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TW200938223A - Monoclonal antibody partner molecule conjugates directed to protein tyrosine kinase 7 (PTK7) - Google Patents

Monoclonal antibody partner molecule conjugates directed to protein tyrosine kinase 7 (PTK7) Download PDF

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TW200938223A
TW200938223A TW097145713A TW97145713A TW200938223A TW 200938223 A TW200938223 A TW 200938223A TW 097145713 A TW097145713 A TW 097145713A TW 97145713 A TW97145713 A TW 97145713A TW 200938223 A TW200938223 A TW 200938223A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
seq
group
human
cancer
Prior art date
Application number
TW097145713A
Other languages
English (en)
Inventor
Jonathan Alexander Terrett
Chetana Rao-Naik
Chin Pan
Original Assignee
Medarex Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medarex Inc filed Critical Medarex Inc
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Description

200938223 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於針對蛋白酪氨酸激酶7( PTK7 )的單選 殖抗體伴體分子共軛物。 【先前技術】 受體酪氨酸激酶（RTK)係可將細胞外環境的生物信 號傳遞至細胞內部的跨膜信號傳導蛋白。RTK信號的調 節對於調節細胞生長、分化，軸突生長，上皮生長、發 育、黏附、遷移和凋亡都很重要（Prenzel ei «/. (2001) Endocr. Relat· Cancer 8:11-31; Hubbard and Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-98 )。已知 RTK 參與多種形 式的癌症的發生和發展。在大多數的RTK相關癌症中都 存在受體蛋白擴增，而不係該基因的一突變（Kobus and Fleming (2005) 544:1464-70)。 蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)，受體蛋白酪氨酸激酶家族 的成員，它最初從正常人黑色素細胞中分離並通過RT-PCR 選殖得到（Lee ei «/·, (1993) (Oncogene 8:3403-10; Park d α/·，（1996) ·/_ 5/oc/iew 119:235-9)。該基因又獨立 地從人結腸癌來源的細胞系中選殖得到，並被命名爲結 腸癌激酶 4 ( CCK4 ) ( Mossie et al. ( 1 995) Oncogene 1 1:21 79-84 ) 。PTK7屬於缺乏可檢測的酪氨酸激酶催化 活性、但保留了信號傳導活性的RTK亞類，它被認爲可 能起到細胞黏附分子的作用。 -5- 200938223 PTK7的mRNA被發現在結腸癌來源的細胞系中不定 表現，但在成人結腸組織中未發現表現（Mossie " α/·， 見上文）。在某些黑色素瘤細胞系和黑色素瘤活檢組織 中也發現有 PTK7 表現（Easty，ei α/· (1 997) ·/·
Cancer 71:1061-5)。在肝癌和結腸癌細胞中還發現了其 另一剪接形式的表現（Jung a/. (2002) ⑴ocWw
JcM 1 5 79: 1 53-63 )。此外，還發現 PTK7 在急 性髓細胞性白血病樣本中高表現（Muller-Tidow Η α/·， (2004) C/z«· Cancer 及10:1241-9)。如 PCT 公開文本 WO04/1 7992中所述，借助免疫組織化學方法，在乳癌、 結腸癌、肺癌、胰臟癌、腎癌和膀胱癌中均觀察到PTK7 的腫瘤特異性染色。 因此，需要可識別PTK7的藥劑和使用該藥劑的方法 【發明內容】 © 本發明提供了分離的單選殖抗體，具體而言，係可結 合PTK7並表現出多種所需特性的人類單選殖抗體。上述 特性包括與人PTK7結合以及與Wilms’腫瘤細胞結合的高 親和性。還提供了使用本發明之抗體和組成物治療多種 PTK介導的疾病的方法。 一方面’本發明涉及一分離的單選殖抗體或其抗原結 合部分，其中所述抗體： (a)與人ρΤΚ7特異性結合，並且 -6- 200938223 (b)與Wilms’腫瘤細胞系（ATCC保藏號CRL-1441 )結合。 所述抗體優選地爲人類抗體，但在其他實施方案中， 所述抗體可以係鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。 在更優選的實施方案中，所述抗體以等於或小於4.0 nM的EC5q與Wilms’腫瘤細胞結合，或者以等於或小於 3.5 nM的EC5D與Wilms’腫瘤細胞結合。 在另一實施方案中，所述抗體與選自下列的癌症細胞系結 合：A-431 (ATCC 保藏號 CRL- 1 555)、Saos-2 (ATCC 保藏 號 HTB-85)、SKOV-3 (ATCC 保藏號 HTB-77)、PC3 (ATCC 保藏號 CRL- 1 435)、DMS 1 14 (ATC C 保藏號 CRL-2066)、ACHN (ATCC 保藏號 CRL-1611)、LNCaP (ATCC 保藏號 CRL- 1 740)、DU 145 (ATCC 保藏號 HTB-81)、 LoVo (ATCC 保藏號 CCL-229)和 MIA P a C a - 2 (AT C C 保藏 號CRL- 1 420)細胞系。 在另一實施方案中，本發明提供了一分離的單選殖抗 體或其抗原結合部分，其中所述抗體交叉競爭結合PTK7 上可被參考抗體識別的一抗原決定位，其中所述參考抗體 (a) 與人PTK7特異性結合，並且 (b) 與Wilms’腫瘤細胞系（ATCC保藏號CRL-1441 )結合。 在不同實施方案中，所述參考抗體包括： (a) —包括胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:1 的重鏈可變區 200938223 :和 (b ) —包括胺基酸序列SEQ ID NO:5的輕鏈可變區； 或者，所述參考抗體包括： (a) —包括胺基酸序列SEQ ID NOM 的重鏈可變區 ;和 (b) —包括胺基酸序列SEQIDNO:6的輕鏈可變區； 或者，所述標參考抗體包括： (a) —包括胺基酸序列 SEQ ID NO:2的重鏈可變區 ;和 (b) —包括胺基酸序列SEQ ID NO:7的輕鏈可變區； 或者，所述參考抗體包括： (a) —包括胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··3的重鏈可變區 :和 (b) —包括胺基酸序列SEQIDNO:8的輕鏈可變區； 或者，所述參考抗體包括： (Ο —包括胺基酸序列 SEQ ID NO:3 的重鏈可變區 •’和 (b )—包括胺基酸序列SEQ ID NO:9的輕鏈可變區； 或者，所述參考抗體包括： (〇 —包括胺基酸序列 SEQ ID NO:4 的重鏈可變區 :和 (b) —包括胺基酸序列SEQ ID NO:1〇的輕鏈可變區 〇 在一方面，本發明涉及一分離的單選殖抗體或其抗原 -8- 200938223 結合部分，包括作爲人VH 3-30_3基因產物或來自該基因 的一重鏈可變區，其中所述抗體與PTK7特異性結合。本 發明還提供一分離的單選殖抗體或其抗原結合部分，包括 作爲人VH DP44基因產物或來自該基因的一重鏈可變區， 其中所述抗體與PTK7特異性結合。本發明還提供一分離 的單選殖抗體或其抗原結合部分，包括作爲人VH 3-33基 因產物或來自該基因的一重鏈可變區，其中所述抗體與 Q PTK7特異性結合。本發明還提供一分離的單選殖抗體或 其抗原結合部分，包括作爲人Vk L15基因產物或來自該 基因的一輕鏈可變區，其中所述抗體與PTK7特異性結合 。本發明還提供一分離的單選殖抗體或其抗原結合部分， 包括作爲人Vk A10基因產物或來自該基因的一輕鏈可變 區’其中所述抗體與PTK7特異性結合。本發明還提供一 分離的單選殖抗體或其抗原結合部分，包括作爲人Vk A2 7 基因產物或來自該基因的一輕鏈可變區，其中所述抗體與 Q PTK7特異性結合。本發明還提供一分離的單選殖抗體或 其抗原結合部分，包括作爲人Vk L6基因產物或來自該基 因的一輕鏈可變區，其中所述抗體與PTK7特異性結合。 一優選的組合包括： (a) —包括SEQ IDNO:ll的重鏈可變區CDR1 ; (b) —包括SEQIDN〇:15的重鏈可變區CDR2; (c) —包括SEQIDNO:19的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQ ID N〇:23的輕鏈可變區CDR1 ; (e) —包括SEQIDN〇:29的輕鏈可變區CDR2;和 200938223 (f)—包括SEQIDNO:35的輕鏈可變區CDR3。 另一優選的組合包括： (a) —包括SEQ IDNO:ll的重鏈可變區CDR1 ; (b) —包括SEQIDNO:15的重鏈可變區CDR2; (c) —包括SEQIDNO:19的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQID NO:24的輕鏈可變區CDR1; (e) —包括SEQIDNO:30的輕鏈可變區CDR2;和 (f) 一包括SEQIDNO:36的輕鏈可變區CDR3。 另一優選的組合包括： (a) —包括SEQIDNO:12的重鏈可變區CDR1; (b) —包括SEQIDNO:16的重鏈可變區CDR2; (c) 一包括SEQIDNO:20的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQIDNO:25的輕鏈可變區CDR1; (e) —包括SEQIDNO:31的輕鏈可變區CDR2;和 (f) 一包括SEQIDNO:37的輕鏈可變區CDR3。 另一優選的組合包括： (a) —包括SEQIDNO:13的重鏈可變區CDR1; (b) —包括SEQIDNO:17的重鏈可變區CDR2; (c) 一包括SEQIDNO:21的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQIDNO:26的輕鏈可變區CDR1; (e) —包括SEQIDNO:32的輕鏈可變區CDR2;和 (f) 一包括SEQIDNO:38的輕鏈可變區CDR3。 另一優選的組合包括： (a) —包括SEQ ID NO:13的重鏈可變區CDR1 ; -10- 200938223 (b) —包括SEQIDNO:17的重鏈可變區CDR2; (c )—包括SEQIDNO:21的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQ ID NO:27的輕鏈可變區CDR1 ; (e) —包括SEQIDNO:33的輕鏈可變區CDR2;和 (〇 —包括SEQIDNO:39的輕鏈可變區CDR3。 另一優選的組合包括： (a) —包括SEQIDNO:14的重鏈可變區CDR1; ◎ (b)—包括SEQIDNO:18的重鏈可變區CDR2; (c) —包括SEQIDNO:22的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQIDNO:28的輕鏈可變區CDR1; (e) —包括SEQIDNO:34的輕鏈可變區CDR2;和 (f) 一包括SEQIDNO:40的輕鏈可變區CDR3。 #發明的其他優選抗體或其抗原結合部分包括： (a) —包括胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:1的重鏈可變區； 和 〇 (b)—包括胺基酸序列SEQIDNO:5的輕鏈可變區。 另一優選的組合包括： (a ) —包括胺基酸序列SEQ ID NO: 1的重鏈可變區； 和 (b )—包括胺基酸序列SEQ ID N0:6的輕鏈可變區。 另一優選的組合包括： (a) —包括胺基酸序列SEQ ID N0:2的重鏈可變區； 和 (b )—包括胺基酸序列SEQ IDNO:7的輕鏈可變區。 -11 - 200938223 另一優選的組合包括： (Ο —包括胺基酸序列SEQ ID NO:3的重鏈可變區； 和 (b) —包括胺基酸序列SEQIDNO:8的輕鏈可變區。 另一優選的組合包括： (a) —包括胺基酸序列SEQ ID NO:3的重鏈可變區； 和 (b) —包括胺基酸序列SEQIDNO:9的輕鏈可變區。 另一優選的組合包括： (a) —包括胺基酸序列SEQ ID NO:4的重鏈可變區； 和 (b ) —包括胺基酸序列SEQ ID NO:10的輕鏈可變區 〇 本發明之抗體可以係例如全長抗體（例如IgG 1或 IgG4同種型）。作爲替代，所述抗體也可以係例如Fab 或Fab’2片段的抗體片段，或單鏈抗體。 本發明還提供一抗體-伴體分子（partner molecule)共 軛物（conjugate)，所述共轭物包含與一治療劑（例如細胞 毒素或放射性同位素）相連的本發明抗體或其抗原結合部 分。在特別優選的實施方案中，本發明提供一抗體-伴體 分子共軛物，所述共軛物包含（例如藉由锍鍵）與化合物 N (圖28)相連的本文所披露的抗體或其抗原結合部分。 例如’在各個實施方案中，本發明提供以下優選的抗體-伴體分子共軛物： -12- 200938223 (i)包含一抗體或其抗原結合部分的一抗體-伴體分子 共軛物，所述抗體或其抗原結合部分包括一含胺基酸 序列SEQ ID NO:4的重鏈可變區和一含胺基酸序列 SEQ ID NO:10的輕鏈可變區，其中所述抗體或抗原結 合部分與化合物N (圖28)相連，該化合物在美國專 利申請No. 60/882,46 1中有詳細論述’該申請藉由引 用的方式全文納入本文； (Π)包含如下一與化合物N (圖28)相連的抗體或 其抗原結合部分的抗體-伴體分子共軛物，所述抗體或 其抗原結合部分包括： (a) —包括SEQIDNO:14的重鏈可變區CDR1; (b) —包括SEQIDNO:18的重鏈可變區CDR2; (c) 一包括SEQIDNO:22的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQIDNO:28的輕鏈可變區CDR1; (e) —包括SEQIDNO:34的輕鏈可變區CDR2;和 (f) —包括SEQIDNO:40的輕鏈可變區CDR3; 在一具體的實施方案中，所述抗體-伴體分子共軛物 的所述抗體或其抗原結合部分具有包括以下序列分別所示 的胺基酸序列的重鏈和輕鏈可變區：SEQ ID NO :4和10、 SEQ ID N0:1 和 5、SEQ ID N0:1 和 6、SEQ ID N0:2 和 7 、SEQ ID N0:3 和 8 或 SEQ ID NO:3 和 9。 本發明還提供這樣的抗體-伴體分子共軛物，其中所 述抗體可結合與被本發明的任何抗體結合的抗原決定位相 同或與其重疊的抗原決定位。例如，在一實施方案中，所 -13- 200938223 述抗體-伴體分子共軛物的所述抗體或其抗原結合部分可 結合由參考抗體（例如交叉競爭）識別的ρτκ-7上的抗原 決定位，所述參考抗體具有以下序列分別所示的胺基酸序 列：SEQ ID ΝΟ:4 和 1〇、SEQ ID ΝΟ:1 和 5、SEQ ID ΝΟ:1 和 6、SEQ ID NO:2 和 7、SEQ ID NO:3 和 8 或 SEQ ID NO :3 和 9。 本發明之抗體-伴體分子共軛物可藉由例如本申請通 篇所描述的以及本領域已知的多種連接子（linker )相連 。在一實施方案中，所述伴體分子藉由一化學連接子（即 ，一個巯基連接子、肽基連接子、肼連接子或二硫化物連 接子）與抗體共軛。 另一方面，本發明提供了編碼本發明的前述抗體-伴 體分子共軛物的所述抗體（或其抗原結合部分）的分離的 核酸，以及表現載體和宿主細胞。 如本申請通篇所述，本發明之抗體-伴體分子共軛物 可用於許多種診斷和治療應用。例如，可將有效量的本發 明之抗體-伴體分子共軛物給予受試者以治療或預防一種 疾病（例如一種癌症），所述疾病以表現PTK7的腫瘤細 胞生長爲特徵。可治療或預防的癌症包括但不限於：結腸 癌、肺癌、乳癌、胰臟癌、黑色素瘤、急性髓樣白血病、 腎癌、膀胱癌、卵巢癌和攝護腺癌。 本發明還提供包括本發明的一抗體或其抗原結合部分 不部 有能 具功 與二 分第 部的 合性 結異 原特 抗合 其結 或的 體分 抗部 述合 所結 ’ 原 子抗 分其 性或 異體 特抗 雙該 一 於 的同 -14- 200938223 分相連。 還提供了含有本發明的一抗體或其抗原結合部分或免 疫共軛物或雙特異性分子以及藥學可接受的載體的組成物 〇 本披露還提供了以高親和性（affinity )與PTK7特異 性結合的分離的抗PTK7抗體-伴體分子共軛物，特別係包 含人單選殖抗體的那些共轭物。這類抗體-伴體分子共軛 φ 物中的某些共軛物能被內化至表現PTK7的細胞中，並且 能介導抗原依賴性細胞毒性。本披露還提供了使用本文公 開的抗PTK7抗體-伴體分子共軛物治療癌症的方法，所述 癌症例如有間皮瘤、直腸癌、肺癌、乳癌、胰臟癌、黑色 素瘤、急性髓樣白血病、腎癌、膀胱癌、卵巢癌和攝護腺 癌。 還提供了含有本文公開的與伴體分子共軛的一抗體或 其抗原結合部分的組成物。在本披露的抗體伴體分子共軛 φ 物中，可與抗體有利共軛的伴體分子包括但不限於，藥物 分子、毒素、標記分子（例如放射性同位素）、蛋白質和 治療劑。本文還公開了含有抗體-伴體分子共軛物和藥學 可接受的載體的組成物。 在一方面，這類抗體-伴體分子共軛物藉由化學連接 子共軛。在某些實施方案中，所述連接子爲一肽基連接子 ’它在本文中以（L4)p — F —（L’m表示。其他連接子包括肼 和二硫化物連接子，它們在本文中分別以（L4)p —H —(L^m 或（L4)p —J —(L^m表示。除與伴體分子連接的連接子外， -15- 200938223 本發明還提供了適於與基本上任何分子種類連接的可裂解 連接臂。 本發明還包括編碼本發明之抗體或其抗原結合部分的 核酸分子，以及含有該核酸的表現載體和含有該表現載體 的宿主。此外，本發明還提供了一含人類免疫球蛋白重鏈 和輕鏈轉基因的轉基因小鼠，其中所述小鼠表現本發明的 一抗體，以及由該小鼠製備的雜交瘤，其中所述雜交瘤可 產生本發明之抗體。 在另一方面，本發明提供了一治療或預防以表現 PTK7的腫瘤細胞生長爲特徵的疾病的方法，包括將有效 量的本發明抗體或其抗原結合部分給予受試者以治療或預 防該疾病。所述疾病可以係例如癌症，例如結腸癌（包括 小腸癌）、肺癌、乳癌、胰臟癌、黑色素瘤（例如轉移性 惡性黑色素瘤）、急性髓樣白血病、腎癌、膀胱癌、卵巢 癌和攝護腺癌。 在一優選的實施方案中，本發明提供一使用抗PTK7 抗體體內治療癌症的方法。所述抗PTK7抗體可以係鼠類 抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。可使用本發明 的方法治療的其他癌症的實例包括腎臟癌症（例如腎細胞 癌）、成膠質細胞瘤、腦瘤、慢性或急性白血病（包括急 性淋巴細胞性白血病（ALL )、成人T細胞白血病（Τ'-all ) 、慢性髓樣白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢 性淋巴細胞性白血病）、淋巴瘤（例如’何傑金氏（ Hodgkin )和非何傑金氏淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、原 200938223 發性CNS淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、伯基特（Burkitt )淋巴 瘤、間變性大細胞淋巴瘤 （anaplastic large-cell lymphomas » ALCL)、皮膚T淋巴細胞瘤、結節狀小分裂 細胞淋巴瘤（nodular small cleaved-cell lymphomas)、周 圍T細胞淋巴瘤、倫南德氏淋巴瘤（Lennert's lymphomas )、免疫母細胞性淋巴結瘤、T細胞白血病/淋巴瘤（ ATLL )、中心母細胞性/中心細胞性濾泡性淋巴瘤（ entroblastic/centrocytic (cb/cc) follicular lymphomas cancers) 、B譜系彌散性大細胞淋巴瘤（diffuse large cell lymphomas of B lineage)、血管免疫母細胞性淋巴結病（ AILD)樣T細胞淋巴瘤和HIV相關的基於體腔的淋巴瘤 )、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌（例如施明克氏（ Schmincke)瘤）、卡斯爾曼氏（Castleman)病、卡波濟 氏（Kaposi )肉瘤、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏（ Waldenstrom)巨球蛋白血症和其他 B細胞淋巴瘤、鼻咽 φ 癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、 子宮癌、直腸癌、肛區癌症、胃癌、睪九癌、子宮癌、輸 卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰門癌、食道癌 、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎 上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體瘤、膀 胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS)腫 瘤、腫瘤血管發生、脊椎腫瘤（spinal axis tumor )、腦 幹膠質瘤、垂體腺瘤、表皮樣癌症、鱗狀上皮細胞癌、包 括那些由石棉誘導的環境誘導性癌症（例如間皮瘤），以 -17- 200938223 及所述癌症的組合。 本發明的其他特徵和優點將從下文的詳細敘述和實例 中顯而易見，這些詳細敘述和實例不應解釋爲係對本發明 的限制。本申請通篇引用的所有的文獻、Genbank登記號 、專利和公開的專利申請均藉由引用的方式明確地納入本 文。 【實施方式】 在一方面，本發明涉及一分離的特異性結合PTK7的 單選殖抗體，特別係人類單選殖抗體。在某些實施方案中 ，本發明之抗體具有一或多種所需的功能屬性，例如以高 親和力結合PTK7和/或能夠在體內或體外抑制腫瘤細胞的 生長。在某些實施方案中，本發明之抗體來源於特定的重 鏈和輕鏈種系序列和/或包含特定的結構特徵，例如含有 特定胺基酸序列的CDR區域。本發明提供了分離的抗體 、製備這類抗體的方法、免疫共軛物、包括這類抗體的雙 特異性分子和包括本發明之抗體、免疫共軛物或雙特異性 分子的藥物組成物。本發明還涉及使用所述抗體來例如治 療疾病例如癌症的方法。 爲了可以更容易理解本發明，首先對一些術語進行定 義。其他定義則在整個詳細說明中闡明。 術語“PTK7”和“CCK4”在本文中可以互換使用，其含 義包括人類PTK7的變體、同種型和物種同系物。因此， 本發明的人抗體在一些情況下可以與來自人之外的其他物 -18- 200938223 種的PTK7產生交叉反應。在某些實施方案中，這些抗體 可以對一或更多的人PTK7具有完全特異性，並且可能不 顯示非人類交叉反應性的物種或其他類型。一示例性的人 類PTK7的全長胺基酸序列爲Genbank編號爲NM_002821 的胺基酸序列（SEQIDNO:58)。 術語“免疫應答”指的是諸如淋巴細胞、抗原遞呈細胞 、吞噬細胞、粒細胞和由以上細胞或肝臟製造的可溶性大 分子（包括抗體、細胞因數和補體）的作用，該作用可導致 侵入性病原體、被病原體感染的細胞或組織、癌細胞，或 者（在自身免疫炎症和病理炎症情況下）正常的人細胞或 組織的選擇性損害、破壞或從人體清除。 “信號轉導途徑”指的是各種負責將信號從細胞的一部 分傳遞到細胞的另一部分的信號轉導分子之間的生物化學 關係。在本文中所使用的術語“細胞表面受體”包括例如能 夠接受信號並將該信號傳遞藉由細胞的原生質膜的分子和 分子的複合物。本發明中“細胞表面受體”的一實例就係 PTK7受體。 在本文中使用的術語“抗體”包括完整的抗體及其任何 抗原結合片段（即“抗原結合部分”）或其單鏈。“抗體”指的 是一包括至少兩條重鏈（H鏈）和兩條輕鏈（L鏈）的糖蛋白或 其抗原結合部分，其中兩條重鏈和兩條輕鏈之間以二硫鍵 相連接。每一條重鏈都包括一重鏈可變區（在本文中縮寫 爲VH)和一重鏈恆定區。該重鏈恆定區包括三個功能域（ domain) CH1、CH2和CH3。每一條輕鏈都包括一輕鏈可 -19- 200938223 變區（在本文中縮寫爲VL)和一輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區 包含一功能域，CL.VH和VL區域還可再細分爲具有高可 變性的多個區’被稱爲互補決定區（CDR)，其間散佈有更 爲保守的被稱爲框架結構區（FR)的多個區域。每個VH和 VL均由三個CDR和四個FR構成，按照以下順序從氨基 端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 、FR4 °重鏈和輕鏈的這些可變區包含與抗原相互作用的 結合功能域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主的組 織或因數結合，包括免疫系統的各種細胞（如效應細胞）和 經典補體系統的第一成分（Clq)。 本文中所使用的術語抗體的“抗原結合部分”（或簡稱 爲“抗體部分”）指的是保留了與一抗原（例如PTK7)的特異 性結合能力的抗體的一或多個片段。已經證實一抗體的抗 原結合功能可以由全長抗體的多個片段來實現。術語抗體 的“抗原結合部分”所涵蓋的結合片段的實例包括：（i) Fab 片段’即由 VL、VH、CL和CH1功能域構成的單價片段 ;(ii) F(ab’）2片段，即包括由一個二硫橋在鉸鏈區連接的 兩個Fab片段的二價片段；（iii) Fab’片段：它實質上係帶 有一部分鉸鏈區的一 Fab片段（參見 FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1 993 ) ； (iv)由 VH 和 CH1功能域構成的Fd片段；（v)由抗體的一單臂的Vl和 VH功能域構成的Fv片段；（vi)由VH功能域構成的dAb片 段（Ward et al·，（1989) Nature 341 : 544-546) ; (vii)分離 的互補決定區（CDR);和（viii)納米抗體（nanobody):爲含有 200938223 一可變區和兩個恆定區的一重鏈可變區。此外，雖然Fv 片段的兩個功能域Vl和VH係由分離的基因編碼的，但係 可以使用重組方法藉由一合成連接子將它們連接起來，使 它們形成一單蛋白鏈，其中VL和VH區域配對形成單價分 子（被稱爲單鏈 Fv(scFv);參見例如 Bird ei «/. ( 1 988) Science 242:423-426 和 Huston e t al. (1 9 8 8) Proc. Natl.
Acad. Scz·. C/SJ 85:5 879-5 883)。術語抗體的“抗原結合部 u 分”也意在涵蓋這類單鏈抗體。這些抗體可藉由本領域技 術人員已知的常規方法獲得，並且可以篩選這些片段從而 能夠以與完整抗體相同的方式應用它們。 本文中使用的術語“分離的抗體”意指一抗體，它基本 上沒有其他的具有不同抗原特異性的抗體（例如，特異性 結合PTK7的分離的抗體基本上沒有特異性結合PTK7之 外的其他抗原的抗體）。然而，特異性結合PTK7的分離的 抗體對於其他抗原，例如來自其他物種的PTK7分子可具 Q 有交叉反應性。此外，分離的抗體可基本上沒有其他細胞 材料和/或化學物。 本文中所使用的術語“單選殖抗體”或“單選殖抗體組 成物”指的是由單一分子組分的抗體分子形成的製劑。單 選殖抗體組成物對於某一特定抗原決定位具有單一的結合 特異性和親和力。 本文中所使用的術語“人類抗體”意在包括這樣一類抗 體：它的可變區中的框架結構區和CDR區均來自人類種 系免疫球蛋白序列。此外，如果該抗體包含一恆定區，則 -21 - 200938223 該恆定區也來自人類種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗 體包含由非人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（ 例如，由體外隨機誘變或定點誘變引入的突變或藉由體內 體細胞突變引入的突變）。然而，此處使用的術語“人類 抗體”並非旨在包括以下抗體：其中來自另一哺乳動物物 種（如小鼠）的種系的CDR序列被移植到人框架結構區序列 上。 術語“人類單選殖抗體”係指顯示出單一結合特異性 的抗體，該抗體具有的可變區中的框架結構區和CDR區 均來自人類種系免疫球蛋白序列，並且具有單一的結合特 異性。在一實施方案中，該人單選殖抗體由雜交瘤細胞產 生，所述雜交瘤細胞包括由轉基因非人動物（例如一轉基 因小鼠，它具有的基因組包含融合到永生化細胞的人重鏈 轉基因和輕鏈轉基因）得到的B細胞。 本文中所使用的術語“重組人類抗體”包括藉由重組方 法製備、表現、產生或分離的所有人類抗體，例如：（a)從 含有人類免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體動物（例如 小鼠）中分離的抗體或從上述轉基因動物製備的雜交瘤細 胞中分離的抗體（下文將進一步說明）；（b)從被轉染而能表 現人類抗體的宿主細胞（例如轉染瘤）分離的抗體；（c)從重 組的組合人類抗體文庫分離的抗體；以及（d)藉由任何將人 類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的其他方法 製備、表現、產生或分離的抗體。這類重組人類抗體的可 變區中的框架區和CDR區均來源於人類種系免疫球蛋白 200938223 序列。然而，在某些實施方案中，這類重組人類抗體也可 能經過體外誘變（或者當使用含有人類Ig序列的轉基因動 物時爲體內體誘變），這樣一來，所述重組抗體的VH和 VL區域的胺基酸序列雖然係來源於人類種系VH和Vl序 列並與人類種系VH和序列相關，但係並不天然存在於 體內人類抗體種系表現譜之中。 此處使用的“同種型”係指由重鏈恆定區基因編碼的抗 體種類（例如IgM或IgGl)。 短語“識別一抗原的一抗體”和“對一抗原具有特異性 的一抗體”此處可以與術語“特異性結合一抗原的一抗體” 互換使用。 術語“人類抗體衍生物”指的是人類抗體的任何經修飾 的形式，例如，所述抗體與另一試劑或抗體的共軛物。 術語“人源化抗體”係要指以下抗體，其中來自另一 哺乳動物物種（如小鼠）的種系的CDR序列被移植到人框架 結構區序列上。可以在人框架結構區序列中進行額外的框 架結構區修飾。 術語“嵌合抗體”係要指以下抗體，其中的可變區序 列來自一物種而恆定區序列來自另一物種，例如一抗體中 的可變區序列來自小鼠抗體而恆定區序列來自人抗體。 術語“抗體模擬物”係要指能夠模擬抗體與抗原結合 的能力的分子，然而它們並不限於天然抗體結構。此類抗 體類比物的實例包括但不限於 Affibodies、DARPins、 Anticalins、Avimers、和 Versabodies，所有這些抗體模擬 -23- 200938223 物在模擬常規抗體結合時均採用的結合結構都產生於不同 的作用機理並藉由這些機理起作用。 本文中所使用的術語“伴體分子”係指在抗體-伴體 分子共軛物中與抗體共轭的實體。伴體分子的實例包括藥 物、細胞毒素、標記分子（包括但不限於肽和小分子標記 物如螢光染料標記物，以及單原子標記物如放射性同位素 )、蛋白質和治療劑。 此處使用的“特異性結合人PTK7 ”的抗體係要指一 抗體，它以1 xl〇_7或更小，更優選爲5xl0_8 Μ或更小， 更優選爲1χ1χ1〇_8 Μ或更小，甚至更優選爲5χ10·9 μ或 更小的KD結合到人ΡΤΚ7上。 本文中所使用的術語“基本上不結合”到蛋白質或細胞 上係指抗體不與所述蛋白質或細胞結合，或者不以高親和 性結合到蛋白質或細胞上，也就係，以1 X 1 〇 ·6 Μ或更大 ’更優選爲1χ1(Γ5 Μ或更大’更優選爲ΐχ1〇·4 Μ或更大 ’更優選爲1 X 1(Γ3 Μ或更大，甚至更優選爲1 χ1〇-2 Μ或 更大的Kd結合到蛋白質或細胞上。 此處使用的術語“Kass。。”或“Ka,”意指一特定的抗體-抗 原相互作用的聯合率，而此處使用的術語“Kdis，，或“Kd，” 意指一特定的抗體-抗原相互作用的解離速率。此處使用 的術語“KD，”意指解離常數，它係由Kd與Ka之比（即 Kd/Ka)得到，並被表示爲摩爾濃度（M)。抗體的KD値可使 用本領域的已良好確認的方法測定。測定抗體的KD的優 選方法係使用表面等離子體共振，優選使用一生物感測器 -24- 200938223 系統，如Biacore®系統。 本文中所使用的術語IgG抗體的“高親和性”係指抗體 對於靶抗原具有的KD爲10_8 Μ或更小，更優選爲10·9 Μ或更小，甚至更優選爲1(Γ1() Μ或更小。然而，“高親和 性”結合對於其他的抗體同種型可以發生變化。例如，對 於一 IgM同種型的“高親和性”結合係指抗體具有的的Kd 爲1(Γ7 Μ或更小，更優選爲10_8 Μ或更小，甚至更優選 U 爲1(Γ9 Μ或更小。 此處使用的術語“受試者”包括任何人或非人動物。術 語“非人動物”包括所有脊椎動物，如哺乳動物和非哺乳動 物’例如非人靈長類、綿羊、犬類、貓類、馬類、母牛類 、家禽類、兩棲類、爬蟲類、等等。 符號在用作表示一個鍵或表示爲與一個鍵垂直時 ’都標示出了所顯示的部分與分子的其他部分或固體載體 等相連接的點的位置。 φ 除非另作說明，術語“烷基”就其自身或作爲另一取代 基的一部分，係指具有指定的碳原子數（|卩Ci-CM係指一 至十個碳原子）的直鏈或支鏈，或環烴基團，或者係其組 合’它可以係完全飽和的、單不飽和的或多不飽和的，並 且可以包括二價和多價基團。飽和烴基基團的實例包括但 不限於以下基團，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正 丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基' 環己基、（環己基）甲基 、環丙基甲基、以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛 基等的同系物或異構體。不飽和烷基係具有一或多個二鍵 -25- 200938223 或三鍵的基團。不飽和烷基的實例包括但不限於乙烯基、 2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-( 丁二烯基）、2,4_戊二 烯基、3-(1,4-戊二烯基）、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔 基，以及高級同系物和異構體。除非另作說明，術語“烷 基”還應包括將在下面更詳細定義的烷基的衍生物，如“雜 烷基”。限於烴基的烷基被稱爲“同烷基（homoalkyl)”。 術語“亞烷基”就其自身或與作爲另一取代基的一部分 時，都表示由一烷衍生的二價基團，例如但不限於-CH2CH2CH2CH2-，並且還包括作爲“雜亞烴基’’如下說明的 那些基團。通常烷基（或亞烷基）基團應含有1至24個碳原 子，但本發明中優選的基團應含有10個或更少的碳原子 。“低級烷基”或“低級亞烷基”爲一鏈較短的烷基或亞烷基 ，通常含有8個或更少的碳原子。 除非另作說明，術語“雜烷基”就其自身或結合另一術 語時指的是穩定的直鏈或支鏈，或環烴基團，或者係其組 合，由一定數目的碳原子和選自由〇、N、Si和S組成的 組的至少一個雜原子構成，其中，氮原子、碳原子和硫原 子可以任選被氧化，並且氮雜原子可以任選被季銨化。一 或多個雜原子〇、N、S和Si可位於雜烷基內部的任何位 置，也可以位於烷基與分子的其餘部分連接的位置。其實 例包括但不限於-ch2-ch2-o-ch3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-s( = o)-ch3 、-ch2-ch2-s( = o)2-ch3、-ch = ch-o-ch3、-
Si(CH3)3、-CH2-CH = N-OCH3 和-CH = CH-N(CH3)-CH3。可 200938223 以連續有多達兩個雜原子，例如-CH2-NH-〇CH3和-CHrO-Si(CH3)3。類似地，術語“雜亞烴基”就其自身或作爲另一 取代基的一部分係指由雜烷基衍生的一個二價基團’如 以-ch2-ch2-s-ch2-ch2-和-ch2-s-ch2-ch2-nh-ch2-爲 例但並不限於此。對於雜亞烷基，雜原子可佔據鏈末端的 任一端或兩端（例如，亞烷氧基、亞烷二氧基、亞烷基氨 基和亞烷基二氨基等）。術語“雜烷基”和“雜亞烴基”包括聚 0 (乙二醇）及其衍生物（例如，參見 Shearwater Polymers
Catalog, 2 00 1 )。進而，對於亞烴基和雜亞烴基連接基團， 書寫連接基團的分子式的方向並不表示連接基團的方向， 例如，結構式-C(0)2R’-可以代表-C(0)2R’-或-R’c(0)2-。 與術語“烷基”或“雜烷基”與術語“低級”相結合指的是 一具有1-6個碳原子的部分。 術語“烷氧基”、“烷基氨基”、“烷基磺醯基，，和“烷硫基 ”（或硫代烷氧基）此處使用它們的常用含義，並且指的是那 Q 些與分子的殘餘部分分別藉由氧原子、氨基、S〇2基團或 硫原子連接的院基。術語“芳基磺醯基”指的是與分子的其 餘部分藉由S〇2基團連接的芳基，術語“锍基，，指的是SH 基團。 通常，“醯基取代基”也係選自上述的基團。本文中所 使用的術語“醯基取代基”係指與羰基碳連接並滿足其原 子價的基團’羰基碳與本發明的化合物的多環核直接或間 接相連。 除非另作說明’術語“環垸基”和“雜環院基，，就其自身 -27- 200938223 或結合其他術語時分別指的是被取代的或未被取代的“烷 基”的環形變體以及被取代的或未被取代的“雜烷基”的環 形變體。另外，對於雜環烷基，雜原子可佔據雜環與分子 殘餘部分連接處的位置。環烷基的實例包括但不限於環戊 基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基、等等。 雜環烷基的實例包括但不限於1-(1，2,5,6-四氫吡啶基）、1-呱啶基、2-呱啶基、3-呱啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四 氫呋喃-2 -基、四氫呋喃-3 -基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-呱嗪基、2-呱嗪基、等等。環結構的雜原子和碳 原子可以任選被氧化。 除非另外指明，術語“鹵”或“鹵素”就其自身或作爲另 一取代基的一部分係指氟、氯、溴或碘原子。另外，術語 諸如“鹵代烷基”係要包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例如 ’術語“鹵代（Ci-CJ烷基”係要包括但不限於三氟甲基、 2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基、等等。 除非另作說明，術語“芳基”係指被取代的或未被取代 的多不飽和芳烴取代基，它可爲單環或爲稠合在一起或共 價連接在一起的多環（優選1-3個環）。術語“雜芳基，，係指 包含一至四個選自N、0和S的雜原子的芳基（或環），其 中’氮原子、碳原子和硫原子可以任選被氧化，並且氮原 子可以任選被季銨化。雜芳基可藉由雜原子與分子的殘餘 部分連接。芳基和雜芳基的非限制性實例包括苯基、丨_萘 基、2 -萘基、4 -聯苯基、1-啦略基、2 -啦咯基、3 -啦略基 、3·吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2_噁唑基、 -28- 200938223 4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5_噁唑基、3_異噁唑基、4_ 異嚼嗤基、5 -異嚼嗤基、2 -唾哩基、4 -噻哩基、5_唾哗基 、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3_噻吩基、2_批啶基 、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4_嘧啶基、5_苯並噻 唑基、嘌呤基（purinyl)、2-苯並咪唑基、5_嘲哄基、^異 喹啉基、5-異唾啉基、2-喹喔啉基、5_喹喔啉基、3_喹琳 基和6 -喹啉基。以上提到的每一芳基和雜芳基環體系的取 0 代基選自下述的可接受的取代基的組。“芳基，，和“雜芳基” 也包括以下環體系·其中一或多個非芳香環體系與芳基或 雜芳基體系稠合或另外結合。 簡而言之’術語“芳基”在結合其他術語（例如芳氧基 、芳基硫氧基、芳基烷基）使用時包括如上所述的芳基和 雜芳基環。因此，術語“芳基烷基，，包括芳基與烷基連接的 基團（如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等），所述烷基包括碳 原子（如亞甲基）已經被例如氧原子取代的那些烷基（如苯氧 〇 基甲基、2_吡啶氧基甲基和3-(1-萘氧基）丙基等）。 以上每一個術語（如“烷基，，、“雜烷基，’、“芳基，，和‘‘雜 芳基”）都包括所指明的基團被取代和未被取代的形式。以 下提供每一類型基團的優選取代基。 用於院基和雜烷基的取代基（包括常稱爲亞烴基、烯 基、雜亞烴基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯 基和雜環烯基的那些基團）通常分別稱爲“烷基取代基，，和“ 雜院基取代基，’’它們可以係多種基團中的一或多個，這 些基團選自但不限於：_〇R，、=〇、=NR，、=N-OR，、- -29- 200938223 NR，R”、-SR，、-鹵素、-SiR，R，，R”，、-0C(0)R,、-C(0)R， 、-C02R，、-C0NR，R，’、-0C(0)NR，R，’、-NR’，C(0)R，、-NR，-C(0)NR”R” ， 、 -NR’，C(0)2R， 、 _NR- C(NR’R，’R，，，）= NR，，，，、_NR-C(NR，R’，）= NR，，，、-S(〇)R，、_ S(0)2R，、-S(0)2NR，R”、-NRS02R，、-CN 和-N02 取代基數 目的範圍從o到（2m’+ 1)，其中m’係該基團中的碳原子的 總數。R’、R”、R”’和R”’’各自優選獨立地表示氫、被取 代的或未被取代的的雜烷基、被取代的或未被取代的的芳 基如被1-3個鹵素取代的芳基、被取代的或未被取代的烷 基、烷氧基或硫代烷氧基、或者芳基烷基。當本發明的化 合物包含多於一 R基團時，例如，這些R基團的每一個均 獨立地選擇，R，、R”、R”’和R”’’基團中的每一個也係同 樣（當這些基團存在一個以上時）。當R’和R’’與同一氮原 子相連時，它們可以與氮原子結合以形成5、6或7元環 。例如，-NR’R”包括但不限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。 從以上對取代基的討論，本領域的技術人員可以理解術語 “烷基”包括含有與氫基團之外的基團連接的碳原子的基團 ，例如鹵代烷基（如-CF3和-CH2CF3)和醯基（如-C( = 0)CH3 、-C( = 0)CF3、-C( = 〇)CH2〇CH3 等）。 類似於對烷基基團說明的取代基，芳基取代基和雜芳 基取代基通常分別被稱爲“芳基取代基”和“雜芳基取代基” ，它們變化並選自，例如：鹵原子、-OR’、=〇、=NR，、 = N-〇R，、-NR，R”、-SR，、-画素、-SiR，R，’R’，，、-0C(0)R， 、-C(0)R，、 -C02R，、 -CONR，R” 、 -0C(0)NR，R” 、- -30- 200938223 NR，，C(0)R，、-NR，-C(0)NR’，R’，，、-NR，’C(0)2R’、-NR-C(NR，R”）= NR，”、-S(0)R，、-S(0)2R’、-S(0)2NR，R”、-NRSO2R，、_CN 和-N02、-R’、-N3、-CH(ph)2、氟（C1-C4)- 烷氧基、和氟（C^-CU)烷基，數目的範圍從0至該芳環體系 上開放價數的總數；R’、R”、R”’和R”’’優選獨立地選自 氫、烷基和雜烷基、未被取代的芳基和雜芳基、（ 未被取代的芳基）-(<^-<:4)烷基、和（未被取代的芳基）氧-(Ci-CU)烷基。當本發明的化合物包含多於一 R’、R”、R”’ 或R”’’基團時，其中每一個該基團可以獨立於其他基團變 化。 在芳基或雜芳基環上的兩個相鄰原子上的兩個芳基取 代基可以任選地被結構式爲-T-C(0)-(CRR’）q-U-的取代基 所代替，其中τ和U分別獨立地爲-NR-、-0-、-CRR’-或 一單鍵，q爲一 0至3之間的整數。或者，在芳基或雜芳 基環上的相鄰原子上的兩個芳基取代基可以任選地被結構 式爲-A-(CH2)r-B-的取代基所代替，其中A和B分別獨立 地爲-CRR，-、-〇-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(0)2-、_ S(〇hNR’-或一單鍵，r爲一 1至4之間的整數。這樣形成 的新環上的一個單鍵可以任選地被一個雙鍵所代替。或者 ’在芳基或雜芳基環上的相鄰原子上的兩個芳基取代基可 以任選地被結構式爲-(^^，:^-…^’”:^-的取代基所代 替，其中s和d分別獨立地爲0至3之間的整數，並且χ 爲-0-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(0)2-或-S(0)2NR，-。所述 取代基R，R，，R”和R’，，優選地獨立地選自氫原子或被取代 -31 - 200938223 的或未被取代的（Ci-Ce)烷基。 此處使用的術語“二磷酸酯，，包括但不限於含有兩個磷 酸根基團的碟酸的醋。術語“三磷酸醋，，包括但不限於含有 三個磷酸根基團的磷酸的酯。例如，含有二磷酸酯或三磷 酸酯的具體藥物包括：
