TW200950803A

TW200950803A - Combinations and methods for subcutaneous administration of immune globulin and hyaluronidase

Info

Publication number: TW200950803A
Application number: TW098108166A
Authority: TW
Inventors: Richard Schiff; Heinz Leibl; Gregory I Frost
Original assignee: Baxter Healthcare Sa; Baxter Int; Halozyme Inc
Priority date: 2008-03-17
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2009-12-16
Also published as: CN101977627A; CN105816876A; BRPI0909499A2; AR114957A2; WO2009117085A1; SG10201503296QA; CA2714708C; SI2271363T1; JP5898286B2; TWI532498B; CO6331301A2; HUE033055T2; HRP20171068T1; EP2271363A1; EP2271363B1; CA2714708A1; DK2271363T3; AU2009226141A1; JP2015028050A; TWI489994B

Description

200950803 六、發明說明：相關申請案主張對 Richard Schiff、Heinz Leibl 及 Gregory Frost 於 2008 年 3 月 17 曰申請之名為「Combinations and Methods for Subcutaneous Administration of Immune Globulin and Hyaluronidase」之美國臨時申請案第61/069,841號的優先權。在允許之情況下’上文所述之申請案之主題物係以引用之方式全文併入。【發明之領域】本發明提供經調配以供皮下投藥之含有免疫球蛋白 (IG )組合物及可溶性玻尿酸酶組合物之組合組合物及套組。該等產品可用於治療IG可治療性疾病或病狀之方法中。本發明亦提供用於皮下投予免疫球蛋白之方法，藉此給藥攝生法實質上與靜脈内投予相同劑量以治療相同1(}可治療性疾病或病狀之給藥攝生法相同。【背景】靜脈内（IV)投予免疫球蛋白（IVIG)為對具有免疫缺乏症之個體的一線治療（primary treatment 儘管初始 WIG製劑會引起嚴重副作用，但目前可用之製劑可為大多數免疫缺乏症患者良好耐受。儘管如&，小比例患者仍持續具有令人不快、甚至失能之反應，諸如頭痛、疲勞及肌痛。尤其當患者具有間發性感㈣，存在發燒及寒冷 200950803 問題。儘管嘗試其他IVIG製劑或用乙醯胺苯紛 (acetaminophen)、苯海拉明（diphenhydramine)及皮質類固醇（corticosteroid )預先給藥，但該等反應常常持續存在。此外，由於IV投藥之需要，所以存在患者順應性之問題。免疫球蛋白之皮下（SQ )投藥可替代靜脈内投藥。與 IV輸注相比，SQ投予免疫球蛋白具有若干優勢。舉例而

0 言，其減少全身性反應之發生率，不需要往往困難之lv進入，改良最低含量且給予患者更多獨立性。由於難以在單個部位中投予大量流體，所以需要每次使用兩個至多達5 個部位來一週進行SQ輸注一次或兩次。因此，不同於一月一次給予之IVIG，皮下投藥通常每週進行—次。因此，存在對投予免疫球蛋白之替代方法的需求。 L概要】本文中提供用於皮下投予免疫球蛋白且用於治療町治療性疾病或病狀之方法、組合物、組合及套組。提供用於治療個體之IG可治療性疾病或病狀之方法，該方法係藉由向該個體皮下投予可溶性玻尿酸酶及免疫球蛋白（ig) 以治療s亥疾病或病狀。共同投子τ 、U柷予IG及破尿酸酶會增加經皮下投予之IG之生物可用車，奸 #田奋⑯，料彳^料針對料錢或病狀投藥相同之給藥攝生法皮下杈予IG ^ IG之投藥經達成曾卜取使所&予之量及投藥頻率實質上與經由IV以相同量用於相庐越4 n U展病或病狀之IV(靜脈内）技藥相同。經由…所投予之了歹、特疋疾病或病狀而言可 5 200950803 經：定或為已知的。在可溶性玻尿酸酶存在下，對於皮下投藥而5 ’投藥速率可典型地大於Iv投藥之速率。因此， :減少投予特定劑量之時間。投藥速率可諸如藉由泵來控制或可依靠重力。因此，在該等方法中，提供用於治療需要肖治療之個體之IG可治療性疾病或病狀的方法，該等方法係藉由向該個體皮下投予可溶性玻展酸酶及有效治療該疾病或病狀之量的免疫球蛋白（IG)來實施。以如下劑量攝生法進行該投予，其中：（a) IG之量及（b)用於向該個體連續投予ι〇之給藥頻率經選擇以使皮下IG投藥對患者之治療作用至少實質上等於使用相同給藥攝生法向個體靜脈内投予沁之治療作用。

在本文中所提供之方法的一些實例中，皮下投予IG 生物可用率至少約為經由1¥投藥所投予之相同劑量之生物可用率& 90%。戶斤投予之可溶性玻尿酸酶之量彳足以達成以所投予之劑量不超過一月一次皮下投予ig。在其他實例中，IG之投藥不超過每月一次。本文中所提供之方法及用途中所用之可溶性玻尿酸酶為PH2G或其截短形式舉例而言，可溶性玻尿酸酶可為綿羊或牛或截短型人類PH20。在截短型人類pH2〇用於本文中所提供之方法及用途中之情況下’該截短型人類pH2〇可選自具有SEQ m趾4_9中之任-者所閣明之胺基酸序列的多肽或其對偶基因變異體或其他變異體。在一實例中， s亥可溶性玻尿酸酶為rHupH2〇。 200950803 使用本文令之方法及用途所投予之1(}可諸如藉由醇分餾（alcohol fractionation )而自人類血漿純化。在一些實例

中，藉由以下各者中之任一或多者來進一步純化iG :化學修飾、在胃蛋白酶存在或不存在之情況下在4〇之pH下培育、聚乙二醇（PEG)沈澱、離子交換層析、酶促裂解、溶劑清潔劑處理、透濾或超濾。本文中所提供之方法及用途可使用含有IgG、IgA及IgM之IG。在一些實例中，IG含有大於95%之IgG。此外，IgG可為單體。諸如甘胺酸、麥芽糖、多元醇 (poloyl)、人血清白蛋白、甘露醇、及非離子型清潔劑中之一或多者之蛋白質穩定賦形劑亦可存在於1〇中。在一些實例中’IG製劑之pH為或約為4.2至5.4、4.6至5.1或4.8 至5 ·0 ’且蛋白質濃度為或約為ig組合物之5%至15% w/v、 6%至15% w/v、或8%至12% w/v。在一實例中，IG之蛋白質濃度為1 0% w/v。本文中提供治療IG可治療性疾病或病狀之方法及用途’其中皮下投予用於治療疾病或病狀之可溶性玻尿酸酶及免疫球蛋白（IG)，且IG係以10 ml/hr至300 ml/hr之速率輸注，諸如等於或約1 〇 ml/hr、2〇 ml/hr、30 ml/hr、40 ml/hr、50 ml/hr、60 ml/hr、70 ml/hr、80 ml/hr、90 ml/hr、 100 ml/hr、150 ml/hr、200 ml/hr、250 ml/hr 及 300 ml/hr。可藉由泵或重力來控制速率。在一些實例中，分開、同時或間歇投予IG及玻尿酸酶。舉例而言，可在投予ig前投予玻尿酸酶’諸如在投予IG前0.5分鐘、1分鐘、2分鐘、 7 200950803 3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、 10分鐘、20分鐘或30分鐘。在其他實例中，ig及玻尿酸酶係處於單一組合物中。在其他實例中，投予約或等於5 公克（g)、l〇g、15g、20g、21 g、22g、23g、24g、25 g、 26 g、27 g、28 g、29 g、30 g、31 g ' 32 g、33 g、34 g、 35 g、36 g、37 g、38 g、39 g 或 40 g IG，且以等於或約為 10 U /公克（g)、20 U/g、30 u/g、35 u/g、4〇 u/g、5〇 u/g、 60 U/g、70 U/g、80 U/g、90 U/g、100 u/g、150 U/g、或 3 00 U/g之比率（玻尿酸酶單位數/IG公克數）來投予玻尿酸酶。可使用本文中所提供之方法及用途來投予可溶性玻尿酸酶及IG以治療例如免疫缺乏症；血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症’川崎氏病（Kawasaki's disease );慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病（CIDp );格巴二氏症候群 (Ginllain-Barre Syndrome );特發性血小板減少性紫癜；發炎性肌病；蘭伯特.伊頓肌無力症候群（Lamben_Eat〇n myasthenic syndrome );多灶性運動神經病；重症肌無力；莫氏；天特义症候群（M〇ersch_w〇ltmann syndr〇me);繼發低γ球蛋白血症（包括醫原性免疫缺乏症）；特異性抗體缺乏’急性播散性腦脊髓炎；ANCA陽性全身壞死性脈管 : 體免疫a血丨生貧血大水皰性天范瘡樣病；瘋痕性天癌瘡樣病；伊文氏症候群（Evans咖觸e)(包括具有免疫性血小板減少症之自體免疫溶血性貧幻；母胎/新生兒同種免疫性血小板減少症（F〇et〇_maternai/ne〇natai 200950803 alloimmune thrombocytopenia，FMAIT/NAIT);嗤血細胞症候群（Haemophagocytic syndrome );高風險同種異體造血_ 幹細胞移植；IgM Si]蛋白血症神經病（IgM paraproteinaemic neuropathy );腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調；落葉型天疱瘡；尋常天疱瘡；輸血後紫癜；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群（Toxic epidermal

0 necrolysis/Steven Johnson syndrome，TEN/SJS);中毒性休克症候群；阿耳滋海默氏病（Alzheimer's Disease );全身性紅斑狼瘡；多發性骨髓瘤；膿毒病；B細胞瘤；創傷；及細菌、病毒或真菌感染。在投予IG及玻尿酸酶以治療免疫缺乏症之情況下，該免疫缺乏症可選自常見變異性免疫缺乏症（CVID)、先天無γ球蛋白血症、維斯科特-奥爾德裏奇症候群（Wiskott-Aldrich syndrome )、嚴重複合塑免疫缺乏症（SCID )、原發性低γ球蛋白血症、具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏疾病、X-連結無γ球蛋白血症（XLA )、發兒期低Ύ球蛋白血症、及無抗體之副腫瘤性小腦變性° 在IG可治療性疾病或病狀為血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症之情況下，該血液惡性腫瘤可為慢性·淋巴胞性白血病（CLL )、多發性骨髓瘤（ΜΜ )或#霍奇金氏譯木巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL )。在 IG < /σ 療 t ;、多發

病或病狀為發炎性肌病之情況下，該發炎性肌病J 治療桿菌性肌炎、皮肌炎或包涵體肌炎。在一些實例中，皮下投予可溶性玻尿酸酶及lG » 細菌、病毒或真菌病狀，諸如 B型流感嗜> 9 200950803 (Haemophilus )、A 型及 B 型綠膿桿菌 (Psuedomonas aeruginosa )、色葡萄 g 菌 (&叩flwrew)、B 群鏈球菌（Strept〇c〇ccus)、i 型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、14型、 18型、19型及23型肺炎鍵球菌（請)、2型及5型腺病毒、細胞巨大病毒、E_B病毒 VCA ( Epstein Barr virus VCA)、A 型肝炎病毒、B 型肝炎病毒、疱疹單純型病毒-1、疱疹單純型病毒_2、A型流行性感冒、麻疹、1型、2型及3型副流行性感冒、脊髓灰質炎、水痘帶狀疮療病毒（Varicella zoster virus )、麵菌 iApergillus)反白色念珠蛰{Candida albicans) 〇本文中提供含有第一組合物及第二組合物之組合物組合’該第一組合物含有經調配以用於不超過每月一次皮下單一劑量投藥之IG ’且該第二組合物含有經調配以用於不超過每月一次單一劑量投藥之可溶性玻尿酸酶。組合物可處於雙腔室容器中或處於彼此分離之單個容器中。在一些實例中，玻尿酸酶係位於供在IG之前投藥的容器中。該容器可為注射器、管或瓶’且可進一步含有注射用針。本文中所提供之組合物組合可含有PH20或其截短形式。舉例而言’本文中所提供之組合物組合中可包括錦羊、牛或截短型人類PH20，諸如具有SEQ ID NO:4-9中之任_ 者中所闡明之胺基酸序列的多肽或其對偶基因變異體或其他變異體。在一些實例中，組合中之可溶性玻尿酸酶為 rHuPH20。此外，組合物組合中之IG可自人類血漿純化， 200950803 且可經冷凍乾燥或為液體。在一些實例中，本文中所提供之組合物組合中之液體體積為或約為 1〇〇 ml、150 ml、200 ml、300 ml、4〇〇 mi、 500 ml、600 ml或7〇〇瓜卜組合物組合中之IG可具有為或約為IG組合物之5%至15% w/v、6%至15% w/v、或8%至 12% w/v之蛋白質濃度，諸如1〇% w/v。在一些實例中’組合物中之IG為或約為5公克（g)、l〇g、i5g、20g、2l 〇

0 22 g、23 g、24 g、25 g、26 g、27 g、28 g、29 g、30 g、 31 g、32g、33 g、34g、35 g、36 g、37g、38 g、39g 或 40 g。玻尿酸酶可為液體。在一些實例中，玻尿酸酶液體體積為或約為 1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml、8 ml、9 ml、l〇、2〇 mi或3〇 m卜且玻尿酸酶為或約為單位至500,〇〇〇單位、1〇〇單位至1〇〇〇〇〇單位、5〇〇單位至5 0,000單位、1〇〇〇單位至1〇〇〇〇單位、5〇〇〇單位至75〇〇單位、5000單位至5〇,〇〇〇單位、或1〇〇〇單位至1〇〇〇〇單位。本文中k供經調配以用於一月一次單一劑量投藥之含有免疫球蛋白（IG )及可溶性玻尿酸酶之組合物。組合物中所含有之可溶性玻尿酸酶可為pH2〇或其截短形式。舉例而言，本文中所提供之經調配以用於單一劑量投藥之組合物中可包括綿羊、牛或截短型人類pH2〇，諸如具有seq① N0:4-9中之任—者中所_之胺基酸序列的多肽或其對偶基因變異體或其他變異體。在__些實例中，組合物中之可溶性玻尿酸酶為rHuPH20。組合物中之阳可自人類血浆純 11 200950803 化’且可為液體。在例示性具體實例中，本文中所提供之經調配以用於單-劑量投藥之組合物中的IG具有為或約為1(}組合物之 5%至 15〇/〇w/v、6%至 15〇/ow/v、或 8%至 12〇/〇w/v 之蛋白濃度，諸如10%W/v。組合物中之扣為或約為5公克^)、 l〇g> 15g^20g^21g.22g.23g,24g.25g^6gg ' 27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g34g35g ^、34、388、39§或4()8，且玻尿酸酶為或約為1〇單位至500,000單位、100單位至⑽單位m 至50,000單位、1000單位至1〇〇〇〇單位、5〇〇〇單位至單位、侧單位至5〇，綱單位、或1，_單位至1()，_單位。組合物中之液㈣積可為或約為iQ()m卜i5Q如、· ml>30〇m1.4〇〇ml,5〇〇ml,6〇〇mi^7〇〇mi〇 ::中提供含有組合物組合之套組，冑等組合物組合包3 δ有經調配以田w包之_笛一6 月―次皮下單-劑量投藥〇、且合物，及含有經調配以用於不超過每月一-欠單-劑量投藥之可溶性玻尿酸酶的第二組合 =含有免疫球蛋白（IG)及可溶性玻尿酸酶之組=亦 :經調配以用於-月-次單-劑量投藥。視情況，在L 中可包括說明書。仕當組【詳述】提網 A·定義 12 200950803 Β·免疫球蛋白（IG)之皮下投藥 C. 免疫球蛋白 D. 玻尿酸酶可溶性玻尿酸酶可溶性人類PH20 可溶性重組人類PH20 ( rHuPH20 ) E.產生編碼可溶性玻尿酸酶及其多肽之核酸之方法 1. 載體及細胞

2. 表現 a. 原核細胞 b. 酵母細胞 c. 昆蟲細胞 d. 哺乳動物細胞 e. 植物 3. 純化技術 F.免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶多肽之製備、調配及投藥 1. 調配物冷凍乾燥粉末 2. 劑量及投藥 G·評定活性、生物可用率及藥物動力學之方法 1·藥物動力學及可耐受性 2.生物活性 a.免疫球蛋白 13 200950803 b.玻尿酸酶 Η.治療用途 I. 具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏症 2·血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症 3. 川崎氏病 4. 慢性發炎性髄鞘脫失多發性神經病 5·格巴二氏症候群 6. 特發性血小板減少性紫巍 7. 發炎性肌病：多發性肌炎、皮肌炎及包涵艘肌炎 8·蘭伯特-伊頓肌無力症候群 9.多灶性運動神經病 10·重症肌無力 II. 莫氏-沃特曼症候群 12·其他疾病及病狀 I.製品及套組 J·實施例 Α. 定義除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解之意義相同之意義。除非另外說明，否則在本文中遍及整個揭示案所參考之所有專利、專利申請案、公開申請案及公開案、Genbank 序列、資料庫、網站及其他公開材料係以引用之方式全文併在對於本文中之術語存在複數個定義之情況下，以

〇 200950803 本節中之彼等定義為準。在參考狐或其他該種識別符或位址之情況下’應瞭解該等標識符可變化且網際網路上之特定資訊可來回變化，作mJ，夺仁可错由搜尋網際網路發現等效資訊。對資訊之參考證明該資訊之可用性及公眾傳播。如本文中所用，「免疫球蛋白」、「T球蛋白」係指源自成人捐獻者之彙集血漿的ώ漿蛋白製劑。lgG抗體占大多數；存在其他抗體亞類，諸如IgA及IgM。治療性免疫球蛋白可藉由增加接受者之循環抗體之血清含量來提供被動免疫。妙抗體可例如與細菌毒素結合且中和細菌毒素；使病原體受調理（opsonize);活化補體；且經由與細胞因子及其受體（諸如CD5、介白素七（IL_la)、介白素_6(il_。、腫瘤壞死因子-a(TNF_a)及丁細胞受體）才目互作用來抑制病原性細胞因子及吞谨細胞。治療性免疫球蛋白可抑制自體抗體之活性。免疫球蛋白製劑亦包括（但不限於）免疫球蛋白靜脈内注射劑（immune gl〇bulin intraven〇us， IGIV)、免疫球蛋白IV、治療性免疫球蛋白。免疫球蛋白製劑為熟知的且包括諸如BayGam®、Gamimune® N、

Gammagard® S/D、Gammar®-P、lveegam® ΕΝ、Panglobulin®、 Polygam® S/D、Sandoglobulin®、Venogl〇bulin®-I、

Venoglobulin®-S、WinRho® SDF 等商標名。如本文中所用，IG可治療性疾病或病狀係指針對其使用免疫球蛋白製劑之任何疾病或病狀。該等疾病及病狀包括（但不限於）其中循環抗體增加具有改善性之任何疾病，諸如免疫缺乏症；血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血 15 200950803 症’川崎氏病，慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病（CIDP ); 格巴一氏症候群；特發性血小板減少性紫癜；發炎性肌病；蘭伯特-伊頓肌無力症候群；多灶性運動神經病；重症肌無力；莫氏-沃特曼症候群；繼發性低γ球蛋白血症（包括醫原性免疫缺乏症）；特異性抗體缺乏；急性播散性腦脊髓炎；ANCA陽性全身壞死性脈管炎；自體免疫溶血性貧血；大水皰性天疱瘡樣病；瘋痕性天疱瘡樣病；伊文氏症候群 (包括具有免疫性血小板減少症之自體免疫溶血性貧血）；母胎/新生兒同種免疫性血小板減少症；噬血細胞症候群尚風險同種異體造血幹細胞移植；IgM副蛋白血症神經病，腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調 (Opsoclonus my0Cl0nus ataxia);落葉型天疱瘡（pemphigus f〇liaCeus);尋常天疱瘡；輸血後紫癜；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群（TEN/SJS);中毒性休克症候群；阿耳滋海默氏病；全身性紅斑狼瘡；多發性骨趙瘤；膿毒病； B細胞腫瘤；創傷；及細菌、病毒或真菌感染。如本文中所用，給藥攝生法係指所投予之免疫球蛋白量及投藥頻率。給藥攝生法隨待治療之疾病或病狀而變，且因此可不同。如本文中所用，「實質上與靜脈内IG(IVIG)給藥攝生法相同」係指其中劑量及/或頻率處於有效治療特定疾病或病狀之量的範圍内且典型地約為或等於IV劑量或頻率之 10%的攝生法。有效㈣特定疾病或病狀之IVIG2量為已知的或可由熟習此項技術者憑經驗判定。舉例而言，如下 16 200950803 文所例示，300 mg/kg (亦即，假定平均成則投予21公克）至卩u 為70 kg 發性免疫缺乏疾病之患者每月投予之 ^為向具有原此，當與玻尿酸酶組合投予_，以等的典型劑量。因至600 mg/kg之劑量皮、5約為300 mg/kg 病。里皮下&予1G來治療原發性免疫缺之疾 Ο ο 如本文中所用，投藥頻率係指免疫球蛋之間的時間。舉例而言’頻率可為-週、兩週…週：：週且隨所治療之特定疾病或病狀而變。一般而言，頻率為至少母隔兩週或三週一次，且典型地不超過一月一次。如本文中所帛’玻尿酸酶係#降解玻尿酸之酶。玻尿酸酶包括細菌玻尿酸酶（EC 4 2 99 1 )、來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼類動物之玻尿酸酶（EC 3 2 1 36)及哺乳動物型玻尿酸酶（EC 3.2.135)。玻尿酸酶亦包括非人源性（包括 (但不限於）鼠、犬、猫、野兔、烏、+、綿羊、諸、馬、魚、娃科動物、細菌）玻尿酸酶中之任一者以及來自水虫至、其他寄生蟲及甲殼類動物之任何玻尿酸酶。例示性非人類玻尿酸酶包括：來自母牛（SEq m NO:1〇及11 )、小黃蜂

(yellow jacket wasp) ( SEQ ID ΝΟ··12 及 13)、蜜蜂（SEQ ID NO.14)、白臉大黃蜂（SEQ ID ΝΟ:15)、胡蜂（paper wasp) (SEQ ID NO: 16)、小鼠（SEQ ID NO: 17-19、31 )、豬（SEQ ID ΝΟ··20-21 )、大鼠（SEQ ID NO:22-24、30)、家兔（SEQ ID NO:25)、羊（SEQ ID NO:26 及 27)、猩猩（SEQ ID NO:28)、獼猴（cynomolgus monkey) ( SEQ ID NO:29)、豚 17 200950803 鼠（SEQ ID NO:32 )、金黃色葡萄球菌（Siaph/ococcw awrew·? ) ( SEQ ID NO:33 )、釀膿鏈球菌（ pyogewe·? ) ( SEQ ID NO:34 )及產氣莢膜梭菌（C/〇jiri 山'wm per/Wwge/i·?) (SEQ ID NO:35)之玻展酸酶。玻尿酸酶亦包括彼等人源性玻尿酸酶。例示性人類玻尿酸酶包括HYAL1 (SEQ ID NO:36)、HYAL2( SEQ ID NO:37)、HYAL3 ( SEQ ID NO:38)、HYAL4 ( SEQ ID NO:39)及 PH20 ( SEQ ID NO: 1 )。在玻尿酸酶中亦包括可溶性玻尿酸酶，包括綿羊及牛PH20、可溶性人類PH20及可溶性rHuPH20。對玻尿酸酶之提及包括前驅玻尿酸酶多肽及成熟玻尿酸酶多肽（諸如其中已移除信號序列之彼等玻尿酸酶多肽）、其具有活性之截短形式，且包括對偶基因變異體及物種變異體（species variant )、由剪接變異體編碼之變異體及其他變異體，包括與SEQ ID NO: 1及10-39中所闞明之前驅多肽具有至少 40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 99%以上之序列一致性的多肽或其成熟形式。舉例而言，對玻尿酸酶之提及亦包括SEQ ID NO:5 0-51中所闡明之人類PH20 前驅多肽變異體。玻尿酸酶亦包括彼等含有化學或轉譯後修飾之玻尿酸酶及彼等不含化學或轉譯後修飾之玻尿酸酶。該等修飾包括（但不限於）聚乙二醇化、白蛋白化 (albumination )、糖基化、法尼基化（farnysylation )、叛化、經化、鱗酸化及此項技術中已知之其他多肽修飾。如本文中所用，可溶性玻尿酸酶係指特徵在於其在生 18 200950803 理條件下之溶解性之客垃士拔甘ν. 多肽。舉例而言，可溶性玻尿酸酶可七^ , 37C之Tnton X_U4溶液之水相中來區別等人，〇981)J _、，256撕$ 〇

膜錨定（諸如脂Μ)破尿酸酶將分溶於富含清潔劑之相争’但在用麟月旨酶_C處理後將分溶於含清潔劑較少之相或水相中。在可溶性破尿酸酶中包括膜錨定玻尿酸酶，其中在可溶形式保持玻尿酸酶活性之情況下，已移除或修飾一或多個與玻尿酸酶對媒之财相關之區域。可溶性玻尿酸酶包括重組可溶性破尿酸酶及彼等在天然來源（諸如來自平或母牛之睾丸提取物）中所含有或自天然來㈣化之玻尿酸酶。該種可溶性玻尿酸酶之例示物為可溶性人類 PH20。其他可溶性玻尿酸酶包括綿羊（seq⑴no:”）及牛（SEQ ID NO:ll ) PH20。如本文中所用，可溶性人類PH2〇或sHuPH2〇包括成熟多肽，其缺乏所有或一部分處於c末端之糖基磷脂醯肌醇（GPI )附著位點使得該等多肽在表現後為可溶性的。例示性SHUPH20多肽包括成熟多肽，其具有SEQ⑴n〇:4_9 及47-48中之任一者中所闡明之胺基酸序列。該等例示性 sHuPH20多肽之前驅多肽包括信號序列。該等前驅體之例不物為SEQ ID NO:3及40-46中所闡明之彼等前驅體，其各自含有處於1-35位胺基酸位置上之35個胺基酸信號序列。可溶性HuPH20多肽亦包括在本文中所述之製備及純化方法期間或之後降解之彼等HuPH20多肽。如本文中所用’可溶性重組人類PH20 ( rHuPH20 )係 19 200950803 指以重組方式表現於中囚倉鼠卵巢（CHO )細胞中之人類 PH20之可溶解形式。开为^ 弋了各性rHuPH20係藉由包括信號序列

之核酸來編碼且在SEO Tn Mrv yl Λ丄B 社btQlDNO:49中闡明。亦包括為其對偶基因變異體及其他可溶性變異體之職分子。編瑪可溶性偷刪）之核酸係表現於分泌成熟多肽之⑽細胞中。如在培養基中所產生，在c末端處存在異質性使得產物包括可以各種含量包括SEQ ID職4_9中任—或多者之物質混合物。亦包括相應對·偶基因變異體及其他變異體，包括彼等與SEQ ID NO:50-51中所闡明之前驅人類pH2〇多肤相應之變異體。只要其他變異體保持玻尿酸酶活性且為可溶性的，則該等變異體可與SEQ ID NO:4-9及47-48中任一者具有 60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性。如本文中所用，活性係指與全長（完全）蛋白質相關之多肽或其部分之功能活性。功能活性包括（但不限於）生物活性、催化或酶促活性、抗原性（結合抗多肽抗體或與多肽競爭結合抗多肽抗體之能力）、免疫原性、形成多聚體之能力及與多肽之受體或配體特異性結合之能力。如本文中所用，玻尿酸酶活性係指玻尿酸酶裂解玻尿酸之能力。測定玻尿酸酶（諸如可溶性rHuPH20)之玻展酸酶活性之試管内檢定在此項技術中為已知的且描述於本文中。例示性檢定包括下文所述之微濁度（microturbidity ) 檢定（例如參見實例3 )’其藉由偵測當未裂解之玻尿酸與血清白蛋白結合時所形成之不溶性沈澱物來間接量測玻尿 20 200950803 *' 酸酶對玻尿酸之裂解。如本文中所用，天然存在t α胺基酸之殘基為在自然界中發現之20種α胺基酸之殘基，其係藉由人類中之負載 tRNA分子之同源mRNA密碼子對負載tRNA分子之特異性識別而併入蛋白質中。如本文中所用，核酸包括DNA、RNA及其類似物（包括肽核酸（PNA))及其混合物。核酸可為單股或雙股的。 f提及視情況經諸如可谓測標記物（諸如螢光或放射性標 ◎ 記物）標記之探針或引子時，涵蓋單股分子。該等分子典型地具有使其k輕對於探測或啟動（priming )文庫而言為統計上唯一的或具有低複本數（典型地小於5, 一般小於3) 之長度。探針或引子一般含有與所關注之基因互補或相同之序列的至少14個、16個或30個連續核苷酸。探針及引子可為10個、20個、30個、50個、1〇〇個或100個以上核酸長。 0 如本文中所用，肽係指長度為2個胺基酸至4〇個胺基酸之多狀。如本文中所用，本文中所提供之各種胺基酸序列中存在之胺基酸係根據其已知之三個字母或一個字母縮寫（表 1)來標示。各種核酸片段中存在之核苷酸係以此項技術中常規使用之標準單字母名稱來表示。如本文中所用，「胺基酸」為含有胺基及羧酸基團之有機化合物。多肽含有兩個或兩個以上之胺基酸。出於本文中之目的，胺基酸包括20種天然存在之胺基酸、非天然胺 21 200950803 基酸及胺基酸類似物（亦即，其中〇!碳具有側鏈之胺基酸）。如本文中所用，「胺基酸殘基」係指在使多肽在其肽鍵處化學消化（水解）後所形成之胺基酸。本文中所述之胺基酸殘基假定為呈「L」異構形式。所指定之呈「D」異構形式之殘基可替代任何L-胺基酸殘基，只要多肽仍保持所需功能特性。ΝΗ2係指多肽之胺基末端處存在之自由胺基。 COOH係指多肽之羧基末端處存在之自由羧基。符合·/·价〇/. 243: 3557-3559 (1968)中所述且 37 C_F.R..§§ 1.821-1.822所採用之標準多肽命名，表1中展示胺基酸殘基之縮寫：表1-對應表符號 1字母 3字母胺基酸 Y Tyr 酪胺酸 G Gly 甘胺酸 F Phe 苯丙胺酸 Μ Met 甲硫胺酸 A Ala 丙胺酸 S Ser 絲胺酸 I lie 異白胺酸 L Leu 白胺酸 T Thr 蘇胺酸 V Val 纈胺酸 P Pro 脯胺酸 K Lys 離胺酸 H His 組胺酸 0 Gin 麩醯胺酸 E Glu 麩胺酸 Z Glx 麩胺酸及/或麩醯胺酸 w Trp 色胺酸 R Arg 精胺酸 D Asp 天冬胺酸 N Asn 天冬醯胺 B Asx 天冬醯胺及/或天冬胺酸 C Cys 半胱胺酸 X Xaa 未知或其他 22 200950803 應注意’本文中藉由各式所表示之所有胺基酸殘基序列在胺基末端至羧基末端之習知方向上具有自左至右之定向。另外’短語「胺基酸殘基」經廣泛定義以包括對應表 (表1 )令所列之胺基酸及經修飾及不常見之胺基酸（諸如 37 (：·Ρ·Κ·§§1·821-1.822中所提及且以引用之方式併入本文中之彼等胺基酸）。此外，應注意，在胺基酸殘基序列之開

端或末端處之短劃線指示與具有一或多個胺基酸殘基之另一序列、與胺基端基（諸如ΝΗ2 )或與羧基端基（諸如C〇〇H) 鍵結之肽鍵。如本文中所用，「天然存在之胺基酸」係指多肽中存在之20種L-胺基酸。如本文中所用，「非天然胺基酸」係指具有類似於天然胺基酸之結構但已在結構上經修飾以模擬天然胺基酸之結構及反應性的有機化合物。非天然存在之胺基酸因此包= 〇例如除2G種天然存在之胺基酸以外之胺基酸或胺基酸類似物且包括（但不限於）胺基酸之D_立體異構體。例示性非天然胺基酸描述於本文中且為熟習此項技術者所知。如本文中所用，DNA構築體為單股或雙股、線狀或環狀DNA分子’其含有以在自然界中未發現之方式組合及並列之DNA片段。DNA構築體係作為人類操作之產物存在且包括所操作分子之純系及其他複本。如本文中所用，腿鏈段為具有特定屬性之較大分子之-部分。舉例而言，編碼特定多肽之舰鍵段為較 23 200950803 長dna分子之一部分，諸如質體或質體片段，當自5，至3, 方向讀取時，其編碼特定多肽之胺基酸序列。如本文中所用’術語多核苷酸意謂自51末端至3，末端讀取之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基之單股或雙股聚合物。多核苷酸包括RNA及DNA且可自天然來源分離、 »式管内合成或自天然與合成分子之組合製備。多核苷酸分子之長度在本文中係以核苷酸（縮寫為「nt」）或鹼基對（縮寫為「bp」）形式給出。在上下文允許之情況下術語核苷酸係用於單股及雙股分子。當該術語用於雙股分子時，其用於表不總長且應瞭解其等同於術語鹼基對。熟習此項技術者應認識到，雙股多核苷酸之兩條鏈可在長度上略微不同且其末端可交錯排列；因此雙股多核苷酸分子中之所有核苷酸可不成對。該等不成對末端之長度一般應不超過個核苷酸。如本文中所用，兩個蛋白質或核酸之間的「相似性」係指蛋白質之胺基酸序列或核酸之核苷酸序列之間的關聯性。相似性可基於殘基與其中所含有之殘基之序列一致度及/或同源度。評定蛋白質或核酸之間的相似度之方法為熟習此項技術者所知。舉例而言，在評定序列相似性之—方法中，以產生序列之間的最大程度之一致性的方式使兩個胺基酸或核苷酸序列比對。「一致性」係指胺基酸或核苷酸序列之不變程度。胺基酸序列及在某種程度上核苷酸序列之比對亦可考慮胺基酸（或核苷酸）中之保守差異及/或常見取代。保守差異為保留所涉及之殘基之物理化學特性之 24 200950803 差異。比對可為全局的（在序列之整個長度上且包括所有殘基之所比較序列之比對）或局部的（僅包括最相似區域之一部分序列之比對）。「一致性」本身具有此項技術公認之意義且可使用所公開之技術來計算（參見例如：Mo/eeM/af

6 少，Lesk，A.M.編，Oxford University Press，New York 1988 ； Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.I^, Academic Press, New York, 1993 ； Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.jSl Griffin, H.G.編，Humana Press, New Jersey, 1994 ; nSegwewce 少; in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 ；及 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及 Devereux, J·編，M Stockton Press，New York, 1991 )〇雖然存在許多量測兩個多核苷酸或多肽之間的一致性之方法，但術語「一致性」為熟習此項技術者所熟知（Carillo，H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math ^5:1073 (1988)) ° 如本文中所用，同源性（關於核酸及/或胺基酸序列）意謂約大於或等於2 5 %序列同源性，典型地大於或等於 25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或 95%序列同源性；必要時可說明精確百分比。出於本文中之目的，除非另外說明’否則術語「同源性」與「一致性」常常可互換使用。一般而言，為測定同源性或一致性百分比，比對序列以獲付最南程度之匹配（參見例如： 5/<?/〇容少，Lesk，A.Μ·編，Oxford University Press， 25 200950803

New York, 1988 ； Biocomputing: Informatics and Genome iVo/.ech， Smith, D.W.編，Academic Press, New York， 1993 i Computer Analysis of Sequence Data, Part /, Griffin, A.M·及 Griffin，H.G.編，Humana Press，New Jersey, 1994 ;

Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G·， Academic Press， 1987 ;及 SegMewce Primer,

Gribskov，M.及 Devereux，J·編，M Stockton Press, New York, 1991 ; Carillo 等人（1988) 孝5:1073 )。藉由序列同源性，保守胺基酸之數目可藉由標準比對演算 ^ 程式來測定且可與由每一供應者所建立之預設空隙處罰一起使用。實質上同源之核酸分子始終沿所關注核酸之長度以中等嚴格度或高嚴格度典型雜交。亦涵蓋含有簡并密碼子來代替雜交核酸分子中之密碼子的核酸分子。無論任何兩個分子具有至少60%、70%、80%、85%、

90%、95%、96%、97%、98%或99%「同一性」或「同源性」之核苷酸序列或胺基酸序列，一致性或同源性可使用已知電腦算法，諸如使用如Pearson等人（1988) Proc. iVizi/· 乂cai/. •Sci. 55:2444中之預設參數之「FASTA」程式（其他程式包括 GCG 程式包（Devereux, J.專尺，Nucleic Acids Research 12(1):3^1 (1984)) ' BLASTP ' BLASTN ' FASTA (Atschul, S.F.# A, J Molec Biol 275:403 (1990) ； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 編，Academic Press, San Diego, 1994 ;及 Carillo 等人（1988) ·/ jpp/iei/ ΜαίΛ 1073 ))。舉例而言，國家生物技術資訊中心資料庫 26 200950803 (National Center for Biotechnology Information database) 之BLAST功能可用於測定一致性。其他市售或公開可用之程式包括 DNAStar「MegAlign」程式（Madison，WI)及威

斯康星大學（University of Wisconsin) Genetics Computer Group ( UWG )「Gap」程式（Madison WI )。蛋白質及/或核酸分子之同源性或一致性百分比可藉由例如使用GAP電腦程式比較序列資訊來測定（例如Needleman等人（1970) ·/. Μο/· _5ζ·ο/· 48:443 (如藉由 Smith &Waterman((1981)di/v· /· Μα ίΛ 2:482)所改編））〇簡而言之，G AP程式將相似性定義為相似之所比對符號（亦即核苷酸或胺基酸）的數目除以兩個序列中較短者中之總符號數目。GAP程式之預設參數可包括：（1)如由Schwartz及Dayhoff編，WrUS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation，第 353-358 頁（1979)所述，Gribskov 等人（1986) A^wc/. 14:6745 之一元比較矩陣（含有一致性之1值及非一致性之〇值）及加權比較矩陣；（2 )每一空隙3.0之處罰及每一空隙中之每一符號之額外0.10之處罰；及（3 )末端空隙無處罰。因此，如本文中所用，術語「一致性」或「同源性」表示測試與參照多肽或多核苷酸之間的比較。如本文中所用，術語「至少90%—致性」係指相對於多肽之參照核酸或胺基酸序列90%至99.99%之一致性百分比。90%或90% 以上程度之一致性指示下列事實，假定出於例示之目的比較100個胺基酸長度之測試及對照多肽。測試多肽中不超 27 200950803 過ιο°/。（亦即’ 100個胺基酸中有ι〇個胺基酸）之胺基酸與參照多肽中之胺基酸不同。可在測試多核苷酸與參照多核苷酸之間進行類似比較。該等差異可表現為隨機分布於多肽之整個長度範圍内之點突變或其可在不同長度之一或夕個位置上叢集直至達到最大可容許差異，例如1〇/丨胺基酸差異（約90%—致性广差異係定義為核酸或胺基酸取代、插入或缺失。在同源度或一致度高於約85%_90%之情況下，結果應獨立於程式及空隙參數組；該種高一致度常常可藉由手動比對來容易地評定而不依靠軟體。如本文中所用，比對序列係指使用同源性（相似性及/ 或一致性）來比對核苷酸或胺基酸序列中之相應位置。典型地比對以50%或50%以上一致性相關之兩個或兩個以上序列。比對序列組係指在相應位置處比對之2個或2個以上序列且可包括與基因組DNA序列比對之源自rNA之比對序列（諸如EST及其他cDNA )。如本文中所用，「引子」係指可在合適緩衝液中且在合適溫度下於合適條件（例如，在4種不同核苷三磷酸及聚合劑（諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或反轉錄酶）存在下）下可充當模板引導型DNA合成之起始點的核酸分子。應瞭解，某一核酸分子可用作「探針」及「引子」。然而，引子具有3'羥基以供延長。引子可用於多種方法中，包括例如聚合酶鏈反應（PCR)、反轉錄酶（rT) _pcR、RNA pCR、 LCR、多重 PCR ( multiplex PCR) ' 鍋柄式 pCR ( panhandie PCR)、捕捉 PCR( capture PCR)、表現 pCR、3，及 5, RACE、 28 200950803 原位PCR、連接介導型PCR及其他擴增方案。如本文中所用，「引子對」係指包括與待擴增（例如藉由PCR)之序列之5'末端雜交的5·(上游）引子及與待擴增序列之3’末端之互補序列雜交的3,（下游）引子的一組引子。如本文中所用，「特異性雜交」係指藉由核酸分子（例如寡聚核苷酸）與目標核酸分子之互補鹼基配對來黏接。熟習此項技術者熟悉影響特異性雜交之試管内及活體内參 ^ 數，諸如特定分子之長度及組成。與試管内雜交尤其相關之參數進步包括點接及洗務溫度、緩衝液組成及鹽濃度。移除非特異性結合之核酸分子之例示性洗滌條件在高嚴格度下為O.lxSSPE、〇.1% SDS、65t：且在中等嚴格度下為0.2XSSPE、0.1% SDS、50°C。等效嚴格度條件在此項技術中為已知的。熟習此項技術者可容易地調節此等參數來達成核酸分子與適於特定應用之目標核酸分子的特異性雜 Q 父。當提及兩個核苷酸序列時，互補意謂兩個核苷酸序列 U 能夠雜交，其中對置核苷酸之間的錯配典型地小於25%、 15%或5%。必要時，說明互補性之百分比。典型地，兩個分子經選擇以使其在高嚴格度條件下雜交。如本文中所用，實質上與產物相同意謂足夠相似以致所關注之特性充分保持不變使得實質上相同之產物可代替產物使用。如本文中所用，亦應瞭解，術語「實質上相同」或「相似」隨如熟習相關技術者所理解之内容而變。 29 200950803 如本文中所用，對偶基因變異體或對偶基因變異係指佔據相同染色體位點之基因的兩種或兩種以上替代形式中之任一者。對偶基因變異天然地經由突變而發生且可引起群體内之表現型多型現象。基因突變可為沉默的（所編碼之多肽未發生變化）或可編碼具有改變之胺基酸序列的多肽。術語「對偶基因變異體」在本文中亦用於表示由基因之對偶基因變異體所編碼之蛋白質。基因之參照形式典型地編碼物種之群體或單個參照成員之多肽的野生型形式及/ 或主要形式。典型地，包括物種間及物種内之變異體的對偶基因變異體典型地與相同物種之野生型及/或主要形式具有至少80%、90%或90%以上之胺基酸一致性；一致度視基因而定且與比較為種間或種内比較無關。冑内對偶基因變異體一般與野生型及/或主要形式具有至少約80%、85%、 90%或95%或95%以上之—致性，包括與多肽之野生型及/ 或主要形式具有96%、97%、98%、99%或99%以上之一致性。本文中對對偶基因變異體之提及一般係指相同物種之成員之間的蛋白質變異。如本文中所用，在本文中可與「對偶基因變異體」互換使用之「對偶基因」係指基因或其部分之替代形式。對 :基因佔據同源樑色體上之相同位點或位置。當個體具有 :之兩個相同對偶基因時，認為該個體關於彼基因或對因為純β的。當個體具有基因之兩個不同對偶基因夺在：：該個體關於該基因為雜合的。特定基因之對偶基在單個核普酸或若干核普酸中可互不相同，且可包括核 30 200950803 基因之對偶基因亦可呈含有突苷酸之取代、缺失及插入變之基因形式。如本文中所用，物種變異體係指不同物種（包括哺乳動物物種，諸如小鼠及人類）間之多肽變異體。只一種工所產如本文中所用，剪接變異體係指藉由對產生不類型之mRNA的基因組DNA之初級轉錄物之分化加生之變異體。

