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TW200934877A - Use of CLEC1B for the determination of cardiovascular and thrombotic risk - Google Patents

Use of CLEC1B for the determination of cardiovascular and thrombotic risk

Info

Publication number
TW200934877A
TW200934877A TW097136244A TW97136244A TW200934877A TW 200934877 A TW200934877 A TW 200934877A TW 097136244 A TW097136244 A TW 097136244A TW 97136244 A TW97136244 A TW 97136244A TW 200934877 A TW200934877 A TW 200934877A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
clec1b
protein
gene
sequence
cardiovascular
Prior art date
Application number
TW097136244A
Other languages
English (en)
Inventor
Detlef Kozian
Peter Wonerow
Matthias Herrmann
Original Assignee
Sanofi Aventis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis filed Critical Sanofi Aventis
Publication of TW200934877A publication Critical patent/TW200934877A/zh

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Description

200934877 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 . 本發明，有關單核苷酸多型性(SNPs)及蛋白質多型性 於鑑定心血管及/或血栓病症風險增加上之用途，及有關適 5 · 用於該用途之引子與核酸。此外，本發明係有關CLEC1B [c 型凝集素功能部位1族，成員B (C_TYPE LECtin d〇main FAMILY 1，MEMBER B)或者類C型凝集素受體2 (c_TYpE LE^TIN-LIKE RECEPTOR 2)/CLEC-2，下文中稱為 CLEC1B] o 於尋找預防及治療心血管及血栓病症之活性物質上之用 10 途0 【先前技術】 於西方世界，心血管及/或血栓性疾病在男女兩性中均 為死亡之主要原因。心血管疾病涵蓋影響心臟功能之所有 病症，尤其包括心臟組織及心臟血管之失調症。血栓性病 15 症涵蓋所有影響血流病理狀態或與出血傾向增加有關之血 管阻塞結果金流減少相關之病症。 冠狀心臟疾病，特別是冠狀動脈疾病’可視為心血管 ® 疾病主因之一。絞痛，亦稱為心絞痛，係發生於心肌氧氣 供應不足時之暫時性胸痛或壓迫感。當冠狀動脈狹窄或阻 2〇 塞，使得流至心肌之血流無法增加至符合氧氣增加需求 時’其結果可能發生局部缺血，引起疼痛（亦即心絞痛）。通 、絞痛起因於冠狀動脈疾病，惟亦可能由其他冠狀心 臟疾病引起。並非每一次心肌缺血即引起與心絞痛有關連 之疼痛或壓迫感；此類心肌缺血，亦即無心絞痛之心肌局 25 部缺血’稱為沉默性局部缺血。沉默性局部缺血之危險性 在於受侵襲之個體未查覺心肌受損害。因此，直到該損害 200934877 最後導致心肌梗塞之前’病患或主治醫師常未能確認心臟 組織之可能損害。基於此因，業界對於用以確認血管及心 臟衰退，俾使儘早獲得診斷結果，因而進行介入性治療之 診斷方法及手段有極大需求。 5 由於與心血管及/或血栓性疾渙相關之高社會經濟及個 人負擔，因此對於該等疾病之早期診斷及治療有極大需求。 因此，本發明之目的在於提供診斷及治療心血管及/或 血栓性疾病之改善方法。 ❹ 【發明内容】
10 根據本發明，針對待檢查個體之生物取樣使用CLEC1B 基因之單核苷酸多型性(SNPs)* CLEC1B蛋白質多型性鑑 定心血管及血栓性疾病而達成該目的。 舉例而s，此可利用分析CLEC1B核酸[亦即RNA或 DNA(舉例而言，如，cDNA或基因體DNA)]之根據參考序 15 列NM-016509 CLEC1B核酸序列位置250胸苷(τ) 胞苷 (C)[或CLEC1B基因體序列（例如根據SEq ID N〇 ⑩ NT-009714)之對應位置]單核苷酸多型性之存在；及/或利用 分析CLEC1B蛋白質之根據參考序列Np_〇57593 cLEC1b 蛋白質位置24絲胺酸(Ser)—脯胺酸(pr〇)蛋白質多型性之
20 存在；或利用分析存在該取樣中CLEC1B蛋白質或mRNA 之量或功能性質而達成。 此處，根據平常方法可確定CLEC1B核酸或蛋白質内 任何相關位置之核苷酸或胺基酸種類。由於知道特定位置 之核苷酸或胺基酸種類，熟習此項技藝人士即可判定該生 25 物試樣由來個體之心血管及/或血栓性風險群。 200934877 CLEC1B屬於跨膜蛋白質之c型凝集素超家族 (Kanazawa et al.，2007)。CLEC1B 於 2000 年被基因轉殖及 . 定位於人類第12號染色體之NK基因複合體内。CLEC1B 由229個胺基酸組成，其表觀分子量為27 kDa (Colonna et 5' a1·，2000; Sobanov etal” 2001)。CLEC1B 於單核細胞、粒細 胞及樹突細胞中表現(Kanazawa et al.，2007)。近來，CLECIB 於jk小板上之表現已被敘述（Suzuki-Inoue et al., 2006)。 CLEC1B被鑑定為係紅蛇毒（rh〇docytin)之新穎之結合蛋白 ® 質，暗示該受體涉及該蛇毒蛋白對血小板之活化作用。最 1〇 近被闡明之CLEC1B晶體結構進一步支撐紅蛇毒為此受體 之配體之說法（Watson et al.，2007)。除了紅蛇毒之外，對抗 CLEC1B之諸抗體亦能引發血小板中酪胺酸激酶之磷酸 化，表示該受體銜接促效劑後，能傳介血小板活化作用 (Suzuki-Inoue et al.，2006 ; Fuller et al.，2007)。CLEC1B 於 15 血小板上之確實功能雖未被闡明，惟該受體於感染病患中 似乎涉及1型人類免疫缺乏病毒(HIV-1)之散播；血小板似 © 乎係經由均於血小板上表現之CLEC1B及對凝集素樹突細 胞具專一性之細胞内黏著分子3-攫取非整合素（3-grabbing nonintegrin)(DC-SIGN)等連接因子而漸被HIV-1佔用 2〇 (Chaipan et al·, 2006)。 CLEC1B基因之序列於此項技藝中為已知。CLEC1B基 因位於染色體12pl3.2上。該基因之編碼核酸序列可擷取自 NCBI基因庫之編號NM__016509〇CLEC1B基因之鄰接基因 體序列可自NCBI基因庫之智人染色體12基因體contig 200934877 ΝΤ_009714獲得。其衍生之蛋白質序列可擷取自NCBI基 因庫之編號NP_057593。NCBI係美國國家生物科技資訊中 心（National Center for Biotechnology Information)(郵寄地 址：National Center for Biotechnology Information，National 5 Library of Medicine，Bethesda, MD 20894，USA ;網址： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。 本發明係有關臨床病患群組染色體層次之CLEC1B基 因之研究，由發明人等進行評估CLEC1B基因及/或蛋白質 D 中之變異對帶有此等變異體者臨床或病理生理表現型之影 10 響。 單核苷酸多型性(S N P s)係於個別位置含有置換之特定 核苷酸序列之變異體，其為熟習此項技藝人士所悉知。本 文所用之蛋白質多型性一詞包含蛋白質一級(亦即胺基酸序 列）、二級（亦即蛋白質折疊）及/或三級結構（亦即由不同多肽 15 次單元之蛋白質集合)之任何改變，較佳為包含編碼蛋白質 基因之一或多個SNPs引起之改變；其實例為，例如胺基酸 〇 交換、胺基酸缺失或蛋白質切截。 CLEC1B基因之各種單核苷酸多型性（SNPs)為先前技 藝已知且可自 Ensembl基因庫公開取得，例如 20 http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/genesnpview?db=core ;gene=ENSG00000165682。又，上文經鑑定之根據參考序列 NM—016509 CLEC1B核酸序列位置250 (或CLEC1B基因體 序列之對應位置，例如有關SEQ ID NO:3之位置201)之SNP 係已知（參照SNPID:rs2273986)，且可擷取自NCBI基因庫 200934877 存取編號rs_2273986及尤其可利用下述關聯取得： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=2273986 - 此關聯亦揭示圍繞根據本發明SNP之部分基因體序列 (亦見 SEQIDNO: 3)。 5 然而，CLEC1B之該多型性與具有或遭受心血管及/或 血栓性疾病間之關聯性迄今尚未知或未見述而完全令人驚 奇。 【實施方式】
Q 發明人等之實驗第一次證明CLEC1B基因之特定變異 ίο 常以統計學上顯著之頻率發生於罹患心血管及/或血栓性疾 病之人類。為了評估CLEC1B基因或蛋白質内之SNPs或變 異體與該等疾病之發作及進展之可能關係，乃詳細分析 CLEC1B蛋白質位置24之絲胺酸—脯胺酸基因變異體，及 於界定明確之病患群組中進行基因型_表現型相關分析；結 15 果令人驚奇地發現，該CLEC1B多型性與心血管及/或血栓 性風險或病症相互關聯。CLEC1B基因多型性與易感染此 p 類疾病體質之相關性之前從未見敘述，就有關CLEC1B公 佈之數據而言，到目前為止，被視為是完全令人驚奇的。
本發明之各種態樣適用於所有動物或人類；一較佳具 20 體實例係有關應用於哺乳動物及/或人類。因此，CLEC1B (有關核酸、蛋白質、多型性等）一詞係指得自任何動物物種 或智人種之CLEC1B ;較佳具體實例涵蓋得自哺乳動物之 CLEC1B 及/或智人種(hs) CLEC1B。 因此，本發明另一態樣係有關CLEC1B蛋白質或核酸 25 或其功能性片段於待檢查個體之生物取樣中鑑定心血管及/ 200934877 或血栓性風險或疾病上之用途。 下文中，於CLEC1B基因及/或核酸或蛋白質内既定位 置最常發生之核普酸或胺基酸稱之為最常發生之變異體 “野生型’’。 一 5 ‘ CLEC1B -T250T敘述於CLEC1B基因之二對偶基因上 有關參考序列NMJH6509之位置250(或於CLEC1B基因體 序列之對應位置）具有胸苷(T)之個體群。此多型性導致產生 於有關參考序列NP_057593之位置24具有絲胺酸(ser或 ❹ s)胺基酸（Ser24)之CLEC1B蛋白質。該等個體有關該 ίο CLEC1B變異為同型接合。由表2可獲得，核苷酸τ為 CLEC1B基因位置250最常發生之變異及胺基酸絲胺酸為 CLEC1B蛋白質位置24最常發生之變異。 CLEC1B - T250C敘述於CLEC1B基因之一對偶基因上 有關參考序列NM_016509之位置250(或於CLEC1B基因體 15 序列之對應位置）具有胸苷(T)及於CLEC1B基因之另一對 偶基因上有關參考序列NM一016509之位置250(或於 G CLEC1B基因體序列之對應位置）具有胞苷（C)之個體群。此
多型性導致產生於有關參考序列NP_057593之位置24具有 絲胺酸(Ser或S)胺基酸(Ser24)及有關參考序列NP_057593 2〇 之位置24具有脯胺酸(Pro或P)胺基酸(Pro24)之CLEC1B 蛋白質。該等個體有關該CLEC1B變異為異型接合。 CLEC1B - C250C敘述於CLEC1B基因之二對偶基因上 有關參考序列NM_016509之位置250(或於CLEC1B基因體 序列之對應位置）具有胞苷(C)之個體群。此多型性導致產生 200934877 於有關參考序列NP_057593之位置24具有脯胺酸(Pro或 P)胺基酸（Pro24)之CLEC1B蛋白質。該等個體有關讀 CLEC1B變異為同型接合。 CLEC1B基因中之基因變異，舉例而言，可利用下迷 〆 方法檢測： a) 經由分子-生物分析可能含有基因變異之CLEC1B基 因’直接檢測染色體DNA層次之該等基因變異；此處 特別是針對根據參考序列NM—016509 CLEC1B編碼序 ❹ 列（*CLEC1B基因體序列中之對應位置)位置250周圍 10 區域； b) 經由測定CLEC1B mRNA表現進行檢測； c) 檢測CLEC1B蛋白質内之蛋白質多型性；此處特別是 針對根據參考序列NP—057593，CLEC1B多肽鏈之位 置24 ;及 15 d)經由利用蛋白質-化學方法測定存在細胞、組織或體液 中之CLEC1B蛋白質之量及/或活性進行間接檢測。 © 於CLEC1B基因中，核酸層次（此處為染色體Dna)之 於上述參考序列中之位置之基因變異或多型性，舉例而 言’可利用下述方法檢測： 20 1)根據CLEC1B基因之該區域核酸序列之定序方法(例如 焦磷酸定序法、使用放射性標記或螢光染料標記之核 苷酸之定序法、或經由該核酸序列之質譜分析）； 2)根據CLEC 1B基因之該區域核酸序列之雜交方法(例如 利用“DNA微陣列”）； 200934877 3) 根據CLEC1B基因之該區域核酸序列擴增產物之分析 方法(例如TaqMan分析）。 於CLEC1B基因中，核酸層次（此處為染色體DNA)之 基因變異或多型性於有關上述參考序列中之上述位置，舉 5 ^ 例而言，亦可根據測定表現之CLEC1B mRNA經由下述方 法檢測： 1) 根據CLEC1B基因之核酸序列之雜交方法（例如利用 “DNA微陣列”、北方墨點分析）； © 2) 根據CLEC1B基因之核酸序列擴增產物之分析方法(例 ίο 如TaqMan分析、RNA差異顯示、代表性差異分析）。 CLEC1B蛋白質内有關根據參考序列NP—057593蛋白 質序列一或兩個位置24之蛋白質多型性可，例如，利用能 區分CLEC1B蛋白質内位置24之例如絲胺酸或脯胺酸之專 一性抗體，或利用適用於區分根據參考序列NP_057593 is CLEC 1B蛋白質序列位置24具有脯胺酸或者絲胺酸之 CLEC1B變異體之替代生化方法或分子生物方法進行檢測。 〇 此外，上述參考序列内之一者之上述位置之基因變異 或多型性可經由分析CLEC 1B蛋白質之量及/或活性予以檢 測。CLEC1B蛋白質之量及/或活性可，舉例而言，根據下 20 述方法檢測： 1) 根據CLEC1B蛋白質量之定量檢測方法(例如西方墨點 分析、ELISA試驗）；或 2) 經由試管内測試系統’例如於人類細胞、動物細胞、 細菌及/或酵母細胞中’根據CLEC1B蛋白質活性之功 200934877 能性檢測方法。 CLEC1B基因中上述位置之一者之基因變異或多型 性，舉例而言，可使用’例如，下述諸項予以檢測：呈⑷ 用以評估心血管及/或血栓性疾病（例如：周邊血管疾病、高 血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定型絞痛、早期心肌梗塞、 心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病）風險之基因標記；於對應 基因變異體之載劑中用以預防性治療心血管及/或血栓性疾 病（例如：周邊血管疾病、高血壓、中風/PRIND/TIA、不穩 定型絞痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病） 之標記；（c)用以調整心血管及/或血栓性疾病（例如：周邊血 官疾病、高血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定型絞痛、早期 心肌梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病）用醫藥活性物質 4里之“ §己，⑷用以判定鑑定心血管及/或血栓性疾病（例 如：周邊血管疾病、高血壓、中風/pRIND/TIA、不穩定型 紅痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病）用醫 藥活性物質之大量快速篩檢策略之標記；（e)用以鑑定供臨 床研究之相關個體或病患俾使測試心血管及/或血栓性疾病 (例如：周邊血管疾病、高血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定 型絞痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病） 用醫藥活性物質之相容性、安全性及效力之標記；及(f)用 以開發分析CLEC1B基因DNA、RNA或蛋白質層次之基因 變異用之測試系統之基礎。 因此，本發明另一態樣係有關CLEC1B蛋白質或核酸 或其片段於待檢查個體之生物取樣中鑑定形成心血管及/或 11 200934877
❹ 血栓性疾病風險增加上之用途。 本發明又另一態樣係有關用以鑑定個體中心血管及/或 血检性疾病或形成心血管及/或血栓性疾病風險增加之方 法’該方法包括針對個體取樣檢測出現於CLEC1B基因之 一或二對偶基因上根據參考序列NM—〇165〇9之位置25〇 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）之核苷酸種類；出現 於該位置之核苦酸種類為該個體罹患或形成心血管及/或血 栓性疾病風險之指標。 10 15
本發明因此亦有關用以鑑定個體中心血管及/或血栓性 疾病或形成心血管及/或血栓性疾病風險增加之方法，該方 法包括針對個體取樣檢測出現於CLEC1B蛋白質多肽鏈位 置24之胺基酸種類；出現於該一或多個位置之胺基酸種類 為該個體罹患或形成^血管及/或血栓性疾病風險之指標。 ^根據一具體實例，本發明係有關用以鑑定個體中心血 官及/或血栓性疾病或形成心、血管及/或血栓性疾病風險增 加之方法，該方法包括針對個體取樣檢測有關存在該試樣 ^之CLEC1BmRNA之量及/或蛋自質之量或功能活性是否 二或多個參考試樣不同。出現不同量表示該個體羅患或 形成心血管及/或血栓性疾病之風險增加。 CLEC1B量改變，亦即CLEC1B含量之變化可能係 響:有表現層次(轉錄、轉譯、剪接）、轉譯後修飾、 i^蛋白質之運送、或對蛋白質安定性之影響以及 由於訊心傳導麵對CLEC1B表現作用^彡響所致。 多考4樣可為例如具有下述基因體及/或蛋白質變異赠 20 200934877 之一或多個個體之取樣：於cxEclB基因之一或二對偶基 因上根據參考序列NM—016509 CLEC1B核苷酸序列位置 250(或於CLEC1B基因體序列之對應位置）為胸苷以外之核 苷酸’較佳為胞苷。
