TW200944133A - Compositions for preparing a beverage - Google Patents

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200944133 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於製備飲料之組合物。該等組合物包含 能夠使咖啡萃取物之綠原酸水解為酚酸之微生物及/或 酶。用本發明之組合物製備之飲料具有改良之抗氧化及/ 或消炎特性。 【先前技術】 已展示咖_及諸如咖啡驗及二萜（例如咖啡醇、咖啡豆 醇）之咖啡活性化合物於齧齒動物中誘發解毒酶（例如麩胱 甘肽-S-轉移酶，GST)(Cavin C.等人，1998. The coffee-specific diterpenes cafestol and kahweol protect against aflatoxin Bl-induced genotoxicity trough a dual mechanism. Carcinogenesis 19, 1369-1375 ; Cavin, C.等人，2003.

Coffee diterpenes prevent benzo[a]pyrene genotoxicity in rat and human culture systems. Biochemical Biophysical Research Communication 306，488-495 ; Huber，W.等人， 2002a. Enhancement of the chemoprotective enzymes glucuronyl transferase and glutathione transferase in specific organs of the rat by the coffee components kahweol and cafestol. Archive of Toxicology 76，209-217)。已進一 步表明在人類中飲用800 ml咖啡歷時5日之後由咖啡所造 成之 GST 活性增加（Steinkellner，Η.等人，· 2005· Coffee consumption induces GSTP in plasma and protects lymphocytes against (+/-)-anti-benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol- 139211.doc 200944133 9,10-epoxide induced DNA-damage: results of controlled human intervention trials. Mut. Res. 591 264-275) ° 已知此類抗氧化活性藉由降低（例如）癌症、心臟病、腦 退化性病症及衰老中可能涉及之自由基損害而保護免受 「氧化應力」。 為增加食物及飲料產品之健康益處，需要製造具有增加 之抗氧化活性以及其他有益生物活性的產品。 【發明内容】 本發明者已驚人地發現用能夠水解綠原酸以產生酚酸之 微生物或酶處理咖啡萃取物導致咖啡萃取物之改良之抗氧 化及/或消炎特性。此外’已發現當人類或動物攝取咖啡 萃取物以及能夠水解綠原酸以產生酚酸之酶或微生物時， 此處理可在活體内發生。 因此，本發明係關於一種飲料粉末，其包含：a)乾咖啡 萃取物，及b)能夠水解咖啡醯基奎尼酸及二酯以產生咖啡 酸之微生物及/或酶。在另一態樣中，本發明係關於一種 用於製備飲料之套組，其包含至少兩個部分：a)包含η加啡 萃取物之第—部分；及b)包含能夠水解綠原酸以產生盼酸 之微生物及/每臨夕笼__ \ . 夂A _之第一部分。在又一態樣中，本發明係 關於本發明之產品的用途。 【實施方式】 此項技術中热知待與咖啡萃取物混合以製備咖啡飲料之 、且口物例如牛奶、奶油、咖啡奶精及咖啡奶精。消費者 使用,亥等組合物以改變(例如)咖啡之香味、外觀及質感。 139211.doc 200944133 二二#可呈液體或乾燥形式’例如呈溶解及/或懸浮 ::咖軸如一杯新沖之B加啡或一杯藉由將純的可溶 °哪浴解於水中而製備之咖徘）中之粉末形式。 發月之只施例中，待與咖啡萃取物混合之組合物 :咖徘奶精或㈣奶精^奶精可（例如）基於乳蛋自及/或乳 月曰’或可為基於植㈣白及，或植物㈣之非乳製品奶 2 ”亥、’且口物可呈乾燥形式，例如呈粉末形式，其中水含

