TW200902063A - Therapeutic agent comprising antibody capable of specifically binding to human hmgb-1 as active ingredient - Google Patents

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200902063 . 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用於類澱粉變性（AMYLOIDOSIS)治 療劑，含有抗HMG.B-1抗體作為有效成分。 【先前技術】 高移動性群匣蛋白質（High Mobility Group

Protein; HMGB 或 High Mobility Group Protein; HMG〕 於1 964年被發現為在染色質構造中所含大量之非組蛋白 蛋白貝。HMGB為所有高等動植物中普遍含有之蛋白質，在 種私間初級構造之保守性極高。又，已知不僅存在於核内， 在、，、田胞貝内亦存量豐富。HMG之正確生理作用尚不明之部 /刀仍多，但由於HMG與DMA結合時，會鬆開DNA之雙螺旋 構w因此，被涊為在轉錄反應時，具有使DNA之高次構 造變化為最適構造而提高轉錄活性之作為極廣範圍之轉錄 促進因子及核小體（NUCLE〇s〇ME)鬆弛因子的功能。 對於存在哪些種類之HMGB為明確的。例如，已知有^ 1性群E蛋白質—丨⑽GB_UHM㈠）、高移動性龍蛋 _ (HMGB 2或HMG-2)、高移動性群蛋白質一3(HMG —3)、 尚移動性群蛋白質—_G — 8)、高移動性群蛋白質 17(:G-17)、高移動性群蛋白質-I(HMG-I)、高移動性群 員Υ⑽G —Y)、高移動性群蛋白質- I(Y)(HMG—I(Y))、 南移動性群蛋白質I-C(HMG I-C)等。 本案發明人等使用遺傳資訊處理軟體「服Τγχ」 2125~9415-PF；Kai 5 200902063 (SOFTWARE DEVELOPMENT公司）解析胺基酸序列之相同性， 結果發現·牛HMGB—1相對於人類HMGB-1，相同性為98. 6%， 豬HMGB-1相對於人類HMGB-1，相同性為99.1%。又，人類 HMGB 2相對於人類HMGB-1，相同性為81. 2%，牛HMGB-2 相對於人類，相同性為72· 3%，豬腿相對於人 類HMGB-1，相同性為79· 4%。

Wang等人於1999年，藉由使用了以HMGB-1自體作為 免疫原所製備之多株抗體的西方點墨法，首次對於血清中 (一血液中）之跗⑼―1實施定量測定。其結果，Wang等人顯 不HMGB 1可成為敗血症之標記。並且，於敗血症患者中， 可猎由精密地測定血液中之龍⑶]，而判別出生存下來之 患者及最後會死亡之患者。亦即，㈣等人敘述將此對抗 刪―1之抗體對於敗血症模型小鼠投予時’與未投予抗體 之敗血症槿，丨、_ u 、j鼠比較，生存率大幅改善。此暗示了， 嶋-!不僅是單純敗灰症標記，而以作為原因物質相關， 亦即’可迠作為HMGB—!之中介子。於今曰對敗血症尚盈關 鍵治療法之下，此發現非常重要（非專利文獻D。 p 有文獻發表：咖―1在發炎時亦會誘導，被認 疋、’ ’田胞介素大量分泌之原因#，有許多資料去拉 有〇貝科支持 療之橾靶（非專利文獻2〜4)。此情事，不 僮疋確έ忍血液φ ， 在量… 存在’亦充分顯示將順]存 在里“測定且抑制_-1工力能可能為有益的。 HMGB =-本案發明人等發現當於活體試樣中檢測到 會同時亦檢測到刪_2(非專利文獻5)。又， 2125-9415-PF；Kai 6 200902063 發現HMGB-i與HMGB-2雖相同性高（812%)，但是HMGB 2 並沒有像HMGB-1的作為疾病中介劑的作用（非專利文獻 6)。所以’在不受HMGB-2影塑之下，直 以 心曰i卜，專—性測定或抑制 HMGB-1非常重要。 於測定血液中Η M G B - i濃度時，及作為治療標靶而抑制 HMGB-1活牲時，抗體為非常有用的工具。然而，欲得到不 與HMGB-2結合而與HMGB-1專一性結合，且對於Η·Β —〗親 和性高之抗體並不容易。 其理由不僅是HMGB-1與HMGB-2的相同性非常高。通 常，製備對抗目的抗原之抗體時，係將目的抗原對於容易 飼育的動物（豬、兔、山羊、羊、小鼠、大鼠等）進行免疫。 通¥ 免疫日寸’為了誘導親和性良好之抗體，會使用佐劑 等實施許多工夫。但是會因此而誘導發炎反應，進一步在 動物體内誘導HMGB-1。此會對於接受免疫之動物造成非常 大的負荷。 又’ HMGB-1跨種之同源性非常高之現象，亦是使得到 抗人類HMGB-1抗體變困難。亦即，以人類為中心考量時， 緒、牛、山羊、羊、小鼠、大鼠之HMGB-1之初級構造在胺 基酸層級僅有2 - 3個殘基不同（非專利文獻7)。因此，將 人類HMGB-1對於此等動物免疫時，所誘導之高親和性抗 體，會被接受免疫之動物所誘導之HMGB-1吸收。結果使實 際得到之抗體為親和性低、品質差的抗體。 又’免疫動物之個體差異，亦為得到抗體之一大考量 點《本案發明人等之經驗為，實際探討HMGB-1時，.由於個 2125-9415-PF;Kai 7 200902063 _ 體差異，在5隻兔子中，僅能從1隻兔得到有用抗體。且 此現象常發生。 以下為本發明之先前技術文獻。 【非專利文獻1】H. Wang等人，SCIENCE ’ 285; 248〜 251 :1 999 【非專利文獻 2】Andersson, U 等人J· Exp. Med，192， 565-570, 2000 【非專利文獻 3】Scaffidi 等人，Nature, 418，191-195， 2002 【非專利文獻 4】Park 等人，The Journal of Biological Chemistry, 279;27:2004 【非專利文獻 5】Shingo_ Y. Cl ini Chem，9，1535-37，2003 【非專利文獻 6】Ueno_ H. Am J Respir Crii: Car Med 2004 【非專利文獻 7】L. Wen. Nucleic Acids Research. 17， 1197-1214, 1989 【非專利文獻 8】H. J. Lachmann and P. N. Hawkins，Curr· 〇Pin Pharmacol·， 6， 214-20， 2006 【發明内容】 【發明欲解決之問題】 本發明之課題在於提供一種類澱粉變性（amyl〇id〇sis) 之新治療劑，含有抗HMGB — i抗體作為有效成分。 【解決問題之方法】 本案發明人等努力研究的結果，發現抗丽⑶—丨抗體對 2l25-9415-PF;Kai 8 200902063 特定疾病為有效，乃完成本發明。更具體而言，本 含以下發明。 匕 ⑴-種類澱粉變性治療齊丨，含有抗高移動性群 質khmgb-d抗體作為有效成分。 蛋白

(2)如(1)之治療劑’其中’類澱粉變性為 粉變性。 注頰爲I ⑻如(2)之治療劑，其中，全身性類澱粉變二4 性全身性類澱粉變性。 ~ -人 (4) 如（1)至（3)中任一項之治療劑，盆中 抗體與!之結合強於與高移動性〜 2(HMGB-2)之結合。 蛋白質 (5) 如⑴至⑻中任一項之治療劑，其中 抗體不結合於HMGB-2。 ^ HMGB-j ⑻如⑴至⑸中任一項之治療劑，其 抗體認識具序列編號：1之胺基酸序列的部分胜肽' GB] (7) —種類澱粉變性之治療 。 口康万法，包含對於受 抗高移動性群ϋ蛋白質咖㈣）抗體之步驟。者奴予 (8) 如（7)之類澱粉變性之治療方法，^ a , 性為全身性類澱粉變性。 /、 ’類题粉變 (9) 如（8)之類澱粉變性之治療方法，其 澱粉變性為二次性全身性類澱粉變性^中，全身性類 U(0如⑺至⑼中任一項之類殿粉變性 其中，抗MGB-l抗體與hmgbj 縈方法， 丄之結合強於與汽狡去 匣蛋白質2(HMGB-2)之結合。 阿移勤性群 2125-9415-PF;Kai 9 200902063 (11)如（7 )至（9 )中任一項之類澱粉變性之治療方法， 其中，抗HMGB-1抗體不結合至HMGB-2。 (1 2)如（7 )至（11)中任一項之類澱粉變性之治療方 法，其中，抗HMGB-1抗體認識具序列編號：1之胺基酸序 列的部分胜肽。 (13) —種抗高移動性群匣蛋白質khmgb — d抗體之用 途，用在製造類澱粉變性治療劑。 (14) 如（13)之抗高移動性群匣蛋白質1(HMGB—丨）抗體 之用途，其中，類澱粉變性為全身性類澱粉變性。 (15) 如（14)之抗高移動性群匣蛋白質κημβμ)抗體 之用途，其中，全身性類殿粉變性為二次性全身性類澱粉 變性。 (16) 如（13)至（15)中任一項之抗高移動性群匣蛋白質 l(HMGB-l)抗體之用途，其中，抗HMGB —j抗體與腿⑶―^之 結合強於與高移動性群匣蛋白質2(HMGB_2)之結合。 (17) 如（13)至（15)中任—項之抗高移動性群匣蛋白質 l(HMGB-l)抗體之用途，其中，抗ΗΜΜ]抗體不結合至 HMGB-2 。 。 (18)如（13)至（1 7)中任— 項之抗1¾移動性群昆蛋白

1 (HMGB-1)抗體之用 編號：1之胺基酸序 途，其中，抗HMGB-1抗體認識具序列 列的部分胜肽。 【實施方式】 [實施發明之形態] 2125-9415-PF；Kai 10 200902063 現 性 ，知本發明，提供類;殿粉變性之新治療劑。本發明發 猎由投予對抗HMGB-1之抗體，可預防或治療類澱粉變 本發明使用之抗HMGBj抗體只要是結合於龍⑶—工， 且對於類殿粉變性之治療具效果即不特別限^，不限其來 '、:員彳乳、大既、兔、雞等）、種類（多株抗體、單株 杬m )形狀（改變抗體、修飾抗體、抗體片段、低分子化 抗體專）同種型（is〇type)(IgG、IgM等）等。 本發明使用之抗體之較佳態樣之一，例如：相較於結 合於刪~2£強力結合於刪—1之抗體。尤佳抗體，例 如：相較於結合於人類HMGB_2更強力結合於人類關⑶一】 之抗體。本發明中，相較於結合於HMGB — 2更強力結合於 HMGB-1，係指抗體對於HMGB_丨之結合活性大於對於hmgb — 2 之結合活性。對於肌⑶—丨之結合活性只要大於對於hmgb_2 之結合活性，則結合活性之差異不特別限定，較佳為對於 HMGB-1之結合活性大於對於HMGB—2之結合活性的2倍以 上，更佳為對於HMGB-1之結合活性大於對於HMGB_2之結 合活性5倍以上，再者較佳為對於— i之結合活性大於 對於HMGB-2之結合活性1 〇倍以上。 抗體對於HMGB-1或HMGB —2之結合，可利用該技術領 域之人士所公知之方法，例如ELISA、BIAC0RE、西方點墨、 流動細胞計數法等檢測。又，抗體之結合活性可利用 E LIS A、BIA C 0 R E專該技術領域之人士公知的方法測定。 又本兔明使用抗體之較佳態樣之一，例如：與腿g b — 1 2125-9415-PF;Kai 200902063 .結合但不與HMGB-2結合之抗體。尤佳之抗體，例如與人類 HMGB-1結合但不與人類HMGB-2結合之抗體。本發明中， 不與HMGB-2結合，係指抗HMGB-1抗體與HMGB_2之結合實 貝上檢測不到。抗腿⑶―；！抗體是否與MGB_2結合，可以 利用西方點墨、ELISA等通常方法確認。 再者，本發明使用抗體之較佳態樣之―’例如對於 HMGB-1具中和活性之抗體。對於HMGB1具中和活性之抗 體，可能妨礙HMGB-1與其受器之結合。抗體之中和活性= 利用該技術領域之人士公知之方法確認，例如可以e l〗s A、 BIACORE等確認。 本發明使用之抗HMGB-1抗體，可使用公知方法以多株 抗體或單株抗體形式得到。例如，藉由對於動物將抗原免 疫可製備。 作為免疫原之HMGB-1不特別限定，可使用構成hmgb—j 之蛋白貝王體，或該蛋白質之部分胜肽等。又，可使hmGb_i 蛋白質或其部分胜肽與其他分子結合，亦可使冊⑼—丨之部 分序列（胜肽）結合於適當擔體而作為免疫原。又，視需要， 可將該抗原表現於細胞表面上之細胞作為免疫原。像此種 細胞，可為天然（腫瘤細胞株等）來源之細胞，或藉由重組 技術而表現抗原分子之細胞。 將動物免疫之抗原，例如：具免疫原性之完全抗原， 及不具免疫原性之不完全抗原（包含半抗原），本發明使用 之抗體之取何時可使用任一種。 HMGB-1蛋白質或其部分胜肽可利用公知方法取得，例 2125-9415-PF;Kai 12 200902063 如HMGB-1仉人類胸腺、豬胸腺、牛胸冑、人類胎盤、嗜中 !·生球HL 60細胞株等取得之方法為公知（η η &丄. Biochem Biophy Acta (1975) 405: 280-91; Yoshida M et al., J Biochem ( 1 980) 95： n7-24; Adachi Y et al j Chr〇matogr ( 1 992) 53〇: 39_46)。又，牛 hmgbh 及牛聰gb_2 之混合物由於和光純藥工業公司有販售，因此，亦可從其 中僅將牛HMGB-1精製並取得。 又’編碼為人類、牛、豬、兔、小鼠、大鼠等之HMGB-1 的基因為公知，亦可依據此等之基因資訊，以基因工程的 手法得到成為抗原之HMGB—丨。例如，人類龍⑶^之胺基 酸序列’ 4 GenBank ACcessic)n Nq.阶—⑽㈣，編碼為 此序列之核芽酸序列，公開為GenBank Accessi〇n n〇 ΝΜ」02128。將依此方式取得之各種動物來源乂刪」， 可作為用以得到本發明使用之抗體的抗原（免疫原）。 用以製作本發明使用之抗體之免疫原較佳例，例如： 包含在HMGB-1與HMGB-2之間相同性低之祖B—i來源之胺 基酸序列的胜肽。X，成為免疫原之胜肽，較佳為含高親 水性之胺基酸序列。原因為，親水性愈高，則其胺基酸序 列存在於HMGB-1分子表面之可能性高，因此其作為免疫原 產生之抗體能與HMGB-丨結合之可能性亦高。本發明中，構 成免疫原之各胺基酸殘基之親水性高低之推定，可利用 H〇PP 等人之方法(Τ.Ρ·Ηορρ et al·，Pr〇c 心“㈣ w USAU即78:襲-_Parker等人之方法心如以 al.，Biochemistry ( 1 986) 25: 5425-32)等進行。 2125-9415-PF;Kai 13 200902063 因此’就可用於製作本發明使用之抗體之免疫原的尤 佳例而言’例如：HMGB-1與HMGB-2之間相同性低且含高 親水性之HMGB-1來源之胺基酸序列的胜肽。.ΜΗ與 HMGB-2之間相同性低且含高親水性之hMGB_i來源之胺基 酸序列的胜肽’例如可利用實施例丨之方法等決定。 HMGB-1與HMGB-2之間相同性低且含高親水性之 HMGB-1來源之胺基酸序列的胜肽之具體例，例如”人類 HMGB-1之第167號之胺基酸殘基（離胺酸）至第ι8〇號之胺 基酸殘基（離胺酸）的「LyS Pr〇 Asp Ala Ala Lys Lys Gly

Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列編號：i)。 以感作抗原對動物免疫，可利用公知方法實施 方法，例如：將感作抗原注射到動物腹腔内或皮下。具靡 而=，將感作抗原以PBS、生理食鹽水等適當量稀釋、懸 浮後，於I中視需要適量混合通常之佐冑，例如佛洛依德 完全佐劑並乳化後，每4〜21日對於動物投予數次。又， 感作抗原免疫時’亦可使用適當擔體。依此方式將動物免 Μ認血清中所望之上升抗體水平後，當目的為取得 單株抗體時，從該動物採取免疫細胞，並施以細胞融合， 製作成融合瘤。免疫之動物，例如可使用小鼠、大鼠、倉 既、雞或怪河猴（Macaca mulatta)等。 與HMGB-1結合之多株抗體或單株抗體，例如可利用以 下記載之方法取得。 多株抗體.抗血清 可利用以下 對抗HMGB-1之多株抗體或抗血清之取得 2125-9415-PF;Kai 14 200902063 操作取得。 首先’以前述免疫原’或前述免疫原與擔體之結合物， 將哺礼動物（小鼠、兔、大鼠、羊、.山羊、馬等）或鳥類等 免疫。HMGB-1之情形，1)將動物免疫本身，會在免疫動物 引表強烈發炎，並於血液中誘導HMGB-1，及2)HMGB-1之 種間同源性非常高，所誘導之抗HMGB-1抗體會被發炎而誘 ‘出來的HMGB-1吸收，最終得到之抗血清中與目的jjmgbh 之親和性高的抗體減少，會僅留下親和性弱的抗體，考慮 此等因素，較佳為以雞等鳥類作為免疫動物。雞題队^由 於與人類HMGB-1的同源性低（胺基酸序列中有76%之相同 性），因此以取得對抗人類之抗體為目的時，能避 免上述現象。 該前述免疫原，或前述免疫原與擔體之結合物的免疫 量，可視免疫動物種類、免疫注射部位等而決定，但小鼠 之情形，約5〜10週齡之小鼠每隻每次注射〇1#g〜數 吨、較佳為5 ^ g〜lmg之前述免疫原，或前述免疫原與擔 體之結合物。又，兔之情形，兔每隻每次注射1〇#g〜數 十岬、雞之情形雞每隻每次注射0.1//g〜數十mg之前述 免疫原或前述免疫原與擔體之結合物。又，該前述免疫原， 或4述免疫原與擔體之結合物，以添加佐劑並混合後注射 車乂铨。佐劑可使用佛洛依德完全佐劑、佛洛依德不完全佐 劑、氫氧化鋁佐劑或百日咳菌佐劑等公知物。注射可以皮 下（腹部皮下、背部皮下、腳墊等）、靜脈内、腹腔内等實 施。 2125-9415-PF；Kai 15 200902063 初次免疫後，以2〜3週間隔於皮下（腹部皮下、背部 皮：、腳1等)、靜脈内、腹腔内等，追加注射前述免疫原， 或前述免疫原與擔體之結合物。此情形中，#以將前述免 疫原或岫述免疫原與擔體之結合物與佐劑添加混合後追 加注射較佳。初次免疫之後，以EUSA法等反複測定免疫 動物於血清中之抗體價’ 一般而t，於抗體價達到穩定高 值’則進行全採血，將血清分離而得到含本發明使用之抗 體的抗血清。 從此抗血清’以利用硫酸銨、硫酸鈉等之鹽析法、離 子交換層析、凝膠過遽法或親和性層析等方法，或將此等 方法組合而進行抗體精製，得到多株抗體。 在此得到之多株抗體，係由與簡⑶—丨結合但不與 HMGB-2結合之多株抗體，及會與HMGB-1及hmgb_2中任一 者都結合之多株抗體兩方所構成。將此等通過以hmgb_2作 為配體而固定化於固相之親和性層析管柱，能將與腿Η 結合但不與隱-2結合之多株抗體，及會與刪」及 隱2中任一者都結合之多株抗體分離。會與HMGH及 HMGB-2巾任一者都結合之多株抗體，藉由此管柱之配體 (觀-2)而結合於„並被捕捉收集。另—方面，與顯—i 結合但不键B_2結合之多株抗體，+會與此管柱之配體 (HMGB-2)結合而直接通過管柱’因此，藉由取得直接通過 之分部，能得到會與人類雛結合值不與人類霞Η 結合之多株抗體。 又 使用免疫原與擔體之結合物對動物免疫時 由於 2125-9415-PF；Kai 16 200902063 仔到之抗血清或多株抗體中存在對抗此擔體之抗體，因 此κ圭為實施冑此種對抗擔體之抗體除去之處理。除去 處理方法可採用：將擔體添加於所得到多株抗體或抗血清 之溶液中’並將產生之凝集物除去，或將擔體固定於不溶 性固相’以親和性層析除去之方法等。 單株抗體 單株抗體可利用K〇ehler等人之細胞融合法（K〇ehler G et a1.，NatUre ( 1 975) 256: 495-7)得到之融合瘤、或

Epsteln-Barr病毒等病毒得到之腫瘤細胞等抗體產生細胞 而得。 例如，利用細胞融合法製備單株抗體時，可利用以下 操作進行。首先，將前述免疫原，或前述免疫原與㈣之 結合物，對於哺乳動物（小鼠、裸小鼠、大鼠等，例如近交 系二鼠之BALB/c)或鳥類（雞等）等免疫。此前述免疫原、 或料免疫原與擔體之結合物之免疫量，可依照免疫動物 種類、免疫注射部位等適當決定，例如於小氣之情形，每 隻每次注射D.bg〜5mg、雞之情形每隻每次注射〇⑹ 〜數十Μ之前述免疫原或前述免疫原與擔體之結合物較 佳。又，該前述免疫原，或前述免疫原與擔體之結合物， 以添加佐劑並混合後注射較佳。佐劑可使用佛洛依德完全 佐劑、佛洛依德不完全佐劑、氮氧化铭佐劑或百日咳菌佐 劑專公知物。注射可以皮下(腹部皮下、背部皮下、腳塾 等）、靜脈内、腹腔内等實施。 初次免疫後，以1〜2週間隔於皮下(腹部皮下、背部 2125-9415-PF;Kai 17 200902063 皮下、腳墊等）、靜脈内、腹腔内等’追加注射前述免疫原、 或前述免疫原與擔體之結合物。此追加注射之次數—般為 2〜6次。於此情形，亦將前述免疫原，或前述免疫原與:擔 體之結合物，添加佐劑混合並追加注射為較佳。 初次免疫之後’以ELISA法等反複測定免疫動物之血 清中之抗體價，一般而·r，於抗體價達到穩定高值，則將 前述免疫原或前述免疫原與擔體之結合物溶解於例如ρΒ§ 或生理食鹽水（〇·9%氯化鈉水溶液）者注射到靜脈内或腹腔 内’作為最終免疫。此最終免疫之3〜5曰後，取得免疫動 物之脾細胞、;林巴節細胞或末梢淋巴球等具抗體產生能力 之細胞。 使由該免疫動物所得具抗體產生能力之細胞與哺乳動 物等（小既裸小鼠、大鼠等）之骨髓瘤細胞（町細胞 融合。前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之融合，基本上可依據 公知方法例如Kc)hler及Milstein等人之方法及 MUstem，Methods £nzymol (1 981 ) 73: 3_46)等實施。 更具體而言’例如細胞融合’可使用細胞融合促進劑 實施。*融合促進劑，例如可使用聚乙二醇（pEG)、仙台病毒 (HVJ)等再者，視所望為提高融合效率，#可添加二甲基 亞颯等輔助劑。免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例，可以 〜地°又定例如，—般而言，對於骨髓瘤細胞將免疫細 胞定於1〜10倍較佳。使用於此等細胞之培養液，例如適 於骨髓瘤細胞株增殖之RPMI164(U^養液、MEM培養液等， 此外，可適當使用此種細胞培養通常使用之培養液。再者， 2125-9415-PF;Kai 18 200902063 亦可將胎牛血清⑽）等血液補液加至培養液t。將免疫，田 胞與既定量骨驗瘤細胞充分混合，將預先加溫至37t左右 ^ ’合液（例如平均分子量約1 000-6000 )以通常 6(U(w/v)之濃度添加並混合以實施細胞融合，使形成目 的融合細胞（融合瘤）。接著，將‘逐次添加適當培養液並離 心除去上清之操作反複實施，.以將對於融合瘤生長不佳之 細胞融合劑等除去。所形成之融合瘤，藉由以通常之選擇 培養液例如HAT培養液（含次黃嘌呤、胺基喋呤和胸腺嘧啶 之培養液）培養並選擇。以上述HAT培養液之培養，為了使 目的融合瘤以外之細胞（非融合細胞）死滅，需持續足夠時 間（通¥數日至數週間）。接著，實施通常之極限稀釋法或 使用έ甲基纖維素之半流動培養基的群落法等，進行產生 目的抗體之融合瘤篩選及單一選殖。 用於細胞融合之較佳免疫細胞，尤其例如脾臟細胞。 另一方面，與免疫細胞融合之母細胞，通常可使用哺乳動 物之骨髓瘤細胞。各種骨髓瘤細胞株可使用公知任一者。 例如可使用 P3(P3x63Ag8.653)(J Immunol (1979) 1 23: 1 548-50) ' P3x63Ag8U.l(Curr Topics Microbiol Immunol (1 978) 81: 1-7)、NS-1(Kohler 及 Mil stein，Eur J Immunol (1976)6: 511-9)'MPC-ll(Marguliesetal., Cell (1976) 8: 405-15) > SP2/0(Shulman et al., Nature (1978) 276: 269-70)'F0(deSt.Groth et al. , J Immunol Methods (1980) 35: 1-21) ' SI94(Trowbridge, J Exp Med (1978) 148: 313-23)'R210(Galfre et al. , Nature ( 1 979) 277 : 131-3) 2125-9415-PF;Kai 19 200902063 等。 將以此方式得到之融合瘤之 原、前述免疫原與擔體之 。，使用前述免疫 FJ r〇A .. , ,σ 口物、或人類腿GB-!箅，以 A法或西方點墨法等免疫學、 ^ a. ^ . 、疋法予以分析，可以邏 擇產生與人類Hmgb-1等結人 了以& 3人e 之抗體的融合瘤。又，脾义、+- I瘤之培養上清使用人類臆Μ 將別述 點墨法等免疫學測定法予 、用嶋法或西方 合於人類HMGB-2，更強社人於可以選擇產生相較於結 產生與人類 人广 j、’a 口但不與人類HMGB-2等結合之抗體 的融5瘤。此2種融合瘤選摞 m ^ Λ 璉擇方法與極限稀釋法或使用含 甲基纖維素之半流動培養 入 处 。香基之群洛法等公知選殖法方法組 己貝％ ’此將本發明使用之尤 抗耝（卓抹抗體），亦即斑 人類HMGB-1結合但不與人類 /、 頰HMGB —2結合之抗體（單株抗體） 的產生細胞株單離。依此古 早隹⑯此方式所製作之產生單株抗體的融 5瘤’可於通“養液中繼代培養，且能於液體氮中長期 保存。 ， 為了仗融合瘤取得單株抗體，例如將該融合瘤依照習 知方法培養，並以培養上清之形式得到單株抗體之方法。 或’在與融合瘤具適合性之動物腹㈣，&予融合瘤並使 增殖，從該動物產生之腹水得到單株抗體之方法亦可採 用。此時，可在動物之腹腔内預先投予降植烷（叩， 預先刺激。前者方法，適於得到高純度抗體，後者適於將 抗體簡易大量生產。 培養單株抗體產生細胞株而得抗體之情形，可將無血 20 2125-9415-PF;Kai 200902063 ’月坨養基、低》辰度血清培養基、或含經施以抗體除去處理 之血清的培養基等作為培養基使用。可理想地使用抗體之 精製較容易之DMEM、RPMI 1 640培養基或ASF培養基1〇3等 培養基。 又，亦可取代如上所述人類以外之動物以抗原免疫得 到融合瘤，而將人類淋巴球於體外以抗原感作，並使感作 淋巴球與人類來源之具永久分裂能力之骨髓瘤細胞融合， 而得產生所望人類抗體之融合瘤（參照日本特公平1 — 5 9 8 7 8 號公報）。再者，亦可對於具有人類抗體基因之全部或一部 分曲目（repertory)的基因轉殖動物投予抗原並取得抗體 產生細胞，使其不死化，並取得產生所望人類抗體之融合 瘤（參照㈣ 94/25585 號；W〇93/1 2227 號；ψ〇92/〇391δ 號； W094/02602 號等）。 抗體片段 本發明使用之抗HMGB-1抗體，只要是與腿⑶-丨結合 亚且對於類澱粉變性具治療效果者，則抗體片段或抗體修 飾物均可。抗體片段’包含：1^、1^、1?以，、1?(讣，）2、 雙功能抗體（diabody ; Db)、線狀抗體、單鏈鏈抗體（以下 亦記載為scFv)分子等。r Fv」片段為最小的抗體片段， 包含完全的抗原認識部位與結合部位。「Fv」片段為i個 重（H)鏈可變區域（Vh)及輕（L)鏈可變區域（Vl)以非共價鍵 強力連結之二聚體（V«-VL二聚體）。各可變區域之3個互補 性決定區域（compl㈣entarity determining regi〇n ; CDR) 彼此相互作用，並於VH-VL二聚體表面形成抗原結合部位。 2125-9415-PF;Kai 21 200902063 ‘利用6個CDR，形成抗體之抗原結合部位^然@，即使丄 個可變區域（或為僅含對抗原為專一性之3個c卯之一半

