反應 1.5小時。該環 肽 ciArgrPmc)-Glv-AsD(OtBu、-D-Tyr(tBu)-Amp}係依據實 施例15所描述之方法藉由SPPS且使用Fm〇c-Amp(CbZ)-OH 替代 Fmoc-Amp-[CO-(CH2)2-(〇-CH2-CH2)2-〇-(CH2)2_NH-Cit-C0-(CH2)2-(0-CH2-CH2)2-0-(CH2)2-N3]加以製備。該 粗殘餘物係經製備性HPLC (管柱Alltima, Cl 8 Alltech; 10 μιη，250 x 22 mm; 69% CH3CN水溶液+0.1% TFA)純化。 產率4 8 %。 步驟6 於DCM (1 ml)中藉由利用TFA( 540當量）和苯硫基 甲烷（110當量）進行最終之去保護反應以生成粗產物’ 其係經由於冰冷Et2 Ο中數次連續沉澱而加以純化。得到白 -33- 201004647 色固體之所欲片段10。產率69%。 分析級 HPLC (管柱 Gemini Phenomenex C1 8; 25 0 X 4.6 mm，5 μιη; 22% CH3CN水溶液 +〇. 1 % TFA )。滯留時間 10.9分鐘。MALDI質量：[M + H]+ 1 93 5.22。 實施例1 9 合成片段1 1 將溶解於DCM( 0.5 ml)中之琥珀醯亞胺衍生物（圖 3c，3 7 mg, 0.11毫莫耳，得自片段5之構築團的合成期間之 步驟Π )加入至片段2 ( 80 mg, 0.094毫莫耳）和DIPEA ( 19 μΐ，0.11毫莫耳）之DMF(1 ml)溶液中。室溫下攪拌 該反應混合物5小時。於減壓下經蒸發溶劑後，令殘餘物 經製備性 HPLC (管柱 Alltima, 10 μιη，250 X 22 mm;流動 相：37% CH3CN水溶液+0· 1 % TFA )純化。滯留時間9.7和 12.4分鐘。產率 76.3%。ESI質量：[M + H]+ 1041.42。 實施例2 0 合成片段1 2 步驟1 將抗壞血酸鈉（90 μΐ)和 0.5M CuS04 + 5H20 ( 45 μΐ) 之2.5Μ水溶液加入至（1,3-二-丙-2-炔基胺甲醯基-丙基）-胺甲酸苄酯（72.5 mg, 0.20 毫莫耳）和 C{Arg(PinC)-Gly-Asp(OtBu)-D-Tyr(tBu)-Amp-[CO-(CH2)2-(〇-CH2-CH2)2-〇-(CH2)2-N3]} ( 5 72 mg，0.45毫莫耳）之 DMF/水（7/5，12 -34- 201004647 ml )溶液中。上述環肽係依據實施例1 3所描述之方法且使 用 Fmoc-D-Tyr-(t-Bu)-OH替代 Fmoc-D-Phe-OH而加以合成 。令所生成之反應混合物經微波（90W)照射2分鐘。觀 察到最大溫度1 2 1 °C。重複該照射3次直至起始物完全消失 ，該等起始物係藉由HPLC (管柱Gemini, 250 X 4.6 mm, 5 μ m ;流動相：3 5 % C Η 3 C N水溶液+ 〇 · 1 % T F A )加以監測。 減壓下除去溶劑並令粗反應混合物經閃爍層析（DCM/ MeOH梯度：93/7 —90/ 1 0 — 80/20 )純化以生成所欲之產物 (417 mg )。產率 71 %。ESI 質量：1453.6 (m/z 2+), 969.4 (m/z 3+)。 步驟2 令溶解於DMF ( 3 ml)和MeOH ( 5 ml)混合液中之上 述所得產物（406 mg)藉由甲酸銨（44 mg, 0.70毫莫耳） 和Pd/C( 200 mg)之作用而被去保護以除去該苄氧羰基保 護基。攪拌該懸浮液3小時並隨後經過濾。減壓下除去溶 劑且所生成之產物係未經任何進一步純化而用於下一個步 驟中。 步驟3 將上述所得產物之DMF( 3 ml)溶液加入至自炔两基 甘胺酸和甲基- (PEG) 12-NHS(l〇2 mg, 0.15毫莫耳）之 標準偶合反應所得的中間產物之D C Μ ( 4 · 5 m I )溶液中， 隨後加入 HCTU(62 mg, 0.15 毫莫耳）和 〇ΙΡΕΑ(51 μΐ， -35- 201004647 0.3 0毫莫耳）。