0 如本文中所用，修飾係指對吝伯耵夕肽之胺基酸序列或核酸

刀子中之核普酸序列之修飾，且合別句紅卜# A 刀另J包括胺基酸及核苷酸之缺失、插入及置換。修飾多肽古哪夕肽之方法對於熟習此項技術者為常規的，諸如藉由使用重組DNA方法。如本文中所用’術語啟動子意謂含有提供RNA聚合酶結合及轉錄開始之舰序列的—部分基因。啟動子序列通常但不總是見於基因之5·非編碼區中。如本文中所用，經分離或純化之多肽或蛋白質或其生物學活性部分實質上不含來自細胞或組織（蛋白質自幻寻到）之細胞物質或其他污染蛋白質，或實質上不含化學合成時之化學前驅體或其他化學物質。若如藉由熟習此項技術者所用之用於較純度之標準分析方法（諸如薄層層析法（TLC)、凝膠電泳及高效液相層析法（HpLc))所測定，製劑似乎不含可易於_之雜f，或其足夠純以至進一步純化不會可偵測地改變該物f之物理及化學特性（諸如酶及生物活性）’則可將製劑測定為實f上不含雜質的。用於、化σ物以產生實資上化學純化合物之方法為熟習此項 31 200950803

技術者所知。然而，實皙卜彳卜塾紅A 貫質上化學純化合物可為立體異構體之混合物》在該尊•降π π & ., 月况下，進一步純化可增加化合物之比活性。術語實質上不含細胞物質包括蛋白質製劑，其中蛋白質係自細胞之細胞組份所分離，纟白f係自該等細胞所分離或以重組方式產生。纟—具體實例中，術語實質上不含細胞物質包括酶蛋白質製劑，其具有小於約3〇%(以乾重計）之非酶蛋白質（在本文中亦稱作污染蛋白質），一般小於約20%之非酶蛋白f《1()%之非酶蛋白質或小於約^。之非酶蛋白f胃以重組方式產生酶蛋白質時，其亦實質上不含培養基’亦即培養基相當於酶蛋白質製劑體積之小於約或等於20%、1〇 %或5%。如本文中所用，術語實質上不含化學前驅體或其他化學物質包㈣蛋白質製劑’纟中蛋白質係自涉及該蛋白質合成之化學前驅體或其他化學物f所分離。該術語包括酶蛋白質製劑’該等酶蛋白f製劑具有小於約3〇% (以乾重計）、20%、10%、5%或5%以下之化學前驅體或非酶化學物質或組份。如本文中所用’與合成有關 < (例如）合成核酸分子或合成基因或合成肽係指藉由重組方法及/或藉由化學合成方法所產生之核酸分子或多肽分子。如本文中所用，藉由使用重組DNA方法之重組方式進行製備意謂使用熟知之分子生物學方法來表現由選殖DNA 編碼之蛋白質。 32 200950803 如本文中所用’載體（或質體）係指用於將異源核酸 y入細胞中以使其表現或複製之分立Ml體典㈣保持為游離型，但可經設計以達成將基因或其部分整合至基因組之染色體卜亦涵蓋為人工染色體之栽體，諸：酵母人工染色體及哺乳動物人工染色體。該等運載體之選擇及使用為熟習此項技術者所熟知。如本文中所用，表現載體包括與調節序列（諸如啟動〇 Ο ^區）操作性連接之能夠表現DNA的载體，該等調節序列能夠達成該等DNA片段之表現。該等額外鏈段可包括啟動子及終止子序列，且視情況可包括一或多個複製起點、一或多個可選擇標記、增強子、聚料酸化信號及其類似物。表現栽體一般源自質體或病毒DNA或可含有此兩者之元件。因此，表現載體係指重組DNA或RNA構築體，諸如質體、噬菌體、重組病毒或其他載體，其在引入合適宿主細胞後引起選殖DNA之表現。合適表現載體為熟習此項技術者所熟知且包括彼等在真核細胞及/或原核細胞中可複製之載體及彼等保持游離型之載體或彼等整合至宿主細胞基因組中之載體。。如本文中所用，載體亦包括「病毒載體」。病毒載體為操作I1生連接至外源基因以（作為運載體或穿梭载體）將外源基因轉移至細胞中之工程改造病毒。、如本文中所用，當提及DNA鏈段時，可操作地或操作性連接意謂該等鏈段經排列以使其功能與其預期目的相一致，例如轉錄在啟動子中開始且經由編碼鍵段進行至終止 33 200950803 子。如本文中所用，術語評定意欲包括在獲得樣品中所存在之蛋白酶或其結構域（domain )之活性的絕對值的意義上且亦在獲得表明該活性程度之指數、比率、百分比、視覺或其他值之意義上之定量及定性測定。評定可為直接或間接的且實際上所 <貞測之化學物質當然無需為蛋白質水解 f物自身’但可為例如其衍生物或一些其他物質。舉例而否，可諸如藉由SDS-PAGE及用庫馬斯亮藍（coomasieblue) 對蛋白質染色來偵測補體蛋白質之裂解產物。如本文中所用，生物活性係指化合物之活體内活性或活體内投予化合物、组人你七 ’ ’’ σ物或其他混合物後所產生之生理反應。生物活性因此涵蓋該等化合物、組合物及混合物之療作用及醫樂活性。& %、、本以 ^ 生物活性可在經設計以測試或使用該等活性之試管内系統中進行觀察。因此，出於本文中之目的’蛋白酶之生物活性為其使多肽水解之催化活性。如本文中所用’當提及兩個核酸序列時，等效音謂所时論之兩個序列編碼胺基酸或等丞敗次寺效蛋白質之相同序列。當等效用於提及兩値蛋白質或肽時，其意謂兩個蛋白質或肽具有實質上相同之胺基酸序列而僅僅胺基酸取代不會實質上改變該蛋白質或肽之活性或功貫貫貿 /此备4效係指特性時，該特性無需以相同程度呈現（例如，网1固肽可展現相同類型酶促活性之不同速率），但該等门的。性通常為實質上相同如本文中所用調節」或「改變」係指諸如蛋白質之 34 ( 200950803 分子之活性變化。例示性活性 |土巴枯（但不限於、轉導之生物活性。調節可自杠斗u 、）諸如k號活性增加（亦即，々或促效活性）、活性降低（亦g π上調即其他活性變化（諸如週期性、頻率、持續時門i次任何其他參數之變化）。調節可視情、、··、動力學或定狀態相比擬，例如野生型蛋白調知一才曰質或如指定細胞類型或條件下 '構成狀態之蛋白卞卜所表現之蛋白質。 ϋ 0 如本文中所用，組合物係指任何混合懸浮液、液體、散劑、糊劑、7tc A t j馮心液組合。水-液、非水溶液或其任何如本文中所用，組合係指兩個或兩個之中的任何聯合。組合可為兩個或兩個以上之分開項目2 如兩個組合物或兩個集合），可盔 _ ’、’、/、、彳昆合物（諸如兩個或兩個以上項目之單個混合物）《其任何變體。組合之組份一叙在功能上有關或相關。如本文中所用，套組為視情 υ匕括其他組份（諸如額外試劑）及該組合或其組份之使用用。兒明書之經包裝組合。如本文中所用，「疾病或病症 ,, 」係h在有機體中由包括 (但不限於）感染、後天病狀贵 ^ 遺傳病狀之原因或病狀所引起之病理病狀，且該病理病狀疋特徵在於可識別之症狀。本文中所關注之疾病及病症為 7正馮彼專可由免疫球蛋白治療之疾病及病症。如本文中所用，「治療」具有疾、g + + d 电^ ’展病或病狀之個體意謂治療後個體之症狀部分或完全減輕 4保持靜止狀態。因此， 35 200950803 治療涵蓋預防、治療及/或治癒。預防係指預防潛在疾病及/ 或預防症狀惡化或疾病進展。治療亦涵蓋本文中所提供之免疫球蛋白製劑及組合物之任何醫藥用途。如本文中所用，醫藥學有效劑包括任何治療劑或生物活性劑，包括（但不限於）例如麻醉劑 '血管收縮劑、分散劑、習知治療藥物（包括小分子藥物及治療性蛋白質）。如本文中所用，治療意謂改善或以其他方式有利地改變病狀、病症或疾病或其他適應症之症狀的任何方式。如本文中所用，治療作用意謂由個體治療所引起之改變、典型地改良錢善疾病或病狀之症狀或治癒疾病或病狀的作用。治療有效量係指向個體投予後產生治療作用之组合物、分子或化合物之量β 如本文中所用’術語Γ個體」係指動物，包括諸如人類之哺乳動物。如本文中所用，患者係指人類個體。如本文中所用，藉由諸如投予醫藥組合物或其他治療劑之治療來改善特定疾病或病症之症狀係指可歸因於投予組合物或治療劑或與投予組合物或治療劑有關之任何症狀減輕作用（無論持久或暫時的，持續或短暫的）。如本文中所用防止或預防係指降低疾病或病狀發生風險之方法。如不又Τ “ 双篁」或 /ϋ深另双剛篁」指至少足以產生治療作用之劍儿人& # π <劑、化合物、物質或含有化物之組合物之量。因此，其兔祐共為預防、治癒、改善、抑制 36 200950803 部分抑制疾病或病症之症狀所必需之量β 如本文中所用’單位劑型係指如此項技術中所知適用於人類及動物個體且經個別包裝之物理分立單元。如本文中所用，單一劑詈难耐札Μ > Λ

早劑量凋配物係指用於直接投藥調配物。议樂I 如本文中所用，「製品」為製成且出售之產品。如貫穿本申請案所使用’該術語意欲涵蓋包裝物品中所容納之沁及玻尿酸酶組合物。 ' ϋ Ο 如本文中所用，流體係指任何可流動之組合物。因此流體涵蓋呈半固體、糊劑、溶液、水性混合物、凝膠、洗劑、乳紊劑及其他該等組合物形式之組合物。 ' 如本文中所用，「套組」係指本文中所提供之組合物與出於包括（但不限於）活化、投藥、診斷及評定生物活性 =性之目的之另一項目的組合。套組視情況包括使用說如本文令所用，細胞提取物或溶解產物係指由溶破裂之細胞製成之製劑或部分》 ' 5 如本文中所用，動物包括任何動物，諸如（但不包括人類、大猩猩及猴之靈長類動物；齧齒動物諸如小鼠及大鼠；家禽，諸如雞·，反舞動物，諸如山羊、母 Μ 鹿、羊；綿羊，諸如豬及其他動物。非人類之動物不2括人類作為所涵蓋之動物。本文中所提供之酶係來自任：源（動物、植物、原核及真菌來源）。大部分酶具有包括乳動物起源之動物起源。 37 200950803 如本文中所用’對照係指測試樣品實質上相同之樣品，可來自未受所關注之病狀影響内部對照。除未用測試參數處理以外與或者若其為血漿樣品，則其之正常志願者。對照亦可為如本文中所用形式「一」及「該包含「細胞外域」細胞外域之化合物除非上下文另外清楚規定，否則單數」包括複數個指示物。因此，例如，對化0物之知·及包括具有一個或複數個如本文中所用，範圍及量可以「約」特定值或範圍之形式來表示。約亦包括精確量。因此「約5個驗基」意謂「約5個鹼基」及「5個鹼基如本文中所用，「任選」或「視情況」意謂出現或不出現隨後所述之事件或情境，且該描述包卿事件或情境出現之情況及該事件或情m現n舉例而言，視情况經取代之基團意§胃該基團未經取代或經取代。如本文中所用’除非另外指示，否則任何保護基困、胺基酸及其他化合物之縮寫係根據其―般用法、公認縮寫或服AC-IUB生物化學命名委員會（iupac iub

Commission on Biochemical N〇menclature)(參見 Biochem. 11： 1 726 ) » B.免疫球蛋白（IG)之皮下投藥本文中提供治療1G可治療性疾病及病狀之方法及用途，其係藉由皮下投予與可溶性玻尿酸酶組合之免疫球蛋白（IG)。因此，亦提供IG與可溶性玻尿酸酶之組合。藉 38 200950803 Ο ο 助於玻尿酸酶分解細胞外基質中之玻尿酸的能力，玻尿酸酶有助於治療劑之皮下輸注。免疫球蛋白為治療劑，其主要藉由靜脈内投予以治療具有免疫缺乏症之個體（稱作 IVIG治療）加以給予。在玻尿酸酶存在下，IG之生物可用率大於IVIG治療後IG之生物可用率之9〇%。因此，在本文中所提供之方法及用途中，玻尿酸酶與IG之組合治療允許以類似於IVIG治療之劑量及頻率來皮下投予免疫球蛋白。因此，在本文中所提供之方法及用途中，當在可溶性玻尿酸酶存在下皮下投予時，對於特定適應症而言ig可以主要mG劑量每月-次投予。此外，因為玻尿酸酶用以開放皮膚中之流動通道，所以其可加快輸注速率。因此，皮下投予與玻尿酸酶共同調配及/或共同投予之IG的方法增加輸注速率且從而減少IG治療之傳遞時間。曰缺fe型抗體形成為大多數原發性免疫缺乏（灿）疾病之最常見異常症狀；其最常反映於灰清免疫球蛋白減少，其繼而尤其導致寶肺呼吸道對細菌感染之敏感性增加。在具有抗體缺乏（諸如X-連結無γ球蛋白血症、免疫球蛋白重鏈缺失、選擇性免疫球蛋白G(IgG)亞類缺乏異性免疫缺乏症戋χ_遠绅古變中發現免疫球蛋白Μ症候群）之個體 :發現免疫球蛋白含量減少。在具有歸因於Τ細胞及Β細胞缺乏之複合免疫缺乏症（諸如（但不限於）疫缺乏症或維斯科特.奥爾德。免免疫球蛋白含量減少（则個體中亦發現具有此等疾病之個艚赍 miUee} 19") ° 等疾扃之個體需要用免疫球蛋白產品進行替代 39 200950803 治療以防止或降低感染嚴重度。最初，免疫球蛋白替代治療係以肌肉内途徑給予，但1981年開始已藉由靜脈内（IV ) 途徑治療絕大多數患者。當前，美國之大多數免疫球蛋白產品係用於IV投予。然而，近年來已開發用於皮下投予之免疫球蛋白製劑（Gardulf 等人（2006) Curr. Opin. Allergy

Clin. Immunol., 6: 434-42; Gardulf 等人（2006)】0^11· Immunol·，26: 177-85 ; Ochs 等人（2006) J Clin· Immunol.， 26:265-73 )。至少一種產品vivaglobin®經批准用於皮下投 ° 目前使用之所有免疫球蛋白製劑係以16%來調配，相比而言，IVIG製劑係以5%至12%來調配。相對於IV製劑之較高濃度使得輸注體積較小，該等製劑不可靜脈内輸 >主。免疫球蛋白替代治療之該等皮下方法視作安全有效且亦受到患者高度評估，因為其具有低全身性不良反應風險且引起與每月iv輸注相比較高之最低血清IgG濃度 (Gardulf 等人（1995) J Adv. N亂，21: 917_27; Gardulf 等人（1993) Clin· Exp. lmmun〇i.，92: 200-4 ; Gardulf 等人 (1991) Lancet, 338: 162-6 ) 〇皮下投予之免疫球蛋白之生物可用率—般小於靜脈内輸注之免疫球蛋白之生物可用率。免疫球蛋白可直接到達企液中’且經3至5日緩慢平衡至血管外代謝區（等人（1986) J. Clin. immunol，6:256_64)。皮下投予之免疫球蛋白自皮下m緩慢吸收至血液中且同時與血管外代謝區平衡’不存在高IV峰值。未對生物可用率進行廣泛研究， 40 200950803 但在ZLB-Behring製劑（亦即Vivagl〇Mn®)之新近試驗中，藉由量測曲線下面積（AUC )測定出僅67%之免疫球蛋白得到吸收且因此推薦劑量為IV劑量之137% ( 〇chs等人 (2006) J Clin· Immunol·’ 26:265-73 )。儘管比較 2 種不同投

藥途徑及頻率之AUC存在技術困難，但向家兔皮内投予免疫球蛋白之研究暗示經由皮下途徑存在降低之生物可用率。此可能歸因於大蛋白質分子之吸收模式，其不能經由毛細管壁容易地擴散且必須經由淋巴管吸收（Supersaxo等人（1990) Pharm. Res.，7: 167-9)。除與IG之皮下投藥有關之生物可用率問題以外，sc 投藥之主要缺點在於在每一部位中僅可輸注小體積，使得以每週或每兩週（每隔一週）計需要使用多個部位。一般而言’使用16%溶液時’每部位可輸注約2〇 ml ;且接受每公斤體重（BW ) 400 mg之成人患者因此需要每週至少3個部位或每月12個部位。即使每週或每兩週投藥比每月iv 輸注具有保持較佳之最低含量之附加優勢，但對於許多患者而言多次針頭插入之要求已成為威懾因素。 SC空間係由以凝膠狀物質（玻尿酸）填充之膠原蛋白網狀物形成。玻尿酸經約5h之半衰期置換且主要負責阻礙流體流經組織。玻尿酸酶暫時消化玻尿酸，從而促進輸注液進入皮下空間。玻尿酸在24小時内恢復，未留下可觀察之變化。因此’歸因於玻尿酸酶經由降解葡糖胺聚糖而開放間質空間中之通道的能力，投予可溶性玻尿酸酶允許分子擴散’從而改良該荨共同調配或共同投予之分子之生物 200950803 可用率、藥物動力學及/或藥效學特徵。在一些實例中，與玻尿酸酶皮下共同投予之IG之生物可用率為IVIG生物可用率之70%、80%、90%、91%、92%、 93%、94% ' 95%、96%、97%、98%、99%或 100% ° 生物可用率典型地大於90%。此外，與可溶性玻尿酸酶共同投予允許在單個皮下部位處大體積輸注。舉例而言，可以單個坐姿在單個部位投予至多600 ml或更大體積之IG，舉例而言，在單次投藥中可在單個部位投予200 ml、300 ml、400 ml、5 00 ml、600 ml或600 ml以上。因此，以等於或介於 5%-12%之間調配之IG製劑可以等於每月一次IVIG劑量之劑量（例如等於或約為 100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg、 400 mg/kg、500 mg/kg、600 mg/kg 或 600 mg/kg 以上）與可溶性玻尿酸酶皮下共同投予。因此，藉由在可溶性玻尿酸酶存在下皮下投予IG，解決了與IG之皮下投藥相關之一種或全部顧慮及問題。因此，藉助於玻尿酸酶之擴散特性，在可溶性玻尿酸酶存在下皮下投予IG允許以每月一次 IVIG頻率投予IVIG劑量，同時保持IVIG生物可用率。以下章節描述本文中之組合中之例示性免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶，其製造方法及使用其治療IG可治療性疾病及病狀之方法。 C. 免疫球蛋白

本文中提供免疫球蛋白（IG，亦稱作γ球蛋白或IgG )，其可與可溶性玻尿酸酶組合用於皮下投藥。IG用以藉由調節補體活性、抑制自體抗體產生、飽和或阻斷巨噬細胞及B 42 200950803 淋巴細胞上之Fc受體及抑制諸如細胞因子、趨化因子及金屬蛋白酶之發炎性介體產生來增強免疫系統。

IG為在高等動物血漿中發現之蛋白質片段且含有大量具有不同特異性之抗體。一般而言，IG含有血清免疫球蛋白，其可為任何個體基因型（諸如IgG )及各種亞類（IgA、 IgM、IgD、IgE )。各種免疫球蛋白或亞類可以各種濃度及特異性存在，在免疫球蛋白製劑之間該等濃度及特異性可視例如血漿捐獻者對抗原之暴露（例如，藉由接種方式）而不同。免疫球蛋白常常以在血清中正常所見之量存在（參見表2 )，但可使用純化步驟以改變特定免疫球蛋白類別之比率。IG製劑典型地含有90%或90%以上之IgG，諸如 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或99%以上之IgG。免疫球蛋白可為多株或單株的。製劑典型地包括高百分比之單體IgG及低IgA含量。表2 :血清免疫球蛋白 Ig類血清含量mg/ml (%) 功能 IgG 1200 (77) 人類之主要Ig IgA 200 (13) 保護黏膜 IgM 150 (9) 用於初次免疫反應之主要Ig IgD 2 (<1) 調節B細胞 IgE <1 (痕量）過敏反應中之主要Ig 免疫球蛋白可自人類或動物血液分離或以其他方式產生，例如藉由重組DNA技術或融合瘤（hybridoma )技術製備。舉例而言，免疫球蛋白可使用任何合適分離程序（例如醇沈澱或離子交換分離）而自組織、淋巴細胞融合瘤培 43 200950803 養物、血漿或血清或重組細胞培養物獲得。一般而言，IG 可自血漿藉由醇分餾來製備，該方法（諸如）最初由c〇hn 使用且由Oncley修改（柯恩·昂柯利（c〇hn_〇ncley )方法，參見例如 Cohn 等人（1946) J· Am· Chem. Soc. 68: 459-475 ; Oncley 等人（1949) J Am. Chem· Soc·, 71: 541-550 )。在純化中使用私可使潛在污染病毒滅活。柯恩-昂柯利方法可使蛋白質變性且聚集，其可產生可用作抗體_抗原複合物之高分子量形式，該等抗體-抗原複合物具有自由固定補體之能力。為防止該等不需要之作用’經修改之柯恩-昂柯利方法已經發展用於製備及純化IG。各種該等程序為已知的且可經調適及修改以用於本文中之IG製備。鑒於此項技術中已知且可用之詳細方法，製備IG製劑係在此項技術之技術範圍内。典型地使用一級低溫乙醇分餾及二級分離來製造 IG，該等分離可包括化學修飾 '在存在或不存在胃蛋白酶之情況下於4_0之PH下培育、pEG沈澱、離子交換層析、酶促裂解、溶劑清潔劑處理及透濾及超濾中之任一或多者。舉例而言，藉由習知技術（諸如超離心或排阻層折）分離IG聚集體使得獲得具有低抗補體活性之產物成為可月匕°IG製備之其他方法包括（但不限於）藉助於乙二醇聚合物使人類血漿分離之方法（p〇ls〇n等人（1964)Bi〇chim

Biophys. Acta.，82: 463-475 );自由柯恩分離所分離之物質開始將聚乙二醇（peg )作為純化劑併入（館分π或η + ItI，參見例如美國專利第4,〇93,6〇6號及第4，165,37〇號）；及其他使用聚乙二醇之純化製程之類似方法（Ep 〇246579 )。此 44 200950803 ϋ Ο 外，已描述用於獲得展現低抗補體活性之IG的方法，其係藉由用諸如胃蛋白酶、血纖維蛋白溶酶、固定化姨蛋白酶之酶處理、在中度酸性PH下處理、B_丙内酯處理、使用聚乙二醇作為沈澱劑之分離方法及美國專利第4,〇93,6〇6號、第4，126,605號、第3,966,906號及第4，124,576中所述之其他技術來進行。其他方法係基於藉由用還原劑、醇化、烷基化及磺化處理沁分子而對1(3分子之化學及部分修飾（參見例如美國專利第M75,848號）。離子交換層析可用於自用於獲得IG製劑之起始物質消除不合需要之污染物（參見例如美國專利第3,869,436號、Ep 913〇〇79〇及w〇 94/29334)。刪難3描述基於離子交換層析及在弱酸性 PH下透遽而適用於促進靜脈内產品製備之技術組合。亦描述此項技術中之其他方沐B甘Α μ ™ T T 他方去且其為热習此項技術者所知（束見例如美國專利第5，177，194號及第6,875,848號)/ ^製劑應經處理以移除病毒負荷。存在兩種降低病毒負荷之方法：病毒滅活及症表夂届鲁々離或移除。使病毒減活之例不性方法包括（但不限於）低溫乙醇分顧、加熱（巴氏殺菌（pasterurization))、溶劑/清潔劑及酸性環境（低ΡΗ)。舉例而言，溶劑/清潔劑太 _ 方法已經證明具有針對VSV (水躺性口炎病毒）、辛得比斯、由主

斯病毒（Sindbis virus )、HIV、HBV

(B性肝炎病毒）及Hcv BV (^•肝犬病毒）之殺病毒作用。例示性病毒分離或移除包哥作用 v 陈包括（但不限於）低溫乙醇分餾、相分離或PEG沈殿、親知層析、離子交換或凝膠排阻層析及過慮。〜 45 200950803 亦須製備最終經純化之調配物以避免過度聚集且使蛋白質穩定。可藉由製備經冷凍乾燥之製劑以改良儲存之穩定性來使IG製劑之聚集降至最低，該經冷凍乾燥之製劑在使用前用稀釋劑復水。在此項技術中熟知之增加Ϊ G製劑穩定性之另一方法為將蛋白質穩定賦形劑添加至IG製劑中。已知賦形劑包括（但不限於）糖、多元醇、胺基酸、胺、鹽、聚合物及界面活性劑。舉例而言，美國專利第4,499,073 號描述經由選擇pH及離子強度進行穩定；日本專利 54020124揭示將胺基酸添加至肌肉内製劑中以使其儲存穩

定且安全；JP 57031623 及 JP 57128635 揭示在 5%至 15% IG 製劑中使用精胺酸及/或離胺酸與NaCl以達成肌肉内製劑之長期穩定性；JP 4346934揭示使用低電導率（小於毫姆歐）、5.3至5.7之pH及包括PEG、人企清白蛋白及甘露醇之任選的一或多種穩定劑；US 4,439,421教示添加親水性巨分子、多元醇、及另一蛋白質以穩定而防止抗補體產生； U.S. 5,945,098揭示若藉由添加胺基酸（ο ι μ至0.3 Μ甘胺酸）及非離子型清潔劑（聚山梨醇酯及peg )使其成為等張溶液則穩定；US 4,186,192揭示包括胺基酸之各種添加劑，WO 2005/049078揭示用麥芽糖及另外達到〇· ϊ μ之甘胺酸進行穩定；US 4,362,661揭示使用中性及鹼性胺基酸來將穩定性賦予5% IG製劑。亦可製備穩定液體調配物，其使用具有極低離子強度及4_25之ρΗ(美國專利第4,396,6〇8 號）或5-6之弱酸性pH ( ΕΡ 0278422)之水性介質中的碳水化合物。 46 200950803 亦可控制IG製劑之二聚體形成。舉例而言，美國專利第5’871’736號揭示m製劑（尤其液體製劑）含有一或多種兩親媒性穩定查,丨以/由甘％ θ i ，齊J以使其穩定而防止二聚體形成。兩親媒杜穩疋劑包括蒋驗酸及其衍生物，特定而言於驗酿胺，及主要連同上述穩定劑之具有不帶電之親脂性侧鏈之胺基酸例如苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸及纈胺酸。 &劑可藉由諸如本文中所述之任何方法的此項技術中已知之方法來製備。然而’ -般可將最終製劑之pH調節至相對較高但仍為酸性PH，亦即處於約4.2至5.4之pH範圍内諸如4.6至5.1之pH範圍。已發現此pH範圍尤其適用於改良IG製劑之儲存。最終IG製劑一般具有約5%至25% w/v、一般6%至 w/v 8 /〇至12。/。w/v且典型地1〇% w/v之蛋白質濃度。最終蛋白質濃度視各種因素而定，諸如投藥途徑、待治療之患 0 #及待治療之病狀類型。在本文中亦預期任何用於IV投藥之IG製剤可與可溶性玻尿酸酶組合用於本文中所提供之方法中以供皮下投藥。製劑包括冷凍乾燥及液體調配物。免疫球蛋白（IVIG ) 為市售的’如 Carimune® NF、Flebogamma® 5%、Gammagard®

Liquid、Gammagard® S/D、Gamunex®、Iveegam® ΕΝ、

Octagam®及polygam® S/D。該等製劑典型地皆使用低溫醇分顧方法’但使用不同之使免疫球蛋白分離且純化之方法及不同之減少潛在病毒污染之方法。此外，目前經調配用 47 200950803 於肌肉内或皮下投藥之其他製劑可用於本文中所提供之組合及方法中。例示性IG製劑為10%免疫球蛋白靜脈内注射劑（人類） (IVIG，10%，以 Gammagard®液體出售，Baxter Healthcare 公司），其為IgG亞類分布類似於正常血漿之IgG亞類分布的未經修飾之液體IgG製劑。該製劑含有完整可結晶片段 (Fc)及Fab區。製劑含有1〇〇 mg/ml蛋白質，其中至少 98%為IgG; IgA係以37 pg/ml之濃度存在且IgM僅以痕量存在。其具有類似於生理滲透壓度之滲透壓度且不含所添加之糖、鈉或防腐劑。其與甘胺酸一起調配以在4 6至51 之PH下穩定。製造方法使用經修改之柯恩_昂柯利低溫醇分餾程序且經由使用弱陽離子交換層析及弱陰離子交換層析之連續方法來進一步純化。製造方法亦包括3個獨立之病毒滅活或移除步驟：溶劑/清潔劑（S/D)處理、奈米過濾及在低pH及高溫下培育。 D· 玻尿酸酶本文中提供含有免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶之組合及使用用於皮下投藥之该等組合來治療IG介導性疾病及病狀之方法。玻尿酸酶為降解破尿酸之酶家&，玻尿酸為細胞外基質之基本組份及間質障壁之主要成份。藉由催化玻尿酸（間質障壁之主要成份）水解，玻尿酸酶降低玻尿酸黏性，從而增加組織滲透性H玻尿酸酶已例如作為展布劑或分散劑而連同其他劑、藥物及蛋白質一起使用以增強該等劑、㈣及蛋白質之分散及傳遞。本文中所提供 48 200950803 * 之組合及方法中之例示性玻尿酸酶為可溶性玻尿酸酶。

存在三種一般類別之玻尿酸酶：哺乳動物玻尿酸酶、細菌玻尿酸酶及來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼類動物之玻尿酸酶。哺乳動物型玻尿酸酶（EC 3.2.1.35 )為冷-/3-//-乙醯基-己醣胺酶，其將玻尿酸之/31~»4醣苷鍵水解成各種募醣長度（諸如四醣及六醣）。哺乳動物型玻尿酸酶具有水解及轉醣苷酶活性，且可降解玻尿酸及硫酸軟骨素（CS)( — 般為C4-S及C6-S)。此類型之玻尿酸酶包括（但不限於） ❹ 來自母牛（牛）（SEQ ID NO: 10及11 )、小鼠（SEQ ID

NO:17-19、31 )、豬（SEQ ID NO:20-21 )、大鼠（SEQ ID NO:22-24、30 )、家兔（SEQ ID NO:25 )、羊（綿羊）（SEQ ID NO:26 及 27 )、猩獲（SEQ ID NO:28 )、獼狼（SEQ ID NO:29 )、豚鼠（SEQ ID NO:32 )之玻尿酸酶及人類玻尿酸酶。哺乳動物玻尿酸酶可進一步再分為中性活性玻尿酸酶 (主要見於睾丸提取物中）及酸性活性玻尿酸酶（主要見於諸如肝臟之器官中）。例示性中性活性玻尿酸酶包括 ΡΗ20 ’包括（但不限於）源自諸如綿羊（seq ν〇:27)、牛（SEQ ID ΝΟ:11)及人類（SEQ ID Ν〇:1)之不同物種之 ΡΗ20 »人類ΡΗ2〇 (亦稱作spAM1或精子表面蛋白ρΗ2〇 ) 一般經由糖基磷脂醯肌醇（Gpi )錨而鎖定至質膜。其自然地涉及精子-卵子黏著且藉由消化玻尿酸以協助精子穿透卵丘、、’田胞層。PH20 mRNA轉錄物通常經轉譯以產生509個胺基酸之前驅多肽（SEQlDN〇:1)，其含有處於^^末端處之 49 200950803 35個胺基酸信號序列（1-35胺基酸殘基位置）及處於C末端之19個胺基酸GPI錨（491-509胺基酸殘基位置）。成熟 PH20因此為SEQ ID NO:2中所闡明之474個胺基酸之多肽。牛PH20為553個胺基酸之前驅多肽（SEQ ID ΝΟ:11 )。將牛PH20與人類PH20比對僅展示微弱之同源性，在牛多肽中歸因於不存在GPI錨而存在自470位胺基酸直至各別叛基末端之多個缺口（參見例如Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440 )。事實上，預言十除人類以外在任何其他PH20種類中均無明確GPI錨。因此，自綿羊及牛產生之PH20多肽以可溶解形式存在。雖然牛PH20以極鬆散地附接至質膜之形式存在，但其並非經由磷脂酶敏感性錫來錯定（Lalancette 等人，Biol Reprod. 2001 年 8 月；65(2):628-36.)。牛玻尿酸酶之此獨特特徵允許以提取物形式使用可溶性牛睾丸玻尿酸酶以供臨床使用 (Wydase™、HyalaseTM) ° 除人類PH20 (亦稱作SPAM1 )以外，在人類基因組中已識別5種玻尿酸酶樣基因，亦即HYAL1、HYAL2、HYAL3、 HYAL4 及 HYALP卜 HYALP1 為假基因，且 HYAL3( SEQ ID NO:38 )不展示具有針對任何已知受質之酶活性。HYAL4 (SEQ ID NO:39中所闡明之前驅多肽）為軟骨素酶 (chondroitinase )且幾乎不展現針對玻尿酸之活性。HYAL1 (SEQ ID NO:36中所闡明之前驅多肽）為原型酸性-活性酶且PH20 ( SEQ ID ΝΟ:1中所闡明之前驅多肽）為原型中性-活性酶。諸如HYAL1及HYAL2 ( SEQ ID NO:37中所闡明 50 200950803 之則驅多肽）之酸性_活性玻尿酸酶在中性pH(亦即pH == 7 ) 下一般缺乏催化活性。舉例而言，HYAL1在4·5之pH下幾乎不具有試管内催化活性（Frost等人（1997) Anal. Biochemistry，251:263-269)。HYAL2 為酸性-活性酶，其具有極低之試管内比活性。玻尿酸酶樣酶之特徵亦在於彼等一般經由糖基磷脂醯肌醇錨鎖定至質膜之酶（諸如人類

HYAL2 及人類 pH20 ) ( Danilkovitch-Miagkova 等人 (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5 )及彼等一般可溶解之酶（諸如人類 HYAL1 ) ( Frost 等人，（1997) Bi〇chem Biophys Res Commun. 236(1):10-5 ) ° 一些玻尿酸酶之糖基化（包括N及〇連接之糖基化）對於其催化活性及穩定性為極重要的。雖然改變修飾醣蛋白之多醣類型可對蛋白質之抗原性、結構摺疊、溶解性及穩定性具有顯著影響，但不認為大部分酶需要糖基化以達到最佳酶活性。該等玻尿酸酶在此方面為獨特的，因為移除N連接之糖基化可使玻尿酸酶活性近乎完全鈍化。對於該等玻尿酸酶而言，N連接多醣之存在對於產生活性酶為關鍵性的。 N連接募醣分為若干主要類型（募甘露糖型、複合型、雜合型、硫酸化型），其均具有經由屬於·AsnXaaThr/Se卜序列（其中Xaa不為pro)之Asn殘基之醯胺氮所連接之對於凝血蛋白C已報導在。在一些情況下，玻尿酸酶舉例而言’ PH20具有〇連 (Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。 -Asn-Xaa-Cys-位點處之糖基化可含有N-醣苷鍵及〇_醣苷鍵。 51 200950803 接募醣以及N連接寡醣。在SEQ ID NO : 1中所例示之人類PH2〇之N82、m66、 N235、N254、N368、N393、N490 處存在 7 個潛在 N 連接糖基化位點。半胱胺酸殘基C60與C351之間及C224與C238 之間形成一硫鍵以形成核心玻尿酸酶結構域。然而，對於中性酶催化活性而言，在羧基末端需要額外之半胱胺酸以使SEQ ID NO: 1之36位至464位胺基酸含有最小活性之人類PH20玻尿酸酶結構域。因此，對於合適玻尿酸酶活性而言不需要N連接糖基化位點N-490 » 可溶性玻尿酸酶在本文中之組合及方法中提供可溶性玻尿酸酶。可溶性玻尿酸酶包括任何以可溶解形式存在之玻尿酸酶，包括 (但不限於）Hyal 1、牛PH20及綿羊ph2〇 '其對偶基因變異體及其他變異體。在可溶性玻尿酸酶中亦包括任何經修飾而具有可溶性之玻尿酸酶。舉例而言，通常經由GPi錫而與膜錨定之人類PH20可藉由截短且移除c末端處之全部或一部分GPI錨來製成可溶性人類pH2〇。可溶性玻展酸酶亦包括中性活性及酸性活性玻尿酸酶，然而，出於皮下投藥之目的’中性活性玻尿酸酶預期用於本文中。因此，只要玻尿酸酶為可溶解的且保持玻尿酸酶活性，則例示性可溶性玻尿酸酶為來自任何物種之PH2〇，諸如在 SEQ ID NO: 1、2、11、25、27、30 及 31 中之任一者中所闌明之任何玻尿酸酶或其缺乏全部或一部分c末端 GPI錫之截短形式。在可溶性玻尿酸酶中亦包括seq id NO . 52 200950803 1、2、11、25、27、30及31中之任一者之對偶基因變異體或其他變異體或其截短形式。對偶基因變異體及其他變異體為熟習此項技術者所知且包括與SEQ ID NO : 1、2、11、 25、27、30 及 31 中之任一者具有 6〇%、7〇%、8〇%、9〇%、 91%、92%、93%、94%、95%或95〇/〇以上序列一致性之多肽或其截短形式。為用於本文中之方法中’典型地使用可溶性人類 ϋ 0 PH20。儘管可使用來自其他動物之pH2〇，但因為該等製劑為動物蛋白質，所以其潛在具有免疫原性。舉例而言，顯著比例之患者表現繼發於所攝取食物之前期致敏，且因為此等製劑為動物蛋白質，所以所有患者皆具有後繼致敏之風險。因此，非人類製劑可能不適於長期使用。若需要非人類製劑，則在本文中預期該等多肽可經製備以具有降低之免疫原性》該等修飾係在熟習此項技術者之技術範圍内。用於本文中之方法中的包括PH20之玻尿酸酶可以重組方式製備或可自天然來源（諸如自睾丸提取物）純化或部分純化。可溶性人類PH20 例不性可溶性玻尿酸酶為可溶性人類pH2〇。已製備重組人類PH20之可溶解形式且其可用於本文中所述之方法中 /與免疫球蛋白共同投予或共同調配以用於皮下投藥來治療IG可/α療性疾病及病狀。PH20之該等可溶解形式之製 1係&述於中請案第11/065,716號及苐11/238,171號中且描述於以下實例2_6中。可溶解形式包括（但不限於）任何 53 200950803 具有C末端截短以產生含有SEQ ID NO: 1中所蘭明之胺基酸序列之1位胺基酸至347、372、394、413、430、447、 467、477、478、479、480、481、482 及 483 位胺基酸之多肽的玻尿酸酶。當在哺乳動物細胞中表現時，在加工期間使35個胺基酸之N末端信號序列裂解且分泌蛋白質之成熟形式。因此，成熟可溶性多肽含有SEQ ID NO: 1之36位胺基酸至 347、372、394、413、430、447、467、477、478、 479、480、481、482及483位胺基酸。終止於477至483 位胺基酸位置之缺失突變體（對應於SEQ ID Ν〇··1中所闡明之前驅多肽）展現高於全長GPI錨定形式之分泌性玻尿酸酶活性。因此’例示性可溶性玻尿酸酶為長度為442、 443、444、445、446或447個胺基酸之彼等玻尿酸酶（諸如SEQ ID NO :4-9中之任一者中所闞明之玻尿酸酶）或其對偶基因變異體或物種變異體或其他變異體。一般而言， PH20之可溶解形式可使用蛋白表現系統來製備，該等蛋白表現系統有助於校正N-糖基化以確保多肽保持活性，因為糖基化對於玻尿酸酶之催化活性及穩定性而言十分重要。該等細胞包括例如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞（例如DG44 CHO細胞）。重组可溶性人類PH20 (rHuPH20) 已產生重組可溶解形式之人類PH20(可溶性rHuPH2〇 ) 且可使用本文中所述之方法對其製備及純化。rHuPH2〇之該等可溶解形式之產生係描述於美國專利申請案第 11/065,716號及第11/238,171號（以美國公開專利申請案第 54 200950803 us20050260186號及第US 20060104968號公開）中且描述於以下實％2_6中。該等多肽之例示性多肽為彼等自編碼 SEQ ID NO:3中所闞明之1-482位胺基酸之核酸分子所產生的多肽。轉譯後加工移除35個胺基酸之信號序列，使4竹個胺基酸之可溶性rHuPH2〇 ( SEQ m N〇:4)分泌。由於在製備及純化後肽酶存在於培養基中，所以所得之經純化之 rHuPH2G可為異質的。典型地，rHupH2()侍在有助於校正

Ο N-糖基化以保持活性之細胞中產生，諸如ch〇細胞（例如 DG44 CHO 細胞）。 E.產生編碼可溶性玻尿酸酶及其多肽之核睃之方法本文中所闡明之可溶性玻尿酸酶之多肽可藉由此項技術中熟知之用於蛋白質純化及重組蛋白質表現之方法來獲得。可使用任何為熟習此項技術者所知用於識別編碼所需基因之核酸之方法。此項技術中可用之任何方法可用於自諸如細胞或組織來源獲得編碼玻尿酸酶之全長（亦即，涵蓋整個編碼區）cDNA或基因組DNA純系。可藉由（諸如）疋位突變而自野生型多肽工程改造經修飾或變異之可溶性玻尿酸酶。

