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MX2010009478A - Combinaciones y metodos para administracion subcutanea de inmunoglobulina y hialuronidasa. - Google Patents

Combinaciones y metodos para administracion subcutanea de inmunoglobulina y hialuronidasa.

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MX2010009478A
MX2010009478A MX2010009478A MX2010009478A MX2010009478A MX 2010009478 A MX2010009478 A MX 2010009478A MX 2010009478 A MX2010009478 A MX 2010009478A MX 2010009478 A MX2010009478 A MX 2010009478A MX 2010009478 A MX2010009478 A MX 2010009478A
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MX
Mexico
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hyaluronidase
administration
units
administered
disease
Prior art date
Application number
MX2010009478A
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MX339658B (es
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Heinz Leibl
Gregory I Frost
Richard Schiff
Original Assignee
Baxter Healthcare Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by Baxter Healthcare Sa filed Critical Baxter Healthcare Sa
Publication of MX2010009478A publication Critical patent/MX2010009478A/es
Publication of MX339658B publication Critical patent/MX339658B/es

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Abstract

Se proporcionan combinaciones, composiciones y equipos que contienen una composición de inmunoglobulina (IG) y una composición de hialuronidasa soluble formulada para administración subcutánea. Dichos productos pueden ser usados en métodos de tratar enfermedades o condiciones tratables con IG. También se proporcionan métodos para administración subcutánea de inmunoglobulina, con los cuales el régimen de dosificación es sustancialmente el mismo que para administración intravenosa de la misma dosificación para tratamiento de la misma enfermedad o condición tratable con IG.

Description

COMBINACIONES Y METODOS PARA ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA DE INMUNOGLOBULINA Y HIALURONIDASA CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan combinaciones, composiciones y equipos que contengan una composición de inmunoglobulina (IG) y una composición de hialuronidasa soluble formulada para administración subcutánea. Dichos productos pueden ser usados en métodos de tratar condiciones o enfermedades tratables con IG. También se proporcionan métodos para administración subcutánea de inmunoglobulinas con los cuales el régimen de dosificación es sustancialmente el mismo que para administración intravenosa de la misma dosificación para tratamiento de la misma enfermedad o condición tratable con IG.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La administración intravenosa (IV) de inmunoglobulina (IVIG, siglas del inglés IntraVenous Immune Globuline) es el tratamiento primario de individuos con deficiencias inmunes. Aunque las preparaciones iniciales de IVIG causaron severos efectos secundarios, las preparaciones de IVIG disponibles actualmente son bien toleradas en la mayoría de pacientes inmunodeficientes . No obstante, una pequeña proporción de pacientes continúa teniendo reacciones desagradables, aún inhabilitadoras , como jaqueca, fatiga, y mialgia. Fiebre y escalofríos permanecen siendo un problema, especialmente cuando los pacientes tienen infecciones intercurrentes . Las reacciones, a menudo persisten a pesar de intentar otras preparaciones de IVIG o pre-medicar con acetaminofeno, difenhidramina, y corticoesteroides .
Adicionalmente, debido al requerimiento por la administración IV, existen resultados con la aceptación de pacientes.
La administración subcutánea (SC) de inmunoglobulina es una alternativa a la administración intravenosa. Comparada con infusiones IV, la administración SC de inmunoglobulina tiene varias ventajas. Por ejemplo, reduce la incidencia de reacciones generalizadas, no requiere acceso IV algunas veces difícil, mejora los niveles mínimos, y da a los pacientes más independencia. A causa de la dificultad en administrar grandes cantidades de fluido en un solo sitio, es necesario hacer infusiones SC una o dos veces por semana, usando dos o tantos como 5 sitios a la vez. Así, a diferencia de IVIG, el cual es dado una vez al mes, la administración subcutánea es hecha usualmente semanalmente . Por consiguiente, hay una necesidad por métodos alternativos para administrar inmunoglobulina.
SUMARIO DE LA INVENCION Se proporcionan en la presente métodos, composiciones, combinaciones y equipos para administración subcutánea de inmunoglobulina y para tratar condiciones o enfermedades tratables con IG. Se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o condición tratable con IG en un sujeto administrando subcutáneamente al sujeto hialuronidasa soluble y una inmunoglobulina (IG) para tratar la enfermedad o condición. La co-administración de IG y hialuronidasa incrementa la biodisponibilidad de IG administrada subcutáneamente para permitir la administración de IG subcutáneamente usando un régimen de dosificación sustancialmente igual a la administración intravenosa de IG (IVIG) para la enfermedad o condición particular. La administración de la IG es efectuada de modo que la cantidad administrada y la frecuencia de la administración es sustancialmente la misma que para administración IV (intravenosa) de la misma cantidad vía IV para la misma enfermedad o condición. La cantidad administrada via IV puede ser pre-determinada o es conocida para una enfermedad o condición. Típicamente, en la presencia de una hialuronidasa soluble, para administración subcutánea, la velocidad de administración puede ser mayor que para administración IV.
Por consiguiente, el tiempo para administración de una dosis particular puede ser reducido. La velocidad de administración puede ser controlada, por medio de una bomba o puede efectuarse por gravedad.
Asi, entre los métodos proporcionados están métodos para tratar una enfermedad o condición tratable por IG en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento por administración subcutánea al sujeto de una hialuronidasa soluble y una cantidad de inmunoglobulina (IG) efectiva para tratar la enfermedad o condición. La administración es efectuada con un régimen de dosificación en el cual: (a) una cantidad de IG; y (b) una frecuencia de dosificación para administraciones sucesivas de IG al sujeto son seleccionadas de modo que el efecto terapéutico de la administración subcutánea de IG en el sujeto es al menos sustancialmente equivalente a la administración intravenosa de la IG al sujeto usando el mismo régimen de dosificación.
En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente, la biodisponibilidad de la IG administrada subcutáneamente es al menos de aproximadamente 90 % de la biodisponibilidad de la misma dosificación administrada vía administración IV. La cantidad de hialuronidasa soluble administrada puede ser suficiente para efectuar administración subcutánea de la IG a una dosificación administrada no más de una vez al mes. En otros ejemplos, la administración de IG no es más de una vez mensualmente .
La hialuronidasa soluble usada en los métodos proporcionados en la presente puede ser PH20 o una forma truncada de ésta. Por ejemplo, la hialuronidasa soluble puede ser una PH20 ovina o bovina o humana truncada. En casos en donde se usa una PH20 humana truncada en los métodos y usos proporcionados en la presente, la PH20 humana truncada puede ser seleccionada de entre polipéptidos que tengan una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 4-9, o variantes alélicas u otras variantes de éstas. En un ejemplo, la hialuronidasa soluble es rHuPH20.
La IG administrada usando los métodos y usos de la presente puede ser purificada a partir de plasma humano, como por fraccionamiento en medio alcohólico. En algunos ejemplos, la IG es adicionalmente purificada por medio de cualquiera de una o más de una modificación química, incubación a pH de 4.0 con o sin pepsina, precipitación con polietilenglicol (PEG), cromatografía por intercambio iónico, fraccionamiento enzimático, tratamiento con detergente como solvente, diafiltración o ultrafiltración . Los métodos y usos proporcionados en la presente pueden emplear IG que contenga IgG, IgA e IgM. En algunos ejemplos, la IG contiene más de 95 % de IgG. Adicionalmente, la IgG puede ser monomérica.
También pueden estar presentes en la IG excipientes estabilizantes de proteínas, como uno o más de glicina, maltosa, un poliol, albúmina de suero humano, manitol, y detergente no iónico. En algunos ejemplos, el pH de la preparación de IG está en o es de aproximadamente 4.2 a 5.4, 4.6 a 5.1 o 4.8 a 5.0, y la concentración de proteína es de aproximadamente 5 a 15 % en peso/volumen, 6 a 15 % en peso/volumen, u 8 a 12 % en peso/volumen de composición de IG. En un ejemplo, la concentración de proteínas de la IG es de 10 % en peso/volumen.
Se proporcionan en la presente métodos y usos para tratar una enfermedad o condición tratable por IG, en la cual hialuronidasa soluble y una inmunoglobulina (IG) para tratar la enfermedad o condición son administradas subcutáneamente, y la IG es infusionada a una velocidad de 10 mL/hr a 300 mL/hr, como en o aproximadamente 10 mL/hr, 20 mL/hr, 30 mL/hr, 40 mL/hr, 50 mL/hr, 60 mL/hr, 70 mL/hr, 80 mL/hr, 90 mL/hr, 100 mL/hr, 150 mL/hr, 200 mL/hr, 250 mL/hr y 300 mL/hr. La velocidad puede ser controlada por medio de una bomba o por gravedad. En algunos ejemplos, la IG y la hialuronidasa son administradas separada, simultánea o intermitentemente. Por ejemplo, la hialuronidasa puede ser administrada antes de administración de la IG, como 0.5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 20 minutos o minutos antes de la administración de la IG. En otros ejemplos, la IG y la hialuronidasa están en una composición individual. En ejemplos adicionales, aproximadamente o 5 gramos (g) , 10 g, 15 g, 20 g, 21 g, 22 g, 23 g, 24 g, 25 g, 26 g, 27 g, 28 g, 29 g, 30 g, 31 g, 32 g, 33 g, 34 g, 35 g, 36 g, 37 g, 38 g, 39 g o 40 g de IG son administrados, y la hialuronidasa es administrada en una proporción (unidades de hialuronidasa /gramos de IG) de o aproximadamente 10 U/gramo (g) , 20 U/g, 30, 35 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 300 U/g.
La hialuronidasa soluble y la IG pueden ser administradas usando los métodos y usos proporcionados en la presente para tratar, por ejemplo, inmunodeficiencia; hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas ; enfermedad de Kawasaki; polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP, siglas del inglés Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy ) ; Síndrome de Guillain-Barre ; púrpura trombocitopénica idiopática; miopatías inflamatorias; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; neuropatía motora multifocal; Miastenia Gravis; síndrome de Moersch-Woltmann; hipogamaglobulinemia secundaria (incluyendo inmunodeficiencia iatrogénica ) ; deficiencia de anticuerpos específicos; encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrosizante generalizada ANCA positiva; anemia hemolítica autoinmune; penfigoide hullosa; penfigoide cicatrizante; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítica autoinmune con trombocitopenia inmune) ; trombocitopenia feto-maternal/neonatal aloinmune ( FMAIT/NAIT, siglas del inglés Foeto-Maternal Allolmmune Thrombocytopenia/Neonatal Allolmmune Thrombocytopenia) ; síndrome hemofagocítico ; trasplante de células embrionarias hemopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatías para-proteinémicas de IgM; trasplante de riñon; esclerosis múltiple; ataxia de mioclonus opsoclonus; pénfigus foliáceo; pénfigus vulgaris; púrpura post-transfusión ; necrolisis epidérmica tóxica/síndrome de Steven Johnson (TEN/SJS, siglas del inglés Toxic Epidermal Necrolysis/Steven Johnson Syndrome) ; síndrome de choque tóxico; enfermedad de Alzheimer; lupus eritematoso generalizado; mieloma múltiple; sepsis; tumores de células B; traumatismo; y una infección bacteriana, viral o fúngica. En los casos en los que se administra IG y hialuronidasa para tratar una inmunodeficiencia , la inmunodeficiencia puede ser seleccionada de entre inmunodeficiencia variable común (CVID, siglas del inglés Common Variable ImmunoDeficiency ) , agamaglobulinemia congénita, síndrome de Wiskott-Aldrich, inmunodeficiencia combinada severa (SCID, siglas del inglés Severe Combined IramunoDeficiency) , hipogamaglobulinemia primaria, enfermedades por inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos, agamaglobulinemia congénita o ligada al cromosoma X (XLA, siglas del inglés X-Linked Agammaglobulinemia) , hipogamaglobulinemia de la infancia, y degeneración cerebélica paraneoplástica sin anticuerpos.
En casos en donde la enfermedad o condición tratable con IG es hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas , y la malignidad hematológica puede ser leucemia linfocitica crónica (CLL, siglas del inglés Chronic Lynphocytic Leukemia), mieloma múltiple (MM, siglas del inglés Múltiple Myeloma), o linfoma diferente al de Hodgkin (NHL, siglas del inglés Non-Hodgkin' s Lymphoma) . En casos en donde la enfermedad o condición tratable con IG es una miopatia inflamatoria, la miopatia inflamatoria puede ser polimiositis , dermatomiositis o miositis corporal por inclusión .
En algunos ejemplos, la hialuronidasa soluble y la IG son administradas subcutáneamente para tratar una condición bacteriana, viral o fúngica, como, por ejemplo Haemophilus influenzae de typo B, Pseudomonas aeruginosa de tipos A y B, Staphylococcus aureus, Streptococcus del Grupo B, Streptococcus penumoniae de los tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, y 23, Adenovirus de los tipos 2 y 5, Citomegalovirus , virus VCA de Epstein Barr, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus del herpes simplex 1, virus del herpes simplex 2, influenza A, sarampión, parainfluenza de tipos 1, 2 y 3, polio, virus de varicela zóster, Aspergillus y Candida albicans .
Se proporcionan en la presente combinaciones de composiciones, que contienen una primera composición que contiene IG formulada para administración subcutánea de dosificación individual no más de una vez al mes, y una segunda composición que contiene una hialuronidasa soluble formulada para administración de dosificación individual no más de una vez al mes. Las composiciones pueden estar en un contenedor de cámara dual o en dos contenedores individuales separados entre si. En algunos ejemplos, la hialuronidasa es posicionada en el contenedor para ser administrada antes de la IG. El contenedor puede ser una jeringa, tubo o botella, y puede contener adicionalmente una aguja para inyección.
Las combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente pueden contener PH20, o una forma truncada de ésta. Por ejemplo, PH20 ovina, bovina o humana truncada, como un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 4-9, o variantes alélicas u otras variantes de éstas, pueden ser incluidas en las combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente. En algunos ejemplos, la hialuronidasa soluble en la combinación es rHuPH20. Adicionalmente la IG en las combinaciones de composiciones puede ser purificada a partir de plasma humano y puede ser liofilizada o un liquido.
En algunos ejemplos, el volumen de liquido en las combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente es o es de aproximadamente 100 m, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL o 700 mL . La IG en las combinaciones de composiciones puede tener una concentración de proteínas que es o es aproximadamente de 5 a 15 % en peso/volumen, 6 a 15 % en peso/volumen, u 8 a 12 % en peso/volumen de composición de IG, como por ejemplo 10 % en peso/volumen. En algunos ejemplos, la IG en la composición es o es de aproximadamente 5 gramos (g) , 10 g, 15 g, 20 g, 21 g, 22 g, 23 g, 24 g, 25 g, 26 g, 27 g, 28 g, 29 g, 30 g, 31 g, 32 g, 34 g, 35 g, 36 g( 37 g, 38 g, 39 g, o 40 g. La hialuronidasa puede ser un líquido. En algunos ejemplos, el volumen de la hialuronidasa líquida es o es aproximadamente de 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 20 mL, o 30 mL, y la hialuronidasa está en o es aproximadamente de 10 Unidades a 500,000 Unidades, 100 Unidades a 100,000 Unidades, 500 Unidades a 50,000 Unidades, 1,000 Unidades a 10,000 Unidades, 5,000 Unidades a 7,500 Unidades, 5,000 Unidades a 50,000 Unidades 1,000 Unidades a 10,000 Unidades.
Se proporcionan en la presente composiciones que contienen inmunoglobulina (IG) y una hialuronidasa soluble formulada para una administración en dosificación unitaria una vez al mes. La hialuronidasa soluble contenida en la composición puede ser PH20, o una forma truncada de ésta. Por ejemplo, PH20 ovina, bovina, o humana truncada, como un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 4-9, o variantes alélicas u otras variantes de éstas, pueden ser incluidas en las composiciones formuladas para la administración en dosificación individual proporcionada en la presente. En algunos ejemplos, la hialuronidasa soluble en la composición es rHuPH20. La IG en las composiciones puede ser purificada a partir de plasma humano, y puede ser un liquido En modalidades ejemplares, la IG en las composiciones formuladas para administración en dosificación individual proporcionada en la presente tiene una concentración de proteínas que es o es de aproximadamente 5 a 15 % en peso/volumen, 6 a 15 % en peso/volumen, u 8 a 12 % en peso/volumen de la composición de IG, como por ejemplo, 10 % en peso/volumen. La IG en la composición es o es de aproximadamente 5 gramos (g) , 10 g, 15 g, 20 g, 21 g, 22 g, 23 g, 24 g, 25 g, 26 g, 27 g, 28 g, 29 g, 30 g, 31 g, 32 g, 33 g, 34 g, 35 g, 36 g, 37 g, 38 g, 39 g, 40 g, y la hialuronidasa es de o es de aproximadamente 10 Unidades a 500,000 Unidades, 100 Unidades a 100,000 Unidades, 500 Unidades a 50,000 Unidades, 1,000 Unidades a 10,000 Unidades, 5,000 Unidades a 7,500 Unidades, 5,000 Unidades a 50,000 Unidades o 1,000 Unidades a 10,000 Unidades. El volumen de liquido en la composición puede ser de aproximadamente 100 mL, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, o 700 mL.
Se proporcionan en la presente equipos que contienen combinaciones de composiciones, que contienen una primera composición que contiene IG formulada para administración en dosificación individual subcutánea no más de una vez al mes, y una segunda composición que contiene una hialuronidasa soluble formulada para administración en dosificación individual no más de una vez al mes. También se proporcionan en la presente composiciones que contienen inmunoglobulina (IG) y una hialuronidasa soluble formulada para administración en dosificación individual una vez al mes. Opcionalmente , pueden incluirse en los equipos, instrucciones .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Indice A. Definiciones B. Administración Subcutánea de Inmunoglobulina (IG) C . Inmunoglobulina D . Hialuronidasa PH20 Humana Soluble PH20 Recombinante Soluble (rHuPH20) E . Métodos de Producir Acidos Nucleicos que codifican a una Hialuronidasa Soluble y a Polipéptidos de Esta . 1. Vectores y Células 2. Expresión a. Células Procarióticas b . Células de Levaduras c . Células de Insectos d. Células de Mamíferos e. Plantas 3. Técnicas de Purificación F. Preparación, Formulación y Administración de Inmunoglobulinas y Polipéptidos de Hialuronidasa Soluble 1. Formulaciones Polvos liofilizados 2. Dosificación y Administración G. Métodos de Evaluar la Actividad, Biodisponibilidad y Farmacocinética 1. Farmacocinética y Tolerancia 2. Actividad Biológica a . Inmunoglobulina b. Hialuronidasa H . Usos Terapéuticos 1. Inmunodeficiencia Primaria con Deficiencia de Anticuerpos 2. Hipogamaglobulinemia Secundaria Adquirida en Malignidades Hematológicas 3. Enfermedad de Kawasaki 4. Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica 5. Síndrome de Guillain-Barre 6. Púrpura Trombocitopénica Idiopatica 7. Miopatías Inflamatorias: polimiositis , dermatomiositis y miositis corporal por inclusión 8. Síndrome Miasténico de Lambert-Eaton 9. Neuropatía Motora Multi-focal 11. Síndrome de Moersch- oltzmann 12. Enfermedad de Alzheimer 13. Otras Enfermedades y Condiciones I . Artículos de abricación y equipos J . Ejemplos .
A. DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que comprende comúnmente un experto en el arte al cual pertenece la invención. Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes y publicadas, publicaciones, secuencias de GenBank, bases de datos, sitios de red y otros materiales publicados mencionados en el transcurso de la descripción entera de la presente, a menos que se indique de otra manera, son íntegramente incorporadas como referencia. En el caso en el que haya una pluralidad de definiciones para términos en la presente, prevalecen los de esta sección. Donde se haga referencia a una URL u otro identificador o dirección tal, se comprende que dichos identificadores pueden cambiar y la información particular en la "internet" puede ir y venir, pero la información equivalente puede ser encontrada por búsqueda en "internet". Referencia a estas evidencias, la disponibilidad y diseminación pública de dicha información Como se usa en la presente, "inmunoglobulina", "globulina inmune", "gama globulina", se refieren a preparaciones de proteínas plasmáticas derivadas del plasma conjuntado de donadores adultos. Los anticuerpos IgG predominan; están presentes otras subclases de anticuerpos, como IgA e IgM. La inmunoglobulina terapéutica puede proporcionar inmunización pasiva al aumentar los niveles de suero del receptor de anticuerpos circulantes. Los anticuerpos IgG pueden, por ejemplo, enlazar a y neutralizar toxinas bacterianas; opsonizar patógenos; activar complemento; y suprimir citoquinas patógenas y fagocitos a través de la interacción con citoquinas y receptores de éstos, como CD5, interleuquina-la (IL-la) , interleuquina 6 (IL-6), factor de necrosis de tumor-alfa (TNF-alfa), y receptores de células T. Las inmunoglobulinas terapéuticas pueden inhibir la actividad de autoanticuerpos . Preparaciones de inmunoglobulina también incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulina intravenosa (IGIV), inmunoglobulina IV, inmunoglobulina terapéutica. Las preparaciones de inmunoglobulina son bien conocidas, e incluyen nombres comerciales, como BayGam®, Gamimune®N, Gammagard® S/D, Gamma®-P, Iveegam®EN, Panglobulin®, Polygam®S/D, Sandoglobulin®, Venoglobuün®-l, Venoglobulin®-S , WinRho®SDF y otros. Las preparaciones de inmunoglobulina pueden ser derivadas de plasma humano, o ser producidas de manera recombinante .
Como se usa en la presente enfermedades o condiciones tratables con IG se refiere a cualquier enfermedad o condición para la cual son usadas las preparaciones de inmunoglobulina. Dichas enfermedades y condiciones incluyen, pero no se limitan a, cualquier enfermedad en la cual un incremento en anticuerpos circulantes es mejoradora, como, por ejemplo, inmunodeficiencia , hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas ; enfermedad de Kawasaki; polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) ; Síndrome de Guillain-Barre ; púrpura trombocitopénica idiopática; miopatías inflamatorias; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; neuropatía motora multifocal; Miastenia Gravis; síndrome de Moersch-Woltmann ; hipogamaglobulinemia secundaria (incluyendo inmunodeficiencia iatrogénica) ; deficiencia de anticuerpos específicos; encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrosizante generalizada ANCA positiva; anemia hemolítica autoinmune; penfigoide hullosa; penfigoide cicatrizante; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítica autoinmune con trombocitopenia inmune) ; trombocitopenia feto-maternal /neonatal aloinmune ( FMAIT/NAIT ) ; síndrome hemofagocítico; trasplante de células embrionarias hemopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatías para-proteinémicas de IgM; trasplante de riñon; esclerosis múltiple; ataxia de mioclonus opsoclonus; pénfigus foliáceo; pénfigus vulgaris; púrpura post-transfusión; necrolisis epidérmica tóxica/síndrome de Steven Johnson (TEN/SJS); síndrome de choque tóxico; enfermedad de Alzheimer; lupus eritematoso generalizado; mieloma múltiple; sepsis; tumores de células B; traumatismo; y una infección bacteriana, viral o fúngica.
Como se usa en la presente, régimen de dosificación se refiere a la cantidad de inmunoglobulina administrada y a la frecuencia de administración. El régimen de dosificación es una función de la enfermedad o condición a ser tratada, y por consiguiente puede variar.
Como se usa en la presente, "sustancíalmente el mismo que un régimen de dosificación intravenosa de IG (IVIG)", se refiere a un régimen en el cual la dosis y/o la frecuencia está en una cantidad que es efectiva para tratar una enfermedad o condición particular, típicamente es de aproximadamente 0 10 %, de la dosis o frecuencia IV. Cantidades de IVIG que son efectivas para tratar una enfermedad o condición particular son conocidas o pueden ser determinada empíricamente por un experto en el arte. Por ejemplo, como se ejemplifica posteriormente, 300 mg/kg (es decir 21 gramos asumiendo los pesos del adulto promedio de 70 kg) a 600 mg/kg (es decir 42 gramos) es la dosis mensual típica de IVIG administrada a pacientes que tienen enfermedades por inmunodeficiencia . Por lo tanto, IG, cuando se administra en combinación con hialuronidasa , es administrada subcutáneamente a dosis que son o son aproximadamente 300 mg/kg a 600 mg/kg para el tratamiento de enfermedades por inmunodeficiencia primaria.
Como se usa en la presente, frecuencia de administración se refiere al tiempo entre dosis sucesivas de inmunoglobulina . Por ejemplo, frecuencia puede ser una, dos, tres, cuatro semanas, y es una función de la enfermedad o condición particular tratada. Generalmente, frecuencia es al menos cada dos o tres semanas, y típicamente no mas de una vez al mes.
Como se usa en la presente, hialuronidasa se refiere a una enzima que degrada el ácido hialurónico. Hialuronidasa incluye hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos, y crustáceos (EC 3.2.1.36), y hialuronidasas de tipo de mamífero (EC 3.2.1.35). Hialuronidasas también incluye cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitándose a, roedor, canino, felino, leprino, aviar, bovino, ovino, porcino, equino, de peces, de ranas, bacteriano, y de sanguijuelas, otros parásitos, crustáceos. Hialuronidasas no humanas ejemplares incluyen, hialuronidasas de vacas (SEC ID NO: 10 y 11) , avispa social del género vespa (SEC ID NOS: 12 y 13), abeja de miel (SEC ID NO: 14), avispón de cara blanca (SEC ID NO: 15), avispa papelera (SEC ID NO: 16), ratón (SEC ID NOS: 17-19, 32), cerdo (SEC ID NOS: 20-21), rata (SEC ID NOS: 22-24,31), conejo (SEC ID NO: 25), oveja (SEC ID NO: 26 y 27), orangután (SEC ID NO: 28), mono cynomolgus (SEC ID NO: 29), cobayo (SEC ID NO: 30), Staphylococcus aureus (SEC ID NO: 33) , Streptococcus pyogenes (SEC ID NO: 34), y Clostridium perfringens (SEC ID NO: 35). Las hialuronidasas también incluyen las de origen humano. Las hialuronidasas humanas ejemplares incluyen HYAL1 (SEC ID NO: 36), HYAL2 (SEC ID NO: 37), HYAL3 (SEC ID NO: 38), HYAL4 (SEC ID NO: 39), y PH20 (SEC ID NO: 1). También están incluidas entre las hialuronidasas las hialuronidasas solubles, incluyendo PH20 ovina y bovina, PH20 humana soluble y rHuPH20 soluble.
La referencia a hialuronidasas incluye polipéptidos de hialuronidasa precursores y polipéptidos de hialuronidasa maduros (como aquellos en los cuales una ha sido retirada una secuencia de señal), formas truncadas de éstos que tengan actividad, e incluye las variantes alélicas y especies variantes, variantes codificadas por variantes de empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos 40 %, 45 %, 50 , 55 %, 60 %, 65 %, 70 , 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en las SEC ID NOS: 1 y 10-39, o con la forma madura de éstos. Por ejemplo, la referencia ala hialuronidasa también incluye variantes del polipéptido precursor de PH20 humana expuestas en las SEC ID NOS: 50-51. Las hialuronidasas también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o post-traslacionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o post-translacionales. Dichas modificaciones incluye, pero no se limitan a, PEGilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en el arte.
Como se usa en la presente, una hialuronidasa soluble se refiere a un polipéptido caracterizado por su solubilidad bajo condiciones fisiológicas. Las hialuronidasas solubles pueden ser diferenciadas , por ejemplo, por su separación en la fase acuosa de una solución de Tritón X-114 calentada a 37 °C (Bordier y colaboradores, (1981) J. Biol. Chem. , 256:1604-7) . Fijadas a membrana, como hialuronidasas fijadas en lípido, se separarán en la fase rica en detergente, pero se separarán en la fase acuosa o pobre en detergente después de tratamiento con Fosfolipasa-C . Se incluyen entre las hialuronidasas solubles las hialuronidasas fijadas a membrana en las cuales una o más regiones asociadas con la fijación de la hialuronidasa a la membrana ha sido removida o modificada, donde la forma soluble retiene la actividad hialuronidasa. Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas solubles recombinantes y aquellas contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, como por ejemplo, extractos de testículo de oveja o vaca. Son ejemplares de hialuronidasas solubles la PH20 humana soluble. Otras hialuronidasas solubles incluyen PH20 ovina (SEC ID NO: 27) y bovina (SEC ID NO: 11).
Como se usa en la presente, PH20 humana soluble o sHuPH20 incluye los polipéptidos maduros que carecen de todos o de una porción del sitio de fijación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) en el terminus-C de modo que a partir de la expresión los polipéptidos son solubles. Polipéptidos de sHuPH20 ejemplares incluyen polipéptidos maduros que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEC D NOS: 4-9 47-48. Los polipéptidos precursores para dichos polipéptidos de sHuPH20 ejemplares incluyen una secuencia de señal. Son ejemplos de precursores aquellos expuestos en las SEC ID NOS: 3 y 40-46, cada uno de los cuales contiene una secuencia de señal de 35 aminoácidos en las posiciones de los aminoácidos 1-35. Los polipéptidos de HuPH20 soluble también incluyen aquellos degradados durante o después de los métodos de producción y de purificación descritos en la presente.
Como se usa en la presente, PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20) se refiere a una forma soluble de PH20 humana que es expresada recombinantemente en células de Ovario de Cobayo (Hámster Chino) (CHO, siglas del inglés Chínese Hámster Ovary) . La rHuPH20 soluble es codificada por el ácido nucleico que incluye la secuencia de señal y es expuesta en la SEC ID NO: 49. También se incluyen moléculas de ADN que son variantes alélicas de éstas y otras variantes. El ácido nucleico que codifica a rHuPH20 soluble es expresado en células de CHO, las cuales secretan el polipéptido maduro. Como se produjo en el medio de cultivo hay heterogeneidad en el terminus-C de modo que el producto incluye una mezcla de especies que puede incluir una cualquiera o más de las SEC ID NOS: 4-9 en varias abundancias. También se incluyen las variantes alélicas correspondientes y otras variantes, incluyendo aquellas correspondientes a polipéptidos de PH20 humano precursor expuestas en las SEC ID NOS: 50-51. Otras variantes pueden tener 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID NOS: 4-9 y 47-48 mientras que retienen una actividad hialuronidasa y son solubles.
Como se usa en la presente, actividad, se refiere a una actividad o actividades funcional (es ) de un polipéptido o porción de éste asociada con una proteína de extensión total (completa) . Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (habilidad para enlazar o competir con un polipéptido para enlazar a un anticuerpo anti-polipéptido) , inmunogenicidad, habilidad para formar multimeros, y la habilidad para enlazar específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido.
Como se usa en la presente, actividad hialuronidasa se refiere a la habilidad de la hialuronidasa para fragmentar el ácido hialurónico. Ensayos in vitro para determinar la actividad hialuronidasa de hialuronidasas , como rHuPH20 soluble, son conocidos en el arte y se describen en la presente. Ensayos ejemplares incluyen el ensayo de microturbidez descrito posteriormente (véase por ejemplo, el Ejemplo 3) que mide la fragmentación del ácido hialurónico por hialuronidasa indirectamente por medio de la detección del precipitado insoluble formado cuando ácido hialurónico sin fragmentar enlaza con albúmina de suero.
Como se usa en la presente, los residuos de cc-aminoácidos como se encuentran de manera natural son los residuos de 20 a-aminoácidos encontrados en la naturaleza, los cuales son incorporados en proteínas por medio del reconocimiento específico de la molécula de tARN cargada con su codón de mARN análogo en humanos.
Como se usa en la presente, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de éstos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA, siglas del inglés Peptide Nucleic Acids) y mezclas de éstos. Los ácidos nucleicos pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. Cuando nos referimos a sondas o cebadores, los cuales son opcionalmente marcadas, como con un marcador detectable, como un marcador fluorescente o radiomarca, se contemplan moléculas de una sola hebra. Dichas moléculas son típicamente de una extensión tal que su objetivo es estadísticamente único o de bajo número de copias (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para sondear o cebar una biblioteca. Generalmente una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria o idéntica a un gen de interés. Las sondas o cebadores pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de largo.
Como se usa en la presente, un péptido se refiere a un polipéptido que es desde 2 a 40 aminoácidos de extensión.
Como se usa en la presente, los aminoácidos que se encuentran en las varias secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente son identificados de conformidad con sus abreviaciones de una letra o de tres letras conocidas (Tabla 1) . Los nucleótidos que se encuentran en varios fragmentos de ácido nucleicos son designados con la designación de tres letras individuales estándar usada rutinariamente en el arte.
Como se encuentra en la presente, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxilico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los propósitos de la presente, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos que se encuentran de manera natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en donde el carbono alfa tiene una cadena lateral).