量（例如）小於5%。該組合物亦可呈液體形式。 待與本發明之咖啡萃取物混合之組合物包含能夠水解綠 原I以產生酚酸之微生物及/或酶。綠原酸為反式肉桂酸 與奎尼酸之間所形成之酯家族。綠原酸天然存在於咖啡 中主要呈奎尼酸與連接於不同位置之酚系基團（例如咖 啡基、阿魏基、香豆基、甲氧基肉桂基）之單酯及二酯形 式。在本發明之一實施例中，微生物及/或酶能夠分別水 解咖啡醯基奎尼酸及二酯（例如3_咖啡醯基奎尼酸及二酯、 4-咖啡醯基奎尼酸及二酯或5_咖啡醯基奎尼酸及二酯）及/ 或阿魏醢基奎尼酸及二酯（例如3 -阿魏醯基奎尼酸及二酯、 4-阿魏酿基奎尼酸及二酯或5 -阿魏酿基查尼酸及二酯）以產 生咖啡酸及阿魏酸。 本發明之組合物應經調配以便微生物及/或酶在儲存期 間不會醱酵或與組合物反應。此舉可（例如）藉由將組合物 調配為乾粉及/或藉由封裝微生物及/或酶以便使微生物及/ 或酶僅當組合物與咖啡萃取物混合時或在消化期間釋放而 達成。 139211.doc 200944133 本發明之組合物可進一步包含適用於包括於待與咖啡萃 取物混合以製備飲料之組合物中之任何成份。常見成份可 為（例如）糖、人工甜味劑、乳化劑、穩定劑、增稠劑、助 流劑、染料、芳香劑、芳香物及其類似物。合適的人工甜 味劑包括糖精、環己胺磺酸鹽、合成糖精（acet〇sulfame)、 基於L天冬胺醯基之甜味劑（諸如阿斯巴甜及 此等物質之混合物。合適乳化劑包括甘油單酯、甘油二 酯、卵磷脂、單甘油二酯之二乙醯酒石酸酯、乳化澱粉及 其混合物。合適穩定劑包括磷酸氫二鉀及檸檬酸鈉。合適 助流劑為矽鋁酸鈉。在一實施例中，該組合物包含乳蛋白 及/或植物蛋白。在另一實施例中，該組合物包含乳脂及/ 或植物脂肪。 咖_萃取物 本發明之咖啡萃取物為藉由水或蒸汽之生咖啡豆及/或 烘焙咖啡豆之萃取物。在（例如）來自EP 0916267之技術中 已知製造咖啡萃取物之眾多方法。咖啡萃取物可為（例如） 純的可溶咖啡。純的可溶咖啡產品易於獲得且在（例如）來 自EP 106930之技術中已知用於製造純的可溶咖啡產品之 眾多方法。 微生物 可如此申請案之實例中所揭示（例如）鑑別能夠水解綠 酸之微生物。合適微生物可選自醇母、真菌或細 ” 、囷。合適 微生物可為（例如）麴菌屬（Aperg"/㈣，諸、& , + 兩如綠麴菌 ;乳桿菌屬， } 错如約 139211.doc 200944133 乳桿 ί (£· 1-1225);雙岐桿菌屬 (A/Wo6aciehMW)，諸如乳酸雙歧桿菌（凡/ac沿)（CNC]y[ ι_ 3446);或酵母，諸如釀酒酵母。 酶 _ 合適酶為（例如）酯酶，例如來源於曰本麴菌（Aspergillus japonicus)(可購自Kikk〇man，Japan)之綠原酸酯酶、來自綠 麴菌（EC 3.1.1.20)(可購自Kikk〇man，Japan)之鞣酸酯酶； 參 及 Palatase 2〇〇〇OL(EC 3.1.1.3)(可購自 Novozymes A/S， ark)每可以純化酶形式或（例如）以微生物之細胞溶 胞物形式存在。合適細胞可為（例如）以上所提及之微生物 之細胞。此項技術中已知產生細胞溶胞物之合適方法。 微生物及/或酶應以在消化期間足以將大量存在於咖啡 萃取物中之綠原酸水解為盼酸之量存在。所需微生物及/ 或酶之量可（例如）在本文實例3中所述之消化模型中藉 由測疋在消化實驗期間所水解之綠原酸的量來測定。較佳 ❹ 水解至）2G% ’諸如至少3G%、至少5G%或至少75%之存在 於咖非萃取物中之咖°非醯基奎尼酸（CQA)及/或阿魏醯基奎 尼酸（FQA)。 部分之套組 在一貫施例中，士 本泉明係關於一種用於製備飲料之套 八.八^ 3至V兩個部分：a)包含咖啡萃取物之第一部 刀及b)包3 夠水解綠原酸以產生紛酸之微生物及/或酶 t护：：刀。兩個部分—起銷售以製備飲料，但在產品之 上刀離。待飲用之最終飲料係在飲用之前不久 139211.doc 200944133 藉由混合兩個部分而製備。若一或兩個部分呈液體形式， 則其可直接混合，可視情況添加其他液體（例如水或牛 奶）兩個°卩刀亦可藉由將其溶解或懸浮於液體（例如水或 牛奶）中而混合。當使用液體時，視需要熱飲料或冷飲料 而定此液體可為熱的或冷的。若使用熱液體，則其可較佳 ，、有並不冋之,皿度以便不使微生物及/或酶在飲料攝取 前失活。 套組之第一部分包含咖啡萃取物。在—較佳實施例中， 第-部分呈乾燥形式，例如呈粉末形式。咖啡萃取物可為 (例如）習知純的可溶咖0非 咖#叔末，例如經嘴霧乾燥或冷凍 燥之咖啡萃取物。紂的 a 砘的了 >谷咖啡粉末可易於獲得且 述:此項技術中。第—部分亦可呈液體形式。液體咖啡萃 取t可易於（例如）以即飲咖啡飲料形式獲得。第一部分可 另外包含任何其他合適成份 & n例如網巨萃取物、芳香添加 劑、穩疋劑、鹽及/或甜咗私 $勹 。第一部分可以任何合適方 式i裝’例如包裝於藥囊、瓶子或小罐中。 第二部分包含能夠水解綠 .^ 、 原馱以產生酚酸之微生物及/ 或酶。此部分較佳可呈待盥 t組入鉍# β 一本文所述之咖啡萃取物混合 人杯打甘灿人 精或咖0非奶精形式。