室溫下攪拌所生成之溶液2小時。經減壓 下除去溶劑後，令殘餘物溶解於DCM ( 3 00 ml )中並經水 沖洗。隨後蒸發有機相以生成所欲之加成物（3 1 2 mg )。 產率67%。£81質量：1741(111/2 2+),1168(111/2 3+)。 步驟4 藉由使用TFA/DCM/苯硫基甲烷（1/1/0.3 )之混合物 使上述所得之中間產物完全去保護。藉由於冰冷Et20中沉 澱以純化該化合物，生成所欲之片段1 2 ( 245 mg )。產率 92%。發現 MALDI質量：2679.79。 生物測試結果 共軛物與整合蛋白受體ανβ3和〜卩5之固相結合測定 如文獻 Orlando R.A., et al·，J. Biol. Chem. 1991, 266, 1 9543所描述般進行受體結合測定。〇^卩3和〇^卩5分別於塗覆 緩衝液（20 mM Tris, pH 7.4，150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2)中被稀釋爲 500 ng/ml 和 1 μ§/πΠ，且將其部分（100 μΐ )加入至96孔槽微滴量盤中並 於4°C下經隔夜培育。令該盤經阻斷/結合緩衝液（50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnC 12 , 1 %牛血清白蛋白）沖洗1次並隨後於室溫下再 經培育2小時。令該盤經相同之緩衝液輕洗2次並於室溫下 且於競爭性抑制劑之存在下與經放射線標記之配體 [1 251]Echi statin ( Amersh am Pharmacia Biotech, 0.05 nM ； -36- 201004647 對αν β 5爲0 · 1 nM )培育3小時。經該培育後，沖洗孔槽並利 用γ計數器（Packard )測量放射活性。利用莫耳過量（200 nM )之冰冷配體echi statin測定配體之非專一性結合。 計算表1和2所示之IC5Q値爲抑制配體echi statin結合達 50%所需之化合物濃度且係由Prism GraphPad程式估算。 依據 Cheng-Prusoff方程式（Cheng Y.C.，et al_，Biochem. Pharmacol., 1 973, 22，3 099 )計算競爭性配體之Ki値。該 等値係由兩個獨立之實驗經三重複測定之平均値±l〇g標準 誤差。 該等共軛物之大多數於低奈莫耳範圍下顯現有效之抑 制活性。値得注重的是由ST3 2 80所證實之活體外活性主要 係基於因該化合物本身之不安定性所導致之分解產物的內 在活性。 表1 抑制[125I]Echistatin與ανβ3受體結合 化合物 IC5〇±1〇^ SE(nM) Ki(nM) Echistatin 0.28 ± 0.08 0.26 ST3833 78.4士 1.5 61.0 ST3280 9.7±0.06 8.5 ST4167 11.0±0.8 8.7 ST5744TF1 3.01 ±0.11 2.4 ST5745TF1 6.21 士 0.09 4.92 -37- 201004647 表2 抑制[125I]EchiStatin與ανβ5受體結合 化合物 IC5〇 ± log SE(nM) Κΐ(ηΜ) Echistatin 0.29 ± 0.02 0.33 ST3833 · 87·8±1.21 68.2 ST3280 34·4±0.8 23.0 ST4167 18·4±0.89 13.8 ST5744TF1 3·84± 0.12 2.95 ST5745TF1 3·15±0·11 2.41 腫瘤細胞於玻連蛋白上之黏附測定 令Α2 7 80人卵巢癌和PC3前列腺癌細胞於含有1〇°/。牛胎 血清和50 pg/ml慶大黴素硫酸鹽之培養基RPMI 1 640中生 長。