Como se usa en la presente, "residuo de aminoácido", se refiere a un aminoácido formado a partir de la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus ligaduras peptídicas. Los residuos de aminoácido descritos en la presente se asume que están en la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D", los cuales son designados, así, pueden ser sustituidos por cualquier residuo de aminoácido-L mientras que la propiedad funcional deseada sea retenida por el polipéptido. NH2, se refiere al grupo amino libre presente en el terminus amino de un polipéptido. COOH, se refiere al grupo carboxi libre presente en el terminus carboxi de un polipéptido conservando la nomenclatura de polipéptidos estándar descrita en J. Biol. Chem. , 243: 3557-3559 (1968), y adoptada 37 C.F.R., §§ 1.821-1.822, las abreviaciones para los residuos de aminoácidos se muestran en la Tabla 1: Tabla 1- Tabla de Correspondencia SIMBOLO -Letra 3-Letras Aminoácido y Tyr Tiros ina G Gly Glicina F Phe Fenilalanina M Met Met ionina A Ala Alanina S Ser Serina I lie Isoleucina L Leu Le u c i n a T Thr Treonina V Val Va 1 i na P Pro Prolina K Ly s Li sina H His Histidina Q Gln Glutamina E Glu Acido glutámico Z Glx Glu y/o Gln W Trp Triptof ano R Arg Arginina D Asp Acido aspártico Tabla 1 (Continuación) Se hace debe hacer notar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos representadas en la presente por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del termuinus-amino al terminus-carboxilo. Además, la frase "residuo de aminoácido" es definida ampliamente para incluir los aminoácidos enlistados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y modificada y aminoácidos inusuales, como los mencionados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados a la presente como referencia. Además, se hace notar que un guión al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptidico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos, a un grupo amino terminal como NH2 o a un grupo carboxilo terminal como COOH.
Como se usa en la presente, "aminoácidos como se encuentran de manera natural", se refiere a los 20 L-aminoácidos que se encuentran en polipéptidos .
Como se usa en la presente, "aminoácidos no naturales", se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural pero ha sido modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Por consiguiente, los aminoácidos que no se encuentran de manera natural incluyen, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos que se encuentran de manera natural e incluyen, pero no se limitan a, los D-isoestereómeros de aminoácidos. Se describen aminoácidos no naturales ejemplares en la presente y son conocidos por los expertos en el arte.
Como se usa en la presente, una construcción de ADN es una molécula de ADN circular o lineal de una o de doble hebra que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos en una manera no encontrada en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como un resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
Como se usa en la presente, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos específicos. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica a un polipéptido específico es una porción de una molécula de ADN más larga, como un plásmido o un fragmento de plásmido, el cual cuando se lee desde la dirección 5' a 3' , codifica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido especifico .
Como se usa en la presente, el término "polinucleótido" significa un polímero de una o de doble hebra de desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos bases leídas desde el extremo 5' a 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados desde fuentes naturales, sintetizados in vitro, o preparados desde una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La extensión de una molécula de polinucleótido se da en la presente en términos de nucleótido (abreviado "nt") o pares base (abreviado "pb"). El término nucleótidos es usado para moléculas de una sola o de doble hebra donde lo permita el contexto. Cuando el término es aplicado a moléculas de doble hebra, es usado para denotar extensión total y se comprenderá que es equivalente al término pares base. Los expertos en el arte reconocerán que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de éstas pueden estar desplazados; así todos los nucleótidos en una molécula de polinucleótido de doble hebra pueden no estar emparejados. Dichos extremos disparejos, en general, no excederán de 20 nucleótidos de extensión.
Como se usa en la presente "similaridad" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la conexión entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o de las secuencias de los ácidos nucleicos del nucleótido. Similarmente peden basarse en el grado de identidad y/o homología de secuencias de residuos y de los residuos contenidos en ellas.
Los expertos en el arte conocen métodos para evaluar el grado de similaridad entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método de evaluar la similaridad de secuencia, dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son alienadas en una manera que produzca un nivel máximo de identidad entre las secuencias, "identidad", se refiere a la medida en la cual las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son invariables. La alineación de secuencias de aminoácidos y en algún grado de secuencias de nucleótidos, también puede tomar en cuenta diferencias conservadoras y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Diferencias conservadoras son aquellas que preservan las propiedades físico-químicas del residuo involucrado. Las alineaciones pueden ser generales (alineación de las secuencias comparadas sobre la extensión entera de las secuencias y que incluye todos los residuos) o local (la alineación de una porción de las secuencias que incluye solamente la región o regiones más similares.
"Identidad", per se tiene un significado reconocido en el arte y puede ser calculada usando técnicas publicadas. (Véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed . , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M . , y Griffin, H. G . , eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. Y Devereaux, J. , eds., M. Stockton Press, New York, 1991) . Aunque existen numerosos métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos , el término "identidad" es bien conocido por los expertos en la materia (Carillo, H. & Lipton, D. , SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988)).
Como se usa en la presente, "homólogo" (con respecto a secuencias de ácidos nucleicos y/o de aminoácidos) significa aproximadamente mayor que o igual a 25 % de homología de secuencia, típicamente mayor que o igual a 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de homología de secuencia; el porcentaje preciso puede ser especificado si es necesario. Para los propósitos de la presente los términos "homología" e "identidad" a menudo, son usados indistintamente, a menos que se indique de otra manera. En general, para determinación del porcentaje de homología o identidad; las secuencias son alineadas de modo que se obtenga el máximo orden de parejas (véase, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. , y Griffin, H. G., Eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereaux, J. , Eds., M. Stockton Press, New York, 1991; Carillo y colaboradores (1988) SIAM J. Applied Math. 48: 1073). Por "homología de secuencia", el número de aminoácidos conservados es determinado por medio de programas de algoritmos de alineación estándar, y pueden ser usados con penalidades de espacios de faltantes establecidos por cada proveedor. Moléculas de ácidos nucleicos sustancialmente homologas hibridizarían típicamente a severidad moderada o a severidad alta a todo lo largo de la extensión del ácido nucleico de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de los codones en la molécula de ácido nucleico hibridizante .
Ya sea que cualquiera de dos moléculas tenga secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que sean al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % "idénticas u "homologas", esto puede ser determinado usando algoritmos de cómputo conocidos, como el programa "FASTA", usando por ejemplo, los parámetros faltantes como en Pearson y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (otros programas incluyen el programa paquete GCG (Devereaux, J., y colaboradores, Nucleics Acids Research 12 (I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. y colaboradores, J. Molec. Biol . 215: 403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo y colaboradores (1988) SIAM J. Applied Math 48: 1073) . Por ejemplo, puede usarse la función BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information para determinar la identidad. Otros programas disponibles pública o comercialmente incluyen el programa DNAStar "MegAlign" (Madison, I) y el programa "Gap" del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison WI). El por ciento de homología o de identidad de moléculas de proteínas y/o de ácidos nucleicos puede ser determinado, por ejemplo, por comparación de la información de secuencia usando un programa de cómputo GAP (por ejemplo, Needleman y colaboradores (1970) J. Mol. Biol. 48"443, revisado por Smith y Waterman ((1981) Adv. Appl . ath. 2:482). Resumiendo, el programa GAP define similaridad como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) , que son similares, divididos entre el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias.. Los parámetros faltantes para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación uñaría (que contenga un valor de 1 para identidades y 0 para no-identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gibskov y colaboradores (1986) Nucí. Acids. Res. 14: 6745, como se describió por Schwartz y Dayhoff, Eds . ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358 (1979); (2) una penalidad de 3.0 ara cada espacio y una penalidad adicional de 0.10 para cada símbolo en cada espacio; y (3) ninguna penalidad para espacios terminales.
Por consiguiente, como se usa en la presente, el término "identidad" u "homología, representa una comparación entre un polinucleótido o polipéptido de prueba y uno de referencia. Como se usa en la presente, el término al menos "90 % idéntico a", se refiere a por ciento de identidades desde 90 a 99.99 en relación a la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos de referencia. Identidad a un nivel de 90 % o más es indicador del hecho que, suponiendo para propósitos de ej emplificación que sean comparados un polipéptido de prueba y uno de referencia de 100 aminoácidos de extensión. No más de 10 % (es decir, 10 afuera de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba difieren de los del polipéptido de referencia. Pueden hacerse comparaciones similares entre polinucleótidos de prueba y de referencia. Dichas diferencias pueden ser representadas como mutaciones puntuales aleatoriamente distribuidas sobre la extensión total de un polipéptido o pueden estar aglomerados en una o más localizaciones de extensión variable hasta el máximo permisible, por ejemplo, diferencia de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90 % de identidad) . Las diferencias son definidas como sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Al nivel de homologías o identidades superiores a 85 - 90 %, el resultado deberá ser independiente del programa y grupo de parámetros de espacios; dichos altos niveles de identidad pueden ser evaluados fácilmente, a menudo por alineación manual sin confiar en el "software" .
Como se usa en la presente, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similaridad y/o identidad) para alinear las posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Típicamente, son alienadas dos o más secuencias que están relacionadas en 50 % o más de identidad. Un grupo de secuencias alineadas se refiere a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y pueden incluir secuencias que se alinean derivadas de ARNs, y otra cADNs, alienadas con secuencia de ADN genómico.
Como se usa en la presente, "cebador", se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como un punto de iniciación de síntesis de ADN dirigida hacia el modelo bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, en la presencia de cuatro trifosfatos de nucleósidos diferentes y un agente de polimerización, como ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa en sentido contrario) en un regulador apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que ciertas moléculas de ácidos nucleicos pueden servir como una "sonda" y como un "cebador". Un cebador, no obstante, tiene un grupo hidroxilo en 3' por extensión. Un cebador puede ser usado en una variedad de métodos, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa en sentido contrario (RT)-PCR, ARN PCR, LCR, PCR multiplex, PCR con enclave, PCR de captura, PCR de expresión, 3' y 5' RACE, PCR in situ, PCR- mediada por ligadura y otros protocolos de amplificación .
Como se usa en la presente, "par cebador" se refiere a un grupo de cebadores que incluyen un cebador 5' (de 5' a 3' ) que hibridiza con el extremo 5' de una secuencia a ser amplificada (por ejemplo, por PCR y un cebador 3' (de 3' a 5' ) que hibridiza con el complemento del extremo 3' de la secuencia a ser amplificada.
Como se usa en la presente, "específicamente hibridiza", se refiere a fortalecimiento, por emparejamiento con la base complementaria, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) a una molécula de ácido nucleico objetivo. Los expertos en la materia están familiarizados con parámetros in vitro e in vivo que afectan la hibridización específica, como longitud y composición de la molécula particular. Parámetros particularmente relevantes para hibridización in vitro incluyen adicionalmente temperatura de lavado y de fortalecimiento, composición reguladora y concentración de sales. Condiciones de lavado ejemplares para remover moléculas de ácido nucleico enlazadas no específicamente a alta severidad son =.1 x SSPE, 0.1 % de SDS, 65 °C, y a severidad media son 0.2 SSPE, 0.1 % de SDS, 50 °C . Condiciones de severidad equivalente son conocidas en el arte. El experto en la materia puede ajusfar fácilmente estos parámetros para lograr hibridización específica de una molécula de ácido nucleico a una molécula de ácido nucleico objetivo apropiada para una aplicación particular. Complementarias cuando se refiere a dos secuencias de nucleótidos, significa que las dos secuencias de nucleótidos son capaces de hibridizar, típicamente con menos de 25 %, 15 % o 5 % de desigualdades entre nucleótidos opuestos. Si es necesario, el porcentaje de complementaridad será especificado. Típicamente, las dos moléculas son seleccionadas de modo que hibridizarán bajo condiciones de alta severidad.
Como se usa en la presente, sustancialmente idéntico a un producto significa suficientemente similar de modo que la propiedad de interés es suficientemente sin cambio de modo que el producto sustancialmente idéntico puede ser usado en lugar del producto.
Como se usa en la presente, también se comprende que los términos "sustancialmente idéntico" o "similar" varían con el contexto como comprenderán los expertos en el arte relevante.
Como se usa en la presente, una variante alélica o variaciones alélicas, referencias a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. Variación alélica surge naturalmente mediante una mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico en poblaciones. La mutación genética, puede ser silenciosa (sin cambio en el polipéptido codificado) o puede codificar polipéptidos que tengan que tengan secuencia de aminoácido alterada. El término "variante alélica" también es usado en la presente para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente, la forma de referencia del gen codifica una forma salvaje y/o forma predominante de un polipéptido a partir de una población o elemento de referencia individual de una especie. Típicamente, variantes alélicas, las cuales incluyen variantes entre y mezclado con especies que tienen típicamente al menos 80 %, 90 % o más identidad de aminoácidos con una forma predominante y/o de tipo salvaje de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y de si la comparación es ínter-especies o intra-especies . Generalmente, variantes alélicas intra-especies tienen al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad o mayor con una forma predominante o de tipo salvaje, incluyendo 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad con una forma predominante o de tipo salvaje de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en la presente generalmente se refiere a variaciones en proteínas entre elementos de la misma especie.
Como se usa en la presente, "alelo", el cual es usado indistintamente en la presente con "variante alélica", se refiere a formas alternativas de un gen o porciones de éste. Los alelos ocupan el mismo locus o posición sobre cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homozigótico para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterozigótico para el gen. Alelos de un gen especifico pueden diferir entre si en un nucleótido individual o en varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, eliminaciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Como se usa en la presente, especies variantes, se refiere a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamíferos, como ratón y humano .
Como se usa en la presente, una variante de empalme, se refiere a una variante producida por medio de diferente procesamiento de un trascripto primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de mARN .
Como se usa en la presente, modificación, es una referencia a modificación de una secuencia de aminoácidos o de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácidos nucleicos e incluye eliminaciones, inserciones, y reemplazos de nucleótidos y aminoácidos, respectivamente. Los métodos para modificar un polipéptido son rutinarios para los expertos en el arte, como usando metodologías de ADN recombinante .
Como se usa en la presente, el término promotor significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que se proporciona para el enlace de ARN polimerasa e iniciación de trascripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en la región no codificadora 5' de genes.
Como se usa en la presente, proteina o polipéptido purificado o aislado o porción de éstos biológicamente activa está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido desde el cual se ha derivado la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando es sintetizada químicamente. Se puede determinar que las preparaciones son sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables determinado por medio de los métodos estándares de análisis, tales como cromatografía en capa fina (TLC, siglas del inglés Thin Layer Chromatography) , electroforesis sobre el y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, siglas del inglés High Performance Liquid Chromatography) , usados por los expertos en el arte para evaluar dicha pureza, o suficientemente pura de modo que la purificación adicional no alteraría de manera detectable las propiedades físicas y químicas, como las actividades biológicas y enzimáticas, de la sustancia. Los métodos de purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente puros químicamente son conocidos pro los expertos en el arte. Un compuesto sustancialmente puro químicamente, no obstante, puede ser una mezcla de estereoisómeros . En dichos casos, la purificación adicional debe incrementar la actividad específica del compuesto.
El término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las cuales la proteína es separada de los componentes celulares de las células a partir de las cuales es aislada o producida recombinantemente . En una modalidad, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de proteínas no enzimáticas) (también mencionadas en la presente como una proteína contaminante) , generalmente menos de aproximadamente 20 % de proteínas no enzimáticas o 10 % de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente 5 % de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática es producida recombinantemente, está también sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente o en 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación de proteína enzimática.
Como se usa en la presente, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las cuales la proteína es separada de precursores químicos u otros productos químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tengan menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) 20 %, 10 %, 5 % o menos de precursores químicos o componentes o productos químicos no enzimáticos.
Como se usa en la presente, "sintético", con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintético o un gen sintético o un péptido sintético, se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de péptido que es producida por medio de métodos recombinantes y/o por medio de métodos de síntesis química.
Como se usa en la presente, producción por medios recombinantes usando métodos de ADN recombinante significa el uso de los métodos de biología molecular bien conocidos para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.
Como se usa en la presente, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que son usados para introducir un ácido nucleico heterólogo en células ya sea para expresión o bien para replicación de éste. Los vectores típicamente permanecen episomales, pero pueden ser diseñados para efectuar la integración de un gen o de una porción de éste en un cromosoma del genoma . También están contemplados vectores que son cromosomas artificiales, como cromosomas artificiales de levaduras y cromosomas artificiales de mamíferos. La selección y el uso de dichos vehículos son bien conocidos por el experto en el arte.
Como se usa en la presente, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que están operativamente ligados con secuencias reguladoras, como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras , y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables , un mejorador, una señal de poliadenilación , y los similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente de ADN plásmido o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por consiguiente, un vector de expresión se refiere a una construcción de ARN o ADN recombinante , como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, desde la introducción en una célula huésped apropiada da como resultado la expresión de un ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los expertos en el arte e incluyen aquellos que son replicables en células eucarióticas y/o células procarióticas y aquellos que permanecen episomales o aquellos que se integran en el genoma de la célula huésped.
Como se usa en la presente, vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Vectores virales son virus diseñados que están ligados operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzadores) los genes exógenos al interior de las células.
Como se usa en la presente, operable u operativamente ligado cuando se refiere a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan en concierto para sus propósitos previstos, por ejemplo, la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento que codifica al terminador.
Como se usa en la presente, el término evaluar está previsto para incluir la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteasa, o de un dominio de ésta, presente en la muestra, y también de obtener un índice, proporción, porcentaje, valor visual u otro indicador del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta y la especie química actualmente detectada no necesita ser, por supuesto, producto de la proteólisis misma, sino que puede por ejemplo, ser un derivado de ésta o de alguna sustancia adicional. Por ejemplo, la detección de un producto de fragmentación de una proteina de complemento, como por SDS-PAGE y tinción proteinica con azul de Coomasie.
Como se usa en la presente, actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o a respuestas fisiológicas que resultan después de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. Actividad biológica, por consiguiente, abarca efectos terapéuticos y actividad farmacéutica de dichos compuestos, composiciones y mezclas. Las actividades biológicas pueden ser observadas en sistemas in vitro diseñados para probar o usar dichas actividades. Por consiguiente, para propósitos de la presente un ensayo biológico de una proteasa es su actividad catalítica en la cual es hidrolizado un polipéptido .
Como se usa en la presente equivalente, cuando se refiere a dos secuencias de ácidos nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestión codifican a la misma secuencia de aminoácidos o a proteínas equivalentes. Cuando equivalente es usado haciendo referencia a dos proteínas o péptidos, significa que las dos proteínas o péptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos con solamente sustituciones de aminoácidos que no alteran sustancialmente la actividad o función de la proteína o péptido. Cuando equivalente se refiere a una propiedad, la propiedad no necesita estar presente en el mismo grado (por ejemplo, dos péptidos pueden exhibir diferentes velocidades del mismo tipo de actividad enzimática) , pero las actividades son usualmente de manera sustancial las mismas.
Como se usa en la presente, "modular" y "modulación" o "alterar", se refieren a un cambio de una actividad de una molécula, como una proteína. Actividades ejemplares incluyen, pero no se limitan a, actividades biológicas, como una señal de transducción . Modulación puede incluir un incremento en la actividad (es decir, sobre-regulación o actividad agonista) una disminución en la actividad (es decir sub-regulación o inhibición) o cualquier otra alteración en una actividad (como un cambio en periodicidad, frecuencia, duración, cinética u otros parámetros). Modulación puede ser contexto dependiente, y típicamente modulación, se compara a un estado determinado, por ejemplo, proteína de tipo salvaje, la proteína en un estado constitutivo, o la proteína como se expresa en una condición o tipo celular determinado.
Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla. Si puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de éstas.
Como se usa en la presente, una combinación se refiere a cualquier asociación entre o mezcla de dos o más artículos. La combinación puede ser de dos o más artículos separados, como dos composiciones o dos colecciones, puede ser una mezcla de éstos, como una mezcla individual de los dos o más artículos, o cualquier variación de éstos. Los elementos de una combinación están generalmente, de manera funcional asociados o relacionados.
Como se usa en la presente, un equipo es una combinación empacada que opcionalmente incluye otros elementos, como reactivos e instrucciones adicionales para uso de la combinación o elementos de ésta.
Como se usa en la presente, "enfermedad o trastorno", se refiere a una condición patológica en un organismo resultante de causa o condición que incluye, pero no se limita a, infecciones, condiciones adquiridas, condiciones genéticas, y caracterizada por síntomas identificables . Enfermedades y trastornos de interés en la presente son aquellas que son tratables por medio de inmunoglobulina .
Como se usa en la presente, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o condición significa que los síntomas del sujeto son aliviados total o parcialmente, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por consiguiente, tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. Profilaxis se refiere a prevención de una enfermedad potencial y/o prevención del empeoramiento de los síntomas o progreso de una enfermedad. Tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de una preparación de inmunoglobulina y composiciones proporcionadas en la presente.
Como se usa en la presente, un agente efectivo farmacéuticamente, incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, anestésicos, vasoconstrictores, agentes dispersantes, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de moléculas pequeñas y proteínas terapéuticas .
Como se usa en la presente, tratamiento significa cualquier manera en la cual los síntomas de una condición, trastorno o enfermedad u otra indicación, son mejorados o de otra manera alterados benéficamente.
Como se usa en la presente "efecto terapéutico" significa un efecto resultante del tratamiento de un sujeto que altera, típicamente beneficia o mejora los síntomas de una enfermedad o condición o que cura una enfermedad o condición. Una cantidad efectiva terapéuticamente se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto que da como resultado un efecto terapéutico después de administración a un sujeto.
Como se usa en la presente, el término "sujeto", se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, como un ser humano .
Como se usa en la presente, un paciente se refiere a un sujeto humano.
Como se usa en la presente, mejoramiento de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular por medio de un tratamiento, como por administración de una composición farmacéutica u otro agente terapéutico, se refiere a cualquier aminoración ya sea permanente o temporal, que dure o transitorio, de los síntomas que pueden ser atribuidos a o asociados con la administración de la composición o agente terapéutico .
Como se usa en la presente, prevención o profilaxis, se refiere a métodos en los cuales el riesgo de desarrollar la enfermedad o condición se reduce.
Como se usa en la presente, "una cantidad efectiva terapéuticamente" o "una dosis efectiva terapéuticamente", se refiere a la cantidad de un agente, compuesto, material, o composición que contenga un compuesto que sea al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por consiguiente, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.
Como se usa en la presente, forma de dosis unitaria, se refiere a unidades discretas físicamente adecuadas para sujetos humanos y animales y empacados individualmente como es sabido en el arte.
Como se usa en la presente, una formulación en dosificación individual se refiere a una formulación para administración directa.
Como se usa en la presente, un "artículo de fabricación" es un producto que es elaborado y comercializado. Como se usa en el transcurso de esta solicitud, el término está previsto para abarcar composiciones de IG y hialuronidasa contenidas en artículos de empaque .
Como se usa en la presente, fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Por consiguiente fluidos abarca composiciones que están en la forma de semi-sólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones.
Como se usa en la presente "equipo" se refiere a una combinación de composiciones proporcionadas en la presente y otro artículo para un propósito que incluye, pero no se limita a, activación, administración, diagnóstico, y evaluación de una propiedad o actividad biológica. Los equipos opcionalmente incluyen instrucciones para uso.
Como se usa en la presente, un extracto o lisado celular, se refiere a una preparación o fracción que es elaborada a partir de una célula lisada o disruptada.
Como se usa en la presente, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no se limita a primates, incluyendo humanos, gorilas y monos; roedores, como ratones y ratas; aves, como pollos; rumiantes, como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ovinos, como cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen humanos como el animal contemplado. Las enzimas proporcionadas en la presente son de cualquier fuente, animal, vegetal, procarióticas y fúngicas. La mayoría de las enzimas son de origen animal, incluyendo de origen mamífero.
Como se usa en la presente, un control, se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no está tratada con un parámetro de prueba, o , si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado con la condición de interés. Un control, también puede ser un control interno.
Como se usa en la presente, las formas singulares "un, una" (antes de consonante) y "un, una" (antes de vocal) y "el, la, los, las" incluyen referentes del plural, a menos que el contexto dicte de otra manera. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a un compuesto que comprende "un dominio extracelular" incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.
Como se usa en la presente, intervalos y cantidades pueden ser expresados como "aproximadamente" un valor o un intervalo particular: aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por consiguiente "aproximadamente 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases".
Como se usa en la presente "opcional" u "opcionalmente" , significa que el evento o circunstancia descritos subsecuentemente ocurre o no, y que la descripción incluye casos donde dicho evento o circunstancia tiene lugar y casos donde no. Por ejemplo, un grupo sustituido opcionalmente significa que el grupo es sustituido o no sustituido .
Como se usa en la presente, las abreviaciones para cualquiera de los grupos protectores, aminoácidos y otros compuestos, son, a menos que se indique de otra manera, de conformidad con su uso común, abreviaciones reconocidas, o la IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (véase, (1972) Biochem. 11 : 1726) .
B. ADMINISTRACION SUBCUTANEA DE INMUNOGLOBULINA (IG) Se proporcionan en la presente métodos y usos de tratar enfermedades y condiciones tratables con IG por administración subcutánea de inmunoglobulina (IG) en combinación con una hialuronidasa soluble. Por consiguiente, también se proporcionan combinaciones de IG y una hialuronidasa soluble. En virtud de la habilidad de la hialuronidasa para desintegrar el ácido hialurónico en la matriz extracelular , la hialuronidasa facilita la infusión subcutánea de agentes terapéuticos. La inmunoglobulina es un agente terapéutico que es primeramente dado por administración intravenosa para tratar individuos con deficiencias inmunes, mencionada como terapia IVIG. La biodisponibilidad de IG en la presencia de hialuronidasa es mayor que 90 % de la biodisponibilidad de IG después del tratamiento IVIG. Por consiguiente, en los métodos y usos proporcionados en la presente, la terapia en combinación de hialuronidasa e IG permite la administración subcutánea de inmunoglobulina a dosificaciones y frecuencias que son similares al tratamiento IVIG. Asi, por ejemplo, en los métodos y usos proporcionados en la presente, IG, cuando se administra subcutáneamente en la presencia de hialuronidasa soluble, puede ser administrada una vez mensualmente a dosis de IVIG eficaces para la indicación particular. Adicionalmente , porque la hialuronidasa actúa para abrir canales de flujo en la piel puede acelerar la velocidad de infusión. Por consiguiente, métodos de administrar subcutáneamente IG co-formulada y/o co-administrada con hialuronidasa incrementan las velocidades de infusión, y disminuye asi el tiempo de liberación de la terapia con IG.
La formación de anticuerpos defectuosos es la anormalidad más común en la mayoría de las enfermedades por inmunodeficiencia primaria (PID, siglas del inglés Primary Inmunodeficiency Diseases); se refleja más a menudo por una disminución en las inmunoglobulinas del suero, lo cual a su vez conduce a susceptibilidad creciente a infecciones bacterianas, especialmente del tracto sinopulmonar . Los niveles disminuidos de inmunoglobulina son encontrados en individuos que tienen defectos de anticuerpos como agamaglobulinemia congénita o relacionada con el cromosoma X, eliminaciones de la cadena pesada de inmunoglobulina, deficiencia de la subclase de inmunoglobulina G selectiva (IgG), inmunodeficiencia variable común, o síndrome de hiperinmunoglobulina M relacionada con rayos X. Los niveles de inmunoglobulina abatidos también son encontrados en individuos que tienen inmunodeficiencias combinadas debido a defectos en las células B y T, tal, como, pero no se limita a, inmunodeficiencia combinada severa o Síndrome de Wiskott Aldrich (IUIS Scientific Committee, 1999) .
Individuos con estas deficiencias requieren terapia de reemplazo con productos de inmunoglobulina para prevenir o reducir la severidad de infecciones. Inicialmente, la terapia de reemplazo de inmunoglobulina fue dada por la ruta intramuscular, pero a principios de 1981 la abrumadora mayoría de pacientes ha sido tratada por la ruta intravenosa (IV). Corrientemente, la mayoría de los productos de inmunoglobulina en los Estados Unidos son para administración IV. Sin embargo, las preparaciones de inmunoglobulina han sido desarrolladas más recientemente para administración subcutánea (Gardulf y colaboradores (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 6: 434-42; Gardulf y colaboradores (2006) J. Clin. Immunol., 26: 265-73). Al menos un producto, Vivaglobin®, es aprobado para administración subcutánea.
Todas las preparaciones de inmunoglobulina usadas actualmente son formuladas al 16 %, en comparación con preparaciones IVIG formuladas al 5 a 12 %. Concentración más alta en relación a preparaciones IV permiten volúmenes de infusión más pequeños; dichas preparaciones no pueden ser infusionadas intravenosamente. Dichos métodos subcutáneos de terapia de reemplazo de inmunoglobulina se consideran efectivos, seguros y también muy apreciados por pacientes para tener un bajo riesgo de reacciones adversas generalizadas y conduce a mínimos más altos en concentraciones de IgG en suero en comparación con infusiones IV mensuales (Gardulf y colaboradores (1995)) J. Adv. Nurs., 21: 917-27; Gardulf y colaboradores (1993) Clin. Exp. Immunol., 92: 200-4; Gardulf y colaboradores (1991) Lancet, 338: 162-6) .
La biodisponibilidad de inmunoglobulina administrada subcutáneamente generalmente es menor que la infusionada intravenosamente. La inmunoglobulina está disponible inmediatamente en la sangre, y se equilibra lentamente en el compartimento extra-vascular durante 3 a 5 días (Schiff y colaboradores (1986) J. Clin. Immunol., 6: 256-64) . La inmunoglobulina administrada subcutáneamente es absorbida lentamente desde el espacio subcutáneo en la sangre y al mismo tiempo se equilibra con el compartimento extra-vascular; no hay picos IV altos. La biodisponibilidad no ha sido estudiada extensivamente, pero en un ensayo reciente de la preparación de ZLB-Behring (es decir Vibaglobin®) , se determinó por medición del área bajo la curva (AUC) que solamente 67 % de la inmunoglobulina fue absorbida y por consiguiente, la dosis recomendada fue de 137 % de la dosis IV (Ochs y colaboradores (2006) J. Clin. Immunol., 26: 265-73) . A pesar de las dificultades técnicas de comparar el AUC por dos rutas y frecuencias de administración diferentes, estudios de inmunoglobulina administrada intradérmicamente en conejos sugieren que has biodisponibilidad disminuida a través de la ruta subcutánea. Esto puede ser debido al modo de absorción de moléculas de proteina grandes, las cuales no pueden difundirse fácilmente a través de las paredes capilares y deben ser absorbidas vía los vasos linfáticos (Supersaxo y colaboradores (1990) Pharm. Res., 7: 167-9).
Además de problemas con la biodisponibilidad asociados con la administración subcutánea de IG, la desventaja primaria de la administración SC es que solamente pequeños volúmenes pueden ser infusionados en cada sitio, necesitándose el uso de sitios múltiples sobre una base semanal o bisemanal (por otra semana) . Generalmente, usando una solución al 16 %, aproximadamente 20 mL pueden ser infusionados por sitio; y paciente adulto que recibe 400 mg/kg de peso corporal (PC)) requeriría así al menos 3 sitios por semana o 12 sitios por mes. Aunque a la administración semanal o bisemanal se ha añadido la ventaja de mantener mejor los niveles mínimos que por infusiones IV mensualmente , los requerimientos de inserciones múltiples de agujas ha sido desanimante para muchos pacientes.
El espacio SC está formado por una retícula de colágeno llena con una sustancia similar a un gel, ácido hialurónico. El ácido hialurónico es reemplazado con una vida media de aproximadamente 5 horas, y es ampliamente responsable por la resistencia a fluir del fluido a través de los tejidos. La hialuronidasa temporalmente digiere el ácido hialurónico, facilitando asi infusiones en el espacio subcutáneo. El ácido hialurónico es restaurado en 24 horas, no dejando cambios observables. Por consiguiente, debido a la habilidad de la hialuronidasa para abrir canales en el espacio intersticial a través de la degradación de glicosaminoglicanos , la administración de una hialuronidasa soluble permite la difusión de moléculas, mejorando asi la biodisponibilidad, las características farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de dichas moléculas co-formuladas y coadministradas .
En algunos ejemplos, la biodisponibilidad de IG coadministrada subcutáneamente con hialuronidasa es 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 , 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de la biodisponibilidad de IVIG. Típicamente, la biodisponibilidad es mayor que 90 %. Adicionalmente, la coadministración con una hialuronidasa soluble permite la infusión de grandes volúmenes en un solo sitio subcutáneo. Por ejemplo, volúmenes de hasta 600 mL o mayores de IG pueden ser administrados en un solo sitio en una sola sesión, por ejemplo 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, o más pueden ser administrados en un solo sitio en una administración individual. Así, una preparación de IG formulada en o entre 5 - 12 % puede ser co-administrada subcutáneamente con una hialuronidasa soluble a dosificaciones equivalentes para dosis IVIG una vez al mes, por ejemplo, a o aproximadamente 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg o más. Las dosificaciones pueden ser administradas como una dosis única o pueden ser divididas en dosis múltiples dadas diaria o semanalmente, como una vez a la semana, o cada dos, tres o cuatro semanas o combinaciones de éstas. Por consiguiente, al administrar IG subcutáneamente en la presencia de una hialuronidasa soluble, una o todas las consideraciones y problemas asociados con la administración subcutánea de IG son resueltos. Asi, en virtud de las propiedades de dispersión de hialuronidasa, administrar subcutáneamente IG en la presencia de una hialuronidasa soluble permite la administración de dosis IVIG a frecuencias de IVIG una vez 1 mes, mientras que se mantiene la biodisponibilidad de IVIG.
Las siguientes secciones describen inunoglobulinas ejemplares y hialuronidasas solubles en las combinaciones de la presente, métodos de elaborarlas, y usarlas para tratar enfermedades y condiciones tratables con IG.