❹ 20 本^明又另一態樣係有關判定羅患心血管及/或血检性 疾病風險之方法，該方法包括針對個體之單離試樣分析前 述SNP或蛋白質多型性之存在，根據病患年齡及出現於 CLEC1B編碼序列位置250或CLEC1B蛋白質位置24之核 苷酸或胺基酸種類計算該評估風險。該風險判定之基礎係 根據表3至5之結果。 本赉明任何不同具體實例及態樣中之心血管及/或血栓 性疾病可為例如周邊血管疾病、高血壓、中風/pRIND/TIA、 不穩定型絞痛、心肌梗塞、早期心肌梗塞、冠狀動脈疾病、 冠狀心臟疾病及必需進行冠狀動脈氣球擴張術（c〇r〇nary angioplasty)之任何病理狀況。 本文所示之核苷酸位置係指參考序列NM-〇165〇9中該 核苷酸之位置（或於CLEC1B基因體序列之對應位置）。° 有關CLEC1B胺基酸序列胺基酸位置係指參考 ΝΡ 057593。 位置從參考序列第-個胺基酸或核时為丨起算，惟 於表示核賊位置與㈣㈣相關時，财雜聽序列 之核苦酸編號前加+或-。 義之標準縮寫（亦即 下文中將使用與核苷酸及胺基酸同 三個或一個字母代碼）。 13 200934877 核酸可為任何寡-或多核苷酸，“寡核苷酸，，一詞係有關 含2至25個核苷酸之核酸；“多核苷酸，，一詞則係指具有％ 個及26個以上核苷酸之核酸。 於本申請案中，所使用之蛋白質序列、胺基酸序列及 多肽序列等詞為同義詞。 迄今，尚無人類之臨床效應與CLEC1B變異體相關聯 之數據被揭示。令人驚奇地，發明人等之研究得以將 CLEC1B蛋白質位置24 CLEC1B變異體（尤其是clecib蛋 白質位置24 Ser~>pr0變異體)之出現與易感染心血管及/或 血栓性疾病體質緊密連結。 CLEC1B基因之基因多型性之檢測，特別是於根據參 考序列NM_016509位置25〇 (或於CleC1B基因體序列之 對應位置）之T~>C核苷酸交換，可作為，例如，（a)預防性 治療及預防性措施（藥物治療、生活方式）之基因標記用，俾 使L緩或甚至預防心企管及/或血栓性疾病[例如周邊血管 疾病、高血壓、中風/PRIND/TIA (pRIND代表長期性腦缺 血發作’ TIA代表短暫性腦缺血發作）、不穩定型絞痛、心 肌，塞、早期心肌梗塞、冠狀心臟疾病及必需進行冠狀動 脈氣球擴張術之任何病理狀況]、或緩和或中止晚期病程與 病理後遺症之嚴重性；或(b)作為調整藥物劑量之基因標記 用或作為設計藥物篩檢之基因標記用或(d)作為鑑定及， 適當時’挑選特別是供治療或醫學研究之病患之基因標記 用。 本發明方法賦能早期鑑定易感染心血管及/或血栓性疾 200934877 病體質，從而使於發生傳統症狀(例如由於組織傷害而感覺 疼痛）之前及早使用預防性或治療性措施成為可能：由負責 之熟習此項技藝者鑑定本發明之多型性或CLEC1B mRNA 或蛋白質經改變之穩定狀況程度或功能，給予治療或檢查 5 醫師明確指示，甚至於對應傷害或疼痛發生之前即篩檢血 管或心臟組織已持續存在之傷害、或投與預防性藥物、或 建議生活方式之改變。 此外，該等變異體與易感染心金管及/或血栓性疾病體 Ο 質間有關聯之新穎發現使得以藉由示意特定藥物劑量之改 ίο 、憂或有必要改變以CLEC1B編碼序列或蛋白質之該多型性 治療病患而使用更有效之治療。 因此’本發明亦係有關使用 a) CLEC1B基因中之一或多個單核苷酸多型性(SNPs)、 b) CLEC1B蛋白質中之—或多個蛋白質多型性及/或 15 c) 蛋白質或核酸或其功能性片段 以调整預防及/或治療心血管及/或血检性疾病用藥物劑量 © 之用途。 再者，本發明係有關於個體中用以調整預防及/或治療 心血管及/或血栓性疾病用藥物劑量之方法，該方法包括針 20 對個體之取樣檢測： a) 出現於CLEC1B基因之一或二對偶基因上根據參考序 列NM—016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之 對應位置）之核苷酸種類及/或 b) 出現於CLEC1B蛋白質根據參考序列np 057593位置 200934877 24之胺基酸種類， 該劑量視出現於該等位置之核苷酸或胺基酸種類而調整。 一具體實例包括針對個體取樣檢測有關是否CLEC1B 基因之一或二對偶基因具有下述SNp :根據參考序列 5 NM-016509 CLEC1B編碼序列位置250 (或於CLEC1B基因 體序列之對應位置）之胸苷；於多型性存在下，藥物劑量係 減少或增加。 另一具體實例包括針對個體取樣檢測有關是否 〇 CLEC1B基因之一或二對偶基因於上列位置具有上文列舉 10 以外之核苷酸；於另一核苷酸存在下，藥物劑量係減少或 增加。另一核苷酸較佳為根據參考序列NMJH6509 CLEC1B序列位置250 (或於CleC1B基因體序列之對應位 置）之胞苷。 根據本發明另一具體實例，調整個體治療及/或預防心 15 血管及/或血栓性疾病用藥物劑量之方法包括針對該個體取 樣檢測有關存在該試樣中之CLEC1B mRNA及/或蛋白質之 © 量是否與一或多個參考試樣不同。參考試樣可例如為具有 一或多個下述基因體及/或蛋白質變異體之個體取樣：於 CLEC1B基因之一或二對偶基因上CLEC1B序列 2〇 NM—016509之位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位 置）之胸皆以外之核發酸’較佳為胞苷；該劑量視個體取樣 中蛋白質及/或mRNA之量是否與得自具有一或多個該等變 異體之一或多個個體之參考試樣或諸參考試樣者不同而調 整。 200934877 CLEC1B基因變異體，特別是CLEC1B-T250C變異體 或CLEC1B-C25GC變異體之存在，具有指標作用。先前技 藝已知讀或，心血管及/或血栓性疾病狀多種藥物。 由於不是所有藥物對羅患相同疾病之所有病冑、均具有相同 j力’因此第--人以心血管藥物治療之病患通常必須“適應” 藥物亦即師事實上必須針對個別病患測試有關何 種藥物之何種劑量具有期望之效力而副作用盡可能小；其
G 15 Ο 20 =為事先並孙m錄是否㈣所投與藥物(於既定 或終止；事先亦不可能料地·該病患是 否將受不良副作用之苦。 血其广於治ΐ之前，鑑定病患為具有與罹患心 $々病特定可能性相關之特^clecib基因 成 =核酸或蛋白質之量之病患，可能增進以 物成#療之可預測性：clecib細特定變显體 血:及/或血栓性疾病之關聯暗示此類咖⑽變 ;;也=r二致’其最終具有之作用為該個體比 於不同個體中二同;理條件背景’各藥物 定生理背景之此等病患群使個體歸屬具有特 活性之特定藥物明對此病患群組特具 之藥物從-開始即不被^活性或很可能產生不良副作用 it例於/ α療之則對此類個別病患進行分類是不可 17 200934877 能之事；惟有暸解根據本發明之多型性與發生心血管及/或 血栓性疾病間之關聯方使其成為可能。因此，於臨床研究 上已被證實極成功地治療具有相同基因變異體之病患群組 之藥物可被優先使用於CLEC1B基因具有變異之病患，而 5' 對該病患群組較不具活性或比具不同基因變異體之病患群 組具有產生不良副作用之更高可能性之藥物從一開始即不 被採用。 〇 a) 因此，本發明之進一步態樣係有關使用 CLEC1B基因中之一或多個單核苷酸多型性(SNPs)、 10 b) CLEC1B蛋白質中之一或多個多型性及/或 c) CLEC1B蛋白質或核酸或其片段 以鑑定個體對治療及/或預防心血管及/或血栓性疾病用藥 物反應之用途。 此等鑑定之進行，舉例而言，可利用針對個體取樣檢 15 測有關是否（a) CLEC1B基因之一或二對偶基因具有下述變 異體’該核苷酸之存在為試樣由來個體對藥物反應之指
Ο 標：CLEC1B 序列 NM 016509 之位置 250 (或於 CLEC1B 基因體序列之對應位置）之胸苷；（b) CLEC1B基因之一或二 對偶基因具有下述一或多個變異體’其存在為試樣由來個 20 體對藥物反應之指標：CLEC1B序列NM_016509之位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）之胸苦以外之核苦 酸’較佳為胞苷；⑷試樣中CLECIBmRNA及/或蛋白質之 量與一或多個比較/參考試樣者不同，例如得自具有有關 CLEC1B基因之已知基因背景之一或多個參考個體者[例如 200934877 根據(a)或(b)之多型性)]’不同量之存在為試樣由來個體對 樂物反應之指標或(d)s亥CLEC1B蛋白質於clecIB蛋白質 參考序列NP_057593位置24具有多型性;使用其 他方法及程序進行鑑定亦具可信度。 本發明不同態樣之核苷酸種類之測定可根據此項技藝 中已知方法進行；例如可利用下逑方法達成： a) 提供包含基因體DNA之單離之生物試樣或提供單離之 基因體DNA ; b) 使用能擴增包含CLEC1B序列nm—016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）之核酸之引子 進行PCR反應以擴增核酸； c) 定序該核酸。 測定核普酸種類之另-可能性為，例如，利用下述方 法： a) 提供包含基因體DNA之單離之生物試樣或提供單離之 基因體DNA ; b) 使該基因體DNA固定於適當支稽物上； 0使於標準條件下能專一性結合於具有（基因體） CLEC1B序列之核酸及於根據參考序列NM_〇i65〇9 CLEC1B序列位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對 應位置)對特定核皆酸具有專一性之一或多個探針與該 經固定之DNA雜交。 根據另一可能性，核苷酸種類亦可以上述兩種方法為 基礎進行収，耗使用mRNA產生之eDNAffi^用基因 19 200934877 體 DNA。 mRNA之量可，例如，利用下述方法測定： a.提供包含mRNA之生物試樣或提供得自a)之試樣之單 離之mRNA ; 5' b.使用具擴增衍生自CLEC1BmRNA之核酸的能力之引 子，利用RT-PCR擴增核酸； C-定量該經擴增之核酸，與於至少一個參考試樣（亦即正 及/或負對照試樣）中擴增之核酸量進行比較。 〇 肖讀證任何既定分析（生物、生化或化學)反應結果之 10 正或負對照組觀念為熟習此項技藝者所悉知，其包括，例 如，反應以原始分析實驗之相同方式進行，惟缺少一或多 個界定成分(例如缺少CLEC1B蛋白質4mRNA或缺少專一 性CLEC1B抗體等）’以區分該等實驗從所謂“背景，，信號会士 果之特殊信號（由既定分析方法產生之人為信號）'(負°對° = 15 組）；亦包括反應以原始分析實驗之相同方式進行，惟使用' 能產生已知信號之附加成分’以驗證反應條件正常運作（正 〇 對照組）。 測定mRNA量之另一可能性為’例如，利用了述方法. a.提供包含mRNA之生物試樣或提供單離之. 2〇 b. 轉移該mRNA至適當支撐物； ’ c. 利用至少一個適當探針檢測及定量該支撐物上之 CLEC1B mRNA ； d. 該CLEC1B mRNA量與一或多個參考試樣(例如正及/ 或負對照試樣)進行比較。 20 200934877 又另一可能性為包括下述步驟之方法： a. 提供個體之組織學試樣； * b. 經由與適當mRNA探針之雜交反應檢測CLEC1B mRNA之量，檢測及定量該雜交探針； 5 C· 該CLEC1B mRNA量與得自一或多個參考試樣(例如正 及/或負對照試樣)者進行比較。 蛋白質量之測定或蛋白質多型性之鑑定可，例如，利 〇 用下述方法達成： a. 提供欲檢測個體之生物試樣，其中包含蛋白質； 10 b. C. 較佳為自a.之試樣中單離出蛋白質； 轉移該蛋白質至適當支撐物； d. 利用對CLEC1B蛋白質具專一性或對特定CLEC1B蛋 白質多型性具專一性之至少一個抗體檢測蛋白質；及 e. 定量該信號並與得自至少一個參考試樣（亦即負對照組 15 及/或正對照試樣)之信號進行比較。 〇 測定蛋白質量或鑑定特定蛋白質多型性之另一可能性 為包括下述步驟之方法： a. 提供個體之組織學試樣； b. 經由與適當CLEC1B抗體之結合反應檢測CLEC1B蛋 20 c. 白質量，檢測及定量該量； 該CLEC1B蛋白質量與得自一或多個參考試樣(例如正 及/或負對照試樣)者進行比較。 特定蛋白質多型性之測定可例如經由使用對多肽鏈位 置24具有絲胺酸之CLEC1B蛋白質較具有另外胺基酸之 21 200934877 CLEC1B蛋白質（尤其是多肽鏈位置24具有脯胺酸)(根據參 考序列NP_〇57593之胺基酸位置）具有可檢測出之較高結合 • 親和性之對抗CLEC1B蛋白質之抗體而達成。 再者，特定蛋白質多型性之測定可經由使用適用於鐘 5 別性檢測多肽鏈位置24具有絲胺酸之CLEC1B蛋白質及具 有另外胺基酸之CLEC1B蛋白質（尤其是多肽鏈位置24具 有脯胺酸)之此項技藝中已知之任何適當替代之分子生物學 g 或生化方法(如質譜分析法）而達成。 於此，試樣或採樣或單離試樣係指取自病患之生物材 ίο 料。生物材料可包括，例如··細胞或製備物或部分組織或 器官或體液(例如淋巴、唾液、血液、皮膚、結締組織）、或 細胞’較佳為容易移除之細胞，舉例而言，如，黏膜細胞。 此類生物材料可利用一般技術獲得，例如以藥簽擦拭取 樣、採取血液試樣、組織穿刺或外科技術（例如活組織切 15 片）。該等試樣較佳為組織學抽樣、細胞製劑、細胞例如黏 膜細胞、細胞組織、純化之DNA、mRNA或蛋白質或體液 例如唾液、淋巴或血液或該等試樣之抽取物或製備物。得 自細胞或組織之天然存在分子之純化及細胞或組織抽取物 之製備為熟習此項技藝人士所悉知（亦參見下文列出之標準 2〇 文獻之實例）。dna/rna或蛋白質製備物可由其利用一般 技術製得。 由於CLEC1B已於本申請案中第一次被鑑定為與心也 管及/或血栓性疾病相關聯，因此，本發明群組彼此關連地 亦有關使用CLEC1B蛋白質或核酸或其功能性片段尋找用 22 200934877 以治療及/或預防心血管及/或血栓性疾病之活性物質之用 途。 根據本發明不同態樣之-具體實例，CLEC1B、其衍生 物或其片段可作為單離分子使用。 5 於本發明說明書中，‘‘單離分子，，一詞，尤其是有關 CLEC1B者’係指自天然來源純化（亦即自其天然環境取得) 之C L E C1B核酸或多肽或其片段以及經純化之重組分子（其 巾純化-詞包含部分纟仏以及^全純化）。減之單離為此 項技#巾悉知（亦參見下文鮮實驗室程序之文獻）。 1〇 、根據本發明之用途容許鑑定用於預防及/或治療心血管 及/或血栓性疾病之新穎物質。根據本發明之用途包括鑑定 具有所需特性之物質，以及進一步確認已被鑑定可用於預 防及/或治療心血管及/或血栓性疾病之物質。 被用於本發明不同態樣中之物質可為經純化、部分純 15 化、合成或利用生物化學或分子生物方法製造之任何生物 或化學物質或天然產物抽取物。 〇 &於本發明不同態樣之意義上被視為具有預防或治療心 血官及/或血栓性疾病活性之物質可為對CLEC1B諸功能之 一者或對CLEC1B mRNA或蛋白質於生物系統中之表現、 20 量或穩定狀態程度具有影響之任何物質。 义 欲達此目的，該物質可調節CLEC1B之任何功能(例如 如上文或下文界定者）。CLEC1B蛋白質活性可由物質調 節，例如利用與CLEC1B多肽/蛋白質或其片段直接相互; 用及干預。該物質亦可調節CLEC1B之表現，例如於轉錄(起 23 200934877 始、延長、終止)層次、轉錄_或轉譯_程序（尤其是前蛋白原 或前蛋白成為活性型之轉譯後程序，其亦可包括缺少前狀 功能部位之全長蛋白質之c端切截)層次、__或㈣錢 安錄或轉譯；再者’其可卿CLEC1B之轉譯後程序、 5 修飾、蛋白質折㈣。該物質可直接或間接發揮上述效力[間 接意指利㈣CLEaB功能/蛋白質活性/表料具有影響 力之天然訊號串聯反應進行(正向或負向）干預]。此外，^ 物質亦可模擬CLEC1B活性（亦即接管其功能/角色）。 CLEC1B之片段可為較對應野生型短[例如較智人種 ίο CLEC1B或其多肽短]之任何多肽或核酸。CLEC1B之功能 性片段為展現CLEC1B之至少一種功能之任何片段（多肽或 者核酸）。 CLEC1B或CLEC1B片段之衍生物可為任何經修飾之 CLEC1B核酸、多肽或其片段。該等衍生物包括，例如麵 15 修飾之胺基酸或核苷酸序列或任何其他類型之修飾，例如 經化學或生物修飾導致該多肽或核酸穩定[例如核酸骨幹之 ® 硫代鱗酸酯(phosphoorothioate)修飾作用或其他類型之修轉 作用或胺基酸間之鍵結交換等]、或賦能多肽或核酸專一性 標靶導向特定細胞或促進其進入細胞或被細胞吸收[例如細 2〇 胞可滲透(cell-permeant)之罐酸肽類、鄰位偶聯於細胞可渗 透之肽載體，例如以觸足（antennapedia)/穿透胜 (penetratin)、TAT、及信號-肽系序列為基礎；或偶聯於專一 性轉運子或輸入子（importers)之部分配體]。 CLEC1B之“功能性衍生物”包含有關天然存在型 24 200934877 CLEC1B (多肽或者核酸)任何種類之修飾作用，其至少具有 CLEC1B諸功能之一者。本發明亦涵蓋CLEC1B片 能性衍生物。 關於CLEC1B核酸或其片段，CLECm功能包括例如 5 與其他分子(舉例而言，如，專-性雜交引子或探針)相互作 用之能力、調控下游編碼序列轉錄作用、編碼CLEC1B蛋 白質之能力等。CLEC1B之功能亦包括CLEC1B (蛋白質或 核酸）或其片段與其他分子[包含，惟不限於，蛋白質或蛋白 貝片段、核酸（亦即與與核酸專一性雜交之CLEC1B核酸）、 10 合成分子（亦即與合成藥物專—性相互作用之CLEC1B蛋白 質或片段)]相互作用之能力。 活性物質之鑑定，舉例而言，可利用下述一或多種梦 定方法進行，例如： μ 於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具活性之物質 15 之鑑定方法包括： 、 b. 使CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物與測試物 質接觸；及 判定該測試物質是否調節CLEC1B蛋白質或其功能性 片段或衍生物之活性。 於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具活性之物質 之鑑定方法包括： a. 使具有可檢測之CLEC1B或其功能性片段或衍生物的 量之細胞與測試物質接觸； b. 判疋3亥測5式物貝疋否能5周郎存在細胞中之CLEC1B戍 25 200934877 其功能性片段或衍生物之量或活性。 關於本發明不同態樣使用之物質/測試物質/活性物質 可為任何生物或化學物質或天然產物抽取物，其係利用生 物化學或分子生物方法純化、部分純化、合成或製造者。 5 #以可檢測地調節clEC1B量或活性之物質被視為係 於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具活性之物質。可 檢測之CLEC1B量係指可檢測之CLEC1B核酸(mRNA、 _ cDNA或基因體DNA)及/或蛋白質（前蛋白原/前蛋白/成熟 蛋白質）之量。可檢測之活性係指CLEC1B DNA/mRNA或 ίο 蛋白質之轉錄及/或轉譯及/或蛋白質活性。 於本發明諸具體實例之不同態樣中，調節一詞係指活 化或抑制。 另貝例為於預防或治療心血管及/或血检性疾病上具 活性之物質之鑑定方法，該方法包括： 15 a·使編碼CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物之核 酸與轉錄活性系統中之測試物質接觸；
® b.於該物質存在下，測定存在該系統中之編石馬CLEC1B 蛋白質或其功能性片段或衍生物的mRNA之量；
c. 於該物質不存在下，測定存在該系統中之編碼CLEC1B !〇 蛋白質或其功能性片段或衍生物的mRNA之量； d. 判定該物質是否能於該系統中調節編碼CLEC1B蛋白 質或其功能性片段或衍生物的mRNA之量。 能調節存在該系統中之CLEC1B mRNA量之物質被視 為係於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具活性之物 26 200934877 質。 轉錄活性系統為至少具有進行轉錄元件之轉錄反應能 ， 力之任何生物化學或細胞系統。此等系統為此項技藝中悉 知，包括細胞(例如一般實驗室菌株或細胞株以及真核或原 5 核細胞之初級培養物）以及試管内轉錄系統或套組（例如以 細胞抽取物為基礎者）’彼等亦為市售可得。於本發明情形 下’此可為表現CLEC1B mRNA或表現編碼功能性cleCIB 片段mRNA之生化或細胞系統。 存在系統中之mRNA量之測定可根據此項技藝中悉知 1〇 之技術進行(例如利用放射性或螢光標記法直接標記產物或 使用專一性引子或探針進行產物檢測等）。 另一實例為於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具 活性之物質之鑑定方法，該方法包括： a. 使編碼CLECIB蛋白質或其功能性片段或衍生物之核 15 酸與轉譯活性系統中之測試物質接觸； b. 於該物質存在下’測定存在該系統中之CLECIB蛋白 ® 質或其功能性片段或衍生物之量； c. 於該物質不存在下，測定存在該系統中之CLEC1B蛋 白質或其功能性片段或衍生物之量； 20 d.判定該物質是否能於該系統中調節CLECIB蛋白質或 其功能性片段或衍生物之量。 能調節存在該系統中之CLECIB蛋白質、衍生物或片 段之量之物質被視為係於預防或治療心血管及/或血栓性疾 病上具活性之物質。 ' 27 200934877 轉譯活性系統為至少具有進行轉錄本之轉譯反應能力 之任何生物化學或細胞系。此等系統為此項技藝中悉知， 包括細胞(例如-般實驗室菌株或細胞株以及真核或原核細 胞之初級培養物）以及試管内轉譯系統（亦為市售可得者，例 如套組）。於本發明情形下，此可為表現CLEC1BmRNA或 表現編碼功能性CLEC1B片段mRNA之生化或細胞系。核 酸之試管_譯’储減:欠触於適當健巾，隨後於 Ο 15 ❹ 20 適當緩衝劑及細胞抽取物（例如網狀紅血球溶解物）中表現 多肽。載體、必要試劑及帶有適當條件之實驗流程為此項 技藝中已知且為市售可得。 :本發：說明書中’，，多肽“一詞係指含有利用 目結合之胺基酸分子，其含有至少1G個以線性方式互相連 接之胺基酸。此類型之較短分子稱為肽類。 π纽鍵之分子，惟亦可指“ 互相結合之二或多個多肽鏈之分子。因 ^ 含，，多肽“。 貝δ°Ί包 存在該系統中之CLEC1B蛋白質之檢測可根據 4中悉知之技㈣行(❹觸產物之直舰射 = 記體、標記蛋白質及檢測該標記物ί 另一貫例係有關於預防或治療心） 上具活性之物質讀定方法，财法^及/或血栓性疾病 a·提供經含有操作性地連接於報導基 之CLEC1B基因啓動子或A 飞八力月U生片段 染之細胞；冑社《載體轉 28 200934877
b. =ζζ=;:= 胞； CLEC1B啓動子 、組載體轉染之細 C. 存在下，測定根據之細胞之報導基 d. =:質不存在下，測定根據_ b)之細胞之報導 Ο =著調節（亦即增加或減少）根據a)之報導基因活性 而未』者調節b)之報導基因活性（亦即能專— CLECm啓動子活性)之物f被視為係於預防或治療心^管 及/或血栓性疾病上具活性之物質。 顯著調節係高於標準偏差之任何調節（亦即增加或減 少）；其較佳為標準偏差之至少兩倍。 Ο 本發明之上述態樣係根據此項技藝中一般已知之典型 報導基因測定法。欲達此目的，將所挑選啓動子以啓動子 具活性時容許表現報導基因之方式插入表現載體(適用於選 定宿主細胞類型）中所挑選報導基因之上游。接著將該構築 體引入所挑選宿主細胞中。轉形或轉染所用適當方法以及 細胞培養條件與報導基因表現之檢測為此項技藝中悉知（參 見例如下文列舉之標準文獻）。諸適當條件以及載體、報導 基因與必要試劑為此項技藝中悉知且亦為市售可得。 載體係圓形或線型核酸分子，例如DNA質體、嗟菌體 或粘接質體，藉助於該等核酸片段(例如自其他載體切下咬 利用PCR擴增並插入轉殖載體中）可專一性地於適當細胞 29 20 200934877 或生物中擴增。表現載體使所關注基因（例如報導基因）能於 宿主細胞或生物中異源表現。細胞或生物類型主要取決於 •目的’其選擇屬熟習此項技藝者知識範圍之内。用於擴增 核酸之適當生物為，例如，具有高增殖率之多數單細胞生 5 物例如細菌或酵母。適當生物亦可為自多細胞組織單離及 培養之細胞，例如自各種生物產生之細胞株[例如得自草地 黏蟲也)之SF9細胞等]。適當轉殖載體 為此項技藝中已知且可自不同生技供應商，例如Roche