細胞係保持在飽和濕度及95%空氣和5% C02之氣體環 境的37°C恆溫箱中。A27 80腫瘤細胞株表現高量之ανβ5整 合蛋白，而PC3表現低量之ανβ3和ανβ5整合蛋白。 於96孔槽組織培養盤中，室溫下加入5〇 μΐ/孔槽之玻 連蛋白（5 pg/ml )溶液2小時。令該等盤倒覆以除去溶液 。室溫下加入50 μΐ/孔槽之1% BSA溶液1小時。藉由加入 100 μΐ/孔槽之不含有小牛胎血清（FCS)之培養基RPMI 1640以沖洗該等盤。重複該沖洗2次。加入介於0.039至20 μΜ之間的不同濃度之該等分子。於不含有FCS之培養基中 經1 :2之比例稀釋以製備該等溶液。於經刮刀剝離前’藉 由加入5 ml之不含有FCS和1% BSA之培養基’沖洗燒瓶內 於鹽水溶液中之腫瘤細胞。經再懸浮後計數腫瘤細胞並以 適當之細胞密度（4 0 0 0 0 _ 5 0 0 0 0細胞/孔槽）加入。令該等 盤於增濕恆溫箱（37°C，5%C〇2 )中經培育1小時。隨後’ -38- 201004647 令該等盤倒覆以除去溶液並經200 μ 1/孔槽之含有Ca2+和 Mg2+之PBS溶液沖洗1次。室溫下於〇.2M Sorensen磷酸鹽 緩衝液，pH 7.2-7.4中利用4%聚甲醛溶液（1〇〇 μΐ )固定腫 瘤細胞1 〇分鐘。令該等盤倒覆並於室溫下加入1 %甲苯胺藍 (Toluidine Blu)溶液（100 μΐ) 10分鐘。藉由浸沒於二 次蒸餾水中沖洗該等盤2次並令彼等乾燥於6(TC恆溫箱（ Kottermann)中。加入1〇〇 μ1/孔槽之1% SDS。室溫下令該 等盤維持攪拌20分鐘並隨後於600 nm下經Victor 1 420多重 標記計數器（Wallac )評估。 利用“ALLFIT”電腦程式評估作爲測量該等分子對腫瘤 細胞黏附於玻連蛋白上之抑制功效的參數之IC5G値。 經發現被硏究之共軛物能以IC 5 Q値介於〇 . 3 9至4.6 μ Μ (表3)且未顯現對腫瘤細胞株過度選擇性之方式阻斷腫 瘤細胞（PC3和Α2780 )附著細胞外間質成分（諸如玻連 蛋白，即細胞表面受體整合蛋白ανβ3和ανβ5之配體）。如 所述對ανβ3受體之結合親和性，ST3 2 80對ανβ5受體之活性 係該化合物遭剪切而非該化合物本身之結果。 -39- 201004647 表3 共軛物對A 2 7 8 0卵巢癌細胞和p C 3前列腺癌細胞黏附玻連 蛋白之抗黏附功效 〔1小時處理） 化合物 PC3 A2780 IC50±SD(uM) ST3280 1_8±0_4 2_7士0.3 ST3833 2.1±0.2 0.9±0.05 ST4167 0.56±0.07 0.67±0.02 ST4215 4.6±0.8 1.7±0.2 ST5744TF1 0.39±0.09 0.45±0.02 ST5745TF1 1.0±0.05 1.0±0.01 共軛物對不同腫瘤細胞株之細胞毒性 使用硫氰酸胺13(3111口]1〇11〇<1&111丨1^8)試驗以評估化合 物對存活細胞之功效。使用P C 3人前列腺癌和A2 7 8 0人卵 巢癌細胞以測量該化合物對細胞生長之功效。於含有1 0% 牛胎血清之培養基RPMI 1 640 (GIBCO)中生長A2780和 PC3腫瘤細胞。 腫瘤細胞係於約1 0%匯合下接種於96孔槽組織培養盤 中並使其黏附且恢復達至少24小時。隨後對每個孔槽加入 不同濃度之藥物以計算彼等之IC5〇値（即抑制細胞存活達 50%之濃度）。於37 °C下培育該等盤達72小時。於該處理 結束時’藉由除去上清液並加入PBS溶液3次以沖洗該等盤 。加入？83溶液（2〇〇01)和冰冷8〇%三氯乙酸（1'€八）（ 5 〇 μ 1 )。令該等盤於冰上經培育至少1小時。除去T C A並 藉由浸沒於蒸餾水中沖洗該等盤3次且於紙上和4 0。(：下經 乾燥5分鐘。隨後加入〇 · 4 %硫氰酸胺B之1 %乙酸溶液（2 0 0 μΐ)。室溫下培育該等盤30分鐘。除去硫氰酸胺B，藉由 -40- 201004647 浸沒於1 %乙酸中3次以沖洗該等盤，再於紙上和4 0。