TW200900076A - Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth and treating multiple myeloma - Google Patents

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200900076 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於促進骨生長及增加骨密度以及用於 治療多發性骨髓瘤之組合物及方法。 【先前技術】 處於骨質疏鬆症至骨折範圍内之骨病症表示一組存在 極少有效醫藥劑之病理狀況。治療替代地集中於肢體干預 及行為干預，包括固定、鍛煉及膳食變化。出於治療多種 骨病症之目的，具有促進骨生長且增加骨密度之治療劑將 為有益的。 月生長及礦化視兩種細胞類型破骨細胞與造骨細胞之 活性而定，儘管軟骨細胞及維管結構細胞亦參與此等過程 之關鍵方面。在發育方面，骨形成經兩種機制軟骨内骨化 與膜内骨化而發生’前者負責縱向骨形成而後者負責拓撲 H (諸如頭骨）形成。軟骨内骨化需要軟骨結構在充當 &月細胞、破骨細胞、維管結構形成及後續礦化之模板的 生長板中依序形成並退化。在膜内骨化期間，骨直接形成 於結締組織中。兩種過程均需要造骨細胞滲入及後續基質 沈積。 月折及月骼之其他結構破裂係經至少表面上類似於骨 生成之發育事件（包括軟骨組織形成及後續礦化）之次序 的過％而復原。骨折復原之過程可以兩種方式發生。直接 或初級月復原在無骨痴形成之情況下發生。間接或二級骨 5 200900076 復原在具有骨痂前驅階段之情況下發生。骨折之初級復原 涉及跨過高密破裂再形成機械連續性。在合適之條件下， 破裂周圍之骨再吸收細胞顯示穿隧再吸收反應且確立血管 穿透及後續復原之路徑。骨路之二級復原遵循發炎、軟骨 痂形成、骨痂礦化及骨痂重塑之過程。在發炎階段中，血 腫及出血形成由党傷處骨膜及骨内膜血管的破裂而引起。 發炎性細胞侵入該區域。在軟骨痂形成階段中，細胞產生 新血官、纖維母細胞、細胞内物質及支持細胞，從而在骨 f

折片段之間的空間中形成肉芽組織。跨過破裂之臨床癒合 係由纖維或軟骨組織（軟骨痂）冑立。造骨細胞得以形成 且"導軚月痂礦化，該軟骨痂接著經板層骨置換且進行正 常重塑過程。 除骨折及骨結構之其他實體破裂以外，骨礦物含量及 骨質量之流失可由多種病狀引起且可導致顯著醫學問題。 在個體-生中’骨質量的變化以相對可預測之方式發生。 直到約30歲，男性與女性之骨骼經軟骨内生長板線性生 長及钇向生長而生長至最大質量。約3〇歲（對於小梁骨 (trabeCUlar b〇ne) ’例如扁骨，諸如椎骨及骨盆）及40 歲（對於皮質f，例如見於四肢中之長骨）後，男性與女 !生均出現緩忮骨質流失。在女性中，'亦出現實質性骨質流 失之最、’冬p “又’其可能係歸因於停經後雌激素的缺乏。在 此階段中，女性可能自皮質骨損失另夕卜㈣骨質量且自小 ㈣損失另外25%骨質量。進行性骨質流失是否導致諸如 骨質疏鬆症之病理病狀报大程度上視個體之初始骨質量及 6 200900076 疋否存在惡化病狀而定。 月質々IL失有時特徵在於正常骨重塑過 骨铖赍、仓 > 去^ 巾月里土3°往（失调。健康 ^常進仃重塑。重塑以由破骨細胞對骨再吸收起 吸收之骨接著經新骨組織置換，其特徵在於由造骨細胞來 成膠原蛋白且隨後妈化。在健康個體中，再吸收速率與形 成速率平衡。骨質疏鬆症為以向再吸收轉移為標誌之慢 眭、進仃性病狀，其導致骨質量及骨礦化總體降低。人類 「之骨質疏鬆症之前為臨床骨質減少（低於年輕成人骨之平 、均值一個標準差以上但在2 5 W標準差以下之骨礦物密 度）。在世界範圍内’約75，_，_人處於骨質疏鬆症之 危險中。 、 因此，控制破骨細胞活性與造骨細胞活性之間的平衡 $方法可適用於促進骨折及骨骼之其他損傷的復原以及與 月質量及骨礦化損失相關之病症（諸如骨質疏鬆症）的治 療。 / 關於月質疏鬆症，雌激素、降血約素、骨妈化素與維 生素K ’或高劑量之膳食鈣皆用作治療性干預。針對骨質 疏鬆症之其他治療方法包括雙膦酸鹽、副甲狀腺激素、擬 舞劑（calcirnimetic )、司他汀（statin )、同化類固醇、 鑭鹽及錕鹽，及氟化鈉。然而，該等治療劑通常與不合需 要之副作用相關。 因此’本發明揭示案之一目的在於提供促進骨生長及 礦化之組合物及方法。 7 200900076 【發明内容】 發明概要 部分地，本案之揭示證實具有活化素或AetRIla拮抗 釗活性之分子（「活化素拮抗劑」及「ActRlia拮抗劑」， 統稱為「活化素-ActRIIa拮抗劑」）可用於增加骨密度， 促進骨生長及/或增加骨強度。詳言之，本案之揭示證實可 洛形式之ActRIIa充當活化素_ActRna信號轉導之抑制劑 且促進活體内骨密度、骨生長及骨強度增加。儘管促進骨 生長或抑制骨質流失之多數醫藥劑充當抗異化劑（抓岀 catabolic agent ’通常亦稱作「異化劑（catab〇Uc）」） (例如雙膦酸鹽）或同化劑（anab〇lic agent，例如副甲狀 腺激素PTH，當適當給藥時），但可溶性ActRna蛋白顯 不雙重/舌性，其具有抗異化作用與同化作用。因此，本案 之揭示確立活化素-ActRHa信號轉導路徑之拮抗劑可用於 增加骨密度且促進骨生長。儘管可溶性ActRIIa可能經不 同於活化素拮抗之機制影響骨骼，但本案之揭示仍證實所 需治療劑可基於活化素_ActRIIa拮抗劑活性來選擇。因此， 在某些具體實例中，本案之揭示提供使用包括（例如）活 化素結合性ActRIIa多肽、抗活化素抗體、抗ActRIIa抗 體、靶向活化素或靶向ActRIIa之小分子及適體（aptamer ) 的活化素-ActRIIa拮抗劑’及減少活化素及ActRIIa表現 之核酸’治療與低骨密度或低骨強度相關之病症（諸如骨 質疏鬆症）或促進有需要之患者（諸如患有骨折之患者） 之骨生長的方法。本案之揭示進一步證實活化素_ActRna 8 200900076 拮抗」有a預防及/或修復由多發性骨髓瘤及乳房腫瘤所引 起之“貝傷且另外證實活化素_ActRna拮抗劑減少多發性 骨，瘤中之腫瘤負荷。可雜Ae麵a多肽在不引起^肉 貝里一致可量測增加之情況下促進骨生長。 在某些方面中，本案之揭示提供包含與活化素結合之 可溶性活化素結合性ActRIIa多肽。可將ActRiia多狀調 配成包含活化素結合性AetRIIa多肽及醫藥學上可接受之 載劑的醫藥製劑。較佳地，活化素結合性AetRna多狀以 小於1微莫耳或小於100、10或！奈莫耳之^與活化素 結合。視情況，活化素結合性ActRIIa多肽相對於gDfu 及/或GDF8選擇性結合活化素，且較佳以比對力gDF } i 及/或GDF8之Kd低至少1〇倍、2〇倍或％倍之L與活 化素結合。儘管不希望受特定作用機制束缚，但仍預期此 對於活化素抑制優於GDF11/GDF8抑制之選擇性程度為對 骨骼有選擇性影響而對肌肉無一致可量測影響的原因。在 許多具體實例中，將選擇ActRIIa多肽以在達成對骨骼之 所需影響的劑量下引起肌肉增加小於15%、小於1〇%或小 於5%。較佳地，如由尺寸排阻層析法所評估，組合物相 對於其他多狀組份之純度至少為95%，且更佳地，組合物 之純度至少為98〇/〇。在該製劑中使用之活化素結合性 ActRIIa多肽可為本文所揭示之彼等多肽中之任一者，諸 如具有選自SEQ ID NO: 2、3、7或12之胺基酸序列的多 肽’或具有與選自SEQ ID NO: 2、3、7、u或13之胺基 酸序列至少80%、85%、90%、95%、97。/。或99%_致之胺 9 200900076 基酸序列的多肽。活化素結合性ActRiIa多肽可包括天然 ActRIIa多肽之功能片段，諸如包含選自SEq出恥,u (「尾巴」）之SEQ 3 0個胺基酸之功能 之序列或缺乏C末端10至15個胺基酸 ID NO·· 2之序列的至少個、2〇個或 片段。 可溶性活化素結合性ActRIIa多肽相對於天然產生之 ActRIIa多肽在胺基酸序列令（例如配位體結合域中）可 包括-或多處變異。變# ActRIIa多肽之實例提供於以引 用的方式併入本文中之W〇 2〇〇6/〇12627，第59 6〇頁中。 胺基酸序列的變異彳（例如）改變當於哺乳動物、昆蟲或 ，、他真核細胞中產生時多肽之糖基化或相對於天然產生之 ActRiIa多肽改變多肽之蛋白質裂解。 活化素結合性ActRiIa多肽可為具有ActRna多肽（例 士 ActRiIa之配位體結合部分）作為一個域及一或多個提 供所需特性之其他域的融人 4的Μ 5蛋白’该特性諸如改良之藥物 動力學、較容易之純化、對特定組織之㈣等。舉例而言， 融合蛋白之域可增強活體内穩定性、活體内半生期、吸收/ 投藥、組織定位或分布、蛋白質複合物形成、融合蛋白多

聚化、及/或純化中之一 $ I Α夕者。二聚或多聚化可提供增加 之配位體結合親和力。活 刀活化素結合ActRiIa融合蛋白可包 括免疫球蛋白 FC祕, 域（野生型或突變體）或血清白蛋白或 提供諸如改良之藥物動力璺 勒刀學、改良之溶解性或改良之穩定 性之所需特定的其他多妝八 ^ 夕狀分。典型地，ActRIIa-Fc融合 蛋白將以同源二聚複合物 物之形式產生。視情況，ActRIIa-Fc 10 200900076 融合體包含位於Fc域與細胞外ActRIIa域之間的相對未結 構化連接子。此未結構化連接子可對應於在ActRHa之胞 外域之c末端處的約15個胺基酸未結構化區（「尾巴」）， 或其可為1個、2個、3個、4個或5個胺基酸之人工序列 或長度介於5個與15個、2〇個、3〇個、5〇個或更多個胺 基S文之間相對無一級結構的人工序列，或二者之混合物。 連接子/可富含甘胺酸及脯胺酸殘基且可（例如）含有蘇胺 -曼、糸胺I及甘胺酸之單一序列或蘇胺酸/絲胺酸及甘胺酸 之重複序列（例如，ΤΑ或S'單一體或重複體）。融合 ，白可包括純化序列，諸如抗原決^基標籤、flag標藏、 夕、，且胺酸序列、及GST融合體。視情況，可溶性 多肽包括-或多個選自以下各者之經修飾胺基酸殘基：糖 基化胺基酸、PEG化胺基酸、法呢基化胺基酸、乙醯化胺 基酸、經結合生物素之胺基酸、與脂質部分結合之胺基酸、 及與有機衍生劑結合之胺基酸。醫藥製劑亦可包括一或多 種其他化合物，諸如用於治療骨病症之化合物。較佳地， 醫藥製劑實質上無熱原冑…般而言，Ac觀a蛋白較佳 ;σ適地介導ActRIIa蛋白之天然糖基化之哺乳動物細胞 系中表現以減小患者之不利免疫反應的可能性。已成功使 用人類細胞系及CH0細胞系，且預期其他常用喷乳動物 表現系統將適用。 如本文所述，ActRIIa蛋白（命名為ActRHa_Fc )具有 所需特性，包括相對於GDF8及7或GDFu與活化素之選 δ尚親和力配位體結合及在動物模型中長於兩週 11 200900076 之血清半生期。在某些具體實例中，本發明提供ActRIIa_Fe 多肽及包含該等多肽及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥製 劑。 在某些方面中’本案之揭不提供編碼可溶性活化素社 合性ActRIIa多肽之核酸。經分離聚核苷酸可包含可溶性 活化素結合性ActRIIa多肽（諸如上述）之編碼序列。舉 例而言，經分離核酸可包括編碼ActRIIa之胞外域（例如 配位體結合域）之序列及將編碼ActRIIa之部分或全部跨 膜域及/或細胞質域，但編碼位於跨膜域或細胞質域内或位 於胞外域與跨膜域或細胞質域之間的終止密碼子之序列。 舉例而言，經分離聚核苷酸可包含全長ActRIIa聚核苷酸 序列（諸如SEQ ID NO: 4或5)或部分截斷型式，該經分 離聚核苷酸進一步包含轉錄終止密碼子，其處於3,末端之 前至少六百個核普酸處或以其他方式定位使得聚核普酸之 轉譯產生視情況與全長ActRIIa之 域。較佳之核酸序列為SEQ ID NO: 酸可與表現啟動子以可操作方式連接 經該等重組性聚核苷酸轉型之細胞。 動物細胞，諸如CHO細胞。 之戴斷部分融合之胞外 14。本文所揭示之核 •接’且本案之揭示提供 ’。較佳地，細胞為哺乳