可使用此項技術中已知用於選殖及分離核酸分子之任何可用方法來選殖或分離多肽。該等方法包括核酸之PCR 擴增及包括核酸雜交篩選、基於抗體之筛選及基於活性之篩選的文庫篩選。用於核酸擴增之方法可用於分離編碼所需多肽之核酸分子’該等方法包括例如聚合酶鏈反應（PCR)法。含有核 55 200950803 酸之物質可用作起始物質’彳自其分離所需之編碼多肽之核酸刀子舉例而言，DNA及mRNA製劑、細胞提取物、、織提取物、机體樣品（例如企液、血清、唾液）、來自健康及/或患病個體之樣品可用於擴增方法中。核酸文庫亦可用作起始物質來源。引子可經設計以使所需多肽擴增。舉例而p引子可基於自其產生所需多肽之所表現序列來設。十引子可基於多狀胺基酸序列之反轉譯（back七ansiati〇n ) 來认十藉由擴增所產生之核酸分子可經定序及確認以編碼所需多肽。額外核苷酸序列可連接至編碼多肽之核酸分子，包括出於將口成基因選殖至載體中之目的含有限制性核酸内切酶位點之連接子序列，該載體為例如蛋白質表現載體或經没计以^於使編碼核心蛋白質之DNa序列擴增之載體。此外’指定功能性DNA元件之額外核芽酸序列可與編碼多狀之核酸分子操作性連接。料序狀㈣包括（但不限於）經設計以促進細胞内蛋白質表現之啟動子序列及經設計以促進蛋白質分泌之例如異源信號序列之分泌序列。該等序列為熟習此項技術者所知。諸如指^蛋白質結合區域之驗基序列之額外核㈣殘基序列亦可連接至編碼酶之核酸分子》該等區域包括（但不限於）促進或編碼有助於酶吸收至特定標乾細胞中，或以其他方式改變合成基因產物之藥物動力學的蛋白質的殘基序列。舉例而言，酶可連接至服部分。另外，可添加標籤或其他部分（例如）以協助多肽之 56 200950803

偵測或親和純化。舉例而言，諸如指定“pecifying)抗原決定基標籤或其他可偵測標記之鹼基序列之額外核苷酸殘基序列亦可與編碼酶之核酸分子連接。該等序列之例示性序列包括編媽His標籤（例如，6xHis，HHHHHH ; SEQ ID NO:54)或 Flag 標籤（DYKDDDDK ; SEQ ID NO:55)之核酸序列。所識別及分離之核酸接著可插入合適之選瘦載體中。可使用此項技術中已知之大量載體-宿主系統。可能的載體 ^ 包括（但不限於）質體或經修飾之病毒，但載體系統須與所使用之伤主細胞相容。該等載體包括（但不限於）噬菌體（諸如λ衍生物）或質體（諸如pcMV4、pBR322或pUC 質體衍生物或 Bluescdpt 載體（Stratagene, La J〇Ua，CA))。其他表現載體包括本文中所例示之HZ24表現載體。插入選殖載體中可例如伴隨有將DNA片段接合至具有互補黏性末端之選殖載體中。插入可使用TOPO選殖載體 (INVITR〇GEN，Carlsbad, CA)來達成。若在選殖載體中不存在用於將DNA分段之互補限制性位點，則可用酶修飾 DNA分子末端。或者，可藉由將核苷酸序列（連接子）接合至DNA末端上來產生所需之任何位點；此等所接合之連接子可含有編碼限制性核酸内切酶識別序列之特異性化學合成之寡聚核苷酸。在一替代方法中，所裂解之載體及蛋白質基因可藉由均聚物加尾來修飾。重組分子可經由例如轉型、轉染、感染、電穿孔及超音波穿孔（sonop0rati〇n ) 而引入宿主細胞中以產生基因序列之許多複本。 57 200950803 在特定具體實例中，用合併有所分離之蛋白基因、 CDNA或合成DNA序列之重組DNA分子使宿主細胞轉型能夠產生基因之多個複本。因此，基因可藉由使轉型體生長、自轉型體分離重組DNA分子及必要時自所分離之重組而A 擁取所插入之基因來大量獲得。 1. 載體及細胞為使諸如本文中所述之任何蛋白質之所需蛋白質中的一或多者重組表現，可將含有所有或一部分編碼該蛋白質之核苷酸序列的核酸插入合適表現載體中，亦即該載體含有所插入之蛋白質編碼序列轉錄及轉譯所需之元件。必需之轉錄及轉譯信號亦可由酶基因之天然啟動子及/或其侧接區來提供。亦提供含有編碼酶之核酸的載體。亦提供含有載體之細胞。細胞包括真核細胞及原核細胞且載體為任何適用於細胞中之載體。 ' 提供含有載體之包括内皮細胞之原核及真核細胞。該等細胞包括細菌細胞、酵母細胞'真菌細胞、古生菌 (Archea)、植物細胞、昆蟲細胞及動物細胞。藉由使上述細胞在使細胞表現所編碼之蛋白質的條件下生長且回收所表現之蛋白質來使用該等細胞產生其蛋白質。出於本文中之目的’舉例而言，酶可分泌至培養基中。提供含有編碼可溶性玻尿酸酶多肽之核苷酸序列之載體，該核苷酸序列係偶接至天然或異源信號序列以及其多個複本。載體可經選擇以在細胞中表現酶蛋白或使得酶蛋 58 200950803 白以分泌性蛋白質形式表現。多種宿主·載體系統可用於表現蛋白質編碼序列。系統包括（但不限於）感染病毒（例如等丁也届，、腺病毒及其他病毒）之哺乳動物細胞系統； a永病毒（例如桿狀病毒）之昆蟲細胞系統；諸如含有酵母葡 ώ力择呼戰體之酵母的微生物；或用嗤菌體、DNA、質體DNA戎斑拉陆a* 貝通 Α虱黏接質體DNA轉型之細菌。載體之表現元件在其強度及特異性方面不同、 ^ 件中之任一者所用之宿主-載體系統而定，可使用畔容人 J仗用汗多合適轉錄及轉譯元 ^F· 〇熟習此項技術者已知用於將DNA片段插入載體中之任何方法可用於構建含有嵌合基因之表現載體，該嵌合基因含有合適之轉錄/轉譯控制信號及蛋白質編碼序列。此等方法可包括試管内重組DNA及合成技術及活體内重組物（遺傳重組）。編碼蛋白質或其結構域、衍生物、片段或同系物之核酸序列之表現可藉由第二核酸序列來調節使得其基因 ^段在用重組DNA分子轉型之宿主中得到表現。舉^ 言，可藉由此項技術中已知之任何啟動子/增強子來控制蛋白質表現《在一特定具體實例中’啟動子不為所需蛋白質之基因自身所具有的。可使用之啟動子包括（但不限於） SV4〇早期啟動子（Bern〇ist 及 Chamb〇n，⑽e (1981))、勞氏肉瘤病毒（R〇us sarcoma virus)之3,長末端重複中所含有之啟動子（Yamamoto等人Ce// 22:787·797 (198〇))、疱疹胸苷激酶啟動子（Wagner等人，尸 Jcad’ t/u 7&1441-1445 (1981))、金屬硫蛋白基因之調 59 200950803 節序列（Brinster等人，抱⑽e 29(5:39-42 (1982));原核表現載體，諸如/3-内醯胺酶啟動子（Jay等人，（1981) Pr〇c 以 Ααί/·如·· t/以 75:5543 )或 iac 啟動子（DeBoer 等人，7V〇c. iWzi/. Jccti/. to·· ί/α ⑽:21-25 (1983);亦參見「Useful Proteins from Recombinant Bacteria j ： Scientific American 242:79-94 (1980)中）；含有胭脂鹼（n〇paiine )合成酶啟動子之植物表現載體（Herrara-Estrella等人，iVaiMre 303:209-213 (1984))或化椰菜欲紋病毒（cauim〇wer mosaic virus) 35S RNA 啟動子（Garder 等人，Jc/心及以. 夕:2871 (1981))及光合成酶雙磷酸核酮糖羧化酶之啟動子 (Herrera-Estrella 等人，ATaiWre 3/〇:115_12〇 (1984));諸如

Gal4啟動子之來自酵母及其他真菌之啟動子元件、醇脫氫酶啟動子、填酸甘油激酶啟動子、驗性填酸酶啟動子；及展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中之下列動物轉錄控制區：在胰腺腺泡細胞中具有活性之彈性蛋白酶〗基因控制區（Swift 等人，Ce// 35:639-646 (1984); Ornitz 等人，Co/d

Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986)； MacDonald，丑7:425-515 (1987))、在胰腺尽細胞中具有活性之胰島素基因控制區（Hanahan等人，iVaiwre 375:115-122 (1985))、在淋巴樣細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區（Grosschedl 等人，Ce// 35:647-658 (1984); Adams 等人，iVfliwre 3 75:533-538 (1985) ; Alexander 等人， Λ/〇/· Ce// 5/〇/· 7:1436-1444 (1987))、在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具有活性之小鼠乳房腫瘤病毒控制區（Leder 60 200950803 等人，Ce// 45:485-495 (1986))、在肝中具有活性之白蛋白基因控制區（Pinckert 等人，Gewej £>eve/. 7:268-276 (1987))、在肝中具有活性之α-胎蛋白基因控制區（KrUmlauf 等人，Ce//·沿〇/. 5:1639-1648 (1985); Hammer 等人， Science 235:53-58 1987))、在肝中具有活性之抗胰蛋白酶基因控制區（Kelsey 等人，Gewe·? Z)eve/. 7:161-171 (1987))、在骨髓細胞中具有活性之卢球蛋白基因控制區

(Magram 等人，iVaiwre 3/5:338-340 (1985) ; Kollias 等人，

Ce// #:89-94 (1986))、在腦之寡樹突神經膠質細胞中具有活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區（Readhea(i等人，ce// 料:703-712 (1987))、在骨骼肌中具有活性之肌凝蛋白輕鏈 -2 基因控制區（Shani，A^iwre 3/4:283-286 (1985))及在丘腦下部之促性腺激素細胞中具有活性之促性腺釋放激素基因控制區（Mason 等人，234:1372-1378 (1986))。

在一特定具體實例中，使用含有與編碼所需蛋白質或其結構域、片段、衍生物或同系物之核酸操作性連接之啟動子、一或多個複製起點及視情況一或多個可選擇標記（例如抗生素耐藥基因（antibiotic resistance gene))的載體。用於轉型大腸桿菌（五.co/〇細胞之例示性質體載體包括例如PQE表現載體（可自Qiagen, Valencia，CA得到；亦參見由Qiagen發表之描述該系統之文獻）。pqe載體具有噬菌體 T5啟動子（由大腸桿菌RNA聚合酶識別）及雙操縱基因阻遏模組（以提供重組蛋白質於大腸桿菌中之緊密調節之高程度表現）、用於有效轉譯之合成核糖體結合位點（RBS 61 200950803 II)、6xHis標籤編碼序列、t〇及T1轉錄終止子、c〇lEl複製起點及用於賦予安比西林（ampicillin )耐藥性之卜内酿胺酶基因。pQE載體使6xHis標籤能夠安置於重組蛋白質之 N末端或C末端處。該等質體包括pqe 32、pQE 30及PQE 3 1，其提供用於所有三個閱讀框架之多個選殖位點且使N 末端6xHis-標記之蛋白質得到表現。用於轉型大腸桿菌細胞之其他例示性質體載體包括例如pET表現載體（參見美國專利 4,952,496 ;可自 NOVAGEN，Madison，WI 得到；亦參見由Novagen發表之描述該系統之文獻）。該等質體包括 pET 11a，其含有T71ac啟動子、T7終止子、誘導性大腸桿菌lac操縱基因及lac阻遏基因；pET 12a-c，其含有T7啟動子、T7終止子及大腸桿菌ompT分泌信號；及pET 15b 及 pETl 9b ( NOVAGEN，Madison, WI)，其含有用於使用 His 管柱純化之His-TagTM前導序列及在經由管柱純化後允許裂解之凝企酶裂解位點、T7-lac啟動子區及T7終止子。用於哺乳動物細胞表現之例示性載體為HZ24表現載體。HZ24表現載體係源自pCI載體骨架（Pr〇mega )。其含有編碼卜内醯胺酶耐藥基因（AmpR )之DNA、F1複製起點、細胞巨大病毒即刻早期增強子/啟動子區（CMV)及SV40 晚期聚腺苷酸化信號（SV40)。表現載體亦具有來自ECMV 病毒C Clontech )之内部核糖體進入位點（IRES )及小鼠二氫葉酸還原酶（DHFR)基因。 2. 表現可藉由熟習此項技術者已知之包括活體内及試管内方 62 200950803 白質可為投藥及真核哺乳動主可在後修飾安全考現宿主法之任何方法來製備可溶性玻尿酸酶多肽。所需蛋表現於適於產生所需量及形式之該等蛋白質（諸如及治療所需）之任何有機體中。表現宿主包括原核有機體，諸如大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲細胞二物細胞（包括人類細胞系及轉殖基因動物）。表現宿其蛋白質產生量以及所表現蛋白質上所存在之轉譯類型方面有所不同。可基於此等因素及諸如調節及 ϋ 慮、製備成本及純化需要及方法之其他因素來對表進行選擇。許多表現載體為可得到的且為熟習此項技術者所知且可用於表現蛋白質。表現載體之選擇受宿主表現系統之選擇影響。一般而言，表現載體可包括轉錄啟動子及任選之增強子、轉譯信號及轉錄及轉譯終止信號。用於穩定轉型之表現載體典型地具有允許選擇及維持經轉型細胞之可選擇標記。在一些狀況下，複製起點可用於擴增載體之複本數。可溶性玻尿酸酶多肽亦可以蛋白質融合形式使用或表現。舉例而言，可產生酶融合以將額外功能添加至酶。酶融合蛋白質之實例包括（但不限於）信號序列、諸如用於疋位之標籤（例如hi”標籤或myc標籤）或用於純化之標籤（例如GST融合）及用於引導蛋白質分泌及/或膜結合之序列的融合。 a· 原核細胞原核生物（尤其大腸桿菌）提供用於產生大量蛋白質 63 200950803 之系統。大腸桿菌之轉型為熟習此項技術者所熟知之簡單且快速之技術。大腸桿菌之表現載體可含有誘導性啟動子，該等啟動子適用於誘導高程度之蛋白質表現且適用於表現對宿主細胞展現某些毒性之蛋白質。誘導性啟動子之實例包括lac啟動子、trp啟動子、雜合tac啟動子、丁7及 SP6 RNA啟動子及溫度調節性xpL啟動子。諸如本文中所提供之任何蛋白質之蛋白質可表現於大腸桿菌之細胞質環境中。細胞質為還原性環境且對於一些分子而言，此可引起不可溶性包涵體形成。諸如二硫蘇糖醇、及/5-巯基乙醇之還原劑及諸如胍_HC1及尿素之變性劑可用於使蛋白質再溶解。替代方法為使蛋白質表現於細菌之周質空間（penplasmic space )中，該周質空間提供氧化性環境及類伴侣蛋白（ehaperGnin_like)及二硫化物異構酶且可引起可溶性蛋白質產生。前導序列典型地融合至待表現之蛋白質，從而將蛋白質引導至周質。接著在周質内部藉由信號肽酶移除前導序列。周質靶向性前導序列之實例包括來自果膠酸裂解酶基因之pelB前導序列及源自鹼性磷酸酶基因之前導序列。在一些狀況下，周質表現允許所表現之蛋白質滲漏至培養基中。蛋白質之分泌允許自培養物上清液快速及簡單純化。未經分泌之蛋白質可藉由滲透溶解而自周質獲得。類似於細胞質表現，在一些狀況下，蛋白質可變成不可溶的且可使用變性劑及還原劑來促進溶解及再摺疊。誘導及生長之溫度亦可影響表現量及溶解性，典型地使用介於25。。與3rc之間的溫度。、細菌典型地產生 64 200950803 無糖基化（aglycosylated )之蛋白質。因此，若蛋白質出於功能之考慮需要糖基化，則可在自宿主細胞純化後試管内添加糖基化。 b. 酵母細胞諸如釀酒酵母（Saa/rflro/«少ces cerevbae )、粟酒裂殖酵母（)、解脂耶氏酵母（ ϋ Ο 办〇/少iica )、乳酸克魯維酵母（A7M_yverom_yce5· /acib )及巴斯德畢赤酵母（Pic/Wa /JizWor以）的酵母為熟知之可用於產生諸如本文中所述之任何蛋白質之蛋白質的酵母表現宿主。酵母可用游離型複製載體或藉由經同源重組之穩定染色體整合來加以轉型。誘導性啟動子典型地用於調節基因表現。該等啟動子之實例包括GALl、GAL7及GAL5及金屬硫蛋白啟動子，諸如CUP1、Α0Χ1或其他畢赤酵母 (Pzcha )或其他酵母啟動子。表現載體常常包括用於選擇及維持經轉型DNA之諸如LEU2、TRP卜HIS3及UHA3 可選擇標記β表現於酵母中之蛋白質常常為可溶解的。與諸如Bip之伴侣蛋白及蛋白質二硫化物異構酶共同表現可改良表現量及溶解性。另外，酵母中所表現之蛋白用分泌信號肽融合（諸如來自釀酒酵母之酵母交配型子分泌信號）及與酵母細胞表面蛋白f L啫如Aga2p交齙 a黏著受體或知/“―咖葡萄糖殿來引導分泌。諸如用…蛋白酶之蛋白酶裂解=; 經工程改造以當所表現之多肽自分泌路點可肽移除所融合之序列。酵母亦能夠在Asn-X_Ser Th :等多丄基元處 65 200950803 糖基化。 c· 昆蟲細胞尤其使用桿狀病毒表現之昆蟲細胞適用於表現諸如玻尿酸酶多狀之多肽。昆蟲細胞表現高含量之蛋白質且能夠產生由而等真核細胞所用之大多數轉譯後修飾。桿狀病毒具有限制性宿主範圍’其改良安全性且減少真核表現之調 \ 節性顧慮°典型表現載體使用用於高程度表現之啟動子，諸如桿狀病毒之多角體蛋白啟動子（polyhedrin promoter ) °常用之桿狀病毒系統包括諸如苜蓿銀紋夜蛾核夕角體病病毒（nuclear p〇lyhedr〇sis virus ’ AcNPV )及家蠶（）核多角體病病毒 (BmNPV )之桿狀病毒及諸如源自草地黏蟲（印〇如〆 frugiperda)之 Sf9、一 1 黎备（Pseudaletia unipuncta) ( AIS) 及黑脈金斑蝶（Dawaws p/exippw·? ) ( DpNl )之昆蟲細胞系。為高程度表現’待表現之分子之核苷酸序列直接與病毒之多角體蛋白起始密碼子之下游融合。哺乳動物分泌信號在昆蟲細胞中經精確加工且可用於使所表現之蛋白質分泌至培養基中。另外，細胞系一星黏蟲（A7S )及黑脈金斑蝶 (DpN 1 )產生具有類似於哺乳動物細胞系統之糖基化模式之蛋白質。在昆蟲細胞中之替代表現系統為經穩定轉型之細胞之使用。可使用諸如Schneider 2 ( S2 )及Kc細胞（黑腹果罐 (Drojo/7/π’/α me/awogaWer))及 C7 細胞（白紋伊蚊（之細胞系用於表現。果蠅（Drwopf/a)金屬 66 200950803 硫蛋白啟動子可用於在具有鎘或銅之重金屬誘導存在下誘導高程度之表現。典型地藉由使用諸如新黴素（_myein) 及潮黴素（hygromycin)之可選擇標記來維持表現載體。 d. 哺乳動物細胞哺乳動物表現系統可用於表現包括可溶性玻尿酸酶多狀之蛋白質。可藉由諸如腺病毒之病毒感染或藉由諸如脂質體、«飼、腿E-葡聚糖之直接舰轉移及藉由諸如冑穿孔及顯微注射之物理方法將表現構築體轉移至哺乳動 I 物細胞。歸哺乳動物細胞之表現載體典型地包括加帽位點（cap site)、TATA±、轉課起始序列（κ〇ζΑ — 致序列）及聚腺芽酸化元件。亦可添加刪元件以允許盘諸如可選擇標記之另-基因的雙順反子表現。該等載體常常包括用於高程度表現之轉錄啟動子·增強子，例如SV40 啟動子-增強子、人類*田妝/ 、、胞巨大病骨（CMV )啟動子及勞氏肉瘤病毒（RSV)之長末端重複。此等啟動子增強子在許〇乡細胞類型中為活性的。亦可使用組織及細胞型啟動子及增強子區以用於表現。例示性啟動子/增強子區包括“曰不限於；彼等來自諸如彈性蛋白酶I、騰島素、免疫球蛋白、小鼠乳房腫瘤病毒、白恭6 ㈣每白蛋白、讀蛋白、α1抗胰蛋白酶去=白難驗性蛋白、肌凝蛋白輕鍵2及促性腺釋放激 :基：控制之基因的彼等啟動子/增強子區。可使用可選擇因之實二維持具有表現構築體之細胞。可選擇標記基 I =(但不限於）潮黴素Β磷酸轉移酶、腺苷去胺酶、m島噪呤磷酸核糖基轉移酶、胺基糖㈣酸轉 67 200950803 移酶 '二氫葉酸還原酶（DHFR )及胸苷激酶。舉例而言，可在甲胺喋呤存在下進行表現以僅選擇表現DHFR基因之彼等細胞。與諸如TCR-t及FceRI-7之細胞表面信號分子之融合可引導呈活性狀態之蛋白質在細胞表面表現。許多細胞系可用於哺乳動物表現，包括小鼠、大鼠、人類、狼、難及倉鼠細胞。例示性細胞系包括（但不限於） CHO、Balb/3T3、HeLa ' MT2、小鼠 NS0 (非分泌性）及其他骨髓瘤細胞系、融合瘤及雜交瘤（heterohybridoma )細胞系、淋巴細胞、纖維母細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、 293S ' 2B8及HKB細胞。亦可使用適應於無血清培養基之細胞系’該無血清培養基有助於自細胞培養基純化所分泌之蛋白質。實例包括CHO-S細胞（Invitrogen，Carlsbad, CA，目錄號U619-012)及無血清eBNA-1細胞系（Pham 等人，（2003)5ioiec/i«o/. A’oeng.以:332-42.)。亦可使用適應於在經最佳化以供最大表現之特殊培養基中生長之細胞系。舉例而言’ DG44 CHO細胞適應於在不含化學上定義之動物產品之培養基中的懸浮培養物中生長。 e. 植物轉殖基因植物細胞及植物可用於表現諸如本文中所述之任何蛋白質之蛋白質。典型地使用諸如微彈轟擊及PEG 介導之向原生質體中之轉移的直接DNA轉移且使用土壌桿菌（agrobacterium)介導之轉型來將表現構築體轉移至植物中。表現載體可包括啟動子及增強子序列、轉錄終止元件及轉譯控制元件。表現載體及轉型技術通常在諸如芬菜 68 200950803 • (心及煙草之雙子葉植物宿主與諸如玉米及稻来之單子葉植物宿主之間劃分。用於表現之植物啟動子之實例包括花椰菜嵌紋病毒啟動子、胭脂鹼合成酶啟動子、雙磷酸核糖羧化酶啟動子及泛素及UBQ3啟動子。諸如潮黴素、磷酸甘露糖異構酶及新黴素磷酸轉移酶之可選擇標記常用於促進轉型細胞之選擇及維持。轉型植物細胞可以細胞、聚集體（愈傷組織）形式維持於培養物中或再生於全植物中。轉殖基因植物細胞亦可包括經工程改造以產生玻尿酸酶多肽之海藻。因為植物具有不同於哺乳動物細胞之糖基化模式，所以此可影響此等宿主中所產生之蛋白質之選擇。 3- 純化技術用於自宿主細胞純化包括可溶性玻尿酸酶多肽或其他蛋白質之多肽的方法將視所選宿主細胞及表現系統而定。對於分泌性分子而言，一般在移除細胞後自培養基純化蛋白質。對於細胞内表現而言，可使細胞溶解且自提取物純 ^ 化蛋白質。當使用諸如轉殖基因植物及動物之轉殖基因有機體用於表現時，組織或器官可用作起始物質以製成溶解細胞提取物。另外，轉殖基因動物製備可包括在奶或蛋中製備可收集之多肽，且必要時可提取蛋白質且使用此項技術中之標準方法進一步純化。諸如可溶性玻尿酸酶多肽之蛋白質可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術加以純化，該等技術包括（但不限於）SDS-PAGE、尺寸分級（size fracti〇n)及尺寸排阻 69 200950803 層析、硫酸銨沈澱及諸如陰離子交換之離子交換層析。親和純化技術亦可用於改良製劑之效率及純度。舉例而言，與玻尿酸酶結合之抗體、受體及其他分子可用於親和純化中。表現構築體亦可經工程改造以將諸如myC抗原決定基、 GST融合體或Hise之親和標籤添加至蛋白質中且分別用 myc抗體、楚胱甘肽樹脂及Ni-樹脂加以親和純化。可藉由此項技術中已知之任何方法來評定純度，包括凝膠電泳及染色及分光光度技術》 F.免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶多肽之製備、調配及投藥在本文中提供免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶之醫藥組合物以用於皮下投藥。例如PH2〇之可溶性玻尿酸酶之醫藥組合物的調配物在此項技術中為已知的（參見例如美國公開申請案第US20040268425號、第US20050260186號及第 US20060104968號）。可溶性玻尿酸酶係與免疫球蛋白之醫藥調配物共同調配或共同投予以藉由增加免疫球蛋白之生物可用率來增強免疫球蛋白向身體中之所需部位之傳遞。舉例而§ ’ IG與玻尿酸酶之共同投予或共同調配可藉由在投予後更快速之滲透以使較多之IG到達血液及/或使較少之IG降解來改良吸收程度及/或吸收速率且因此改良劑之生物可用率。可例如藉由在投藥後施加與體積注射有關之流體靜力壓組合與玻尿酸降解有關之流動阻抗降低來加速間質流動及潛在結締組織輸送來達成增加之吸收及生物可用率。因此，與皮下投藥之習知方法相比，可溶性玻尿酸 200950803 酶可用於在皮下投藥後達成升高及/或更快速地達到之免疫

球蛋白濃度以提供例如對於給定劑量之更有效及/或更快速反應。或者，可溶性玻尿酸酶可用於在所投予之IG劑量較低之情況下達成給定反應。可溶性玻尿酸酶在注射或輸注部位處或附近增強總體流體流動之能力亦可改良相關藥理傳遞之其他態樣。舉例而言，總體流體流動增加可有助於使得所注射體積之流體更易於自注射部位擴散（潛在降低注射之疼痛或其他不良後果）。此對於皮下輸注尤其重要，其允許投予更高劑量。除生物可用率增加以外，與習知靜脈内投藥途徑相比，IG與可溶性玻尿酸酶之共同投予或共同調配提供更安全或更便利之投藥途徑。王............尤殁琢蛋白可以製及投予當前靜脈内（IVIG)製劑之劑量及頻率來皮下投予優於當前m皮下調配物之優點在於共同投予或共同調配玻尿酸酶/IG可產生更有利之給藥攝生法（例如給藥頻率治療之藥物動力學及/或藥效‘ d改良。另外，IG之皮下投藥亦具有注之優點。舉例而言，皮下輸注允許由；= 熟練護士來輸注；可以較高速率達成輸注以使1(^而非1 時内輸注（相比習知IVIG治療之5丨〇丨眩 1-3 ' 存在對功能靜脈之要求；不存在小^IG輪注）；〉血栓形成、頭痛、丄副作用，事件；且輸注可在家中或任何地方進行。W概率之不， 71 200950803 組合物可調配成冷凍乾燥或液體形式。在組合物以冷凍乾燥形式提供之情況下，其可在臨用前藉由例如無菌鹽水'谷液之合適緩衝液來復水。組合物可共同或分開提供。出於本文中之目的’典型地分開提供該等組合物。可溶性玻尿酸酶及IG可包裝成用於共同、連續或間斷投藥之分開的組合物。該等組合可包裝成套組。 1 · 調配物可將化合物調配成用於皮下投藥之任何合適醫藥製劑’諸如溶液、懸浮液、散劑或持續釋放調配物。典型地可使用此項技術中所熟知之技術及程序將化合物調配成醫樂、口物（參見例如 Ansel 所乃wage ，第四版，1985，126)。鑒於管理機構或其他機構之批准，根據一般公認之藥典來製備用於動物及人類之醫藥學上可接受組合物。調配物應適合於投藥模式。醫藥組合物可包括諸如稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑之載劑，其可與破尿酸酶或IG —起投予。e. W. Martin之

Remington s Pharmaceutical Sciences」中描述合適醫藥載劑之實例。4等組合物將含有__般呈純化形式或部分純化形式之治療有效量之化合物連同合適量4載劑以提供用於向〜者適g杈藥之形式。該等醫藥載劑可為無菌液體，諸 =水j油’包括石油 '動物油、植物油或合成起源之油，諸如彳b生油大豆油、礦物油及芝麻油。當靜脈内投予醫藥組合物時’水為典型載劑。鹽水溶液及水性右旋糖及甘 /合液亦可用作尤其用於可注射溶液之液體載劑。組合物 72 200950803 可含有連同活性成份一起之下列物質：稀釋劑，諸如乳糖蔗糖、磷酸二鈣或羧甲基纖維素；潤滑劑，諸如硬脂酸鎖硬脂酸鈣及滑石；及黏合劑，諸如澱粉、天然樹膠（諸士阿拉伯膠（gum acaciagelatin))、葡萄糖、撼象 _ ^ 傅隹、聚乙烯吼咯啶、纖維素及其衍生物、聚乙烯吡咯S同、交聯聚乙稀。比嘻酮及熟習此項技術者所知之其他該等黏合劑。合適醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽稻

米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬舱4、丄u 卞％日酸甘油酯、滑石、氣化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二酿好、水及乙醇。必要時，組合物亦可含有較少量之濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑，例如乙酸酯、檸檬酸鈉、環糊精衍生物、單月桂萨油酸三乙醇胺及其脫水山梨糖醇酯、三乙酵胺、乙酸納、他該等試劑。醫藥治療活性化合物及其衍生物典型地以單位劑型或多劑型調配及投予。每一單位劑量含有足以產生所需治療作用之預定量之治療活性化合物以及所需之醫藥載劑、媒劑或稀釋劑。單位劑紅實例包括安瓶及注射器及個別包裝之錠劑或膠囊。單㈣㈣可以其分數或倍數形式投予。多劑型為包裳於單個容器中之用於以分離之單位劑型投予，複數個相同單位劑型。多劑型之實例包括小瓶、錠劑或膠囊瓶或品脫或加舍瓶。因&，多劑型為未在包裝中分離之多個單位劑量。-般而言，可製備含有處於0.005%至 1嶋範圍内之活性成份（其餘由無毒載劑組成）之劑型或組合物。 73 200950803 本文中所提供之組合物典型地經調配以用力藉由皮下途“又予’但亦涵蓋其他投藥途徑，諸如熟習此項技術者已知之任何途徑，包括肌肉β、靜脈内、皮内、病變内、腹膜内注射：硬膜外'經鼻、經口、經陰道、經直腸、表皮局。P 耳、吸入、頻内（例如舌下）及經皮投藥或任何途徑。適合於該等途徑之調配物為熟習此項技術者所知。投藥可視治療部位而為局部、表皮或全身性的。可例 2 (但不限於）藉由手術期間之局部輸注、表皮塗覆（例手術後連同傷口塗劑-起）、藉由注射、藉助於導管、藉助於栓劑或藉助於植物机― 初术違成對需要治療之區域之局部 =。組合物亦可與其他生物活性劑—起連續、間斷或在 i組合物中投予。投藥亦可包括控制釋放系統，盆包括控制釋放調配物及控制釋放之裝置（諸如藉助於系）、。諸任何、、α疋狀況下’最合適之途徑視多種因素而定，諸如疾病性質、疾病進程人铷^ 疾病威重度'所使用之特定組皮膚或組織之間質，從而降尿酸酶以使其到達後繼值、路㈣降解間質空間以供免疫球蛋白之炱繼傳遞。因此，涵蓋諸如藉接投藥。因此，在一實例令，J下投樂方法在皮膚下直盗或含有諸如針之注射裝置 ^ _實彳丨八他製品注射來達成。在另 ^中，局部投藥可藉由輸注來達成，輸注可藉由使用筚袓人鉍件谷易。亦涵蓋其他投藥模式。醫物可調配成適用於每-投藥途徑之劑型。本文中涵蓋-般以注射或輸注為特徵之皮下投藥。可 74 200950803 ( ( 注射劑可以習知形式供 _ _ 製備该等習知形式為液體溶液或懸浮液、適於在注射前於液體令形成溶液或懸浮液之固體形式或乳液：合適賦形劑為例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙酵。醫藥組合物可含有其他較小量之無毒辅助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、丨 „ P ，，犮衝劑、穩疋劑、溶解增強劑及其他該等試劑，諸如乙酿細 00 _ 納、早月桂酸脫水山梨糖醇酯、油酸三乙醇胺及環糊精。太由本文令亦涵羞緩慢釋放或持續釋放 ϋ 系統之植入以便維持值定劑量含量（參見例如美國專利第 WO,795號^該等組合物中所含有之活性化合物之百分比極其視其特定性質以及仆人&、尤、及化口物活性及個體需要而定。可注射劑經設計以用於局部及全身性投藥。出於本文中之目的’局部投藥需要直接投予至受影響之間質。用於 t經^投藥之製劑包括準備用於注射之無菌溶液、準備在臨用則與溶劑組合之諸如冷東 ο 乾知粉末之無菌乾燥可溶性 ^口（包括皮下錠劑）、準備用於注射之無菌懸浮液、準備 =别與媒劑組合之無菌乾燥不可溶性產品及無菌乳、文。命液可為水性或非水性的。若靜脈内投藥，則合劑包括生理鹽水或填酸鹽緩衝鹽水（pBs)，及含：萄糖、聚乙二醇、及聚丙二醇、口葡增溶劑的溶液。及，、混合物之增稠劑、及用於非經腸製劑中之醫藥學媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、之載劑包括水性化劑、局部麻醉劑、懸浮及分散乳緩衝劑、抗氧劑及其他醫藥學上可接受之物質Α魏劑、甜合或聲合 75 200950803 水性媒劑之實例包括氣化鈉注射液、任氏注射液 (Ringers Injecti〇n )、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸任氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物源性不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。可將抗微生物劑以抑菌或抑真菌濃度添加至包裝於多劑量容器中之非經腸製劑中，該等抗微生物劑包括酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氣丁醇、對羥基苯曱酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、羥基氣苯胺（benzalkonium chloride )及苄索氣銨 (benzethonium chloride )。等張劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉齊J包括鹽酸奴佛卡因（pr〇caine hydr〇chl〇ride)。懸浮及分散劑包括緩甲基纖維素納、㈣基甲基纖維素及聚乙稀吡洛咬酮。乳化劑包括聚山梨醇画旨8〇(吐溫（tween) 80)。金屬離子之钳合或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括用於水可混溶媒劑之乙醇、聚乙二醇、及丙二醇、及用於PH調節之氫氧化納 '鹽酸、檸檬酸或乳酸。調節醫藥活性化合物之潼疮德β 您/辰度使得注射提供產生所需藥理作用之有效量。如此項技術中祕仪彳盯Τ所知，確切劑量視患者或動物年齡、重量及情況而定。罩^ θ 早位劑量之非經腸製劑可包裝於安瓿、小瓶或具有針之注射哭士人射益中。含有醫藥活性化合物之液體溶液或復水粉末製劑之牌灶^丄別之體積隨待治療之疾病及選擇用於包裝之特定製品而變。如如此項技術中所知及所實踐’用於非經腸投藥之所有制劑必須為無菌的。在一實例中’醫藥製劑可呈治胁^ , w』至液體形式’例如溶液、糠 76 200950803 漿或懸浮液。若以液體形式提供劑形式提供以在使用前稀釋至治療丄 ==濃縮製劑可藉由習知方法用醫藥接又U液體製予工j供受之添加劑來，等添加劑為諸如懸浮劑（製備遠鉍七备儿A 山呆糖酵糖漿、纖維素衍生 5 ·<用月日肪），乳化劑（例如_磷脂或阿拉伯膝）；劑（例如杏仁油、油性醋或經分顧之植物油）；及防腐劑（例如對經基苯甲酸甲醋或對經基苯甲酸丙醋或山梨酸）°在另—實例中，醫藥製劑可以冷純燥形式呈現以在使用前用水或其他合適媒劑復水。投藥方法可經使用以降低所選化合物對降解過程（諸如蛋白質水解降解及經由抗原性及免疫原性反應之免疫干預）之暴露。該等方法之實例包括在治療部位局部投藥。 Ο 已報導使/ο療劑聚乙一醇化以增加對蛋白質水解之抵抗性、增加企漿半衰期及降低抗原性及免疫原性。聚乙二醇化方法之實例在此項技術中為已知的（參見例如Lu及Feiix， /ηί. </· PepizWe 户叩如-« 及以·, 127-138, 1994 ; Lu 及 Felix， Peptide Res., 6: 142-6, 1993. Felix ^ Λ., /ηί. J. Peptide Res., 彳6 : 253-64，1995 ; Benhar 等人，《/.別〇/. CAem·, 26夕： 13 398-404, 1994； Brumeanu ^ X, J Immunol., 154: 3088-95, 1995 ;亦參見 Caliceti 等人（2003) Ji/v. De/zv. 55(/(^:1261-77 及 Molineux (2003) ·23 Θ

Pi 2力3S-8S )。聚乙二醇化亦可用於活體内核酸分子傳遞。舉例而言，使腺病毒聚乙二醇化可增加穩定性及基因轉移 (參見例如 Cheng 等人{2Q0V) Pharm. Res. 20(9)’. 77 200950803 1444-51)〇冷凍乾燥粉末 ^在本文中關注冷凍乾燥粉末，其可經復水而以溶液、礼液及其他混合物形式投^。其亦可以固體或凝膠形式水及調配。無菌冷凍乾燥粉末係藉由將活性化合物溶解於緩衝溶液中來製備。緩衝溶液可含有改良穩定性之賦形劑或粉末 :自粉末製備之復水溶液之其他藥理組份。後續無菌過濾 /合液繼而在熟習此項技術者已知之標準條件下冷凍乾燥以提供所需調配物。簡而言 <，冷綠燥粉末係藉由將諸如右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖聚、木糖醇、甘油、葡萄糖、庶糖或其他合適試劑之賦形劑溶解於諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或熟習此項技術者已知之其他該等緩衝液之合適緩衝液中來製備。接著，將所選之酶添加至所得混合物中，且攪拌直至其溶解。所得混合物經無菌過濾或處理以移除微粒且確保無菌，且將其分配至小瓶中以供冷凍乾燥。每一小瓶容納單個劑量或多個劑量之化合物。冷來乾燥粉末可在諸如、約代至室溫之纟適條件下儲存。用緩衝溶液使此冷凍乾燥粉末復水以提供用於非經腸投藥之調配物。 2. 劑量及投藥本文中所提供之可溶性玻尿酸酶可調配成典型地用於單一劑量投藥之醫藥組合物。以足以在不存在對所治療患者之不合需要之副作用的情況下發揮治療有效作用之量包 78 200950803 括所選之可溶性玻尿酸酶。治療有效濃度可藉由諸如使用本文中所提供或此項技術中已知之檢定在已知試管内及活體内系統中測試多肽來根據經驗判定（參見例如Taliani等人（1996) Anal. Biochem·，240: 60-67 ; Filocamo 等人 (1997) J Virology, 71: 1417-1427 ; Sudo 等人（1996)

Antiviral Res. 32: 9-18 ; Buffard 等人（1995) Virology， 209:52-59 ; Bianchi 等人（1996) Anal. Biochem.，237:

239-244 ; Hamatake 等人（1996) Intervirology 39:249-258 ; Steinkuhler 等人（1998) Biochem.，37:8899-8905 ; D'Souza 等人（1995) J Gen. Virol.，76:1729-1736; Takeshita 等人 (1997) Anal. Biochem.，247:242-246;亦參見例如 Shimizu 等人（1994) J. Virol. 68:8406-8408 ; Mizutani 等人（1996) J_ Virol. 70:7219-7223 ; Mizutani 等人（1996) Biochem. Biophys. Res. Commun.，227:822-826; Lu 等人(1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA)，93:1412-1417; Hahm 等人，（1996) Virology，226:318-326 ; Ito 等人（1996) J. Gen. Virol·， 77:1043-1054 ; Mizutani 等人（1995) Biochem· Biophys. Res. Commun.，212:906-911 ; Cho 等人（1997) J. Virol. Meth· 65:201-207 )且接著自其推斷用於人類之劑量。 /台療有效劑量典型地等於或約為5〇〇單位至〇〇〇單位之可溶性玻尿酸酶。舉例而言，可溶性玻尿酸酶可以等於或約為500單位、1〇〇〇單位、2〇〇〇單位、5〇〇〇單位、單位、30,000單位、40,〇〇〇單位、50,000單位、6〇〇〇〇單位、70,000單位、80，_單位、9〇〇〇〇單位、1〇〇,〇〇〇單位 79 200950803 或100,000單位以上皮下投予。在一些實例中，劑量可以與所投予之IG之比率形式提供。舉例而言，玻尿酸酶可以每公克IG 10 U至500 U或500 U以上來投予，例如等於或約為 10 U/g、20 U/g、30 U/g' 40 U/g、50 U/g、60 U/g、70 U/g、 80 U/g、90 U/g、100 u/g、150 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g或500 u/g以上。本文中所涵蓋之玻尿酸酶之注射或輸注體積典型地等於或約為〇 5爪卜i ml、2瓜卜3 m卜 4 m卜 5 ml、6 ml、7 邱、8 ml、9 ml、1〇 ml、15 如、 2/m卜30mb 40W、5〇1111或5〇mlw上。玻尿酸酶可以等於或約為 50 U/m卜 100 u/m卜 150 U/m卜 200 ϋ/ml、400 U/ml或500 U/ml之儲備溶液形式提供或可以例如等於或約為 1000 U/m 卜 1500 U/nU' 2_ u/ml、4〇〇〇 u/ml 或 5_

