CN101809168A

CN101809168A - Clec1b用于鉴定心血管和血栓形成风险的用途

Info

Publication number: CN101809168A
Application number: CN200880108448A
Authority: CN
Inventors: D·科齐安; P·沃内罗; M·赫尔曼
Original assignee: Sanofi Aventis SpA
Current assignee: Sanofi SRL
Priority date: 2007-09-24
Filing date: 2008-09-13
Publication date: 2010-08-18
Also published as: AR068529A1; MX2010002993A; SG184704A1; CA2700219A1; KR20100059897A; ATE547706T1; TW200934877A; EP2048243A1; US20100311053A1; EP2195455B1; IL204557A0; AU2008303866A1; WO2009040002A1; JP2010539891A; BRPI0817944A2; EP2195455A1; EP2233584A1

Abstract

CLEC1B基因的单核苷酸多态性(SNP)用于在采自待检查的个体的生物样品中鉴定心血管和/或血栓形成病症或增加的发生心血管和/或血栓形成病症的风险的用途；CLEC1B用于鉴定在预防和/或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的用途以及用于进行该用途的方法。

Description

CLEC1B用于鉴定心血管和血栓形成风险的用途

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)和蛋白质多态性在鉴定增加的心血管和/或血栓形成病症风险中的用途和适用于所述用途的引物和核酸。此外，本发明涉及CLEC1B(C型凝集素结构域家族1、成员B或备选地C型凝集素样受体2/CLEC-2，在下文中称为CLEC1B)在发现用于预防和治疗心血管及血栓形成病症的活性物质中的用途。

背景技术

在西方国家，心血管病症和/或血栓形成病症在两性中均是死亡的主要原因之一。心血管病症包括所有影响心脏功能的病症，特别地包括心脏组织和心血管的病症。血栓形成病症包括所有影响血流的病理状态的病症，与血管阻塞导致的减少的血流相关或与增加的出血倾向相关。

冠心病，特别地，冠状动脉疾病，可被认为是心血管病症的主要病因之一。心绞痛angina，也称为angina pectoris，是当心肌供氧不足时发生的暂时性胸痛或压迫感。当冠状动脉变狭窄或被阻塞以致流至心肌的血液不能增加至满足增加的氧需求时，作为其结果，可发生局部缺血，引起所述疼痛(即所述心绞痛)。通常，心绞痛由冠状动脉疾病引起，但也可由其他冠心病引起。并非所有的心肌局部缺血都引起与心绞痛相关的疼痛或压迫感。该类型(即无心绞痛)的心肌局部缺血，称为无症状性心肌缺血。无症状性心肌缺血的危险在于对心肌的损伤不会引起受影响的个体的注意。因此，患者或主治医生通常不能意识到对心脏组织的可能损伤，直到所述损伤最终导致心肌梗塞。为此，极为需要能够用于识别血管和心脏变性的诊断方法和手段(means)，由此使得能够尽可能早地作出诊断和相应地进行治疗性干预。

由于与心血管和/或血栓形成病症相关的高社会经济和个人负担，因此存在对所述病症进行早期诊断和治疗的巨大需求。

因此本发明的目的是提供用于诊断和治疗心血管和/或血栓形成病症的改良方法。

发明内容

根据本发明，该目的通过使用CLEC1B基因中的单核苷酸多态性(SNP)或CLEC1B蛋白的多态性在采自待检个体的生物样品中鉴定心血管和血栓形成病症而达成。

这可以例如，通过如下方式实现：分析CLEC1B核酸(即RNA或DNA(例如，cDNA或基因组DNA))是否在根据参照序列NM_016509的CLEC1B核酸序列的位置250(或CLEC1B基因组序列(例如，根据SEQ ID NO NT_009714)的相应位置)上存在单核苷酸多态性胸苷(T)→胞苷(C)，和/或分析CLEC1B蛋白是否在根据参照序列NP_057593的CLEC1B蛋白的位置24上存在蛋白质多态性丝氨酸(Ser)→脯氨酸(Pro)，或分析存在于采集的样品中的CLEC1B的蛋白或mRNA的量或功能特性。

在此可基于常规方法确定CLEC1B核酸或蛋白内的任何相关位点上的核苷酸或氨基酸的类型。通过了解某些位点上的核苷酸或氨基酸的类型，本领域技术人员可容易地确定生物样品所源自的个体属于的心血管和/或血栓形成风险组。

CLEC1B属于C型凝集素跨膜蛋白超家族(Kanazawa等，2007)。CLEC1B在2000年已被克隆并且被定位至第12号人染色体的NK基因复合体内。CLEC1B由229个氨基酸组成并且具有27kDa的表观分子量(Colonna等，2000；Sobanov等，2001)。CLEC1B在单核细胞、粒细胞和树突细胞中表达(Kanazawa等，2007)。最近已描述了CLEC1B在血小板上的表达(Suzuki-Inoue等，2006)。CLEC1B已被鉴定为rhodocytin的新型结合蛋白，提示所述受体通过蛇毒液毒素参与血小板激活。最近解析的CLEC1B的晶体结构进一步支持rhodocytin为该受体的配体的概念(Watson等，2007)。除了rhodocytin以外，抗CLEC1B抗体也能够在血小板中起始酪氨酸激酶的磷酸化，这表明所述受体能够在激动剂结合后介导血小板激活(Suzuki-Inoue等，2006；Fuller等，2007)。虽然CLEC1B对血小板的确切功能仍未阐明，但受体似乎参与1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)在感染患者中的散播。血小板似乎被HIV-1通过附着因子(attachmentfactor)CLEC1B和凝集素树突细胞特异性细胞内黏附分子3结合非整合素(dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule 3-grabbingnonintegrin)(DC-SIGN)(两者都在血小板上表达)占据(Chaipan等，2006)。

CLEC1B基因的序列在本领域内是已知的。CLEC1B基因位于染色体12p13.2上。所述基因的编码核酸序列可在NCBI数据库中于编号NM_016509下获得。CLEC1B基因的连续基因组序列可在NCBI数据库中从人类第12号染色体基因组重叠群NT_009714获得。推导的蛋白质序列可在NCBI核苷酸数据库中于编号NP_057593下获得。NCBI是美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(邮政地址：National Center for Biotechnology Information，National Library ofMedicine，Bethesda，MD 20894，USA；网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

本发明涉及在临床患者队列中进行的染色体水平上CLEC1B基因研究，所述研究由本发明人实施，用于评估CLEC1B基因和/或蛋白质中的变异对此类变体的携带者的临床或病理生理学表型的影响。

单核苷酸多态性(SNP)是在单个位点上含有置换的特定核苷酸序列的变体，对于本领域技术人员来说是熟知的。本文中所用的术语蛋白质多态性包括蛋白质一级(即氨基酸序列)、二级(即蛋白质折叠)和/或三级结构(即蛋白质从不同多肽亚基的装配)的任何变化，优选包括由编码蛋白质的基因的一个或多个SNP引起的变化；实例为例如氨基酸交换、氨基酸缺失或蛋白质的截短。

CLEC1B基因的不同单核苷酸多态性(SNP)在现有技术中是已知的并且可在Ensembl数据库中，例如在http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/genesnpview？db＝core；gene＝ENSG00000165682上公开获得。同样，在根据参照序列NM_016509的CLEC1B核酸序列的250位置上(或在CLEC1B基因组序列的相应位置上，例如在SEQ ID NO：3的位置201上)的如上鉴定的SNP也是已知的(refSNP ID：rs2273986)，并且可在登录号rs_2273986下从NCBI数据库获得，特别地可通过使用下列链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？rs＝2273986获得。

该链接还公开了围绕根据本发明的SNP的部分基因组序列(也参见SEQ ID NO：3)。

然而，CLEC1B的所述多态性与患有或经历心血管和/或血栓形成病症的相关性到目前为止是未知的和未曾有过描述的，因此是十分令人惊讶的。

本发明人的实验第一次证明CLEC1B基因中的一定变异以统计学上显著的频率发生在患有心血管和/或血栓形成病症的人中。为了估计CLEC1B基因或蛋白质中的SNP或变体与疾病的发病和发展的可能关系，已详尽地分析了CLEC1B蛋白的位置24上的遗传变异丝氨酸→脯氨酸，并且已在定义明确的患者队列中进行了基因型-表型相关性分析。结果是令人惊讶地发现：所述CLEC1B多态性与心血管和/或血栓形成风险或病症相关。之前从未描述过CLEC1B基因与此类疾病的易感性(predisposition)的关系，并且鉴于关于CLEC1B的公布的数据，到目前为止，所述关系被认为是十分令人惊讶的。

本发明的各个不同方面可适用于所有动物或人类。优选实施方案涉及用于哺乳动物和/或人的应用。因此，术语CLEC1B(就核酸、蛋白质、多态性等而言)是指来自任何动物物种或人类(Homo sapiens)的CLEC1B。优选实施方案包括来自哺乳动物的CLEC1B和/或人类(hs)CLEC1B。

因此，本发明的另一个方面涉及CLEC1B蛋白或核酸或其功能片段用于在采自待检个体的生物样品中鉴定心血管和/或血栓形成风险或病症的用途。

在下面，在CLEC1B基因和/或核酸或蛋白质内给定的位点上出现频率最高的核苷酸或氨基酸称为最常见变体或“野生型”。

CLEC1B-T250T描述在CLEC1B基因的两个等位基因上在根据参照序列NM_016509的位置250(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置)均具有胸苷(T)的个体的组。该多态性导致在根据参照序列NP_057593的位置24上具有氨基酸丝氨酸(Ser或S)(Ser24)的CLEC1B蛋白。所述个人就所述CLEC1B变体而言是纯合的。如可从表2中获得的，核苷酸T是CLEC1B基因的位置250上最常见的变体，氨基酸丝氨酸是CLEC1B蛋白的位置24上最常见的变体。

CLEC1B-T250C描述在CLEC1B基因的一个等位基因上在根据参照序列NM_016509的位置250(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置)具有胸苷(T)并且在CLEC1B基因的另一个等位基因上在根据参照序列NM_016509的位置250(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置)具有胞苷(C)的个体的组。该多态性导致在根据参照序列NP_057593的位置24上具有氨基酸丝氨酸(Ser或S)(Ser24)的CLEC1B蛋白以及在根据参照序列NP_057593的位置24上具有氨基酸脯氨酸(Pro或P)(Pro24)的CLEC1B蛋白。所述个人就所述CLEC1B变体而言是杂合的。

CLEC1B-C250C描述在CLEC1B基因的两个等位基因上在根据参照序列NM_016509的位置250(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置)均具有胞苷(C)的个体的组。该多态性导致在根据参照序列NP_057593的位置24上具有氨基酸脯氨酸(Pro或P)(Pro24)的CLEC1B蛋白。所述个人就所述CLEC1B变体而言是纯合的。