在某些方 合性ActRIIa多肽之方法。該方法 卵巢（CHO )細胞之合適細胞中表 之任一者（例如SEQ ID NO: 4、5或 a)在適合於表現可溶性ActRIIa多 12 200900076 八中a.’、田胞經可溶性ActRIIa表現構築體轉型；及b)回 收如此表現之可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRna多肽 可以粗製、經部分純化或經高度純化之部分的形式回收。 純化可由—系列純化步驟達成，該等純化步驟包括（例如） 以任何次序進行之以下各者中之一者'兩者或三者或三者 乂上蛋白貝A層析、陰離子交換層析（例如Q璦脂糖）、 疏水性相互作用層析（例如苯基瓊脂糖）、尺寸排阻層析 及陽離子交換層析。

在某些方面中’本文所揭示之活化素_ActRIIa拮抗劑， 諸如可溶性活化素結合性ActRIIa多肽，可在促進個體之 骨生長或增加個體之骨密度的方法中使用。在某些具體實 例中，本案之揭示提供治療有需要之患者與低骨密度相關 之病症或促進有需要之患者骨生長的方法。方法可包含將 有效量之活化素-ActRIIa拮抗劑投予有需要之個體。在某 些方面中’本案之揭示提供活化素-ActRJIa拮抗劑製造用 於治療如本文所述之病症或病狀之醫藥品的用途。 在某些方面中’本案之揭示提供鑑別刺激骨生長或刺 激骨礦化增加之藥劑的方法。該方法包含：a )鑑別與活化 素或ActRIIa多肽之配位體結合域結合之測試藥劑；及b) 評估該藥劑對骨生長或骨礦化之影響。 【實施方式】 發明詳述 1.綜述 13 200900076 =生長因子·p(TGF_p)@㈣含有多種 序列70素及結構基元之生長因子。已知此等蛋白質對脊： 動物與無脊椎動物中之多種έ 椎 夕種細胞類型產生生物作用。超家 族之成員在胚胎發育期間在圖案形成及組織特化方面執行 重要功=可影響多種分化過程，包括脂肪生成、肌肉生 成軟月生成、心臟生成、血細胞生成、神經生成及 細胞分化。該家族分成兩個—般分支：bmp/gdf與扣, 活化素/BMP10分支，其成員具有不同的、通常互補之作 用。藉由操縱㈣家族之成員的活性，通常有可能引起 有機體之顯著生理變化。舉例…皮埃蒙特牛 (Piedmontese cattle )及屮 口* 奸山, ;及比利時藍牛（Belgian Blue cattle) 品種帶有纟GDF8(亦稱為肌肉抑素）基因中之功能喪失 突變’該突變引起肌肉質量明顯增加。等人如

Genet· 1997, 17(1):71_4。此外，在人類中，咖8之非活 I·生等位基因與肌肉質量增加相關，且據報導與異常強度相 關 Schuelke 等人，N Engl J Med 2004, 350:2682-8。 i 活化素為屬於TGF-β超家族之二聚多肽生長因子。存 在二種主要活化素形式（A、B & ab )，其為兩種密切相 關之β子單疋之同源二聚體/異源二聚體（bpA、pBpB及 βΑβΒ)。人類基因組亦編碼主要於肝中表現之活化素c及 活化素Ε。在TGF-β超家族中，活化素為可刺激卵巢細胞 及胎盤細胞中激素產生，支持神經元細胞存活，根據細胞 類❹正面或負面影響細胞週期冑程，纟至少在兩樓動物 胚胎中誘導中胚層分化之獨特及多功能因子（Depa〇i〇等 14 200900076 人，1991，Pr〇e Soc Ep Bi〇1 Med 198:500 512 ; Dys〇n 等人， 1997, Curr Biol. 7:81-84 ； Woodruff, i998, Biochem

Pharmacol. 5 5:953-963 )。此外，發現自受激人類單核白 血病細胞分離之紅血球分化因子（EDF )與活化素A相同 (Murata 等人，1988, pNAS，85:2434 )。已表明活化素 a 充當骨髓中紅血球生成之天然正性調節劑。在若干組織 中’活化素信號轉導受其相關異源二聚體抑制素（inhibin) 拮抗。舉例而言，在卵泡刺激激素（fsh )自垂體釋放期 間’活化素促進FSH分泌及合成’而抑制素阻止FSH分 泌及合成。可調節活化素生物活性及/或與活化素結合之其 他蛋白質包括卵泡抑素（FS )、卵泡抑素相關蛋白（FSRp ) 及α2 -巨球蛋白。 TGF-β信號係由I型與π型絲胺酸/蘇胺酸激酶受體之 異聚複合物介導’該等異聚複合物在配位體刺激後即使下 游 Smad 蛋白磷酸化並活化（MassaguS, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol_ 1:169-178)。此等I型及II型受體為包含具有 虽含半胱胺酸區域之配位體結合胞外域、跨膜域及具有預 測絲胺酸/蘇胺酸特異性之細胞質域的跨膜蛋白。I型受體 為信號轉導所必需；且Π型受體為結合配位體及表現I型 受體所需。I型及π型活化素受體在配位體結合後形成穩 定複合物’使得I型受體由π型受體磷酸化。 兩種相關II型受體ActRIIa與ActRIIb已被鑑別為活 化素之 II 型受體（Mathews 及 Vale, 1991, Cell 65:973-982 ; Attisano 等人，1992，Cell 68: 97-108 )。除活化素以外， 15 200900076

ActRIIa及ActRIIb可與若干其他Τ(3ρ_β家族蛋白質（包 括BMP7、Nodal、GDF8及GDF11 )以生物化學方式相互 作用（Yamashita 等人，1995, J· Cell Biol. 130:217-226 ; Lee 及 McPherron，2001，Pr〇c· Natl. Acad. Sci. 98:9306-931 1 ; Yeo 及 Whitman，2001, Mol. Cell 7·· 949-957; Oh 等人，2002

Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4為活化素、尤其活化素A 之主要I型受體，且ALK-7亦可充當活化素、尤其活化素 B之受體。 f ' 如本文所證實，顯示與其他TGF_p家族成員（諸如GDF8 或GDF 1 1 )對比在與活化素a結合方面顯示實質性優先性 的可溶性ActRIIa多肽（sActRIIa )有效促進活體内骨生長 -且增加活體内骨密度。儘管不希望受任何特定機制束缚， 仍預』sActRIIa之作用主要由活化素拮抗劑作用所引 起，假定此等研究中所使用之特定sActRIIa構築體顯示極 化素、、、°合（皮莫耳解離常數）。無論機制如何，自本 、文所呈現之資料顯而易見，ActRna·活化素拮抗劑的確增 ^ 常J 月貝疏鬆症之小鼠模型及多發性骨髓瘤之小 型的骨密度。應注意，骨為動態組織，其生長或收縮 足费度增加或減小視產生骨並刺激礦化之因子（主要為造 :細胞）=破壞骨並使之脫礦質之因子（主要為破骨細胞） 、衡而疋。骨生長及礦化可藉由增加產生因子、藉由減 〉'破壞因子，+ 歲藉由二者同時來增加。術語「促進骨生長 料"月礦化」係指可觀測之骨骼實體變化且關於骨骼 定化發生的機制意欲為中性的。 16 200900076 本文所述之研究中所使用之骨質疏鬆症及骨生長/密度 的小鼠模型被視為對人類中之功效具有高度預測性，且由 此本案之揭不提供使用ActRIIa多肽及其他活化素_

ActRUa拮抗劑促進人類骨生長且增加人類骨密度的方法。 活化素ActRIIa拮抗劑包括（例如）活化素結合可溶性 ^她多肽、與活化素（尤其活化素A或B子單元，亦 .稱作βΑ或βΒ)結合且破壞ActRIIa結合之抗體、與ActRIIa 、、。口且破裏活化素結合之抗體、選擇用於活化素或AdRHa 〇結合之非抗體蛋白（對於該等蛋白質的實例及設計並選擇 該等非抗體親和力結合試劑之方&，參見，例如 WO/2002/088171、W〇/2〇〇6/〇55689 及 w〇/2〇〇2/〇32925 )， 及選擇用於活化素或ActRIIa結合（通常附著於以域）之 隨機化狀。兩種具右、壬彳μ _ι> 、有活化素或ActRIIa結合活性之不同蛋

白夤（或八他邙仝），尤其分別阻斷I型（例如可溶性I 里活化素又體）及II型（例如可溶性Η型活化素受體）結 +位點之活化素結合劑’可連接在一起以產生雙功能結合 "分子。亦可使用抑制活化素_ActRIIa信號轉導轴之核酸適 體、小分子及其他藥劑。多種蛋白質具有活化素_ActRHa 拮抗劑活性，包括抑制素（亦即，抑制素α子單元）（儘 管抑制素並不普遍地在所有組織中拮抗活化素）、印泡抑 素（例如，卵泡抑素_288及卵泡抑素-3丨5 ) 、FSRp、活化 素C、α(2)-巨球蛋白，及Ml〇8A (在位置ι〇8處甲硫胺酸 變成丙胺酸）突變活化f A。一般而言，活化素之替代形 式’尤其在I型受體結合域中具有變異之彼等活化素，可 17 200900076 與π型受體結合且未能形成活性三元複合 抗劑。另外，抑制活化素A、B、c或 此充虽才口 表現之核酸（諸如反義分子、siRNA 3 ” ρ制ActRIIa

Ah Μ- 或核糖核酸酶）可用

作活化素―枯抗劑。較佳地，待使用 J 括抗劑將顯示對比㈣家族之其他成員： G刪及GDFU抑制活化素介導之信 其相對於 溶性ActRIIb蛋白的確盥活化素 A 、、、擇性。可 J吨，、在化素結合，然而，野生 質並不顯示對& G卿u與活化素結合之顯著選擇性 初步實驗表明此蛋白質^提供對^之所㈣響，同時 亦引起實質性肌肉生長。然而，已鑑別具有不同結合特性 之ActRIIb變異形式（參見，例如w〇 2〇〇6/〇12627,第w $ 頁’其以引用的方式併入本文中），且此等蛋白質:9 對骨絡之所要影響。可藉由與第二活化素選擇性結合劑偶 合而給予原生或變# ActRIIb以增加之對活化素之特異 在本發明之情形内且在使用各術語之特定情形中，本 :兄明書中所使用之術語—般具有其在此項技術中之普通含 義。某些術語於下文或本說明書中之其他地方加以討論: 以在描述本發明之組合物及方法以及如何製造及使用其方 面向從業者提供額外導則。術語之任何使用之範疇或含義 將自使用該術語之特定情形顯而易見。 「約」一般應意謂在給定量測之性質或精度下所量蜊 之里的可接受誤差程度。典型地，例示性誤差程度處於給 定值或值範圍之20〇/。内、較佳1〇%内，且更佳5%内。 18 200900076 其他且尤其在生物系姑士 _ 系統中，術語「約」可意謂處於給 疋值之一個數ϊ級内、較佳 咚非£亡避— 倍以内且更佳2倍以内之值。 除非另有規疋，否則本文仏 ^ . RS . ^ ± 所a出之數量為近似值，其意謂 虽未明確規疋時可推斷出術語「約」。 本發明之方法可包枯脸t 括將序列彼此比較之步驟’包括將 野生型序列與一或多個穿戀_ / ^體（序列變體）比較。該等比 較典型地包含（例如）使 ^ 便用序列對準程式及/或此項技術中