形式提供。冷耗燥調配物對於儲存大單位㈣之可溶性至有效濃度。形式提供。為

中測試化合物來根據經驗判定。已知試管内及活體内系統紐合物中所選之免疫球蛋 80 200950803

白之濃度視複合物之吸收、鈍化及排泄率、複合物之物理化學特徵、給藥時程及所投^之量以及熟習此項技術者已知之其他因素而定。舉例而t，應㈣’精確劑量及治療持續時間隨所治療之組織而變且可使用已知測試方案或藉由自活體内或試管内測試資料推斷來根據經驗判定。應注意，濃度及劑量值亦可隨所治療之個體年齡而變。應進一步瞭解，對於任何特定個體而言，特定劑量攝生法應隨時間推移而根據個體需要及投藥或指導調配物投藥之人員之專業判斷來調整，且應瞭解本文中所闡明之濃度範圍僅為例不性的且不意欲限制其範疇。經投予用於治療疾病或病狀（例如IG可治療性疾病或病狀）之所選免疫球蛋白製劑之量可藉由標準臨床技術來判定。另外，可使用試管内檢定及動物模型來幫助識別最佳劑量範圍。因此’可根據經驗判定之精確劑量可視特定免疫球蛋白製劑、可溶性玻尿酸酶之攝生法及給藥時程、投藥途徑、待治療之疾病類型及疾病之嚴重度而定。對於所治療之特定適應症而言，一般以允許以等於每月一次IV劑量之劑量皮下投藥之量提供IG。特定之每月一次iv劑量隨待治療之疾病而變，且因此可不同。皮下投予IG之例示性劑量範圍等於或約為 1 公克（g)、5 g、10 g、20 g、30 g、40 g、50 g、60 g、7〇 g、8〇 g、90 g、100 g 或 20〇 g。其特定劑量及调配物視適應症及個體而定。舉例而言，可以每公斤體重 (BW) 50 毫克（50 mg/kg BW)、1〇〇 mg/kg BW、200 mg/kg BW、300 mg/kg BW、400 mg/kg BW、500 mg/kg BW、600 81 200950803 mg/kg BW或600 mg/kg Bw以上投予劑量。必要時，劑量可根據經驗來判疋。為達成該等劑量，皮下投予之製劑之體積可等於或約為50 ml、1〇〇 mi、2〇〇 mi、300 ml、400 m卜500 m卜600 ml、7〇〇 ml或7〇〇⑹以上。舉例而言，用於本文中所述之適應症的1〇%液體IG調配物（ι〇〇 mg/ml)可以50 ml至700 ml之體積投予以達成〇 5 g至70 g IG之劑量。在投予大體積之情況下，典型地藉由輸注來投藥。可以等於或約為〇·5 ml/kg/BW/h、1 ml/kg/Bw/h、2 ml/kg/BW/h、3 ml/kg/BW/h、4 ml/kg/BW/h 或 5 ml/kg/BW/h 之輸注速率對個體進行給藥。輸注速率可根據經驗判定且典型地隨個體之可耐受性而變。若在輸注期間出現不良反應則了將輸注速率減慢至恰好低於出現不良事件之速率。若回應於速率降低而使不良事件消除，則可在醫師斟酌下緩慢增加輸注速率。可藉由重力、泵輸注或完全2〇公克-30公克劑量之注射來促進皮下IG輸注。對於輸注而言，一般可使用靜脈内輸注泵。1(}可以等於或約為5 ml/h' 1〇 ml/h、30 ml/h、60 ml/h、120 ml/h、240 ml/h 或 300 ml/h 之速率來輸 >主。只要輸注可為患者所耐受即可在治療過程期間增加輸注速率。輸注之投藥時間一般等於或約為〇5 h lh、1.511、211、2_511、311、4]1或411以上。歸因於藉由皮下投予與玻尿酸酶共同調配及/或共同投予之IG所達成之回輸注速率’所以輸注時間顯著小於習知IVIG治療之輸注時間。在輸注時間超過所需限度之情況下，可在醫 82

200950803 郎及個體之斜酌H h & 兩始使用第二輸注部位。典型地用距初始部位至少10cm之第二部位。用於輸注之技街為熟習此項技術者所知，且在治療醫師之技術範圍内。人摘逾 ’ σ1-齊丨里之IG —般可儲集於標準jy•袋中舉例而5，可使用不通氣輪注裝置，其在末端附近具有Υ形σ可將24號皮下輪注針在個體所偏好之部位處插入仁由於待輸注之溶液體積’所以推薦腹部且其次大腿。玻尿酸酶及1G可提供於相同Υ形口㈣中。出於藉由重力或泵來輸庄之目的’在本文中亦可使用其他製品且其包括 (仁不限於）f、瓶、注射器或其他容器。可溶性玻尿酸酶可在IGt劑之後、與之間歇或同時投予般在投丨IG製劑之前投予玻尿酸酶以允許玻尿酸酶降解間I工間中之玻尿酸。舉例而言，可在投予犯製劑前第1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、1〇分鐘、2〇分鐘或3〇分鐘投予可溶性玻尿酸酶。在一些實例中，玻尿酸酶與免疫球蛋白製劑一起投予。如將由熟習此項技術者所瞭解，所需之共同投予接近度在顯著程度上視劑在特定組織環境中之作用半衰期及所治療之特定疾病而定，且可藉由在合適模型（諸如合適動物模型）中測試以不同時間投予劑之作用來容易地最佳化。在一些情境下，投予玻尿酸酶之最佳時間應超過 60分鐘。在輸注IG之前，一般以等於或約為〇 2 ml/min、〇 5 ml/min、1 ml/min、2 ml/min、5 ml/min、1〇 mi/min 或 ι〇 83 200950803 ml/min以上之速率注射可溶性玻尿酸酶。舉例而言，可經由用於後繼輪注IG之相同γ形口來注射可溶性玻尿酸酶。如上文所述，所投予之可溶性玻展酸酶之體積隨所需劑量而變，但可視可用之可溶性玻尿酸酶儲備調配物之濃度而變化。舉例而言，在本文中預期不以大於約50 ml之體積來投予可溶性玻尿酸酶’且典型地以5 ‘3〇⑹之體積來投予。在醫師之斜酌下，對於較大體積可使用注射栗。在不耐受輸注（例如，其引起中度至重度局部反應）之情況下，可開始使用第二輸注部位以便個體接受完全劑量。 3 IG製劑可一次投予或可分為多個較小劑量以按時間間 3予可卩《多個劑量經治療時程（例如經若干小時、週或月）投予所選IG製劑。在一些狀況下，連續投藥 =適用的。應瞭解，投藥之精確劑量及過程視適應症及患者可耐受性而定。應瞭解精確劑量及治療持續時間隨所治療之疾試資^可使用已知測试方案或藉由自活體内或試管内測 =推斷來根據經驗判定。應注意，濃度及劑量值亦可特定個Πΐ重度而變。應進一步瞭解，對於任何需要及4 疋劑量攝生法應隨時間推移而根據個體或指導組合物投藥之人員之專業判斷來調整，限=本文中所閣明之濃度範圍僅為例示性的且不意欲天、：有其：組合物及組合之範嘴或使用。可每小時、每週、每月、每年或-次性投予組合物。劑量攝生法 84 200950803 ( 或it選擇以限制毒性。應注意，歸因於毒性或骨趙、肝 ^ 1其他組織功能障礙，主治醫師應瞭解如何及何時終或調整治療至較低劑量。相反4臨床反應不足瘠％緣& ^作用）’則主治醫師亦應瞭解如何及何時將治療調整至較高含量。 G·評定活性、生物可用率及藥物動力學之方法

4人可用⑪評定免疫球蛋白單獨或與可溶性玻尿酸酶 =口之试管内及活體内活性。在該等檢定中包括彼等評定下投予之免疫球蛋白之藥物動力學特性（包括生物可用 < =耐受性）的檢定。亦可使用此項技術中熟知之檢定 — '免疫球蛋白及玻尿酸酶之生物活性。可使用該等檢如）來判疋用於治療之免疫球蛋白及玻尿酸酶之合適劑量及給藥頻率β σ ^ 藥物動力學及可耐受性樂物動力學及可对受性研究（諸如下文描述於實施例i 中之彼等研究）可使用動物模型來進行或可在對患者進行 Z九期間進行。動物模型包括（但不限於）小鼠、大鼠豕兔、犬、豚鼠及非人類之靈長類動物模型（諸如獼猴或良可猴（rhesus maeaques))H情況下，使用健康動物進仃藥物動力學及可耐受性研究。在其他實例中，使用-有考慮用免疫球蛋白、冶療之疾病之動物模㉟（諸如具斤述之疾病及病狀中之任—者的動物模型）來進行投藥後’可藉由量測下列參數來評定皮下投予之免疫 85 200950803 求蛋白之藥物動力學：最大（峰值）血裝免疫球蛋白濃度 (cmax)、峰值時間（亦即出現最大血漿免疫球蛋白濃度之時間；Tmax)、最小血漿免疫球蛋白濃度（亦即免疫球蛋白劑量之間的最小血漿濃度；C—)、消除半衰期（Tl/2)及曲線下面積（亦即由繪製血漿免疫球蛋白濃度隨時間之關係圖所產生之曲線下的面積；AUC)e藉由比較皮下傳遞後免疫球蛋白之曲線下面積（AUCsc)與靜脈内傳遞後免疫球蛋之AUC ( AUCiv )來測定皮下投予之免疫球蛋白之絕對生物可用率。可使用公式：卜（[AUC]sex劑量se)/([AUC]iv X劑量iv)來計算絕對生物可用率（F)。可使用此項技術中已知之任何適於評定血液樣品中之免疫球蛋白濃度之方法來量測皮下投藥後免疫球蛋白於血漿中之濃度。例示性方法包括（但不限於）ELISA及濁度測定法。 —在藥物動力學研究中可投予給藥之劑量範圍及不同給藥頻率來評定增加或減少劑量中之免疫球蛋白及/或玻尿酸酶濃度之效應。亦可在共同投予或未共同投予玻尿酸酶之清況下。平疋皮下投予之免疫球蛋白之藥物動力學特性（諸如生物可用率）。舉例而言，可向犬（諸如米格魯犬（“巧卜））皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白或單獨皮下投予免疫球蛋白。亦向另一組米格魯犬給予免疫球蛋白之靜脈内劑篁。接著可在各個時間點獲取血液樣品且諸如藉由濁度測定法來測定血漿中之免疫球蛋白量。接著可量測AUC且可測定在投予或未投予玻尿酸酶之情況下皮下投予之免疫球蛋白之生物可用率。可進行該等研究來評定與玻尿酸酶 86 200950803 . 共同投予對皮下投予之免疫球蛋白之藥物動力學特性（諸如生物可用率）的影響。評定安全性及可耐受性之研究在此項技術中亦為已知的且可在本文中使用。在共同投予或未共同投予玻尿酸酶之情況下，皮下投予免疫球蛋白後，可監視任何不良反應之出現。不良反應可包括（但不限於）諸如浮腫或腫服之注射部位反應、頭痛、發燒、疲勞、寒冷、面部潮紅、眩暈、蓴麻療、喘鳴或胸闕…惡心“區吐、寒戰、背痛、胸 ^ _、肌肉痙攣、癲癇發作或抽摆、企壓變化及過敏性或嚴重超敏性反應。典型地在安全性及可耐受性研究中投予多種劑量及不同給藥頻率來評定增加或降低劑量中之免疫球蛋白及/或玻尿酸酶濃度之效應。 2. 生物活性 a. 免疫球蛋白可試管内或活體内評定免疫球蛋白用作治療劑之能力。舉例而[可進行試管内檢定來評定免疫球蛋白中和 €/ 病毒或細菌感染性之能力（Hiemstra等人，（1994) J Lab Clin Med 123:241_6)。可使用其他試f内檢定來評定免疫球蛋白之其他生物活性。舉例而言，可使用此項技術巾已知之包括（但不限於）ELIS A、西方墨點法（Western bl〇t)、北方墨點法（Northern blot)及流式細胞法之任何方法來評定標記表現以評定免疫球蛋白製劑與補體活化產物相互作用及調即補體活化產物、結合個體遺傳型抗體、結合巨噬細胞上之Fc受體及抑制包括細胞因子、趨化因子及金屬蛋白酶 87 200950803 之各種發炎性介體的能力。舉例而言，可使用流式細胞法來評定免疫球蛋白對外周血單核細胞上之趨化因子受體表現之影響（Trebst 等人，（2006) Eur J Neurology)。在另一實例中，可使用北方墨點分析來評定免疫球蛋白對巨噬細胞上之金屬蛋白酶表現之影響（Shapiro等人，（2002) Cancer 95:2032-2037) ° 亦可進行使用動物模型之活體内研究來評定免疫球蛋白之治療活性。可向感染一或多種微生物之動物模型投予免疫球蛋白且可諸如藉由量測微生物數目或量測重量作為發病標記來評定對感染進程之影響。亦可使用具有考慮使用免疫球蛋白治療之疾病及病狀之動物模型來評定免疫球蛋白之治療作用。該等動物模型在此項技術中為已知的，且包括（但不限於）下列疾病之小動物模型：X-連結無Ύ 球蛋白血症（XLA)、SCID、維斯科特-奥爾德裏奇症候群、川崎氏病、格巴二氏症候群、ITP、多發性肌炎、蘭伯特-伊頓肌無力症候群、重症肌無力及莫氏-沃特曼症候群 (Czitrom 等人（1985) J Immunol 134:2276-2280 ； Ellmeier 等人，（2000) J Exp Med. 192: 1611-1624 ; Ohno (2006) Drug Discovery Today: Disease Models 3:83-89 ; Oyaizu 等人 (1988) J Exp Med 2017-2022; Hansen 等人，（2002) Blood 100:2087-2093 ; Strongwater 等人，（1984) Arthritis Rheum. 27:433-42 ； Kim 等人（1998) Annals NY Acad Sci 841:670-676 ; Christadoss 等人(2000) 94:75-87 ; Sommer 等人，（2005) Lancet 365:1406-1411 ;美國專利第 7309810 88 200950803 號）。 b· 玻尿酸酶可使用此項技術中熟知之方法來評定玻尿酸酶活性。在—實例中，使用微濁度檢定來量測活性。此係基於當玻尿酸與血清白蛋白結合時不溶性沈澱物之形成。藉由將玻尿酸酶與玻尿酸鈉（玻尿酸）一起培育設定時段（例如10 刀名里）且接著藉由添加酸化之血清白蛋白來使未消化之玻尿酸鈉沈澱來量測活性。在額外發展時段後，於640 nm處量測所得樣品之濁度。由玻尿酸酶對玻尿酸鈉受質之活性所引起之濁度降低為玻尿酸酶酶促活性之量度。在另—實例中’使用微量滴定檢定來量測玻尿酸酶活性，其中在與玻尿酸酶培育後量測剩餘之生物素標記玻尿酸（參見例如

Frost 及 Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269 ;美國專利公開案第20050260186號）。玻尿酸之葡萄糖醛酸殘基上之自由羧基經生物素標記，且生物素標記之玻尿酸受質與 £\ 微量滴定板共價偶合。在與玻尿酸酶一起培育後，使用抗生物素蛋白-過氧化酶反應來偵測剩餘之生物素標記之玻尿 I受質，且將其與在與具有已知活性之玻尿酸酶標準物反應後所獲得之結果比較。其他用於量測玻尿酸酶活性之檢定在此項技術中亦為已知的且可用於本文中之方法中（例如參見 Delpech 等人，（1995) Anal. Biochem· 229:35-41 ; Takahashi 等人，（2003) Anal· Biochem· 322:257-263 )。亦可评定玻尿酸酶充當展布劑或擴散劑之能力。舉例而5，可在玻尿酸酶存在或不存在之情況下將台盼藍染料 89 200950803 皮下注射至裸小鼠之每一侧上之侧面皮膚中。接著諸如用測微計量測染色面積來測定玻尿酸酶充當展布劑之能力 (美國專利第20060104968號）。 H.治療用途可使用本文中所述之方法來治療針對其使用免疫球蛋白之任何病狀。可皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白 (IG )來治療可由免疫球蛋白治療來改善之任何病狀。本節提供IG之例示性治療用途。下文所述之治療用途為例示性的且不限制本文中所述方法之應用。治療用途包括（但不限於）用於各種免疫學、血液學、神經學、發炎性、皮膚病學及/或傳染性疾病及病狀之免疫球蛋白替代治療及免疫調節治療。在一些實例中，諸如在可能暴露於傳染性疾病（例如，意外針刺損傷）後，投予免疫球蛋白以強化健康患者之免疫反應。識別該等疾病或病狀係在治療醫師之技術範圍内。與其他用於治療此等疾病及病狀之劑組合之免疫球蛋白可與玻尿酸酶皮下共同投予。舉例而言，其他可投予之劑包括（但不限於）抗生素、化學治療劑、類固醇消1藥、非類固醇消炎藥及其他諸如細胞因子、趨化因子及生長因子之免疫調節劑。必要時，可根據經驗判定或推斷特定劑量及持續時間及治療方案。舉例而言，可將靜脈内投予之免疫球蛋白之例示性劑量用作起點來判定合適劑量。劑量含量可基於多種因素加以判定，諸如個體體重、一般健康、年齡、所用 90 200950803 ( ( ^特疋化合物之活性、性別、膳食、投藥時間、排泄率、藥物組合、疾病之嚴重度及過程及患者對疾病之傾向及治療醫師之判斷。免疫球蛋白之劑量一般等於或約為每公斤體重1〇0 mg (亦即100 mg/kg黯）至2 g/kg BW，且玻尿心酶之劑里等於或約為每公克免疫球蛋白口至5〇〇u或 500 U以上’例如等於或約為1〇 _、μ、π u/g、4〇 U/g、50 U/g、60 U/g、70 U/g、80 U/g、90 U/g、100 U/g、 50 U/g 200 U/g、300 u/g、400 u/g、500 u/g 或 500 U/g 以上。應瞭解，所投予之量應隨所治療之適應症而變且可能隨將要耐受之副作用而變。可使用用於每一病症之公認模型來根據經驗判定劑量。在改善患者病狀後，必要時’可與玻尿酸酶以組合方式皮下投予維持劑量之免疫球蛋白，且可修改劑量、劑型或投藥頻率或其、组合。纟一些狀況下，纟#何疾病症狀復發後’個體可能需要基於長期之間歇治療。 Q i具有抗is缺乏之原發性免疫缺乏症免疫球蛋白可用於治療具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏症。原發性免疫缺乏症涵蓋特徵在於缺乏免疫系統之一或多種蛋白質之許多病症。原發性免疫缺乏症典型地為遺傳病症，且許多表現為保護性抗體產生障礙。因此，可向呈現該等疾病之患者投予免疫球蛋白作為免疫球蛋白替代治療。例示性原發性免疫缺乏症包括（但不限於）常見變異性免疫缺乏症（CVID)、先天性無γ球蛋白血症、維斯科特-奥爾德裏奇症候群、嚴重複合型免疫缺乏症（SCID)、 91 200950803 原發性低γ球蛋白症、具有抗體缺乏之原發性$ # 病、X-連結無Ύ玷$ τ货旺兇疫缺乏疾 '，、7失蛋白血症（XLA)、嬰兒期低症、及無抗體之s，丨瞄# Λ诋γ %蛋白血菔之鈉腫瘤性小腦變性。可向患有乏之原發性免疫缺各^ Α 令八有抗體缺、乏症之患者以類似於免疫球番白德晰如投藥所用之劑量“… 兄役衣蛋白靜脈内 ^置的劑置皮下投予與玻尿酸酶組合之蛋白。例示性劑量白包括例如 l〇〇mg/kgBW 與 800 mg/kgBW 免疫球蛋白之間的滴丨丨县, 二— 門的劑置（以四週之間隔時間）。視臨床反應疋’可增加或降低劑量，亦可增加或降低給藥頻率。 2.血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症夺具有血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症之患者命因於錢天低γ球蛋白血症而易患上細菌感染，該等血液惡性腫瘤為諸如慢性淋巴細胞性白血病（似）、多發性骨趙瘤（MM)、非霍奇金氏淋巴瘤（祖）及其他相關惡性腫瘤及造血幹細胞後移植。⑯7球蛋白▲症由錢中缺乏 B-淋巴細胞及所造成之抗體含量較低引起且可見於具有 CLL、MM、NHL之患者中且為白血病相關之免疫功能障礙及治療相關之免疫抑制的結果.體液性免疫缺乏主要為造成（尤其）受被膜包袠之微生物感染相關之發病風險及此等患者死亡率增加之原因。舉例而言，肺炎鏈球菌 iStrept〇coccus pneumoniae)' Ά 戴嗜虹椁菌（Haem〇philus )及金黃色葡萄球菌（汾⑽〜似）以及退伍軍人桿菌及奴卡菌屬為在具有CLL之患者中引起肺炎之常見細菌性病原體。亦已觀察到諸如肺炎肺囊蟲（PwewwocFiz’i carjf/n·/ )、真菌、病毒 92 200950803 及分枝桿菌（mycobacteria)之機會性感染。可藉由投予免疫球蛋白來顯著降低此等患者中之感染數及嚴重度 (Griffiths 等人，（1989) Bl00d 73:366 368; 等人 (1994) Laneet 343:1059-1063 )。因此，可使用本文中所述之

方法向該專患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白來防止復發感染。例示性劑量包括向具有血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症之患者靜脈内投予免疫球蛋白所用，彼等劑量。舉例而言，可每3 i 4週皮下投予與玻尿酸酶組合之約400 mg/kg BW免疫球蛋白。在另一實例中，在患者血清IgG小於4 g/L之治療第一個月可投予4〇〇 mg/kg BW之額外劑量。適當時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量及給藥頻率。 3. 州崎氏病川崎氏病為常常累及冠狀動脈之兒童及小嬰兒之急性發熱性多系統疾病。其亦稱作淋巴結症候群、黏膜皮膚淋巴結疾病、嬰兒多動脈炎及川崎氏症候群且為瞭解較少之 'IV響G括皮膚及黏膜、淋巴結、也管壁及心臟之多個器官的自限性脈管炎（selMimited vascuHtis )。在恢復階段期間，冠狀動脈動脈瘤自疾病之第二週開始出現。儘管病狀之起因為未知的，但存在證據說明特徵性脈管炎由免疫反應引起，該免疫反應特徵在於τ細胞及巨噬細胞針對未知抗原活化、細胞因子分泌、多株Β細胞機能亢進及針對内皮細胞及平滑肌細胞之自體抗體形成。在遺傳易感性個體中，一或多種可能具有超抗原活性之不典型之常見感染因 93 200950803 子可觸& /疾病。在川崎氏病早期投予免疫球蛋白可預防冠狀動脈病變。向具有與川崎氏病有關之進行性炎症之患者皮下，予與破尿酸酶組合之免疫球蛋白可改善症狀。例丁！生脅j量已括向具有川崎氏病之患者靜脈内投予免疫球蛋白所用之彼等劑量。舉例而t，可向具有川崎氏病之患者投予每公斤患者體重約lg-2g免疫球蛋白。舉例而言，此劑量可以4份4〇〇 mg/kg Bw之劑量分連續4日投予。在另 -實例中’可經10小時之時段以單—劑量形式投予i g/kg BW之免疫球蛋白。適當時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。 4.慢性發炎性趙鞠脫失多發性神經病漫性發炎性髓鞘脫失多發性神經病（CIDP )為特徵在於腿及手臂進行性無力及感覺功能受損之神經病症。有時稱作If陡復發性多發性神經病之該病症係由周邊神經之髓鞘遭損壞而引起。儘管其可發生於任何年齡及兩種性別，但CIDP更常見於年輕成人中且男性多於女性。其常常以包括發麻或麻療（開始於腳趾及手指）、手臂及腿無力、深部鍵反射喪失（反射消失）、疲勞及感覺異常之症狀呈現。ClDp 與格巴二氏症候群密切相關且被視作彼急性病之慢性對應疾病不存在特異性診斷性測試，但特徵性臨床及實驗室九°果有助於將此病症與其他免疫介導性神經病症候群相辨別。研究指示用免疫球蛋白治療會減輕症狀（van SChaik 等人，（2002) Lancet Neurol. 1:497-498 )。因此，可使用本文中所述之方法向呈現CIDP之患者皮下共同投予玻尿 94 200950803 . 酸酶及免疫球蛋白。例示性劑量包括向具有CIDP之患者靜脈内投予免疫球蛋白所用之彼等劑量。在一實例中，向具有CIDP之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之約2 g/kg bw之免疫球蛋白。舉例而言，此劑量可以5份4〇〇mg/kgBw之劑量分連續五曰投予。適當時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。 5. 格巴二氏症候群格巴二氏症候群為涉及周邊神經之發炎性髓鞘脫失之 Cz #經自體免疫病症。第一症狀包括不同程度之腿部無力或發麻感，其可波及手臂及上身。此等症狀之強度可增加直至肌肉完全不能使用且患者幾乎完全癱瘓，引起危及生命之病狀。儘管大多數患者一般恢復良好或完全恢復，但已報導約20%患者存在永久傷殘且4%至15%患者死亡。格巴二氏症候群可在呼吸道或胃腸道病毒感染症狀後數曰或數週時出現。在一些情況下，手術或疫苗接種可觸發該症候 Q 群。該病症可經數小時或數日之時程發展，或其可持續3 至4週。神經傳導速度（NCV)測試可向醫生提供線索以協助診斷。在一些情況下，脊椎抽液（spinal up)可用於診斷中，因為格巴二氏症候群患者之腦脊髓液典型地比正常個體含有更多蛋白質。儘管不存在用於格巴二氏症候群之已知治療，但用免疫球蛋白治療可減輕疾病之嚴重度且加速恢復。可以合適州量向患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白，該合適劑量為諸如與用於向具有袼巴二氏症候群之患者靜脈内 95 200950803 投予免疫球蛋白之劑量相類似之劑量。 .^ m ^ 、舉例而s’可向具有格巴一氏症候群之患者皮下投兴瑕尿酸酶組合之約2 g/kg BW之免疫球蛋白。舉例 0此劑量可以5份400 m:g7之劑量分連續5曰投予。視例如可由熟習此項技術者谷易地评估的疾病嚴重度及對治療之臨床反應而定，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。 6. 特發性血小板減少性紫癍亦稱作原發性免疫性企小板減少性紫瘋及自體免疫性血小板減少性紫癜之特發性血小板減少性紫癍（Up)為由抗血小板抗體導致血小板存活縮短所引起之血小板計數減少（血小板減少症）。當血小板計數極低（例如<3〇><i〇9/L)

時，可出現血液滲出至皮膚（紫癜）及黏膜中。具有ITP 之患者之骨髓血小板生成（巨核細胞生成 (megakaryopoiesis))在形態上為正常的。在一些情況下，存在額外血小板功能障礙，其與結合至血小板表面上之醣蛋白之抗體有關。itp可以慢性及急性形式存在。約8〇%之具有itp之成人具有慢性疾病形式。慢性Ιτρ之最高發病率在年齡為15歲歲之女性中，但—些報導暗示發料隨年齡增加。itp相對常見於具有HIV之患者中。雖然ιτρ 可見於感染之任何階段，但其發病率隨HIV疾病推進而增加。研究已表明免疫球蛋白可用於治療具有ΙΤρ之患者 (Godeau 等人（1993) Bl00d 82(5):1415·21 ; G〇deau 等人 (1999) Br J Haematol 1999;107(4):716-9)。為治療具有 Ιτρ 96 200950803 • 之患者，可以類似於用於靜脈内投予免疫球蛋白之劑量的劑量向患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白。舉例而σ 了向具有ΙΤΡ之患者皮下投予與玻展酸酶組合之約1 g/kg至2 g/kg之免疫球蛋白。此劑量可經若干天投予或可以一次劑量投予。在一些實例中，以5份4〇〇 mg/kg bw之免疫球蛋白之劑量分連續數日投予。在另一實例中，視血小板計數及臨床反應而定，投予i g/kg BW，持續連續^ 日。視例如可由熟習此項技術者容易地評估之血小板計數 C A對治療之臨床反應而定，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量及給藥頻率。 7·發炎性肌病：多發性肌炎、皮肌炎及包涵艘肌炎發炎性肌病為涉及骨骼肌組織炎症及變性之一組肌肉疾病。此等疾病為後天的且皆呈現顯著肌肉無力及肌肉内存在發炎性反應。皮肌炎（DM)由於其特殊祕而為於識別之發炎性肌病，該皮療以眼險、面頻及鼻標上及背冑或上胸部：肘、膝及關節上之片狀暗黑色、微紅或淡紫色皮疹之形式出現。在一些患者中， ” 在皮膚下出現舞化筋結或硬化凸塊。皮疹常常先於肌肉盔，、，、刀其典型地經數调之犄段出現但可經數月或甚至數日出兒童期至成人期之任何年齡且女性比男降^炎可出現於 - v 男性更常見。報導約二刀之一的DM患者具有吞咽困難 ,,. , 、25/〇之具有 DM 之成人一般出現肌肉疼痛及觸痛，但多於 ( 兒童抱怨肌肉疼痛及觸痛。 °之具彳DM之多發性肌炎（PM)不具有皮之·特徵性皮疹，且肌 97 200950803 肉無力之發作通常比DM進展更為緩慢。許多？蘭患者具有吞因困難在些情況下’患者亦具有歸因於肌肉衰竭之呼吸困難。多達三分之一的PM患者具有肌肉疼痛。與男性相比，較多女性感染該疾病，且年齡在20歲以下之人群很少感染該疾病，但已報導兒童期及嬰兒期多發性肌炎之病例。包涵體肌炎（IBM )與多發性肌炎極類似。IBM中之肌肉無力之發作通常極為漸進，經數月或數年發生。其與PM 不同之處在於近端及遠端肌肉皆受到影響，而在PM中一般僅近端肌肉受到影響。典型發現包括腕屈肌及指屈肌無力。前臂萎縮為該疾病之特徵，且常見四頭肌萎縮及不同程度之其他肌肉無力。約一半患有IBM之患者具有吞咽困難。IBM之症狀通常在5 〇歲後開始，但不排除任何年齡組。與女性相比，IBM更常出現於男性中。約十分之一的IBM 病例為遺傳性的。研究指示投予免疫球蛋白可有益於具有此等發炎性肌病之患者。免疫球蛋白可改善肌肉力量，減輕炎症且減輕疾病進程及嚴重度（Dalakas等人（1993) N Engl J Med 329(27):1993-2000 ; Dalakas 等人（2001) Neurology 56(3):323-7 ; Dalakas (2004) Pharmacol Ther 102(3):177-93 ; Walter 等人（2000) J Neurol 247(1):22-8 )。可向具有DM、PM或IBM之患者以類似於用於靜脈内投予免疫球蛋白之劑量的劑量皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白。舉例而言’可典型地經若干天投予2 g/kg bw之免 98 200950803 疫球蛋白，諸如以5份400 mg/kg BW之劑量分連續數曰投予。 8,蘭伯特-伊頓肌無力症候群蘭伯特-伊頓肌無力症候群（LEMS )為罕見之自體免疫性神經肌肉傳遞病症，其首先被認為臨床上與肺癌有關且隨後出現於未偵測出任何贅瘤之病例中。具有之串、者具有突觸前神經肌肉接合點缺損。該疾病之臨床特徵在於近端肌肉無力（練習後力量增加），輕度動眼體征、深部匕鍵反射壓抑及自主神經功能障礙（口乾燥、便秘、勃起障 )白具有LEMS之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白可改善症狀。例示性劑量包括彼等用於向具有lems 之患者靜脈内投予免疫球蛋白之劑量。舉例而言，可經由若干次給藥向具有LEMS之患者投予每公斤患者體重2 g之免疫球蛋白。舉例而言，可以5份400 mg/kg b w免疫球蛋白之劑量分連續5曰投予。合適時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。 ^ 9·多灶性運動神經病具有傳導阻滯之多灶性運動神經病（MMN )為後天免疫介導性髓鞘脫失神經病，其具有緩慢漸進性無力、自發性收縮及痙攣而無顯著感覺受累。在診斷之前，疾病之持續時間處於若干月至多於15年之範圍内。MMN之明確成因為未知的。組織病理學及電診斷研究表明存在髓鞘脫失及軸突損傷。主要影響運動神經’但已表明感覺神經中亦存在輕度髓鞘脫失。免疫調節及免疫抑制治療之功效進— 99 200950803 步支持MMN之免疫性質。在超過一半之具有MMN之患者 . 中’抗GM1抗體之力價升高，儘管抗GM1抗體在該疾病中之作用為未知的’但其存在可用作MMN之診斷標誌。向具有MMN之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白可改善症狀。例示性劑量包括彼等用於向具有Mmn 之患者靜脈内投予免疫球蛋白之劑量。舉例而言，可經由若干次給樂向具有MMN之患者投予每公斤患者體重2 g之免疫球蛋白。舉例而言，可以5份400 mg/kg B w免疫球蛋白之劑量分連續5日投予。在另一實例中，i g/kg BW可分連續2日投予。可向一些患者給予維持治療，其可包括例如每2-6週給予400 mg/kg BW至2 g/kg BW之劑量。考慮患者反應，合適時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。 10.重症肌無力重症肌無力（MG )為慢性自體免疫性神經肌肉疾病，其特徵在於身體骨骼肌不同程度之無力。其與存在針對乙酿膽驗党體（AChR )之抗體有關或與神經肌肉接合點處之肌肉特異性酪胺酸激酶（MuSK)有關，但一些患者為抗體〇陰性的之臨床特徵包括波動性無力及隨意肌之易疲勞性（尤其提上瞼肌、眼外肌、眼球肌 '肢體肌肉及呼吸肌）。患者通常呈現眼瞼單侧或雙側下垂（下垂）、複視、吞咽困難及近端肌肉無力。在嚴重狀況下或在急性嚴重惡化（肌無力危症）中，呼吸肌無力可引起呼吸衰竭。重症肌無力出現於所有種族群體及兩種性別中。其最常感染低於歲之年輕成人女性及高於60歲之年長男性，但其可出現於任 100 200950803 何年齡。在一此情況下，ϋ 一 πΑ & 血袖一月下了進仃胸腺切除術以減輕症狀。 m 當其他治療無效或弓丨起嚴重副作用時，可將免疫球蛋白例如作為維持治療療用於具有中度至重度MG之患症i期2在胸腺切除術之前或疾病急性惡化（肌無力危 “又予免疫球蛋白。可使用本文中所述之方法向具症肌無力之患者皮下投予與玻尿酸示性劑量包括彼等用於向具…患者靜脈内: 免疫球蛋白之劑量。舉例而言，可向具有MG之患者每4 週-6週投予_mg/kgB^ 2心黯之劑量以供維持治療：胸腺切除術之前或肌無力危症_，可經由若干次給藥來投予1 g/kg B W-2 g/kg B w，諸如以5份彻mg/kg B w 之劑量分連續5日投予。在另—實例中，1 g/kg Bw可分連續2曰投予。 11 ·莫氏-沃特曼症候群

、亦稱作僵人症候群之莫氏-沃特曼症候群為具有自體免疫疾病特徵之罕見神經病症。患者呈現與肌肉僵硬及併發車孓f生痙攣有關之症狀。肌肉僵硬波及主要腹部及胸腰部肌肉之中軸肌肉以及近端肢體肌肉。軀幹主動肌及拮抗肌共同收縮典型地導致具有脊柱前凸過度之板狀外觀。較不 ¥見的疋’呼吸肌受累導致呼吸困難且面部肌肉受累導致饭面樣面容。用免疫球蛋白治療可達成具有莫氏-沃特曼症候群之患者之僵硬減輊及敏感性評分增高（Dalakas等人 (2001) N Engl J Med 345(26):1870-6)。可使用本文中所述之方法向八有莫氏_沃特曼症候群之患者皮下投予與玻尿酸酶 101 200950803 組合之免疫球蛋白。例示性劑量包括彼等用於向具有沃料症候群之患者靜脈内投予免疫球蛋自之劑量。舉例而言’免疫球蛋白可以400 mg/kgBW之劑量分連續$曰浐予。可向-些患者給予維持治療，其可包括例如每Η週二予^ g/kg抓2 g/kg B W免疫球蛋白。合適時，可增加或^ 低所投予之免疫球蛋白量。 12.其他疾病及病狀

臨床資料指示免疫球蛋白可用於治療許多病狀。在一些情況下，免疫球蛋白可用作一線治療，然而，在並他狀況下，當標準治療經證明無效、變得不可耐受或顯示不合時，可投予免疫球蛋白以作為二線治療。識別該等疾病或病狀係在治療訪之技術範圍卜此#疾病或病狀之實例包括（但不限於）繼發性低γ球蛋白血症（包括醫原性免疫缺乏症）’特異性抗體缺乏；急性播散性腦脊趙炎丨謂以陽性全身壞死性脈管炎；自體免疫溶血性貧血；大水皰性天疱瘡樣病；瘢痕性天疱瘡樣病；伊文氏症候群（包括具有免疫性企小板減少症之自體免疫溶血性貧幻；母胎/新2 兒同種免疫性血小板減少症（FMAIT/NAIT);阿耳滋海默氏病；噬血細胞症候群；高風險同種異體造血幹細胞移植； IgM副蛋白血症神經病；腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調；落葉型天隸；尋常天癌瘡；輸血後紫瘋；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群（ten/sjs);中毒 !生休克症候群’全身性紅斑狼瘡；多發性骨趙瘤，·腹毒病；骨髓移植；B細胞腫瘤；及創傷。 102 200950803 免疫球蛋白亦已展示具有針對多種細菌、病毒及真菌感染之抗微生物活性，該等細菌、病毒及真菌包括（但不限於）B型流感嗜血桿菌、A型及B型綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、B群鏈球菌、1型、3型、4型、6型、7型、8型、 9型、12型、14型、18型、19型及23型肺炎鏈球菌、2 型及5型腺病毒、細胞巨大病毒、E_B病毒vca、a型肝炎病毒、B型肝炎病毒、疱疹單純型病毒4、疱疹單純型病毒-2、A型流行性感冒、麻療、！型、2型及3型副流行性感s脊髓灰質炎、水痘帶狀疱疹病毒、麴菌及白色念珠菌。因此，可向具有細菌、病毒及真菌感染之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白以強化患者之免疫系統且治療疾病。在一些實例中，亦可投予抗生素或其他抗微生物劑。 I· 製品及套組可將共同或分別提供之免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶 Φ 之醫藥組合物包裝成製品，該等製品含有包裝材料、有效用於治療IG可治療性疾病或病狀之醫藥組合物及指示組合物及組合打算用於治療IG可治療性疾病及病狀之標籤。例不性製品為包括單腔室及雙腔室容器之容器。容器包括（但不限於）管、瓶及注射器。容器可進一步包括用於皮下投藥之針。本文中所提供之製品含有包裝材料。用於包裝醫藥產叩之包裝材料為熟習此項技術者所熟知。例如參見美國專利第5,323,907號、第5,033,252號及第5,〇52,558號，其每 103 200950803 —者係全部併入本文中。醫藥包裝材料之實例包括（但不限於^發泡包裝、航'管、吸入器、系、袋、小瓶、容器、器瓶及適用於所選調配物及預期投藥及治療模式之可。裝材料。預期本文中所提供之化合物及組合物之多種調配物為對任何IG可治療性疾病或病狀之多種治療。共同或分別提供之免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶之組合物亦可以套組形式提供。套組可包括本文中所述之醫藥組合物及用於投藥之項目。舉例而言，組合物可與諸如注射器吸入器、劑量杯、滴管或塗藥器之用於投藥之裝置 -起提供。套組可視情況包括關於包括劑量、給藥攝生法之應用之說明書及關於投藥模式之說明書。套組亦可包括本文中所述之醫藥組合物及用於診斷之項目。舉例而言，該等套組可包括用於量測IG之濃度、量或活性之項目。 J· 實施例僅出於說明性目的而包括下列實施例且該等實施例不意欲限制本發明之範疇。實施例1 可溶性重組人類PH20(rHuPH2〇)促進免疫球蛋白 (IG)之皮下投藥及生物可用率與靜脈内（IV)投藥相比，免疫球蛋白（ig)之皮下 (SQ)投藥引起生物可用率降低。—項研究報導與ιν投藥相比之63%生物可用率，從而需要使用ιν劑量之137%之 SQ劑量來達成相等生物可用率（亦即，時間_濃度曲線下之面積（AUC ) ) ( Ochs 等人（2〇〇6) j —如_〇1， 104 200950803

26:265-273 )。因此，進行實驗來測定在可溶性重組人類 PH20 ( rHuPH20 )存在下皮下投予 IG ( GAMMAGARD LIQUID ( GGL )，Baxter Bio sciences )是否會增加 SQ 投藥後IG之生物可用率，從而排除增加劑量之必要。實驗研究經設計以評定1 )經由皮下（SQ )途徑個體在單個部位耐受 GGL之每月劑量之能力；2)在僅僅輕度局部不良藥物反應之情況下耐受每月GGL劑量所需之每公克GGL rHuPH20 劑量；3 ) SC投藥所需之時間；及4 )比較藉由GGL之曲線下面積（AUC )所量測之IV生物可用率與SQ生物可用率。簡而言之，11個免疫缺乏症成人患者參與研究中，其接受穩定靜脈内γ球蛋白（IVIG)劑量。所有患者保持與其在研究前所接受之劑量相同之每月IVIG劑量。關於皮下投藥，每四週以IV方式接受至多每公斤體重600 mg GGL 之患者在單個部位以4週IV劑量之％之劑量（亦即1週劑量）開始接受SQ輸注以測定耐受1週劑量所需之rHuPH20 劑量。隨後，降低rHuPH20劑量且患者接受2週GGL劑量、 3週GGL劑量且最終完全4週GGL劑量以測定耐受每月一次GGL之SQ輸注所需之最少rHuPH20。使用每公克GGL 150 U rHuPH20進行初始輸注。在輸注GGL之前，經由24號SQ針以1 ml/min_-2 ml/min.之速率投予濃度為150 U/ml或1500 U/ml之rHuPH20。若使用 1500 U/ml rHuPH20,則其如下稀釋：a)若所需濃縮rHuPH20 溶液（1500 U/ml)之體積為1.5 ml或1.5 ml以下，則使用 105 200950803 注射用生理鹽水以1:10將其稀釋；b )若所需濃縮rHuPH20 (1500 U/ml)之體積高於1.5 ml但低於15 ml，貝ij用注射用生理鹽水將其稀釋至15 1 ; c )若所需濃縮rHuPH20溶液 (1500 U/ml)之體積為15 ml或15 ml以上，則其以未稀釋形式使用。