(：下經 乾燥5分鐘。隨後加入Tris(10 mM，200 μΐ)並令該等盤 於攪拌下維持2〇分鐘。藉由光學密度且利用Multiskan螢 光分光光度計（波長5 4 0 n m )測量細胞存活。計算被殺死 之細胞數量爲與對照組培養相比較之硫氰酸胺B結合降低 %。 該等1〇5()値係利用“ALLFIT”程式加以計算。 藉由兩種人腫瘤細胞株（即表現高量整合蛋白之 A 2 7 8 0卵巢腫瘤細胞和表現低量整合蛋白之p C 3前列腺腫 瘤細胞）比較3種共軛物之抗增生活性。如示於表4，該等 分子對腫瘤細胞顯現IC5〇値爲8 nM之顯著細胞毒性功效。 所有該等共軛物對表現低量整合蛋白之PC3腫瘤細胞顯現 極小之作用（IC5G値係介於1至4.6 μΜ )。特別地，該3種 化合物對Α2 7 80腫瘤細胞比對PC3腫瘤細胞顯現較爲專一 之抗增生功效（表4)且對Α2 7 80腫瘤細胞之功效約略呈大 於100倍。 表4 共軛物對Α27 80卵巢癌細胞和PC3前列腺癌細胞之細胞毒 性（72小時處理) 化合物 PC3 A2780 IC50±SD, μΜ ST3280 0.2 士 0.03 0.0084±0.0006 ST3833 4.6±0.8 0.095±0.02 ST4167 1.0±0.1 0.030±0.003 ST4215 2_5±0·7 0.009±0.0007 ST5744TF1 1·0±0_02 0.008±0.0005 ST5745TF1 1.0±0.01 0.008±0.0001 -41 - 201004647 活體內評估共軛物ST3833對CD1裸鼠體內異種移植之卵巢 癌的腫瘤生長之抗腫瘤活性 將腫瘤細胞株（3 X 1 〇6 )經皮下注射至C D 1裸鼠（ Harlan)之右肋腹。每個實驗組包括1〇隻小鼠。於第〇天 移植腫瘤且腫瘤生長後每二週一次地利用V erni er彎腳規測 量腫瘤大小。依據公式TV ( mm3 ) =d2 X D/2計算腫瘤體積 ，其中d和D分別係最短直徑和最長直徑。腫瘤接種後第3 天，當腫瘤恰好可被測量時，開始藥物治療。於體積1 0 ml/kg之不同劑量下，依據療程qd X 5/w X 2w經皮下投遞 藥物達兩週。對照組小鼠係經載體（10% DMSO )處理。 藉由下述之方式評估藥物功效。 a )藥物治療小鼠對對照組小鼠之TVI係以下述方式表 示：TVI ( % ) =100 -(經治療小鼠之平均TV値/對照組小 鼠之平均TV値）X 100。經最後治療後，評估TVI達6天， 此時間對應觀察到對照組小鼠之腫瘤體積加倍所需之時間 〇 b)依據公式LCK =(T-C) /3·32 X DT計算Log細胞殺 死（LCK )値，其中T和C分別係對治療組（T )和對照組 (C )腫瘤達到被測量體積所需之平均時間（天）且DT係 觀察到對照組小鼠之腫瘤體積加倍所需之時間。 c ) CR係定義爲經治療終止後腫瘤消失持續達至少6天 。實驗終止前未再生長之腫瘤被視爲“治癒”。 藉由下述之方式評估藥物治療之毒性效果。 -42- 201004647 a)依據公式BWL(%) =100 -(第χ天平均體重/第} 天平均體重）X 1〇〇計算BWL，其中第1天係治療第丨天且 第X天係隨後之任一天。最高（最大）BWL値係記載於表 中。於治療期間全程對小鼠每天稱重。 b )致死毒性係定義爲於任何對照組小鼠死亡前發生 之任何治療組小鼠死亡。對小鼠每天調查死亡數。計算TI (治療指數）爲比例MTD/ED80。 結果 於異種移植之CD1裸鼠體內，ST3 8 3 3之抗腫瘤活性係 最具有拮抗腫瘤之活體外反應性。該分子顯現依據該療程 qd X 5/w X 2w經皮下投遞25 mg/kg之大約最大耐受劑量 (MTD )，因爲BWL値係25%且10隻小鼠翁1隻死亡。 ST3833顯示有效之抗腫瘤功效，因爲ST3 83 3產生對所有腫 瘤之完全退化（被治癒之小鼠於第90天於該MTD下係100% )(表5 )。