Diagnostics、New England Biolabs、Promega、Stratagene 等 ίο 購得。適當細胞株可自，例如，美國菌種保存中心(ATCC) 購得。 至於蛋白質或多肽之異源表現，該細胞可為適用於以 核酸載體轉染及表現所關注基因（例如報導基因）之任何原 核或真核細胞’其可此實例為初級細胞或培養細胞，較佳 15 為真核生物細胞培養物’彼等係源自，例如，多細胞生物 或組織(舉例而言，如，HeLa、CHO、COS、SF9或3T3)或 參 其本身為單細胞生物，舉例而言，如，酵母細胞[例如裂殖 酵母(*S. 或釀酒酵母(iS. cerevzWae)]或原核細胞培養 物、或畢赤(Pichia)酵母菌或大腸桿菌。得自組織之細胞與 20 試樣可利用先前技藝之已知技術製取(例如採取血液試樣、 組織穿刺或外科技術）。適用於本發明CLEC1B用途者亦為 天然產生CLEC1B以直接判定心血管藥物增加或滅少所產 生CLEC1B量能力之單離細胞。 於本申請案說明書中，“轉染”一詞係指將核酸載體引入 30 200934877 (原核或真核生物）宿主細胞中，因而涵蓋“轉形，，一詞。該轉 染可為穩定性或暫時性及可根據常見方法進行。 . CLEC1B啓動子區域為CLEC1B基因之一部分，若將
所關注基因之編碼序列轉殖入適當載體中，功能性地於啓 5 動子/促進子下游，及轉染入適當宿主細胞中，則該CLEC1B 啓動子區域能控制所關注基因產物之轉錄。CLEC1B基因 上游之核苷酸序列可被視為係CLEC1B啓動子區域；此區 域包含序列編號1\[(：_000012.101之核苷酸編號1〇〇43146下 游之核苷酸序列。 10 CLEC1B啓動子之功能性片段為CLEC1B啓動子片 段，其於指定條件下同樣可控制下游編碼序列之轉錄。適 當片段之鑑定屬熟習此項技藝者熟知技藝範圍之内。 報導基因可為得以容易定量其基因產物之任何基因。 用於真核生物或原核生物宿主之多種報導基因以及檢測方 15 法與必要試劑為此項技藝中已知且為市售可得；包括，例 如，β内醯胺酶(lacZ)、蟲螢光素酶、綠或藍螢光蛋白（GFp ’或 BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1 或 LEU2 或 β 半乳 糖苷酶等基因。彼等基因編碼可容易地利用看得見之（出現 顏色或發光)反應檢測（例如lacZ、蟲螢光素酶)之蛋白質； 20 彼等包括可容易地利用看得見之（出現顏色或發光）反應檢 測之基因產物或於表現時授予對例如胺节青黴素 (Ampicillin)或康黴素(Kanamycin)等抗體之抗性。其他報導 基因產物使表現細胞能於特定條件下生長，例如營養缺陷 型基因。 ❹ 15 20 本發明另 200934877 報導基因之功能性片段為得以容易定量其基因產物 指定報導基因之任何片段。 於本發明上述態樣之說明書中，對照組载體可為包含 報導基因或其功能性片段之任何適當載體，惟其中^導其 因表現不為（功能性)CLEC1B啓動子所驅使；舉例而言，此 意才曰報導基因或其功能性片段並非操作性地連接於功能性 CLEC1B啓動子（亦即或者完全缺乏CLEC1B啓動子、含有 非功能性CLEC1B啓動子或啓動子片段、或者其申啓動子 與報導基因之連接不具功能性）；亦可意純導基因或其功 能性片段係操作性地連接於CLEC1B啓動子以外之另一啓 動子(例如svm標準㈣子）。功驗紐及對照二 載體亦可㈣至相同細胞，惟於此情形下，報導基因必須 不同。 知银乃有關根據上述鑑定活性物質所用新 顆方法之-者之高產量_法(料方法亦稱為“測定法”）。 分析方法或分析系統，所謂測定法，於此項技藝中悉 知，制以測量界定躲分子(所謂標⑧，主要為蛋白質或 1酸)之雜或濃度，彼㈣潛在醫藥化合物效力之參數。 m ’測定法包括使用於界定空間與時間内一起置入 中之單離或部分單離之諸成分之生化分析方法 t糸=中可測試潛在醫藥化合物之效力(例如上述方 法）。測I蛋自酶活㈣，彼等涵蓋 用(例如標記受質與未== 、於又貝裂解後，部分標記受質被釋出；因 32 200934877 而可藉由檢測及定量指定時助釋出之標記成員量而測量 蛋白酶活性)之放射性同位素或螢光測定法。其他測定法實 例包括細胞系測定法(例如上述報導子測定法或表現型測定 法，其中可利用於細胞表現型中之變化檢測物質活性）。 5 不同類孓之'則疋法為此項技藝中一般已知且可自市面 供應商購得。 根據本發明不同態樣之進一步具體實例，係使用包含 NM—016509位置25〇之CLEC1B核酸或使用包含 NP_057593 位置 24 之 CLEC1B 多肽。 ίο 由於根據參考序列NM一0165〇9 CLEC1B位置25〇 (或 基因體序列中之對應位置）T—C或根據參考序列 NP 057593 CLEC1B 蛋白質位置 24 Ser->Pro 之 CLEC1B 基 因與蛋白質變異體與心血管及/或血栓性血管疾病之存在最 為顯著關聯’因此本發明之較佳具體實例係有關使用具有 15 一或多個上述多型性之CLEC1B核酸或多肽進行一或多個 根據本發明之應用之用途。 ’ 通常，使用標靶基因（“分子標靶”)篩檢活性化合物時， 不會慮及所研究基因野生型序列中之個體SNPs。由於本申 請案已確認CLEC1B變異體與心血管及/或也栓性疾病之發 2〇 生相關聯，因此使用此類變異體(特別是針對隨之發生之該 等細胞特定生理結構背景）於尋找適用於治療及/或預防心 血管及/或血栓性血管疾病之活性化合物上可能產生較高可 能性。事實上，具有此類基因及生理結構之個體亦更有可 能罹患心血管及/或血栓性疾病。因此，使用於根據參考序 33 200934877 列NM_016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應 位置)具有胞苷之CLEC1B核苷酸序列應可發現具有此基因 或蛋白質變異體之特定病患有反應之活性化合物。於根據 參考序列NM_016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列 5 ' 之對應位置）具有τ或C之CLEC1B編碼序列之用途代表本 發明之另一具體實例。 此外，CLEC1B基因中之SNPs適合在使用除了 CLEC1B本身以外之標把物篩檢活性化合物時使用：於細 胞測定法中可能使用細胞尋找用於治療及/或預防心血管及 ίο /或血栓性疾病之活性化合物（該等化合物具有影響除了 CLEC1B以外之標靶物的功能及/或活性及/或量之能力），特 別是其基因體於根據參考序列NM_016509之核苷酸序列位 置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）具有CLEC1B 基因界定變異體之細胞。以此方式，得以針對基因背景（較 15 佳為與欲治療疾病相關聯）’專一性地篩檢出於預防或治療 心血管及/或血栓性疾病上具活性之化合物（甚至連干預該 @ 變異基因以外之基因功能者）。 本發明進一步態樣係有關利用分析欲檢測個體之生物 取樣，使用CLEC1B檢測工具(means)診斷心血管及/或血栓 2〇 性疾病或易感染心血管及/或血栓性疾病體質之用途。 有鑑於此，下述變異體之存在較佳為表示風險增加： CLEC1B編碼區域於至少一個對偶基因上，根據參考序列 NM_016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置) 含有C。 34
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200934877 檢測CLEC1B之工具 CLEC1B蛋白質或核酸之任何:。讀測生物試樣中之 用以檢測之工具可盏 ., CL觀囊或蛋白質為之=如二广檢測試樣中之 之CLECIBmRNA或蛋白質、可據从定量試樣中 針、抗-CLEC1B抗體等·、^^具[例如適當引子、探 CLEC1B m醜或專：V於標準條件下能與 人风丨平外法’或反轉錄酶聚人 (RT-PCR則闕子組]。另—實例係有關^^ ^ 因於根據參考序列NMJ)16位置細（或於 =^ 因體序狀對綠置)之核純麵之卫具， ^ =如=定序之適當PCR引子組(例如基因體或；^ 引子）、心針（用於例如南方墨點法或晶片_或微陣列雜幻或 用於此項技藝令已知之例如免疫C组織）化學、_螢光或-放射 化學技術之專-性抗_DNA抗體。又另—實例係有關用於判 定出現於根據參考序列NP_〇57593 CLEC1B蛋白質位置24 之胺基酸種類之工具，例如對特定蛋白質多型性具專一性 之抗體。 根據另一具體實例，用以檢測之工具為列定clecib 基因於根據參考序列NM—0165〇9位置25〇 (或於CLEC1B 基因體序列之對應位置）之核苷酸種類之工具，舉例而言， 如’根據SEQ IDXXX之一或多個引子 適當引子之設計及合成為先前技藝中已知；此等引子 亦為市售可传。根據較佳具體實例’彼等為根據SEQ ID NOs: 35 20 200934877 4及/或5之引子。核酸係利用傳統例行方法定序，舉例而 言，使用由例如Applied Biosystems、Bio-Rad等公司出售 . 之習知實驗室機器人。 適當探針之設計及合成同樣為先前技藝中已知（參見， 5 例如，下文列舉之標準文獻）。 於根據本發明之用途或方法之一者之進一步較佳具體 實例中，CLEC1B蛋白質内蛋白質量之變化或指定蛋白質_ 多型性之測定係藉助於至少一個抗體而進行。於此，較佳 Θ 檢測方法為ELISA、西方墨點法、蛋白質晶片及光譜分析 ίο 法。 適當抗體或其功能性片段之製備為先前技藝中已知， 舉例而言，以CLEC1B蛋白質或其片段免疫處理哺乳動物 (例如兔子）’適當時於適當輔助劑[Freund氏輔助劑或氫氧 化I呂凝膠，參見，例如，Diamond, B.A. et al. (1981) The New is England Journal of Medicine: 1344-1349]存在下。接著可利 用已知方法，例如利用管柱層析法，單離及純化免疫反應 @ 結果於動物中產生之多株抗體。單株抗體之製得，舉例而 言，可根據 Winter and Milstein 之已知方法[Winter，G. & Milstein, C_ (1991) Nature, 349, 293-299]。製備及純化單株 2〇 抗體之適當方法為先前技藝已知（參見標準文獻）。用以檢測 CLEC1B之已知抗體實例包括得自Abnova Corporation， Cat.No.: H00051266-A01 或得自 Novus Biologicals，Catalog Number: H00051266-A01之諸CLEC1B抗體。抗體於檢測 CLEC1B上之用途為此項技藝中已知，亦揭示於，例如Fuller 36
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20 200934877 et al.或 Suzuki-Inoue et al 中。 於本發明相關組群之說明書中，抗體或抗體月段等詞 亦係指重組產生之抗體或其抗原結合部位，適當時，彼等 亦可經修飾，舉例而言，如，嵌合型抗體、擬人化抗體: 多功能抗體、雙-或寡專一性抗體或F(ab)或F(ab)2片段。 用以檢測抗體反應之習知免疫化學或免疫放射學方法 為熟習此項技藝人士悉知。常見方法係根據，例如，專— 性一次抗體與待鑑定抗原之結合作用、二次抗體之結合作 用，其通常係識別該一次抗體上之物種專一性抗原決定部 位。於此，係利用該二次抗體之結合作用，俾使產生可檢 測信號(例如使用放射性標記二次抗體時之放射性信號、或 使用螢光-偶聯二次抗體時之螢光信號、或例如使用酵素- 偶聯二次抗體時之比色可測定之信號等），亦參見下文有關 標準方法列舉之文獻。 本發明群組彼此關連地亦有關用以檢測易感染心血管 栓性疾病體質之診斷套組，該套組含有用以檢測生 物试樣中之CLEC1B之至少—種工具。 人以摄^ f 書中’ “套組”(諸元件之套組)—詞意指組 :卩指定任務(例如診斷及/或血栓性疾病 心管及/或4性疾病鮮）之空間及功能性相 經鑑定成分之任何組合物，其可附加地含有進 ^本發明之診斷套組含有Μ制生物試樣中之 CLEC1B之至少^ —種工且.-c . 〃，再者，其可適當地包含適當緩 37 200934877 衝劑及/或用以檢測CLEC1B及/或製備或整理試樣之進一 步試劑，及適當時，包含施行該特定檢測法之操作指南。
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20 根據本發明用途或方法之較佳具體實例，利用PCR檢 測CLEC1B基因中一或多個變異之存在，其後，適當時， 使用核酸探針定序。此等探針可為，例如，具有50個以上、 100個以上、150個以上、200個以上或250個以上、300 個以上、350個以上、400個以上根據SEq π) NO:3之鄰接 核苷酸之核酸片段’該片段包含SEQ ID NO:3之位置201 (根據本發明SNP所在位置）。 用於PCR或使用例如，結合於適當支撐物(例如膜或晶 片）上之固定化基因體DNA之適當探針進行雜交之適當實 驗流程及試劑為先前技藝中悉知。 純分子與另—核酸分子之單股型於適當反應條 一下(周圍介貝之溫度與離+滚度)可彼此點結⑽&帅則該 苛條^而二i子必須具有互補序列。然而，視所選擇嚴 -詞敘述ί應條:能:錯配而黏結未終止。“嚴苛” 互相魅結時之•專^反應條件影響兩個單股核酸分子 少或多強烈之兩個八^/因而亦決u結期間可容忍多 應專-性，尤其取；於、。此處之嚴苛性’從而反 酸之適當條件及Μ條件。雜交兩個既定核 既定分析方法之該二：長度、種類及互補程度而定。 藝人士所悉知，亦男、> 料條件之決定為熟習此項技 才見迷於標準實驗室方法文獻(例如“Current 38 200934877
Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons, Ν.Υ. (1989)，6.3.1-6.3.6)。 . 根據彼此關連之本發明群組之較佳具體實例，個體為 具有心血管及/或jk栓性疾病之病患。該心血管疾病較佳為 5 冠狀動脈疾病（>20%狭窄症及/或>50%狹窄症）、心肌梗塞、 不成熟型心肌梗塞、急性冠狀動脈症候群或心絞痛（特別是 不穩定型絞痛）。 用於本發明諸方法、用途或測試套組之單離試樣較佳 為人類試樣，欲檢測之個體較佳為人類。該試樣可為’特 10 別是：組織學試樣、活檢試樣、細胞(例如黏膜細胞）、細胞 抽取物、細胞組織、體液，較佳為血液、唾液、淋巴或尿。 本發明附加地係有關單離CLEC1B核酸(例如具有或包 含根據NM—016509之序列或部分序列或根據NT009714或 根據SEQ ID NO: 3之核酸或其片段)之用途。該核酸或片段 is 含有下述SNP: a. 於根據NM_016509之CLEC1B序列位置250 (或於 D CLEC1B基因體序列之對應位置，例如於SEq ID N〇:3 位置201)之胞苷或 b. 於根據NM-016509之CLEC1B序列位置250 (或於 20 CLEC1B基因體序列之對應位置，例如於SEq idn〇:3 位置201)之胸苷。 此外本發明係有關單離CLEC1B蛋白質或其片段之用 途，該蛋白質或片段具有下述蛋白質多型性： a. 於根據參考序列NP—057593之CLEC1B蛋白質多肽鏈 39 200934877 位置24之脯胺酸或 b. 於根據參考序列NP_057593之CLEC1B蛋白質多肽鏈 位置24之絲胺酸。 茲於下文根據實例結合圖式與表更具細節地說明本發 明，惟彼等實例不擬對本發明構成侷限： 200934877 參考文獻：
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Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York ； Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York. 43 20 200934877 實例： 1.定序檢測SNP及定序結果分析 1 a) CLEC1B基因中DNA區域之擴增 用於DNA擴增之募核苷酸（引子）： 檢測出現於根據參考序列NM_016509之CLEC1B基因 中位置250 (或於根據NT009714之CLEC1B基因體序列中 對應位置）之核苷酸時，可使用下述一或兩個引子：
10 15
引子 1 (前置引子）：5'-TGCCTGCTCCTTGATGTCTTTATT-3, (SEQ ID NO: 4) 引子2 (反置引子）： 5,-TCAGCAGAATCAAAGCCATCACA-3, (SEQ ID NO: 5) 擴增用PCR實驗流程： 所用試劑係得自 Applied Biosystems (Foster City, USA)： 20奈克基因體DNA; 1單位TaqGoldDNA聚合酶；1 x Taq 聚合酶缓衝液；500 μΜ dNTPs ; 2.5 mM MgCl2 ; 200 nM 各擴增引子對（l.A下之諸序列）；H20至5微升。 用於基因型鑑定(genotyping)之PCR擴增程序： 95°C 10分鐘 X 1個循環； 950C 30 秒 70oC 30秒 X 2個循環； 95°C 30 秒 65°C 30秒 X 2個循環； 95°C 30 秒 44 20 200934877 60oC 30 秒 x 2個循環； 95°C 30 秒 56°C 30 秒 72°C 30 秒 X 40個循環； 72°C 10分鐘 4°C 30 秒 X 1個循環。 1 b) SNPs之鑑定 Ο 10 15 Ο 微定序用實驗流程及SNPs之檢測 所用試劑係得自 Applied Biosystems (Foster City, USA)。 2微升純化PCR產物、1.5微升BigDye終結子套組、 200 nM定序引子（見1.A下之諸序列）、h20至10微升。 定序用擴增程序： 96°C 2分鐘 X 1個循環； 960C 10 秒 55°C 10 秒 65°C 4分鐘 x 30個循環； 72°C 7分鐘 4°C 30秒 x 1個循環。 實例2 :經鑑定SNPs之統計分析 分析參考核苷酸序列ΝΜ_0165〇9、ΝΤΟ〇9714及參考蛋 白質序列NP—057593中經分析之CLEC1B多型性與約14〇〇 個個體之臨床參數之關聯性。表1列出所分析群組之特性 各種經鑑定多型性之頻率與分佈示於表2。參考序列 45 20 200934877 ΝΡ_〇57593位置24 CLEC2多型性Ser->Pro與病患組群臨 床指標(endpoints)之關聯性見述於表3、4及5。所有統計分 析均以 SAS version 8.2 (SAS Institute GmbH，Heidelberg, Germany)執行。 p值乃有關所觀察關聯性之統計學顯著性參數。RR (風 險比率）係有關具有特定CLEC1B多型性病患所示出現臨床 指標風險增加之參數；針對病患群組調整有關年齡、性別、 吸煙與否、血壓及有無糖尿病予以計算。 如表3所示’具有為Pr〇25Pro同型接合之 CLEC1B-C250C 之個體，相較於具有 CLEC1B-T250T (Ser24Ser)之個體’有遭受冠狀動脈疾病（CAd)(狹窄症>20%) 之較大風險。由於罹患CAD頻率隨著個體C對偶基因數而 增加’因此可看出CLEC1B核苷酸序列位置250出現C (胞 普）對CAD頻率之依賴性。亦即，於CLEC1B核苷酸序列 位置250無C對偶基因之個體，CAD頻率為76.89% ;具有 一個C對偶基因之個體’ CAD頻率為84.24%及具有兩個C 對偶基因之個體，CAD頻率為88.89%。具有為Pro25Pro 同型接合之CLEC1B-C250C之個體，相較於具有 CLEC1B-T250T (Ser24Ser)之個體’有遭受冠狀動脈疾病 (CAD)(狹窄症>50%)之較大風險。由於罹患cad頻率隨著 個體c對偶基因數而增加，因此可看出CLEC1B核苷酸序 列位置250出現C (胞苷）對CAD頻率之依賴性。亦即，於 CLEC1B核苷酸序列位置250無C對偶基因之個體，CAD 頻率為66.35% ;具有一個c對偶基因之個體，CAD頻率為 46 200934877 74.50%及具有兩個c對偶基因之個體，CAD頻率為83.33%。 如表4及5所概述’蛋白質位置24(或核苷酸序列位置 . 250)之CLEC1B多型性與冠狀動脈疾病關聯性之統計顯著 分析結果與例如性別、糖尿病及吸煙與否或高血壓等混雜 5 因素無關。具有CLEC1B-C250C (Pro24Pro)之個體罹患 >20%狹窄症及>50%狹窄症冠狀動脈疾病之升高風險分別 為 1.610 〇值=〇.〇026)及 i 499 (p-值=0.0021)倍。 D 該研究之一成果大致可敘述如下： 於根據參考序列NM_016509 CLEC1B編碼區域位置 10 250之一或二對偶基因上之胞苷，尤其是於根據參考序列 NM_016509 CLEC1B核苷酸序列之位置250未具有胸發之 個體中，罹患或形成心血管及/或血栓性疾病（尤其是冠狀動 脈疾病）之風險顯著增加，可能需要治療性介入。 臨床指標與CLEC1B基因及/或蛋白質中基因變異間之 15 關聯性為CLEC1B蛋白質位置24基因變異體Ser->Pro影響 ^ 心血管及/或血栓性疾病例如冠狀動脈疾病（具有〉2〇%及 P >50°/。血管腔狹窄症)發作之明確示意。CLEC1B變異體與該 等臨床指標間之統計顯著相關性於此首次獲得證明，從而 為本發明提供有意義之基礎。 2〇 【圖式及表簡單說明】 圖1 :具有NCBI參考編號NM—016509之CLEC1B編 碼序列（SEQ IDNO:l);位置250之多型性於其下劃出底線 並以粗字體標示。 圖2 :具有NCBI參考編號NP_057593之CLEC1B蛋 47 200934877 白質序列(seqiDN0:2);位置24之多型性以粗字體標示。 圖3 .含有根據本發明SNP之如NCBI基因庫存取編 號rS-2273986揭不之CLEC1B基因體DNA之核酸片段 (SEQIDN0:3) ; PCR引子及多型性之位置以粗字體標示； 5 “Y”代表C或T。 圖4 .用於分析出現於有關參考序列NM_〇165〇9位置 250或基因體序列（SEQ ID NOs : 4及5)各別位置之核苷酸 種類之PCR引子。 0 表· 10 縮寫·