C. Inmunoglobulina Se proporcionan en la presente inmunoglobulinas (IG, también mencionadas como gama globulinas o IgG) que pueden ser usadas para administración subcutánea en combinación con una hialuronidasa soluble. IG actúa para fortalecer el sistema inmune por modulación de la actividad de complemento, suprimir la producción de auto-anticuerpos, saturar o bloquear a los receptores de Fe sobre macrofagos y linfocitos B, y suprimir la producción de mediadores inflamatorios como citoquinas, quimioquinas y metaloproteinasas .
IG es una fracción proteinica encontrada en el plasma de animales superiores y contiene un gran número de anticuerpos que tienen especificidades variables. Generalmente, IG contiene inmunoglobulinas de suero que pueden ser cualquier idiotipo, como IgG y varias subclases, IgA, IgM, IgD, IgE. Las varias inmunoglobulinas o subclases pueden estar presentes a varias concentraciones y especificidades, las cuales pueden diferir entre preparaciones de inmunoglobulinas dependiendo, por ejemplo, sobre la exposición de los donadores de plasma a antigenos (por ejemplo, por medio de vacunaciones) . A menudo, las inmunoglobulinas están presentes en cantidades normalmente encontradas en el suero (véase la Tabla 2), aunque pueden emplearse etapas de purificación para alterar las proporciones de clases o subclases de inmunoglobulinas particulares. Típicamente, preparaciones de IG contienen 90 % o más IgG, como 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de IgG. Las inmunoglobulinas pueden ser policlonales o monoclonales . Típicamente, las preparaciones incluyen un alto porcentaje de IgG monomérica y un bajo contenido de IgA.
Las inmunoglobulinas pueden ser aisladas a partir de sangre animal o humana o producida por tros medios, por ejemplo, por tecnología de ADN recombinante o tecnología del hibridoma. Por ejemplo, las inmunoglobulinas pueden ser obtenidas a partir de tejidos, cultivos de hibridoma de linfocitos, suero o plasma de sangre, o cultivos celulares recombinantes usando cualquier procedimiento de fraccionamiento adecuado, por ejemplo, precipitaciones en medio alcohólico o separaciones por intercambio iónico. En general, IG es preparada a partir de plasma sanguíneo por fraccionamiento en medio alcohólico, como se empleó originalmente por Cohn y lo modificó por Oncley (el método de Cohn-Oncley, véase, por ejemplo, Cohn y colaboradores (1946) J. Am. Chem. Soc. 68: 459-475; Oncley y colaboradores (1949) J. Am. Chem. Soc, 71:541-550). El uso de alcohol en la purificación puede inactivar virus potencialmente contaminantes. El método de Cohn - Oncley puede dar como resultado proteínas aglomeradas y desnaturalizadas, las cuales pueden dar como resultado formas de alto peso molecular que pueden actuar como complejos antígeno-anticuerpo que tengan la capacidad para fijar libremente el complemento .
Para prevenir dichos efectos indeseables, los métodos de Cohn-Oncley modificados han sido desarrollados para la preparación y purificación de IG. Varios de dichos procedimientos son conocidos y pueden ser adaptados y modificados para uso de las preparaciones de IG de la presente. Está en la experiencia del arte preparar preparaciones de IG en vista de los métodos detallados conocidos y disponibles en el arte. Típicamente, IG es fabricada usando fraccionamiento primario de etanol en frío y un fraccionamiento secundario que puede incluir cualquiera de una o más modificaciones químicas, incubación a pH de 4.0 con o sin pepsina, precipitación con PEG, cromatografía por intercambio iónico, fraccionamiento enzimático, tratamiento con detergente como solvente y diafiltración y ultrafiltración.
Por ejemplo, la separación de aglomerados de IG por medio de técnicas convencionales como ultra-centrifugación o cromatografía por exclusión, hace posible obtener un producto que tenga una actividad anti-complementaria baja. Otros métodos de preparación de IG incluyen, pero no se limitan a, un proceso para fraccionar plasma humano por medio de polímeros de etilenglicol (Polson y colaboradores (1964) Biochim. Biophys . Acta, 82: 463-475); incorporación de un polietilenglicol (PEG) como un agente de purificación iniciando a partir de un material separado desde el fraccionamiento de Cohn (fracción II o II + III, véase, por ejemplo, Las Patentes U.S. Nos. 4,093,606 y 4,165,370); y otros métodos similares de procesos de purificación con polietilenglicol (EP 0246579). Además, se han descrito procesos para obtener IG que exhiben baja actividad anticomplemento por tratamiento con enzimas como pepsina, plasmina, tripsina inmovilizada, tratamiento a un pH ácido moderado, tratamiento con propiolactona-B, métodos de fraccionamiento que usan polietilenglicol como un agente de precipitación, y otras técnicas descritas en las Patentes U.S. Nos. 4,093, 4,126,605, 3,966,906, y 4,124,576. Otros procesos están basados en modificar química y parcialmente las moléculas de IG tratándolas con agentes reductores, alcoholización, alquilación y sulfonación (véase por ejemplo, la Patente U.S. 6,875,848). La cromatografía por intercambio iónico puede ser usada para eliminar contaminantes indeseables de los materiales iniciales usados para obtener las preparaciones de IG (véase por ejemplo, la Patente U.S. No. 3,869,436, EP 91300790 y WO 94/29334). EP0440483 describe una combinación de técnicas útiles para facilitar la preparación intravenosa de del producto basado en cromatografía por intercambio iónico y diafiltración a un pH de ácido débil. También se describen en el arte otros métodos y son conocidos por el experto en el arte (véase por ejemplo, la Patente U.S. 5,177,194 y 6,875,848).
Las preparaciones de IG deberán ser tratadas para remover la carga viral. Hay dos métodos para disminuir la carga viral: inactivación viral y separación o remoción viral. Ejemplos de métodos de inactivación viral incluyen, pero no se limitan a, fraccionamiento en frío con etanol, calentamiento (pasteurización) , medio ácido y detergente/solvente (bajo pH) . Por ejemplo los procesos con solvente/detergente han demostrado tener acción virucida contra VSV (virus de la estomatitis vesicular) , virus de Sindbis, VIH, VHB (virus de la hepatitis B) y VHC (virus de la hepatitis C) . Ejemplos de remoción y separación viral incluyen, pero no se limitan a, fraccionamiento en frió con etanol, separación de fase o precipitación con polietilenglicol , cromatografía por afinidad, cromatografía por exclusión sobre gel o por intercambio iónico, y filtración.
La formulación purificada final también debe de ser preparada para evitar aglomeración excesiva y para estabilizar la proteína. La aglomeración de la preparación de IG puede ser minimizada preparando preparaciones liofilizadas para estabilidad mejorada en almacenamiento, para reconstitución con un diluyente antes de uso. Otra manera de incrementar la estabilidad de preparaciones de IG que es bien conocida en el arte es la adición de excipientes estabilizantes de proteínas a la preparación de IG. Los excipientes conocidos incluyen, pero no se limitan a, azúcares, polioles, aminoácidos, aminas, sales, polímeros y tensoactivos . Por ejemplo, la Patente U.S. 4,499,073 describe la estabilización por medio de la selección de pH y de la fuerza iónica; La Patente JP 54020124, describe la adición de un aminoácido a una preparación intramuscular para volver su almacenamiento estable y seguro; Las Patentes JP 57031623 y JP 57128635 describen el uso de arginina y/o lisina con NaCl en preparaciones al 5 a 10 % de IG para lograr estabilidad a largo plazo en una preparación intramuscular; JP 4346934 describe el uso de baja conductividad (menos de mmho) , pH de 5.3 a 5.7 y opcionalmente uno o más estabilizantes incluyendo PEG, albúmina de suero humano y manitol; U. S. 4,439,421 expone la adición de una macromolécula hidrofilica, un poliol y otra proteina para estabilizar contra la generación anticomplemento; U. S. 5,945,098 describe la estabilización si soluciones isotónicas por la adición de aminoácidos glicina 0.1 a 0.3 M) y detergentes no-iónicos (polisorbato y PEG); U.S. 4,186,192 describe varios aditivos que incluyen aminoácidos; WO 2005/049078 describe la estabilización con maltosa y adicionalmente glicina a 0.1 M; U.S. 4,362,661 describe el uso de aminoácidos básicos o neutros para impartir estabilidad sobre preparaciones al 5 % de IG. También pueden prepararse formulaciones liquidas estables, que usan carbohidratos en un medio acuoso que tenga una fuerza iónica muy baja y un pH de 4.25 (patente U.S. No. 4,396,608) o un pH de ácido débil de 5-6 (EP 0278422).
También puede controlarse la formación de dimeros de preparaciones de IG. Por ejemplo, la Patente U.S. No. 5,871,736 describe preparaciones de IG, particularmente preparaciones liquidas, que contienen uno o más estabilizantes anfifilicos a fin de estabilizar contra la formación de dimeros. Los estabilizantes anfifilicos incluyen ácido nicotinico y sus derivados, en particular nicotinamida, y principalmente conjuntamente con lo anterior, aminoácidos que tengas cadenas laterales lipofilicas sin carga, por ejemplo, fenilalanina , metionina, leucina, isoleucina, prolina y valina.
Las preparaciones pueden ser preparadas por medio de métodos conocidos en el arte, como se describe en la presente. No obstante, generalmente, el pH de la preparación final es ajustado a un pH relativamente alto pero ácido, es decir en el intervalo de aproximadamente un pH de 4.2 a 5.4, como un pH en el intervalo de 4.6 a 5.1. Se encontró que este intervalo de pH es particularmente útil para mejorar el almacenamiento de preparaciones de IG.
Generalmente, preparaciones de IG finales tienen una concentración de proteina de aproximadamente 5 a 25 % en peso/volumen. Generalmente de 6 a 15 % en peso/volumen, 8 a 12 en peso/volumen, y típicamente 10 % en peso/volumen. La concentración final de proteínas dependerá de varios factores, como la ruta de administración, el paciente a ser tratado, y el tipo de condición a ser tratada.
En la presente se contempló que cualquier preparación de IG usada para administración IV puede ser usada en los métodos proporcionados en la presente en combinación con una hialuronidasa soluble para administración subcutánea. La preparación incluye formulaciones líquidas y liofilizadas . La inmunoglobulina (IVIG) está comercialmente disponible como Carimune® NF, Flebogamma® 5%, Gammagard® Liquid, Gammagard® S/D, Gamunex®, Iveegam® EN, Octagam® y Polygam® S/D. Típicamente, dichas preparaciones usan todas un método de fraccionamiento en frío en medio alcohólico, pero usan diferentes métodos para aislar y purificar la inmunoglobulina y diferentes métodos para reducir la contaminación potencial con virus. Adicionalmente, otras preparaciones actualmente formuladas para administración intramuscular o subcutánea pueden ser usadas en las combinaciones y métodos proporcionados en la presente.
Ejemplar de una preparación de Ig es Inmuno Globulina Intravenosa (Humana), al 10 % (IVIG, 10 % comercializada como Gammagard® líquido, Baxter Healthcare Corporation) , el cual es una preparación de IgG no modificada líquida con una distribución de subclases de IgG similar a la de plasma normal. La preparación contiene el fragmento cristalizable intacto (Fe) y regiones Fab. Las preparaciones contienen 100 mg/mL de proteínas, con al menos 98 % de IgG; IgA está presente a una concentración de 37 µq/m IgM está presente solamente en cantidades en trazas. Tiene una osmolalidad que es similar a la osmolalidad fisiológica y no contiene azúcares, sodio o conservadores añadidos. Está formulada con glicina para estabilización a un pH de 4.6 a 5.1. El proceso de fabricación emplea un procedimiento de fraccionamiento en frío en medio alcohólico de Cohn-Oncley modificado y purificación adicional por un proceso continuo mediante el uso de cromatografía por intercambio catiónico débil y cromatografía por intercambio aniónico débil. El proceso de fabricación también incluye 3 etapas de remoción o de inactivación viral independientes; tratamiento con solvente/detergente (S/D), nanofiltración e incubación a un pH bajo y temperatura elevada.
D. Hialuronidasa Se proporcionan en la presente combinaciones que contienen inmunoglobulina y una hialuronidasa soluble, y métodos de usar dichas combinaciones para administración subcutánea para el tratamiento de enfermedades y condiciones mediadas por IG. Las hialuronidasas son una familia de enzimas que degradan el ácido hialurónico, el cual es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente importante del protector intersticial. Al catalizar la hidrólisis del ácido hialurónico, un constituyente importante del protector intersticial, hialuronidasa, baja la viscosidad del ácido hialurónico, incrementando así la permeabilidad del tejido. Como tal la hialuronidasa ha sido usada, por ejemplo, como un agente dispersante o impartidor de untuosidad conjuntamente con otros agentes, fármacos y proteínas para mejorar su dispersión y liberación. Hialuronidasas ejemplares en las combinaciones y métodos proporcionados en la presente son las hialuronidasas solubles.
Hay tres clases generales de hialuronidasas; hialuronidasa de mamífero, hialuronidasa bacteriana y hialuronidasa de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas de tipo de mamífero (EC 3.2.1.35) son endo--N-acetil-hexoaminidasas que hidrolizan al enlace ß?—>4 glicosídico de hialuronano en varias extensiones de oligosacárido como tetrasacáridos y hexasacáridos . Ambos tienen actividades hidrolítica y transglicosidasa , y pueden degradar hialuronano y sulfatos de condroitina (CS) , generalmente C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas de vacas (vacunas) (SEC ID NOS: 10 y 11), ratón (SEC ID NOS: 17-19, 32), cerdo (SEC ID NOS: 20-21), rata (SEC ID NOS: 22-24, 31), conejo (SEC ID NO: 25), oveja (ovina) (SEC ID NOS: 26 y 27), orangután (SEC ID NO: 28), mono cynomolgus (SEC ID NO: 29), cobayo (SEC ID NO: 30), y hialuronidass humanas.
Las hialuronidasas de mamífero pueden ser adicionalmente subdivididas en aquellas que son de neutro-activas, predominantemente encontradas en extractos de testículos, y ácido-activas, predominantemente encontradas en órganos como el hígado. Las hialuronidasas neutro-activas ejemplares incluyen PH20, que incluyen pero no se limitan a, PH20 derivado de diferentes especies como ovina (SEC ID NO: 27), bovina (SEC ID NO: 11) y humana (SEC ID NO: 1). La PH20 humana (también conocida como SPAMl o PH20 de proteína de superficie espermática) , está generalmente enclavada en la membrana plasmática vía una fijación glicosilfosfatidil inositol (GPI, siglas del inglés GlycosylPhosphatidyl Inositol) . Está naturalmente involucrada en la adhesión huevo-esperma y ayuda a la penetración por el esperma de la capa de células de cúmulo al digerir el ácido hialurónico. El mARN trasncripto de PH20 es normalmente transladado para generar un polipéptido precursor de 509 aminoácidos (SEC ID NO: 1) que contiene una secuencia de señal de 35 aminoácidos en el terminus-N (posiciones de los residuos de aminoácido 1-35) y una fijación GPI de 19 aminoácidos en el terminus-C (posiciones de los residuos de aminoácidos 491-509). El PH20 maduro es, por consiguiente, un polipéptido de 474 aminoácidos expuestos en la SEC ID NO: 2). PH20 bovino es un polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEC ID NO: 11). La alineación del PH20 bovino con el PH20 humano muestra solamente débil homología, con múltiples espacios que existen desde el aminoácido 470 hasta el respectivo termini carboxi debido a la ausencia de una fijación GPI en el polipéptido bovino (véase por ejemplo, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug . Deliv. 4: 427-440). De hecho, ninguna fijación GPI clara es predicha en cualquier especie de PH20 junto a las humanas.. Por consiguiente, los polipéptidos de PH20 producidos a partir de ovinos y bovinos existen como formas solubles. Aunque la PH20 bovina existe muy débilmente fijada a la membrana plasmática, no está fijada vía una fijación sensible a fosfolipasa La Lancette y colaboradores, Biol. Reprod. Agosto de 2001; 65(2): 628-36). Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como un extracto para uso clínico (Wydase™, Hyalase™) . Junto a PH20 humana (también denominada SPAM1), se han identificado en el genoma humano cinco genes similares a hialuronidasa, HYAL1, HYAL2, HYAL3 , HYAL4 y HYALP1. HYALP1 es un pseudogen, y HYAL3 (SEC ID NO: 38) no ha mostrado poseer actividad enzimática hacia cualquiera de los sustratos conocidos. HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en la SEC ID NO: 39) es una condroitinasa y exhibe poca actividad hacia hialuronano. HYAL1 (polipéptido precursor expuesto en la SEC ID NO: 36) es la enzima ácido-activa prototípica y PH20 (polipéptido precursor expuesto en la SEC ID NO: 1) es la enzima neutro-activa prototípica. Hialuronidasas ácido-activas, como HYAL1 y HYAL2 (polipéptido precursor expuesto en la SEC ID NO: 37) generalmente carecen de actividad catalítica a pH neutro (es decir pH de 7) . Por ejemplo, HYAL1 tiene poca actividad catalítica in vitro a pH superior a 4.5 (Frost y colaboradores (1997) Anal. Biochemistry, 251: 263-269). HYAL2 es una encima ácido-activa con una actividad específica muy baja in vitro. Las enzimas similares a hialuronidasas pueden también caracterizarse por aquellas que están generalmente enclavadas a la membrana plasmática vía una fijación glicosilfosfatidil inositol como HYAL2 humana y PH20 humana ( Danilkovitch-Miagkova , y colaboradores (2003) Proc Nati Acad Sci USA. 100 (8):4580-5), y aquellas que son generalmente solubles como la HYAL1 humana (Frost y colaboradores, (1997) Biochem Biophys Res Commun. :236 (1) : 10-5) .
La glicosilación , incluyendo glicosilación N- y 0-ligada, de algunas hialuronidasas puede ser muy importante para su estabilidad y actividad catalítica. Aunque altera el tipo de glicano que modifica a una glicoproteína, puede tener efectos sobre una anteginicidad de la proteína, pliegue estructural, solubilidad, y estabilidad, no se piensa que la mayoría de las enzimas requieran glicosilación para óptima actividad enzimática. Dichas hialuronidasas son únicas a este respecto, porque la remoción de la glicosilación N-ligada puede dar como resultado la inactivación casi completa de la actividad hialuronidasa . Para dichas hialuronidasas la presencia de glicanos N-ligados es critica para generar una enzima activa.
Oligosacáridos N-ligados caen en varios tipos importantes (oligomanosa, compleja, híbrida, sulfatada), todas las cuales tienen núcleos (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc fijados vía el nitrógeno de la amida de residuos Asn que caen en las secuencias Asn-Xaa-Thr/Ser- (donde Xaa no es Pro) . La glicosilación en un sitio Asn-Xaa-Cys ha sido reportada para la proteína C de coagulación. En algunos casos , la hialuronidasa puede contener ambos enlaces N-glicosídico y 0-glicosídico. Por ejemplo, PH20 tiene oligosacáridos O-ligados así como también oligosacáridos N-ligados.
Hay siete sitios potenciales de glicosilación tingados en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana ejemplificados en la SEC ID NO: 1. se forman enlaces disulfuro entre los residuos cisterna C60 y C351 y entre C224 y C238 para formar el dominio hialuronidasa central. No obstante, se requieren cisteínas adicionales en el terminus carboxi para actividad catalítica de la enzima neutra de modo que los aminoácidos 36 a 464 de la SEC ID NO: 1 contienen el dominio hialuronidasa de PH20 humana mínimamente activa. Por consiguiente, el sitio N-490 de glicosilación N-ligada no se requiere para actividad hialuronidasa apropiada.
Hialuronidasa Soluble Se proporcionan en las combinaciones y métodos de la presente hialuronidasas solubles. Las hialuronidasas solubles incluyen cualquiera que exista en forma soluble, incluyendo, pero no limitándose a, HYAL1, PH20 bovina y PH20 ovina, variantes alélilas de éstas y otras variantes. También están incluidas entre las hialuronidasas cualquier hialuronidasa que haya sido modificada para ser soluble. Por ejemplo, PH20 humana, la cual normalmente está enclavada a membrana vía una fijación GPI, puede hacerse soluble por truncado de y remoción de toda o una porción de la fijación GPI en el terminus C. Las hialuronidasas solubles también incluyen hialuronidasas neutro-activas y ácido-activas, no obstante, las hialuronidasas neutro-activas son contempladas en la presente para propósitos de administración subcutánea.
Asi, es ejemplar de hialuronidasa soluble PH20 de cualquier especie, como cualquiera de las expuestas en las SEC ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30 y 31, o formas truncadas de éstas que carecen de toda o una porción de la fijación GPI C terminal, mientras que la hialuronidasa sea soluble y retenga la actividad hialuronidasa. También se incluyen entre las hialuronidasas solubles las variantes alélicas u otras variantes de cualquiera de las SEC ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30 y 31, o formas truncadas de éstas. Las variantes alélilas y otras variantes son conocidas pro los expertos en el arte, e incluyen polipéptidos que tengan 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30 y 31 o formas truncadas de éstas.
Típicamente, para uso en los métodos de la presente se usó una PH20 humana soluble. Aunque puede utilizarse PH20 de otros animales, dichas preparaciones son potencialmente inmunogénicas , ya que son proteínas animales. Por ejemplo, una proporción significativa de pacientes demostraron sensibilidad secundaria previa a la ingesta de alimentos, y ya que éstas son proteínas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilización subsecuente. Por consiguiente, preparaciones no humanas pueden no ser adecuadas para uso crónico. Si se desean preparaciones no humanas, se contempló en la presente que dichos polipéptidos puedan ser preparados para tener inmunogenicidad reducida. Dichas modificaciones están en el nivel de un experto en el arte. Las hialuronidasas , incluyendo PH20, usadas en los métodos de la presente pueden ser producidas recombinantemente o pueden ser purificadas o parcialmente purificadas a partir de fuentes naturales, como, por ejemplo, desde extractos de testículos.
PH20 Humana Soluble Ejemplar de una hialuronidasa soluble es PH20 humana soluble. E han producido las formas solubles de PH20 humana recombinante y pueden ser usadas en los métodos descritos en la presente para co-administración o co-formulación con inmunoglobulina para administración subcutánea para tratar enfermedades y condiciones tratables con IG. La producción de dichas formas solubles de PH20 se describe en las Solicitudes Nos. 11/065,716 y 11/238,171, y en los Ejemplos 2 - 6 posteriores. Las formas solubles incluyen, pero no se limitan a, cualquiera que tenga truncaciones C terminales para generar polipéptidos que contengan los aminoácidos 1 al aminoácido 347, 372, 394, 413, 430, 447, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 1. Cuando se expresa en células de mamífero la secuencia de señal de 35 aminoácidos N terminales es fragmentada durante el procesamiento, y la forma madura de la proteína es secretada. Así, los polipéptidos solubles maduros contienen los aminoácidos 36 a 347, 372, 394, 413, 430, 447, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483 de la SEC ID NO: 1. Los mutantes finales por eliminación en la posición del aminoácido 477 a 483 (correspondientes al polipéptido precursor expuesto en la SEC ID NO: 1) exhiben mayor actividad hialuronidasa secretada que la forma enclavada en GPI de extensión total. Por lo tanto, ejemplares de hialuronidasas solubles son aquellas que son de 442, 443, 444 , 445, 446 y 447 aminoácidos de extensión, como se expone en las SEC ID NOS: 4-9, o variantes alélicas o de especies u otras variantes de éstas. Generalmente, formas solubles de PH20 son producidas usando sistemas de expresión de proteínas que facilitan la N-glicosilación correcta para asegurar que el polipéptido retenga actividad, ya que la glicosilación es importante para la actividad catalítica y la estabilidad de las hialuronidasas. Dichas células incluyen, por ejemplo células de ovario de cobayo (CHO) (por ejemplo, células DG44 de CHO) .
PH20 Recombinan e Humana Soluble (rHuPH20) Se han generado las formas solubles recombinantes de PH20 humana (rHuPH20 soluble) y pueden ser producidas y purificadas usando los métodos descritos en la presente. La generación de dichas formas solubles de rHuPH20 se describe en la Solicitud de Patente U.S. Nos. 11/065,716 y 11/238,171 (publicadas como solicitudes de patentes publicadas U.S. Nos. US 2005/0260186 y US 2006/0104968), y en los Ejemplos 2-6 posteriores. Ejemplares de dichos polipéptidos son aquellos generados a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica a los aminoácidos 1-482 expuestos en la SEC ID NO: 3. El procesamiento post-translacional remueve la secuencia de señal de 35 aminoácidos, dando como resultado la secreción de una rHuPH20 soluble de 447 aminoácidos (SEC ID NO: 4). La rHuPH20 purificada resultante puede ser heterogénea debido a peptidasas presentes en el medio de cultivo, después de la producción y purificación. Típicamente, rHuPH20 es producida en células que facilitan la N-glicosilación correcta para retener la actividad, como células CHO (por ejemplo células DG44 de CHO) .
E.Métodos de Producir Acidos Nucleicos que Codifican a una Hialuronidasa Soluble y a Polipéptidos de Esta Pueden obtenerse polipéptidos de una hialuronidasa soluble expuesta en la presente por medio de métodos bien conocidos en el arte por purificación de proteínas y expresión recombinante de proteínas. Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en el arte para identificación de ácidos nucleicos que codifican a genes deseados. Cualquier método disponible en el arte puede ser usado para obtener un clon de ADN genómico o de cADN de extensión total (es decir, que abarca la región codificadora entera) que codifica a una hialuronidasa, como desde una fuente de célula o de tejido. Las hialuronidasas solubles variantes o modificadas, pueden ser diseñadas a partir de un polipéptido de tipo salvaje, como por mutagénesis en sitio puntual .
Los polipéptidos pueden ser clonados o aislados usando cualquier método conocido en el arte para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Dichos métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y cribado de bibliotecas, incluyendo cribado por hibridización de ácido nucleico, cribado basado en anticuerpos y cribado basado en actividad .
Pueden usarse métodos para amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican a un polipéptido deseado, incluyendo, por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Un material que contiene ácido nucleico puede ser usado como un material inicial desde el cual puede ser aislada una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido. Por ejemplo, pueden usarse en métodos de amplificación, preparaciones de ADN y de mARN, extractos celulares, extractos de tejido, muestras de fluido (por ejemplo, sangre, suero, saliva), muestras de sujetos saludables y/o enfermos. Pueden usarse bibliotecas de ácidos nucleicos como una fuente de material inicial. Los cebadores pueden ser diseñados para amplificar a un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores pueden ser diseñados basados en secuencias expresadas a partir de las cuales es generado un polipéptido deseado. Los cebadores pueden ser diseñados basados en retro-translación de una secuencia de aminoácidos polipeptidicos . Moléculas de ácidos nucleicos generadas por amplificación pueden ser secuenciadas y confirmadas para codificar a un polipéptido deseado.
Moléculas de nucleótidos adicionales pueden ser unidas a una molécula de ácido nucleico que codifica a un 'polipéptido, incluyendo secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción para el propósito de clonar al en sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de secuencias de ADN que codifican al núcleo proteínico. Además, secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales pueden ser enlazadas operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido. Ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de la proteína intracelular , y secuencias de secreción, por ejemplo, secuencias de señal heterólogas, diseñadas para facilitar la secreción proteínica. Dichas secuencias son conocidas por los expertos en el arte. Secuencias de residuos de nucleótidos adicionales como las secuencias de bases que indican regiones de enlace proteínico también pueden ser enlazadas a moléculas de ácido nucleico que codifican a una enzima. Dichas regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias de residuos que facilitan o codifican proteínas que facilitan la captación de una enzima en células objetivo especificas, o de otra manera alteran la farmacocinética de un producto de un gen sintético. Por ejemplo, enzimas pueden ser enlazadas a porciones de PEG.
Además, pueden añadirse marcas u otras porciones, por ejemplo para ayudar en la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, secuencias de residuos de nucleótidos adicionales como secuencias de bases que indican una marca de epítope u otro marcador detectable también pueden ser enlazadas a moléculas de ácidos nucleicos que codifican a una enzima. Ejemplares de dichas secuencias incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican a una marca His (por ejemplo, 6xHis, HHHHHH; SEC ID NO: 54) o Marca Señalizadora (DYKDDDDK; SEC ID NO: 55) .
Los ácidos nucleicos aislados e identificados pueden entonces ser insertados en un vector de clonación apropiado. Pueden usarse numerosos sistemas de huésped-vector conocidos en el arte. Posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector debe de ser compatible con la célula huésped usada. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos como derivados lambda, o plásmidos como pCMV4 , pBR322 o derivados del plásmido pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ejemplificado en la presente. La inserción en un vector de clonación puede, por ejemplo, lograrse ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tenga un termini cohesivo complementario. La inserción puede efectuarse usando vectores de clonación TOPO (INVITROGEN, Carlsbad, CA) . Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden ser modificados enzimáticamente . Alternativamente, cualquier sitio deseado puede ser producido ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) sobre el termini del ADN; estos enlazadores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican a secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector fragmentado y el gen proteínico pueden ser modificados por adición de una cola homopolimérica . Pueden introducirse moléculas recombinantes en células huéspedes vía, por ejemplo, transformación, transíección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generen muchas copias de la secuencia del gen.
En modalidades específicas, la transformación de células huéspedes con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen proteínico aislado, cADN, o secuencias de ADN sintetizado facilitan la generación de muchas copias del gen. Asi, el gen puede ser obtenido en grandes cantidades por crecimiento de transformantes, aislamiento de las moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperación del gen insertado a partir del ADN recombinante aislado. 1.Vectores y Células Para expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, como cualquiera descrita en la presente, el ácido nucleico que contiene toda o una porción de la secuencia del nucleótido que codifica a la proteína puede ser insertado en un vector de expresión adecuado, es decir un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y translación de la secuencia que codifica a la proteína insertada. Las señales translacionales y transcripcionales necesarias también pueden ser suministradas por el promotor nativo para genes enzimáticos, y/o sus regiones de flanqueo.
También se proporcionan vectores que contienen un ácido nucleico que codifica a la enzima. También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células procarioticas y eucarióticas, y los vectores son cualquiera de los adecuados para uso en la presente.
Se porporcionan células procarióticas y eucarióticas , incluyendo células endoteliales, que contienen los vectores. Dichas células incluyen células bacterianas, células de levaduras, células de hongos, Archea, células vegetales, células de insectos y células animales. Las células son usadas para producir una proteina de ésta por crecimiento de las células anteriormente descritas bajo condiciones en las cuales es expresada la proteína codificada por la célula, y recuperando la proteína expresada. Para propósitos de la presente, por ejemplo, las enzimas pueden ser secretadas en el medio.
Se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido de la hialuronidasa soluble acoplado a la secuencia de señal heteróloga o nativa, así como también múltiples copias de éstos. Los vectores pueden ser seleccionados para expresión de la proteína enzimática en la célula o de modo que la proteína enzimática sea expresada como una proteína secretada .
Puede usarse una variedad de sistemas huésped-vector para expresar a la secuencia que codifica a la proteína. Estos incluyen pero nos e limitan a sistemas celulares de mamíferos infectados con virus (por ejemplo, virus de la viruela, adenovirus u otros virus); sistemas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus) ; microorganismos como levaduras que contienen vectores de levaduras; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plásmido, o ADN cósmido. Los elementos de expresión de vectores varían en su fuerza y especificidades. Dependiendo del sistema huésped-vector usado, puede usarse cualquiera de los numerosos elementos de transcripción y translación.
Puede usarse cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en el arte para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que contenga las señales de control transcripcional/translacional apropiadas y secuencias que codifiquen a la proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante in vitro y sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican ala proteína, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de ésta, puede ser regulada por una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de ésta sean expresados en huésped transformado con la(s) molécula (s) de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede ser controlada por medio de cualquier promotor/mej orador conocido en el arte. En una modalidad específica, el promotor no es nativo a los genes para una proteína deseada. Promotores que pueden ser usados incluyen pero no se limitan al promotor precoz de SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal a lo largo de 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y colaboradores Cell 22: 787-797 (1980)), el promotor quinasa timidina del herpes (Wagner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 78: 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster y colaboradores, Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procarióticos como el promotor ß-lactamasa (Jay y colaboradores (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:5543) o el promotor tac (DeBoer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); ver también "Usefull Proteins from Recombinant Bacteria": en Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresión de vegetales que contienen el promotor nopalina sintetasa (Herrara-Estrella y colaboradores, Nature 303:209-213 (1984)) o el promotor 35S ARN del virus mosaico del coliflor (Garder y colaboradores, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética bifosfato de ribulosa carboxilasa (Herrera-estrella y colaboradores, Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores a partir de levaduras y otros hongos como el promotor GAL4 , el promotor alcohol deshidrogenasa , el promotor fosfoglicerol quinasa, el promotor fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional animal que exhiben especificidad de tejido y han sido usadas en animales transgénicos : región de control del gen de elastasa I que está activa en células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, cell 38: 639-646 (1984); Ormitz y colaboradores, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); Mac Donald, Hepatology 7:425-515 (1987)); región control del gen de insulina la cual está activa en células beta pancreáticas (Hanahan y colaboradores, Nature 315:115-122 (1985)), región de control del gen de inmunoglobulina la cual está activa en células linfoides (Grosschedln y colaboradores, Cell 38:647-658 (1984); Adams y colaboradores, Nature 318:533-538 (1985); Alexander y colaboradores, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), región de control del virus de tumor mamario de ratón, la cual está activa en mastocitos, células linfoides, de seno y testiculares (Leder y colaboradores, Cell 45:485-495 (1986)9, región de control del gen de albúmina la cual está activa en hígado (Pinkert y colaboradores, Genes y Devel. 1:268-276 (1987)), región de control del gen de alfa-fetoproteína la cual está activa en hígado (KrumLauf y colaboradores, Mol. Cell Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer y colaboradores, Science 235:53-58 (1987)), región de control del gen de alfa- 1 antitripsina la cual está activa en hígado (Kelsey y colaboradores, Genes y Devel. 1:161-171 (1987)), región de control del gen de beta-globulina la cual está activa en células mieloides (Magram y colaboradores, Nature 315:338-340 (1985); ollias y colaboradores, Cell 46:89-94 (1986)), región de control del gen de la proteína básica de mielina la cual está activa en células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead y colaboradores, Cell 48:703-712 (1987)), región de control del gen de la cadena ligera 2 de miosina la cual está activa en el músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985) ), y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrófica la cual está activa en gonadotrofos del hipotálamo (Masón y colaboradores, Science 234:1372-1378 (1986) ) .