於1/3 MTD ( 8.3 mg/kg)下觀察到50%被治癒 小鼠。於較低劑量（2.77和0.92 mg/kg )下，被治癒小鼠 係達3 0 %。經最後治療後之功效持續性和該共軛物之良好 可耐受性顯示高治療指數（ΤΙ = 8·9)，此結果建議該共鞭 物之高治療功效。 -43- 201004647 表5 經皮下投遞（qdx5/wx2w)之ST3833拮抗CD1裸鼠體內經異 種移植的A2780卵巢癌之抗腫瘤活性_______ 化合物 a劑量 bBWL% c致死 毒性 dTVI°/〇 eCR f治癒 gLCK hTI mg/10 ml/kg 00 ρ 25 24 1/10 100 9/9 9/9 >11.4 8.9 8.3 0 0/10 100 5/10 4/10 2.7 2.77 0 0/10 75 3/10 3/10 1.1 0.92 0 0/10 60 3/10 3/10 0.9 a每次投藥之皮下劑量 b因藥物治療所產生之最大BWL% e死亡/治療動物 dTVI%對對照組小鼠 eCR:腫瘤消失達至少10天 f治癒：腫瘤注射後90天未損傷之小鼠 gLCK，參閱方法 hTI:治療指數(MTD/ED80) 活體內評估共軛物ST3 8 3 3於心內注射PC3人前列腺癌所引 起之骨轉移上之抗轉移活性 藉由腹膜內注射4 ml/kg混合物（甲苯噻嗪：氯胺酮 1 0 〇 )麻醉雄性C D 1裸鼠。利用2 7 -規針藉由心內注射（1 X 1〇5細胞/0.1 ml/小鼠）將PC3腫瘤細胞接種至小鼠之心臟 左心室。將鼠隻區分爲下述之實驗組（1 1隻鼠/組）且經 腫瘤注射3天後，依下述之方式投服分子： 載體（DMSO 10%)靜脈內q4dx4 ST3833 56 mg/l〇 ml/kg靜脈內 q4dx4 爲評估藥物之抗腫瘤活性，利用Fax itr on系統進行高 -44- 201004647 解析全身放射學分析。腫瘤注射後進行放射學分析3 0天。 硏究期間全程記錄體重並注意死亡數。 該共軛物於靜脈內投藥56 mg/kg ( q4dx4 )下顯現良 好之耐受性，因爲未發現致死毒性之體重減少。該分子顯 現顯著地增加4 5 %之生命期（P <〇 · 〇 〇 1 )且降低溶骨損傷之 發生（自載體處理組鼠隻之9 1 %至藥物治療組鼠隻之4 5 % :表 6 )。 表6 靜脈內投遞（q4dx4)之共軛物ST3 83 3於拮抗CD1裸鼠體內經 異種移植 :的PC3獻 —列腺癌上之抗轉移活性 化合物 a劑量mg/ 10 ml/kg bBWL% 。致死毒性 d溶骨損 傷發生 eMST (範圍天數) fILS% 載體 0 0 0/11 10/11 40 (37-45) / ST3833 56 0 0/11 5/11 58 (45-71) ***45 3每次投藥之靜脈內劑量 b因藥物治療所產生之最大BWL% e死亡/治療動物 d溶骨損傷發生(腫瘤注射後3〇天，藥物治療組鼠隻轉移之數目對載體處理組鼠隻) eMST:平均存活時間 fILS%:生命期增加 * * *Ρ<〇·〇〇 1對載體處理組(Mann-Whitney試驗) 【圖式簡單說明】 圖1描述用於合成雙重靶向性細胞毒性衍生物類之不 同片段的化學結構。 圖2描述雙重靶向性細胞毒性衍生物類之化學結構。 -45- 201004647 圖3描述用於合成片段1、2、5、6及12及完全合成片 段1 0 (圖3 . e )之某些構築團的合成。 圖4槪要地描述供合成每個最終化合物所需之兩個片 段的本性。 -46 -

Claims (1)

1. 201004647 七、申請專利範圍： 1.一種式I環肽 [(L-D)nE]m-F-D-PI-Sl-CT 式I 其中 L係識別α-整合蛋白受體之式Π環肽 c(R1-Arg-Gly-Asp-R2) 式II R1 係 Amp、Lys或 Aad ; R2係呈R構型之Phe、Tyr或Amp; D於每次出現時可爲相同或不同且係不存在或係式III 二價基 -SP1-A1-SP2-A2-SP3-式III SP1係不存在或係 RMCHJqjocHrCH^q-O-CCHOq-R4 I R3和R4係相同或不同且係不存在或係_€〇_、—COO-、 -NH-、-〇 -或式IV、式VIII或式IX之二價基