三磷酸_
此處使用的術語“雜原子”包括氧（〇)、氮（N)、硫（8)和 矽（Si) 〇 符號“R”係一通用的縮寫’它表示—取代基，該取代基選 自被取代的或未被取代的院基、被取代的或未被取代的的 雜烷基、被取代的或未被取代的的芳基、被取代的或未被 取代的的雜芳基和被取代或未被取代的雜環基。 在以下各分部中詳細說明本發明的不同方面。 抗PTK7抗體 本發明抗體的特徵在於抗體某些特定的功能性特徵或 屬性。例如’所述抗體特異性地結合人類PTK7。優選地 ’本發明之抗體以高親和力結合人類PTK7，例如其Kd爲 1 xl(T7 Μ或更低。本發明的抗ΡΤΚ7抗體優選地具有下述 -32- 200938223 特徵中的一或多種： (a) 特異性結合人類PTK7 ;或 (b) 結合 Wilms’腫瘤細胞系（ATCC編號No. CRL_ 1441) ° 優選地，抗體與人類PTK7蛋白結合的爲5χ1〇-8 Μ或更低、與人類ΡΤΚ7蛋白結合的KD爲1χ1〇_8 μ或更 低、與人類ΡΤΚ7蛋白結合的KD爲5χ1(Γ9 Μ或更低、或 者與人類ΡΤΚ7蛋白結合的KD爲在1χ1(Γ8 Μ至Ιχίο·10 Μ之間或更低。優選地，所述抗體與Wilms’腫瘤細胞系結 合的ECso爲4.0 nM或更低或與Wilms’腫瘤細胞系結合的 EC5Q爲3.5 nM或更低。評估抗體對PTK7的結合親和力 的標準測試方法係本領域中已知的，包括例如ELISA、蛋 白質印跡法和RIA。抗體的結合動力學（例如結合親和力） 也可以藉由本領域中已知的標準測試方法來評估，例如藉 由ELISA，Scatchard和Biacore進行分析。作爲另一實例 ，本發明之抗體可以結合腎癌腫瘤細胞系，例如Wilms’腫 瘤細胞系。適用於評估上述任一特徵的分析方法在實例中 都有詳述。 單選殖抗體 3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和 7C8 優選的本發明抗體爲人類單選殖抗體3G8、3G8a、 4D5、12C6、12C6a和7C8，它們的分離和結構表徵詳見 實例1和2。本領域技術人員能夠理解的是，抗體3G8和 -33- 200938223 3G8a具有相同的重鏈序列而輕鏈序列不同；同樣地’抗 體12C6和12C6a也具有相同的重鏈序列而輕鏈序列不同 ，3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和 7C8 的 VH 胺基酸序 列分別示於於 SEQ ID NO: 1(3G8 和 3G8a)、2(4D5)、 3(12C6 和 12C6a)和 4(7C8)。3G8、3G8a、4D5、12C6、 12C6a和7C8的胺基酸序列分別示於SEQ IDNO: 5、6 、7 、 8 、 9 和 10 。 由於每一種上述抗體均可結合PTK7，因此可將VH和 VL序列進行“混合與匹配”，從而產生本發明的其他的抗 PTK7結合分子。可以使用上文以及實例中所述的結合分 析（例如ELISA)來檢測這類“混合與匹配”的抗體與PTK7 的結合。優選地，當VH和Vl鏈被混合和匹配時，來自某 —特定VH/VL對的VH序列被另一結構相似的VH序列代替 。類似地，優選地來自某一特定Vh/Vl對的Vl序列被另 一結構相似的V L序列代替。 因此，在一方面，本發明提供了 一分離的單選殖抗體 或其抗原結合部分，包括： (a) 包括選自SEQ ID NO: 1、2、3和4的胺基酸序列 的一重鏈可變區，和 (b) 包括選自 SEQ ID NO: 5、6、7、8' 9 和 1〇 的一 胺基酸序列的輕鏈可變區； 其中所述抗體特異性結合PTK7，優選地結合人類 PTK7。 優選的重鏈和輕鏈組合包括： -34- 200938223 (a) —包括SEQ ID ΝΟ:1的胺基酸序列的重鏈可變區 :和（b)—包括SEQ ID NO:5的胺基酸序列的輕鏈可變區 :或 (a)—包括SEQ ID ΝΟ:1的胺基酸序列的重鏈可變區 :和（b)—包括SEQ ID NO:6的胺基酸序列的輕鏈可變區 ;或 U)—包括SEQ ID NO:2的胺基酸序列的重鏈可變區 0 ;和（b)—包括SEQ ID NO:7的胺基酸序列的輕鏈可變區 :或 U)—包括SEQ ID NO:3的胺基酸序列的重鏈可變區 :和（b)—包括SEQ ID NO:8的胺基酸序列的輕鏈可變區 :或 U)—包括SEQ ID NO:3的胺基酸序列的重鏈可變區 :和（b)—包括SEQ ID NO:9的胺基酸序列的輕鏈可變區 ;或 φ (a)—包括SEQ ID ΝΟ_·4的胺基酸序列的重鏈可變區 :和（b)—包括SEQ ID ΝΟ:10的胺基酸序列的輕鏈可變區 〇 在另一方面，本發明提供了由 3G8、3G8a、4D5、 12C6、12C6a 和 7C8 的重鏈和輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 或其組合構成的抗體。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和7C8的VH CDR1的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO : 11(3G8 和 3G8a)、12(4D5) ' 13(12C6 和 12C6a)和 14(7C8) 。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和 7C8 的 VH CDR2 的 -35- 200938223 胺基酸序列分別示於 SEQ ID NO : 15(3G8和 3G8a)、 16(4D5)、1 7( 12C6 和 12C6a)和 18(7C8)。3G8、3G8a、 4D5、12C6、12C6a和7C8的VH CDR3的胺基酸序列分別 示於 SEQ ID NO: 19(3G8 和 3G8a)、20(4D5)、21(12C6 和 12C6a)和 22(7C8)。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和 7C8的Vk CDR1的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO : 23、 24、25、26、27 和 28。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和7C8的Vk CDR2的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO : 29、30、31、32、33 和 34。3G8、3G8a、4D5、12C6、 12C6a和708的Vk CDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 35、36、37、38、39 和 40。CDR 區用 Kabat 系統進 行 了標示（Kabat, E. A.，et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242) 〇 由於上述人類抗體的每一種都能夠結合PTK7，並且 抗原結合特異性主要由CDR1、CDR2和CDR3區域提供， 因此 VH的 CDR1、CDR2和CDR3序列和 Vk的 CDR1、 CDR2和CDR3序列可以被“混合和匹配”（即來源於不同抗 體的CDR可以被混合和匹配，但係每種抗體都必須含有 一 VH 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 以及一 Vk 的 CDR1、CDR2 和CDR3)，從而產生本發明的其他的抗PTK7結合分子。 可以使用上文及實例所述的結合分析（例如 ELISA、 Biacore分析）來檢測這類“混合與匹配”的抗體與PTK7的 200938223 結合。優選地，當VHCDR被混合和匹配時’來自某一特 定νΗ序列的CDR1、CDR2和/或 CDR3序列被另一結構 相似的C D R序列代替。類似地’當V k C D R被混合和匹配 時，來自某一特定Vk序列的CDR1、CDR2和/或 CDR3 序列優選地被另一結構相似的CDR序列代替。對於本領 域技術人員顯而易見的是，對於單選殖抗體3G8、3G8a、 4D5、12C6、12C6a和7C8而言，可以藉由將一或多個VH 0 和/或CDR區域序列替換爲結構相似的來源於本文公開 的CDR序列的序列，來產生新的VH和Vl序列。 因此，在另一方面，本發明提供了分離的單選殖抗體 或其抗原結合部分*包括· (a) 包括選自SEQIDNO: 11、12、13和14的胺基酸 序列的一重鏈可變區CDR1 ; (b) 包括選自SEQ ID NO: 15、16、17和18的胺基酸 序列的一重鏈可變區CDR2; Q (c)包括選自SEQIDN0: 19、20、21和22的胺基酸 序列的一重鏈可變區CDR3; (d) 包括選自 SEQ ID NO: 23、24、25、26、27 和 28 的胺基酸序列的一輕鏈可變區CDR1 ; (e) 包括選自 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33 和 34 的胺基酸序列的一輕鏈可變區CDR2 ;和 (0 包括選自 SEQ ID NO: 35、36、37、38、39 和 40 的胺基酸序列的一輕鏈可變區CDR3 ; 其中所述抗體特異性結合PTK7，優選地結合人類 -37- 200938223 PTK7。 在一優選的實施方案中，所述抗體包括： (a) —包括SEQ ID ΝΟ:11的重鏈可變區CDR1 ; (b) —包括SEQ ID NO:15的重鏈可變區CDR2 ; (c) 一包括SEQ ID ΝΟ··19的重鏈可變區CDR3 ; (d) —包括SEQ ID ΝΟ:23的輕鏈可變區CDR1 ; (e) —包括SEQ ID ΝΟ:29的輕鏈可變區CDR2 ;和
(f) 一包括SEQ ID NO:35的輕鏈可變區CDR3。 在另一優選的實施方案中，所述抗體包括： (a) —包括SEQ ID ΝΟ:11的重鏈可變區CDR1 ; (b) 一包括SEQIDNO:15的重鏈可變區CDR2; (c) —包括SEQ ID NO:19的重鏈可變區CDR3 ; (d) —包括SEQ ID NO:24的輕鏈可變區CDR1 ; (e) 一包括SEQ ID NO:30的輕鏈可變區CDR2 ;和
(f) 一包括SEQ ID NO:36的輕鏈可變區CDR3。 在另一優選的實施方案中，所述抗體包括： (a) —包括SEQIDNO:12的重鏈可變區CDR1; (b) —包括SEQIDNO:16的重鏈可變區CDR2; (c) 一包括SEQIDNO:20的重鏈可變區CDR3; (d) —包括SEQ ID NO:25的輕鏈可變區CDR1; (e) 一包括SEQ IDNO:31的輕鏈可變區CDR2;和 (f) 一包括SEQIDNO:37的輕鏈可變區CDR3。 在另一優選的實施方案中，所述抗體包括： (a) —包括SEQ ID NO:13的重鏈可變區CDR1; -38- 200938223 (b) —包括SEQIDNO:17的重鏈可變區CDR2; (c) —包括SEQ ID NO:21的重鏈可變區CDR3 ; (d) —包括SEQIDNO:26的輕鏈可變區CDR1; (e) —包括SEQIDNO:32的輕鏈可變區CDR2;和 (f) 一包括SEQ ID NO:38的輕鏈可變區CDR3。 在另一優選的實施方案中，所述抗體包括： (a) —包括SEQ ID NO:13的重鏈可變區CDR1; (b) —包括SEQIDNO:17的重鏈可變區CDR2; (c) 一包括SEQ ID NO:21的重鏈可變區CDR3 ; (d) —包括SEQ ID N〇:27的輕鏈可變區CDR1 ; (e) —包括SEQ ID NO:33的輕鏈可變區CDR2 ;和 (f) 一包括SEQ ID NO:39的輕鏈可變區CDR3。 在另一優選的實施方案中，所述抗體包括： (a) —包括SEQ ID NO:14的重鏈可變區CDR1 ; (b) —包括SEQIDNO:18的重鏈可變區CDR2; (c) 一包括SEQ ID NO:22的重鏈可變區CDR3 ; (d) —包括SEQIDNO:28的輕鏈可變區CDR1; (e) —包括SEQ ID NO:34的輕鏈可變區CDR2 ;和 (f) 一包括SEQIDNO:40的輕鏈可變區CDR3。 在本領域中公知的是，CDR3功能域可以獨立於 CDR1和/或CDR2功能域而獨自決定抗體對於同族抗原的 結合特異性，並且多種抗體可以基於共同的CDR3序列而 可預期地產生相同的結合特異性。參見例如，Klimka ^ -39- 200938223 a/·, ·/. o/Cancez* 83(2):252-260 (2000)(描述 了僅使 用鼠類抗CD30抗體Ki-4的重鏈可變功能域CDR3來產生 人源化抗 CD30 抗體）；Beiboer ei a/.，又 Μ〇/· 5ίοΛ 296:833-849 (2000)(描述了僅使用親代鼠類 MOC-31抗 EGP-2抗體的重鏈CDR3序列重組上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗 體）；Rader e t al.，Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 95:89 1 0-89 1 5 ( 1 998)(描述了使用鼠類抗整聯蛋白ανβ3抗體LM609 的重鏈和輕鏈可變CDR3功能域產生一系列的人源化抗整 聯蛋白ανβ3抗體，其中每一抗體成員在CDR3功能域之外 的序列均不相同，但係都能與親代鼠類抗體結合相同的抗 原決定位，並且其結合親和力與親代鼠類抗體相似或比親 代鼠類抗體更高）；Barbas ei fl/.，·/. jw. C/iew. <Soc. 1 1 6:2 1 6 1 -2 1 62 ( 1 994)(公開了 CDR3功能域對抗原結合的 貢獻度最大）；Barbas ei α/_，Proc. Wai/. Jcac?. Sc ζ·. t/.ϋ 92:2529-25 3 3 ( 1 995 )(描述了將三個針對人類胎盤DNA的 Fab(SI-l、SI-40和SI-32)的重鏈CDR3序列移植到抗破傷 風類毒素Fab的重鏈上，藉此替換原先的重鏈CDR3，並 證實了僅有C D R3功能域就能夠賦予結合特異性）；以及 D i t z e 1 e i a /.，·/. /«? »2 w « ο / · 1 5 7 : 7 3 9 - 7 4 9 ( 1 9 9 6)(描述 了移植 硏究，其中僅將親代多特異性Fab LNA3的重鏈CDR3移 植到單特異性IgG破傷風類毒素結合Fab p3 13抗體的重 鏈上，就足以保留親代Fab的結合特異性）；Berezov ei al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001)(描述 了基於 抗HER2單選殖抗體的 CDR3的肽模擬物）；Igarashi ei 200938223 J. 5/oc/ze/w (ToA:少ο) 117:452-7 (1995)(描述了對應於抗 磷脂醯絲氨酸抗體的CDR3功能域的一 12個胺基酸的合 成多狀）；Bourgeois ei a/., J_ Firo/ 72:807-10 (1998)(顯 示了來源於抗呼吸道合胞病毒（RSV)抗體的重鏈CDR3功 能域的一單肽能夠在體外中和所述病毒）；Levi ei a/., Proc. Natl. Acad. Sci. t/. 丄 9 0 : 4 3 7 4 - 8 (1 9 9 3 )(描述了基 於鼠類抗 HIV抗體的重鏈 CDR3功能域的一種肽）； Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 ( 1 994)( 描述了藉由移植Z-DNA結合抗體的重鏈CDR3區域使得 能夠結合 scFv);以及 Xu and Davis, 13:37-45 (2000)(描述了重鏈CDR3的多樣性足以使得其他部分相同 的IgM分子區分各種半抗原和蛋白質抗原）。還可參見美 國專利 No. 6,951,646、6,914,128、6,090,382、6,818,216 、6,156,313 > 6,827,925 ' 5,833,943 ' 5,762,905 和 5，760,185，描述了由單個CDR功能域定義的獲得專利權 的抗體。上述每一篇文獻均藉由引用全文納入本文。 因此，本發明提供了包括來源於人類或非人類抗體的 一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3功能域的單選殖抗體，其中 所述單選殖抗體能夠特異性結合PTK7。在某些方面，本 發明提供了包括來源於非人類抗體（例如小鼠或大鼠抗體） 的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3功能域的單選殖抗體，其 中所述單選殖抗體能夠特異性結合PTK7。在一些實施方 案中，這類包括來源於非人類抗體的一或多個重鏈和/或 輕鏈CDR3功能域的本發明抗體：（a)能夠與其相應的親代 -41 - 200938223 非人類抗體競爭結合；（b)保留了其相應的親代非人類抗體 的功能特性；（c)與其相應的親代非人類抗體結合相同的抗 原決定位；和/或（d)與其相應的親代非人類抗體具有相似 的結合親和力。 在其他方面，本發明提供了包括來源於一人類抗體（ 例如一由非人類的動物獲得的人類抗體）的一或多個重鏈 和/或輕鏈CDR3功能域的單選殖抗體，其中所述單選殖抗 體能夠特異性結合PTK7。在其他方面，本發明提供了包 括一來源於第一人類抗體的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3 功能域的單選殖抗體，所述第一人類抗體例如一獲自非人 類動物的人類抗體，其中所述第一人類抗體能夠特異性結 合PTK7，並且其中所述來源於所述第一人類抗體的CDR3 功能域替換了一不具有PTK7結合特異性的人類抗體中的 CDR3功能域，以產生一能夠特異性結合PTK7的第二人 類抗體。在一些實施方案中，這類包括來源於第一人類抗 體的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3功能域的本發明抗體： (a)能夠與其相應的親代第一人類抗體競爭結合；（b)保留 了其相應的親代第一人類抗體的功能特性；（c)與其相應的 親代第一人類抗體結合相同的抗原決定位；和/或（d)與其 相應的親代第一人類抗體具有相似的結合親和力。在優選 的實施方案中，所述第一人類抗體爲3G8、#g8a、4D5、 1 2C6、12C6a 或 7C8。 具有特定種系序列的抗體 -42- 200938223 在某些實施方案中，本發明之抗體包括一來源於特定 種系重鏈免疫球蛋白基因的一重鏈可變區和/或一來源於 特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的一輕鏈可變區。 例如，在一優選的實施方案中，本發明提供了一分離 的單選殖抗體或其抗原結合部分，包括一來源於人類VH 3-30.3基因或者係人類VH 3-30.3基因的產物的重鏈可變 區，其中所述抗體特異性結合PTK7，優選爲人類PTK7。 0 在另一優選的實施方案中，本發明提供了一分離的單選殖 抗體或其抗原結合部分，包括一來源於人類Vh DP44基因 或者係人類VH DP44基因的產物的重鏈可變區，其中所述 抗體特異性結合PTK7，優選爲人類PTK7。在另一優選的 實施方案中，本發明提供了一分離的單選殖抗體或其抗原 結合部分，包括一來源於人類VH 3-33基因或者係人類VH 3-3 3基因的產物的重鏈可變區，其中所述抗體特異性結合 PTK7，優選爲人類PTK7。在另一優選的實施方案中，本 φ 發明提供了一分離的單選殖抗體或其抗原結合部分，包括 —來源於人類Vk L15基因或者係人類Vk L15基因的產物 的輕鏈可變區，其中所述抗體特異性結合PTK7，優選爲 人類PTK7。在另一優選的實施方案中，本發明提供了一 分離的單選殖抗體或其抗原結合部分，包括一來源於人類 Vk A10基因或者係人類VkAlO基因的產物的輕鏈可變區 ，其中所述抗體特異性結合PTK7，優選爲人類PTK7。在 另一優選的實施方案中，本發明提供了一分離的單選殖抗 體或其抗原結合部分，包括一來源於人類Vk A27基因或 -43- 200938223 者係人類vk A2 7基因的產物的輕鏈可變區，其中所述抗 體特異性結合PTK7，優選爲人類PTK7。在另一優選的實 施方案中，本發明提供了一分離的單選殖抗體或其抗原結 合部分，包括一來源於人類Vk L6基因或者係人類Vk L6 基因的產物的輕鏈可變區，其中所述抗體特異性結合 PTK7，優選爲人類PTK7。在又另一優選的實施方案中， 本發明提供了一分離的單選殖抗體或其抗原結合部分，其 中所述抗體： β Θ (a) 包括一重鏈可變區，所述重鏈可變區來源於人類 VH 3-30.3、DP44或3-33基因或者係上述基因的產物（上 述基因所編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO : 51、52 和 53); (b) 包括一輕鏈可變區，所述輕鏈可變區來源於人類 Vk L15、A10、A2 7或L6基因或者係上述基因的產物（上 述基因所編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO : 54、55 、56和57);並且 0 (c) 特異性結合PTK7。 分別具有VH 3-30.3和Vk L1 5的VH和Vk的抗體的 實例爲3G8和3G8a。分別具有VH 3-30.3和Vk A10的VH 和Vk的抗體的實例爲4D5。分別具有VH DP44和Vk A27 的VH和Vk的抗體的實例爲12C6。分別具有VH DP44和 Vk L15的VH和Vk的抗體的實例爲12C6a。分別具有Vh 3-33和Vk L6的VH和乂1£的抗體的實例爲7C8。 如此處所用，如果一人抗體的可變區由使用人類種系 -44 - 200938223 免疫球蛋白基因的系統獲得，則所述人抗體包含“產自” 或者“衍生於”特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區。該系統 包括用所關注的抗原對攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小 鼠進行免疫或者用所關注的抗原對在噬菌體上展示的人免 疫球蛋白基因文庫進行篩查。“衍生於”某一人類種系免疫 球蛋白序列或作爲其“產物”的人類抗體可以藉由下述方 式進行識別：將所述人類抗體的胺基酸序列與人類種系免 疫球蛋白的胺基酸序列相比較，並選擇在序列上與所述人 類抗體最接近（即同一性百分數最高的）人類種系免疫球蛋 白序列。一“產自”或“源自”特定人類種系免疫球蛋白序列 的人抗體可能含有與種系序列不同的胺基酸，這可能係由 於例如自然產生的體細胞突變或有意引入的定點突變。然 而，所選擇的人抗體通常與由一人類種系免疫球蛋白基因 編碼的胺基酸序列相比具有至少90%的胺基酸序列的同一 性，而且所述人抗體在與其他物種的種系免疫球蛋白胺基 酸序列（例如，鼠科種系序列）進行比較時，其含有的胺基 酸殘基將其鑒定爲人的抗體。在一些情況中，人抗體與該 種系免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列相比可以具有至少 9 5 %、至少9 6 %、9 7 %、9 8 %或9 9 %的胺基酸序列同一性。 通常，源自特定人類種系序列的人抗體不會顯現超過10 個與由人類種系免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列不同的 胺基酸。在一些情況中’人抗體可以顯現不超過5個’乃 至不超過4、3、2或1個與由人類種系免疫球蛋白基因編 碼的胺基酸序列不同的胺基酸。 -45 - 200938223 同源抗體 在另一實施方案中，本發明之抗體包括含有與此處說 明的優選抗體的胺基酸序列同源的胺基酸序列的重鏈可變 區和輕鏈可變區，其中，該抗體保留本發明所需的抗 PTK7抗體的功能性質。 例如，本發明提供了一分離的單選殖抗體或其抗原結 合部分，包括一重鏈可變區和一輕鏈可變區，其中： (a) 所述重鏈可變區包括與選自SEQ ID NO : 1、2、 3和4的胺基酸序列具有至少80%同源性的胺基酸序列； (b) 所述輕鏈可變區包括與選自SEQ ID NO: 5、6、 7、8、9和1 0的胺基酸序列具有至少8〇%同源性的胺基酸 序列；並且 其中所述抗體具有下列一或多種屬性： (Ο所述抗體與人類PTK7的結合的KD爲ΙχΙΟ·7 Μ 或更低； (d)所述抗體能夠結合Wilms’腫瘤細胞系。 在其他實施方案中，VH和/或VL胺基酸序列可以與 前述序列具有 8 5 %、9 0 %、9 5 %、9 6 %、9 7 %、9 8 % 或 9 9 % 的同源性。具有與前述序列的VH和VL區高同源性（即， 80%或更大）的VH和VL區的抗體可以如下獲得：誘導編碼 SEQIDNO: 41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 的核酸分子發生突變（例如，定點突變或PCR介導的突變） ’然後使用此處說明的功能測定方法測試編碼改變的抗體 -46- 200938223 的保留功能（即上述的（C)和（d)中所述的功能）。 如本文中所使用’兩條胺基酸序列的同源性的百分比 等同於兩條序列的同一性的百分比，兩個序列之間的同一 性百分數比爲兩序列共有的相同位置的數目的函數（βΡ， 同源性％ =相同的位置數/位置總數X 1 〇〇)，並需要考慮空 位（gap )數目，和每個空位的長度，這些空位需要被引 入用於兩條序列的優化比對。正如在以下的非限制性實例 φ 中所述，藉由數學演算法可以完成兩條序列的序列比較和 同一性百分比的測定。 兩條胺基酸序列的同一性百分比的測定可以運用E. Meyers 和 W. Miller (Cow;? Mi. 5 i.oxci·.，4: 11-17 ( 1 9 8 8)的演算法來進行，此演算法已經結合在ALIGN程 式中（版本 2.0)，該演算法採用 PAM120權重殘基表 (weight residue table)、12 空位長度處罰（gap length penalty)和4空位長度處罰。此外，兩條胺基酸序列的同 ❹ 一性百分比的測定還可使用Needleman和1\1118<:11(1/.从〇/· 心〇/· 48 ·· 444-453 (1 970))演算法進行，此演算法已結合 在GCG套裝軟體的GAP程式中（可從www.gcg.com獲得） ，此演算法應用了 Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及 16、 14、 12、 10、 8、 6 或 4 的空位權重和 1、 2、 3、 4、 5或 6的長度權重。 另外或者替代性地，本發明的蛋白質序列能被進一步 用作“查詢序列”以對照公開的序列資料庫進行檢索，以便 (例如）鑒定相關序列。此檢索可採用Altschul，et al. -47- 200938223 (1 990) «/. Mo/. 5i_o/· 2 1 5: 403 - 1 0 的 XBLAST 程式（版本 2.0)進行。BLAST蛋白質檢索可採用記分爲50，字長爲 3的XBL AST程式進行，從而獲得與本發明之抗體分子同 源的胺基酸序列。爲獲得用於比較的空位比對，可使用 Altschul et al. ((1 997) Nucleic Acids Res.25{\l) ： 3 3 89-3402)說明的空位 BLAST。當運用 BLAST和空位空隙 BLAST程式時，可使用相應程式（例如 XBLAST和 NBLAST)的缺省參數。（參見 http : "www.ncbi.nlm.nih.gov) 具有保守性修飾的抗體 在某些實施方案中，本發明之抗體包括一含有CDR1 、CDR2和 CDR3序列的重鏈可變區和一含有 CDR1、 CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，其中一或多個上述 CDR序列包括本文所述的優選抗體（例如，3G8、3G8a、 4D5、12C6、12C6a或7C8)的具體的胺基酸序列或其保守 性修飾，並且其中所述抗體保留了本發明的抗PTK7抗體 的所需功能屬性。本領域技術人員可以理解的是，可以進 行某些保守性序列修飾而不會失去其抗原結合能力。參見 例如 Brummell ei α/_ (1 993) 32:1 1 80-8 (描述了在 特異性針對沙門氏菌（Sa/m〇«e//«)抗體的重鏈CDR3功能 域的突變分析）；de Wildt " αΛ (1 997)尸 roi. 1 0:83 5- 41 (描述了抗UA1抗體的突變硏究）；Komissarov αΛ (1 997) J. Biol. Chem. 2 7 2:26864-26870 (證實在 HCDR3 中 200938223 間的突變可導致親和力的減弱或消失）；Hall ei α/. (1 992) J. Immunol. 1 49 : 1 605 - 1 2 (描述了在CDR3區域中單個胺基 酸的改變會減弱結合活性）；.Kelley and O’Connell (1993) 们ocAem. 3 2:6862-3 5 (描述了 Tyr對於抗原結合的作用）; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 (描述了 疏水性對於結合的影響）和Beers er α/· (2000) 6:2 8 3 5-43 (描述了 HCDR3胺基酸突變體）。因此，本 u 發明提供了一包括單選殖抗體或其抗原結合部分的抗體-伴體分子共軛物，所述單選殖抗體或其抗原結合部分包括 一含有CDRl、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區和一含有 CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，其中： (a) 所述重鏈可變區CDR3序列包括選自SEQ ID NO :19、20、21和22的胺基酸序列及其保守性修飾的胺基 酸序列； (b) 所述輕鏈可變區CDR3序列包括選自SEQ ID NO 〇 : 35、36、37、38、39和40的胺基酸序列及其保守性修 飾的胺基酸序列；並且 其中所述抗體具有下列一或多種屬性： (c) 所述抗體能夠結合人類ΡΤΚ7; (d) 所述抗體能夠結合Wilms’腫瘤細胞系（ATCC編號 No. CRL-1441)。 在一優選的實施方案中，所述重鏈可變區CDR2序列 包括選自SEQ ID NO: 15、16、17和18的胺基酸序列及 其保守性修飾的胺基酸序列；並且所述輕鏈可變區CDR2 -49- 200938223 序列包括選自SEQ ID NO: 29、30、31、32、33和34的 胺基酸序列及其保守性修飾的胺基酸序列。在另一優選的 實施方案中，所述重鏈可變區CDR1序列包括選自SEQ ID NO: 11、12、13和14的胺基酸序列及其保守性修飾的胺 基酸序列；並且所述輕鏈可變區CDR1序列包括選自SEQ ID NO : 23、24、25、26、27和28的胺基酸序列及其保 守性修飾的胺基酸序列。 在不同實施方案中，所述抗體可爲例如人類抗體、人 源化抗體或嵌合抗體。 如本文中所使用，術語“保守性序列修飾”意指不會明 顯影響或改變含有所述胺基酸序列的所述抗體的結合特性 的胺基酸修飾。這類保守性修飾包括胺基酸的置換、插入 和缺失。修飾可藉由例如定點誘變和PCR介導的誘變等本 領域已知的標準技術引入本發明之抗體中。保守胺基酸置 換係其中的胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基替換 的置換。在本領域中已經確定具有相似側鏈的胺基酸殘基 家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸（如賴氨酸、 精氨酸、組氨酸），具有酸性側鏈的胺基酸（如天冬氨酸、 谷氨酸），具有未帶電的極性側鏈的胺基酸（如甘氨酸、天 冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸 、色氨酸），具有非極性側鏈的胺基酸（如丙氨酸、纈氨酸 、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸），具 有β-支化側鏈的胺基酸（如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）、 和具有芳香側鏈的胺基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸 200938223 、組氨酸）。因此，本發明之抗體的CDR區中的一或多個 胺基酸殘基可以被來自相同側鏈家族的胺基酸殘基替代， 並且使用此處說明的功能分析方法對變化的抗體的保留功 能（即上述的（c)和（d)中所述的功能）進行測試。 與本發明的抗PTK7抗體結合相同抗原決定位的抗體 在另一實施方案中，本發明提供了結合任何本發明的 PTK7單選殖抗體所識別的人類PTK7上的相同抗原決定位 的抗體（即能夠與任何本發明單選殖抗體交叉競爭結合 PTK7的抗體）。在優選的實施方案中，所述在交叉競爭分 析中使用的參照抗體可爲：單選殖抗體3G8(其VH和VL 序列分別示於SEQ ID NO : 1和5)，或單選殖抗體3G8a( 其VH和VL序列分別示於SEQ ID NO : 1和6)，或單選殖 抗體4D5(其VH和VL序分別列示於SEQ ID NO : 2和7) ，或單選殖抗體12C6(其VH和VL序列分別示於SEQ ID NO : 3和8)，或單選殖抗體12C6a(其VH和VL序列分別 示於SEQ ID NO : 3和9)，或單選殖抗體7C8(其VH和VL 序列分別示於S E Q ID Ν Ο : 4和1 0)。 可以使用標準的PTK7結合分析基於它們與3G8、 3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8交叉競爭的能力來識別 這類交叉競爭抗體。例如，可以使用BIAcore®系統分析 、ELISA測定或流式細胞術來證明與本發明抗體的交叉競 爭。如果一待測抗體能夠抑制例如3G8、3G8a、4D5、 12C6、12C6a或7C8與人類PTK7的結合，則證明該待測 200938223 抗體能夠與 3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 或 7C8 競爭 結合人類PTK7，從而證明待測抗體與3G8、3G8a、4D5、 12C6、12C6a或7C8結合人類PTK7上的相同抗原決定位 。在一優選的實施方案中，所述抗體能夠結合被3G8(其 VH和VL序列分別示於SEQ ID NO : 1和5)或3G8a(其VH 和VL序列分別示於SEQ ID NO : 1和6)或4D5(其VH和 VL序分別列示於SEQ ID NO : 2和7)或12C6(其VH和VL 序列分別示於SEQ ID NO : 3和8)或12C6a(其VH和VL序 列分別示於SEQ ID NO : 3和9)或7C8(其VH和VL序列分 別示於SEQ ID NO : 4和10)所識別的人類PTK7上的相 同抗原決定位。在一優選的實施方案中，所述能夠結合被 3G8 ' 3G8a、4D5、12C6、12C6a 或 7C8 所識別的人類 PTK7上的相同抗原決定位的抗體爲一人類單選殖抗體。 可以按照實例中所述製備和分離這類單選殖抗體。 工程處理的和修飾的抗體 還可以藉由下述方式製備本發明之抗體：使用具有一 或多個本文公開的VH和/或VL序列的抗體作爲起始材料 ’從而藉由工程處理獲得改造的抗體，這種改造的抗體可 能具有與起始抗體不同的屬性。可以藉由改變一或兩個可 變區（即VH和/或VL)中的一或多個殘基來對抗體進行工程 處理，例如可以改變一或多個CDR區和/或一或多個框架 區中的殘基。作爲附加的或替代的手段，也可以藉由改變 恆定區中的殘基來對抗體進行工程處理，以改變所述抗體 -52- 200938223 的效應物功能。 CDR移植可用於對抗體的可變區進行改造。抗體和 靶抗原主要藉由位於六個重鏈和輕鏈互補決定區（CDR)中 的胺基酸殘基進行相互作用。爲此原因，CDR中的胺基酸 序列在各單獨抗體之間比在CDR之外的序列更具有多樣 性。因爲CDR序列負責絕大多數抗體-抗原相互作用，這 使得藉由構建包含來自被移植到骨架序列（來自具有不同 0 性質的不同抗體）的特異性天然抗體的CDR序列的表現載 體，模擬特異性天然抗體性質的重組抗體的表現成爲可能 。（參見例如，Riechmann, L. ei α/. (1998) TVfliwre 3 32:3 23 -32 7 ； Jones, P. et al. (1 986) Nature 3 2 1:5 22-525 > Queen, C. et al. ( 1 9 8 9) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:1 0029- 1 0033 ； Winter 的美國專利 No. 5,225,539，以及 Queen 等人的美國專利 No. 5,530,1 01 ; 5,5 85,08 9 ; 5,693,762 和 6,180,370)。 Q 因此，本發明的另一實施方案涉及一包括一重鏈可變 區和一輕鏈可變區的分離的單選殖抗體或其抗原結合部分 ，所述重鏈可變區中含有的CDR1、CDR2和CDR3序列分 別包括選自 SEQ ID NO: 11、12、13 和 14; SEQ ID NO: 15、16、17 和 18;和 SEQIDNO: 19、20、21 和 22 的胺 基酸序列；所述輕鏈可變區中含有的 CDR1、CDR2和 CDR3 序歹[J 分另 〇 包括選自 SEQ ID NO: 23、24、25、26、 27 和 28; SEQ ID NO: 29、30、31、32、33 和 34;和 SEQ ID NO: 35、36、37、38、39 和 40 的胺基酸序列。 -53- 200938223 因此，這類抗體含有單選殖抗體 3G8、3G8a、4D5、12C6 、12C6a或7C8的VH和VL的CDR序列，但係其框架序 列與上述抗體不同。
這類框架序列可以獲自含有種系抗體基因序列的公共 DNA資料庫或公開出版的文獻。例如，人類重鏈和輕鏈可 變區基因的種系 DNA序列可以在“VBase”人類種系序列 資料庫中找到（可以獲自互聯網網站 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及在下述文獻中找到：Kabat，E. A., e t al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242; Tomlinson, I. M., e t al. (1992)。“The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable ίοορβ^ J. Mol. Biol. 22 7 ：