En una modalidad específica, se usa un vector que contiene un promotor ligado operablemente a ácidos nucleicos que codifican a una proteína deseada, o a un dominio, fragmento, derivado u homólogo de ésta, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Vectores plásmidos ejemplares para transformación de células E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también la literatura publicada por Qiagen que describe el sistema) . Los vectores pQE tienen un promotor Fago T5 (reconocido por ARN polimerasa de E. coli) y un doble módulo de represión del operador lac para proporcionar expresión de alto nivel, ligeramente regulada de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de enlace ribosómico sintético (RBS II) para translación eficiente, una secuencia gue codifica a la marca 6Xhis, terminadores transcripcionales t0 y Ti, origen de replicación ColEl, y un gen de beta lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE facilitan la colocación de la marca 6xHis ya sea en el terminus N- o bien en el C- de la proteína recombinante. Dichos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31 los cuales proporcionan múltiples sitios de clonación para los tres macros de lectura y se proporcionan para la expresión de proteínas marcadas con 6xHis N-terminalmente . Otros vectores plásmidos ejemplares para la transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase la Patente U.S. 4,952,496, disponible de NOVAGEN, Madison, WI; véase, también la literatura publicada por Novagen que describe el sistema) . Dichos plásmidos incluyen pET lia, el cual contiene el promotor T71ac, terminador T7, el operador lac de E. coli inducible, y el gen represor lac, pET 12a-c, el cual contiene al promotor T7, terminador T7, y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET 15b y pET 19b (NOVAGEN, Madison, WI), el cual contiene una secuencia líder His-Tag™ para uso en purificación con una columna de His y un sitio de fragmentación de trombina que permite la fragmentación después de purificación sobre la columna , la región promotora lac-T7 y el terminador T7.
Ejemplar de un vector para expresión de células de mamíferos es el vector de expresión HZ24. El vector de expresión HZ24 fue derivado de la estructura principal del vector pCI (Promega) . Contiene ADN que codifica al gen de resistencia a beta-lactamasa (AmpR) , un origen de replicación FI, una región promotora/mejoradora precoz/inmediata de citomegalovirus (CMV) , y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40) . El vector de expresión también tiene un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) a partir del virus de ECMV (Clontech) y el gen de dihidrofoliato reductasa de ratón (DHFR) . 2.Expresión Los polipéptidos de hialuronidasa soluble pueden ser producidos por medio de cualquier método conocido por el experto en el arte incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas pueden ser expresadas en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de las proteínas, como por ejemplo, necesarias para administración y tratamiento. Los huéspedes de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos como E. coli, levaduras, plantas, células de insectos, células de mamíferos, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos . Los huéspedes de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas así como también los tipos de modificaciones post-translacionales que están presentes sobre la proteína expresada. La selección del huésped de expresión puede hacerse con base en estos y otros factores, como consideraciones de seguridad y reguladoras, costos de producción y la necesidad y métodos de purificación .
Muchos vectores de expresión están disponibles y son conocidos por los expertos en el arte y pueden ser usados para expresión de proteínas. La selección del vector de expresión será influenciado por la selección del sistema de expresión del huésped. En general, vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente mejoradores, señales translacionales, y señales de terminación translacional y transcripcional . Vectores de expresión que son usados para transformación estable típicamente tienen un marcador seleccionable que permite la selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, puede usarse un origen de replicación para amplificar el número de copias del vector.
Polipéptidos de hialuronidasa soluble también pueden ser utilizados o expresados como fusiones proteinicas. Por ejemplo, puede generarse una fusión enzimática para añadir funcionalidad adicional a una enzima. Ejemplos de proteínas de fusión enzimática incluyen, pero no se limitan a fusiones de una secuencia de señal, una marca para localización, por ejemplo, una marca his o una marca myc, o una marca para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de la proteína y/o asociación de membrana. a. Células Procarióticas Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es una técnica simple y rápida bien conocida por los expertos en el arte. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducible, dichos promotores son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que exhiban alguna toxicidad para las células huéspedes. Ejemplos de promotores inducibles incluyen al promotor lac, al promotor trp, al promotor tac híbrido, y a los promotores T7 y SP6 ARN y al promotor ? L regulado por temperatura .
Proteínas, como cualquiera de las proporcionadas en la presente, pueden ser expresadas en el ambiente citoplásmico de E. coli. El citoplasma es un ambiente reductor y para algunas moléculas, esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Agentes reductores como ditiotreitol y ß-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como clorhidrato de guanidina y urea pueden ser usados para resolubilizar las proteínas. Un procedimiento alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de bacterias que proporcionan un ambiente oxidante y similar a la chaperonina y disulfuro isomerasas y pueden conducir a la producción de la proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder es fusionada a la proteína para ser expresada, la cual dirige a la proteína al periplasma. La líder es entonces removida por medio de peptidasas de señal en el interior del periplasma. Ejemplos de secuencias líder que tienen como objetivo el periplasma incluyen la líder pelB del gen del pectato liasa y la líder derivada del gen de fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la dispersión de la proteína expresada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas permite la purificación rápida y simple a partir del sobrenadante de cultivo. Proteínas que no son secretadas pueden ser obtenidas a partir del periplasma por medio de lisis osmótica. Similar a la expresión citoplásmica , en algunos casos las proteínas pueden volverse insolubles y pueden usarse agentes desnaturalizantes y reductores para facilitar la solubili zación y re-doblamiento . La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir los niveles de expresión y la solubilidad, típicamente se usan temperaturas entre 25 °C y 37 °C . Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas . Por consiguiente, si las proteínas requieren glicosilación ara funcionar, la glicosilación puede ser añadida in vitro después de purificación a partir de células huéspedes, b . Células de Levaduras Levaduras como Sacharomyces cerevisae, Schizosacharomyces pombe, Yarrowia lipolytica , Kluyveromyces lactis y Pichia pastorís son levaduras huéspedes de expresión bien conocidas que pueden ser usadas para producción de proteínas, como cualquiera de las descritas en la presente. Las levaduras pueden ser transformadas con vectores de replicación episomales o por medio de integración cromosómica estable por recombinación homologa. Típicamente, se usan promotores inducibles para regular la expresión genética. Ejemplos de dichos promotores incluyen los promotores de GAL1, GAL7 y GAL5 y de metalotioneína , como CUP1, AOX1 u otro promotor de Pichia u otra levadura. Los vectores de expresión a menudo incluyen un marcador seleccionable como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en levaduras son a menudo solubles. La co-expresión con chaperoninas como Bip y la proteina disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Adicionalmente, proteínas expresadas en levaduras pueden ser dirigidas para secreción usando fusiones de péptidos de señal de secreción como la señal de secreción del factor-alfa del tipo conjugado a levadura de Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de superficie celular de levaduras como el receptor de adhesión conjugado a Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans . Un sitio de fraccionamiento de proteasa como el Kex-2 proteasa, puede ser diseñado para remover las secuencias fusionadas a partir délos polipéptidos expresados como salen de la trayectoria de secreción. Las levaduras también son capaces de glicosilación en los motivos Asn-X-Ser/Thr . c. Células de Insectos Las células de insectos, particularmente usando expresión en baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos como polipéptidos de hialuronidasa . Las células de insectos expresan altos niveles de proteínas y son capaces de la mayor parte de las modificaciones post-translacionales usadas por eucariotas superiores. Baculovirus tiene un intervalo de huéspedes restrictivo, lo cual mejora la seguridad y reduce las consecuencias reguladoras de la expresión eucariótica. Vectores de expresión típica usan un promotor para expresión de alto nivel como el promotor polihedrina de baculovirus. Los sistemas de baculovirus usados comúnmente incluyen baculovirus como Autographa californica , virus de polihedrosis nuclear (AcNPV, siglas del inglés Autograpa californica Nuclear Polihedrosis Virus), y el Bombyx mori nuclear polihedrosis virus (BmNPV, siglas del inglés Bombyx morí Nuclear Polihedrosis Virus) y una línea celular de insectos como Sf9, derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danus plexippus (DpNl). Para expresión de alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula a ser expresada es fusionada inmediatamente en la dirección del extremo amino libre hacia el extremo carboxi libre del codón de iniciación de polihedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos son procesadas precisamente en células de insectos y pueden ser usadas para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexipus (DpNl) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a sistemas celulares de mamíferos .
Un sistema de expresión alternativo en células de insectos es el uso de células transformadas establemente. Líneas celulares como las células Schneider 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster ) y células C7 (Aedes albopictus) pueden ser usadas para expresión. El promotor netalotioneina de Drosophila puede ser usado para inducir altos niveles de expresión en la presencia de inducción por metales pesados con cadmio o cobre. Vectores de expresión son típicamente mantenidos por el uso de marcadores seleccionables como neomicina e higromicina. d. Células de Mamíferos Sistemas de expresión de mamíferos pueden ser usados para expresar proteínas incluyendo polipéptidos de hialuronidasa soluble. Construcciones para expresión pueden ser transferidas a células de mamíferos por infección viral como adenovirus o por transferencia de ADN directa como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos como electroporación y microinyección . Vectores de expresión para células de mamíferos incluyen típicamente un sitio de encapsulacion de mARN, un bloque TATA, una secuencia de iniciación translacional (secuencia consensus de Kozac) y elementos de poliadenilación . También pueden añadirse elementos IRES para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, como un marcador seleccionable . Dichos vectores a menudo incluyen mej oradores-promotores transcripcxonales para expresión de alto nivel, por ejemplo, el mej orador-promotor de SV40, el promotor de citomegalovirus (CMV) humano y la repetición terminal prolongada del virus del sarcoma de Rous (RSV) . Estos mej oradores-promotores son activos en muchos tipos de células. También pueden ser usados para expresión regiones mejoradoras y promotores de tipo celular y tisular. Regiones mej oradoras/promotoras ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellas de los genes como elastasa I, insulina, inmunoglobulina , virus de tumor mamario de ratón. Albúmina, alfa fetoproteina , antitripsina alfa 1, beta-globina, proteina básica de mielina, cadena ligera 2 de miosina, y control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica . Pueden usarse marcadores seleccionables para seleccionar y mantener células con la construcción de expresión. Ejemplos de genes ¦ marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, higromicina B fosfotransferasa , adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforibosil transferasa, aminoglicósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Por ejemplo, la expresión puede ser efectuada en la presencia de metotrexate para seleccionar solamente aquellas células que expresan al gen de DHFR. La fusión con moléculas señalizadoras de superficie celular como TCR-? y Fct-RI-y pueden dirigir la expresión de proteínas en un estado activo sobre la superficie celular.
Están disponibles muchas lineas celulares para expresión de mamíferos, incluyendo células de ratón, rata, humano, mono, pollo y de hámster. Las líneas celulares ejemplares incluyen pero no se limitan a CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NSO de ratón (no secretoras) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma , células de linfocitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, y HKB. Las líneas celulares están disponibles adaptadas para medio libre de suero lo cual facilita la purificación de las proteínas secretadas desde el medio de cultivo celular. Ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, # de cat . 11619-012) y la línea celular EBNA-1 libre de suero (Pham y colaboradores, (2003) Biotechnol., Bioeng. 84:32-42). Las líneas celulares también están disponibles que estén adaptadas a crecer en medio especial optimizado para expresión máxima. Por ejemplo, células DG44 CHO están adaptadas para crecer en cultivo en suspensión en un medio químicamente definido, libre de producto animal. e .Vegetales Células vegetales transgénicas y plantas pueden ser usadas para expresar proteínas como cualquiera descrita en la presente. Construcciones de expresión son típicamente transferidas a plantas usando transferencia directa de ADN como bombardeo de microproyectil y transferencia mediada por PEG en protoplastos , y con transformación mediada por agrobacterium . Los vectores de expresión pueden incluir secuencias mejoradoras y promotoras, elementos de terminación transcripcional y elementos de control translacional . Vectores de expresión y técnicas de transformación son usualmente divididas entre huéspedes dicotiledóneos, como Arabidopsis y tabaco, y huéspedes monocotiledóneos , como maíz y arroz. Ejemplos de promotores vegetales usados para expresión incluyen el promotor del virus mosaico de colifor, el promotor nopalina sintasa, el promotor bifosfato de ribosa carboxilasa y los promotores ubiquitina y UBQ3. A menudo son usados marcadores seleccionables como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa, para facilitar la selección y mantenimiento de células transformadas. Células vegetales transformadas pueden ser mantenidas en cultivo como células, aglomerados (tejido calloso) o regenerado en plantas enteras. Células vegetales transgénicas también pueden incluir algas diseñadas para producir polipéptidos de hialuronidasa . Porque las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación que células de mamíferos, esto puede influir la selección de la proteína producida en estos huéspedes. 3. écnicas de Purificación El método para purificación de polipéptidos, incluyendo polipéptidos de hialuronidasa soluble u otras proteínas, a partir de células huéspedes depender-a de las células huéspedes y de los sistemas de expresión seleccionados. Para moléculas secretadas, las proteínas son purificadas generalmente a partir del medio de cultivo después de remoción de las células. Para expresión intracelular , las células pueden ser lisadas y las proteínas purificadas a partir del extracto. Cuando organismos transgénicos como vegetales y animales transgénicos son usados para expresión, tejidos u órganos pueden ser usados como material inicial para elaborar un extracto celular lisado. Adicionalmente la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos los cuales pueden ser colectados, y si es necesario, las proteínas pueden ser extraídas y purificadas adicionalmente usando métodos estándares en el arte.
Las proteínas, como polipéptidos de hialuronidasa soluble, pueden ser purificadas usando técnicas de purificación de proteínas estándares conocidas en el arte que incluyen pero no se limitan a, SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño y fracción de tamaño, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía por intercambio iónico, como intercambio aniónico. Las técnicas de purificación por afinidad también pueden ser utilizadas para mejorar la eficiencia y la pureza de las preparaciones. Por ejemplo, anticuerpos, receptores y otras moléculas que enlazan a enzimas hialuronidasas pueden ser usados en purificación por afinidad. Construcciones para expresión también pueden ser diseñados para añadir una marca de afinidad a una proteina como un epitope myc, fusión GST o His6 y purificada por afinidad con el anticuerpo de myc, la resina glutatión y la resina Ni respectivamente.. La pureza puede ser evaluada por cualquier método conocido en el arte incluyendo técnicas de electroforesis sobre gel y de tinción y espectrofotométricas .
F . Preparación , Formulación y Administración de Inmunoglobulinas y Polipéptidos de Hialuronidasa Soluble Se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas de inmunoglobulinas y hialuronidasas solubles para administración subcutánea. Las formulaciones de composiciones farmacéuticas de hialuronidasas, por ejemplo, PH20, son conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Solicitudes U.S. Nos. US200 /0268425, US2005/0260186 y US2006/0104968 ) . Las hialuronidasas son co-formuladas o coadministradas con formulaciones farmacéuticas de inmunoglobulina para mejorar la liberación de inmunoglobulinas en sitios deseados en el cuerpo incrementando la biodisponibilidad de inmunoglobulinas . Por ejemplo, la co-administración o co-formulación de IG con una hialuronidasa puede mejorar el grado y/o la velocidad de absorción y por consiguiente la biodisponibilidad de un agente causando que más de él, alcance el torrente sanguíneo y/o menos de él, sea degradado después de administración por permeación más rápida. Lograrse absorción y biodisponibilidad crecientes, por ejemplo, acelerando el flujo intersticial y potencialmente el transporte colectivo después de administración por aplicación de presión hidrostática asociada con inyección del volumen combinada la reducción en la impedancia para flujo asociado con la degradación de hialuronano. Por consiguiente, pueden usarse hialuronidasas solubles para lograr concentraciones elevadas y/o más rápidamente logradas de la inmunoglobulina después de administración subcutánea en comparación con métodos convencionales de administración subcutánea, para proporcionar, por ejemplo, una respuesta más potente y/o más rápida para una dosis dada. Alternativamente, la hialuronidasa soluble puede ser usada para permitir una respuesta dada sea lograda con una dosis más baja de IG administrada. La habilidad de una hialuronidasa soluble para mejorar el flujo de fluido global en y cerca de un sitio de inyección o infusión también puede mejorar otros aspectos de la liberación farmacológica asociada. Por ejemplo, el incremento el flujo de fluido global puede ayudar a permitir que el volumen de fluido inyectado sea más fácilmente dispersado desde el sitio de inyección (reduciendo dolor potencial u otras consecuencias adversas de la inyección) . Esto es particularmente importante para infusiones subcutáneas para permitir que dosis más altas sean administradas. Además de la biodisponibilidad creciente, la co-administración o co-formulación de IG con hialuronidasa soluble proporciona una ruta de administración más conveniente o más segura en comparación con las rutas de administración intravenosas convencionales.
Por consiguiente, en virtud de la biodisponibilidad creciente, las inmunoglobulinas pueden ser administradas subcutáneamente a dosificaciones y frecuencias para las cuales las preparaciones intravenosas (IVIG) corrientes son preparadas y administ adas. Las ventajas sobre las formulaciones subcutáneas corrientes de IG es que Hialuronidasa/IG co-administrada o co-formulada puede dar como resultado regímenes de dosificación más favorables, por ejemplo, dosificación menos frecuente, Por menos frecuente o dosificación más baja, los efectos secundarios asociados con la toxicidad pueden ser reducidos. Generalmente, la farmacocinética y/o farmacodinámica de la terapia con IG subcutánea es mejorada. Además, administraciones subcutáneas de IG también tienen ventajas sobre las infusiones intravenosas corrientes. Por ejemplo, la infusión subcutánea permite la infusión por el paciente o la familia opuestamente a una enfermera experta, la infusión puede lograrse a velocidades más altas de modo que la IG sea infusionada en 1-3 horas en vez de 5 - 10 horas para terapias IVIG convencionales; no hay requerimiento para venas funcionales; no hay efectos secundarios relacionados con la infusión, como trombosis, jaqueca, tromboflebitis, y náuseas y menos probabilidad de eventos adversos; y la infusión puede efectuarse en casa o en cualquier parte.
Las composiciones pueden ser formuladas en forma líquida o, liofilizada. Cuando las composiciones son proporcionadas en forma liofilizada pueden ser reconstituidas justamente antes de uso por medio de un regulador apropiado, por ejemplo, una solución salina estéril. Las composiciones pueden ser proporcionadas juntas o separadamente. Para propósitos de la presente, dichas composiciones típicamente se proporcionan separadamente. La hialuronidasa soluble y la IG pueden ser empacadas como composiciones separadas para administración juntas, secuencial o intermitentemente. Las composiciones pueden ser empacadas como un equipo. 1. Formulaciones Los compuestos pueden ser formulados en cualquiera de las preparaciones farmacéuticas adecuadas para administración subcutánea como soluciones, suspensiones, polvos, o formulaciones de liberación sostenida. Típicamente, los compuestos son formulados en composiciones farmacéuticas que usan técnicas y procedimientos bien conocidos en el arte (véase por ejemplo, Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Cuarta Edición, 1985, 126) . Las composiciones farmacéuticas aceptables son preparadas en vista de aprobaciones para una agencia reguladora u otra agencia preparada de conformidad con la Farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y en humanos. La formulación deberá adaptarse al modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores como diluyentes, adyuvantes, excipientes, o vehículos con los cuales la hialuronidasa o la IG es administrada. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad efectiva terapéuticamente del compuesto, generalmente en forma purificada o en forma parcialmente purificada, junto con una cantidad adecuada de portador de modo de proporcionar la forma para administración apropiada al paciente. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen animal, vegetal, de petróleo o sintético, como aceite de cacahuate, aceite de semilla de soya, aceite mineral, y aceite de sésamo. El agua es un portador típico cuando la composición farmacéutica es administrada intravenosamente. También pueden emplearse soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol, como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un ingrediente activo: un diluyente como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico, o carboximetil celulosa; un lubricante, como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante como almidón, gomas naturales, como goma arábiga, gelatina, glucosa, molasas, polivinil pirrolidina, celulosas y derivados de éstas, povidona, crospovidonas y otras aglutinantes diferentes conocidos por el experto en el arte. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, carbonato cálcico, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilenglicol , agua, y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes reguladores del pH, por ejemplo acetato de sodio, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina , monolaureato de sorbitan, trietanolamina , oleato de trietanolamina, y otros de dichos agentes.
Los compuestos activos terapéutica y farmacéuticamente y derivados de éstos son formulados típicamente y administrados en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiple. Cada dosis unitaria contiene una cantidad pre-determinada de compuesto activo terapéuticamente suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Ejemplos de formas de dosis unitaria incluyen ampolletas y jeringas y tabletas o cápsulas empacadas individualmente. Las formas de dosis unitaria pueden ser administradas en fracciones o múltiples de éstas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitaria idénticas empacadas en un contenedor individual para ser administrada en forma de dosis unitaria segregada. Ejemplos de formas de dosis múltiple incluyen frasquitos, botellas de tabletas o cápsulas o botellas de pintas o galones. Por lo tanto, forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitaria que no son segregadas al empacar. Generalmente, pueden prepararse formas de dosificación o composiciones que contienen ingrediente activo en el intervalo de 0.005 % a 100 % con el equilibrio hecho de portador no tóxico.
Las composiciones proporcionadas en la presente típicamente son formuladas para administración por la ruta subcutánea, aunque se contemplan otras rutas de administración, como cualquier ruta conocida por el experto en el arte incluyendo inyección intramuscular, intravenosa, intradérmica , intralesiones, inyección intraperitoneal , administración epidural, nasal, oral, vaginal, rectal, tópica, local, ótica, inhalacional , bucal (por ejemplo, sublingual) y transdérmica o cualquier ruta. Formulaciones adecuadas para dichas rutas son conocidas por un experto en el arte. La administración puede ser local, tópica o generalizada dependiendo del locus del tratamiento. La administración local a un área en necesidad de tratamiento puede lograse, por ejemplo, pero no limitándose a, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo conjuntamente con un aposito de herida después de cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante. Las composiciones pueden ser administradas con otros agentes activos biológicamente, ya sea secuencial o intermitentemente o en la misma composición. La administración también puede incluir sistemas de liberación controlada incluyendo formulaciones de liberación controlada y dispositivos de liberación controlada, como por medio de una bomba.
La ruta más adecuada en cualquier caso dado depende de una variedad de factores, como la naturaleza de la enfermedad, el progreso de la enfermedad, la severidad de la enfermedad, la composición particular que es usada. Para propósitos de la presente, se desea que la hialuronidasa sea administrada de modo que alcance el intersticio de piel o tejidos, degradando asi el espacio intersticial, por liberación subsecuente de inmunoglobulina . Por consiguiente, se contempló la administración directa bajo la piel, como por métodos de administración subcutánea. Asi, en un ejemplo, la administración local puede lograrse por inyección, como desde una jeringa u otro articulo de fabricación que contenga un dispositivo de inyección como una aguja. En otro ejemplo, la administración local puede lograrse por infusión, la cual puede ser facilitada por medio del uso de una bomba u otro dispositivo similar. También se contemplan otros modos de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas en formas de dosificación apropiadas para cada ruta de administración.
Se contempla en la presente la administración subcutánea, generalmente caracterizada por inyección o infusión. Los inyectables pueden ser preparados en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de inyección, o como emulsiones. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Las composiciones farmacéuticas pueden contener otras cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas como agentes humectantes o emulsificantes , agentes reguladores de pH, estabilizantes, mejoradores de solubilidad, y otros de dichos agentes, como por ejemplo, acetato de sodio, monolaureato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas . Se contempla también en la presente la implantación de un sistema de liberación sostenida o lenta, de modo que un nivel constante de dosificación sea mantenido (véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 3,710,795). El porcentaje de compuesto activo contenido en dichas composiciones es muy dependiente de la naturaleza específica de éste, así como también de la actividad del compuesto y de las necesidades del sujeto.
Los inyectables son diseñados para administración local y generalizada. Para propósitos de la presente, la administración local es deseada para administración directa al intersticio afectado. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, como polvos liofilizados, listos para ser combinados con un solvente justamente antes de uso, que incluyen tabletas hipodérmicas , suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser combinados con un vehículo justamente antes de uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser ya sea acuosas o bien no acuosas. Si se administran intravenosamente, portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina regulada con fosfato (PBS), y soluciones que contengan agentes espesantes y solubilizantes, como glucosa, polietilenglicol , y propilenglicol y mezclas de éstos.
Los portadores aceptables farmacéuticamente usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, reguladores, antioxidantes, anestésicos locales, agentes dispersantes y para suspensión, agentes emulsificantes , agentes secuestrantes o quelante y otras sustancias aceptables farmacéuticamente. Ejemplos de vehículos acuosos incluyen Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa Isotónica, Inyección de Agua Estéril, Inyección de Ringer Lacteada y Dextrosa. Vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo, y aceite de cacahuate. Pueden añadirse gentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a preparaciones parenterales empacadas en contenedores de dosis múltiple, los cuales incluyen, los cuales incluyen fenoles o cresoles, mercurianos, alcohol bencílico, clorobutanol , ásteres metílico y propílico del ácido p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Reguladores incluyen fosfato y citrato. Antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Agentes de suspensión y dispersantes incluyen carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropil metilcelulosa y polivinilpirrolidona . Agentes emulsificantes incluyen Polisorbato 80 (TEENs 80) . Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para ajuste de pH .
La concentración del compuesto activo farmacéuticamente es ajustada de modo que una inyección proporcione una cantidad efectiva para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, peso y condición del paciente o animal como es sabido en el arte. Las preparaciones parenterales en dosis unitaria son empacadas en una ampolleta, un frasquito o una jeringa con aguja. El volumen de solución liquida o preparación de polvo reconstituido, que contenga el compuesto activo farmacéuticamente, es una función de la enfermedad a ser tratada y del articulo de fabricación particular seleccionado para empaque. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles; como es sabido y practicado en el arte.
En un ejemplo, la preparación farmacéutica puede estar en forma liquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones. Si se proporciona en forma líquida, las preparaciones farmacéuticas pueden ser proporcionadas como una preparación concentrada para ser diluida a una concentración efectiva terapéuticamente antes de uso. Dichas preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos aceptables farmacéuticamente como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas) ; agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metil o propil p-benzoatos o ácido sórbico) . En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas pueden ser presentadas en forma liofilizada para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso.
Pueden emplearse métodos de administración para disminuir la exposición de compuestos seleccionados a procesos degenerativos, como degradación proteolítica e intervención inmunológica vía antigénica y respuestas inmunogénicas . Ejemplos de dichos métodos incluyen administración local en el sitio de tratamiento. La PEGilación de productos terapéuticos se ha reportado que incrementa la resistencia a la proteolisis, incrementa la vida media plasmática y disminuye la antigenicidad y la inmunogenicidad . Ejemplos de metodologías de PEGilación son conocidos en el arte (véase por ejemplo, Lu y Félix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu y Félix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Félix y colaboradores, Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 1995; Benhar y colaboradores, J. Biol. Chem., 269:13398-404, 1994; Brumeanu y colaboradores, J. Immunol., 154: 3088-95, 1995; véase también Caliceti y colaboradores (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (10) : 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23(8 Pt 2): 3S-8S). La PEGilación también puede ser usada en la liberación de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por ejemplo, la PEGilación de adenovirus puede incrementar la estabilidad y la transferencia genética (véase, por ejemplo, Cheng y colaboradores (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51).
Polvos Liofilizados Son de interés en la presente los polvos liofilizados, los cuales pueden ser reconstituidos para administración como soluciones, emulsiones y otras mezclas. Pueden también ser reconstituidos y formulados como sólidos o geles .
El polvo liofilizado, estéril, es preparado disolviendo un compuesto activo en una solución reguladora. La solución reguladora puede contener un excipiente, el cual mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o solución reconstituida, preparada a partir del polvo. La filtración estéril subsecuente de la solución seguida por liofili zación bajo condiciones estándares conocidas por los expertos en el arte proporciona la formulación deseada. Resumiendo, el polvo liofilizado es preparado disolviendo un excipiente, como dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado, en un regulador adecuado, como citrato de sodio o fosfato de potasio u otro regulador diferente conocido por los expertos en el arte. Luego, se añade una enzima seleccionada a la mezcla resultante, y se agita hasta que disuelva. La mezcla resultante es filtrada en medio estéril o tratada para remover partículas y asegurar la esterilidad, y se distribuye en frasquitos para liofilización . Cada frasquito contiene una dosificación individual o dosificaciones múltiples del compuesto. El polvo liofilizado puede ser almacenado bajo condiciones apropiadas, como a aproximadamente 4 °C a temperatura ambiente. La reconstitución de este polvo liofilizado con una solución reguladora proporciona una formulación para uso en administración parenteral. 2.Dosificación y Administración La hialuronidasa soluble proporcionada en la presente puede ser formulada como composiciones farmacéuticas, típicamente para administración en dosificación individual, en combinación con la IG. La hialuronidasa soluble seleccionada es incluida en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil de la IG en la ausencia de efectos secundarios indeseables sobre el paciente tratado. La concentración terapéuticamente efectiva puede ser determinada empíricamente probando los polipéptidos en sistemas in vitro e in vivo conocidos como por medio del uso de ensayos proporcionados en la presente o conocidos en el arte (véase por ejemplo, Taliani y colaboradores (1996) Anal. Biochem. , 240: 60-67; Filocamo y colaboradores (1997) J. Virology, 71:1417-1427; Sudo y colaboradores (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard y colaboradores (1995) Virology, 209: 52-59; Bianchi y colaboradores (1996) Anal. Biochem. , 237: 239-244; Hamatake y colaboradores (1996) Intervirology 39: 249-258; Steinkuhler y colaboradores (1998) Biochem., 37:8899-8905; D' Souza y colaboradores (1995) J. Gen. Virol., 76: 1729-1736; Takeshita y colaboradores (1997) Anal. Biochem., 247: 242-246; véase también por ejemplo Shimizu y colaboradores (1994) J. Virol. 68:8406-8408; izutani y colaboradores (1996) J. Virol. 70: 7219-7223; Mizutani y colaboradores (1996) Biochem. Biophys . Res. Commun . , 227: 822-826; Lu y colaboradores (1996) Proc. Nati. Acad. Sci . (USA) , 93:1412-1417; Hahm y colaboradores, (1996) Virology, 226: 318_326; Ito y colaboradores (1996) J. Gen. Virol., 77: 1043-1054; Mizutani y colaboradores (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun, 212: 906-911; Cho y colaboradores (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 y luego extrapolados a partir de éstos para dosificación a humanos.
Típicamente, una dosis efectiva terapéuticamente es a o aproximadamente 500 Unidades a 100,000 Unidades de una hialuronidasa soluble. Por ejemplo, hialuronidasa soluble puede ser administrada subcutáneamente a o aproximadamente 500 unidades, 1,000 Unidades, 2,000 Unidades, 5,000 Unidades, 10,000 Unidades, 30,000 Unidades, 40,000 Unidades, 50,000 Unidades, 60,000 Unidades, 70,000 Unidades, 80,000 Unidades, 90,000 Unidades, 100,000 Unidades o más. En algunos ejemplos, pueden proporcionarse dosificaciones como una proporción de la IG administrada. Por ejemplo, la hialuronidasa puede ser administrada a 10 U/g a 500 U/g o más de IG, por ejemplo a o aproximadamente 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g o más. Típicamente, volúmenes de inyecciones o infusiones de hialuronidasa contemplados en la presente son desde o aproximadamente 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL o más. La hialuronidasa puede ser proporcionada como una solución madre a o aproximadamente 50 U/mL, 100 U(mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 400 U/mL o 500 U/mL o puede ser proporcionada en una forma más concentrada, por ejemplo a o aproximadamente 1,000 U/mL, 1,500 U/mL, 2,000 U/mL, 4 , 000 U/mL o 5, 000 U/mL para uso directamente o para dilución a la concentración efectiva antes de uso. La hialuronidasa soluble puede ser proporcionada como una formulación líquida o liofilizada. Formulaciones liofilizadas son ideales para almacenamiento de grandes dosis de Unidades de hialuronidasa soluble.