可以例如通过下列方法检测CLEC1B基因中的遗传变异：

a)分子生物学分析可能包含所述遗传变异的CLEC1B基因，在此尤其是围绕根据参照序列NM_016509的位置250(或CLEC1B基因组序列中的相应位置)的CLEC1B编码序列的区域，从而在染色体DNA水平上直接检测遗传变异，

b)通过测量CLEC1B mRNA的表达进行检测，

c)检测CLEC1B蛋白内，在此特别是CLEC1B多肽链的根据参照序列NP_057593的位置24，的蛋白质多态性

d)通过利用蛋白质-化学法测定存在于细胞、组织或体液中的CLEC1B蛋白的量和/或活性进行间接检测。

可以例如通过下列方法，在核酸水平(在此，染色体DNA)上检测CLEC1B基因在上述参照序列的位置上的遗传变异或多态性：

1)基于CLEC1B基因的所述区域的核酸序列的测序的方法(例如焦磷酸测序(Pyrosequencing)、使用放射性标记的或荧光染料标记的核苷酸的测序或所述核酸序列的质谱分析)；

2)基于CLEC1B基因的所述区域的核酸序列的杂交的方法(例如，利用“DNA微阵列”)；

3)基于CLEC1B基因的所述区域的核酸序列的扩增产物的分析的方法(例如TaqMan分析)。

还可以例如基于测量表达的CLEC1B mRNA，在核酸水平(在此，染色体DNA)上检测CLEC1B基因在根据上述参照序列的上述位置上的遗传变异或多态性，可以通过下列方法测量表达的CLEC1B mRNA

1)基于CLEC1B基因的核酸序列的杂交的方法(例如，利用“DNA微阵列”、Northern印迹分析)；

2)基于CLEC1B基因的核酸序列的扩增产物的分析的方法(例如TaqMan分析、差异RNA显示、表现度差异分析(representationaldifference analysis))。

可例如利用能够区分例如CLEC1B蛋白的位置24上的丝氨酸或脯氨酸的特异性抗体，或利用适用于区分在根据参照序列NP_057593的CLEC1B蛋白序列位置24具有脯氨酸或丝氨酸的CLEC1B变体的备选生物化学或分子生物学方法，检测CLEC1B蛋白在根据参照序列NP_057593的蛋白质序列的位置24的一个或两个上的蛋白质多态性。

此外，可通过分析CLEC1B蛋白的量和/或活性，检测上述参照序列之一的上述位置上的遗传变异或多态性。可基于例如下列方法检测CLEC1B蛋白的量和/或活性：

1)基于定量检测CLEC1B蛋白的量的方法(例如Western印迹分析、ELISA检测)，或

2)基于在体外检测系统，例如在人细胞、动物细胞、细菌和/或酵母细胞中对CLEC1B蛋白的活性的功能检测的方法。

对CLEC1B基因中上述位置之一上的遗传变异或多态性的检测可以例如用作：(a)评估心血管和/或血栓形成病症，例如：外周血管病、高血压、中风/PRIND/TIA、不稳定型心绞痛、早发心肌梗塞、心肌梗塞和/或冠心病的风险的遗传标记，(b)在相应遗传变异的携带者中预防性治疗心血管和/或血栓形成病症，例如外周血管病、高血压、中风/PRIND/TIA、不稳定型心绞痛、早发心肌梗塞、心肌梗塞和/或冠心病的标记，(c)调整待施用的用于心血管和/或血栓形成病症的药物活性物质的剂量的标记，所述病症例如：外周血管病、高血压、中风/PRIND/TIA、不稳定型心绞痛、早发心肌梗塞、心肌梗塞和/或冠心病，(d)确定用于鉴定如下药物活性物质的高通量筛选策略的标记，所述药物活性物质用于心血管和/或血栓形成病症例如：外周血管病、高血压、中风/PRIND/TIA、不稳定型心绞痛、早发心肌梗塞、心肌梗塞和/或冠心病，(e)鉴定进行临床研究的相关个体或患者以检测用于心血管和/或血栓形成病症例如：外周血管病、高血压、中风/PRIND/TIA、不稳定型心绞痛、早发心肌梗塞、心肌梗塞和/或冠心病的药物物质的相容性、安全性和功效的标记，和(f)开发在DNA、RNA或蛋白质水平分析CLEC1B基因的遗传变异的检测系统的基础。

因此，本发明的另一个方面涉及CLEC1B蛋白或核酸或其片段在于采自待检个体的生物样品中鉴定发生心血管和/或血栓形成病症的增加风险中的用途。

本发明的另一个方面还涉及用于在个体中鉴定心血管和/或血栓形成病症或发生心血管和/或血栓形成病症的增加风险的方法，该方法包括就如下核苷酸的类型，检查取自个体的样品，其中所述核苷酸为在CLEC1B基因的一个或两个等位基因上存在于根据参照序列NM_016509的位置250(或CLEC1B基因组序列的相应位置)上的核苷酸，存在于所述位置上的核苷酸的类型指示所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险。

本发明因而还涉及用于在个体中鉴定心血管和/或血栓形成病症和/或增加的发生心血管和/或血栓形成病症的风险的方法，该方法包括就存在于CLEC1B蛋白的多肽链的位置24上的氨基酸的类型，检查采自个体的样品，存在于所述一个或多个位置上的氨基酸的类型指示所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险。

根据一个实施方案，本发明涉及用于在个体中鉴定心血管和/或血栓形成病症或增加的发生心血管和/或血栓形成病症的风险的方法，该方法包括检查采自个体的样品，考察存在于所述样品中的CLEC1B mRNA的量和/或蛋白质的量或功能活性是否与一个或多个参照样品的不同。不同量的存在表明所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险增加。

在此，CLEC1B量的变化，即，CLEC1B水平的变化，可以因如下引起：影响所有水平的表达(转录、翻译、剪接)、翻译后修饰、蛋白质或前蛋白的转运，或影响蛋白质的稳定性、以及由作用于CLCEC1B表达的信号转导途径施加的影响。

参照样品可以例如是采自一个或多个具有下列基因组和/或蛋白质变体的个体的样品：CLEC1B基因的一个或两个等位基因上根据参照序列NM_016509的CLEC1B核苷酸序列的位置250处(或在CLEC1B基因组序列的相应位置处)，非胸苷的核苷酸，优选胞苷。

本发明的另一个方面涉及用于确定罹患心血管和/或血栓形成病症的风险的方法，其包括分析分离的个体样品以考察上述SNP或蛋白质多态性的存在，基于患者的年龄和存在于CLEC1B编码序列的位置250或CLEC1B蛋白的位置24上的核苷酸或氨基酸的类型，计算估计的风险度。风险确定的基础是根据表3至5的结果。

本发明的任何不同实施方案和方面中的心血管和/或血栓形成病症都可以是例如外周血管病、高血压、中风/PRIND/TIA、不稳定型心绞痛、心肌梗塞、早发心肌梗塞、冠状动脉疾病、冠心病以及使得必需经历冠状动脉血管成形术(coronary angioplasty)的任何病理状态。

本文中给出的核苷酸位置，指参照序列NM_016509中的核苷酸位置(或CLEC1B基因组序列中的相应位置)。

就CLEC1B氨基酸序列而言，氨基酸位置参考参照序列NP_057593。

除了对于核苷酸序列，核苷酸的编号之前加有+或-，在该情况下根据翻译的位置给出核苷酸位置外，位置均始于1，即，参照序列的第一个氨基酸或核苷酸。

在下文中使用核苷酸和氨基酸的同义标准缩写(即，3或1字母代码)。

核酸可以是任何寡核苷酸或多核苷酸，术语“寡核苷酸”涉及具有2至25个核苷酸的核酸，术语“多核苷酸”是指具有26个或更多个核苷酸的核酸。

在本申请中，术语蛋白质序列、氨基酸序列和多肽序列可作为同义词使用。

到目前为止，未曾公开过可以将临床效果与人中CLEC1B变体联系在一起的数据。令人惊讶地，由本发明人进行的研究已能够将CLEC1B蛋白的位置24上存在的CLEC1B变体，特别地CLEC1B蛋白的位置24上的变体Ser→Pro，与心血管和/或血栓形成病症的易感性密切联系在一起。

对CLEC1B基因的遗传多态性，特别地根据参照序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的核苷酸交换T→C，的检测，可以例如(a)作为遗传标记用于预防性治疗和预防性措施(用药、生活方式)，以延迟或甚至预防心血管和/或血栓形成病症(例如外周血管病、高血压、中风/PRIND/TIA(PRIND代表迁prolonged ischemicattack；TIA代表transitory ischemic attack)、不稳定型心绞痛、心肌梗塞、早发心肌梗塞、冠心病以及使得必需经历冠状动脉血管成形术的任何病理状态)的发生，或减轻或终止后期病程和病理学后遗症的严重性，或(b)作为遗传标记用于调整药物剂量，或(c)作为遗传标记用于设计药物的筛选，或(d)作为遗传标记用于鉴定和在适当时选择进行特定的治疗或医学研究的患者。

本发明的方法使得能够早期鉴定对心血管和/或血栓形成病症的潜在敏感性，从而使得可能在典型症状如由于组织损伤而导致的疼痛感发生之前尽早地使用预防性或治愈性治疗措施：本领域技术人员对本发明的多态性或CLEC1B mRNA或蛋白质的改变的稳定状态水平或功能的鉴定，为治疗或检查医生筛选已持续存在的对血管或心脏组织的损伤，或甚至在相应的损伤或疼痛发生之前施用预防性药物，或建议生活方式的改变提供了明确的指标。

此外，所述变体与对心血管和/或血栓形成病症的潜在敏感性之间的相关性的新发现允许通过暗示特定药物的剂量的改变或必要时改变在CLEC1B编码序列或蛋白中具有所述多态性的患者的治疗来使用更有效的治疗。

因此，本发明还涉及

a)CLEC1B基因中的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)，

b)CLEC1B蛋白中的一个或多个蛋白多态性和/或

c)CLEC1B蛋白或核酸或其功能性片段

用于使药物的剂量适用于心血管和/或血栓形成病症的预防和/或治疗的用途。

此外，本发明涉及用于使药物的剂量适合于个体中的心血管和/或血栓形成病症的预防和/治疗的方法，该方法包括就下列方面检查采集的个体样品

a)存在于根据参照序列NM_016509的CLEC1B基因的一个或两个等位基因上的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的核苷酸的类型和/或

b)存在于根据参照序列NP_057593的CLEC1B蛋白的位置24上的氨基酸的类型，

所述适合的剂量依赖于存在于所述位置上的核苷酸或氨基酸的类型。

一个实施方案包括就CLEC1B基因的一个或两个等位基因是否具有下列SNP：根据参照序列NM_016509的CLEC1B编码序列的位置250(或在CLEC1B基因组序列的相应位置上)的胸苷来检查采自个体的样品，在多态性存在的情况下减少或增加药物的剂量。