Fv)較全結合部位的親和性低，但仍認識抗原並具結合能 力。因此，僅含像這種Ϊ個可變區域或CDR之片段、僅含 3個CDR之一半以’只要與HMGB-1.結合並對於類澱粉變性 具治療效果，即能使用在本發明中。 又，Fab片段（亦稱為F(ab))更包含L鏈之不變區域及 Η鏈之不變區域（CH1)。Fab，片段（亦稱F(ab，））與片 段之不同點在於：加成了來自包含抗體之鉸鏈區域之】個 以上半胱胺酸之Η鏈CH1區域的羧基末端來源的數個殘 基。Fab’-SH片段（亦稱為F(ab’ ）_SH)代表不變區域之i 個以上半胱胺酸殘基具游離硫醇基之形態的Fab，片段。 F(ab’）2片段為2分子Fab’-SH片段經雙硫鍵結之抗體片 段。此等抗體片段之製作方法，具體而言，例如：將完全 分子之抗體以酵素例如木瓜酵素、胰蛋白酶處理並產生抗 體片段之方法，或構建編碼為抗體片段之基因，將其導入 表現載體後，以適當寄主細胞表現之方法（例如，c〇^Set al.，J I_UnoI ( 1 994) 1 52: 2968一76)。其他抗體片段， 為該技術領域之人士已知者尚有含化學鍵之抗體片段，此 等抗體亦能使用在本發明中。 雙功能抗體係指利用基因重組手法所構建之二價 (bivalent)抗體片段（Holliger p et al. (1993) pr〇c

Acad Sci USA 1 993, 90: 6444-8; EP404, 097 號. W093/ 1 1 1 6 1號等）。雙功能抗體為2條多胜肽鏈所構成之 2125-9415-PF;Kai 200902063 . 二聚體，多胜肽鏈分別、於同鏈中，抗體來源之L鏈可變 區域（VL)及Η鏈可變區域（VH)利用彼此無法結合程度之短 的例如5個殘基左右的連結子結合。被編碼在同一多胜肽 鍵上之VL及Vh，由於其之間的連結子短，不能形成單鏈可 變區域片段’而形成二聚體，因而雙功能抗體具2個抗原 結合部·位。 單鏈鏈抗體或scFv抗體片段包含抗體之Vh及Vl區 域，此等區域存在於單一多胜肽鍵中。一般而言，Fv多胜 肽尚於VH及VL區域之間包含多胜肽連結子，藉此可使scFv 形成用於抗原結合所必要的構造（Huston JS et al.，Proe

Natl Acad Sci USA ( 1 988) 85: 5879-83 ;關於 scFv 之總 論，參照 PlUckthUn『 The Pharmacology 0f M〇nocl〇nai Antibodiesj Vol. 11 3(Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag’ New York) pp.269-315，1994))。本發明中之連 結子’只要是完全不妨礙其兩端連結之抗體可變區域之表 ; 現及活性，即不特別限定。 k 編碼為scFv之DNA，例如可以下列方式得到。 (1) 以編碼為前述抗體之Η鏈或、Η鏈V區域之dna、 及L鏈或、l鏈V區域之DNA作為鑄模，將此等序列之中 編碼為所望之胺基酸序列的DNA部分，使用規定其兩端之 引子對，利用PCR法予以放大。 (2) 接著，將編碼為胜肽連結子部分之dNA及其兩端與 引子對組合放大’該引子對係規定為使該各胜肽連結子之 兩端與Η鏈、L鍵連結。 2125-9415-PF;Kai 23 200902063 • 又，一旦製作編碼為scFv之DNA，則能以常法得到含 此等之表現載體，及經該表現載體予以轉形（transf〇rm) 之寄主’又’藉由使用此寄主依照常法可得scFv。 再者’視需要本發明使用之抗體亦可為雙專一性抗 體I gG型雙專一性抗體可由將2種產生I gG抗體之融合 瘤予以融a所生的雜父融合瘤（hybrid hybridoma，又稱 quadroma)分泌（Milstein C et al. ( 1 983) Nature 305: 537-40)。又’可藉由將分別構成二種igG之L鏈及h鏈基 因，合計4種基因導入細胞並使共表現而使分泌。此時， 藉由對於Η鏈之CH3區域施以適當胺基酸取代，能優先分 /必關於Η鏈為異質組合之IgG(Ridgway JB et al. (1996) Protein Engineering 9: 617-21; Merchant AM et al. (1998) Nat Biotech 16: 677-81)。 藉由將Fab’予以化學交聯，亦能製作雙專一性抗體。 例如，將從其中之一抗體製備之Fab’以〇-PDM (鄰-伸苯二 馬來醯亞胺’ ortho-phenylenedi-maleimide)予以馬來醯 亞胺化，將其與從另一抗體製備之Fab’反應，使不同抗 體來源之Fab’彼此交聯，能製作雙專一性F(ab，MKeler T et al. ( 1 997) Cancer Res 57: 4008-14)。又，已知有 將Fab’ -硫硝基苯曱酸（TNB)衍生物與Fab’ -硫醇（SH)等 抗體片段予以化學鍵結之方法（Brennan M et al. (1985) Science 229: 81-3)。 化學交聯之外，亦可使用Fos、Jun等來源之白胺酸拉 鍊結構（Leucine zipper)。Fos、Jun亦會形成同二聚體， 2125-9415-PF;Kai 24 200902063 « . 但是利用優先形成異二聚體者。表現製備加成有Fos白胺 酸拉鍊結構之Fab’及加成有Jun白胺酸拉鍊結構之另一 Fab 。藉由使於溫和條件還原之單體Fab，—fos、 Fab -Jun混合並反應，可形成雙專一性F(ab， (Kostelny SA et al. (1992) J Immunol 148: 1547-53)。 此方法不限於Fab’ ，亦可應用於將scFv、Fv等連結時。 雙功能抗體亦能製作成具雙專一性。雙專一性雙功能 抗體’為2個交叉（cross-over)scFv片段之異二聚體。亦 即’可藉由將2種抗體A、B來源之Vh與Vl以5個殘基左 右之較短連結子連接而製作的Vh(A) —Vl(B)、Vh(B) —Vl(a) 構成異二聚體之形式，而製作（H〇niger p et al. (1993)

Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-8)。 此時’亦可將2種scFv以15殘基左右之柔軟、較長 連結子連結’（單鏈雙功能抗體·· Kipriyanov SM et al. (1999) J Mol Biol 293: 41-56)、施以適當胺基酸取代 (knobs-into-holes: Zhu Z et al. ( 1 997) Protein Sci 6： 781-8)，而促進目的構成。可藉將2種scFv以15個殘基 左右之柔軟、較長連結子連結而製作的s c ( f v )2，亦可能為 雙專一性抗體（Mallender WD et al. ( 1 994) J Biol Chem 269: 199-206)。 重組抗體 將抗體基因從融合瘤選殖’並且利用基因重組技術， 併入到適當載體，並將所製作之表現載體導入寄主，能將 本發明使用之抗體製作成重組型抗體（例如參照Vanda_e 2125-9415-PF;Kai 25 200902063 . et al.，Eur J Biochem (1990) 192: 767-75)。具體而言， 最初從產生所望抗體之融合瘤製備mRNA。利用公知方法， 例如胍（guanidine)超離心法（Chirgwin et al.，

Biochemistry (1979) 18: 5294-9) 、 AGPC 法（Chomczynski et al·，Anal Biochem ( 1 987) 1 62: 1 56-9)等，從產生抗 體之脾臟細胞製備全RNA後’使用mRNA Purification Kit (Pharmacia)·# ,可製備 mRNA。又’藉由使用 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)，可不製備全 RNA，而僅 直接製備mRNA。其次’從得到之mRNA使用反轉錄酵素合 成抗體V區域之cDNA。cDNA之合成，可利用AMV Reverse

Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化 學工業）等實施。又，cDNA之合成及放大，可利用5，_Ampli FINDER RACE Kit (Clontech)、利用 PCR 之 5’ -RACE 法 (Frohman et al., proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 8998 9002, Belyavsky et al., Nucleic Acids Res (1989) 17: 29 1 9-32 )等實施。例如，利用與可變區域附近對應之 引子’以RT-PCR將L鏈、Η鏈可變區域（VL、V〇之cDNA放 大亚回收。引子可使用：對應於CDR之引子、對應於較CDR 之夕樣性為低之框架的引子，或與信號序列及CH1或L鏈 不欠區域（CL)對應之引子。接著，從得到之pcR產物精製 目的DNA片段’並藉由與載體應連結，製作重組載體。 將该重組載體導入大腸菌等寄主細胞，選擇經轉形之細胞 之群洛。藉由培養得到之細胞，可製作所望重組抗體。視 胃要’將編碼為目的抗體之基因之鹼基序列，以公知方法 2l25-9415-PF;Kai 26 200902063 例如雙去氧核苷酸（di deoxynuc〗eot i de)法等確認。 又’可將編碼為上述得到之抗體v區域的dm，併入 含有編碼為所望抗體不變區域（C區域）之DNA的表現載 體表見载體包含表現控制區域例如增強子（enhancer )及 啟動子’本發明之製劑冲使用的抗體之DNA，以受該區域 控制而表現之方式併入。使用表現載體將適當的寄主細胞 轉形’成使所望分子型之抗體表現並得到。 抗體基因之表現，可將編碼為抗體重鏈（H鏈）或輕鏈 (L鏈）之DNA为別併入表現載體而使寄主細胞同時轉形， 或者藉由併入有編碼為Η鏈及L鏈之DNA的單一表現載體 將寄主細胞轉形（參照W094/1 1523等）。 人類抗體及人類化抗體 本發明使用之抗體為雞抗體、小鼠抗體、大鼠抗體等 其來源不㈣，但以對於人類投予為目的時，以人類化抗 體或人類抗體較佳。人類抗體之取得方法為已知，例如可 藉由將具人類抗體基因全部或一部 丨刀曲目之基因轉殖動物 以目的抗原免疫，取得目的之人類抗體（參照麵/1 2227、 W092/03918 ' W094/02602 > W094/2R^«^ _6/33735)。 咖5、剛6/34〇96、 不贫明使用之重 性降低等目的，可使用以基因工 r 0 ^ , 矛方法所製作之改變 二 頦抗體不艾區域之嵌合抗體、人 化抗體等。像此種基因改變抗體， 目触t J使用既知方法製造 具體而言，例如嵌合抗體為由免疫