在輸注rHuPH20後（且在5分鐘内）立即經由相同24 號SQ針自4週劑量之％之劑量（亦即1週劑量）開始輸注 GGL以測定在單個部位給予4週劑量之四分之一所需的 rHuPH20量。若耐受輸注，則評定每一患者以供測定；若存在中度或重度局部反應，則認為不耐受輸注，從而需要不只一處投藥部位或不能在不到3小時内完成輸注。若耐受每週GGL劑量，則使用100 U/g GGL之rHuPH20來投予一半劑量（2週劑量）且rHuPH20之劑量進一步降低至66 U/g GGL，接著50 U/g GGL。重複以每公克GGL計之 rHuPH20劑量，其中增加GGL量直至在單個部位耐受完全 4週GGL劑量。若在任一點處不耐受rHuPH20量，則接著以下一時間間隔重複每週GGL劑量且增加rHuPH20量直至耐受該劑量。若個體不能耐受rHuPH20劑量2次連續增加之劑量（亦即以GGL之各別劑量3次嘗試），則接著將先前财受劑量判定為最大财受劑量。僅評估前4名患者之可耐受性；最後7名患者經IV輸注，繼而進行藥物動力學（PK )研究以比較IV輸注與後繼 SQ輸注。關於SQ輸注，在達成GGL之每月劑量投藥後，重複相同每月劑量且進行PK研究以評估T1/2、Tmax及 106 200950803 AUC。若AUC (SQ)不在AUC (iv)之9〇0/〇範圍内，則在下一次輪注時將rHuPH20劑量增加4倍且重複ρκ評定。 11名患者中有10名患者在單個SQ部位以120毫升/ 小時至300毫升/小時之速率達成25.5公克至61 2公克ggL ( 255 ml至612 ml)之每月劑量。第u名患者在i週輸注引發局部不適後退出。對於第一名患者（39〇〇1 )而言，藉由重力進行初始輸注。然而，儘管rHuPH2〇劑量自15〇 u/g GGL增加至300 u/g GGL，但速率為不可接受的。因此，所有後繼輸注皆使用IV蠕動泵來進行。剩餘9名患者在不需要重複劑量或增加rHuPH20濃度之情況下達成GGL每月劑量。因此，嘗試降低rHuPH2〇劑量之所有9 本研究且能夠耐受使用5GU/gGGL之輸注。為敎:心 GGL是否為可投予之最少rHuPH2Q，對兩 Ο 邮之劑量而未成功：一者具有不適且另一者之可耐受性 g 降低且需要在兩個部位投藥。因此，允許咖之每月劑量投藥（SQ )的rHuPH2〇之最小量為5〇 u/g ggl。結果概述於下表3中。結果展示除前兩名患者以外所有患者以至多 300 ml/hr之迷率經輸注！ 64 h( 27〇加）至3 55 ^(奶⑹）之輸注時間。主要藉由所用之杲類型來限制投藥速率栗常常在快速輸注速率下發出警報…者減慢輸注且歸因於輕度輸注部位疼痛而中斷輸注。兩者輸注恢復且完成0 107 200950803 表3 ··成功完成每月SC輸注之_患者之輪注來激個體 (N=10) 每月劑量輸注數所輸注IgG 劑量（g ) (平均值）所輸注IgG II積（mL) (平均值）最终 rHuPH20 濃度（U/g) 最大輸注速率 (mL/hr) 輸注時間 (hr )(平均值） 390001 1 25.5 255 305.9 175 2.13 390003 1 30.1 301 46.9 200 2.38 400001 1 44.5 445 49.8 300 3.05 340001 3 30.3 303 52.5 300 3.02 340002 4 39.9 399 50.0 1 300 3.20 390004 4 29.3 293 50.8 300 1.92 390005 3 27.2 272 50.6 300 1.64 390006 3 61.4 614 50.0 300 2.75 400002 3 53.7 537 51.5 300 3.55 400003 3 42.1 421 一 48.8 300 2.29 可耐受性評定對個體評定其對SQ輸注之可耐受性。大部分輸注僅與輕度輸注相關反應有關（表4)〇最常見之輕度反應為輸注部位紅斑、疼痛、腫脹、發熱及搔癢。中度輸注部位反應包括三個疼痛病例及各一播疼、腫脹及發熱病例。未報導重度反應。在10次輸注中在輪注rIluPH2〇期間，存在短暫高熱之不適’ 1名患者5次輸注出現該等不適。表4 :在對應於命I量類別之時段内的不良夸件

MeDRA系統器官分類耳部及迷路病症眼部病症胃腸病症一般病症及投藥部位病狀免疫系統病症感染及侵染肌肉骨胳及結締組織病症神經系統病症呼吸道、胸部及縱隔病症皮膚及皮下組織病症合計 26 2 0 30 sc%mt

SC全劑量 \_ 3 一 2 29 44 2互互 Ί

108 200950803 認為可能或也許與輸注有關之全身性不良事件列 5中。三者為中疳的衣 ’、’、一者為重度的。僅輕度胸痛事件與令斷輸;主有關，但仍完成輪注a對後繼輸注良好耐受。表6 描述完成皮下輸注而未因不良反應中斷之比例。 1名患者出現一種重度不良事件（過敏性反應），其盥研究治療無關。該患者具有對抗生素之既往過敏反應病史，其在輸注GGL/rHuPH20後第二天接受抗生素，且隨後出現過敏性反應。此患者完全恢復且能夠成功完成研究。在此PID患者試驗期間’不存在所記錄之細菌感染。存在9個所報導之病毒感染病例，皆不認為與研究治療有關：2個病毒性胃腸炎病例、1個疱疹性角膜炎病例、2個鼻竇炎病例、1個結膜炎病例及3個類流行性感冒疾病病例 (出現於1名患者）。

表5:全身性非重度相關不良事# -- 不良事件（MEDRA術語）輕度中度重度合計眼乾 __ ........ 1 0 ~0 ~ 1 盜汗 1 0 0 1 肌肉骨胳不適 0 1 1 頭痛 1 2 "〇 ~~ 3 嗜睡 - 1 0 0 1 胸痛 1 0 0 _ 1 周邊性水腫 1 0 ~0 1 疼痛 1 卜0 0 1 背痛 ---- 2 r〇「0 2 合計相關不良事件 9 3 1 ~~ 12 109 200950803 表6:完成SC輸注而未因不良事件中斷之比例患者未中斷百分比（％) 中斷停止百分比（％) 總輸注 390001 4 80 1* 0 20 5 390002 2 100 0 0 0 2 390003 4 100 0 0 0 4 400001 4 100 0 0 0 4 340001 6 100 0 0 0 6 340002 6 86 1τ 0 14 7 390004 7 100 0 0 0 7 390005 7 100. 0 0 0 7 390006 6 100. 0 0 0 6 400002 6 100. 0 0 0 6 400003 7 100. 0 0 0 7 合計 59 無 2 0 無 61

*由於輕度輸注部位疼痛而中斷 t由於輕度短暫性胸痛而中斷 2. 藥物動力學評定

對血清IgG含量進行藥物動力學（PK)分析。參與此研究之PK評定階段之7名患者在單個部位使用每公克GGL 50 U rHuPH20達成27公克GGL至61公克GGL之每月劑量（參見表3 )。在接受GGL之第二每月劑量輸注後進行 PK研究。收集輸注前、輸注後第1小時及輸注後第1、2、 3、4、5、7、14、21及28天（若以28天時程）之血清樣品。7名患者之藥物動力學參數描述於表7中。7名患者之 AUC ( SQ)與AUC (IV)之比率展示於表8中。結果展示 7名患者中之5名患者具有處於AUC ( IV)之90%範圍内的AUC ( SQ)。使比率小於90%之2名個體之rHuPH20劑量增加4倍並未進一步改良生物可用率。 110 200950803 表7 :個別個體之藥物動力學參數患者 AUC (天*公克/公升） Τ·Α (天） Tmax (天) Cmin (公克/公升） 34001 461.2 61.3 3.0 12.9 Q/mno 氺 387.1 114.1 4.9 11.3 356.7 43.9 4.0 11.3 256.9 113.8 5.0 7.9 jyKJOH' 264.2 44.3 6.9 7.7 39005 369.6 59.3 3.1 10.9 39006 368.9 40.3 4.8 10.8 40002 375.2 33.7 6.8 10.6 40003 356.2 37.9 4.9 9.7 中值 368.9 43.93 4.8 10.8

*以增加之rHuPH20劑量投藥後重複PK評定之患者表 8 : AUC(sq)與 AUC(iv)之比率（％ ) rHuPH20 濃度患者 50U/g 200 U/g 34001 101.0 無 34002 86.5 79.6 39004 75.8 77.8 39005 102.7 無 39006 94.7 無 40002 97.3 無 40003 90.5 無平均值 92.6 無 3. 結果概述在此研究中，在輸注GGL之前藉由注射使用rHuPH20 使得在單個皮下部位以至多每小時300 ml之輸注速率輸注多達600 ml GGL成為可能。主要藉由所用之IV泵來限制速率，該等IV泵經設計以當IV滲透及壓力增加時發出警報且關閉。儘管泵直至速率接近300 ml/h時才出現關閉，但重新啟動泵之需要增加輸注時間。由於對於皮下投藥而 111 200950803 言，不存在對壓力警報之需要，因此藉由更換成能夠在不發出警報之情況下產生更高壓力之泵來消除關閉問題。

儘管大部分輸注與一些腫脹、發紅或偶而疼痛或發癢有關，但除少數以外皆為輕度的。6個中有兩個在輸注中出現中度反應，其中降低rHuPH20以試圖找到最小有效劑量；11名個體中有10名個體耐受50 U/g GGL之rHuPH20 劑量。先前未經受皮下輸注之一名個體在下腹部部位出現第——週劑量引起之不適後退出。儘管出現輕度反應，但所有其他輸注皆完成，其中97%之輸注在無中斷之情況下完成。大部分反應用冷卻包處理且僅少數反應需要乙醯胺苯酚或苯海拉明。

在與rHuPH20組合皮下投予後，平均GGL生物可用率為IV投藥後GGL生物可用率之92%。此研究暗示由戶斤& # t才廣臂欠i曾力口改良GGL· t 口及& 〇 jt匕夕卜，D匕研究中由每月皮下給予GGL所達成之最低含量與由IV投藥所達成之最低含量相同。因此，相對於IV給藥，不需要增加皮下給予GGL之投藥頻率；皮下投予與rHuPH20組合之GGL僅需要單個SQ部位且可以至多300 ml/h之輸注速率達成。總之，rHuPH20有助於在成人免疫缺乏個體之群體中以至多300 ml/h之速率在單個部位投予完全每月GGL劑量。基於IgG濃度隨時間變化曲線之AUC，該組合之生物可用率為IV生物可用率之92%。此結果暗示rHuPH20改良皮下投予之GGL之吸收。大部分局部副作用為輕度的且不 112 200950803 導致輸注減慢或中斷。實施例2 可溶性rHuPH20表現細胞系之產生

使用HZ24質體（SEQ ID NO:52中所闡明）轉染中國倉鼠卵巢（CHO細胞）（參見例如申請案第10,795,095號、第11/065,716號及第1 1/238,171號）。用於表現可溶性 rHuPH20之HZ24質體載體含有pCI載體骨架（Promega)、編碼人類PH20玻尿酸酶（SEQ ID NO:49)之1-482位胺基酸之DNA、來自ECMV病毒（Clontech )之内部核糖體進入位點（IRES )及小鼠二氫葉酸還原酶（DHFR)基因。pCI 載體骨架亦包括編碼）3-内醯胺酶耐藥基因（AmpR )之 DNA、f 1複製起點、細胞巨大病毒即刻早期增強子/啟動子區（CMV )、嵌合内含子及SV40晚期聚腺苷酸化信號 (SV40 )。編碼可溶性rHuPH20構築體之DNA含有在編碼人類PH20之天然35個胺基酸信號序列之1位胺基酸位置上的甲硫胺酸的DNA之前的Nhel位點及Kozak —致序列，及在編碼對應於人類PH20玻尿酸酶（SEQ ID ΝΟ:1中所闡明）之482位胺基酸位置之酪胺酸的DNA之後的終止密碼子，繼之以 BamHI 限制性位點。構築體 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa ( HZ24)因此在 CMV 啟動子驅動下產生單一 mRNA物質，其編碼由内部核糖體進入位點（IRES )所分離之人類PH20 ( SEQ ID NO:3中所闡明）之1-482位胺基酸及小鼠二氫葉酸還原酶（SEQ ID NO:53 中所闡明）之1 -1 8 6位胺基酸。 113 200950803 未轉染之DG44 CHO細胞在補充有4 mM麩胺醯胺及 18 ml/L Plurionic F68/L(Gibco)之用於 DHFR(-)細胞之 GIBC0改良CD-CHO培養基中生長，且以〇.5xi 〇6個細胞/ 毫升接種於震盪燒瓶中以為轉染作準備。在加濕培育箱中使細胞在37°C下於5% C〇2中生長，同時以120 rpm震盪。在轉染前測試指數生長之未轉染DG44 CHO細胞之活力。使未轉染之DG44 CHO細胞培養物之6千萬個活細胞粒化且以0.7 mL之2χ轉染緩衝液（2xHeBS : 40 mM Hepes (pH=7.0)、274 mM NaCM、10 mM KCn、1.4 mM Na2HP04、 12 mM右旋糖）中2χ 107個細胞之密度再懸浮。向再懸浮細胞之每一等分試樣中添加〇·〇9 mL ( 250 pg )線狀HZ24質體（藉由使用Cla I ( New England Biolabs)消化隔夜而經直線化）’且在室溫下將細胞/DNA溶液轉移至0.4 cm間隙之BTX ( Gentronics )電穿孔管中。在未將質體DNA與細胞混合之情況下進行陰性對照電穿孔。在33〇 V及960 pF 或350 V及960 pF之電容器放電下對細胞/質體混合物進行電穿孔。電穿孔後自電穿孔管移除細胞且轉移至5 mL補充有4 ιηΜ 麩胺醯胺及 18 ml/L Plurionic F68/L ( Gibco )之用於 DHFR(-)細胞之改良CD_CH0培養基中且在加濕培育箱中使其在未經選擇之情況下在6孔組織培養板之孔中於37°c 下5% C02中生長2天。電穿孔後第2天，自各孔移除〇.5 mL組織培養基且使用實施例3中所述之微濁度檢定來測試玻尿酸酶活性之存 114 200950803 在。表9 :經HZ24轉染之DG44 CHO細胞在轉染後第40小時之初始玻尿酸酶活性稀釋度活性單位/毫升轉染1 330V 1:10 0.25 轉染2 350V 1:10 0.52 陰性對照 1:10 0.015 自組織培養孔收集來自轉染2 ( 350 V)之細胞，計數且稀釋至每毫升1 X 1 04至2χ 104個活細胞。將細胞懸浮液之 0.1 mL等分試樣轉移至5個96孔圓底組織培養板之各孔中。向容納細胞之孔中添加 100 微升含有 4 mM GlutaMAXTM-l 補充劑（GIBCO™，Invitrogen 公司）且不含次黃嘌呤及胸苷補充劑之CD-CHO培養基（GIBCO )(最終體積為0.2 mL)。自在無曱胺喋呤之情況下生長之5塊板識別出1 0個純系。表10.所識別之純系的玻尿酸酶活性

板/孔ID 相對玻尿酸酶 1C3 261 2C2 261 3D3 261 3E5 243 3C6 174 2G8 103 1B9 304 2D9 273 4D10 302 使6個HZ24純系在培養物中繁殖且以單細胞懸浮液形 115 200950803 式轉移至震盪燒瓶中。使用二維無限稀释策略將純系3D3、 3E5、2G8、2D9、1E11及4D10鋪於96孔圓底組織培養板中，在該策略中自上部左手邊孔中之5〇〇〇個細胞開始沿板向下以1:2稀釋細胞且沿板橫向以〗：3稀釋細胞。所稀釋之純系在每孔500個未轉染之DG44 CH〇細胞之背景中生長以提供培養初始數日所需之生長因子。每個次純系使用1〇塊板，5塊板含有50 nM甲胺喋呤且5塊板不含甲胺喋呤。純系3D3產生24個可見次純系（13個次純系來自未經甲胺喋呤處理之板且11個次純系來自經5〇 nM甲胺喋呤處 2 理之板）。在來自24個次純系中之8者之上清液中量測到顯著玻尿酸酶活性（>5〇單位/毫升），且使此8個次純系繁殖至T-25組織培養燒瓶中。在5〇 nM甲胺喋呤存在下，使自曱胺喋呤處理方案分離之純系繁殖。在震盪燒瓶中，使純系3D35M在500 nM曱胺喋呤中進一步繁殖，得到產生超過1，000單位/毫升之純系（純系3D35M;或Geni

3D35M)。接著製備3D35M細胞之母細胞庫（_如㈤ bank，MCB )。 Q 實施例3 測定可溶性rHuPH20之玻尿酸酶活性使用濁度檢定來測定諸如細胞培養物、純化部分及純化溶液之樣品中之可溶性rHuPH2〇的玻尿酸酶活性，該濁度檢定係基於當玻尿酸與血清白蛋白結合時形成不溶性沈澱。藉由將可溶性rHuPH20與玻尿酸鈉（玻尿酸）培育固定時段（10分鐘）且接著添加酸化之血清白蛋白使未消化 116 200950803 之玻尿酸納沈澱來量測活性。3 0分鐘發生時段後，在640 nm 下量測所得樣品之濁度。由酶對玻尿酸鈉受質之活性所引起之濁度降低為可溶性rHuPH20玻尿酸酶活性之量度。使用由稀釋可溶性rHuPH20檢定工作參照標準所產生之校正曲線來進行該方法，且相對於此校正曲線進行樣品活性量測。

在酶稀釋劑溶液中製備樣品之稀釋液。酶稀釋劑溶液係藉由將33.0 mg±0.05 mg水解明膠溶解於25.0 mL之50 mM PIPES 反應緩衝液（140 mM NaCn、50 mM PIPES， pH=5.5 )及 25·0 mL SWFI 中且將 0.2 mL 之 25% Buminate 溶液稀釋至混合物中且渦旋30秒來製備。在使用2小時内進行此製備且冰上儲存直至需要。將樣品稀釋至估計1 -2 U/mL。一般而言，每步驟最大稀釋度不超過1:100且用於第一稀釋之初始樣品體積不小於20 gL。進行該檢定所需之最小樣品體積為：處理中樣品、FPLC溶離份：80 )iiL ;組織培養上清液：1 mL ;濃縮物質：80 /iL ;純化或最終步驟物質：80 /iL。將稀釋液在低蛋白結合96孔板中製成三份，且將30 /XL每一稀釋液轉移至Optilux黑色/透明底板（BD BioSciences)中。在酶稀釋劑溶液中製備濃度為2.5 U/mL之已知可溶性 rHuPH20之稀釋液以產生標準曲線且分三份添力口至Optilux 板中。稀釋液包括 0 U/mL、0.25 U/mL、0.5 U/mL、1.0 U/mL、 1.5 U/mL、2.0 U/mL 及 2.5 U/mL。在板中包括容納 60 jttL 酶稀釋劑溶液之「試劑空白」孔作為陰性對照。接著蓋上 117 200950803 板且在37°C下在加熱塊（heat block)上加熱5分鐘。移除蓋子且將板震盪10秒。震盪後，將板放回至加熱塊上且用

溫熱之0.25 mg/mL玻尿酸納溶液（藉由將100 mg玻尿酸鈉（LifeCore Biomedical)溶解於 20.0 mL SWFI 來製備）填充MULTIDROP 384液體操作裝置。藉由在2°C-8°C下輕輕旋轉及/或搖動2-4小時或直至完全溶解來使其混合。將反應板轉移至MULTIDROP 384且藉由按下開始鍵開始反應以將30 pL玻尿酸鈉分配至各孔。接著自 MULTIDROP 3 84移除該板且震盪10秒，之後在放回板蓋之情況下轉移至加熱塊上。在37°C下將該板培育1〇分鐘。

藉由用血清工作溶液預充MULTIDROP 384且將體積設置變化至240 jitL來使該機器準備停止反應（於75 mL之 500 mM乙酸鹽缓衝溶液中之25 mL血清儲備溶液[用9體積5 00 mM乙酸鹽緩衝溶液稀釋1體積馬血清（Sigma)且用鹽酸將pH調節至3.1])。自加熱塊移除板且置放於 MULTIDROP 384上且將240 μί血清工作溶液分配至孔中。移除該板且在板讀取器上震盪10秒。另外1 5分鐘後，在640 nm處量測樣品濁度且藉由擬合於標準曲線來測定各樣品之玻尿酸酶活性（以U/mL計）。藉由用玻尿酸酶活性（U/ml )除以蛋白質濃度（mg/mL ) 來計算比活性（單位/毫克）。實施例4

Genl人類SPH20之製備及純化 A. 5 L生物反應器製程 118 200950803 使一瓶3D35M融化且自震盪燒瓶經由1 L旋轉式燒航在補充有 100 nM 曱胺喋呤及 GlutaMAXTNM ( Invitr〇gen) 之 CD-CHO 培養基（Invitrogen，Carlsbad Calif.)中繁殖。以每毫升4x 105個活細胞之接種密度將細胞自旋轉式燒瓶轉移至5 L生物反應器（Braun)。參數為37 °C之溫度設定點、7.2之pH (開始設定點）、25%之溶氧設定點及〇 cc/min-100 cc/min之空氣覆蓋。第168小時，添加250 ml 1

號補料培養基（具有50 g/L葡萄糖之CD CHO)。第216小時，添加250 ml 2號補料培養基（具有50 g/L葡萄糖及10 mM 丁酸鈉之CD CHO) ’且第264小時，添加250 ml 2號補料培養基。此製程以6x 106個細胞/毫升之最大細胞密度產生每毫升1600單位之最終生產率。在最終製備階段，添加丁酸鈉顯著增強可溶性rHuPH20之產生。藉由深層過濾及向10 mM Hepes (pH為7.0)中之切向流透濾作用以使來自3D35M純系之條件培養基淨化。可溶性rHuPH20接著藉由Q瓊脂糖（Pharmacia )離子交換、苯基瓊脂糖（Pharmacia )疏水性相互作用層析、苯基酉朋酸醋（Prometics )及羥基磷灰石層析（Biorad，Richmond，CA) 之連續層析來純化。可溶性rHuPH20與Q瓊脂糖結合且以於相同緩衝液中之400 mM NaCl溶離。用2 Μ硫酸銨將溶離液稀釋至5〇〇 mM硫酸銨之最終濃度且通過苯基瓊脂糖（1〇w sub)管柱，繼而在相同條件下與苯基酉朋酸酯樹脂結合。在無硫酸錢之情況下，在pH9.0下於50 mM N-二甘胺酸（bicine )中洗 119 200950803 蘇後，在Hepes ( pH=6.9 )中自苯基瓊脂糖溶離可溶性 rHuPH20。將溶離液負載於5 mM填酸卸及1 mM CaCl2中之陶瓷羥基磷灰石樹脂（ρΗ=6·9)上且用具有0.1 mM CaCl2 之80 mM磷酸鉀（pH=7_4)溶離。

使用USP參照標準經由微濁度檢定（實施例16 )，所得經純化之可溶性rHuPH20具有超過每毫克蛋白質65,000 USP單位之比活性。經純化之sPH20自Pharmacia 5RPC苯乙烯二乙烯苯管柱自第24分鐘至第26分鐘在單個峰下溶離，梯度處於 0.1% TFA/H20 與 0.1% TFA/90% 乙腈/10% H20 之間且藉由 SDS電泳解析為單個寬61 kDa條帶，用 PNGASE-F處理後，其縮減為清晰5 1 kDa條帶。N末端胺基酸定序揭示已有效移除前導肽。 B. 上游細胞培養物至100 L生物反應器細胞培養物中之繁瘦（expansion)製程

使用按比例放大製程來自4瓶不同3D35M細胞分別純化可溶性rHuPH20以產生4個分開批次之sHuPH20 : HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C 及 HUA0420C 〇經由 125 L生物反應器使各瓶細胞分別繁殖且培養，接著使用管柱層析純化。在整個製程期間獲得樣品以評定如酶產率之該等參數。下文所提供之製程描述闡明如生物反應器開始及補料培養基體積、轉移細胞密度及洗滌及溶離體積之該等情況之代表性說明。各批次之確切數字略有不同，且詳細描述於表11至18中。在37°C水浴槽中將4瓶3D35M細胞融化，添加含有100 120 ( 200950803

nM甲胺喋呤及40 mL/L GlutaMAX之CD CHO且將細胞離心。在125 mL震盪燒瓶中用20 mL新鮮培養基使細胞再懸浮且置放於37°C 7% C〇2培育箱中。在i25 mL震盪燒瓶中使細胞繁殖至40 mL。當細胞密度達到ι.5·2 5xl〇6個細胞/ 毫升時’使培養物以100 mL培養體積繁殖至125 mL旋轉式燒瓶中。將燒瓶在37°C、7%C〇2下培育。當細胞密度達到1.5-2.5 χΙΟ6個細胞/毫升時，使培養物以2〇〇 mL培養體積繁殖至250 mL旋轉式燒瓶中，且將燒瓶在37<t、7% c〇2 下培育。當細胞禮·度達到1.5 - 2.5 X 1 〇 6個細胞/毫升時，使培養物以800 mL·培養體積繁殖至il旋轉式燒瓶中，且培育於37°C、7%C〇2下。當細胞密度達到i.5_2.5xl〇6個細胞/ 毫升時，使培養物以5 L培養體積繁殖至6 L旋轉式燒瓶中’且培育於37°C、7%C〇2下。當細胞密度達到1 ·5_2.5χ 1〇6 個細胞/毫升時’使培養物以20 L培養體積繁殖至36 L旋轉式燒瓶中，且培育於3 7。(：、7%C02下。在121°C、20 PSI下用蒸汽對125 L反應器進行滅菌且添加65 L CD CHO培養基。使用前，針對污染檢查反應器。當36 L旋轉式燒瓶中之細胞密度達到ι_8_25χ1〇6個細胞/ 毫升時，將細胞培養物自36 L旋轉式燒瓶轉移至125 L生物反應器（Braun)中，得到85 L之最終體積及約4xl05個細胞/毫升之接種密度。參數為溫度設定點：37°c ; pH : 7.2 ; 溶氧：25%±10〇/〇 ;轉子速度：5〇 rpin ;容器壓力：3 psi ; 空氣噴射：1 L/min.;空氣覆蓋：1 L/min。每曰對反應器採樣以用於細胞計數、pH核對、培養基分析、蛋白質製備及 121 200950803 留存。在進行期間添加營養補料。第6天，添加3 4 L i號補料培養基（CD CHO + 50 g/L葡萄糖+4〇 mL/L GlutaMAXTM-丨），且將培養溫度變為36.5t：。第9天，添加 3.5 L 2 號補料（CD CHO + 50 g/L 葡萄糖 +4〇 mL/L GlutaMAXTM_1 + M g/L 丁酸鈉）且將培養溫度變為36艺。第11天，添加3.7 L 3號補料（CD CHO+50 g/L葡萄糖+ 40

mL/L GlutaMAXTM-i + Μ g/L 丁酸鈉）且將培養溫度變為 35.5C。第14天或當細胞活力降低於50%時’收集反應5|。該製程以8百萬個細胞/毫升之最大細胞密度產生酶活性為 1600單位/毫升之可溶性rHuPH20。收集時，對培養物採樣以檢驗試管内及活體内支原體、生物負荷、内毒素及病毒、病毒粒子之透射電子顯微（TEM )及酶活性。

將100公升生物反應器細胞培養收集物經由一系列具有聚醚砜介質之膠囊式過濾器（Sartorius )過濾：首先經由 8.0 μηι深度之膠囊、0·65 μιη深度之膠囊、0.22 μηι膠囊且最終經由0.22 μιη Sartopore 2000 cm2過遽器過渡，且進入 1〇〇 L無菌儲存袋中。使用具有螺旋聚醚砜3〇 kDa MWCO 過濾器（Millipore )之兩個TFF將培養物濃縮成1 〇x，繼而與 10 mM HEPES、25 mM Na2S04 ( ρΗ=7·0)進行 6x緩衝液交換’經0.22 μιη最終過滤器過遽至20 L無菌儲存袋中。表11提供與細胞培養、收集 '濃縮及緩衝液交換步驟有關之監測資料。 122 200950803 表ιι·細胞培養、收集、濃縮及緩衝液交換步驟之監測資料參數 HUA0406C HUA04010C HUA0415C HUA0420C 自融化至接種於100 L生物反應器中之時間（天） 21 19 17 18 100 L接種密度（χΙΟ6個細胞/毫升） 0.45 0.33 0.44 0.46 指數生長之倍增時間（hr) 29.8 27.3 29.2 23.5 最大細胞密度（χίο6個細胞/毫升） 5.65 8.70 6.07 9.70 收集物活力（％) 41 48 41 41 收集物力價（U/ml) 1964 1670 991 1319 於100 L生物反應器中之時間 (天） 13 13 12 13 經淨化之收集物體積（mL) 81800 93300 91800 89100 經淨化之收集物酶檢定（U/mL) 2385 1768 1039 1425 濃縮物酶檢定（U/mL) 22954 17091 8561 17785 經缓衝液交換之濃縮物酶檢定 (U/mL) 15829 11649 9915 8679 經過濾之經緩衝液交換之濃縮物酶檢定（U/mL) 21550 10882 9471 8527 經緩衝液交換之濃縮物體積 (mL) 10699 13578 12727 20500 酶單位濃度/收集物之比率 0.87 0.96 1.32 1.4

製備Q瓊脂糖（Pharmacia )離子交換管柱（3 L樹脂，高度=20 cm，直徑=14 cm)。收集沖洗樣品以測定pH、傳導性及内毒素（LAL)檢定。管柱係用5倍管柱體積之10 mM Tris、20 mM Na2S〇4 (pH=7.5)來平衡。以 100 cm/hr 之流速將經濃縮之經透濾之收集物負載於Q管柱上。用5倍管柱體積之 10 mM Tris、20 mM Na2S04 ( ρΗ=7·5)及 10 mM Hepes、50 mM NaCl ( ρΗ=7·0 )來洗條管柱。用 10 mM Hepes、400 mM NaCl( pH=7.0 )來溶離蛋白質且經由 0.22 μηι 123 200950803 最終過濾器過濾至無菌袋中。 - 接著進行苯基瓊脂糖（Pharmacia )疏水性相互作用層析。製備苯基瓊脂糖（PS)管柱（9.1 L樹脂，高度=29 cm，直徑=20 cm)。用5倍管柱體積之5 mM磷酸鉀、0.5 M硫酸銨、0.1 mM CaCl2 ( ρΗ=7·0)來平衡管柱。向來自上文之蛋白質溶離液中補充2Μ硫酸銨、1Μ磷酸鉀及iM CaCl2 儲備溶液直至分別得到5 mM硫酸銨、〇·5 Μ磷酸钟及〇丄 mM CaCl2之最終濃度。以1〇〇 cm/hr之流速將蛋白質負載於PS管柱上。以1〇〇 cm/hr添加5 mM磷酸鉀、〇.5 μ硫酸銨及0.1 mM CaCl2 ( ΡΗ=7·0)。經由0.22 μπι最終過據器通過而流入無菌袋中。將經P S純化之蛋白質負載於胺基笨基酉朋酸g旨管柱 (ProMedics) ( 6.3 L 樹脂，高度=20 cm，直徑=20 cm)上，

該管柱已用5倍管柱體積之5 mM磷酸鉀、〇.5 Μ硫酸錢來平衡。蛋白質以100 cm/hr之流速通過管柱，且用5 mM鱗酸鉀、0.5 Μ硫酸銨（PH=7_0)來洗滌管柱。接著用2〇 mM

N-二甘胺酸、1〇〇 mM NaCl( pH=9.0)來洗滌管柱且用50 mM Hepes、100 mM NaCl ( ρΗ=6·9)來溶離蛋白質，經由無菌過濾器且進入20 L無菌袋中。測試溶離液之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。用 5 mM 填酸舒、100 mM NaC卜 0.1 mM CaCl2( ρΗ=7.0 ) 來平衡羥基磷灰石（HAP)管柱（BioRad) ( 1.6 L樹脂，高度=10 cm ’直徑=14 cm )。收集沖洗樣品且測試pH、傳導性及内毒素（LAL檢定）。向經胺基苯基酉朋酸酯純化之蛋 124 200950803 白質中補充磷酸鉀及CaCl2以得到5 mM磷酸鉀及〇1 mM CaCU之最終濃度，且以1〇〇 cm/hr之流速負載於HAp管柱上。用 5 mM 構酸卸（PH=7.0)、1〇〇福 Na〇、〇」mM CaCl2,接著 10 mM 磷酸鉀（pH=7〇)、1〇〇 NaC1、〇1 mM CaCh來洗滌管柱。用70 mM磷酸鉀（pH=7 〇 )溶離蛋白質且經由0.22 μιη過濾器過濾至5 L無菌儲存袋中。測試溶離液之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。接著經由壓力槽抽汲經hap純化之蛋白質而經過20 nM病毒移除過濾器。將蛋白質添加至DV2〇壓力槽及過濾器（Pall公司）中’通過具有2〇 nni微孔之Ultipor DV20 過濾器（Pall公司）而進入無菌2〇 L儲存袋中。測試濾液之蛋白質濃度、酶活性、寡醣、單醣及唾液酸分布及製程相關雜質。接著使用1〇 kD分子量截斷（MWCO ) Sartocon Slice切向流過濾（TFF )系統（sartorius )將濾液中之蛋白質濃縮至1 mg/mL。首先藉由用Hepes/鹽水溶液（1〇 mM 0 Hepes ’ 130 mM NaC卜ρΗ=7·0)洗滌來使過濾器作準備且對滲透物採樣以檢測pH及傳導性。濃縮後，對經濃縮之蛋白質採樣且測試蛋白質濃度及酶活性。對經濃縮之蛋白質進行6χ緩衝液交換而使其處於最終緩衝液（1〇 Hepes、 130 mM NaC卜ρΗ7·0 )中。使經濃縮之蛋白質通過〇 22 μηι 過濾器而進入20 L無菌儲存袋中。對蛋白質採樣且測試蛋白質濃度、酶活性、自由硫氫基、寡醣分布及容積滲透濃度。表12至18提供每一 3D35M細胞批次之與上文所述之 125 200950803 純化步驟中之每一者有關之監測資料。表12.Q瓊脂糖管柱資料參數 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C 貞載體積（mL) 10647 13524 12852 20418 負載體積/樹脂體精比 3.1 4.9 4.5 7.3 管柱容穑（mL) 2770 3840 2850 2880 溶離液體精（mL) 6108 5923 5759 6284 溶離液之蛋白質▲度（mg/mL) 2.8 3.05 2.80 2.86 溶離液酶檢定（U/mL) 24493 26683 18321 21052 81產率（％) 65 107 87 76

表13.苯基瓊脂糖管柱資料參數 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C 添加儲備溶液之前的體精（mL) 5670 5015 5694 6251 負載艘穑（mL) 7599 6693 7631 8360 管柱容精（mL) 9106 9420 9340 9420 負載體積/樹脂體積比 0.8 0.71 0.82 0.89 溶離液體精（mL) 16144 18010 16960 17328 溶離液之蛋白質j農度（mg/mL ) 0.4 0.33 0.33 0.38 溶離液酶檢定（U/mL) 8806 6585 4472 7509 蛋白質產率（％) 41 40 36 37 酶產率（％) 102 88 82 96

表14.胺基苯基酉朋酸酯管柱資料奏數 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C 負載體精（mL) 16136 17958 16931 17884 負載體精/樹脂體精比 2.99 3.15 3.08 2.98 管柱容精（mL) 5400 5700 5500 5300 溶離液體精（mL) 17595 22084 20686 19145 溶離液之蛋白質濃度（mg/mL) 0.0 0.03 0.03 0.04 經過濾之溶離液之蛋白質濃度 (mg/mL) 未測試 0.03 0.00 0.04 溶離液酶檢定（U/mL) 4050 2410 1523 4721 蛋白質產率（％) 0 11 11 12 酶產率（％) 未測定 41 40 69 126 200950803 • 表15.羥基磷灰石管柱資料參數 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C 添加儲備溶液之前的體積（mL) 16345 20799 20640 19103 負載體積/樹脂體積比 10.95 13.58 14.19 12.81 管柱容積（mL) 1500 1540 1462 1500 負載體積（mL) 16429 20917 20746 19213 溶離液體積（mL) 4100 2415 1936 2419 溶離液之蛋白質濃度（mg/mL) 未測試 0.24 0.17 0.23 經過濾之溶離液之蛋白質濃度 (mg/mL) 無無 0.17 無溶離液酶檢定（U/mL) 14051 29089 20424 29826 蛋白質產率（％) 未測試 93 53 73 酶產率（％) 87 118 140 104

表16.DV20過濾資料參數 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C 開始體積（mL) 4077 2233 1917 2419 據液體積_ (mL) 4602 3334 2963 3504 遽液之蛋白質濃度（mg/mL ) 0.1 無 0.09 無經過濾之溶離液之蛋白質濃度 (mg/mL) 無 0.15 0.09 0.16 蛋^質產奉（％) 未測試 93 82 101 表17.最终濃度資料參數 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C 開始體積（mL) 4575 3298 2963 3492 濃縮物體積（mL) 562 407 237 316 濃縮物之蛋白質濃度（mg/mL) 0.9 1.24 1.16 1.73 蛋白質產率（％) 111 102 103 98 127 200950803 表18.緩衝液交換成最终調配物之資料參數 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C 開始體積（mL) 562 407 237 316 經緩衝液交換之濃縮物之最終體積（mL) 594 516 310 554 濃縮物之蛋白質漢度（mg/mL) 1.00 0.97 0.98 1.00 經過濾之濃縮物之蛋白質濃度 (mg/mL) 0.95 0.92 0.95 1.02 蛋白質產率（％) 118 99 110 101

將經純化及濃縮之可溶性rHuPH20蛋白質無菌填充至具有5 mL及1 mL填充體積之無菌瓶中。使蛋白質通過0.22 μιη過渡器而到達操作者控制之录，該泵使用重量讀出器而用於填充該等瓶。用塞子封閉該等小瓶且用捲拉蓋密封。視覺上檢查所封閉之小瓶之外來粒子且接著貼標籤。貼標籤後，藉由在液氮中浸泡不超過1分鐘而使小瓶急驟冷凍且在 S15°C (-20°C±5°C)下儲存。實施例5

含有可溶性人類PH20 ( rHuPH20 )之Gen2細胞的產生使實施例2中所述之Gen 1 3D35M細胞系適應於較高甲胺喋呤含量以產生2代（Gen2 )純系。將3D35M細胞自已形成之含甲胺嗓吟之培養物接種至含有 4 mM GlutaMAX-l™及1.0 μΜ甲胺喋呤之CD CHO培養基中。藉由使細胞在37°C、7% C02加濕培育箱中經46天之時段生長且續代9次而使細胞適應於較高曱胺嗓呤含量。在容納具有2.0 μΜ曱胺喋呤之培養基的96孔組織培養板中藉由限 128 200950803 制稀釋而選殖出擴增之細胞群體。約4週後，識別純系且選擇純系3E10B以供繁殖。使3E10B細胞在含有4 mM GlutaMAX-l™及2.0 μΜ曱胺喋呤之CD CHO培養基中生長 20代。形成3E1 0B細胞系之主細胞庫（MCB )且冷凍且用於後繼研究。藉由將3E10B細胞培養於含有4 mM GlutaMAX-l™及 4.0 μΜ甲胺喋呤之CD CHO培養基中而使細胞系繼續擴增。第12代後，將細胞在小瓶中冷凍以作為研究細胞庫

(RCB)。將一小瓶RCB融化且培養於含有8.0 μΜ甲胺喋呤之培養基中。5天後，培養基中之甲胺喋呤濃度增加至 16.0 μΜ，接著在18天後增加至20.0 μΜ。在容納含有4 mM GlutaMAX-l™及20.0 μΜ甲胺喋呤之CD CHO培養基之96 孔組織培養板中藉由限制稀釋而選殖出處於含有20.0 μΜ 甲胺喋呤之培養基中之第8代細胞。5-6週後識別純系且選擇純系2Β2以供在含有20.0 μΜ曱胺喋呤之培養基中繁殖。第11代後，將2Β2細胞在小瓶中冷凍以作為研究細胞庫（RCB)。所得2Β2細胞為二氫葉酸還原酶缺乏之（dhfr- ) DG44 CHO細胞，其表現可溶性重組人類PH20 ( rHuPH20 )。可溶性PH20係以約206個複本/細胞之複本數存在於2B2細胞中。使用rHuPH20特異性探針對Spe I-、Xba I-及BamH I/Hind III-消化之基因組2B2細胞DNA之南方墨點分析揭示下列限制性消化特徵：在用Spe I消化DNA之情況下，1 條約7.7 kb之較大雜交條帶及4條較小雜交條帶（約13.9 129 200950803 kb、約 6.6 kb、約 5.7 kb 及約 4.6 kb);在用 Xba I 消化 DNA ，之情況下，1條約5.0 kb之較大雜交條帶及2條較小雜交條帶（約13.9 kb及約6.5 kb);及使用由BamH I/Hind III消化之2B2 DNA，所觀察到之1條約1.4 kb之單一雜交條帶。 mRNA轉錄物之序列分析指示除丨丨3丨位置處之一個鹼基對差異以外所衍生之cDNA( SEQ ID ΝΟ··56)與參照序列（SEQ ID ΝΟ:49) —致’該鹼基對差異經觀察為胸苷（τ)代替預期之胞嘧啶（C )。此為沉默突變，而不影響胺基酸序列。實施例6 A. Gen2可溶性rHuPH20於300 L生物反應器細胞培養物中之產生