7 7 6-798 ；和 Cox, J. P. L.et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” ·/_ /mwwwo/. 24: 827-836 找到；在此明 確將各文獻的內容藉由引用結合在此。作爲另一實例，人 類重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在Genbank 資料庫中找到。例如，下列在HCo7 HuMAb小鼠體內發 現的重鏈種系序列可以從以下的所附Genbank登錄號獲得 :1-69 (NG_00 1 0 1 09、NT_02463 7 和 BC0703 3 3 )、3-33 (NG_00 1 0 1 09 和 NT_024637)和 3-7 (NG_00 1 0 1 09 和 NT — 024637)。作爲另一實例，下列在H C ο 1 2 H u M A b小鼠 -54- 200938223 體內發現的重鏈種系序列可以從以下的所附Genbank登錄 號獲得：1-69 (NG_001 01 09、NT_024637 和 BC070333)、 5-5 1 (NG_00 1 0 1 09 和 NT_024637)、4-34 (NG_00 1 0 1 09 和 NT_024637)、3-30.3 (CAJ556644)和 3 - 2 3 ( A J 4 0 6 6 7 8 )。也 可以與上述VBASE相類似的方式使用其他的人類種系序 列資料庫，例如可獲自IMGT(http://imgt.cines.fr)的資料 庫。 使用本領域中公知的一被稱爲Gapped BLAST的序列 相似性檢索方法（Altschul ei α/. (1997) Nucleic Acids iiexeari：/? 25:3389- 3402)，將抗體蛋白質序列與彙編的蛋 白質資料庫進行比較。BLAST係探索式演算法，其中抗體 序列與資料庫序列之間的具有統計學顯著的比對有可能包 括比對字元的高得分片段對（HSP)。其得分不能藉由擴展 或修正加以提高的片段對被稱爲命中記錄（a hit )。 簡言之，VBASE 源的核苷序列（/^尸’//以^(>^.所，£；-c/7 e. c a/W · ac. μ 灸/v Z? as e ·//Π·? ί 2)可被翻譯，並且 FR1 至 FR3框架結構區之間的區域（包括FR1至FR3框架結構區） 被保留。資料庫序列具有的平均長度爲98個殘基。蛋白 全長上的精確匹配的重複序列被剔除。用於蛋白質的 BLAST檢索，採用設爲缺省値的程式blastp、不包括已被 關閉的低複雜性過濾的標準參數和BLOSUM62的置換矩 陣，該檢索瀘出實現序列相配的前5個命中記錄。核苷酸 序列可在全部六個框架中被翻譯，在資料庫序列的匹配片 段中不具有終止密碼子的框架被視爲潛在的命中記錄。這 -55- 200938223 反過來採用BLAST程式tblastx進行確認，該程式翻譯了 在全部六個框架中的抗體序列，並且將這些翻譯與在全部 六個框架中被動態翻譯的VBASE核苷序列進行比較。可 以如上所述地使用與VBASE類似的其他人類種系序列資 料庫進行檢索，例如可以檢索獲自 IMGT (http://imgt.cines.fr)的資料庫。 同一性係在抗體序列和蛋白質資料庫之間在序列全長 上存在的精確的胺基酸匹配。陽性（同一性+與取代匹配） 並不相同，但胺基酸取代係由BLOSUM62取代矩陣所引 導。如果抗體序列以一樣的同一性匹配資料庫序列中的兩 條序列，則具有最大陽性的命中記錄將被判定爲匹配序列 命中記錄。 優選的可用於本發明抗體的框架序列爲與所選擇的本 發明抗體所用的框架序列結構上類似的那些框架序列，例 如與下列框架序列相似的序列（這些序列爲優選的單選殖 本發明抗體所用的框架序列）：VH 3-30.3框架序列（SEQ ID NO:51)和 / 或 VH DP44 框架序列（SEQ ID NO:52)和 / 或組 合的VH 3-33框架序列（SEQ ID NO:53)和/或Vk L15框架 序列（SEQ ID NO:54)和/或 Vk A10框架序列（SEQ ID NO:55)和 /或 Vk L15 框架序列（SEQ ID NO:54)和 / 或 Vk A27框架序列（SEQ ID NO:56)和/或Vk L15框架序列（SEQ ID NO:54)和 /或 Vk L6 框架序列（SEQ ID NO:57)。VH CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，以及 Vk CDR1、CDR2 和 CDR3序列可被移植到具有與由其得到骨架序列的種系免 200938223 疫球蛋白基因中發現的相同的序列的框架結構區，或者 CDR序列可被移植到與種系序列相比包括一或多個突變的 框架結構區。例如，已經發現在一些情況中，在框架結構 區使殘基突變從而保留或增強抗體的抗原結合能力係有益 的（例如，參見 Queen et al.的 US Patent Nos. 5,530,101 ;5，585,089; 5,693,762 和 6,180,370)。 另一類型的可變區修飾係使 VH和/或 VkCDRl、 U CDR2和/或CDR3區中的胺基酸殘基突變，由此改進目的 抗體的一或多種結合屬性（例如親和力）。可以使用定向誘 變或PCR介導的誘變來引入突變並影響抗體的結合能力或 其他所關注的功能屬性，也可以藉由本文所述的和實例中 提供的體內或體外分析來進行評估。優選地引入保守性修 飾（如上所述）。所述突變可爲胺基酸置換、插入或缺失， 但係優選地爲置換。此外，通常在一 CDR區域中改變不 超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。 Q 因此，在另一實施方案中，本發明提供了分離的抗 PTK7單選殖抗體其抗原結合部分，包括一重鏈可變區， 包括：（a) — VH CDR1區域，該區域包括選自SEQ ID NO :1 1、12、13和14的一胺基酸序列，或包括與SEQ ID NO: 11、12、13和14相比具有一個、兩個、三個、四個 或五個胺基酸置換、缺失或插入的一胺基酸序列；（b) — VH CD R2區域，該區域包括選自SEQ ID NO: 15、16、17 和1 8的一胺基酸序列，或包括與SEQ ID NO : 1 6、1 7和 18相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸置換、 -57- 200938223 缺失或插入的一胺基酸序列；（c) 一 vh CDR3區域’該區 域包括選自SEQ ID NO: 19、20、21和22的一胺基酸序 列，或包括與SEQ ID NO: 19、20、21和22相比具有一 個、兩個、三個、四個或五個胺基酸置換、缺失或插入的 —胺基酸序列；（d) — Vk CDR1區域’該區域包括選自 SEQ ID NO: 23、24、25、26、27 和 28 的一胺基酸序列 ，或包括與 SEQ ID NO : 23、24、25、26、27 和 28 相比 具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸置換、缺失或 插入的一胺基酸序列；（e) — Vk CDR2區域，該區域包括 選自 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33 和 34 的一胺基酸 序歹！J，或包括與 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33 和 34 相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸置換、缺 失或插入的一胺基酸序列；和（f)一 CDR3區域，該區 域包括選自 SEQ ID NO: 35、36、37、38、39 和 40 的一 胺基酸序列，或包括與SEQ ID NO: 35、36、37、38、39 和40相比具有一個、兩個、三個 '四個或五個胺基酸置 換、缺失或插入的一胺基酸序列。 本發明的工程化抗體包括這樣的抗體：它們在VH和/ 或Vk的框架殘基進行了修飾，從而例如改進所述抗體的 屬性。通常，進行這類框架修飾係爲了降低所述抗體的免 疫原性。例如，一方法係使一或多個骨架殘基進行“回復 突變”而成爲相應的種系序列。更具體而言，已經經歷體 細胞突變的抗體可包含與得到該抗體的種系序列不同的骨 架殘基。這樣的殘基可以藉由將抗體框架序列與從中衍生 -58- 200938223 出該抗體的種系序列進行比較而進行鑒定。 例如，對於3G8(和3G8a)而言，VH的胺基酸殘基 #2 8 (在FR1內）爲一異亮氨酸，而在相應的VH 3-3 0.3種系 序列中這一殘基爲一蘇氨酸。爲了使框架區域序列變回它 們的種系構型，可以藉由例如定向誘變或者PCR介導的誘 變將這一體突變“回突變”爲種系序列（例如將3G8(和 3G8a)的VH中FR1的殘基#28從異亮氨酸再“回突變”爲蘇 ❹隱）。 作爲另一實例，對於12C6(和12C6a)而言，VH的胺 基酸殘基#44(在 FR2內）爲一蘇氨酸，而在相應的 VH DP44種系序列中這一殘基爲一甘氨酸。爲了使框架區域 序列變回它們的種系構型，例如可以將12C6(和12C6a)的 VH中（FR2的殘基#9 )的殘基#44從蘇氨酸再“回突變”爲 甘氨酸）。本發明的範圍也意圖涵蓋這類“回突變”的抗體 〇 〇 另一類型的框架修飾涉及將框架區域甚至一或多個 CDR區域內的一或多個殘基進行突變，以除去T細胞抗原 決定位從而降低所述抗體的潛在的免疫原性。這種方法也 被稱爲“去免疫（deimmunization)”，在Carr等人的美國專 利公佈No. 20030 1 53 043中有更詳細的描述。 作爲在框架區或CDR區域內進行修飾的附加手段或 替代手段，還可以對本發明之抗體進行工程處理還使其在 Fc區域內也包含修飾，通常可以改變所述抗體的一或多種 功能屬性，例如血清半衰期、補體結合（complement -59- 200938223 fixation)、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外 ，本發明之抗體可以進行化學修飾（例如，一或多個化學 物部分可以與抗體連接），或進行修飾以改變其糖基化作 用，從而再次改變該抗體的一或多個功能性質。下面將對 這些實施方案中的每一個進行更詳細的說明。Fc區中的殘 基的編號係Kabat的EU索引的編號。 在一實施方案中，CH1的鉸鏈區被修飾從而改變了（ 例如，增加或減少）鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的個數。在 B o d m e r 等人的 U · S . P a t e n t N 〇 . 5，6 7 7，4 2 5 中進一步說明瞭 該方法。將CHI的鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的個數加以改 變，例如以便於組裝輕鏈和重鏈或者增加或減小抗體的穩 定性。 在另一實施方案中，抗體的Fc鉸鏈區發生突變以減 小其生物半衰期。更具體而言，將一或多個胺基酸變異引 入Fc鉸鏈域片段的CH2-CH3功能域的介面區域，以致相 對于天然Fc鉸鏈域的Sp A結合，該抗體削弱與葡萄球菌 蛋白 A( Staphylococcyl protein A, SpA)的結合。Ward 等 人的U.S. Patent No. 6，165,745更詳細地說明瞭該方法。 在另一實施方案中，對該抗體進行修飾以增大其生物 半衰期。不同的方法係可能的。例如，可以引入一或多個 下列突變：如Ward的U.S. Patent No. 6,277,375中說明 的T252L、T254S、T25 6F。作爲替代，爲增大生物半衰期 ，該抗體可以在CH1或CL區域中發生變化以包含從IgG 的 Fc區域的 CH2功能域的雨個環獲得的補救抗體 200938223 (salvage receptor)結合抗原決定位，如presta等人的U.S. Patent No. 5,869,046 和 6,1 21,022 所述。 在其他實施方案中，藉由用不同的胺基酸殘基取代至 少一個胺基酸殘基以改變Fc區，從而改變抗體的效應因 數功能。例如，選自胺基酸殘基234、235、236、237、 297、318、320和3 22的一或多個胺基酸可以被不同的胺 基酸殘基取代，從而使抗體對於效應因數配體而言具有改 變的親和力性，但仍保留親本抗體的抗原結合能力。親和 力變化的效應子配體可以係，例如Fc受體或補體的C1成 分。均爲授予給 Winter 等人的 U.S. Patent No. 5,624,82 1 和5,648,260更詳細地說明瞭該方法。 在另一實例中，選自胺基酸殘基329、331和322的 一或多個胺基酸殘基可以被不同的胺基酸殘基取代，以使 抗體具有改變的Clq結合和/或減少的或無效的補體依賴 的細胞毒性（CDC)。Idusogie 等人的 U.S· Patent No. 6,1 94,5 5 1更詳細地說明瞭該方法。 在另一實例中，胺基酸位置231和239中的一或多個 胺基酸可被改變，從而改變所述抗體定位補體的能力。這 種方法在Bodmer等人的PCT申請公佈WO 94/29351中有 更詳細的描述。 在又另一實例中’爲了提高所述抗體介導抗體依賴性 細胞毒性（ADCC)的能力和/或提高所述抗體對FcY受體的 親和力，藉由修飾下列位置的一或多個胺基酸對Fc區域 進行了修飾：238、 239、 248、 249、 252、 254、 255、 256 -61 - 200938223 、258 ' 265 、 267、 268 ' 269、 270 ' 272 、 276 ' 278、 280 、283 ' 285 、 286 ' 289、 290 ' 292 、 293 、 294、 295、 296 、298 、 301 ' 3 03、 3 05、 307、 309 、 312 、 315 ' 320 ' 322 、324 ' 326 、 327、 329 ' 330、 331' 333 ' 334、 3 3 5 ' 337 、338 、 340 ' 360 ' 3 73、 3 76 ' 378 、 382 、 3 88 ' 389、 398 、414 、 416 、 419 、 430 、 434 、 435 ' 437 、 438 或 439 ° 這 種方法在Presta的PCT申請公佈WO 00/42072有更詳細 的描述。此外，還做出了人類IgGl對FcYRl、FcyRII、 FcyRIE和FcRn的結合位點的圖譜，並描述了具有改進的 結合能力的變體（參見Shields，R.L. ei α/. (2001 ) «/·以〇厂 Chem. 276:6591 -6604)° 已證明在 256、 290、298、 3 33、 3 34和3 3 9位置的具體突變能夠改進對FcYRDI的結合能力 。另外，已證明下列組合突變能夠改進對fc τ Rm的結合 能力：T256A/S298A 、 S298A/E333A 、 S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A 。 在又一實施方案中，如美國臨時申請No. 60/957,271 (其全部內容藉由引用結合在此）所說明，藉由引入一半胱 氨酸殘基來修飾本發明之抗體的C末端。該修飾包括但不 限於在全長重鏈序列的C端處或附近取代現有的胺基酸殘 基，以及將一包含半胱氨酸的延長序列（extension)引入至 全長重鏈序列的C端。在優選的實施方案中，包含半胱氨 酸的延長序列包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸（從N端 至C端）。 在又另一實施方案中，如美國臨時申請 No. -62- 200938223 60/95 7,27 1 (該文獻全文以援引的方式納入本文）所述，藉 由引入一半胱氨酸殘基對本發明抗體的C末端進行了修飾 。這類修飾包括但不限於：替換全長重鏈序列的C末端或 其附近的原有一胺基酸殘基，以及在全長重鏈序列的C末 端引入一含有半胱氨酸的延長序列（extension)。在優選的 實施方案中，含有半胱氨酸的延長序列包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸（從N末端至C末端）。 ^ 在優選的實施方案中，這類C末端半胱氨酸修飾的 存在爲伴體分子的共軛提供了位點，所述伴體分子例如一 治療劑或標記物分子。具體而言，因爲C末端半胱氨酸修 飾而出現的反應活性锍基基團可被用於藉由二硫鍵與伴體 分子相共鈪，這將在下文詳述。所述抗體與伴體分子的這 種方式的共轭使得可以增強對連接的具體位點的控制。此 外，藉由在C末端或其附近引入連接位點更優化了共軛， 因爲這樣能夠減少或者消除共軛對於抗體的功能屬性的幹 Q 擾，並且更便於對共軛物進行分析和質量控制。 在又另一實施方案中，對抗體的糖基化進行了修飾。 例如，可以製備一去糖基化的抗體（即所述抗體沒有被糖 基化）。可以藉由例如提高所述抗體對抗原的親和力來改 變糖基化。例如可以藉由在抗體序列中改變一或多個糖基 化的位點來實現這類糖基化修飾。例如，可以進行一或多 個胺基酸的置換，從而除去一或多個可變區框架中的糖基 化位點，由此在該位點消除糖基化。這類糖基化能夠提高 所述抗體對抗原的親和力。這類方法在Co等人的美國專 -63- 200938223 利No. 5，714,350和6,350，861中有更詳細的描述。下述文 獻還描述了另外一些改變糖基化的方法：Hanai等人的美 國專利 7,2 14,775、Presta 的美國專利 No_ 6,737,056、 Presta的美國專利公佈No. 20070020260、Dickey等人的 PCT申請公佈No. WO/2007/084926、Zhu等人的PCT申請 公佈No. WO/2006/089294和Ravetch等人的PCT申請公 佈No. WO/2007/0 55916，上述文獻的每一篇都以援引的方 式全文納入本文。
作爲附加的或替代的手段，可以製備具有改變的糖基 化類型的抗體，例如具有較少的岩藻糖殘基含量的低岩藻 糖化抗體或具有增加的二等分GlcNac結構的抗體。已證 實這種這種改變的糖基化類型能提高抗體的ADCC能力。 例如可以在具有改變的糖基化機制的宿主細胞中表現所述 抗體來實現這類糖基化修飾。具有改變的糖基化機制的細 胞在本領域中係已知的，並可被用作表現本發明的重組抗 體的宿主細胞，由此產生具有改變的糖基化的抗體。例如 ，Ms7 04、Ms705和Ms709細胞系缺乏岩藻糖基轉移酶基 因FUT8(a(l,6)岩藻糖轉移酶），因此在Ms704、Ms705和 Ms709細胞系中表現的抗體的糖基中就沒有岩藻糖。 Ms704、Ms70 5和Ms709 FUT8_/_細胞系係藉由使用兩種替 換載體對CHO/DG44細胞中的FUT8基因進行靶向破壞之 後產生的（參見 Yamane 等人的美國專利公佈 No. 200401 1 0704 和 Yamane- Ohnuki et al. (2004) Biot e chnol 5/oe/ig 87:6 1 4-22)。作爲另一實例，Hanai 等人的 EP 200938223 1，1 76,1 95描述了一帶有被功能性破壞的FUT8基因的細胞 系’由於FUT8基因編碼岩藻糖基轉移酶，因此藉由減少 或消除了 al,6鍵相關的酶就使得在這種細胞系中表現的 抗體表現出低岩藻糖化。Hanai等人還描述了這樣一細胞 系，它具有較低的用於將岩藻糖添加至結合抗體的Fc區 域的N-乙醯基葡糖胺的酶活性，或者不具有該酶活性， 這種細胞系的實例爲大鼠骨髓瘤細胞系 YB2/0(ATCC CRL ❹ 1662)。Pre st a 的 PCT 申請公佈 WO 03/0 35835 描述 了一變 體 CHO細胞系 Lecl3，該細胞系將岩藻糖加成到與 A sn(2 9 7)相連的糖基上的能力較低，這也能導致在該宿主 細胞系中表現的抗體的低岩藻糖化（還可參見Shields，R.L. et al. (2 0 02) J. Biol. Chem. 2 7 7 :2673 3 -26740)。Umana 等 人的PCT申請公佈WO 99/54342描述了一經過工程處理 而表現糖蛋白改變的糖基轉移酶（例如，β(1,4)-Ν-乙醯葡 萄糖胺基轉移酶HI (GnTIH ))的細胞系，在這種經過工程處 ❹ 理的細胞系中表現的抗體具有增多的二等分GlcNac結構 ’這可導致抗體的ADCC活性提高（還可參見Umana d α/. (1999) ⑴〇 red 17:176-180)。作爲替代，可以使用岩 藻糖苷酶切去所述抗體的岩藻糖殘基。例如，岩藻糖苷酶 α-L-岩藻糖苷酶能夠從抗體上切去岩藻糖殘基（Tarentino, A . L . et al. (1975) Biochem. 14:5516-23)。 作爲附加的或替代的手段，可以製備具有改變的糖基 化類型的抗體，其中改變涉及所述抗體的唾液酸化水準。 這類改變在 Dickey 等人的 PCT 申請公佈 No. -65- 200938223 WO/2007/084926 和 Ravetch 等人的 PCT 申請公佈 No. WO/2007/0559 1 6中有所描述，上述兩篇文獻均以援引的 方式全文納入本文。例如，可以使用例如 Arthrobacter ureafacens唾液酸酶的唾液酸酶來進行酶反應。這類反應 的條件綜述於美國專利No. 5,831,077中，該文獻以援引 的方式全文納入本文。合適的酶的其他非限制性實例爲神 經氨酸酶和N -糖苷酶F，它們分別描述於Schloemer ei α/.，15(4)，8 82-893 ( 1 975)和 Leibiger e，αΓ, «/·，3 3 8，529-538 (1 999)中。去唾液酸化的抗體可 以藉由親和色譜被進一步純化。作爲替代，可以藉由使用 例如唾液酸轉移酶的方法來提高唾液酸化的水準。這類反 應的條件總體上如 Basset a/·, ScflwdinaWflw JowrAia/ 〇/ Immunology, 5 1 (3 ), 3 07-3 1 1 (2 000)所說明。 本發明還考慮到的抗體的另一修飾類型爲聚乙二醇化 。對一抗體進行聚乙二醇化可以例如增加所述抗體的生物 半衰期（例如血清半衰期）。爲了對抗體進行聚乙二醇化， 通常在能夠使得一或多個聚乙二醇（PEG)基團連接到所述 抗體或抗體片段的反應條件下，將所述抗體或抗體片段與 PEG反應，例如與PEG的反應活性酯類或醛類衍生物反應 。優選地，使用反應活性的PEG分子（或類似的具有反應 活性的水溶性聚合物），藉由醯基化反應或烷基化反應來 進行聚乙二醇化。本文中所使用的，術語“聚乙二醇”意在 涵蓋可用於衍生其他蛋白的PEG的任一形式，例如單（C 1 -C10)烷氧基聚乙二醇或（C1-C10)芳基氧基聚乙二醇或聚乙 200938223 二醇-馬來醯亞胺。在某些實施方案中’用於有待聚乙二 醇化的所述抗體爲未被糖基化的抗體。對蛋白質進行聚乙 二醇化的方法爲本領域中已知的，並可應用於本發明之抗 體。參見例如，Nishimura等人的 EP 0 154 316和
Ishikawa 等人的 EP 0 401 384。 抗體片段和抗體模擬物 本文公開的本發明並不限於常規的抗體例如抗原結合 部分，可以藉由使用抗體片段（antibody fragment)和抗 體模擬物進行實踐。如今已經開發了多種抗體片段和抗體 模擬物技術，且這些技術在現有技術中係廣泛公知的。 單域抗體（domain antibody，dAb)係抗體的最小功能結 合單位，分子量約爲13 kDa，相當於抗體的重鏈（VH)或輕 鏈（VL)的可變區。關於單域抗體及其製造方法的更多的細 節可在 US 6,291，158 ; 6,582,91 5 ; 6,593,08 1 ; 6，172，197 ；和 6,696,245 ； US 2004/0110941 ； EP 1433846 、 0368684 和 061 6640 ； WO 2005/035572 、 2004/1 01 790 、 2004/081026、 2004/058821、 2004/003019 和 2003/002609 中找到，其全部內容均藉由引用結合在此。 納米抗體係包含天然重鏈抗體的獨特結構及功能性質 的源自抗體的蛋白質。這些重鏈抗體包括單一可變區 (VHH)和兩個恆定區（CH2和CH3)。重要的是，選殖並分 離的VHH區係攜帶原始重鏈抗體的全部抗原結合能力的 穩定多狀。納米抗體對人抗體的VH區具有高同源性，可 -67- 200938223 進一步人源化而不會損失任何活性。重要的是，納米抗體 具有較低的免疫原潛力。 納米抗體將傳統抗體的優點與小分子藥物的重要特徵 相結合。與傳統抗體類似，納米抗體顯示出很高的靶特異 性和親和性及較低的固有毒性。此外，納米抗體極爲穩定 ，可以藉由注射之外的方法施用（例如，參見 WO 2004/041 86 7)，並且易於製造。納米抗體的其他優點包括 由於其尺寸小而能夠識別罕見的或隱藏的抗原決定位，由 於其獨特的三維、藥物形式的靈活性所致而以高親和性和 選擇性結合入蛋白靶的空腔或活性位點、適應藥物發現的 半衰期和容易性及速度。 納米抗體被單基因編碼，並在幾乎全部的原核宿主和 真核宿主中被有效製造，所述宿主例如爲大腸桿菌（E. coli)(例如，參見US 6,765,087，其全部內容藉由引用結 合在此）、黴菌（例如曲黴菌或木黴 (7>k/i〇i/erwa))和酵母（例如酵母菌屬（iSacc/iarow少ce5)、 克魯維酵母（尺/MjveromyceO、漢遜酵母或畢赤 酵母（Picft/α))(例如，參見US 6,83 8,254，其全部內容藉 由引用結合在此）。 納米選殖方法（例如，參見WO 06/079372，其全部內 容藉由引用結合在此）基於B細胞的自動高通量選擇產生 抗所需靶的納米抗體，並且能夠在本發明中應用。
UniBodies係另一抗體片段技術，基於移除IgG4抗體 的鉸鏈區。刪除鉸鏈區得到基本上爲傳統IgG4抗體一半 200938223 尺寸的分子，並且該分子具有單價結合區而非二價結合區 。此外，因爲UniBodies較小，因此它們可以在較大的實 體瘤上顯示出更好的分佈，具有潛在的有利功效。關於 UniBodies的更多細節可藉由參考WO 2007/059782而獲得 ，其全部內容藉由引用結合在此。
Affibody分子係高親和力蛋白，基於來自葡萄球菌蛋 白A的三螺旋束IgG結合功能域的58胺基酸殘基蛋白域 q 。該域已被用作構建組合職菌體文庫（combinatorial
phagemid library)的框架，使用職菌體展示技術可由此選 擇針對目標靶分子 Affibody 變體（Nord et al·, Nat Biotechnol 1 99 7 ； 15 ： 7 72-7 ； Ronmark et al., Eur J
Biochem 2002; 269: 2647-55)。Affibody 分子的簡單堅固 結構和低分子量（6 kDa)使得它們適於各種廣泛的用途，如 受體相互作用的檢測試劑和抑制劑。關於Affibody的更多 的細節可在US 5,831,012中找到，其全部內容藉由引用結 φ 合在此。標記的Affibody在用於檢測同種型的豐度的成像 應用中也係有用的。 DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein » DARPin) 體現了 DRP (Designed Repeat Protein)抗體模擬技術，該 技術利用非抗體多肽的結合能力。重複蛋白，例如錨蛋白 和富含亮氨酸的重複蛋白，係普遍存在的結合分子，與抗 體不同，其出現在細胞內和細胞外。它們獨特的模組結構 以重複結構單元（重複子）爲特徵，這些單元堆疊在一起以 形成展示可變的、模組靶結合表面的伸長的延長重複域。 -69- 200938223 基於該模組性，可以生成具有高度多樣性的結合特異性的 多肽的組合文庫。該策略包括對展示可變表面殘基自交親 和重複序列（self-compatible repeat)的共有設計和將它們 隨意組裝進重複域中。關於DARPin和其他DRP技術的更 多資訊可以在US 2004/0132028和WO 02/20565中找到， 其全部內容均藉由引用結合在此。
Anticalins係另一抗體模擬技術。在該情況中，結合 特異性源自脂質運載蛋白，其屬於在人體組織和體液中天 然地豐富地表現的一低分子量蛋白家族。脂質運載蛋白 已經發展而在體內執行與生理運輸和化學敏感或不溶化合 物的存儲有關的各種功能。脂質運載蛋白具有堅固的內 部結構，其包括在蛋白質的一端支持四個環（loop )的高 度保守的β-桶。這些環形成結合口袋的入口，並且分子在 這一部分的構象差異解釋了各個脂質運載蛋白之間的結 合特異性的變化。 儘管由保守的片狀結構支援的超可變環的整體結構 能夠讓人聯想起免疫球蛋白，然而脂質運載蛋白與抗體 在大小上存在顯著差異，其由1 60- 1 80個胺基酸的單一多 肽鏈構成，在邊緣上大於單一的免疫球蛋白結構。 可以選殖脂質運載蛋白，將它們的環改造以產生 Anticalin。結構多樣性的 Anticalin文庫已經生成， Anticalin的展示允許對結合功能進行選擇和篩查，隨後原 核或真核體系中表現和生成可溶蛋白質以進行進一步的分 析。硏究表明Anticalin可以被開發使它們對於幾乎任何 200938223 人類靶蛋白都具有特異性並且可以獲得納摩爾或更高範圍 內的親緣。關於 Anticalin的其他資訊可以在 US 7,250,297和WO 99/ 1 6 8 73中找到，其全部內容均藉由引 用結合在此。
Avimers係另一類型的可用於本發明之抗體模擬技術 。Avimers由人細胞外受體域的大家族藉由體外的外顯子 重排和噬菌體展示發展而來，產生具有結合和抑制性質的 多域蛋白。連接多重獨立結合功能域已經顯示出產生親和 力，與傳統的單抗原決定位結合蛋白比較，其具有提高的 親和性和特異性。其他潛在的優點包括在大腸桿菌中簡單 且有效地生成多靶特異性分子，提高熱穩定性和對蛋白酶 的抵抗力。已經得到了針對各種靶的具有亞納摩爾親和性 的 Avimers。關於 Avimers 的其他資訊可在 US 2006/0286603 、 2006/0234299 、 2006/0223114 、 2006/0177831 、 2006/0008844 、 2005/0221384 、 2005/0164301 、 2005/0089932 、 2005/0053973 、 2005/00485 1 2、2004/01 75756中找到，其全部內容均藉由 引用結合在此。
Versabodies係另一可用於本發明之抗體模擬技術。 \^^81)〇(1丨68係具有大於15%的半腕氨酸的小分子蛋白（3-5 kDa)，其形成高密度二硫化物密度構架結構來替代典型蛋 白質所具有的疏水核。這種替代使得蛋白質分子更小且更 加親水（即，不易發生凝集和非特異性結合），對於熱和蛋 白酶具有更大的抵抗力’具有較低密度的T細胞抗原決定 -71 - 200938223 位元，這係因爲對MHC的呈遞貢獻最多的殘基係疏水性 的。這些性質眾所周知會影響免疫原性’而且預期它們會 大幅度降低免疫原性。 由於Versabodies的結構，這些抗體類比物提供了包 括多價、多特異性、多樣化的半衰期機理、組織靶模組和 抗體Fc區域的空缺等多種形式。此外，Versabodies可以 從E.大腸桿菌中以高產率獲得’由於它門的親水性和小尺 寸，Versabodies高度可溶，能夠以高濃度配製。 Versabodies極具熱穩定性，並具有長的保質期。關於 Versabodies的更多資訊可在US 200 7/0 191272中找到，其 全部內容藉由引用結合在此。 以上關於抗體片段和模擬技術的說明無意於太過廣泛 。各種其他的技術，包括基於選擇性多肽的技術’如Qui et al.(Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007))槪述的 互補決定區的融合，以及基於核酸的技術，如 US 5,789,157 ； 5,864,026 ； 5,712,375 ； 5,763,566 ； 6,013,443 ；6,376,474 ； 6,613,526 ； 6,114,120 ； 6,261,774 和 6,387,620中說明的RNA核酸適體技術都可用於本發明， 這些文獻均藉由引用結合在此。 抗體的物理屬性 本發明中所使用的抗體的特徵在於具有多種物理屬性 所述抗體可在VL或VH含有一或多個糖基化位點這可 -72- 200938223 導致所述抗體的免疫原性增高，或 ρΚ値發生變化 (Marshall e t al (19 7 2) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94 ； Wallick et al ( 1 988) J Exp Med 168:1099-109 ； Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R ； Parekh et al (1 985) Nature 3 1 6:452-7 ； Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化會發生在含有N-X-S/T序列的基 q 序中。可以使用Glycoblot測試來檢測可變區的糖基化， 在該測試中所述抗體被切割產生一 Fab，然後使用測量高 碘酸鹽氧化和Schiff城形成的一測試來檢測糖基化。或者 ，可以使用Dionex光色譜（Dionex-LC)來檢測可變區的糖 基化，在該測試中將一 Fab上的糖切割爲單糖並分析每種 糖的含量。在某些情況下，優選使用一不具有可變區糖基 化的抗體。這可以藉由篩選在可變區中不含有糖基化基序 的抗體，或者藉由使用標準技術突變糖基化基序中的殘基 Q 來實現。 在一優選的實施方案中，本披露的抗體不含有天（門） 冬醯胺同分異構位點。在N - G序列或D - G序列上有可能 發生天（門）冬醯胺的脫醯胺反應，並導致生成一異天冬氨 酸殘基，這會在多肽鏈上生成纏繞結構從而降低抗體的穩 定性（異天冬氨酸效應）。可以藉由使用反相HPLC測試（等 量測定）來測試異天冬氨酸的產生。 每種抗體都具有獨特的等電點（P1)’但係通常都落在 pH6至9.5的範圍內。IgGl抗體的pi通常落在PH7-9.5的 -73- 200938223 範圍內，IgG4抗體的pi通常落在pH6-8的範圍內。推測 pi在上述範圍之外的抗體在體內可能會解折疊（ unfolding)而不穩定。因此，優選使用一 pi値落在正常 範圍內的抗PTK7抗體。這可以藉由篩選pi値在正常範圍 內的抗體或者藉由突變帶電的表面殘基來實現。 每種抗體都有特徵性的熔點，熔點越高表明抗體在體 內的總體穩定性越好（Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Cwrr P/jflrw 5ioiec/iwo/ 3:361-71)。較高的熱穩定 性表明抗體在體內的總體穩定性較好。通常，優選地TM i ( 開始解折疊的溫度）大於6(TC，優選地大於65°C，甚至更 優選地大於7〇 °C。可以使用例如差示掃描量熱法（Chen ei al (2003) P harm Res 20:1952-60 ； Ghirlando e t a l (1999) Zeii 6 8:47-5 2)或者圓二色性（Murray α/. (2002) ·/_ Chomwogr Sci 40:343-9)來測量抗體的熔點。 在一優選的實施方案中，選擇不會快速降解的抗體。 可以使用本領域公知的毛細管電泳（C E)和M A L D I - M S來測 量抗 ΡΤΚ7 抗體的片段化（Alexander AJ and Hughes DE ( 1 995) C/iew 67:3 626-3 2)。 在另一優選的實施方案中，選擇具有儘量少的聚集作 用的抗體，聚集可能導致引發不需要的免疫反應和/或變 化的或不良的藥物動力學屬性。通常，可接受的抗體的聚 集度爲25%或更低，優選地20%或更低，甚至更優選地爲 1 5 %或更低，甚至更優選地爲1 0 %或更低，甚至更優選地 爲5 %或更低。可以使用多種技術來測量聚集，所述技術 -74- 200938223 包括尺寸排阻柱（SEC)、高效液相色譜（HPLC)和光散射法 工程處理抗體的方法 如上所述’可以藉由改造VH和/或Vk序列或其毗連的 恆定區的方式，使用具有本文公開的VH和vk序列的抗 PTK7抗體來產生新的抗PTK7抗體。因此，在本發明的另 φ —方面，使用了本發明的抗PTK7抗體例如3G8、3G8a、 4D5、12C6、12C6a或7C8的結構特徵，用於產生結構相 關的抗PTK7抗體，所述新產生的抗體保留了本發明抗體 的至少一種功能屬性，例如可結合人類PTK7。例如如上 文所述，可以將例如3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或 7C8的一或多個CDr區或其突變體與已知的框架區和/或 其他CDR重組組合，以產生另外的重組工程化的本發明 抗PTK7抗體。其他類型的修飾包括上文所述的那些修飾 © 。用於工程處理方法的起始材料爲本文提供的一或多個 VH和/或Vk序列或其一或多個CDR區。爲產生工程化的 抗體’實際上不係必須製備一具有本文提供的一或多個 νΗ和/或vk序列或其一或多個CDR區的抗體（即不必表現 爲蛋白形式）。而只係使用其序列中含有的資訊作爲起始 材料’就能由原始序列生成一“第二代，，序列，然後再製備 這種“第二代，，序列並將其表現爲蛋白。 因此’在另一實施方案中，本發明提供了一製備抗 pTK7抗體的方法，包括： -75- 200938223 (a) 提供：（i)一重鏈可變區抗體序列，所述重鏈可變 區抗體序列包括一選自SEQ ID NO: 11、12、13和14的 CDR1 序列、一選自 SEQ ID NO : 15、16、17 和 18 的 CDR2序列和/或一選自SEQ ID NO: 19、20、21和22的 CDR3序列；和/或（ii)一輕鏈可變區抗體序列’所述輕鏈 可變區抗體序列包括一選自SEQ ID NO : 23、24、25、26 、27 和 28 的 CDR1 序列、一選自 SEQ ID NO: 29、30、 31、32、33和34的CDR2序列和/或一選自SEQ ID NO: 35、36、37、38、39 和 40 的 CDR3 序列； (b) 改變所述重鏈可變區抗體序列和/或所述輕鏈可變 區抗體序列中的至少一胺基酸殘基，以產生至少一改變的 抗體序列；以及 (c) 將所述改變的抗體序列表現爲一蛋白。 幾種或全部功能屬性，所述功能屬性包括但不限於： (a) 所述抗體與人類PTK7結合的KD爲lxl(T7 Μ或 更低； (b) 所述抗可以使用標準的分子生物學技術來製備和 表現所述改變的抗體序列。 優選地，由改變的抗體序列編碼的所述抗體保留了本 文所述的抗PTK 7抗體的一、體能結合Wilms’腫瘤細胞系 〇 可以使用本領域已知的標準技術和/或本文所述的技 術（例如實例中所述的技術，例如流式細胞術和結合測定） 來測試所述改變的抗體的功能屬性。 -76- 200938223 在本發明的工程處理抗體的方法的某些實施方案中， 可以在抗PTK7抗體編碼序列的全長或一部分中隨機地或 選擇性地引入突變，並篩選所得的經改造的抗PTK7抗體 的結合活性和/或本文所述的其他屬性。突變方法在本領 域中已有記載。例如，Short的 PCT申請公佈 WO 02/092780描述了使用飽和誘變、合成連接或其組合方法 來生成和篩選抗體突變的方法。或者，Lazar等人的PCT 申請公佈W0 03/074679描述了使用計算篩選來優化抗體 的生理化學屬性的方法。 編碼本發明抗體的核酸分子 本發明的另一方面涉及編碼本發明之抗體的核酸分子 。所述核酸可以存在於完整細胞或細胞裂解液中，或者以 部分純化的形式或大體上純的形式存在。如果藉由標準技 術將核酸從其他細胞組分或其他污染物（例如其他的細胞 核酸或蛋白）純化，那麼所述核酸係“分離的”或“使得大 體上純的”，所述標準技術包括城/SDS處理，CsCl成帶、 柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及本領域的其他公知技術。見F . Ausubel 等人編著.（1987) Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Inter science, New York。本發明的核酸可以係例如DNA或RNA，並且可以 包含或不包含內含子序列。在一優選的實施方案中，所述 核酸爲cDNA分子。 可以使用標準的分子生物學技術獲得本發明的核酸。 -77- 200938223 對於雜交瘤表現的抗體（例如從下文進一步描述的攜帶人 免疫球蛋白基因的轉基因小鼠製備的雜交瘤）’可以藉由 標準的PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼雜交瘤製備抗 體的輕鏈和重鏈的cDNA。對於從免疫球蛋白基因文庫中 獲得的抗體（例如使用噬菌體展示技術）’可以從所述文 庫回收編碼所述抗體的核酸。 本發明優選那些編碼 3G8、3G8a、4D5、12C6、 12C6a或7C8單選殖抗體的VH和VL序列的核酸分子。編 碼 3G8、3G8a' 4D5、12C6 > 12C6a 和 7C8 的 VH 序列的 DNA序列分別顯示於 SEQ ID NO : 41(3G8和 3G8a)、 42(4D5)、43(12C6 和 12C6a)和 44(7C8)。編碼 3G8、3G8a 、4D5、12C6、12C6a和7C8的VL序列的DNA序列分別 顯示於 SEQ IDNO: 45、46、47、48、49 和 50 中。 一旦獲得了編碼Vh和VL區段的DNA片段，那麼可 以藉由標準的重組DNA技術進一步操作這些DNA片段， 例如將可變區基因轉變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因 或scFv基因。在這些操作中，編碼VL或VH的DNA片段 有效地連接至另一條編碼其他蛋白的DNA片段例如抗體 恆定區或柔性連接子（flexible linker)。本文使用的術語 “有效連接”意指所述兩條DNA片段被連接起來，使得所 述兩條DNA片段編碼的胺基酸序列保持在閱讀框內。 可以藉由將分離出的編碼VH的DNA有效連接至另一 編碼重鏈恆定區（CHI、CH2和CH3 )的DNA分子，將編 碼Vh區的分離DNA轉化成全長重鏈基因。所述人重鏈假 200938223 定區基因的序列在本領域中係已知的（見例如Kabat, Ε· A,, el al. (19 9 1) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242 )，並且藉由標準 的PC R擴增可以獲得涵蓋這些區域的DNA片段。所述重 鏈恆定區可以爲 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、 IgM或IgD恆定區，但最優選爲IgGl或IgG4恆定區。對 於Fab重鏈基因，所述編碼VH的DNA可以有效地連接至 另一僅編碼重鏈CH1恆定區的DNA分子。 可以藉由將分離出的編碼Vl的DNA有效連接至另一 編碼輕鏈恆定區Cl的DN A分子，將所述編碼VL區的分 離DNA轉化成全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。所 述人輕鏈恆定區基因的序列在本領域中係已知的（見例如 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，並且藉由標準的PCR擴增可以獲得涵蓋這些區域 的DNA片段。所述輕鏈恆定區可以爲κ或λ恆定區，但 最優選爲κ恆定區。 爲產生scFv基因，VH-和VL-編碼DNA片段可有效 地連接另一條編碼柔性連接基團的片段，如編碼胺基酸序 列（Gly4-Ser3)，以使VL和Vh序列可表現爲相鄰的單鏈蛋 白，其中VH和VL區域藉由柔性連接基團連接（例如，參 見 Bird et al.( 1 988) Science 242 ： 423-426 ; Huston et -79- 200938223 al.( 1 98 8) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 ： 5 879 -5 8 8 3 ； McCafferty et al., ( 1 990) Nature 3 48 ： 552-554) ° 產生本發明的單選殖抗體 可以藉由多種技術產生本發明的單選殖抗體（mAb ) ，所述技術包括常規的單選殖抗體方法例如Kohler and Milstein ( 1 975) 256: 495的標準體細胞雜交技術。 雖然優選體細胞雜交法，但係在原理上可以應用其他用於 產生單選殖抗體的技術，例如B淋巴細胞的病毒性轉化或 致癌性轉化。 用於製備雜交瘤的優選的動物系統係鼠類系統。在小 鼠中產生雜交瘤係公知的方法。用於分離用於融合的被免 疫的脾細胞的免疫方案和技術在本領域中係已知的。用於 融合的細胞（例如鼠骨髓瘤細胞）和融合方法也係已知的 〇 可以基於上文的描述製備的鼠類單選殖抗體的序列， 製備本發明的嵌合抗體或人源化抗體。從所關注的鼠類雜 交瘤可以獲得編碼所述重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA，並 且使用標準的分子生物學技術可以對其進行設計以包含非 鼠（例如人）免疫球蛋白序列。例如，爲了形成嵌合抗體 ’可以使用本領域中已知的方法（見例如Cabilly等人的 美國專利No. 4,8 1 6,567 )將鼠可變區連接至人恆定區。爲 了形成人源化抗體，可以使用本領域中已知的方法（見例 如Winter的美國專利No. 5,225,539的，以及Queen等 200938223 人的美國專利 No. 5,530,1 0 1 ; 5,585,089 ; 5,693,762 和 6，1 80,370 )將鼠CDR區插入至人的框架中。 在一優選的實施方案中，本發明之抗體係人單選殖抗 體。使用攜帶部分人免疫系統而不係小鼠系統的轉基因小 鼠或轉染色體小鼠，可以產生這類人PTK7的人單選殖抗 體。這些轉基因小鼠或轉染色體小鼠包括本文分別稱爲 HuMAb小鼠和KM miceTM的小鼠，它們在本文中統稱爲“ 人I g小鼠”。 所述 HuMAb mouse® (Medarex, Inc.)含有編碼非重 排的人重鏈（μ和γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫 球蛋白基因微位點，並含有使內源性μ和κ鏈位點失活的 定向突變（見例如 Lonberg， et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859 )。因此，所述小鼠表現出小鼠 IgM 或κ表現降低，並且所述引入的人重鏈和輕鏈轉基因在免 疫反應中經過類別轉換和體細胞突變以產生高度親和的人 IgGK 單選殖（Lonberg，N. War/· (19 94)，見上文；綜述見 Lonberg， N. (1 9 9 4) Handbook of Experimental
Pharmacology 1 13:49-101 ； Lonberg, N. and Huszar, D. (1 9 9 5) /w r w· /?e v. //w m wηo /. 1 3 : 6 5 - 9 3，和 H ar ding，F . and Lonberg, N. (1 9 9 5) Ann. N. Y. Acad· Sci · 764:536-546 )。HuMAb小鼠的製備和用途以及這種小鼠攜帶的基因 組修飾還記載於 Taylor，L· " a/. (1992) 7Vwc/e/c
Research 20:6287-6295; Chen， J. et al. ( 1 9 9 3)
International Immunology 5: 647-656; T uaillon e t al. -81 - 200938223 (1 993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 0:3720-3724; Choi et al. ( 1 993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. ( 1 993 ) EMBO J. 1 2: 82 1 -83 0; Tuaillon et al. ( 1 994) J.
