MX2010011059A - Composiciones para preparar una bebida de cafe que comprende acido clorogenico hidrolizado. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con composiciones para preparar una bebida, donde las composiciones comprenden un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos de un extracto de café a ácidos fenólicos. Cuando una bebida preparada con las composiciones de la invención se consume los ácidos clorogénicos presentes en el extracto de café se hidrolizan para mejorar las propiedades antioxidantes y/o anti-inflamatorias en comparación con las bebidas convencionales similares.

Description

COMPOSICIONES PARA PREPARAR UNA BEBIDA DE CAFÉ QUE COMPRENDE ÁCIDO CLOROGÉNICO HIROLIZADO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones para preparar una bebida. Las composiciones comprenden un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos de un extracto de café a ácidos fenólicos. Las bebidas preparadas con las composiciones de la invención tienen propiedades antioxidantes y/o anti-inflamatorias.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El café y los compuestos activos del café tal como la cafeína y diterpenos (por ejemplo cafestol, kahweol) han demostrado que inducen enzimas desintoxicantes (por ejemplo glutation-S-transferasas, GST) en roedores (Cavin C. et al, 1998. Los diterpenos específicos del café, cafestol y kahweol protegen contra la genotoxicidad inducida por aflatoxina B1 a través de un mecanismo dual. Carcinogenesis 19, 1369-1375; Cavin, C. et al, 2003. Los diterpenos del café previenen la genotoxicidad por benzo[a]pireno en sistemas de cultivo de ratas y de humano. Biochemical Biophysical Research Communication 306, 488-495; Huber, W. et al. 2002a. El aumento de las enzimas quimioprotectoras, glucuronosil transferasa y glutation transferasa en órganos específicos de la rata a través de los componentes del cafó, kahweol y cafestol. Archive of Toxicology 76, 209-217). Además se ha demostrado la actividad GST aumentada por el café en el ser humano luego del consumo de 800 mi de café durante 5 días (Steinkellner, H. et al. 2005. El consumo de café induce GSTP en el plasma y protege a COMPOSICIONES PARA PREPARAR UNA BEBIDA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones para preparar una bebida. Las composiciones comprenden un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos de un extracto de café a ácidos fenólicos. Las bebidas preparadas con las composiciones de la invención tienen propiedades antioxidantes y/o anti-inflamatorias.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El café y los compuestos activos del café tal como la cafeína y diterpenos (por ejemplo cafestol, kahweol) han demostrado que inducen enzimas desintoxicantes (por ejemplo glutation-S-transferasas, GST) en roedores (Cavin C. et al, 1998. Los diterpenos específicos del café, cafestol y kahweol protegen contra la genotoxicidad inducida por aflatoxina B1 a través de un mecanismo dual. Carcinogenesis 19, 1369-1375; Cavin, C. et al, 2003. Los diterpenos del café previenen la genotoxicidad por benzo[a]pireno en sistemas de cultivo de ratas y de humano. Biochemical Biophysical Research Communication 306, 488-495; Huber, W. et al. 2002a. El aumento de las enzimas quimioprotectoras, glucuronosil transferasa y glutation transferasa en órganos específicos de la rata a través de los componentes del café, kahweol y cafestol. Archive of Toxicology 76, 209-217). Además se ha demostrado la actividad GST aumentada por el café en el ser humano luego del consumo de 800 mi de café durante 5 días (Steinkellner, H. et al. 2005. El consumo de café induce GSTP en el plasma y protege a los linfocitos contra el daño del ADN inducido por (+/-)-anti-benzo[a]piren-7,8-dihidrodiol-9,10-epóxido: resultados de pruebas de intervención humana controlada. Mut. Res. 591 264-275).

Este tipo de actividad antioxidante es conocida por proteger contra el "estrés oxidativo" por medio de la reducción de los daños de radicales libres que pueden estar implicados, por ejemplo, en cáncer, enfermedades del cardíacas, desórdenes degenerativos del cerebro, y envejecimiento.

Para aumentar los beneficios de salud de los productos alimenticios y bebidas existe un deseo de elaborar productos con una actividad antioxidante incrementada, así como otras actividades biológicas benéficas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Los inventores han encontrado sorpresivamente que al tratar el extracto de café con microorganismos o enzimas capaces de hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos resulta en un antioxidante perfeccionado y/o propiedades antiinflamatorias del extracto de café. Además, se ha encontrado que este tratamiento se puede llevar a cabo in vivo cuando un humano o un animal ingiere un extracto de café en combinación con una enzima o un microorganismo capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos.

Por consiguiente, la presente invención se relaciona con una bebida en polvo que comprende: a) un extracto de café secado; y b) un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácido cafeoilquínico y di-ésteres para generar ácido cafeico. En un aspecto adicional la invención se refiere a un equipo para preparar una bebida, que comprende al menos dos partes: a) una primera parte comprende un extracto de café, y b) una segunda parte comprende un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos. En otro aspecto más la invención se refiere a la utilización de los productos de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 : Geles de Western Blot muestran la expresión de las subunidades de la proteína GST (GSTA4, GSTP1 ) y Hemo-Oxigenasa-1 (HO-1 ) en heptocitos primarios de rata tratadas con 200 y 400 pg/ml de NESCAFE RED CUP® (extracto de los granos de café tostado) no tratadas para hidrolizar ácidos clorogénicos, y 200 y 400 g/ml de NESCAFE PROTECT® tratados con Lactobacillus johnsonii, así como muestras de control no tratadas con extracto de café. Para más detalles, véase el ejemplo 1.