Ser=絲胺酸 Pro =脯胺酸 CAD =冠狀動脈疾病 CAD20 = 20%以上目視狹窄 is CAD50 = 50%以上目視狹窄 表1 .病患群組基本特徵 © 表2 : LURIC群組中CLEC1B多型性Ser24Pro之分佈 表3 : LURIC群組中CLEC1B多型性Ser24Pro與冠狀動脈 疾病之關聯性 2〇 表4: LURIC群組中包括混雜因素(邏輯迴歸)之CLEC1B蛋 白質位置24之(Ser->Pro)多型性對具有2〇%以上狹窄症的 冠狀動脈疾病影響之分析；CAD20 = 20%以上血管腔狹窄 症’ CAD50 = 50%以上血管腔狹窄症。 \ 48 200934877 圖 15 1 ctatgaagaa 61 tggttctacc 121 ttggaaacta 181 catgcaggat 241 ctccgttggc 301 gtgcgtgggg 361 ttacctacaa 421 ctgtcaatat 481 cccctgtgac 541 cttaacatgg 601 tgacaaccgg 661 attatctcgc 721 aaatatgttt 781 tgggaaaatg 841 tggcatgacc 901 aagggcttta 961 aaa gcttcctgga ctactaaaga cattttgcaa gaagatggat cctgcatcct atggttgteg gatgagaatg gtggtaaaac acaaactgga gaagagagta aacattgtgg cagaagtega gagtttttgg caccctacct aaggtggacc ttgtacaata aaacaataag caggaagat c agtcattgaa acatcacctt cctcctggtg ggetggtggc aaaat egea c aatcagaact gatattatgg agcagtactg agtacatcaa atgaggtctg aagatggaaa tctgtgagaa aactacctta aaagatatgt caaaggaaaa ataaactgac ctctgaget c aaatattaaa gegtgtgatg tctggggatt aggaactctg aaagggcact agatagetgc cactgacat g agccaggact gaagtgggag aggaaatatg caaacatt at atgcaaagag atgaatgcat caaatgtgtc agatactgaa agttgcagt a actcggaaac gctttgatt c tggtctgtca caacaattag ttcaaaggtc tatgggttct aatgctactc catttaatt c gatggetegg aattgtgett ttaatgtgtg gtggacagga cagtagctga ccatctcaca attgtaagag ctegggaage cagctctcgt tgctgatcct tgcagcgcaa caaagcgctt ataaatgcag tcaggcacaa tcctgaagat gttgggtcgg ttatctcaga attttcataa agaggaagge taacacagat aaaaaaaaaa 20 SEQ ID NO:1
49 200934877
2 1 61 121 181 mqdedgyit1 ylqdenenrt 1twees kqyc nmfefledgk niktrkpalv gtlqqlakrf tdmnatllki gnmncayfhn svgg^asssww cqyvvkqsel dnrniveyik gkmhptfcen rvmalillil kgtfkghkcs arthlirwvg khylmcerka cvgmvvglva pcdtnwryyg 1s rqksnevw gmt kvdqlp lgiwsvmqrn dscygf frhn kwedgsvi se SEQ ID NO:2
50 200934877
AGAATGGATG
CAGGTGAGAT
CAGGGGCAGG
ATTATATGCC
TGCTGATCCT
GTTGACTCTG
ACTAAGCTTC
TATGGTATAG
CTGCCAGCAA
GGTGAGCCTT
TACAGTTGGC
GTGCGTGGGG
CCAGAAATTT
TCAATGGTCG
GGGTGGGCCA
AGCTCTTTCT
CCCCATAGCT
YCTGCATCCT
ATGGTTGTCG
GACTGGAGGA
CTATTTGTCT
TGCCTATTGT
ATTACTTGGA
AACCCATACT
CCTCCTGGTG
GGCTGGTGGC
AGGTAATACT
GTTTATCACT
TGATGATCAT
GGACCCTGAG
GCCTGCTCCT
GCGTGTGATG
TCTGGGGATT
GAAGGGTCAT
T
GAGGAGAACA
AAGGCAGGGG
TGATGTCTTT
GCTTTGATTC
TGGTGTAAGT
GGCATATCCC 10 SEQ ID NO:3
51 200934877 圖4 前置引子：5’-TGCCTGCTCCTTGATGTCTTTATT-3i SEQ ID NO ： 4 反置引子：5^TCAGCAGAATCAAAGCCATCACA-3· SEQ ID NO ： 5
52 200934877 縮寫：
Ser=絲胺酸
Pro =脯胺酸 CAD =冠狀動脈疾病 CAD20 = 20%以上目視狹窄 CAD50 = 50%以上目視狹窄 表1 :病患群組基本特徵 10 年齡[歲] 61.79 ± 10.57 BMI [公斤] 27.97 ± 4.41 性別 男 1016 (70.75%) 女 420 (29.25%) 糖尿病（有）（1) 595 (31.27%) 15 高血壓（肴）（2) 1123 (58.34%) 〇 吸煙（有） 1277 (66.34%) CAD(有） 1367 (78.65%) 心肌梗塞(有） 802 (42.14%) 53 1 根據A D A標準之所有糖尿病 2 20 (2)動脈高血壓 200934877 表2 : LURIC群組中CLEC1B多型性Ser24Pro之分佈 η % Ser24Ser 1061 73.89 Ser24Pro 357 24.86 Pro24Pro 18 1.25 表3 : LURIC群組中CLEC1B多型性 Ser24Pro與冠狀動脈疾 病之關聯性 Ser24Ser Ser24Pro Pro24Pro η (%) η (%) η (%) p-值 CAD20 有 802 (76.89) 294 (84.24) 16 (88.89) 0.0084 益 259 (23.11) 63 (15.76) 2 (11.11) CAD50 有 692 (66.35) 260 (74.50) 15 (83.33) 0.0071 無 369 (33.65) 97 (25.50) 3 (16.67) Ο 表4 : LURIC群組中包括混雜因素(邏輯迴歸)之CLEC1B蛋白 質位置24之(Ser—Pro)多型性對具有20%以上狭窄症的冠狀動 50% 脈疾病影響之分析；CAD20 = 20%以上目視狭窄，CAD50 = 以上目視狹窄 CLEC1B SeroPro 多型性 性別 第II型糖尿病（*) 吸煙與否 高血壓（**) 0.0026 1.610 (1.181-2.198) <0.0001 2.584 (1.908-3.497) <0.0001 2.198 (1.577-3.058) 0.0005 1.695 (1.258-2.283) <0.0001 2.273 (1.721-2.994) 54 20 200934877 表5 : LURIC群組中包括混雜因素(邏輯迴歸)之cleCIB蛋白 質位置24之(Ser~>Pro)多型性對具有50%以上狹窄症的冠狀動 脈疾病影響之分析；CAD20 = 20%以上目視狭窄，CAD50 = 50% 以上目視狹窄 5 CLEC1B Ser->Pro 多型性 0.0021 1.499 (1.152-1.942) 性別 <0.0001 2.639 P.012-3.448) 第II型糖尿病（*) <0.0001 1.812 (1.379-2.381) 吸煙與否 w高血壓（**) <0.0001 1.764 (1.355-2.294) <0.0001 1.603 (1.256-2.041) 55 Ο e 200934877 序列表 <110> Sanofi-Aventi s <120> CLEC1B於判定心血管及血栓風險上之用途 <130> DE2007/042 <160> 5
<170> Patentln version 3.B <210> 1 <211> 963 <212> DNA <213>智人 <400> 1 ctatgaagaa gcttcctgga aaacaataag caaaggaaaa caaatgtgtc ccatctcaca tggttctacc ctactaaaga caggaagatc ataaactgac agatactgaa attgtaagag ttggaaacta cattttgcaa agtcattgaa ctctgagctc agttgcagta ctcgggaagc catgcaggat gaagatggat acatcacctt aaatattaaa actcggaaac cagctctcgt ctccgttggc cctgcatcct cctcctggtg gcgtgtgatg gctttgattc tgctgatcct gtgcgtgggg atggttgtcg ggctggtggc tctggggatt tggtctgtca tgcagcgcaa ttacctacaa gatgagaatg aaaatcgcac aggaactctg caacaattag caaagcgctt ctgtcaatat gtggtaaaac aatcagaact aaagggcact ttcaaaggtc ataaatgcag cccctgtgac acaaactgga gatattatgg agatagctgc tatgggttct tcaggcacaa cttaacatgg gaagagagta agcagtactg cactgacatg aatgctactc tcctgaagat tgacaaccgg aacattgtgg agtacatcaa agccaggact catttaattc gttgggtcgg attatctcgc cagaagtcga atgaggtctg gaagtgggag gatggctcgg ttatctcaga aaatatgttt gagtttttgg aagatggaaa aggaaatatg aattgtgctt attttcataa tgggaaaatg caccctacct tctgtgagaa caaacattat ttaatgtgtg agaggaaggc tggcatgacc aaggtggacc aactacctta atgcaaagag gtggacagga taacacagat aagggcttta ttgtacaata aaagatatgt atgaatgcat cagtagctga aaaaaaaaaa aaa <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> 智人 <400> 2
Met Gin Asp Glu Asp Gly Tyr lie Thr Leu Asn lie Lys Thr Arg Lys 15 10 15
Pro Ala Leu val Ser Val Gly Pro Ala Ser Ser Ser Trp Trp Arg Val 20 25 30 第1頁 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 963 200934877
Met Ala Leu lie Leu Leu lie Leu Cys val Gly Met Val val Gly Leu B5 40 45 val Ala Leu Gly lie Trp Ser val Met Gin Arg Asn Tyr Leu Gin Asp 50 55 60
Glu Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu Gin Gin Leu Ala Lys Arg Phe 65 70 75 80
Cys Gin Tyr val val Lys Gin s.er Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly 85 90 95
His Lys Cys Ser Pro cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr Gly Asp ser 100 105 110 Ο
Cys Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu Ser Lys Gin 115 120 125
Tyr Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys lie Asp Asn Arg Asn 130 135 140 lie Val Glu Tyr lie Lys Ala Arg Thr His Leu lie Arg Trp val Gly 145 150 155 160
Leu ser Arg Gin Lys ser Asn Glu val Trp Lys Trp Glu Asp Gly ser 165 170 175
Val lie Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn 180 185 190
Met Asn cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Phe cys 195 200 205
Glu Asn Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys 210 215 220
Val Asp Gin Leu Pro 225 <210> 3 <211> 401 <212> DNA <213> 智人 60 120 180 240 <400> 3 agaatggatg tatggtatag gggtgggcca tgcctattgt tgatgatcat gaggagaaca caggtgagat ctgccagcaa agctctttct attacttgga ggaccctgag aaggcagggg caggggcagg ggtgagcctt ccccatagct aacccatact gcctgctcct tgatgtcttt attatatgcc tacagttggc yctgcatcct cctcctggtg gcgtgtgatg gctttgattc tgctgatcct gtgcgtgggg atggttgtcg ggctggtggc tctggggatt tggtgtaagt 第2頁 300 200934877 gttgactctg ccagaaattt gactggagga aggtaatact gaagggtcat ggcatatccc 360 actaagcttc tcaatggtcg ctatttgtct gtttatcact t 401 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>前置引子 <400> 4 tgcctgctcc ttgatgtctt tatt 24 <210> 5 <211> 23
<212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 反置引子 <400> 5 23 tcagcagaat caaagccatc aca
第3頁

Claims (2)

  1. 200934877 七 2. Ο 3. 15 20 申請專利範圍： 一種針對待檢查個體之生物取— 單核_型性(SNPs)或蛋_鏗U :检性疾病或形成心血⑽血检性疾病= 待檢查個體之生物取樣使用咖⑽蛋白質或 二能性諸鑑定心血管及/或血栓性疾病或形成 血s及/或血栓性疾病風險增加之用途。 以鑑㈣體中心血管及/或血栓彡&血 疾錢險增蚊錢，料純括針對個 a)出現於clecib基因（根據NM—0165〇9)之一或二對 偶基因上位置25G之核純麵，出現於該位置之 核苷酸種類為該個體罹患或形成心血管及/或血栓性 疾病風險之指標；或 出現於CLEC1B蛋白質多肽鏈(根據Np—〇57593)位 置24之胺基酸種類，出現於該位置之胺基酸種類為 該個體罹患或形成心血管及/或血栓性疾病風險之指 標，或 有關存在該試樣中之CLEC1BmRNA及/或蛋白質之 量是否與一或多個參考試樣不同，不同量之出現表 示罹患或形成心血管及/或血栓性疾病之風險增加。 一種判定罹患心血管及/或血栓性疾病風險之方法，該方 法包括針對個體之單離試樣分析一或多個前述SNPs或 b) c) 56 4. 200934877 蛋白質多型性之存在及根據年齡及出現於 CLEC1B基因 位置250或CLEC1B蛋白質位置24之核苷酸或胺基酸種 類計算該評估風險。 5· —種使用CLEC1B單核苷酸多型性(SNp)或蛋白質多型 5 性調整前及/或治療心A管及/或血栓性疾病用藥物劑 量之用途。 6. —種使用CLEC1B蛋白質或核酸或其功能性片段調整預 防及/或治療心血管及/或血栓性疾病用藥物劑量之用途。 ® 7. 一種用以調整個體中預防及/或治療心血管及/或血栓性 ίο 疾病用藥物劑量之方法，該方法包括針對個體取樣檢測 a) 出現於CLEC1B基因一或二對偶基因上位置250之 核苷酸種類，該劑量視出現於一或多個該等位置之 核苷酸種類而調整；或 b) 出現於CLEC1B蛋白質位置24之胺基酸種類，該劑 15 量視出現於一或多個該等位置之胺基酸種類而調 整；或 0 c) 有關存在該試樣中之CLEC1B mRNA及/或蛋白質之 量是否與一或多個參考試樣不同，該劑量視個體取 樣中蛋白質及/或mRNA之量是否與得自參考試樣或 20 諸參考試樣者不同而調整。 8. —種使用一或多個CLEC1B單核苷酸多型性(SNP)或蛋 白質多型性鑑定個體對治療及/或預防心血管及/或血拾 性疾病用藥物反應之用途。 9. 一種使用CLEC1B蛋白質或核酸或其片段鑑定個體對治 200934877 療及/或預防心血管及/或血栓性疾病用藥物反應之用途。 10. —種使用CLEC1B蛋白質或核酸或其功能性片段或衍生 物鑑定於預防及/或治療心血管及/或血栓性疾病上具活 性之物質之用途。 Π. —種利用分析欲檢測個體之生物取樣使用CLEC1B檢測 工具診斷心血管及/或血栓性疾病或易感染心血管及/或 血栓性疾病體質之用途。 H 一種用以鑑定於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具 活性之物質之方法，該方法包括： a) 使CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物與測試 物質接觸；及 b) 判定該測試物質是否調節CLEC1B蛋白質或其功能 性片段或衍生物之活性。 13. —種用以鑑定於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具 活性之物質之方法，該方法包括： a) 使具有可檢測之CLEC1B或其功能性片段或衍生物 的量之細胞與測試物質接觸； b) 判疋3亥測试物質是否能調節存在細胞中之cleC 1B 或其功能性片段或衍生物之量或活性。 14. 一種用以鑑定於預防或洽療心血管及/或血栓性疾病上具 活性之物質之方法，該方法包括： a) 使編碼CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物之 核酸與轉錄活性系統中之測試物質接觸； b) 於該物質存在下，測定存在該系統中之編螞CLEC1B 58 200934877 ❹ 15 蛋白質或其功能性片段或衍生物的恤财之量； 於該物質不存在下’測定存在該系統中之編碼 CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物的爪丽 之量； 判定該物質是否能於該系統中調節編碼CLEcm蛋 白質或其功能性片段或衍生物的mRNA之量。 15. -種用以鑑定於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上旦 活性之物質之方法，該方法包括： 、八 a)提供經含有操作性地連接於報導基因或其功能性片 ^之CLEC1B基因啓動子或其功紐片段之核酸載 體轉染之細胞； 提供經含有非操作性地連接於功祕clecib啓動 報導基因或其功能性片段之對照組載體轉染之 ^則試物質存在下，測定根據_ b)之細胞之報導 基因活性；3:::不存在下，測定根據a)與b)之細胞之報 16. 轉斷心血管及/或血检性疾病或易感染心血管及 /或血栓性疾病體質之測試套組，該測試套也 ， 物試樣中之CLEC1B用之至少一種工具。 W/、J生 17. 如申请專利範圍第3或7項之方法，贫士、+ 取樣檢測有關CLEC1B基因之一或二: 下述基因跑想:於CLE⑽基因 C) d) b) c) d) 59 20 200934877 苷·，一或多個該變異體之存在表示根據申請專利範圍第3 項之方法中之風險增加，及藥物劑量於一或多個該基因 • 體變異體存在下根射請專利範㈣7項之方法調整。 18. 如申請專利範圍第3或7項之方法，該方法包括針對該 5 取樣檢測有關其是否含具有下述蛋白質變異體之 CI^ECIB蛋白質：於CLEC1B蛋白質位置24之脯胺酸； 該變異體之存在表示該鋪於根據申請專利範®第3項 之方法中惟患或开〉成心企管及/或血栓性疾病之風險增 加，及藥物劑量於一或多個該基因體變異體存在下根據 10 申請專利範圍第7項之方法調整。 19. 如申請專利範圍第3或7項之方法，該方法包括針對該 取樣檢測有關CLEC1B基因之一或二對偶基因是否具有 下述基因體變異體：於CLEC1B基因之-或二對偶基因 上CLEC1B序列（根據NM—16509)位置250之胞苷以外之 15 核苷酸，較佳為胸苷；該變異體之存在表示該個體於根 據申請專利範圍第3項之方法中羅患或形成心血管及域 0 血栓性疾病之風險較低，及於一或多個該基因體變異體 存在下根據申請專利範圍第7項之方法調整之藥物劑量。 20·如申請專利範圍第3或7項之方法，該方法包括針對該 20 取樣檢測有關其是否含具有一或二個下述蛋白質變異體 之CLEC1B蛋白質：於CLEC1B蛋白質（根據Np—〇57柳) 位置24之脯胺酸以外之胺基酸，較佳為絲胺酸；—或二 個該變異體之存在表示該個體於根射請專利範圍第3 項之方法m切如血管及/或血她_之風險較 60 200934877 ，，及於一或多個該基因體變異體存在下根據申請專利 範圍第7項之方法調整之藥物劑量。 月