Immunol · 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (19 94)
International Immunology 6: 5 7 9-591;和 Fishwild, D. et a/· (1996) iVaii/re 14: 845-851，所有這些文
獻的全文藉由引用的方式明確地納入本文。還可參見均爲 Lonberg 和 Kay 的美國專利 No. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,789,650 ； 5,877,397 ； 5,661,016 ;5,814,318; 5,874,299;和 5,770,429; Surani 等人的美 國專利No. 5,545,807; Lonberg和Kay的PCT申請公佈 WO 92/03 9 1 8, WO 93/1 2227, WO 94/255 85, WO 97/1 3852, WO 98/24884 和 WO 99/45962 ;以及 Korman 等人的 PCT 申請公佈WO 01/14424。
在另一實施方案中，可以使用在轉基因和轉染色體上 攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠生產本發明的人抗體，所述 小鼠例如係攜帶人重鏈轉基因和人輕鏈轉染色體的小鼠。 這類小鼠在本文中被稱爲“KM miceTM”，並詳細記載於 Ishida 等人的PCT申請公佈WO 02/4 3478中。 再者，替代性的表現人免疫球蛋白基因的轉基因動物 系統在現有技術中係可用的，並可用於生產本發明的 PTK7抗體。例如，可以使用另一被稱作 Xenomouse ( Abgenix, Inc.)轉基因系統；這種小鼠記載於例如 Kucherlapat 等人的美國專利 No. 5,939,598 ; 6,075，181 ; -82- 200938223 6,114,598; 6,150,584 和 6,162,963 中。 而且’替代性的表現人免疫球蛋白基因的轉染色體動 物系統在現有技術中係可用的，並可用於生產本發明的 PTK7抗體。例如，可以使用另一種被稱作“TC小鼠”並同 時攜帶人重鏈轉染色體和人輕鏈轉染色體的小鼠；這種小 鼠§己載於 T omizuka e t al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sc i. iASJ 97:722-727中。再者，攜帶人重鏈和輕鏈轉染色體的 母牛在現有技術（Kuroiwa ei α/. (2002) Να ture
Bioiec/zwo/ogy 20:889-894 )中有記載，並且可用於生產本 發明的PTK7抗體。 也可以藉由用於篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體 展示方法製備本發明的人單選殖抗體。這種噬菌體展示方 法用於分離人抗體係現有技術中已知的。見例如Ladner 等人的美國專利 No. 5,223,409 ; 5,403,484;和 5,57 1,698 ;Dower 等人的美國專利 No. 5,427,908 和 5,5 80,7 1 7; McCafferty 等人的美國專利 No. 5,969，108 和 6，172，197 ;Griffiths 等人的美國專利 No. 5,885,793 ; 6,521,404 ; 6,544,731 ; 6,555,313 ; 6,582,915 和 6,593,081。 也可以使用這樣的SCID小鼠製備本發明的人單選殖 抗體，即其體內已重建了人免疫細胞’使得在免疫時產生 人抗體反應。這種小鼠記載於例如Wilson等人的美國專 利 No. 5,476,996 和 5,698,767 中。 在另一實施方案中，可以使用如Buechler ei 的美 國專利No. 6,794,132中描述的人Ig小鼠和噬菌體展示技 -83 200938223 術的結合製備人ΡΤΚ 7抗體。更具體地，該方法首先包括 藉由用一或多種ΡΤΚ7抗原免疫人Ig小鼠（例如上述的 HuMab小鼠或KM小鼠），在所述小鼠中形成PTK7抗體 反應，隨後從所述小鼠的淋巴細胞中分離編碼人抗體鏈的 核酸，然後將這些核酸導入展示載體（例如噬菌體）中以 提供展示包裝體（display package)文庫。因此，每個文 庫成員包含編碼一人抗體鏈的核酸並且每種抗體鏈藉由所 述展示包裝體展示。然後用PTK7蛋白篩選所述文庫以分 離與PTK7特異性結合的文庫成員。然後將所選文庫成員 中插入的核酸分離並藉由標準的方法測序以確定所選 PTK7結合成員的輕鏈和重鏈可變序列。藉由標準的重組 DNA技術可以將所述可變區轉化成全長抗體鏈，所述技術 例如將所述可變區選殖至攜帶人重鏈和輕鏈恆定區的表現 載體中，使得所述VH區有效地連接至所述CH區並且所述 VL區有效地連接至所述Cl區。 人Ig小鼠的免疫 如果人Ig小鼠用於生產本發明的人抗體，那麼可以 用於免疫這種小鼠的抗原有：一純化的或富集的PTK 7抗 原製品和/或重組PTK7蛋白，或者PTK7融合蛋白，如 Lonberg, N. e t al. (1 994) Nature 3 6 8(6474): 8 5 6-85 9; F ishwild, D. e t al. ( 1 9 9 6) Nature Biotechnology 14: 845-851 ;以及 PCT 申請公佈 WO 98/24884 和 WO 01/14424 中 所述。優選地，所述小鼠在初次輸注時將係6 -1 6周齡。 -84- 200938223 例如，純化的或重組的PTK7抗原製品（5-50 pg )可用於 經腹腔內免疫人I g小鼠。 用於產生與PTK7結合的全長人單選殖抗體的詳細步 驟將在下文實施例1中描述。在多種抗原上積累的經驗顯 示在以下條件下轉基因小鼠會應答：用完全弗氏佐劑的抗 原進行初始腹腔內免疫（IP)，之後每隔一周用不完全弗 氏佐劑的抗原進行IP免疫（至共6次）。然而，除弗氏 g 佐劑之外的其他佐劑也顯示係有效的。另外，在不存在佐 劑的情況下全細胞顯示出高度的免疫原性。在進行免疫過 程中可以用眶後取血得到的血漿樣品監測免疫應答。藉由 ELISA (如下文所述）可以篩選所述血漿，具有足夠滴度 的抗PTK7的人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。可以在處 死並取脾之前的3天，藉由靜脈內對小鼠追加抗原。預計 對每個免疫需要進行2-3個融合。每種抗原一般免疫6-24 個小鼠。通常使用HC〇7和HC〇12兩個株。另外，可以將 φ HC〇7和HCol2兩種轉基因在一塊培育成同時具有兩種不 同的人重鏈轉基因（HCo7/HCol2 )的小鼠。此外或另外 ，可以如實施例1所述使用KM m〇UseTM株。 生成產生本發明的人單選殖抗體的雜交瘤 爲了生成產生本發明的人單選殖抗體的雜交瘤，可從 被免疫的小鼠分離脾細胞和/或淋巴結細胞並與合適的無 限增殖化細胞系例如小鼠骨髓瘤細胞系融合。可以對形成 的雜交瘤篩選抗原特性抗體的產生。例如，可以用50%的 -85- 200938223 PEG將來自免疫的小鼠脾淋巴細胞的單細胞懸液與六分之 一數量的P3X63-Ag 8.65 3非分泌型小鼠骨髓瘤細胞（ ATCC，CRL 1 5 80 )融合。作爲替代，可以使用基於電場的 電融合方法，藉由CytoPulse大腔細胞融合電穿孔儀（ large chamber cell fusion electroporator ) ( CytoPulse S c i e n c e s，I n c ·，G1 e η B u r n i e M a r y 1 a n d )融合來自被免疫的 小鼠脾淋巴細胞單細胞懸液。將大約2x1 05的細胞培養于 平底微量滴定板上，之後在如下的選擇性培養基中勝育2 周：包含 20%的胎選殖血清（fetal Clone Serum) 、18% 的 “65 3 ”條件培養液、5%的 origen ( IGEN) 、4 mM 的 L-榖氨醯胺、1 mM的丙酮酸鈉、5mM的HEPES、0.055 mM 的2-锍基乙醇、50單位/ml的青黴素、50 mg/ml鏈黴素、 5 0 mg/ml的慶大黴素和1 X HAT ( Sigma ;在融合24小時 後加入HAT)。在大約2周後，可以將細胞培養於以HT 替代HAT的培養液中。然後可以藉由ELISA篩選單個孔 中的人單選殖IgM和IgG抗體。一旦出現雜交瘤的擴大生 長，即可以通常在10-14天後觀察培養基。可以將抗體分 泌雜交瘤再培養，再次篩選，並且如果其仍然係人IgG陽 性的，那麼可以藉由有限稀釋將所述單選殖抗體亞選殖至 少2次。然後可以在體外培養穩定的亞選殖以在組織培養 液中產生少量抗體用於特徵描述。 爲了純化人單選殖抗體，可以將選擇的雜交瘤培養於 2升的旋.瓶中用於純化單選殖抗體。可以將上清液過濾並 濃縮，之後用蛋白 A-瓊脂糖（Pharmacia，Piscataway, -86- 200938223 N.J·)進行親和層析。可以藉由凝膠電泳和高效液相色譜 檢查洗脫的IgG以確保純度。可以將所述緩衝液替換爲 PBS，且藉由OD28〇使用1.43的衰竭係數（extinction coefficient)確定其濃度。可以將所述抗體分成等份，置 於-80°C下保存。 生成產生本發明的單選殖抗體的轉染瘤 U 也可以使用例如重組DNA技術和基因轉染方法的結 合’在宿主細胞轉染瘤中產生本發明之抗體，這係本領域 中公知的（例如 Morrison, S· ( 1 98 5) Science 229:1202 ) ο 例如，爲了表現所述抗體或其片段，可以藉由標準的 分子生物學技術（例如，使用表現所需抗體的雜交瘤的 PCR擴增或cDNA選殖）獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈 的DNA，並且可將所述DNA插入至表現載體中，使得所 Q 述基因有效連接至轉錄和翻譯調控序列。所述術語“有效 連接的”在本文中意指抗體基因連接至載體，使得所述載 體中的轉錄和翻譯調控序列起到調節所述抗體基因轉錄和 翻譯的預期功能。對表現載體和表現調控序列進行選擇以 與所使用的表現宿主細胞相容。可以將所述抗體輕鏈基因 和所述抗體重鏈基因插入至不同的載體中，或者更普遍係 將兩個基因插入至相同的表現載體中。藉由標準的方法（ 例如連接所述抗體基因片段和載體上的互補限制位點’或 者如果不存在限制位點進行平端連接）將所述抗體基因插 -87- 200938223 入至所述表現載體中。可以藉由以下方法將本文所述抗體 的輕鏈和重鏈可變區用於形成任何抗體同種型的全長抗體 基因：將所述輕鏈和重鏈可變區插入至已經編碼所述需要 的同種型的重鏈恆定區和輕鏈恆定區的表現載體中’使得 所述VH片段有效連接至所述載體中的CH片段且所述νκ 片段有效連接至所述載體中的CL片段。此外或替代地’ 所述重組的表現載體可以編碼有利於所述抗體鏈從宿主細 胞中分泌的一信號肽。可以將所述抗體鏈選殖至所述載體 ，使得所述信號肽在框架內連接至所述抗體鏈基因的氨基 末端。所述信號肽可以係免疫球蛋白信號肽或者異源的信 號肽（即一來自非免疫球蛋白的信號肽）。
本發明的重組表現載體除了攜帶所述抗體鏈基因之外 ，還攜帶調控所述抗體鏈基因在宿主細胞中表現的調節序 列。所述術語“調節序列”意指包括啓動子、增強子及控制 所述抗體鏈基因轉錄或翻譯的其他表現控制元件（例如多 腺苷酸化信號）。這些調節序列記載於例如Goeddel ( Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))中。本領域技術 人員應瞭解，所述表現載體的設計（包括調節序列的選擇 )可能要依賴於這樣的因素，如轉化宿主細胞的選擇、所 需的蛋白表現水準等。用於哺乳動物宿主細胞表現的調節 序列優選包括指導蛋白在哺乳動物細胞中高水準表現的病 毒的元件，例如衍生自巨細胞病毒（CMV )、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒（例如腺病毒主要晚期啓動子（AdMLP 200938223 ))和多瘤病毒的啓動子和/或增強子 非病毒調節序列，例如泛素啓動子或P-者’調節元件可由不同來源的序列組j SV40早期啓動子和I型人類T細胞白 重複的SRa啓動子系統（Takebe，Y. Cell. Biol. 8:466-472 )。 本發明的重組表現載體除了攜帶所 0 節序列之外，還可攜帶另外的序列—— 在宿主細胞中複製的序列（例如複製起 記基因。所述可選擇標記基因有利於對 體的宿主細胞的選擇（見例如Axel等 4,399,2 1 6、4,634,665 和 5，179,017)。 基因一般賦予已導入所述載體的宿主紐 、潮黴素或甲氨喋呤的抗性。優選的可 二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於E Q 的dhfr-宿主細胞中）和neo基因（用於 爲了表現所述輕鏈和重鏈，藉由標 重鏈和輕鏈的表現載體轉染至宿主細拥 染”的各種形式意涵蓋很寬範圍的多種 常用於將外源DNA導入原核的或真核 電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉 上可能在原核宿主細胞或真核宿主細胞 體，但係在真核細胞（且最優選在哺乳 表現係最優選的，這係因爲這些真核細 。或者，可以使用 珠蛋白啓動子。再 成，例如包含來自 血病病毒的長末端 et al. ( 1 988) Mol. 述抗體鏈基因和調 例如調節所述載體 始點）和可選擇標 其中已導入所述載 人的美國專利No. 例如，可選擇標記 1胞藥物例如G41 8 選擇標記基因包括 P氨喋呤選擇/擴增 G418的選擇）。 準技術將編碼所述 3中。所述術語“轉 技術，這些技術通 的宿主細胞，例如 染等。雖然在理論 中表現本發明之抗 動物宿主細胞）中 胞並且特別係哺乳 -89- 200938223 動物細胞比原核細胞更有可能組裝並分泌正確折疊且具有 免疫活性的抗體。現有技術已經報導了抗體基因的原核表 現對於大量活性抗體的產生係無效的（Boss，M. A. and Wood, C. R. ( 1 985) Immunology Today 6:12-13)。 優選的用於表現本發明的重組抗體的哺乳動物宿主細 胞包括中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）（包括dhfr CHO 細胞，言己載於 Urlaub and Chasin，（1980) ZVoc. Natl. Acad. Sci. ί/α 77:42 1 6-4220，使用一 DHFR可選擇標記物，例 如如 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (19 8 2) Mol. Biol. 159:601-621中的描述）、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和 SP2細胞。具體地，對於使用NSO骨髓瘤細胞的情況，另 —優選的表現系統係記載於 WO 87/04462、WO 89/01036 和EP 33 8,841的GS基因表現系統。如果將編碼抗體基因 的重組表現載體導入哺乳動物宿主細胞，那麼可藉由培養 所述宿主細胞一段時間產生所述抗體，所述時間足夠使所 述抗體在所述宿主細胞內表現，或者更加優選使所述抗體 分泌到培養所述宿主細胞的培養液中。可以使用標準的蛋 白純化方法從所述培養液中回收抗體。 抗體與抗原結合的表徵 可以藉由例如標準ELISA測試本發明之抗體與PTK7 的結合。簡言之，將微量滴定板用PBS中0.25pg/ml的純 化PTK7蛋白包被，然後用PBS中5%的牛血清白蛋白封 閉。在每個孔中加入稀釋的抗體（例如稀釋的PTK7免疫 200938223 小鼠血漿），並於3 7 °C下勝育1 -2小時。將所述板用 PBS/吐溫洗滌，然後用偶接至鹼性磷酸酶的二級試劑（例 如對於人抗體，山羊抗人IgG Fc的特異性多選殖抗體試 劑）於371下孵育1小時。在洗滌後，用pNPP底物（1 mg/ml )對所述板進行顯影，在OD 405-650下進行分析。 優選將形成最大滴定的小鼠用於融合。 上文描述的ELISA測定還可用於篩選與PTK7免疫原 0 顯示正反應性的雜交瘤。將以高親合力和/或高親和力結 合PTK7蛋白的雜交瘤亞選殖並進行進一步的特徵描述。 可以從每個雜交瘤選擇一保持所述母細胞活性的選殖（藉 由ELISA)，用於製備5-10小瓶細胞庫於-140°C保存，並 用於抗體純化。 爲了純化PTK7抗體，可以將選擇的雜交瘤培養於2 升的旋瓶中用於單選殖抗體純化。可以將上清液過濾並濃 縮，之後用蛋白 Α-ϊ貪脂糖（Pharmacia，Piscataway，N.J. Ο )進行親和層析。可以藉由凝膠電泳和高效液相色譜檢查 洗脫的IgG以確保純度。可以將所述緩衝液替換爲PBS， 且藉由OD28〇使用1.43的消光係數確定其濃度。可以將所 述單選殖抗體分成等份，置於-80 °C下保存。 爲了確定選擇的PTK7單選殖抗體是否結合於單一抗 原決定位，可使用市售試劑（Pierce, Rockford, IL)將每 種抗體生物素化。使用未標記的單選殖抗體和生物素化的 單選殖抗體的競爭硏究可以用上文描述的PTK7蛋白塗鋪 的ELISA板進行。可以使用鏈酶親和素-鹼性磷酸酶探針 -91 - 200938223 檢測生物素化的mAb的結合。 爲了確定純化的抗體的同種型，可以使用對特定同種 型的抗體特異的試劑進行同種型ELISA。例如，爲了確定 人單選殖抗體的同種型，可以用1 pg/ml的人免疫球蛋白 抗體於4 °C下過夜塗鋪微量滴定板的孔。用1%的BSA封 閉後，所述板與1 Rg /ml或更低的測試單選殖抗體或者純 化的同種型對照在室溫下反應1 -2小時。所述孔然後可以 與人IgGl或人IgM-特異的鹼性磷酸酶連接的探針反應。 如上文所述對板進行顯影並分析。 可以藉由蛋白質印跡法進一步測試抗PTK7的人IgG 與PTK7抗原的反應性。簡言之，可製備PTK7蛋白並進 行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳後將分離的抗原轉移 至硝酸纖維素膜上，用1 〇%的胎牛血清封閉，用待測試的 單選殖抗體進行探測。人IgG的結合可以用鹼性磷酸酶標 記的人IgG抗體檢測並用BCIP/NBT底物片顯影（Sigma Chem. Co·, St. Louis, Mo.)。 雙特異性分子 在另一方面，本發明提供了含有本發明的抗PTK7抗 體或其片段的雙特異性分子。本發明一抗體或其抗原結合 部分可被衍生化或與另一功能分子相連接，例如與另一肽 或蛋白質（例如另一抗體或受體的配體）相連接，以生成能 夠結合至少兩種結合位點或靶分子的雙特異性分子。實際 上，本發明之抗體可被衍生化或與另外多於一種的功能分 -92- 200938223 子相連接，生成能夠結合多於兩種結合位點和/或靶分子 的多特異匣分子，本文中所使用的術語“雙特異性分子，，也 意圖涵盖追類多特異性分子。爲了生成本發明的雙特異性 分子，可將本發明之抗體與—或多個其他的結合分子（例 如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物）功能性地連接（ 例如藉由化學共轭、遺傳融合、非共價連接等等），由此 得到雙特異性分子。 0 因此’本發明還包括雙特異性分子，所述雙特異性分 子含有針對PTK7的至少一種第一結合特異性和針對第二 耙向抗原決定位的第二結合特異性。在本發明的一具體實 施方案中’所述第二靶向抗原決定位爲一 Fc受體，例如 人類FcyRI(CD64)或人類Fca受體（CD89)。因此，本發明 所包括的雙特異性分子能夠結合表現FcyR或FcaR的效應 物細胞（例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞（PMN))， 也能夠結合表現PTK7蛋白的靶細胞。這些雙特異性分子 ❹ 將表現PTK7的細胞靶向至效應物細胞，並觸發Fc受體介 導的效應物細胞活性，例如，表現PTK7的細胞的吞噬作 用、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC)、細胞因數 的釋放或超氧化物負離子的生成。 在本發明的雙特異性分子爲多特異性的實施方案中， 所述分子除了含有抗-Fc結合特異性和抗PTK7結合特異 性之外，還可以含有第三種結合特異性。在一實施方案中 ，第三結合特異性係一抗增強因數（EF)部分，例如，與涉 及細胞毒素活性的表面蛋白結合由此增強針對靶細胞的免 -93- 200938223 疫應答的分子。“抗增強因數部分”可以係結合給定分子（ 如抗原或受體）’由此增強Fc受體或靶細胞抗原的結合決 定簇效果的抗體、功能抗體片段或配體。“抗增強因數部 分”可以結合Fc受體或靶細胞抗原，或者，作爲替代，“ 抗增強因數部分”可以結合與第一和第二結合特異性結合 的實體不同的實體。例如，抗增強因數部分可結合細胞毒 性 T 細胞（如，經 CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40 、ICAM-1或導致針對靶細胞的免疫應答增強的其他免疫 細胞）。 在一實施方案中，本發明的雙特異性分子包括至少一 種抗體或其一抗體片段（包括如Fab、Fab’、F(ab’）2、Fv或 一條單鏈Fv)作爲結合特異性。抗體還可以係輕鏈或重鏈 二聚物，或係其任何最小片段，如Fv或一單鏈構建體， 如 Ladner 等人的 U.S. Patent No. 4J46,778 所述，其內容 藉由引用結合在此。 在一實施方案中，Fq受體的結合特異性由單選殖抗 體提供，其結合並未被人免疫球蛋白G (IgG)所阻斷。本 文中所使用的術語“IgG受體”指的是位於1號染色體上的 任何的8γ鏈基因。這些基因編碼總共12種膜受體或可溶 性受體同種型，它們被分爲三類：FcYRI(CD64)、FcYR Π (CD32)和FcyRIE(CD16)。在一優選實施方案中，所述Fey 受體爲人類高親和力FcyRI。人類FcyRI爲一 72 kDa的 分子，它對於單體igG具有高親和力（ι〇8-ι〇9μ^)。 在Fanger等人的PCT申請公佈WO 88/00052和美國 200938223 專利No. 4,954,617中描述了某些優選的抗Fq單選殖抗 體的製備和表徵，上述文獻的教導以援引的方式完全納入 本文。這些抗體所結合的FcyRI、Fc^RII和FcrRn的抗 原決定位與FcY所結合的受體上的抗原決定位不同，因此 它們與受體的結合基本上不會被IgG的生理水準所阻礙。 可用於本發明的特異性抗FcyRI抗體爲mAb 22、mAb 32 、mAb 44' mAb 62和mAb 197。產生mAb 32的雜交瘤可 0 以獲自美國典型培養物保藏中心（ATCC)，其保藏號爲 ATCC No· HB9469。在其他的實施方案中，所述Fq受體 抗體爲單選殖抗體22(H22)的人源化形式。H22抗體的製 備和表徵目己載於 Graziano, R.F. ei α/. (1995) J. /znmwwo/ 155 (10): 4996-5002 和 Tempest 等人的 PCT 申請公佈 WO 9 4/1 0332中。產生H22抗體的細胞系被命名爲HA02 2 CL 1 ，保藏於美國典型培養物保藏中心，保藏號爲ATCC No. CRL 1 1 1 77。 Q 在另一優選的實施方案中，對於Fc受體的結合特異 性由能結合人類IgA受體的抗體提供，所述人類IgA受 體例如Fca受體（FcaRI (CD89))，優選地，這種結合不會 被人類免疫球蛋白A(IgA)所阻斷。術語“IgA受體”意在包 括位於19號染色體上的一α基因（FcaRI)的基因產物。已 知這一基因編碼幾種55至110 kDa的可變剪接的膜同種 型。FcaRI(CD89)在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和 嗜中性粒細胞中組成型地表現，但在非效應物細胞類群中 不表現。FcaRI對於IgAl和IgA2都具有中等的親和力（= -95- 200938223 5xl07 NT1)，該親和力在存在細胞因數例如G-CSF或GM-CSF 時會更高（Morton, H.C. ei α/· (1996) CV/i/cfl/ in Immunol o gy 16:423-440)。已經描述 了四種 FcaRI 的特 異性單選殖抗體，分別被命名爲A3、A59、A62和A77它 們結合FcaRI外側的IgA配體結合域（Monteiro, R.C. ei al. ( 1 992) J. Immunol. 1 48:1 764)。
FcaRI和FcYRI係可用於本發明的雙特異性分子的優 選的觸發受體，因爲它們：（1)主要在免疫效應物細胞例如 單核細胞、PMN、巨噬細胞和樹突細胞中表現；（2)表現水 準很高（例如5,000- 1 00,000/細胞）；（3)能夠介導細胞毒性 活性（例如ADCC和吞噬作用）；（4)能夠介導抗原例如自體 抗原靶向於它們的增強抗原呈遞。 雖然人類單選殖抗體係優選的，但係其他抗體（鼠類 抗體、嵌合抗體和人源化抗體）也可用於本發明的雙特異 性分子。 可以使用本領域中已知的方法，藉由將各結合特異性 組分（例如’抗FcR結合特異性和抗PTK7結合特異性）共 軛起來而製備本發明的雙特異性分子。例如，可以分別生 成雙特異性分子中的每一種結合特異性，然後再將它們共 軛在一起。當所述結合特異性爲蛋白質或肽時，可以使用 多種共轆試劑或交聯試劑來進行共價交聯。交聯試劑的實 例包括蛋白A、碳二亞胺、N -琥珀醯基_S_ s_乙醯基硫代 乙酸酯（SATA)、5,5’-二硫雙（2 -硝基苯甲酸）（〇ΤΝΒ)、鄰苯 擦馬來醯亞胺（oPDM)、3-(2 -吡啶二锍基）丙酸N —琥珀醯亞 200938223 胺酯（SPDP)和4-(N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸磺基 號珀醯亞胺酯（磺基-SMCC)(參見例如，Karpovsky ei 〇厂 ( 1 9 84) J. Exp. Med. 16 0:1 686 ; Liu, M A e t al. ( 1 98 5) dead. Sci. 82:8648)。其他方法包括
Paulus (1 9 8 5) Behring Ins. Mitt. No. 78， 118-132 ；
Brennan et al. ( 1 9 8 5) Science 229:81-83 和 Glennie et al. (1987) «/· /wwmwo/. 139: 2367-2375 中所述的方法。優選的 0 共軛試劑爲SATA和磺基-SMCC，都可從Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)公司商購。 當所述結合特異性爲抗體時，它們之間可以藉由兩個 重鏈之間的C末端鉸鏈區的二硫鍵相共軛。在一特別優選 的實施方案中，在共轭之前對鉸鏈區進行改造，使其含有 奇數個锍基殘基，優選地含有一個巯基殘基。 作爲替代，兩種結合特異性可以由相同的載體編碼並 在同一宿主細胞中表現和組裝。當所述雙特異性分子爲 ❹ mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab’）2 或配體 xFab 融合蛋白 時，這一方法特別有用。本發明的一雙特異性分子爲含有 一單鏈抗體和一結合決定簇的一單鏈分子，或含有兩個結 合決定簇的一單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以含有 至少兩種單鏈分子。製備雙特異性分子的方法記載於例如 美國專利No· 5,260,203、美國專利No.5,455,030、美國專 利 Νο·4,88 1,1 75、美國專利 No.5,1 3 2,405、美國專利 N〇.5,091,513 、美國專利 N 〇 . 5,4 7 6,7 8 6、美國專利 Ν〇·5,013,653 、美國專利 No.5,258,498 和美國專利 -97- 200938223
No.5,482,85 8 中。 雙特異性分子與其特異性靶標的結合可以藉由下列方 法來確認，例如酶聯免疫吸附測定（ELISA)、放射免疫測 定（RIA)、FACS分析、生物測定（例如生長抑制）或蛋白質 印跡分析。上述每一種分析總體上都係藉由使用特異性針 對目的蛋白質-抗體複合物的標記試劑（例如抗體），來檢測 所述特定複合物的存在。例如，可以使用能夠識別和特異 性結合所述抗體-FcR複合物的酶聯抗體或抗體片段來檢測 0
FcR-抗體複合物。或者，可以使用任何各種其他免疫測定 來檢測所述複合物。例如，可對所述抗體進行放射性標記 並用放射免疫測定（RIA)來檢測（參見例如，Weintraub, B·, Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1 986，該文獻以援引的方式納入本文）。
可以使用例如γ計數器或閃爍計數器或藉由放射自顯影來 檢測所述放射性同位素。 D 共軛物 本發明的共轭物中，該伴體分子系藉由一化學連接子 (有時簡稱爲“接頭”）與一抗體共軛。該伴體分子可以 系一治療劑或一標記物。該治療劑例如可以系例如系一細 胞毒素、一非細胞毒性藥物（如免疫抑制劑 (immunosuppressant))、一放射性試劑、另一抗體或酶。 伴體分子優選系一細胞毒素。該標記物可以系產生可檢測 -98- 200938223 的信號的標記，如放射性標記、螢光標記或對催化對於底 物進行可檢測修飾的酶。抗體具有用作一靶向功能：藉由 與發現其抗原所在處的一靶組織或細胞結合，抗體使共軛 物轉向靶組織或細胞。在所述靶組織或細胞中，該連接子 被切割，釋放伴體分子以執行其所需的生物學功能。 伴體分子與一抗體連接的比率可以隨著諸如共軛反應 時所用的伴體分子的量和試驗條件等因素而變化。伴體分 0 子與抗體的比率優選爲1-3，更優選爲1-1.5。本領域的技 術人員將可以認爲，抗體Z的各單獨分子與整數個伴體分 子共軛，而共軛物製劑可以分析伴體分子與抗體的非整數 比，此顯示爲一統計學平均値。 連接子 在一些實施方式中，該連接子係一肽基連接子，此處 被說明爲（L^p-F-a1；^。其他連接子包括肼和二硫化物連 ❹ 接子，此處分別被說明爲（L^p-H-a1、和（i/h-J-a1、。 F、Η和J分別係肽基、肼和二硫化物部分，它們可以切 割伴體分子使其從抗體上釋放出來，此時L1和L4係連 接子。F、H、J、L1和L4，連同下標ρ和m —起在下文有 更充分的定義。這些和其他連接子的製備和使用說明於 WO 2005/1 1291 9中，其披露的內容以引用的方式結合在 此。 US 2006/0004081 ； 2006/00243 17 ； 2006/0247295 ； 6,989,452 ； 7,08 7,600 ;和 7,1 29,261 ； WO 2007/05 1 081 ; -99- 200938223 2007/038658; 2007/059404;和 2007/0891 00 說明瞭肽基 和其他連接子在抗體-伴體分子共軛物中的使用，所有這 些文獻藉由引用結合在此。 US 6,214,345 ； 2003/0096743 ；和 2003/0130189 ； de Groot 等人，J. Med. Chem. 42, 5277 ( 1 999) ； de Groot 等 人 J. Org. Chem. 43, 3093 (2000) ; de Groot 等人，J. Med.