\

所熟知之讀鼻法（僅舉幾個例子，例如BLAST、FASTA ^ Μ驗LIGN)將聚合物序列對準。熟習此項技術者可易 於瞭解，在該等對準中，當突變含有殘基插人或缺失時， =列對準將在不含有所插入或所缺失之殘基的聚合物序列 引^「空位」（典型地由破折號或「A」表示）。 …@源」（所有其语法形式及拼法變化）係指具有「共 同演化起源」t兩種蛋白質之間的關係，該等蛋白質包： 來自相同有機體物種中之超家族之蛋白質以及來自不同有 Μ物種之同源蛋白f。該等蛋白質（及其編碼核酸）具 有如由其序列相似性，根據—致性百分比抑或由特定殘基 或土元及保寸位置的存在所反映之序列同源性。 丑術語「序列相似性」（所有其語法形式）係指在可能 共用或可能不共用共同演化起源之核酸序列或胺基酸序列 之間的一致性或對應性之程度。 然而’在常見用法中及本發明應用中，術語「同源」 當經諸如「高度」之副詞修飾時可指代序列相似性且可能 或可能不涉及共同演化起源。 19 200900076 2.ActRIIa 多狀 在某些方面ΐ，本發明係關於ActRIIa多肽。如本文 所用之術語「ActRIIa」係指來自任何物種之Ila型活化素 受體（ActRIIa )蛋白質家族及藉由突變或其他修飾而衍生 自該等ActRIIa蛋白之變體。在本文中提及ActRIIa應理 解為提及目前所鑑別之形式中之任一者。ActRIIa家族之 成員一般為包含具有富含半胱胺酸區域之配位體結合胞外 域、跨膜域及具有預測絲胺酸/蘇胺酸激酶活性之細胞質域 的跨膜蛋白。 術語「ActRIIa多肽」包括包含ActRIIa家族成員之任 何天然產生多肽以及其保留有用活性之任何變體（包括突 變體、片段、融合體及肽模擬物形式）之多肽。舉例而言， ActRIIa多肽包括衍生自序列與ActRIIa多肽之序列至少約 80%—致且較佳至少 85%、90%、95%、97%、99%或更高 一致性的任何已知ActRIIa之序列的多肽。舉例而言，本 發明之ActRIIa多肽可與ActRIIa蛋白及/或活化素結合且 抑制其功能。較佳地，ActRIIa多肽促進骨生長及骨礦化。 ActRIIa多肽之實例包括人類ActRIIa前驅多肽（SEQ ID NO: 1 )及可溶性人類ActRIIa多肽（例如，SEQ ID NO: 2、3、 7 及 12)。 人類ActRIIa前驅蛋白序列如下：

MGAAAKLAFAVFLTSCSSGATLGRSRTQEn.FFNANWF.KnR

TKQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKMSGSIEIVKQGCWLDDINC

YDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNP 20 200900076

VTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPT

QDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIF

PIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLIT

AFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGLAYLHEDIPGLKDG

HKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQ

VGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELASRCTAA

DGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRDYWQKHA

GMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIITTEDIV TVVTMVTNVDFPPKESSL ( SEQ ID NO: 1 ) 信號肽加單下劃線；胞外域為粗體且潛在N-連接糖基 化位點加雙下劃線。 人類ActRIIa可溶性（細胞外）經加工之多肽序列如 下：

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFA TWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGN MCNKKFSYFPRMRVTOPTSNPVTPKPP ( SEQ ID NO： 2 ) 胞外域之C末端「尾巴」加下劃線。「尾巴」缺失之 序列（△ 1 5序列）如下： ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFA TWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGN MCNEKFSYFPEM ( SEQ ID NO: 3) 編碼人類ActRIIa前驅蛋白之核酸序列如下（Genbank 條目 NM—001616 之核苷酸 164-1705 ):

ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATC 21 200900076

TCCTGTTCTTCAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAG

TGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAA

ACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCA

TTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGT

GAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGA

CTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTT

GCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAG

AGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAG

CCACCCTATTACAACATCCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATG

TTAATTGCGGGGATTGTCATTTGTGCATTTTGGGTGTACAGGCAT

CACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTCCAACTCAAGACCCA

GGACCACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACCACTGCAG

TTATTAGAAGTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAA

AGCCCAGTTGCTTAACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAAT

ACAGGACAAACAGTCATGGCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTT

TGCCTGGAATGAAGCATGAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCA

GAAAAACGAGGCACCAGTGTTGATGTGGATCTTTGGCTGATCAC

AGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACTTTCTTAAGGCTAA

TGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAAACCATGGC

TAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAAAAG

ATGGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAA

AATGTGCTGTTGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTT

GGGTTGGCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATAC

CCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTAT 22 200900076

TAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCATTTTTGAGGATA

GATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTCTCGC

TGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTT

GAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGA

AGTTGTTGTGCATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTG

GCAGAAACATGCTGGAATGGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAG

AATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAGGTTATCAGCTGGATGT

GTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAACAAATATTAT

TACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATG TTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA ( SEQ ID NO: 4) 編碼人類ActRIIa可溶性（細胞外）多肽之核酸序列 如下： ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAA TGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAAC CGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCT GGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTT GGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAA AAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAA TATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCAC ACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC ( SEQ ID NO: 5) 在一特定具體實例中，本發明係關於可溶性ActRIIa 多肽。如本文所述之術語「可溶性ActRIIa多肽」一般係 指包含ActRIIa蛋白之胞外域之多肽。如本文所用之術語 23 200900076 「可溶性ActRIIa多狀」包括ActRlIa蛋白之任何天然產 生胞外域以及其任何變體（包括突變體、片段及肽模擬物 形式）。活化素結合性ActRIIa多肽為保留與活化素，尤 其與活化素AA、AB或BB結合之能力的ActRIIa多肽。 較佳地，活化素結合性ActRIIa多肽將以1 nM或更小之解 離常數與活化素AA結合。人類ActRIIa前驅蛋白之胺基 • 酸序列提供於下文中。ActRIIa蛋白之胞外域與活化素結 合且一般為可溶的，且由此可稱為可溶性活化素結合性 ActRIIa多肽。可溶性活化素結合性ActRIIa多肽之實例包 括SEQ ID NO: 2、3、7、12及13所說明之可溶性多肽。 SEQ ID NO: 7係稱為ActRIIa-hFc，且在實施例中進一步 描述。可溶性活化素結合性ActRIIa多肽之其他實例包含 除ActRIIa蛋白之胞外域以外之信號序列，例如蜜蜂蜂毒 肽（mellitin)前導序列（SEQ ID NO: 8)、組織纖維蛋白 溶酶原活化劑（TPA )前導子（SEQ ID NO: 9 )或原生ActRIIa 前導子（SEQ ID NO: l〇) 。SEQ ID NO: 13 所說明之 v ActRIIa-hFc多肽使用TPA前導子。

ActRIIa多肽之功能活性片段可藉由篩選自編碼 ActRIIa多肽之核酸的相應片段重組產生之多肽而獲得。 另外’片段可使用此項技術中已知之技術（諸如習知

Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學）來化學合成。可（以 重組方式或藉由化學合成）產生片段且對其測試以鑑別可 充當ActRIIa蛋白或由活化素介導之信號轉導之拮抗劑（抑 制劑）的彼等肽基片段。 24 200900076

ActRIIa多肽之功能活性變體可藉由篩選自編碼 ActRIIa多肽之相應突變核酸重組產生之經修飾多肽的文 庫而獲得。可產生變體且對其測試以鑑別可充當ActRIIa 蛋白或由活化素介導之信號轉導之拮抗劑（抑制劑）的彼 等變體。在某些具體實例中，ActRIIa多肽之功能變體包 含與選自SEQ ID NO: 2或3之胺基酸序列至少75%—致的 胺基酸序列。在某些狀況下，功能變體具有與選自SEQ ID NO: 2或3之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、 98%、99%或100%—致的胺基酸序列。 功能變體可藉由出於增強治療功效或穩定性（例如活 體外存放期及對活體内蛋白水解降解之抗性）之目的來修 飾ActRIIa多肽之結構而產生。該等經修飾之ActRIIa多 肽當經選擇以保留活化素結合性時被視為天然產生之 ActRIIa多肽之功能等效物。經修飾之ActRIIa多肽亦可（例 如）藉由胺基酸取代、缺失或添加而產生。舉例而言，合 理地預期白胺酸經異白胺酸或纈胺酸、天冬胺酸酯經麵胺 酸酯、蘇胺酸經絲胺酸的經分離置換或胺基酸經結構相關 胺基酸的類似置換（例如保守突變）不會對所得分子之生 物活丨生產生主要影響。保守置換為在胺基酸家族内發生之 與其側鏈相關之彼等置換。ActRIIa多肽之胺基酸序列的 變化是否產生功能同源物可易於藉由評估變體ActRiia多 肽以類似於野生型ActRIIa多肽之方式在細胞中產生反應 的能力來確定。 在某些具體實例中，本發明涵蓋ActRIIa多肽之特定 25 200900076 突變以改變多肽之糖基化。該等突變可經選擇以引入或消 除一或多個糖基化位點，諸如0-連接或N_連接糖基化位 點。天冬醯胺酸連接糖基化識別位點一般包含由適當細胞 糖基化酶特異性識別之三肽序列天冬醯胺酸_x_蘇胺酸（或 天冬醯胺酸-X-絲胺酸）（其中「X」為任何胺基酸）。變 異亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至野生型 ActRIIa多肽之序列中或使野生型ActRIIa多肽之序列經一 或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代而得（對於〇_連接糖基化 位點而言）。在糖基化識別位點之第一或第三胺基酸位置 中之一或兩者處的多種胺基酸取代或缺失（及/或在第二位 置處之胺基酸缺失）在經修飾之三肽序列處產生非糖基 化。增加ActRIIa多肽上之碳水化合物部分之數目的另一 方式為藉由使醣苷與ActRIIa多肽化學或酶促偶合。視所 使用之偶合模式而定，可使糖與以下各者連接：（a )精胺 酸及組胺酸；（b)游離羧基；（c)游離硫氫基，諸如半 胱胺酸之彼等游離硫氫基；（d )游離羥基，諸如絲胺酸、 " 蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等游離羥基；（e)芳族殘基，諸 如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基；或（f)麩 醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於1987年9月11日公開 之 WO 87/05330 中及 Aplin 及 Wriston (1981) CRC Crit. Rev.

Biochem.，第259-306頁中’該等文獻以引用的方式併入 本文中。移除存在於ActRIIa多肽上之一或多個碳水化合 物部分可以化學方式及/或以酶促方式實現。化學脫糖基化 可涉及（例如）將ActRIIa多肽暴露於化合物三氟曱烷磺 26 200900076 酸或等效化合物。此處理使得除連接糖（N-乙醯基葡糖胺 或N-乙醯基半乳糖胺）以外之多數或所有糖裂解，同時留 下完整胺基酸序列。化學脫糖基化由Hakimuddin等人（1987)

Arch. Biochem. Biophys. 259:52 及由 Edge 等人（1981) Anal. Biochem. 118:131 進一步描述。如由 Thotakura 等人（1987) Meth· Enzymol· 138:350所述，ActRIIa多肽上之碳水化合 物部分的酶促裂解可藉由使用多種内切醣苷酶及外切膽苷 酶來達成。當哺乳動物、酵母、昆蟲及植物細胞皆可引入 可受ActRIIa多肽之胺基酸序列影響之不同糖基化模式 時’該肽之序列適當時可視所使用之表現系統之類型而加 以調整。儘管預期其他哺乳動物表現細胞系、具有工程化 糖基化酶之酵母細胞系及昆蟲細胞同樣適用，但一般而 吕，於人類中使用之ActRIIa蛋白將在提供適當糖基化之 哺乳動物細胞系（諸如HEK293或CHO細胞系）中表現。 本案之揭示進一步涵蓋產生ActRIIa多肽之突變體、 尤其組合突變體組以及截斷突變體之方法；組合突變體組 尤其適用於鑑別功能變體序列。篩選該等組合文庫之目的 可在於產生（例如）可充當促效劑或拮抗劑或者共同具有 新穎活性之ActRIIa多肽變體。多種篩選檢定提供於下文 中，且該等檢定可用於評估變體。舉例而言，ActRHa多 肽變體可針對與Ac削a配位體結合、防止Μ·配位 '、ActRIIa夕肽結合或干擾由ActRna配位體引起之信 號轉導的能力來篩選。 ^

ActRIIa多肽或其變體之活性亦可在基於細胞之檢定 27 200900076 或活體内檢定中測試。舉例而言，可評估A_a多狀變 =對骨產生或骨破壞中所涉及之基因之表現的影響。必要 時，其可在一或多種重組性ActRiia配位體蛋白（例如活 ’、）存在下進行，且可轉染細胞以產生ActRIIa多肽及/ 或其變體，及視情況之ActRIIa配位體。同樣地，可將Ac則a 多肽投予小鼠或其他動物，且可評估一或多種骨特性，諸 β如密度或體積。亦可評估骨折之復原速率。雙能量X射線 吸收測疋法（DEXA)為評估動物骨密度之經充分確立之 非侵襲性定量技術 其 厅在人類中，中央DEXA系統可用於評 脊月及月盆中之骨密度。該等密度為總體骨密度之最佳 預測因子。外周DEXA系統可用於評估包括（例如）手骨、 腕骨、踝骨及^的外周骨中之f密度。包括cat掃描之 傳統X射線成像系統可用於評估骨生長及骨折復原。亦可 評估骨骼之機械強度。 可產生相對於天然產生之ActRHa多狀具有選擇性或 一般增加之效能的組合衍生變體。同樣地，突變可產生且 有顯著不同於相應野生M A_a多肽之細胞内半生期的 ㈣。舉例而言’可使變異蛋白質對蛋白水解降解或^起 =生A爾a多肽破壞或以其他方式失活之其他細胞過程 ^穩定或較不穩定。該等變體及其編瑪基因可用於藉由 周即ActRIIa多肽之半生期而改變多肽含量。兴 例而言’短半生期可引起更短暫之生物作用且可允許更^ 格控制患者體内重組性Ac前珏多肽含量。在^融合蛋白 中，可在連接子（若有）及/或Fe部分中進行突變以改變 28 200900076 蛋白質之半生期。 組合文庫可經由編碼各自包括至少一部分潛在ActRIIa 多肽序列之多肽文庫的基因簡并文庫來產生。舉例而言， 可使合成寡核苷酸之混合物酶促接合至基因序列中使得潛 在ActRIIa多肽核苷酸序列之簡并組可表現為個別多肽或 者可表現為一組較大融合蛋白（例如，對於噬菌體呈現）。 存在許多可用於自簡并募核苷酸序列產生潛在同源物 之文庫的方式。簡并基因序列的化學合成可在自動DNA 合成器中進行’且接著使合成基因接合至適當表現載體 中。簡并寡核苷酸的合成在此項技術中已為熟知（參見， 例如 Narang，SA (1983) Tetrahedron 39:3 ; Itakura 等人， (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos.