其可包 二Τ’例如通常見於咖啡奶精或咖啡奶精 …二：Τ所提及作為待與咖啡萃取物混合之組 呈液體形m #可呈乾燥形式(例如呈粉末形式)或 主夜體形式，且可以任何合 囊、瓶子$丨$ Α 式匕裝，例如包裝於藥 襄瓶子或小罐中。其應經靖& '調配以便使微生物及/或酶在 139211.doc 200944133 儲存期間不會醱酵或與其他成份反應。此舉可（例如）藉由 . 將組合物調配為乾粉末及/或藉由封裝微生物及/或酶以便 使微生物及/或酶僅當組合物與咖啡萃取物混合時或在消 化期間釋放而達成。 至少兩個部分可以任何合適方式包裝於一起。其可（例 如）包裝於組合容器中，其中該等部分在儲存期間保持實 際上分離且當容器打開時混合，或其可包裝於一起銷售以 製備飲料之分離容器中。 ®飲料粉末 在一實施例中，本發明係關於一種飲料粉末，其包含： a)乾咖啡萃取物；及b)能夠水解綠原酸以產生酚酸之微生 物及/或酶。 本發明之飲料粉末為待用於藉由將粉末溶解或懸浮於液 體（例如水或牛奶）中而製備飲料之粉末。待由粉末製備之 飲料可為（例如）黑喻啡、拿鐵咖啡（⑽以⑷、瑪奇哈朵 參 咖啡（Caf0 macchiat0)、卡布奇諾咖啡（cappuccin〇)或任何 其他基於咖啡之飲料。 .乾咖啡萃取物可為（例如）習知純的可溶咖啡粉末，例如 經喷霧乾燥或冷凍乾燥之咖啡萃取物。純的可溶咖啡粉末 可易於獲得且廣泛描述於此項技術中。 微生物及/或酶係以乾燥粉末形式存在，例如呈冷凍乾 燥粉末形式。可將微生物及/或酶封裝。 飲料粉末應經調配，使得微生物及/或酶在儲存期間不 會醱酵或與咖啡萃取物及/或其他成份反應。 139211.doc 200944133 在本發明之一較佳實施例中，飲料粉末包含待與如本文 所述呈乾燥形式之咖啡萃取物混合之組合物。在本發明之 一更佳實施例中，飲料粉末包含奶精。 一飲料粉末可包含適用於製備所要飲料之任何其他成份。 合適成份在此項技術中熟知且可為（例如）糖類、人工甜味 劑、礼化劑、穩定劑、增稍劑、助流劑、染料、芳香劑、 方香物及其類似物。合適的人工甜味劑包括糖精、環己胺 磺酸鹽、基於L-天冬胺醯基之甜味劑（諸如阿斯巴甜）及此 等物質之混合物。合適乳化劑包括甘油單酯、甘油二酯、 卵磷知單甘油一酯之二乙醯酒石酸酯（資料酯）、乳化澱 粉及其混合物。合適穩定劑包括磷酸氫二鉀及擰檬酸鈉。 口適助流劑為石夕銘酸爿。在一實施例中，飲才斗粉末包含乳 蛋白及/或植物蛋白D在另一實施例中，飲料粉末包含乳 脂或植物脂肪。在另一實施例中，飲料粉末包含甜味劑。 本發明之產品的用途 本發明之產品可用以在飲用由本發明之產品製備之飲料 的人類或動物中（例如）藉由誘發諸如麵胱甘肽_s_轉移酶 (GST)之解毒酶及藉由增加Nrf2_介導之基因表現路徑而增 強'舌體内抗氧化能力。已報導增加之與Nrf2活性相關之基 因增強解毒作用且激發内源性防衛以抵抗氧化應力。 本發明之產品可用以（例如）藉由降低前列腺素E2含量而 減輕發炎。 斗多健康問題及病症與氧化應力及發炎有關。本發明之 產°σ可用以治療或預防飲用由本發明之產品製備之飲料的 139211.doc 200944133 人類或動物之該等問題或病症。相關問題及病症為（例如） 皮膚病症，例如歸因於uv輻射之光損害、異位性皮膚 炎、濕疹、脫屑、瘙癢、過敏症狀；腦病症；發炎；肥胖 症；及癌症，例如皮膚癌及肺癌。 本發明之產品可進一步（例如）藉由降低血糖含量及/或增 加血液瘦體素、胰島素及/或c-肽之含量而用作抗糖尿病藥 劑；（例如）藉由例如經由增加金清雌激素及/或黃體酮含量 及/或驗性磷酸酶活性來增加骨礦物密度而用作骨重塑 劑；用作（例如）具有抗血管生成效應之抗轉移劑。 實例 實例1 用約氏乳桿菌新鮮細胞處理NESCAFE PROTECT® 使約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)之細胞生長（7.0 E08 cfu/ml)且離心（5000 g，10 min)，將離心塊以0.61 g/ml之 濃度再懸浮於磷酸鹽緩衝液（50 mM ’ pH 7.0)中.。添加30 mg/ml NESCAFE PROTECT®(生咖。非豆與烘焙咖哺豆之乾 的共萃取物）且將混合物在37。(：下培育。在不同反應時間 抽取樣品，將其離心（3000 g，5 min)且經由〇·45 Km微孔尺 寸針筒過濾器（Millipore SLHA 025 BS)過濾且藉由HPLC分 析。 在相同反應條件下但無細菌之情況下平行運作反應對照 組。 用約氏乳桿菌萃取物（經溶胞細胞）處理NESCAFE PROTECT® 139211.doc 11 200944133 使約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)之細胞生長（7.0 e〇8 cfu/ml)且離心（5000 g，10 min)，將離心塊以 〇·6ΐ g/mi之 濃度再懸浮於碌酸鹽緩衝液（50 mM，pH 7.0)中。接著使 用玻璃珠粒法將細胞溶胞。