Las preparaciones de inmunoglobulina proporcionadas en la presente pueden ser formuladas como composiciones farmacéuticas para uso en dosificación individual o múltiple. Generalmente, las preparaciones de IG son formuladas en composición farmacéuticas para lograr regímenes de dosificación (dosis y frecuencias) para las cuales son preparadas las preparaciones intravenosas (IVIG) corrientes y administradas para enfermedades o condiciones tratables por IG particulares. Un experto en el arte está familiarizado con regímenes de dosificación para administración IVIG de enfermedades o condiciones particulares. Por ejemplo, la sección H posterior proporciona regímenes de dosificación ejemplares (dosis y frecuencias) de IG para enfermedades y condiciones particulares. Otros regímenes de dosificación son bien conocidos por los expertos en el arte. En algunos ejemplos, la frecuencia de dosificación puede ser diaria durante un intervalo de tiempo dado durante días consecutivos o alternados, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días. En otros ejemplos, el régimen de dosificación es semanalmente, por ejemplo, una vez cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas o más. Típicamente, preparaciones de inmunoglobulina son formuladas para administración en dosis individual en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de una vez mensualmente, pero puede ser proporcionada en cantidades menores para administraciones en dosificación múltiple. Por ejemplo, dosis de una vez mensualmente de preparaciones de IG pueden ser administradas diariamente, semanalmente , bisemanalmente o una vez al mes. Regímenes de dosificación pueden ser continuos por meses o años. Las preparaciones de IG pueden ser proporcionadas en forma líquida o liofilizada como se discutió en otra parte de la presente.
La inmunoglobulina es proporcionada en una dosis efectiva terapéuticamente. La concentración efectiva terapéuticamente puede ser determinada empíricamente probando los compuestos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, como los ensayos proporcionados en la presente. La concentración de una inmunoglobulina seleccionada en la composición depende de la absorción, inactivación y velocidades de excreción del complejo, las características fisicoquímicas del complejo, el programa de dosificación, y cantidad administrada así como también otros factores conocidos por el experto en el arte. Por ejemplo, se comprende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento es una función del tejido que es tratado y puede ser determinada empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o por extrapolación a partir de datos de prueba in vivo o in vitro. Se hace notar que los valores de las concentraciones y de la dosificación pueden también variar con la edad del individuo tratado. Adicionalmente, se comprende que para cualquier sujeto particular, regímenes de dosificación específicos deberán ser ajustados con el tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las formulaciones, y que los intervalos de concentración expuestos en la presente son solamente ejemplares y no están previstos para limitar el alcance de ésta. La cantidad de una preparación de inmunoglobulina seleccionada a ser administrada para el tratamiento de una enfermedad o condición, por ejemplo una enfermedad o condición tratable con IG, puede ser determinada por medio de técnicas clínicas estándares. Además, ensayos in vitro y modelos animales pueden ser empleados para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos.
Por consiguiente, la dosificación precisa, la cual puede ser determinada empíricamente, puede depender de la preparación de inmunoglobulina particular, el régimen y el programa de dosificación con la hialuronidasa soluble, la ruta de administración, el tipo de enfermedad a ser tratada y la seriedad de la enfermedad. Generalmente, las preparaciones de IG tienen una concentración de proteína que es o es de aproximadamente 5 a 15 % en peso/volumen, 6 a 15 % en peso/volumen, u 8 a 12 % en peso/volumen de composición de IG, como, por ejemplo, 10 % en peso/volumen. Por ejemplo, IG es proporcionada en una cantidad que permita la administración subcutánea de una dosis equivalente a una dosis IV de una vez mensualmente para la indicación particular que es tratada. La dosis IV una vez mensualmente particular es una función de la enfermedad a ser tratada, y asi puede variar. Intervalos de dosificación ejemplares para administración subcutánea de IG son desde a o aproximadamente 1 gramo (g) , 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g, o 200 g. La dosificación particular y las formulaciones de ésta dependen de la indicación y del individuo. Por ejemplo, pueden administrarse dosificaciones a 50 mg/kg de peso corporal (PC) , 100 mg/kg de PC, 200 mg/kg de PC, 300 mg/kg de PC, 400 mg/kg de PC, 500 mg/kg de PC, 600 mg/kg de PC, o más. Si es necesario la dosificación puede determinarse empíricamente. Para lograr dichas dosificaciones, volúmenes de preparaciones de IG administrados subcutáneamente pueden ser a o aproximadamente 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL o más. Por ejemplo, una formulación líquida de IG al 10 % (100 mg/mL) para indicaciones descritas en la presente, puede ser administrada en un volumen de 50 mL a 700 mL para lograr una dosificación de 0.5 g a 70 g de IG.
Cuando son administrados grandes volúmenes, la administración es típicamente por infusión. Los sujetos pueden ser dosificados a velocidades de infusión a o aproximadamente 0.5 mL/kg de PC/h, 1 mL/kg de PC/h, 2 mL/kg de PC/h, 3 mL/kg de PC/h, 4 mL/kg de PC/h, o 5 mL/kg de PC/h. La velocidad de infusión puede ser determinada empíricamente, y típicamente es una función de la tolerancia del sujeto. Si tiene lugar una reacción adversa durante la infusión, la velocidad de infusión puede bajarse a la velocidad inmediatamente inferior a la cual tuvo lugar el evento adverso. Si el evento adverso se resuelve en respuesta a la reducción en la velocidad, la velocidad de infusión puede ser incrementada lentamente a discreción del médico. Las infusiones de IG subcutáneas pueden ser facilitadas por la gravedad, infusión por bombeo o inyección de una dosis total de 20 a 30 gramos. Generalmente, para infusión intravenosa, pueden emplearse las bombas de infusión. IG puede ser infusionada a velocidades a o de aproximadamente 5 mL/h, 10 mL/h, 30 mL/h, 60 mL/h, 120 mL/h, 240 mL/h o 300 mL/h. Las velocidades de infusión pueden ser incrementadas durante el transcurso del tratamiento siempre que la infusión sea tolerada por el paciente. Generalmente, el tiempo de administración de la infusión es a o de aproximadamente 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h, 3 h, 4 h o más. Debido a la alta velocidad de infusión lograda por administración subcutánea de IG coformulada y/o coadministrada con hialuronidasa , el tiempo de infusión es significativamente menos que para las terapias IVIG convencionales. Cuando el tiempo de infusión excede el limite deseado, puede iniciarse un segundo sitio de infusión a discreción del sujeto y del médico. El segundo sitio típicamente es iniciado al menos 10 cm del sitio inicial.
Las técnicas para infusión son conocidas por un experto en el arte, y está en la experiencia de un médico tratante. Generalmente, la dosis apropiada de IG puede ser conjuntada en una bolsa de IV estándar. Por ejemplo, puede usarse un equipo para infusión sin venteo que tenga un puerto en "Y" cerca de su terminus. Puede insertarse una aguja para infusión subcutánea calibre 24 en un sitio de la preferencia del sujeto, pero el abdomen y en segundo término los muslos son recomendados por el volumen de solución a ser infusionado. La hialuronidasa y la IG pueden ser proporcionadas en el mismo equipo de puerto en "Y". También pueden usarse en la presente otros artículos de fabricación para propósitos de infusión por gravedad o una bomba, e incluyen pero no se limitan a tubos, botellas, jeringas u otros contenedores.
La hialuronidasa soluble puede ser administrada subsecuente, intermitente o simultáneamente de la preparación de IG. Generalmente, la hialuronidasa es administrada antes de la administración de la preparación de IG para permitir a la hialuronidasa degradar el ácido hialurónico en el espacio intersticial. Por ejemplo, la hialuronidasa soluble puede ser administrada 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 20 minutos, o 30 minutos antes de la administración de la preparación de IG. En algunos ejemplos, la hialuronidasa es administrad ajunto con la preparación de inmunoglobulina . Como apreciarán los expertos en el arte, al proximidad deseada de co-administración depende en parte significativa de la vida media efectiva de los agentes en el tejido particular involucrado, y de la enfermedad particular que es tratada, y puede ser optimizada fácilmente probando los efectos de administrar los agentes a tiempos variables en modelos adecuados, como en modelos animales adecuados. En algunas situaciones, el tiempo óptimo de administración de la hialuronidasa excederá de 60 minutos.
Generalmente, antes de infusión de IG, es inyectada una hialuronidasa soluble a una velocidad de o de aproximadamente 0.2 mL/min, 0.5 mL/min, 1 mL/min, 2 mL/min, 5 mL/min, 10 mL/min o más. Por ejemplo, la hialuronidasa soluble puede ser inyectada a través del mismo puerto en "Y" usado para infusión subsecuente de IG. Como se indicó anteriormente, el volumen de hialuronidasa soluble administrada es una función de la dosificación requerida, pero puede variar dependiendo de la concentración de una formulación madre de hialuronidasa soluble disponible. Por ejemplo, se contempló en la presente que la hialuronidasa soluble no sea administrada en volúmenes mayores que aproximadamente 50 mL, y típicamente es administrada en un volumen de 5 - 30 mL. Puede usarse una bomba de jeringa para los volúmenes mayores, a discreción del médico.
En el caso en el que una infusión no sea tolerada (por ejemplo, cause reacciones locales moderadas a severas), puede iniciarse un segundo sitio de infusión de modo que el sujeto reciba la dosificación total.
Una preparación de IG puede ser administrada en una vez, o puede ser dividida en un número de dosis más pequeñas a ser administradas a intervalos de tiempo. Las preparaciones de Ig seleccionadas pueden ser administradas en una o más dosis durante el transcurso de un tiempo de tratamiento, por ejemplo, durante varias horas, días, semanas, o meses. En algunos casos, es útil la administración continua. Se entiende que la dosificación precisa y el curso de administración depende de la indicación y tolerancia del paciente .
También, se comprende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento es una función de la enfermedad que es tratada y pueden ser determinados empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o por extrapolación de datos de pruebas in vivo e in vitro. Se hace notar que los valores de concentraciones y dosificaciones también pueden variar con la severidad de la condición a ser aliviada. Adicionalmente, se comprende que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deberán ser ajustados con el tiempo de conformidad con la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las composiciones, y que las variaciones de concentración expuestas en la presente son ejemplares solamente y no están previstas para limitar el alcance o uso de composiciones y combinaciones que las contienen. Las composiciones pueden ser administradas horaria, diaria, semanal, mensualmente o una vez. Generalmente, regímenes de dosificación son seleccionados para limitar la toxicidad. Se debe hacer notar que el médico que atiende deberá saber cómo y cuando terminar, interrumpir o ajusfar la terapia a dosificación más baja debido a la toxicidad, o disfunciones de la médula ósea, de hígado o de riñon o de otro tejido. Contrariamente, el médico que atiende también debe saber cómo y cuando ajusfar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica no es adecuada (previniendo efectos tóxicos secundarios) .
G.Mé odos de Evaluar la Actividad, Biodisponibilidad y Farmacocinética Pueden usarse ensayos para evaluar las actividades in vivo e in vitro de inmunoglobulina sola o en combinación con una hialuronidasa soluble. Entre dichos ensayos se incluyen aquellos que evalúan las propiedades farmacocinéticas de inmunoglobulina administrada subcutáneamente, que incluyen la biodisponibilidad y la tolerancia. La actividad biológica de ambas, inmunoglobulina y hialuronidasa soluble también puede ser evaluada usando ensayos bien conocidos en el arte. Dichos ensayos pueden ser usados, por ejemplo, para determinar dosificaciones apropiadas de inmunoglobulina y hialuronidasa, y la frecuencia de dosificación, para tratamiento. 1. Farmacocinética y Tolerancia Los estudios farmacocinéticos y de tolerancia , como los descritos en el Ejemplo 1 posterior, pueden ser efectuados usando modelos animales o pueden ser efectuados durante estudios clínicos con pacientes. Los modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, perros, cobayos y modelos primates no humanos, como los monos cinomolgus o los macacos rhesus. En algunos casos, los estudios farmacocinéticos y de tolerancia son efectuados usando animales saludables. En otros ejemplos, los estudios son efectuados usando modelos animales de una enfermedad para la cual es considerada la terapia con inmunoglobulina , como modelos animales de cualquiera de las enfermedades y condiciones descritas posteriormente.
La farmacocinética de la inmunoglobulina administrada subcutáneamente puede ser evaluada midiendo dichos parámetros como la concentración plasmática máxima (pico) de inmunoglobulina (Cmax) , el tiempo pico, (es decir, cuando tiene lugar la concentración plasmática máxima de inmunoglobulina (Tmax) ) , la concentración plasmática mínima de inmunoglobulina (es decir la concentración plasmática mínima entre dosis de inmunoglobulina; Cmin) , la vida media de eliminación (Tl/2) y el área bajo la curva (es decir, el área bajo la curva generada por graficación del tiempo contra la concentración plasmática de inmunoglobulina; AUC) , después de administración. La biodisponibilidad absoluta de inmunoglobulina administrada subcutáneamente es determinada comparando el área bajo la curva de inmunoglobulina después de liberación subcutánea (AUCSC) con el AUC de inmunoglobulina después de liberación intravenosa (AUCiV) . La biodisponibilidad absoluta (F), puede ser calculada usando la fórmula F = ([AUC]SC x dosissc) / ([AUC]iv x dosisiv) . La concentración de inmunoglobulina en el plasma después de administración subcutánea puede ser medida usando cualquier método conocido en el arte adecuado para evaluar concentraciones de inmunoglobulina en muestras de sangre. Métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ELISA y nefelometría .
Un intervalo de dosis y diferente frecuencia de dosificación de dosificaciones pueden ser administradas en los estudios farmacocinéticos para evaluar el efecto de disminuir o aumentar las concentraciones de inmunoglobulina y/o de hialuronidasa en la dosis. Las propiedades farmacocinéticas de inmunoglobulina administrada subcutáneamente, como biodisponibilidad, también pueden ser evaluadas con o sin co-administración de hialuronidasa. Por ejemplo, a perros como sabuesos, se les puede administrar inmunoglobulina subcutáneamente en combinación con hialuronidasa, o sola. También se dieron dosis intravenosas de inmunoglobulina a otro grupo de sabuesos. Pueden entonces tomarse muestras de sangre a varios tiempos puntuales y determinar la cantidad de inmunoglobulina en el plasma, como por nefelometría. Puede entonces medirse el AUC y puede determinarse la biodisponibilidad de inmunoglobulina administrada subcutáneamente, administrada con o sin hialuronidasa. Dichos estudios pueden ser efectuados para evaluar el efecto de la co-administración con hialuronidasa sobre las propiedades farmacocinéticas , como la biodisponibilidad, de inmunoglobulina administrada subcutáneamente .
Los estudios para evaluar la seguridad y la tolerancia también son conocidos en el arte y pueden ser usados en la presente. Después de administración subcutánea de inmunoglobulina con o sin co-administración de hialuronidasa, puede monitorearse el desarrollo de cualquiera de las reacciones adversas. Las reacciones adversas pueden incluir, pero no limitarse a, reacciones en el sitio de inyección, como edema o hinchazón, jaqueca, fiebre, fatiga, escalofríos, bochornos, vértigo, urticaria, respiración ruidosa u opresión torácica náuseas, vómitos, rigor, dolor de espalda, dolor de pecho, calambres musculares, accesos o convulsiones, cambios en la presión sanguínea y respuestas anafilácticas o de hipersensibilidad severa. Típicamente, un intervalo de dosis y diferentes frecuencias de dosificación son administradas en los estudios de seguridad y tolerancia para evaluar el efecto de aumentar o disminuir las concentraciones de inmunoglobulina y/o de hialuronidasa en la dosis . 2.Actividad Biológica a . Inmunoglobulina La habilidad de inmunoglobulina para actuar como un agente terapéutico puede ser evaluada in vitro o in vivo. Por ejemplo, pueden efectuarse ensayos in vivo para evaluar la habilidad de inmunoglobulina para neutralizar la infectividad viral o bacteriana (Hiemstra y colaboradores, (1994) J Lab Clin Med 123:241-6). Otros ensayos in vitro pueden ser utilizados para evaluar otras actividades biológicas de inmunoglobulina. Por ejemplo, la habilidad de preparaciones de inmunoglobulina para interactuar con y modular productos de activación de complemento, enlazar anticuerpos idiotipicos, enlazar a receptores de Fe sobre macrófagos, y suprimir varios mediadores inflamatorios incluyendo citoquinas, quimioquinas , y metaloproteinasas , pueden ser expresados usando cualquier método conocido en el arte, incluyendo, pero no limitándose a ELISA, tinción Western, tinción Northern y citometria de flujo para evaluar la expresión del marcador. Por ejemplo, el efecto de inmunoglobulina sobre la expresión de receptores de quimioquina sobre células mononucleares de sangre periférica puede ser evaluada usando citometria de flujo (Trebs y colaboradores (2006) Eur J Neurology) . En otro ejemplo, el efecto de inmunoglobulina sobre la expresión de metaloproteinasa en macrófagos puede ser evaluada usando análisis por tinción Northern (Shapiro y colaboradores (2002) Cáncer 95:2032-2037).
También pueden ser efectuados estudios in vivo usando modelos animales para evaluar la actividad terapéutica de inmunoglobulina . La inmunoglobulina puede ser administrada a modelos animales infectados con uno o más microorganismos y pueden evaluarse el efecto sobre el progreso de la infección, como midiendo el número de microorganismos o midiendo el peso como un marcador de morbilidad. El efecto terapéutico de inmunoglobulina también puede ser evaluado usando modelos animales de las enfermedades y condiciones para las cuales se considera la terapia usando inmunoglobulina. Dichos modelos animales son conocidos en el arte, e incluyen, pero no se limitan a, modelos de animales pegueños para agamaglobulinemia congénita o ligada al cromosoma X (XLA) , SCID, síndrome de Wiskott-Aldrich, enfermedad de Kawasaki, síndrome de Guillain-Barré, ITP, poliomiositis , síndrome miasténico de Lambert-Eaton , Miastenia gravis y síndrome de Moersch-Woltmann (Czitrom y colaboradores (1985) J immunol 134:2276-2280, Ellmeier y colaboradores, (2000) J Exp Med 192:1611-1624, Ohno (2006) Drug Discovery Today: Disease odels 3:83-89, Oyaizy y colaboradores (1988) J Exp Med 2017-2022, Hansen y colaboradores, (2002) Blood 100:2087-2093, Strongwater y colaboradores, (1984) Arthritis Rheum. 27:433-42, Kim y colaboradores (1998) Annals NY Acad Sci 841:670-676, Christadoss y colaboradores (2000) 94:7-87, Sommer y colaboradores, (2005) Lancet 365:1406-1411, Patente U.S. No. 7309810) . b . Hialuronidasa La actividad hialuronidasa puede ser evaluada usando métodos bien conocidos en el arte. En un ejemplo, la actividad es medida usando un ensayo de microturbidez . Este, está basado en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se enlaza con albúmina de suero. La actividad es medida por incubación de hialuronidasa con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) Por un periodo de tiempo (por ejemplo 10 minutos) y luego precipitando el hialuronato de sodio sin digerir con la adición de albúmina de suero acidificada. La turbidez de la muestra resultante es medida a 640 nm después de un período de desarrollo adicional. La disminución en turbidez que resulta de la actividad hialuronidasa sobre el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad enzimática de la hialuronidasa. En otro ejemplo, la actividad hialuronidasa es medida usando un ensayo de microtítulo en el cual el ácido hialurónico biotinilado residual es medido después de incubación con hialuronidasa (véase por ejemplo, Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicación de Patente U.S. No 2005/0260186). Los grupos carboxilo libres sobre los residuos de ácido glucurónico de ácido hialurónico son biotinilados, y el sustrato de ácido hialurónico biotinilado es acoplado covalentemente a una placa de microtítulo. Después de incubación con hialuronidasa , el sustrato de ácido hialurónico biotinilado residual es detectado usando una reacción de avidina-peroxidasa , y es comparado con el obtenido después de reacción con estándares de hialuronidasa de actividad conocida. También son conocidos en el arte otros ensayos para medir la actividad hialuronidasa y pueden ser usados en los métodos de la presente (véase por ejemplo Delpech y colaboradores, (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi y colaboradores, (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
La habilidad de hialuronidasa para actuar como un agente diseminador o difusor también puede ser evaluada. Por ejemplo, el colorante azul de triptano puede ser inyectado subcutáneamente con o sin hialuronidasa en la piel lateral sobre cada lado de ratón desnudo. El área colorada es entonces medida, como con un calibre micrométrico, para determinar la habilidad de hialuronidasa para actuar como un agente diseminador (Patente U.S. No. 206/0104968).
H . Usos Terapéuticos Los métodos descritos en la presente pueden ser usados para tratamiento de cualquier condición para la cual sea empleada inmunoglobulina . La inmunoglobulina (IG) puede ser administrada subcutáneamente, en combinación con hialuronidasa, para tratar cualquier condición que sea corregible con tratamiento con inmunoglobulina . Esta sección proporciona usos terapéuticos ejemplares de IG. Los usos terapéuticos descritos posteriormente son ejemplares y no limitan las aplicaciones de los métodos descritos en la presente. Los usos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, terapia de reemplazo de inmunoglobulina y terapia de inmunomodulación para varias condiciones y enfermedades inmunológicas, hematológicas , neurológicas , inflamatorias, dermatológicas y/o infecciosas. En algunos ejemplos, la inmunoglobulina es administrada para aumentar la respuesta inmune en pacientes saludables, como después de posible exposición a enfermedades infecciosas (por ejemplo, daño por pinchazo accidental con aguja). Está en la experiencia de un médico tratante identificar dichas enfermedades o condiciones.
La inmunoglobulina puede ser co-administrada subcutáneamente con hialuronidasa , en combinación con otros agentes usados en el tratamiento de estas enfermedades y condiciones. Por ejemplo, otros agentes que pueden ser administrados incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, quimioterapéuticos, anti-inflamatorios esferoidales, antiinflamatorios no esferoidales, y otros agentes inmunomoduladores como citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento .
Si es necesario, puede ser determinado empíricamente o extrapolado un protocolo de dosificación particular y duración de tratamiento. Por ejemplo, dosis ejemplares de inmunoglobulina administrada intravenosamente pueden ser usadas como un punto de partida para determinar dosificaciones apropiadas. Los niveles de dosificación pueden ser determinados con base en una variedad de factores, como peso corporal del individuo, salud general, edad, la actividad del compuesto específico empleado, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la severidad y el curso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el juicio del médico tratante. Generalmente, las dosificaciones de inmunoglobulina son desde o aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal (es decir, 100 mg/kg de PC) a 2 g/kg de PC, y las dosificaciones de hialuronidasa son desde o aproximadamente 100 U/gramo a 500 U/g o más de inmunoglobulina, por ejemplo, a o aproximadamente 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g o más. Se comprende que la cantidad a administrar será una función de la indicación tratada, y posiblemente los efectos secundarios serán tolerados. Las dosificaciones pueden ser determinada empíricamente usando modelos reconocidos para cada trastorno.
Después de mejoramiento de una condición de un paciente, una dosis de inmunoglobulina de mantenimiento puede ser administrada subcutáneamente en combinación con hialuronidasa, si es necesario, y la dosificación, la forma de dosificación, o la frecuencia de administración, o una combinación de éstas pueden ser modificadas. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente con una base a largo plazo después de cualquier recurrencia de los síntomas de la enfermedad. 1. Inmunodeficiencia Primaria con Deficiencia de Anticuerpos La inmunoglobulina puede ser usad apara tratar inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos. La inmunodeficiencia primaria abarca muchos trastornos que están caracterizados por una deficiencia de una o más proteínas del sistema inmune. Típicamente, las inmunodeficiencias primarias son trastornos heredados, y muchos se manifiestan por falla en la producción del anticuerpo protector. Por consiguiente, la inmunoglobulina puede ser administrada como terapia de reemplazo de inmunoglobulina para pacientes que se presentan con dichas enfermedades. Ejemplares de inmunodeficiencias primarias incluyen, pero no se limitan a, inmunodeficiencia variable común (CVID) agamaglobulinemia congénita, síndrome de Wis kott-Aldrich , inmunodeficiencia severa combinada (SCID) , hipogamaglobulinemia primaria, enfermedades por inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos, agamaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA) , hipogamaglobulinemia de la infancia, y degeneración cerebelar paraneoplástica sin anticuerpos. La inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente, en combinación con hialuronidasa , a pacientes con inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos a dosis similares a las dosis usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina. Las dosis ejemplares incluyen, por ejemplo, entre 100 mg/kg de PC y 800 mg/kg de PC de inmunoglobulina, a intervalos de cuatro semanas. La dosis puede ser incrementada o disminuida, según la frecuencia de las dosis, dependiendo de la respuesta clínica . 2. Hipogamaglobulinemia Secundaria Adquirida en Malignidades Hematologicas Pacientes con hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematologicas, como leucemia linfocítica crónica (CLL) , mieloma múltiple (MM) , linfoma no de Hodgkin (NHL) y otras malignidades relevantes y posttrasplante de células embrionarias hematopoyéticas , son susceptibles a infecciones bacterianas debido a. La hipogamaglobulinemia es causada por una falta de linfocitos B y a un bajo nivel de anticuerpos en la sangre resultante, y puede ocurrir en pacientes con CLL, MM, NHL y como un resultado tanto de disfunción inmune relacionada con leucemia como a inmunosupresión relacionada con terapia. La deficiencia en la inmunidad humoral es ampliamente responsable por el riesgo creciente de morbilidad y mortalidad relacionada con infección en estos pacientes, especialmente por microorganismos encapsulados . Por ejemplo, Streptococcus pneumoniae , Haemophilus influenzae , y Staphylococcus aureus, asi como también Legionella y Nocardia spp. son patógenos bacterianos frecuentes que causan pneumonía en pacientes con CLL. También han sido observadas infecciones oportunistas como Pneumocystitis carinii , hongos, virus, y micobacterias . El número y severidad de infecciones en estos pacientes puede ser reducido significativamente por administración de inmunoglobulina (Griffiths y colaboradores, (1989) Blood 73:366-368, Chapel y colaboradores (1994) Lancet 343:1059-1063). Por consiguiente a dichos pacientes se les puede administrar inmunoglobulina subcutáneamente en combinación con hialuronidasa usando los métodos descritos en la presente para prevenir infecciones recurrentes. Dosificaciones ejemplares incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas . Por ejemplo, aproximadamente 400 mg/kg de PC de inmunoglobulina , en combinación con hialuronidasa , pueden ser administrados subcutáneamente cada 3 a 4 semanas. En un ejemplo adicional, una dosis adicional de 400 mg/kg de PC pueden ser administrados en el primer mes de terapia cuando la inmunoglobulina del suero del paciente sea inferior a 4 g/litro. La cantidad de inmunoglobulina administrada, y la frecuencia de las dosis, puede ser incrementada o disminuida según sea apropiado. 3.Enfermedad de Kawasaki La enfermedad de Kawasaki es una enfermedad multi-sistema, febril, aguda de niños y jóvenes que involucra a menudo las arterias coronarias. Es también conocida como síndrome de los ganglios linfáticos, poliarteritis infantil y síndrome de Kawasaki, y es una vasculitis auto-limitada pobremente comprendida que afecta a muchos órganos, incluyendo la piel y membranas mucosas, ganglios linfáticos, paredes de vasos sanguíneos, y el corazón. Puede tener lugar aneurisma de arterias coronarias desde la segunda semana de enfermedad durante la etapa de convalecencia. Aunque la causa de la condición es desconocida, hay evidencia de que las vasculitis característica resulta de una reacción inmune caracterizada por la activación de células T y macrófagos a un antígeno desconocido, secreción de citoquinas, hiperactividad de células B policlonales , y la formación de auto-anticuerpos en células endoteliales y células de músculo liso. En individuos susceptibles genéticamente, uno o más agentes infecciosos comunes no caracterizados , posiblemente con actividad super-antigénica, pueden activar la enfermedad. La inmunoglobulina administrada previamente en la enfermedad de Kawasaki puede prevenir la patología de la arteria coronaria. La administración subcutánea de inmunoglobulina en combinación con hialuronidasa a pacientes con inflamación en curso asociada con la enfermedad de Kawasaki pueden mejorar los síntomas. Dosificaciones ejemplares incluyen aquellas usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con enfermedad de Kawasaki. Por ejemplo, a un paciente con enfermedad de Kawasaki se le puede administrar aproximadamente 1 - 2 g de inmunoglobulina por kg de peso corporal del paciente. Esta puede ser administrada, por ejemplo, en cuatro dosis de 400 mg/kg de PC por cuatro días consecutivos. En otro ejemplo, 1 g de inmunoglobulina/kg de PC es administrado como una dosis única durante un período de 10 horas. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede ser incrementada o disminuida según sea apropiado. 4. Polineuropatía Desmielinante Inflamatoria Crónica La polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica (CIDP) es un trastorno neurológico caracterizado por debilidad progresiva y deterioro de la función sensorial en las piernas y brazos. El trastorno, el cual algunas veces es llamada neuropatía recurrente crónica, es causada por daño a la envolvente de mielina de los nervios periféricos. Aunque puede ocurrir a cualquier edad y en ambos géneros, CIDP es más común en jóvenes adultos y en hombres más que en mujeres. A menudo se presenta con síntomas que incluyen comezón o adormecimiento (que comienza en los dedos de los pies y dedos), debilidad de los brazos y piernas, pérdida de reflejos del tendón profundo (areflexia) , fatiga, y sensaciones anormales, CIDP está estrechamente relacionada al síndrome de Guillain-Barre y es considerada la contraparte crónica de esa enfermedad aguda. No hay prueba de diagnóstico específica pro descubrimientos de laboratorio y clínicos característicos ayudan a distinguir este trastorno de otros síndromes neuropáticos inmunomediados . Los estudios indican que el tratamiento con inmunoglobulina reduce los síntomas (van Schaik y colaboradores, (2002) Lancet Neurol. 1: 497-498). Por consiguiente, la inmunoglobulina puede ser coadministrada con hialuronidasa subcutáneamente a pacientes que se presentan con CIDP usando los métodos descritos en la presente. Dosificaciones ejemplares incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con CIDP. En un ejemplo, a un paciente con CIDP se le administró aproximadamente 2 g/kg de PC de inmunoglobulina subcutáneamente, en combinación con hialuronidasa . Esta puede ser administrada, por ejemplo, en cinco dosis de 400 mg/kg de PC por cinco días consecutivos. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede ser aumentada o disminuida según sea apropiado. 5. Síndrome de Guillain-Barré El síndrome de Guillain-Barré es un trastorno autoinmune neurológico que involucra desmielinación inflamatoria de nervios periféricos. Los primeros síntomas incluyen grados variables de debilidad o sensaciones de comezón en las piernas, las cuales pueden extenderse a los brazos y parte superior del cuerpo. Estos síntomas pueden disminuir en intensidad hasta que los músculos no pueden ser usados totalmente y el paciente está casi totalmente paralizado, dando como resultado una condición amenazante de vida. Aunque la recuperación es generalmente buena o completa en la mayoría de pacientes, se ha reportado que tiene lugar una incapacidad persistente en aproximadamente 20 % y muerte en 4 a 15 % de pacientes. El síndrome de Guillain-Barré puede tener lugar unos cuantos días o semanas después de los síntomas de infección viral respiratoria o gastrointestinal. En algunos casos la cirugía o la vacunación pueden activar el síndrome. El trastorno se puede desarrollar durante el transcurso de horas o días, o puede tomar 3 a 4 semanas. Un aprueba de velocidad de conducción del nervio (NCV) puede dar una pista al doctor para ayudar al diagnóstico. En algunos casos, una punción espinal puede ser usada para diagnóstico ya que el fluido cerebroespinal en pacientes on síndrome de Guillain-Barré típicamente contiene más proteínas que en sujetos normales.
Aunque no hay cura conocida para el síndrome de Guillain-Barré, el tratamiento con inmunoglobulina puede aminorar la severidad de la enfermedad y acelerar la recuperación. La inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente a pacientes en combinación con hialuronidasa a una dosis apropiada, como, por ejemplo, una dosis similar a la dosis usada para administrar inmunoglobulina intravenosamente a pacientes con el síndrome de Guillan-Barré. Por ejemplo, a un paciente con el síndrome de Guillain-Barré se le puede administrar aproximadamente 2 g/kg de PC de inmunoglobulina, en combinación con hialuronidasa, subcutáneamente. Esta puede ser administrada, por ejemplo, en cinco dosis de 400 mg/kg de PC por cinco días consecutivos. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede ser aumentada o disminuida dependiendo de, por ejemplo, la severidad de la enfermedad y la respuesta clínica a la terapia, la cual puede ser evaluada fácilmente por un experto en el arte. 6. Púrpura Trombocitopenica Idiopática La Púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) también conocida como púrpura trombocitopénica inmune primaria y púrpura trombocitopénica autoinmune, es una reducción en la cuenta plaquetaria (trombocitopenia) resultante de la supervivencia plaquetaria acortada debido a anticuerpos anti-plaquetas . Cuando las cuentas plaquetarias son muy bajas (por ejemplo < 30 x 109/L) puede tener lugar el sangrado en la piel (púrpura) y membranas mucosas. La producción de plaquetas en la médula ósea (megakariopoyesis ) en pacientes con ITP es morfológicamente normal. En algunos casos, hay deterioro adicional de la función plaquetaria relacionada con el enlace del anticuerpo a glicoproteinas sobre la superficie plaquetaria. La ITP puede estar presente como formas agudas y crónicas. Aproximadamente 80 % de adultos con ITP tienen la forma crónica de la enfermedad. La máxima incidencia de ITP crónica es en mujeres de 15 a 50 años de edad, aunque algunos reportes sugieren que la incidencia es creciente con la edad. La ITP es relativamente común en pacientes con VIH. Aunque la ITP puede encontrarse en cualquier etapa de la infección, su importancia aumenta cuando la enfermedad de VIH avanza.