免動物之抗體之H 2125-9415-PF;Kai 27 200902063 鏈之可變區域， 人人類抗體之Η鏈及L鍵之不變區域所椹 成之抗體。將 饵 、'’勒瑪為免疫動物來源之抗體之可變區域 DNA，連結於欲' 义匕λ的 °、、'兩喝為人類抗體之不變區域的DNA，並且併入 表現載體並導人& 等入寄主使產生，可得嵌合抗體。 、匕抗體為亦稱為再構成（reshaped)人類抗體之 變抗體。人類I^ 、 几體’係藉由將免疫動物來源之抗體之CDR , 類抗體之CDR而構建。其一般的基因重組方法亦 為已知。具體而言’首先設言十謝序列，以將小鼠抗體之 -、人類抗體之框架區域（framew〇rk ; F幻連結。 此序列以末端部具重疊部分之方式分成數個。合成各 ^的寡核普酉文’並以pCR法組裝成所設計之腿序列。將 組衣成的DNA與編碼為人類抗體不變區域之謝連結，接 著併入表現載體並導入寄主使生產（參照卯2394〇〇; w〇 96/02576)。 透過CDR連結之人類抗體之FR，係選擇結果製作之人 類化抗體之CDR能形成良好抗原結合部位者。視需要，可 將人類化抗體之可變區域中之FR之胺基酸進行取代（Sat〇 K et al. (1 993) Cancer Res 53: 85卜6)，以使人類化抗 k m形成適切抗原結合部位。又’亦可取代為其他各 樣人類抗體來源之FR(參照w〇 99/51^43：)。 胺基酸改變抗體 本發明使用之才几體，包含將如上所述得到之抗體之胺 基酸序列進行取代、缺失、加成及/或插入等改變者。胺基 酸序列之改變，可利用公知方法實施。胺基酸之取代、缺 2125-9415-PF;Kai 28 200902063 失、加成及/或插入等而改轡枋 又吏之机體’較佳為與改變前之抗 體具同樣活性。 在 $樣活性」意指生物學的或生化學的活性。 生物學的或生化學的活性之具體例，例如：結合活性、中 和活性等。 通吊與改變月ίι之抗體具同樣活性之抗體，與改變前 ，抗耻冋相同性。本發明巾，高相同性係指於胺基酸水 平，通常至少有5〇%以上之同一性’較佳為75%以上之同一 性’更佳為85%以上之同一性，又更佳為95%以上之同一 性。為了決定多胜肽之相同性，例如可使用文獻（Wi lbur 及 Lipman， Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80: 726-30) 等記載之演算法。 本發明使用之抗體，可為以此方式經胺基酸取代、缺 失' 加成及/或插入等而經改變之抗體。 抗體修飾物 再者’本發明使用之抗體，包含抗體修飾物。抗體修 飾物’例如：與聚乙二醇（pEG)等各種分子結合之抗體。本 發明之治療劑中使用之抗體修飾物，所結合之物質不限 疋。為使抗體安定化，提高其結合能力等，可以各樣目的 進行抗體修飾。為得此種抗體修飾物’可將得到之抗體施 以化學修飾。此等方法在此領域中已經確立。 抗體表現.產生 使構建之抗體基因依公知方法表現’可取得抗體。哺 乳類細胞之情形，可以以含有常用之有用啟動子/增強子、 2125-94l5-PF；Kai 29 200902063 表現之抗體基因、及其3, #j下游多A信號功能性結合之 DNA的表現載體，使表現抗體基因。例如，啟動子/增強子， 例如：人類巨細胞病毒前期啟動子/增強子。又，除此以外， 亦能使用反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、翻毒4Q(sv4〇) 等病毒啟動子/增強子，或人類延長因子—1α #哺乳類細 胞來源之啟動子/增強子。例如，使用SV4〇啟動子/增強子 時，若依照Mulling等人之方法（MuUing RC et ，

Nature ( 1 979) 277: 1 08-14)，可以輕易地表現抗體基因: 使用人類延長因子1 α時，若依照Mizushima之方法 (Mizushima， Nucleic Acids Res (199〇) 18: 5322)，可 輕易地表現抗體基因。大腸菌之情形，可利用包含常用有 用之啟動+、用卩分泌抗體之信號序歹d、將使表現之抗體 基因予以功能性結合之DNA的表現載體，可使抗體基因表 現。例如，啟動子有LacZ啟動子、araB啟動子。 使用LacZ啟動子時，例如可依照ward等人之方法

(Ward ES et al·，Nature (1 989) 341: 544-6)。使用 araB 啟動子時。例如可依照Better等人之方法（Bette M et ai.，

Science ( 1 988) 240: 1 041-3)。用以分泌抗體之信號序 列，於產生在大腸&之胞質之情形，例如可使用p e 1B信號 序列（Lei SP et al.，J Bacteriol (1 987) 1 69 : 4379-83)。 將產生在胞質之抗體分離後，可將抗體之構造適當改造並 使用（W0 96/30394)。 複製起源可使用牛乳突病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴 病毒40 (SV40)等來源之複製起源。再者，可包含胺基糖芽 2125-9415—PF;Kai 30 200902063 • 轉移酶基因、胸腺嘧啶激酶基因、大腸菌黃嘌呤鳥。票吟碟 酸核糖轉移酶（xanthine guanineph〇sph〇ribosyl transferase)基因、二氫葉酸還原酵素基因等，此等係為 了將寄主細胞系的基因副本數放大，在表現載體作為選擇 標記使用。 為了製造本發明使用之抗體’可使用任意生產系。用 以製造抗體之生產系，有體外（in vitro)及體内（in viv〇) 生產系。體外生產系’例如：使用真核細胞之生產系或使 用原核細胞之生產系。使用真核細胞時，有使用動物細胞、 植物細胞、真菌細胞之生產系。動物細胞已知：（a)哺乳類 細胞例如CH0、COS、（b)兩生類細胞、例如非洲爪蟾印母 細胞、（c)昆蟲細胞例如Sf 9、Sf 21。植物細胞已知例如終 草屬（N i c 〇 t i a n a)來源之細胞。將其進行癒合培養即可。真 a細胞已知有（a)酵母例如Saccharomyces屬、（b)絲狀菌 例如Aspergi 1 lus屬。使用原核細胞時，有使用細菌細胞 之生產系。細菌細胞已知大腸菌、枯草菌。將目的抗體基 因藉由轉形導入此等細胞中，並將轉形的細胞於體外培養 可得抗體。培養依照公知方法實施。例如哺乳類細胞之情 形’培養液可使用DMEM、MEM、RPMI 1 640等。此時可以併 用胎牛血清等血清補液’亦可無血清培養。又，將導入有 才几體基因之細胞移植到動物細胞之腹腔等，可於體内生產 抗體。體内之生產系，例如：使用動物之生產系或使用植 物之生產系。使用動物時’例如有哺乳類動物、使用昆蟲 之生產系。哺乳類動物可使用山羊、豬、羊、小鼠、牛。 2125-9415-PF;Kai 31 200902063 又’使用哺乳類動物時，可使用基因轉殖動物。例如， 在編碼為山羊"蛋白之類的乳汁中固有產生之蛋白質 的基因中途插入抗體基因’而製備融合基因。將含插入有 抗體基因之融合基因的讓片段注入山羊胚胎，並將此胚 胎注入雌山羊體内。從接受胚胎之山羊產下之基因轉殖山 羊或其子孫產生之乳汁，得到目的抗體…使基因轉殖 山羊中含目的抗體之乳汁量增加，可以適時將激素對基因 轉殖山羊施用。又，昆蟲可以使用蠶。使用蠶時，可藉由 使插入有目的抗體基因之桿狀病毒感染蠶，並從此蠶之體

液得到目的抗體。（Maeda S et al.，Nature (1985) 31L 5 92-4)。再者，將植物用於抗體生產時，例如可使用菸草。 使用菸草時，將編碼為目的抗體之聚核苷酸插入於植物表 現用載體例如PMON530，並將此載體導入於如農桿菌 (Agrobacterium tumef aciens)的細菌。使此細菌感染终草 例Nicotiana tabacum)，可從菸草葉得到所望抗體（Ma al·， Eur J Immunol (1994) 24:131-8)。 抗體精製 如上所述，利用融合瘤培養.增殖或基因重組得到之 抗體’可精製成達均勻之程度。抗體之分離、精製，可使 用通常蛋白質使用之分離、精製方法。例如，適當選擇、 組合親和性層析等層析管柱、過濾、超過濾、利用硫酸銨 或硫酸鈉等之鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、等 電點電泳等’能將抗體分離、精製（A n t i b 〇 d i e s : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold 2125-9415-PF;Kai 32 200902063

Spnng Harbor Laboratory, 1 988),但不限於此等。親和 性層析使用之管柱，例如：蛋白質A管柱、蛋白質G管柱、 蛋白質L管柱等。 本發明使用之抗抗體之選擇，可藉由例如 ELISA法等，調查與人類HMGB-1之反應性以實施。 類殿粉變性之治療劑/預防劑. ▲本發明提供含有抗HMGB-1抗體作為有效成分之類澱 粉變性治療劑。本發明巾，誠粉變性意指顏粉沉積於 各種組織之疾病。分類為在結核、骨髓腫瘤等續發者、原 因不明者、遺傳性者等，並依照沉積分布.部位等呈現多 樣症狀。本發明之含抗Η·]抗體之治療劑，纟其適於全 身性類澱粉變性之中類澱粉沉積之治療及/或預防。再者， 亡孓月之/α療劑’適於二次性全身性類澱粉變性之類澱粉 沉積治療及/或預防。 本發明之含抗咖]抗體作為有效成分之治療劑，視 需要可以與對其為鈍性 田杲子上可奋5午之擔體、媒體 4 Λ匕5並製劑化。例如，、、力玆卜斗、[ _ Η 滅囷水或生理食鹽水、安定劑、 賦幵/背]、抗氧化劑（抗壞血 、纟 ^ 其他有機酸等h防腐劑j Μ、檸檬酸、 防腐d、界面活性劑（PEG、Tween等）、 螯合劑（EDTA等）、έ士人南丨莖 ν ’ 、、’σ σ J 4。又，亦可含其他之低分子量 :胜：：：清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質、甘胺 及&冬醯胺、精胺酸及離胺酸等胺基酸、多糖 及早糖等糖類或碳水化、+

甘路醇或山梨醇等糖醇。製作 成注射用水溶液時，例如 I 生理g鹽水、葡萄糖或含其 2125-9415-PF;Kai 200902063 他輔助藥之等張液例如D_ ^ ,, Λ 山柒醉、D-甘露糖、D-甘露醇、 納一，亦可與適當溶解輔助劑、例如醇（乙醇等）、多元 『(丙一醇、PEG等）、非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯 80、HC0-50)等併用。 本發明中之治療劑，σ亚θ 康則^要疋抗HMGB-1抗體彼此功能不 相妨礙’可合9插Γ/ I* 3= JL, 。再者，視需要本發明中之治療劑， 亦可與其他類澱粉變性之治療劑組合使用。 ，又，視需要可將本發明中之製劑封入微膠囊(經基甲基 纖、准素曰月膠、聚[甲基甲基丙稀酸]等微膠囊）。又，視需 σ夺本Ιχ Θ之巾之製劑製作為膠體藥物傳遞系統（微脂 體白蛋白微球體 '微乳劑、奈米粒子及奈米膝囊等）（參 照” Remington’s PharmaceuticaI Science 16让 editi ⑽"，

Oslo Ed. ( 1 980)等）。再者，將藥劑製作為緩釋性藥劑之 方法亦為公知，可應j在本發明之製劑（Unger d A 0981) J Bi〇med Mater Res 1 5: 267-77; Langer ( 1 982) Chemtech 12: 98 —1〇5;美國專利第 3,773,9i9 號； EP58,481 E； Sidman et al. (ΐ983) Biop〇lymers 22: 547-56; EP1 33, 988 號）。 本發明之治療劑投予量，可考慮劑型種類、投予方法、 患者年齡或體重、患者症狀、疾病種類或進行程度等，最 終由醫師判斷而適當決定。一般而言，大人每日含有抗體 量，可將0.1〜l〇〇〇〇mg分成i〜數次投予。更佳為5〜 5000mg/日，最佳為50〜2000mg/日。此等投予量視患者體 重或年齡、投予方法等變動，但若是該技術領域之人士， 2125-9415-PF;Kai 34 200902063 •可適當選擇投予量。投予期間亦因應患者之治癒過程等適 虽決定較佳。投予途徑不特別限定，以靜脈内投予、皮下 投予等實施。 又’可考慮將編碼為本發明中之治療劑使用之抗體的 基因併入基因治療用載體，來進行基因治療。編碼為抗體 之基因之投予方法，例如：直接投予裸質體之方法、包裝 在微脂體等後投予之方法、形成反轉錄病毒載體、腺病毒 载體、痘苗病毒載體、痘病毒載體、腺病毒關連載體、 載體等各種病毒載體之形式並投予之方法（參照Ad〇iph