    Ο CLEC1B 21.根據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測 包’其中CLEC1B為哺乳動物CLEC1B，較1 22.根據前述中請專利範圍中任—項之用途、方法或測試套 組’其中心血管及/或血栓性疾病為心絞痛、不穩定型心 絞痛、心臟梗塞、早期心臟梗塞、周邊血管疾病、冠狀 、高金壓、中風、p刪D、TIA或需要進行冠狀 動脈氣球擴張術之疾病。 23·根據前述中請專利範圍中任—項之用途、方法或測試套 、=，包括分析個體取樣，其中取樣被檢測之該個體具有 葡萄糖代謝疾病’較佳為罹患糖尿病，特佳為罹患^第Ϊ 型糖尿病。 〜 24. f據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測試套 組’其中取樣被檢測之該個體罹患心血管及/或血栓性疾 病。 25. f據前述中請專利範圍中任—項之用途、方法或測試套 組，其中該試樣為哺乳動物試樣，較佳為人類試樣。 .1 艮據刖述申凊專利範圍中任一項之用途、方法或測試套 、’、/、中名減樣為組織學试樣、活檢試樣、細胞抽取物、 —或多個細胞或採取之體液。 根據刖述申凊專利範圍中任一項之用途、方法或測試套 組’其中CLEC1B係呈單離分子使用。 20 200934877 28. 根據申請專利範圍第1、2、5或8項之任一項之用途， 其中係分析CLEC1B基因（根據NM_016509)位置250之 . 一或多個SNPs。 29. 根據申請專利範圍第6、9或10項之任一項之用途，其 5 中該核酸於CLEC1B基因（根據NM_016509)位置250含 有 SNP。 30. 根據申請專利範圍第24或25項之用途或方法，其中該 等SNPs為：於CLEC1B基因（根據NM_016509)之一或二 〇 對偶基因上CLEC1B序列位置250之胞苷。 ίο 31.根據申請專利範圍第1、2或4至6之任一項之用途或根 據申明專利範圍第3項之方法，其中一或二個下述蛋白 質多型性之鑑定表示疾病或風險增加：於CLEC1B蛋白 質（根據NP_〇57593)位置24之脯胺酸。 32. 如申請專利範圍第1、2、6或8至11之任一項之用途或 15 如申凊專利範圍第3、7、14或17之任一項之方法，其 中於CLEC1B基因（根據NMJH6509)位置250之核苷酸 0 種類係利用一或多個適當引子或探針測定。 33. 如申請專利範圍第3〇項之用途或方法，其中核苷酸種類 係利用PCR、南方墨點法、陣列_或晶片_雜交法鑑定。 20 34·根據申請專利範圍第11項之用途或根據申請專利範圍第 12項之測試套組，其中該檢測用工具為用以檢測 CLEC1B DNA 之工具。 35,根據巾請專利範圍第30項之料或測試套組，其中該工 具為引子或引子組、適當探針或序列專-性抗-DNA抗 62 200934877 36. 根據申請專利範圍第2、6、8或9之任一項之用途或如 申請專利範圍第3或7項之方法，其中係分析mRNA量 之變化’較佳為使用擴增CLEC1B cDNA用之一或多個 5 適當引子或於標準條件下適用於與CLEC1B cDNA或 mRNA雜交之一或多個探針。 37. 根據申凊專利範圍第33項之用途或方法’其中mRNA之 量係利用PCR、北方墨點法、陣列-或晶片-雜交法分析。 ® 38.如申請專利範圍第u項之用途或如申請專利範圍第i2 10 項之測試套組，其中該檢測用工具為用以檢測存在生物 試樣中之CLECIBmRNA及/或蛋白質之工具。 39. 如申請專利範圍第35項之用途或測試套組，其中該用以 檢測CLEC1B蛋白質之工具為抗體。 40. 根據申請專利範圍第2、6、8或9之任一項之用途或根 15 據申請專利範圍第3或7項之方法，其中係測定CLEC1B 蛋白質量之變化。 d 41.根據申請專利範圍第i、6或37項之用途或方法，其中 該蛋白質係藉助於至少一種抗體進行檢測。 42. 如申請專利範圍第38項之用途、方法或測試套組，其中 20 該檢測係利用ELISA、西方墨點法或蛋白質晶片進行。 43. 如申請專利範圍第37或38項之用途、方法或測試套組， 其中該檢测係利用免疫組織化學法或免疫玫射化學檢測 法進行。 “ 44. 根據前述申請專利範圍任一項之用途、方法或測試套 63 200934877 45. 5 46. ❾ 10 47. is 48. ό 49. 2〇 50. 組其中及基因體CLEC1B;^酸序列係如」 或16中界定之序列，視需要於有_ clecib基因序列(根 據NM_016509)位置250之核苷酸有偏差。 根據申請專鄕®第41項之用途、方法或測試套組其 中該序列具有-或多個下述SNPs:於clecib基因序列 位置250之胞苷。 根據申請專利範圍第29至34項任—項之用途、方法或 測試套組，其特徵為含有如SEQ ID N〇s: 4及5界定的序 列之或一個引子之引子組或如序列3界定 之探針。 根據申π專利$!!圍f 1Q項之用途，其中該clecib核酸 或其片U合位置25G及較佳為亦包含―或多個下述 SNPs .於CLEC1B基因序列（有關NM_〇165〇9)位置25〇 之胞苷。 根據申δ月專利範圍第1〇工員之用途，其中係使用clecib 蛋白質或其片段，其包含胺基酸位置25及包含下述蛋白 質多型性：於CLEC1B蛋白f位置25之脯胺酸。 -種核酸引子，其具有根據SEQIDN〇: 4或5之核酸序 列。 -種核酸探針，其具有根據SEQIDN〇: 3之核酸序列。 64 200934877 四、指定代表圖·· (一） 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 無。 〇 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 無。 2 200934877
    發明專利說明_ 、順序’請勿任意更動，※記號部分請勿填寫） ※申請案號 .※申請曰： 、發明名稱：（中文/英文） ※IPC分類：
    CLEC1B於判定心金管及血栓風險上之用途 USE OF CLEC1B FOR THE DETERMINATION OF CARDIOVASCULAR AND THROMBOTIC RISK o 二、 中文發明摘要： 本發明乃有關針對待檢查個體之生物取樣使用 CLEC1B基因之單核苷酸多型性(SNP)鑑定心血管及/或血栓 病症或形成心血管及/或血栓病症風險增加上之用途；及使 用CLEC1B鑑定於預防及/或治療心血管及/或血栓病症上具 活性之物質之用途及其方法。 三、 英文發明摘要： ❹ The use of the single nucleotide polymorphism (SNP) of the CLEC IB gene for the identification of cardiovascular and/or thrombotic disorders or of an increased risk for developing cardiovascular and/or thrombotic disorders in a biological sample taken from an individual to be examined; the use of CLEC IB for identifying substances active in preventing and/or treating cardiovascular and/or thrombotic disorders and methods for doing so. 200934877 .六、發明說明： 【發明所屬之技術領域] 本發明係有關單核苷酸多型性(SNPs)&蛋白質多型性 • 於鑑定心血管及/或血栓病症風險增加上之用途，及有關適 5 用於該用途之引子與核酸。此外，本發明係有關CLEC1B [C * 型凝集素功能部位1族，成員B (C-TYPE LECTIN DOMAIN FAMILY 1，MEMBER B)或者類C型凝集素受體2 (c_TYpE LECTIN-UKE RECEPTOR 2)/CLEC士下文中稱為 clecib] O 於尋找預防及治療心血管及血栓病症之活性物質上之用 10 途。 、 【先前技術】 、於西方世界，心血管及/或血栓性疾病在男女兩性中均 為死亡之主要原因。心血管疾病涵蓋影響心臟功能之所有 病症，尤其包括心臟組織及心臟血管之失調症。金栓性病 15 症涵蓋所有影響血流病理狀態或與出血傾向增加有關之血 管阻塞結果企流減少相關之病症。 冠狀心臟疾病，特別是冠狀動脈疾病，可視為心血管 《病主因之—。絞痛，亦稱為心絞痛，係發生於心肌氧氣 供應不=時之暫時性胸痛或壓迫感。當冠狀動脈狹窄或阻 20 塞，使得流至心肌之血流無法增加至符合氧氣辦加雷1 時’其結果可能發生局部缺血，引起疼痛（亦 常，心絞痛起因於冠狀動脈疾病，惟亦可能由其他冠狀心 臟疾病引起。並非每一次心肌缺血即引起與心絞痛有關連 之疼痛或壓迫感，此類心肌缺血，亦即無心絞痛之心肌局 25 部缺血，稱為沉默性局部缺血。沉默性局部缺血之危險性 在於受侵襲之個體未查覺心肌受損害。因此，直到該損害 3 200934877 塞之前，病患或主治醫師常未能確認心臟 臟声、艮:2 2 !· °基於此因，業界對於用以確認金管及心 獲得診斷結果’因而進行介人性治療之 0斷方法及手&有極大需求。 =於與^血管及/或血栓性疾病相關之高社會經濟及個 、^，因此對於該等疾病之早期診斷及治療有極大需求。 二此’本㈣之目的在於提供賴及治療4管及/或 血栓性疾病之改善方法。 10 15
    20 【發明内容】 根，本發明’針對待檢查個體之生物取樣使用C L E C1B 基因之單核苷酸多型性(SNPs)或CLEC1B蛋白質多型性鑑 定心血管及血栓性疾病而達成該目的。 舉例而言，此可利用分析CLEC1B核酸[亦即RNA或 DNA (舉例而言，如，cDNA或基因體DNA)]之根據參考序 列NM 016509 CLEC1B核酸序列位置250胸苷(τ) -)►胞苷 (C)[或CLEC1B基因體序列（例如根據SEq ID N〇 NT_009714)之對應位置]單核苷酸多型性之存在；及/或利用 分析CLEC1B蛋白質之根據參考序列np_〇57593 CLEC1B 蛋白質位置24絲胺酸(Ser)—脯胺酸(Pro)蛋白質多型性之 存在；或利用分析存在該取樣中CLEC1B蛋白質或mRNA 之量或功能性質而達成。 此處’根據平常方法可確定CLEC1B核酸或蛋白質内 任何相關位置之核苷酸或胺基酸種類。由於知道特定位置 之核苷酸或胺基酸種類，熟習此項技藝人士即可判定該生 物試樣由來個體之心血管及/或血检性風險群。 25 200934877 • CLEC1B屬於跨膜蛋白質之C型凝集素超家族 (Kanazawa et al” 2007)。CLEC1B 於 2000 年被基因轉殖及 定位於人類第12號染色體之NK基因複合體内。CLEC1B - 由229個胺基酸組成，其表觀分子量為27kDa(Colonnaet 5 al.，2000; Sobanov et al.，2001)。CLEC1B 於單核細胞、粒細 胞及樹突細胞中表現(Kanazawa et al·，2007)。近來，CLEC1B 於血小板上之表現已被敘述（Suzuki-Inoue et al.，2006)。 CLEC1B被鑑定為係紅蛇毒(rh〇docytin)之新穎之結合蛋白 質’暗示該受體涉及該蛇毒蛋白對血小板之活化作用。最 10 近被闡明之CLEC1B晶體結構進一步支撐紅蛇毒為此受體 之配體之說法(Watson etal” 2007)。除了紅蛇毒之外，對抗 CLEC1B之諸抗體亦能引發血小板中路胺酸激酶之填酸 化，表示該受體銜接促效劑後’能傳介血小板活化作用 (Suzuki_Inoue et al” 2006 ; Fuller et al.，2007)。CLEC1B 於 15 血小板上之確實功能雖未被闡明，惟該受體於感染病患中 似乎涉及1型人類免疫缺乏病毒(HIV-1)之散播；血小板似 D 乎係經由均於血小板上表現之CLEC1B及對凝集素樹突細 胞具專一性之細胞内黏著分子3 _攫取非整合素(3 _grabbing nonintegrin)(DC-SIGN)等連接因子而漸被mv_i佔用 2〇 (Chaipan et al.，2006)。 CLEC1B基因之序列於此項技藝中為已知。clecIB基 因位於染色體12pl3.2上。該基因之編碼核酸序列可擷取自 NCBI基因庫之編號NM_〇} 65 〇9。CLEC1B基因之鄰接基因 體序列可自NCBI基因庫之智人染色體12基因體c〇ndg 5 200934877 ΝΤ_009714獲得。其衍生之蛋白質序列可擷取自NCBI基 因庫之編號NP_057593。NCBI係美國國家生物科技資訊中 心（National Center for Biotechnology Information)(郵寄地 . 址：National Center for Biotechnology Information, National 5 Library of Medicine, Bethesda，MD 20894，USA ;網址： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。 本發明係有關臨床病患群組染色體層次之CLEC1B基 因之研究，由發明人等進行評估CLEC1B基因及/或蛋白質 > 中之變異對帶有此等變異體者臨床或病理生理表現型之影 10 響0 單核苷酸多型性(SNPs)係於個別位置含有置換之特定 核苷酸序列之變異體，其為熟習此項技藝人士所悉知。本 文所用之蛋白質多型性一詞包含蛋白質一級（亦即胺基酸序 列）、二級（亦即蛋白質折疊）及/或三級結構（亦即由不同多肽 15 次單元之蛋白質集合)之任何改變，較佳為包含編碼蛋白質 基因之一或多個SNPs引起之改變；其實例為，例如胺基酸 0 交換、胺基酸缺失或蛋白質切截。 CLEC1B基因之各種單核苷酸多型性(SNPs)為先前技 藝已知且可自Ensembl基因庫公開取得，例如 2〇 http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/genesnpview?db=core ;gene=ENSG00000165682。又，上文經鑑定之根據參考序列 NM—016509 CLEC1B核酸序列位置250 (或CLEC1B基因體 序列之對應位置，例如有關SEQ ID NO:3之位置201)之SNP 係已知（參照SNPID:rs2273986)’且可擷取自NCBI基因庫 6 200934877 存取編號rs—2273986及尤其可利用下述關聯取得： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=2273986 此關聯亦揭示圍繞根據本發明SNP之部分基因體序列 • (亦見 SEQIDNO: 3)。 5 然而，CLEC1B之該多型性與具有或遭受心血管及/或 血栓性疾病間之關聯性迄今尚未知或未見述而完全令人驚 奇。 【實施方式】 ^ 發明人等之實驗第一次證明CLEC1B基因之特定變異 ίο 常以統計學上顯著之頻率發生於罹患心血管及/或血栓性疾 病之人類。為了評估CLEC1B基因或蛋白質内之sNPs或變 異體與該等疾病之發作及進展之可能關係，乃詳細分析 CLEC1B蛋白質位置24之絲胺酸4脯胺酸基因變異體，及 於界定明確之病患群組中進行基因型-表現型相關分析；結 is 果令人驚奇地發現’該CLEC1B多型性與心血管及/或血栓 性風險或病症相互關聯。CLEC1B基因多型性與易感染此 ◎ 類疾病體質之相關性之前從未見敛述’就有關CLEC1B公 佈之數據而言’到目前為止，被視為是完全令人驚奇的。 本發明之各種態樣適用於所有動物或人類；一較佳具 20 體實例係有關應用於哺乳動物及/或人類。因此，CLEC1B (有關核酸、蛋白質、多型性等）一詞係指得自任何動物物種 或智人種之CLEC1B ;較佳具體實例涵蓋得自哺乳動物之 CLEC1B 及/或智人種(hs) CLEC1B。 因此，本發明另一態樣係有關CLEC1B蛋白質或核酸 或其功能性片段於待檢查個體之生物取樣中鑑定心血管及/ 7 25 200934877 或血栓性風險或疾病上之用途。 下文中，於CLEC1B基因及/或核酸或蛋白質内既定位 置最常發生之核苷酸或胺基酸稱之為最常發生之變異體或 “野生型’’。 CLEC1B - T250T敘述於CLEC1B基因之二對偶基因上 有關參考序列NM_016509之位置250(或於CLEC1B基因體 序列之對應位置）具有胸苷(T)之個體群。此多型性導致產生 於有關參考序列NP_057593之位置24具有絲胺酸(Ser或 S)胺基酸（Ser24)之CLEC1B蛋白質。該等個體有關該 CLEC1B變異為同型接合。由表2可獲得，核苷酸τ為 CLEC1B基因位置250最常發生之變異及胺基酸絲胺酸為 CLEC1B蛋白質位置24最常發生之變異。 CLEC1B - T250C敘述於CLEC1B基因之一對偶基因上 有關參考序列NM_016509之位置250(或於CLEC1B基因體 序列之對應位置）具有胸苷(T)及於CLEC1B基因之另一對 偶基因上有關參考序列NM_016509之位置250(或於 CLEC1B基因體序列之對應位置）具有胞苷（c)之個體群。此 多型性導致產生於有關參考序列NP_057593之位置24具有 絲胺酸(Ser或S)胺基酸(Ser24)及有關參考序列NP_057593 之位置24具有脯胺酸(pro或p)胺基酸(Pr〇24)之CLEC1B 蛋白質。該等個體有關該CLEC1B變異為異型接合。 CLEC1B - C250C敘述於CLEC1B基因之二對偶基因上 有關參考序列NM_016509之位置250(或於CLEC1B基因體 序列之對應位置）具有胞苷(C)之個體群。此多型性導致產生 8 200934877 於有關參考序列NP—057593之位置24具有脯胺酸(Pr〇或 P)胺基酸(Pr〇24)之CLEC1B蛋白質。該等個體有關該 CLEC1B變異為同型接合。 CLEC1B基因中之基因變異，舉例而言，可利用下述 方法檢測：
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    20 a) 經由分子-生物分析可能含有基因變異之CLEC1B基 因’直接檢測染色體DNA層次之該等基因變異；此處 特別是針對根據參考序列NM—016509 CLEC1B編碼序 列（或CLEC1B基因體序列中之對應位置)位置250周圍 區域； b) 經由測定CLEC1B mRNA表現進行檢測； c) 檢測CLEC1B蛋白質内之蛋白質多型性；此處特別是 針對根據參考序列NP_057593，CLEC1B多肽鏈之位 置24 ;及 d) 經由利用蛋白質-化學方法測定存在細胞、組織或體液 中之CLEC1B蛋白質之量及/或活性進行間接檢測。 於CLEC1B基因中，核酸層次（此處為染色體DNA)之 於上述參考序列中之位置之基因變異或多型性，舉例而 言’可利用下述方法檢測： 1) 根據CLEC1B基因之該區域核酸序列之定序方法(例如 焦磷酸定序法、使用放射性標記或螢光染料標記之核 苷酸之定序法、或經由該核酸序列之質譜分析）； 2) 根據CLEC1B基因之該區域核酸序列之雜交方法(例如 利用“DNA微陣列”）； 9 200934877 3) 根據CLEC1B基因之該區域核酸序列擴増產物之分析 方法(例如TaqMan分析）。 於CLEC1B基因中’核酸層次(此處為染色體dna)之 基因變異或多型性於有關上述參考序列中之上述位置，舉 例而言，亦可根據測定表現之CLECIB mRNA經由下述方 法檢測：