Los estudios han demostrado que la inmunoglobulina puede ser usada para tratar a pacientes con ITP (Godeau y colaboradores (1993) Blood 82 (5) : 1415-21, Godeau y colaboradores (1999) Br J Haematol 1999; 107 (4 ): 716-9) . La inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente a pacientes en combinación con hialuronidasa a una dosis similar a la dosis usada para administrar inmunoglobulina intravenosamente, para tratar pacientes con ITP. Por ejemplo, a un paciente con ITP se le puede administrar aproximadamente 1 a 2 g/kg de inmunoglobulina, en combinación con hialuronidasa, subcutáneamente. Esta puede ser administrada durante varios días, o puede ser administrada en una dosis. En algunos ejemplos, cinco dosis de 400 mg/kg de PC de inmunoglobulina es administrada por 1 - 2 días consecutivos, dependiendo de la cuenta plaquetaria y de la respuesta clínica. La cantidad de inmunoglobulina administrada, y la frecuencia de las dosis, puede ser aumentada o disminuida dependiendo de, por ejemplo, la cuenta plaquetaria y lia respuesta clínica a la terapia, la cual puede ser fácilmente evaluada por un experto en el arte. 7.Miopatias Inflamatorias: Polimiositis , derma omiositis y miositis corporal por inclusión.
Las miopatías inflamatorias son un grupo de enfermedades musculares que involucran la inflamación y la degeneración de tejidos del músculo esquelético. Estos trastornos son adquiridos y todos están presentes con significativa debilidad muscular y la presencia de una respuesta inflamatoria en el músculo. La dermatomiositis (DM) es la más fácilmente reconocida de las miopatias inflamatorias debido a su sarpullido distintivo, el cual ocurre como un sarpullido por zonas, oscuro, rojizo o lila sobre los párpados, mejillas y el puente nasal, , y sobre la espalda o parte superior del tórax, codos, rodillas y nudillos. En algunos pacientes, ganglios calcificados o barriga endurecida se desarrolla bajo la piel. El sarpullido a menudo precede a la debilidad muscular, la cual típicamente se desarrolla durante un período de semanas pero puede desarrollarse durante meses o aún días. La dermatomiositis puede tener lugar a cualquier edad desde la niñez a la adultez y es más común en hembras que en machos. Aproximadamente un tercio de pacientes con DM reporta dificultades para tragar. Dolor y ablandamiento muscular, generalmente ocurren en menos de 25 % de adultos con DM, pero más de 50 % de niños con DM se quejan de dolor y ablandamiento muscular.
La Polimiositis no tiene el sarpullido característico de la dermatomiositis, y el principio de la debilidad muscular usualmente progresa más lento que en DM . Muchos pacientes de PM presentes tienen dificultad para tragar. En algunos casos, los pacientes también tienen dificultad para respirar debido a falla muscular. Tantos como un tercio de pacientes de P tienen dolor muscular, PM. La enfermedad afecta a más mujeres que hombres, y raramente afecta a gente con edad inferior a 20 años, aunque se han reportado casos de polimiositis de la infancia y de la niñez.
La miositis corporal por inclusión (IBM) es muy similar a la polimiositis. El principio de la debilidad muscular en IBM es usualmente muy gradual, teniendo lugar durante meses o años. Es diferente de PM en que ambos músculos distal y proximal son afectados mientras que generalmente solamente los músculos proximales son afectados en PM. Encuentros típicos incluyen debilidad de los flexores de la muñeca y de los flexores de los dedos. La atrofia del antebrazo es característica de la enfermedad, y atrofia del músculo cuadríceps es común con grados variables de debilidad en otros músculos. Aproximadamente la mitad de los pacientes afligidos con IBM tienen dificultad para tragar. Los síntomas de IBM usualmente comienzan después de la edad de 50 años, aunque ningún grupo de edad es excluido. La IBM tiene lugar más frecuentemente en hombres que en mujeres. Aproximadamente uno en diez casos de IBM puede ser hereditaria.
Los estudios indican que la administración de inmunoglobulina puede beneficiar a pacientes con estas miopatías inflamatorias. La inmunoglobulina puede mejorar la fortaleza muscular, reducir la inflamación y reducir el progreso y la severidad de la enfermedad (Dalakas y colaboradores (1993) N Engl J Med 329(27): 1993-2000; Dalakas y colaboradores (2001) Neurology 56(3):323.7, Dalakas (2004) Pharmacol Ther 102 (3) : 177-93, Walter y colaboradores (2000) J Neurol 247 ( 1 ) : 22-8 ) . La inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente a pacientes con DM, PM o IBM en combinación con hialuronidasa a una dosis similar a la dosis usada para administra inunoglobulina intravenosamente. Por ejemplo, 2 g/kg de PC de inmunoglobulina pueden ser administrados, típicamente durante varios días, como, por ejemplo, cinco dosis de 400 mg/kg de PC en días consecutivos. 8. Síndrome Miasténico de Lambert-Eaton El síndrome miasténico de Lambert Eaton (LEMS) es un raro trastorno inmune de transmisión neuromuscular primero reconocido clínicamente en asociación con cáncer de pulmón y subsecuentemente en casos en los cuales no se detectó ningún neoplasma. Pacientes con LEMS tienen un defecto en la articulación neuromuscular presináptica . La enfermedad está caracterizada clínicamente por debilidad del músculo proximal con aumento de la fuerza después de ejercicio, signos óculomotores ligeros, reflejos del tendón profundo disminuidos y disfunción autonómica (boca seca, constipación, falla eréctil). La administración subcutánea de inmunoglobulina en combinación con hialuronidasa a pacientes con LEMS puede mejorar los síntomas. Dosificaciones ejemplares incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina apacientes con LEMS. Por ejemplo, a un paciente con LEMS se le pueden administrar 2 g de inmunoglobulina por kg de peso corporal del paciente en varias dosis. Por ejemplo, cinco dosis de 400 mg de inmunoglobulina por kg de peso corporal pueden ser administradas en cinco días consecutivos. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede ser aumentada o disminuida según sea apropiado. 9. europatía Motora Muítifocal La neuropatía motora multifocal (MMN) con bloqueo de conducción es una neuropatía desmielinante inmuno mediada adquirida con debilidad progresiva lentamente, fasciculaciones , y calambres, sin implicaciones sensoriales significativas. La duración de la enfermedad antes de diagnóstico varía en intervalos de diagnóstico desde varios meses a más de 15 años. La causa precisa de MMN es desconocida. Estudios histopatológicos y de electrodiagnóstico demuestran la presencia de ambos daños, axonal y desmielinante. Los nervios motores son afectados primeramente, aunque también se ha demostrado ligera desmielinación en nervios sensoriales. La eficiencia del tratamiento inmunomodulador e inmunosupresor apoya adicionalmente la naturaleza inmune de MMN. Los títulos de anticuerpos anti-GMl son elevados en más de la mitad de los pacientes con MMN. Aunque el papel de los anticuerpos anti-GM1 en la enfermedad es desconocido, su presencia puede ser usada como un marcador de diagnóstico para MMN.
La administración subcutánea de inmunoglobulina en combinación con hialuronidasa a pacientes con MMN puede mejorar los síntomas. Dosificaciones ejemplares incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con MMN. Por ejemplo, a un paciente con MMN se le puede administrar 2 g de inmunoglobulina por kg de peso corporal en varias dosis. Por ejemplo, cinco dosis de 400 mg de inmunoglobulina por kg de peso corporal pueden ser administrados en cinco días consecutivos. En otro ejemplo, pueden administrarse 1 g/kg de peso corporal en 2 días consecutivos. A algunos pacientes se les puede dar terapia de mantenimiento, la cual puede incluir, por ejemplo, dosis de 400 mg/kg de peso corporal a 2 g/kg de peso corporal, dados cada 2 - 6 semanas. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede ser aumentada o disminuida según sea apropiado tomando en cuenta la respuesta de los pacientes. lO.Miastenia Gravis La miastenia gravis (MG) es una enfermedad neuromuscular autoinmune crónica caracterizada pro grados variables de debilidad de los músculos esqueléticos del cuerpo. Esta asociada con la presencia de anticuerpos a receptores de acetilcolina (AchR) o a tirosina quinasa específica de músculo (MuSK) en la articulación neuromuscular, aunque algunos pacientes son negativos al anticuerpo. Las características clínicas de MG incluyen debilidad fluctuante y fatigabilidad de músculos voluntarios, particularmente músculos elevadores de los párpados, extraoculares , bulbares, de los miembros y respiratorios. Los pacientes usualmente se presentan con caída de párpados unilateral o bilateral (ptosis) doble visión (diplopia), dificultad para tragar (disfagia) y debilidad del músculo proximal. La debilidad de los músculos respiratorios pueden dar como resultado falla respiratoria en casos severos o en exacerbaciones severas agudas (crisis miasténica) . La miastenia gravis ocurre en todos los grupos étnicos y en ambos géneros. Más comúnmente afecta a mujeres adultas jóvenes de menos de 40 años y a hombres de edad avanzada de más de 60 años pero puede ocurrir a cualquier edad. En algunos casos, es efectuada la timectomía para reducir los síntomas .
La inmunoglobulina puede ser usada, por ejemplo, como terapia de mantenimiento para pacientes con MG moderada a severa, típicamente cuando otros tratamientos han sido inefectivos o han causado severos efectos secundarios, y también puede ser administrada antes de la timectomía o durante una exacerbación aguda de la enfermedad (crisis miasténica) . La inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente, en combinación con hialuronidasa , a pacientes con miastenia gravis usando los métodos descritos en la presente. Dosificaciones ejemplares incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con MG. Por ejemplo, a un paciente con MG se le pueden administrar dosis de 400 mg/kg de peso corporal a 2 g/kg de peso corporal cada 4 -6 semanas para terapia de mantenimiento. Antes de timectomía o durante crisis miasténica, 1 - 2 g/kg de peso corporal pueden ser administrados en varias dosis, como, por ejemplo, cinco dosis de 400 mg/kg de peso corporal en cinco días consecutivos. En otro ejemplo, 1 g/kg de peso corporal pueden ser administrados en 2 días consecutivos. 11. Síndrome de Moersch-Wol mann El síndrome de Moersch-Woltmann, también conocido como síndrome de la persona rígida o síndrome del hombre rígido, es un raro trastorno neurológico con características de una enfermedad autoinmune. Los pacientes se presentan con síntomas relacionados con rigidez muscular y espasmos episódicos superpuestos. La rigidez muscular se extiende para involucrar los músculos axiales, primeramente abdominal y tóracolumbar , asi como también músculos de los miembros proximales. Típicamente, la co-contracción de músculos agonistas y antagonistas trúncales conduce a una apariencia como tabla con hiperlordosis . Menos frecuentemente, la implicación del músculo respiratorio conduce a la dificultad respiratoria y la implicación del músculo facial a una cara como máscara. El tratamiento con inmunoglobulina puede efectuar rigidez disminuida y evaluaciones de sensibilidad elevadas en pacientes con síndrome de Moersch-Woltmann (Dalakas y colaboradores (2001) N Engl J Med 345 ( 26 ) : 1870-6 ) . La inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente, en combinación con hialuronidasa , a pacientes con síndrome de Moersch-Woltmann usando los métodos descritos en la presente. Dosificaciones ejemplares incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunolgobulina a pacientes con síndrome de Moersch-Woltmann. Por ejemplo, la inmunoglobulina puede ser administrada a dosis de 400 mg/kg de peso corporal en cinco días consecutivos. A algunos pacientes se les puede dar terapia de mantenimiento, la cual puede incluir por ejemplo, 1 - 2 g de inmunolgobulina por kg de peso corporal cada 4 - 6 semanas. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede ser aumentada o disminuida según sea apropiado . 12. Enfermedad de Alzheimer El tratamiento para la enfermedad de Alzheimer incluye tratamiento con inmunoglobulina intravenosa (véase por ejemplo, Dodel y colaboradores (2004) J Neurol Neurosurg. Psychiatry, 75: 1472-4; Solomon y colaboradores (2007) Curr. Opin. Mol. Ther., 9:79-85; Relkin y colaboradores (2008) Neurobiol Aging) . La IG contiene anticuerpos que enlazan al beta amiloide (AB) , el cual es un componente central de la placa en los cerebros de pacientes de Alzheimer. Por consiguiente, la IG puede ayudar a promover la eliminación de AB desde el cerebro y bloquear los efectos tóxicos de AB' s en las células cerebrales. Por lo tanto, la inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente, en combinación con hialuronidasa , a pacientes con enfermedad de Alzheimer usando los métodos descritos en la presente. Los sujetos a ser tratados incluyen pacientes que tienen enfermedad de Alzheimer ligera, moderada o avanzada. Esta en el nivel de la experiencia de un médico tratante identificar a pacientes para tratamiento. La imunoglobulina en combinación con hialuronidasa puede ser administrada cada semana, cada dos semanas o una vez al mes. El tratamiento puede continuar durante el transcurso de meses o años. La IG puede ser administrada a dosis de o entre 200 mg/kg de PC a 2 mg/kg de PC cada semana o cada dos semanas, y generalmente al menos 200 mg/kg a 2 g/kg de PC al menos una vez al mes. El tratamiento con inmunoglobulina puede efectuar un incremento en los niveles del anticuerpo anti-beta-amiloide de pacientes en comparación con los niveles antes de tratamiento. 13. Otras Enfermedades y Condiciones Los datos clínicos indican que la inmunoglobulina puede ser usada en el tratamiento de muchas condiciones. En algunos casos, la inmunoglobulina puede ser usada en el tratamiento primario, mientras que en otros casos, es administrada como terapia de segunda línea cuando las terapias estándares han probado no ser efectivas, se han vuelto intolerables o son contra-indicadas. Está en la experiencia de un médico tratante identificar dichas enfermedades o condiciones. Ejemplares de éstas incluyen, pero no se limitan a, hipogamaglobulinemia secundaria (incluyendo inmunodeficiencia iatrogénica ) ; deficiencia de anticuerpos específicos; encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrosizante generalizada positiva a ANCA; anemia hemolítica autoinmune; penfigoide bullosa; penfigoide cicatrizante; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítica autoinmune con trombocitopenia inmune) ; trombocitopenia feto-maternal/neonatal aloinmune (FMAIT/NAIT) ; enfermedad de Alzheimer, síndrome hematofagocítico; trasplante de células embrionarias hematopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatía paraproteinémica de IgM; trasplante de riñon; esclerosis múltiple; ataxia por opsoclonus mioclonus; penfigo foliáceo; penfigo vulgaris; púrpura post-transfusión; necrolisis epidérmica/síndrome de Steven Johnson (TEN/SJS) ; síndrome de choque tóxico; lupus eritematoso generalizado; mieloma múltiple; sepsis; trasplante de médula ósea; tumores por células T; y traumatismo.
También se ha mostrado que la inmunoglobulina tiene actividad antimicrobiana contra numerosas infecciones bacterianas, virales y fúngicas, incluyendo, pero no limitándose a, Haemophilus influenzae de tipo B, Pseudomonas aeruginosas de tipos A y B, Staphylococcus aureus, Streptococcus del Grupo B, St reptococcus penumoniae de los tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 y 23, Adenovirus de los tipos 2 y 5, Citomegalovirus , virus de Epstein Barr, VCA, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus del herpes simplex 1, virus del herpes simplex 2, influenza A, tosferina, parainfluenza de los tipos 1, 2 y 3, Polio, virus del herpes zóster, varicela, Aspergillus y Candida albicans. Por consiguiente, la inmunoglobulina puede ser administrada subcutáneamente en combinación con hialuronidasa a pacientes con infecciones bacterianas, virales y fúngicas para aumentar el sistema inmune del paciente y tratar la enfermedad. En algunos ejemplos, también son administrados antibióticos u otros antimicrobianos.
I.Artículos de Fabricación y Equipos Las composiciones farmacéuticas de inmunoglobulina y una hialuronidasa soluble, proporcionadas juntas o separadamente, pueden ser empacadas como artículos de fabricación que contengan material de empaque, una composición farmacéutica la cual sea efectiva para tratar una enfermedad o condición tratable con IG, y una etiqueta que indique que la composición y las combinaciones son para ser usadas para tratar enfermedades y condiciones tratables con IG. Ejemplares de artículos de fabricación son contenedores incluyendo contenedores de cámara individual y de cámara dual. Los contenedores incluyen, pero o se limitan a, tubos, botellas y jeringas. Los contenedores pueden incluir adicionalmente una aguja para administración subcutánea.
Los artículos de fabricación proporcionados en la presente contienen materiales de empaque. Los materiales de empaque para uso al empacar productos farmacéuticos son bien conocidos para el experto en el arte. Véase por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 5,323,907, 5,033,252 y 5,052,558, cada una de las cuales es incorporada íntegramente a la presente. Ejemplos de materiales de empaque farmacéuticos incluyen, pero no se limitan a, empaques vesiculares, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, frasquitos, contenedores, jeringas, botellas, y cualquier material de empaque adecuado para una formulación seleccionada y el modo previsto de administración y tratamiento. Un amplio grupo de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionadas en la presente son contemplados cuando son una variedad de tratamientos para cualquier enfermedad o condición tratable por IG.
Las composiciones de inmunoglobulina y de hialuronidasa soluble, proporcionadas juntas o separadamente, también pueden ser proporcionadas en equipos. Los equipos pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente y un articulo para administración. Por ejemplo las composiciones pueden ser suministradas con un dispositivo para administración, como una jeringa, un inhalador, un recipiente de dosificación, un gotero, o un aplicador. El equipo puede incluir, opcionalmente , instrucciones para aplicación incluyendo dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para modos de administración. Los equipos pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente y un artículo para diagnóstico. Por ejemplo, dichos equipos incluyen un artículo para medir la concentración , cantidad o actividad de la IG.
J. EJEMPLOS Se incluyen los siguientes ejemplos para propósitos ilustrativos solamente y no se pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 PH20 recombinante Humana Soluble (rHuPH20) Facilita la Administración Subcutánea de Inmunoglobulina (IG) y la Biodisponibilidad La administración subcutánea (SC) de inmunoglobulina (IG) da como resultado la biodisponibilidad reducida en comparación con la administración intravenosa (IV). Un estudio reportó 63 % de biodisponibilidad en comparación con la administración IV, requiriéndose asi una dosis de 137 % de la dosis IV a ser usada para lograr una biodisponibilidad equivalente, es decir, el área bajo la curva (AUC) de tiempo-concentración (Ochs y colaboradores (2006) J Clin. Immunol . , 26:265-273) . Por consiguiente, se efectuaron experimentos para determinar si la administración de IG (GAMMAGARD LIQUID (GGL) , Baxter Biosciences) en la presencia de PH20 recombinante humana soluble (rHuPH20) incrementó la biodisponibilidad de IG después de administración SC de IG, poniendo en evidencia la necesidad de dosis crecientes. El estudio experimental fue diseñado para evaluar 1) la habilidad de los sujetos para tolerar una dosis mensualmente de GGL en un sitio único vía la ruta subcutánea (SC) ; 2) la dosis de rHuPH20 por gramo de GGL requerida para tolerar una dosis mensualmente de GGL, con no más que ligeras reacciones adversas locales al fármaco; 3) el tiempo requerido para administración SC; y 4 ) una comparación de la biodisponibilidad medida por medio del área bajo la curva (AUC) de GGL IV versus SC.
Resumiendo, fueron enrolados en el estudio once pacientes adultos inmunodeficientes quienes estuvieron sobre dosis estables de gamaglobulina intravenosa (IVIG). Todos los pacientes permanecieron sobre las mismas dosis mensuales de IVIG que recibieron antes del estudio. Para administración subcutánea, los pacientes que habían recibido hasta 600 mg/kg de PC de GGL cada cuatro semanas IV, recibieron infusiones SC en un sitio único comenzando a una dosis que fue un cuarto de la dosis IV durante IV semanas, es decir una dosis por semana, para determinar la dosis de rHuPH20 requerida para tolerar una dosis a la semana. Subsecuentemente, dosificaciones de rHuPH20 fueron reducidas y los pacientes recibieron la 2, 3, y finalmente una dosis total de GGL la cuarta semana para determinar la rHuPH20 mínima requerida para tolerar una infusión una vez al mes de GGL SC.
Las infusiones iniciales se condujeron usando 150 U de rHuPH20 por gramo de GGL. La rHuPH20 fue administrada a través de una aguja SC calibre 24 a una concentración de 150 U/mL o 1500 U/mL a una velocidad de 1 - 2 mL/min, antes de la infusión de GGL. Si se usaron 1500 U/mL de rHuPH20, se diluyó como sigue: a) si el volumen de la solución concentrada de rHuPH20 (1500 U/mL) necesitado fue de 1.5 mL o menos, fue diluida 1:10 usando solución salina inyectable normal; b) si el volumen del concentrado necesitado de rHuPH20 (1500 U/mL) fue superior a 1.5 mL pero inferior a 15 mL, se diluyó a 15 litros con solución salina inyectable normal; si el volumen de la solución de rHuPH20 concentrada (1500 U/mL) necesitado fue 15 mL o más, se usó sin diluir.
Inmediatamente después de la infusión de rHuPH20 (y en 5 minutos), la GG1 fue infusionada a través de la misma aguja SC calibre 24 que comenzó a una dosis que fue un cuarto de la dosis cada 4 semanas (es decir 1 dosis por semana) para determinar la cantidad de rHuPH20 necesitada para da un cuarto de la dosis de 4 semanas en un sitio único. Cada paciente fue evaluado para determinar si la infusión fue tolerada ; se juzgó que la infusión no fue tolerada si hubo reacciones locales moderadas o severas que requieran más de un sitio de administración o una incapacidad para terminar la infusión en menos de 3 horas. Si la dosis semanal de GG1 fue tolerada, la mitad de la dosis (dos dosis por semana) fue administrada usando rHuPH20 a 100 U/g de GGL, y la dosis de rHuPH20 fue adicionalmente reducida a 66 U/g de GGL, luego 50 U/g de GGL. La dosis de rHuPH20 se repitió, sobre una base por gramo de GGL, con cantidades crecientes de GGL hasta una dosis de GGL total a 4 semanas, fue tolerada en un sitio único. Si la cantidad de rHuPH20 no fue tolerada en cualquier punto, entonces se repitió la dosis semanalmente de GG1 en el siguiente intervalo y la cantidad de rHuPH20 fue incrementada hasta que la dosis fue tolerada. Si un sujeto falla en tolerar una dosis por dos incrementos sucesivos en la dosis de rHuPH20 (es decir, 3 intentos a una dosis distinta de GGL) , entonces se determinó que la dosis tolerada previamente fue la dosis máxima tolerada.
Los primeros cuatro pacientes fueron evaluados para tolerancia solamente; los últimos 7 pacientes tuvieron una infusión IV, seguida por un estudio farmacocinético (PK) para comparar la infusión IV con las infusiones SC subsecuentes. Para las infusiones SC, después de que s e logró una administración de dosis de GGL mensualmente , se repitió la misma dosis mensualmente y se efectuó un estudio PK para evaluar la Tl/2, Tmax, y AUC. Si AUC(SC) no estuvo en el 90 % de la AUC (IV), la dosis de rHuPH20 fue incrementada 4 veces en la siguiente infusión, y se repitió la evaluación PK.
Diez de los 11 pacientes lograron dosis mensuales de 25.5 a 61.2 gramos de GGL (255 a 612 mL) en un sitio SC único, a velocidades de 120 a 300 mL/hora. El onceavo paciente se lo retiró después de la infusión en la primera semana manifestando incomodidad local: Para el primer paciente (39001), las infusiones iniciales fueron hechas por gravedad, no obstante, las velocidades no fueron aceptables incrementando la dosis de rHuPH20 desde 150 a 300 U/g de GGL. Por consiguiente, todas las infusiones subsecuentes fueron hechas usando una bomba peristáltica para IV. Los 9 pacientes restantes lograron la dosis de GGl mensualmente sin la necesidad de repetir dosis o de incrementar la concentración de rHuPH20. Por consiguiente, los 9 pacientes en guienes se hizo un intento de reducir la dosis de rHuPH20 completaron el estudio y fueron capaces de tolerar las infusiones usando 50 U/g de GGL. Para determinar si 50 U/g de GGL fue la rHuPH20 mínima que podía ser administrada., una dosis de 25 U/g de GGL se intentó en dos pacientes sin éxito: uno tuvo incomodidad y el otro tuvo tolerancia reducida y requirió administración en dos sitios. Por consiguiente, la cantidad mínima de rHuPH20 que permitió una administración de dosis mensualmente de GGL SC fue de 50 U/g de GGL. Los resultados se resumen en la Tabla 3 siguiente. Los resultados mostraron que los primeros dos pacientes fueron infusionados a velocidades de hasta 300 mL/hr con tiempos de infusión de 1.64 h (270 mL) a 3.55 h (537 mL) . La velocidad de administración estuvo limitada primeramente por el tipo de bomba usada. La bomba para IV frecuentemente alarmó con velocidades de infusión rápidas. Una infusión se hizo lenta y una fue interrumpida debido a dolor ligero en el sitio de infusión. Ambas infusiones se abreviaron y fueron terminadas.
A = Sujetos (N = 10) B = Número de infusiones de dosis mensuales C = IgG (g) por dosis infusionada (media) D = Volumen (raL) de IgG infusionado (media) E = Concentración final de rHuPH20 (U/g) F = Velocidad máxima de infusión (mL/hr) G = Tiempo (horas) para infusionar (media) 1. Evaluación de la Tolerancia Los sujetos fueron evaluados por su tolerancia a las infusiones SC . La mayoría de las infusiones fueron asociadas solamente con reacciones ligeras relacionadas con la infusión (tabla 4) . La mayoría de las reacciones ligeras comunes fueron eritema, dolor, hinchazón, ardor y prurito en el sitio de infusión. Las reacciones moderadas en el sitio de infusión incluyeron tres casos de dolor, y un caso cada uno de prurito, hinchazón y ardor. No se reportaron reacciones severas. Hubieron quejas de ardor transitorio durante la infusión de la rHuPH20 en 10 de las infusiones, con cinco que tuvieron lugar en un paciente.
Tabla 4: Eventos Adversos Independientemente de la Causalidad, por Periodos Correspondientes a Categorías de Dosis Clase de Organo del Sistema MeDRA ¼ dosis ½ dosis ¼ dosis Dosis SC SC SC SC total Trastornos del oído y del 0 0 0 1 laberinto Trastornos oculares 0 1 0 3 Trastornos gastrointestinales 0 1 0 2 Trastornos generales y condiciones 26 15 20 29 del sitio de administración Tabla 4 (Continuación) Clase de Organo del Sistema ¼ dosis ½ dosis dosis Dosis SC MeDRA SC SC SC total Trastornos del sistema inmune 0 0 0 1 Infecciones e infestaciones 1 1 1 3 Trastornos del tejido conectivo 1 1 1 0 y músculoesquelético Trastornos del sistema nervioso 2 1 0 0 Trastornos respiratorios, 0 0 0 4 torácicos y mediastinales Trastornos de la piel y del 0 0 3 1 tejido subcutáneo Total 30 20 25 44 Los eventos adversos generalizados relacionados con las infusiones que se consideran posibles o probables se enlistan en la Tabla 5. Fueron tres moderados y ninguno fue severo. Solamente el episodio de ligero dolor de pecho estaba asociado con la interrupción de la infusión, pero la infusión fue terminada y las infusiones subsecuentes fueron bien toleradas. La Tabla 6 expone la proporción de infusiones subcutáneas que fueron terminadas sin interrupción por un evento adverso.
Un evento adverso serio, una reacción anafiláctica , tuvo lugar en un paciente, no relacionado con la terapia de estudio. El paciente, quien tuvo una historia de reacciones alérgicas previas a antibióticos, recibió un antibiótico el dia siguiente de su infusión con GGL/rHuPH20, y subsecuentemente se desarrolló la anafilaxia. Este paciente se recuperó completamente y fue capaz de terminar exitosamente el estudio.
No hubo infecciones bacterianas documentadas durante este ensayo de pacientes de PID. Hubieron 9 casos reportados de infecciones virales, se juzgó que todas no se relacionaron con la terapia de estudio: 2 casos de gastroenteritis viral, 1 caso de queratitis herpética, 2 casos de sinusitis, 1 caso de conjuntivitis y 3 casos (en un paciente) de enfermedad similar a la influenza.
Tabla 5: Eventos Adversos generalizados, no serios, relacionados Evento adverso en términos Ligero Moderado Severo Total de MEDRA Ojos secos 1 0 0 1 Sudoración nocturna 1 0 0 1 Malestar musculoesquelético 0 1 0 1 Jaqueca 1 2 0 3 Letargía 1 0 0 1 Dolor de pecho 1 0 0 1 Edema periférico 1 0 0 1 Dolor 1 0 0 1 Dolor de espalda 2 0 0 2 Total de eventos adversos 9 3 0 12 relacionados Tabla 6: Proporción de Infusiones SC Completadas sin Interrupción por un Evento Adverso Paciente Sin Por I n t e r r u mp i da Detenida Por Infusiones interrupción c ie n t ciento totales o ( % ) (% ) 390001 4 80 1 * 0 20 5 390002 2 100 0 0 0 2 390003 4 100 0 0 0 4 400001 4 100 0 0 0 4 340001 6 100 0 0 0 6 340002 6 86 1 * * 0 14 7 390004 7 100 0 0 0 7 390005 7 100 0 0 0 7 390006 6 100 0 0 0 6 400002 6 100 0 0 0 6 400003 7 100 0 0 0 7 Total 59 N / A 2 0 N/A 61 ^Interrumpida debido a dolor ligero en el sitio de infusión ^^Interrumpida debido a ligero dolor de pecho transitorio 2. Evaluación Farmacocinética Se efectuaron análisis farmacocinéticos sobre niveles de IgG en suero. Los siete pacientes enrolados en la fase de evaluación PK de este estudio lograron dosis mensuales de 27 a 61 gramos de GGL en un sitio único usando 50 U de rHuPH20 por gramo de GGL (véase la Tabla 3) . El estudio PK fue efectuado después de recibir una segunda dosis mensual de infusión de GGL. Se colectaron muestras de suero pre-infusión , 1 hora post-infusión y en los días 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 21 y 28 (si se programaron 28 días) post-infusión . Los parámetros farmacocinéticos de los 7 pacientes se exponen en la Tabla 7. Las proporciones de AUC(SC) a AUC(IV) para los 7 pacientes se muestran en la Tabla 8. Los resultados muestran que cinco de los 7 pacientes tuvieron AUC(SC) en 90 % de la AUC(IV). Incrementando la dosis o rHuPH20 cuatro veces en los 2 sujetos con una proporción de menos de 90 % no hubo mejora adicional en la biodisponibilidad .
^Pacientes con evaluaciones PK repetidas después de administración con una dosis creciente de rHuPH20. 3. Resumen de Resultados El uso de rHuPH20 por inyección antes de infusión con GGL hace posible infusionar tanto como 600 mL de GGL en un sitio subcutáneo único a velocidades de infusión de hasta 300 mL por hora en este estudio. La velocidad fue limitada primeramente por las bombas IV que fueron usadas, las cuales son diseñadas para iniciar la alerta y detenerse cuando hay infiltración IV y la presión aumenta. Aunque la bomba se interrumpe, esto no ocurre hasta que las velocidades se aproximan a 300 mL/h, la necesidad de re-iniciar la bomba incrementa el tiempo de infusión. Ya que no hay necesidad de alarmas de presión para administración subcutánea, el problema de interrupción debería de eliminarse conectándose a bombas capaces de generar más presión sin alertas.
Aunque la mayoría de las infusiones fueron asociadas con alguna hinchazón, enrojecimiento u ocasionalmente dolor o sarpullido, todas excepto unos cuantos fueron ligeras. Dos de las seis reacciones moderadas ocurrieron en infusiones donde la rHuPH20 fue reducida en un esfuerzo por encontrar la dosis mínima efectiva; La dosis de rHuPH20 de 50 U/g de GGL fue tolerada por 10 de los 11 sujetos. Un sujeto que no había experimentado previamente infusiones subcutáneas, se le retiró después de la primera dosis semanal que citó incomodidad en el sitio del abdomen inferior. Todas las otras infusiones fueron completadas a pesar de reacciones ligeras, con 97 % de las infusiones que fueron completadas sin interrupción. La mayoría de las reacciones fueron tratadas con compresas frías y solamente unos cuantos requirieron acetaminofeno o difenhidramina .
La biodisponibilidad media de GGL después de administrarla subcutáneamente en combinación con rHuPH20 fue de 92 % de la biodisponibilidad de GGL después de administración IV. Este estudio sugiere que la difusión creciente produjo la absorción mejorada de rHuPH20 de GGL.
Adicionalmente, los niveles mínimos logrados por medio de la dosificación subcutánea mensual de GGL en este estudio son idénticos a los logrados por administración IV. Por consiguiente, no hay necesidad de incrementar la frecuencia de administración de GGL por dosificación subcutánea versus la dosificación IV; la administración subcutánea de GGL en combinación con rHuPH20 requiere solamente un sitio SC único y puede ser lograda a velocidades de infusión de hasta 300 raL/h.