Chem. 66，8815，(2001) ； WO 02/083 1 80 ； Carl 等人，J.
Med. Chem. Lett. 24, 479, (1 98 1 ) ; Dubowchik 等人，
Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 ( 1 998)說明瞭其他連接 子，所有這些文獻披露的內容藉由引用結合在此。 除連接抗體和伴體分子之外，連接子還增加了伴體分 子的穩定性，減小其體內毒性，或者對其藥物動力學、生 物利用度和/或藥效學產生有利的影響。通常優選的是一 旦共軛物被輸送至其作用部位，連接子即被切割，釋放出 伴體分子。同樣優選的是，連接子無痕跡，使得一旦被切 割，不留有連接子的存在痕跡。 0 在另一實施方式中，連接子的特徵在於它們在靶細胞 內或附近位點（例如在伴體分子的治療作用位元點或標記 活性位元點）被切割的能力。該切割本質上具有酶促性。 這一特點有助於減小伴體分子的系統啓動作用、減少毒性 和系統副作用。用於酶促切割的優選的可切割基團包括肽 鍵、酯鍵、二硫鍵，如前述的F、Η和J部分。在其他的 實施方式中’連接子對ΡΗ敏感’可藉由改變ΡΗ而被切 割。 -100- 200938223 一重要的方面係控制連接子的切割速度的能力。一般 需要連接子快速切割。然而，在一些實施方式中，可能優 選切割較慢的連接子。例如，在緩釋製劑或同時具有快速 釋放成分和慢速釋放成分的製劑中，提供較慢切割的連接 子係有用的。前述的WO 2005/1 1 291 9公開了肼連接子， 它可以被設計而在一定速度範圍內（從極快到極慢）切割。 在共軛物處在迴圈過程中，在到達靶組織或細胞前， 0 連接子還可用於穩定伴體分子，防止其降解。這係重要的 有利之處，因爲它延長了伴體分子的迴圈半衰期。連接子 還可用於減弱伴體分子的活性以使共軛物在迴圈時相對爲 良性，而伴體分子在所需的作用位點活化後具有所需效果 ，例如具有細胞毒性。對於治療劑共軛物而言，連接子這 一特點可改善該試劑的治療指數。 除了可切割的肽、胼或二硫化物基團（分別爲F、Η 或J)之外，根據情況，一或多個連接子L1可任選被導入 φ 至伴體分子和F、Η或J之間。這些連接子L1還可被稱爲 間隔基團（spacer group )並包含至少兩個官能團。依據 下標m的値（即，存在的L1基團的個數）和特定基團L1的 位置，根據情況，基團L1的化學官能團可以與伴體分子 的化學官能團以及F、Η或J的化學官能團結合，或者與 另一連接子L1的化學官能團結合（如果有多於一 L1基圑存 在）。用於間隔基團L 1的適宜的化學官能團的例子包括羥 基、锍基、羰基、羧基、氨基、酮、醛和锍基基團。 連接子L1可以係被取代的或未被取代的烷基、被取 -101 - 200938223 代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的雜芳基或 被取代的或未被取代的的雜烷基。在一實施方式中，烷基 或芳基可包含1-20個碳原子。它們還可以包含聚乙二醇 部分。 示例性基團L1包括例如6-氨基己醇、6-锍基己醇、 10-經基癸酸、甘氨酸和其他胺基酸、1>6_己二醇、β_丙氨 酸、2-氨基乙醇、半胱胺（2 _氨基乙硫醇）、5_氨基戊酸、 6-氨基己酸、3_馬來醯亞胺基苯甲酸、苯酞（2-苯並（C)呋 喃酮）、α-取代的苯酞、羰基、縮醛胺酯、核酸和肽等。 基團L1的一功能係根據情況提供ρ、Η或J與伴體分 子之間的空間分離’以免後者幹擾（例如藉由位阻效應或 電效應）在F、Η或J的切割化學性。基團L1還可用於將 額外的分子量和化學官能團引入共軛物。通常，額外的分 子量和官能團影響共軛物的血清半衰期和其他性質。因此 ，藉由仔細挑選間隔基團，可以制得血清半衰期在一定範 圍內的共軛物。可任選的是，一或多個連接子L1可以係 一自消基團（self-immolativegroup)，如後所述。 下標m係選自0、1、2、3、4、5和6的一整數。多 個L1基團存在時，它們可爲相同或不同。 L4係一連接子部分，可根據情況提供F、Η或j與抗 體之間的空間分離的連接子，以免F、Η或J幹擾抗體與 抗原的結合或者抗體幹擾F、H或J的切割化學性。優選 的是，L4利用包含所述部分或改變所述共軛物的水解速率 的連接子，增大共軛物的溶解性或減小其凝集性。如在L 1 -102- 200938223 情況所示，L4可任選係一自消基團。在一實施方式中，L4 係被取代的烷基、未被取代的的烷基、被取代的芳基、未 被取代的芳基、被取代的雜烷基或未被取代的雜烷基，所 述基團的任一都可以爲直鏈、支化或環狀。取代基例如可 以係低級 （Q-C6)烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基或者 二烷基氨基。在一些實施方式中，L4包括非環狀部分。在 另一實施方式中，L4包括帶正電或負電的胺基酸聚合物， 如聚賴氨酸或聚精氨酸。L4可包括諸如聚乙二醇部分等聚 合物。另外，L4可同時包括諸如聚合物部分和小分子部分 〇 在一優選的實施方式中，L4包括聚乙二醇 （PEG)部 分。L4的PEG部分可爲1到50個單元長。優選的是， PEG含有1到12個重複單元，更優選3到12個重複單元 ，更優選2到6個重複單元，或甚至更優選3到5個重複 單元，最優選4個重複單元。L4可僅僅含有PEG部分， 或也可包括其他的未取代的或未被取代的烷基或雜烷基。 將PEG作爲L4部分的一部分進行組合可以用於提高複合 物的水溶性。另外，PEG部分可能在藥物和抗體共軛時降 低凝集程度。 下標P爲〇或1;也就係說，L4的存在係可選的。當 L4存在時，其至少具有兩個功能團，根據情況，一官能團 結合F、H或J中的化學官能團，另一官能團結合抗體。 基團L4適宜化學官能團的實例包括羥基、锍基、羰基、 羧基、氨基、酮、醛和锍基基團。由於抗體通常經锍基基 -103- 200938223 團（例如來自未氧化的半胱氨酸殘基，用亞氨基硫烷使含 有锍基的擴鏈物（extension)與賴氨酸殘基加成，或者二硫 化物橋鍵的還原）、氨基（例如來自賴氨酸殘基）、醛基（例 如來自糖苷側鏈的氧化）或羥基（例如來自絲氨酸殘基）共軛 ，用於連接抗體的優選的化學官能團係與前述基團具有反 應性的官能團，其實例係馬來醯亞胺、锍基、醛基、肼基 、氨基脲和羧基。優選抗體上锍基與L4上馬來醯亞胺的 組合。 在一些實施方式中，L4包括與（AA1)。的N末端直接 連接的 〇 R^'R25'
R2()係選自Η、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或 未被取代的雜烷基和醯基的基團。R25、R25’、R26和R26’ 各自獨立地選自Η、被取代的或未被取代的烷基、被取代 的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的芳基、被 取代的或未被取代的雜芳基和被取代的或未被取代的雜環 烷基；s和t獨立地係1-6的整數。優選的是，R2°、R25、 R25’、R26和R26’係疏水性的。在一些實施方式中，R2Q係 Η或烷基（優選的是未被取代的低級烷基）。在一些實施方 式中，R25、R25’、R26和R26’獨立地係Η或烷基（優選的是 未被取代的d-C4烷基）。在一些實施方式中’ R25、R25’ 、R26和R26’均爲H。在一些實施方式中，t係l’s係1 -104- 200938223 或2。 肽連接子（F) 如上所述，本發明的肽基連接子可由通式（L4)P —F — (L1)^表示，其中F表示含有肽基部分的部分。在一實施 方式中，F部分包括可選的額外的自消接頭L2和羰基’從 而對應於式（a)的共軛物： 〇 ^ Ο
X4-(L4)p-(AA1)c-(L2-C)0-(L1)m-D 在該實施方式中，L1、L4、p和 m如上所述。X4係抗 體，D係伴體分子。下標〇爲〇或1，L2如果存在，即表 示自消連接子。AA1代表一或多個天然胺基酸，和/或非天 然α -胺基酸；c爲1到20的整數。在一些實施方式中，c 爲2-5的整數，或c爲2或3。 式（a)中，ΑΑ1在其氨基末端直接與L4相連，如果沒 φ 有L4，則直接與X4相連。在一些實施方式中，如L4存在 ，L4不含直接與（AA1)。的N末端相連的羰醯基團。 在另一實施方式中’ F部分包括氨基基團和可選的間 隔基團L3 ’且L1不存在（即m爲零），從而對應於式（b)的 共軛物： x4-(lV(aa1)c-K-(L3)0—d。 在該實施方式中’ X4、D、L4、AA1、c和ρ如上所述 。下標〇爲0或1。L3如果存在，則爲含有伯胺或仲胺或 羧基官能團的間隔基團’並且或者L3的胺基與D的側鏈 -105- 200938223 羧基官能團形成醯胺鍵，或者L3的羧基與D的側鏈胺基 官能團形成醯胺鍵。 自消連接子 一自消連接子係一雙官能化合物部分，它能將兩個間 隔的化學部分共價連接成一通常穩定的三節分子（ tripartate molecule )，藉由酶切割從該三節分子釋放所述 間隔的化學部分中的一個；在所述酶切割之後，從分子的 殘餘部分中自發切割而釋放所述間隔的化學部分中的另一 個。根據本發明，自消的間隔區在其一端以共價鍵和肽部 分相連’而在其另一端以共價鍵與藥物部分的化學反應位 元點相連，藥物部分的衍生化會抑制藥理活性，以間隔並 將肽部分與藥物部分共價連接成三節分子，所述分子在靶 酶不存在的情況下係穩定的且無藥理活性，但藉由該靶酶 可在共價連接間隔區部分（spacer moiety)與肽部分的鍵 發生酶促切割，從而使肽部分從三節分子釋放。反過來， 此酶促切割又能夠啓動間隔區部分的自消性質，且引發共 價連接間隔區部分與藥物部分的鍵的自發斷裂，由此釋放 藥理活性形式的藥物。例如，參見Carletal·，J·Med· Chem., 24 (3), 479-480 (1 98 1 )； Carl et al., WO 81/01145 (1981) ; Toki et al., J. 〇rg. Chem. 67, 1 866-1 872 (2002) ;Boyd et al. WO 2005/112919:以及 Boyd et al. WO 2007/03 865 8’其內容藉由引用結合在此。 一特別優選的自消間隔區可以由式（c)表示： -106- 200938223
氨基苄基的芳環可由一或多個“κ”基團取代。“κ”基團 係芳環上的取代基’其取代氫’否則氫將與構成環結構的 四個非取代碳之一相連。“Κ”基團可以係單原子，如鹵素 ，也可以係多原子基團，如烷基、雜烷基、氨基、硝基、 羥基、烷氧基、鹵代烷基和氰基。每個Κ獨立地選自由被. 〇 取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的雜烷基、未被取 代的雜烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的 雜芳基、未被取代的雜芳基、被取代的雜環院基、未被取 代的雜環院基、鹵素，no2、nr21r22、nr21cor22、 oconr21r22、ocor21 和 OR21 組成的組，其中 R21 和 R22 獨立地選自由Η、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取 代的雜烷基、未被取代的雜烷基、被取代的芳基、未被取 代的芳基、被取代的雜芳基、未被取代的雜芳基、被取代 Ο 的雜環烷基、和未被取代的雜環烷基組成的組。示例性Κ 取代基包括但不限於 F、Cl、Br、I、Ν〇2、OH、OCH3、 NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3 和甲基。對於 “Ki”，i 係 ο 、1、2、3或4中的整數。在一優選實施方式中，i係0。 上述結構的醚氧原子與羰基（未示出）相連。NR24官能 團與芳環相連的線表示胺功能團可以與成環的且未被-CH2-〇-取代的5個碳的任一個相連。優選的是，X的 NR24官能團以相對於-CH2-0-的對位與芳環共價連接。R24 係選自由Η ’被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的 -107- 200938223 雜烷基、和未被取代的雜烷基組成的組的基團。在一具體 的實施方式中，R24爲Η。 在一實施方式中’本發明提供上式（a)的肽連接子，其 中F包含以下結構：
R24
其中，R24、AA1、K、i和c的定義如前所述。 在另一實施方式中，上式（a)的肽連接子包含具有以下 結構的-F-a1)^ :
其中R24、AA1、K、i和c的定義如前所述。 在一些實施方式中，自消間隔區L1或L2包括：
其中各R17、R18和R19獨立地選自Η、被取代的或未被取 代的院基、被取代的或未被取代的雜烷基、和被取代的或 未被取代的芳基，其中w爲〇到4的整數。一些實施方式 中’ R17和R18獨立地爲Η或者烷基（優選未被取代的cl — C4烷基）。優選的，R17和R18爲C1 一 C4的烷基，如甲基 -108- 200938223 或乙基。一些實施方式中，W爲0。實驗證明，該特定的 自消間隔區成環速度相對較快。 在一些實施方式中，L1或L2包括：
其中，R17、R18、R19、R24和K的定義如前所述。 間隔基團 間隔基團L3的特徵在於包括伯胺或仲胺或羧基官能 團，並且或者L3的胺基與D的側鏈羧基官能團形成醯胺 鍵，或者L3的胺基與D的側鏈羧基官能團形成醯胺鍵。 L3可選自由被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被 取代的雜烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或 〇 未被取代的雜芳基或被取代的或被取代的雜環烷基組成@ 組。在一優選的實施方式中，L3包括芳香族基團。更優選 L3包括苯甲酸基團、苯胺基團或吲哚基團。用作_l3_Nh. 間隔區的結構的非限制性實例包括下列結構：
-109- 200938223
其中Z係選自0、s和NR23的成員’並且其中R23係選自 Η、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的 雜烷基、和醯基的基團。 包含L3的本發明連接子在切割時’ L3部分仍然與藥 物D連接。因此’選擇L3部分以使其與D的連接不顯著 改變D的活性。在另一實施方式中’藥物D本身的部分 可用作L3間隔區。例如，在一實施方式中’藥物D係多 卡黴素（duocarmycin)的衍生物，其中藥物部分即爲L3間 隔區。該實施方式的非限制性實例包括其中的NH2-(l3)-d 具有選自由以下結構組成的組的結構的那些實例：
-110- 200938223
其中，Z係ο、s和NR23，其中R23係Η、被取代的或未 被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、或醯基； 各結構上的ΝΗ2基團與（ΑΑ1)。反應形成- (ΑΑ^-ΝΗ-。 肽序列（A A ^ © 基團AA1表示單個胺基酸或多個藉由醯胺鍵連接在— 起的胺基酸。胺基酸可以係天然胺基酸和/或非天然α胺 基酸。它們可以爲L或D構型。在一實施方式中，使用至 少三個不同的胺基酸。在另一實施方式中，僅僅使用兩個 胺基酸。 術語“胺基酸”指的是天然胺基酸和合成胺基酸，以及 胺基酸的類似物和胺基酸的模擬物，它們發揮作用的方式 與天然胺基酸類似。天然胺基酸係被遺傳密碼子編碼的胺 G 基酸，以及隨後被修飾的那些胺基酸，如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯（鹽）、瓜氨酸和鄰磷酸絲氨酸。胺基酸類似 物指的是具有與天然胺基酸相同的基本化學結構的化合物 ，即，其中α碳與氫 '羧基、氨基和R基團連接，如高絲 氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞颯、蛋氨酸甲基毓。這些類似 物具有被修飾的R基團（如正亮氨酸）或被修飾的肽骨架’ 但保留與天然胺基酸相同的基本化學結構。一尤其可以使 用的胺基酸係瓜氨酸’它係精氨酸的前體，與肝臟中尿素 的合成有關。胺基酸類比物指的是這樣的化學化合物’其 -111 - 200938223 具有與胺基酸的普通化學結構不同的結構，但發揮作用的 方式與天然胺基酸類似。術語“非天然胺基酸”表示上述的 二十個天然胺基酸的“D”立體化學形式。進一步而言，術 語“非天然胺基酸”包括天然胺基酸的同系物，和天然胺基 酸的合成修飾形式。合成修飾形式包括但不限於具有縮短 或延長至不超過2個碳原子的亞烴基鏈的胺基酸、包括任 選取代的芳基的胺基酸和包括鹵化基團（優選爲鹵化烷基 和芳基）的胺基酸。當與本發明的連接子或共軛物相連時 ，胺基酸爲“胺基酸側鏈”形式，胺基酸羧酸基團的位點被 酮（c(o))基團取代。因此，例如丙氨酸側鏈爲-c(o)-CH(NH2)-CH3 等等。 肽序列（ΑΑ1、在功能上係單個胺基酸（c=l時）或多個 藉由醯胺鍵連接在一起的胺基酸的醯胺化殘基。肽序列 (A A1)。優選選擇用於利用生物系統中所關注位置的酶的酶 催化切割。例如，對於靶向細胞但是並未內化的共軛物， 選擇藉由胞外基質中的蛋白酶（例如由附近瀕於死亡的細 胞釋放的蛋白酶或與腫瘤有關的蛋白酶）進行切割的肽， 由此使肽在細胞外被切割。對於經設計用於被細胞內化的 共軛物，序列（AA1)。優選選擇用於藉由內涵體或溶酶體蛋 白酶進行切割。肽中胺基酸的數目可爲1-20;然而更優選 包含 1-8個胺基酸，1-6個胺基酸或1、2、3或4個胺基 酸的（AA1)。。對特定多個酶或酶組的切割敏感的狀序列在 本領域中係公知的。 優選的是，（AA1)。包含胺基酸序列（“切割識別序列”) 200938223 ，該序列爲蛋白酶的分裂部位。許多蛋白酶切割序列在本 領域中係公知的。例如’參見Matayoshi ei a/· Science 2 4 7:954 ( 1 990) ; Dunn e t al. Me th. Enzymol. 24 1 : 254 ( 1 994) ； Seidah et al. Meth. Enzymol. 244175 (1 994);
Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 61 5 (1994); Weber e t al. Meth. E nzym o l. 24 4 : 5 9 5 (1 9 94) ； Smith e t al. Meth. Enzymol· 244 : 412 (1994) ； Bouvier et al. Meth. Enzymol. ◎ 248 6 1 4 ( 1 995), Hardy et al., in Amyloid Protein
Precursor in Development, Aging, and Alzheimer's Disease, ed . Masters et al. pp · 1 9 0 - 1 9 8 ( 1 994)。 肽通常包含3-12(或更多）個胺基酸。特定胺基酸的選 擇至少部分取決於將用於切割肽的酶，以及肽在體內的穩 定性。合適的可切割肽的一實例係β- Ala - Leu - Ala-Leu (SEQ ID NO: 27)。 它可 以與穩 定基團 結合形 成琥珀 醯-β- Ala - Leu - Ala-Leu (SEQ ID NO: 30)。其他合適的 〇 可切割肽的實例提供在下面引用的文獻中。作爲替代，可 以使用包括單個胺基酸殘基的連接子，如 WO 2008/103693中所公開的，其公開內容藉由引用結合在此 〇 在一優選的實施方式中，選擇肽序列（ΑΑ1)。係因爲它 能夠被溶酶體蛋白酶切割，所述蛋白酶的實例包括組織蛋 白酶B、C、D、H、L和S。優選的是，肽序列（八八^在 體外能夠被組織蛋白酶Β切割。雖然組織蛋白酶Β係溶酶 體蛋白酶，但在腫瘤組織周圍的胞外基質中發現了 一定濃 -113- 200938223 度的組織蛋白酶B。 在另一實施方式中，選擇肽序列（AA1)。係因爲它可被 一腫瘤相關蛋白酶切割（例如在腫瘤細胞附近胞外發現的 一蛋白酶），其實例包括寡酶（TOP)和CD10。或者，設計 序列（AA1)。用於尿激酶或類胰蛋白酶的選擇性切割。 作爲一說明例，CD10，也被稱爲腦啡肽酶、中性內肽酶 (NEP)、和常見的急性淋巴母細胞白血病抗原（CALLA)， 係II型細胞-表面鋅依賴型金屬蛋白酶。適宜使用CD10 的可切割底物包括Leu-Ala-Leu和Ile-Ala-Leu。 另一說明例基於基質金屬蛋白酶（MMP)。可能係與腫 瘤有關最具特點的蛋白水解酶，在腫瘤微環境中MMP的 活化作用具有明顯的相關性。尤其係，已經對可溶性基質 酶 MMP2 ( gelatinase A)和 MMP9 ( gelatinase B)進行了深 入硏究，它們在包括腫瘤生長在內的組織重構中顯示出被 選擇性啓動。已設計出可被MMP2和MMP9切割的肽設計 序列並測試下列物質的共軛物：葡聚糖和氨甲喋呤（Chau e t al., Biocon jugate C hem. 15 : 9 3 1 -94 1 (2004)) ； PEG ( polyethylene glycol)和多柔比星（Bae ei a/., Drwgj C/i«. 29: 1 5-23 (2004));以及白蛋白和多柔比星 (Kratz et al., Bio or g. Med. Chem. Lett. 11 ： 2001-2006 (200 1 ))。使用MMP的合適序列的實例包括但不限於？1*〇-Val-Gly-Leu-Ile-Gly (SEQ. ID NO : 21)、Gly-Pro-Leu-
Gly-Val (SEQ. ID NO : 22)、Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-
Gly-Gln (SEQ. ID NO : 23) ' Pro-Leu-Gly-Leu (SEQ. ID -114- 200938223 NO : 24)、Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Leu-Ser-Gln (SEQ. ID NO :25)和 Gly-Pro_Leu-Gly-Leu_Trp-Ala-Gln (SEQ. ID NO : 26)(例如，參見上文引用的文獻以及 Kline et al.，Mo/. P harmaceut. 1 ： 9-22 (2004)禾口 Liu et al., Cancer Res. 60 :6061-6067(2000))°
又一實例係II型跨膜絲氨酸蛋白酶。這一組酶包括但 不限於例如 hepsin、睪蛋白（testisin)和 TMPRSS4。Gln-Ala-Arg 係一底物序列，其用於蛋白裂解酶 (matriptaSe)/MT-SPl (在乳癌和卵巢癌中被過表現），Leu-Ser-Arg用於hepsin(在攝護腺和其他一些腫瘤類型中被過 表現）。（例如，參見 Lee a/., J. Bio/. 275: 3 6720-3 6725 以及 Kurachi and Yamamoto, Handbook of Proeolytic Enzymes V ο 1.2 , 2nd edition(Barrett A J,
Rawlings ND &Woessner JF, eds) pp . 1 6 9 9 - 1 7 0 2 (2 0 0 4))。 適合在本發明的共軛物中使用的適宜的、但非限制性 的肽序列的實例包括 Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys 、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、 Ile-Cit、Trp、 C it ' Phe-Ala、P h e-N 9 -1 o s y 1 - A r g、Phe-N9-nitro-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、 Leu-Ala-Leu、 Ile-Ala-Leu ' Val-Ala-Val ' Ala-Leu-Ala-Leu ' β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO ： 27) ' Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ. ID NO -28)、Val-Ala，Leu-Leu-Gly-Leu (SEQ ID NO : 29)、 Leu-Asn-Ala 和 Lys-Leu-Val。優選的肽序列係 Val-Cit 和 V al - L y s。 -115- 200938223 在另一實施方式中，最接近藥物部分位置的胺基酸選 自由 Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gin、Glu、Gly、lie、 Leu ' Lys、Met、Phe' Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val 組成的組。在又一實施方式中，最接近藥物部分位置的胺 基酸選自由 Ala、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、lie、 Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val 組成的 組。 本領域的技術人員可迅速評價肽序列的排列以確定其 在本發明中的效用，無需過度的試驗。例如，參見 Zimmerman , M., et al. , ( 1 977) Analytical Biochemistry 78 :4 7-51 ； Lee, D., et al. , (1999) Bioorganic and Medicinal Zeiieri 9 : 1667-72 ;和 Rano, T.A., ei a/., (19 9 7) Chemistry and Biology 4 · 149-55 。 本發明的共軛物可任選包含兩個或兩個以上連接子。 這些連接子可以相同或不同。例如，肽基連接子可用於連 接藥物和配體，第二肽基連接子可連接診斷劑和複合物。 額外連接子的其他用途包括連接分析試劑、生物分子、靶 向試劑和抗體-伴體分子複合物的可檢測標記。 肼連接子（H) 在另一實施方式中，本發明的共軛物包括肼自消連接 子，其中所述共軛物具有以下結構：
X4-(L4)p-H-(L1)m-D -116- 200938223 其中，D、L 、1/、1)、111和χ4如上所限定，並在此處進 一步說明，Η係包含以下結構的連接子：
其中1^係1-10的整數；η2係〇、i或2;各r24係獨立地 選自由Η、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的雜 院基和未被取代的雜烷基組成的組的基團；I係鍵（即，骨 架上的碳原子與臨近氮之間的鍵）或以下結構：
在一實施方式中，苯環上的取代係對位取代。在優選 的實施方式中，以係2、3或4’或η!係3。在優選的實 施方式中’ η2係1。在優選的實施方式中’ Ϊ係鍵（即’骨 架上的碳原子與臨近氮之間的鍵）。一方面’肼連接子Η 可在切割時形成6元環的自消（self immolative)連接子’ 例如當113係0和n4係2時。另一方面’肼連接子Η可在 切割時形成兩個5元環的自消連接子。在其他方面’切割 時Η形成5元環的自消連接子’ Η形成7元環的自消連接 子，或Η形成5元環的自消連接子和6元環的自消連接子 。切割速率受切割時形成的環大小的影響。因此’依據所 -117- 200938223 需的切割速率，可選擇切割時形成的適宜大小的環。 另一肼結構Η具有下式：
其中q係0、1、2、3、4、5或6;各R24係獨立地選自由 Η、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的雜烷基和 未被取代的雜烷基組成的組的基團。該肼結構也可形成五 元、六元或七元環，可以加入其他成分以形成多個環。 WO 2005/112919公開了各種肼連接子的製備、切割 化學性和環化動力學，所公開的內容藉由引用結合在此。 二硫化物連接子（J) 在又一實施方式中，連接子包括可進行酶促切割的二 硫化物基團。在一實施方式中，本發明提供一具有式（d)結 構的細胞毒性抗體-伴體分子化合物： 其中，D、L1、L4、p、m和X4如上所限定，並在此處進 一步說明，J係包括具有以下結構的基團的二硫化物連接 子：
-118- 200938223 ^中各尺係獨Ji•地選自由H、被取代的烷基、未被取 代的烷基、被取代的雜烷基和未被取代的雜烷基組成的組 的基團，各Κ係獨立地選自由被取代的烷基、未被取代的 兀基被取代的雜烷基、未被取代的雜烷基、被取代的芳 基、未被取代的芳基、被取代的雜芳基'未被取代的雜芳 基、被取代的雜環烷基、未被取代的雜環烷基、鹵素、 νο2、nr21r22、NR21cor22、〇c〇nr21r22 〇c〇r21 和 O 組成的組的基團，其中，r21和r22獨立地選自由u 、被取代的院基、未被取代的烷基、被取代的雜烷基、未 被取代的雜烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取 代的雜芳基、未被取代的雜芳基、被取代的雜環烷基和未 被取代的雜環院基組成的組；i係〇、1、2、3或4中的整 數；d係〇、1、2、3、4、5或6中的整數。 •—硫化物連接子的芳環可以被一或多個“K”基團取代 。“ K”基團係取代氫的取代基，否則氫將與構成環結構的 G 四個非取代碳之一相連。“K”基團可以係單原子，如鹵素 ’也可以係多原子基團，如烷基、雜烷基、氨基、硝基、 淫基、烷氧基、鹵烷基和氰基。示例性K取代基包括但不 限於 F、C1 ' Br ' I、ΝΟ2 ' OH、OCH3、NHCOCH3、 N(CH3)2、NHCOCF3 和甲基。對於 “Ki”，i 係 0、1、2、3 或4中的整數。在一具體的實施方式中，i係〇。 在一優選的實施方式中，連接子包含下式的可酶促切 割的二硫化物連接子： -119- 200938223
其中，L4、X4、p和R24如上所限定，d係ο、1、2、3、 4、5或6。在一特定的實施方式中，d係1或2。 更具體的二硫化物連接子如下式所示：
優選的是，d係1或2，各K係H。 另一種二硫化物連接子如下式所示：
在各種實施方式中，二硫化物在胺的鄰位。在另一具 體的實施方式中，a係0。在優選的實施方式中’ R24獨立 地選自Η和CH3。 WO 2005/1 12919公開了諸如上述的二硫化物連接子 的製備和使用，其公開內容藉由引用結合在此。 對於細胞毒素、連接子和與抗體共軛治療劑類型的更 多討論， 還 可參 見 US 7,087,600 ; US 6,989,452 ；US 7,129,261 US 2006/0004081 ； US 2006/0247295 ;WO 02/096910 WO 2007/051081 ； WO 2005/112919 ；WO 2007/059404 ；WO 2008/083312 ； WO 2008/103693 ； S aito -120- 200938223 et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 : 1 99-2 1 5 ； Trail et al. (2 003) Cancer Immunol. Immunother. 52 : 3 28-3 3 7 ; Payne. (2003 ) Cancer Cell 3 ： 207-2 1 2 ; Allen (2002) Nat. Rev. Cancer 2 : 75 0-763 ; Pastan and Kreitman (2002) C ur r. Opin. In ve stig. Drugs 3 : 1089-1091 ； S enter and
Springer (200 1 ) Ad v. Drug Deliv. Rev. 53 : 247-264，以 上各文獻藉由引用結合在此。 ❹ 作爲伴體分子的細胞毒素 在一方面中，本發明的特徵在於抗體與伴體分子（如 細胞毒素、藥物（如免疫抑制劑）或放射性毒素）共軛。該共 軛物也被稱爲“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒劑包括對細 胞有害（如殺死）的任何試劑。此處，“細胞毒素”包括前藥 形式並在體內被轉化爲實際的有毒物種的化合物。 本發明的伴體分子的實例包括紫杉醇醇、松胞菌素B 〇 、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根城、絲裂黴素、依託泊苷 、替尼泊苷、長春新域、長春城、秋水仙素、多柔比星、 柔紅黴素、二經基炭痕菌素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光輝黴素、放射菌素D、l-去氫睪酮 、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾 和嘌呤黴素及其類似物或同系物。伴體分子的實例還包括 例如抗代謝物（如甲氨蝶呤、6-锍基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿 糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨氮烯咪胺）、烷基化試劑（如氮芥、 thioepa chlorambucil、美法命、卡吴司汀（BSNU)和洛莫司 -121 - 200938223 汀（CCNU)、環碟醯胺、白消安、tubulysin 、二溴甘露醇、 鏈脲黴素、絲裂黴素C、順鉑、蒽環類抗生素（如柔紅比星 (以前爲柔紅黴素）和多柔比星），抗生素（如更生黴素（以前 爲放線菌素）、博來黴素、光輝黴素和安麯黴素（AMC))， 以及抗有絲分裂劑（如長春新城和長春域）。其他可與本發 明之抗體共軛的伴體分子優選例包括刺孢黴素、美登素和 阿裡斯達汀（auristatin)及其衍生物。 伴體分子的優選實例係CC- 1 065的類似物和衍生物和 結構相關的多卡黴素。雖然其具有強效而廣泛的抗腫瘤活 性’但因CC- 1 065可引起試驗動物的遲發性死亡，故不能 用於人類’這提出對於具有更好治療指數的類似物或衍生 物的硏究。
許多CC- 1 065的類似物和衍生物和多卡黴素在本領域 中係公知的。已經對許多化合物的結構、合成和性質的硏 究進行了評論。例如，參見Boger et al.，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1 4 3 8 ( 1 9 9 6)；和 Boger et al., Chem. Rev. 97 : 787 ( 1 997)。關於CC- 1 065的類似物或衍生物的 其他公開內容包括：US 5,101，038; US 5,641,780 ; US 5,1 87,1 86 ； US 5,070,092 ； US 5,703,080 ； US 5,070,092 ; US 5,64 1,780 ； US 5,1 0 1,03 8 ； US 5,0 84,468 ； 〇S 5,73 9,3 5 0 ； US 4,978,757、US 5,3 3 2, 837 和 US 4,912,227 ；WO 96/1 0405 ；以及 EP 0,5 3 7,5 75 Al。 在特別優選的方面中，伴體分子係具有以下式（e)的結 構的CC-1065 /多卡黴素類似物： -122- 200938223
其中，環系統A係選自被取代的或未被取代序 代的或未被取代的的雜芳基和被取代的或未初 烷基的基團。示例性的環系統A包括苯基和阳 符號E和G獨立地選自Η、被取代的或灵 基、被取代的或未被取代的雜烷基、雜原子、 Ε和G任選連接形成環系統，該系統選自被5 取代的芳基、被取代的或未被取代的的雜芳S 或未被取代的雜環烷基。 符號X表示選自〇、S和NR23的基團。 、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或身 烷基、和醯基的基團。 符號R3表示選自（ = 〇)、SR"、NHR11和 ，其中，R11係H、被取代的或未被取代的危 的或未被取代的雜烷基、單磷酸鹽、二磷酸圈 、磺酸鹽、醯基、C(0)R12 R13、C(0)0R12、 、P(0)(0R12)2、C(0)CHR12R13、SR12 或 SiR 號R12、R13和R14獨立地表示H、被取代的宜 烷基、被取代的或未被取代的雜烷基和被取 代的芳基，其中R12和R13及與之所連的氮 任選連接形成被取代的或未被取代的雜環烷 9芳基、被取 芝取代的雜環 :咯基。 ^被取代的烷 單鍵，或者 Z代的或未被 ^和被取代的 R23係選自Η i被取代的雜 OR11的基團 Ϊ基、被取代 I、三磷酸鹽 C(0)NR12R13 12r13r14。符 $未被取代的 ί的或未被取 C子或碳原子 ^環系統，該 -123- 200938223 環系統爲4-6元環系統並任選包含2個以上雜原子。 R4、R4’、R5和R5’係獨立地選自η、被取代的或未被 取代的烷基 '被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未 被取代的雜芳基、被取代的或未被取代的雜環烷基、_素 、νο2、NR15R16、NC(0)R15、oc(o)nr15r16、〇c(〇)〇ri5 、C(0)R15、SR15、OR'5、CR15=NR16 和 0(CH2)nN(CH3)2 的基團，其中，n係1-20的整數，或者R4、r“、R5和 R5’的任何相鄰對與其所連的碳原子連接，形成具有4_6元 環的被取代的或未被取代的環烷基或雜環烷基環系統。 R15和R16獨立地表示Η、被取代的或未被取代的烷基、 被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的芳 基、被取代的或未被取代的雜芳基、被取代的或未被取代 的雜環烷基和被取代的或未被取代的肽基，其中R15和 R16及與其所連的氮原子任選相連接，形成被取代的或未 被取代的雜環烷基環系統，該環系統爲4-6元環系統並任 選包含兩個或更多以上雜原子。一示例性的結構係苯胺。 R3、R4、R4’、R5和R5’之一將細胞毒素與本發明的連 接子或酶可切割底物連接，如此處所述，例如與L1或L3 連接（如果存在），或與F、Η或J連接。 R6係存在或不存在的單鍵。R6存在時，R6和r7連接 形成環丙基環。R7係CHrX1或-CH2-。R7係-CH2-時’它 係環丙烷環的成分。符號X1表示離去基團’如鹵素（例如 Cl、Br或F)。以不會違反化學價原理的方式解釋r6和R7 的組合。 -124- 200938223 χ1可以係任何離去基團。有用的離去基團包括但不限 於鹵素、疊氮化物、磺酸酯（如烷基磺醯基、芳基磺醯基） 、氧鎗離子、高氯酸烷基酯、氨基烷基磺酸酯、以及烷基 氟代磺酸酯和氟化化合物（如三氟甲磺酸鹽、全氟甲磺酸 鹽、三氟乙烷磺酸鹽）等。特殊的可用作離去基團的鹵素 係 F 、 CI 和 Br 。 六元環中的曲線表示該環可能具有一或多個不飽和度 ，它可以爲芳環。因此，環結構（如以下所示）及其相關 結構在式（f)的範圍內：
和
⑴ ❹ 並將藥物與L1或L3 (如果存在）連接，或與F、Η或J連接 。X5部分優選爲可以使用酶進行切割’並在切割時提供活 性藥物。作爲一實例，R11可具有以下結構（其右側與藥物 的殘餘部分耦合）：
在一些實施方式中，R4、R4’、R5和R5’中的至少一個 將所述藥物與L1(如果存在）連接，或與F、H、J或X2連 接，並且R3選自SR11、NHR11和OR11。R11選自-SO(OH)2 、 -P〇(〇H)2 、 -AAn、 -Si(CH3)2C(CH3)3 、- -125- 200938223
或任何其他糖或多種糖的組合
及其藥學上可接受的鹽，其中n係1-10的任意整數，m 係1 -4的任意整數，p係1 _6的任意整數，AA係任何天然 或非天然胺基酸。其中式（e)的化合物經R4、R4’、R5或R6 共軛，R3優選包括可切割阻斷基團，該基團可阻斷化合物 的細胞毒性活性，但是在見於預期作用位點的條件下藉由 與用於切割使細胞毒素與抗體共軛的連接子不同的機制可 以切割。藉由這種方法，如果在血漿中存在共軛物的偶然 切割，阻斷基團則可削弱所釋放的細胞毒素的細胞毒性。 例如，如果共軛物具有腙連接子或二硫化物連接子，則阻 斷基團可以係酶可切割的醯胺。或者，如果連接子係蛋白 酶可切割的肽基，則阻斷基團可以係羧酸酯酶可切割的酯 或氨基甲酸酯。 例如，在一優選的實施方式中，D係具有結構〇)的細 胞毒素： -126- 200938223 r2
在該結構中，R3、R6、R7、R4、R4,、R5、R5 以上式（e)中所說明。z係選自O、S和NR23的 中R23係選自H、被取代的或未被取代的的烷基 D 的或未被取代的雜烷基、和醯基的基團。 R1係Η、被取代的或未被取代的低級烷基 或C02R8，其中R8係選自NR9R1G和OR9中的基 R9和R1C)係獨立地選自Η、被取代的或未被取代 被取代的或未被取代的雜烷基的基團。 R1 ’係 Η、被取代的或未被取代的低級i C(0)R8，其中R8係選自NR9R1G和OR9的基團 和R1()係獨立地選自Η、被取代的或未被取代的 〇 取代的或未被取代的雜烷基的基團。 R2係Η、或被取代的或未被取代的低級烷基 取代的雜烷基或氰基或烷氧基；R2’係Η、或被取 被取代的低級烷基或未被取代的雜烷基。 R3、R4、R4,、R5或R5’中的一將細胞毒素 L3(如果存在）連接，或與F、Η或J連接。 另一實施方式具有下式： ’ fΠ X 如 成員，其 、被取代 、C(0)R8 團，其中 的烷基、 笔基、或 ，其中R9 院基、被 、或未被 代的或未 與L1或 -127- 200938223
如以上 式（e)所說明。Z係選自Ο、S和NR23的成員’其中R23係 選自Η、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取 代的雜烷基、和醯基的基團。
R34係C( = 0)R33或Ci-C^烷基，其中R33選自Η、 被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的芳基 、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的 雜環烷基、鹵素、Ν〇2 、NR15R16 、NC(0)R15 、 0C(0)NR15R16、0C(0)0R15、C(0)R15、SR15、OR15、
CR15=NR16 和 0(CH2)nN(CH3)2，其中 n 係 1-20 的整數。 R15和R16獨立地表示H、被取代的或未被取代的烷基、 被取代的或未被取代的的雜烷基、被取代的或未被取代的 芳基、被取代的或未被取代的雜芳基、被取代的或未被取 代的雜環烷基和被取代的或未被取代的肽基，其中R15和 R16及與之所連的氮原子任選連接形成被取代的或未被取 代的雜環院基環系統，該環系統爲4-6元環系統，並任選 包含兩個或更多雜原子。 優選的是，Α係被取代的或未被取代的苯基或被取代 的或未被取代的吡咯基。此外，此處說明的用於Rii的取 代基的任何選擇也適用於R33。 優選的伴體分子具有由式（I)表示的結構 -128- 200938223
式（I)中，PD表示前藥基團（有時也稱爲保護基團）。 化合物（I)在原位水解（優選爲酶促）從而釋放式（II)的化合 物。本領域的技術人員可認識到化合物式（II)屬於CBI化 合物的化合物種類（（Boger et al·, ·/· CAe/w. 2001， © 6654-6661 ;和 Boger et al.，US 2005/00 1 4700 A 1 (2005)) 。CBI化合物原位（或者當施用于患者時爲體內）轉化成爲 它們的環丙基衍生物，如化合物（ΙΠ)，與DNA的小溝結 合，然後在腺嘌呤基團上烷基化DNA，所述環丙基衍生物 被認爲係實際的烷基化物質。
nh2 合適的前藥基團P D的非限制性實例包括酯、氨基甲 酸酯（鹽）、磷酸鹽、和糖苷，如下圖所示： -129- 200938223
優選的前藥基團PD係氨基甲酸酯（鹽）（以上述的前五 個結構爲例），其可被羧基酯酶水解；磷酸酯（鹽）（上述第 六個結構）’其可被鹼性磷酸酶水解；以及β-葡糖醛酸衍 生物’其可被β-葡糖醛酸糖苷酶水解。特別優選的伴體分 子係由式（IV)表示的氨基甲酸酯（鹽）前藥基團：
作爲伴體分子的標誌物 伴體分子係標誌物時，它可以係任何具有或產生可被 檢測的物理或化學性質以表明其存在於特定組織或細胞中 的部分。標誌物（有時也稱爲報告基團）已經在免疫測定、 生物醫學硏究和醫療診斷領域得到充分發展。標誌物可藉 由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或 化學手段檢測。其實例包括磁珠（如 DYNABEADSTM)、 螢光染料（如螢光素異硫氰酸酯、德克薩斯紅、羅丹明等） 、放射性標記（如3H、1251、35s、14C或32P)、酶（如辣根 -130- 200938223 過氧化物酶、鹼性磷酸酶以及常用於ELISA的其他酶）、 和比色標記如膠態金或有色玻璃或塑膠珠（如聚苯乙烯、 聚丙嫌、膠乳等）。 該標誌物優擇由放射性同位素、螢光劑、螢光劑前體 、發色團、酶及其組合組成的組的成員。適宜的酶的實例 係辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖 氧化酶。螢光劑包括螢光素及其衍生物、羅丹明及其衍生 0 物、丹醯、傘形酮等。化學發光的化合物包括螢光素和 2,3-二氫酞嗪二酮如魯米諾。對於可以使用的各種標記或 信號產生體系的評述，參見US4,391，904。 標誌物可以藉由間接手段連接：配體分子（如生物素） 與抗體共價連接。然後配體與另一分子（如抗生蛋白鏈菌 素）結合，該分子或者本身即爲可檢測的或者與信號系統（ 如可檢測酶、螢光化合物或化學發光化合物）共價連接。 ❹ 共軛物的實例 適合與本發明之抗體共軛的伴體分子-連接子組合的 具體實例如下所示：
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-132- 200938223
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式（P)如下所示： -134- 200938223
e M. e NIM
O -135- 200938223
-136- 200938223
在前述的化合物中，式中存在下標r時，其係0-24的 © 整數。R，無論在何種情況下出現，爲