使一小瓶HZ24-2B2融化且自震盪燒瓶經由36 L旋轉式燒瓶於補充有20 μΜ曱胺喋呤及GlutaMAX-lTM (Invitrogen)之 CD-CHO 培養基（Invitrogen，Carlsbad，CA) 中繁殖。簡而言之，在3 7 °C水浴槽中使一小瓶細胞融化，添加培養基且將細胞離心。在125 mL震盪燒瓶中用2〇 mL 新鮮培養基使細胞再懸浮且置放於37°c、7%培育箱中。使細胞在125 mL震盪燒瓶中繁殖至40 mL。當細胞密度達到大於1·5χ1〇6個細胞/mL時，使培養物以1〇〇 mL培養體積繁殖至125 mL旋轉式燒瓶中。在m、7% c〇2下培育燒槪。當細胞密度達到大於UxiO6個細胞/毫升時，使培養物以200 mL培養體積繁殖至25〇 mL旋轉式燒瓶中，且在 37°C、7% C〇2下培育燒瓶。當細胞密度達到大於ΐ 5χΐ〇6 個細胞/毫升時，使培養物以8〇〇 mL培養體積繁殖至i l旋 130 200950803 轉式燒瓶中，且培育於3rc、7%叫下^當細胞密度到達大於1.5X106個細胞/毫升時，使培養物以5〇〇〇 mL培養體積繁殖至6L旋轉式燒瓶中且培育於37〇c、7% c〇2下。當細胞密度到達大於K5M06個細胞/毫升時，使培養物以32 L 培養體積繁殖至36L旋轉式燒瓶中且培育於37。〇、7% c〇2 下。

對400 L反應器進行滅菌且添加230 mL CD-CHO培養基。使用W ’針對污染檢查反應器。將約3〇 l細胞以每毫升4.〇Xl〇5個活細胞之接種密度及260 L之總體積自36 L 旋轉式燒瓶轉移至400 L生物反應器（Braun)中。參數為溫度設定點：37°C ;轉子速度：40 RPM-55 RPM ;容器壓力： 3 Psi ;空氣噴射：〇.5 L/Min._l 5 L/Min ;空氣覆蓋：3 L/min·。每日對反應器採樣以用於細胞計數、pH核對、培養基分析、蛋白質製備及留存。同樣，在進行期間，添加營養捕料。第120小時（第5天），添加1 〇.4 L 1號補料培養基（4xCD-CHO+33 g/L 葡萄糖 +160 mL/L Glutamax-lTM+83 mL/L 酵母自溶液（Yeast〇late) +33 mg/L 重組人類胰島素（rHuInsulin))。第168小時（第7天），添加 10.8 L 2 號補料（2xCD-CHO + 33 g/L 葡萄糖+80 mL/L Glutamax-l™十167 mL/L酵母自溶液+0.92 g/L 丁酸鈉）且將培養溫度變為36.5°C。第216小時（第9天），添加10.8 l 3 號補料（lxCD-CHO + 50 g/L 葡萄糖 +50 mL/L GIutamax-lTM+250 mL/L 酵母自溶液+1.80 g/L 丁酸納），且將培養溫度變為36°C。第264小時（第η天），添加1〇 8 [ 131 200950803 4號補料（lxCD_CHO+33 g/L葡萄糖+33机化 G1UtamaX-1TM+250 mL/L 酵母自溶液+0.92 g/L· 丁酸鈉），且將培養溫度變為35_5。〇在最終製備階段，觀察到添加補料培養基顯著增強可溶性rHuPH2〇之產生。第14天或^天或當細胞活力降低於40%時’收集反應器。該製程以以百萬個細胞/毫升之最大細胞密度得到每毫升17,〇〇〇單位之最終生產率。收集時，自培養物採樣以檢驗試管内及活體内支原體 '生物負荷、内毒素及病毒、透射電子顯微（) 及酶活性。藉由蠕動泵抽汲培養物而通過4個並聯之Millistak過濾系統模組（Millipore )(每一者含有一層屬於4从.8 卓級之妙藻土及一層屬於1.4 Am-1.1 μηι等級之石夕藻土，繼之以纖維素膜）接著通過含有一層屬於〇 4 μηι_〇.丨丨只以等級之矽藻土及一層屬於<〇· 1 μιη等級之矽藻土，繼之以纖維素膜之第二單個Millistak過濾系統（Millip0re )，且接著通過0.22 μιη最終過濾器而進入具有350 L容量之無菌一次性可撓性袋中。用lOmMEDTA及10mMTris補充所收集之細胞培養物直至pH為7.5。用使用4個Sartoslice TFF 3 0 kDa分子量截斷（MWC0 )聚醚颯（pES )過濾器（Sart〇ri〇us ) 之切向流過濾（TFF )設備將培養物濃縮成丨〇X，繼而與1 〇 mM Tris、20 mM Na2S04 (ρΗ=7·5)進行 l〇x緩衝液交換，經由0.22 μιη最終過濾器而進入50L無菌儲存袋中。使經濃縮、經透濾之收集物之病毒滅活。在病毒滅活之刖，製備10% Triton X-1 〇〇、3%三（正丁基）碟酸醋（ΤΝΒΡ ) 132 200950803 1 ( 之溶液。在經Q管柱純化前立即使經濃縮、經透濾之收集物在36 L玻璃反應容器中暴露於1% Triton X-100、0.3% TNBP，歷時1小時》 B. Gen2可溶性rHuPH20之純化

製備Q瓊脂糖（Pharmacia )離子交換管柱（9 L樹脂， H=29 cm，D=20 cm)。收集沖洗樣品以測定pH、傳導性及内毒素（LAL)檢定。管柱用5倍管柱體積之i〇mM Tris、 20 mM Na2S〇4( pH=7.5 )來平衡。病毒滅活後，以 1 〇〇 cm/hr 之流速將經濃縮透濾之收集物負載於q管柱上。用5倍管柱容積之 10 mM Tris、20 mM Na2S04 ( ρΗ=7·5 )及 10 mM Hepes、50 mM NaCl ( pH—7.0 )洗猶;管柱。用 i〇 mM Hepes、 400 mM NaCl ( pH=7.0 )溶離蛋白質，經由ο.〗〗μιη最終過濾器而進入無菌袋中。測試溶離液樣品之生物負荷、蛋白質濃度及玻尿酸酶活性。在交換開始及結束時獲得α28<)吸光度讀數。接著進行苯基瓊脂糖（Pharmacia )疏水性相互作用層 ◎ 析。製備苯基瓊脂糖（PS)管柱（19 L-21 L樹脂，H=29 cm， D=30 cm)。收集沖洗液且採樣以檢驗pH、傳導性及内毒素 (LAL檢定）。用5倍管柱體積之5 mM磷酸鉀、〇 5 M硫酸敍、0.1 mM CaCl2 (PH=7.〇)來平衡管柱。向來自q瓊脂糖管柱之蛋白質溶離液中補充2皿硫酸録、丨酸鉀及 1 M CaCh儲備溶液以分別得到5 mM硫酸銨、〇 5 M磷酸鉀及0.1 mM CaCh之最終濃度。以1〇〇 cm/hr之流速將蛋白質負載於ps管柱上且收集經過管柱之流。以1〇〇 cm/hr用 133 200950803 5 mM 鱗酸鉀 ' 〇·5 Μ 硫酸銨及 0.1 mM CaCl2 ( ρη=7·〇)洗務管柱且將洗滌液添加至所收集之經過流中。將經過流與管柱洗滌液組合，通過〇.22 μιη最終過濾器而進入無菌袋中。對經過流採樣以檢驗生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。

製備胺基笨基酉朋酸酯（Promtics )管柱。收集洗務液且採樣以檢驗pH、傳導性及内毒素（LAL檢定）。用5倍管柱體積之5 mM磷酸鉀、〇·5 Μ硫酸銨平衡管柱。將含有經純化之蛋白質之PS經過流以1 〇〇 cm/hr之流速負載於胺基苯基酉朋酸酯管柱上。用5 mM鱗酸鉀、〇·5 Μ硫酸敍 (ρΗ=7.0 )洗滌管柱。用20 mM Ν-二甘胺酸、〇·5 μ硫酸錢（ρΗ=9·0)洗條管柱。用20 mM Ν-二甘胺酸、1〇〇 mM 氣化納（pH=9.0)洗條管柱。用 50 mM Hepes、100 mM NaCl (pH=6.9 )溶離蛋白質且通過無菌過濾器而進入無菌袋中。測試所溶離樣品之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。

製備Ik基磷灰石（HAP )管柱（Biorad )。收集洗滌液且測試pH、傳導性及内毒素（LAL檢定）。用5 mM磷酸鉀、 100 mM NaC卜 0_1 mM CaCl2 ( ρΗ=7·0)平衡管柱。將經胺基苯基酉朋酸酯純化之蛋白質補充至5 mM磷酸鉀及〇. 1 mM CaCl2之最終濃度，且以100 cm/hr之流速負載於HAP 管柱上。用 5 mM 磷酸鉀（ρΗ=7·0)、1〇〇 mM NaCl、0.1 mM CaCl2洗滌管柱。其次用10 mM磷酸卸（ρΗ=7·0 )、loo mM NaCU、0.1 mM CaCl2 洗滌管柱。用 70 mM 磷酸鉀（pH=7.0) 溶離蛋白質且通過0.22 μιη無菌過濾器而進入無菌袋中。測試所溶離樣品之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。 134 200950803 接著使經HAP純化之蛋白質通過病毒移除過濾器。首先藉由用2L7GmM磷酸鉀（ρη=7·ο)洗務來使經滅菌之 viosari過遽器（Sart0rius)作準備。使用前，對經過濾之緩衝液採樣以檢驗PH及傳導性。經由螺動聚抽汲經純化之蛋白質而經過20nM病毒移除過遽器。使7〇_碟酸卸（PH=7.G)中之經過遽蛋白質通過0.22 _最終過遽器而進入無菌袋中。測試經病毒過滤之樣品之蛋白質濃度、酶活性、寡醣、單醣及唾液酸分布。亦測試樣品之製關雜質。接者使用10 kD分子量截斷（MWC〇) Sart〇c〇n siice 切向流過濾（TFF)系統（Sart〇rius )將濾液中之蛋白質濃縮至l〇mg/mL。首先藉由用1〇mM組胺酸、 (PH=6.G)洗務來使職器作準備且對渗透物採樣以檢測 P傳導ί·生；農縮後，對經農縮之蛋白質採樣且測試蛋白質濃度及酶活性。對經濃縮之蛋白f進行6χ缓衝液交換而 ^使其處於最終緩衝液·· 10 組胺酸、13〇 mM NaC1 (PH 6.G )巾。緩衝液交換後，使經濃縮之蛋白質通過0.22 μιη過；1' ϋ而進人2G L無菌健存袋中。對蛋白質採樣且測試蛋白貝濃纟冑#性、自由硫氫基、寡分布及容積滲透濃度。接著將無菌經過遽之主體蛋白質以20 無菌分配於 3〇 mL無菌鐵1龍小弃瓦（舰旦…）+。接著使小瓶急驟冷束且在-20°C±5t：下儲存。 C. Genl可溶性rHupH2〇與Gen2可溶性rHupH2❶ 135 200950803 之製備及純化比較與Gen 1可溶性rHuPH2〇於丨〇〇 L生物反應器細胞培養物中之製備及純化（實施例4.B中所述）相比，Gen2可溶性rHuPH20於300 L生物反應器細胞培養物中之製備及純化的方案含有一些變化。表19闡明該等方法之間的除簡單按比例放大變化以外之例示性差異。表19 製程差異 Genl 可溶性 rHuPH20 Gen2 可溶性 rHuPH20 細胞系用於擴增細胞接種體之培養基 3D35M 含有0·10 μΜ甲胺喋呤 (0.045 mg/L) 2B2 --- 含有20 μΜ甲胺喋呤（9 mg/L) 先刖6 L培養物中之培養基含有0.10 μΜ甲胺喋呤不含甲胺喋呤 36 L旋轉式燒瓶無儀器裝備 20 L操作體積裝備有監測及控制pH、溶氧、噴射及覆蓋氣體流速之儀器裝備。 32 L操作體精生物反應器中之最終操作體積 125 L生物反應器中之約 100 L (初始培養體積+65 L) 400 L生物反應器中之約300 L(初始培養體積+260 L) 最終生物反應器中之培養基無重組人類胰島素 5.0 mg/L重組人類胰島素培養基補料體積 &模為生物反應器細胞培養物體積之4%，亦即3.4 L、3.5 L及3.7 L，得到約 92 L之目標生物反應器體積。規模為生物反應盗細胞培養杨體積之 4%’ 亦即 10.4L、10.8L、11.2L 及 11.7 L ’得到約303 L之目標生物反應器體積。培養基補料 1號補料培養基：CD CHO+50 g/L 葡萄糖+8 mM GlutaMAX™-l 1號補料培養基：4xCD CHO+33 g/L葡萄糖+32 mM Glutamax+16.6 g/L 酵母自溶液+33 mg/L重組人類騰島素 2 號補料（CD CHO+50 g/L 葡萄糖 +8 mM GlutaMAX+1.1 g/L 丁酸納） 2號補料:2xCD CHO+33 g/L葡萄糖+16 mM Glutamax+33.4 g/L 酵母自溶液 +0.92 g/L 丁酸鈉 3 號補料：CD CHO+50 g/L 葡萄糖 +8 mM GlutaMAX+l_l g/L 丁酸納 3號補料:lxCD CHO+50 g/L葡萄糖+l〇 mM Glutamax+50 g/L 酵母自溶液+1.80 g/L 丁酸鈉 4號補料：lxCD CHO+33 g/L葡萄糖 136 200950803

+6·6 mM Glutamax+50 g/L 酵母自溶液 +0.92 g/L 丁酸鈉生物反應器細胞培養物之過濾串聯之4個聚醚颯過濾器 (8.0 μιη、0.65 μιη、0.22 μιη 及 0.22 μιη ) 100 L儲存袋第一階段-並聯之4個模組，每一者具有一層屬於4 μιη-8 μιη等級之矽藻土及一層屬於1.4 μπ>1.1 μιη等級之矽藻土，繼之以纖維素膜。第二階段-單個模組，其含有一層屬於〇.4 μιη-0.11 μιη等級之矽藻土及一層屬於<0.1 /mi等級之發藻土，繼之以纖維素膜。第三階段-0.22 μιη聚縫踢過濾器 300 L儲存袋用 10 mM EDTA、10 mM Tris 補充所收集之細胞培養物以使pH達到7.5。層析前濃縮及緩衝液交換用具有Millipore螺旋聚醚砜30K MWCO過濾器之2 個TFF濃縮用 10 mM Hepes、25 mM NaCl (ρΗ=7·0)與 6x濃縮物緩衝液交換 20 L無菌儲存袋使用 4 個 Sartorius Sartoslice TFF 30K MWCO過濾器濃縮用 10mMTris、20mMNa2S04(pH=7.5) 與l〇x濃縮物緩衝液交換 50 L無菌儲存袋層析前病毒滅活無藉由添加1 % Triton X-1〇〇、0.3%磷酸三丁酯（pH=7.5)來進行病毒滅活第一純化步驟 (Q瓊脂糖）無吸光度讀數在開始及結束時A280量測層析後病毒過滤 PallDV-20 過濾器（2〇nm) Sartorius Virosart 過濾器（20 rnn) 層析後濃縮及緩衝液交換 Hepes/鹽水緩衝液(pH=7〇 ) 蛋白質濃縮至1 mg/ml 組胺酸/鹽水緩衝液（ρΗ=6·0) 蛋白質漢縮至10 mg/ml 因為修改對於熟習此項技術者而言為顯而易見的，所以本發明意欲僅受隨附之申請專利範圍之範疇所限制。【圖式簡單說明】無 137 200950803 【主要元件符號說明】無

138 200950803 序列表 <110>巴克斯特保健公司巴克斯特國際公司哈羅赛公司理査史夫赫恩斯雷柏葛傑瑞.芙羅斯 <120>供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法 <130> 0119374-00114/3058IW <140>尙未指定 <141>同此 <150> US 61/069,841 <151> 2008-03-17 <160> 56

<170> 適用Wi.ndows 4.0版的FastSEQ

<210> 1 <211> 509 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>前驅人類PH20 <400〉 1

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys- Leu* Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu G3n Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Aig Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 第1頁 200950803 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Gys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 485 490 495

Ser lie Leu Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 2 <211> 474 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> 成熟PH20 <400> 2

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Atg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val ISe Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 第2頁 200950803 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430

Phe -Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val Ser lie Leu 450 455 460

Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala Ser Leu 465 470 <210> 3 <211> 482 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>前驅可溶性rHuPH20 <400> 3

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly Ile Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro' Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 2i〇 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Set Asp Tyi Leu His Leu 第3頁 200950803 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Phe Tyr <210> 4 <211> 447 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> 可溶性rHuPH20 1-447 <400> 4

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu G】n Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95 .

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 第4頁 200950803 (

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr 435 440 445 <210> 5 <211> 446 <212> PRT <213〉智慧人 <220〉 <223> 可溶性rHuPH20 1-446 <400> 5

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Tht Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 乙ys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe 435 440 445

<210> 6 <211> 445 <212> PRT 第5頁 200950803 <213>智慧人 <220> <223> 可溶性rHuPH20 1-445 <400> 6

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Vai 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 2i〇 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 435 440 445 <210〉 7 <211> 444 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> 可溶性rHuPH20 1-444 <400> 7

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 第6頁 200950803 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Fhe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin 435 440 <210> 8 <211> 443 <2\2> PRT <213>智慧人 <220> <223〉可溶性rHuPH20 1-443 <400> 8

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95 第7頁 200950803

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys He 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 435 440 <210> 9 <211> 442 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> 可溶性rHuPH20 1-442 <400〉 9

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 第8頁 200950803 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Giu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 2l〇 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie -245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 435 440

<210> 10 <211> 450 <212> PRT <2Ϊ3> 敵翻牛（Bos taurus) <220> <223>玻尿酸酶 <400> 10

Met Arg Pro Phe Ser Leu Glu Val Ser Leu His Leu Pro Trp Ala Met 15 10 15

Ala Ala His Leu Leu Pro Val Cys Thr Leu Phe Leu Asn Leu Leu Ser 20 25 30

Met Thr Gin Gly Ser Arg Asp Pro Val Val Pro Asn Gin Pro Phe Thr 35 40 45

Thr lie Trp Asn Ala Asn Thr Glu Trp Cys Met Lys Lys His Gly Val 50 55 60

Asp Val Asp lie Ser lie Phe Asp Val Val Thr Asn Pro Gly Gin Thr 65 70 75 80

Phe Arg Gly Pro Asn Met Thr lie Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly Thr 85 90 95

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Ser Ala Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro 100 105 110

Gin Asn Ala Ser Leu Asn Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gin Asp lie 115 120 125

Leu Ala Ala Met Pro Glu Pro Arg Phe Ser Gly Leu Ala Val lie Asp 130 135 140

Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys Asp 145 150 155 160 lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Lys Gin His Pro Asp 165 170 175

Trp Leu Ala Pro Arg Val Glu Ala Ala Ala Gin Asp Gin Phe Glu Gly 180 185 190

Ala Ala Glu Glu Trp Met Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly G3n Ala Leu 195 200 205

Arg Pro Gin Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Asn Phe Pro Glu Cys Tyr Asn 210 215 220

Tyr Asp Phe Lys Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Cys Pro Leu Asn lie 225 230 235 240 200950803

Cys Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg Ala 245 250 255

Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Glu Gly Thr Lys Lys 260 265 270

Thr Gin Met Phe Val Gin His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val Ala 275 280 285

Ala Gly Ala Gly Asp Pro Lys Leu Pro Val Leu Pro Tyr Met Gin Leu 290 295 300

Phe Tyr Asp Met Thr Asn His Phe Leu Pro Ala Glu Glu Leu Glu His 305 310 315 320 • Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp 325 330 335

Val Ser Trp Leu Ser Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie Lys 340 345 350

Glu Tyr Val Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ser lie Leu Asn Val Thr Ser 355 360 365

Gly Ala Arg Leu Cys Ser Gin Val Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys 370 375 380

Ala Arg Arg Pro Ser Tyr Pro Lys Ala Arg Leu lie Leu Asn Ser Thr 385 390 395 400

Ser Phe Ser lie Lys Pro Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Thr Leu Gin 405 410 415

Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Arg Leu Arg Met Ala Val Glu Phe Glu 420 425 430

Cys Arg Cys Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Thr Arg Cys Glu Gin Trp Gly 435 440 445

Met Trp 450 <210> 11 <211> 553 <212> PRT <213>歐洲牛 <220> <223> PH20 <400> 11

Met Arg Met Leu Arg Arg His His He Ser Phe Arg Ser Phe Ala Gly 15 10 15

Ser Ser Gly Thr Pro Gin Ala Val Phe Thr Phe Leu Leu Leu Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Ala Leu Asp Phe Arg Ala Pro Pro Leu lie Ser Asn Thr Ser 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Val Glu Arg Cys Val Asn Arg Arg 50 55 60

Phe Gin Leu Pro Pro Asp Leu Arg Leu Phe Ser Val Lys Gly Ser Pro 65 70 75 80

Gin Lys Ser Ala Thr Gly Gin Phe lie Thr Leu Phe Tyr Ala Asp Arg 85 90 95

Leu Gly Tyr Tyr Pro His lie Asp Glu Lys Thr Gly Lys Thr Val Phe 100 105 110

Gly Gly He Pro Gin Leu Gly Asn Leu Lys Ser His Met Glu Lys Ala 115 120 125

Lys Asn Asp lie Ala Tyr Tyr lie Pro Asn Asp Ser Val Gly Leu Ala 130 135 140

Val lie Asp Trp Glu Asn Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys 145 150 155 160

Pro Lys Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ser Val Glu Leu Val Leu Gin Lys 165 170 175

Asn Pro Gin Leu Ser Phe Pro Glu Ala Ser Lys lie Ala Lys Val Asp 180 185 190

Phe Glu Thr Ala Gly Lys Ser Phe Met Gin Glu Thr Leu Lys Leu Gly 195 200 205

Lys Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp 210 215 220

Cys Tyr Asn His Asn His Asn Gin Pro Thr Tyr Asn Gly Asn Cys Pro 225 230 235 240

Asp Val Glu Lys Arg Arg Asn Asp Asp Leu Glu Trp Leu Trp Lys Glu 245 250 255

Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asn lie Arg Leu Lys Ser 260 265 270

Thr Gin Asn Ala Ala Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gin Glu Ala lie 275 280 285

Arg Leu Ser Lys He Ala Ser Val Glu Ser Pro Leu Pro Val Phe Val 第10頁 200950803 290 295 300

Tyr Ala Arg Pro Val Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin 305 310 315 320

Gly Asp Leu Val Asn Ser Val Gly Glu lie Val Ser Leu Gly Ala Ser 325 330 335

Gly lie lie Met Trp Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Ser Met Gin Ser 340 345 350

Cys Met Asn Leu Gly Thr Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Asn Pro Tyr lie 355 360 365 lie Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys His 370 375 380

Asn Glu Gly Val Cys Thr Arg Lys His Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu 385 390 395 400

His Leu Asn Pro Met Asn Phe Ala lie Gin Thr Gly Glu Gly Gly Lys 405 410 415

Tyr Thr Val Pro Gly Thr Val Thr Leu Glu Asp Leu Gin Lys Phe Ser 420 425 430

Asp Thr Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ala Asn lie His Cys Lys Lys Arg 435 440 445

Val Asp lie Lys Asn Val His Ser Val Asn Val Cys Met Ala Glu Asp 450 455 460 lie Cys lie Asp Ser Pro Val Lys Leu Gin Pro Ser Asp His Ser Ser 465 470 475 480

Ser Gin Glu Ala Ser Thr Thr Thr Phe Ser Ser lie Ser Pro Ser Thr 485 490 495

Thr Thr Ala Thr Val Ser Pro Cys Thr Pro Glu Lys His Ser Pro Glu 500 505 510

Cys Leu Lys Val Arg Cys Ser Glu Val lie Pro Asn Val Thr Gin Lys 515 520 525

Ala Cys Gin Ser Val Lys Leu Lys Asn lie Ser Tyr Gin Ser Pro lie 530 535 540

Gin Asn lie Lys Asn Gin Thr Thr Tyr 545 550

<210> 12 <211> 331 <212> PRT <213> 黃胡蜂（Vespula vulgaris) <220> <223>玻尿酸酶A <400> 12

Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn lie Tyr Trp Asn Val Pro Thr 15 10 15

Phe Met Cys His Gin Tyr Asp Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30

Asn lie Lys Arg Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gin Gly Asp Lys lie Ala 35 40 45 lie Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Ser Leu Lys Asp 50 55 60

Gly Lys Tyr Lys Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Glu Gly Asn lie 65 70 75 80

Thr lie His Leu Gin Lys Phe lie Glu Asn Leu Asp Lys He Tyr Pro 85 90 95

Asn Arg Asn Phe Ser Gly lie Gly Val He Asp Phe Glu Arg Trp Arg loo 105 no

Pro lie Phe Arg Gin Asn Trp Gly Asn Met Lys lie His Lys Asn Phe 115 120 125

Ser He Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Thr Trp Asn Lys Lys Met 130 135 140 lie Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Phe Phe 145 150 155 160

Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gin Ala Asp 165 170 175

Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Pro Asn Asn 180 185 190

Leu Val Pro Glu Cys Asp Val Thr Ala Met His Glu Asn Asp Lys Met 195 200 205

Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr Val 210 215 220

Arg Gin Glu Leu Thr Pro Asp Gin Arg lie Gly Leu Val Gin Gly Arg 225 230 235 240

Val Lys Glu Ala Val Arg lie Ser Asn Asn Leu Lys His Ser Pro Lys 245 250 255 第11頁 200950803 -

Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Glu Thr Asn Thr Phe 260 265 270

Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gin Glu lie Val lie Asn 275 280 285

Gly Gly Asp Gly lie lie lie Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300

Leu Ser Lys Cys Lys Arg Leu Gin Asp Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320

Pro lie Ala He Asn Val Thr Glu Ala Val Asn 325 330 <210> 13 <211> 340 <212> PRT <213>黃胡蜂 <220> <223>玻尿酸酶B <400> 13

Asp Arg Thr lie Trp Pro Lys Lys Gly Phe Ser lie Tyr Trp Asn lie 15 10 15

Pro Thr His Phe Cys His Asn Fhe Gly Val Tyr Phe Lys Glu Leu Lys 20 25 30

Gin Phe Asn lie Lys Tyr Asn Ser Met Asn Asn Phe Arg Gly Glu Thr 35 40 45 lie Ser Leu Phe Tyr Asp Pro Gly Asn Phe Pro Ser Met Val Leu Leu 50 55 60

Lys Asn Gly Thr Tyr Glu lie Arg Asn Glu Gly Val Pro Gin Lys Gly 65 70 75 80

Asn Leu Thr lie His Leu Glu Gin Phe Thr Lys Glu Leu Asp Glu lie 85 90 95

Tyr Pro Lys Lys lie Ala Gly Gly lie Gly Val lie His Phe His Asn 100 105 110

Trp Arg Pro lie Phe Arg Arg Asn Val Asp Asn Leu Lys lie Asn Lys 115 120 125

Asp lie Ser lie Asp Leu Val Arg Lys Glu His Pro Lys Trp Asp Lys 130 135 140

Ser Met lie Glu Lys Glu Ala Ser Asn Arg- Phe Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 lie Phe Met Glu Lys Thr Leu Lys Leu Ala Lys Glu lie Arg Lys Lys 165 170 175

Thr Glu Trp Gly Tyr His Gly Tyr Pro His Cys Leu Ser Gly Ser Thr 180 185 190

Asp Lys Pro Ser Phe Asp Cys Asp Ala Leu Ser Met Ser Glu Asn Asp 195 200 205

Lys Met Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser lie 210 215 220

Tyr Leu Lys Asn Val Leu Lys Pro Asp Glu Lys lie His Leu Val Gin 225 230 235 240

Glu Arg Leu Lys Glu Ala lie Arg lie Ser Lys Asn Phe Lys His Leu 245 250 255

Pro Lys Val Leu Pro Tyr Trp Trp Tyr Thr Tyr Gin Asp Lys Glu Ser 260 265 270 lie Phe Leu Thr Glu Ala Asp Val Lys Asn Thr Phe Lys Glu lie Leu 275 280 285

Thr Asn Gly Ala Asp Gly lie lie lie Trp Gly Val Ser Tyr Glu Leu 290 295 300

Thr Asp Arg Lys Arg Cys Glu Lys Leu Lys Glu Tyr Leu Met Lys lie 305 310 315 320

Leu Gly Pro lie Ala Phe Lys Val Thr Lys Ala Val Lys Glu Asn Thr 325 330 335

Pro Leu Asn Phe 340

<210> 14 <211> 382 <212> PRT <213> 西方蜂（Apis mellifera) <220> <223>玻尿酸酶 <400> 14 第12頁 200950803

Met Ser Arg Pro Leu Val lie Thr Glu Gly Met Met lie Gly Val Leu 15 10 15

Leu Met Leu Ala Pro lie Asn Ala Leu Leu Leu Gly Phe Val Gin Ser 20 25 30

Thr Pro Asp Asn Asn Lys Thr Val Arg Glu Phe Asn Val Tyr Trp Asn 35 40 45

Val Pro Thr Phe Met Cys His Lys Tyr Gly Leu Arg Phe Glu Glu Val 50 55 60

Ser Glu Lys Tyr Gly lie Leu Gin Asn Trp Met Asp Lys Phe Arg Gly 65 70 75 80

Glu Glu lie Ala lie Leu Tyr Asp Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu S5 90 95

Lys Asp Pro Asn Gly Asn Val Val Ala Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin 100 105 110

Leu Gly Asn Leu Thr Lys His Leu Gin Val Phe Arg Asp His Leu lie 115 120 125

Asn Gin lie Pro Asp Lys Ser Phe Pro Gly Val Gly Val lie Asp Phe 130 135 140

Glu Ser Trp Arg Pro lie Phe Arg Gin Asn Trp Ala Ser Leu Gin Pro 145 150 155 160

Tyr Lys Lys Leu Ser Val Glu Val Val Arg Arg Glu His Pro Phe Trp 165 170 175

Asp Asp Gin Arg Val Glu Gin Glu Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Tyr 180 185 190

Gly Gin Leu Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Ala Ala Lys Arg Met Arg 195 200 205

Pro Ala Ala Asn Trp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Pro Tyr Cys Tyr Asn Leu 210 215 220

Thr Pro Asn Gin Pro Ser Ala Gin Cys Glu Ala Thr Thr Met Gin Glu 225 230 235 240

Asn Asp Lys Met Ser Trp Leu Phe Glu Ser Glu Asp Val Leu Leu Pro 245 250 255

Ser Val Tyr Leu Arg Trp Asn Leu Thr Ser Gly Glu Arg Val Gly Leu 260 265 270

Val Gly Gly Arg Val Lys Glu Ala Leu Arg lie Ala Arg Gin Met Thr 275 280 285

Thr Ser Arg Lys Lys Val Leu Pro Tyr Tyr Trp Tyr Lys Tyr Gin Asp 290 295 300

Arg Arg Asp Thr Asp Leu Ser Arg Ala Asp Leu Glu Ala Thr Leu Arg 305 310 315 320

Lys lie Thr Asp Leu Gly Ala Asp Gly Phe lie lie Trp Gly Ser Ser 325 330 335

Asp Asp lie Asn Thr Lys Ala Lys Cys Leu Gin Phe Arg Glu Tyr Leu 340 345 350

Asn Asn Glu Leu Gly Pro Ala Val Lys Arg lie Ala Leu Asn Asn Asn 355 360 365

Ala Asn Asp Arg Leu Thr Val Asp Val Ser Val Asp Gin Val 370 375 380

<210> 15 <211> 331 <212> PRT <213> 白麵長黃胡蜂（Dolichovespula maculata) <220> <223>玻尿酸酶 <400> 15

Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn lie Tyr Trp Asn Val Pro Thr 15 10 15

Phe Met Cys His Gin Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30

Asn lie Lys His Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gin Gly Asp Lys lie Ser 35 40 45 lie Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Pro Leu Lys Glu 50* 55 60

Gly Asn Tyr Lys lie Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Glu Gly Asn lie 65 70 75 80

Thr lie His Leu Gin Arg Phe lie Glu Asn Leu Asp Lys Thr Tyr Pro 85 90 95

Asn Arg Asn Phe Asn Gly lie Gly Val lie Asp Phe Glu Arg Trp Arg 100 105 110

Pro He Phe Arg Gin Asn Trp Gly Asn Met Met lie His Lys Lys Phe 115 120 125

Ser lie Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Phe Trp Asp Lys Lys Met 第13頁 200950803 130 135 140 lie Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Phe 145 150 155 160

Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gin Ala Asp 165 170 175

Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Pro Asn Asn 180 185 190

Leu Val Pro Asp Cys Asp Ala Thr Ala Met Leu Glu Asn Asp Lys Met 195 200 205

Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr He 2l〇 215 220

Arg His Glu Leu Thr Pro Asp Gin Arg Val Gly Leu Val Gin Gly Arg 225 230 235 240

Val Lys Glu Ala Val Arg lie Ser Asn Asn Leu Lys His Ser Pro Lys 245 250 255

Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Asp Thr Asn Thr Phe 260 265 270

Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gin Glu lie Ala lie Asn 275 280 285

Gly Gly Asp Gly lie lie lie Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300

Leu Ser Lys Cys Lys Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320

Pro lie Thr Val Asn Val Thr Glu Thr Val Asn 325 330

<210〉 16 <211> 367 <212> PRT <213> 馬蜂（Polistes annularis) <220〉 <223>玻尿酸酶 <400> 16

Tyr Val Ser Leu Ser Pro Asp Ser Val Phe Asn lie lie Thr Asp Asp 15 10 15 lie Ser His Gin lie Leu Ser Arg Ser Asn Cys Glu Arg Ser Lys Arg 20 25 30

Pro Lys Arg Val Phe Ser lie Tyr Trp Asn Val Pro Thr Phe Met Cys 35 40 45

His Gin Tyr Gly Met Asn Phe Asp Glu Val Thr Asp Phe Asn lie Lys 50 55 60

His Asn Ser Lys Asp Asn Phe Arg Gly Glu Thr He Ser lie Tyr Tyr 65 70 75 80

Asp Pro Gly Lys Phe Pro Ala Leu Met Pro Leu Lys Asn Gly Asn Tyr 85 90 95

Glu Glu Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Arg Gly Asn lie Thr lie His 100 105 110

Leu Gin Gin Phe Asn Glu Asp Leu Asp Lys Met Thr Pro Asp Lys Asn 115 120 125

Phe Gly Gly lie Gly Val lie Asp Phe Glu Arg Trp Lys Pro lie Phe 130 135 140

Arg Gin Asn Trp Gly Asn Thr Glu lie His Lys Lys Tyr Ser lie Glu 145 150 155 160

Leu Val Arg Lys Glu His Pro Lys Trp Ser Glu Ser Met lie Glu Ala 165 170 175

Glu Ala Thr Lys Lys Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Tyr Phe Met Glu Glu 180 185 190

Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Arg Ala Lys Trp Gly Tyr 195 200 205

Tyr G】y Phe Pro Tyr Cys Tyr Asn Val Thr Pro Asn Asn Pro Gly Pro 210 215 220

Asp Cys Asp Ala Lys Ala Thr lie Glu Asn Asp Arg Leu Ser Trp Met 225 230 235 240

Tyr Asn Asn Gin Glu lie Leu Phe Pro Ser Val Tyr Val Arg His Glu 245 250 255

Gin Lys Pro Glu Glu Arg Val Tyr Leu Val Gin Gly Arg lie Lys Glu 260 265 270

Ala Val Arg lie Ser Asn Asn Leu Glu His Ser Pro Ser Val Leu Ala 275 280 285

Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Lys Met Asp lie Tyr Leu Ser Glu 290 295 300

Thr Asp Val Glu Lys Thr Phe Gin Glu lie Val Thr Asn Gly Gly Asp 305 310 315 320 第14頁 200950803 (

Gly lie lie lie Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser Leu Ser Lys 325 330 335

Cys Lys Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Gly Pro Phe Ala 340 345 350

Val Asn Val Thr Glu Thr Val Asn Gly Arg Ser Ser Leu Asn Phe 355 360 365

<210〉 17 <211> 462 <212> PRT <213> (Mus musculus) <220> <223>玻尿酸酶 <400> 17

Met Leu Gly Leu Thr Gin His Ala Gin Lys Val Trp Arg Met Lys Pro 15 10 15

Phe Ser Pro Glu Val Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ala Thr Ala Gly His 20 25 30

Leu Leu Arg lie Ser Thr Leu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ala Gin 35 40 45

Val Cys Arg Gly Ser Val Val Ser Asn Arg Pro Phe lie Thr Val Trp 50 55 60

Asn Gly Asp Thr His Trp Cys Leu Thr Glu Tyr Gly Val Asp Val Asp 65 70 75 80

Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Lys Glu Gin Ser Phe Gin Gly 85 90 95

Ser Asn Met Thr lie Phe Tyr Arg Glu Glu Leu Gly Thr Tyr Pro Tyr 100 105 110

Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro Gin Asn Ala 115 120 125

Ser Leu Val Thr His Leu Ala His Thr Phe Gin Asp lie Lys Ala Ala 130 135 140

Met Pro Glu Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Ala 145 150 155 160

Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Ser Lys Asp lie Tyr Arg 165 170 175

Gin Arg Ser Met Glu Leu Val Gin Ala Glu His Pro Asp Trp Pro Glu 180 1S5 190

Thr Leu Val Glu Ala Ala Ala Lys Asn Gin Phe Gin Glu Ala Ala Glu 195 200 205

Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Gin Val Leu Arg Pro Arg 210 215 220

Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr Asn Asn Asp Phe 225 230 235 240

Leu Ser Leu Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Val Phe Val Arg Asp Gin 245 250 255

Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Asn Gin Ser Tyr Ala Leu Tyr Pro 260 265 270

Ser lie Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Met Gly Thr Gly Lys Ser Gin Met 275 280 285

Tyr Val Arg His Arg Val Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala lie Val Ser 290 295 300

Arg Asp Pro His Val Pro Val Met Pro Tyr Val Gin lie Phe Tyr Glu 305 310 315 320

Met Thr Asp Tyr Leu Leu Pro Leu Glu Glu Leu Glu His Ser Leu Gly 325 330 335

Glu Ser Ala Ala Gin Gly Val Ala Gly Ala Val Leu Trp Leu Ser Ser 340 345 350

Asp Lys Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie Lys Ala Tyr Met 355 360 365

Asp Ser Thr Leu Gly Pro Phe lie Val Asn Val Thr Ser Ala Ala Leu 370 375 380

Leu Cys Ser Glu Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Val Arg His 385 390 395 400

Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Leu Leu Thr Leu Asn Pro Ala Ser Phe Ser 405 410 415 lie Glu Leu Thr His Asp Gly Arg Pro Pro Ser Leu Lys Gly Thr Leu 420 425 430

Ser Leu Lys Asp Arg Ala Gin Met Ala Met Lys Phe Arg Cys Arg Cys 435 440 445

Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Lys Trp Cys Asp Lys Arg Gly Met 450 455 460 第15頁 200950803 <210> 18 <211> 473 <212> PRT <213>小鼠 <220> <223>玻尿酸酶2 <400> 18

Met Arg Ala Gly Leu Gly Pro lie lie Thr Leu Ala Leu Val Leu Glu 15 10 15

Val Ala Trp Ala Gly Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30

Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asn Val Pro Thr Gin Glu Cys Ala 35 40 45

Pro Arg His Lys Val Pro Leu Asp Leu Arg Ala Phe Asp Val Lys Ala 50 55 60

Thr Pro Asn Glu Gly Phe Phe Asn Gin Asn lie Thr Thr Phe Tyr Tyr 65 70 75 80

Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ala Ala Gly Thr Ser Val 85 90 95

His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Cys Ala His Leu Pro Met 100 105 110

Leu Lys Glu Ser Val Glu Arg Tyr lie Gin Thr Gin Glu Pro Gly Gly 115 120 125

Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140

Trp Gin Glu Lys Asp Val Tyr Arg Gin Ser Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160

Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Ser Asp krg Val Met Lys Gin Ala Gin 165 170 175

Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Asn Thr Leu Arg 180 185 190

Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Gin His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205

Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu Ser Tyr Thr 210 215 220

Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Arg Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240

Leu 丁rp Ala Glu Ser Tiir Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Glu 245 250 255

Thr Leu Ala Ser Ser Val His Ser Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg Val 260 265 270

Arg Glu Ala Leu Arg Val Ala His Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 280 285

Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Thr Arg Gly Leu Thr Gly 290 295 300

Leu Ser Gin Val Asp Leu lie Ser Thr lie Gly Glu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320

Gly Ser Ala Gly Val lie Phe Trp Gly Asp Ser Glu Asp Ala Ser Ser 325 330 335

Met Glu Thr Cys Gin Tyr Leu Lys Asn Tyr Leu Thr Gin Leu Leu Val 340 345 350

Pro Tyr lie Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Trp Thr 355 360 365

Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asn Pro Ser Ala Asn 370 375 380

Thr Phe Leu His Leu Asn Ala Ser Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly His 385 390 395 400

Thr Pro Ser Glu Pro Gin Leu Arg Pro Glu Gly Gin Leu Ser Glu Ala 405 410 415

Asp Leu Asn Tyr Leu Gin Lys His Phe Arg Cys Gin Cys Tyr Leu Gly 420 425 430

Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Arg Asn Tyr Lys Gly Ala Ala Gly Asn 435 440 445

Ala Ser Arg Ala Trp Aia Gly Ser His Leu Thr Ser Leu Leu Gly Leu 450 455 460

Val Ala Val Ala Leu Thr Trp Thr Leu 465 470 <210> 19 <211> 412 <212> PRT <213>小鼠第16頁 200950803 <220> <223>玻尿酸酶3 <400〉 19 Met lie Met His 1 Leu Met His Gly 20 Val Val Trp Asn 35 His Leu Pro Leu 50 Phe His Gly Gin 65 Tyr Pro Tyr Phe

Leu Gly Leu 5 Gin Ala Leu Val Pro Ser Asp Ala Leu 55 Asn lie Ser 70 Gly Pro Arg 85 Leu Asp His ο

Gin Ala Val Ser 100 Leu His Ser Leu Gly Ser Ser 115 Glu Glu Trp Tyr 130 Va] Tyr Leu Ala 145 Leu Asp Pro Gin

Pro Leu Trp 135 Ala Ser Trp 150 Glu Gin Leu 165 Leu Met Glu

Ala Ala Arg Ala 180 Arg Pro Ser Gly Leu Trp Gly 195 Gly Trp His Lys 210 lie Thr Thr Gin 225 Ala Leu Phe Pro

Arg Gin Ala Phe 260 Leu Leu Glu His 275 Thr His Arg Ser 290 Thr lie Gly Val 305 Gly Asp Leu Ser Asp Tyr Leu Val 340 Ala Asp Met Ala 355 Ala Arg Lys Asp 370 Asp Asp Ser Leu 385 Gly Trp Ala Gly