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    1) 根據CLEC1B基因之核酸序列之雜交方法(例如利用 “DNA微陣列’’、北方墨點分析）； 2) 根據CLEC1B基因之核酸序列擴增產物之分析方法(例 如TaqMan分析、RNA差異顯示、代表性差異分析）。 CLEC1B蛋白質内有關根據參考序列np_〇57593蛋白 質序列一或兩個位置24之蛋白質多型性可，例如，利用能 區分CLEC1B蛋白質内位置24之例如絲胺酸或脯胺酸之專 一性抗體，或利用適用於區分根據參考序列NP 057593 CLEC1B蛋白質序列位置24具有脯胺酸或者絲胺酸之 CLEC1B變異體之替代生化方法或分子生物方法進行檢測。 此外’上述參考序列内之一者之上述位置之基因變異 或多型性可經由分析CLEC 1B蛋白質之量及/或活性予以檢 測。CLEC1B蛋白質之量及/或活性可，舉例而言，根據下 述方法檢測： G根據CLEC1B蛋白質量之定量檢測方法(例如西方墨點 分析、ELISA試驗）；或 2)經由試管内測試系統’例如於人類細胞、動物細胞、 細菌及/或酵母細胞中’根據CLEC1B蛋白質活性之功 20 200934877 能性檢測方法。 €5 15 20 CLEC1B基因中上述位置之一者之基因變異或多型 性’舉例而言，可使用，例如，下述諸項予以檢測：呈（a) 用以評估心血管及/或血栓性疾病（例如：周邊血管疾病、高 血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定型絞痛、早期心肌梗塞、 心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病）風險之基因標記；（b)於對應 基因變異體之載劑中用以預防性治療心血管及/或血栓性疾 病（例如：周邊血管疾病、高血壓、中風/PRInD/tia、不穩 定型絞痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病） ^祐3己’（c)用以調整心血管及/或血栓性疾病（例如：周邊血 皆疾病、高血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定型絞痛、早期 梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病）用醫藥活性物質 劑量之標記；（d)用以判定鑑定心血管及/或血栓性疾病（例 i .周邊金管疾病、高血壓、中風/PRINd/tia、不穩定型 ^痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病）用醫 =活=物質之大量快速篩檢策略之標記；（e)用以鑑定供臨 =研究之相關個體或病患俾使測試心血管及/或血栓性疾病 3 .周邊血管疾病、高血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定 早期心肌梗塞、心肌梗塞、及/或冠狀心臟疾病） 以樂活性物質之相容性、安全性及效力之標記；及⑺用 =發分析CLEC1B基因DNA、RNA或蛋白質層次之基因 用之测試系統之基礎。 或政因5，本發明另一態樣係有關CLEC1B蛋白質或核酸 ^、片段於待檢查個體之生物取樣中鑑定形成心血管及/或 11 200934877 血栓性疾病風險增加上之用途。
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    20 本發明又另一態樣係有關用以鑑定個體中心血管及/或 血栓性疾病或形成心血管及/或血栓性疾病風險增加之方 法，該方法包括針對個體取樣檢測出現於CLEC1B基因之 一或二對偶基因上根據參考序列NM_016509之位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）之核苷酸種類；出現 於該位置之核苷酸種類為該個體罹患或形成心血管及/或血 栓性疾病風險之指標。 本發明因此亦有關用以鑑定個體中心血管及/或血栓性 疾病或形成心血管及/或血栓性疾病風險增加之方法，該方 法包括針對個體取樣檢測出現於CLEC1B蛋白質多肽鏈位 置24之胺基酸種類；出現於該一或多個位置之胺基酸種類 為該個體罹患或形成心血管及/或血栓性疾病風險之指標。 ^根據一具體實例，本發明係有關用以鑑定個體中心j 笞及/或血栓性疾病或形成心血管及/或血栓性疾病風險』 $之方法’该方法包括針對個體取樣檢測有關存在該試^ :之CLECIBmRNA之量及/或蛋白f之量或功能活性是; 二-或多個參考試樣:^同。出料同量表示該個體羅患』 形成心血管及/或血栓性疾病之風險增加。 CLEC1B量改變’亦即啦⑽含量之變化，可㈤ 次(轉錄、轉譯、剪接)、轉譯後修飾 由沐―、1 ? 冑之運送、或對蛋白質安定性之影響以j 導it徑對CLEC1W現作用之影響所致。 '4樣可為例如具有下述基因體及/或蛋白質變異| 12 200934877 之一或多個個體之取樣：於CLEC1B基因之一或二對偶基 因上根據參考序列NM_016509 CLEC1B核苷酸序列位置 250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）為胸苷以外之核 - 苷酸，較佳為胞苦。 5. 本發明又另一態樣係有關判定罹患心血管及/或血栓性 疾病風險之方法，該方法包括針對個體之單離試樣分析前 述SNP或蛋白質多型性之存在，根據病患年齡及出現於 > CLEC1B編碼序列位置250或CLEC1B蛋白質位置24之核 苷酸或胺基酸種類計算該評估風險。該風險判定之基礎係 ίο 根據表3至5之結果。 本發明任何不同具體實例及態樣中之心血管及/或血栓 性疾病可為例如周邊金管疾病、高血壓、中風/pRIND/TIA、 不穩疋型纟父痛、心肌梗塞、早期心肌梗塞、冠狀動脈疾病、 冠狀心臟疾病及必需進行冠狀動脈氣球擴張術（c〇r〇nary is angioplasty)之任何病理狀況。 本文所示之核苷酸位置係指參考序列NM一〇丨65〇9中該 β 核苷酸之位置（或於CLEC1B基因體序列之對應位置）。 有關CLEC1B胺基酸序列胺基酸位置係指參考序列 ΝΡ_057593 。 2〇 位置從參考序列第一個胺基酸或核苷酸為丨起算，惟 於表示核普酸位置與轉譯位點相關時，則在該核普酸序列 之核皆酸編號前加+或-。 下文中將使用與核芽酸及胺基酸同義之標準縮寫（亦即 三個或一個字母代碼）。 13 200934877 核酸可為任何募_或多核苷酸，“寡核苷酸，，一詞係有關 含2至25個核苷酸之核酸；“多核苷酸，，一詞則係指具有％ 個及26個以上核苷酸之核酸。 於本申請案中，所使用之蛋白質序列、胺基酸序列及 多狀序列等同為同義詞。 迄今，尚無人類之臨床效應與CLEC1B變異體相關聯 之數據被揭示。令人驚奇地，發明人等之研究得以將 CLEC1B蛋白質位置24 CLEC1B變異體（尤其是clecib蛋 白質位置24 Ser〜Pro變異體)之出現與易感染心血管及/或 血栓性疾病體質緊密連結。 使延緩或甚至預防心 疾病、面血·壓、中風/ 血發作；TIA代矣拓. CLEC1B基因之基因多型性之檢測，特別是於根據參 考序列nm_oi6509位置250 (或於CLEC1B基因體序之 對應位置)之核㈣交換，可作為，例如，⑷預防性 治療及預防性措施（藥物治療、生活方式)之基因標記用，俾 心血管及/或血栓性疾病[例如周邊血管
    本發明方㈣能早管及/或血栓性 200934877 病體質，從而使於發生傳統症狀(例如由於組織傷害而感覺 疼痛）之前及早使用預防性或治療性措施成為可能：由負責 之熟習此項技藝輕縣發明之乡型料clecib mRNA 或蛋白質減變之敎狀驗度或功能，給料療或檢查 醫師明確指不’甚至於對應傷害或疼痛發生之前即筛檢血 管或心臟組織已持續存在之傷害、或投與預防性藥物、或
    20 此外，該等變異體與«染心血管及/或錄性疾 質間有關聯之新穎發現使得簡由示意特定藥物劑量之改 變或有必要改扣CLEC1B Μ序㈣蛋白質之該多型性 治療病患而使用更有效之治療。 因此，本發明亦係有關使用 =CLEC1B基因中之-或多個單核錄多型性(sNps)、 b) CLEC1B蛋白質十之-或多個蛋 C) CLEC1B蛋白質或核酸或其功能性片段 ^ ^調整預防及/或治和血管及栓性赫㈣物劑量 <用途。 再者，本發明係有關於個體中用以調整預防及/或治療 =管及/或血栓性赫用藥物劑量之方法，該方法包括針 對個體之取樣檢測： )出現於CLEC1B基因之-或二對偶基因上根據參考序 列NM—016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之 對應位置）之核苦·酸種類及/或 )出現於CLEC1B *白質根據參考序列Np—〇57593位置 15 200934877 24之胺基酸種類， 該劑量視出現於該等位置之核苷酸或胺基酸種類而調整。 一具體實例包括針對個體取樣檢測有關是否CLEC1B 基因之一或二對偶基因具有下述SNP :根據參考序列 5 ΝΜ_016509 CLEC1B編碼序列位置250 (或於CLEC1B基因 體序列之對應位置)之胸苷；於多型性存在下，藥物劑量係 減少或增加。 > 另一具體實例包括針對個體取樣檢測有關是否 CLEC1B基因之一或二對偶基因於上列位置具有上文列舉 ίο 以外之核苷酸；於另一核苷酸存在下，藥物劑量係減少或 增加。另一核苷酸較佳為根據參考序列NM_016509 CLEC1B序列位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位 置）之胞苷。 根據本發明另一具體實例，調整個體治療及/或預防心 15 血官及/或血栓性疾病用藥物劑量之方法包括針對該個體取 樣檢測有關存在該試樣中之CLEC1B mRNA及/或蛋白質之 里疋否與一或多個參考試樣不同。參考試樣可例如為具有 一或多個下述基因體及/或蛋白質變異體之個體取樣：於 CLEC1B基因之一或二對偶基因上CLEC1B序列 2〇 醒―〇16509之位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位 置)之胸苦以外之核普酸’較佳為胞苷；該劑量視個體取樣 中蛋白質及/或mRNA之量是否與得自具有一或多個該等變 異體之-或多個個體之參考試樣或諸參考試樣者不同而調 整0 200934877 Ο 15 Ο 20 CLEC1B基因變異體，特別是CLECnm ι雜 或CWC變異體之存在，具有指標作用。先前技 藝已知，療或預防心血管及/或錄性疾病用之多種藥物。 由於不疋所有^物對羅患相同疾狀所有病患均具有相同 H，因此HX心血f藥物治療之病患通常必須“適應,， 亦即治療醫師事實上必須針對個職患測試有關何 =:==具有期望之效力而副作用盡可能小;其 劑：道病患症狀是否經由所投與藥物(於既定 否終止；事先亦不可能準確地評估該病患是 否將遭受不良副作用之苦。 此說明書巾’於治療之前，鑑定病患為具有與羅患心 變ίΐΐιί Γ特定可能性相關之特^ CLEC1B基因 特;3=力3 蛋白f之量之病患，可能增進以 與發基因特定變異體 显盥相胁, 性疾病之關聯暗示此類CLEC1B變 其他個體且有，其最終具有之作用為該個體比 :能性。針對個別病患之此等不：二= 。使個二= 將得以優i使用已= 於無該變異體之病患， 活性之特定藥物，而較不明對此病患群組特具 之藥物從-開始即不被=活性或很可能產生不良副作用 依慣例’於治療之前對此類個別病患進行分類是不可 200934877 能之事；惟有瞭解根據本發明之多型性與發生心血管及/或 血栓性疾病間之關聯方使其成為可能。因此，於臨床研究 上已被證實極成功地治療具有相同基因變異體之病患群組 • 之藥物可被優先使用於CLEC1B基因具有變異之病患，而 5 對該病患群組較不具活性或比具不同基因變異體之病串、群 組具有產生不良副作用之更高可能性之藥物從一開始即不 被採用。 因此，本發明之進一步態樣係有關使用 a) CLEC1B基因中之一或多個單核苷酸多型性(SNPs)、 10 b) CLEC1B蛋白質中之一或多個多型性及/或 c) CLEC1B蛋白質或核酸或其片段 以鑑定個體對治療及/或預防心血管及/或血栓性疾病用藥 物反應之用途。 此等鑑定之進行’舉例而言，可利用針對個體取樣檢 15 測有關是否（a) CLEC1B基因之一或二對偶基因具有下述變 異體，該核苷酸之存在為試樣由來個體對藥物反應之指 D 標：CLEC1B 序列 NM_016509 之位置 250 (或於 CLEC1B 基因體序列之對應位置）之胸苷；（b)CLEClB基因之—或二 對偶基因具有下述一或多個變異體，其存在為試樣由來個 2〇 體對藥物反應之指標：CLEC1B序列ΝΜ_016509之位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）之胸苷以外之核苦 酸，較佳為胞苷；（c)試樣中CLECIBmRNA及/或蛋白質之 量與一或多個比較/參考試樣者不同，例如得自具有有關 CLEC1B基因之已知基因背景之一或多個參考個體者[例如 200934877 根據⑷或(b)^舰)]，μ量之存在為試樣由來個體對 藥物反應之指標或(d)該CLEC1B蛋白質於CLECm蛋白質 參考序列NP—057593位置24具有多型性SeMpr。；使用其 他方法及程序進行鑑定亦具可信度。 本發明不同態樣之核苷酸種類之測定可根據此項技藝 中已知方法進行；例如可利用下述方法達成： a) 提供包含基因體dna之單離之生物試樣或提供單離之 基因體DNA ; b) 使用能擴增包含CLEC1B序列NM—016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）之核酸之引子 進行PCR反應以擴增核酸； c) 定序該核酸。 測定核普酸種類之另一可能性為，例如，利用下述方 法： a) 提供包含基因體DNA之單離之生物試樣或提供單離之 基因體DNA ; b) 使該基因體DNA固定於適當支撐物上； c) 使於標準條件下能專一性結合於具有（基因體） CLEC1B序列之核酸及於根據參考序列nm 016509 CLEC1B序列位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對 應位置）對特定核普酸具有專一性之一或多個探針與該 經固定之DNA雜交。 根據另一可能性’核芽酸種類亦可以上述兩種方法為 基礎進行測定’惟係使用mRNA產生之cDNA而不用基因 200934877 體 DNA。 mRNA之量可，例如，利用下述方法測定： a.提供包含mRNA之生物試樣或提供得自a)之試樣之單 離之mRNA ; 5 b.使用具擴增衍生自CLEC1B mRNA之核酸的能力之引 子’利用RT-PCR擴增核酸； c·定量該經擴增之核酸，與於至少一個參考試樣（亦即正 ^ 及/或負對照試樣）中擴增之核酸量進行比較。 用以驗證任何既定分析（生物、生化或化學）反應結果之 10 正或負對知、組觀念為熟習此項技藝者所悉知，其包括，例 如’反應以原始分析實驗之相同方式進行，惟缺少一或多 個界定成分(例如缺少C L E C1B蛋白質或mRN A或缺少專一 性CLEC1B抗體等）’以區分該等實驗從所謂“背景，，信號結 果之特殊#说（由既定分析方法產生之人為信號）（負對照 15 組）’亦包括反應以原始分析實驗之相同方式進行，惟使用 志產生已知彳§號之附加成分’以驗證反應條件正常運作（正 D 對照組）。 測定mRNA量之另一可能性為，例如，利用下述方法： a.提供包含mRNA之生物試樣或提供單離之mRNA ; 2〇 b. 轉移該mRNA至適當支撐物； c. 利用至少一個適當探針檢測及定量該支撐物上之 CLEC1B mRNA ; d. 該CLECIBmRNA量與一或多個參考試樣(例如正及/ 或負對照試樣）進行比較。 20 200934877 又另一可能性為包栝下述少驟之方法： a·提供個體之組織學試樣； b·經由與適當！nRNA探針之雜交反應檢測CLEC1B / 之量，檢測及定量該雜交探針； C·讀CLEClBmRNA量與得自一或多個參考試樣(例如正 及/或負對照試樣)者進行比較。 〇 用蛋白質量之測定或蛋白質多型性之鑑定可，例如，利 &下述方法達成·· 10 b 提供欲檢測個體之生物試樣，其中包含蛋白質； ^ 較佳為自a.之試樣中單離出蛋白質； ^ 轉移該蛋白質至適當支撐物； 利用對CLEC1B蛋白質具專一性或對特定CLEC1B蛋 e 白質多型性具專一性之至少一個抗體檢测蛋白質；及 15 6·定量該信號並與得自至少一個參考試樣（亦即負對照組 及/或正對照試樣)之信號進行比較。 ^ 測定蛋白質量或鑑定特定蛋白質多型性之另一可能性 為包括下述步驟之方法： a* 提供個體之組織學試樣； 20 餐由與適當CLEC1B抗體之結合反應檢測clec 1B蛋 白質量，檢測及定量該量； 該CLEC1B蛋白質量與得自一或多個參考試樣(例如正 及/或負對照試樣)者進行比較。 特定蛋白質多塑性之測定可例如經由使用對多肽鏈位 之4具有絲胺酸之CLEC1B蛋白質較具有另外胺基酸之 21 200934877 CLEC1B蛋白質（尤其是多肽鏈位置24具有脯胺酸)(根據參 考序列NPJ)57593之胺基酸位置)具有可檢測出之較高結合 親和性之對抗CLEC1B蛋白質之抗體而達成。 再者，特定蛋白質多型性之測定可經由使用適用於鑑
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    20 別性檢測多肽鏈位置24具有絲胺酸之CLEC1B蛋白質及具 有另外胺基酸之CLEC1B蛋白質（尤其是多肽鏈位置24具 有脯胺酸)之此項技藝中已知之任何適當替代之分子生物學 或生化方法(如質譜分析法）而達成。 於此’試樣或採樣或單離試樣係指取自病患之生物材 料。生物材料可包括，例如：細胞或製備物或部分組織或 器宫或體液(例如淋巴、唾液、錢、皮膚、結締組織）、或 細胞，較佳為容易移除之細胞，舉例而言，如，黏膜細胞。 此頌生物材料可利用一般技術獲得，例如以藥簽擦拭取 ，、採取血賴樣、_穿骸外科技雜❿活組織切 =。二亥等賴佳為組織學抽樣、細胞製劑、細胞例如黏 =二細、純化之舰、·或蛋白質或體液 自細胞或_之天然麵分子之·及細胞^ ^ 之製備為熟習此項技藝人士所来 I且織抽取物 ηΜΑ/^χτΛ '"知（亦參見下文列出之標準 二: 或蛋白質製備物可由其利用-般 由於CLEC1B已於本申誇奎由楚 u 、 =或蝴生疾病相關聯’因此， 亦有關使用CLEC1B蛋白皙#吁、、且彼此關連地 質或減或其魏性諸尋找用 22 200934877 ^ a管及/或血m病之活性物質之用 途。 物發明不同態樣之—具體實例，CLEC1B、其衍生 物或其片段可作為單離分子使用。 明5兒明書中’ “單離分子，，-詞，尤其是有關 CLiiClB ^ it a —. 、扣自天然來源純化（亦即自其天然環境取得） =1B㈣或多肽或其片段以及經純化之重組分子(其 ^ d包含部分純化以及完全純化）。核酸之單離為此 項技蟄中悉知(亦參見下域準實驗室程序之文獻）。 根據本發明之用途容許鐘定用於預防及/或治療心血管 及/或血栓f生疾病之新穎物質。根據本發明之用途包括鑑定 八有所而特之物質’以及進—步確認已被鑑定可用於預 防及/、或治療心血管及/或血栓性疾病之物質。 被用於本發明不同態樣中之物質可為經純化、部分純 35 〇 化&成或利用生物化學或分子生物方法製造之任何生物 或化學物質或天然產物抽取物。 於本發明不同態樣之意義上被視為具有預防或治療心 A管及/或血錄疾赫性之物質可為對clecm諸功能之 -者或對CLEC1B mRNA或蛋白質於生㈣射之表現、 量或穩定狀態程度具有影響之任何物質。 欲達此目的，該物質可調節CLEC1B之任何功能(例如 如上文或下文界定者pCLEC1B蛋白質活性可由物質調 節’例如利用與CLEC1B多肽/蛋白y或其片段直接相互作 用及干預。該物質亦可調節CLEC1B之表例如於轉錄(起 23 20 200934877 Φ 10 始、延長、終止)層:欠、轉錄_或轉譯_程序（尤其是前蛋白原 或前蛋白成為活性型之轉譯後程序，其亦可包括缺少前肽 =部位之全長蛋自質之c端城)層:欠、魏·或轉譯產物 女定性或轉譯；再者’其可調節clecib之轉譯後程序、 修飾、蛋自質折疊等。該物質可直接或間接發揮上述效力[間 接意指湘對CLEC1B功能/蛋白該性/表現料有影響 力之天然訊號串聯反應進行(正向或負向）干預]。此外，該 物質亦可模擬CLEC1B活性（亦即接管其功能/角色）。 CLEC1B之片段可為較對應野生型短[例如較智人種(^) CLEC1B或其多肽短]之任何多肽或核酸。CLEC1B之功能 性片段為展現CLEC1B之至少一種功能之任何片段（多肽或 者核酸）。 ^ CLEC1B或CLEC1B片段之衍生物可為任何經修都之 CLEC1B核酸、多肽或其片段。該等衍生物包括，例如經 修飾之胺基酸或核苷酸序列或任何其他類型之修飾，例如 經化學或生物修飾導致該多肽或核酸穩定[例如核酸骨幹之 硫代磷酸酯(phosphoorothioate)修飾作用或其他類型之修飾 作用或胺基酸間之鍵結交換等]、或赋能多肽或核酸專〜性 標靶導向特定細胞或促進其進入細胞或被細胞吸收[例如細 胞可滲透(cell-permeant)之磷酸肽類、鄰位偶聯於細胞可沒 透之肽載體，例如以觸足（antennapedia)/穿遷牲 (penetratin)、TAT、及信號-肽系序列為基礎；或偶聯於專〜 性轉運子或輸入子(importers)之部分配體]。 CLEC1B之“功能性衍生物”包含有關天然存在梨 24 20 200934877 CLEC1B (多肽或者核酸)任何種類之修飾作用，其至少具有 CLEC1B諸功能之—者。本發明亦涵蓋咖⑽片段之功 能性衍生物。 • 關於CLEC1B核酸或其片段，CLEC1B功能包括例如 5 與其=分子(舉例而言，如，專-性雜交引子或探針)相互作 用之能力、調控下游編碼序列轉錄作用、編碼cLEC1B蛋 白質之能力等。CLEC1B之功能亦包括CLEC1B (蛋白質或 核酸)或其片段與其他分子[包含，惟不限於，蛋白質或蛋白 質片段、核酸（亦即與與核酸專一性雜交之CLEC1B核酸）、 ίο 合成分子（亦即與合成藥物專一性相互作用之CLEC1B蛋白 質或片段)]相互作用之能力。 活性物質之鑑定，舉例而言’可利用下述一或多種鑑 定方法進行，例如： 於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具活性之物質 15 之鑑定方法包括： a. 使CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物與測試物 〇 質接觸；及 b. 判定該測試物質是否調節CLEC1B蛋白質或其功能性 片段或衍生物之活性。 20 於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具活性之物質 之鑑定方法包括： a. 使具有可檢測之CLEC1B或其功能性片段或衍生物的 量之細胞與測試物質接觸； b. 判定該測試物質是否能調節存在細胞中之CLEC1B或 25 200934877 其功能性片段或衍生物之量或活性。 關於本發明不同態樣使用之物質/測試物質/活性物質 可為任何生物或化學物質或天然產物抽取物，其係利用生 物化學或分子生物方法純化、部分純化、合成或製造者。 