將600 μΐ細胞製劑置於旋蓋管 中且在0°C下添加600 μΐ玻璃珠粒。接著將該等管置於小型 珠磨式授打器（Mini-Beadbeater)中歷時1 min之劇烈震遷， 於冰中冷卻且再置於小型珠磨式攪打器中歷時1 min。接 著將粗細胞萃取物添加至900 μΐ NESCAFE PROTECT®(30 mg/ml，磷酸鹽緩衝液PH 7.0)之溶液中且將該混合物在 37°C下培育。在不同反應時間抽取樣品，將其離心（3000 g，5 min)，經由0.45 μιη微孔尺寸針筒過滤器（Millipore SLHA 025 BS)過濾且藉由HPLC分析。 用經喷霧乾燥之約氏乳桿菌製劑處理NESCAFE PROTECT® 將30 mg NESCAFE PROTECT®溶解於1 ml磷酸鹽緩衝液 (5 0 mM，pH 7.0)或1 ml水中。向此溶液中添加1〇 mg經喷 霧乾燥之約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)製劑（3.3 E9 cfu/g)。 接著將該混合物在37°C下培育且在不同反應時間抽取樣 品。在離心（3000 g，5 mi η)及過濾（0.45 μπι微孔尺寸針筒 過濾器，Millipore SLHA 025 BS)之後，藉由HPLC分析該 等樣品。 用經喷霧乾燥之約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)製劑處理生咖 _萃取物 將30 mg經乾燥之生咖啡萃取物溶解於1 ml填酸鹽緩衝 139211.doc -12- 200944133 液（50 mM，pH 7.0)或1 ml水中。向此溶液中添加l〇 mg經 噴霧乾燥之約氏乳桿菌製劑（3.3 E9 cfu/g)。接著將混合物 在3 7°C下培育且在不同反應時間抽取樣品。在離心（3〇〇〇 g，5 min)及過濾（0.45 μιη微孔尺寸針筒過濾器，Millipore SLHA 025 BS)之後，藉由HPLC分析該等樣品。 用濃縮約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)製劑處理NESCAFE® 將400 mg NESCAFE SPECIAL FILTRE®(烘焙咖啡豆之 乾萃取物）溶解於1 ml沸水中且將該溶液在室溫下冷卻至 37°C。向250 μΐ此咖啡溶液中添加不同量之濃縮約氏乳桿 菌製劑（50 μΐ、100 μΐ、350 μΐ、750 μΐ)且用水將體積調節 至1 ml。接著將混合物在37°C下培育2 h及4 h。在離心 (3000 g，5 min)及過濾之後，藉由HPLC分析該等樣品。 HPLC分析 將咖啡樣品稀釋至l%(w/w)且藉由RP-HPLC經CC 250/4 Nucleosil 100-5-C18管柱（Macherey-Nagel)分析其。溶離劑 系統為1 mL/min之流動速率的Millipore水、0.1 % TFA及 CH3CN。該方法允許使用外部標準校正曲線同步測定咖啡 醯基奎尼酸（CQA)、阿魏醯基奎尼酸（FQA)、二咖啡醯基 奎尼酸（diCQA)、阿魏醯基奎尼酸内酯、咖啡酸（CA)及阿 魏酸（FA)(325 nm之吸光度）。相對於時間0(t0)處之參考或 相對於相同時間而無細菌之參考來表示結果。 抗氧化劑反應元件（ARE)螢光素酶檢定 將含有8個存在於大鼠麩胱甘肽-S-轉移酶A2(GSTA2)中 之ARE複本之pGL-8xARE，以及含有新黴素可選標記之 139211.doc .13- 200944133 pcDNA3.1質體穩定轉染至人類MCF7細胞中（Wang等人， Cancer Res. 66, 10983-10994, 2006)。ARE(抗氧化劑反應 元件）為轉錄因子Nrf2之結合位點，其調節解毒及内源性 防衛中所涉及之基因以抵抗氧化應力。質體pGL-8xARE在 8個Nrf2結合位點之下游含有允許監控Nrf2活性之螢光素 酶基因。 對於用咖啡處理而言，在DMEM生長培養基中將AREc 32細胞接種於96孔微量滴定板中。在用不同咖啡處理24 h 之後，測定螢火蟲螢光素酶活性。 蛋白質表現 藉由用膠原酶溶液灌注Sprague-Dawley大鼠之肝臟獲得 原生肝細胞（Sidhu 等人，Arch. Biochem. Biophys. 301, 103-113,1993)。發現藉由台盼藍排斥測試（Trypan Blue exclusion test)估計之細胞生存力在90%-95%之範圍内。在 3 ml補充有2 mM L-麩胺醯胺、10 mM Hepes(pH 7.4)、 ITS+、15000U青黴素/鏈黴素、100 nM地塞米松 (Dexamethasone)及5%胎牛血清（Hi-純系）之威廉姆斯氏培 養基（William's medium)中，將細胞以1.5x105個細胞/cm2 之密度接種於60 mm塑膠組織培養皿上。