Macromolecules，AG Walton 編，Amsterdam: Elsevier 第 273-289 頁；itakura 等人，（1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323 ; Itakura 等人，（1984) Science 198:1056 ; Ike 等人， (1983) Nucleic Acid Res. 1 1:477)。該等技術已在其他蛋 白質之定向演化中使用（參見，例如Scott等人，（1990)

Science 249:386-390 ; Roberts 等人，（1992) PNAS USA 89:2429-2433 ; Devlin 等人，（1990) Science 249: 404-406 ; Cwirla 等人，（1990) PNAS USA 87: 6378-63 82 ;以及美國 專利第 5,223,409 號、第 5，198,346 號及第 5,096,815 號）。 或者，其他形式之突變可用於產生組合文庫。舉例而 言，可藉由使用以下方式進行篩選而自文庫產生並分離 ActRIIa多肽變體：例如，丙胺酸掃描突變及類似方式（Ruf 29 200900076 等人，（1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang 等人，（1994) J. Biol· Chem. 269:3095-3099; Balint 等人，（1993) Gene 137:109-1 18 ; Grodberg 等人，（1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601 ; Nagashima 等人，（1993) J· Biol. Chem. 268:2888-2892 ； Lowman 等人，（1991) Biochemistry 30:10832-10838 ;及 Cunningham 等人，（1989) Science 244:1081-1085 );連接子掃描突變（Gustin 等人，（1993) Virology 193:653-660 ; Brown 等人，（1992) Mol. Cell Biol· 12:2644-2652 ; McKnight 等人，（1982) Science 232:316); 飽和突變（Meyers 等人，（1986) Science 232:613 ) ; PCR 突變（Leung 等人，（1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); 或隨機突變（包括化學突變等）（Miller等人，（1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor’ NY ;及 Greener 等人，（1994) Strategies in M〇1 m〇1 7:32-34 )。連接子掃描突變，尤其在組合設定中，為鑑別 截斷（生物活性）形式之ActRIIa多肽的具吸引力之方法。 廣泛技術在此項技術中已知用於篩選藉由點突變及截 斷所得之組合文庫之基因產物且就此而言用於篩選cDna 文庫中具有某種特性之基因產物。該等技術-般將適於快 速篩選由ACtRIIa乡月太之組合突變所產生之基因文庫。最 廣泛使用之師選大基因文庫之技術典型地包含將基因文庫 選殖至可複製表現載體中，用所得載體文庫轉型適當細 胞’且在所要活性之偵测有利於編碼基因（们料產物） 之载體相對容易地分離之條件下表現組合基因。較佳之檢 30 200900076 疋包括活化素結合檢定及活化素介導之細胞信號轉導檢 定。 在某些具體實例中，本發明之ActRIIa多肽除天然存 在於ActRIIa多肽中之任何者以外可進一步包含轉譯後修 飾。該等修飾包括（但不限於）：乙酿化、㈣、糖基化、 磷酸化、脂化及醯化。由此，經修飾之ActRna多肽可含 -有非胺基酸元素，諸如聚乙二醇、脂質、多聽或單醣，及 磷酸酯。該等非胺基酸元素對ActRIIa多肽之功能性的影 ' 響可如本文對於其他ActRlIa多肽變體所述來測試。當藉 由使初生形式之ActRIIa多肽裂解而在細胞中產生ActRna 多肽時，轉譯後加工對於蛋白質之正確摺疊及/或功能而言 亦為重要的。不同細胞（諸如CHO、HeLa、MDCK、293、 WmmH-STS或HEK293 )具有該等轉譯後活性之特定 細胞機構及特徵機制且可經選擇以確保ActRHa多肽之正 確修飾及加工。 在某些方面中，ActRIIa多肽之功能變體或經修飾形 式包括具有至少一部分ActRIIa多肽及一或多個融合域之 融&蛋白。6亥專融合域之熟知實例包括（但不限於）：多 組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶（GST)、硫氧還蛋 白（thioredoxin)、蛋白質A、蛋白質G、免疫球蛋白重 鏈恆定區（Fc)、麥芽糖結合蛋白（MBP)或人血清白蛋 白。融合域可經選擇以賦予所要特性。舉例而言，一些融 &域尤其適用於藉由親和層析分離融合蛋白。出於親和純 化之目的，使用親和層析之相關基質，諸如麩胱甘肽結人 31 200900076 樹脂、澱粉酶結合樹脂及鎳結合樹脂或鈷結合樹脂。該等 基質中有許多可以「套組」形式獲得，諸如適用於（HIS6 ) 融合搭配物之Pharmacia GST純化系統及QIAexpressTM系 統（Qiagen )。作為另一實例，融合域可經選擇以有利於 偵測ActRIIa多肽。該等偵測域之實例包括各種螢光蛋白 (例如GFP )以及「抗原決定基標籤」，其通常為特定抗 ' 體可用之短肽序列。特定單株抗體可易於使用之熟知抗原 決定基標籤包括FLAG、流感病毒紅血球凝集素（ha )及 c-myc標籤。在一些狀況下，融合域具有蛋白酶裂解位點， 諸如因子Xa或凝血酶之蛋白酶裂解位點，其允許相關蛋 • 白酶部分消化融合蛋白且從而自其釋放重組蛋白。可接著 由後續層析分離使所釋放之蛋白質自融合域分離。在某些 較佳具體實例中’ ActRIIa多肽與活體内穩定ActRIIa多肽 之域（「穩定子」域）融合。「穩定」意謂增加血清半生 期之任何者，無論其係由於破壞減小、腎清除減小抑或其 他藥物動力學效應而達成。已知與免疫球蛋白之Fc部分 的融合賦予大範圍之蛋白質以所需藥物動力學特性。同樣 地，與人血清白蛋白之融合可賦予所需特性。可選擇之其 他類型融合域包括多聚（例如二聚、四聚）域及功能域（賦 予其他生物功能，諸如必要時進一步刺激骨生長或肌肉生 長）。 作為一特定實例，本發明提供包含與F c域融合之 ActRIIa之可溶性胞外域的融合蛋白（例如SEQ ID NO: 6 )。 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVa( 32 200900076

A)VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV

LHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP

PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

DSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHK(A)HYTQKSL SLSPGK* 視情況，Fc域在諸如Asp-265、離胺酸322及Asn-43 4 之殘基處具有一或多處突變。在某些狀況下，具有此等突 變中之一或多者（例如Asp_265突變）之突變Fc域相對於 野生型Fc域與Fey受體結合之能力減小。在其他狀況下， 具有此等突變中之一或多者（例如Asn-434突變）之突變 Fc域相對於野生型Fc域與I類MHC相關Fc受體（FeRN) 結合之能力增加。 應瞭解融合蛋白之不同元素可以與所要功能性相符之 任何方式排列。舉例而言，可將ActRIIa多肽置放於異源 域之C末端或者可將異源域置放於ActRIIa多肽之C末端。 ActRIIa多肽域與異源域在融合蛋白中無須相鄰，且其他 域或胺基酸序列可包括於任一域之C末端或N末端中或介 於該等域之間。 在某些具體實例中，本發明之ActRIIa多肽含有一或 多種能穩定ActRIIa多肽之修飾。舉例而言，該等修飾增 強ActRIIa多肽之試管内半生期，增強ActRIIa多肽之循 環半生期或減少 ActRIIa多肽之蛋白水解降解。該等穩定 化修飾包括（但不限於）：融合蛋白（包括，例如包含ActRIIa 多肽及穩定子域之融合蛋白）、糖基化位點之修飾（包括， 33 200900076 例如將糖基化位點添加至ActRIIa多肽中），及碳水化合 物部分之修飾（包括，例如自ActRIIa多肽移除碳水化合 物部分）。在融合蛋白之狀況下，ActRIIa多肽與諸如igG 分子之穩定子域（例如Fc域）融合。如本文所用之術語 穩疋子域」不僅係指如在融合蛋白之狀況下的融合域（例 如Fc)，而且包括諸如碳水化合物部分之非蛋白類修飾或 諸如聚乙二醇之非蛋白類聚合物。 在某些具體實例甲，本發明製造可用之經分離及/或經 ( 純化形式之ActRIIa多肽，其係與其他蛋白質分離或以其 他方式實質上無其他蛋白質。ActRIIa多肽一般將自重組 性核酸藉由表現而產生。 3 ·!!_石馬ActRIIa吝狀之核醅 在某些方面中，本發明提供編碼ActRIIa多肽（例如 可/合f生ActRIIa多肽）中之任一者（包括本文所揭示之片 &、功能變體及融合蛋白）之經分離核酸及/或重組性核酸。 :例而°，SEQ ID N0: 4編碼天然產生之人類ActRIIa前 、 驅多肽，而SEQIDN〇: 5編碼經加工之ActRIIa胞外域。 主題核酸可為單股或雙股。該等核酸可為DNa或rna分 子。此等核酸可（例如）在製造ActRIIa多肽之方法中使 用或用作直接治療劑（例如在基因療法中）。 在某些方面中，編碼ActRIIa多肽之主題核酸應進一 步1解為包括為SEQIDN0:4或5之變體的核酸。變體核 "序歹丨包括因一或多處核苷酸取代、添加或缺失而不同 之序列’諸如等位基因變體。 34 200900076 在某些具體實例中，本發明提供與SEQ ID N〇: 4或5 至少議、85%、90%、95%、97%、98%、99%或 1〇〇%一 致之經分離核酸序列或重組性核酸序列。一般熟習此項技 術者應瞭解，與SEQ ID N0: 4或5及SEQ⑴N〇: 4或5 之變體互補之核酸序列亦處於本發明之範疇内。在其他具 體實例中，本發明之核酸序列可為經分離的、重組性的及/ - 或與異源核苷酸序列融合，或在DNA文庫中。 f 在其他具體實例中，本發明之核酸亦包括在高度嚴格 條件下與SEQIDN〇:4或5所表示之核普酸序列、剛1〇 NO. 4或5之互補序列或其片段雜交之核苷酸序列。如上 文所纣論，一般熟習此項技術者應易於瞭解，可改變促進 厕A雜交之適當嚴格度條件。一般熟習此項技術者應易於 瞭解，可改變促進DNA雜交之適當嚴格度條件。舉例而 言，吾人可在約45。(：下於6.0 X氯化鈉/擰檬酸鈉（ssc) 中進行雜交，接著在5(TC下用2.0xSSC洗滌。舉例而言， 洗滌步驟中之鹽濃度可選自50。〇下約2〇 χ SSC2低嚴格 度至5(TC下約0.2 X SSC之高嚴格度。另外，洗滌步^中 之溫度可自室溫（約22。(：）之低嚴格度條件增至約65它之 高嚴格度條件。溫度與鹽均可改變，或可將溫度或鹽濃度 保持恆定同時改變另一變數.在一具體實例中，本發明^ 供在室溫下6 X SSC之低嚴格度條件下雜交、接著在室溫 下於2 X SSC中洗滌之核酸。 因遺傳密碼之簡并而不同於如SEQ id NO: 4或5中所 述之核酸的經分離核酸亦處於本發明之範疇内。舉例而 35 200900076 / 言，許多胺基酸係由一個以上三聯體表示。指定同—胺基 酸之密碼子或同義密碼子（例如CAu及CAC為組胺酸之 同義密碼子）可引起不影響蛋白質之胺基酸序列的「靜默」 犬變。然而，預期不引起主題蛋白質之胺基酸序列變化之 DNA序列多悲現象將存在於哺乳動物細胞當中。熟習此項 技術者應瞭解，編碼特定蛋白質之核酸之一或多個核苷酸 (至多約3-5%之核苷酸）的此等變化可因天然等位基因變 化而存在於特定物種之個體當中。任何及所有該等核苷酸 變化及所得胺基酸多態現象處於本發明之範疇内。 在某些具體實例中，本發明之重組性核酸可在表現構 築體中與一或多個調節核苷酸序列以可操作方式連接。調 節核苷酸序列一般將適於供表現用之宿主細胞。眾多類型 之適當表現載體及合適之調節序列在此項技術中已知用於 多種宿主細胞。典型地，該或該等調節核苷酸序列可包括 (但不限於）：啟動子序列'前導序列或信號序列、核糖 體結合位點、轉錄起始及終止序列、轉譯起始及終止序列， 及強化子序列或活化子序列。如此項技術中已知之組成性 或誘導性啟動子為本發明所涵蓋。啟動子可為天然產生之 啟：子或組合一個以上啟動子之元素的雜合啟動子。表現 構築體可存在於細胞中離合染色小體（諸如質體）上，或 可將表現構築體插入染色體中。在一較佳具體實例中，表 現載體含有可選擇標記基因以允許選擇經轉型之宿主細 胞。可選擇標記基因在此項技術中已為熟知且將隨所使用 之宿主細胞而變。 36 200900076 在本發明之某些方面中，主題核酸係提供於包含編碼 ActRIIa多肽之核苷酸序列的表現載體中且與至少一個調 節序列以可操作方式連接。調節序列經技術認可且經選擇 以引導ActRIIa多肽表現。因此，術語調節序列包括啟動 子強化子及其他表現控制元素。例示性調節序列描述於