每一前述化合物均具有馬來醯亞胺基團，且容易經其 上的锍基與抗體共軛。 藥物組成物 另一方面，本發明提供包括本發明的共軛物與藥學可 -137- 200938223 接受的載體以及任選其他活性或非活性組分的一藥物組成 物。 本發明的藥物組成物還可以與其他試劑施用於組合療 法中。例如，所述組合療法可以包括本發明的共軛物與至 少一其他抗炎或免疫抑制劑組合。可用於組合療法的治療 劑實例將在下面進行更詳細的說明。 此處使用的“藥學可接受的載體”包括任何和全部的生 理學上相容性的溶劑、分散介質'塗料、抗細菌劑和抗真 菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。優選的是，所述載體適合 於靜脈、肌內、皮下、胃腸外、脊髓和表皮給藥（例如藉 由注射或輸注）。依據給藥途徑，活性化合物可用某種材 料包被以保護該化合物免受可能導致化合物失活的酸和其 他自然條件的影響。 本發明的藥物組成物可包含一或更多種藥學可接受的 鹽。“藥學可接受的鹽”指的係能夠保持母體化合物所需的 生物活性且不會產生任何不希望有的毒物學效應的鹽（例 如參見 Berge，S.M., " α/·, ( 1 9 7 7) J. P harm. Sc i. 66 ： 1 - 19)。該鹽的實例包括酸加成鹽或域加成鹽。酸加成鹽包 括來自無毒無機酸的鹽，所述無機酸例如爲鹽酸、硝酸、 磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸和亞磷酸等，以及來自無毒 有機酸的鹽，所述有機酸例如爲脂肪族單羧酸和二羧酸、 具有苯基取代基的烷醇酸、羥基烷醇酸、芳香酸、脂肪族 和芳香族磺酸等。鹼性加成鹽包括來自鹼土金屬，如鈉、 鉀、鎂和鈣等的鹽，以及來自無毒有機胺，如N，N'-二苄 -138- 200938223 基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇 胺、氨茶鹼和普魯卡因等的鹽。 本發明的藥物組成物還包括藥學可接受的抗氧化劑。 藥學可接受的抗氧化劑的實例包括：（1)水溶性抗氧化劑， 諸如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫 鈉和亞硫酸鈉等；（2)脂溶性抗氧化劑，抗壞血酸棕櫚酸酸 酯、丁基羥基茴香醚（BHA)和丁基羥基甲苯（BHT)、卵磷 U 脂、沒食子酸丙酯和（X-生育酚等；和（3)金屬螯合劑，例 如檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨醇、酒石酸和磷酸 等。 合適的載體的實例包括水、乙醇、多元醇（如甘油、 丙二醇和聚乙二醇等）及其混合物，植物油如橄欖油，以 及可注射的有機酯如油酸乙酯。藉由使用包被材料（如卵 磷脂）、維持分散系中所需顆粒的大小（在）和使用表面活性 劑，可保證適合的流動性。 〇 所述組成物還可包含佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化 劑和分散劑。可同時藉由滅菌和添加抗細菌劑與抗真菌劑 ，例如尼泊金、三氯叔丁醇和苯酚山梨酸等來確保防止微 生物的存在。該組成物中包含等滲劑（如糖和氯化鈉等）可 能也係理想的。另外，可注射的藥物劑型吸收延長，可藉 由包含延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠來實現。 藥學可接受的載體包含無菌水溶液或分散液和用於無 菌注射溶液或分散液的即時配製的無菌粉末。用於藥學活 性物質的該介質和試劑的使用方法在本領域中係公知的。 -139- 200938223 除了與活性化合物物不相容的任何傳統介質或試劑外，可 考慮使用本發明中藥學組成物。還可以加入輔助性活性化 合物。 所述治療組成物通常必須係無菌的並且在製造和存儲 條件下係穩定的。該組成物可以配製成溶液、微乳、脂質 體’或者其他適於高藥物濃度的有序結構。載體可以係溶 劑或如分散介質（包含水、乙醇、多元醇（如甘油、丙二 醇和液體聚乙二醇等）），及其適宜的混合物。使用包被（ 如卵磷脂）、維持分散系所需顆粒的大小（在體情況中）和使 用表面活性劑’可保證適合的流動性。在許多情況中，優 選在組成物中包含等滲試劑，例如糖、多元醇（如甘露醇 、山梨醇）或氯化鈉。可注射組成物吸收延長可藉由在組 成物中包含延遲吸收的試劑（如單硬脂酸鹽和明膠）來實現 0 無菌注射液可藉由將所需量的活性化合物加入必要時 具有上述列舉組分中的一或其組合的適宜溶劑中，然後進 行無菌微過濾而製備。通常，分散液藉由將活性化合物加 入至無菌媒介物（包含基礎分散介質和所需的上述列舉的 其他組分）進行製備。在用於製備無菌注射液的無菌粉末 時，優選的製備方法係真空乾燥和冷凍乾燥（凍乾），制得 活性組分與任何來自預先無菌過濾溶液的其他所需組分的 粉末。 與載體組合制得單一劑型的活性組分的量隨著待治療 的受試者和給藥的特定方式而變化，通常係產生治療效果 -140- 200938223 的組成物的量。通常’在100 %的範圍內，與藥學可接受 載體組合的活性組分的量爲從約0.0 1 %到約99%，優選從 約〇 . 1 %到約7 0 %，最優選從約1 %到約3 0 %。 調節劑量方案以提供最佳的預期反應（如治療效果）。 例如’可以一次使用一大九藥，可以隨時間分劑量使用， 或者根據治療情況的緊急程度所示按比例減少或增加劑量 。爲給藥方便及劑量統一而配製腸胃外用組成物尤爲有利 Q 。此處使用的劑量單位形式指的係物理上的不連續單位， 作爲單位劑量適用於治療受試者的；各單位包含經計算能 產生預期療效的預定量的活性化合物以及所需的藥學載體 。本發明的劑量單位形式的說明由以下因素決定並直接取 決於以下因素：（a)活性組成物的特性和待實現的特定療效 ’和（b)配製一治療個體敏感度的活性組成物時該領域固 有的局限性。 對於共軛物的施用，根據使用者的體重，劑量從約 Q 〇.〇001 到 i〇〇 mg/kg，更常用爲 0.01 到 5mg/kg。例如， 劑量可以爲0.3 mg/kg體重，1 mg/kg體重，3 mg/kg體重 ，5 mg/kg體重或10 mg/kg體重，或者1-1〇 mg/kg的範圍 內。示例性治療方案可以限定爲每週給藥一次，每兩週一 次，每三週一次’每四周一次，每月一次，每三個月一次 或每3到6個月一次。本發明共軛物的優選劑量方案包括 靜脈給藥1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，利用以下劑量方 案之一使用共軛物：（i)每4周給予6個劑量，之後每3 個月給樂，（ii)每二周給藥；（iii)每二周按3 mg/kg體重 -141 - 200938223 —次給藥後按1 mg/kg體重給藥。在一些方法中，調整劑 量使共轭物的血槳濃度爲約1-1000 pg/ml，在另一些方法 中爲約 25 -3 00 pg /ml。 作爲替代，抗體可以作爲緩釋製劑給藥，在這種情況 中需要以較低頻率給藥。劑量和頻率隨抗體在患者體內的 半衰期而變。通常，人抗體半衰期最長，其次係人源化抗 體、嵌合抗體和非人抗體。給藥的劑量和頻率可隨治療係 預防性的還係治療性的而變。進行預防性應用時，在很長 一段時間內以相對較低的頻率給予相對較少的劑量。一些 患者將終生一直接受治療。進行治療性應用時，有時需要 在相對較短的間隔內給予相對較高的劑量直至病情緩減或 終止’並優選直至患者表現出部分或完全的疾病症狀的改 善。之後，患者可以接受預防性方案。 爲用於與細胞增殖異常有關的疾病預防和/或治療， 所給化合物的迴圈濃度優選爲約0.001 μΜ到20 μΜ，其 中優選約0·01 μΜ到5 μΜ。 此處說明的該化合物的患者口服劑量通常爲從約1 mg/天到約10,000 mg/天’更通常爲從約1〇 mg/天到約 1,000 mg/天，最通常爲從約50 mg/天到約500 mg/天。按 照患者體重計，常用劑量爲從約0.01到約150 mg/kg/天 ’更常用從約〇·1到約15 mg/kg/天，最常用從約1到約 10 mg/kg/天，例如 5 mg/kg/天或 3 mg/kg/天。 0.9 在一些實施方式中，延遲或抑制腫瘤生長的患者劑量 可以爲1 pmol/kg/天或更小。例如，患者劑量可以爲 200938223 、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、〇·15 或 0.1 pmol/kg/天或更 少（參照藥物的摩爾數）。優選的是，當日劑量使用至少五 天時抗體-藥物共軛物延緩了腫瘤的生長。在至少一些實 施方式中’腫瘤係SCID小鼠中的人型腫瘤。作爲一例子 ’ SCID小鼠可以爲 CB17.SCID小鼠（可由Taconic， Germantown, NY 獲得）。 可以改變實際的劑量水準，以針對特定患者、組成物 〇 和給藥方式實現預期療效的有效活性組分量，而對患者無 毒。所選的劑量水準將取決於各種藥物代謝動力學因素， 包括採用的特定組成物或其酯、鹽或醯胺的活性、給藥途 徑、給藥時間、排泄速率、療程、及在採用的特定組成物 組合中使用的其他藥物、化合物和/或材料、患者的年齡 、性別、體重、狀態、總體健康狀態和病史等因素。 本發明的共軛物的“治療有效劑量”優選減輕疾病症狀 的嚴重程度、延長無疾病症期的頻率和持續時間、和/或 © 防止由於病痛產生的損害或殘疾。例如，治療RG-1+腫瘤 ’與未被治療受試者相比，“治療有效劑量”優選抑制細胞 生長或腫瘤生長至少約20%，更優選至少約40%，甚至更 優選至少約6 0 % ’更優選至少約8 0 %。共軛物抑制腫瘤生 長的能力可在預測人腫瘤功效的動物模型系統中評價。作 爲替代’組成物的該性質可藉由檢驗其抑制腫瘤生長的能 力而評價，該能力可由有經驗的從業者藉由已知方法進行 體外測定。治療有效量的治療化合物可減小腫瘤的大小， 或者緩解受試者的症狀。本領域的一般技術人員可根據受 -143- 200938223 試者的大小、症狀的嚴重程度和所選具體組成物或給藥途 徑而確定該量。 本發明的共軛物可採用本領域中已知的一或更多種方 法，由一或更多種途徑給藥。如本領域技術人員可以理解 的，給藥途徑和/或方式隨預期結果而變。本發明之抗體 的優選給藥途徑包括靜脈、肌內、皮內、腹膜內、皮下、 脊髓或其他胃腸外途徑（例如藉由注射或輸注）。此處使用 的短語“胃腸外給藥”指的係除了腸內和局部給藥外其他給 藥方式，通常藉由注射，其包括但不限於靜脈內、肌內、 動脈內、鞘內、囊內、眼框內、心內、皮內、腹膜內、經 氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下腔、脊柱 內、硬腦膜外和胸骨內注射及輸注。作爲替代，本發明的 組成物可經由非胃腸外途徑給藥，如局部、表皮或黏膜途 徑給藥’例如鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部途徑 給藥。 活性化合物載體製備，載體可保護活性化合物免於提 前釋放，如控釋製劑、植入劑、經皮貼劑和微囊化遞送系 統。可以使用具有生物降解性、生物相容性的聚合物，例 如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯 和聚乳酸。參見’例如 SwWa/wei/ and Coniro/Zei/
Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc.5 New York, 1 97 8)。 治療組成物可利用本領域中已知的醫用裝置給藥。例 如，在一優選的實施方式中’本發明的治療組成物可利用 -144- 200938223 無針皮下注射裝置給藥，例如US 5,399,163 ; 5,383,851; 5,312,335 ； 5,064,413 ； 4,941,880 ； 4,790,824 ;或 4,596,556公開的裝置。其他適宜裝置的實例包括 US 4,487,603 ； US 4,486,1 94 ； US 4,447,23 3 ； US 4,447,224 ; US 4,439,196 ;和 US 4,475,196 公開的裝 置。這些專利藉由引用結合在此。 在一些實施方式中，配製本發明的共軛物確保其在體 0 內分佈適宜。例如，血腦屏障（B B B )阻止了許多高親水性 化合物。爲確保本發明的治療性化合物藉由B B B (如果需 要的話），它們可以被配製成例如脂質體。配製脂質體的 方法參見例如 US 4,522,811; 5,3 74,548 ;和 5,399,331。脂 質體可包含一或多個部分，該部分被選擇性輸送到特定的 細胞或組織中由此增強靶藥物的遞送（參見，例如 V. V. Ranade ( 1 9 8 9) J. Clin. Pharmacol. 29: 6 8 5) ° 示便!I ;性耙向 部分包括葉酸鹽（酯）或生物素（參見，例如US 5,416,016 to ❹ Low ei αΛ);甘露糖苷（1111^2&\¥3 6^〇^.，（1988)5/〇£；/^/«· Biophys. Res. C o mm un. 153 : 1038);抗體（P.G. Bloeman et al. ( 1 9 9 5 ) F EBS Lett. 357 : 1 40; M. Owais et al. (1995) C/zewoMer. 39: 180);表面活性劑蛋 白 A 受體（Briscoe α/· ( 1 995) Jw.丄 少1 23 3 : 134); ρ 1 2 0 (Schreier et al. ( 1 9 9 4) J. Biol. C h e m · 269: 9 0 9 0);還可參見 K. K e i n a n e η; M . L . L a u k k a n e n (1 9 9 4) FEBS Lett· 3 46 : 1 23; J. J. Killion; I. J. Fidler (1 994) Immunome tho ds 4 ： 273 o •145· 200938223 本發明的用途和方法 本發明之抗體、抗體組成物和方法具有與診斷和治療 PTK7介導的病症相關的多種體外和體內診斷和治療用途 。在一優選的實施方案中，本發明之抗體爲人類抗體。例 如，這些分子可在體外或離體地被給予至培養物中的細胞 ’或者例如體內給予至人類受試者，以治療、預防和診斷 多種病症。本文所使用的術語“受試者”旨在包括人類和非 人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物 和非哺乳動物，例如，非人類靈長類、羊、狗、貓、牛、 馬、家禽類、兩棲動物和爬行動物。優選的受試者包括患 有由PTK7活性介導的病症的人類患者。所述方法特別地 適於治療患與PTK7異常表現相關的病症的人類患者。當 抗PTK 7抗體與另一藥劑聯合給藥時，這兩種物質可相繼 或者同時給藥。 考慮到本發明之抗體針對PTK7的特異性結合，本發 明之抗體可用於特異地檢測細胞表面的PTK7表現，並且 還可用於藉由免疫親和純化方法純化PTK7。 本發明還提供用於檢測樣本中是否存在人PTK7抗原 或者測量人PTK7抗原的量的方法，包括使所述樣本和對 照樣本與可在嚴格條件下特異性結合人PTK7的人單選殖 抗體或其抗原結合部分相接觸，所述嚴格條件允許所述抗 體或其部分和人PTK7之間形成複合物。然後檢測複合物 的形成’其中與對照樣本相比，與所述樣本之間的複合物 形成差異即可指示該樣本中是否存在人PTK7抗原。 200938223 PTK7在結腸癌來源的細胞系中表現，但未發現在成 人結腸組織中表現（Mossie ei αΛ ( 1 995) 1 1 :2 1 79-84 )。在一些黑色素瘤細胞系和黑色素瘤活檢組 織中也觀察到了 PTK7 表現（Easty, ei α/. ( 1 997) /«i. J. Cancer 71:1061-5)。此外，還發現ΡΤΚ7在急性髓樣白 血病樣本中高度過表現（Muller-Tidow a/., (2004)
Cancer i?以· 10:1241-9)。抗 PTK7 抗體可單獨地使 Q 用，用來抑制癌性腫瘤的生長。或者，如下所述，抗 PTK7抗體可與其他免疫原性藥劑、標準癌症治療法或其 他抗體結合使用。 優選的使用本發明之抗體可抑制生長的癌症包括通常 對免疫療法有應答的癌症。優選的治療癌症的非限制性實 例包括結腸癌（包括小腸癌）、肺癌、乳癌、胰臟癌、黑 色素瘤（例如轉移性惡性黑色素瘤）、急性髓樣白血病、 腎癌、膀胱癌、卵巢癌和攝護腺癌。可使用本發明的方法 〇 治療的其他癌症的實例包括腎癌（例如腎細胞癌）、成膠 質細胞瘤、腦瘤、慢性或急性白血病（包括急性淋巴細胞 性白血病（ALL )、成人T細胞白血病（T-ALL )、慢性 髓樣白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性 白血病）、淋巴瘤（例如，何傑金氏和非何傑金氏淋巴瘤 、淋巴細胞性淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤、T細胞淋巴瘤 、伯基特淋巴瘤、間變性大細胞瘤（ALCL )、皮膚T淋 巴細胞瘤、結節狀小分裂細胞淋巴瘤、周圍T細胞淋巴瘤 、倫南德氏淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴結瘤、T細胞白血 -147- 200938223 病/淋巴瘤（ATLL )、中心母細胞性/中心細胞性濾泡性淋 巴瘤、B譜系彌散性大細胞瘤、血管免疫母細胞性淋巴結 病（AILD )樣T細胞淋巴瘤和HIV相關的基於體腔的淋 巴瘤）、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌（例如施明克氏瘤） 、卡斯爾曼氏病、卡波濟氏肉瘤、多發性骨髓瘤、瓦爾登 斯特倫氏巨球蛋白血症和其他B細胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨 癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌 、直腸癌、肛區癌症、胃癌 '畢九癌、子宮癌、輸卵管癌 、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰門癌、食道癌、小腸 癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌 、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體瘤、膀胱癌、 腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS)腫瘤 '腫 瘤血管發生、脊椎腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、表皮樣 癌症、鱗狀上皮細胞癌、包括那些由石棉誘導的環境誘導 性癌症（例如間皮瘤），以及所述癌症的組合。 此外’考慮到各種腫瘤細胞上的PTK7表現，本發明 的人類抗體、抗體組成物和方法可用於治療患致瘤性病症 的受試者’所述致瘤性病症例如爲以存在表現ΡΤΚ7的腫 瘤細胞爲特徵的病症’包括例如，結腸癌（包括小腸癌） 、黑色素瘤（例如轉移性惡性黑色素瘤）、急性髓樣白血 病、肺癌、乳癌、膀胱癌、胰臟癌、卵巢癌和攝護腺癌。 患有致瘤性病症的其他受試者的實例包括患有如下病症的 受試者：腎癌（例如腎細胞癌）'成膠質細胞瘤、腦瘤、 慢性或急性白血病（包括急性淋巴細胞性白血病（ALL ) 200938223 、成人T細胞白血病（T-ALL )、慢性髓樣白血病、急性 成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病）、淋巴瘤 (例如，何傑金氏和非何傑金氏淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴 瘤、原發性CNS淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、 間變性大細胞瘤（ALCL )、皮膚T淋巴細胞瘤、結節狀 小分裂細胞淋巴瘤、周圍T細胞淋巴瘤、倫南德氏淋巴瘤 、免疫母細胞性淋巴結瘤、T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL Q )、中心母細胞性/中心細胞性濾泡性淋巴瘤、B譜系彌散 性大細胞瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病（AILD )樣T 細胞淋巴瘤和HI V相關的基於體腔的淋巴瘤）、胚胎性癌 、未分化的鼻咽癌（例如施明克氏瘤）、卡斯爾曼氏病、 卡波濟氏肉瘤、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白 血症和其他B細胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮膚癌、頭頸 癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、直腸癌、肛區癌 症、胃癌、睪九癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮 〇 頸癌、陰道癌、陰門癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌 症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿 道癌、陰莖癌、兒童實體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎 盂癌、中樞神經系統（CNS)腫瘤、腫瘤血管發生、脊椎 腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、表皮樣癌症、鱗狀上皮細 胞癌、包括那些由石棉誘導的環境誘導性癌症（例如間皮 瘤），以及所述癌症的組合。 因此，在一實施方案中，本發明提供了 一受試者體內 腫瘤細胞生長的方法，包括向受試者給予治療有效量的抗 -149- 200938223 PTK7抗體或其抗原結合部分。優選地，所述抗體爲人抗 PTK7抗體（例如本文所述的任何人類抗人PTK7抗體）。 此外或者再者，所述抗體可爲嵌合的或人源化的抗PTK7 抗體。 在一實施方案中，本發明之抗體（例如，人單選殖抗 體、多特異性和雙特異性分子和組成物）可用於檢測 PTK7水準或細胞膜表面含有PTK7的細胞水準，之後可將 這些水準與某些疾病症狀相關聯。或者，所述抗體可用於 抑制或阻斷PTK7功能，這轉而又可與某些疾病症狀的防 止或緩解相關聯，由此暗示了 PTK7爲該疾病的介質。這 可藉由使實驗樣本和對照樣本在這樣一條件下與抗PTK7 抗體相接觸來實現，所述條件允許該抗體與PTK7之間形 成複合物。該抗體與PTK7之間形成的任何複合物都被檢 測，並比較實驗樣本和對照樣本的複合物。 在另一實施方案中，可初始測試本發明之抗體（例如 ，人類抗體、多特異性和雙特異性分子和組成物）的與體 外治療或診斷用途相關的結合活性。例如，可用下文實例 中所述的流式細胞測定法測試本發明的組成物。 本發明之抗體（例如，人類抗體、多特異性和雙特異 性分子、免疫共軛物和組成物）具有在PTK7相關疾病的 治療和診斷方面的其他用途。例如，所述人單選殖抗體、 多特異性或雙特異性分子和免疫共軛物可用於在體內或體 外激發以下的生物活性：抑制表現PTK7的細胞的生長和/ 或殺傷該細胞，在人效應細胞存在時介導表現PTK7的細 -150- 200938223 胞的吞噬或ADCC效應，或者，阻斷PTK7配體與PTK7 結合。 在一具體的實施方案中，所述抗體（例如，人類抗體 、多特異性和雙特異性分子和組成物）用於體內治療、預 防或診斷多種PTK7相關的疾病。PTK7相關的疾病的實例 包括結腸癌（包括小腸癌）、黑色素瘤（例如轉移性惡性 黑色素瘤）、急性髓樣白血病、肺癌、乳癌、膀胱癌、胰 〇 臟癌、卵巢癌和攝護腺癌等。 本發明之抗體組成物（例如，人單選殖抗體、多特異 性和雙特異性分子和免疫共軛物）的體內和體外的合適給 藥途徑爲本領域公知，並可又本領域普通技術人員選定。 例如’所述抗體組成物可藉由（例如靜脈內或皮下）注射 給藥。所用分子的合適劑量將取決於受試者的年齡和體重 、所述抗體組成物的濃度和/或製劑。 如前所述，本發明的人抗PTK7抗體可與一或其他多 ❹ 種治療劑（例如一細胞毒劑、放射性毒劑或免疫抑制劑） 共同給藥。所述抗體可與所述治療劑相連接（作爲一免疫 複合物）’或者可與所述治療劑分開給藥。對於後一情況 (分開給藥）’所述抗體可在所述治療劑之前、之後或與 其同時給藥’或者可與其他已知療法例如抗癌療法（如輻 射）共同給予。這類治療劑包括其自身只在對患者有毒性 或亞毒性的水準時有效的抗腫瘤劑例如多柔比星（阿黴素 )、順鉑、硫酸博來黴素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和環磷 醯胺羥基脲等。順鈾以每四周一次1 〇〇 mg/ml的劑量靜脈 -151 - 200938223 內給藥，阿黴素以每21天一次60-75 mg/ml的劑量靜脈 內給藥。本發明的人抗PTK7抗體或其抗原結合片段與化 學治療劑的共同給藥可提供兩種抗癌治療劑，這兩種抗癌 治療劑可藉由不同的機制起作用，並獲得針對人類腫瘤細 胞的細胞毒效應。這類共同給藥可解決腫瘤細胞產生藥物 抗性或者抗原性改變方面的問題，所述抗原性改變可能會 導致腫瘤細胞與抗體間無反應。 當給予本發明之抗體-伴體分子共軛物以用於預防和/ 或治療與細胞異常增殖相關的疾病時，所給予的化合物的 循環濃度優選爲約0.001 μΜ至20 μΜ，並優選約0.01 μΜ 至 5 μΜ 0 本文所述的化合物的口服給藥患者劑量典型地爲約1 mg /日至約 10,000 mg /日，更典型地爲約 1〇 mg/日至約 1，000 mg/日，最典型地爲約50 mg/日至約5 00 mg/日。根 據患者體重表示時，典型的劑量範圍爲約0.01至約150 mg/kg /日，更典型地爲約0.1至約15 mg/kg /日，最典型地 爲約1至約10 mg/kg/日，例如5 mg/kg/日或3 mg/kg/日 〇 在至少某些實施方案中’阻滞或抑制腫瘤生長的患者 劑量可爲1 μιηοΐ/kg/日或者更少。例如，所述患者劑量可 爲 0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15 或 0.1 pmol/kg/ 曰或者更少（折合成藥物的摩爾數）。優選地，所述抗 體-藥物共軛物當在至少5天時間內以日劑量給藥時阻滞 腫瘤細胞的生長。在至少某些實施方案中，所述腫瘤爲 -152- 200938223
SCID小鼠體內的人類類型的腫瘤。例如，所述sCID小鼠 可以係 CB17.SCID 小鼠（獲自 Taconic, Germantown，NY )° 在一實施方案中，本發明的免疫共軛物可藉由將化合 物與抗體相連，用於將這些化合物（例如，治療劑、標記 物、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制劑等）靶向具有 PTK7細胞表面受體的細胞。例如，抗PTK7抗體可與美國 φ 專利6，2 8 1, 3 5 4和6，5 4 8,5 3 0、美國專利申請公開文本 20030050331 、 20030064984 、 20030073852 和 20040087497中所述的或者 WO 03/022806中公開的任何 毒素化合物相共軛，這些文獻均藉由引用的方式全文納入 本文。因此，本發明還提供了用於離體地或者在體內將表 現PTK7的細胞（例如，具有可檢測標記，例如放射性同 位素、螢光化合物、酶或酶輔因數）限定在局部區域的方 法。或者，所述免疫共鈪物可用於藉由將細胞毒素或放射 〇 性毒素靶向PTK7來殺傷具有PTK7細胞表面受體的細胞 〇 本發明的靶標特異性效應細胞，例如與組成物（例如 ，人類抗體、多特異性和雙特異性分子）相連的效應細胞 ，也可用作治療劑。用於靶向的效應細胞可以係人白細胞 ，例如，巨噬細胞、嗜中性粒細胞或單核細胞。其他細胞 包括嗜酸性粒細胞、天然殺傷細胞和其他帶有IgG-或 IgA-受體的細胞。如果需要，效應細胞可從待治療的受試 者中獲得。所述靶特異性效應細胞可作爲生理上可接受溶 -153- 200938223 液形式的細胞懸液來給藥。給予的細胞數可以係108-1 Ο9 數量級，但會根據治療目的變化。通常，該劑量足以使靶 細胞局部化例如吞噬作用產生細胞殺傷作用，所述靶細胞 例如有表現ΡΤΚ7的腫瘤細胞。給藥途徑也可以變化。 靶標特異性效應細胞療法可與其他去除靶細胞的技術 聯合實施。例如，使用本發明的組成物（例如，人類抗體 、多特異性和雙特異性分子）和/或帶有這些組成物的效 應細胞的抗腫瘤療法可以與化學療法聯合使用。此外，聯 合免疫療法可用於指導兩種不同的細胞毒性效應群對腫瘤 細胞的排斥作用。例如，與抗FqRI或抗CD3相連的抗 PTK7抗體可與IgG-或IgA-受體特異性結合劑聯合使用。 本發明的雙特異性和多特異性分子也可用于調節效應 細胞上的FcYR或FcYR水準，例如可藉由遮蔽和去除細胞 表面的受體實現。抗Fc受體的混合物也可用於該目的。 還可在存在補體時使用具有補體結合位點的本發明的 組成物（例如，人類抗體、多特異性和雙特異性分子和免 疫共軛物），所述補體結合位點例如來自IgG 1、-2或-3 或IgM的可結合補體的部分。在一實施方案中，可藉由加 入補體或含補體的血清來補充細胞群的離體處理，所述細 胞包括帶有本發明的結合劑和合適的效應細胞的靶細胞。 被覆本發明的結合劑的靶細胞的呑噬作用可藉由補體蛋白 的結合而加強。在另一實施方案中，被覆本發明的組成物 (例如’人類抗體、多特異性和雙特異性分子）的靶細胞 也可藉由補體溶解。在又一實施方案中，本發明的組成物 -154- 200938223 不啓動補體。 本發明的組成物（例如，人類抗體、多特異性和雙特 異性分子和免疫共轭物）也可與補體一起給藥。因此，本 發明的範圍內涵蓋包括人類抗體、多特異性或雙特異性分 子與血清或補體的組成物。這些組成物的優點在於補體位 於接近人類抗體、多特異性或雙特異性分子的位置。或者 ，本發明的人類抗體、多特異性或雙特異性分子與補體或 U 血清可分開給藥。 因此，用本發明之抗體組成物治療的患者還可（在給 予本發明的人類抗體之前、同時或之後）給予另一治療劑 ，例如一細胞毒劑或放射性毒劑，這樣可加強或提高所述 人類抗體的治療效果。 在其他的實施方案中，還用一調節（例如增強或抑制 )FcY或FcY受體表現或活性的藥劑治療受試者，例如用 一細胞因數治療受試者。在用多特異性分子治療過程中給 〇 予的優選的細胞因數包括粒細胞集落刺激因數（G-CSF ) 、粒細胞巨噬細胞集落刺激因數（GM-CSF )、幹擾素γ ( IFN-γ)和腫瘤壞死因數（TNF)。 本發明的組成物（例如，人類抗體、多特異性和雙特 異性抗體）也可用于靶向表現FqR或ΡΤΚ7的細胞，例 如用於標記該細胞。爲此用途，可將所述結合劑與一可檢 測的分子相連。因此，本發明提供了離體地或在體外將表 現Fc受體（例如FqR或PTK7 )的細胞限定在局部區域 的方法。可檢測的標記可以係例如一放射性同位素、螢光 -155- 200938223 化合物、酶或酶輔因數。 本發明的範圍內還涵蓋包括本發明之抗體組成物（例 如，多種人類抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫共軛 物）及其使用說明的試劑盒。該試劑盒還可含有一或多種 其他試劑，例如，一免疫抑制劑、細胞毒劑或放射性毒劑 ’或者一或多種本發明的附加人類抗體（例如，一人類抗 體，它具有與PTK7抗原中的不同於該第一人類抗體的一 抗原決定位結合的互補活性）。試劑盒通常包括表示該試 劑盒內容物的既定用途的標誌。所述詞語標誌包括任何試 劑盒上或與試劑盒一起提供的，或者隨附該試劑盒的書面 或記錄材料。 本發明藉由以下實施例進一步得到說明，這些實施例 不應解釋爲對本發明的進一步限制。本申請通篇引用的所 有附圖和所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容均 藉由引用的方式明確地全文納入本文。 實例 實例1 :抗PTK7的人單選殖抗體的生成 抗原 免疫方案使用（i)具有my c和his標籤的包括PTK7 的胞外部分的重組融合蛋白和（ii)膜結合全長PTK7作 爲抗原。兩種抗原均用CHO細胞系藉由重組轉染法產生 轉基因HuMab和KM小鼠 200938223
使用HCo7和HCol2系的HuMab轉基因小鼠和KM 系的轉基因轉染色體小鼠製備針對PTK7的完全人單選殖 抗體，所述的每種小鼠均表現人抗體基因。對於上述每一 品系的小鼠，按照 Chen eifl/· (1993)五丄 12:8 1 1-820 所述，同型結合地破壞其內源性小鼠κ型輕鏈基因’按照 PCT公開文本WO 01/09187的實例1所述，同型結合地破 壞其內源性小鼠重鏈基因。上述每一品系的小鼠攜帶人κ 0 型輕鏈轉基因 KCo5，如 Fishwild ei α/· ( 1 996) iVaiwre 1 4:845 -85 1 中所述。所述 HCo7 系攜帶 HC〇7人重鏈轉基因，如美國專利5，770，429、5,545,806 、5,625,825和 5,545,807中所述。所述 HCol2系攜帶 HCol2人重鏈轉基因，如WO 0 1 /09 1 8 7的實例2和WO 0 1/1 4424的實例2中所述。所述KM系含有SC20轉染色 體，如PCT公開文本WO 02/43478中所述。
HuMab和KM免疫： φ 爲產生針對PTK7的完全人單選殖抗體，用純化的重 組PTK7融合蛋白和PTK7轉染的CHO細胞作爲抗原免疫 HuMab小鼠和KM小鼠TM。用於HuMab小鼠的一般免疫 方案在 I.onberg，N. ei a/ (1 994) TVfliwre 3 6 8(6474): 8 56-859; Fishwild， D. e t a l. (1 9 9 6) Nature Biotechnology 14: 845-851和PCT公開文本WO 98/24884中有描述。首次注 入抗原時，所述小鼠爲6-16周齡。使用PTK7融合蛋白抗 原的純化重組製劑（5-50 gg )和5-10x1 06細胞經腹膜內 、皮下（Sc)或經足底注射免疫HuMab小鼠和KM小鼠 -157- 200938223 轉基因小鼠用抗原的完全弗氏佐劑或Ribi佐劑溶液 IP免疫兩次，然後用抗原的不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑 溶液IP免疫3-21天（最多至共11次免疫）。藉由眶後 取血監測免疫應答。用ELISA篩選血漿（如下所述）’將 具有足夠的抗PTK7人免疫球蛋白滴度的小鼠用於融合。 用抗原靜脈內加強免疫小鼠3天，然後處死並取脾。通常 ，對於每種抗原進行〗〇_3 5次融合。對於每種抗原均免疫 幾十隻小鼠。 產生抗PTK7抗體的HuMab或KM小鼠TM的篩選 爲篩選產生可結合PTK7的抗體的HuMab或KM小鼠 TM，按照 Fishwild, D. ei α/· ( 1 996)所述，用 ELISA 測試 來自免疫小鼠的血清。簡單來說，用來自轉染CHO細胞 的PBS溶液中1-2 pg /ml的重組PTK7融合蛋白包被微量 滴定板，每孔1〇〇 μΐ，在4°C孵育過夜，然後用5%胎牛血 清的 PBS/吐溫溶液（0.05% )以每孔 200 μΐ封閉。將 ΡΤΚ7免疫小鼠的血清稀釋液加至每孔，並在室溫下孵育 1-2小時。用PBS/吐溫清洗平板，然後用偶合辣根過氧化 物酶（HRP )的山羊抗人IgG多選殖抗體在室溫下孵育1 小時。洗滌後，用 ABTS底物（Sigma，A- 1 888, 0.22 mg/ml )對滴定板顯色，並用分光光度計在OD 415-495處 進行分析。產生最高滴度的抗PTK7抗體的小鼠用於融合 。如下所述進行融合，並採用ELISA測試雜交瘤上清液的 -158- 200938223 抗PTK7活性。 產生針對PTK7的人單選殖抗體的雜交瘤的製備： 按照標準方法，用PEG將分離自HuMab小鼠的小鼠 脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然後篩選所得雜交瘤以 用於抗原特異性抗體的產生。用50% PEG (Sigma)使免 疫小鼠的脾細胞的單細胞懸液與四分之一數目的SP2/0非 0 分泌小鼠骨髓瘤細胞（ATCC，CRL 1581 )融合。以約 1x10 5/孔在平底微量滴定板中接種細胞，然後用含如下成 分的選擇性培養基孵育約兩周：1 0%胎牛血清、1 0% P3 88D1 (ATCC, CRL TIB-63)條件培養基、3-5%的 Origen (IGEN)的 DMEM ( Mediatech, CRL 10013，含高糖，L-穀氨醯胺和丙酮酸鈉）溶液，以及5 mM HEPES、0.055 mM 2-锍基乙醇、50 mg/ml慶大黴素和lx HAT (Sigma, CRL P-7185)。1-2周後，用其中HAT被HT替換的培養 〇 基培養細胞。然後採用ELISA (如上所述）針對各孔篩選 人抗PTK7單選殖IgG抗體。當雜交瘤廣泛生長後，通常 在10-14天後監測培養基。再次接種分泌抗體的雜交瘤、 再次篩選，並且，如果仍對人IgG呈陽性，則藉由限制性 稀釋將抗PTK7單選殖抗體亞選殖至少兩次。然後體外培 養穩定的亞選殖以在組織培養基中產生少量抗體用作進一 步的表徵之用。 選擇雜交瘤選殖3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和 7C8進行進一步的分析。 -159- 200938223 實例 2:人單選殖抗體 3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和7C8的結構表徵 編碼 3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和 7C8 單選殖 抗體的重鏈和輕鏈可變區的cDNA序列係藉由標準PCR技 術分別從 3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a 和 7C8 雜交瘤 中獲得的，並採用標準DNA測序技術進行測序。 3 G8的重鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 1A 和 SEQ ID NO:41 和 1 所示。 3 G8的輕鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 1B 和 SEQ ID NO:45 和 5 所示。 將3 G8重鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球蛋 白重鏈序列相比較，證明瞭該3G8重鏈使用了來自人種系 VH 3-30.3的VH區段、不確定的D區段和來自人種系JH 4b的JH區段。3G8 VH序列與種系VH 3-30.3序列的比對 示於圖5中。使用測定CDR區域的Kabat系統對3G8 VH 序列進一步分析，得到分別如圖1A和5，以及SEQ ID NO: 11、15和19所示的重鏈CDR1、CDR2和CD3區域的 示意圖。 將3G8輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球蛋 白輕鏈序列相比較，證明瞭該3 G8輕鏈使用了來自人種系 VK L1 5的VL區段和來自人種系JK 1的JK區段。3G8 VL序列與種系VK L 1 5序列的比對示於圖9中。使用測定 CDR區域的Kabat系統對3G8 VL序列進一步分析，得到 分別如圖1B和9，以及SEQ ID NO: 23、29和35所示的 200938223 輕鏈CDRl、CDR2和CD3區域示意圖。 3 G8a的重鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 1A 和 SEQ ID NO:41 和 1 所示。 3 G 8 a的輕鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 1C 和 SEQ ID ΝΟ··46 和 6 所示。 將3G8a重鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球 蛋白重鏈序列相比較，證明瞭該3G8a重鏈使用了來自人 種系VH 3-3 0.3的VH區段、不確定的D區段和來自人種 系JH 4b的JH區段。3G8a VH序列與種系VH 3-30.3序 列的比對示於圖5中。使用測定CDR區域的Kabat系統 對3G8a VH序列進一步分析，得到分別如圖1A和5，以 及SEQ ID NO: 11、15和19所示的重鏈CDRl、CDR2和 CD3區域的示意圖。 將3 G8a輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球 蛋白輕鏈序列相比較，證明瞭該3G8a輕鏈使用了來自人 種系VK L15的VL區段和來自人種系JK 3的JK區段。 3G8a VL序列與種系VK L15序列的比對示於圖9中。使 用測定CDR區域的Kabat系統對3G8a VL序列進一步分 析，得到分別如圖1 C和9，以及SEQ ID NO: 24、30和 36所示的輕鏈CDRl、CDR2和CD3區域的示意圖。 4D5的重鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 2A 和 SEQIDNO:42 和 2 所示。 4 D 5的輕鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 2B 和 SEQ ID NO:47 和 7 所示。 -161 - 200938223 將4D 5重鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球蛋 白重鏈序列相比較，證明瞭該4D5重鏈使用了來自人種系 VH 3-30.3的VH區段、不確定的D區段和來自人種系JH 4b的JH區段。4D5 VH序列與種系VH 3-30.3序列的比對 示於圖6中。使用測定CDR區域的Kabat系統對4D5 VH 序列進一步分析，得到分別如圖2A和6，以及SEQ ID NO: 12、16和20所示的重鏈CDR1、CDR2和CD3區域的 示意圖。 將4D5輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球蛋 白輕鏈序列相比較，證明瞭該4D 5輕鏈使用了來自人種系 VK A10的VL區段和來自人種系JK 5的JK區段。4D5 VL序列與種系VK A10序列的比對示於圖1〇中。使用測 定CDR區域的Kabat系統對4D5 VL序列進一步分析，得 到分別如圖2B和10，以及SEQ ID NO: 25、3 1和37所 示的輕鏈CDR1、CDR2和CD3區域的示意圖。 1 2 C 6的重鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 3A 和 SEQ IDNO:43 和 3 所示。 1 2 C 6的輕鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 3B 和 SEQIDNO:48 和 8 所示。 將12C6重鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球 蛋白重鏈序列相比較，證明瞭該〗2C6重鏈使用了來自人 種系VHDP44的VH區段、不確定的D區段和來自人種系 JH 4b的JH區段。12C6 VH序列與種系VH DP44序列的 比對示於圖7中。使用測定CDR區域的Kabat系統對 -162- 200938223 1 2 C 6 V Η序列進一步分析，得到分別如圖3 A和7，以及 SEQ ID NO： 13、17 和 21 所示的重鏈 CDR1、CDR2 和 CD3區域的示意圖。 將12C6輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球 蛋白輕鏈序列相比較’證明瞭該12C6輕鏈使用了來自人 種系VK A2 7的VL區段和來自人種系jk 2的JK區段。 12C6 VL序列與種系VK A27序列的比對示於圖11中。使 U 用測定CDR區域的Kabat系統對12C6 VL序列進一步分 析，得到分別如圖3 B和1 1，以及S E Q ID Ν 0: 2 6、3 2和 38所示的輕鏈CDR1、CDR2和CD3區域的示意圖。 1 2C6a的重鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 3A 和 SEQ ID NO:43 和 3 所示。 1 2C6a的輕鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 3C 和 SEQ IDNO: 49 和 9 所示。 將12C6a重鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球 Q 蛋白重鏈序列相比較，證明瞭該12C6a重鏈使用了來自人 種系VH DP4 4的VH區段、不確定的D區段和來自人種系 JH 4b的JH區段。12C6a VH序列與種系VH DP44序列的 比對示於圖7中。使用測定CDR區域的Kabat系統對 12C6a VH序列進一步分析，得到分別如圖3A和7，以及 SEQ ID NO: 13、17 和 21 所示的重鏈 CDR1、CDR2 和 CD3區域的示意圖。 將12C6a輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球 蛋白輕鏈序列相比較，證明瞭該12C6a輕鏈使用了來自人 -163- 200938223 種系VK L15的VL區段和來自人種系JK 2的JK區段。 12C6a VL序列與種系VK L15序列的比對示於圖12中。 使用測定CDR區域的Kabat系統對12C6a VL序列進一步 分析，得到分別如圖3 C和1 2，以及S E Q ID Ν Ο : 2 7、3 3 和39所示的輕鏈CDR1、CDR2和CD3區域的示意圖。 7C8的重鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 4A 和 SEQ ID NO:44 和 4 所示。 7C8的輕鏈可變區的核苷酸和胺基酸序列分別如圖 4B 和 SEQ ID NO: 50 和 10 所示。 將7C8重鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球蛋 白重鏈序列相比較，證明瞭該7C8重鏈使用了來自人種系 VH 3-33的VH區段、來自人種系3-10的D區段和來自人 種系JH 6b的JH區段。7C8 VH序列與種系VH 3-33序列 的比對示於圖8中。使用測定CDR區域的Kabat系統對 7C8 VH序列進一步分析，得到分別如圖4A和 8，以及 SEQ ID NO: 14、18 和 22 所示的重鏈 CDR1、CDR2 和 CD3區域的示意圖。 將7C8輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人種系免疫球蛋 白輕鏈序列相比較，證明瞭該7C8輕鏈使用了來自人種系 VK L6的VL區段和來自人種系JK 3的JK區段。7C8 VL 序列與種系 VK L6序列的比對示於圖13中。使用測定 CDR區域的Kabat系統對7C8 VL序列進一步分析’得到 分別如圖4B和13，以及SEQ ID NO: 28、34和40所示 的輕鏈CDR1、CDR2和CD3區域的示意圖。 -164- 200938223 實例3 : mAb 12C6的突變和其他種系的使用 如以上實例2所述，單選殖抗體12C6和12C6a使用 了來自 HuMab小鼠®品系的HCo7轉基因中存在的人DP-44種系序列的一重鏈可變區。由於DP-44並非係天然人 類免疫球蛋白所有組分中使用的種系序列，因此有利於將 1 2 C 6和1 2 C 6 a的V Η序列突變以減小潛在免疫原性。優選 g 地，將12C6或12C6a VH序列的一或多個框內殘基突變 爲一條結構上相關的VH種系序列的框記憶體在的一或多 個殘基，所述VH種系序列係天然人類免疫球蛋白所有組 分中使用的種系序列。例如，圓7顯示了 12C6和12C6a VH序列與DP44種系序列、以及兩個結構上相關的人種系 序列VH3-23和VH3-7的比對。鑒於這些序列的相關性， 本領域技術人員可預測到他們可選擇出一特異性結合人 PTK7，並使用來自VH3-23或VH3-7種系序列的VH區域 〇 的人類抗體。此外，本領域技術人員還可將12C6或 12C6a VH序歹IJ內、與VH 3-23或VH 3-7序列相應位置的 殘基不同的一或多個殘基，突變成VH 3-23或VH 3-7中 存在的殘基，或者突變成其保守的胺基酸替換。 實例4 : 抗PTK7人類單選殖抗體的結合特異性和結合動 力學的表徵 在本實例中，用Biacore分析法測定抗PTK7抗體的 親緣和結合動力學。用流式細胞術檢測結合特異性和交叉 -165- 200938223 競爭性。 藉由流式細胞術檢測的結合特異性 形成了細胞表面表現重組人PTK7的HEK3細胞系， 並藉由流式細胞術被用來測定PEK7人單選殖抗體的特異 性。用含編碼跨膜形式的PTK7的全長cDNA的表現質粒 轉染HEK3細胞。藉由使轉染細胞與濃度爲10 gg/ml的抗 PTK7人單選殖抗體一起酔育來測定7C8抗PTK7人單選 殖抗體的結合。洗滌細胞並用FITC標記的抗人IgG Ab檢 測結合。採用 FACScan流式細胞術（Becton Dickinson, San Jose, CA)進行流式細胞分析。其結果如圖14所示。 抗PTK7人單選殖抗體7C8與轉染有PTK7的HEK3細胞 結合，但不與未轉染人PTK7的HEK3細胞結合。該資料 表明了抗PTK7人單選殖抗體對PTK7的特異性。 藉由ELISA測定的結合特異性 還用標準ELISA測定了抗PTK7抗體的結合，以檢測 其結合PTK7的特異性。 測試了重組的PTK7胞外域針對不同濃度的抗PTK7 人單選殖抗體3G8、4D5、12C6和12C6a的結合。進行標 準ELISA步驟。加入抗PTK7人單選殖抗體，初始濃度爲 10 pg/ml’並以1:2的稀釋度系列逐次（serially)進行稀 釋。使用共軛辣根過氧化物酶（HRP )的山羊抗人IgG ( κ 鏈特異性）多選殖抗體作爲二抗。結果如圖15所示。抗 PTK7人單選殖抗體3G8、4D5、12C6和12C6a均與PTK7 200938223 結合。該資料表明了抗PTK7人單選殖抗體對PTK7的特 異性。 抗PTK7抗體的抗原決定位作圖 採用流式細胞術確定抗PTK7 HuMAb的抗原決定位分 型。用含編碼跨膜形式的PTK7的全長cDNA的表現質粒 轉染Wilms腫瘤細胞G-401 ( ATCC保藏號 CRL-1441) U 。藉由將lxlO5個轉染細胞與lOpg/ml冷的抗PTK7人單 選殖抗體一起赙育，然後洗滌並加入l〇Kg/ml共軛螢光素 的抗PTK7人單選殖抗體來測定每種抗PTK7人單選殖抗 體的抗原決定位結合。用FITC標記的抗人IgG Ab檢測結 合。用 FACScan 流式細胞術（Becton Dickinson, San Jose，CA)進行流式細胞分析。分析資料後，將抗PTK7 抗體分爲3類抗原決定位——A類，包括7D11;B類，包 括3G8和3G8a;以及C類，包括7C8、12C6和12C6a。