使肝細胞附著兩 個小時且接著用EBSS洗滌以移除碎片及未附著細胞。添 加含有25 nM地塞米松之新鮮無血清培養基且接著塗覆基 質膠（233 pg/ml)之覆層。在培養基更換之後每兩日將新鮮 基質膠添加至培養物中。為研究咖啡對於解毒酶及抗氧化 劑蛋白質表現之作用，在細胞接種之後24小時將測試物質 139211.doc -14· 200944133 添加至培養基中歷時48小時之時段，之後進行蛋白質萃取 及西方墨點分析（Cavin等人，Food Chem Tox. 46，1239-48, 2008) ° 前列腺素E2形成檢定 將人類結腸HT-29細胞用不同咖啡處理15 h，之後連同 促炎性試劑TNF-a(10 ng/ml)—起共培育6 h。使用競爭性 酶免疫檢定（EIA)測定HT-29細胞中PGE2產生之分析（Cavin 等人，BBRC 327, 742-49, 2005)。

結果 水解綠原酸以產生酚酸 實驗1 :用約氏乳桿菌新鮮細胞以變化反應時間及細胞 製劑之量處理NESCAFE PROTECT®。結果展示於中表1 中。 表1.實驗1之結果。 時間(h) 6 24 6 24 6 24 細胞製劑(uL) 750 750 350 350 100 100 以相對於t=0處未經處理參考之％計 之濃度 CQA 3 0 14 3 39 15 FQA 8 0 17 4 42 17 diCQA 0 0 0 0 23 2 CA 13215 13238 14282 15981 10111 13661 FA 7776 8845 7234 8861 4594 6691 質量平衡(毫莫耳/ 公克乾燥物質） 所飲用之綠原酸 0.20 0.21 0.18 0.20 0.13 0.17 所形成之CA及FA 0.20 0.20 0.21 0.24 0.14 0.20 實驗2 :用約氏乳桿菌萃取物（經溶胞細胞）以變化反應 時間及細胞製劑之量處理NESCAFE PROTECT®。結果展 139211.doc -15- 200944133 示於中表2中。 表2.實驗2之結果。 時間(h) _______ 2 2 6 6 細胞製劑(uL) _ 350.0 100.0 350.0 100.0 以相對於t=〇處未經處理參考之％ 之濃度 cgA __ 10 32 6 14 FQA 15 36 11 18 diCQA 1 8 1 1 CA 13901 10729 16300 12581 FA 7771 5581 9720 6960 實驗3 :用經噴霧乾燥之約氏乳桿菌製劑處理NESCAFE PROTECT®。結果展示於表3中。 表3.實驗3之結果。CQA、FQA、CA及FA係以相對於t=0 處未經處理對照組之％形式給出。 時間(h) 2 6 24 CQA 73 67 32 FQA 82 60 34 CA 3598 6140 7879 FA 1109 2183 3686 實驗4 :用經喷霧乾燥之約氏乳桿菌製劑處理生咖啡萃 取物。結果展示於表4中。 表4.實驗4之結果。CQA、FQA、CA及FA係以相對於t=0 處未經處理之對照組之％形式給出。 時間(h) 4 6 16 24 CQA 77 69 58 50 FQA 79 71 48 52 diCQA 67 53 32 20 CA 2673 3762 51821 6145 FA 961 1429 1963 2432 實驗5 :用經濃縮之約氏乳桿菌製劑處理NESCAFE®。 1392U.doc •16- 200944133 結果展示於表5中。 表5.實驗5之結果。CQA、FQA、CA及FA係以相對於t=0 處未經處理之對照組之％形式給出。 細胞量 50μΙ7 1 mL 100 μυ 1 mL 350 μι/ 1 mL 750 μΙ/ 1 mL 50μΙ7 1 mL 100 μυ 1 mL 350 μΙ7 1 mL 750 μι/ 1 mL 時間(h) 2 2 2 2 4 4 4 4 CQA 92 80 46 25 76 60 33 17 FQA 90 82 61 41 89 74 53 37 diCQA 86 68 23 6 75 56 15 6 CA 1737 2885 5752 7292 1763 2803 4491 5514 FA 1509 2468 5327 7586 786 1266 2408 3281 表6展示許多化合物在未作水解綠原酸處理之生咖啡豆 之萃取物之兩個不同樣品（對照樣品）中的絕對濃度。 表6.未經處理之生咖啡萃取物（對照樣品）之組成。濃度 係以每公克乾物質之毫克數給出。 