Virus Genome 法』，CRC Press, Florid ( 1 996 ))，或 被覆膠體金粒子等顆粒擔體（w〇93/丨77〇 6等）後投予之方 法。然而，可採在活體内表現抗體並能發揮其作用之任何 方法投予。較佳為，透過適當之非經口途徑（靜脈内、腹腔 内皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入或肌肉 内途徑進行注射、注入之方法、或氣體誘導性粒子衝擊法 (利用電子搶等）、點鼻藥等經黏膜途徑之方法等），投予足 夠量。於活體外（ex vivo)，利用微脂體轉染、粒子衝擊法 (美國專利第4, 945’ 05。號)或病毒感染，對於血液細胞及 骨髓來源細胞等導入編碼為抗體之基因，再將該細胞注入 於患者即可。 又，本發明提供用於治療類澱粉變性之方法，包含投 予本發明治療劑之步驟。抗體或#製劑之投+，例如可: 前述方法實施。又，本發明尚關於抗冊⑶—丨抗體用於製造 本發明之治療劑之用途。再者，本發明提供用於上述方法 2l25-9415-PF;Kai 35 200902063 之^套組’至小—人 、 匕έ本發明之治療劑。該套組中，另可包裝、 注射铜、注j|+ A, 射針、藥學上容許之媒體、醇綿布、絆創膏、 或記載使用方法之指示書等。 本6兒明書中所引用之所有先前技術文獻，引入本 發明中作為參考。 【實施例】 —P' ， 、 以貫施例對於本發明更具體詳述，但本發明不 限於此等管# /d 例。以下，以實施例更具體地詳述本發明， 但本發明不限於此等實施例。 [貫知例1 ]人類冊GB_i之胺基酸序列中之親水性高、與人 類HMGB 2之間相同性低之胺基酸序列之選擇 «人類HMGB-1之胺基酸序列選擇親水性高、與人類 HMGB-2之間相同性低之胺基酸序列。 (1) 人類HMGB-1之胺基酸序列（序列編號：6 )，如前述 Wen 等人之貧料（Wen et &1·，Nucleic Acids Res ( 1 989) 17:1197-214)。 (2) 此人類HMGB-1之胺基酸序列之各胺基酸殘基之親 水性高低的推定，係依照前述H〇PP等人之方法（T.p h〇pp et al., Pr〇c Natl Acad Sci USA (1 981 ) 78: 3824-8) 實施。 (3) 其次，將此人類HMGB_ i之胺基酸序列之中親水性 间的序列，與人類腿GB_2之胺基酸序列（M· Y〇shida d J Biol Chem (1 992) 267: 6641-5)比較。並且，從該高親 水性之胺基酸序列中，選擇人類HMGB—丨與人類hmgb —2之 2125-9415-PF;Kai 36 200902063 « • 間相同性低之人類HMGB-1之胺基酸序列。 (4)在此’本案發明人等所選擇胺基酸序列之第1號， 為從人類HMGB-1之第167號之胺基酸殘基（離胺酸）至第 180號之胺基酸殘基（離胺酸）的「Lys Pro Asp Ala Ala Lys

Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列編號：1)。又， 此人類 HMGB-1 之胺基酸序列「Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列編號：1)，與相對應 的人類 HMGB-2 之胺基酸序列「Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly Arg Pro Thr Gly」（序列編號：2)有9個之胺 基酸殘基不同。 [實施例2]胜肽之合成 分別合成在實施例1所選擇胺基酸序列之各N末端， 結合有用以使擔體結合之半胱胺酸的胺基酸序列「Cys Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lysj (序列編號：3 )之胜肽。 首先，利用Applied Biosystems公司之型號430A胜 肽自動合成裝置（Model 430A peptide synthesizer)，依 照操作說明書’以第三丁氧基羰基胺基酸固相法合成胺基 酸序列「Cys Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

Lys Ala Glu Lys」（序列編號：3)之胜肽合成。 為了抑制副反應，就清除劑（scavenger)而言，於二曱 基硫、對硫曱苯酚、間甲苯酚及苯曱醚存在下以敦化氫法 實施從樹脂使合成之胜肽脫離。 之後’以二曱醚萃取清除劑’並且以2N乙酸萃取合成 2125-9415-PF;Kai 37 200902063 之胜肽。 、，以陰離子交換樹脂dowEXi_X2^陰離子交換管柱層 析亚才月製’卩0DS官柱實施高速液體層析⑽Lc)，確認主 峰之圖樣。亚且，以蒸發器進行冷凍乾燥及濃縮後，以肝K 進行精製並分取。又，該HPLC精製時之裝置及條件，係使 用山村化學研究所公司之逆相_管柱 YMC-D-ODS-5(20_x300mm)，以日本分光工業公司之 TWINCLE泵浦及日本分光工業公司之Gp_A4〇 &梯度写於 〇.U三氟乙酸（TFA)中從乙腈之〇%至谓的梯度以流速 7.〇mL/分實施，以日本分光工業公司製uvidec—i〇〇v型檢 測器（210nm，1. 28AUFS)進行檢測。 將此處精製分取之合成胜肽’以蒸發器冷凍乾燥並濃 縮。將得到之合成胜肽純度以Hm分析。裝置及條件，使 用山村化學研究所公司之逆相0DS管柱

YMC-R-0DS-5(4. 9nrnx300_)’ 日本分光工業公司之 TnNCLE 泵浦及日本分光工業公司之Gp_A4〇型梯度器於〇 ι%三氟 乙酸（TFA)中從乙腈之〇%至7G%的梯度以流速分實 施25分鐘，以日本分光工業公司製UVIDEC—1〇〇v型檢測器 (210nni，1.28AUFS)進行檢測。得知以此所得之合成胜肽純 度約100%。 [實施例3 ]免疫原之製備 將為擔體透貝之血青素（KLH)(Calbiochem公司製）或 牛血清白蛋白（BSA)(生化學工業公司製）1〇mg溶解於1〇· 石粦酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩衝液（pH7 ())，並於其中加入溶 38 2125-9415-PF；Kai 200902063 : 解在N，N-二曱基曱醯胺之2.5%馬來醯亞胺苯曱醯基—n一經 基琥珀醯亞胺酯（MBS) (Pierce公司製）溶液150//L，於室 溫一面攪拌一面使反應30分鐘。 將其於4°C下通過以1 OmM鱗酸二氫鉀—填酸氫二钟緩 衝液（ρΗ7·0)平衡化之凝膠過濾管柱 (SephadexG-25(Sephadex G-25)管柱（Pharmacia LKB 公司 製）），監控於280nm中之吸光度，並分取MBS—擔體結合成 分。 將此MBS-擔體結合成分以磷酸三鈉調整為ρΗ7· 〇，於 其中添加混合於實施例2所合成之胜肽「Cys Lys Pro Asp

Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列 編號：3)，使反應1 5 0分鐘。 反應後，以水進行3次透析後，進行冷凍乾燥得到與 前述胜肽結合之擔體所構成之免疫原。 [實施例4]豬HMGB-1與HMGB-2之製備 從豬胸腺，依照Sanders等人之方法（C· Sanders et al.’ BBRC ( 1 977) 78: 1 034-42)，製備豬 UMGB-1(序列編 號：4)及豬HMGB-2(序列編號：5)。 (1)將豬胸腺500g，於含i4〇mM氯化鈉及〇. 5mM PMSF 之6 00mL緩衝液中進行破碎。 (2 )其次，將該破碎物以離心分離機進行離心分離，將 上清液除去。 (3)於其中’加入含14〇mM之氯化鈉及〇. 5mM之pMSF 的緩衝液並攪拌後，以離心分離機進行離心分離，將上清 2125-9415-PF;Kai 39 200902063 : 液除去。反複操作2次此洗滌操作。 (4 )其次’於彳于到之沉殿物中，加入〇. 7 5 μ過氯酸 30OmL。並且’以離心分離機進行離心分離後，分取上清液。 於殘留之沉澱物中加入〇· 75M過氯酸40 OmL。對此以離心 分離機離心分離後，分取上清液，將此上清液與先前分取 之上清液合併。又，將沉澱物廢棄。 (5) 於前述合併之上清液中加入〇. 75M過氣酸，使全體 今里成為1，00OmL。其次’以離心分離機進行離心分離後， 將上清液以玻璃過濾、器（等級4)過濾。 (6) 前述過濾之濾液中’加入3, 5 〇 〇mL丙酮與2 j mL濃 鹽酸之混合液。由於發生混濁，因此以離心分離機離心分 離，分取上清液。於此上清液中加入丙酮2, 5〇〇mL。並且， 由於再度混濁，因此將其以離心分離機離心分離，將上清 液分離，並收集殘留的沉澱物。 (Ό將收集的沉殿物於室溫使自然乾燥。 由以上操作，得到含HMGB-1及HMGB-2之蛋白質分部 約 20mg。 (8) 將前述含随⑶—丨及hmgb —2之蛋白質分部，溶解於 含20 0mM氯化鈉之7. 5mM硼酸鈉緩衝液（pH9. 0)10mL·後， 以含20 0mM氯化鈉之7· 5mM硼酸鈉緩衝液（pm 〇)充分進行 透析。 (9) 透析之後，添加到預先以7. 5mM硼酸鈉缓衝液 (PH9.0)平衡化之CM_SephadexC25管柱。並且之後，使由 含20 0mM氣化鈉之7· 5mM硼酸鈉緩衝液（pH9_ 〇)洗提，進行 2125-9415-PF;Kai 40 200902063 . 陽離子交換層析。 (10) 並且，15%SDS-聚丙烯醯胺電泳之結果，由移動 度’確認圖1中，「A」表示之洗提分部及「B」表示之洗 提分部為含豬HMGB-1之分部，再者，「C」表示之洗提分 部及「D」表示之洗提分部為含豬HMGB-2之分部。 (11) 因此，將圖1中以「A」表示之洗提分部及「B」 表示之洗提分部混合並收集，再將以「C」表示之洗提分部 及以「D」表示之洗提分部混合並收集。 [實施例5]人類HMGB-1與HMGB-2之製備 將人類HMGB-1 (序列編號：6)及HMGB-2(序列編號：7) 依照文獻（P. Cabart et al. Cell Biochemistry and Function 13; 1 25-1 33: 1 995)，從 HL60 細胞精製。 (1) 將HL60細胞於30 0mL之含10%之非動化FCS(胎牛 血清：Gibco)的 RPMI 1 640 (Gibco)，培養約一週。 (2) 將培養之HL60細胞回收，以RPMI 1640洗滌後，於 3L 之 PFHM-II(Invitrogen)培養約二週。 (3)其次，將培養上清通過以 PBS平衡化之 Heparin-Sepharose(Sigma 公司）° (4)以PBS充分洗滌後，以含〇. 5M氯化鈉之PBS進行 洗提。對洗提物監控280nm之吸收，將有吸收之部分合併。 將合併物以5mM硼酸緩衝液（PH9 · 0) 0. 2M氯化鈉充分透析。 將該經透析之合併物添加於經7_ 5mM鄉酸緩彳^夜 (pH9_0)平衡化之 CM-SehadexC25(Pharmacia)。並且之後， 以含200mM氣化鈉7. 5mM硼酸鈉缓衝液（pH9. 0)使洗提。社 2125-9415-PF;Kai 41 200902063 . 果與實施例4所示者相同。 [實施例6 ]多株抗體之製備 使用實施例4製備之免疫原豬hmGB- 1，依下述方式製 備多株抗體。 [1 ]對動物免疫 (1)將前述實施例4得到之免疫原豬HMGB-1溶解於生 理食鹽水（0· 9%氣化鈉水溶液），使成ι〇0μ g/mL，並且與 佛洛依德完全佐劑等量混合成乳劑，並注射〇. 5mL到雞（旭 Technoglass)羽毛根部。 (2 )初次免疫起2週後’將前述免疫原以生理食鹽水溶 解，使成1 0 0 // g/mL·，且將其與佛洛依德不完全佐劑等量 混合成乳劑，並追加注射〇 · 5mL。此追加注射隔2週實施。 (3 )免疫動物雞之血清中及蛋黃中之抗體價，利用酵素 免疫測定法（EL IS A、EIA) ’於初次免疫第6週起每週測定。 EL ISA法之操作如以下所示。 I (3-1)將豬HMGB-1溶解於生理食鹽水使成ivg/mL， 將其對於96井-微平盤（Nunc公司製）中每1井逐一加入 1 00 " L ’於37 C靜置2小時’實施諸HMGB-1之固相化。 (3-2)將此微平盤以含洗滌液（〇. 〇5%Tween2〇)之磷酸 緩衝生理食鹽水（含5· 59mM鱗酸氫二鈉、1. 47mM磷酸二氫 鉀、137mM氯化鈉及2_68mM氣化鉀之水溶液（pH7.2)))洗 蘇後，將含1 %BSA之1 OmM磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀缓衝液 (ρΗ7·2)對每1井逐一加入3〇〇#l，於37°C靜置2小時， 進行阻斷（blocking)，之後再次以洗滌液洗滌。 2125-9415-PF;Kai 42 200902063 * (3 — 3)將待檢查抗體產生之前述雞蛋黃100# L溶於生 理食鹽水900以L中，再將其以生理食鹽水稀釋成丨〇〇〇倍、 1 0000倍，及100000倍，將此等於微平盤之井各加入 1 00 # L，於371靜置2小時使反應。之後以洗滌液洗滌。 (3-4)又，作為對照組，於前述（3_2)之微平盤之井中， 各加入含UBSA之0·1Μ磷酸緩衝生理食鹽水1〇〇/zL，於 3 7 °C靜置2小時’之後以洗滌液洗滌。 (3 5)將過氧化酶（p〇D)標識抗雞igY抗體（如―Data公 司製）以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋成5〇〇〇倍 後，在（3-3)及（3-4)之微平盤中每丄井逐一加入1〇〇"[， 於37°C靜置2小時，使反應進行。 (3-6)將該等以洗滌液洗滌後。在每】井各加入過氧化 酶反應液（對於含3mM 2, 2，-連氮基-雙（3—乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸）（ABTS)之5〇mM磷酸氫二鈉_24錢檸檬酸緩衝液 lmL在即將使用前添加2/^之17%過氧化氫者）i〇〇#l， 於室溫使反應。15分鐘後在每！井加入15〇"L的6N硫酸 使反應停止。 (3-6)將此等以EIA平盤讀取儀（Bi〇 Rad公司製）測定 於415nm之吸光度。 (4)從初次免疫起第丨2週以後，認為抗體價已達穩定 高值，因此，從此免疫動物雞之蛋黃得到抗體（IgY)。 (5)於蛋黃 lOmL 加入 TBS(〇14M Nan、