另一个实施方案包括就CLEC1B基因的一个或两个等位基因是否在上面所列位置上具有除上面所列的核苷酸外的核苷酸来检查采自个体的样品，在另一种核苷酸存在的情况下，减少或增加药物的剂量。另一种核苷酸优选是根据参照序列NM_016509的CLEC1B序列的位置250上(或在CLEC1B基因组序列的相应位置上)的胞苷。

根据本发明的另一个实施方案，用于使药物的剂量适合于个体的心血管和/或血栓形成病症的治疗和/或预防的方法包括就存在于采自个体的样品中的CLEC1B mRNA和/或蛋白质的量是否与一个或多个参照样品的不同来检查所述样品。参照样品可以是采自具有一个或多个下列基因组和/或蛋白质变体的个体的样品：在CLEC1B基因的一个或两个等位基因上在CLEC1B序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)除胸苷，优选胞苷外的核苷酸，所述适合的剂量依赖于采集的个体的样品中蛋白质和/或mRNA的量是否与参照样品或来自一个或多个具有一个或多个变体的个体的参照样品的不同。

CLEC1B基因变体的存在，特别地CLEC1B-T250C变体或CLEC1B-C250C变体的存在具有指示功能。现有技术已知多种用于治疗或预防心血管和/或血栓形成病症的药物。由于并非所有药物对所有患有相同疾病的患者具有相同的效果，因此第一次用心血管药物治疗的患者通常必须被“调整”至后者，即治疗医生事实上必须就哪种药物的哪个剂量具有期望的效果同时副作用尽可能小来对个体患者进行测试。此处的不利方面是预先不知道患者的症状是否被施用的药物(在给定的剂量上)减轻或停止的事实。预先也不可能精确地估计所述患者是否遭受不期望的副作用。

在该背景中，将患者鉴定为具有某一CLEC1B基因变体或具有与在治疗前患有心血管和/或血栓形成病症的一定可能性相关的CLEC1B核酸或蛋白质的量的患者可提高使用特定药物治疗的成功的预测性：CLEC1B基因的特定变体与心血管和/或血栓形成病症的发生的相关性表明：该类型的CLEC1B变异与个体的生理变化一致，这最终具有如下效果：所述个体具有比其他个体更高或更低的患有心血管和/或血栓形成病症的概率。必须要针对这样的个体患者的不同生理条件(physiological provision)的背景看到各药物在不同个体中的不同功效。将个体分配至这样的具有特定生理背景的患者的组可允许在此处优选使用特定药物(该药物已在临床研究中被证明尤其具有活性)和并且从一开始就不使用在该组患者中活性较低或更可能与不期望的副作用相关(与不具有所述变体的患者相比)的药物。

通常，在治疗前对该类型的患者进行分类是不可能的。只有本发明所基于的多态性与心血管和/或血栓形成病症的发生之间的相关性的知识才使这成为可能。因此，在临床研究中，在具有相同基因变体的患者组的治疗中已显示良好成功的药物可优选用于在CLEC1B基因中具有变异的患者，然而一开始就不使用在所述患者组中不太有效的药物或与在具有不同基因变体的患者组中相比具有更高的不期望的副作用可能性的药物。这可降低针对药物接受“调整”的患者的风险和增加成功治疗的概率。

因此，本发明的其他方面涉及：

a)CLEC1B基因中的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)，

b)CLEC1B蛋白中的一个或多个多态性和/或

c)CLEC1B蛋白或核酸或其片段

用于鉴定响应用于心血管和/或血栓形成病症的治疗和/或预防的药物的个体的用途。

可以例如通过就下列方面检查采自个体的样品来进行这样的鉴定：(a)CLEC1B基因的一个或两个等位基因是否具有下列变体，所述核苷酸的存在表示样品所源自的患者响应药物：在CLEC1B序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的胸苷；(b)CLEC1B基因的一个或两个等位基因是否具有一个或多个下列变体，所述变体的存在表示样品所源自的个体响应药物：在CLEC1B序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)除胸苷，优选胞苷外的核苷酸；(c)样品中CLEC1B mRNA和/或蛋白质的量是否与一个或多个可比较的/参照样品例如来自一个或多个具有已知的关于CLEC1B基因的遗传背景(例如根据(a)或(b)的多态性)的个体的样品中的不同，不同量的存在表示样品所源自的个体响应药物或(d)CLEC1B蛋白是否在CLEC1B蛋白参照序列NP_057593的位置24上具有多态性Ser→Pro。还可能使用用于鉴定的其他方法和操作。

可按照本领域内已知的方法就本发明的不同方面进行核苷酸类型的确定。这可以例如通过下列步骤来实现

a)提供含有基因组DNA的分离的生物样品或提供分离的基因组DNA；

b)通过使用引物进行PCR反应来扩增核酸，所述引物能够扩增含CLEC1B序列NM_016509的位置250(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的核酸；；

c)测定所述核酸的序列。

确定核苷酸的类型的另一种可能性是例如通过

b)将基因组DNA固定在适当的支持物上；

c)将一个或多个探针与固定的DNA杂交，所述探针在标准条件下能够特异性结合具有(基因组)CLEC1B序列的核酸以及具有对于根据参照序列NM_016509的CLEC1B序列的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的特定核苷酸的特异性。

根据另一个可能性，还可基于上述两个方法，但使用来自mRNA的cDNA而非使用基因组DNA来确定核苷酸的类型。

mRNA的量可以例如通过下列步骤来确定

a.提供含有mRNA的生物样品或提供来自a)的样品的分离的mRNA；

b.通过使用具有扩增来源于CLEC1B mRNA的核酸的能力的引物进行RT-PCR来扩增核酸；

c.对扩增的核酸的量进行定量，然后将其与在至少一种对照样品(即阳性和/或阴性对照样品)中扩增的核酸的量相比较。

用于验证任何给定的分析(生物、生物化学或化学)反应的结果的阳性或阴性对照的概念对于本领域技术人员来说是熟知的。其包括例如以与原始分析实验相同的方式(但缺少一个或多个确定的组分(例如缺少CLEC1B蛋白或mRNA或缺少特异性CLEC1B抗体等)进行的反应以将作为所述实验的结果的特异性信号与所谓的“背景”信号(由给定的分析方法产生的人工信号)(阴性对照)相区别。其还包括以与原始分析实验相同的方式(但使用将产生已知信号的另外的组分以验证一般工作中的该反应条件)进行的反应(阳性对照)。

测定mRNA的量的另一种可能性是例如利用：

a.提供含有mRNA的生物样品或提供分离的mRNA；

b.将mRNA转移至适当的支持物；

c.利用至少一种适当的探针检测和定量支持物上的CLEC1BmRNA；

d.将其与来自一个或多个参照样品(例如阳性和/或阴性对照样品)的CLEC1B mRNA的量相比较。

另一个可能是方法，其包括：

a.提供个体的组织学样品；

b.利用适当的mRNA探针通过杂交反应，检测和定量杂交的探针来检测CLEC1B mRNA的量；

c.将CLEC1B mRNA的量与一个或多个参照样品(例如阳性和/或阴性对照样品)中的CLEC1B mRNA的量相比较。

蛋白质的量的测定或蛋白质多态性的鉴定可以例如通过下列步骤来实现

a.提供待检查的个体的生物样品，其含有蛋白质；

b.优选从a.的样品分离蛋白质；

c.将所述蛋白质转移至适当的支持物；T

d.利用至少一种CLEC1B蛋白的特异性抗体或对于某种CLEC1B蛋白多态性是特异性的抗体来检测所述蛋白质；和

e.定量信号并且将其与获自至少一种参照样品(即阴性对照和/或阳性对照样品)的信号相比较。

测定蛋白质的量或鉴定某种蛋白质多态性的另一种可能是方法，其包括：

a.提供个体的组织学样品；

b.利用适当的CLEC1B抗体通过结合反应检测CLEC1B的量，检测和定量所述量；

c.将CLEC1B蛋白的量与一种或多种参照样品(例如，阳性和/或阴性对照样品)中的CLEC1B蛋白的量相比较。

某些蛋白质多态性的确定可以例如通过使用抗CLEC1B蛋白的抗体来实现，所述抗体对于在多肽链的位置24上具有丝氨酸的CLEC1B蛋白具有可检测的比对于在多肽链的位置24(根据参照序列NP_057593的氨基酸的位置)上具有另一种氨基酸，特别地具有脯氨酸的CLEC1B蛋白更高的结合亲和力。

此外，某些蛋白质多态性的确定可通过使用本领域内已知的任何适当的备选分子生物学方法或生物化学方法如质谱法(适合于差别检测在多肽链的位置24上具有丝氨酸的CLEC1B蛋白和在多肽链的位置24上具有另一种氨基酸特别地具有脯氨酸的CLEC1B蛋白)来实现。

在这一点上，术语样品或者采集的或分离的样品是指采自患者的生物材料。生物材料，除其他以外，可以包括：组织或器官或体液的细胞或制剂或部分(例如淋巴、唾液、血液、皮肤、结缔组织)或细胞，优选容易取出的细胞，例如，粘膜细胞。该类型的生物材料可利用常规技术例如抹拭(taking a swab)、采集血液样品、组织穿刺或外科技术(例如活组织检查)来获得。样品优选是组织学样品、细胞制剂、细胞例如粘膜细胞、细胞组织、纯化的DNA、mRNA或蛋白质或体液例如唾液、淋巴或血液或其所述样品的提取物或制剂。来自细胞或组织的天然发生的分子的纯化和细胞或组织提取物的制备对于本领域技术人员来说是熟知的(也参见下面所列的标准文献的实例)。DNA/RNA或蛋白质制剂可利用常规技术从其中获得。

因为已在本申请中第一次确定CLEC1B与心血管和/或血栓形成病症相关联，所以彼此相关的本组发明还涉及CLEC1B蛋白或核酸或其功能性片段用于发现用于治疗和/或预防心血管和/或血栓形成病症的活性物质的用途。

根据本发明的不同方面的一个实施方案，CLEC1B、其衍生物或片段可用作分离的分子。

在本发明的背景中，术语“分离的分子”，特别地对于CLEC1B而言，是指从天然来源纯化的(即从它们的天然环境取出的)CLEC1B核酸或多肽或其片段以及纯化的重组分子(其中术语纯化的包括部分纯化以及完全纯化)。核酸的分离在本领域内是熟知的(也参见下面的关于标准实验室方法的文献)。