A B 3-咖啡醯基奎尼酸 13.88 15.57 4-咖啡酿基奎尼酸 17.58 20.08 5_咖啡酿基奎尼酸 81.16 85.45 總CQA 112.62 121.10 3-阿魏醢基奎尼酸 0.00 0.00 4-阿魏醯基奎尼酸 3.29 4.41 5-阿魏醯基奎尼酸 17.70 19.77 總FQA 20.99 24.18 CA 0.39 0.47 FA 0.25 0.23 3-咖啡酸基奎尼酸内酉旨 0.00 0.00 4-咖徘龜基奎尼酸内S旨 0.00 0.00 總内酯 0.00 0.00 3,4-二咖啡醯基奎尼酸 6.80 4.34 3,5-二咖啡醯基奎尼酸 5.53 8.35 4,5-二咖啡醯基奎尼酸 0.12 8.85 總二咖啡醯基奎尼酸 12.45 21.55 139211.doc -17- 200944133 蛋白質表現 在大鼠原生肝細胞中，藉由西方墨點法，在處理48 h之 後產生之在200 ug/ml下之NESCAFE RED CUP®(烘焙咖啡 豆之萃取物）無GST次單元（GSTA4、GSTP1)及血紅素-加氧 酶-l(HO-l)之蛋白質表現增加且在400 ug/ml下具有GSTP1 及HO-1表現之弱誘導。相反，由200 ug/ml與400 ug/ml之 用約氏乳桿菌處理之NESCAFE PROTECT®於GSTA4、 GSTP1及HO-1上觀察到不同蛋白質表現之較強誘導。結果 以西方墨點法凝膠展示於圖1中。 用 5% NESCAFE RED CUP®對 NESCAFE PROTECT®及 用約氏乳桿菌處理之NESCAFE PROTECT®餵食2週之雄 性大鼠肝臟中獲得之資料確定在大鼠原生肝細胞中觀察 到之效應。與未經處理之NESCAFE PROTECT®(GSTPl ; NQOl)及未經處理之 NESCAFE RED CUP®(GSTP1 ； NQOl)相比，由用約氏乳桿菌處理之NESCAFE PROTECT®發現解毒酶表現（GSTP1 ; NQOl)之最強誘導。 結果以西方墨點法凝膠展示於圖2中。 抗氧化劑反應元件（ARE)螢光素酶檢定 使用大鼠GSTA2-ARE報導體構築體之若干複本穩定轉染 之人類乳癌細胞（AREc32)以證實藉由咖啡之Nrf2-ARE路 徑的活化。未作水解綠原酸處理之生咖啡萃取物及用約氏 乳桿菌處理24 h之不同生咖啡萃取物均產生Nrf2螢光素酶 報導體活性之劑量依賴性增加（參見表7)。 139211.doc -18- 200944133 表7.藉由咖啡之Nrf2活性的誘導（螢火蟲螢光素酶活性， AU)。 咖_萃取物 ug/ml 未經處理之 生咖啡萃取物 經處理之 生咖徘萃取物1 經處理之 生咖啡萃取物2 經處理之 生咖啡萃取物色_ 0 0 0 0 200 0.3+/Ό.1 15.2+/-1.5 22.1+/-1.6 22.6+/-2.4_ 300 0.8+A0.1 29.0+/-3.0 40.5+/-1.6 32.1+/-6.0_ 400 1.0+/-0.1 40.4+/-6.6 59.3+/-1.9 47.3+/-3.4一 600 2.0+/-0.2 77.7+/-10.5 90.4+/-0.7 80.4+/-8.2 _ 800 2.8+/-0.1 77.3+/-4.9 80.7+/-7.3 96.2+/-4.1 前列腺素E2形成檢定 φ 在人類結腸HT-29細胞中評定用約氏乳桿菌處理之生咖 啡萃取物之潛在消炎效應。用促炎性試劑TNF-α處理之 後，誘導結腸細胞中之前列腺素E2(PGE2)含量。在此研究 中，將細胞用不同咖啡萃取物（未作水解綠原酸處理之生 咖啡萃取物及用約氏乳桿菌處理24 h之不同生咖啡萃取物） 預處理24h。在實驗之最後6 h添加TNF-a(10 ng/ml)。資料 (參見表8)展示與用TNF-a處理之對照細胞相比，藉由咖啡 造成的Ρ〇Ε2形成之顯著劑量依賴性降低。 參表8.與用TNF-a(AU)處理之對照細胞相比，由於咖°非萃 取物處理之pGE2形成的降低。 咖_萃取物 ug/ml 未經處理之 生吻啡萃取物 經處理之 生咖峨蕈取物1 經處理之 生咖啡萃取物2 0 100+/-9 100+/-9 100+/-9 50 110+/-10 18+/-2 43+/-5 100 85+/-9 6+/-0.9 10+/-1.1 200 80+/-8 1+/-0.1 1+/-0.2 實例2 咖_樣品 來自100%羅布斯塔（Robusta)生豆之生咖啡萃取物 139211.doc -19- 200944133 NESCAFE PROTECT®，一種生咖啡豆與供培咖啡豆之 乾的共萃取物 酶及細胞 微生物 培養基