得以可檢測_節CLEC1B量或活性之物f被視為係 於預防或治療心a管及/或錄性疾病上具活性之物質。可 檢測之CLEC1B量係指可檢測之CLEC1B核酸㈣點、 cDNA或气因體DNA)及/或蛋白質（前蛋白原/前蛋白/成熟 蛋白質）之量。可檢測之活性係指CLEC1B DNA/mRNA或 蛋白質之轉錄及/或轉譯及/或蛋白質活性。 於本發明諸具體實例之不同態樣中，調節—詞係指活 化或抑制。 另一實例為於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具 活性之物質之鑑定方法’該方法包括： 八 a. 使編碼CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物之核 酸與轉錄活性系統中之測試物質接觸； b. 於5亥物質存在下’測定存在該系統中之編碼CLEC1B 蛋白質或其功能性片段或衍生物的mRNA之量； c. 於§亥物質不存在下’測定存在該系統中之編碼CLEC1B 蛋白質或其功能性片段或衍生物的mRNA之量； d. 判定該物質是否能於該系統中調節編碼CLEC1B蛋白 質或其功能性片段或衍生物的mRNA之量。 能調節存在該系統中之CLEC1B mRNA量之物質被視 為係於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具活性之物 200934877 質。 轉錄活性系統為至少具有進行轉錄元件之轉錄反應能 力之任何生物化學或細胞系統。此等系統為此項技藐中朵 • 知，包括細胞(例如—般實驗室菌株或細胞株以及“ 5 餘胞之初級培養物）以及試管内轉錄系統或套组（例如以 細胞抽取物為基礎者）’彼等亦為市售可得。於本發明情形 下，此可為表現CLEC1BmRNA或表現編碼功能 _ ^ 片段mRNA之生化或細胞系統。 存在系統中之mRNA量之測定可根據此項技藝中悉知 10 之技術進行(例如利用放射性或螢光標記法直接標記產物或 使用專一性引子或探針進行產物檢測等）。 另一實例為於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具 活性之物質之鑑定方法，該方法包括： "·使編嗎CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物之核 15 酸與轉譯活性系統中之測試物質接觸； b.於該物質存在下，測定存在該系統中之CLEC1b蛋白 質或其功能性片段或衍生物之量； C，於該物質不存在下，測定存在該系統中之CLEC1B蛋 白質或其功能性片段或衍生物之量； •° d*判定該物質是否能於該系統中調節CLEC1B蛋白質或 其功能性片段或衍生物之量。 能調節存在該系統中之CLEC1B蛋白質、衍生物或片 段之量之物質被視為係於預防或治療心血管及/或血栓性疾 病上具活性之物質。 27 200934877 Ο 10 20 轉譯活性系統為至少具有進行轉錄本之轉譯反應能力 之任何生物化學或細胞系。此等系統為此項技藝中悉知， 包括細胞(例如一般實驗室菌株或細胞株以及真核或原核細 胞之初級培養物）以及試管内轉譯系統（亦為市售可得者，例 如套組）。於本發明情形下，此可為表現CLECIBmRNA或 表現編碼功能性CLEC1B片段mRNA之生化或細胞系。核 酸之試管内轉譯，係將核酸次轉殖於適當载體中，隨後於 適當緩衝劑及細胞抽取物（例如網狀紅血球溶解物）中表現 多肽。載體、必要試劑及帶有適當條件之實驗流程為此項 技藝中已知且為市售可得。 於本發明說明書中，”多肽“-詞係指含有利用肽鍵結互 相結合之胺基酸分子’其含有至少10個以線性方式互相連 接之胺基酸。此類型之較短分子稱為肽類。，，蛋白質‘‘一啁係 =有至少一個多肽鏈之分子’惟亦可指稱含有相關：或 互相結合之二或多個多肽鏈之分子。因一 含，，多肽“。 ，，蛋白質一词包 甘你故尔鱿γ 蛋白質之檢測可根 知之技術進行(例如轉譯產物之直接放 光^ 元法或使料-性抗體、標記蛋白f /螢先標 另一實例係有關於預防或治療心血S己物等）。 上具活性之物質之鑑定方法，該方法包^ . 3血栓性疾病 a·提供經含有操作性地連接於報導其# :=基_子或其功“之 28 200934877 b. 提供經含有非操作性地連接於功能性CLEC1B啓動子 之報導基因或其功能性片段之對照組載體轉染 之細 胞； c. 於測試物質存在下，測定根據_狀細胞之報導基 因活性； d. 於測試物質不存在下，測定根據_b)之細胞之報導 基因活性。 Ο 10 15 ❹ 20 能顯著調節（亦即增加或減少）根據&)之報導基因活性 而未顯著調節b)之報導基因活性（亦即能專—性地增加 CLEC1B啓動子活性)之物視為係於預喊治療心^管 及/或血检性疾病上具活性之物質。 顯著調節係高於標準偏差之任何調節（亦即增加或減 少）；其較佳為標準偏差之至少兩倍。 一 ，本發明之上述態樣係根據此項技藝中一般已知之典型 報導基因測定法。欲達此目的，將所挑選啓動子以啓^ ，活性時容許表現報導基因之方式插人表現載體(適; 定宿主細胞類型）中所挑選報導基因之上游。接 體引入所挑選宿主細胞中。轉形或轉染所用適當方法以= 細胞培養條件與報導基@表狀檢測為此項技料杰 見例如下文列舉之標準文獻）。諸適當條件以及載體、、㈣ 基因與必要試劑為此項技藝中悉知且亦為市售可得。 載體係圓形或線型核酸分子，例如Dna質體、噬 或枯接質體，藉助於該等核酸片段(例如自其他載體= 利用PCR擴增並插人轉殖載體中）可專—性地於適當細^ 29 200934877 j生物中擴增。表現載體使所關注基因（例如報導基因）能於 伤主細胞或生物中異源表現。細胞或生物類型主要取決於 目的，其選擇屬熟習此項技藝者知識範圍之内。用於擴增 - 減之適當生物為，·，具有高增殖率之錄單細胞^ 5 _如細菌或酵母。適當生物亦可為自多細胞組織單離及 培養之細胞，例如自各種生物產生之細胞株[例如得自草地 黏蟲加妳以圳之卯9細胞等]。適當轉殖載體 〇 為此項技藝中已知且可自不同生技供應商，例如Roche Diagnostics > New England Biolabs ^ Promega ^ Stratagene # 1〇 講得。適當細胞株可自，例如，美國菌種保存中心(ATCC) 構得。 至於蛋白質或多肽之異源表現，該細胞可為適用於以 核酸載體轉染及表現所關注基因（例如報導基因）之任何原 核或真核細胞；其可能實例為初級細胞或培養細胞，較佳 15 為真核生物細胞培養物，彼等係源自，例如，多細胞生物 ◎ 或組織(舉例而言，如，HeLa、CHO、COS、SF9或3T3)或 其本身為單細胞生物，舉例而言，如，酵母細胞[例如裂殖 酵雖尸⑽㈣或釀酒酵母⑽他㈣]或原核細胞培養 物、或畢赤(Piehia)酵母菌或大腸桿菌。得自組織之細胞與 2〇 離可利用先前技藝之已知技術製取(例如採取血液試樣、 組織穿刺或外科技術）。適用於本發明CLEC1B用途者亦為 天然產生CLEC1B以直接判定^血管藥物增加或減少所產 生CLEC1B量能力之單離細胞。 於本申請案說明書中’“轉染，，一詞係指將核酸載體引入 30 200934877 (原核或真核生物）宿主細胞中，因而涵蓋“轉形，，一詞。該轉 杂可為穩定性或暫時性及可根據常見方法進行。 CLEC1B啓動子區域為CLEC1B基因之一部分，若將 • 所關注基因之編碼序列轉殖入適當載體中，功能性地於啓 5, 動子/促進子下游’及轉染入適當宿主細胞中，則該CLEC1B 啓動子區域能控制所關注基因產物之轉錄。CLEC1B基因 上游之核苷酸序列可被視為係CLEC1B啓動子區域；此區 域包含序列編號NC—000012.101之核苷酸編號10043146下 游之核苷酸序列。 10 CLEC1B啓動子之功能性片段為CLEC1B啓動子片 段’其於指定條件下同樣可控制下游編碼序列之轉錄。適 當片段之鑑定屬熟習此項技藝者熟知技藝範圍之内。 報導基因可為得以容易定量其基因產物之任何基因。 用於真核生物或原核生物宿主之多種報導基因以及檢測方 15 法與必要試劑為此項技藝中已知且為市售可得；包括，例 如，β内醯胺酶(lacZ)、蟲螢光素酶、綠或藍螢光蛋白（GFp 〇 或 BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1 或 LEU2 或 β 半乳 糖苷酶等基因。彼等基因編碼可容易地利用看得見之（出現 顏色或發光)反應檢測(例如lacZ、蟲螢光素酶)之蛋白質； 2〇 彼等包括可容易地利用看得見之（出現顏色或發光）反應檢 測之基因產物或於表現時授予對例如胺节青彳數素 (Ampicillin)或康黴素(Kanamycin)等抗體之抗性。其他報導 基因產物使表現細胞能於特定條件下生長，例如營養缺陷 型基因。 200934877 報導基因之功能性片段為得以容易定量其基因產物之 指定報導基因之任何片段。 於本發明上述態樣之說明書中，對照組載體可為包含 報導基因或其魏性片段之任何適當賴，惟其中報導基 因表現不為（功紐)CLEC1B啓動子所滅；舉例而言，此 意指報導㈣或其魏性諸並_作性輯接於功能性 CLEC1B啓動子（亦即或者完全缺a clecib啓動子、含有
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    非功能性CLEC1B啓動子或啓動子片段、或者其中啓動子 與報導基因之連接不具功能性）；亦可意指報導基因或其功 能性片段係操作性地連接於CLEC1B啓動子料之另二啓 動子(例如SV40或另一標準啓動子）。功能性載體及對照組 載體亦可轉染至相同細胞’惟於此情形下，報導基因必須 不同。 恐你〇頁關根據上述鑑定活性物質 顆方法之H產量_法(鱗方法亦稱為“測定 分析方法或分析系統，所謂測定法，於 知，係用7量料縣分子(所謂_，主要為 核酸)之活性或濃度，彼料潛在醫藥化合物效力 舉例而β ’測定法包括使用於界定空間與時間内一起 反應混合ft之單離或部分單離之諸成分之生化法 或系統’其中可測試潛在醫藥化合物之 法)。測量蛋白酶活性時，彼等涵蓋， f未=成互作用(例如標記受質與未上 相互作用’其中於受質裂解後’部分標記受質_ 32 20 200934877 而可藉由檢測及定量指定時間内釋出之標記成員量而測量 蛋白酶活性)之放射性同位素或螢光測定法。其他測定法實 例包括細胞系測定法(例如上述報導子測定法或表現型測定 法’其中可利用於細胞表現型中之變化檢測物質活性）。 不同類型之測定法為此項技藝中 一般已知且可自市面 供應商購得。 €> 10 Ο 20 根據本發明不同態樣之進一步具體實例，係使用包含 ΝΜ—016509位置25〇之CLECm核酸或使用包含 NP_057593 位置 24 之 CLEC1B 多肽。 由於根據參考序列NM—016S09 CLECiB位置25〇 (或 基因體序列中之對應位置）R &根據參考序列 NP—057593 CLEC1B蛋白質位置24〜㈠卩⑺之基 因與蛋白質變異體與心*管及/或血栓性&管疾病之存在最 為顯著_ ’因此本發日狀較佳㈣實㈣有關使用呈有 -或多個上述多型性之CLEC1B核酸或多肽進行一或多個 根據本發明之應用之用途。 通常，使用標乾基因（“分子標⑼)筛檢活性化合物時， 不會慮及所研究基因野生型序列中之個體咖。由於本申 請案已確認CLEC1B變異體與心血管及/或血栓性疾病之發 生相關聯，因此使用此類變異體(_是針對隨之發生之^ 等細胞特定生理結構背景)於尋找如於治療及^預防= 血管及域錄壯管疾病之活性化合物切能產生較高可 能性。事實上，具有此類基因及生理結構之個體亦更有可 能罹患心血管及/或錢性疾病。因此，使用於根據參考序 33 200934877 列ΝΜ—016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應 位置)具有胞苷之CLEC1B核苷酸序列應可發現具有此基因 或蛋白質變異體之特定病患有反應之活性化合物。於根據 參考序列NM一016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列 之對應位置)具有T或C之CLEC1B編碼序列之用途代表本 發明之另一具體實例。 Ο 10 15 €> 此外，CLEC1B基因中之SNPs適合在使用除了 CLEC1B本身以外之標靶物篩檢活性化合物時使用：於細 胞測定法中可能使用細胞尋找用於治療及/或預防心血管及 /或血栓性疾病之活性化合物（該等化合物具有影響除了 CLEC1B以外之標靶物的功能及/或活性及/或量之能力），特 別是其基因體於根據參考序列ΝΜ—016509之核苷酸序列位 置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置）具有CLEC1B 基因界定變異體之細胞。以此方式，得以針對基因背景（較 佳為與欲治療疾病相關聯）’專一性地篩檢出於預防或治療 心血管及/或血栓性疾病上具活性之化合物（甚至連干預該 變異基因以外之基因功能者）。 本發明進一步態樣係有關利用分析欲檢測個體之生物 取樣’使用CLEC1B檢測工具(means)診斷心血管及/或血检 性疾病或易感染心血管及/或血栓性疾病體質之用途。 有鑑於此’下述變異體之存在較佳為表示風險增加： CLEC1B編碼區域於至少一個對偶基因上，根據參考序列 NM—016509位置250 (或於CLEC1B基因體序列之對應位置) 含有C。 34 20 200934877 檢測CLEC1B之工且 之 C^CHB蛋白質或核酸之;=用以檢測生物試樣中 用以檢測之工具可主 ., ΡΜΑ . ^ 馬’例如，用以檢測試樣中之 CLEC1B mRNA或蛋·白暂夕 ^ DXTA ^ 貝炙工具；例如可據以定量試樣中 之CLEC1B mRNA或蛋白暂夕旦 Α 負之罝之工具[例如適當引子、探 ㈣舉例而言，於標準條件下能與 CLEC1B mRNA 或 cDNA 直一 η， Ο 15 ❹ Α專性地雜交之核酸探針，例如 用於北，，或微陣列法’或反轉錄酶聚合酶鍵反應 (RT-PCR)疋篁用引子組]。另一實例係有關判定cle⑽基 因於根據參考序列難㈣9位置25()(或於基 因體序列之對應位置)之核芽酸種類之工具，舉例而言，用 於例如PCR定序之適當PCR引子組（例如基因體或cDna 引子）、探針（用於例如南方墨點法或晶片_或微陣列雜交）或 用於此項技藝中已知之例如免疫（組織）化學、-螢光或-放射 化學技術之專一性抗_DNA抗體。又另一實例係有關用於判 定出現於根據參考序列NP_057593 CLEC1B蛋白質位置24 之胺基酸種類之工具，例如對特定蛋白質多型性具專一性 之抗體。 根據另一具體實例，用以檢測之工具為判定CLEC1B 20 基因於根據參考序列NM_016509位置25〇 (或於CLEC1B 基因體序列之對應位置）之核苷酸種類之工具，舉例而言， 如’根據SEQ IDXXX之一或多個引子 適當引子之設計及合成為先前技藝中已知；此等引子 亦為市售可得。根據較佳具體實例，彼等為根據SEQ ID NOs: 35 200934877 4及/或5之引子。核酸係利用傳統例行方法定序，舉例而 言，使用由例如Applied Biosystems、Bio-Rad等公司出售 之習知實驗室機器人。 適當探針之設計及合成同樣為先前技藝中已知（參見， 5 例如，下文列舉之標準文獻）。 於根據本發明之用途或方法之一者之進一步較佳具體 實例中，CLEC1B蛋白質内蛋白質量之變化或指定蛋白質_ 多型性之測定係藉助於至少一個抗體而進行。於此，較佳 > 檢測方法為ELISA、西方墨點法、蛋白質晶片及光譜分析 10 法。 適當抗體或其功能性片段之製備為先前技藝中已知， 舉例而言，以CLEC1B蛋白質或其片段免疫處理哺乳動物 (例如兔子）’適當時於適當辅助劑[Freund氏輔助劑或氫氧 化紹凝膠，參見，例如，Diamond，B.A. et al. (1981) The New i5 England Journal of Medicine: 1344-1349]存在下。接著可利 用已知方法’例如利用管柱層析法，單離及純化免疫反應 ❹結果於動物中產生之多株抗體。單株抗體之製得，舉例而 言，可根據 Winter and Milstein 之已知方法[Winter，G. & Milstein，C. (1991) Nature, 349, 293-299]。製備及純化單株 20 抗體之適當方法為先前技藝已知（參見標準文獻）。用以檢測 CLEC1B之已知抗體實例包括得自Abnova Corporation， Cat.No.: H00051266-A01 或得自 Novus Biologicals，Catalog Number: H00051266-A01之諸CLEC1B抗體。抗體於檢測 CLEC1B上之用途為此項技藝中已知，亦揭示於，例如Fuiier 36 200934877 et al.或 Suzuki-Inoue et al 中。 於本發明相關組群之說明書中，抗體或抗體片段等詞 亦係扣重組產生之抗體或其抗原結合部位，適當時，彼等 亦可經修飾，舉例而言，如，嵌合型抗體、擬人化抗體、 多功能抗體、雙-或寡專一性抗體或F(ab)或F(ab)2片段。 、^用以檢測抗體反應之習知免疫化學或免疫放射學方法 為熟習此項技藝人士悉知。常見方法係根據，例如，專一 Φ 10 〇 性一次抗體與待鑑定抗原之結合作用、二次抗體之結合作 用，其通常係識別該一次抗體上之物種專一性抗原決定部 位。於此，係利用該二次抗體之結合作用，俾使產生可檢 測信號(例如使用放射性標記二次抗體時之放射性信號、或 使用螢光·偶聯二次抗體時之螢光信號、或例如使用酵素_ 偶聯一次抗體時之比色可測定之信號等），亦參見下文有關 標準方法列舉之文獻。 本發明群組彼此關連地亦有關用以檢測易感染心血管 it?性疾病㈣之顿套组，縣組含有肖以檢測生 物忒樣中之CLEC1B之至少—種工且。 =明說明書中，“套，且，，(諸元件 關聯單元之經鑑定成分之彳壬；、'體質）之工間及功庇*性相 一步之元件。 可組合物，其可附加地含有進 根據本發明之診斷套級 CLEC1B之至少一種工具. 有用以檢測生物試樣中之 /、’再者’其可適當地包含適當緩 20 200934877 衝劑及/或用以檢測CLEC1B及/或製備或整理試樣之進一 步試劑，及適當時’包含施行該特定檢測法之操作指南。 Ο 〇 20 根據本發明用途或方法之較佳具體實例，利用PCR檢 測CLEC1B基因中一或多個變異之存在，其後，適當時， 使用核酸探針定序。此等探針可為，例如，具有50個以上、 100個以上、150個以上、200個以上或250個以上、3〇〇 ，個以上、350個以上、400個以上根據SEQ ID N〇:3之鄰接 核苷酸之核酸片段’該片段包含SEQ ID NO:3之位置2〇1 (根據本發明SNP所在位置）。 用於PCR或使用例如，結合於適當支撐物(例如膜或晶 片）上之固定化基因體DNA之適當探針進行雜交之適當實 驗流程及試劑為先前技藝中悉知。 田貝 右一核殹分子與另一核酸分子之單股型於適當反應條 件下(周时質之溫度與離子濃度)可彼此㈣(_帅則該 二核酸分子可“雜交”以形成新雙股核酸分子。為了雜交，^ 相枯結之核酸分子必須具有互補序列。然而視所選擇 可條件而定’亦可能發纽基錯配㈣結未終止。“嚴苛” -詞敘述反應條件，彼#反應條件㈣ 互相粘結時之雜空直一祕平版核酸刀千 少i多強&# 因亦決定赌期間可容忍多 應個分子間之錯配。此處之嚴苛性，從而反 酸之適當條件視核酸分子之長度、種類及互核 既定分析方法之該等夂數 程度而疋 藝人士㈣4，* 師之決定為熟習此項技 〜σ，、見34於鮮實驗室；5Γ法缝(例如“Current 38 200934877 Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons, Ν.Υ· (1989)，6.3.1-6.3.6)。 根據彼此關連之本發明群組之較佳具體實例，個體為 具有心企管及/或血检性疾病之病患。該心血管病病較佳為 冠狀動脈疾病(>20%狹窄症及/或>50%狹窄症）、心肌梗塞、 不成熟型心肌梗塞、急性冠狀動脈症候群或心絞痛（特別是 不穩定型絞痛）。
    10 Ο 用於本發明諸方法、用途或測試套組之單離試樣較佳 為人類試樣，欲檢測之個體較佳為人類。該試樣可為，特 別是：組織學試樣、活檢試樣、細胞(例如黏膜細胞）、細胞 抽取物、細胞組織、體液，較佳為血液、唾液、淋巴或尿。 本發明附加地係有關單離CLEC1B核酸(例如具有或包 含根據NMJM6509之序列或部分序列或根據NT009714或 根據SEQ ID NO: 3之核酸或其片段)之用途。該核酸或片段 含有下述SNP : a. 於根據NM_016509之CLEC1B序列位置250 (或於 CLEC1B基因體序列之對應位置，例如於SEQIDN0:3 位置201)之胞苷或 b. 於根據NM_016509之CLEC1B序列位置250 (或於 CLEC1B基因體序列之對應位置，例如於SEQIDNO:3 位置201)之胸苷。 此外本發明係有關單離CLEC1B蛋白質或其片段之用 途，該蛋白質或片段具有下述蛋白質多型性： a. 於根據參考序列ΝΡ_057593之CLEC1B蛋白質多肽鏈 20 200934877 位置24之脯胺酸或 b. 於根據參考序列NP_057593之CLEC1B蛋白質多肽鏈 位置24之絲胺酸。 茲於下文根據實例結合圖式與表更具細節地說明本發 明，惟彼等實例不擬對本發明構成侷限：
    40 200934877 參考文獻： Chaipan C, Soilleux EJ, Simpson P, Hofmann H, Gramberg T, Marzi A, Geier M, Stewart EA，Eisemann J, Steinkasserer A, Suzuki-Inoue K, Fuller GL, Pearce AC, Watson SP, Hoxie JA, Baribaud F, Pohlmann S. DC-SIGN and CLEC-2 mediate human immunodeficiency virus type 1 capture by platelets. J Virol 80: 8951-8960, 2006.