Figura 2: Western Blot que muestra la inducción de la expresión de enzimas desintoxicantes (GSTP1 ; NQ01 ) en el hígado de ratas macho alimentadas en su dieta durante 2 semanas con 5% de NESCAFE RED CUP® (extracto de los granos de café tostado) no tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos (RN), NESCAFE PROTECT® (un co-extracto de granos de café verde y tostado) no tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos (P); y NESCAFE PROTECT® tratados con Lactobacillus johnsonii (LA1 -P). Para más detalles, véase el ejemplo 1.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las composiciones para ser mezcladas con un extracto de café para preparar una bebida de café son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, leche, crema, leche en polvo y sustituto de crema para café. Tales composiciones son utilizadas por los consumidores para modificar por ejemplo, el aroma, la apariencia y la textura del café.

Las composiciones pueden estar en forma líquida o en forma seca, por ejemplo, como polvos, que se disuelven y/o se suspenden en una taza de de café, por ejemplo, una taza de café recién preparada al disolver café soluble puro en agua.

En una modalidad de la invención, la composición ha ser mezclada con un extracto de café es un sustituto de crema para café o leche en polvo. Un sustituto de crema para café puede ser a base de, por ejemplo, proteína de leche y/o grasa de leche, o puede ser un sustituto de crema para café no lácteo a base de proteína vegetal y/o grasa vegetal. La composición puede estar en una forma seca, por ejemplo, como un polvo, en donde el contenido de agua, por ejemplo, es menor al 5%. La composición puede también estar en una forma líquida.

La composición a ser mezclada con un extracto de café de acuerdo con la invención comprende un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos. Los ácidos clorogénicos son una familia de ésteres formados entre ácidos trans-cinámicos y ácidos quínicos. Los ácidos clorogénicos están naturalmente presentes en el café, principalmente como mono- y di-ésteres de ácido químico y grupos fenólicos (por ejemplo, cafeico, ferúlico, cumárico, metoxicinámico) unido a posiciones diferentes. En una modalidad de la invención el micro organismo y/o enzima es capaz de hidrolizar ácido cafeoilquínico y di-ésteres (por ejemplo, ácido 3-, 4-, o 5-cafeoilquínico y diésteres), y/o ácido quínico fenólico y diésteres (por ejemplo, ácido 3-, 4-, o 5-quínico fenólico y diésteres), para generar ácido cafeico y ácido fenólico, respectivamente.

La composición de la invención será formulada de modo que el microorganismo y/o enzima no fermentará o reaccionará con la composición durante el almacenamiento del producto. Esto se puede lograr, por ejemplo, al formular la composición como un polvo seco, y/o por medio de encapsulado del microorganismo y/o enzima de modo que el microorganismo y/o enzima solamente sea liberada cuando la composición se mezcla con el extracto de café o durante la digestión.

La composición de la invención puede comprender además cualquier ingrediente adecuado para incluirlo en una composición ha ser mezclada con un extracto de café para preparar una bebida. Los ingredientes habituales o comunes puede ser, por ejemplo, azúcares, edulcorantes artificiales, emulsionantes, estabilizadores, espesantes, agentes de fluido, colorantes, saborizantes, aromas y similares. Los edulcorantes artificiales incluyen sacarina, ciclamatos, acetosulfame, edulcorantes en base a L-aspartil, tal como aspartame, y mezclas de los mismos. Los emulsionantes adecuados incluyen mono-glicéridos, di-glicéridos, lecitina, esteres de mono-glicéridos del ácido diacetil tartárico, almidones emulsionados y mezclas de los mismos. Los estabilizadores adecuados incluyen fosfato dipotásico y citrato de sodio. Un agente de fluido adecuado es aluminato de sodio-sílice. En una modalidad la composición comprende proteína de leche y/o proteína vegetal. En otra modalidad, la composición comprende grasa de leche y grasa vegetal.

EXTRACTO DE CAFE Un extracto de café de acuerdo con la invención es un extracto de granos de café verde y/o granos de café tostados por agua o vapor. Numerosos métodos para elaborar extractos de café son conocidos en la técnica, por ejemplo, en el documento EP 0916267. El extracto de café puede ser, por ejemplo, café soluble puro. Los productos de café soluble puro están fácilmente disponibles y se conocen en la técnica numerosos métodos para elaborar productos de café soluble, por ejemplo en el documento EP 106930.