約氏乳桿菌（CNCM 1-1225) MRS 乳酸雙岐桿菌BB12(CNCM 1-3446) MRS+半胱胺酸 長雙岐桿菌办acieWwm /o?igww)BB536(ATCC BAA-999) MRS +半胱胺酸 來源於日本麴菌（Kikkoman，Japan)之綠原酸S旨酶（24 U/g)。 來自綠麴菌（Kikkoman，Japan)之鞣酸醋酶 細菌細胞之製備 在良好地達到生長穩定期（相當於在培養基中在37°C下 在無氧氣氛中在不攪拌之情況下培育16小時）之後收集（在 5000 g下離心10 min)測試菌株。對於菌株之首次活化而 言，將冷凍儲備培養物接種於新鮮培養基中且生長隔夜。 使用此預培養物以接種培養物。 用細菌細胞處理咖啡萃取物 在培養細菌及離心之後，將離心塊以〇.6 1 g/ml之濃度再 懸浮於磷酸鹽缓衝液（pH 7.0)中。向200 μΐ此細胞製劑中， 添加800 μΐ咖啡溶液（3%)且將該混合物在37°C下培育4 h、 16 h及 24 h。 用綠原酸酯酶培育咖啡萃取物 139211.doc •20- 200944133 將綠原酸酯酶（25 mg)於200 μΐ磷酸鹽緩衝液（pH 7.0)中 之溶液添加至800 μΐ咖啡溶液（3%)中。接著將該混合物在 3 7°C下培育4 h、16 h及24 h。反應時間之後，藉由熱處理 (3 min，90°C )中止酶活性且在分析之前過濾該混合物。 ARE螢光素酶檢定 如實例1 結果 使用大鼠GSTA2-ARE報導體構築體之若干複本穩定轉染 碜 之人類乳癌細胞（AREc32)以證實由咖啡造成之抗氧化劑 Nrf2-ARE路徑的活化。未作水解綠原酸處理（未經處理）之 生咖啡萃取物、用約氏乳桿菌（Lj)處理24 h之生咖啡萃取 物、用乳酸雙岐桿菌（B1)處理24 h之生咖啡萃取物及用綠 原酸酯酶（CE)處理4 h之生咖啡萃取物均產生Nrf2-螢光素 酶報導體活性之劑量依賴性增加（表9)。 表9·未經處理及經處理之咖啡萃取物（AU)之Nrf2-螢光素 巍 酶報導體活性。 咖_ mg/ml 未經處理之 生咖啡 用Lj處理之 生咖_ 用B丨處理之 生咖啡 用CE處理之 生咖啡 0 0 0 0 0 100 0.3+/-0.1 0.5+/-0.1 0.3+/-0.1 1 _0+/-0.1 200 0.8+/-0.1 1.0+/-0.1 1.1+/-0.1 2.1+/-0.2 400 1.0+/-0.1 5.2+/-0.4 3.1+/-0.3 8.2+/-1.4 600 2.0+/-0.2 11.1+/-0.5 7.2+/-1 11.3+/-1.4 將生咖啡萃取物用不同微生物及綠原酸酯酶處理以水解 綠原酸。結果展示於中表10中。 139211.doc -21 - 200944133 表10·處理後之生咖啡萃取物之組成。CQA、FQA、CA 及FA係以相對於t=0處未處理對照組之％形式給出。 約氏乳桿菌 乳酸雙岐桿菌 綠原酸酯酶 時間⑻ 4 16 24 4 16 24 4 16 24 CQA 42 15 12 96 79 74 3 2 2 FQA 49 15 15 33 12 6 73 24 23 diCQA 35 6 3 85 70 64 0 0 0 CA 12505 17148 18107 1521 4182 5283 18917 17275 18318 FA 4607 7192 7597 5020 6970 7105 2620 5685 6293 用不同微生物及綠原酸酯酶處理NESCAFE PROTECT® 以水解綠原酸。結果展示於中表11中。 表11.處理後之NESCAFE PROTECT®之組成。CQA、 FQA、CA及FA係以相對於t=0處未處理對照組之％形式給 出。 約氏乳桿菌 乳酸雙岐fl ί菌 綠原酸酯酶 時間(h) 4 16 24 4 16 24 4 16 24 CQA 33 13 13 97 81 80 5 3 3 FQA 42 21 20 54 23 20 54 15 14 diCQA 18 2 2 91 72 67 0 0 1 CA 7942 9429 9933 968 2258 2840 10879 10198 10750 FA 4051 5226 5504 3065 4518 5144 2794 5140 5518 實例3 胃小腸模型（TIM) 胃小腸模型TIM-1包含分別表示胃、十二指腸、空腸及 回腸之4個連通的隔間。各隔間係由玻璃外壁及可撓性内 壁組成。可撓性壁係由37°C之水圍繞以擠壓壁，此舉確保 食物與所分泌之酶藉由胃腸道中之蠕動而混合。 在胃腸道之平均生理條件下進行該模型中之實驗。在實 驗期間，使溫度保持在37°C且模擬唾液、胃液、膽汁及胰 139211.doc -22- 200944133 液分泌。監控模型中之消化過程歷時6 h。在最初3.5 h期 間’胃内含物經由「幽門瓣」逐漸傳遞至小腸。在實驗結 束時’約80%之小腸内含物經由回盲瓣逐漸傳遞至「大 腸」。在約5 h内藉由分泌1 M HC1，胃之pH值由6.5逐漸降 低至2.0 ;小腸内含物之pH值在十二指腸中維持於6 5，在 空腸中維持於6.8且在回腸中維持於7.2。消化產物及水經 由具有約5 000道爾頓之截留分子量的中空纖維薄膜藉由 抽没透析液體而自空腸及回腸隔間吸收。 咖徘萃取物消化之模擬 將4.5 g NESCAFE PROTECT®(生咖啡豆與烘培咖B非豆 之共萃取物）溶解於3 10 ml乙酸醋緩衝液（2〇 mM，pH 6.5) 中。