Tris/ΗΠ、ρΗ7·4、0.01%NaN3)4〇mL，充分搜拌後，進行離 心分離得上清。 2125-9415-PF;Kai 200902063 (6 )其次於此上清中加入7. 5mL CaC 12、3mL葡聚糖硫 酸（10%(W/V)葡聚糖硫酸於TBS)，攪拌約3〇分鐘後，進行 邊〜刀離’彳于上清與沉澱。將上清回收，將沉澱再度以Tbs 再萃取。離心分離後再度得到之上清與前次上清合併，以 TBS加至成i〇〇mL。 (7)於其中添加無水硫酸鈉2〇g，攪拌3〇分鐘後，進 订離心分離，除去上清後，將沉澱溶解於1 OmL TBS，加入 PBS，再以PBS透析，得球蛋白分部。 (8 )其次將其通過固定化有實施例4中製備之豬 HMGB-1的官柱，進行親和性層析。操作如以下所示。 (8-1)對於實施例4所製備之豬HMGB_14mg，使&的 CNBr Sepharose(Pharmacia Biotech 公司製）依照操作說 月曰反應’製備成固定化有前述胜肽之親和性層析用管柱。 (8 - 2)將此管柱以填酸緩衝生理食鹽水預先平衡化，之 後通過於前述（7)濃縮之成分（多株抗體）。 (8~3)於其中使磷酸緩衝生理食鹽水充分通過並洗滌 後’通過0· 1M乙酸緩衝液（PH3. 〇)。 (8 4)收集因此而洗提之分部，以雄酸緩衝生理食鹽水 進行透析，之後實施濃縮。 利用以上之親和性層析操作，分取與豬腿⑶—丨結合之 多株抗體。 (9)以上操作所得到之雞之抗豬hmgb_i多株抗體，為 二與人類HMGB-1，2結合者。此次之情形係製備經親和性精 製之抗體，但亦可不進行親和性精製。 2l25-94i5~PF；Kai 44 200902063 性群1結合但不舆人類高移動性 [實施例7]與人類高移動 群2結合之抗體 與人類HMGB-1妹人扣了 t 、° °仁不與人類HMGB —2結合之多株抗 體之製備依下述方式實施。 將實施例6所製備之夕土 有之夕株机體通過固定化有實施例4 製備之豬HMGB-2的管·；μ 進行與HMGB-2反應之抗體之吸 收。其操作如以下所示。 (1)對於實施例4 CNBr-Sepharose(Pharm 所製備之豬HMGB-24mg，使2g的 acia Biotech公司製）依照操作說 明書反應 管柱。 製備經固定化有前述HMGB-2之 HMGB-2吸收用 (2) 將此管柱以磷酸緩衝生理食鹽水預先平衡化，之後 使實施例6濃縮之成分（多株抗體）通過。 (3) 收集直接通過的分部，以磷酸緩衝生理食鹽水進行 透析，之後實施濃縮。 利用以上親和性層析之操作，分取與豬MGB—丨結合但 不與豬HMGB-2結合之多株抗體。利用以上操作所得之雞之 抗豬HMGB-1多株抗體，係與人類跗诎—丨結合但不與人类員 HMGB-2結合者。 ' [實施例8 ]抗HMGB-1多株抗體對於胜肽之反應性 破認於實施例6所製備之抗豬HMGB-1多株抗體對於實 施例3所製備胜肽抗原之反應性。 (1)將實施例3得到之胜肽抗原溶解於生理食鹽水， 使 成1 // g/mL ’並將其於96井-微平盤（Nunc公司製）中每 2125-9415-PF;Kai 45 200902063 井逐一加入100#L，於3rC靜置2小時，進行此胜肽抗原 之固相化。 (2)將此微平盤以含洗滌液（〇. 〇5%Tweeb2〇)之磷酸緩 衝生理食鹽水（含5.59mM磷酸氫二鈉、磷酸二氯 鉀、137mM氯化鈉及2_68fflM氯化鉀之水溶液（pH7 2)))洗 滌後，將含UBSA之10mM磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩衝液 (PH7.2)於每1井各加入300 #L，於3rc靜置2小時，進 行阻斷’之後再次以洗滌液洗滌。 (3)將待檢查抗體產生之前述雞蛋黃丨⑽以^溶於生理 食鹽水刪W中，再將其以生理食鹽水稀釋成1GQ0倍、 倍，及1_〇〇⑬，將此等於微平盤之井中各加入 ⑽“，於抓靜置2小時使反應進行，之後以洗務液洗 ⑷又’就對照組而言’於前述(2)之微平盤之井中， 各加入3 “BSA之。· 1M磷酸緩衝生理食鹽水刚"l，於 37°C靜置2小時，之後以 ()將過氧化酶（P〇D)標識抗雞IgY抗體⑽L公司 製）以含3%BSA之磷酴结偷a :田a , -、友衝生理食鹽水稀釋為5〇〇〇倍後， 於（3)及（4)之微平盤中备】北 十盤中母1井逐-加入1004,於37°C靜 置2小時以實施反應。 (6 )將其以洗務液洗路德 q u 0 〇) 十、後將過氧化酶反應液（對於含 3mM 2,2 -連氮基、雙（3 一 &基本开噻唑啉-6-磺酸）（ABTS) 之 5 0 in Μ 酸氮-叙j q j a D 納-24mM檸檬酸緩衝液lmL，於即將使用 刖添加2 /z L之1 7 %讲鸟y 、 ’ k軋化鼠者）於每1井各加入100/zL， 2125-9415-PF;Kai 46 200902063 • 於至/jm·使反應。1 5分鐘後’於每1井加入5 〇 // L的6 N硫 酸，使反應停止。 (7)將其於EIA平盤讀取儀（Bi〇 Rad公司製）測定 41 5nm之吸光度。 結果如圖2。稀釋倍率愈高則信號愈高。從此可知， 於HMGB-1得到之多株抗體之中包含對抗胜肽抗原之抗體。 [實施例9 ]多株抗體之製備 使用實施例3所製備之免疫原胜肽抗原製備多株抗 體，係依下述方式進行。 [1 ]對動物進行免疫 (1) 於使刖述貫施例2得到之免疫原（「c y s L y s P r 〇 A s p

Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列 編號：3)表示之胜肽結合BSA者，以生理食鹽水（〇· 9%氯化 鈉水溶液）溶解’使成1 〇 〇 # g/mL，並將其與佛洛依德完全 佐劑各等量混合成乳劑，注射L 5mL至雞（旭Techn〇glass 公司）羽毛根部。 & (2) 從初次免疫起2週後，將前述免疫原以生理食鹽水 溶解，使成1 0 0 # g/mL ’並與佛洛依德不完全佐劑等量混 合成乳劑，以0· 5mL追加免疫注射。此追加免疫注射隔2 週進行。 (3) 免疫動物該雞於血清中及蛋黃中之抗體價，以酵素 免疫測定法（ELISA、EIA)，從初次免疫第6週起每1週測 定。該EL ISA法之操作如以下所示。 (3-1 )將實施例3得到之胜肽結合KLH者，溶解於生理 2l25-9415-PF;Kai 47 200902063 . 食鹽水，使成l//g/mL，並於96井-微平盤（Nunc公司製） 中每1井逐一加入1 00 # L，於37。(：靜置2小時進行此胜肽 -KLH之固相化。 ， (3-2)將此微平盤以含洗滌液（〇· 05%Tween2〇)之磷酸 緩衝生理食鹽水（含559mM磷酸氫二鈉、；[.47mM磷酸二氫 鉀、137mM氯化鈉及2.68mM氯化鉀之水溶液（ΡΗ7·2)))洗 條後，將含UBSA之1 OmM磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩衝液 (ρΗ7· 2)在每1井各加入300 # l，於37t：靜置2小時進行 阻斷，之後再次以洗滌液洗滌。 (3-3)將待檢查抗體產生之前述雞蛋黃1〇〇 gL溶於生 理食鹽水900#L中’再將其以生理食鹽水稀釋成1〇〇〇倍、 1 0000倍’及1 00000倍’將此等在微平盤之井各加入 100 // L，於37°C靜置2小時使反應進行，之後以洗滌液洗 務。 (3-4)又，就對照組而言，於前述（3_2)之微平盤之井， 各加入含1%BSA之0· 1M磷酸緩衝生理食鹽水1〇〇# L，於 37°C靜置2小時，之後以洗滌液洗滌。 (3-5)將過氧化酶（P0D)標識抗雞IgY抗體（如_肫從公 司製）以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋成5〇〇〇倍 後，在（3-3)及（3-4)之微平盤中每j井逐一加入1〇〇/ζί， 於37°C靜置2小時，進行反應。 (3-6)將該等以洗滌液洗滌後，將過氧化酶反應液（對 於含3mM 2,2’-連氮基-雙（3_乙基苯并噻唑啉_6—磺 酸XABTS)之5〇mM碗酸氫二納-24mM檸檬酸緩衝液丨‘在 2125-9415-PF/Kai 48 200902063 .即將使用前添加2#L之1.7%過氧化氫者）於每i井各加入 100 /z L，於室溫使反應。丨5分鐘後每i井加入i 5〇以l的 6N硫酸使反應停止。 (3-7)將其以EIA平盤讀取儀（Bi〇 Rad公司製）測定 41 5nm之吸光度。 (4) 從初次免疫起第丨2週後，因為認為抗體價已達穩 定高值，從免疫動物雞之蛋黃得到抗體（IgY)。 (5) 於蛋黃 l〇mL 中加入 TBS(〇14M Nan，〇〇im

Tris/HCl’ ρΗ7·4，0.01%NaN3)40mL·，充分攪拌後，進行離 心分離得到上清。 (6) 其次於此上清中加入7. 5mL CaC12、3mL葡聚糖硫 酸（10%(W/V)葡聚糖硫酸於TBS)，攪拌約30分鐘後，進行 離。刀離，得到上清及沉澱。將上清回收，將沉澱再度以 TBS再萃取。離心分離後，再度將得到之上清與前次上清 合併’以TBS加成100mL。 (υ於其中添加無水硫酸鈉20g，攪拌3〇分鐘後，進 行離心分離，除去上清後，將沉澱溶解於itbs，加入 PBS，再以PBS透析，得球蛋白分部。 (8)其次，將其通過固定化有實施例2所製備之胜肽的 管柱，進行親和性層析。該操作如以下所示。 (8-1)對於實施例2所製備之胜肽1〇岐，使2g之 CNBr-Sepharose(Phaoiacia Biotech 公司製）依照操作說 明書反應，製備成固定化有前述胜肽之親和性層析用管柱。 (8-2)將此管柱以磷酸緩衝生理食鹽水預先平衡化，之 2125-9415-PF;Kai 49 200902063 後通過於前述⑺濃縮之成分(多株抗體)。 、(8 3)於其中通過足夠碟酸緩衝生理食鹽水並洗蘇 k過〇. 1M乙酸緩衝液（ρΗ3· 0)。 、_ (8 4)收集因此而洗提之部分，以磷酸緩衝生理食鹽 進行透析’之後進行濃縮。 ^ 利用以上親和性層析操作，分取與胜肽結合之多株抗 體。 (9)以上刼作所得到之雞之多株抗體，為能與人類 HMGB - 1么士八去。ν 认 、 >，σ ° # 又，為與人類HMGB-1相同性高之人類 UMGB-2無法結合者。 此人之清形係製備經親和性精製之抗體，但是未經親 和I·生精製之抗體只要使用適當量，亦能期待同樣的效果。 [貫施例1 〇]與抗胜肽多株抗體之人類腿GB_i及人類 HMGB-2之反應性確認 實施例9所製備之抗胜肽多株抗體對於人類HMGB-1，2 之反應性’利用西方點墨法確認。 1.西方點墨法 實施例9所製備之抗胜肽多株抗體之反應性 (1) 將實施例5得到之人類HMGB-1(1 mg/mL)及 HMGB-2(lmg/mL)以1:1混合，再者與樣本緩衝液以ι:1混 合0 (2) 將此樣本使用1 5% SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行電 泳。並且，電泳緩衝液使用巴比妥缓衝液（pH8. 8)，以電流 2OmA通電180分鐘進行電泳。 2125-9415-PF;Kai 50 200902063 (3 )前述（2)之電泳後之轉印，使用N〇VA · b丨〇1：.