Gene Expression Technology： Methods in 五似少卿/—, Academic press，San心別，ca 〇则）中。舉 例而5，§與DNA序列以操作方式連接時控制該DNA序 歹J表現之夕種表現控制序列中之任一者可在此等載體中使 用以表現編碼ActRIia多肽之DNA序列。該等有用之表現 控制序列包括（例如）_之早期及晚期啟動子、⑻啟 腺病毋或細胞巨大病毒即刻早期啟動子、rsv啟動 f lac系統、trp系統、TAC或trc系統、表現由丁7 rna 聚，酶引導之T7啟動子、噬菌Μ λ之主要操縱子及啟動 :區fd鞘蛋白之控制區、3-磷酸甘油酸激酶或其他醣解 酶之啟動子、酸性罐酸酶之啟動子（例如ph〇5)、酵母α_ 父配型因子之啟動子、桿狀病毒系統之多面體啟動子及已 决控制原核或真核細胞或其病毒之基因表現的其他序列， 及f各種組合。應瞭解’表現載體之設計可視諸如待轉型 之伯主細胞的選擇及/或欲待表現之蛋白質的類型而定。此 外’亦應考慮載體之複本數、控制彼複本數之能力及由載 體編石馬之任何其他蛋白質（諸如抗生素標記）的表現。 本教明之重組性核酸可藉由將所選殖之基因或其部分 接合至適合用於原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆蟲 37 200900076 或哺乳動物）或二者中之表現的載體中來產生。產生重組 性ActRIIa多肽之表現媒劑包括質體及其他载體。舉例而 言，合適之載體包括以下類型之質體：供原核細胞（諸如 大腸桿m π/〇 )中之表現用的衍生自pBR322之質 體、衍生自PEMBL之質體、衍生自ρΕχ之質體、衍生自 pBTac之質體及衍生自pUC之質體。 一些哺乳動物表現載體含有有利於載體於細菌中繁殖 之原核序列與一或多個在真核細胞中表現之真核轉錄單 兀。衍生自 pCDNAI/amp、pcDNAI/neo'pRc/CMV、pSV2gpt、 PSV2ne〇、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、 pk〇-neo及pHyg之載體為適合於真核細胞之轉染的哺乳動 物表現載體之實例。一些此等載體經來自細菌質體（諸如 PBR322 )之序列修飾以有利於原核細胞與真核細胞中之複 製及耐藥性選擇。或者，病毒之衍生物，諸如牛乳頭狀瘤 病毋（BPV-1 )或愛-巴病毒（EpStein Barr 、 何生自pREP，及P205 )，可用於在真核細胞中瞬間表現 蛋白質。其他病毒（包括反轉錄病毒）表現系統之實例可 見於下文基因療法傳遞系統之描述中。質體製備中及宿主 有機體轉型中所使用之各種方法在此項技術中已為熟知。 對於原核細胞與真核細胞之其他合適之表現系統以及一般 重、、3·隹終，參 t Molecular Cloning A Laboratory Manual，赛 3 版，Sambrook，Fritsch 及 Maniatis 編（Cold Spring Harbor

Laboratory Press，2001)。在一些情況下，可能需要藉由使 用桿狀病毒表現系統來表現重組性多肽。該等桿狀病毒表 38 200900076 現系統之實例包括衍生自pVL之載體（諸如pVL 1392、 pVL1393及pVL941 )、衍生自pAcUW之載體（諸如 pAcUWl )，及衍生自pBlueBac之載體（諸如含有pBiueBac III 之 β-gal) 〇 在一較佳具體實例中，載體將經設計用於在CHO細胞 中產生主題ActRIIa多肽，該載體諸如Pcmv_Script載體 (Stratagene, La Jolla, Calif.)、pcDNA4 載體（invitr〇gen， r

Carlsbad，Calif.)及 pCI-neo 載體（Promega，Madis〇n,

Wise.)。將顯而易見，主題基因構築體可用於促成主題 ActRIIa多肽在於培養物中繁殖之細胞中表現，（例如） 以產生包括融合蛋白或變體蛋白之蛋白質以供純化。 本案之揭示亦係關於經重組性基因轉染之宿主細胞， 該重組性基因包括主題ActRIIa多肽中之一或多者的編碼 序列（例如SEQIDNO:4或5)。該宿主細胞可為任何原 核細胞或真核細胞。舉例而言，本發明之Μ·多狀可 在諸如大腸桿菌之細菌細胞、昆蟲細豸（例如，使用桿狀 病毋表見系、)、酵母或哺乳動物細胞中表現。其他合適 之宿主細胞為熟習此項技術者所知。 、* ，本發明進一步係關於產生主題ActRIIa多肽之 方 +例而5，可在適當條件下培養經編碼ActRlIa多 肽之表現載體轉毕之说：& 朵之佰主、，，田胞以允許ActRIIa多肽之表現

發生。可使ActRlIa多肽自人古A 夕肽自3有ActRIIa多肽之細胞與培 養基之混合物分泌並分 刀離或者’可使ActRIIa多肽保捭 於細胞質中或膜部八击〇 d 夕肌侏锝 、刀中，且將細胞收集、溶解並分離蛋白 39 200900076

質。細胞培養物包括宿主細胞、培養基及其他副產物。供 細胞培養用之合適培養基在此項技術中已為熟知。可使用 此項技術中已知用於純化蛋白質之技術使主題ActRiia多 肽自細胞培養基、宿主細胞或二者分離，該等技術包括離 子父換層才斤、凝膠過濾層析、超濾、電泳、使用對ActRiia 多肽之特定抗原決定基具特異性之抗體進行免疫親和純化 及使用、纟。σ與ActRIIa多肽融合之域的試劑進行親和純化 (例如，蛋白質A管柱可用於純化ActRna_Fc融合體）。 在-較佳具體實例巾’ ActRlIa乡肽為含有有利於其純化 之域的融合蛋白。在-較佳具體實例巾，純化係由一系列 管柱層析步驟達成，該等管柱層析步驟包括（例如）以任 何次序進行之以下各者中之三者或三者以上：蛋白質A層 析' Q瓊脂糖層析 '苯基瓊脂糖層析、尺寸排阻層析及陽 離子交換層析。純化可以病毒過濾及緩衝液交換來完成。 如本文所證實，AetRHa-心蛋白經純化至如由尺寸排阻層 析所測定>98%且如由SDS PAGE所測定>95%之純度。此 純度足以對小鼠之骨達成所需影響且在小鼠、A鼠及非人 類靈長類動物中達成可接受之安全特徵。 在另一具體實例中，編碼純化前導序列，諸如處於重 組性ActRIIa多肽之所要部分之N末端的多聚汨腸激酶 裂解位點序列的融合基因可允許由親和層析使用Ni2 +金屬 樹脂純化所表現之融合蛋白。可接著藉由用腸激酶處理來 隨後移除純化前導序列以提供經純化< Μ·多狀（例 如，參見 ^atography 411^177 \

Hochuli 等人，（1987) 乂 40 200900076 及 Janknecht 等人，pams ^3 88:8972 )。 製造融合基因之技術已為熟知。基本上，編碼不同多 肽序列之各種DNA片段的接合係根據習知技術，使用供 接合用之鈍端或交錯端末端、提供適當末端之限制酶消 化、適當時黏性末端之填人、避免不合需要之接合的驗性 碟酸酶處理及酶促接合來進彳卜在另—具體實例中，融合 基因可由包括自動化DNA *成器之習知技術來合成^ 者’基因片段之PCR擴增可使㈣定引子來進行，該等銷 定引子在兩個連續基因片段之間產生互補懸垂體；後可 使該兩個連續基因片段黏接以產生嵌合基因序歹“參見， ^'1^ Current Protocols in Molecular Biology, Ausub^ # Λ 編，John Wiley & Sons: 1992 )。 素及 ActRTTa 桔片劑 本文所呈現之資料§登貫活化素_ActRiia信號轉導之枯 抗劑可用於促進骨生長及骨壙化。儘管可溶性&則辽多° 肽且尤其Aet秦Fc為較佳抬抗劑且儘管該等括抗劑可經 =同於活化素拮抗（例如，活化素抑制可為藥劑抑制可能 匕括TGF-β超家族之其他成員的分子譜之活性之趨勢的指 標’且該集合抑制可對骨產生所要影響）之機制影響骨絡， 預期其他類型之活化素_AetRIia括抗劑為適用的，包括 二：素(例如A、B、C“)抗體、抗Ac_a抗體、 • Ct山產生之反義RNAi或核糖核酸酶核酸，及活 之其他抑㈣’尤其破壞活化素-一a …合之彼等抑制劑。 41 200900076

藉由使用衍生自 ActRna 多肽）特異性 或以其他方式 ActRIIa 多肽 應且破 多肽或活化素多肽之免疫

兔之哺乳動物可用免疫原性形式之ActRIIa多肽、能引出 抗體反應之抗原片段，或融合蛋白免疫。賦予蛋白質或肽 以免疫原性之技術包括與載劑結合或此項技術中所熟知之 其他技術。可在佐劑存在下投予ActRIIa或活化素多肽之 免疫原性部分。免疫之進程可藉由偵測血漿或血清中之抗 體政彳貝來監測。標準E LIS A或其他免疫檢定可與作為抗原 之免疫原一起使用以評估抗體含量。 用ActRIIa多肽之抗原製劑使動物免疫後，可獲得抗 血清且必要時可自血清分離多株抗體。為產生單株抗體， 可自經免疫之動物收集抗體產生細胞（淋巴細胞）且由標 準體細胞融合程序使其與永生化細胞（諸如骨髓瘤細胞） 融合以得到融合瘤細胞。該等技術在此項技術中已為熟 知，且包括（例如）融合瘤技術（最初由Kohler及Milstein， (1975) Nature，256: 495-497開發）、人類B細胞融合瘤技 術（Kozbar 等人，（1983) Immunology Today，4: 72)及產 42 200900076 -生人類單株抗體之EBV-融合瘤技術（Cole等人，（1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.第77-96頁）。可以免疫化學方式篩選融合瘤細胞以 產生與ActRIIa多肽特異性反應之抗體及自包含該等融合 瘤細胞之培養物分離之單株抗體。 如本文所用之術語「抗體」意欲包括其亦與主題多肽 特異性反應之片段。可使用習知技術使抗體片段化且以與 上文對於整個抗體所述相同之方式針對效用來篩選片段。 ¢-..... ' 舉例而言’ F(ab)2片段可藉由用胃蛋白酶處理抗體而產生。 可處理所得F(ab)2片段以還原雙硫橋來產生Fab片段。本 發明之抗體進一步意欲包括具有由該抗體之至少一個CDR 區所賦予之對ActRIIa或活化素多肽之親和力的雙特異 性、單鏈、嵌合 '人類化及完全人類分子。抗體可進一步 包含與其連接且能被偵測之標記（例如，標記可為放射性 同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子）。 在某些具體實例中，抗體為重組性抗體，該術語涵蓋 为由分子生物學之技術產生之任何抗體，其包括Cdr_ 移植或後合抗體、自經文庫選擇之抗體域裝配之人類抗體 或其他抗體、單鏈抗體及單域抗體（例如人類VH蛋白或 絡騎νΗΗ蛋白）。在某些具體實例中，本發明之抗體為單 株抗體’且在某些具體實例中’本發明獲得產生新穎抗體 之可用方法。舉例而言，產生與ActRIIa多肽或活化素多 狀特異性結合之單株抗體之方法可包含將一定量之包含有 效刺激可彳貞測免疫反應之抗原多肽的免疫原性組合物投予 43 200900076 小鼠’自該小鼠獲得抗體產生細胞（例如，來自脾之細胞） 且使該等抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合以獲得抗體產生 融合瘤，且測試該等抗體產生融合瘤以鑑別產生與抗原特 異性結合之單株抗體的融合瘤。一旦獲得，即可在細胞培 養物中、視情況在衍生自融合瘤之細胞產生與抗原特異性 結合之單株抗體的培養條件下使融合瘤繁殖。可自細胞培 養物純化單株抗體。 σ 如關於抗體所用之形容詞「與·.特異性反應之」音欲 意謂’如此項技術令一般瞭解’抗體在受關注抗原（例如 ActRIIa多狀）與其他非受關注抗原之間具足夠選擇性使 得該抗體適用於在最小量下㈣特定類型之生物樣本中受 關注抗原的存在。在使用# 便用抗體之某些方法（諸如治療性庫 用）中，較高結合特異性程声可騰 粒度可為所需的。單株抗體一般 ，、有有效區分所要抗原與交又反應多肽的較大趨勢（盘多 料體相比）。-種影響抗體：抗原相互作用之特異性的特 欲為抗體對抗原之親和力。儘管所要特異性可以-定範圍 之不同親和力來達成，但— ^ 般較佳之抗體將具有約10-6、 1〇_7、1〇-8、10-9 或更小 和力（解離常數）。假定活化 素與ActRIIa之間的結合描 — 極其緊岔，預期中和抗活化素或 k ActRIIa抗體一般將具有 〇 不飞 ^ 10或更小之解離常數。 另外，用於篩選抗體w t別所需抗體之技術可影塑所 獲得之抗體之特性。舉例而▲ + 议们知曰所 .2 而§，若抗體有待用於結合溶液 中之抗原，則可能需要測雙执 田她 °式'合液結合性。多種不同技術可 用於測試抗體與抗原之間 1 間的相互作用以鑑別尤其所需之抗 44 200900076 體。該等技術包括ELISA、表面電漿共振結合檢定（例如