根据本发明的用途允许鉴定用于预防和/或治疗心血管和/或血栓形成病症的新型物质。根据本发明的用途包括具有期望的特征的物质的鉴定以及已被鉴定对于心血管和/或血栓形成病症的预防和/或治疗是有用的物质的进一步表征。

如被用于本发明的不同方面的物质可以是利用生物化学或分子生物学方法纯化的、部分纯化的、合成的或制造的任何生物或化学物质或天然产物提取物。

在本发明的不同方面的意义上被认为在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质可以是对CLEC1B的一个功能或对CLEC1BmRNA或蛋白质在生物系统中的表达、量或稳定状态水平具有影响的任何物质。

为此目的，所述物质可调节CLEC1B的任何功能(例如上面定义的功能或本文下文中定义的功能)。CLEC1B蛋白的活性可利用物质例如通过与CLEC1B多肽/蛋白或其片段直接相互作用和干扰其功能来调节。所述物质还可在例如转录(起始、延伸、终止)、转录物加工或翻译加工(特别地前蛋白原或前蛋白至活性形式的翻译后加工，其还可包括缺乏前肽结构域的全长蛋白的C端截断)、转录或翻译产物稳定性或翻译的水平上调控CLEC1B的表达。此外，其还可调控CLEC1B的翻译后加工、修饰、蛋白质折叠等。所述物质可直接或间接(间接意指即通过干扰(正或负)对CLEC1B功能/蛋白质活性/表达等具有影响的天然信号级联)发挥上述作用。此外所述物质还可模拟CLEC1B的活性(即取代其功能/作用)。

CLEC1B的片段可以是比相应的野生型更短的例如比人类(hs)CLEC1B或多肽更短的任何多肽或核酸。CLEC1B的功能性片段是展示CLEC1B的至少一个功能的任何片段(多肽或核酸)。

CLEC1B或CLEC1B片段的衍生物可以是CLEC1B核酸、多肽或其片段的任何修饰。衍生物包括例如氨基酸或核苷酸序列的修饰或任何其他类型的修饰，例如，导致多肽或核酸的稳定化(例如硫代磷酸酯修饰或其他类型的核酸主链或氨基酸之间的键的交换的修饰等)，或使多肽或核酸能够特异性靶向某些细胞或促进其进入或被细胞吸收(例如细胞渗透磷酸肽(cell-permeant phosphopeptide)、至细胞渗透肽载体(cell-permeantpeptide vector)(例如基于antennapedia/penetratin、TAT，和基于信号肽的序列)的邻位偶联；或至特定转运蛋白(transporter)或importer的配体的一部分的偶联)的化学或生物学修饰。

术语CLEC1B的“功能性衍生物”对于天然发生的形式(多肽或核酸)而言包括任何类型的CLEC1B的修饰，其至少具有CLEC1B的一个功能。本发明还包括CLEC1B的片段的功能性衍生物。

关于CLEC1B核酸或其片段，CLEC1B功能包括例如与其他分子例如特异性杂交引物或探针相互作用的能力，控制下游编码序列的转录，以编码CLEC1B蛋白的能力等)。CLEC1B的功能还包括CLEC1B(蛋白质或核酸)或其片段与其他分子(包括但不限于蛋白质或蛋白质片段、核酸(即与其他核酸分子特异性杂交的CLEC1B核酸)、合成的分子(即与合成的药物特异性相互作用的CLEC1B蛋白或片段))相互作用的能力。

活性物质的鉴定可以例如利用一个或多个本文下面确定的方法来进行，所述方法是例如：

用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，包括：

a.将CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物与受试物质接触；和

b.确定所述受试物质是否调节CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的活性。

a.将具有可检测量或活性的CLEC1B或其功能性片段或衍生物的细胞与受试物质接触；

b.确定所述受试物质是否能够调节存在于所述细胞中的CLEC1B或其功能性片段或衍生物的量或活性。

如被用于本发明的不同方面的物质/受试物质/活性物质可以是利用生物化学或分子生物学方法纯化的、部分纯化的、合成的或制造的任何生物或化学物质或天然产物提取物。

能够可检测地调节CLEC1B的量或活性的物质被认为是在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质。可检测的量的CLEC1B可以是指可检测量的CLEC1B核酸(mRNA、cDNA或基因组DNA)和/或蛋白质(前蛋白原/前蛋白/成熟蛋白)。可检测的活性是指CLEC1BDNA/mRNA或蛋白质的转录和/或翻译和/或蛋白质的活性。

在本发明的不同方面和实施方案中，术语调节是指激活或抑制。

另一个实例是用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，包括：

a.将编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的核酸与受试物质在转录活性系统中接触；

b.测定在所述物质存在的情况下存在于所述系统中的编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的mRNA的量；

c.测定在所述物质不存在的情况下存在于所述系统中的编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的mRNA的量；

d.确定所述物质是否能够调节存在于所述系统中的编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的mRNA的量。

能够调节存在于所述系统中的CLEC1B mRNA的量的物质被认为是在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质。

转录活性系统是至少具有进行转录单位的转录反应的能力的任何生物化学或细胞系统。此类系统在本领域内是熟知的，包括细胞(例如常用实验室菌株或细胞系以及真核或原核细胞的原代培养物)以及也可商购获得的体外转录系统或试剂盒(例如基于细胞提取物的)。在本发明的情况下，这可以是表达CLEC1B mRNA或表达编码功能性CLEC1B片段的mRNA的生物化学或细胞系统。

可按照现有技术中熟知的技术(利用放射性或荧光标记物等进行的产物的直接标记或通过使用特异性引物或探针等进行的产物检测)测定存在于系统中的mRNA的量。

另一个实例是用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，该方法包括：

a.将编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的核酸与受试物质在翻译活性系统中接触；

b.测定在所述物质存在的情况下存在于所述系统中的CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的量；

c.测定在所述物质不存在的情况下存在于所述系统中的CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的量；

d.确定所述物质是否能够调节存在于所述系统中的CLEC1B蛋白质或其功能性片段或衍生物的量。

能够调节存在于所述系统中的CLEC1B蛋白、其衍生物或片段的量的物质被认为是对于心血管和/或血栓形成病症的预防或治疗具有活性的物质。

翻译活性系统是至少具有进行转录物的翻译反应的能力的任何生物化学或细胞系统。此类系统在本领域内是熟知的，包括细胞(例如常用实验室菌株或细胞系以及真核或原核细胞的原代培养物)以及体外翻译系统(其也可商购获得，例如如试剂盒)。为了进行核酸的体外翻译，将核酸亚克隆入适当的载体，然后在适当的缓冲液和细胞提取物(例如网织红细胞裂解物)中表达多肽。载体、必需试剂和利用适当的条件的方案在本领域内是已知的并且可商购获得。

在本发明的背景中，术语“多肽”是指含有彼此通过肽键结合的氨基酸并且含有至少10个彼此以线性模式连接的氨基酸的分子。该类型的更短的分子称为肽。术语“蛋白质”是指包含至少一条多肽链的分子，但还可指含有两条或更多彼此缔合或结合的多肽链的分子。因此，术语“蛋白质”包含术语“多肽”。

可按照本领域内熟知的技术(例如翻译产物的直接放射性或荧光标记或特异性抗体的使用、蛋白质的加标签及标签的检测等)检测存在于所述系统中的CLEC1B蛋白。

另一个实例涉及用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，该方法包括：

a.提供用核酸载体转染的细胞，所述载体含有与报告基因或其功能性片段有效连接的CLEC1B基因或其功能性片段的启动子：

b.提供用对照载体转染的细胞，所述对照载体含有不与功能性CLEC1B启动子有效连接的报告基因或其功能性片段；

c.测定在受试物质存在的情况下根据a)和b)的细胞的报告基因的活性；

d.测定在受试物质不存在的情况下根据a)和b)的细胞的报告基因的活性。

其中能够显著调节(即增加或减少)根据a)的报告基因活性而不显著调节b)的报告基因活性(即能够特异性增加CLEC1B启动子活性)的物质被认为是在心血管和/或血栓形成病症的预防或治疗中具有活性的物质。

显著调节是比标准差高的任何调节(即增加或减少)；优选其至少为标准差的两倍高。

本发明的上述方面基于本领域内通常已知的典型的报告基因测定。为此目的，如果选择的启动子具有活性，则以这样的方式如允许报告基因表达的方式将所述启动子插入适用于所选择的宿主细胞的类型的表达载体中，位于选择的报告基因的上游。随后将构建体导入选择的宿主细胞。用于转化或转染的适当方法以及用于细胞培养和报告基因表达的检测的条件在本领域内是熟知的(参见例如下面所列的标准文献)。适当的条件以及也可商购获得的载体、报告基因和必需试剂在本领域内是熟知的。

载体是环形或线性核酸分子，例如DNA质粒、噬菌体或粘粒，借助于其可特别地在适当的细胞或生物中扩增核酸片段(例如从其他载体切取的或通过PCR扩增的以及插入在克隆载体中的)。表达载体使目的基因(例如报告基因)能够在宿主细胞或生物中异源表达。细胞或生物的类型主要取决于目的，选择在本领域技术人员的知识范围内。用于扩增核酸的适当的生物是例如主要地具有高增殖率的单细胞生物例如细菌或酵母。适当的生物还可以是从多细胞组织分离和培养的细胞，例如从不同生物产生的细胞系(例如来自草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)的SF9细胞，等)。适当的克隆性载体在本领域内是已知的并且可以从不同的生物技术提供商如，例如Roche Diagnostics、New England Biolabs、Promega、Stratagene等商购获得。适当的细胞系例如可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)商购获得。

为了异源表达蛋白质或多肽，细胞可以是适合于利用核酸载体转染并且表达目的基因例如报告基因的任何原核或真核细胞。其可能的实例是原代细胞或培养的细胞，优选真核细胞培养物，其最初例如从多细胞生物或组织获得(例如，HeLa、CHO、COS、SF9或3T3)或它们本身是单细胞生物例如酵母细胞(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)或酿酒酵母(S.cerevisiae))或原核细胞培养物或毕赤酵母(Pichia)或大肠杆菌(E.coli)。来自组织的细胞和样品可利用现有技术的已知技术(例如采集血液样品、组织穿刺或外科技术)来获得。天然产生CLEC1B的分离的细胞也适用于CLEC1B的本发明的用途以直接测定心血管药物增加或减少产生的CLEC1B的量的能力的。