Electrophoretic . Transfer . kit(Pharmacia LKB 公司 製）’依知、其使用5兒明書’以乾方式進行。首先，將前述（2) 經電泳之凝膠放置在轉印用裝置上。其次，於此凝膠上， 重疊9cmx9cm之硝基纖維素膜（BioRad公司製），使用48mM 參（經基曱基）胺基曱烧、39mM甘胺酸、q_〇357%(W/V)十二 烷基硫酸鈉（SDS)及20W/V)曱醇所構成之轉印用緩衝 液’以電流60mA進行2小時轉印。 (4) 將經過轉印之硝基纖維素膜，於含1%BSA之磷酸緩 衝生理食鹽水（含5_59mM磷酸氫二鈉、147mM磷酸二氫 鉀、137mM氯化鈉及2.68通氯化鉀之水溶液（pH7.2))2〇mL 中於4 °C浸泡1晚，進行阻斷。 (5) 其次，將其於含洗滌液（〇· 〇5%Tween2〇)之磷酸緩衝 生理食鹽水）2 0mL中進行〗π八4立拉、》、4·仰 τ疋订1 u刀釦振盪洗滌。此操作進行3 次。 厂;丨衣谉之多株抗體80// g 之含UBSA之鱗酸緩衝生理食鹽水，於此溶液中於室溫 泡經前述（5)之操作的硝基纖維素膜2小時使反應。 ⑺將經前述⑻之操作的頌基纖維素膜，於觀之 務液中進行Π)分鐘振|洗務。該㈣作進行3次。 ,()，、人將過氧化酶標識抗小鼠igG抗體（Dako公 力以含3觀之磷酸緩衝生理食鹽水稀#㈣倍，製 2〇:L之…夜’亚於其中，於室溫將前述⑺之硝基纖維 膜浸泡2小時使反應。 2125-9415-PF；Kai 51 200902063 (9) 將此硝基纖維素膜於20mL之洗滌液中進行l〇分鐘 振盪洗滌。此操作進行3次。 (10) 於含0. 025%之3, 3’ -二胺基聯苯胺四鹽酸鹽及 0.01%過氧化氫的填酸緩衝生理食鹽水20mL中，將前述（9) 之硝基纖維素膜於室溫浸泡1 5分鐘使發色。 依以上操作，得到實施例9所製備多株抗體之西方點 墨法結果。 2.貫驗結果 西方點墨法之結果 前述多株抗體之西方點墨法之結果如圖3所示。又， 該圖中’「1」為多株抗體（實施例9製備之多株抗體）中之 結果。並且「2」僅使過氧化酶標識抗雞IgY抗體（Up—Data 公司製）反應之結果。「3」顯示藉使實施例6得到之抗豬 HMGB-1多株抗體反應，而明確化人類腿⑶—丨、2之位置。 仗圖3，於未使「2」之多株抗體作用僅使過氧化酶標 識抗雞IgY抗體作用的對照（控制組）中，於出現人類 HMGB-1譜帶之位置及出現人類HMGB_2譜帶之位置任— 者，均未呈現任何發色。由此，可確認前述各西方點墨法 中，未發生非專一性發色。 4知，丨」之實施例9所製備的多株抗體，雖於人類 HMGB-1電泳之位置觀察到發色，但是於人類随诎―2電沬 之位置未觀察到發色。由此可明自，實施例9所製備之二 胜肽多株抗體，會與人類y ^ . 、頦腿GB—1反應，但不與人類HMGB〜2 反應。 2125-9415-PF;Kai 52 200902063 [實施例11]單株抗體之製備 本發明中可使用之單株抗體，可由以下操作取得。使 用實施例5所製備之免疫原人類祕i製作單株抗體，係 依如下方式實施。 1.對於動物進行免疫 將前述實施例5所得到之免疫原人類嶋]以生理食 鹽水（0.9%氯㈣水溶液）溶解，使成為⑽心社，並將 其與佛洛依德完全佐劑等量混合成為乳劑，對於8週齡雌 BALB/c小鼠（日本Charles心打公司）之腹部皮下注射 〇.5mL。從初次免疫起2週後，將前述免疫原以生理食鹽水 溶解使成為100#g/mL，並將其與佛洛依德不完全佐劑等 此追加注射每隔 以酵素免疫測定 量混合成乳劑’以〇 5mL進行追加注射 2週進行。此等免疫動物小鼠之抗體價 法（ELISA、EIA)’從初次免疫起第6週，每j週測定。eusa 去之具體操作，於以下（1)詳述。從初次免疫起第丨8週後， 由於已涊為抗體價達穩定高值，因此，對於此等免疫動物 小鼠之腹部皮下，注射以生理食鹽水稀釋成8〇〇 # g/mL之 實施例5得到之人類〇 5mL。之後第3日，從此等 小鼠取出脾臟。 (l)ELISA 法 將人類HMGB-1溶解於生理食鹽水，使成g/mL，將 其於96井-微平盤（Nunc公司製）中每1井逐一加入 lOG/z L ’於37°C靜置2小時，進行該人類HMGB-1之固相 化。將該微平盤以含洗滌液（0.05%Tween20)之磷酸緩衝生 2125-9415-PF;Kai 53 200902063 •理食鹽水（含5.59mM磷酸氫二鈉、1·47ιηΜ磷酸二氫鉀、 137禮氣化鈉及2.68mM氣化鉀之水溶液（ρΗ7·2)))洗滌 後，將含UBSA之l〇mM磷酸二氫鉀—磷酸氫二鉀緩衝液 (ρΗ7· 2)對每1井各加入3〇〇 # L，於3rc靜置2小時，進 行阻斷，之後再次以洗滌液洗滌。以待檢查抗體產生之前 述小鼠血清100#L作為試樣，溶於生理食鹽水9〇〇//L中， 再將其以生理食鹽水稀釋成1〇〇〇倍、1〇〇〇〇倍，及1〇〇〇〇〇 倍，將此等於微平盤之井中各加入1〇〇" L，於3rc靜置2 小時使反應進行，之後以洗滌液洗滌。又，作為對照組， 於微平盤之井中，取小鼠血清而代之以加入含1%BSA之 〇. 1M磷酸緩衝生理食鹽水各1〇〇/z L，於3rc靜置2小時， 之後以洗滌液洗滌。將過氧化酶（P0D)標識抗小鼠I邱抗體 (Amersham公司製）以含3%bsa之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋 成5000倍後，於各微平盤中每丨井逐一加入1〇〇# L ,於 371靜置2小時使反應進行。將其以洗滌液洗滌後，將含 過氧化酶反應液（對於3mM 2,2’ _連氮基_雙（3_乙基苯并 噻唑啉-6-%酸）（ABTS)之50mM磷酸氫二鈉-24mM檸檬酸緩 衝液的lmL，在即將使用前添加2 #[之1.7%過氧化氫者） 於母1井各加入l〇〇#L，於室溫使反應。15分鐘後於每1 井加入150// L之6N硫酸使反應停止。將其以EIA平盤讀 取儀（Bio Rad公司製）測定415ηπ1中之吸光度。 2 ·骨髓瘤細胞之增殖 將BALB/c小鼠來源之次黃嘌呤.鳥嘌呤.磷酸核糖. 轉移酶缺損之骨髓瘤細胞株p3_x63_Ag8 —叮株（癌研究 2l25-9415-PF;Kai 54 200902063

Research Source Bank 9085)，於含胎生牛血清10%且補 充有谷醯胺、盤尼西林及鏈黴素之RPM1 1 640組織培養培養 基（万/σ Cell公司製）進行增殖。更詳言之，將該骨髓瘤細 胞於細胞培養用中型瓶（Nunc公司製、容量200mL)内，增 殖至細胞占瓶底面約8成為止。又，細胞數以錐蟲駐 (Trypan blue)染料排除法及血球計計數。 3 ·細胞融合 將前述1 ‘從免疫動物小鼠取得之脾臟，使用不銹鋼篩 網#200充分解碎，一面以不含血清之RPMI 1 640培養基洗 滌一面過濾。之後，以2〇〇g進行離心分離，將脾臟細胞分 離。再者，再度將不含血清之株骨髓瘤細 胞以5 : 1之比例混合後，進行離心分離。將經混合之細胞， 和緩地懸浮於含聚乙二醇1 500 (PEG1 50 0、I?oche

Diagnostics公司製）50%之rpm11640培養基中。並且，將 其以RPMI 1640培養基緩慢稀釋至最終聚乙二醇濃度達到 5 /〇從其中，將細胞以離心分離分離，之後緩慢地分散於 3有5%融σ瘤選殖因子（〇r igen公司製）之s一選殖體培養 基（二光純藥公司製）所構成之增殖培養基。並且，於平底 之96孔微平#(Nunc公司製）之井中，每1井接種…個 /1004細胞數之細胞’於5%二氧化碳中於3rc培養。於 、肊Μ 0後第i曰’在各井加入】〇〇 " l之Hu培養基（前 述增殖培養基補充使為。.〇lmM次黃嘌呤、i 6"M胸腺嘧 咬及Μ胺基蝶呤’均為東京化成公司製）。之後3日 期間’每日將約—半的ΗΑΤ培養基與新的HAT培養基交換， 2125-9415-PF；Kai 55 200902063 ‘ 並於之後每隔2〜3日進行同樣的交換。 將細胞以顯微鏡觀察，結果融合瘤（融合細胞）之選殖 體從ίο日以後出現。細胞融合後14日以後’為了檢查認 識人類HMGB-1之抗體之產生，將井内培養液以EUSA法篩 ^ 又，此此ISA法操作，係與前述1 · (1)相同。將利用 篩選判別為生產認識人類.GB — 丨之抗體之井的融合瘤，於 24井平盤擴大培養，隨著細胞密度增高，於小型瓶、中型 瓶以大規模培養。融合瘤，以HT培養基（不含胺基蝶呤及 融合瘤選殖因子之HAT培養基）培養、保持。將認識I類 HMGB-1之抗體之產生與h (1)以同樣EUSA法檢查，結果 可確認有4 0個該融合瘤。 4.融合瘤次選殖 將各產生對抗人類HMGB-1之抗體的前述融合瘤’以極 限稀釋法予以次選歹直。此等融合瘤之細胞數，以錐蟲藍染 料排除及血球計進行計數。其次，將此等融合瘤，在每 1〇〇aL之HT培養基’卩〇.5個生長細胞數之比例及1個 生長細胞數比例之2種比例懸浮，並對於96 盤每1井各分注…該等每隔2〜3日交換:二千 並使融合瘤增殖。2週後，於顯微鏡下檢查各井之群落數， 並且對於產生對抗豬觀]之抗體的融合瘤，與前述同樣 以ELISA法檢查。得到於！井中有1群落存在，並且產生 此種抗體之融合瘤（井）2個。 將得到之融合瘤移到24孔之平盤，培養2週直到細胞 生長良好為止。苴次，將此堂3A人> /、人肘此寺岫合瘤所產生抗體與實施例 2125-9415-PF；Kai 200902063