在添加10 ml起始殘餘物（5 g胃蛋白酶及5 §脂肪酶酶 /谷液）之後’將溶液注入TIM之胃隔間中。在消化期間，收 集0-2 h、2-4 h及4-6 h之總透析液。在6 11實驗之後，分析 胃、十二指腸、空腸及回腸隔間之殘餘物以計算綠原酸之 φ 質量平衡。如實例1中所述使該等樣品穿過0·45 μιη微孔尺 寸針筒過濾器（Millipore SLHA 025 BS)且藉由HPLC分析。 . 對於用約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)之實驗而言，在添加1〇 ml起始殘餘物之後’將含有總計3 3 E9 Cfu之經喷霧乾燥 之約氏乳桿菌製劑的310 ml乙酸酯緩衝溶液（2〇 mM，pH 6.5)置於胃隔間中。接著在起始消化模擬之後15爪比藉由 注射器將含有4·5 g Nescafe Protect之1〇 ml乙酸酯緩衝液 注入胃隔間中。在消化期間，在穿過與空腸及回腸隔間連 通之半滲透中空纖維薄膜之後，收集〇_2 h、2_4 h及4-6 h 139211.doc •23· 200944133 之總透析液。收集0-2 h、2-4 h及4-6 h之總回腸傳遞物。 在添加NESCAFE PROTECT®之後立即及在1 h時間點處自 胃隔間獲取等分試樣（1 ml)。在6 h之後，藉由HPLC分析 胃、十二指腸、空腸及回腸隔間之殘餘物以計算5-咖啡醯 基奎尼酸之質量平衡。用NESCAFE COOL® (具有奶精及甜 味劑之烘焙咖啡之萃取物）及添加有奶精之正常濾沖烘焙 及研磨咖啡及可購得之5-咖啡醯基奎尼酸（5-CQA)進行類 似試驗。 結果 在實驗期間在添加約氏乳桿菌之情況下水解之5-咖啡醯 基奎尼酸（5-CQA)的百分比展示於表12中。在未添加約氏 乳桿菌之對照實驗中未觀察到5-咖啡醯基奎尼酸（5-CQA) 之水解。 表12.如TIM模型中所測定之於咖啡萃取物中之5-CQA及 純5-CQA之水解（存在於樣品中之總5-CQA之水解百分 產物 5-CQA之水解百分比 5-CQA 48 NESCAFE PROTECT® 34 NESCAFE COOL® 79 具有奶精之濾沖烘焙及研磨咖啡 53 【圖式簡單說明】

圖1 :展示在用200 ug/ml及400 ug/ml未作水解綠原酸處 理之NESCAFE RED CUP®(烘焙咖啡豆之萃取物）及200 ug/ml及400 ug/ml用約氏乳桿菌處理之NESCAFE 139211.doc •24- 200944133 PROTECT®處理的大鼠原生肝細胞以及未用叻口啡萃取物處 理之對照樣品中GST次單元（GSTA4、GSTP1)及血紅素-加 m 氧酶-l(HO-l)之蛋白質表現的西方墨點法凝膠。關於詳細 描述參見實例1 ;及 圖2 :展示在用5%之未作水解綠原酸處理之NESCAFE RED CUP®(烘焙咖啡豆之萃取物）(RN)、未作水解綠原酸 處理之NESCAFE PROTECT®(生咖徘豆與供培咖徘豆之共 萃取物）(P);及用約氏乳桿菌處理之NESCAFE PROTECT® φ (Lal-P)餵食2週之雄性大鼠肝臟中誘導解毒酶表現 (GSTP1 ; NQO1)的西方墨點法。關於詳細描述參見實例 參 139211.doc •25·

Claims (1)

1. 200944133 七、申請專利範圍： I. 一種飲料粉末，其包含： • a)乾咖啡萃取物；及 b)能夠水解咖啡醯基奎尼酸及二酯以產生咖啡酸之微 生物及/或酶。 • 2 ·如請求項1之飲料粉末，其包含奶精。 ， 3.如請求項1或2之飲料粉末，其包含甜味劑。 4_如請求項1或2之飲料粉末’其包含乳蛋白及/或乳脂。 ❹ 5.如請求項1或2之飲料粉末，其中能夠水解咖啡醯基奎尼 酸及二酯以產生咖啡酸之該微生物是乳酸菌。 6. —種用於製備飲料之套組，其包含至少兩個部分： a) 包含咖啡萃取物之第一部分；及 b) 包含能夠水解綠原酸以產生酚酸之微生物及/或酶的 第二部分。 7. 如請求項6之套組，其中該第一部分包含純的可溶咖 啡。 φ 8.如請求項6或7之套組，其中該第二部分包含乳蛋白及/或 植物蛋白。 . 9‘如請求項6或7之套組，其中該第二部分包含奶精及/或甜 味劑。 1 〇.如請求項6或7之套組’其中能夠水解綠原酸以產生酚酸 之該微生物是乳酸菌。 II. 一種如請求項丨至5中任一項之飲料粉末或如請求項61〇 中任一項之套組的用途；其係用於製造供增強飲用由此 製備之該飲料之人類或動物之活體内抗氧化能力的飲料。 139211.doc 200944133 四、 指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） 五、 本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 139211.doc