本申请的背景中，术语“转染”是指核酸载体至(原核或真核)宿主细胞的导入，从而包含术语“转化”。所述转染可以是稳定的或瞬时的，其可基于常规方法来进行。

CLEC1B启动子区域是CLEC1B基因的一部分，如果将目的基因的编码序列在启动子/增强子的下游功能性地克隆入适当的载体并且转染入适当的宿主细胞，其能够控制目的基因产物的转录。CLEC1B基因的上游的核苷酸序列可被当作CLEC1B启动子区域。该区域包括序列编号NC_000012.10的核苷酸编号10043146的下游的核苷酸序列。

CLEC1B启动子的功能性片段是CLEC1B启动子片段，其在给定的条件下可同样地控制下游编码序列的转录。适当的片段的鉴定在本领域技术人员的能力范围之内。

报告基因是可以使其基因产物能够容易定量的任何基因。用于真核或原核宿主细胞以及检测方法的许多种报告基因和必需试剂在本领域内是已知的并且可商购获得。此类报告基因包括例如β-内酰胺酶(lacZ)、萤光素酶、绿色或蓝色荧光蛋白(GFP或BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1或LEU2或β-半乳糖苷酶的基因。此类基因编码可利用可视(颜色或发光)反应(例如lacZ、萤光素酶)容易地检测的蛋白质。此类蛋白质包括可利用可视(颜色或发光)反应容易地检测的基因产物或当表达时赋予对抗生素如氨苄青霉素或卡那霉素的抗性的基因产物。其他报告基因产物使得表达细胞能够在某些条件下生长，例如营养缺陷型基因。

报告基因的功能性片段是给定的报告基因的允许其基因产物被容易地定量的任何片段。

在本发明的上述方面的上下文中，对照载体可以是含有报告基因或其功能性片段的任何适当的载体，但其中报告基因的表达不由(功能性)CLEC1B启动子驱动。这可以例如表示报告基因或其功能性片段不与功能性CLEC1B启动子有效连接(即完全缺乏CLEC1B启动子，包含非功能性CLEC1B启动子或启动子片段或其中启动子与报告基因的连接不是功能性的)。这还可表示报告基因或其功能性片段与除CLEC1B启动子外的另一个启动子(例如SV40或另一个标准启动子)有效连接。还可将功能性载体和对照载体转染入相同的细胞，但在该情况下报告基因必须不同。

本发明的另一个方面涉及高通量筛选，所述高通量筛选基于根据上述用于活性物质的鉴定的新型方法(此类方法也称为“测定”)中的一个方法。

用于测量确定的靶分子(所谓的靶，主要为蛋白质或核酸)的活性或浓度作为潜在的药物化合物的功效的参数的分析方法或分析系统(所谓的测定)在现有技术中是熟知的。测定包括例如使用在确定的空间和时间内被一起置于反应混合物的分离的或部分分离的组分的生物化学分析方法或系统，其中可检测潜在的药物化合物的功效(例如上述方法)。为了测量蛋白酶的活性，此类测定包括例如用于测量标记成员与非标记成员的相互作用(例如标记底物与非标记蛋白酶的相互作用，其中在切割后，标记底物的底物部分被释放；从而可通过检测和定量在给定的时间内释放的标记成员的量来测量蛋白酶的活性)的放射性同位素或荧光测定。测定的其他实例包括基于细胞的测定(例如，上述报告基因测定或表型测定，其中物质的活性可通过细胞表型的变化来监测)。

不同类型的测定在现有技术中通常是已知的并且可从商业提供商商购获得。

根据本发明的不同方面的另外的实施方案，使用含有NM_016509的位置250的CLEC1B核酸或使用含有NP_057593的位置24的CLEC1B多肽。

因为根据参照序列NM_016509的CLEC1B的位置250(或基因组序列中的相应位置)上的CLEC1B基因变体T→C或根据参照序列NP_057593的CLEC1B蛋白的位置24上的蛋白质变体Ser→Pro与心血管和/或血栓形成病症的存在最显著相关，因此，本发明的优选实施方案涉及具有一个或多个上述多态性的CLEC1B核酸或多肽例如用于进行一个或多个根据本发明的应用的用途。

通常，在使用靶基因(“分子靶”)进行活性化合物的筛选中不考虑待研究的基因的野生型序列中的个别SNP。由于本申请已确定CLEC1B变体与心血管和/或血栓形成病症的发生相关，因此该类型的变体的使用(特别地针对带有该变体的细胞的特定生理组成的背景)可能产生更高的发现适合用于治疗和/或预防心血管和/或血栓形成血管病症的活性化合物的概率。事实上，具有由该类型的遗传和生理组成的个体也更可能患有心血管和/或血栓形成病症。因此，在根据参照序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)具有胞苷的CLEC1B核苷酸序列的使用应当导致发现具有该基因或蛋白质变体的特定患者对其作出反应的活性化合物。在根据参照序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)具有T或C的CLEC1B编码序列的使用代表了本发明的另一个实施方案。

此外，CLEC1B基因中的SNP适合用于使用除CLEC1B本身外的靶进行的活性化合物的筛选；可能在用于发现用于治疗和/或预防心血管和/或血栓形成病症的活性化合物(该化合物具有影响除CLEC1B外的靶的功能和/或活性和/或量的能力)的细胞测定中使用细胞，特别地其基因组对于在根据参照序列NM_016509的核苷酸序列的位置250(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)而言具有CLEC1B基因的确定变体的细胞。这样，可能针对优选与待治疗的疾病相关的遗传背景特异性地筛选在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的化合物，甚至干扰除突变的基因外的基因的功能的化合物。

本发明的其他方面涉及用于检测CLEC1B的方法用于通过分析采自待检查的个体的身体的生物样品来诊断心血管和/或血栓形成病症或对心血管和/或血栓形成病症的潜在敏感性的用途。

在这一点上，下列变体的存在优选表示增加的风险：在至少一个等位基因上在根据参照序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列的相应位置上)含有C的CLEC1B编码区。

用于检测CLEC1B的方法可以是适合用于检测生物样品中的CLEC1B蛋白或核酸的任何方法。

用于检测的工具可以是例如，用于检测样品中的CLEC1B mRNA或蛋白质的工具(means)；例如基于其可对样品中的CLEC1B mRNA或蛋白质量的量进行定量的工具(例如适当的引物、探针、抗CLEC1B抗体等；例如能够在标准条件下与CLEC1B mRNA或cDNA特异性杂交，例如用于Northern印迹或微阵列中的核酸探针或用于定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的引物组)。另一个实例涉及用于确定CLEC1B基因的根据参照序列NM_016509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的核苷酸的类型的工具，例如在例如PCR测序中使用的适当的PCR引物组(例如基因组或cDNA引物)、探针(用于例如Southern印迹法或芯片或微阵列杂交中的)或用于例如本领域内已知的免疫(组织)化学、荧光或放射性化学技术的特异性抗DNA抗体。另一个实例涉及用于确定存在于根据参照序列NP_057593的CLEC1B蛋白的位置24上的氨基酸的类型的工具，例如，对于某个蛋白质多态性是特异性的抗体。

根据另一个实施方案，用于检测的工具是用于确定CLEC1B基因的根据参照序列NM_16509的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的核苷酸的类型的工具，例如一个或多个根据SEQ IDXXX的引物。

适当的引物的设计和合成在现有技术中是已知的；此类引物还可商购获得。根据优选实施方案，此类引物是根据SEQ ID NOs：4和/或5的引物。利用常规方法，例如通过使用常规实验室机器人(例如由公司例如Applied Biosystems，Bio-Rad等出售的)测定核酸的序列，

适当的探针的设计和制备同样在现有技术中是已知的(参见，例如，所列的标准文献)。

在根据本发明的一个用途或方法的另外的优选实施方案中，借助于至少一种抗体测定蛋白质的量的变化或确定CLEC1B蛋白中给定的蛋白质多态性。此处优选检测方法是ELISA、Western印迹法、蛋白质芯片和光谱测定法。

适当的抗体或其功能性片段的制备在现有技术中是已知的，例如通过用CLEC1B蛋白或其片段免疫哺乳动物例如兔子来进行制备，适当时在适当的佐剂(弗氏佐剂或氢氧化铝凝胶，参见例如，Diamond，B.A.等(1981)The New England Journal of Medicine：1344-1349)存在的情况下进行免疫。然后可利用已知的方法，例如利用柱层析分离和纯化作为免疫反应的结果而产生的多克隆抗体。可以例如按照已知的由Winter和Milstein提供的方法(Winter，G.&Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299)获得单克隆抗体。用于制备和纯化单克隆抗体的适当的方法在现有技术中是已知的(参见标准文献)。用于检测CLEC1B的已知的抗体的实例包括来自AbnovaCorporation，产品编号：H00051266-A01或来自Novus Biologicals，产品编号：H00051266-A01的CLEC1B抗体。用于检测CLEC1B的抗体的用途在本领域内是已知的并且也公开于例如Fuller等或Suzuki-Inoue等中。

在本组相关的发明的背景中，术语抗体或抗体片段也指重组产生的抗体或其抗原结合部位，在适当时，其也可被修饰，例如，嵌合抗体、人源化抗体、多功能抗体、双或寡特异性抗体或F(ab)或F(ab)2片段。

用于检测抗体反应的常规免疫化学或免疫放射法对于本领域技术人员来说是熟知的。常用方法基于例如特异性一抗与待鉴定的抗原的结合、通常识别所述一抗上的种特异性表位的二抗的结合。此处使用所述二抗的结合以产生可检测的信号(例如当使用放射性标记的二抗时，放射性信号，或当使用荧光偶联的二抗时，荧光信号，或例如当使用酶偶联的二抗时，可通过比色测定的信号，等)，也参见下列所列的关于标准方法的文献。

本组彼此相关的发明还涉及用于检测对心血管和/或血栓形成病症的潜在敏感性的诊断试剂盒，该试剂盒包括至少一种用于检测生物样品中的CLEC1B的工具。

在本发明的说明书中，术语“试剂盒”(部分的试剂盒)是指本文中鉴定的组分的任何组合，所述组分已被组合，从而产生用于进行给定的任务(此处例如用于心血管和/或血栓形成病症或因此对疾病的潜在敏感性的诊断)的在空间和功能上关联的单位，其可额外地包含其他部分。

根据本发明的诊断试剂盒包括至少一种用于检测生物样品中的CLEC1B的工具。在适当的情况下，其还可包括用于检测CLEC1B和/或制备或设计样品的适当的缓冲液和/或其他试剂以及，在适当的情况下还有用于实施特定检测方法的说明书。

根据按照本发明的用途或方法的优选实施方案，通过PCR和在适当的情况下序列测序或通过使用核酸探针来检测CLEC1B基因中一个或多个变异的存在。这样的探针可以例如是具有50或更多个，100或更多个，150或更多个，200或更多个，250或更多个，300或更多个，350或更多个，400或更多个根据SEQ ID NO：3的连续核苷酸的核酸片段、含有SEQID NO：3的位置201(其中根据本发明的SNP所位于的位置)的片段。