BiacoreTM 結合檢定，Biacore AB，Uppsala，Sweden)、夾 心檢定（例如 IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland之順磁性珠粒系統）、西方墨點法、免疫沈澱檢 定及免疫組織化學法。 作為活化素或ActRIIa结抗劑之核酸化合物之類別的 實例包括反義核酸、RNAi構築體及催化核酸構築體。核 酸化合物可為單股或雙股。雙股化合物亦可包括懸垂或非 互補之區域’其中該等股中之一者或另一者為單股。單股 化合物可包括自我互補之區域，其意謂該化合物形成具有 雙螺旋結構區之所謂「髮夾」或「莖環」結構。核酸化合 物可包含與由全長ActRIIa核酸序列或活化素βΑ或活化素 βΒ核酸序列之不超過丨〇〇〇個、不超過500個、不超過250 個、不超過100個或不超過50個、35個、30個、25個、 22個、20個或18個核苷酸組成之區域互補的核苷酸序列。 個核苷酸，且視情況為至少 10個

。同樣地，雙股化 互補區較佳將為至少 或至少1 5個核茌西參 45 200900076 • ，口、物可為 DNA:DNA、DNA:RNA 或 RNA:RNA，且任一股 二:\括DNA ^ RNA之混合物以及不能容易地歸類為 爾或RNA之經修飾形式。核酸化合物可包括多種修飾 者其包括對骨架（天然核酸中之糖-礙酸酯部分， ^括核苷酸間鍵）或鹼基部分（天然核酸之嘌呤或嘧啶部 ^ )之—或多種修飾。反義核酸化合物較佳將具有約15 .個至約30個核苷酸之長度且通常將含有一或多種修飾以 Γ A良以下特徵：諸如在血清中、細胞中或化合物可能被傳 ' ° 處（諸如在經口傳遞之化合物的狀況下於胃中及對 於吸入型化合物而言於肺中）的穩定性。在構築體 之狀况下，與靶轉錄物互補之股一般將為RNA或其修飾 形式。另一股可為RNA、DNA或任何其他變化形式〔雙 股或單股「髮夾」RNAi構築體之雙鏈體部分較佳將具有 長度為18個至4〇個核普酸之長度且視情況長度為約η 個至23個核苦酸’只要其充當受質即可。催化或酶 I促核酸可為核糖核酸酶或驗酶且亦可含有經修飾之形 ^ 4。核酸化合物當在生理條件下及以無義或有義對照具有 極少或無作用之漠度與細胞接觸時可將輕之表現抑制約 50%、75%、90%或更多。測試核酸化合物之作用的較佳濃 度為1、5 & 10微莫耳。亦可針對對（例如）骨生長及擴 化的影響來測試核酸化合物。 5.篩選檢定 在某些方面甲，本發明係關於ActRHa多狀（例如可 溶性ACtRIIa多肽）及活化素多㈣別作為活化素·ActRIIa 46 200900076 信號轉導路徑之促效劑或拮抗劑之化合物（藥劑）的用途。 可測試經此篩選所鑑収化合物崎估其㈣試管内骨生 長或礦化之月b力。視情況，可在動物模型中進一步測試此 等化合物以評估其調節活體内組織生長之能力。 存在眾多方法以篩選藉由靶向活化素及Ac她多肽 而調節組織生長之治療劑。在某些具體實例中’可進行化 合物之高產量篩選以鐘別擾動活化素或&則a介導之對 骨路之影響的藥劑。在某些具體實例中，進行檢定以筛選 並鑑別特異性抑制或減少ActRIIa多肽與活化素結合之化 合物。或者，可使用檢定以鐘別增5金ActRIIa多肽與活化 素結合之化合物。在又一具體實例中’可由化合物與活化 素或ActRIIa多肽相互作用之能力來鑑別該等化合物。 多種檢定格局將足夠’且根據本案之揭示，本文令未 明確描述之彼等檢定格局仍為一般熟習此項技術者所瞭 解。如本文所述，本發明之測試化合物（藥劑）可由任何 組合化學方法產生。或者，主題化合物可為活體内或試管 内:成之天然產生生物分子。有待於針對充當組織生長之 :卽d的此力進仃測試之化合物（藥劑（例如）由細 囷、酵母、植物或其他有機體產生（例如天然產物），以 化學方式產生（例如小分子，包括狀模擬物），或以重組 =式產生。為本發明所涵蓋之測試化合物包括非狀基有機 刀:月太^肽、肽模擬物、糖、激素及核酸分子。在一 寺U只例中’測試藥劑為具有小於約2，_道爾頓之 分子量的小有機分子。 47 200900076 e本發明之測試化合物可以單一離散實體形式提供 提供於具有較高複雜性之文庫（諸如由組合化 : 文庫）中。此等文庫可包含（例如）醇、貌基鹵化物、2 酿胺、醋、酸、趟及其他種類之有機化合物。測 至測試系統之呈現可呈經分離之形式^化合物之現= 开"大（尤其在初始篩選步驟中）。視需要，化合物 況經其他化合物衍生化且具有㈣於化合物分離之衍生I 團。衍生基圏之非限制性實例包括生物素、營光素、^ 辛（dig〇xygenin)、綠色榮光蛋白、同位素、多組胺酸了 磁性珠粒、麩胱甘肽s轉移醢Γ Γςτ、 或其任何組合。#_(GST)、光可活化交聯劑 在測試化合物及天然提取物之文庫的許多藥物筛選程 式中，需要高產量檢定以使給定時段中調查之化合物的數 目最大。在諸如可以經純化或經半純化之蛋白質得出之益 細胞系統中所進行之檢定通常較佳作為「初級」筛選，因 為可產生該等檢定以允許快速顯影且相對容易地偵測由測 試化合物介導之分子無的變異。此外，在試管内系統中一 般可忽略測試化合物之細胞毒性或生物可用性的作用，檢 定替代地主要集中於藥物對分子乾的影響，該影響可在 Act·多肽與活化素之間的結合親和力之變異中顯現。 僅為說明起見’在本蘇明夕—也丨一 / 你不&明之例不性篩選檢定中，使 受關注化合物與通常能與活化素結合之經分離及經純化 ActRUa多肽接觸。接著將含有AetRna配位體之組合物添 加至化合物與AetRUa多肽之混合物中。心觀a/活化素複 48 200900076

合物的偵測及量化提供測定化合物抑制（或加強）ActRlIa 多肽與活化素之間的複合物形成之功效的方式。化合物之 功效可藉由自使用多個濃度之測試化合物獲得之數據產生 劑量反應曲線來評估。此外，亦可進行對照檢定以提供供 比較用之基線。舉例而言，在對照檢定中，將經分離及妙 純化之活化素添加至含有ActRlIa多肽之組合物中，且在 不存在測試化合物下對ActRIIa/活化素複合物的形成進行 定量。應瞭解，一般而言，混合反應物之次序可改變，且 可同時混合。此外，替代經純化之蛋白質，可使用細胞提 取物及溶解產物以促成合適之無細胞檢定系統。 ,ACtRIIa多肽與活化素之間的複合物形成可由多種技 術來债測。舉例而t，複合物形成之調冑可使帛（例如） 諸如經放射性標記（例如3汴、3沟、％或3H)、經螢光

才示5己（例如f IT C )或鄉输/f足；ι；» 0令 A J 酶促標5己之ActRIIa多肽或活化素 之經可偵測標記蛋白質，由免 旦 ^ w兄没檢疋或由層析偵測進行定 在某些具體實例中，本發明涵蓋螢光偏振檢定及螢光 :振能量轉移（FRET)檢定直接或間接量測ActRna多肽 ，、其結合蛋白之間的相互作用# _ + m 谢禮* 之用途。另外，其他偵 直諸如基於光波導（PCT公開案助96/26432及美 =利】第5,677，196號）、表面電衆共振（叫、表面電 :且^及表面力感測器之彼等偵測模式，與本發明之， 多具體實例相容。 月您卉 此外，本發明涵蓋相互作用陷牌檢定（亦稱為「雙雜 49 200900076 •交檢定」）之用途，其係用於鑑別破壞或加強ActRIIa多 肽與其結合蛋白之間的相互作用之藥劑。參見，例如美國 專利第 5,283,3 17 號；Zervos 等人（1993) Cell 72:223-232 ; Madura 等人（1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel 等人（1993) Biotechniques 14:920-924;及 Iwabuchi 等人 (1993) Oncogene 8:1693-1696。在一特定具體實例中，本 發明涵蓋反向雙雜交系統鑑別使ActRIIa多肽與其結合蛋 白之間的相互作用解離之化合物（例如小分子或肽）的用 途。參見’例如 Vidal 及 Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29，Vidal 及 Legrain，（1999) Trends Biotechnol 1^:374-81 ;及美國專利第5,525,49〇號、第5,955,28〇號及 第 5,965,368 號。 在某些具體實例中，由主題化合物與本發明之ActRHa 或活化素多肽相互作用之能力來鑑別該等主題化合物。化 合物與ActRIIa或活化素多肽之間的相互作用可為共價或 非共價的。舉例而言，該相互作用可在蛋白質水平上使用 包括光交聯、經放射性標記之配位體結合及親和層析之試 营内生物化學方法來鑑別（Jak〇by WB等人，i974，Meth〇ds in Enzymology 46:丨）。在某些狀況下，化合物可在基於 機制之檢定中篩選，該檢定諸如偵測與活化素或Μ· 多肽結合之化合物的檢定。其可包括固相或液相結合事 件。或者，可將編石馬活化素或ActRna乡狀之基因經報導 體系統（例如β半乳糖㈣、螢光素酶或綠色螢光蛋白） 轉染至細胞中且較佳由高產量篩選針對文庫或以該文庫之 50 200900076 個別成員進行篩選。可使用其他基於機制之結 如偵測自由台t戀#夕4士人& — ^ 例 片或由姑固。可用固定於孔、珠粒或晶 以抗體捕捉或由毛細電泳法解析之㈣進行結 “…㉟常可使用比色法或螢光法或 測所結合之化合物。 振來偵 在某些方面中，本發明提供調節（刺激或抑制）骨形 加骨質量之方法及藥劑。因此，可於整個細胞或組 織:在試管内或活體内測試所鑑別之任何化合物以確認其 調節骨生長或礦化之能力。此項技術中已知之多種方法可 用於此目的。 舉例而言，可藉由在基於細胞之檢定中量測Msx2誘 導或骨祖細胞至造骨細胞之分化來測定ActRna或活化素 多肽或測試化合物對骨或軟骨生長的影響（參見，例如 Daluiski 等人，Nat Genet. 2001，27(1):84 8;Hin。等人，

Biosci· 2004, 9:152〇-9)。基於細胞之檢定的另一實例包 括分析間質祖細胞及造骨細胞中主題ActRIIa或活化素多 肽及測試化合物之成骨活性。為說明起見，可構築表現活 化素或ActRIIa多肽之重組性腺病毒以感染分化多能間質 祖細胞C3H10T1/2細胞、前造骨細胞C2C12細胞及造骨

細胞TE-85細胞。接著藉由量測鹼性磷酸酶、骨鈣化素及 基質礦化的誘導來測定成骨活性（參見，例如Cheng等人，J bone Joint Surg Am· 2003，85-A(8):1544-52 )。 本發明亦涵蓋量測骨或軟骨生長之活體内檢定。舉例 而言，Namkung-Matthai 等人，B〇ne，28:8〇_86 (2〇〇1)揭示 51 200900076 •研究骨折後早期骨修復之大鼠骨質疏鬆模型。Kubo等人，