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  2. 5,-TCAGCAGAATCAAAGCCATCACA-3, (SEQ ID NO: 5) 擴增用PCR實驗流程： 所用試劑係得自 Applied Biosystems (Foster City， USA)： 20奈克基因體DNA; 1單位TaqGoldDNA聚合酶；1 x Taq 聚合酶緩衝液；500 μΜ dNTPs ; 2.5 mM MgCl2; 200 nM 各擴增引子對（l.A下之諸序列）；H20至5微升。 用於基因型鑑定(genotyping)之PCR擴增程序： 95°C 10分鐘 X 1個循環； 950C 30 秒 70°C30秒 X 2個循環； 950C 30 秒 65°C30秒 X 2個循環； 95°C 30 秒 44 200934877 60oC 30秒 x 2個循環； 950C 30 秒 56°C 30 秒 720C 30秒 ·χ 40個循環； 72°C 1〇分鐘 4°C 30秒 X 1個循環。 1 b) SNPs之鑑定
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    微定序用實驗流程及SNPs之檢測 所用试劑係得自 Applied Biosystems (Foster City， USA)。 2微升純化PCR產物、1.5微升BigDye終結子套組、 200 nM定序引子（見1.A下之諸序列）、h20至10微升。 定序用擴增程序： 96°C2分鐘 xl個循環； 960C 10 秒 550C 10 秒 65°C4分鐘 X 30個猶環； 72°C 7分鐘 4°C30秒 xl個循環。 實例2 :經鑑定SNPs之統計分析 分析參考核苷酸序列NM_016509、NT009714及參考蛋 白質序列NP—057593中經分析之CLEC1B多型性與約14〇〇 個個體之臨床參數之關聯性。表1列出所分析群組之特性。 各種經鑑定多型性之頻率與分佈示於表2。參考序％ 45 20 200934877 NP—057593位置24 CLEC2多型性Ser—Pro與病患組群臨 床指標(endpoints)之關聯性見述於表3、4及5。所有統計分 析均以 SAS version 8·2 (SAS Institute GmbH，Heidelberg, Germany)執行。 P值乃有關所觀察關聯性之統計學顯著性參數。RR (風 險比率）係有關具有特定CLEC1B多型性病患所示出現臨床 指標風險增加之參數；針對病患群組調整有關年齡、性別、 吸煙與否、血壓及有無糖尿病予以計算。 如表3所示’具有為pr〇25Pro同型接合之 CLEC1B-C250C 之個體，相較於具有 CLEC1B-T250T (Ser24Ser)之個體，有遭受冠狀動脈疾病（CAD)(狹窄症>20%) 之較大風險。由於罹患CAD頻率隨著個體c對偶基因數而 增加，因此可看出CLEC1B核苷酸序列位置250出現C (胞 苷）對CAD頻率之依賴性。亦即’於CLEC1B核苷酸序列 位置250無C對偶基因之個體，CAD頻率為76.89% ;具有 一個C對偶基因之個體’ CAD頻率為84.24%及具有兩個c 對偶基因之個體，CAD頻率為88.89%。具有為pr〇25Pr〇 同型接合之CLEC1B-C250C之個體，相較於具有 CLEC1B-T250T (Ser24Ser)之個體，有遭受冠狀動脈疾病 (CAD)(狹窄症>50%)之較大風險。由於罹患CAd頻率隨著 個體c對偶基因數而增加，因此可看出CLEC1B核苷酸序 列位置250出現C (胞苷）對CAD頻率之依賴性。亦即，於 CLEC1B核苷酸序列位置250無c對偶基因之個體，cAD 頻率為66.35%;具有一個C對偶基因之個體，CAD頻率為 46 200934877 74.50%及具有兩個C對偶基因之個體，CAD頻率為83 33〇/ 如表4及5所概述，蛋白質位置2 4 (或核苷酸序列位= 250)之CLEC1B多型性與冠狀動脈疾病關聯性之統計顯著 分析結果與例如性別、糖尿病及吸煙與否或高血壓等混雜 5 因素無關。具有CLEC1B-C250C (Pro24Pr〇)之個體羅串 > 2 0 %狹窄症及> 5 0 %狹窄症冠狀動脈疾病之升高風險分^ 為 1.610 (p-值=〇.〇〇26)及 1.499 (p-值=0.0021)倍。 該研究之一成果大致可敘述如下： 於根據參考序列NM一016509 CLEC1B編碼區域位置 ίο 250之一或一對偶基因上之胞普，尤其是於根據參考序列 NM—016509 CLEC1B核皆酸序列之位置250未具有胸普之 個體中，罹患或形成心血管及/或血栓性疾病（尤其是冠狀動 脈疾病）之風險顯著增加，可能需要治療性介入。 臨床指標與CLEC1B基因及/或蛋白質中基因變異間之 15 關聯性為CLEC1B蛋白質位置24基因變異體Ser~>Pro影響 心血管及/或血栓性疾病例如冠狀動脈疾病（具有>2〇%及 >50%血管腔狹窄症)發作之明確示意。CLEC1b變異體與該 等臨床指標間之統計顯著相關性於此首次獲得證明，從而 為本發明提供有意義之基礎。 2〇 【圖式及表簡單說明】 圖1 :具有NCBI參考編號]SfM_016509之CLEC1B編 碼序列（SEQIDN0..1);位置250之多型性於其下劃出底線 並以粗字體標示。 圖2 :具有NCBI參考編號NP 057593之CLEC1B蛋 47 200934877 白質序列(SEQIDN〇:2);位置24之多型性以粗字體標示。 圖3 :含有根據本發明SNP之如腳1基因庫存取編 號rs_227雇揭示之CLEC1B基因體DNA之核酸片段 (SEQ ID N〇:3) ; PCR引子及多型性之位置以粗字體標示； 5 “Y”代表C或T。 圖4 .用於分析出現於有關參考序列NM—〇l65〇9位置 250或基因體序列（SEQ ID NOs : 4及5)各別位f之核芽酸 種類之PCR引子。 Λ 士 表： 10 縮寫： Ser=絲胺酸 Pro =脯胺酸 CAD =冠狀動脈疾病 CAD20 = 20%以上目視狹窄 is CAD50 = 50%以上目視狹窄 表1 :病患群組基本特徵 ® 表2 : LURIC群組中CLEC1B多型性Ser24Pro之分佈 表3 · LURIC群組中CLEC1B多型性Ser24Pro與冠狀動脈 疾病之關聯性 20 表4:LURIC群組中包括混雜因素(邏輯迴歸)之CLECm蛋 白質位置24之(Ser->Pro)多型性對具有20%以上狹窄症的 冠狀動脈疾病影響之分析；CAD20 = 20%以上金管腔狹窄 症’ CAD50 = 50%以上血管腔狹窄症。 48 200934877 縮寫： Ser=絲胺酸 Pro =脯胺酸 C AD =冠狀動脈疾病 CAD20 = 20%以上目視狹窄 CAD50 = 50%以上目視狹窄 ^ 表1:病患群組基本特徵 ίο 年齡[歲] 61.79 ±10.57 BMI [公斤] 27.97 ± 4.41 15
    心肌梗塞(有） (*)根據ADA標準之所有糖尿病 (**)動脈高金壓 性別 男 女 糖尿病（有）（*) 高血壓（有）（**) 吸煙（有） CAD (有） 1016 (70.75%) 420 (29.25%) 595 (31.27%) 1123 (58.34%) 1277 (66.34%) 1367 (78.65%) 802 (42.14%) 49 20 200934877 表2 : LURIC群組中CLEC1B多型性Ser24Pro之分佈 η % Ser24Ser 1061 73.89 Ser24Pro 357 24.86 5 Pro24Pro 18 1.25 表3 : LURIC群組中CLEC1B多型性Ser24Pro與冠狀動脈疾 病之關聯性 Ser24Ser Ser24Pro Pro24Pro 10 η (%) CAD20 有 802 (76.89) 無 259 (23.11) CAD50 有 692 (66.35) Μ. 369 (33.65) 15 η (%) η (%) ρ-值 294 (84.24) 16 (88.89) 0.0084 63 (15.76) 2 (11.11) 260 (74.50) 15 (83.33) 0.0071 97 (25.50) 3 (16.67) 表4 : LURIC群組中包括混雜因素(邏輯迴歸)之CLEC1B蛋白 W質位置24之(Ser^Pro)多型性對具有20%以上狹窄症的冠狀動 脈疾病影響之分析；CAD20 = 20°/❶以上目視狹窄，CAD50 = 50% 以上目視狹窄 2〇 CLEC1B Ser—>Pro 多型性 性別 第II型糖尿病（*) 吸煙與否 高血壓（**) 0.0026 1.610 (1.181-2.198) <0.0001 2.584 (1.908-3.497) <0.0001 2.198 (1.577-3.058) 0.0005 1.695 (1.258-2.283) <0.0001 2.273 (1.721-2.994) 50 200934877 表5 : LURIC群組中包括混雜因素(邏輯迴歸)之CLEC1B蛋白 質位置24之(Ser->Pr〇)多型性對具有50〇/〇以上狹窄症的冠狀動 脈疾病影響之分析；CAD20 .以上目視狹窄 5 CLEC1B Ser->Pro 多型性 性別 第II型糖尿病（*) 吸煙與否 ®高血壓（**) =20%以上目視狹窄，CAD50 = 50% 0.0021 1.499 (1.152-1.942) <0.0001 2.639 (2.012-3.448) <0.0001 1.812 (1.379-2.381) <0.0001 1.764 (1.355-2.294) <0.0001 1.603 (1.256-2.041) ❹ 51 200934877
    序列表 <110> sanofi-Aventi s <12 0> CLEClB於判定心血管及▲栓風險上之用途 <130> DE2007/042 <160> 5 <170> patentln version 3.3 <210> 1 <211> 963 <212> DNA <213>智人 <400> 1 ctatgaagaa gcttcctgga aaacaataag caaaggaaaa caaatgtgtc ccatctcaca tggttctacc ctactaaaga caggaagatc ataaactgac agatactgaa attgtaagag ttggaaacta cattttgcaa agtcattgaa ctctgagctc agttgcagta ctcgggaagc catgcaggat gaagatggat acatcacctt aaatattaaa actcggaaac cagctctcgt ctccgttggc cctgcatcct cctcctggtg gcgtgtgatg gctttgattc tgctgatcct gtgcgtgggg atggttgtcg ggctggtggc tctggggatt tggtctgtca tgcagcgcaa ttacctacaa gatgagaatg aaaatcgcac aggaactctg caacaattag caaagcgctt ctgtcaatat gtggtaaaac aatcagaact aaagggcact ttcaaaggtc ataaatgcag cccctgtgac acaaactgga gatattatgg agatagctgc tatgggttct tcaggcacaa cttaacatgg gaagagagta agcagtactg cactgacatg aatgctactc tcctgaagat tgacaaccgg aacattgtgg agtacatcaa agccaggact catttaattc gttgggtcgg attatctcgc cagaagtcga atgaggtctg gaagtgggag gatggctcgg ttatctcaga aaatatgttt gagtttttgg aagatggaaa aggaaatatg aattgtgctt attttcataa tgggaaaatg caccctacct tctgtgagaa caaacattat ttaatgtgtg agaggaaggc tggcatgacc aaggtggacc aactacctta atgcaaagag gtggacagga taacacagat aagggcttta ttgtacaata aaagatatgt atgaatgcat cagtagctga aaaaaaaaaa aaa <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> 智人 <400> 2 Met Gin Asp Glu Asp Gly Tyr He Thr Leu Asn lie Lys Thr Arg Lys Pro Ala Leu val Ser val Gly Pro Ala Ser ser ser Trp Trp Arg Val 20 25 30 第1 I 60 120 180 240 BOO 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 963 200934877 Met Ala Leu lie Leu Leu lie Leu Cys Val Gly Met Val Val Gly Leu 35 40 45 Val Ala Leu Gly lie Trp ser val Met Gin Arg Asn Tyr Leu Gin Asp 50 55 6〇 Glu ASH Glu ASH Arg Thn Gly Thr Leu Gin Gin Leu Ala Lys Arg Phe Cys Gin Tyr val Val Lys Gin s,er Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly 85 90 95 His Lys Cys ser Pro cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr gy Asp Ser φ Cys Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu ser Lys Gin 115 120 125 Tyr cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys lie Asp Asn Arg Asn 130 135 140 lie Val Glu Tyr lie Lys Ala Arg Thr His Leu lie Arg Trp val Gly 145 150 155 160 Leu Ser Arg Gin Lys Ser Asn Glu Val Trp Lys Trp Glu Asp Gly Ser 165 17D 175 Val lie Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn 180 185 190 Met Asn cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Phe Cys Glu Asn Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys 210 215 220 val Asp Gin Leu Pro 225 <210> B <211> 401 <212> DNA <213>智人 <400> 3 60 120 180 240 300 agaatggatg tatggtatag gggtgggcca tgcctattgt tgatgatcat gaggagaaca caggtgagat ctgccagcaa agctctttct attacttgga ggaccctgag aaggcagggg caggggcagg ggtgagcctt ccccatagct aacccatact gcctgctcct tgatgtcttt attatatgcc tacagttggc yctgcatcct cctcctggtg gcgtgtgatg gctttgattc tgctgatcct gtgcgtgggg atggttgtcg ggctggtggc tctggggatt tggtgtaagt 第2頁 200934877 gttgactctg ccagaaattt gactggagga aggtaatact gaagggtcat ggcatatccc actaagcttc tcaatggtcg ctatttgtct gtttatcact t <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>前置引子 <400> 4 tgcctgctcc ttgatgtctt tatt <210> 5 <211> 23
    <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 反置引子 <400> 5 tcagcagaat caaagccatc aca 200934877
    發明專利說明_ 、順序’請勿任意更動，※記號部分請勿填寫） ※申請案號 .※申請曰： 、發明名稱：（中文/英文） ※IPC分類：
    CLEC1B於判定心金管及血栓風險上之用途 USE OF CLEC1B FOR THE DETERMINATION OF CARDIOVASCULAR AND THROMBOTIC RISK o 二、 中文發明摘要： 本發明乃有關針對待檢查個體之生物取樣使用 CLEC1B基因之單核苷酸多型性(SNP)鑑定心血管及/或血栓 病症或形成心血管及/或血栓病症風險增加上之用途；及使 用CLEC1B鑑定於預防及/或治療心血管及/或血栓病症上具 活性之物質之用途及其方法。 三、 英文發明摘要： ❹ The use of the single nucleotide polymorphism (SNP) of the CLEC IB gene for the identification of cardiovascular and/or thrombotic disorders or of an increased risk for developing cardiovascular and/or thrombotic disorders in a biological sample taken from an individual to be examined; the use of CLEC IB for identifying substances active in preventing and/or treating cardiovascular and/or thrombotic disorders and methods for doing so. 200934877 5 © 10 七 申請專利範圍： =針對待檢查爐之生物取樣使固clecib 酸多型_NPs)或蛋白f多型性鏗定心血管及/或 检性疾病或形心血管及/或錄性疾病風險 增加之用 2. 3. 一種針對待檢查個體之生物取#使用CLEC1 =3功:性片段鑑定心血管及/或血栓性疾病或形成 血s及/或血栓性疾病風險增加之用途。 =以鑑定個體中心血管及/或血栓性疾病或形成心血 2 =錄赫驗增加之料，财料括針對個 體取樣檢測 &)出現於CLEC1B基因（根據NM_〇165〇9)之一或二對 偶基因上位置250之核芽酸種類，出現於該位置之 核芽酸種類為該個體罹患或形成心血fA/或血栓性 疾病風險之指標；或
    b)出現於CLEC1B蛋白質多肽鏈(根據Np—〇57593)位 置24之胺基酸種類，出現於該位置之胺基酸種類為 該個體羅患或形成心▲管及/或血栓性疾病風險之指 標；或 c)有關存在該試樣令之咖⑽城财及/或蛋白質之 里疋否與一或多個參考試樣不同，不同量之出現表 示罹心或形成心血管及/或血栓性疾病之風險增加。 4· 一種判疋罹患心血管及/或血栓性疾病風險之方法，該方 法包括針對個體之單離試樣分析一或多個前述SNPs或 52 200934877 蛋白質多型性之存在及根據年齡及出現於CLEC1B基因 位置250或CLEC1B蛋白質位置24之核苷酸或胺基酸種 類計算該評估風險。 5. —種使用CLEC1B單核苷酸多型性(SNp)或蛋白質多型 5 φ 10 Ο 性調整預防及/或治療心血管及/或血栓性疾病用藥物劑 量之用途。 6· —種使用CLEC1B蛋白質或核酸或其功能性片段調整預 防及/或治療心血管及/或血栓性疾病用藥物劑量之用途。 7· —種用以調整個體中預防及/或治療心血管及/或血栓性 疾病用藥物劑量之方法，該方法包括針對個體取樣檢測 a) 出現於CLEC1B基因一或二對偶基因上位置250之 核苷酸種類，該劑量視出現於一或多個該等位置之 核苷酸種類而調整；或 b) 出現於CLEC1B蛋白質位置24之胺基酸種類，該劑 量視出現於一或多個該等位置之胺基酸種類而調 整；或 c) 有關存在該試樣中之CLECIBmRNA及/或蛋白質之 量是否與一或多個參考試樣不同，該劑量視個體取 樣中蛋白質及/或mRNA之量是否與得自參考試樣或 諸參考試樣者不同而調整。 8. —種使用一或多個CLEC1B單核苦酸多型性(§νρ)或蛋 白質多型性鑑定個體對治療及/或預防心血管及/或血栓 性疾病用藥物反應之用途。 一種使用CLEC1B蛋白質或核酸或其片段鑑定個體對治 53 9. 20 200934877 療及/或預防心血管及/或血栓性疾病用藥物反應之用途。 10· —種使用CLEC1B蛋白質或核酸或其功能性片段或衍生 物鑑定於預防及/或治療心血管及/或血栓性疾病上具活 性之物質之用途。 5 11. —種利用分析欲檢測個體之生物取樣使用CLEC1B檢測 工具診斷心血管及/或血栓性疾病或易感染心血管及/或 血栓性疾病體質之用途。 >12. 種用以鑑定於預防或治療心血管及/或企栓性疾病上具 活性之物質之方法，該方法包括： a) 使CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物與測試 物質接觸；及 b) 判定該測試物質是否調節CLEC1B蛋白質或其功能 性片段或衍生物之活性。 種用以鑑定於預防或治療心血管及/或血栓性疾病上具 15 /舌性之物質之方法，該方法包括： 〇 使具有可檢測之CLEC1B或其功能性片段或衍生物 的量之細胞與測試物質接觸； b)判定該測試物質是否能調節存在細胞中之cLEc1B 或其功能性片段或衍生物之量或活性。 20 14·—種用以較於預防或治療^血管及/或血栓性疾病上具 活性之物質之方法，該方法包括： 、 八 a) 使編碼CLEC1B蛋白質或其功能性片段或衍生物之 核酸與轉錄活性系統中之測試物質接觸； b) 於該物質存在下，測定存在該系統中之編碼clecib 54 200934877 〇 15 Ο 20 蛋白質或其功能性片段或衍生物的恤 敎存在㈣統2編碼 之量；蛋白質或其功能性片段或衍生物的瓜職 於該系統中調節編碼cle⑽蛋 白質或其功雜片段或衍生 蛋 15·;=定於預防或治療心血管及/或血栓;;病上且 活性之物質之方法，該方法包括. T !疾届上具 Θ == 性地連接於報導基因或其功能性片 體轉染之細胞d啓動子或其魏性片段之核酸載 ==非操作性地連接於功能性I聽啓動 細胞Λ土因或其功能性片段之對照組載體轉染之=:質存在下，測定根據_b)之細胞之報導 =試物質不存在下，_眺&)細胞之報 導基因活性。 /=1 以診斷心'血管及/或血錄疾病或易感染心血管及 錢體質之贼套組，_試套組含有檢測生 物试樣中之CLEC1B用之至少—種工具。 Π.=請專利範圍第3或7項之方法，該方法包括針對該 取樣檢測有關CLEC1B基因之-或二對偶基因是否具有 下述基因體變異體：於CLEC1B基因序列位置25〇之胞 16. c) d) b) c) d) 55 200934877 苷，一或多個該變異體之存在表示根據申請專利範圍第3 項之方法中之風險增加，及藥物劑量於一或多個該基因 體變異體存在下根據申請專利範圍第7項之方法調整。 5 10 18·如申請專利範圍第3 & 7項之方法’該方法包括針對該 取樣檢测有關其是否含具有下述蛋白質變異體之 CL，C1B蛋白質：於CLEC1B蛋白質位置24之脯胺酸； 該變異體之存在表示該個體於根據申請專利範圍第3項 之方法中罹患或形成心血管及/或血栓性疾病之風險增 加，及藥物劑量於一或多個該基因體變異體存在 申請專利範圍第7項之方法調整。 19·如申請專利範圍第3或7項之方法，該方法包括針對該 取樣檢測有關CLEC1B基因之-或二龍基因是否具有 下述基因職異體：於CLEC1B基因之-或二對偶基因 上CLEC1B序列（根據nm—165〇9)位置25〇之胞苷以外之 核苷酸’較佳為胸苷；該變異體之存在表示該個體於根 據申請專利範圍第3項之方法中羅患或形成心血管及域 血栓性疾病之風險較低，及於一或多個該基因體變異體 存在下根據申請專利範圍第7項之方法難之藥物劑量。 20.如申請專利範圍第3或7項之方法，該方法包括針對該 取樣檢測有關其是否含具有一或二個下述蛋 之CLE⑽蛋白質：於CL觀蛋白質(根據Np—〇5乃93) 位置24之脯鞍酸以外之胺基酸，較佳為絲胺酸；一或二 在表示該個體於根射請專利範圍第3 項之方法切如血衫絲翻之風險較 56 20 200934877 請專利 低，及於一或多個該基因體變異體存在下拫據 範圍第7項之方法調整之藥物劑量。 2L根據前述申請專職财任—項之職、方法 5 φ 10 20 組’其中CLEC1B為哺乳動物CLEC1B，棱:也。 CLEC1B。 1土為人類 22. 根據前述中請專利範圍中任—項之用途、方 組’其中心血管及/或血检性疾/病為心絞痛、不穩乳、 奴痛、心臟梗塞、早期心臟梗塞、周邊 ^ 心臟疾病' 高血壓、中風、PRIND、TIA^U行= 動脈氣球擴張術之疾病。 仃70狀 23. 根據前述巾請專利範财任—項之㈣、方m式套 组’包括分析個餘樣，其中取樣被_之該個體且有 葡萄糠代謝疾病，較佳為罹患糖尿病，特佳為罹患第Ϊ 型糖尿病。 ~ 24·根據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測試套 組，其中取樣被檢測之該個體罹患心血管及/或血栓性疾 病。 25. 根據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測試套 組，其中該試樣為哺乳動物試樣，較佳為人類試樣。 26. 根據前述申凊專利範圍中任一項之用途、方法或測試套 組，其中該試樣為組織學試樣、活檢試樣、細胞抽取物、 一或多個細胞或採取之體液。 27. 根據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測試套 組，其中CLEC1B係呈單離分子使用。 57 200934877 28.根據申請專利範圍第1、2、5或8項之任一項之用途， 其中係分析CLEC1B基因（根據NM_016509)位置250之 一或多個SNPs。 . 29.根據申請專利範圍第6、9或10項之任一項之用途，其 5 中該核酸於CLEC1B基因（根據NM_016509)位置250含 有 SNP。 30.根據申請專利範圍第24或25項之用途或方法，其中該 等SNPs為：於CLEC1B基因（根據NM_016509)之一或二 > 對偶基因上CLEC1B序列位置250之胞苷。 ίο 31.根據申請專利範圍第1、2或4至6之任一項之用途或根 據申請專利範圍第3項之方法，其中一或二個下述蛋白 質多型性之鑑定表示疾病或風險增加：於CLEC1B蛋白 質（根據NP_〇57593)位置24之脯胺酸。 32. 如申請專利範圍第i、2、6或8至11之任一項之用途或 15 如申請專利範圍第3、7、14或17之任一項之方法，其 中於CLEC1B基因（根據NM—016509)位置250之核苷酸 〇 種類係利用一或多個適當引子或探針測定。 33. 如申清專利範圍第3〇項之用途或方法，其中核苷酸種類 係利用PCR、南方墨點法、陣列_或晶片_雜交法鑑定。 20 34.根據申請專利範圍第π項之用途或根據申請專利範圍第 12項之測試套組’其中該檢測用工具為用以檢測 CLEC1B DNA 之工具。 35.根據申請專利範圍第3〇項之用途或測試套組，其中該工 具為引子或引子組、適當探針或序列專一性抗_DNA抗 58 200934877 36_根據申請專利範圍第2、6、8或9之任一項之用途或如 申請專利範圍第3或7項之方法，其中係分析mRNA量 - 之變化，較佳為使用擴增CLEC1B cDNA用之一或多個 5 適當引子或於標準條件下適用於與CLEC1B cDNA或 mRNA雜交之一或多個探針。 37·根據申請專利範圍第33項之用途或方法，其中mRNA之 量係利用PCR、北方墨點法、陣列_或晶片雜交法分析。 38. 如中請專利範圍第U項之用途或如中請專利範圍第12 1〇 項之測試套組’其巾該檢測社具為用錢測存在生物 試樣中之CLEC1B mRNA及/或蛋白質之工且。 39. 如申請專利範圍第35項之用途或測試套組了其中該用以 檢測CLEC1B蛋白質之工具為抗體。 40. 根據申請專利範圍第2、6、8或9之任一項之用途或根 15 射請專利範圍第3或7項之方法，其中係測定CLEC1B 蛋白質量之變化。 © 41.根據申請專利範圍第1、6或37項之用途或方法，苴中 該蛋白質係藉助於至少一種抗體進行檢測。 42. 如申請專利範圍第38項之用途、方法或測試套组，苴中 20 該檢測係利用ELIS A、西方墨點法或蛋白質晶片進行。 43. 如申請專利範圍第37或38項之用途、方法或測試套组， 其中該檢測係利用免疫組織化學法或免疫放射化學檢測 法進行。 44. 根據前述申請專利範圍任一項之用途、方法或測試套 59 200934877 組’其中該基因體CLEC1B核酸序列係如SEQ ID No. 1 或16中界定之序列，視需要於有關CLEC1B基因序列(根 據NM—016509)位置250之核苷酸有偏差。 -45.根據申請專利範圍第41項之用途、方法或測試套組，其 [ 中該序列具有一或多個下述SNPs :於CLEC1B基因序列 位置250之胞苷。 46.根據申請專利範圍第29至34項任一項之用途、方法或 ，測試套組’其特徵為含有如SEqidn〇s:4及5界定的序 列之一或二個引子之引子組或如序列SEqIDN〇: 3界定 1〇 之探針。 47_根據申請專利範圍第1〇項之用途，其中該cLEC1B核酸 或其片段包含位置250及較佳為亦包含一或多個下述 SNPs .於CLEC1B基因序列（有關NM_016509)位置250 之胞苷。 15 48.根據申請專利範圍第1〇項之用途，其中係使用CLEC1B 蛋白質或其片段’其包含胺基酸位置25及包含下述蛋白 質多型性：於CLEC1B蛋白質位置25之脯胺酸。 49. 一種核酸引子’其具有根據SEQIDNO:4或5之核酸序 列。 20 5〇. 一種核酸探針，其具有根據SEQIDN〇: 3之核酸序列。
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