En conclusión, rHuPH20 facilitó la administración de una dosis total mensual de GGL en un solo sitio a velocidades de hasta 300 mL/h en un grupo de sujetos adultos inmunodeficientes . La biodisponibilidad de la combinación fue de 92 % de la biodisponibilidad IV, con base en la AUC del la curva del tiempo versus la concentración de IgG. Esto sugiere que rHuPH20 mejora la absorción de GGL administrada subcutáneamente. La mayoría de los efectos secundarios locales fueron ligeros y no dieron como resultado la lentitud o la interrupción de las infusiones.
Ejemplo 2 Generación de una linea celular que expresa a rHuPH20 soluble Se usó el plásmido HZ24 (expuesto en la SEC ID NO: 52) para transfectar a células de Ovario de Cobayo (células de CHO) (véase por ejemplo las solicitudes Nos. 10,795,095, 11/065,716 y 11/238,171). El vector plásmido HZ24 para expresión de rHuPH20 contiene una estructura principal del vector pCI (Promega), ADN que codifica a los aminoácidos 1-482 de la hialuronidasa PH20 humana (SEC ID NO: 49), un sitio de entrada ribosómica interna (IRES, siglas del inglés Internal Ribosomal Entry Site) del virus de ECMV (Clontech) , y el gen de dihidrofoliato reductasa de ratón (DHFR) . La estructura principal del vector pCI también incluye ADN que codifica al gen de la resistencia a beta-lactamasa (AmpR) , un origen fl de replicación, una región promotora/mej oradora precoz inmediata del citomegalovirus (CMV) , un intrón quimérico, y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40) . El ADN que codifica a la construcción rHuPH20 soluble contiene un sitio Nhel y una secuencia consensus de Kozac previa al ADN que codifica a la metionina en la posición 1 del aminoácido de la secuencia señal de 35 aminoácidos de PH20 humana, y un codón de detención después del ADN que codifica a la tirosina correspondiente en la posición del aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana expuesta en la SEC ID NO:l), seguido por un sitio de restricción BamHI . La construcción pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24), por consiguiente, da como resultado una especie de mARN individual activada por el promotor de CMV que codifica a los aminoácidos 1-482 de PH20 humana (expuesta en la SEC ID NO: 3) y a los aminoácidos 1-186 de la dihidrofoliato reductasa de ratón (expuestos en la SEC ID NO: 53), separados por el sitio de entrada ribosómica interno (IRES).
Células DG44 de CHO no transíectadas que crecieron en medio CD-CHO Modificado de Gibco para células DHFR (-) , suplementado con 4 m de Glutamina y 18 mL/L de Plurionic F68/L (Gibco), fueron sembradas a 0.5 x 106 células/mL en un frasco agitador en preparación para transfección. Las células fueron desarrolladas a 37 °C en C02 a 5 % en una incubadora humidificada , sacudiendo a 120 rpm. Las células DG4 de CHO no transfectadas que crecieron exponencialmente fueron probadas para viabilidad antes de transfección.
Sesenta millones de célula viables del cultivo de células DG44 de CHO no transfectadas fueron compactadas y resuspendidas a una densidad de 2 x 107 células en 0.7 mL de 2x el regulador de transfección (2x HeBS : 40 mM de Hepes, pH de 7.0, 274 mM de NaCl, 10 mM de KC1, 1.4 mM de Na2HP04, 12 mM de dextrosa) . A cada alícuota de células resuspendidas, se añadieron 0.09 mL (250 µg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado por digestión durante toda la noche con Cía I (New England Biolabs) , y las soluciones de células/ADN fueron transferidas en cubetas de electroporacion BTX de espacio de 0.4 cm (Gentronics) a temperatura ambiente. Se efectuó una electroporacion de control negativo sin ADN plásmido mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmido fueron electroporadas con una descarga capacitora de 330 V y 960 µG o a 350 V y 960 µ? .
Las células fueron retiradas de las cubetas después de electroporacion y fueron transferidas en 5 mL de medio CD-CHO Modificado para células DHFR (-), suplementado con 4 nM de Glutamina y 18 mL/L de Plurionic F68/L (Gibco) , y se dejaron crecer en un pocilio de una placa para cultivo de tejido de 6 pocilios sin selección por 2 días a 37 °C en una incubadora humidificada, con C02 al 5 %.
Dos días post-electroporación, se removieron 0.5 mL de medio para cultivo de tejido de cada pocilio y se probaron para la presencia de actividad hialuronidasa, usando el ensayo de microturbidez descrito en el Ejemplo 3.
Las células de la Transfección 2 (350 V) fueron colectadas del pocilio de cultivo de tejido, fueron contadas y diluidas a 1 x 104 a 2 x 104 células viables por mL. Se transfirieron 0.1 mL de la alícuota de la suspensión celular a cada uno de cinco pocilios, placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocilios. Se añadieron cien microlitros de medio CD -CHO (Gibco) que contenia 4 mM del suplemento GlutaMAX™-l (Gibco™, Invitrogen Corporation) y sin suplementos de timidina e hipoxantina a los pocilios que contenían células (volumen final de 2 mL) .
Se identificaron diez clones de las 5 placas desarrolladas sin metotrexate.
TABLA 10. Actividad hialuronidasa de los clones identificados Se expandieron en cultivo seis clones de HZ24 y se transfirieron en frascos agitadores como suspensiones celulares individuales. Los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9,1E11, y 4D10 fueron plaqueados en placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocilios usando la estrategia de dilución infinita bidimensional en la cual las células fueron diluidas 1:2 en la parte de abajo de la placa, y 1:3 a través de la placa, comenzando en 5000 células en el pocilio a mano izquierda superior. Los clones diluidos fueron desarrollados en un respaldo de 500 células DG44 de CHO no transfectadas por pocilio, para proporcionar los factores de crecimiento necesarios para los días iniciales en cultivo. Diez placas fueron elaboradas para subclonar, con cinco placas que contenían 50 nM de metotrexate y 5 placas sin metotrexate.
El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexate y 11 del tratamiento con 50 nM de metotrexate. Se midió la actividad hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (> 50 Unidades/ mL) , y estos 8 subclones fueron expandidos en frascos de cultivo de tejido T-25. Los clones aislados a partir del protocolo con tratamiento con metotrexate fueron expandidos en la presencia de 50 nM de metotrexate. El clon 3D35M fue expandido adicionalmente en 500 nM de metotrexate dando origen a clones que produjeron en exceso de 1,000 Unidades/mL en frascos agitadores (el clon 3D35M; o 3D35M de geni) . Se preparó entonces un banco de células madres (MCB, siglas del inglés Master Cells Bank) de las células 3D35M.
Ejemplo 3 Determinación de la Actividad Hialuronidasa de rHuPH20 soluble Se determinó la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble en muestras tales como cultivos celulares, fracciones de purificación y soluciones purificadas usando un ensayo turbidimétrico, el cual se basó en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se enlaza a albúmina de suero. La actividad es medida por incubación de rHuPH20 con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) por un periodo de tiempo ajustado (10 minutos) y precipitando luego el hialuronato de sodio sin digerir con la adición de albúmina de suero acidificada. La turbidez de la muestra resultante se midió a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos. La disminución de la turbidez resultante de la actividad enzimática sobre el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se efectuó usando una curva de calibración generada con diluciones de un ensayo con rHuPH20 soluble trabajando el estándar de referencia, y la muestra, se hicieron mediciones de actividad en relación a su curva de calibración.
Se prepararon diluciones de la muestra en Soluciones Diluyentes para Enzimas. La Solución Diluyente para Enzimas se preparó disolviendo 33.0 ± 0.05 mg de gelatina hidrolizada en 25.0 mL del regulador de Reacción PIPES de 50 mM (140 mM de NaCl, 50 mM de PIPES, pH de 5.5) y 25 mL de SWFI, y diluyendo 0.2 mL de solución de Buminato al 25 % en la mezcla y aplicando vórtice por 30 segundos. Esto se efectuó en 2 horas de uso y se almacenó sobre hielo hasta que fue necesario. Las muestras fueron diluidas a un estimado de 1 - 2 U/mL. Generalmente, la dilución máxima por etapa no excedió de 1:100 y el tamaño de muestra inicial para la primera dilución no fue de menos de 20 µ?- Los volúmenes de muestra mínimos necesarios para efectuar los ensayos fueron: muestras en proceso, Fracciones de FPLC: 80 µL; Sobrenadantes de Cultivo de Tejido: 1 mL; material concentrado, 80 iL; Material de la Etapa Final o Purificado: 80 iL. Las diluciones se hicieron por triplicado en una placa de 96 pocilios para Enlace de Bajas Proteínas y 30 L de cada dilución fueron transferidos a placas de fondo redondo Optilux Negros/Claros (BD BioSciences) .
Se prepararon diluciones de rHuPH20 soluble conocida con una concentración de 2.5 U/mL en Soluciones Diluyentes para Enzimas para generar una curva estándar y se añadieron a la placa de Optilux por triplicado. Las diluciones incluyeron 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL, y 2.5 U/mL. Se incluyeron en la placa pocilios "Blanco Reactivo" que contuvieron 60 µ?, de Solución Diluyente para Enzimas como un control negativo. La placa fue entonces cubierta y calentada sobre un bloque de calor por 5 minutos a 37 °C . Se retiró la cubierta y la placa fue sacudida por 10 segundos. Después de sacudir, la placa fue retornada a la placa en el bloque de calor y el Dispositivo para Manejo de Líquidos MULTIDROP 384 fue cebado con la solución de 0.25 mg/mL de hialuronato de sodio templada (preparada disolviendo 100 mg de hialuronato de sodio (LifeCore Biomedical ) en 20.0 mL de S F1. Esta fue mezclada rotando suavemente y/o meciendo a 2 - 8 °C por 2 - 4 horas, o hasta disolución completa) . La placa de reacción fue transferida al MULTIDROP 384 y la reacción fue iniciada presionando la tecla de inicio para distribuir 30 L de hialuronato de sodio en cada pocilio. La placa fue entonces retirada del MULTIDROP 384 y sacudida por 10 segundos antes de ser transferida a un bloque de calor con la cubierta de la placa reubicada. La placa fue incubada a 37 °F por 10 minutos.
Se preparó el MULTIDROP 384 para detener la reacción cebando la máquina con solución de Trabajo con Suero y cambiando el ajuste de volumen a 240 µ?,, (25 µ?, de Solución Madre con Suero [1 volumen de Suero de Caballo (Sigma) fue diluido con 9 volúmenes de Solución Reguladora de 500 mM de Acetato y se ajustó el pH a 3.1 con ácido clorhídrico] en 75 mL de Solución Reguladora de 500 mM de Acetato) . La placa fue retirada del bloque de calor y colocada sobre el MULTIDROP 384 y se distribuyeron 240 µ?, de Solución de Trabajo de Suero en los pocilios. La placa fue retirada y sacudida sobre un lector de placas por 30 segundos. Después de 15 minutos adicionales, se midió la turbidez de las muestras a 640 nm y se determinó la actividad hialuronidasa (en U/mL) de cada muestra por ajuste a la curva estándar Se calculó la actividad específica (Unidades/mg) dividiendo la actividad hialuronidasa (U/mL) entre la concentración de proteínas (mg/mL) .
Ejemplo 4 Producción y Purificación de PH20 Humana de Geni A. Proceso en Bioreactor de 5 L Un frasquito de 3D35 fue descongelado y expandido desde los frascos agitadores hasta frascos giratorios de 1 L en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad Calif.) suplementado con 100 nM de Metotrexate y GlutaMAX™-l (Invitrogen) . Se transfirieron las células de los frascos rotatorios a un bioreactor de 5 L (Braun) a una densidad de inoculación de 4 x 105 células viables por mL. Los parámetros fueron regulación de Temperatura 37 °C, pH de 7.2 (Regulación de arranque) , con Regulación de Oxigeno Disuelto de 25 % y una sobrecapa de aire de 0 -100 cc/min. A 168 horas, se añadieron 250 mL del Medio de Alimentación # 1 (CD-CHO con 50 g/L de Glucosa) . A 216 horas, se añadieron 250 mL del Medio de Alimentación # 2 (CD CHO con 50 g/L de Glucosa y 10 mM de butirato de sodio) , y a 264 horas se añadieron 250 mL del Medio de Alimentación # 2. Este proceso dio como resultado una productividad final de 1600 Unidades por mL con una densidad celular máxima de 6 x 106 células/mL. La adición de butirato de sodio fue para mejorar dramáticamente la producción de rHuPH20 en las etapas finales de producción.
El medio acondicionado del clon 3D35M fue clarificado por filtración profunda y diafiltración de flujo tangencial en 10 mM de HEPES a pH de 7.0. Se purificó luego la rHuPH20 soluble por cromatografía secuencial sobre intercambio iónico de Q Sepharose (Pharmacia), cromatografía de interacción hidrofóbica de Fenil Sepharose (Pharmacia), Cromatografía de Hidroxiapatita (Biorad, Richmond, CA) . y con borato de fenilo (Prometics) . rHuPH20 soluble se enlazó a Q Sepharose y se eluyó a 400 mM de NaCl en el mismo regulador. El eluato fue diluido con sulfato de amonio 2M a una concentración final de 500 mM de sulfato de amonio y se pasó a través de una columna de Fenil Sepharose (baja sub) , seguido por enlace bajo las mismas condiciones a una resina de borato de fenilo. La rHuPH20 soluble fue eluida de la resina de fenil Separóse en Hepes a pH de 6.9 después de lavar a pH de 9.0 en 50 m de bicina sin sulfato de amonio. El eluato fue cargado sobre una resina de hidroxiapatita cerámica a pH de 6.9 en 5 mM de fosfato de potasio y 1 mM de CaCl2 y eluyó con 80 mM de fosfato de potasio, pH de 7.4 con 0.1 mM de CaCl2.
El rHuPH20 soluble purificado resultante poseyó una actividad especifica en exceso de 65,000 Unidades USP/mg de proteina vía el ensayo de microturbidez (ejemplo 16) usando el estándar de referencia USP. Las PH20 purificadas eluyeron como un pico único desde 24 a 26 minutos a partir de una columna de estireno divinil benceno 5RPC de Pharmacia con un gradiente entre 0.1 % de TFA/H20 y 0.1 %de TFA/ 90 % de acetonitrilo/10 % de agua y resolvió como una sola banda amplia de 61 kDa por electroforesis sobre SDS que se redujo a una banda aguzada de 51 kDa después de tratamiento con PNGASE-F. La formación de secuencias del aminoácido N-terminal reveló que el péptido líder había sido removido eficientemente .
B. Proceso de Expansión del Cultivo Celular en Dirección Opuesta de la Expresión Genética en Cultivo Celular del Bioreactor de 100 L Se usó un proceso a mayor escala para purificar separadamente rHuPH20 soluble a partir de cuatro frasquitos diferentes de células 3D35M para producir cuatro lotes separados de sHuPH20; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C y HUA0420C. Cada frasquito fue expandido separadamente y cultivado mediante un bioreactor de 125 L, lego fue purificado usando cromatografía de columna. Se tomaron muestras en el transcurso del proceso para evaluar parámetros como el rendimiento enzimático. La descripción del proceso proporcionó las especificaciones representativas expuestas posteriormente para cosas tales como el arranque del bioreactor y volúmenes de medios de alimentación, densidades celulares de transferencia, y volúmenes de elución y lavado. Los números exactos varían ligeramente con cada lote, y se detallan en las Tablas 11 a 18.
Cuatro frasquitos que contenían células 3D35 fueron descongeladas en un baño de agua a 37 °C, se añadió medio CD CHO que contenía 100 nM de metotrexate y 40 mL/L de GlutaMAX y las células fueron centrifugadas. Las células fueron resuspendidas en un frasco con agitación de 125 mL con 20 mL de medio recientemente preparado y se colocaron en una incubadora a 37 °C, C02 al 7 %. Las células fueron expandidas hasta 40 mL en el frasco con agitación de 125 mL. Cuando la densidad celular alcanzó 1.5 - 2.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco rotatorio de 125 mL en un volumen de cultivo de 100 mL. El frasco fue incubado a 37 °C, C02 al 7 %. Cuando la densidad celular alcanzó 1.5 - 2.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco rotatorio de 250 mL en volumen de cultivo de 200 mL, y el frasco fue incubado a 37 °C, C02 al 7 %. Cuando la densidad celular alcanzó 1.5 - 2.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco rotatorio de 1 L en volumen de cultivo de 800 mL y se incubó a 27 °C, C02 al 7 %. Cuando la densidad celular alcanzó 1.5 - 2.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco rotatorio de 6 L en volumen de cultivo de 5 L y se incubó a 27 °C, C02 al 7 %. Cuando la densidad celular alcanzó 1.5 - 2.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco rotatorio de 36 L en volumen de cultivo de 20 L y se incubó a 27 °C, C02 al 7 % .
Se esterilizó un reactor de 125 L con vapor a 121 °C, 1.4 kg/cm2 (20 psi) y se añadieron 65 L de medio CD CHO. Antes de uso el reactor fue verificado para contaminación. Cuando la densidad celular en los frascos rotatorios de 36 L alcanzó 1.5 - 2.5 x 106 células/mL, 20 L del cultivo celular fueron transferidos desde los frascos giratorios de 36 L al bioreactor de 125 L (Braun) , resultando un volumen final de 85 L y una densidad de siembra de aproximadamente 4 x 105 células/mL. Los parámetros fueron regulación de temperatura, 37 °C; pH: 7.2, Oxígeno Disuelto: 25 % ± 10 %, Velocidad del Impulsor: 50 rpm, Presión del Reactor: 0.21 kg/cm2 (3 psi); Burbujeo de Aire: 1 1 /min; Capa Superpuesta de Aire: 1 L/min. El reactor fue muestreado diariamente para conteo celular, verificación de pH, análisis del medio, retención y producción de proteínas. La alimentación de nutrientes fue añadida durante la corrida. Al día 6, se añadieron 3.4 L de Medio de Alimentación # 1 (CD CHO + 50 g/1 de Glucosa + 40 mL/L de GlutaMAX™-l) y la temperatura del cultivo se cambió a 36.5 °C . Al día 9, se añadieron 3.5 L de Medio de Alimentación # 2 (CD CHO + 50 g/L de Glucosa + 40 mL/L de GlutaMAX™-l + 1.1 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambió a 36 °C . Al día 11, se añadieron 3.7 L de Medio de alimentación # 3 (CD CHO + 50 g/L de Glucosa + 40 mL/L de GlutaMAX™-l + 1.1 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambió a 35.5 °C . El reactor fue cosechado a 14 días o cuando la viabilidad celular haya caído abajo de 50 %. El proceso dio como resultado la producción de rHuPH20 soluble con una actividad enzimática de 1600 Unidades/mL con una densidad celular máxima de 8 millones de células/mL. Al cosechar el cultivo fue muestreado para micoplasma, carga biológica, endotoxina, y virus in vitro e in vivo, microscopía electrónica de transmisión (TEM, siglas del inglés Transmission Electron Microscopy) para partículas virales, y actividad enzimática. ( La cosecha del cultivo celular del bioreactor de 100 litros fue filtrada a través de una serie de filtros de cápsula desechables que tenían un medio de poliétersulfona (Sartorius) : primero a través de una cápsula de 8.0 µp? de profundidad, una cápsula de 0.65 µta de profundidad, una cápsula de 0.22 µ?? de profundidad, y finalmente a través de un filtro de 2000 cm2 Sartopore de 0.22 µ?t? y en una bolsa de almacenamiento estéril de 100 L. El cultivo fue concentrado 10 veces usando dos TFF con filtros MWCO de 30 kDa en Espiral de Poliéter sulfona (Millipore) , seguido por un intercambio de regulador 6 veces con 10 mM de HEPES, 25 mM de Na2S04, pH de 7.0 en un filtro final de 0.22 µp? en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 L. La Tabla 11 proporciona los datos relacionados con el cultivo celular, cosecha, concentración y etapas de intercambio de regulador.
Tabla 11. Datos de monitoreo para cultivo celular, cosecha, concentración y etapas de intercambio de regulador .
Parámetro HUA0406C HUA04010C HUA0 15C HUA0420C Tiempo de descongelación 21 19 17 18 para inocular al bioreactor de 100 L (días ) Densidad de inoculación 0.45 0.33 0.44 0. 6 de 100 L (x 106 células/mL) Tiempo de duplicación en 29.8 27.3 29.2 23.5 crecimiento logarítmico (hr ) Densidad celular máxima 5.65 8.70 6.07 9.70 (x 106 células/mL) Viabilidad de la cosecha 41 48 41 41 (% ) Título de la cosecha 1964 1670 991 1319 (U/mL) Tiempo en el bioreactor 13 13 12 13 de 100 L (días) Volumen de cosecha 81800 93300 91800 89100 clarificado (mL) Ensayo enzimático de la 2385 1768 1039 1425 cosecha clarificada (U/mL) Tabla 11 (Continuación) Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (3 L de resina, altura de 20 cm, diámetro = 14 cm. Se colectaron las muestras lavadas para una determinación de pH, conductividad y ensayo de endotoxinas (L/AL) . La columna fue equilibrada con 5 volúmenes de columna de 10 mM de Tris, 20 mM de Na2S04, pH de 7.5. Se cargó la cosecha diafiltrada , concentrada sobre la columna Q a un gasto de 100 cm/ hr. La columna fue lavada con 5 volúmenes de columna de 10 mM de Tris, 20 mM de Na2S04, pH de 7.5 y 10 mM de Hepes, 50 mM de NaCl, pH de 7.0. La proteina fue eluida con 10 mM de Hepes, 400 mM de NaCl, pH de 7.0 y se filtró a través de un filtro final de 0.22 µp? en una bolsa estéril. Después se efectuó cromatografía de interacción hidrofóbica sobre Fenil Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna Fenil Sepharose (PS) (9.1 L de resina, Altura = 29 cm, Diámetro = 20 cm) . La columna fue equilibrada con 5 volúmenes de columna de 5 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M, CaCl2 0.1 mM, pH de 7.0. El eluato de proteína de la columna anterior fue suplementado con sulfato de amonio 2M, fosfato de potasio 1M y solución madre de CaCl2 1M a la concentración final de 5 mM, 0.5 M y 0.1 M, respectivamente. La proteína fue cargada sobre la columna PS a un gasto de 100 cm/hr. 55 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M y 0.1 mM de CaCl2, pH de 7.0 fueron añadidos a 100 cm/hr. El flujo que atravesó, fue pasado a través de un filtro final de 0.22 µp? en una bolsa estéril.
La proteína purificada por PS fue cargada sobre una columna de borato de aminofenilo (ProMedics) (6.3 L de resina, Altura = 20 cm, Diámetro = 20 cm) que había sido equilibrada con 5 volúmenes de columna de 5 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M. La proteina fue pasada a través de la columna a un gasto de 100 cm/hr, y la columna fue lavada con 5 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M,, pH de 7.0. La columna fué entonces lavada con 20 mM de bicina, 10 mM de NaCl, pH de 9.0 y la proteina eluyó con 50 mM de Hepes, 100 mM de NaCl, pH de 6. a través de un filtro estéril y en una bolsa estéril de 20 L. El eluato fue probado para carga biológica, concentración de proteina, y actividad enzimática.
Una columna de hidroxiapatita (HAP) (BioRad) (1.6 L de resina, Altura = 10 cm, Diámetro = 14 cm) , se equilibró con 5 mM de fosfato de potasio, 100 mM de NaCl, 0.1 mM de CaC12, pH de 7.0. Se colectaron muestras lavadas y se probaron para pH, conductividad y endotoxinas (ensayo LAL) . El La proteina purificada con borato de amino fenilo fue suplementada con fosfato de potasio y CaC12 para producir concentraciones finales de 5 mM de fosfato de potasio y 0.1 mM de CaC12 y se cargó sobre la columna de HAP a un gasto de 100 cm/hr. La columna fue lavada con 5 mM de fosfato de potasio a pH de 7.0, 100 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, luego 10 mM de fosfato de potasio pH de 7.0, 100 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, pH de 7.0. La proteina fue eluida con 70 mM de fosfato de potasio, pH de 7.0 y se filtró a través de un filtro de 0.22 µp? en una bolsa de almacenamiento estéril de 5 L. El eluato fue probado para carga biológica, concentración de proteina y actividad enzimática.
La proteina purificada con HAP fue entonces bombeada a través de un filtro de remoción viral de 20 nM vía un tanque a presión. La proteina fue añadida al tanque de presión DV20 y se filtró (Pall Corporation), pasando a través de un filtro Ultipor DV20 con poros de 20 nm (Pall Corporation) en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 L. El filtrado fue probado para concentración de proteina, actividad enzimática, oligosacáridos , monosacáridos y perfil de ácido siálico, e impurezas relacionadas con el proceso. La proteina en el filtrado fue entonces concentrada a 1 mg/mL usando un fin de filtrado de peso molecular de 10 kD (MWCO, Molecular Weight Cut Off) sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon Slice (Sartorius) . El filtro se preparó primero por lavado con una solución de Hepes/solución salina (10 nM de Hepes, 130 mM de NaCl, pH de 7.0) y el permeado fue muestreado para pH y conductividad. Después de concentración, la proteina concentrada fue muestreada y probada para concentración de proteina y actividad enzimática. Se efectuó un intercambio con 6 veces regulador sobre la proteina concentrada en el regulador final: 10 mM de Hepes, 130 mM de NaCl, pH de 7.0. La proteina concentrada fue pasada a través de un filtro de 0.22 µp? en una bolsa estéril de 20 L. La proteina fue muestreada para concentración de proteina, actividad enzimática, grupos sulfhidrilo libres, perfil de oligosacáridos y osmolaridad .
Las Tablas 12 a 18 proporcionan datos del monitoreo relacionados con cada una de las etapas descritas anteriormente, para cada lote de células 3D35M.
Tabla 12. Datos de la columna con Q Sepharose Parámetro HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C Volumen de carga (mL) 10647 13524 12852 20418 Proporción en volumen de 3.1 4.9 4.5 7.3 carga/volumen de resina Volumen de columna (mL) 2770 3840 2850 2880 Volumen de eluato (mL) 6108 5923 5759 6284 Concentración proteinica de 2.8 3.05 2.80 2.86 eluato (mg/mL) Ensayo enzimático de eluato 24493 26683 18321 21052 (U/mL) Rendimiento enzimático (%) 65 107 87 76 Tabla 13. Datos de la columna con Fenil Sepharose Parámetro HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C Volumen antes de la adición 5670 5015 5694 6251 de la solución madre (mL) Volumen de carga (mL) 7599 6693 7631 8360 Volumen de columna (mL) 9106 9420 9340 9420 Proporción de volumen de 0.8 0.71 0.82 0.89 carga/ volumen de resina Volumen de eluato (mL) 16144 18010 16960 17328 Conc. de proteina del eluato 0.4 0.33 0.33 0.38 (mg/mL) Ensayo enzimático del eluato 8806 6585 4472 7509 (U/mL) Rendimiento de proteínas (%) 41 40 36 37 Rendimiento enzimático (%) 102 88 82 96 Tabla 14. Datos de la columna con Borato de amino fenilo N.D. = No determinado Tabla 15. Datos de la columna con Hidroxiapatita .
Parámetro HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C Volumen antes de adición de 16345 20799 20640 19103 la solución madre (mL) Proporción de volumen de 10.95 13.58 14.19 12.81 carga/volumen de resina Volumen de columna (mL) 1500 1540 1462 1500 Volumen de carga (mL) 16429 20917 20746 19213 Volumen de eluato (mL) 4100 2415 1936 2419 Concentración de proteínas No 0.24 0.17 0.23 del eluato _(mg/mL) probada Concentración de proteínas NA NA 0.17 NA del eluato filtrado (mg/mL) Ensayo enzimático del eluato 14051 29089 20424 29826 (U/mL) Rendimiento de proteínas (%) No 93 53 73 probado Rendimiento enzimático (%) 87 118 140 104 Tabla 16. Datos de filtración sobre DV20 Tabla 17. Datos de concentración final .
Parámetro HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C Volumen inicial (mL) 4575 3298 2963 3492 Volumen del concentrado (mL) 562 407 237 316 Concentración de proteínas 0.9 1.24 1.16 1.73 del concentrado (mg/mL) Rendimiento de proteínas (%) 111 102 103 98 Tabla 18. Datos de Intercambio con Regulador Formulación Final La proteina rHuPH20 soluble concentrada y purificada fue llenada asépticamente en frasquitos estériles con volúmenes de llenado de 5 mL y 1 mL. La proteina fue pasada a través de un filtro de 0.22 µp? a una bomba controlada por operador que se usó para llenar los frasquitos usando una terminación de llenado gravimétrica . Los frasquitos fueron cerrados con tapones y asegurados con un capuchón a presión. Los frasquitos cerrados fueron inspeccionados visualmente para partículas extrañas y luego fueron etiquetados. Después de etiquetar, los frasquitos fueron congelados instantáneamente por inmersión en nitrógeno liquido por no más tiempo que 1 minuto y fueron almacenados a < 15 °C (-20 ± 5 °C) .
Ejemplo 5 Producción de Células 6en2 que Contienen PH20 Humana Soluble (rHuPH20) La linea celular 3D35M de Geni descrita en el Ejemplo 2 fue adaptada para niveles más altos de metotrexate para producir clones de generación 2 (Gen2). Células 3D35 fueron sembradas a partir de cultivos que contenían metotrexate en medio de cultivo CD CHO que contenía 4 mM de GlutaMAX-1™ y 1.0 µ? de metotrexate. Las células fueron adaptadas a un nivel de metotrexate más alto desarrollándolas y pasándolas 9 veces durante un período de 46 días en una incubadora a 37 °C, humidificada con C02 al 7 %. La población amplificada de células clonadas fueron separadas limitando la dilución en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios que contenían medio con 2.0 µ? de metotrexate. Después de aproximadamente 4 semanas, se identificaron los clones y se seleccionó el clon 3E10B para expansión. Las células 3E10B fueron desarrolladas en medio CD CHO que contenía 4 mM de GlutaMAX-1™ y 2.0 µ? de metotrexate por 20 traspasos de células. Se creó un banco de células madres (MCB, Master Cells Bank) de la linea celular 3E10B y se congelaron y usaron para estudios subsecuentes.
La amplificación de la linea celular continuó por medio del cultivo de células 3E10B en medio CD CHO que contenia 4 mM de GlitaMAX-1™ y 4.0 µ? de metotrexate. Después de la doceava vez que se traspasaron, las células fueron congeladas en frasquitos como un banco de células de investigación (RCB, Research Cells Bank) . Un frasquito de RCB fue descongelado a temperatura ambiente y cultivado en medio que contenia 6.0 µ? de metotrexate. Después de 5 días, la concentración de metotrexate en el medio fue decreciente a 16.0 µ?, luego 20.0 µ? 18 días después. Las células del octavo traspaso en medio que contenia 20.0 µ? de metotrexate clonadas fueron separadas limitando la dilución en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios que contenia medio CD CHO que contenia 4 mM de GlutaMAX-1™ y 20.0 µ? de metotrexate. Los clones fueron identificados 5-6 semanas después y se seleccionó el clon 2B2 para expansión en medio que contenia 20.0 µ? de metotrexate. Después del primer traspaso, las células 2B2 fueron congeladas en frasquitos como un banco de células de investigación (RCB).
Las células 2B2 resultantes son células DG44 CHO deficientes en dihidrofoliato reductasa (dhfr-) que expresan a PH20 recombinante humana soluble (rHuPH20) . La PH20 soluble está presente en células 2B2 en un número de copias de aproximadamente 206 copias/célula. Análisis por tinción Southern del ADN de la célula 2B2 genómica digerida en Spel-, Xba I- y BamH I/Hind III usando una sonda especifica para rHuPH20 reveló el perfil de digestión de restricción siguiente: una banda hibridizante importante de ~ 7.7 kb y cuatro bandas hibridizantes menores (~ 13.9 - 6.6, ~ 5.7 y ~ 4.6 kb) con ADN digerido con Spe I; una banda hibridizante importante de ~ 5.0 kb y dos bandas hibridizantes menores (~ 13.9 y ~ 6.5 kb) con ADN digerido con Xba I; y una sola banda hibridizante de ~ 1. kb observada usando ADN de 2B2 digerido con BamH I/Hind III. El análisis de la secuencia del mARN transcrito indicó que la cADN derivada (SEC ID NO: 56) fue idéntica a la secuencia de referencia (SEC ID NO: 49) excepto por la diferencia de un par base en la posición 1131, la cual se observó que era timidina (T) en vez de la citosina (C) esperada. Esta es una mutación silenciosa, sin ningún efecto sobre la secuencia de aminoácidos.