Steroid Biochemistry & Molecular Biology，68:197-202 (1999)亦揭示研究骨折後晚期骨修復之大鼠骨質疏鬆模 型。Andersson 等人，j. End〇crin〇1 17〇:529 537 描述小鼠 、’·至卵巢切除之小乳骨質疏鬆症模型，卵巢切除使得該等小 鼠損失實質性骨礦含量及骨礦密度，其中小梁骨損失約5〇% '之骨礦密度。可藉由投予諸如副甲狀腺激素之因子使卵巢 切除之小鼠的骨密度增加。在某些方面中，本發明使用此 項技術中已知之骨折復原檢定。此等檢定包括骨折技術、 f織學分析及生物力學分析’其描述於（例如）美國專利 第6,521，75G號巾’該專利對於其5丨起以及量測骨折程度 • ^復過程之貫驗程序之揭示内容全部以引用的方式併 入0 6.例示性治瘆用诠 在某些具體實例中，本發明之活化素_ActRna拮抗劑 (如ActRIIa乡肽）可用於治療或預防與（例如）經破 裂、流失或脫礦質而引起之骨損傷相關之疾病或病狀。如 本文所證實，活化素_Ae觀a拮抗劑且尤其AetRna_Fc構 築體有效治療或預防癌症相關骨質流失。在某些具體實例 中，本發明提供經由將治療有效量之活化素_ActRna拮抗 尤，、ActRIIa夕肽投予有需要之個體來治療或預防該 個體之骨損傷的方法。在某些具體實例中，本發明提供經 2將治療有效量之活化素_ActRIIa拮抗劑，尤其 夕肽投予有需要之個體來促進該個體之骨生長或礙化的方 52 200900076 .法。此等方法較佳針對動物且更佳人類之治療性及預防性 治療。在某些具體實例中，本案之揭示提供活化素‘則a 结抗劑（尤其可溶性AetRIIa多肽絲向活化素或罐心 之中和抗體）用於治療與低骨密度或降低之骨強度相關之 病症的用途。 ▲如本文所用之「預防」病症或病狀之治療劑係指在統 計樣本中，相對於未經治療之對照樣本減少經治療樣本之 病症或病狀的發生或相對於未經治療之對照樣本延緩病症 或病狀之一或多種症狀之發作或降低病症或病狀之一或多 種症狀之嚴重性的化合物。如本文所用之術語「治療」包 括預防指定病狀或-旦病狀已確立即改善或消除該病狀。 在任一狀況下’預防或治療可在醫師所提供之診斷及投予 治療劑所欲之結果中辨別。 本案之揭示提供誘導骨及/或軟骨形成、預防骨質流 失、增加骨鑛化或預防骨脫礦質之方法。舉例而言，主題 活化素-ActRIIa括抗劑具有治療人類及其他動物之骨質疏 鬆症且使人類及其他動物之骨折及軟骨缺陷復原之應用。 ActRIIa或活化素多肽可在經診斷具有亞臨床低骨密度之 患者中適用作針對骨質疏鬆症發展之保護性量測。 在-特定具體實例中，本發明之方法及組合物可在使 人類及其他動物之骨折及軟骨缺陷復原方面具有醫學效 用。主題方法及組合物亦可在閉合性以及開放性骨折復位 方面以及人工關節之ή m ^ > 良固疋方面具有預防性用途。由成 a Μ誘^之重新骨形成促成先天性、外傷誘發或腫瘤切除 53 200900076 誘發之顱面缺陷的修復’且亦適用於整形美容外科。在某 些狀況下，主題活化素-ActRIIa拮抗劑可提供吸引骨形成 細胞、刺激骨形成細胞生長或誘導骨形成細胞之祖細胞分 化的環境。本發明之活化素_ActRIIa拮抗劑亦可適用於治 療骨質疏鬆症。 本發明之方法及組合物可應用於特徵在於骨質流失或 引起骨質流失之病狀，該等病狀諸如骨質疏鬆症（包括繼 發性骨質疏鬆症）、副甲狀腺高能症、庫欣氏病（Cush — crease)、佩吉特氏病（Paget,s仙咖）、甲狀腺毒症、 慢性腹瀉病況或吸收障礙、腎小管性酸中毒或神經性厭 食0 骨質疏鬆症可由多種因素引起或與多種因素相關。作 為女性，尤其停經後女性，體重輕及經歷久坐生活方式皆 為骨質疏鬆症之危險因f (骨礦物密度流失，導致骨折危 險）。具有以下特徵甲之任-者之人可為用Ac趣3结抗 劑β療之候選者：停經後女性且未採取雕激素或其他激素 替代療法；具有體部骨折或吸煙之個人或母體歷史之人. 個高（超過…忖）或體瘦(小…）丄後女 性，具有與骨質流失相關之臨床病狀之男性；使用已知引 起骨質流失之藥物（包括皮f類固醇，諸如ρ㈣仏_τμ)、 :種:·猝發藥物（諸如D—M)及某些巴比妥酸鹽 ar _ate)或高劑量甲狀腺替代藥物之人；患有1型 病、腎病或具有骨質疏鬆症家族病史之人；具 有“㈣（例如尿樣中膠原蛋白過量）之人；具有，狀 54 200900076 腺病狀（諸如甲狀腺高能症） 骨折之人；具有椎骨骨折之】 他徵象之人。 之人；僅輕微外傷後即遭受 射線跡象或骨質疏鬆症之其

日守間減y。含有鋁之抗酸劑當以高劑量由具有腎問題之 人，尤其彼等經歷透析之人服用時可導致骨質流失。可引 起繼發性骨質疏鬆症之其他藥物包括：苯妥英（phenyt〇in〕 (Dilantin )及巴比妥酸鹽，其用於預防猝發；甲胺喋呤 (methotrexate) ( Rheumatrex, Immunex, Folex PFS ) > 一種用於一些形式之關節炎、癌症及免疫病症之藥物；環 孢黴素（cyclosporine) (Sandimmune，Neoral)，一種用 於治療一些自體免疫疾病及抑制器官移植患者之免疫系統 的藥物；促黃體激素釋放之激素促效劑（Lupron，zoladex)， 其用於治療前列腺癌及子宮内膜異位；肝素（Calcipadne， Liquaemin)，一 種抗凝藥物；及消膽胺（ch〇iestyrainine) (Questran )及考來替潑（e〇iestip〇i ) ( Colestid )，其用 於治療高膽固醇。由癌症療法引起之骨質流失為人所普遍 55 200900076 瞭解且稱為癌症療法誘導之骨質流失（CTIBl )。骨轉移 可在骨中產生空腔，該等空腔可藉由用活化素_ActRIIa拮 抗劑治療來校正。 在一較佳具體實例中’本文所揭示之活化素-ActRIIa 拮抗劑，尤其可溶性ActRIIa可用於癌症患者。患有某些 腫瘤（例如前列腺腫瘤、乳房腫瘤、多發性骨髓瘤或引起 副甲狀腺咼能症之任何腫瘤）之患者處於腫瘤誘導之骨質 流失以及骨轉移及治療劑所引起之骨質流失的高危險下。 該等患者即使在不存在骨質流失或骨轉移之跡象下亦可用 活化素-ActRIIa拮抗劑治療。亦可監測患者骨質流失或骨 轉移之跡象，且在指標表明危險增加之情況下可用活化素-ActRIIa括抗劑治療該等患者。一般而言，使用dexa掃 描以評估骨密度之變化’而骨重塑之指標可用於評估骨轉 移之可能性。可監測血清標言己。骨特異性鹼性磷酸酶 (BSAP)為-種存在於造骨細胞中之酶。BSAp之血液含 罝在具有骨轉移及導致骨重塑增加之其他病狀的患者中增 加。骨約化素及原膠原肽亦與骨形成及骨轉移相關。心 增加已於具有由前列腺癌引起之骨轉移的患者中债則到 且在來自乳癌之骨轉移中達較小程度。骨形態發生蛋白 含量在已轉移至骨之前列腺癌"交高， 肢癌、皮膚癌、肝癌或肺癌所引起之骨餘

月轉移中並非如此。T 型羧基末端尾肽。CTP)為在骨骼再吸收期間所形 膠原蛋白中發現之交聯物。由於骨骼經常破裂、 因此ICTP被發現於整個身體中。 二 "成， 在骨轉移之部位 56 200900076 '處，含量將顯著高於正常骨之區域。已在前列腺癌、㈣ 及乳癌所引起之骨轉移中發現高含量之ICTp。另一膠原蛋 白父聯物I型N末端尾肽（NTx )係在骨轉換期間連同icTp -起產生。NTx之量在由包括肺癌、前列腺癌及乳癌之許 多不同類型癌症引起之骨轉移中增加。又，ΝΤχ之含量隨 著骨轉移之進程而增加。因此，此標記可用於偵測轉移以 及量測疾病程度。再吸收之其他標記包括比林二酚胺 (pyridinoUne )及脫氧比林二酚胺（)。 再吸收標§己或骨轉移標記之任何增加指示患者對活化素_ ActRIIa拮抗劑療法之需要。 • 活化素-ActRIIa拮抗劑可與其他醫藥劑結合投予。結 合投藥可藉由投予單一共調配物、藉由同時投藥或藉由在 獨立時間投藥來實現。活化素_ActRIIa拮抗劑若與其他骨 活性劑一起投予則尤其有利。患者可得益於結合接受活化 素-ActRIIa拮抗劑並採用鈣補充劑、維生素D、適當鍛煉 及/或在一些狀況下其他藥物。其他藥物之實例包括雙膦酸 鹽（阿侖膦酸鹽（alendronate )、伊班膦酸鹽（ibandr〇nate ) 及利塞膦酸鹽（risedronate ))、降血鈣素、雌激素、副 甲狀腺激素及雷諾昔酚（raloxifene )。雙膦酸鹽（阿余麟 酸鹽、伊班膦酸鹽及利塞膦酸鹽）、降血鈣素、雌激素及 雷諾昔酚影響骨重塑週期且歸類為抗再吸收藥物。骨重塑 由兩個不同階段組成：骨再吸收及骨形成。抗再吸收藥物 減緩或停止骨重塑週期之骨再吸收部分，但並不減緩該週 期之骨形成部分。因此，新的形成以比骨再吸收快之速率 57 200900076 ，繼續，且骨密度可隨時間増加。副甲狀腺激素之一種形式 特立帕肽（teriparatide)增加骨重塑週期中之骨形成速率。 阿侖膦酸鹽經核準用於停經後骨質疏鬆症之預防（每天5 毫克或每週一次35毫克）與治療（每天ι〇毫克或每週— -人70冤克）。阿侖膦酸鹽減少骨質流失，增加骨密度且 ，降低脊骨、腕部及體部骨折之危險。阿侖膦酸鹽亦經核準 用於治療男性及女性由於長期使用糖皮質激素藥物（亦 即’潑尼松（prednisone)及皮質_ (c〇rtis_))而引起 之糖皮貝激素誘發之骨質疏鬆症且用於治療男性之骨質疏 鬆症。阿侖膦酸鹽加上維生素D經核準用於停經後女性2 骨質疏鬆症的治療（加上維生素D每週一次7〇毫克）且 用於改良患有骨質疏鬆症之男性之骨質量的治療。伊班膦 酸鹽經核準用於預防及治療停經後骨質疏鬆症。以每月— -人丸劑（1 50 mg )之形式服用，伊班膦酸鹽應在每月之同 二天服用。伊班膦酸鹽減少骨質流失，增加骨密度且降低 脊骨骨折之危險。利塞膦酸鹽經核準用於預防及治療停經 後骨質疏鬆症。每天（5 mg劑量）或每週（35 mg劑量或 與鈣一起35 mg劑量）服用，利塞膦酸鹽減緩骨質流失， 增加骨密度且降低脊骨骨折及非脊骨骨折之危險。利塞膦 酸鹽亦經核準為男性及女性使用以預防及/或治療由長期使 用糖皮質激素藥物（亦即，潑尼松或皮質酮）所引起之糖 皮質激素誘發之骨質疏鬆症。降企鈣素為鈣調節及骨代謝 中所涉及之天然產生激素。在停經期之後5年以上之女性 中，降血鈣素減緩骨質流失，增加脊骨密度，且可減輕與 58 200900076 I斤相關之疼痛。降血鈣素降低脊骨骨折之危險。降血鈣 ’、可以注射劑（每天5(M00 m)或鼻喷霧（每天2〇〇叫 2式使用。雌激素療法（ET) /激素療法（ht)經核準 骨與=骨2鬆症。已顯示ΕΤ減少骨質流失，增加脊 險 之月搶度且降低停經後女性體部及脊骨骨折之危 、以傳遞每天約〇_3毫克之低劑量或每天約〇,⑵ :後起=劑量之丸劑或皮膚貼片之形式投予且即使在7。 發展^ 有效。當單獨服用雖激素時，其可增加女性 險，健子宮内臈癌）之危險。為消除此危 激素組人之鉍+廿 整子呂之彼專女性開出與雌 :之激素黃體素（激素替代療法或ητ)^τ/ητ 二Τ經期症狀且已顯示萤^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 昔齡^天房服痛、情緒资亂及膽囊疾病。雷諾 疏鬆症。…Γ 核準用於預防及治療停經後骨質 之-_物2稱為選擇性雌激素受體調節劑（咖Μ) 下提供雌激素在…雌激素之潛在缺陷 骨骨折之危險。雷諾昔齡增加骨質量且降低脊 骨折及其他非脊骨〜：用於證實雷諾昔酚可降低髖部 特立帕肽經核準用二之危險。副甲狀腺激素之-種形式 下之男性的骨質療停Ϊ後女性及處於骨折之高危險 骨礦物密度。在产Α/正Α藥物刺激新骨形成且顯著增加 肋骨及腕部t之典把斤 中已圮载脊骨'髖部、足部、 折復位，但評估復位在男性中，已記載脊骨甲之骨 、他部位處之骨折復位的資料尚不充分。 59 200900076 特立帕肽以日注射劑之形式自身投予至多24個月。 7·墨藥组会私) 在某些具體實例中，將本發明之活化素-ActRIU拮抗 劑（例如AetRIIa多肽）與醫藥學上可接受之載劑一起調 配。舉例而言，可單獨或作為醫藥調配物（治療組合物） 之組份投+ ACtRlla多肽。主題化合物可經調配用於以任 何便利方式投藥以在人類或獸醫醫學中使用。 在某些具體實例中，本發明之治療方法包括以植入物 或裝置之I式王身或局部投予組合物。當投予時，用於本 七明之冶療組合物係呈無熱原質、生理學上可接受之形 式。亦可視情況包括於如上所述之組合物中之不同於 ActRIIa拮抗劑的治療學上適用之藥劑可在本發明之方法 中與主題化合物（例如AetRIIa多肽）同時或相繼投予。 典型i也，ActRlIa #抗劑將非經腸且尤其經靜脈内或 經皮下投予。適合於非經腸投藥之醫藥組合物可包含一或 多種ACtRIIa多肽與一或多種醫藥學上可接受之無菌等張 水溶液或非水料、分散液、料液或乳液，或可在臨用 前復水成無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末的組合，該 等醫藥組合物可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、促使調 配物與所欲接受者之，液等張的溶質，或懸浮^劑= 劑。可在本發明H组合物中使用之合適水性载劑及非 水載劑之實例包括水、乙醇、多元醇（諸如甘油、丙二醇、 聚乙二醇及類似多元醇）及其合適之混合物、植物油（諸 如橄欖油）及可注射之有機酯（諸如油酸乙酯）。可（例 200900076 質：諸如㈣脂）、在分散液之狀況 及藉由使用界面活性劑來維持適當流 另外，組合物可以供值、择 ^± 傳遞至目標組織部位（例如骨） 之形式囊封或注射。在某此目_ + ^; 可包括能將—或多鞴、、…u a 月之組合物 -種/π療化合物（例如ActRIIa多肽）傳 遞至目標組織部位（例如A )如 夕肽）傳 m 处 月）、如供使組織發育之結構且