Met Ala Ser 215 Asn Thr Gin 230 Ser lie Tyr 245 Val Arg His

Ser His Pro Ser Gly Arg 295 Ser Ala Ala 310 Phe Ser Ser 325 Gly Thr Leu Cys Ser His Pro Gly Gin 375 Gly Ala Trp 390 Pro Thr Cys 405

Met Met Val 10 Leu Gin Val 25 Ala Arg Cys 40 Gly lie Val lie Phe Tyr Gly Thr Ala 90 His Leu Ala 105 Phe Ala Gly 120 Ala Gly Asn Val Trp Thr His Lys Ala 170 Tyr Thr Leu 185 Phe Tyr Arg 200 Asn Tyr Thr Leu Arg Trp Leu Pro Pro 250 Arg Leu Glu 265 Leu Pro Val 280 Phe Leu Ser Leu Gly Thr Ser Glu Glu 330 Gly Pro Tyr 345 Gin Arg Cys 360 Met Glu Ala Asn Ser Phe Leu Glu Pro 410

Val Gly Leu Thr Pro Glu Lys Ala

Ala Asn 60 Lys Asn 75 His Asn Arg Ala Leu Ala Trp Gly 140 Gin Gin 155 His Thr Gin Leu Tyr Pro Gly His 220 Leu Trp 235 Arg Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp 300 Ala Gly 315 Lys Cys Val ile His Gly Phe Leu 380 Arg Cys 395 Lys Pro

His Pro 30 His Phe 45 His Gly

Gin Phe Gly Gly Ala His 110 Val Leu 125 Pro His Met Phe Ser Phe Gly Arg 190 Ala Cys 205 Cys His Ala Ala Pro Leu Phe Arg 270 Tyr Ser 285 Asp Leu Val Val Trp Arg Asn Val 350 His Gly 365 His Leu His Cys

Leu Cys 15 Phe Ser Gly Val Gin His Gly Leu 80 Ile Pro 95 Gin Ile Asp Trp Arg Gin Pro Gly 160 Glu Gin 175 Thr Leu Gly Asn Ala Ala Ser Ser 240 Ala Tyr 255 Val Ala Arg Leu Met Gin Leu Trp 320 Leu His 335 Thr Lys Arg Cys Gin Pro Tyr Ser 400 <210> 20 <211> 435 <212> PRT <213> 藉（Sus scrofa) <220> <223>玻尿酸酶 <400> 20 Met Ala Ala His Leu Leu Pro Ile Cys Thr Leu Phe Leu Asn Leu Leu 1 '5 10 15 Ser Val Ala Gin Gly Ser Arg Asp Pro Val Val Leu Asn Arg Pro Phe 20 25 30 Thr Thr Ile Trp Asn Ala Asn Thr Gin Trp Cys Leu Lys Arg His Gly 35 40 45 Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Glu Val Val Val Asn Pro Gly Gin 50 55 60 第17頁 200950803

Thr Phe Arg Gly Pro Asn Met Thr lie Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly 65 70 75 80

Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Ser Ala Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu 85 90 95

Pro Gin Asn Ala Ser Leu Asp Val His Leu Asn Arg Thr Phe Lys Asp 100 105 110 lie Leu Ala Ala Met Pro Glu Ser Asn Phe Ser Gly Leu Ala Val lie 115 120 125

Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Ala Lys 130 135 140

Asp lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Lys Gin His Pro 145 150 155 160

Asp Trp Pro Ala Pro Trp Val Glu Ala Ala Ala Gin Asp Gin Phe Gin 165 170 175

Glu Ala Ala Gin Thr Trp Met Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly Gin Thr 180 185 190

Leu Arg Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr 195 200 205

Asn Tyr Asp Phe Gin Ser Ser Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Pro Gly 210 215 220

Val Ser Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg 225 230 235 240

Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Pro Ser Ala Leu Glu Gly Thr Asn 245 250 255

Lys Thr Gin Leu Tyr Val Gin His Arg Val Asn Glu Ala Phe Arg Val 260 265 270

Ala Ala Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Ala Gin 275 280 285 lie Phe His Asp Met Thr Asn Arg Leu Leu Ser Arg Glu Glu Leu Glu 290 295 300

His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Val Val Leu 305 310 315 320 trp Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ser lie 325 330 335

Lys Glu Tyr Val Asp Thr Thr Leu Gly Pro Phe lie Leu Asn Val Thr 340 345 350

Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gin Ala Val Cys Ser Gly His Gly Arg 355 360 365

Cys Val Arg Arg Pro Ser His Thr Glu Ala Leu Pro lie Leu Asn Pro 370 375 3S0

Ser Ser Phe Ser lie Lys Pro Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Thr Leu 385 390 395 400

Gin Gly Ala Leu Ser Leu Lys Asp Arg Val Gin Met Ala Glu Glu Phe 405 410 415

Gin Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Trp Arg Gly Thr 丁rp Cys Glu G】n Gin 420 425 430

Gly Thr Arg 435 <210> 21 <211〉 419 <212〉 PRT <213> 豬 <220> <223>玻尿酸酶3 <400> 21

Met Thr Met Gin Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Met Cys 15 10 15

Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Leu Arg Ala Pro Glu Arg Pro Phe Cys 20 25 30

Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Ala Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gly lie Thr Ala Asn His Gly Gin Arg 50 55 60

Phe His Gly Gin Asn lie Thr lie Phe Tyr Lys Ser Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Arg Ala Ala Tyr Gin lie 100 105 110

His Arg Ser Leu Arg Pro Gly Phe Thr Gly Leu Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Gin Ala 第18頁 200950803 130 135 140

Tyr Gin Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ala Gin Arg Val Tyr Pro Asn Leu 145 150 155 160

Asp Pro Gin GIu Gin Leu Cys Lys Ala Arg Ala Gly Phe Glu Glu Ala 165 170 175

Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Leu Gly Arg Met Leu Arg 180 185 190

Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205

Trp His Gly Thr Ala Ser Asn Tyr Thr Gly His Cys His Ala Ala Ala 210 215 220

Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu Tyr Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240

Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Gly Leu Pro^Pro Ala Tyr His 245 250 255

Gin Ala Phe Val Arg Tyr Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 270

Val Gly His Pro His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Ala Arg Leu Thr 275 280 285

His Arg Asn Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Gin Thr 290 295 300 lie Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ser Gly Val Val Leu Trp Gly 305 310 315 320

Asp Leu Ser Phe Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu Arg Gly 325 330 335

Tyr Leu Val Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Arg Ala 340 345 350

Ala Met Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala 355 360 365

Trp Gin Asp Pro Gly Gin Leu Lys Val Phe Leu His Leu His Pro Gly 370 375 380

Gly Ser Pro Gly Ala Trp Glu Ser Phe Ser Cys Arg Cys Tyr Trp Gly 385 390 395 400

Trp Ala Gly Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Pro Glu Leu Gly Pro Glu 405 410 415

Glu Ala Thr

<210> 22 <211> 449 <212〉 PRT <213> ii® (Rattus norvegicus) <220〉 <223>玻尿酸酶1 <400> 22

Met Lys Pro Phe Ser Pro Glu Val Ser Pro Asp Pro Cys Pro Ala Thr 15 10 15

Ala Ala His Leu Leu Arg Thr Tyr Thr Leu Phe Leu Thr Leu Leu Glu 20 25 30

Leu Ala Gin Gly Cys Arg Gly Ser Met Val Ser Asn Arg Pro Phe lie 35 40 45

Thr Val Trp Asn Ala Asp Thr His Trp Cys Leu Lys Asp His Gly Val 50 55 60

Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Lys Glu Gin Asn 65 70 75 80

Phe Gin Gly Pro Asn Met Thr lie Phe Tyr Arg Glu Glu Leu Gly Thr 85 90 95

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro loo 105 no

Gin Asn Ala Ser Leu Val Thr His Leu Ala His Ala Phe Gin Asp lie 115 120 125

Lys Ala Ala Met Pro Glu Pro Asp Fhe Ser Gly Leu Ala Val lie Asp 130 135 140

Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Ser Lys Asp 145 150 155 160 lie Tyr Gin Gin Arg Ser Met Glu Leu Val Arg Ala Glu His Pro Asp 165 170 175

Trp Pro Glu Thr Leu Val Glu Ala Glu Ala Gin Gly Gin Phe Gin Glu 180 185 190

Ala Ala Glu Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Gin Val Leu 195 200 205

Arg Pro Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr Asn 210 215 220 第19頁 200950803

Tyr Asp Phe Leu Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Ser Leu Ser lie 225 230 235 240

His Asp Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Asn Gin Ser Tyr Ala 245 250 255

Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Met Gly Thr Gly Lys 260 265 270

Ser Gin Met Tyr Val Arg Tyr Arg Val Gin Glu Ala Phe Arg Leu Ala 275 280 285

Leu Val Ser Arg Asp Pro His Val Pro lie Met Pro Tyr Val Gin lie 290 295 300

Phe Tyr Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Leu Pro Leu Glu Glu Leu Glu His 305 310 315 320

Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Ala Val Leu Trp 325 330 335 lie Ser Ser Glu Lys Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie Lys 340 345 350

Ala Tyr Met Asp Ser Thr Leu Gly Pro Phe lie Leu Asn Val Thr Ser 355 360 365

Ala Ala Leu Leu Cys Ser Glu Ala Leu Cys Ser Gly Arg Gly Arg Cys 370 375 380

Val Arg His Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Leu Leu Thr Leu Ser Pro Ala 385 390 395 400

Ser Phe Ser lie Glu Pro Thr His Asp Gly Arg Pro Leu Ser Leu Lys 405 410 415

Gly Thr Leu Ser Leu Lys Asp Arg Ala Gin Met Ala Met Lys Phe Lys 420 425 430

Cys Arg Cys Tyr Arg Gly Trp Ser Gly Glu Trp Cys Lys Lys Gin Asp 435 440 445

Met <210> 23 <211> 473 <212〉 PRT <213>褐鼠 <220> <223>玻尿酸酶2 <400〉 23

Met Arg Ala Gly Leu Gly Pro lie lie Thr Leu Ala Leu Val Leu Glu 15 10 15

Val Ala Trp Ala Ser Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30

Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asn Val Pro Thr Gin Glu Cys Ala 35 40 45

Pro Arg His Lys Val Pro Leu Asp Leu Arg Ala Phe Asp Val Glu Ala 50 55 60

Thr Pro Asn Glu Gly Phe Phe Asn Gin Asn lie Thr Thr Phe Tyr Tyr 65 70 75 80

Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ala Ala Gly Met Ser Val 85 90 95

His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Cys Ala His Leu Pro Met 100 105 110

Leu Lys Glu Ala Val Glu Arg Tyr lie Gin Thr Gin Glu Pro Ala Gly 115 120 125

Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140

Trp Gin Glu Lys Asp Val Tyr Arg Gin Ser Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160

Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Ser Asp Arg lie Val Lys Gin Ala Gin 165 170 175

Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Asn Thr Leu Arg 180 185 190

Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Gin His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205

Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val G]n Asn Trp Asp Ser Tyr Thr 210 215 220

Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Gin Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240

Leu Trp Ala Glu Asn Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Lys 245 250 255

Thr Leu Ala Ser Ser Lys His Ser Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg Val 260 265 270

Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala His Thr His His Ala Asn His Ala Leu 第20頁 200950803 275 280 285

Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Thr Arg Arg Leu Thr Glu 290 295 300

Leu Asn Gin Met Asp Leu lie Ser Thr lie Gly Glu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320

Gly Ser Ala Gly Val lie Phe Trp Gly Asp Ser Val Tyr Ala Ser Ser 325 330 335

Met Glu Asn Cys Gin Asn Leu Lys Lys Tyr Leu Thr Gin Thr Leu Val 340 345 350

Pro Tyr lie Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Trp Thr 355 360 365

Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asn Pro Ser Ala Ser 370 375 380

Thr Phe Leu His Leu Ser Pro Ser Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly Arg 385 390 395 400

Thr Pro Ser Glu Pro Gin Leu Arg Pro Glu Gly Glu Leu Ser Glu Asp 405 410 415

Asp Leu Ser Tyr Leu Gin Met His Phe Arg Cys His Cys Tyr Leu Gly 420 425 430

Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asn His Lys Arg Ala Ala Gly Asp 435 440 445

Ala Ser Arg Ala Trp Ala Gly Ala His Leu Ala Ser Leu Leu Gly Leu 450 455 460

Val Ala Met Thr Leu Thr Trp Thr Leu 465 470 <210> 24 <211> 412 <212> PRT <213〉褊鼠 <220> <223>玻尿酸酶3 <400> 24

Met lie Thr Gin Leu Gly Leu Thr Leu Val Val Gly Leu Thr Leu Cys 15 10 15

Leu Val His Val Gin Ala Leu Leu Gin Val Pro Glu Phe Pro Phe Ser 20 25 30

Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Thr Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Asp Ala Leu Gly lie lie Ala Asn His Gly Gin Arg 50 55 60

Phe His Gly Gin Asn lie Thr lie Phe Tyr Lys Asn Gin Phe Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Gin Ala Ala His Gin lie 100 105 110

Leu His Asn Leu Gly Ser Ser Phe Ala Gly Leu Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Tyr Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Thr His Arg Gin 130 135 140

Val Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Met Phe Pro Asp 145 150 155 160-

Leu Asn Pro Gin Glu Gin Leu His Lys Ala Gin Thr Gly Phe Glu Gin 165 170 175

Ala Ala Arg Ala Leu Met Glu His Thr Leu Arg Leu Gly Gin Met Leu 180 185 190

Arg Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Arg Tyr Pro Val Cys Gly Asn 195 200 205

Gly Trp His Asn Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly His Cys His Pro Ala 210 215 220 lie lie Thr Arg Asn Thr Gin Leu Arg Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser 225 230 235 240

Ala Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Aia Tyr 245 250 255

His Gin Thr Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala 260 265 270

Leu Thr Gly His Ala His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu 275 280 285

Thr His Arg Ser Ser Gly Arg Phe Leu Ser Leu Asp Asp Leu Met Gin 290 295 300

Thr lie Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp 305 310 315 320 第21頁 200950803

Gly Asp Leu Ser Val Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp Arg Leu His 325 330 335

Asp Tyr Leu Val Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Lys 340 345 350

Ala Ala Thr Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys 355 360 365

Ser Trp Lys Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Gin Pro 370 375 380

Asp Asp Asn Leu Gly Ala Trp Lys Ser Phe Arg Cys Arg Cys Tyr Leu 385 390 395 400

Gly Trp Ser Gly Pro Thr Cys Leu Glu Pro Lys Pro 405 410

<210> 25 <211> 545 <212〉 PRT <213> 兔（Oryctolagus cuniculus) <220> <223> PH20 <400> 25

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Gly Ser Ala Val Glu 15 10 15

Leu Ser Gly Val Phe Gin lie Val Phe lie Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Ala Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu trp Ala Trp Asn Ala Pro Thr Glu Phe Cys Leu Gly Lys Ser 50 55 60

Gly Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Leu Phe Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

Lys Asn Lys Thr Gly Gin Gly lie Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Pro His Thr Gly Ala He Val His Gly 100 105 110

Arg lie Pro Gin Leu Gly Pro Leu Gin Gin His Leu Thr Lys Leu Arg 115 120 125

Gin Glu lie Leu Tyr Tyr Met Pro Lys Asp Asn Val Gly Leu Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Leu Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp lie Tyr Arg lie Lys Ser lie Glu Leu Val Lys Ser Gin His 165 170 175

Pro Gin Tyr Asn His Ser Tyr Ala Thr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Gly Arg 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Asp Lys Pro Asn Leu Tyr Lys Gly Ser Cys Phe 225 230 235 240

Asp lie Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Lys Glu 245 250 255

Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Ala Arg Ser 260 265 270

Ala Thr Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Val Val Arg Asn Arg Val His Glu 275 280 285

Ala lie Arg Val Ser Lys lie Pro Asp Asp Lys Ser Pro Leu Pro Asn 290 295 300

Phe Val Tyr thr Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin lie Phe Gin Phe Leu 305 310 315 320

Ser His His Asp Leu Val Tyr Thr He Gly Glu lie Val Ala Leu Gly 325 330 335

Ala Ser Gly lie Val Val Trp Gly Ser Gin Ser Leu Ala Arg Ser Met 340 345 350

Lys Ser Cys Leu His Leu Asp Asn Tyr Met Lys Thr lie Leu Asn Pro 355 360 365

Tyr Leu He Asn Val thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Asn Gin Val Leu 370 375 380

Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys Thr Arg Lys Asn Trp Asn Pro Asn Asp 385 390 395 400

Tyr Leu His Leu Asn Pro Gly Asn Phe Ala lie Gin Leu Gly Ser Asn 405 410 415

Gly Thr Tyr Lys Va] Asp Gly Lys Pro Thr Leu Thr Asp Leu Glu Gin 第22頁 200950803 420 425 430

Phe Ser Lys Asn Phe Gin Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Asn Cys Lys 435 440 445

Glu Arg Thr Asp Met Asn Asn Val Arg Thr Val Asn Val Cys Ala Val 450 455 460

Glu Asn Val Cys lie Asp Thr Asn Val Gly Pro Gin Ala Val Thr Tyr 465 470 475 480

Ala Pro Lys Glu Lys Lys Asp Val Ala His lie Leu Ser Asn Thr Thr 485 490 495

Ser lie Asn Ser Ser Thr Thr Met Ser Leu Pro Phe Pro Arg Lys His 500 505 510

Val Ser Gly Cys Leu Leu Val Leu Cys Met Tyr Ser Gin Tyr Leu Asn 515 520 525 lie Cys Tyr Arg Leu Val Ala lie Gly lie Gin His Gly Tyr Tyr Leu 530 535 540

Lys 545 <210> 26

<211> 476 <212> PRT <2Ϊ3> 繞羊（Ovis aries) <220>

<223>玻尿酸酶2 <400> 26

Met Trp Thr Gly Leu Gly Pro Ala Val Thr Leu Ala Leu Val Leu Val 15 10 15

Val Ala Trp Ala Thr Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30

Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asp Val Pro Thr Gin Asp Cys Gly 35 40 45

Pro Arg His Lys Met Pro Leu Asp Pro Lys Asp Met Lys Ala Phe Asp 50 55 60

Val Gin Ala Ser Pro Asn Glu Gly Phe Val Asn Gin Asn He Thr lie 65 70 75 80

Phe Tyr Arg Asp Arg Leu Gly Met Tyr Pro His Phe Asn Ser Val Gly 85 90 95

Arg Ser Val His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Trp Val His 100 105 110

Leu Glu Met Leu Lys Gly His Val Glu His Tyr lie Arg Thr Gin Glu 115 120 125

Pro Ala Gly Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Asp Trp Arg Pro Val Trp 130 135 140

Val Arg Asn Trp Gin Asp Lys Asp Val Tyr Arg Arg Leu Ser Arg Gin 145 150 155 160

Leu Val Ala Ser His His Pro Asp Trp Pro Pro Glu Arg He Val Lys 165 170 175

Glu Ala Gin Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Glu 180 185 190

Thr Leu Arg Phe Val Lys Ala Phe Arg Pro Arg His Leu Trp Gly Phe 195 200 205

Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu 210 215 220

Thr Tyr Thr Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ser Arg Asn Asp Gin 225 230 235 240

Leu Ser Trp Leu Trp Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr 245 250 255

Leu Glu Glu Thr Leu Ala Ser Ser Thr His Gly Axg Asn Phe Val Ser 260 265 270

Phe Arg Val Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala Asp Val His His Ala Asn 275 280 285

His Ala Leu Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Ser Arg Gly 290 295 300

Leu Thr Gly Leu Ser Glu Met Asp Leu lie Ser Thr lie Gly Glu Ser 305 310 315 320

Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val lie Leu Trp Gly Asp Ala Gly Phe 325 330 335

Thr Thr Ser Asn Glu Thr Cys Arg Arg Leu Lys Asp Tyr Leu Thr Arg 340 345 350

Ser Leu Val Pro Tyr Val Val Asn Val Ser Trp Ala Ala Gin Tyr Cys 355 360 365

Ser Trp Ala Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asp Pro 370 375 380 第23頁 200950803

Asn Ala His Thr Phe Leu His Leu Ser Ala Ser Ser Phe Arg Leu Val 385 390 395 400

Pro Ser His Ala Pro Asp Glu Pro Arg Leu Arg Pro Glu Gly Glu Leu 405 410 415

Ser Trp Ala Asp Arg Asn His Leu Gin Thr His Phe Arg Cys Gin Cys 420 425 430

Tyr Leu Gly Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asp Arg Arg Arg Ala 435 440 445

Ala Gly Gly Ala Ser Gly Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Gly Leu 450 455 460

Leu Ala Val Ala Val Leu Ala Phe Thr Trp Thr Ser 465 470 475 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213>綿羊 <220> <223> PH20SI5分序列 <400> 27

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Leu Ser Lys lie 15 10 15

Ala Ser Val Glu Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr His Arg Pro Val 20 25 30

Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin Gly Asp Leu Val Asn 35 40 45

Ser Val Gly Glu lie Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He lie Met Trp 50 55 60

Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr Met Gin Ser Cys Met Asn Leu Gly 65 70 75 80

Asn Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 85 90 95

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 100 105 110 lie Arg

<210> 28 <211〉 414 <212> PRT <213> 紅毛猩猩（Pongo pygmaeus) <220> <223>玻尿酸酶3 <400> 28

Met Thr Thr Arg Leu Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Leu Cys 1 5 10 15

Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Pro Gin Val Pro Glu Arg Pro Phe Ser 20 25 30

Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala His Cys Lys Ser Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Asn Ala Leu Gly lie lie Ala Asn Arg Gly Gin His 50 55 60

Phe His Gly Gin Asn Met Thr lie Phe Tyr Lys Asn Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Lys Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Leu Pro Leu Asp Arg His Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gin lie 100 105 110

His His Ser Leu Arg Pro Gly Phe Ala Gly Pro Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Arg Ala 130 135 140

Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Val Phe Pro Asp Leu 145 150 155 160

Asp Pro Gin Glu Gin Leu Tyr Lys Ala Tyr Thr Gly Phe Glu Gin Ala 165 170 175

Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Val Ala Gin Ala Leu Arg 180 185 190

Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205 第24頁 200950803

Trp His Ser Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Arg Cys His Ala Ala Thr 210 215 220

Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu His Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240

Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala His His 245 250 255

Gin Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 270

Val Gly His Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu Thr His Arg Arg 275 280 285

Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Asp Leu Val Gin Thr lie Gly Val 290 295 300

Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp Gly Asp Leu Ser 305 310 315 320

Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His Asp Tyr Leu Val 325 330 335

Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Gly lie Asn Val Thr Arg Ala Ala Met Ala 340 345 350

Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala Arg Arg Asp 355 360 365

Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Trp Pro Asp Gly Ser Leu 370 375 380

Gly Asp Trp Lys Ser Phe Ser Cys His Cys Tyr Ττρ Gly Trp Ala Gly 385 390 395 400

Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Leu Gly Pro Lys Glu Ala Val 405 410

<210> 29 <211> 510 <212> PRT <2l3> A蟹猴（Macaca fascicularis) <220> <223> PH20 <400> 29

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro lie lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asn Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Val Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val His Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys Val Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ser Lys 115 120 125

Gin Asp lie Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140

He Asp Trp Glu Glu Tr.p Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Pro Gin Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Leu Glu Thr ile Lys Leu Gly Arg 195 200 205

Ser Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Arg Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Val Val 260 265 270

Val Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285

Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Asn Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala 290 295 300

Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Arg Glu Glu 第25頁 200950803 305 310 315 320

Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Ser Leu Ser lie Thr Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Thr Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Asp lie Arg Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val His Gly Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

He Asp Ala Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro 465 470 475 480 lie Phe Tyr Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Thr Thr Met Phe He 485 490 495

Val Asn lie Leu Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 510

<210> 30 <211> 529 <212> PRT <213> 膝鼠（Cavia porcellus) <220〉 <223> PH20 <400> 30

Met Gly Ala Phe Thr Phe Lys His Ser Phe Phe Gly Ser Phe Val Glu 15 10 15

Cys Ser Gly Val Leu Gin Thr Val Phe lie Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Ala Asp Lys Arg Ala Pro Pro Leu lie Pro Asn Val Pro Leu 35 40 45

Leu Trp Val Trp Asn Ala Pro Thr Glu Phe Cys lie Gly Gly Thr Asn 50 55 60

Gin Pro Leu Asp Met Ser Phe Phe Ser lie Val Gly Thr Pro Arg Lys 65 70 75 80

Asn lie Thr Gly Gin Ser lie Thr Leu Tyr Tyr Val Asp Arg Leu Gly 85 90 95

Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Pro His Thr Gly Ala lie Val His Gly Gly 100 105 110

Leu Pro Gin Leu Met Asn Leu Gin Gin His Leu Arg Lys Ser Arg Gin 115 120 125

Asp lie Leu Phe Tyr Met Pro Thr Asp Ser Val Gly Leu Ala Val lie 130 135 140

Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Thr Arg Asn Trp Arg Pro Lys 145 150 155 160

Asp lie Tyr Arg Asn Lys Ser lie Glu Leu Val Lys Ser Gin His Pro 165 170 175

Gin Tyr Asn His Ser Tyr Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Asp Phe Glu 180 185 190

Arg Thr Gly Lys Ala Phe Met Leu Glu Thr Leu Lys Leu Gly Lys Ser 195 200 205

Leu Arg Pro Ser Ser Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220

Asn Thr His Phe Thr Lys Pro Asn Tyr Asp Gly His Cys Pro Pro lie 225 230 235 240

Glu Leu Gin Arg Asn Asn Asp Leu Gin Trp Leu Trp Asn Asp Ser Thr 245 250 255

Ala Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Val Arg Ser Ser Gin 260 265 270

Asn Gly Ala Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val His Glu Ser lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys Leu Met Asp Asp Lys Asn Pro Leu Pro lie Tyr Val Tyr lie 290 295 300

Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin Thr Thr Thr Phe Leu Glu Leu Asp Asp 305 310 315 320 第26頁 200950803

Leu Val His Ser Val Gly Glu lie Val Pro Leu Gly Val Ser Gly lie •325 330 335 lie lie Trp Gly Ser Leu Ser Leu Thr Arg Ser Leu Val Ser Cys lie 340 345 350

Gly Leu Glu Asn Tyr Met Lys Gly Thr Leu Leu Pro Tyr Leu lie Asn 355 360 365

Val Ήιγ Leu Ala Ala Lys Met Cys Gly Gin Val Leu Cys Lys Asn Gin 370 375 380

Gly lie Cys Thr Arg Lys Asp Trp Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Ala Thr Asn Phe Asp lie Glu Leu Gin Gin Asn Gly Lys Phe Val 405 410 415

Val His Gly Lys Pro Ser Leu Glu Asp Leu Gin Glu Phe Ser Lys Asn 420 425 430

Phe His Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Val Ala Cys Lys Asp Arg Leu Asp 435 440 445

Val His Asn Val Arg Ser Val Asn Val Cys Thr Ala Asn Asn lie Cys 450 455 460

He Asp Ala Val Leu Asn Phe Pro Ser Leu Asp Asp Asp Asp Glu Pro 465 470 475 480

Pro lie Thr Asp Asp Thr Ser Gin Asn Gin Asp Ser lie Ser Asp lie 485 490 495

Thr Ser Ser Ala Pro Pro Ser Ser His lie Leu Pro Lys Asp Leu Ser 500 505 510

Trp Cys Leu Phe Leu Leu Ser lie Phe Ser Gin His Trp Lys Tyr Leu 515 520 525

Leu <210> 31 <211> 512 <212> PRT <213>德鼠 <220> <223> PH20 <400> 31

Met Gly Glu Leu Gin Phe Lys Trp Leu Phe Trp Arg Ser Phe Ala Glu 15 10 15

Ser Gly Gly Thr Phe Gin Thr Val Leu lie Phe Leu Phe lie Pro Tyr 20 25 30

Ser Leu Thr Val Asp Tyr Arg Ala Thr Pro Val Leu Ser Asp Thr Thr 35 40 45

Phe Val Trp Val Trp Asn Val Pro Thr Glu Ala Cys Val Glu Asn Val 50 55 60

Thr Glu Pro lie Asp Leu Ser Phe Phe Ser Leu lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

Lys Thr Ala lie Gly Gin Pro Val Thr Leu Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Asn Tyr Pro His lie Asp Ala Gin Gin Thr Glu His His Gly Gly loo 105 no lie Pro Gin Lys Gly Asp Leu Thr Thr His Leu Val Lys Ala Lys Giu 115 120 125

Asp Val Glu Arg Tyr lie Pro Thr Asp Lys Leu Gly Leu Ala lie lie 130 135 140

Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Met Arg Asn Trp Thr Pro Lys 145 150 155 160

Asp lie Tyr Arg Asn Lys Ser lie Glu Leu Val Gin Ala Ala Asp Pro 165 170 175

Ala lie Asn lie Thr Glu Ala Thr Val Arg Ala Lys Ala Gin Phe Glu 180 185 190

Gly Ala Ala Lys Glu Phe Met Glu Gly Thr Leu Lys Leu Gly Lys His 195 200 205 lie Arg Pro Lys His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220

Asn Asn Lys Phe Gin Val Asp Asn Tyr Asp Gly Gin Cys Pro Asp Val 225 230 235 240

Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asp Leu Asp Trp Leu Trp 乙ys Glu Ser Thr 245 250 255

Gly Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser Ser Arg 260 265 270

Lys Ala Thr Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Vai Leu Glu Ser lie Arg Val 275 280 285

Set Lys Val Ser Asp Glu Ser Asn Pro Val Pro lie Phe Val Tyr lie 第27頁 200950803 290 295 300

Arg Leu Val Phe Thr Asp His Val Ser Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Asp 305 310 315 320

Leu Val Asn Thr lie Gly Glu lie Val Ala Gin Gly Thr Ser Gly lie 325 330 335

He lie Trp Asp Ala Met Ser Leu Ala Gin Arg Scr Ala Gly Cys Pro 340 345 350

He Leu Arg Gin Tyr Met Lys Thr Thr Leu Asn Pro Tyr lie Val Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Thr Leu Cys Lys Glu Lys 370 375 380

Gly Met Cys Ser Arg Lys Thr Glu Ser Ser Asp Ala Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asp Pro Ser Ser Phe Ser lie Asn Val Thr Glu Ala Gly Lys Tyr Glu 405 410 415

Val Leu Gly Lys Pro Glu Val Lys Asp Leu Glu Tyr Phe Ser Glu His 420 425 430

Phe Lys Cys Ser Cys Phe Ser Lys Met Thr Cys Glu Glu Thr Ser Asp 435 440 445

Met Arg Ser lie Gin Asp Val Asn Val Cys Met Gly Asp Asn Val Cys 450 455 460 lie Lys Ala Thr Leu Gly Pro Asn Ser Ala Phe His Leu Leu Pro Gly 465 470 475 480

Lys Gly Leu Leu Leu Met Thr Thr Leu Ala His Ile Leu His His Leu 485 490 495

Pro His Asp lie Phe Val Phe Pro Trp Lys Met Leu Val Ser Thr Pro 500 505 510 <210〉 32 <211> 512 <212> PRT <213>小鼠 <220> <223> PH20 <400> 32

Met Gly Glu Leu Arg Phe Lys His Leu Phe Trp Gly Ser Phe Val Glu 15 10 15

Ser Gly Gly Thr Phe Gin Thr Val Leu lie Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Ser Leu Thr Val Asp Tyr Arg Ala Ala Pro lie Leu Ser Asn Thr Thr 35 40 45

Phe Leu Trp lie Trp Asn Val Pro Thr Glu Arg Cys Val Gly Asn Val 50 55 60

Asn Asp Pro lie Asp Leu Ser Phe Phe Ser Leu lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80

Lys Thr Ala Thr Gly Gin Pro Val Thr Leu Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Leu Tyr Pro His lie Asp Ala Asn Gin Ala Glu His Tyr Gly Gly 100 105 130 lie Pro Gin Arg Gly Asp Tyr Gin Ala His Leu Arg Lys Ala Lys Thr 115 120 125

Asp lie Glu His Tyr lie Pro Asp Asp Lys Leu Gly Leu Ala lie lie 130 135 140

Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro Lys 145 150 155 160

Asp Asn Tyr Arg Asn Lys Ser lie Glu Leu Val Gin Ser Thr Asn Pro 165 170 175

Gly Leu Ser lie Thr Glu Ala Thr Gin Lys Ala lie Gin Gin Phe Glu 180 185 190

Glu Ala Gly Arg Lys Phe Met Glu Gly Thr Leu His Leu Gly Lys Phe 195 200 205

Leu Arg Pro Asn Gin Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220

Asn Asn Lys Phe Gin Asp Pro Lys Tyr Asp Gly Gin Cys Pro Ala Val 225 230 235 240

Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asn Leu Lys Trp Leu Trp Lys Ala Ser Thr 245 250 255

Gly Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser Asn Arg 260 265 270

Gin Ala Thr Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Val Val Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys Val Gly Asn Ala Ser Asp Pro Val Pro lie Phe Val Tyr lie 290 295 300 第28頁 200950803

Arg Leu Val Phe Thr Asp Arg Thr Ser Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Asp 305 310 315 320

Leu Val Asn Thr lie Gly Glu lie Val Ala Leu Gly Thr Ser Gly lie 325 330 335 lie lie Trp Asp Ala Met Ser Leu Ala Gin Arg Ala Ala Gly Cys Pro 340 345 350 lie Leu His Lys Tyr Met Gin Thr Thr Leu Asn Pro Tyr lie Val Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Thr Leu Cys Asn Glu Lys 370 375 380

Gly Met Cys Ser Arg Arg Lys Glu Ser Set Asp Val Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Ser His Phe Asp lie Met Leu Thr Glu Thr Gly Lys Tyr Glu 405 410 415

Val Leu Gly Asn Pro Arg Val Gly Asp Leu Glu Tyr Phe Ser Glu His 420 425 430

Phe Lys Cys Ser Cys Phe Ser Arg Met Thr Cys Lys Glu Thr Ser Asp 435 440 445

Val Lys Asn Val Gin Asp Val Asn Val Cys Val Gly Asp Asn Val Cys 450 455 460

He Lys Ala Lys Val Glu Pro Asn Pro Ala Phe Tyr Leu Leu Pro Gly 465 470 475 480

Lys Ser Leu Leu Phe Met Thr Thr Leu Gly His Val Leu Tyr His Leu 485 490 495

Pro Gin Asp lie Phe Val Phe Pro Arg Lys Thr Leu Val Ser Thr Pro 500 505 510

<210> 33 <211> 807 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) <220> <2孤玻尿酸酶 <400> 33

Met Thr Tyr Arg lie Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser Thr lie Thr Leu 15 10 15

Leu Met Ala Gly Val lie Thr Leu Asn Gly Gly Glu Phe Arg Ser Val 20 25 30

Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45

Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60

Lys Tyr Asp Glu Asn Asn Pro Asp Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Thr 65 70 75 80

Glu Lys Glu Ala Thr Asn Leu Leu Lys Glu Met Lys Thr Glu Ser Gly 85 90 95

Arg Lys Tyr Leu Trp Ser Gly Ala Glu Thr Leu Glu Thr Asn Ser Ser 100 105 110

His Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys lie Ala Glu Ala Met 115 120 125

Arg Asn Pro Lys Thr Thr Leu Asn Thr Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140

Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Pro 145 150 155 160

Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Ser Glu Asn Phe Thr Lys Thr Thr Gly 165 170 175

Lys Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu lie Gly Thr Pro Lys 180 185 190

Ser Leu Thr Asn Thr Leu lie Leu Leu Asn Asp Gin Phe Ser Asn Glu 195 200 205

Glu Lys Lys Lys Phe Thr Ala Pro lie Lys Thr Phe Ala Pro Asp Ser 210 215 220

Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Lys Ala Glu Leu Ala Lys Gly Gly 225 230 235 240

Asn Leu Val Asp lie Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Cys lie lie Glu 245 250 255

Glu Asp Lys Asp Met Met Lys Lys Ser lie Asp Ser Phe Asn Lys Val 260 265 270

Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Gly Phe 275 280 285

Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Gly lie Ser Gin Met Met Pro Met 第29頁 200950803 305 310 315 320 lie Lys G3u Tbr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Gin Asn Asp Thr Thr Leu 325 330 335

Lys Ser Trp lie Asp Asp Gly Phe Met Pro Leu lie Tyr Lys Gly Glu 340 345 350

Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 360 365

Ser His Ser Ala Ser Ala Th-r Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu Ser 370 375 380

Asp Ala Met Asp Asp Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys lie Val Lys 385 390 395 400

Ser Ser Val Glu Ser Asp Ser Ser Tyr Lys Gin Asn Asp Tyr Leu Asn 405 410 415

Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys Ser Leu Met Thr Asp Asn Ser 420 425 430 lie Ser Lys Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys He Tyr Asn Asp Met 435 440 445

Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly Leu 450 455 460

Ser Met Thr Ser Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Ser lie Asn Gly Glu 465 470 475 480

Asn Leu Lys Gly Trp His Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 485 490 495

Ser Asp Val Lys His Tyr His Asp Asn Phe Trp Val Thr Ala Asp Met 5.00 505 510

Lys Arg Leu Ser Gly Thr Thr Thr Leu Asp Asn Glu lie Leu Lys Asp 515 520 525

Thr Asp Asp Lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Val Gly Gly Thr Lys Val 530 535 540

Asp Asp Gin His Ala Ser He Gly Met Asp Phe Glu Asn Gin Asp Lys 545 550 555 560

Thr Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys lie Val 565 570 575

Phe Leu Gly Thr Gly lie Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro Val 580 585 590

Thr Thr I3e Glu Asn Arg Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr Asp 595 600 605

Asp Lys Gin Thr Thr Asn Ser Asp Asn Gin Giu Asn Asn Ser Val Phe 610 615 620

Leu Glu Ser Thr Asp Thr Lys Lys Asn lie Gly Tyr His Phe Leu Asn 625 630 635 640

Lys Pro Lys lie Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys Trp Lys 645 650 655

Glu lie Asri Lys Ser Gin Lys Asp Thr Gin Lys Thr Asp Glu Tyr Tyr 660 665 670

Glu Val Thr Gin Lys His Ser Asn Ser Asp Asn Lys Tyr Gly Tyr Val 675 680 685

Leu Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Asp Val Phe Lys Thr Lys Lys Asp Glu 690 695 700

Val Thr Val Val Lys Gin Glu Asp Asp Phe His Val Val Lys Asp Asn 705 710 715 720

Glu Ser Val Trp Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asn Ser Thr Gin Thr Phe 725 730 735

Asp lie Asn Asn Thr Lys Val Glu Val Lys Ala Lys Gly Met Phe lie 740 745 750

Leu Lys Lys Lys Asp Asp Asn Thr Tyr Glu Cys Ser Phe Tyr Asn Pro 755 760 765

Glu Ser Thr Asn Ser Ala Ser Asp lie Glu Ser Lys lie Ser Met Thr 770 775 780

Gly Tyr Ser lie Thr Asn Lys Asn Thr Ser Thr Ser Asn Glu Ser Gly 785 790 795 800

Val His Phe Glu Leu Thr Lys 805 <210> 34

<211> 371 <212〉 PRT <2Ϊ3> 釀膜鏈球菌（Streptococcus pyogenes) 菌體H4489A <220> <223>玻尿酸酶 <400〉 34

Met Thr Glu Asn lie Pro Leu Are Val Gin Phe Lys Arg Met Ser Ala 200950803

Asp Glu Trp Ala Arg Ser Asp Val lie Leu Leu Glu Gly Glu lie Gly 20 25 30

Phe Glu Thr Asp Thr Gly Phe Ala Lys Phe Gly Asp Gly Gin Asn Thr 35 40 45

Phe Ser Lys Leu Lys Tyr Leu Thr Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Asp 50 55 60

Thr Gly Leu Gin Gly Lys Thr Gly Gly Thr Gly Pro Arg Gly Pro Ala 65 70 75 80

Gly Lys Pro Gly Thr Thr Asp Tyr Asp Gin Leu Gin Asn Lys Pro Asp 85 90 95

Leu Gly Ala Phe Ala Gin Lys Glu Glu Thr Asn Ser Lys lie Thr Lys 100 105 110

Leu Glu Ser Ser Lys Ala Asp Lys Ser Ala Val Tyr Ser Lys Ala Glu 115 120 125

Ser Lys lie Glu Leu Asp Lys Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gly lie Val 130 135 140

Thr Gly Gin Leu Gin Phe Lys Pro Asn Lys Ser Gly lie Lys Pro Ser 145 150 155 160

Ser Ser Val Gly Gly Ala lie Asn lie Asp Met Ser Lys Ser Glu Gly 165 ' 170 175

Ala Ala Met Val Met Tyr Thr Asn Lys Asp Thr Thr Asp Gly Pro Leu 180 185 190

Met lie Leu Arg Ser Asp Lys Asp Thr Phe Asp Gin Ser Ala Gin Phe 195 200 205

Val Asp Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Ala Val Asn lie Val Met Arg Gin 210 215 220

Pro Ser Ala Pro Asn Phe Ser Ser Ala Leu Asn lie Thr Ser Ala Asn 225 230 235 240

Glu Gly Gly Ser Ala Met Gin He Arg Gly Val Glu Lys Ala Leu Gly 245 250 255

Thr Leu Lys lie Thr His Glu Asn Pro Asn Val Glu Ala Lys Tyr Asp 260 265 270

Glu Asn Ala Ala Ala Leu Ser lie Asp lie Val Lys Lys Gin Lys Gly 275 280 285

Gly Lys Gly Thr Ala Ala Gin Gly lie Tyr lie Asn Ser Thr Ser Gly 290 295 300

Thr Ala Gly Lys Met Leu Arg lie Arg Asn Lys Asn Glu Asp Lys Phe 305 310 315 320

Tyr Val Gly Pro Asp Gly Gly Phe His Ser Gly Ala Asn Ser Thr Val 325 330 335

Ala Gly Asn Leu Thr Val Lys Asp Pro Thr Ser Gly Lys His Ala Ala 340 345 350

Thr Lys Asp Tyr Val Asp Glu Lys lie Ala Glu Leu Lys Lys Leu lie 355 360 365

Leu Lys Lys 370

<210〉 35 <211> 1628 <212> PRT <213> 產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens) <220> <223>玻尿酸酶 <400〉 35