   式 VIII

   q於每次出現時可爲相同或不同且係獨立地〇至6之整 -47- 201004647 數； A 1係不存在或含有親水性側鏈之天然或非天然（L ) 或（D )胺基酸； SP2係不存在或係與SP1者相同； A2係不存在或係與A1者相同； SP3係不存在或係與SP1者相同； m = 1 或 2 ; n= 1 或 2 ; E於每次出現時可爲相同或不同且係Glu、Lys或不存 在； F係與E相同或係不存在或式X之組胺酸類似物；

   其中該三唑環係與D-PI-SI-CT部分連接，該羰基部分係與 含有L之部分連接且SP1係如上述所定義者； PI係由選自Ala或Cit之（L)或（D)胺基酸所構成的 天然或非天然之寡肽； S I係二價基對胺基苄氧羰基； c T代表細胞毒性基團； 彼等之互變異構體、幾何異構體、光學活性型式（諸 如鏡像異構物、非鏡像異構物及彼等之消旋型式）及前述 -48 - 201004647 彼等之藥學上可接受之鹽； 唯其： 至少一個D應存在；且 當E存在且係Lys時，E係經由其胺基部分與含有L基之 部分連接，或當E存在且係Glu時，E係經由其羧基部分與 含有L基之部分連接。 2. 如申請專利範圍第1項之環狀，其中CT係喜樹鹼衍 生物，R1係Amp或Aad，R2係選自Phe、Amp或Tyr。 3. 如申請專利範圍第1或2項之環肽，其中m=l且n=l。 4. 如申請專利範圍第1或2項之環肽，其中m=l且n = 2。 5·—種具有整合蛋白ανβ3和ανβ5抑制性質的如申請專 利範圍第1至4項中任一項之環肽於作爲藥物上之用途。 6. 如申請專利範圍第5項之用途，該環肽具有低於1 μΜ之整合蛋白IC5〇値。 7. —種醫藥組成物，其含有與至少一種藥學上可接受 之賦形劑及/或載體混合之作爲活性成分的至少一種如申 請專利範圍第1至4項中任一項之環肽。 8. ^種合成如申請專利軔圍弟1至3項中任一項之環肽 之方法，其係藉由令式V化合物 (CT-SI-PI)-NH2 (式 V) (其中CT、SI及PI係如上所述者） 與式VI之含有疊氮基的衍生物 L^SP^A^SP^A'-SP^-Ns (式 VI) (其中L、SP1、A1、SP2、A2及SP3係如上所述者且尺4係 -49- 201004647 CO，且其中CT、SI及PI係如上所述者）反應。 9. 一種合成如申請專利範圍第1至3項中任一項之環肽 之方法，其係藉由令式VII化合物 (CT-SI-PI)-CO-C = CH (式 VII) (其中CT、SI及PI係如上所述者） 與式VI化合物（其中該式VI化合物中之L、SP1、A1、 SP2、A2及SP3係如上所述者’唯其R4係不存在）反應。 1 0 .—種合成如申請專利範圍第1、2及4項中任一項之 環肽之方法’其係藉由令式XI化合物 (CT-SI-PI)-D-NHCH2-C = CH (式 XI) c其中CT、SI、PI及D係如上所述者） 與式XII化合物 [(L-D)nE]m-COCH2-N3 (式 XII) (其中L、D及E係如上所述者）反應。 1 1 · 一種合成如申請專利範圍第1、2及4項中任一項之 環肽之方法，其係藉由令式ΧΙΠ化合物 (CT-SI-PI)-D-N3 (式 XIII) (其中CT、SI、PI及D係如上所述者） 與式xiv化合物 [(L-D)nE]m-CO-CH(NHD)CH2-C = CH (式 XIV) (其中L、D及E係如上所述者）反應。 1 2.—種如申請專利範圍第7項之鸷藥組成物於製備具 有抗癌活性的藥物上之用途。 1 3 · —種如申請專利範圍第7項之鹭藥組成物於製備供 -50- 201004647 治療哺乳動物罹患未受控制之細胞生長、侵襲及/或轉移 指徵的藥物上之用途。 1 4.如申請專利範圍第1 3項之用途，其係用於治療卵 巢癌及/或前列腺癌。 -51 -