用于PCR或与适当的探针(其结合例如固定在适当的支持物(例如膜或芯片)上的基因组DNA)的杂交的适当的方案和试剂在现有技术中是熟知的。

核酸分子可与另一个核酸分子“杂交”，例如两个分子的单链形式可在适当的反应条件(周围介质的温度和离子强度)下彼此粘附(attach)以形成新的双链核酸分子的话。为了杂交，彼此粘附的核酸分子必须具有互补序列。然而，取决于选择的严格性条件，也可能发生碱基错配而不终止粘附。术语“严格性”描述了反应条件，当两个单链核酸分子彼此粘附时，所述反应条件影响杂交的特异性，从而也确定了粘附过程中所能耐受的两个分子间的错配数目或错配强度。严格性，和从而还有反应的特异性在此处除其他以外依赖于温度和缓冲液条件。用于使两个给定的核酸杂交的适当的条件取决于核酸分子的长度、类型和互补的程度。所述参数和用于给定的分析方法的适当条件的确定对于本领域技术人员来说是熟知的，也可见于标准实验方法的文献(例如，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)。

根据本组彼此相关的发明的优选实施方案，个体是患有心血管和/或血栓形成疾病的患者。心血管疾病优选是冠状动脉疾病(＞20％的狭窄和/或＞50％的狭窄)、心肌梗塞、早发性心肌梗塞、急性冠状动脉综合征或心绞痛(特别地不稳定型心绞痛)。

用于本发明的方法、用途或检测试剂盒的分离的样品优选是人样品，待检查的个体优选是人类。所述样品可以特别地是：组织学样品、活组织检查样品、细胞(例如粘膜细胞)、细胞提取物、细胞组织、体液，优选血液、唾液、淋巴或尿。

本发明额外地涉及分离的CLEC1B核酸，例如具有或含有根据NM_016509或根据NT009714或根据SEQ ID NO：3的序列的序列或部分的核酸或其片段的用途。所述核酸或片段含有下列SNP：

a.根据NM_016509的CLEC1B序列的位置250上(或在CLEC1B基因组序列中的相应位置上，例如在SEQ ID NO：3的位置201上)的胞苷或

b.根据NM_016509的CLEC1B序列的位置250上(或在CLEC1B基因序列中的相应位置上，例如在SEQ ID NO：3的位置201上)的胸苷。

此外，本发明还涉及分离的CLEC1B蛋白或其片段、具有下列蛋白质多态性的蛋白质或片段的用途：

a.根据参照序列NP_057593的CLEC1B蛋白的多肽链的位置24上的脯氨酸或

b.根据参照序列NP_057593的CLEC1B蛋白的多肽链的位置24上的丝氨酸。

基于不被当作限定的实施例，结合附图和表在下面更详细地举例说明本发明：

参考文献：

Chaipan C，Soilleux EJ，Simpson P，Hofmann H，Gramberg T，MarziA，Geier M，Stewart EA，Eisemann J，Steinkasserer A，Suzuki-Inoue K，Fuller GL，Pearce AC，Watson SP，Hoxie JA，Baribaud F，Pohlmann S.DC-SIGN and CLEC-2 mediate human immunodeficiency virus type 1capture by platelets.J Virol 80：8951-8960，2006.

Colonna M，Samaridis J，Angman L.Molecular characterization oftwo novel C-type lectin-like receptors，one of which is selectively expressedin human dendritic cells.Eur J Immunol 30：697-704，2000.

Fuller GL，Williams JA，Tomlinson MG，Eble JA，Hanna SL，Pohlmann S，Suzuki-Inoue K，Ozaki Y，Watson SP，Pearce AC.TheC-type lectin receptors CLEC-2 and Dectin-1，but not DC-SIGN，signal viaa novel YXXL-dependent signaling cascade.J Biol Chem 282：12397-12409，2007.

Kanazawa N.Dendritic cell immunoreceptors：C-type lectinreceptors for pattern-recognition and signaling on antigen-presenting cells.J Dermatol Sci 45：77-86，2007.

Sobanov Y，Bernreiter A，Derdak S，Mechtcheriakova D，Schweighofer B，Duchler M，Kalthoff F，Hofer E.A novel cluster oflectin-like receptor genes expressed in monocytic，dendritic and endothelialcells maps close to the NK receptor genes in the human NK gene complex.Eur J Immunol 31：3493-3503，2001.

Suzuki-Inoue K，Fuller GL，Garcia A，Eble JA，Pohlmann S，Inoue O，Gartner TK，Hughan SC，Pearce AC，Laing GD，Theakston RD，Schweighoffer E，Zitzmann N，MoritaT，Tybulewicz VL，Ozaki Y，WatsonSP.A novel Syk-dependent mechanism of platelet activation by theC-type lectin receptor CLEC-2.Blood 107：542-549，2006.

Watson AA，Brown J，Harlos K，Eble JA，Walter TS，O′Callaghan CA.The crystal structure and mutational binding analysis of the extracellulardomain of the platelet-activating receptor CLEC-2.J Biol Chem 282：3165-3172，2007.

实验室方法标准文献：

(除非另外说明，本文提到的实验室方法根据或可以根据下面列出的标准文献。)

Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，545 pp；

Current Protocols in Molecular Biology；regularly updated，e.g.Volume 2000；Wiley&Sons，Inc；Editors：Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，KevinStruhl.

Current Protocols in Human Genetics；regularly updated；Wiley&Sons，Inc；Editors：Nicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith.

Current Protocols in Protein Science；regularly updated；Wiley&Sons，Inc；Editors：John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.

DavidW.Speicher，Paul T.Wingfield.

Molecular Biology of the Cell；third edition；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；Garland Publishing，Inc.New York&London，1994；

Short Protocols in Molecular Biology，5th edition，by Frederick M.Ausubel(Editor)，Roger Brent(Editor)，Robert E.Kingston(Editor)，David D.Moore(Editor)，J.G.Seidman(Editor)，John A.Smith(Editor)，Kevin Struhl(Editor)，October 2002，John Wiley&Sons，Inc.，New York

Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboo k.C.A.Pinkert，editor；Academic Press Inc.，San Diego，California，1994(ISBN：0125571658)

Gene targeting：A Practical Approach，2nd Ed.，Joyner AL，ed.2000.IRL Press at Oxford University Press，New York；

Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual.Nagy，A，Gertsenstein，M.，Vintersten，K.，Behringer，R.，2003，Cold Spring HarborPress，New York；

实施例：

1.通过测序和分析测序结果进行的SNP检测

1.a)CLEC1B基因中的DNA区域的扩增

用于DNA扩增的寡核苷酸(引物)：

为了检测存在于根据参照序列NM_016509的CLEC1B基因中的位置250上(或在根据NT009714的CLEC1B基因组序列中的相应位置上)的核苷酸，可使用一个或两个下列引物：

引物1(正向引物)：5′-TGCCTGCTCCTTGATGTCTTTATT-3′(SEQ ID NO：4)

引物2(反向引物)：5’-TCAGCAGAATCAAAGCCATCACA-3’(SEQ ID NO：5)

用于扩增的PCR方案：

所使用的试剂来自Applied Biosystems(Foster City，USA)：

20ng基因组DNA；1个单位的TaqGold DNA聚合酶；1xTaq聚合酶缓冲液；500μM dNTPs；2.5mM MgCl₂；200nM的各扩增引物对(1.A下的序列)；加H₂O至5μl。

用于基因分型的PCR扩增程序：

95℃下进行10分钟 ×1个循环；

95℃下进行30秒

70℃下进行30秒 ×2个循环；

95℃下进行30秒

65℃下进行30秒 ×2个循环；

95℃下进行30秒

60℃下进行30秒 ×2个循环；

95℃下进行30秒

56℃下进行30秒

72℃下进行30秒 ×40个循环；

72℃下进行10分钟

4℃下进行30秒 ×1个循环.

1b)SNP的鉴定

用于SNP的微测序(minisequencing)和检测的方案

所有试剂来自Applied Biosystems(Foster City，USA)。2μl纯化的PCR产物，1.5μl BigDye terminator试剂盒，200nM测序引物(关于序列，参见1.A下)，加H₂O至10μl。

用于测序的扩增程序：

96℃下进行2分钟 1个循环；

96℃下进行10秒

55℃下进行10秒

65℃下进行4分钟 30个循环；

72℃下进行7分钟

4℃下进行30秒 1个循环.

实施例2：鉴定的SNP的统计分析

在大约1400个个体中就与临床参数的相关性分析参照核苷酸序列NM_016509、NT009714和参照蛋白质序列NP_057593中的已被分析的CLEC1B多态性。被分析的队列的特征列于表1中。不同的已鉴定的多态性的频率和分布示于表2中。被分析的患者组中参照序列NP_057593的位置24上的CLEC2多态性Ser→Pro与临床终点的相关性可见于表3、4和5中。使用SAS版本8.2(SAS Institute GmbH，Heidelberg，Germany)进行所有统计分析。

P值是关于观察到的相关性的统计显著性的参数。RR(风险率(riskratio))是关于具有某种CLEC1B多态性的患者中预示的发生临床终点的增加的风险的参数。通过就年龄、性别、吸烟者状态、血压和糖尿病状态调整患者组来计算RR。

如图3中所示，具有CLEC1B-C250C的个体(其对于Pro25Pro是纯合的)比具有CLEC1B-T250T(Ser24Ser)的个体具有更高的经历冠状动脉疾病(CAD)的风险，狭窄＞20％。可观察到CLEC1B核苷酸序列的位置250中C(胞苷)的存在依赖于与观察到的CAD的频率，因为患有CAD的频率随个体中C等位基因的数目增加而增加。即，对于在CLEC1B核苷酸序列的位置250中不具有C等位基因的个体，CAD频率为76.89％，对于具有一个C等位基因的个体，CAD频率为84.24％，对于具有2个C等位基因的个体，CAD频率为88.89％。此外，具有CLEC1B-C250C的个体(其对于Pro25Pro是纯合的)比具有CLEC1B-T250T(Ser24Ser)的个体具有更大的经历冠状动脉疾病(CAD)的风险，狭窄＞50％。可观察到CLEC1B核苷酸序列的位置250中C(胞苷)的存在依赖于CAD的频率，因为具有CAD的频率随个体中C等位基因的数目增加而增加。即，对于在CLEC1B核苷酸序列的位置250中不具有C等位基因的个体，CAD频率为66.35％，对于具有一个C等位基因的个体，CAD频率为74.50％，以及对于具有2个C等位基因的个体，CAD的频率为83.33％。