Elf:備人類_β —1之反應性’以ELISA法檢查。又，該 匕L 1 b A法之j品从 知作，係將固相化於96井-微平盤之蛋白質 銓為實施例R 貝又 b所製備之人類HMGB-1 ’並將試樣改變為备融 合瘤（各井） ”·、谷w °養上h，除此以外與前述1. (1)以同樣方 式貫施。 果’解明了，前述融合瘤之中，有20個融合瘤為 產生與前述人類臓β—1結合之抗體的細胞株。 -^· 一 “ :、人以EL1SA法檢查此融合瘤產生之抗體與實施例 y所製備之人類HMGB_卜人類MGB_2分別的反應性。又， 忒ELISA法之操作，係將固相化於96井一微平盤之蛋白質 改變為實施例5所製備之人類HMGB-1或人類HMGB-2,並 將4衩改變為該融合瘤（該井之培養上清），除此以外，與 前述1. (1)同樣地進行。 忒彳木时之結果，確認該融合瘤所產生之抗體，為與人 類HMGB-1，结合但不與人類HMGB_2結合之選殖體。該融合 瘤命名為 R08G12G2、R0 6G7E10。 5.單株抗體之產生 將岫述4.所得各單株抗體產生細胞株（融合瘤），逐一 放入分別的中型瓶（Nunc公司製）中，並於HT培養基中培 養至細胞占底面之約8成為止。之後，收集此等融合瘤， 以20Og、5分鐘之離心分離回收之。其次，將其以不含血 /月之RPM1 1 640培養液洗滌3次後，懸浮於2mL之RPM11 640 培養液。將該融合瘤懸浮液1 mL，注射到預先經2, 6，1 0, 1 4-四甲基十五烧處置之雄性BA.LB/c小鼠（日本Chari es River 2125-9415-PF;Kai 57 200902063 . 公司）之腹腔。從注射起2週以内未認為腹部膨脹之情形， 再度反複此操作。採取認為腹部膨脹之小鼠之腹水。將該 腹水施以200g、5分鐘之離心分離，將含有從融合瘤所產 生單株抗體之上清液，從融合瘤分離取得。 6 ·單株抗體之精製 (1) 單株抗體為IgG之情形 將前述5.所得、含有從融合瘤產生之單株抗體的上清 液各10mL中’一面攪拌一面於22t；加入硫酸鈉1. 8g，並 於硫酸鈉完全溶解起算再持續攪拌1小時，進行鹽析。將 其於22°C進行離心分離（7Q〇〇g、15分鐘）’將與上清液分 離知到之'’儿殿’溶解於含3 0mM氣化納之40ηιΜ碟酸納緩衝 液（pH8. 0)2mL。其次’將其對於含30mM氯化鈉之4〇mM碌 酸納緩衝液（pH8. 0)充分透析後’以1〇〇〇g進行2〇分鐘離 心分離，除去不溶物。將其以流速〇. 4mL/分通過經含3〇mM 氣化鈉之40mM磷酸納緩衝液（pH8.〇)預先平衡好之DEAE-纖維素離子交換管柱（Seluba公司製）[lxl〇cm],以2mL逐 一收集洗提液。從28Onm之吸光度確認免疫球蛋白G(I gG) 包含於洗提液中直接通過分部，收集該等並濃縮為2mL。 再者’將其施加到蛋白質A -SepharoseCL-4B親和性層析 (Pharmacia LKB公司製）進行精製，得到經精製之單株抗 體。 (2) 單株抗體為I gM之情形 將荊述5 ·所彳寸、含有從融合瘤產生之單株抗體的上清 液各10mL ’以20mM填酸緩衝液（ρΗ7· 5)0· 8M硫酸錢充分透 2125-9415-PF;Kai 58 200902063 析。將透析結束之上清液，施加於經2〇mM磷酸緩衝液 (pH7.5)0.8M 硫酸銨平衡之 HiTrap IgM purification Hp lmL(Amersham Bi〇science)。以 2〇mM 磷酸緩衝液 (ρΗ7.5)0·8Μ硫酸銨充分洗滌後，以2〇mM磷酸緩衝液 (ρΗ7· 5)洗提。而得到經精製之IgM型單株抗體。 [貫她例12 ]單株抗體對於人類HMGB-1，2之反應性探討 利用西方點墨法確認單株抗體對於在實施例5所製備 人類HMGB-1，2之反應性。此情形以選殖體r〇6G7e1〇為例 說明°對於其他選殖體亦進行同樣探討。 U)於實施例11所製備之單株抗體之反應性（西方點墨法） 將實施例5所得之人類HMGB-l(lmg/mL)與 HMGB-2(lmg/mL)混合為1:1，再者，與樣本緩衝液以1:1 混合。將該樣本使用15% SDS_聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。 並且，使用巴比妥緩衝液（pH8. 8)作為電泳缓衝液，以電流 20mA通電180分鐘通電進行電泳。電泳之後之轉印，使用

Nova· Blot· Electrophoretic· Transfer· Kit(Pharmacia LKB公司製），並依照其使用說明書，以乾式進行。具體而 言，首先將已實施電泳之凝膠放在轉印用裝置上。其次， 在該凝膠上，重疊9cmx9cm之硝基纖維素膜（Bi〇 Rad公司 製），使用48mM參（羥基曱基）胺基甲烷、39mM甘胺酸、 L〇357%(W/V)十二烷基硫酸鈉（SDS)及20%(V/V)曱醇所構 成之轉印用緩衝液，以電流60mA進行2小時轉印。 將經過轉印之硝基纖維素膜，於含1%BSA之磷酸緩衝 生理食鹽水（含5. 59mM磷酸氫二鈉、1· 47mM磷酸二氫鉀、 2125-9415-PF；Kai 59 200902063 • 137mM氯化鈉及2. 68mM氯化鉀之水溶液（pH7. 2))2〇mL於 4°C浸泡1晚，進行阻斷。其次，將該等於含洗滌液 (0_05%Tween20)之磷酸緩衝生理食鹽水）2〇mL中，進行1〇 分鐘振盪洗滌。此操作進行3次。將實施例u製備之單株 抗體80#g溶解於20mL之含1%BSA的磷酸緩衝生理食鹽水 中，將則述經洗滌之硝基纖維素膜於室溫浸泡2小時使反 應。接著，將膜於2 0 m L之洗滌液令進行丨〇分鐘振蘯洗滌。 該等操作進行3次。 其次，將過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體（Dak〇公司 衣）’以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋5〇〇倍，製備 成20mL溶液，並於其中，腺益；；士、w .

墨法結果。 -1多株抗體反應者。 從圖4，未使「1 之 之西方點墨法結果如圖4所示 」係僅使過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體 者’ 「2」係使r06G7E1〇(實施例I】所 前述1之R06G7E10 又，該圖之中，「1」係{ (Dako公司製）反應者，「 I備之單株抗體）反應者， Η M G B -1多枝括.賴后& 抗小鼠 3」係使實施例6得到之抗豬 」之單株抗體作用僅使過氧化酶標識

，在人類HMGB-1譜 2125-9415-PF;Kai 60 200902063 帶出現之位置及人類HMGB-2譜帶出現之私班 ®兄之位置，均未認為有 任何發色。從此，確認前述各西方點 .^ ^ ^ 土戍平’未發生非專 一性發色。「2」之實施例11所製備之單 心早株抗體，雖觀察 到在人類HMGB-1電泳位置有發色，作是 丨―疋人頰HMGB-2電泳 位置未觀察到發色。 [實施例13 ]中和抗體對於類澱粉變性之治療效果 對於類澱粉變性模型小鼠僅投予AgN〇；}時，會引起發 炎’輕過14-21日才認為有類澱粉沉積。相對於此，若打 入AgN〇3(或以任何方法引起發炎)及來自二次性類澱粉變 性小鼠脾臟之均質液作為類澱粉增強因子（amyl〇id enhancing factor)(AEF)’ 則 2-3 日程度認、為_粉沉積， 可認為因為AEF造成類澱粉變性發病時期變快之現象。同 時，此效果於投予後持續12。日以上。本案發明人等，確 認做為AEF使用之二次性類殿粉變性小鼠脾臟中得到之均 質液中，含有許多HMGB — i。因此，本案發明人等確認了， 抗HMGB-1抗體對於此現象可認為有何種效果。 對於6週齡之C3H/HeNCrj系統β進行2%“ν〇3 l 皮下注射+AEF 400 /z L腹腔内投予時，類澱粉沉積狀態如 圖5所示。合併於圖6顯示SAA(血清類澱粉蛋白）之變化。 又，將事先經抗HMGB-1抗體（實施例7中調製之抗豬 HMGB 1夕株抗體）處理的AEF (來自二次性類澱粉變性小鼠 脾臟之均質液）或未經任何處理之AEF及AgN〇3 一起對小鼠 投予，並且比較探討6日後類澱粉沉積之結果如圖7所示。 明顯地，事先經抗HMGB-丨抗體處理者，認為類澱粉沉積受 2125-9415-PF;Kai 61 200902063 , 到抑制。 【產業利用性】 依照本發明’提供類澱粉變性之新治療劑。依照本發 明提供之治療劑，作為其有效成分，含有與HMGB-1結合之 抗HMGB-1抗體。 【圖式簡單說明】 圖1顯示從豬胸腺依照Sanders等人之方法製備 HMGB-1及HMGB-2時所進行的陽離子交換層析中，於28〇_ 吸光度監控經洗提之分部之結果。關於經洗提之分部進行 15%SDS-PAGE’確認圖中八及B之分部包含hmgb」、〇及d 之分部包含HMGB-2。 圖2顯示對於人類^(^-丨之第167號胺基酸殘基（離 胺酸）至第180號之胺基酸殘基（離胺酸）之序列，以eusa 測定與抗豬HMGB-1多株抗體之反應性之結果圖。固相化抗 原，使用在該序列N末端加成半胱胺酸並結合有作為擔體 之透貝之血青素（KLH)或牛血清白蛋白（BSA)之抗原。橫軸 顯示添加在該ELISA系之抗豬HMGB-1多株抗體之濃度。 又’縱軸顯示於該ELISA系中，使用過氧化酶（p〇D)標識抗 雞I gY抗體及過氧化酶反應液，檢測吸光度之值作為與該 抗原結合之抗豬HMGB -1多株抗體量。對於附著在任一擔體 之胜狀抗原’抗豬Η M G B -1多株抗體以濃度依存性反應。方 法細節記載於實施例8。 2125-9415-PF;Kai 62 200902063 圖3顯不以西方點墨法，使用在人類HMGB-1之第1 6 7 號胺基酸殘基（離胺酸）至第18〇號胺基酸殘基（離胺酸）為 止之序列N末端加成半胱胺酸並結合作為擔體之透貝血青 素（KLH)或牛企清白蛋白（BSA)之抗原，探討所取得單株抗 體對於人類HMGB-1及人類HMGB—2之反應性結果照片。「J」 為該多株抗體（於實施例9製備之多株抗體）中之結果。「2」 為僅使過氧化酶標識抗小鼠！ gG抗體（Dak〇公司製）者。「3」 為使實施例6得到之抗豬HMGBq多株抗體反應，並使人類 HMGB-1，2之位置明確化者。 圖4顯不以西方點墨法探討選殖體r〇6g1〇E7所產生之 單株抗體對於人類HMGB—丨及HMGB_2之反應性之結果照 片。「1」為僅使過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體（Dak〇公司 製）反應者，「2」為R〇6G7E10(實施例11所製備之單株抗 體）中之結果。「3」為使實施例6所得之抗豬HMGB」多株 抗體，使人類HMGB-1，2位置明確化者。 圖5顯示類澱粉變性模型小鼠之脾臟中，類澱粉沉積 狀態之照片。該模型，係對於6週齡之C3H/HeNCr〗系統0， 皮下庄射2%AgN〇3 40 0 # L，同時將來自二次性類澱粉變性 小队脾臟之均質液（amyl〇id enhancing fact〇r; AEF)400 // L進行腹腔内投予所製作。將AgN〇3 & AEF 4〇〇 # [ 進行腹腔内投予後，4日後及7日後，認為有類澱粉沉積（類 澱粉被剛果紅（Congo red)染成紅色）。另一方面，僅將 2%AgN〇3 40 0 // L皮下注射時，即使投予7日後，確認剛果 紅染色程度弱。 2125-9415-PF;Kai 63 200902063 圖6顯示類澱粉變性模型小鼠之中，血清類澱粉（SAA) 變化。該模型，係對於6週齡之C3H/HeNCr j系統β，皮下 注射2%AgN〇3 400 # L·，同，時將來自二次性類澱粉變性小鼠 脾臟之均質液（amyloid enhancing factor 進行腹腔内投予所製作。實施2%AgN〇3 4〇〇 # L皮下注射 +AEF 400 //L腹腔内投予後，隔天認為在峰部有SM上升。 圖7顯不類澱粉變性模型小鼠之脾臟中，抗HMGB_丨抗 體對於類澱粉沉積之抑制效果照片。係對於6週齡之 C3H/HeNCrj系統心皮下注射2%AgN〇3 4〇〇以，同時將預 先經抗HMGB-1抗體（實施例9所製備之雞抗hmgb_i多株抗 體)處理過之二次性類殿粉變性小氣脾臟得到的均質液 U町ioid enhancing factor; AEF)或未經任何處理之 400 // L，對於腹腔内投予。投予6 卞b日後，比較探討脾臟中 的類澱粉沉積。投予了預先經抗腿卯 机體處理過之aef 的小鼠，被認為脾臟中之類澱粉沉積 果紅染成紅色）。 ㈣(颉殿粉被剛 【主要元件符號說明】 無。 2125-9415-PF;Kai 64

Claims (1)

1. 200902063 十、申請專利範圍： 1.-種類澱粉變性治療劑 質湖㈣）抗體作為有效成分。3有“㈣性群匿蛋白 其中類;殿粉 2·如申請專利範圍第ϊ項所述之治療劑 變性為全身性類澱粉變性。 其中全身性 3·如申請專利範圍第2項所述之治療劑 類澱粉變性為二次性全身性類澱粉變性。 4·如申請專利範圍第i至3項中任—項所述之治療 劑，其中抗HMGB-!抗體與題㈣之結合強於與高移動性 群匣蛋白質2(HMGB-2)之結合。 5_如申請專利範圍第1 中i主d項中任一項所述之治療 劑，其中抗HMGB-1抗體不結合至腿⑶-2。 6.如申請專利_ !至5項中任一項所述之治療 劑，其中抗HMGB-1抗體辨識具序列編號··丨之胺基酸序列 的部分胜肽。 2125-9415-PF;Kai 1