Ejemplo 6 A. Producción de rHuH20 soluble de Gen2 en el Cultivo Celular del Bioreactor de 300 L Se descongeló a temperatura ambiente un frasquito de HZ24-2B2 y se expandió a partir de frascos con agitación a través de los frascos giratorios de 36 L en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 20 µ? de metotrexate y GlutaMAX-1™ (Invitrogen). Resumiendo, Un frasquito de células fue descongelado en baño de agua a 37 °C, se añadió medio y las células fueron centrifugadas. Las células fueron resuspendidas en un frasco con agitación de 125 mL con 20 mL de medio recientemente preparado y se colocaron en incubadora a 37 °C, C02 al 7 %. Las células fueron expandidas hasta 40 mL en el frasco agitador de 125 mL. Cuando la densidad celular alcanzada fue mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco giratorio de 125 mL en un volumen de cultivo de 100 mL. El frasco fue incubado a 37 °C, C02 al 7 %. Cuando la densidad celular alcanzada fue mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco giratorio de 250 mL en volumen de cultivo de 200 mL, y el frasco fue incubado a 37 °C, C02 al 7 %. Cuando la densidad celular alcanzada fue mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco giratorio de 1 L en volumen de cultivo de 800 mL y se incubó a 37 °C, C02 al 7 %. Cuando la densidad celular alcanzada fue mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco giratorio de 6 L en volumen de cultivo de 5000 mL y se incubó a 37 °C, C02 al 7 % . Cuando la densidad celular alcanzada fue mayor que 1.5 x 105 células/mL, el cultivo fue expandido en un frasco giratorio de 36 L en volumen de cultivo de 32 L y se incubó a 37 °C, C02 al 7 % .
Se esterilizó un reactor de 400 L y se añadieron 230 mL de medio CD-CHO. Antes de uso, el rector fue verificado para contaminación. Se transfirieron aproximadamente 30 L de células del frasco giratorio de 36 L al bioreactor de 400 L (Braun) a una densidad de inoculación de 4.0 x 105 células viables por mL y un volumen total de 260 L. Los parámetros fueron temperatura regulada a 37 °C; Velocidad del Impulsor, 40 - 55 RPM; Presión del Reactor: 0.21 kg/cm2 (3 psi); Burbujeo de Aire: 0.5 - 1.5 L/Min; Capa Superpuesta de Aire: 3 L/min. El reactor fue muestreado diariamente para conteo celular, verificación de pH, análisis del medio, producción y retención de proteina. También, durante la corrida se añadió la alimentación de nutrientes. A 120 hrs (día 5), se añadieron 10.4 L de Medio de alimentación # 1 (4 x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 160 mL/L de GlutaMAX-1™ + 83 mL/L de Levadurato + 33 mg/L de rHuInsulina) . A 168 horas (dia 7), se añadieron 10.8 L de Medio de alimentación # 2 (2 x CD - CHO + 33 g/L de Glucosa + 80 mL/L de Glutamax-1™ + 167 mL/L de Levadurato + 0.92 g/L de Butirato de Sodio) , y la temperatura del cultivo fue cambiada a 36.5 °C. A 216 horas (día 9), se añadieron 10.8 L de Medio de Alimentación # 3 (1 x CD-CHO + 50 g/L de Glucosa + 50 mL/L de Gluta AX-1™ + 250 mL/L de Levadurato + 1.80 g/L de Butirato de Sodio) , y la temperatura del cultivo se cambió a 36 °C. A 264 horas (dia 11), se añadieron 10.8 L de Medio de Alimentación # 4 (1 x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 33 mL/L de GlutaMAX-1™ + 250 mL/L de Levadurato + 0.92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambió a 35.5 °C . Se observó que la adición de los medios de alimentación mejoró dramáticamente la producción de rHuPH20 soluble en las etapas finales de producción. El reactor fue cosechado a 14 o 15 días o cuando la viabilidad de las células cayó abajo de 40 %. El proceso dio como resultado una productividad final de 17,000 Unidades por mL con una densidad celular máxima de 12 millones de células/mL. Al cosechar, el cultivo fue muestreado para micoplasma, carga biológica, endotoxinas y viral in vitro e in vivo, Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) y actividad enzimática.
El cultivo fue bombeado por medio de una bomba peristáltica a través de un sistema de filtración de cuatro módulos Millistak (Millipore) en paralelo, que contenía cada uno una capa de tierras diatomáceas calibradas a 4 - 8 µp? y una capa de tierras diatomáceas calibradas a 1.4 - 1.1 µp?, seguidas por una membrana de celulosa, luego a través de un segundo sistema de filtración Millistak individual (Millipore) que contenia una capa de tierras diatomáceas calibradas a 0.4 - 0.11 µp? y una capa de tierras diatomáceas calibradas a < 0.1 µp?, seguido por una membrana de celulosa, y luego a través de un filtro final de 0.22 µ?t? en una bolsa flexible estéril de un solo uso con una capacidad de 350 L. El fluido de cultivo celular cosechado fue suplementado con 10 mM de EDTA y 10 mM de Tris a un pH de 7.5. El cultivo fue concentrado 10 veces con un aparato para filtración de flujo tangencial (TFF, Tangencial Flow Filtration) que usa cuatro filtros de poliéter sulfona (PES, Polyether sulfone) de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa Sartoslice TFF (Sartorius), seguido por un inrtercambio de regulador 10 veces con 10 mM de Tris, 20 mM de Na2S04, pH de 7.5 en un filtro final de 0.22 µt? en una bolsa de almacenamiento estéril de 50 L.
La cosecha diafiltrada, concentrada fue inactivada para virus. Previo a la inactivación viral, se preparó una solución de Tritón X-100 al 10 %, fosfato de tri (n-butilo) (TNBP, Tri-N-Butil) Phosphate) al 3 %. La cosecha diafiltrada, concentrada fue expuesta a Tritón X-100 al 1 %, TNBP al 0.3 % por 1 hora en un reactor de vidrio de 36 L inmediatamente antes de purificación sobre la columna Q.
B.Purificación de la Gen2 de rHuPH20 soluble Se preparó la columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (9 L de resina, Altura = 29 cm, D = 20 cm) . Se colectaron las muestras lavadas para una determinación de pH . Conductividad y ensayo para endotoxinas (LAL) . La columna fue equilibrada con 5 volúmenes de columna de 10 m de Tris, 20 mM de Na2S04, pH de 7.5. Después de inactivación viral, la cosecha diafiltrada, concentrada fue cargada sobre la columna Q a un gasto de 100 cm/hr. La columna fue lavada con 5 volúmenes de columna de 10 mM de Tris, 20 mM de Na2S04, pH de 7.5 y 10 mM de Hepes, 50 mM de NaCl, pH de 7.0. La proteina fue eluida con 10 mM de Hepes, 400 mM de NaCl, pH de 7.0 en un filtro final de 0.22 µ?t? en una bolsa estéril. La muestra de eluato fue probada para carga biológica, concentración de proteina y actividad hialuronidasa . Se tomaron lecturas de absorbancia A2so al principio al final del intercambio.
Se efectuó después la cromatografía hidrofóbica sobre Fenil Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna de Fenil-Sepharose (PS) (19 a 21 L de resina, Altura = 29 cm, D = 30 cm) . El lavado fue colectado y muestreado para pH, conductividad y endotoxinas (ensayo LAL) . La columna fue equilibrada con 5 volúmenes de columna de 5 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M, 0.1 mM de CaCl2, pH de 7.0. El eluato de proteina de la columna Q Sepharose fue suplementado con soluciones madres de sulfato de amonio 2M, fosfato de potasio 1 M y CaCl2 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0.5 M y 0.1 mM, respectivamente. La proteina fue cargada sobre la columna de PS a un gasto de 100 cra/hr y se colectó el flujo que atravesó la columna. La columna fue lavada con 5 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M y 0.1 mM de CaCl2, pH de 7.0 a 100 cm/hr y los lavados fueron añadidos al flujo que atravesó la columna colectado. Combinado con el lavado de la columna, el filtrado se pasó a través de un filtro final de 0.22 µp? en una bolsa estéril. El filtrado fue muestreado para carga biológica, concentración de proteínas y actividad enzimática .
Se preparó una columna de borato de aminofenilo (Promtics). El lavado fue colectado y muestreado para pH, conductividad y endotoxinas (ensayo LAL) . La columna fue equilibrada con 5 volúmenes de columna de 5 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M. El flujo que atravesó la columna de PS que contenía la proteína purificada fue cargado sobre la columna de borato de aminofenilo a un gasto de 100 cm/hr. La columna fue lavada con 5 mM de fosfato de potasio, sulfato de amonio 0.5 M, pH de 7.0. La columna fue lavada con 20 mM de bicina, sulfato de amonio 0.5 M, pH de 9.0. La columna fue lavada con 20 mM de bicina, 100 mM de cloruro de sodio, pH de 9.0. La proteina fue eluida con 50 mM de Hepes, 100 mM de NaCl, pH de 6.9 y se pasó a través de un filtro estéril a una bolsa estéril. La muestra eluida fue probada para carga biológica, concentración de proteina y actividad enzimática.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Biorad) . Se colectó el lavado y se probó para pH, conductividad y endotoxinas (ensayo LAL) . La columna fue equilibrada con 5 mM de fosfato de potasio, 100 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, pH de 7.0. La proteina purificada con el borato de aminofenilo fue suplementada a concentraciones finales de 5 mM de fosfato de potasio y 0.1 mM de CaC12 y fue cargada sobre la columna de HAP a un gasto de 100 cm/hr. La columna fue lavada con 5 mM de fosfato de potasio, pH de 7.0, 100 mM de NaCl, 0.1 mM de CaC12. La columna fue después lavada con 10 mM de fosfato de potasio, pH de 7.0, 100 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2. La proteina fue eluida con 70 mM de fosfato de potasio, pH de 7.0 y fue pasada a través de un filtro estéril de 0.22 µp? a una bolsa estéril. La muestra eluida fue probada para carga biológica, concentración de proteínas y actividad enzimática.
La proteina purificada sobre HAP fue luego pasada a través de un filtro para remoción viral. El filtro Virosart (Sartorius) esterilizado fue preparado primero por lavado con 2 L de 70 mM de fosfato de potasio, pH de 7.0. antes de uso, el regulador filtrado fue muestreado para pH y conductividad. La proteina purificada por HAP fue bombeada vía una bomba peristáltica a través de un filtro para remoción viral de 20 nM. La proteína filtrada en 70 mM de fosfato de potasio, pH de 7.0 fue pasada a través de un filtro final de 0.22 µ?? a una bolsa estéril. La muestra filtrada para remoción viral fue probada para concentración de proteínas, actividad enzimática, oligosacáridos , monosacáridos y perfil de ácido siálico. La muestra fue también probada para impurezas relacionadas con el proceso.
La proteína en el filtrado fue entonces concentrada a 10 mg/mL usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) de corte de peso molecular (M CO) de 10 kD Sartocon Slice (Sartorius). El filtro fue preparado primero por lavado con 10 mM de histidina, 130 mM de NaCl, pH de 6.0 y el permeado fue muestreado para pH y conductividad. Después de la concentración, la proteína concentrada fue muestreada y probada para concentración de proteínas y actividad enzimática. Se efectuó 6 veces un intercambio con regulador sobre la proteína concentrada en un regulador final: 10 mM de histidina, 130 mM de NaCl, pH de 6.0.
Después del intercambio con regulador, la proteina concentrada fue pasada a través de un filtro de 0.22 µp? a una bolsa estéril de 20 L. La proteina fue muestreada y probada para concentración de proteínas, actividad enzimática, grupos sulfhidrilo libres, perfil de oligosacáridos y osmolaridad .
La proteína bruta filtrada estéril fue entonces distribuida asépticamente a 20 mL en frasquitos de Teflón (Nalgene) estériles de 30 mL. Los frasquitos fueron entonces congelados instantáneamente y almacenados a -20 ± 5 °C .
C . Comparación de la Producción y Purificación de las Generaciones 1 y 2 de rHuPH20 soluble La producción y purificación de rHuPH20 soluble de Gen2 en un cultivo celular en un bioreactor de 300 L contuvo algunos cambios en los protocolos en comparación con la producción y purificación de rHuPH20 soluble de Geni en un cultivo celular en un bioreactor de 100 L ) descrito en el Ejemplo 4.B). La Tabla 19 expone diferencias ejemplares, además de cambios a aumento de escala simple, entre los métodos.
Tabla 19 Diferencia de Generación 1 de Generación 2 de rHuPH20 proceso rHuPH20 soluble soluble Línea celular 3D35M 2B2 Medios usados para Contiene 0.10 µ? de Contiene 20 µ? de expandir el inoculo metotrexate (0.045 metotrexate (9 mg/L) celular mg/L) Medios en 6 L de Contiene 0.10 µ? de No contiene metotrexate cultivos hacia metotrexate adelante Frasco giratorio de Ninguna Equipado con 36 L instrumentación instrumentación que Volumen de operación: monitorea y controla pH, 20 L oxígeno disuelto, burbujeo y gasto de gas de la capa superpuesta.
Volumen de Aprox. 100 L en un Aprox. 300 L en un operación final en bioreactor de 125 L bioreactor de 400 L el bioreactor (volumen de cultivo (volumen de cultivo inicial + 65 L) inicial + 260 L) Medios de cultivo No rHuInsulina 5.0 mg/L de rHuInsulina en el bioreactor final Volumen de Escalonado a 4 % del Escalonado a 4 % del alimentación de los volumen del cultivo volumen del cultivo medios celular del bioreactor celular del bioreactor, Tabla 19 (Continuación) Diferencia de Generación 1 de Generación 2 de rHuPH20 proceso rHuPH20 soluble soluble es decir, 3.4, 3 • 5, es decir, 10.4, 10.8, 3.7 L, que dio como 11.2 y 11.7 L que dio resultado un volumen como resultado un de bioreactor objetivo volumen de bioreactor de ~ 92 L. objetivo de ~ 303 L.
Alimentación de Medio de Alimentación Medio de Alimentación # Medios # 1:CD CHO + 50 g/L de 1: 4 x CD CHO + 33 g/L Glucosa + 8 mM de de Glucosa + 32 mM de GlutaMAX™-l . Glutamax + 16.6 g/L de Alimentación # 2 (CD levadurato + 33 mg/L de CHO + 50 g/L de rHuInsulina Glucosa + 8 mM de Alimentación # 2:2 x CD GlutaMAX + 1.1 g/L de CHO + 33 g/L de Glucosa Butirato de sodio. + 16 mM de Glutamax + Alimentación # 3: CD 33.4 g/L de levadurato + CHO + 50 g/L de 0.92 g/L de butirato de Glucosa + 8 mM de sodio .
GlutaMax + 1.1 g/L de Alimentación # 3: 1 x butirato de sodio CDCHO + 50 g/L de Glucosa + 10 mM de Glutamax + 50 g/L de levadurato + 1.80 g/L de butirato de sodio.
Tabla 19 (Continuación) Diferencia de Generación 1 de Generación 2 de rHuPH20 proceso rHuPH20 soluble soluble Alimentación # 4: 1 x CD CHO + 33 g/L de Glucosa + 6.6 mM de Glutamax + 50 g/L de Levadurato * 0.92 g/L de Butirato de Sodio .
Filtración del Cuatro filtros de 1 a . Etapa - Cuatro cultivo celular del poliétersul fona (8.0 módulos en paralelo, Bioreactor µp?, 0.65 µ?t? y 0.22 µ?? ) cada uno con una capa de en serie tierras diatomáceas calibrada a 4 - 8 µp? y una capa de tierras diatomáceas calibradas a 1.4 - 1.1 µp?, seguido por una membrana de celulosa . 2 a . Etapa- módulo individual que contiene una capa de tierras diatomáceas calibradas a de tierras diatomáceas calibradas a < 0.1 µt , Tabla 19 (Continuación) Diferencia de Generación 1 de rHuPH20 Generación 2 de rHuPH20 proceso soluble soluble Seguido por una membrana de celulosa. 3a. Etapa: filtro de poliéter sulfona de 0.22 µp?.
Bolsa de almacenamiento Bolsa de Almacenamiento de 100 L de 300 L.
El cultivo celular cosechado es suplementado con 10 mM de EDTA, 10 mM de Tris a un pH de 7.5.
Concentración e Concentrado con 2 con Concentrado que usa intercambio de Filtros TFF con MWCO a cuatro Filtros TFF con regulador antes de 30 de Poliétersulfona MWCO a 30 de cromatografía Millipore Spiral Poliétersulfona El concentrado Millipore Spiral intercambia de regulador El concentrado 6 veces con 10 mM de intercambia regulador 10 Hepes, 25 mM de NaCl, pH veces con 10 mM de Tris, de 7.0. 20 mM de Na2S04, pH de Bolsa de almacenamiento 7.5. estéril de 20 L. Bolsa de almacenamiento estéril de 50 L Tabla 19 (Continuación) Diferencia de Generación 1 de Generación 2 de rHuPH20 proceso rHuPH20 soluble soluble Inactivación viral Ninguna Inactivación viral antes de efectuada con la cromatografía adición de Tritón X-100 al 1 %, Fosfato de tributilo al 0.3 %, pH de 7.5 Primera Etapa de Ninguna lectura de Mediciones de A280 al purificación (Q absorbancia principio y al final Sepharose Filtración viral Filtro Pall DV-20 (20 Filtro Sartorius después de nm ) Virosart (20 nm) cromatografía Concentración e Regulador con Regulador con intercambio de Hepes/solución salina, Histidina /solución regulador después pH de 7.0 salina, pH de 6.0 de cromatografía Proteína concentrada a Proteína concentrada a 1 mg/mL. 10 mg/ml Puesto que las modificaciones serán obvias para los expertos en el arte, está previsto que esta invención se limite solamente al alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (71)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. - Una combinación de composiciones caracterizada porque comprende : una primera composición que comprende IG formulada para administración en una sola dosificación subcutánea en una cantidad para tratamiento de una enfermedad tratable con IG no más de una vez por mes, en donde la cantidad de IG en la composición es sustancialmente la misma que la cantidad cuando se administra intravenosamente no más de una vez por mes para la misma enfermedad tratable con IG; y una segunda composición que comprende una hialuronidasa soluble formulada para administración en una sola dosificación en combinación con la IG para el tratamiento no más de una vez por mes.
2. - La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las composiciones están en un contenedor con cámara dual o en un solo contendor separadas entre si.
3. - La combinación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la hialuronidasa es posicionada en el contenedor para ser administrada antes de la IG.
4. - La combinación de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizada porque el contenedor es una jeringa, tubo o botella.
5. - La combinación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el contendor comprende adicionalmente una aguja para inyección.
6. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, caracterizada porque la hialuronidasa soluble es una PH20, o una forma truncada de ésta.
7. - La combinación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la PH20 es seleccionada de una PH20 ovina, bovina o humana truncada.
8. - La combinación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la PH20 humana truncada es seleccionada de entre polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos expuestos en cualquiera de las SECS. ID. NOS: 4 - 9, o variantes alélicas u otras variantes de éstas .
9. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, caracterizada porque la hialuronidasa soluble es designada rHuPH20.
10. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, caracterizada porque la IG es purificada a partir de plasma humano.
11. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, caracterizada porque la IG es liofilizada o es proporcionada en una forma liquida.
12. - La combinación de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el volumen de líquido es o es aproximadamente 100 mL, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, o 700 mL.
13. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, caracterizada porque la IG tiene una concentración proteínica que es menor que 16 % en peso/volumen de IG.
14. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, caracterizada porque la IG tiene una concentración proteínica que es o es aproximadamente de 5 a 15 % en peso/volumen, 6 a 15 % en peso volumen, u 8 a 12 % en peso/volumen de la composición de IG.
15. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14, caracterizada porque la concentración de proteina es de 10 % en peso/volumen.
16. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15, caracterizada porque la IG en la composición es o es de aproximadamente 5 gramos (g) , 10 g, 15 g, 20 g, 21 g, 22 g, 23 g, 24 g, 25 g, 26 g, 27 g, 28 g, 29 g, 30 g, 31 g, 32 g, 33 g, 34 g, 35 g, 36 g, 37 g, 38 g, 39 g, o 40 g.
17. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, caracterizada porque: la IG en la primera composición es 27 g a 67 g o 25.5 g a 61.2 g; y la hialuronidasa soluble en la segunda composición está en una cantidad que está en una proporción (unidades de hialuronidasa/gramos de IG) de 50 U/g.
18. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 17, caracterizada porque la hialuronidasa es proporcionada en un liquido.
19. - La combinación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el volumen de liquido es o es aproximadamente 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 20 mL o 30 mL.
20. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 19, caracterizada porque la hialuronidasa es de o aproximadamente de 10 Unidades a 500,000 Unidades, 100 Unidades a 100,000 Unidades, 500 Unidades a 50,000 Unidades, 1,000 Unidades a 10,000 Unidades, 5,000 Unidades a 7,500 Unidades, 5,000 Unidades a 50,000 Unidades o 1,000 Unidades a 10,000 Unidades.
21. - Una combinación de composiciones, caracterizada porque comprende: una primera composición que comprende IG formulada para administración subcutánea en una concentración de proteina de la IG en la composición, que sea menor que 16 % en peso/volumen de IG; y una segunda composición que comprende una hilauronidasa soluble formulada en combinación con la IG en una cantidad suficiente para volver la composición de IG terapéuticamente efectiva.
22. - La combinación de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque las composiciones son formuladas para administración en dosificación única o para administración en dosificación múltiple.
23. - La combinación de conformidad con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, caracterizada porque la cantidad de IG en la composición es sustancialmente la misma que la cantidad en una administración de dosificación única cuando se administra intravenosamente para tratamiento de una enfermedad o condición tratable con IG.
24. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, caracterizada porque la primera composición y la segunda composición son formuladas en una cantidad para administración diaria, semanal o bisemanalmente, cada 2-3 semanas, cada 3-4 semanas o mensualmente .
25. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizada porque la cantidad de IG en la primera composición es o es aproximadamente 1 gramo (g) , 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g o 200 g.
26. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 - 25, caracterizada porque la cantidad de hialuronidasa en la composición es o es aproximadamente 500 Unidades, 1,000 Unidades, 2,000 Unidades, 5,000 Unidades, 10,000 Unidades, 30,000 Unidades, 40,000 Unidades, 50,000 Unidades, 60,000 Unidades, 70,000 Unidades, 80,000 Unidades, 90,000 Unidades, 100,000 Unidades o más
27. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 - 26, caracterizada porque la cantidad de hialuronidasa en la composición es una cantidad que está en una proporción (unidades de hialuronidasa/gramo de IG) que es o es aproximadamente 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g o más.
28. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 - 24, caracterizada porque: la concentración de IG en la primera composición es 100 mg/mL; y la concentración de hialuronidasa soluble en la segunda composición es 150 U/mL a 1,500 U/mL.
29. - Un equipo, caracterizado porque comprende la combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 28, y opcionalmente instrucciones para uso en el tratamiento de una enfermedad o condición tratable con IG.
30. - Un método para tratar una enfermedad o condición tratable con IG en un sujeto, caracterizado porque comprende : primero, administrar subcutáneamente al sujeto una hialuronidasa soluble; y después de administración de la hialuronidasa soluble, administrar una inmunoglobulina (IG) para tratar la enfermedad o condición, en donde la administración de la IG es efectuada de modo que la cantidad administrada y la frecuencia de administración sea sustancialmente la misma que para administración IV (intravenosa) de la misma cantidad vía IV para la misma enfermedad o condición.
31. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cantidad de hialuronidasa soluble administrada es suficiente para efectuar biodisponibilidad de la IG administrada subcutáneamente de al menos aproximadamente 90 % de la biodisponibilidad de la misma dosificación administrada vía administración IV.
32. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cantidad de hialuronidasa soluble es suficiente para convertir a la IG administrada, terapéuticamente efectiva.
33. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cantidad de hialuronidasa soluble es suficiente para efectuar la administración subcutánea de la IG a una dosificación administrada no más de una vez al mes .
34. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la frecuencia del régimen de dosificación comprende no más de una vez mensualmente la administración de IG.
35. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la frecuencia del régimen de dosificación es diariamente, semanalmente , bisemanalmente , cada 2 - 3 semanas, cada 3 - 4 semanas o mensualmente.
36. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 35, caracterizado porque la hialuronidasa soluble es una PH20, o una forma truncada de ésta .
37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la PH20 es seleccionada de una PH20 ovina, bovina o humana truncada.
38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la PH20 humana truncada es seleccionada de entre polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS.: 4 -9 o variantes alélicas u otras variantes de éstas.
39. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 38, caracterizado porque la hialuronidasa soluble es rHuPH20.
40. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 39, caracterizado porque la IG es purificada a partir de plasma humano.
41. - El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la IG purificada a partir de plasma humano es purificada por fraccionamiento alcohólico.
42. - El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la IG es purificada adicionalmente por medio de una cualquiera o más de una modificación química, incubación a pH de 4.0 con o sin pepsina, precipitación con polietilenglicol (PEG), cromatografía por intercambio iónico, fraccionamiento enzimático, tratamiento con detergente-solvente, diafiltración o ultrafiltración .
43. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 42, caracterizado porque la IG contiene IgG, IgA e IgM.
44. - El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la IG contiene más de 95 % de IgG.
45. - El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la IgG es monomérica.
46.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 45, caracterizado porque la IG contiene adicionalmente excipientes estabilizantes de proteínas.
47. - El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el excipiente estabilizante de proteínas es seleccionado de entre uno o más de glicina, maltosa, un poliol, albúmina de suero humano, manitol, y detergente no iónico.
48. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 47, caracterizado porque el pH de la preparación de IG es de o aproximadamente 4.2 a 5.4, 4.6 a 5.1, o 4.8 a 5.0.
49. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 48, caracterizado porque la IG tiene una concentración de proteína que es o es aproximadamente 5 a 15 % en peso/volumen, 6 a 15 % en peso/volumen, u 8 a 12 % en peso/volumen de la composición de IG.
50. - El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la concentración de proteina es de 10 % en peso/volumen.
51. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 50, caracterizado porque la IG es infusionada a una velocidad de 10 mL/hr a 300 mL/hr.
52. - El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la velocidad es seleccionada de entre o aproximadamente 10 mL/hr, 20 mL/hr, 30 mL/hr, 40 mL/hr, 50 mL/hr, 60 mL/hr, 70 mL/hr, 80 mL/hr, 90 mL/hr, 100 mL/hr, 150 mL/hr, 200 mL/hr, 250 mL/hr y 300 mL/hr.
53. - El método de conformidad con la reivindicación 51 o la reivindicación 52, caracterizado porque la velocidad es controlada por medio de una bomba.
54. - El método de conformidad con la reivindicación 51 o la reivindicación 52, caracterizado porque la velocidad es controlada por gravedad.
55. - El método de conformidad con las reivindicaciones 30 - 54, caracterizado porque la hialuronidasa es administrada 0.5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 20 minutos o 30 minutos antes de administración de la IG.
56. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 55, caracterizado porque son administrados aproximadamente o 5 gramos (g) , 10 g, 15 g, 20 g, 21 g, 22 g, 23 g, 24 g, 25 g, 26 g, 27 g, 28 g, 29 g, 30 g, 31 g, 32 g, 33 g, 34 g, 35 g, 36 g, 37 g, 38 g, 39 g, 40 g de IG.
57. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 56, caracterizado porque la hialuronidasa es administrada en una proporción (unidades de hialuronidasa/gramos de IG) de o aproximadamente 10 U/gramo (g) , 20 U/g, 30 U/g, 35 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g o 300 U/g.
58. -El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la hialuronidasa es administrada en una proporción de o aproximadamente 50 U/gramo de IG.
59. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 57, caracterizado porque la IG es administrada a 50 mg/kg de peso corporal (PC), 100 mg/kg de PC, 200 mg/kg de PC, 300 mg/kg de PC, 400 mg/kg de PC, 500 mg/kg de PC o 600 mg/kg de PC.
60. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 57, caracterizado porque la IG es administrada a 600 mg/kg de PC y la hialuronidasa soluble es administrada en una proporción (Unidades de hialuronidasa/gramo de IG) de 50 U/g.
61.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 - 60 caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es seleccionada de entre inmunodeficiencia; hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas ; enfermedad de Kawasaki; polineuropatia desmielini zante inflamatoria crónica (CIDP) ; Síndrome de Guillain-Barre ; púrpura trombocitopénica idiopática; miopatías inflamatorias; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; neuropatía motora multifocal ; Miastenia Gravis; síndrome de Moersch-Woltmann; hipogamaglobulinemia secundaria (incluyendo inmunodeficiencia iatrogénica ) ; deficiencia de anticuerpos específicos; encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrosizante generalizada ANCA positiva; anemia hemolítica autoinmune; penfigoide bullosa; penfigoide cicatrizante; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítica autoinmune con trombocitopenia inmune) ; trombocitopenia feto-maternal/neonatal aloinmune ( FMAIT/NAIT) ; síndrome hemofagocítico ; trasplante de células embrionarias hemopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatías para-proteinémicas de IgM; trasplante de riñon; esclerosis múltiple; ataxia de mioclonus opsoclonus; pénfigus foliáceo; pénfigus vulgaris; púrpura post-transfusión; necrolisis epidérmica tóxica/síndrome de Steven Johnson (TEN/SJS) ; síndrome de choque tóxico; enfermedad de Alzheimer; lupus eritematoso generalizado; mieloma múltiple; sepsis; tumores de células B; traumatismo; y una infección bacteriana, viral o fúngica.
62. - El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es una inmunodeficiencia y la inmunodeficiencia es seleccionada de entre inmunodeficiencia variable común (CVID) , agamaglobulinemia congénita, síndrome de Wiskott-Aldrich, inmunodeficiencia combinada severa (SCID), hipogamaglobulinemia primaria, enfermedades por inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos, agamaglobulinemia congénita o ligada al cromosoma X (XLA) , hipogamaglobulinemia de la infancia, y degeneración cerebelar paraneoplástica sin anticuerpos.
63. - El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas , y la malignidad hematológica es seleccionada de entre leucemia linfocítica crónica (CLL) , mieloma múltiple (MM) , o linfoma diferente al de Hodgkin (NHL) .
64. -El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es una miopatia inflamatoria y la miopatía inflamatoria es seleccionada de entre polimiositis , dermatomiositis o miositis corporal por inclusión.
65.- El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es una condición bacteriana, viral o fúngica y la condición bacteriana, viral o fúngica es seleccionada de entre Haemophilus influenzae de typo B, Pseudomonas aeruginosa de tipos A y B, Staphylococcus aureus, Streptococcus del Grupo B, Streptococcus penumoniae de los tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, y 23, Adenovirus de los tipos 2 y 5, Citomegalovirus , virus VCA de Epstein Barr, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus del herpes simplex 1, virus del herpes simplex 2, Influenza A, sarampión, parainfluenza de tipos 1, 2 y 3, polio, virus de varicela zóster, Aspergillus y Candida albicans.
66. - Uso de una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 28 para la formulación de un medicamento para tratar una enfermedad o condición tratable con IG, en un sujeto.
67. - El uso de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es seleccionada de entre inmunodeficiencia ; hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas ; enfermedad de Kawasaki; polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) ; Síndrome de Guillain-Barre ; púrpura trombocitopénica idiopática; miopatías inflamatorias; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; neuropatía motora multifocal; Miastenia Gravis; síndrome de Moersch-Woltmann ; hipogamaglobulinemia secundaria (incluyendo inmunodeficiencia iatrogénica ) ; deficiencia de anticuerpos específicos; encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrosizante generalizada ANCA positiva; anemia hemolítica autoinmune; penfigoide bullosa; penfigoide cicatrizante; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítica autoinmune con trombocitopenia inmune) ; trombocitopenia feto-maternal/neonatal aloinmune ( FMAIT/NAIT ) ; síndrome hemofagocítico; trasplante de células embrionarias hemopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatías para-proteinémicas de IgM; trasplante de riñon; esclerosis múltiple; ataxia de mioclonus opsoclonus; pénfigus foliáceo; pénfigus vulgaris; púrpura post-transfusión; necrolisis epidérmica tóxica/síndrome de Steven Johnson (TEN/SJS) ; síndrome de choque tóxico; enfermedad de Alzheimer; lupus eritematoso generalizado; mieloma múltiple; sepsis; tumores de células B; traumatismo; y una infección bacteriana, viral o fúngica.
68. - El uso de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es una inmunodeficiencia y la inmunodeficiencia es seleccionada de entre inmunodeficiencia variable común (CVID) , agamaglobulinemia congénita, síndrome de Wiskott-Aldrich, inmunodeficiencia combinada severa (SCID), hipogamaglobulinemia primaria, enfermedades por inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos, agamaglobulinemia congénita o ligada al cromosoma X (XLA) , hipogamaglobulinemia de la infancia, y degeneración cerebelar paraneoplástica sin anticuerpos.
69. - El uso de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es hipogamaglobulinemia secundaria adquirida en malignidades hematológicas , y la malignidad hematológica es seleccionada de entre leucemia linfocítica crónica (CLL) , mieloma múltiple (MM) , y linfoma diferente al de Hodgkin (NHL) .
70. - El uso de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es una miopatía inflamatoria y la miopatía inflamatoria es seleccionada de entre polimiositis , dermatomiositis o miositis corporal por inclusión.
71. - El uso de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la enfermedad o condición tratable con IG es una condición bacteriana, viral o fúngica y la condición bacteriana, viral o fúngica es seleccionada de entre Haemophilus influenzae de typo B, Pseudomonas aeruginosa de tipos A y B, Staphylococcus aureus, Streptococcus del Grupo B, Streptococcus penumoniae de los tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, y 23, Adenovirus de los tipos 2 y 5, Citomegalovirus , virus VCA de Epstein Barr, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus del herpes simplex 1, virus del herpes simplex 2, Influenza A, sarampión, parainfluenza de tipos 1, 2 y 3, polio, virus de varicela zóster, Aspergillus y Candida albicans.
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