MICROORGANISMOS Los microorganismos capaces de hidrolizar el ácido clorogénico pueden ser identificados por ejemplo en los ejemplos de esta solicitud. Los microorganismos adecuados pueden ser seleccionados a partir de levaduras, hongos o bacterias. Los microorganismos adecuados pueden ser, por ejemplo, un Aspergillus; tal como por ejemplo, Aspergillus oryzae, un Lactobacillus, tal como por ejemplo, L. johnsonii (CNCM I-1225); un Bifidobacterium, tal como por ejemplo, B. lactis (CNCM I-3446), o una levadura tal como por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

ENZIMAS Una enzima adecuada es, por ejemplo, una esterasa, como por ejemplo una esterasa clorogenato derivada de Aspergillus japonicus. (Comercialmente disponible de Kikkoman, Japón), Tannase de Aspergillus oryzae (EC 3.1.1 .20) (comercialmente disponible de Kikkoman, Japón); y Palatase 20000L (EC 3.1 .1.3) (comercialmente disponible de Novozymes A/S, Dinamarca). La enzima puede estar presente como una enzima purificada o, por ejemplo en la forma de un lisado celular de un microorganismo. Las células adecuadas pueden ser, por ejemplo células de los microorganismos mencionados anteriormente. Los métodos adecuados para producir lisado celular son bien conocidos en la técnica.

El microorganismo y/o enzima debe estar presente en una cantidad suficiente para hidrolizar una cantidad sustancial de ácidos clorogénicos presentes en el extracto de café a ácidos fenólicos durante la digestión. La cantidad de microorganismos y/o enzimas necesarios puede estar determinada, por ejemplo, en el modelo de digestión TIM que aquí se describe en el Ejemplo 3, al determinar la cantidad de ácidos clorogénicos hidrolizados durante el experimento de digestión. Preferentemente, son hidrolizados al menos 20%, tal como al menos 30%, al menos 50%, o al menos 75% de ácido quínico cafeico (CQA) y/o ácidos quínicos fenólicos (FAQ) presentes en el extracto de café.

EQUIPO DE PARTES En una modalidad, la invención se refiere a un equipo para preparar una bebida, que comprende al menos dos partes: a) una primera parte que comprende un extracto de café; y b) una segunda parte que comprende un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos. Las dos partes son comercializadas en conjunto para la preparación de una bebida pero están físicamente separadas en el empaque del producto. La bebida final para ser consumida se prepara al mezclar las dos partes poco antes del consumo. Si una de las partes o ambas partes están en forma líquida pueden ser mezcladas directamente, de modo opcional se puede agregar además otro líquido, por ejemplo, agua o leche. Las dos partes se pueden mezclar también por medio de la disolución o suspensión en un líquido, por ejemplo, agua o leche. El líquido utilizado puede estar caliente o frío dependiendo si se desea una bebida caliente o fría. Si se utiliza líquido caliente, éste debe tener preferentemente una temperatura que no sea demasiado elevada de modo que desactive el microorganismo y/o enzima antes de la ingestión de la bebida.

La primera parte del equipo comprende un extracto de café. En una modalidad preferida la primera parte está en una forma seca, por ejemplo, en la forma de un polvo. Por ejemplo, el extracto de café puede ser un café en polvo puro convencional, como por ejemplo un extracto de café secado por aspersión o un extracto de café secado por congelación. Los café en polvo solubles puros están fácilmente disponibles y han sido exhaustivamente descritos en la técnica. La primera parte también puede estar en una forma líquida. Los extractos líquidos de café están fácilmente disponibles, como por ejemplo, las bebidas de café listas para consumir. La primera parte puede comprender además cualquier otro ingrediente adecuado, por ejemplo, extracto de achicoria, aditivos de aroma, estabilizadores, sales y/o edulcorantes. La primera parte puede ser envasada de cualquier forma adecuada, por ejemplo, en un sobrecito, botella o lata.

La segunda parte comprende un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos. Esta parte puede estar preferentemente en la forma de una composición para ser mezclada con un extracto de café como se describió anteriormente, preferentemente en la forma de leche en polvo o sustituto de crema para café. Esta puede comprender cualquier otro componente adecuado, como por ejemplo, componentes generalmente encontrados en sustitutos de cremas para café o leche en polvo, tales como los componentes aquí mencionados como ingredientes de una composición a ser mezclada con un extracto de café. Esta puede estar en forma de material seco, por ejemplo, como un polvo, o en forma líquida, y puede ser envasada de cualquier manera adecuada, por ejemplo, en un sobrecito, botella o lata. Debes ser formulado de tal modo que el microorganismo y/o enzima no fermente o reaccione con otros ingredientes durante el almacenamiento. Esto puede ser logrado, por ejemplo, por medio de formular la composición como un polvo seco, y/o por medio de encapsular el microorganismo y/o enzima de modo que el microorganismo y/o enzima solo será liberada cuando la composición es mezclada con extracto de café o durante la digestión.

Dichas por lo menos dos partes pueden ser envasadas en conjunto de cualquier forma adecuada. Por ejemplo, pueden ser envasadas en un contenedor o envase combinado en donde las partes se mantienen físicamente separadas durante el almacenamiento y son mezcladas cuando el envase se abre, o pueden ser envasadas en contenedores separados que son comercializados juntos para la preparación de una bebida.

BEBIDA EN POLVO En una modalidad, la invención se relaciona con una bebida en polvo que comprende: a) un extracto de café secado; y b) un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos.

Una bebida en polvo de acuerdo con la invención es un polvo a ser utilizado para la preparación de una bebida disolviendo o suspendiendo el polvo en un líquido, por ejemplo, agua o leche. La bebida a ser preparada a partir del polvo puede, por ejemplo, ser café negro, café latte, café macchiato, capuchino, o cualquier otra bebida en base a café.