G 實例5 :抗PTK7抗體與表現於人癌細胞表面的PTK7結合 的表徵 用腎胚細胞瘤Wilms腫瘤細胞系G-401 (ATCC保藏 號CRL-1441)測定不同濃度的HuMAb抗PTK7人單選殖 抗體12C6和7C8的結合。藉由將lxlO5個細胞與抗體一 起毈育來測定抗PTK7人單選殖抗體的結合，所述抗體起 始濃度爲30pg/ml，並以1:10的比例連續稀釋。洗滌細胞 ，並用PE標記的抗人IgG Ab檢測結合。採用FACScan -167- 200938223 流式細胞術（Becton Dickinson，San Jose, CA)進行流式 細胞分析。結果如圖16所示。藉由平均染色螢光強度（ MFI)測得，抗PTK7單選殖抗體12C6和7C8濃度依賴性 地與腎胚細胞瘤Wilms腫瘤細胞系結合。抗PTK7單選殖 抗體12C6和7C8的EC5G値分別爲4.0 nM和3.4 nM。 這些資料表明抗PTK 7 HuM Ab與腎癌細胞系結合。 實例6 :人抗PTK7抗體與癌細胞系的結合 藉由流式細胞術測量抗PTK7抗體與多種癌細胞系的 結合。 藉由將癌細胞系與濃度爲10 pg/ml的抗PTK7人單選 殖抗體一起孵育來測定 3G8、12C6a、4D5和 12C6抗 PTK7人單選殖抗體與一組癌細胞系的結合。測試的癌症 細胞系爲A-431 (ATCC保藏號CRL-1555)、Wilms腫瘤細 胞 G-401 (ATCC 保藏號 CRL-1441)、Saos-2 (ATCC 保藏號 HTB-85)、SKOV-3 (ATCC 保藏號 HTB-77)、PC3 (ATCC 保藏號 CRL- 1 43 5)、DMS 114 (ATCC 保藏號 CRL-2066)、 ACHN (ATCC 保藏號 CRL-161 1)、LNCaP (ATCC 保藏號 CRL- 1 740)、DU 145 (ATCC 保藏號 HTB-81)、LoVo (ATCC 保藏號 CCL-229)和 MIA PaCa-2 (ATCC 保藏號 CRL- 1 42 0)。使用同種型對照抗體作爲陰性對照。洗滌細 胞，並用 FITC標記的抗人IgG Ab檢測結合。使用 FACScan 流式細胞術（Becton Dickinson，San Jose, CA) 進行流式細胞分析。結果示於圖1 7中。藉由平均染色螢 -168- 200938223 光強度（MFI)測得，抗PTK7單選殖抗體3G8、12C6a、 4D5和12C6與癌細胞系A-431、Wilms腫瘤細胞 G_401 、Saos-2、SKOV-3、PC3、DMS 114, ACHN、LNCaP ' DU 145、LoVo和 MIA PaCa-2結合。這些資料表明抗PTK7 HuMAb與多種表現細胞表面ΡΤΚ7的癌細胞結合。 實例7 :抗PTK7與人T、B和樹突細胞的結合 0 採用流式細胞術測試抗PTK7抗體與細胞表面表現 PTK7的CD4+、CD8+ T細胞，CD19+ B細胞和人血液髓 樣樹突細胞的結合。 抗CD3抗體啓動人T細胞以誘導T細胞上的PTK7 表現，然後與人抗PTK7單選殖抗體結合。藉由將細胞與 濃度爲10 pg/ml的抗PTK7人單選殖抗體一起孵育來測定 7c 8抗PTK7人單選殖抗體的結合。在一些實驗中，使用 已知的可結合T和B細胞特異性標記物的已知抗體作爲陽 φ 性對照。洗滌細胞，並用FITC標記的抗人IgG Ab檢測結 合。採用 FACScan 流式細胞術（Becton Dickinson, San Jose，CA)進行流式細胞分析。結果如圖18 (被啓動的人 T細胞和B細胞）和19(樹突細胞）所示。藉由平均染色 螢光強度（MFI )測得，抗PTK7單選殖抗體7C8結合被 啓動的人CD4 +和CD 8+ T細胞以及樹突細胞，但不結合B 細胞。這些資料表明了該抗PTK7 HuMAb與人T細胞和樹 突細胞結合。 -169- 200938223 實例8 :抗PTK7單選殖抗體的內化 採用Hum-Zap內化測定法測量抗PTK7 HuMAb內化 至表現PTK7的細胞系中的能力。Hum-Zap測定法可藉由 與細胞毒素皂草素共軛的人IgG親和的二抗的結合來測量 人類一抗的內化。 在100 μΐ的孔中以lxlO4細胞/孔直接接種表現 PTK7的癌細胞系Wilms腫瘤G-401 (ATCC保藏號CRL-1441)、A-431 (ATCC 保藏號 CRL- 1 5 55)和 PC3 (ATCC 保 藏號CRL-1435)。向各孔中加入抗PTK7 HuMAb抗體3G8 、4D5、12C6或7C8，起始濃度爲30 ιιΜ，以1:3比例連 續稀釋。對用對PTK7非特異性的同種型對照抗體作爲陰 性對照。以 11 nM的濃度加入 Hum-Zap ( Advanced Targeting Systems, San Diego, CA，IT-22-25 )，將板孵育 72小時。然後用1.0 μ(：ί的3 H-胸苷對板脈衝24小時，收 集並用 Top Count 閃爍計數器（Packard Instruments, Meriden，CT)讀數。結果示於圖20 A-D中。抗PTK7抗 體3G8、4D5、12C6和7C8可抗體濃度依賴性地降低表 現PTK7的Wilms腫瘤癌細胞系中3H-胸苷的摻入量。抗 PTK7抗體12C6和7C8可抗體濃度依賴性地降低表現 PTK7的癌細胞系A-431和PC3中3H-胸苷的摻入量。抗 PTK7抗體3G8、4D5、12C6和7C8在Wilms腫瘤細胞中 的 EC5〇 値分別爲 〇·6 nM、0_3 nM、0.2 nM 和 0.2 nM。抗 PTK7抗體12C6和7C8在A-431細胞中的EC5〇値分別爲 0.2 nM 和 0.2 nM。抗 PTK7 抗體 12C6 和 7C8 在 PC3 腫瘤 -170- 200938223 細胞中的EC5〇値分別爲〇·3 nM和0.3 nM。該資料表明了 抗pTK7抗體3G8、4D5、12C6和7C8可被內化至腫瘤細 胞內。 實例9:共軛細胞毒素的抗PTK7抗體對人癌細胞系的細 胞殺傷測定 在本實例中，在細胞增殖測定中，共軛細胞毒素的抗 0 PTK7單選殖抗體顯示出對PTK7 +人癌細胞系的殺傷。抗 PTK7抗體可能藉由連接基團與細胞毒素共軛，所述連接 基團如肽基、腙或二硫化物連接子。可與本發明之抗體以 及連接基團共軛的細胞毒素化合物的實例在本申請和2005 年9月26日提交的美國專利申請No. 60/720,499中均有 描述，該文獻藉由引用的方式全文納入本文。 抗PTK7抗體1F12(SEQ ID NO:84-98 )與本文公開 的式（q)共軛，生成1F12-式（q)。共軛方法如下：100 ❹ mM 磷酸鈉、50 mM NaCl、2 mM DTPA(pH 8.0)中約 5 mg/ml的抗體，用摩爾數過量15倍的2-亞氨硫醇室溫連 續混合進行硫醇化（thiolated ) 1小時。硫醇化後，用共 軛緩衝液（50 mM HEPES、5 mM甘氨酸、3%甘油，pH 6.0)藉由PD10柱（Sephadex G-25)對硫醇化的1F12進 行緩衝液交換。測定硫醇化抗體的濃度和硫醇濃度。以每 抗體锍基3倍過量的摩爾數加入5 mM式（q)的DMSO儲 液，室溫混合90分鐘。用0.2 μιη濾膜過濾共軛的抗體。 藉由分子排阻色譜法，將得到的共軛物在Sephacryl-200 -171 - 200938223 分子大小排阻柱上用50 mM HEPES、5 mM 甘氨酸、100 mM NaCl ( pH 7.2 )的溶液過柱純化。收集含單體抗體共 軛物的部分，並超濾濃縮。測量280和340nm處的吸收度 ，測定抗體共軛物濃度和取代比例。 將表現PTK7的Wilms腫瘤人腎癌細胞系 G-401 (
ATCC保藏號CRL-1441)以1〇4細胞/孔接種于100 μΐ孔 中3小時。向孔中加入1F12-式（ρ)，初始濃度爲100 ηΜ ，並以1:3的比例連續稀釋。將板孵育48小時。然後用 U 1μ(：ί的3Η-胸苷對板脈衝24小時，之後終止培養、收集 並用 Top Count 閃爍計數器（Packard Instruments)讀數 。圖21表明隨著1F12-式（ρ)濃度增加，表現PTK7的 Wilms腫瘤人腎癌細胞系中3 H-胸苷的摻入量減少。這些 資料證明瞭與細胞毒素共軛的抗PTK7抗體顯示出了對人 腎癌細胞具有特異的細胞毒性。 實例10 :細胞毒素共軛的抗PTK7抗體細胞殺傷評價 ❹ 在本實例中，與細胞毒素共軛的抗PTK7單選殖抗體 在細胞增殖測定中被證明，可殺傷細胞表面低、中或高表 現PTK7的PTK7 +人腫瘤細胞系。 將抗PTK7 HuMAb抗體12C6a與式（ρ)共軛，得到以 12C6a-式（ρ)表示的抗體共軛物。12C6a與式（P)的共軛如 下進行：用摩爾數過量15倍的2-亞氨硫醇對mM磷 酸鈉、50 mM NaCl、2 mM DTPA(pH 8.0)中約 5 mg/ml 的1 2C6a硫醇化。硫醇化反應在室溫下連續攪拌進行1小 -172- 200938223 時。硫醇化後’用共軛緩衝液（50 mM HEPES、5 mM甘 氨酸、3%甘油 ρΗ6·0)藉由 PD10 柱（SephadexG-25)對 抗體進行緩衝液交換。測定硫醇化抗體的濃度和硫醇濃度 以每抗體巯基3倍過量的摩爾數加入5 mM式（p)的 DMSO儲存液，室溫混合90分鐘。用0·2μηι濾膜過濾共 軛的抗體。藉由分子排阻色譜法，將得到的共軛物在 Sephacryl-200分子大小排阻柱上用50 mM HEPES、5 mM 甘氨酸、100 mM NaCl ( pH 7.2 )的溶液過柱純化。收集 含單體抗體共軛物的部分’並超濾濃縮。測量 280和 3 4Onm處的吸收度，測定抗體共軛物濃度和取代比例。 將表現PTK7的人腫瘤癌細胞系 A-431、SKOV3和 LoVo以104細胞/孔接種於1〇〇μ1的孔中。該細胞系預先 用標準FACS測定法檢測ΡΤΚ7的細胞表面表現。Α-43 1 細胞系具有最高水準的PTK7細胞表面表現’ LoVo細胞系 具有最低水準的PTK7細胞表面表現。向孔中加入12C6a-式（P)，起始濃度爲20 nM ’並以1 :2的比例連續稀釋。使 用同種型對照抗體作爲陰性對照。將板孵育3小時，洗去 未結合的（無）抗體-細胞的毒素共軛物。將板繼續孵育 96 小時，採用 CellTiter-Glo®發光測定法（Promega，WI， USA，Technical bulletin No. 2 8 8 )和 BIO-TEK 讀數儀（ Bio-Tek Instruments，Inc, VT，USA)測量殺細胞活性（FU ，螢光單位）。結果如圖22所示。12C6a-式（p)在所有三 種細胞系中均顯示出活細胞呈濃度依賴性減少’這證明瞭 -173- 200938223 與細胞毒素共軛的抗PTK7抗體顯示出了對各種人癌細胞 的特異性細胞毒性。 實例11: 3G8、12C6a、2E11和7C8的免疫組織化學 用來自以下癌症的臨床活檢組織，藉由免疫組織化學 測定抗 PTK7 HuMAb 3G8、12C6a、2E1 1 和 7C8 識別 PTK7的能力：肺癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、胰臟癌、結 腸癌、卵巢癌、小腸癌、攝護腺癌、黑色素瘤和頭頸癌。 使用5 μπι的冷凍切片進行免疫組織化學測定（ Ardais Inc, USA)。乾燥30分鐘後，用乙酸固定切片（ 室溫下10分鐘），風乾5分鐘。將玻片用PBS漂洗’然 後用含10%的正常山羊血清的PBS液孵育玻片20分鐘， 並隨後在10%正常山羊血清的PBS液中用10 pg/ml溶於 的 FITC 化（fitcylated )的 3G8、12C6a 或 2E1 1 抗體在 室溫下毈育30分鐘。然後’用PBS洗滌玻片3次，並在 室溫下用小鼠抗FITC (lOpg/ml DAKO)孵育30分鐘。再 用PBS洗滌玻片，並在室溫下用山羊抗小鼠HRP共軛物 (DAKO )孵育30分鐘。再用PBS洗滌玻片3次。使用 二氨基聯苯（Sigma )作爲底物，得到棕色染色。用蒸餾 水洗滌後，用蘇木素對玻片進行染色計數1分鐘。隨後， 用流動的蒸餾水洗滌玻片1〇秒鐘’並用 G1ycergel ( DAKO )封固。肺癌、乳癌、膀胱癌、胰臟癌、結腸癌、 卵巢癌、小腸癌和攝護腺癌切片的臨床活檢組織免疫組織 化學染色顯示出陽性染色。正常組織對於PTK7染色始終 -174- 200938223 爲陰性’但在惡性組織中，癌啓動的成纖維細胞和癌性上 皮細胞均被觀察到對PTK7染色呈陽性。藉由用成纖維細 胞啓動蛋白抗體（FAP，Alexis Biochemicals，San Diego, USA)染色證實了，在膀胱癌和乳癌切片中存在癌啓動的 成纖維細胞。FAP係一已知的癌啓動成纖維細胞標記物（ Hofheinz et al. (2003) On c ol o gie 26:44-48 )。 預先將7C8與FITC標記的山羊抗人Fab(Jackson # Q 1〇9-〇97-003 )混合，使7C8終濃度爲5 /ml。然後，對 該混合物用標準IHC法測定結合。7C8與卵巢癌、胰臟癌 、肺癌（小細胞和非小細胞）、黑色素瘤、腎癌、結腸癌 、乳癌、膀胱癌和頭頸癌。 實例1 2 :侵襲測定 在本實例中，測定了針對PTK7的抗體在PTK7轉染 的CHO細胞系中影響細胞侵襲的能力。 ❹ 使用 HTS 96-多孔插入系統（Multiwell Insert System )(Cat# 35 1 1 62, BD Biosciences, CA)根據其方案進行測定 。將CHO母細胞系、轉染有全長PTK7的CHO細胞或對 照HEK293細胞系與抗PTK7 HuMab混合物或同種型對照 抗體混合，然後將細胞加至插入物中。將混合物（細胞+ 抗體混合物）加入至侵襲板的插入孔中。在3 7 °C、5 % C02條件下孵育24小時後，用螢光染料標記細胞，並使 用螢光板讀數儀對侵襲至膜底部的細胞定量。結果示於圖 23中。該資料證明瞭抗PTK7抗體可抑制細胞表面表現 -175- 200938223 PTK7的細胞的侵襲活動。 實例13:使用了未修飾的和細胞毒素共軛的抗PTK7抗體 進行的胰臟癌細胞異種移植模型體內治療 本實例證明，共軛細胞毒素的抗PTK7抗體在移植有 胰臟癌細胞腫瘤的小鼠中可抑制腫瘤生長。可與本發明之 抗體共軛的細胞毒素化合物的實例在未審結的美國專利申 請11/134,826中有描述，該文獻藉由引用的方式全文納入 本文。測定了本文所述的兩種HuMAb抗PTK7抗體-毒素 共軛物：7C8-式（〇)和7C8-式（p)。 使用上文實例10所述的方法將式（P)與7C8共軛。 式（0)與7C8的共軛方法如下：對於溶於100 mM磷酸鈉 ' 50 mM NaCl、2 mM DTPA(pH 8.0)中的約 5 mg/ml 的 抗體7C8，用摩爾數過量15倍的2-亞氨硫醇藉由室溫下 連續混合進行硫醇化1小時。然後，用共軛緩衝液（5 0 mMHEPES、5mM 甘氨酸、0.5% 聚維酮（10K) 、2mM DTPA，pH 5.5)藉由 PD10 柱（Sephadex G-25)對抗體進 行緩衝液交換。測定硫醇化抗體的濃度和硫醇濃度。以每 抗體锍基3倍過量的摩爾數加入5 mM式（〇)的DMS◦儲 液（r = 4 )，室溫混合90分鐘。用0.2μιη濾膜過濾共軛的 抗體。共軛後，以每抗體锍基10倍過量的摩爾數加入100 mM Ν-己基順丁烯二醯亞胺的DMSO液，以終止未反應的 锍基。該終止反應在室溫下連續混合進行1小時。在NEM 的存在下孵育後，藉由分子排阻色譜法，將得到的共軛物 -176- 200938223 在Sephacryl-200分子大小排阻柱上用50 mM HEPES、5 mM甘氨酸、100 mM NaCl(pH 6.0)的溶液過柱純化。 彙集含單體抗體共軛物的級分，並超濾濃縮。藉由測量 280和34〇nm處的吸光度測定抗體共軛物濃度和取代比例 〇 多種胰臟癌細胞類型可被用於證明抗PTK7抗體可抑 制腫瘤。在本實例中，選擇HPAC (人胰臟癌，ATCC保 0 藏號CRL-21 19 )並使用標準實驗室方法進行體外擴增。 在每只6-8周齡的雄性Ncr無胸腺裸鼠（Taconic，Hudson, NY)右側皮下植入0.2 ml含2·5 xlO6 HPAC細胞的PBS /基質膠（Matrigel) (1:1)。對小鼠稱重，並在植入後， 用電子測徑器每兩周對腫瘤進行立體測量。腫瘤體積以高 X寬X長/2來計算。將荷有平均90 mm3的HPAC腫瘤的小 鼠隨機分至處理組。如圖2 4所示，在第〇天，以所述劑 量（μηιοΐ/kg )靜脈內給予小鼠單劑量的PBS載體、未修 〇 飾的抗ΡΤΚ7抗體、7C8-式（〇)或7C8-式（Ρ)。給藥後監測 小鼠的腫瘤生長61天。當腫瘤達到腫瘤終點（2000 mm3 )或潰爛時，將小鼠無痛致死。7C8抑制腫瘤生長進程， 並且7C8共軛物被證明可顯著提高抑制率（圖24) 。7C8 共鈪物的抗腫瘤效應爲劑量依賴性，劑量爲0.3 μπιοΐ/kg 時觀察到最大效應。抗體共軛物的治療被良好耐受，受試 者的體重減輕中位數不會高於5% (資料未顯示）。因此 ，抗PTK7抗體-細胞毒素共軛物的治療對胰臟癌腫瘤生長 有直接的體內抑制效果。 -177- 200938223 實例14:使用未修飾的和細胞毒素共轭的抗PTK7抗體進 行的乳癌細胞異種移植模型體內治療 本實例證明瞭，抗PTK7抗體共軛物可抑制體內乳癌 腫瘤生長。使用標準實驗室方法’擴增MCF 7-adr細胞’ 該細胞係對阿黴素具有抗性的人乳癌細胞。對6-8周齡的 雌性 CB17.SCID 小鼠（Taconic，Hudson，NY)皮下植入 1.7 mg的90天內釋放的雌激素藥九，其大小爲3.0 mm (Innovative Research of America, Sarasota, F L )。在頸 部給予雌激素，1天後每只小鼠在右側皮下植入〇·2 ml含 1〇χ106 MCF7-Adr細胞的PBS/基質膠（1:1)。對小鼠稱重 ，並在植入後，用電子測徑器每兩周對腫瘤進行立體測量 。腫瘤體積以高x寬x長/2來計算。將荷有平均160 mm3的 MCF7-adr腫瘤的小鼠隨機分至處理組。在第〇天’對小 鼠給予PBS載體、靜脈內給予〇.1 Mmol/kg單劑量的未修 飾的7C8或7C8 -式（〇)。給藥後監測小鼠的腫瘤生長63天 。當腫瘤潰爛時，將小鼠無痛致死。結果示於圖25中。 7C8-式（〇)抑制腫瘤生長。因此’應用抗PTK7抗體-細胞 毒素共軛物的治療對乳癌腫瘤生長有直接的體內抑制效果 實例15: 7C8毒素共軛物的體內腫瘤抑制作用 在本實例中，證明瞭毒素共軛的7C8在體內SCID小 鼠模型中可抑制上皮細胞和肺腫瘤生長。在本實例中’將 7C8與式（m)共軛。式（m)的結構示於圖28中。式（m)及其 -178- 200938223 製備在 2006年 12月 28日提交的美國專利申請 60/882,46 1中有進一步的描述，該文獻藉由引用的方式特 別地全文納入本文。7C8 -式（m)共軛物的製備如下：
將抗PTK7抗體7C8濃縮至約5 mg/ml’用1〇〇 mM 磷酸鹽緩衝液、50 mM NaCl、2 mM DTPA(pH 8.0)交換 緩衝液，加入摩爾數過量8-10倍的2 -亞氨硫醇在室溫下 硫醇化60分鐘。硫醇化後，用含300 mM甘氨酸、2 mM 0 DTPA和0.5%聚維酮 （10 K)的50 mM HEPES緩衝液（ PH5.5 )對抗體進行緩衝液交換。用4,4’’-二硫二吡啶（ dithiodipyridine )藉由測量 324 nM 處的硫啦陡（ thiopyridine)釋放來量化硫醇化。以藥物/锍基3:1的摩 爾比加入含式（m)的馬來醯亞胺來進行共軛。在室溫下 孵育60分鐘，然後向反應混合物中以N-己基順丁烯二醯 亞胺（NEM ) /硫醇1 0: 1的摩爾比加入NEM，以終止未反 應的锍基。該終止反應在室溫連續混合下進行1小時。 〇 然後將抗體藥物共軛物進行0.2 μιη過濾，之後進行 陽離子交換色譜純化。用5 CV (柱體積）的 50 mM HEPES、5 mM 甘氨酸、1M NaCl ( pH 5.5 )再生 SP Sepharose高效陽離子交換柱（CEX)。再生後，用3 CV 的平衡緩衝液（50 mM HEP ES、5 mM甘氨酸、pH 5.5) 平衡柱子。載入7C8-式（m)共軛物，用平衡緩衝液洗柱一 次。用 50 mM HEPES、5 mM 甘氨酸、230 mM NaCl(pH 5.5)洗脫共軛物。收集洗脫液級分。用50 mM HEPES、5 mM甘氨酸1M NaCl(pH 5.5)再生柱子以除去蛋白聚集 -179- 200938223 體和所有未反應的式（m)。洗脫級分的彙集基於聚集水 準和取代比例（SR)，即每摩抗體的藥物摩爾數。彙集標 準爲藉由SEC-HPLC測得單體δ 95%且SR範圍爲1-2。藉 由帶有 PES 膜的 10 NMWCO 平層（flat-sheet ) TFF 盒，
用大量透析緩衝液（30 mg/ml蔗糖、10 mg/ml甘氨酸、 pH 6.0)對純化的CEX洗脫彙集液進行緩衝液交換。藉由 將蛋白濃度稀釋至5 mg/ml，並向透析過濾（diafilter)後 的共轭物溶液中加入終濃度爲10 mg/ml的Dextran 40製 Q 備批量製劑。配製的製劑經0.2 μπι PES濾膜過濾至無菌 PETG中，並於2°C至8°C下保存。 然後測定7C8和7C8-式（m)對小鼠模型體內A431異 種移植腫瘤的生長的作用。A431係一表現PTK-7的上皮 細胞系，因此代表了表現PTK-7蛋白質的上皮細胞癌症， 包括乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、腎癌、頭頸癌、膀胱癌 、攝護腺癌和胰臟癌。此外，已經藉由FACS和IHC證明 7C8可結合代表這些疾病的細胞系和癌症。PTK7有時還 ❹ 在啓動的上皮癌間質上表現。抗PTK7抗體藥物共軛物例 如7C 8-式（m)在這些癌症中會具有抗癌活性。這一點與 抗RG-1毒素共軛物的活性類似。RG-1也係在細胞間質上 表現。美國專利申請60/991,690中記載了抗RG-1抗體藥 物在攝護腺癌異種移植模型中的抗癌活性。 在A43 1異種移植模型中，將A43 1細胞植入SCID小 鼠（CB17 SCID, Taconic Farms, Germantown, NY )，並 使其生長至腫瘤達到約90 mm3。然後將小鼠隨機化，並 -180- 200938223 用單劑量的載體、〇.3Pm〇1/kg的同種型匹配的人1gG抗體 連接的式（m) (is〇-式（m))、未修飾的7C8或7C8_ 式（m)共軛物（O·3,01/*^)進行腹膜內處理。35天後 定期測量腫瘤體積（圖26)。 未修飾的7C8抗體或同種型匹配的式（m)抗體的處 理未顯示出對A431腫瘤細胞體積有影響（即不抑制腫瘤 生長），而7C8 -式（m)共軛物的處理顯著地抑制腫瘤生 Q 長，如圖26A所示。而且，根據體重測量’當將7C8 -式 (m)共軛物給予小鼠時，該共軛物與毒性不相關（圖27 )° 在另一組分析中，7C8-式（m )共軛物可抑制小鼠異 種移植模型中D M S 7 9細胞來源的小細胞肺癌生長。在該 異種移植模型中，對每只SCID小鼠植入5 X 1〇6 DMS79 細胞，並使其生長至平均腫瘤體積爲約200 mm3。然後將 小鼠隨機化，並用7C8·式（m)共軛物（〇·3 Pmol/kg)進 φ 行腹膜內處理。如圖27C所示，在81天時間內，7C8 -式 (m)共軛物處理在所有小鼠中均導致腫瘤完全消退。 總而言之，抗PTK7抗體毒素共軛物顯著抑制上皮腫 瘤和肺部腫瘤的體內生長’並且在小鼠中並未顯示出明顯 毒性。 實例 16: 7C8-式(m )對短尾猴(Cynomolgus Monkey ) 的毒性測定 短尾猴和人顯示出有相似的ΡΤΚ7表現模式。免疫組 -181 - 200938223 織化學分析顯示，在短尾猴中，7C 8結合與其結合的人類 組織相同的組織。因此，短尾猴適用於評價7C8-式（m) 對靶標的毒性。 對兩隻雄性和兩隻雌性短尾猴靜脈內給予7C8-式（m )。在第1天和第15天給予兩個0.4 μηιοΐ/kg的劑量。觀 察動物的行爲改變、毒性表現，並採血分析。未觀察到行 爲改變。血細胞和化學分析顯示無藥物相關改變。已知表 現ptk7的組織（例如卵巢成纖維細胞）的病理檢查顯示 ，沒有7C8-式（m)誘導的毒性現象。因此，在短尾猴中 未檢測到7C8-式（m )毒性。 SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO: 序列 1 VH a.a. 3G8, 3G8a 22 VH CDR3 a.a. 7C8 2 VH a.a. 4D5 23 VK CDR1 a.a. 3G8 3 VH a.a. 12C6, 12C6a 24 VK CDR1 a.a. 3G8a 4 VH a.a. 7C8 25 VK CDR1 a.a. 4D5 5 VK a.a. 3G8 26 VK CDR1 a.a. 12C6 6 VK a.a. 3G8a 27 VK CDR1 a.a. 12C6a 7 VK a.a. 4D5 28 VK CDR1 a.a. 7C8 8 VK a.a. 12C6 29 VK CDR2 a.a. 3G8 9 VK a.a. 12C6a 30 VK CDR2 a.a. 3G8a 10 VK a.a. 7C8 31 VK CDR2 a.a. 4D5 11 VH CDR1 a.a. 3G8 32 VK CDR2 a.a. 12C6 12 VH CDR1 a.a. 4D5 33 VK CDR2 a.a. 12C6a 13 VH CDR1 a.a. 12C6 34 VK CDR2 a.a. 7C8 14 VH CDR1 a.a. 7C8 35 VK CDR3 a.a. 3G8 15 VH CDR2 a.a. 3G8 36 VK CDR3 a.a. 3G8a 16 VH CDR2 a.a. 4D5 37 VK CDR3 a.a. 4D5 17 VH CDR2 a.a. 12C6 38 VK CDR3 a.a. 12C6 -182- 200938223
SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO: 序列 18 VH CDR2 a.a. 7C8 39 VK CDR3 a.a. 12C6a 19 VH CDR3 a.a. 3G8 40 VK CDR3 a.a. 7C8 20 VH CDR3 a.a. 4D5 41 VH n.t. 3G8, 3G8a 21 VH CDR3 a.a. 12C6 42 VH n.t. 4D5 43 VH n.t. 12C6, 12C6a 71 狀連接子 44 VH n.t. 7C8 72 肽連接子 45 VK n.t. 3G8 73 肽連接子 46 VK n.t. 3G8a 74 肽連接子 47 VK n.t. 4D5 75 肽連接子 48 VK n.t. 12C6 76 肽連接子 49 VK n.t. 12C6a 77 狀連接子 50 VK n.t. 7C8 78 狀連接子 51 VH 3-30.3 種系 a.a· 79 肽連接子 52 VH DP44 種系 a.a. 80 肽連接子 53 VH 3-33 種系 a.a. 81 肽連接子 54 VK L15 種系 a.a. 82 肽連接子 55 VK A10 種系 a.a. 83 肽連接子 56 VKA27 種系 a.a. 84 VH a.a. 1F12 57 VK L6 種系 a.a. 85 VK1 a.a. 1F12 58 PTK7 a.a. 86 VK2 a.a. 1F12 59 JH4b 種系 a.a 87 VH CDR1 a.a. 1F12 60 JH4b 種系 a.a. 88 VH CDR2 a.a. 1F12 61 3-7 種系 a.a. 89 VH CDR3 a.a. 1F12 62 3-23 種系 a.a. 90 VK1 CDR1 a.a. 1F12 63 JH4b 種系 a.a 91 VK1 CDR2 a.a. 1F12 64 JH6b 種系 a.a. 92 VK1 CDR3 a.a. 1F12 65 JKl 種系 a.a. 93 VK2 CDR1 a.a. 1F12 66 JK5 種系 a.a. 94 VK2 CDR2 a.a. 1F12 67 JK2 種系 a.a. 95 VK2 CDR3 a.a. 1F12 68 JK2 種系 a.a. 96 VH n.t. 1F12 69 JK3 種系 a.a. 97 VK1 n.t. 1F12 70 肽連接子 98 VK2 n.t. 1F12 -183- 200938223 【圖式簡單說明】 圖1A示出了 3G8和3G8a人單選殖抗體重鏈可變區 的核苷酸序列（SEQ ID NO:41)和胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:1) 。標出了 CDR1(SEQ ID NO:ll)、CDR2(SEQ ID N〇:15)和 CDR3 (SEQ ID NO:19)區域，並指明了 V、D和J種系來源 ο 圖1Β示出了 3 G8人單選殖抗體輕鏈可變區的核苷酸 序列 （SEQIDNO:45)和胺基酸序列 （SEQIDNO:5)。標 ❹ 出了 CDR1 (SEQ ID NO: 23)、CDR2 (SEQ ID NO:29)和 CDR3 (SEQ IDNO:35)區域，並指明了 V和J種系來源。 圖1C示出了 3G8a人單選殖抗體輕鏈可變區的核苷 酸序列（3£(5 10>10:46)和胺基酸序列（8£()10>10:6)。標 出了 CDR1 (SEQ ID NO:24)、CDR2 (SEQ ID NO:30)和 C DIO (SEQ ID NO :3 6)區域，並指明了 V和J種系來源。 圖2A示出了 4D5人單選殖抗體重鏈可變區的核苷 酸序列（SEQ ID NO:42)和胺基酸序列（SEQ ID NO:2)。標 〇 出了 CDR1 (SEQ ID NO:12)、CDR2 (SEQ ID NO:16)和 CDR3 (SEQ IDNO:20)區域和V、D和J種系來源。 圖2B示出了 4D5人單選殖抗體輕鏈可變區的核苷酸 序列（SEQ ID NO:47)和胺基酸序列（SEQ ID NO:7)。標出 了 CDR1 (SEQ ID NO:25)、CDR2 (SEQ ID NO:3 1)和 CDR3 (3£()1〇]^0:37)區域，並指明了1^和1種系來源。 圖3A示出了 12C6人單選殖抗體重鏈可變區的核苷 酸序列（SEQ ID NO:43)和胺基酸序列 （SEQ ID NO:3)° -184- 200938223 標出了 CDRl (SEQ ID NO:13)、CDR2 (SEQ ID NO:17)和 CDR3 (SEQ ID NO:21)區域，並指明了 V、D和J種系來 源。 圖3B示出了 12C6人單選殖抗體輕鏈可變區的核苷 酸序列（SEQ ID NO:48)和胺基酸序列（SEQ ID NO:8)。標出 了 CDRl (SEQ ID NO:26)、CDR2 (SEQ ID N〇:32)和 CDR3 (8£〇1〇]^0:38)區域，並指明了乂和1種系來源。 D 圖3C示出了 12C6a人單選殖抗體輕鏈可變區的核 苷酸序列（SEQ ID NO:49)和胺基酸序列（SEQ ID NO:9) 。標出了 CDRl (SEQ ID NO:27)、CDR2 (SEQ ID NO:33) 和CDR3 (SEQ ID NO:39)區域，並指明了 V和J種系來源 〇 圖4A示出了 7C8人單選殖抗體重鏈可變區的核苷 酸序列 （SEQ ID NO:44)和胺基酸序列 （SEQ ID NO:4)。 標出了 CDRl (SEQ ID NO: 14)、CDR2 (SEQ ID NO: 1 8)和 〇 CDR3 (SEQ ID NO:22)區域，並指明了 V、D和J種系來 源。 圖4B示出了 7C8人單選殖抗體輕鏈可變區的核苷 酸序列（SEQ ID NO:50)和胺基酸序列（SEQ ID NO:10)。標 出了 CDR1(SEQ ID Ν 0:2 8)、CDR2(SEQ ID NO:34)和 CDR3(SEQ ID NO:40)區域，並指明了 V和J種系來源。 圖 5 示出了 3G8(SEQ ID NO: 1)和 3 G 8 a( S E Q ID Ν Ο : 1)重鏈可變區的胺基酸序列與人種系VH 3-30.3胺基酸序 列（SEQ ID NO:51)(如 SEQ ID NO: 59 公開的 JH4b 種系 -185- 200938223 )的比對. 圖6示出了 4D5 (SEQ ID NO: 2)重鏈可變區的胺基 酸序列與人種系VH 3-30.3胺基酸序列 （SEQ ID NO:51) (如SEQ ID NO: 60公開的JH4b種系）的比對。 圖 7 示出了 12C6 (SEQ ID NO: 3)和 12C6a (SEQ ID NO: 2)重鏈可變區的胺基酸序列與人種系 VH DP44胺基 酸序列（SEQ ID NO:52)(如 SEQ ID NO 61-63 分別公開 的3-7、3-23和JH4b種系）的比對。 圖8 示出了 7C8 (SEQ ID NO: 4)重鏈可變區的胺基 酸序列與人種系VH3-33 胺基酸序列 （SEQIDNO:53)( 如SEQ ID NO: 64公開的JH6b種系）的比對。 圖 9 示出了 3G8 (SEQ ID NO: 5)和 3G8a (SEQ ID NO: 6)輕鏈可變區的胺基酸序列與人種系 Vk L15胺基 酸序列（SEQ ID NO:54)(如 SEQ ID NO: 65 公開的 JK1 種系）的比對。 圖10 示出了 4D5(SEQ ID NO: 7)輕鏈可變區的胺基 酸序列與人種系Vk A10胺基酸序列（SEQ ID NO:55)( 如SEQ ID NO: 66公開的JK5種系）的比對。 圖11 示出了 12C6 (SEQ ID NO: 8)輕鏈可變區的胺 基酸序列與人種系Vk A27胺基酸序列（SEQ ID NO:56)( 如 SEQIDNO: 67公開的JK2種系）的比對。 圖12示出了 12C6a (SEQ ID NO: 9)輕鏈可變區的胺 基酸序列與人種系Vk L15胺基酸序列（SEQ ID NO:54) (如SEQ ID NO: 68公開的JK2種系）的比對。 200938223 圖13 示出了 7C8 (SEQ ID NO: 10)輕鏈可變區的胺 基酸序列與人種系VkL6胺基酸序列（SEQIDNO:57)( 如 SEQ ID NO: 69公開的JK3種系）的比對。 圖14示出了流式細胞術實驗的結果，該結果證明針 對人PTK7的人單選殖抗體7C8與轉染有全長人PTK7的 Η EK3細胞的細胞表面結合。 圖15示出了 ELSIA實驗的結果，該結果證明針對人 Q ΡΤΚ7的人單選殖抗體特異性結合ΡΤΚ7。 圖1 6示出了流式細胞術實驗的結果，該結果證明針 對人ΡΤΚ7的抗體與Wilms’腫瘤細胞的細胞表面結合。 圖17示出了流式細胞術實驗的結果，該結果證明針 對人PTK7的抗體與多種癌細胞系的細胞表面結合。 圖18示出了流式細胞術實驗的結果，該結果證明針 對人PTK7的抗體與樹突細胞的細胞表面結合。 圖1 9示出了流式細胞術實驗的結果，該結果證明針 φ 對人PTK7的抗體與CD4 +和CD8+ T淋巴細胞結合，但不 與B淋巴細胞結合。 圖20示出了 Hum-Zap內化實驗的結果，該結果證明 針對人PTK7的人單選殖抗體可內化至PTK7+細胞中。 (A)人類抗體3G8、4D5和7C8內化至Wilms’腫瘤細胞中 。（B)人類抗體12C6內化至Wilms’腫瘤細胞中。（C)人 類抗體7C8和12C6內化至A-431腫瘤細胞中。（D)人類抗 體7C8和12C6內化至PC3腫瘤細胞中。 圖21示出了細胞增殖測定的結果，該結果證明毒素 -187- 200938223 共軛的人單選殖抗ΡΤΚ7抗體可殺傷人腎癌細胞系。 圖22示出了細胞增殖測定的結果，該結果證明毒素 共軛的人單選殖抗ΡΤΚ7抗體可殺傷低水準至高水準表現 ΡΤΚ7的細胞系。 圖23 示出了侵襲測定的結果，該結果證明抗ΡΤΚ7 抗體抑制細胞表面表現ΡΤΚ7的細胞的侵襲活動。 圖24示出了在體內異種移植模型中，共軛有毒素的 抗ΡΤΚ7抗體減緩了胰腺腫瘤的發展進程。 © 圖25示出了在體內異種移植模型中，共軛有毒素的 抗ΡΤΚ7抗體減緩了乳癌的發展進程。 圖26Α和26Β爲示出藉由使用7C8-式（m)共軛物使 體內模型中上皮來源的A431和小細胞肺來源的DMS 79腫 瘤減小的圖示。在圖26A，測量了僅用載體、用未修飾的 同種型匹配的式（m)共軛物、同種型匹配的式（m)共 軛物和7C8-式（m)處理的小鼠體內的腫瘤體積中位數° 圖26B表明7C8-式（m)處理可導致SCID小鼠體內的 DMS 79小細胞肺癌腫瘤的完全消退。 圖27爲表明在SCID異種移植小鼠體內模型中’ 7C8_ 式（m)共軛物不導致體重顯著減輕的圖示。 圖28爲式（m)的化學結構圖。 -188- 200938223 序列表 <110> Medarex, Inc.
Terrett, Jonathan A. <120〉針對蛋白酪氨酸激酶7 (ΡΓΚ7)的單選殖抗體伴侣分子綴合物
<130> 0199PC <140> W0 00/000,000 <141〉 2008-1卜04 <150> 61/005034 <151〉 2007-11-30 <160> 98 <170> Patentln version 3. 5
<210〉 1 <211> 116 <212> PRT
<213〉人類（Homo sapiens) <400> 1
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Val Trp Ser lie Asp Asn Trp Gly Gin Glv Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210〉 2 <211> 115 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 2
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Phe His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 200938223
Ala Val lie Ser Tyr Asp G1y Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser 115
<210〉 3 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 3
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30
Leu Met Tyr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lvs Asn Ser Leu Tvr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tvr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
〈210〉 4 <211〉 126 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 4
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cvs Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Glv Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 -2- 200938223
Ala Val He Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly 100 105 110
Thr Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210〉 5 <211〉 107 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 5
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lvs 100 105
<210〉 6 〈211〉 107 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 6
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cvs Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 -3- 200938223
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Fhe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tvr Cys Gin Gin Tvr Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Glv Pro Gly Thr Lys Val Asp He Lys 100 105 <210〉 7 <211> 107
<212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 7
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cvs Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Ser 20 25 30
Leu His Trp Tvr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tvr Tvr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro lie 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu He Lvs 100 105
<210〉 8 <211> 109 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 8
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cvs Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tvr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tvr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu -4- 200938223 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Met Tvr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 9 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉 人類（Homo sapiens) <400> 9
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 〇
Asp Arg Val Thr lie Thr Cvs Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tvr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
〈210〉 10 <211> 108 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 10
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser He Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Fro Pro 85 90 95 5- 200938223
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Lys 100 105 <210> 11 <211〉 5 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 11 Asn Tyr Ala Met His <210> 12 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 12 Ser Tyr Ala Phe His <210〉 13 <211> 5 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 13