Met Asn Lys Asn lie Arg Lys lie lie Thr Ser Thr Val Leu Ala Ala 1 5 10 15

Met Thr lie Ser Val Leu Pro Ser Asn Leu Val Val Phe Ala Thr Asp 20 25 30

Gly lie Thr Glu Asn Phe Tyr Glu lie Tyr Pro Lys Pro Gin Glu lie 35 40 45

Ser Tyr Ser Gly Gly Glu Phe Gin lie Ser Asp Glu lie Asn lie Val 50 55 60

Tyr Asp Asp Gly lie Asp Thr Tyr Thr Lys Lys Arg Val Asp Glu Val 65 70 75 80

Leu Glu Ala Ser Asn Leu Glu Ala Thr Val Ser Asn Glu lie Val Pro 85 90 95

Gly Lys Thr Asn Phe Leu Val Gly lie Asn Glu Ser Gly Gly Val Val 100 105 110

Asp Asn Tyr Phe Asn Lys Asn lie Pro His Asp Glu Ser Phe Phe Asp 115 120 125

Glu Lys Met Asp Ala Asn lie Val Ser Val Lys Asp Gly Val lie Gly 130 135 140

Val lie Gly Glu Asp Thr Asp Ser Ala Phe Tyr Gly Val Thr Thr Leu 第31頁 200950803 145 150 155 160

Lys His Val Phe Asn Gin Leu Glu Glu Gly Asn Lys lie Gin Ser Phe 165 170 175

Arg Ala Asp Asp Tyr Ala Glu Val Ala His Arg Gly Phe lie Glu Gly 180 185 190

Tyr Tyr Gly Asn Pro Trp Ser Asn Glu Asp Arg Ala Glu Leu Met Lys 195 200 205

Phe Gly Gly Asp Tyr Lys Leu Asn Gin Tyr Val Phe Ala Pro Lys Asp 210 215 220

Asp Pro Tyr His Asn Ser Lys Trp Arg Asp Leu Tyr Pro Glu Glu Lys 225 230 235 240

Leu Ser Glu lie Lys Lys Leu Ala Gin Val Gly Asn Glu Thr Lys Asn 245 250 255

Arg Tyr Val Tyr Ala Leu His Pro Phe Met Asn Asn Pro Va】Arg Phe 260 265 270

Asp Thr Glu Glu Asn Tyr Gin Asn Asp Leu Gly Val lie Lys Ala Lys 275 280 285

Phe Thr Gin Leu Leu Glu Asn Asp Val Arg Gin Phe Ala lie Leu Ala 290 295 300

Asp Asp Ala Ser Ala Pro Ala Gin Gly Ala Ser Met Tyr Val Lys Leu 305 310 315 320

Leu Thr Asp Leu Thr Arg Trp Leu Glu Glu Gin Gin Ser Thr Tyr Pro 325 330 335

Asp Leu Lys Thr Asp Leu Met Phe Cys Pro Ser Asp Tyr Tyr Gly Asn 340 345 350

Gly Ser Ser Ala Gin Leu Lys Glu Leu Asn Lys Ala Glu Asp Asn Val 355 360 365

Ser lie Val Met Thr Gly Gly Arg lie Trp Gly Glu Val Asp Glu Asn 370 375 380

Phe Ala Asn Asn Phe Met Asn Asn lie Ser Thr Glu Gly His Pro Gly 385 390 395 400

Arg Ala Pro Phe Phe Trp lie Asn Trp Pro Cys Ser Asp Asn Ser Lys 405 410 415

Gin His Leu lie Met Gly Gly Asn Asp Thr Phe Leu His Pro Gly Val 420 425 430

Asp Pro Ser Lys lie Asp Gly He Val Leu Asn Pro Met Gin Gin Ala 435 440 445

Glu Ala Asn Lys Ser Ala Leu Phe Ala lie Ala Asp Tyr Ala Trp Asn 450 455 460 lie Trp Asp Asn Lys Glu Glu Ala Asp Glu Asn Trp Asn Asp Ser Phe 465 470 475 480

Lys Tyr Met Asp His Gly Thr Ala Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Ala 485 490 495

Leu Arg Glu He Ser Lys His Met lie Asn Gin Asn Met Asp Gly Arg 500 505 510

Val Arg Pro Leu Gin Glu Ser Val Glu Leu Ala Pro Lys Leu Glu Ala 515 520 525

Phe Lys Gin Lys Tyr Asp Ser Gly Ala Ser lie Lys Glu Asp Ala Leu 530 535 540

Glu Leu lie Ala Glu Phe Thr Asn Leu Gin Lys Ala Ala Asp Tyr Tyr 545 550 555 560

Lys Asn Asn Pro Gly Asn Glu Arg Thr Arg Asp Gin lie lie Tyr Trp 565 570 575

Leu Asn Cys Trp Glu Asp Thr Met Asp Ala Ala lie Gly Tyr Leu Lys 580 585 590

Ser Ala lie Ala lie Glu Glu Gly Asp Asp Glu Ala Ala Trp Ala Asn 595 600 605

Tyr Ser Glu Ala Gin Gly Ala Phe Glu Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Phe 610 615 620

His Tyr Val Asp His Thr Glu Tyr Ala Glu Val Gly Val Gin His lie 625 630 635 640

Val Pro Phe lie Lys Ser Met Gly Gin Asn Leu Ser Val Val He Gly 645 650 655

Ser lie Val Asp Pro Asn Arg lie lie Ala Thr Tyr He Ser Asn Arg 660 665 670

Gin Asp Ala Pro Thr Gly Asn Pro Asp Asn lie Phe Asp Asn Asn Ala 675 680 685

Ser Thr Glu Leu Val Tyr Lys Asn Pro Asn Arg lie Asp Val Gly Thr 690 695 700

Tyr Val Gly Val Lys Tyr Ser Asn Pro He Thr Leu Asn Asn Val Glu 705 710 715 720

Phe Leu Met Gly Ala Asn Ser Asn Pro Asn Asp Thr Met Gin Lys Ala 725 730 735

Lys lie Gin Tyr Thr Val Asp Gly Arg Glu Trp lie Asp Leu Glu Glu 740 745 750

Gly Val Glu Tyr Thr Met Pro Gly Ala lie Lys Val Glu Asn Leu Asp 第32頁 200950803 755 760 765

Leu Lys Val Arg Gly Val Arg Leu lie Ala Thr Glu Ala Arg Glu Asn 770 775 780

Thr Trp Leu Gly Val Arg Asp lie Asn Val Asn Lys Lys Glu Asp Ser 785 790 795 800

Asn Ser Gly Val Glu Phe Asn Pro Ser Leu lie Arg Ser Glu Ser Trp 805 810 815

Gin Val Tyr Glu Gly Asn Glu Ala Asn Leu Leu Asp Gly Asp Asp Asn 820 825 830

Thr Gly Val Trp Tyr Lys Thr Leu Asn Gly Asp Thr Ser Leu Ala Gly 835 840 845

Glu Phe lie Gly Leu Asp Leu Gly Lys Glu He Lys Leu Asp Gly lie 850. 855 860

Arg Phe Val lie Gly Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ser Asp Lys Trp Asn 865 870 875 880

Lys Phe Lys Leu Glu Tyr Ser Leu Asp Asn Glu Ser Trp Thr Thr lie 885 890 895

Lys Glu Tyr Asp Lys Thr Gly Ala Pro Ala Gly Lys Asp Val lie Glu 900 905 910

Glu Ser Phe Glu Thr Pro lie Ser Ala Lys Tyr lie Arg Leu Thr Asn 915 920 925

Met Glu Asn lie Asn Lys Trp Leu Thr Phe Ser Glu Phe Ala lie lie 930 935 940

Ser Asp Glu Leu Glu Asn Ala Gly Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Asn 945 950 955 960

Thr Glu Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ala Lys Glu Asp Val Thr Lys Leu 965 970 975 lie Pro Thr Asp Asp lie Ser Leu Asn His Gly Glu Tyr lie Gly Val 980 985 990

Lys Leu Asn Arg lie Lys Asp Leu Ser Asn lie Asn Leu Glu lie Ser 995 1000 1005

Asn Asp Thr Gly Leu Lys Leu Gin Ser Ser Met Asn Gly Val Glu Ττρ 1010 1015 1020

Thr Glu lie Thr Asp Lys Asn Thr Leu Glu Asp Gly Arg Tyr Val Arg 1025 1030 1035 1040

Leu lie Asn Thr Ser Asn Glu Ala Val Asn Phe Asn Leu Thr Lys Phe 1045 1050 1055

Glu Val Asn Ser Asn Glu Val Tyr Glu Pro Ser Leu Val Asp Ala Tyr 1060 1065 1070

Val Gly Asp Asp Gly Ala Lys Lys Ala Val Asp Gly Asp Leu Lys Thr 1075 1080 1085

Arg Val Lys Phe Leu Gly Ala Pro Ser Thr Gly Asp Thr lie Val Tyr 1090 1095 1100

Asp Leu Gly Gin Glu lie Leu Val Asp Asn Leu Lys Tyr Val Val Leu 1105 1110 1115 1120

Asp Thr Glu Val Asp His Val Arg Asp Gly Lys lie Gin Leu Ser Leu 1125 1130 1135

Asp Gly Glu Thr Trp Thr Asp Ala He Thr lie Gly Asp Gly Val Glu 1140 1145 1150

Asn Gly Val Asp Asp Met Phe Ser Thr Pro Leu Lys Asn Gly Tyr Lys 1155 1160 1165

His Gly Asn Gin Ser Gly Gly lie Val Pro lie Asp Ser Ala Tyr Val 1170 1175 1180

Glu Gly Asp Asn Leu Asn Gin Lys Ala Arg Tyr Val Arg lie Leu Phe 1185 1190 1195 1200

Thr Ala Pro Tyr Arg His Arg Trp Thr Val lie Asn Glu Leu Met lie 1205 1210 1215

Asn Asn Gly Glu Tyr lie Ser Thr Val Asn Asp Pro Thr Tyr lie Ser 1220 1225 1230

Asn Pro lie Glu Glu Arg Gly Phe Ala Pro Ser Asn Leu Arg Asp Gly 1235 1240 1245

Asn Leu Thr Thr Ser Tyr Lys Pro Asn Thr Asn Asn Gly Glu lie Ser 1250 1255 1260

Glu Gly Ser lie Thr Tyr Arg Leu Ser Glu Lys Thr Asp Val Arg Lys 1265 1270 1275 1280

Val Thr lie Val Gin Ser Gly Ser Ser lie Ser Asn Ala Lys Val Met 1285 1290 1295

Ala Arg Val Gly Asp Gly Ser Glu Asn Val Thr Asp Gin Trp Val Gin 1300 1305 1310

Leu Gly Thr Leu Ser Asn Ser Leu Asn Glu Phe lie Asn Arg Asp Tyr 1315 1320 1325

Asn Asn lie Tyr Glu lie Lys lie Glu Trp Thr Asp Val Ala Pro Asn 1330 1335 1340 lie Tyr Glu lie lie Thr Leu Asn Gin Glu Phe Glu Phe Pro Val Asn 1345 1350 1355 1360

Asp Ser Leu Lys Ala Lys Tyr Asp Glu Leu lie Asn Leu Ser Gly Asp 第33頁 200950803 1365 1370 1375

Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Phe Glu Thr Leu Lys Glu Ala Leu Asn Glu 1380 1385 1390

Ala Lys Ser lie Leu Asp Asp Ser Asn Ser Ser Gin Lys Lys lie Asp 1395 1400 1405

Lys Ala Lea Glu Lys Leu Asn Lys Ala Glu Glu Arg Leu Asp Leu Arg 1410 1415 1420

Ala Thr Asp Phe Glu Asp Phe Asn Lys Val Leu Thr Leu Gly Asn Ser 1425 1430 1435 1440

Leu Val Glu Glu Glu Tyr Thr Ala Glu Ser Trp Ala Leu Phe Ser Glu 1445 1450 1455

Val Leu Glu Ala Ala Asn Glu Ala Asn Lys Asn Lys Ala Asp Tyr Thr 1460 1465 1470

Gin Asp Gin lie Asn Gin lie Val lie Asp Leu Asp Ala Ser lie Lys 1475 1480 1485

Ala Leu Val Lys Glu Thr Pro Glu Val Asp Lys Thr Asn Leu Gly Glu 1490 1495 1500

Leu lie Asn Gin Gly Lys Ser Leu Leu Asp Glu Ser Val Glu Gly Phe 1505 1510 1515 1520

Asn Val Gly Glu Tyr His Lys Gly Ala Lys Asp Gly Leu Thr Val Glu 1525 1530 1535 lie Asn Lys Ala Glu Glu Val Phe Asn Lys Glu Asp Ala Thr Glu Glu 1540 1545 1550

Glu lie Asn Leu Ala Lys Glu Ser Leu Glu Gly Ala lie Ala Arg Phe 1555 1560 1565

Asn Ser Leu Leu lie Glu Glu Ser Thr Gly Asp Phe Asn Gly Asn Gly 1570 1575 1580

Lys lie Asp lie Gly Asp Leu Ala Met Val Ser Lys Asn lie Gly Ser 1585 1590 1595 1600

Thr Thr Asn Thr Ser Leu Asp Leu Asn Lys Asp Gly Ser lie Asp Glu 1605 1610 1615

Tyr Glu lie Ser Phe lie Asn His Arg lie Leu Asn 1620 1625 <210> 36 <211> 435 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>玻尿酸酶-1[前驅體] <400> 36

Met Ala Ala His Leu Leu Pro lie Cys Ala Leu Phe Leu Thr Leu Leu 15 10 15

Asp Met Ala Gin Gly Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe 20 25 30

Thr Thr Val Trp Asn Ala Asn Thr Gin Trp Cys Leu Glu Arg His Gly 35 40 45

Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Pro Gly Gin 50 55 60

Thr Phe Arg Gly Pro Asp Met Thr lie Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly 65 70 75 80

Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu 85 90 95

Pro Gin Asn Ala Ser Leu lie Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gin Asp 100 105 110

He Leu Ala Ala lie Pro Ala Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val lie 115 120 125

Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys 130 135 140

Asp lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Ala Gin His Pro 145 150 155 160

Asp Trp Pro Ala Pro Gin Val Glu Ala Val Ala Gin Asp Gin Phe Gin 165 170 175

Gly Ala Ala Arg Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Arg Ala 180 185 190

Leu Arg Pro Arg Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr 195 200 205

Asn Tyr Asp Phe Leu Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Ser Gly 210 215 220 lie Arg Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg 225 230 235 240

Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Met Pro Ala Val Leu Glu Gly Thr Gly 245 250 255 第34頁 200950803

Lys Ser Gin Met Tyr Val Gin His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val 260 265 270

Ala Val Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Val Gin 275 280 285 lie Phe Tyr Asp Thr Thr Asn His Phe Leu Pro Leu Asp Glu Leu Glu 290 295 300

His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Val Val Leu 305 310 315 320

Trp Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie 325 330 335

Lys Glu Tyr Met A;sp Thr Thr Leu Gly Pro Phe lie Leu Asn Val Thr 340 345 350

Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gin Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg 355 、 360 365

Cys Val Arg Arg Thr Ser His Pro Lys Ala Leu Leu Leu Leu Asn Pro 370 375 380

Ala Ser Phe Ser lie Gin Leu Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Leu 3S5 390 395 400

Arg Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gin Ala Gin Met Ala Val Glu Phe 405 410 415

Lys Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Trp Gin Ala Pro Trp Cys Glu Arg Lys 420 425 430

Ser Met Trp 435

<210> 37 <211> 473 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>玻尿酸酶-2[前驅體] <400> 37

Met Arg Ala Gly Pro Gly Pro Thr Val Thr Leu Ala Leu Val Leu Ala 15 10 15

Val Ala Trp Ala Met Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30

Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asp Val Pro Thr Gin Asp Cys Gly 35 40 45

Pro Arg Leu Lys Val Pro Leu Asp Leu Asn Ala Phe Asp Val Gin Ala 50 55 60

Ser Pro Asn Glu Gly Phe Val Asn Gin Asn lie Thr lie Phe Tyr Arg 65 70 75 80

Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ser Ala Gly Arg Ser Val 85 90 95

His Gly Gly Val Pro Gin Asn Val Ser Leu Trp Ala His Arg Lys Met 100 105 110

Leu Gin Lys Arg Val Glu His Tyr lie Arg Thr Gin Glu Ser Ala Gly 115 120 125

Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Asp Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140

Trp Gin Asp Lys Asp Val Tyr Arg Arg Leu Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160

Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Pro Asp Arg lie Val Lys Gin Ala Gin 165 170 175

Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Gin Gin Phe Met Leu Glu Thr Leu Arg ISO 185 190

Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Arg His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205

Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu Ser Tyr Thr 210 215 220

Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Arg Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240

Leu Trp Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Glu 245 250 255

Thr Leu Ala Ser Ser Arg His Gly Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg Val 260 265 270

Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala Arg Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 280 285

Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Ser Arg Arg Leu Thr Gly 290 295 300

Leu Ser Glu Met Asp Leu lie Ser Thr lie Giy Glu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320

Gly Ala Ala Gly Val lie Leu Trp Gly Asp Ala Gly Tyr Thr Thr Ser 第35頁‘ 200950803 ^ 325 330 335

Thr Glu Thr Cys Gin Tyr Leu Lys Asp Tyr Leu Thr Arg Leu Leu Val 340 345 350

Pro Tyr Val Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Arg Ala 355 360 365

Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asn Pro Ser Ala Ser 370 375 380

Thr Phe Leu His Leu Ser Thr Asn Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly His 385 390 395 400

Ala Pro Gly Glu Pro Gin Leu Arg Pro Val Gly Glu Leu Ser Trp Ala 405 410 415

Asp lie Asp His Leu Gin Thr His Phe Arg Cys Gin Cys Tyr Leu Gly 420 425 430

Trp Ser Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asp His Arg Gin Ala Ala Gly Gly 435 440 445

Ala Ser Glu Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Ser Leu Leu Ala Leu 450 455 460

Ala Ala Leu Ala Phe Thr Trp Thr Leu 465 470 <210> 38 <211> 417 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223>玻尿酸酶-3[前驅體] <400> 38

Met Thr Thr Gin Leu Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Leu Cys 15 10 15

Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Pro Gin Val Pro Glu Arg Pro Phe Ser 20 25 30

Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala His Cys Glu Ala Arg Phe Gly Val 35 40 45

His Leu Pro Leu Asn Ala Leu Gly lie lie Ala Asn Arg Gly Gin His 50 55 60

Phe His Gly Gin Asn Met Thr lie Phe Tyr Lys Asn Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95

Gin Ala Leu Pro Leu Asp Arg His Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gin lie 100 105 110

His His Ser Leu Arg Pro Gly Phe Ala Gly Pro Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125

Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Arg Ala 130 135 140

Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Val Phe Pro Asp Leu 145 150 155 160

Asp Pro Gin Glu Gin Leu Tyr Lys Ala Tyr Thr Gly Phe Glu Gin Ala 165 170 175

Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Val Ala Gin Ala Leu Arg 180 185 190

Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205

Trp His Ser Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Arg Cys His Ala Ala Thr 210 215 220

Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu His Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240

Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala His His 245 250 255

Gin Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 270

Val Gly His Arg His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu Thr 275 280 285

His Arg Arg Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Asp Leu Val Gin Ser 290 295 300 lie Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala A】a Gly Val Va】Leu Trp Gly 305 310 315 320

Asp Leu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His Asp 325 330 335

Tyr Leu Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Arg Ala 340 345 350

Ala Met Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala 355 360 365 第36頁 200950803

Arg Arg Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Trp Pro Asp 370 375 380

Gly Ser Leu Gly Asp Trp Lys Ser Phe Ser Cys His Cys Tyr Trp Gly 385 390 395 400

Trp Ala Gly Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Pro Gly Pro Lys Glu Ala 405 410 415

Val <210〉 39 <211> 481 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223>玻尿酸酶-4 <400> 39

Met Lys Val Leu Ser Glu Gly Gin Leu Lys Leu Cys Val Val Gin Pro 15 10 15

Val His Leu Thr Ser Trp Leu Leu lie Phe Phe lie Leu Lys Ser lie 20 25 30

Ser Cys Leu Lys Pro Ala Arg Leu Pro lie Tyr Gin Arg Lys Pro Phe 35 40 45

lie Ala Ala Trp Asn Ala Pro Thr Asp Gin Cys Leu lie Lys Tyr Asn 50 55 60

Leu Arg Leu Asn Leu Lys Met Phe Pro Val lie Gly Ser Pro Leu Ala 65 70 75 80

Lys Ala Arg Gly Gin Asn Val Thr lie Phe Tyr Val Asn Arg Leu Gly 85 90 95

Tyr Tyr Pro Trp Tyr Thr Ser Gin Gly Val Pro lie Asn Gly Gly Leu 100 105 110

Pro Gin Asn lie Ser Leu Gin Val His Leu Glu Lys Ala Asp Gin Asp 115 120 125 lie Asn Tyr Tyr lie Pro Ala Glu Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val lie 130 135 140

Asp Trp Glu Tyr Trp Arg Pro Gin Trp Ala Arg Asn Trp Asn Ser Lys 145 150 155 160

Asp Val Tyr Arg Gin Lys Ser Arg Lys Leu lie Ser Asp Met Gly Lys 165 170 175

Asn Val Ser- Ala Thr Asp lie Glu Tyr Leu Ala Lys Val Thr Phe Glu 180 185 190

Glu Ser Ala Lys Ala Phe Met Lys Glu Thr lie Lys Leu Gly lie Lys 195 200 205

Ser Arg Pro Lys Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Tyr Pro Asp Cys His 210 215 220

Asn Tyr Asn Val Tyr Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Ser Cys Pro Glu Asp 225 230 235 240

Glu Val Leu Arg Asn Asn Glu Leu Ser Trp Leu Trp Asn Ser Ser Ala 245 250 255

Ala Leu Tyr Pro Ser lie Gly Val Trp Lys Ser Leu Gly Asp Ser Glu 260 265 270

Asn lie Leu Arg Phe Ser Lys Phe Arg Val His Glu Ser Met Arg lie 275 280 285

Ser Thr Met Thr Ser His Asp Tyr Ala Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr 290 295 300

Arg Leu Gly Tyr Arg Asp Glu Pro Leu Phe Phe Leu Ser Lys Gin Asp 305 310 315 320

Leu Val Ser Thr lie Gly Glu Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly lie 325 330 335

Val He Trp Gly Asp Met Asn Leu Thr Ala Ser Lys Ala Asn Cys Thr 340 345 350

Lys Val Lys Gin Phe Val Ser Ser Asp Leu Gly Ser Tyr lie Ala Asn 355 360 365

Val Thr Arg Ala Ala Glu Val Cys Ser Leu His Leu Cys Arg Asn Asn 370 375 380

Gly Arg Cys lie Arg Lys Met Trp Asn Ala Pro Ser Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Ala Ser Tyr His lie Glu Ala Ser Glu Asp Gly Glu Phe Thr 405 410 415

Val Lys Gly Lys Ala Ser Asp Thr Asp Leu Ala Val Met Ala Asp Thr 420 425 430

Phe Ser Cys His Cys Tyr Gin Gly Tyr Glu Gly Ala Asp Cys Arg Glu 435 440 445 lie Lys Thr Ala Asp Gly Cys Ser Gly Val Ser Pro Ser Pro Gly Ser 第37頁 200950803 450 455 460

Leu Met Thr Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ser Tyr Arg Ser lie Gin 465 470 475 480

Leu <210> 40 <211> 467 <212〉 PRT <213>智慧人 <220> <223> sHuPH20前驅體 1-467 <400> 40

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val

130 135 HO lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380 _

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Fhe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala 465 第38頁 200950803 <210> 41 <211> 477 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> sHuPH20前驅體 1-4Ή <400> 41

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser GIu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly He Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val G3n Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Tip Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Sex Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 465 470 475 <210〉 42 <211> 478 第39頁 200950803 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> sHuPH20前驅體 1-478 <400> 42

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Vai Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 465 470 475 <210> 43 <211> 479 <212> PRT <213>智慧人第40頁 <220> 200950803 <223> sHuPH20前驅體 1-479 <400> 43

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Gla Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Fhe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin 465 470 475 <210〉 44 <211〉 480 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> sHuPH20前驅體 1-480 <400> 44 第41頁 200950803

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Fhe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Aia Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480 <210> 45 <211> 481 <212〉 PRT <213>智慧人 <220> <223> sHuPH20前驅體 1-481 <400> 45

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30 第42頁 200950803

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Fhe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 I3e Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Atg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 21〇 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 . 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys Ue Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Set Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Phe <210> 46 <211> 483 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223> sHuPH20前驅體 1-483 <400> 46

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45 第43頁 200950803

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Prd Gin lie 465 470 475 480

Phe Tyr Asn <210〉 47 <211> 432 <212> PRT <213>智慧人 <220〉 <223> sHuPH20成熟36·467 <400> 47

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 第44頁 200950803

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Ττρ Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 2i〇 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430 <210> 48 <211> 448 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> sHuPH20^36-483 <400> 48

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45

Thr Gly Gin Gly Val Thx lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60

Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80

Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu As-p Lys AJa Lys Lys Asp lie 85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140 第45頁 200950803

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160

Giy Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175

Pro Asn His Leu Ttp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Set Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Scr Lys lie 245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270

Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 2^5 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300

Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335

Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400

Scr Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445 <210〉 49 <211> 1446 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223>編碼可溶性rHuPH20「前驅髖」之DNA <400> 49 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagea 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagee actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagaettgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatett 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaageae tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac teageagtet cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgeatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgegaag tatgaaatet tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgeagetg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaage tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctac 1446 第46頁 200950803 <210> 50 <211> 509 <212> PRT <213>智慧人 <220> <223> PH20變異體P48A <400> 50

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Ala 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285

Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335

Val lie Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val 485 490 495

Ser lie Leu Phe Leu lie He Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 51 第47頁 200950803 <211> 509 <212> PRT <213>智慧人 <220>

<223>前驅PH20變異體L499W <400> 51

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60

Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110

Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125

Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175

Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240

Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285

Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300

Arg Ile Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335

Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile lie Asn 355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380

Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460

Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin Ile 465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495

Ser Ile Trp Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 52 第48頁 200950803 <211> 6630 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HZ24載體 <400> 52 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080

catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgagc ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagt 1380 aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 gaaagacatt acattttata tgccagtaga caatttggga atggctgtta ttgactggga 1500

agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 tattgaattg gttcagcaac aaaatgtaca acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc 1620 aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat 2220 aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcaac ccagataatt ttgctattca 2280 acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg tggaaaaccg acacttgaag acctggagca 2340 attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga 24(X) tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa 2520 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2580 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2700 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 2820 ctctgcggcc aaaagcoacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2940 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 第49頁 200950803 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5100 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5220 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5400 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5460 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5520 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5640 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5700 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5820 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagascgca gataccaaat actgttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6480 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6540 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 ggccttttgc tcacatggct cgacagatct 6630 <210〉 53 <211> 186 <212> PRT <213>小鼠 <220> <223>二氫葉酸還原酶 <400> 53

Val Arg Pro Leu Asn Cys lie Val Ala Val Ser Gin Asn Met Gly lie 15 10 15

Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe Lys 20 25 30

Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gin Asn 35 40 45

Leu Val lie Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys Asn 50 55 60

Arg Pro Leu Lys Asp Arg lie Asn lie Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys 65 70 75 80

Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala 85 90 95

Leu Arg Leu lie Glu Gin Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Met Val 100 105 110

Trp lie Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gin Glu Ala Met Asn Gin Pro 115 120 125

Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg lie Met Gin Glu Phe Glu Ser 130 135 140

Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro 145 150 155 160

Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gin Glu Glu Lys Gly lie Lys 第50頁 200950803 165 170 175

Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185 <210〉 54 <211> 6

<212> PRT <213> His人工序列 <220> <223> His標籤 <400> 54

His His His His His His <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220>

<223> Flag標籤 <400> 55

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys <210> 56 <211> 1449 <212> DNA <213>智慧人 <220> <223> Gen2 mRNA序列 <400> 56 atggga£t£c taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctucatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag tcaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaattti attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctactga 1449 第51頁

Claims

200950803 , 七、申請專利範圍： 1·—種組合物，其包含免疫球蛋白（IG)及玻尿酸酶，其中：該組合物經調配以用於皮下投藥；且該組合物中之IG量實質上與當以相同給藥攝生法靜脈内投予時之量相同。 2.如申請專利範圍第1項之組合物，其申該劑量攝生法為以不超過每月一次之給藥頻率投予。 Φ 3.如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物中之玻尿酸酶之量為足以達成以不超過一月一次所投予之劑量皮下投予該IG之量。 4.如申請專利範圍第1項之組合物，其令該組合物中之 IG及玻尿酸酶經調配以用於多劑量投藥。 5 ·如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物中之免疫球蛋白（IG)及玻尿酸酶經調配以用於一月一次單一劑量投藥。 6. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中之 IG 為或約為 5 公克（g) 、l〇g、15g、20g、21 g、22g、 23 g、24 g、25 g、26 g、27 g、28 g、29 g、30 g、31 g、 32 g、33 g、34 g、35 g、36 g、37 g、38 g、39 g 或 40 g。 7. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物中之玻尿酸酶為或約為10單位至500,000單位、1〇〇單位至 100,000單位、500單位至50,000單位、1〇〇〇單位至1〇,〇〇〇單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位、 200950803 或丨，000單位至10,000單位。 8 ‘士申叫專利範圍第5項之組合物’其中該組合物為液體且液體體積為或約為10〇 ml、150 m卜200 ml、300 ml、 400 m 卜 500 d、600 ml 或 7〇〇 ml。 9·如申叫專利範圍第5項之組合物’其中該組合物中之玻尿酸酶之量係呈等於或約為1〇υ/公克（g) 、2〇 u/g、 U/g 35 U/g、40 U/g、50 U/g、60 U/g、70 U/g、80 U/g、 90 U/g ' loo U/g ' 15〇 u/g、或 3〇〇 u/g 之比率（玻尿酸酶之單位數/IG之公克數）。 1 〇.如申叫專利範圍弟9項之組合物，其中該組合物中之玻尿酸酶係以等於或約為5〇u/gIG之比率投予。 Π·如申請專利範圍第i項之組合物’其中該組合物中之玻尿酸酶為PH20或其截短形式。 12. 如申凊專利範圍第丨丨項之組合物，其中該係選自由綿羊、牛或截短型人類PH20。 13. 如申請專利範圍第12項之組合物，其中該截短型人類PH20係選自由具有SEQidn〇:4_9中任一者中所闡明之胺基酸序列之纽或其對偶基因變異體或其他變異體。 14. 如申請專利範圍第u項之組合物，其中該玻尿酸酶指定為rHuPH20。 15. 如申請專利範圍帛i項之組合物，其中該組合物中之IG係自人類血漿所純化。 16. 如申請專利範圍第15項之組合物，其中該組合物中之自人類血漿所純化之IG係藉由醇分餾來純化。 200950803 申明專利範圍第1 6項之組合物，其中該組合物中、藉由以下各者中之任一或多者來進一步純化：化學修飾在胃蛋白酶存在或不存在之情況下在ΡΗ4.0下培育、聚乙二醇f P p r、、）沈澱、離子交換層析、酶促裂解、溶劑、、主潔劑處理、透濾或超濾。 β 18·如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物中之1G含有IgG、私及IgM。 19_如申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物中之IG含有大於95%之IgG。如申叫專利範圍第i9項之組合物，其中該lgG為體。如申請專利範圍帛丄項之組合物，其中該組合物中之IG進一步含有蛋白穩定賦形劑。 φ .如申印專利範圍第21項之組合物，其中該蛋白穩定職形劑係選自由甘胺酸、麥芽糖、多元醇、人血清白蛋白、甘露醇、及非離子型清潔劑中之-或多者。 23 ·如申D月專利粑圍帛！項之組合物，其中該組合物中 IG製劑之pH等於或約為4.2至5 4、4 6至51或u至 5.0。 24·如_ μ專利範圍帛1項之組合物，其中該組合物中 G具有為或約為iG組合物之5%至15% w/v、6%至15% w/v、或8%至12% w/v之蛋白質濃度。 25·如申明專利範圍帛24項之組合物，其中該蛋白質濃度為 10% w/v。 200950803 1項之組合物，其為液體。 1項之組合物，其中該IG及玻尿 I 1項之組合物’其中該IG及玻尿 26·如申請專利範圍第 27·如申請專利範圍第酸酶係處於單一組合物中 28·如申請專利範圍第酸酶係經分開調配。 29’種如申請專利範圍第1 -28項中任一項之組合物之用途’其用於調配供治療個體之IG可治療性疾病或病狀之醫藥品。虫申印專利範圍第29項之用途，其中該ig可治療性疾病或病狀係選自由免疫缺乏症；血液惡性腫瘤繼發之後天低7球蛋白血症；川崎氏病（Kawasaki，s disease );慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病（CIDp );格巴二氏症候群（Guillain-Barre Syndr〇me );特發性血小板減少性紫癜；發炎性肌病；蘭伯特_伊頓肌無力症候群（Lanibert Eat〇n myasthenic syndrome );多灶性運動神經病；重症肌無力；莫氏/夭特曼症候群（Moersch-Woltmann syndrome);繼發陡低T球蛋白血症（包括醫原性免疫缺乏症）；特異性抗體缺乏；急性播散性腦脊髓炎；ANCA陽性全身壞死性脈管炎，自體免疫溶血性貧血；大水皰性天疱瘡樣病；瘢痕性天疱瘡樣病；伊文氏症候群（Evans syndrome )(包括具有免疫性血小板減少症之自體免疫溶血性貧血）；母胎/新生兒同種免疫性jk小板減少症（F〇et〇-matenial/neonatal alloimmune thrombocytopenia , FMAIT/NAIT ):噬血細胞症候群（Haemophagocytic syndrome );高風險同種異體造 200950803 血幹細胞移植’· IgM 副蛋白血症神經病（igjyf paraproteinaemic neuropathy);腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調；落葉型天疱瘡；尋常天疱瘡；輸血後紫癜；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群（Toxic epidermal necrolysis/Steven Johnson syndrome» TEN/SJS) ’ 中毒性休克症候群；阿耳滋海默氏病（Alzheimer Disease );全身性紅斑狼瘡；多發性骨髓瘤；膿毒病；b 細胞腫瘤；創傷；及細菌、病毒或真菌感染。

3 1.如申請專利範圍第30項之用途，其中該IG可治療性疾病或病狀為免疫缺乏症且該免疫缺乏症係選自由常見變異性免疫缺乏症（CVID )、先天性無γ球蛋白血症、維斯科特-奥爾德裏奇症候群（Wiskott-Aldrich syndrome)、嚴重複合型免疫缺乏症（SCID )、原發性低^球蛋白血症、具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏疾病、x_連結無7球蛋白血症（XLA )、嬰兒期低r球蛋白血症、及無抗體之副腫瘤性小腦變性。 32·如申請專利範圍第30項之用途，其中該IG可治療性疾病或病狀為血液惡性腫瘤繼發之後天低r球蛋白血症且该金液惡性腫瘤係選自由慢性淋巴細胞性白血病 (CLL )、多發性骨髓瘤（mm )及非霍奇金氏淋巴瘤 (n〇n-H〇dgkin's lymphoma ’ NHL)。 33如申請專利範圍第30項之用途，其中該IG可治療疾病或病狀為發炎性肌病且該發炎性肌病係選自由多發肌乂、皮肌炎及包涵體肌炎。 200950803 34. 如申請專利範圍第3〇項之用途，其中該ig可治療性疾病或病狀為細菌、病毒或真菌病狀且該細菌、病毒或真@1病狀係選自由B型流感嗜血桿菌（ influenzae ) 、A型及B型綠膿桿菌（⑽5： cterMgfwosiz)、金黃色葡萄球菌（ aureus )、 B 群鏈球菌（streptococcus) 、1 型、3 型、4 型、6 型、7 型、8型、9型、12型、14型、18型、19型及23型肺炎鏈球菌（、2 型及 5 型腺病毒、 .<·田胞巨大病 t、EB 病毒 VCA (Epstein Barr virus VCA)、 A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、疱疹單純型病毒_丨、疱疹單純型病毒-2、A型流行性感冒、麻疹、1型、2型及3型副流行性感冒 '脊髓灰質炎、水痘帶狀疱疹病毒（Varicella zoster virus)、麴菌（及白色念珠菌（Cfl滅心 albicans) 〇 35. —種如申請專利範圍第卜28項中任一項之醫藥組合物’其用於治療個體之IG可治療性疾病或病狀。 36·如申請專利範圍第35項之醫藥組合物，其中該ig 可治療性疾病或病狀係選自由免疫缺乏症；血液惡性腫瘤繼發之後天低^球蛋白血症；川崎氏病；慢性發炎性趙鞠脫失多發性神經病（CIDP);格巴二氏症候群；特發性血小板減少性紫癜；發炎性肌病；蘭伯特·伊頓肌無力症候群；多灶性運動神經病；重症肌無力；莫氏-沃特曼症候群；繼發性低7球蛋白血症（包括醫原性免疫缺乏症）；特異性抗體缺乏；急性播散性腦脊髓炎；ANCA陽性全身壞死性脈 200950803 ’ f炎；自體免疫溶血性貧血；大水皰性天癌瘡樣病；瘢痕性天疱瘡樣病；伊文氏症候群（包括具有免疫性血小板減少症之自體免疫溶血性貧血母胎/新生兒同種免疫性血小板減少症UMAIT/NAIT);喧血細胞症候群；高風險同種異體造血幹細胞移植；IgM副蛋白血症神經病；腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調；落葉型天疱瘡；尋常天疱瘡，輸血後紫癜；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群（TEN/S JS );中毒性休克症候群；阿耳滋海默氏病；全身性紅斑狼瘡；多發性骨髓瘤；膿毒病；B細胞腫瘤；創傷；及細菌、病毒或真菌感染。 37.如申請專利範圍第36項之醫藥組合物，其中該可治療性疾病或病狀為免疫缺乏症且該免疫缺乏症係選自由常見變異性免疫缺乏症（CVID)、先天性無^^球蛋白血症 '維斯科特-奥爾德裏奇症候群、嚴重複合型免疫缺乏症 (SCID )、原發性低r球蛋白血症、具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏疾病、χ-連結無γ球蛋白血症（XLA )、嬰兒冑低r球蛋白血症、及無抗體之副腫瘤性小腦變性。 3 8 _如申凊專利範圍第3 6項之醫藥組合物，其中該ig 可/σ療性疾病或病狀為血液惡性腫瘤繼發之後天低7球蛋白血症且該灰液惡性腫瘤係選自由慢性淋巴細胞性白血病 (CLL )、多發性骨髓瘤（ΜΜ )及非霍奇金氏淋巴瘤（NHL )。 39.如令請專利範圍第36項之醫藥組合物，其中該可，台療性疾病或病狀為發炎性肌病且該發炎性肌病係選自由多發性肌炎、皮肌炎及包涵體肌炎。 200950803 4〇_如申請專利範圍第％項之醫藥組合物其中該扣了:療性疾病或病狀為細菌、病毒或真菌病狀且該細菌、病毒或真菌病狀係選自由B型流感嗜血桿菌、…型綠膿杯菌金黃色葡萄球菌、B群鏈球菌、1型、3型、4型、 6型、7型、8也丨、Q开丨！ 1 i、12型、14型、18型、19型及23 里肺炎鏈球菌、2型及5型腺病毒、細胞巨大病毒、EB病 A A 3L肝炎病毒、B型肝炎病毒、疱疹單純型病毒_ 1、疮療單純型病毒_2、a型流行性感冒 '麻m2型及 3型副流行性感冒、脊髓灰質炎、水痘帶狀疱疹病毒 '麴菌及白色念珠菌。 41.一種組合物之纽合，其包含：第一組合物，其包含經調配以用於治療IG可治療性疾病之量不超過每月—次皮下單一劑量投藥之IG;及第一組a物’其包含經調配以用於不超過每月一次單劑量投藥而與該IG組合用於該治療之可溶性玻尿酸酶。 2 · 士申月專利範圍第4 1項之組合，其中該等組合物係處於雙腔室容器中或處於彼此分離之單個容器中。 43.如申青專利範圍第42項之組合，其中該玻尿酸酶係位於供在該IG之前投藥的容器中。 44·如申請專利範圍第42項之組合，其中該容器為注射器、管或瓶。 45.如申π專利範圍第44項之組合，其中該容器進一步包含注射用針。專利範圍第41項之組合，其中該可溶性玻尿 200950803 酸酶為PH20或其截短形式。 47·如申請專利範圍第耗白士砼、，丄項、口头中該PH20係選自由綿平、牛或截短型人類PH20 » 如申請專利範圍第47 合， ΡΗ7Π ^ , /、甲邊戴短型人類 PH20係選自由具有SEQidn〇 4 並故产有宁所闡明之胺基酸序列之多肽或其對偶基因變異體或其他變異體。

49.如申請專利範圍帛41項之組合，其中該可酸酶指定為rHuPH2〇e 50·如申請專利範圍第41項之組合’其中該阳係自人類血漿所純化。 51. 如申請專利範圍第41項之組合，其中該扣係經冷凉乾燥或於液體中提供。 52. 如申請專利範圍第51項之組合，其中液體體積為或約為 100 HU、150 加、200 m 卜 3〇〇 w、4〇〇 ml、5〇〇 mi、 6〇〇 ml 或 700 ml。 53 如申請專利範圍第4 1項之組合，其中該具有為或約為IG組合物之5%至15% w/v、6%至15% w/v、或8% 至12〇/ow/v之蛋白質濃度。 54.如申請專利範圍第53項之組合，其中該蛋白質濃度為 10% w/v 〇 55.如申請專利範圍第41項之組合，其中該組合物中之 IG 為或約為 5 公克（g) 、10 g、15 g、20 g、21 g、22g、 23 g、24 g、25 g、26 g、27 g、28 g、29 g、30 g、31 g、 3 2 g、33 g、34 g、35 g、36 g、37 g、38 g、39 g 或 40 g。 9 200950803 56. 如申請專利範圍第41項之組合，其中該玻尿酸酶係於液體中提供。 57. 如申請專利範圍第56項之組合，其中液體體積為或約為 1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml、8 ml、9 m卜10 m卜20 ml或30 m卜 58. 如申請專利範圍第4i項之組合，其中該玻尿酸酶為或約為10單位至500 000單位、1〇〇單位至1〇〇〇〇〇單位、 500單位至50,〇〇〇單位、loo。單位至1〇,〇〇〇單位' 5〇〇〇早位至7500單位、5000單位至5〇〇〇〇單位或1〇〇〇單位至10,000單位。 59. —種套組，其包含如申請專利範圍第4ΐ·58項中任 —項之組合或如申請專利範圍第丨_28項中任一項之組合物且視情況包含用於治#IG可治療性疾病或病狀之使用說明書。八、圖式：無 10