El extracto de café secado puede ser, por ejemplo, un café en polvo soluble puro convencional, por ejemplo, un extracto de café secado por aspersión o un extracto de café secado por congelación. Los cafés en polvo solubles puros están fácilmente disponibles y han sido ampliamente descritos en la técnica.

El microorganismo y/o enzima se encuentran presentes en una forma en polvo seca, por ejemplo, como un polvo secado por congelación. El microorganismo y/o enzima pueden estar encapsulados.

La bebida en polvo debe ser formulada de modo que el microorganismo y/o enzima no fermente o reaccione con el extracto de café y/u otros ingredientes durante el almacenamiento.

En una modalidad preferida de la invención, una bebida en polvo comprende una composición para ser mezclada con un extracto de café como se describió anteriormente en una forma seca. En una modalidad más preferida de la invención, una bebida en polvo comprende un sustituto de crema.

La bebida en polvo puede comprender cualquier otro ingrediente adecuado para preparar la bebida deseada. Los ingredientes adecuados son bien conocidos en la técnica, y pueden, por ejemplo, ser azúcares, edulcorantes artificiales, emulsionantes, estabilizadores, espesadores, agentes de fluido, colorantes, saborizantes, aromas y similares. Los edulcorantes artificiales adecuados incluyen sacarina, ciclamatos, edulcorantes en base a L-apartil, tal como aspartame y mezclas de los mismos. Los emulsionantes adecuados incluyen monoglicéridos, diglicéridos, lecitina, ésteres del ácido diacetil tartárico de mono-diglicéridos (data ésteres), almidones de emulsificación y mezclas de los mismos. Los establizadores adecuados incluyen fosfato dipotásico y citrato de sodio. Un agente de fluido adecuado es aluminato de sodio-sílice. En una modalidad de la bebida en polvo comprende proteína de leche y/o proteína vegetal. En otra modalidad la bebida en polvo comprende grasa de leche o grasa vegetal. En otra modalidad, la bebida en polvo comprende un edulcorante.

USO DE LOS PRODUCTOS DE LA INVENCION Los productos de la invención pueden ser usados para aumentar la capacidad antioxidante in vivo en un humano o animal que consumen una bebida preparada de los productos de la invención, por ejemplo, por medio de inducir enzimas destoxificantes tales como la enzima glutation transferasa (GST) y por medio de aumentar la secuencia de la expresión del gen Nrf2. La actividad aumentada del gen Nrf2 asociada a los genes han sido presentadas para aumentar la destoxificación y para estimular la defensa endógena contra el estrés oxidativo.

Los productos de la invención pueden ser utilizados para disminuir inflamación, por ejemplo, por medio de reducir el nivel de prostaglandina E2.

Muchos problemas de salud y desórdenes se relacionan con el estrés oxidativo e inflamación. Los productos de la invención pueden ser utilizados para tratar o prevenir dichos problemas o desórdenes en un humano o animal que consume una bebida preparada a partir de los productos de la invención. Los problemas y padecimientos relevantes son, por ejemplo, padecimientos de la piel, como por ejemplo, daño por exposición a la luz causado por radiación UV, dermatitis atópica, eczema, descamación, picazón, síntomas alérgicos; desórdenes cerebrales; inflamación; obesidad; y cáncer; por como por ejemplo cáncer de piel y cáncer pulmonar.

Los productos de la invención pueden además ser utilizados como agentes antidiabéticos, por ejemplo, mediante la reducción de los niveles de glucosa en sangre, y/o aumentar los niveles en sangre de leptina, insulina y/o péptido C; tal como agentes de remodelado óseo, por ejemplo, al incrementar la densidad mineral del hueso, por ejemplo al aumentar los niveles de suero de estrógeno y/o progesterona, y/o de la actividad de la fosfatasa alcalina; como agentes anti-metásticos, como por ejemplo, con efecto antiangiogénico.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con células frescas de Lactobacillus iohnsonü Células de L. johnsonii (CNCM 1-1225) fueron cultivadas (7,0 E08 ufc/ml) y centrifugadas (5000 g, 10 min), las pellas fueron suspendidas de nuevo en regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) a una concentración de 0,61 g/ml. 30 mg/ml de NESCAFE PROTECT® (un co-extracto seco de granos de café verde y tostado) se añadió y la mezcla se incubó a 37°C. Las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción, centrifugadas (3000 g, 5 min) y filtradas a través de filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 pm (Millipore SLHA 025 BS) y analizadas por medio de HPLC.

Una reacción de control fue ejecutada en paralelo bajo las mismas condiciones de reacción, pero sin bacterias.

Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con extractos de Lactobacillus johnsonii (células Usadas) Células de L. johnsonii (CNCM 1-1225) fueron cultivadas (7,0 E08 ufc/ml) y centrifugadas (5000 g, 10 min), las pellas fueron suspendidas de nuevo en regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) a una concentración de 0,61 g/ml. Las células fueron Usadas después utilizando el método de cuentas de vidrio. 600 µ? de preparación de células fueron colocados en tubos con tapa de rosca y 600 µ? de cuentas de vidrio fueron agregadas a 0°C. Los tubos fueron puestos en un Mini-Beadbeater durante 1 min con agitación intensa, se enfriaron en hielo, y se colocaron un minuto más en el Mini-Beadbeater. El extracto crudo de células se añadió a 900 µ? de una solución de NESCAFE PROTECT® (30 mg/ml, regulador de fosfato pH 7,0) y la mezcla se incubó a 37°C. Las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción, centrifugadas (3000 g, 5 min) y filtradas a través de filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 µ? (Millipore SLHA 025 BS) y analizadas por medio de HPLC.

Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con preparación secada por aspersión de Lactobacillus iohnsonii 30 mg de NESCAFE PROTECT® fueron disueltos en 1 mi de regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) o en 1 mi de agua. A esta solución, se agregaron 10 mg de una preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225) (3,3 E9 ufc/g) fueron añadidas. La mezcla fue luego incubada a 37°C y las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción. Después de la centrifugación (3000 g, 5 min) y filtración (filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 µ?t? Millipore SLHA 025 BS) las muestras fueron analizadas por medio de HPLC.

Tratamiento de extracto de café verde con una preparación secada por aspersión de Lactobacillus iohnsonii (CNCM 1-1225) 30 mg de extracto seco de café verde fueron disueltos en 1 mi de regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) o en 1 mi de agua. A esta solución, se agregaron 10 mg de una preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii (3,3 E9 ufc/g). La mezcla fue luego incubada a 37°C y las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción. Después de la centrifugación (3000 g, 5 min) y filtración (filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 µ?t?, Millipore SLHA 025 BS) las muestras fueron analizadas por medio de HPLC.

Tratamiento de NESCAFE® con una preparación concentrada de Lactobacillus iohnsonii (CNCM 1-1225) 400 mg de NESCAFE SPECIAL FILTRE® (un extracto seco de granos de café tostado) fueron disueltos en 1 mi de agua en ebullición y la solución fue enfriada a 37°C a temperatura ambiente. A 250 µ? de esta solución de café, se agregaron distintas cantidades de preparación concentrada de Lactobacillus johnsonii (50 µ?, 100 µ?, 350 µ?, 750 µ?) y el volumen fue ajustado a 1 mi con agua. Las mezclas fueron incubadas después a 37°C durante 2 h y 4 h. Después de la centrifugación (3000 g, 5 min) y filtración, las muestras se analizaron por medio de HPLC.

Análisis HPLC Muestras de café fueron diluidas al 1 % p/p y analizadas por medio de RP-HPLC en una columna (Macherey-Nagel) CC 250/4 Nucleosil 100-5-C18. El sistema eluyente fue agua Millipore, 0,1 % TFA y CH3CN a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El método permitió la determinación simultánea de ácidos cafeoil quínicos (CQA), ácidos feruloil quínicos (FQA), ácidos di-cafeoil quínicos (diCQA), lactonas de ácido feruloil quínico, ácido cafeico (CC) y ácido ferúlico (FA) (absorbencia a 325 nm) utilizando curvas de calibración estándar externas. Los resultados se expresaron en relación a la referencia en tiempo 0 (tO) o a la referencia al mismo tiempo sin bacterias.

Ensayo de la luciferasa del elemento de respuesta antioxidante (ARE) El pGL-8xARE que contiene ocho copias de ARE presentes en la glutatión-S-transferasa A2 (GSTA2) de rata junto con el plasmido pcDNA3.1 que contiene el marcador de selección para neomicina fueron transfectados establemente en células humanas MCF7 (Wang et al., Cáncer Res. 66, 10983-10994, 2006). ARE (elemento de respuesta antioxidante) es el sitio de unión del factor de transcripción Nrf2 que regula los genes implicados en la desintoxicación y defensa endógena contra el estrés oxidativo. El plasmido pGL-8xARE contiene un gen luciferasa corriente abajo de los ocho sitios de unión Nrí2 que permite el seguimiento de la actividad Nrf2.

Para el tratamiento con café, las células AREc32 se sembraron en placas de microtitulación de 96 pozos en medio de cultivo D EM. Después del tratamiento durante 24 horas con los diferentes cafés, se determinó la actividad luciferasa de luciérnaga.

Expresión de proteína Se obtuvieron hepatocitos primarios mediante la perfusión del hígado de ratas Sprague-Dawley con una solución de colagenasa (Sidhu et al., Arch. Biochem. Biophys. 301 , 103-1 13,1993). Se encontró que la viabilidad celular, estimada por el ensayo de exclusión del Azul de Tripán, oscila entre el 90-95%. Las células fueron sembradas a una densidad de 1 ,5 x 105 células/cm2 en placas plásticas de cultivo celular de 60 mm en 3 mi de medio William complementado con L-glutamina 2mM, HEPES 10 mM pH 7.4, ITS+, 15000U de Penicilina/Estreptomicina, dexametasona 100 nM y 5% de suero bovino fetal (Hi-clone). Se permitió que los hepatocitos se fijaran durante dos horas y luego se lavaron con EBSS para eliminar los desechos y las células no unidas. Se agregó medio fresco libre de suero que contenía 25 nM de dexametasona y se aplicó un revestimiento de matrigel (233 g/ml). Se añadió matrigel fresco a los cultivos cada dos días seguido por un cambio de medio. Para estudiar el efecto del café en enzimas desintoxicantes y en la expresión de proteína antioxidante, el material de ensayo fue añadido al medio de cultivo 24 horas después de la siembra de células por un período de 48 horas antes de la extracción de proteínas y el análisis por Western blot (Cavin et al., Food Chem Tox. 46, 1239-48, 2008).