Thr Tyr Leu Met Tyr 1 5 〈210〉 14 <211〉 5 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 14 Ser Tyr Gly Met His <210> 15 <211〉 17 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 15
Val He Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210〉 16 <2U> IT <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens〉 <400〉 16
Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 6- 200938223
Gly
<210〉 17 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 17
Ala He Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lvs Gly 15 10 15
<210〉 18 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 18
Val lie Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210〉 19 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 19
Glu Val Trp Ser lie Asp Asn 1 5 <210> 20 <211〉 6 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 20
Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
<210〉 21 <211> 4 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 21
Gly Leu Gly Tyr
<210〉 22 <211〉 17 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 22
Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly Thr Asp 15 10 15 200938223
Val
<210> 23 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 23
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10
<210〉 24 <211> 11 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 24
Arg Ala Ser Gin Glv He Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10
<210〉 25 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 25
Arg Ala Ser Gin Ser He Gly Ser Ser Leu His 1 5 10
<210〉 26 <211> 12 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 26
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10
<210> 27 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 27
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10
<210〉 28 <211> 11 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 28
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser He Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) 200938223 <400> 29
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210〉 30 <211> 7 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 30
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210〉 31 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens)
<400〉 31
Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser 1 5 <210〉 32 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 32
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213〉人類（Horao sapiens) <400〉 33
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210> 34 <211〉 7 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 34
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr <210〉 35 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 35
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
<210> 36 <211〉 9 <212〉 PRT 200938223 <213〉人類（Homo sapiens) <400> 36
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 37
His Gin Ser Ser Ser Leu Pro lie Thr
<210> 38 〈211〉 10 <212> PRT
<213〉人類（Homo sapiens) <400〉 38
Gin Gin Tvr Glv Ser Ser Pro Met Tyr Thr 1 5 10 <210〉 39 <211〉 9 <212〉 PRT 〈213> 人類（Homo sapiens) <400> 39
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 40 <211> 10 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 40
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr
1 5 10 Q
<210> 41 <211〉 348 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 41 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt catcttcagt aactatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaaacaa taaatactac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaggtc 300 tggagtattg acaactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 42 <211> 345 <212〉 DNA <213〉人類（Homo sapiens) -10- 200938223 CP1080939T-序列表-tw. txt tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 cctctggatt caccttcagt agctatgctt tccactgggt ccgccaggct 120 ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcat taaatactac 180 tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggacgtac 300 actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 43 <211> 336 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 43 ❹ gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt acctatctta tgtactgggt tcgccaggct 120 ccaggaaaaa ctctggagtg ggtctcagct attggttctg gtggtgatac atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag aggactgggc 300 tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctca 336
<210> 44 <211〉 378 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 44 caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatgggatg atggaagtaa taaatactat 180 gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ❿ <400> 42 caggtgcagc tcctgtgcag ccaggcaagg gcagactccg ctgcaaatga tactttgact ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgat 300 tactatggtt cggggagttt taactcctac tacggtacgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctca 378
<210> 45 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 45 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 46 -11 - 200938223
<211〉 321 <212〉 DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 46 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210〉 47 <211〉 321 <212> DNA
〈213> 人類（Homo sapiens) <400> 47 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtca gagcattggt agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120 gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg cagcgtatta ctgtcatcag agtagtagtt taccgatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 48 <211〉 327 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 48
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccat gtacactttt 300 ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 327
<210> 49 <211〉 321 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 49 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 -12- 60 200938223
<210〉 50 <211> 324 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) 〈400〉 50 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc atctacttag cctggtacca acagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct ggiagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccatt cactttcggc cctgggacca aagtggatat caaa
<210> 51 <211〉 98 <212〉 PRT ❹ 120 180 240 300 324 <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 51
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tvr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg
<210〉 52 <211> 97 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 52
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 -13- 200938223
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg
<210〉 53 <211〉 98 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens〉 <400〉 53
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 54 <211〉 95 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 54
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cvs Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tvr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 -14- 200938223
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95
<210> 55 <211〉 95 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 55
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Gly Ser Ser 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 o
Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tvr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro 85 90 95
<210〉 56 <211> 96 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 56
Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tvr Gin Gin Lys Pro Glv Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Glv Ser Glv Ser Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
<210〉 57 <211〉 96 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 57
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly -15- 200938223 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95
<210〉 58 <211> 1070 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 58
Met Gly Ala Ala Arg Glv Ser Pro Ala Arg Pro Arg Arg Leu Pro Leu 15 10 15
Leu Ser Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Gly Thr Gin Thr Ala lie 20 25 30
Val Phe He Lys Gin Pro Ser Ser Gin Asp Ala Leu Gin Gly Arg Arg 35 40 45
Ala Leu Leu Arg Cys Glu Val Glu Ala Pro Gly Pro Val His Val Tyr 50 55 60
Trp Leu Leu Asp Glv Ala Pro Val Gin Asp Thr Glu Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80
Gin Gly Ser Ser Leu Ser Phe Ala Ala Val Asp Arg Leu Gin Asp Ser 85 90 95
Gly Thr Phe Gin Cys Val Ala Arg Asp Asp Val Thr Gly Glu Glu Ala 100 105 110
Arg Ser Ala Asn Ala Ser Phe Asn He Lys Trp lie Glu Ala Gly Pro 115 120 125
Val Val Leu Lys His Pro Ala Ser Glu Ala Glu lie Gin Pro Gin Thr 130 135 140
Gin Val Thr Leu Arg Cvs His He Asp Gly His Pro Arg Pro Thr Tyr 145 150 155 160
Gin Trp Phe Arg Asp Glv Thr Pro Leu Ser Asp Gly Gin Ser Asn His 165 170 175
Thr Val Ser Ser Lys Glu Arg Asn Leu Thr Leu Arg Pro Ala Gly Pro
-16- 200938223 180 185 190
Glu His Ser Gly Leu Tyr Ser Cys Cys Ala His Ser Ala Phe Gly Gin 195 200 205
Ala Cys Ser Ser Gin Asn Phe Thr Leu Ser He Ala Asp Glu Ser Phe 210 215 220
Ala Arg Val Val Leu Ala Pro Gin Asp Val Val Val Ala Arg Tyr Glu 225 230 235 240
Glu Ala Met Phe His Cys Gin Phe Ser Ala Gin Pro Pro Pro Ser Leu 245 250 255
Gin Trp Leu Phe Glu Asp Glu Thr Pro He Thr Asn Arg Ser Arg Pro 260 265 270 Ο
Pro His Leu Arg Arg Ala Thr Val Phe Ala Asn Gly Ser Leu Leu Leu 275 280 285
Thr Gin Val Arg Pro Arg Asn Ala Gly lie Tyr Arg Cys lie Gly Gin 290 295 300
Gly Gin Arg Glv Pro Pro lie He Leu Glu Ala Thr Leu His Leu Ala 305 310 315 320
Glu He Glu Asp Met Pro Leu Phe Glu Pro Arg Val Phe Thr Ala Gly 325 330 335
Ser Glu Glu Arg Val Thr Cys Leu Pro Pro Lys Gly Leu Pro Glu Pro 340 345 350
Ser Val Trp Trp Glu His Ala Gly Val Arg Leu Pro Thr His Gly Arg 355 360 365
Val Tyr Gin Lys Gly His Glu Leu Val Leu Ala Asn lie Ala Glu Ser 370 375 380
Asp Ala Gly Val Tyr Thr Cys His Ala Ala Asn 乙eu Ala Glv Gin Arg 385 390 395 400
Arg Gin Asp Val Asn He Thr Val Ala Thr Val Pro Ser Trp Leu Lys 405 410 415
Lys Pro Gin Asp Ser Gin Leu Glu Glu Gly Lys Pro Gly Tyr Leu Asp 420 425 430
Cys Leu Thr Gin Ala Thr Pro Lys Pro Thr Val Val Trp Tyr Arg Asn 435 440 445
Gin Met Leu lie Ser Glu Asp Ser Arg Phe Glu Val Phe Lys Asn Gly 450 455 460
Thr Leu Arg lie Asn Ser Val Glu Val Tyr Asp Gly Thr Trp Tyr Arg 465 470 475 480 -17- 200938223
Cys Met Ser Ser Thr Pro Ala Gly Ser He Glu Ala Gin Ala Arg Val 485 490 495
Gin Val Leu Glu Lys Leu Lys Phe Thr Pro Pro Pro Gin Pro Gin Gin 500 505 510
Cys Met Glu Phe Asp Lys Glu Ala Thr Val Pro Cys Ser Ala Thr Gly 515 520 525
Arg Glu Lys Pro Thr lie Lys Trp Glu Arg Ala Asp Gly Ser Ser Leu 530 535 540
Pro Glu Trp Val Thr Asp Asn Ala Gly Thr Leu His Phe Ala Arg Val 545 550 555 560
Thr Arg Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Cys lie Ala Ser Asn Gly Pro 565 570 575
Gin Gly Gin lie Arg Ala His Val Gin Leu Thr Val Ala Val Phe lie 580 585 590
Thr Phe Lys Val Glu Pro Glu Arg Thr Thr Val Tyr Gin Gly His Thr 595 600 605
Ala Leu Leu Gin Cys Glu Ala Gin Gly Asp Pro Lys Pro Leu He Gin 610 615 620
Trp Lys Gly Lys Asp Arg lie Leu Asp Pro Thr Lys Leu Gly Pro Arg 625 630 635 640
Met His He Phe Gin Asn Gly Ser Leu Val lie His Asp Val Ala Pro 645 650 655
Glu Asp Ser Gly Arg Tyr Thr Cys He Ala Gly Asn Ser Cys Asn lie 660 665 670
Lys His Thr Glu Ala Pro Leu Tyr Val Val Asp Lvs Pro Val Pro Glu 675 680 685
Glu Ser Glu Gly Pro Gly Ser Pro Pro Pro Tvr Lys Met lie Gin Thr 690 695 ’ 700 lie Gly Leu Ser Val Gly Ala Ala Val Ala Tyr lie lie Ala Val Leu 705 710 715 720
Gly Leu Met Phe Tvr Cys Lys Lys Arg Cys Lys Ala Lys Arg Leu Gin 725 730 735
Lys Gin Pro Glu Gly Glu Glu Pro Glu Met Glu Cys Leu Asn Gly Gly 740 745 750
Pro Leu Gin Asn Gly Gin Pro Ser Ala Glu lie Gin Glu Glu Val Ala 755 760 765
Leu Thr Ser Leu Glv Ser Gly Pro Ala Ala Thr Asn Lys Arg His Ser 770 775 780 -18- 200938223
Thr Ser Asp Lys Met His Phe Pro Arg Ser Ser Leu Gin Pro lie Thr 785 790 795 800
Thr Leu Gly Lys Ser Glu Phe Gly Glu Val Phe Leu Ala Lys Ala Gin 805 810 815
Glv Leu Glu Glu Gly Val Ala Glu Thr Leu Val Leu Val Lys Ser Leu 820 825 830
Gin Ser Lys Asp Glu Gin Gin Gin Leu Asp Phe Arg Arg Glu Leu Glu 835 840 845
Met Phe Gly Lys Leu Asn His Ala Asn Val Val Arg Leu Leu Gly Leu 850 855 860
Cys Arg Glu Ala Glu Pro His Tyr Met Val Leu Glu Tyr Val Asp Leu 865 870 875 880
Gly Asp Leu Lvs Gin Phe Leu Arg lie Ser Lys Ser Lys Asp Glu Lys 885 890 895
Leu Lys Ser Gin Pro Leu Ser Thr Lys Gin Lys Val Ala Leu Cys Thr 900 905 910
Gin Val Ala Leu Gly Met Glu His Leu Ser Asn Asn Arg Phe Val His 915 920 925
Lvs Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Ser Ala Gin Arg Gin Val 930 935 940
Lys Val Ser Ala Leu Gly Leu Ser Lys Asp Val Tyr Asn Ser Glu Tyr 945 950 955 960
Tyr His Phe Arg Gin Ala Trp Val Pro Leu Arg Trp Met Ser Pro Glu 965 970 975
Ala He Leu Glu Gly Asp Phe Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe 980 985 990
Gly Val Leu Met Trp Glu Val Phe Thr His Glv Glu Met Pro His Gly 995 1000 1005
Gly Gin Ala Asp Asp Glu Val Leu Ala Asp Leu Gin Ala Gly Lys 1010 1015 1020
Ala Arg Leu Pro Gin Pro Glu Gly Cys Pro Ser Lys Leu Tyr Arg 1025 1030 1035
Leu Met Gin Arg Cys Trp Ala Leu Ser Pro Lys Asp Arg Pro Ser 1040 1045 1050
Phe Ser Glu lie Ala Ser Ala Leu Gly Asp Ser Thr Val Asp Ser 1055 1060 1065
Lys Pro 1070 -19- 200938223
<210> 59 <211> 13 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 59
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 60
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 15 <210> 61 <211> 13 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 61
Ala Asn Ala Lys Gin Asp Glv Ser Glu Lys Tyr Tyr Val 1 5 10 <210〉 62 <211〉 6 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 62
Ser Gly Ser Gly Gly Ser <210> 63 <211〉 12 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 63
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210〉 64 <211> 18 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 64
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 15 10 15
Ser Ser 〈210〉 65 <211〉 11 <212> PRT 20- 200938223 <213〉人類（Homo sapiens) <400> 65
Thr Phe Gly Gin Glv Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10
<210> 66 <211> 12 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 66 lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 1 5 10
<210〉 67 <211〉 12 <212> PRT
<213〉人類（Homo sapiens) <400> 67
Tyr Thr Phe Glv Gin Glv Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10
<210> 68 <211〉 12 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 68
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 1 5 10
<210〉 69 <211〉 12 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 69 _ Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys φ 1 5 l〇
<210> 70 <211〉 4 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) 〈400〉 70
Ala Leu Ala Leu <210> 71 <211> 4 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <220〉 <221> M0D_RES <222〉 (1).. (1) <223〉Xaa為P丙氨酸 <400> 71 200938223
Xaa Leu Ala Leu
<210> 72 <211〉 4 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 72
Gly Phe Leu Gly <210〉 73 <211〉 4 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 73
Leu Leu Gly Leu <210> 74 <211〉 4 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 74
Pro Arg Phe Lys <210〉 75 <211> 4 <212> PRT 〈213> 人類（Homo sapiens) <400〉 75
Thr Arg Leu Arg 1 <210> 76 <211> 4 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 76
Ser Lys Gly Arg <210〉 77 <211> 4 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 77
Pro Asn Asp Lys <210> 78 <211〉 6 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) 200938223 <400> 78
Pro Val Gly Leu He Gly
<210> 79 <211〉 5 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 79
Gly Pro Leu Gly Val
<210〉 80 <211> 8 <212> PRT
<213〉人類（Homo sapiens) <400> 80
Gly Pro Leu Gly lie Ala Gly Gin
<210> 81 <211> 4 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 81
Pro Leu Gly Leu
<210〉 82 <211> 8 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 82
Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gin © 1 5
<210〉 83 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 83
Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gin 1 5 <210> 84 <211〉 112 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 84
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 -23- 200938223
Leu Met Tyr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tvr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
<210〉 85 <211〉 109 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 85
Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Glv Ser Ser Pro 85 90 ' 95
Met Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
<210〉 86 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 86
Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cvs Arg Val Ser Gin Gly He Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 -24- 200938223
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gin Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210〉 87 <211> 5 <212〉 PRT
<213〉人類（Homo sapiens) <400〉 87
Thr Tyr Leu Met Tvr 1 5 <210〉 88 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 88
Ala He Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 15 10 15 <210> 89 <211> 4 <212〉 PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 89
Gly Leu Gly Tyr 1 <210> 90 <211〉 12 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 90
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 91 <211〉 7 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens〉 <400〉 91
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210> 92 <211〉 10 <212〉 PRT 25- 200938223 <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 92
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr Thr 1 5 10
<210> 93 <211〉 11 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 93
Arg Val Ser Gin Gly lie Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 94 <211〉 7 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 94
Ser Ala Ser Asn Leu Gin Ser
<210> 95 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類（Homo sapiens) <400> 95
Gin Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Pro Thr
<210〉 96 <211〉 336 <212〉 DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 96 gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt acctatctta tgtactgggt tcgccaggct ccaggaaaaa ctctggagtg ggtctcagct attggttctg gtggtgatac atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag aggactgggc tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctca
<210〉 97 <211〉 327 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400〉 97 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccat gtacactttt -26- 200938223 ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 327
<210> 98 <211> 321 <212〉 DNA <213〉人類（Homo sapiens) <400> 98 gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggtgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca 120 gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg cccctccgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 〇 -27-

Claims (1)

  1. 200938223 十、申請專利範圍 l 一種抗體-伴體分子共轭物’其包含一特異性結合 PTK-7之抗體或其抗原結合部分及—伴體分子，其中該伴 體分子係選自式（m)、式（η)、式（〇)、式（p)或式（q)者。 2.如申請專利範圍第1項所述之抗體-伴體分子共軛物 ，其中該抗體或其抗原結合部分結合在由一參考抗體識別 的PTK-7上的一抗原決定位’其中該參考抗體包含分別由 SEQ ID NO:4 和 10、SEQ ID ΝΟ:1 和 5、SEQ ID ΝΟ:1 和 6、SEQ ID NO:2 和 7、SEQ ID NO:3 和 8、SEQ ID NO:3 和 9、SEQ ID NO:84 和 85、或 SEQ ID NO:84 和 86 所示 之胺基酸序列。 3 .如申請專利範圍第1或2項所述之抗體-伴體分子共 軛物，其中該抗體或其抗原結合部分包含重鏈和輕鏈可變 區，該等可變區包含分別由SEQ ID NO:4和10、SEQ ID ΝΟ:1 和 5、SEQ ID NO:l 和 6、SEQ ID NO:2 和 7、SEQ ID NO:3 和 8、SEQ ID NO:3 和 9、SEQ ID NO:84 和 85、 或者SEQ ID NO:84和86所示胺基酸序列。 4.如申請專利範圍第1或2項所述之抗體-伴體分子共 軛物，其中該抗體或其抗原結合部分包含 a) —包含SEQ ID NO:14的重鏈可變區CDR1 ; b) —包含SEQIDNO:18的重鏈可變區CDR2; c) 一包含SEQ ID ΝΟ··22的重鏈可變區CDR3; d) —包含SEQIDNO:28的輕鏈可變區CDR1; e) —包含SEQIDNO:34的輕鏈可變區CDR2;及 200938223 f)—包含SEQIDNO:40的輕鏈可變區CDR3。 5. —抗體-伴體分子共軛物，其包含一特異性結合 ΡΤΚ-7的抗體或其抗原結合部分及一伴體分子，其中該抗 體包含重鏈和輕鏈可變區，該等可變區分別包含SEQ ID NO:4和1〇所示之胺基酸序列，且該伴體分子爲式（m) (圖 28 )。 6. —種抗體-伴體分子共軛物，其包含一抗體或其抗原 結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包括分別在SEQ ID NO :4和10所示之胺基酸序列。 7. 如申請專利範圍第1、5及6中任一項所述之抗體-伴體分子共軛物，其中該抗體-伴體分子共軛物係藉由一 連接子與該抗體共軛，該連接子係選自巯基連接子、肽基 連接子、肼連接子或二硫化物連接子。 8. —種組成物，其包含申請專利範圍第1至7項中任 一項所述之抗體-伴體分子共軛物和一藥學上可接收的載 體。 9. 一種經分離之核酸分子，其編碼申請專利範圍第2 項至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合部分。 10. —種表現載體，包含申請專利範圍第10項所述之 核酸分子。 11. 一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第11項所述 之表現載體。 1 2 . —種如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之抗 體-伴體分子共軛物於製備供治療或預防以表現PTK7的腫 200938223 瘤細胞之生長爲特徵之疾病的藥物上之用途。 13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該疾病 係癌症。 14. 如申請專利範圍第13項所述之用途，其中該癌症 係選自結腸癌、肺癌、乳癌、胰臟癌、黑色素瘤、急性髓 樣白血病、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、攝護腺癌或上皮細胞 癌。 φ 15.如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該癌症 係胰臟癌。 1 6 ·如申請專利範圍第1 4項所述之用途，其中該癌症 係乳癌。 17.如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該癌症 係肺癌。 ❿
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