如表4和5中所概述的，蛋白质的位置24(或核苷酸序列的位置250)中的CLEC1B多态性与冠状动脉疾病的相关性的统计学上显著的结果不依赖于致混淆因素例如性别、糖尿病和吸烟者状态或高血压。具有CLEC1B-C250C(Pro24Pro)的个体患＞20％的狭窄和＞50％的狭窄的冠状动脉疾病的风险分别升高1.610(p值＝0.0026)和1.499(p值＝0.0021)倍。

作为所述研究的一个结果，可概括地说：

一个或两个等位基因上的根据参照序列NM_016509的CLEC1B编码区中的位置250上的胞苷尤其在在根据参照序列NM_016509的CLEC1B核苷酸序列中的位置250上不具有胸苷的个体中显著增加了经历或发生心血管和/或血栓形成病症、特别地冠状动脉疾病的风险，从而可能使治疗性干预成为必需。

临床终点与CLEC1B基因和/或蛋白质中的遗传变异之间的相关性明确暗示了CLEC1B蛋白中的位置24上的遗传变异Ser→Pro对心血管和/或血栓形成病症例如具有大于20％和大于50％的血管狭窄的冠状动脉疾病的发病的影响。因此本文中证明的CLEC1B的变体与所述临床终点之间的统计学上显著的相关性第一次为本发明提供了意义深远的基础。

附图和表的说明：

图1：具有NCBI参考编号NM_016509(SEQ ID NO：1)的CLEC1B编码序列。在位置250上的多态性加下划线并且以粗体标示。

图2：具有NCBI参考编号NP_057593(SEQ ID NO：2)的CLEC1B蛋白序列。在位置24上的多态性以粗体标示。

图3：如NCBI数据库中在登录号rs_2273986下公开的CLEC1B基因组DNA的核酸片段(SEQ ID NO：3)，其含有根据本发明的SNP。PCR引物和多态性的位置以粗体标示。“Y”代表C或T。

图4：用于分析存在于根据参照序列NM_016509的位置250或基因组序列(SEQ ID NOs：4和5)的各自位置上的核苷酸的类型的PCR引物。

表：

缩写：

Ser＝丝氨酸

Pro＝脯氨酸

CAD＝冠状动脉疾病

CAD20＝20％或更大的可见狭窄(visual stenosis)

CAD50＝50％或更大的可见狭窄

表1：患者队列的基本特征

表2：CLEC1B多态性Ser24Pro在LURIC队列中的分布

表3：LURIC队列中CLEC1B多态性Ser24Pro与冠状动脉疾病的相关性

表4：包括致混淆因素(逻辑回归)的LURIC队列中CLEC1B蛋白的位置24上的(Ser→Pro)多态性对具有20％或更大的狭窄的冠状动脉疾病的影响的分析。CAD20＝20％或更大的可见狭窄，CAD50＝50％或更大的可见狭窄。

表：

缩写：

Ser＝丝氨酸

Pro＝脯氨酸

CAD＝冠状动脉疾病

CAD20＝20％或更大的可见狭窄

CAD50＝50％或更大的可见狭窄

表1：患者队列的基本特征

年龄[岁] 61.79±10.57

BMI[kg] 27.97±4.41

性别男性 1016(70.75％)

女性 420(29.25％)

糖尿病(是)(^＊) 595(31.27％)

高血压(是)(^＊＊) 1123(58.34％)

吸烟者(是) 1277(66.34％)

CAD(是) 1367(78.65％)

心肌梗塞(是) 802(42.14％)

(^＊)根据ADA标准的所有糖尿病患者

(^＊＊)高动脉压

表2：CLEC1B多态性Ser24Pro在LURIC队列中的分布

n ％

Ser24Ser 1061 73.89

Ser24Pro 357 24.86

Pro24Pro 18 1.25

表3：LURIC队列中CLEC1B多态性Ser24Pro与冠状动脉疾病的相关性

Ser24Ser Ser24Pro Pro24Pro

n(％) n(％) n(％) p值

CAD20是 802(76.89) 294(84.24) 16(88.89) 0.0084

否 259(23.11) 63(15.76)2 (11.11)

CAD50是 692(66.35) 260(74.50) 15(83.33) 0.0071

否 369(33.65) 97(25.50) 3(16.67)

图4：包括致混淆因(逻辑回归)的LURIC队列中CLEC1B蛋白的位置24上的(Ser→Pro)多态性对具有20％或更大的狭窄的冠状动脉疾病的影响的分析。CAD20＝20％或更大的可见狭窄，CAD50＝50％或更大的可见狭窄。

CLEC1B Ser→Pro多态性 0.0026 1.610(1.181-2.198)

性别＜0.0001 2.584(1.908-3.497)

II型糖尿病(^＊) ＜0.0001 2.198(1.577-3.058)

吸烟者状态 0.0005 1.695(1.258-2.283)

高血压(^＊＊) ＜0.0001 2.273(1.721-2.994)

表5：包括致混淆因子(逻辑回归)的LURIC队列中CLEC1B蛋白的位置24上的(Ser→Pro)多态性对具有50％或更大的狭窄的冠状动脉疾病的影响的分析。CAD20＝20％或更大的可见狭窄，CAD50＝50％或更大的可见狭窄。

CLEC1B Ser→Pro多态性 0.0021 1.499(1.152-1.942)

性别＜0.0001 2.639(2.012-3.448)

II型糖尿病(^＊) ＜0.0001 1.812(1.379-2.381)

吸烟者状态＜0.0001 1.764(1.355-2.294)

高血压(^＊＊) ＜0.0001 1.603(1.256-2.041)

序列表

<110>塞诺菲-安万特股份有限公司

<120>CLEC1B用于鉴定心血管和血栓形成风险的用途

<130>DE2007/042

<160>5

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>963

<212>DNA

<213>人

<400>1

ctatgaagaa gcttcctgga aaacaataag caaaggaaaa caaatgtgtc ccatctcaca 60

tggttctacc ctactaaaga caggaagatc ataaactgac agatactgaa attgtaagag 120

ttggaaacta cattttgcaa agtcattgaa ctctgagctc agttgcagta ctcgggaagc 180

catgcaggat gaagatggat acatcacctt aaatattaaa actcggaaac cagctctcgt 240

ctccgttggc cctgcatcct cctcctggtg gcgtgtgatg gctttgattc tgctgatcct 300

gtgcgtgggg atggttgtcg ggctggtggc tctggggatt tggtctgtca tgcagcgcaa 360

ttacctacaa gatgagaatg aaaatcgcac aggaactctg caacaattag caaagcgctt 420

ctgtcaatat gtggtaaaac aatcagaact aaagggcact ttcaaaggtc ataaatgcag 480

cccctgtgac acaaactgga gatattatgg agatagctgc tatgggttct tcaggcacaa 540

cttaacatgg gaagagagta agcagtactg cactgacatg aatgctactc tcctgaagat 600

tgacaaccgg aacattgtgg agtacatcaa agccaggact catttaattc gttgggtcgg 660

attatctcgc cagaagtcga atgaggtctg gaagtgggag gatggctcgg ttatctcaga 720

aaatatgttt gagtttttgg aagatggaaa aggaaatatg aattgtgctt attttcataa 780

tgggaaaatg caccctacct tctgtgagaa caaacattat ttaatgtgtg agaggaaggc 840

tggcatgacc aaggtggacc aactacctta atgcaaagag gtggacagga taacacagat 900

aagggcttta ttgtacaata aaagatatgt atgaatgcat cagtagctga aaaaaaaaaa 960

aaa 963

<210>2

<211>229

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Ile Thr Leu Asn Ile Lys Thr Arg Lys

1 5 10 15

Pro Ala Leu Val Ser Val Gly Pro Ala Ser Ser Ser Trp Trp Arg Val

20 25 30

Met Ala Leu Ile Leu Leu Ile Leu Cys Val Gly Met Val Val Gly Leu

35 40 45

Val Ala Leu Gly Ile Trp Ser Val Met Gln Arg Asn Tyr Leu Gln Asp

50 55 60

Glu Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu Gln Gln Leu Ala Lys Arg Phe

65 70 75 80

Cys Gln Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly

85 90 95

His Lys Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser

100 105 110

Cys Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu Ser Lys Gln

115 120 125

Tyr Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys Ile Asp Asn Arg Asn

130 135 140

Ile Val Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His Leu Ile Arg Trp Val Gly

145 150 155 160

Leu Ser Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp Lys Trp Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Ile Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn

180 185 190

Met Asn Cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Phe Cys

195 200 205

Glu Asn Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys

210 215 220

Val Asp Gln Leu Pro

225

<210>3

<211>401

<212>DNA

<213>人

<400>3

agaatggatg tatggtatag gggtgggcca tgcctattgt tgatgatcat gaggagaaca 60

caggtgagat ctgccagcaa agctctttct attacttgga ggaccctgag aaggcagggg 120

caggggcagg ggtgagcctt ccccatagct aacccatact gcctgctcct tgatgtcttt 180

attatatgcc tacagttggc yctgcatcct cctcctggtg gcgtgtgatg gctttgattc 240

tgctgatcct gtgcgtgggg atggttgtcg ggctggtggc tctggggatt tggtgtaagt 300

gttgactctg ccagaaattt gactggagga aggtaatact gaagggtcat ggcatatccc 360

actaagcttc tcaatggtcg ctatttgtct gtttatcact t 401

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>4

tgcctgctcc ttgatgtctt tatt 24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>5

tcagcagaat caaagccatc aca 23

Claims

1.一个或多个CLEC1B单核苷酸多态性(SNP)或蛋白质多态性的用途，用于在采自待检查的个体的生物样品中鉴定心血管和/或血栓形成病症或增加的发生心血管和/或血栓形成病症的风险。

2.CLEC1B蛋白或核酸或其功能性片段的用途，其用于在采自待检查的个体的生物样品中鉴定心血管和/或血栓形成病症或增加的发生心血管和/或血栓形成病症的风险。

3.用于在个体中鉴定心血管和/或血栓形成病症或增加的发生心血管和/或血栓形成病症的风险的方法，其包括就下列方面检查采自个体的样品

a)存在于CLEC1B基因的一个或两个等位基因上的位置250(根据NM_016509)上的核苷酸的类型，存在于所述位置上的核苷酸的类型表示所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险；或

b)存在于CLEC1B蛋白的多肽链的位置24(根据NP_057593)上的氨基酸的类型，存在于所述位置上的氨基酸的类型表示所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险；或

c)存在于所述样品中的CLEC1B mRNA和/或蛋白质的量是否与一个或多个参照样品中的CLEC1B mRNA和/或蛋白质的量不同，不同的量的存在表示增加的患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险。