Ensayo de formación de prostaqlandina E2 Células de colon humano HT-29 fueron tratadas con los distintos cafés durante 15 horas seguida por una co-incubación de 6 horas junto con un agente pro-inflamatorio TNF-a (10 ng/ml). El análisis de la producción de PGE2 en células HT-29 se determinó mediante^un inmuno ensayo enzimático competitivo (EIA) (Cavin et al., BBRC 327, 742-49, 2005).

Resultados Hidrólisis de ácidos cloroqénicos para generar ácidos fenólicos Experimento 1 : Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con células frescas de L johnsonii con diferentes tiempos de reacción y cantidad de preparación celular.

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados del experimento 1 Tiempo (h) 6 24 6 24 6 24 Preparación 750 750 350 350 100 100 celular (µ?_) Concentración en % relativo a referencia no tratada en t=0 CQA 3 0 14 3 39 15 FQA 8 0 17 4 42 17 DiCQA 0 0 0 0 23 2 CA 13215 13238 14282 15981 101 1 1 13661 FA 7776 8845 7234 8861 4594 6691 Balance de masa (mmol/g materia seca) Acidos 0,20 0,21 0,18 0,20 0,13 0,17 clorogénicos consumidos CA y FA 0,20 0,20 0,21 0,24 0,14 0,20 formados Experimento 2. Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con extracto de L johnsonii (células lisadas) con diferentes tiempos de reacción y cantidad de preparación celular.

Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados del experimento 2.

Tiempo (h) 2 2 6 6 Preparación celular 3500 100.0 350.0 100.0 Concentración en % relativo a referencia no tratada en t: =0 CQA 10 32 6 14 FQA 15 36 1 1 18 diCQA 1 8 1 1 CA 13901 10729 16300 12581 FA 7771 5581 9720 6960 Experimento 3: Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii.

Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Resultados del experimento 3. CQA, FQA, CA y FA están dados como % con relación al control no tratado en t=0.

Experimento 4: Tratamiento de extracto de café verde con preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii.

Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Resultados del experimento 4. CQA, FQA, CA y FA están dados como % relativo al control no tratado en t=0.

Experimento 5: Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con preparación concentrada de Lactobacillus johnsonii.

Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Resultados del experimento 5. CQA, FQA, CA y FA están dados como % relativo al control no tratado en t=0.

La tabla 6 muestra la concentración absoluta de un número de compuestos en dos muestras diferentes de extractos de granos de café verde que no han sido tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos (muestras control).

Tabla 6. Composición de los extractos de café verde no tratados (muestras control). La concentración está dada en miligramos por gramo de materia seca.

A B Acido 3-cafeoil químico 13,88 15,57 Ácido 4-cafeoil químico 17,58 20,08 Ácido 5-cafeoil químico 81 ,16 85,45 Suma de CQA 112,62 121 ,10 Ácido 3-feruloil químico 0,00 0,00 Ácido 4-feruloil químico 3,29 4,41 Ácido 5-feruloil químico 17,70 19,77 Expresión de proteína En hepatocitos primarios de rata, NESCAFE RED CUP® (extracto de los granos de café tostado) a 200 9/G?? no produjo después de 48 h de tratamiento incremento alguno en la expresión de proteínas de las subunidades GST (GSTA4, GSTP1 ) y Hemo-Oxigenasa-1 (HO-1 ) e inducciones débiles de las expresiones de GSTP1 y HO-1 a 400 µg/ml mediante Western blot. En cambio, se observó una mayor inducción de las diferentes expresiones de proteínas con NESCAFE PROTECT® tratado con L johnsonii tanto a 200 µg/ml y 400 µg/ml en GSTA4, GSTP1 y HO-1 ). Los resultados se muestran como geles de Western Blot en la fig. 1 .

Los datos obtenidos en el hígado de ratas macho alimentadas en su dieta durante 2 semanas con el 5% de NESCAFE RED CUP® versus NESCAFE PROTECT® y NESCAFE PROTECT® tratados con L. johnsonii confirmó los efectos observados en hepatocitos primarios de rata. La inducción más fuerte de la expresión de las enzimas desintoxicantes (GSTP1 ; NQ01 ) se encontró con el NESCAFE PROTECT® tratado con L. johnsonii en comparación al NESCAFE PROTECT® no tratado (GSTP1 ; NQ01 ) y NESCAFE RED CUP® no tratado (GSTP1 ; NQ01 ). Los resultados se muestran como geles de Western Blot en la fig. 2.

Ensayo de la luciferasa del elemento de respuesta antioxidante (ARE) Células humanas de cáncer de mama (AREc32) transfectadas establemente con varias copias del constructo reportero GSTA2-ARE de rata fue utilizado para demostrar la activación de la ruta de Nrf2-ARE por el café. Extracto de café verde no tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos, y diferentes extractos de café verde tratados con L. johnsonü durante 24 horas produjo un aumento dosis-dependiente en la actividad del reportero Nrf2-luciferasa (véase la tabla 7).

Tabla 7. Inducción de la actividad Nrf2 por café (actividad luciferasa de luciérnaga. AU) Ensayo de formación de prostaglandina E2 El efecto antiinflamatorio potencial del extracto de café verde tratado con L. johnsonii se evaluó en células HT-29 de colon humano. Tras el tratamiento con un agente pro-inflamatorio TNF-a, el nivel de la prostaglandina E2 (PGE2) es inducido en las células del colon. En este estudio, las células fueron pre-tratadas durante 24 h con diferentes extractos de café (extracto de café verde no tratado para hidrolizar ácidos clorogénicos, y extracto de café verde diferente tratado con L. johnsonii durante 24 h). TNF-a (10 ng/ml) se añadió en las últimas 6 h del experimento. Los datos (véase la tabla 8) mostraron una clara disminución dependiente de la dosis por los cafés de la formación de PGE2 al compararla a células controles tratadas con TNF-a.

Tabla 8. Disminución de la formación de PGE2 como un resultado del tratamiento del extracto de café en comparación a células controles tratadas con TNF-a (UA).

Ejemplo 2 Muestras de café Extracto de café verde de granos verde Robusta 100% NESCAFE PROTECT®, un co-extracto seco de granos de café verde y tostado Enzimas y células Microorganismos Medio de cultivo Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225 MRS Clorogenato esterasa (24 U/g), derivada de Aspergillus japonicus (Kikkoman, Japón). Tannasa de Aspergillus oryzae (Kikkoman, Japón).

Preparación de células de bacterias Las cepas probadas fueron cultivadas (centrifugación a 5000 g durante 10 min) después de haber llegado bien a la fase estacionaria, lo que equivale a 16 horas de incubación en el medio de cultivo a 37°C en atmósfera anaeróbica sin agitación. Para una primera activación de las cepas, cultivos madre congelados fueron inoculados en medios frescos y cultivados durante la noche. Este pre-cultivo se utilizó para inocular al cultivo.

Tratamiento de los extractos de café con células de bacterias Después del cultivo de bacterias y la centrifugación, las pellas fueron suspendidas de nuevo en regulador de fosfato (pH 7,0) a una concentración de 0,61 g/ml. A 200 µ? de esta preparación de células, se agregaron 800 µ? de una solución de café (3%) y la mezcla se incubó a 37°C durante 4 h, 16 h y 24 h.

Incubación de los extractos de café con Cloroqenato esterasa Una solución de clorogenato esterasa (25 mg) en 200 µ? de tampón fosfato (pH 7,0) se añadió á 800 µ? de una solución de café (3%). La mezcla se incubó a 37°C durante 4 h, 16 h y 24 h. Después del tiempo de reacción, la actividad enzimática fue detenida por tratamiento térmico (3 min, 90°C) y la mezcla fue filtrada antes de su análisis.

Ensayo luciferasa ARE Como en el ejemplo 1 Resultados Las células humanas de cáncer de mama (AREc32) transfectadas establemente con varias copias del constructo reportero GSTA2-ARE de rata fueron utilizadas para demostrar la activación de la ruta antioxidantes de Nrf2 por el café. Extracto de café verde no tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos (no tratado), extracto de café verde tratados con Lactobacillus johnsonii (Lj) durante 24 h, extracto de café verde tratados con Bifidobacterium lactis (Bl) durante 24 h, y extractos de café verde tratados con clorogenato esterasa (CE) durante 4 h, produjeron un aumento dependiente de dosis en la actividad reportero de Nrf2-luciferasa (tabla 9).

Tabla 9. Actividad reportero de Nrf2-luciferasa de extractos de café no tratados y tratados (AU).

Extractos de café verde fueron tratados con diferentes microorganismos y clorogenato esterasa para hidrolizar ácidos clorogénicos.

Los resultados se muestran en la tabla 10.

Tabla 10. Composición de los extractos de café verde como resultado de los tratamientos. CQA, FQA, CA y FA están dados en % en relación al control sin tratar a t=0.

NESCAFE PROTECT® fue tratado con diferentes microorganismos y clorogenato esterasa para hidrolizar ácidos clorogénicos.

Los resultados se muestran en la tabla 1 1.

Tabla 1 1. Composición de NESCAFE PROTECT® como un resultado de los tratamientos. CQA, FQA, CA y FA están dados en % en relación al control sin tratar en t=0.

Lactobacillus Bifidobacterium lactis Clorogenato esterasa Johnsonii tiempo 4 16 24 4 16 24 4 16 24 (h) CQA 33 13 13 97 81 80 5 3 3 EJEMPLO 3 Modelo gástrico del intestino delgado ???) El modelo gástrico del intestino delgado, TIM-1 , comprende cuatro compartimientos conectados que representan el estómago, duodeno, yeyuno e íleo, respectivamente. Cada compartimiento consiste de una pared exterior de vidrio con una pared interior flexible. La pared flexible está rodeada por agua a 37°C para exprimir las paredes, lo que asegura el mezclado de los alimentos con las enzimas secretadas por movimientos peristálticos en el tracto gastrointestinal.