4.确定患有心血管和/或血栓形成病症的风险的方法，该方法包括就一个或多个上述SNP或蛋白质多态性的存在分析个体的分离样品，并且基于年龄和存在于CLEC1B基因的位置250上或CLEC1B蛋白的位置24上的核苷酸或氨基酸的类型计算估计的风险。

5.CLEC1B单核苷酸多态性(SNP)或蛋白质多态性用于使药物的剂量适合心血管和/或血栓形成病症的预防和/或治疗的用途。

6.CLEC1B蛋白或核酸或其功能性片段用于使药物的剂量适合心血管和/或血栓形成病症的预防和/或治疗的用途。

7.使药物的剂量适合个体中心血管和/或血栓形成病症的预防和/或治疗的方法，该方法包括就下列方面检查取自个体的样品

a)存在于CLEC1B基因的一个或两个等位基因上的位置250上的核苷酸的类型，所述适合的剂量依赖于存在于一个或多个所述位置上的核苷酸的类型；或

b)存在于CLEC1B蛋白中的位置250上的氨基酸的类型，所述适合的剂量依赖于存在于一个或两个所述位置上的氨基酸的类型；或

c)存在于所述样品中的CLEC1B mRNA和/或蛋白质的量是否与一个或多个采集的参照样品中的CLEC1B mRNA和/或蛋白质的量不同，所述适合的剂量依赖于采集的个体的样品中的蛋白质和/或mRNA的量是否与一个或多个参照样品的蛋白质和/或mRNA的量不同。

8.一个或多个CLEC1B单核苷酸多态性(SNP)或蛋白质多态性用于鉴定响应用于心血管和/或血栓形成病症的治疗和/或预防的药物的个体的用途。

9.CLEC1B蛋白或核酸或其片段用于鉴定响应用于心血管和/或血栓形成病症的治疗和/或预防的药物的个体的用途。

10.CLEC1B蛋白或核酸或其功能性片段或衍生物用于鉴定在心血管和/或血栓形成病症的治疗和/或预防中具有活性的物质的用途。

11.用于检测CLEC1B的工具的用途，所述工具用于通过分析采自待检查的个体的身体的生物样品来诊断心血管和/或血栓形成病症或对心血管和/或血栓形成病症的潜在敏感性。

12.用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，该方法包括：

a)将CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物与受试物质接触；和

b)确定所述受试物质是否调节CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的活性。

13.用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，该方法包括：

a)将具有可检测量或活性的CLEC1B或其功能性片段或衍生物的细胞与受试物质接触；

b)确定所述受试物质是否能够调节存在于所述细胞中的CLEC1B或其功能性片段或衍生物的量或活性。

14.用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，该方法包括：

a)将编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的核酸与受试物质在转录活性系统中接触；

b)测定在所述物质存在的情况下存在于所述系统中的编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的mRNA的量；

c)测定在所述物质不存在的情况下存在于所述系统中的编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的mRNA的量；

d)确定所述物质是否能够调节存在于所述系统中的编码CLEC1B蛋白或其功能性片段或衍生物的mRNA的量。

15.用于鉴定在预防或治疗心血管和/或血栓形成病症中具有活性的物质的方法，该方法包括：

a)提供用核酸载体转染的细胞，所述核酸载体含有与报告基因或其功能性片段有效连接的CLEC1B基因或其功能性片段的启动子；

b)提供用对照载体转染的细胞，所述对照载体含有不与功能性CLEC1B启动子有效连接的报告基因或其功能性片段；

c)测定在受试物质存在的情况下根据a)和b)的细胞的报告基因的活性；

d)测定在受试物质不存在的情况下根据a)和b)的细胞的报告基因的活性。

16.用于诊断心血管和/或血栓形成病症或对心血管和/或血栓形成病症的潜在易感性的检测试剂盒，该检测试剂盒包含至少一种用于在生物样品中检测CLEC1B的工具。

17.权利要求3或7中所述的方法，所述方法包括就CLEC1B基因的一个或两个等位基因是否具有下列基因组变体而检查采集的样品：CLEC1B基因序列的位置250上的胞苷；在根据权利要求3的方法中一个或多个所述变体的存在表示增加的风险，以及在根据权利要求7的方法中在一个或多个所述基因组变体存在的情况下药物的剂量是适合的。

18.权利要求3或7中所述的方法，所述方法包括就采集的样品是否含有具有下列蛋白质变体的CLEC1B蛋白检查采集的样品：CLEC1B蛋白的位置24上的脯氨酸；在根据权利要求3的方法中，所述变体的存在表示增加的所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险，以及在根据权利要求7的方法中，在一个或多个所述基因组变体存在的情况下，药物的剂量是适合的。

19.权利要求3或7中所述的方法，所述方法包括就CLEC1B基因的一个或两个等位基因是否具有下列基因组变体检查采集的样品：CLEC1B基因的一个或两个等位基因上的CLEC1B序列(根据NM_16509)的位置250上的除胞苷，优选胸苷外的核苷酸，在根据权利要求3的方法中，所述变体的存在表示所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险降低，以及在根据权利要求7的方法中在一个或多个所述基因组变体存在的情况下药物的剂量是适合的。

20.权利要求3或7中所述的方法，所述方法包括就采集的样品是否包含具有一个或两个下列蛋白质变体的CLEC1B蛋白检查所述样品：CLEC1B蛋白(根据NP_057593)的位置24上的除脯氨酸，优选丝氨酸外的氨基酸，在根据权利要求3的方法中，一个或两个所述变体的存在表示所述个体患有或发生心血管和/或血栓形成病症的风险降低，以及在根据权利要求7的方法中在一个或多个所述基因组变体存在的情况下药物的剂量是适合的。

21.根据前述权利要求的任一项的用途、方法或检测试剂盒，其中CLEC1B是哺乳动物的，优选人的CLEC1B。

22.根据前述权利要求的任一项的用途、方法或检测试剂盒，其中心血管和/或血栓形成病症是心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌梗塞、早发心肌梗塞、外周血管病症、冠心病、高血压、中风、PRIND、TIA或必须采取冠状动脉血管成形术的病症。

23.前述权利要求的任一项中所述的用途、方法或检测试剂盒，包括分析采集的个体的样品，其中其被采集的样品被检查的个体具有葡萄糖代谢病症，优选患有糖尿病，特别优选患有I型糖尿病。

24.如前述权利要求的任一项中所述的用途、方法或检测试剂盒，其中其被采集的样品被检查的个体患有心血管和/或血栓形成病症。

25.前述权利要求的任一项中所述的用途、方法或检测试剂盒，其中所述样品是哺乳动物的，优选人的样品。

26.前述权利要求的任一项中所述的用途、方法或检测试剂盒，其中所述样品是组织学样品、活组织检查样品、细胞提取物、一个或多个细胞或采集的体液。

27.根据前述权利要求1至11的任一项的用途或方法，其中CLEC1B用作分离的分子。

28.权利要求1、2、5或8的一项的用途，其中分析CLEC1B基因(根据NM_016509)的位置250上的一个或多个SNP。

29.权利要求6、9或10的一项的用途，其中所述核酸在CLEC1B基因(根据NM_016509)的位置250上含有SNP。

30.权利要求24或25的一项的用途或方法，其中所述SNP是：CLEC1B基因(根据NM_016509)的一个或两个等位基因上的CLEC1B序列的位置250上的胞苷。

31.权利要求1、2或4至6的用途或权利要求3的方法，其中一个或两个下列蛋白质多态性的鉴定表示疾病或增加的风险：CLEC1B蛋白(根据NP_057593)的位置24上的脯氨酸。

32.权利要求1、2、6或8至11的一项中所述的用途或如权利要求3、7、14或17的任一项中所述的方法，其中CLEC1B基因(根据NM_016509)中位置250上的核苷酸的类型利用一个或多个适当的引物或探针来确定。

33.权利要求30中所述的用途或方法，其中核苷酸的类型利用PCR、Southern印迹法、阵列或芯片杂交来确定。

34.权利要求11的用途或权利要求12的检测试剂盒，其中用于检测的工具是用于检测CLEC1B DNA的工具。

35.权利要求30的用途或检测试剂盒，其中所述工具是引物或引物组、适当的探针或序列特异性抗DNA抗体。

36.权利要求2、6、8或9的一项的用途或权利要求3或7中所述的方法，其中优选使用用于CLEC1B cDNA的扩增的一个或多个适当引物或适合于在标准条件下与CLEC1B cDNA或mRNA杂交的一个或多个探针分析mRNA的量的变化。

37.权利要求33的用途或方法，其中利用PCR、Northern印迹法、阵列或芯片杂交分析mRNA的量。

38.权利要求11中所述的用途或权利要求12中所述的检测试剂盒，其中用于检测的工具是用于检测存在于生物样品中的CLEC1B mRNA和/或蛋白质的工具。

39.权利要求35中所述的用途或检测试剂盒，其中用于检测CLEC1B蛋白的工具是抗体。

40.权利要求2、6、8或9的用途或权利要求3或7的方法，其中测定CLEC1B蛋白的量的变化。

41.权利要求1、6或37的一项的用途或方法，其中所述蛋白质借助于至少一种抗体来检测。

42.权利要求38中所述的用途、方法或检测试剂盒，其中利用ELISA、Western印迹或蛋白质芯片进行所述检测。

43.权利要求37或38中所述的用途、方法或检测试剂盒，其中利用免疫组织化学或免疫放射化学检测法进行所述检测。

44.前述权利要求的任一项中所述的方法、用途或检测试剂盒，其中所述基因组CLEC1B核酸序列是如SEQ ID No.1或16中定义的序列，任选地关于CLEC1B基因序列(根据NM_016509)的位置250上的核苷酸具有偏差。

45.权利要求41中所述的方法、用途或检测试剂盒，其中所述序列具有一个或多个下列SNP：CLEC1B基因序列的位置250上的胞苷。

46.权利要求29至34的一项的方法、用途或检测试剂盒，其特征在于含有一个或两个如SEQ ID NOs：4和5中定义的序列的引物的引物组或如序列SEQ ID NO：3中定义的探针。

47.权利要求10的用途，其中所述CLEC1B核酸或其片段含有位置250并且优选还包含一个或多个下列SNP：CLEC1B基因序列的位置250(对于NM_016509而言)上的胞苷。

48.权利要求10的用途，其中使用CLEC1B蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段含有氨基酸位置25并且含有下列蛋白质多态性：CLEC1B蛋白质的位置25上的脯氨酸。

49.具有根据SEQ ID NO：4或5的核酸序列的核酸引物。

50.具有根据SEQ ID NO：3的核酸序列的核酸探针。