Los experimentos en el modelo fueron realizados bajo condiciones psicológicas promedio del tracto gastro-intestinal. Durante los experimentos, la temperatura fue mantenida a 37°C y las secreciones salivales, gástricas, biliares y pancreáticas fueron simuladas. El proceso de digestión en el modelo fue monitoreado durante 6 horas. Durante las primeras 3,5 horas, el contenido gástrico fue gradualmente suministrado dentro de la "válvula pilórica" del intestino delgado. Al final del experimento, aproximadamente 80% del contenido del intestino delgado fue gradualmente suministrado en el "intestino grueso" a través de la válvula ileocecal. El pH gástrico disminuyó gradualmente desde 6,5 hasta 2,0 en aproximadamente 5 horas por medio de la secreción de 1 M HCI; el pH de los contenidos del intestino delgado fue mantenido en 6,5 en el duodeno, 6,8 en el yeyuno y 7,2 en el íleo. Los productos de la digestión y el agua fueron absorbidos desde los compartimientos yeyunal e ¡leal por medio de bombeo del líquido dializado a través de membranas de fibra hueca con un corte del peso molecular de aproximadamente 5 000 Dalton.

Simulación de digestión de extractos de café Se disolvieron 4,5 g de NESCAFE PROTECT® (un co-extracto de granos de café tostado y verde) en 310 mi de regulador de acetato (20 mM, pH 6,5). Después de agregar 10 mi del residuo inicial (5 g de pepsina y 5 g de una solución de enzima de lipasa) la solución fue inyectada dentro del compartimiento gástrico de TIM. Durante la digestión, se recolectó un dializado total para 0-2, 2-4, y 4-6 h. Luego de 6 horas de experimento, los residuos de los compartimientos del estómago, duodeno, yeyuno e íleo fueron analizados para calcular el balance de masas de ácidos clorogénicos. Las muestras fueron pasadas a través de filtros de jeringa con un tamaño de poro de 0,45 pm ( illipore SLHA 025 BS) y analizadas por medio de HPLC como se describió en el Ejemplo 1 . Para el experimento con Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225), 310 mi de una solución reguladora de acetato (20 mM, pH 6.5) con un contenido total de 3,3 E9 cfu de una preparación secada por aspersión de L. johnsonii, fueron colocados en un compartimiento gástrico luego de la adición de 10 mi del residuo inicial. Después se inyectaron 10 mi del regulador de acetato con un contenido de 4,5 g de NESCAFE PROTECT® por medio de una jeringa dentro del compartimiento gástrico 15 minutos después del inicio de la estimulación de la digestión. Durante la digestión, el dializado total fue recolectado para 0-2, 2-4 y 4-6 horas después del paso a través de las membranas de fibra hueca semi-permeables conectadas a los compartimientos yeyuno e íleo. El suministro ileal total fue recolectado para 0-2; 2-4 y 4-6 horas. Se tomaron alícuotas (1 mi) del compartimiento gástrico directamente después de la adición de NESCAFE PROTECT® y en el punto de tiempo de 1 hora. Luego de 6 horas, los residuos del compartimiento del estómago, duodeno, yeyuno e íleo fueron analizados por medio de HPLC para calcular el balance de masa de ácido 5-cafeoilquínico. Se condujeron pruebas similares con NESCAFE COOL® (un extracto de café tostado con sustituto de crema para café y edulcorante) y con un filtro normal para preparar café tostado y café molido con un sustituto de crema para café agregado, y con ácido 5-cafeoilquínico (5-CQA) comercialmente disponible.

Resultados El porcentaje de ácido 5-cafeoilquínico (5-CQA) hidrolizado durante los experimentos con la adición de L. johnsonii se muestra en la Tabla 12. No se observó hidrólisis del ácido 5-cafeoilquínico (5-CQA) en los experimentos de control sin la adición de L. johnsonii.

Tabla 12. Hidrólisis de 5-CQA en extractos de café y 5-CQA puro como se determinó en el modelo TIM (% hidrolizado del 5-CQA total presente en las muestras).

Producto % de hidrólisis de 5-CQA 5-CQA 48 NESCAFE PROTECT® 34 NESCAFE COOL® 79 Café tostado y molido con crema para café preparado con filtro 53

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1 . Una bebida en polvo CARACTERIZADA porque comprende: a) un extracto de café secado; y b) un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar el ácido cafeoilquínico y diésteres para generar el ácido cafeico.

2. La bebida en polvo de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADA porque comprende un sustituto de crema para café.

3. La bebida en polvo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADA porque comprende un edulcorante.

4. La bebida en polvo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, CARACTERIZADA porque comprende proteína de leche y/o grasa de leche.

5. La bebida en polvo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADA porque el microorganismo capaz de hidrolizar el ácido cafeoilquínico y los diésteres para generar ácido cafeico es una bacteria de ácido láctico.

6. Un equipo para preparar una bebida, CARACTERIZADO porque comprende al menos dos partes: a) una primera parte que comprende un extracto de café; y b) una segunda parte que comprende un microorganismo y/o una enzima capaz de hidrolizar los ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos.

7. El equipo de acuerdo con la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque la primera parte comprende café soluble puro.

8. El equipo de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, CARACTERIZADO porque la segunda parte comprende proteína de leche y/o proteína vegetal.

9. El equipo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, CARACTERIZADO porque la segunda parte comprende un sustituto de crema para café y/o un edulcorante.

10. El equipo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, CARACTERIZADO porque el microorganismo capaz de hidrolizar los ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos es una bacteria de ácido láctico. 1 1. Uso de una bebida en polvo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un equipo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, para mejorar la capacidad antioxidante in vivo en un humano o animal que consume una bebida preparada de la misma.