如）藉由使用塗層物 下藉由維持所需粒度 動性。 取佳被再吸收至體内之美 與A，二 土質舉例而s ，該基質可提供

ActRIIa多肽的緩慢釋放。 、 ^寻巷買可由目刖用於其他植 入式醫學應用之材料形成。 基$材料之選擇係基於生物相容性、生物降解性、機 械=性、美容外觀及界面特性。主題組合物之特定應用將 界疋適當調配物。供組合物用之潛在基質可為生物可降解 且經化學定義之硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸及 聚酸酐。其他潛在材料為生物可降解的且經生物學上充分 疋義，諸如骨膠原蛋白或真皮膠原蛋白。其他基質包含純 蛋白質或細胞外基質組份。其他潛在基質為非生物可降解 的且經化學定義，諸如燒結經構灰石、生物玻璃、紹酸鹽 或其他陶瓷。基質可包含任何上文所提及類型之材料的組 合’諸如聚乳酸與羥磷灰石或膠原蛋白與磷酸三鈣。生物 陶瓷在組成（諸如鈣-鋁酸鹽-填酸鹽）及加工方面可改變 以改變孔徑、粒度、粒子形狀及生物降解性。 在某些具體實例中，可施以本發明之方法以供口服， 例如呈膠囊、扁膠劑、丸劑、錠劑、口含劑（使用調味基 61 200900076 質’通常為蔗糖及阿拉伯膠（acacia )或黃耆膠）、散劑、 顆粒之形式’或作為於水性或非水性液體中之溶液或懸浮 液’或作為水包油或油包水液體乳液，或作為酏劑或糖漿， 或作為片劑（使用惰性基質，諸如明膠及甘油，或蔗糖及 阿拉伯膠）及/或作為漱口水及類似物，其各含有預定量之 樂劑作為活性成份。藥劑亦可以大丸劑、舐劑或糊劑之形 式投予。 在供經口投予之固體劑型（膠囊、錠劑、丸劑、糖衣 藥丸、散劑、顆粒及類似物）中，可將本發明之一或多種 治療化合物與一或多種醫藥學上可接受之載劑（諸如檸檬 酸鈉或磷酸二鈣）及/或以下物質中之任一者混合：（1) 填充劑或增補劑，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露 糖醇及/或矽酸；（2 )黏合劑，諸如羧曱基纖維素、褐藻 酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及/或阿拉伯膠；（3 ) 保濕劑，諸如甘油；（4 )崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、 馬鈴薯或木薯澱粉、褐藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；（5) 溶液阻滯劑，諸如石蠟；（6)吸收促進劑，諸如四級銨 化合物；（7)濕潤劑，諸如十六烷醇及甘油單硬脂酸酯； (8 )吸收劑，諸如高嶺土（ ka〇lin )及膨潤土； （ 9 )潤 滑劑’諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、®體聚乙二醇、 十二烧基硫酸鈉及其現合物；及（1〇 )著色劑。在膠囊、 錠劑及丸劑之狀況下，t藥組合物亦可包含緩衝劑：類似 類型之E1體組合物亦可用作使用諸如乳糖以及冑分子量聚 乙二醇及類似物之職形劑之軟性及硬性填充明膠膠囊中的 62 200900076 填充劑。 …供經π投予之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、 微乳液、溶液、懸浮液、糖聚及_。除活性成份以外， 液體劑型可含有此項技術中常用之惰性稀釋劑，諸如水或 其他溶劑；增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙ϋ、碳酸乙 酉日、乙酸乙g旨、书酿、·^田 % 本甲酸苄g曰、丙二醇、丨，3•丁二醇、 油（尤其棉狩^油、）纟& 4 、 化生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖 麻油及之:¾、、I-L、丄 ,^ 油、四虱糠醇、聚乙二醇，及脫水山 乂糖醇之月曰肪酉夂酉曰’及其混合物。除惰性稀釋劑以外，口 服組合物亦可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、 甜味d調味劑、著色劑、芳香劑及防腐劑。 除活)·生化合物以外，懸浮液可含有懸浮劑（諸如乙氧 t 〃十烷醇、聚氧化乙烯山梨糖醇及脫水山梨糖醇 酉曰）i“曰纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃耆膠 及其混合物。 、 一 月之組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、 ^化骸分散劑。可藉由包括例如對經基苯甲酸醋、氯丁 ’— 山余^及類似物之各種抗細菌劑及抗真菌劑來 確保防止微生抓& 物作用。亦可能需要將諸如糖、氯化鈉及類 似物之等張劑包括於έ日人‘ Λ j匕括於組合物中。另外，可藉由包括延緩吸 收之試劑C Λ π w a σ早硬知酸鋁及明膠）來促成可注射醫藥形 式之延長吸收。 Β 瞭解、、、°藥方案將由主治醫師在考慮改變本發明之主 (例如ActRIIa多肽）之作用的各種因素下確定。 63 200900076 各種因 素包括（但不限於）：欲有待形成之骨重量之量， 骨密度流失之程度，骨損傷之部位，受損骨之病狀，患者 之年齡、性別及膳食’可促成骨質流失之任何疾病的嚴重 性’投藥時間，及其他臨床因素。視情況，劑量可隨復水 中所使用之基質類型及組合物中之化合物類型而變。將其 他已知之生長因子添加至最終組合物中亦可影響劑量。可 藉由對骨生長及/或修復作週期性評估（例如χ射線（包 f 括DEXA)、組織形態測定及四環素標記）來監測進程。 關於靈長類動物及人類之實驗已證實對骨 的影響在化合物以足以達成約2〇〇 ng/ml之幻青濃度之時 間間隔及量給藥時可偵測，其中對同化骨生物標記之半最 :影響在0.3 mg/kg之劑量或根據曲線下面積等效處出現。 在人類中，200 ng/ml之血清含量可 罝A卞丨曰土 月3里了以0.1 mg/kg或更高之 早-人劑置達成且1000 ng/ml之血 #古々A + /月3里可以〇·3 mg/kg或 更阿之早次劑量達成。所顴 約25…a ㈣測之为子的血清半生期係介於 約25天與約35天之間，复 . 、貝上長於夕數Fc融合蛋白， 由此可（例如）藉由以每週或 給筚來遠…： 週叶以約〇.05至0·5 g Q樂不達成持續有效血清含 時間間隔#田* 一 μ 月3里或可以更長的給藥 仏使用更兩劑量。舉例而言，可使用步姑一 ^ 兩月-次〇.1、〇.3、0.5、〇7、i 、用根據母月或每 間的值之劑量，日斟a & · 、2或3 mg/kg ,或介於之 3個月、4個月、5個月“刀持久使得給藥僅需每 個月a 個月、9個月、12個月十“ 個月一次。 调月或更多 的樂時間間隔係由藥效作用夕抽级, 進一步支持，該#W罘双作用之持續時間 通符續時間長於荦物 樂物在血清中之持續時間。 64 200900076 在人類患者中觀測至少120天之PD作用。 在某些具體實例中，本發明亦提供活體内產生ActRIIa 多肽之基因療法。該療法會藉由將ActRIIa聚核苷酸序列 引入患有如上所列之病症的細胞或組織中來達成其治療作 用。ActRIIa聚核苷酸序列的傳遞可使用重組性表現載體 (諸如嵌合病毒）或膠狀分散系統來達成。對ActRna聚 核苷酸序列之治療性傳遞而言較佳為使用所靶向之脂質 體。 可用於如本文所教示之基因療法的各種病毒載體包括 腺病毒、疱疹病毒、牛痘或較佳RNA病毒（諸如反轉錄 =毒^。車交4圭地，反轉錄病毒載體為鼠類或鳥類反轉錄病 毋之何生物。可插有單一外來基因之反轉錄病毒載體之實 例包括（但不限於）：莫洛尼鼠類白血病病毒（仏1〇卿 則nne leukemia virus，Μ〇Μ^ν )、哈維鼠類肉瘤病毒 (Harvey murine sarc〇ma ν—，讀…）、鼠類乳腺腫 瘤病毒（MuMTV )及勞氏肉瘤病毒（R〇us ^叫， 咖）午多其他反轉錄病毒載體可合併多個基因 此等載體可轉移或合併可選擇標記之基因使得經轉導之細 胞可侍以鑑別及產生。反轉錄病毒載體可藉由附 :、糖脂或蛋白質而製成對㈣異性。較佳 ) 由使用抗體來實現。熟習此項技術者應瞭解，可將特2 ^酸序列插人反轉錄病毒基因組中或與病毒包膜 ΓΗ性傳遞含有聚核苦酸之反轉錄::: 八體貫例中，使载體靶向骨或軟骨。 65 200900076 或i省' ” 可由習知磷酸鈣轉染法將組織培養細胞直接用 編碼反轉錄病毒結構基因gag、p〇uenv之質體轉染。接 者將此等細胞用含有受關注基因之載體質體轉染。所得細 胞將反轉錄病毒載體釋放至培養基中。

ActRlIa聚核普酸之另一靶向傳遞系統為膠狀分散系 ’充膠狀刀散系統包括巨分子複合物，奈米膠囊，微球體， =粒及包括水包油乳液、微胞、混合型微胞及脂質體之 脂質基系、统。本發明之較佳膠狀系統為脂質體。脂質體為 適用作試管内及活體内傳遞媒劑之人工膜囊。可將RNA、 DNA及凡整病毒粒子囊封於水性内部中且以生物活性形式 傳遞至細胞（參見，例如Fraley等人，Trends Bi〇chem. ki.， 6_77’ 1981 )。使用脂質體媒劑進行有效基因轉移之方法在 此項技術中已知，參見，例如M_in〇等人，Biotechn咖es， 6:682，1988。脂質體之組成通常為常與類固醇、尤其膽固 醇組合之磷脂的組合。亦可使用其他磷脂或其他脂質。脂 質體之物理特徵視pH值、離子強度及二價陽離子的存在 而定。

適用於產生脂質體之脂質的實例包括磷脂醯化合物， 諸如磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙 醇胺、鞘脂、腦甘脂及神經節苷脂。說明性磷脂包括卵磷 脂醯膽鹼、二棕櫊醯磷脂醯膽鹼及二硬脂醯磷脂醯膽鹼。 脂質體之靶向亦有可能基於（例如）器官特異性、細胞特 異性及細胞器特異性且在此項技術中已知。 實施例 66 200900076 ,, 本發明現正加以一般性描述，藉由參考以下實施例將 更易於理解本發明，該等實施例僅出於說明某些具體實例 及本發明之具體實例之目的而包括在内且並不意欲限制本 發明。 實施例 1 ♦ ActRIIa-Fc融合蛋白 申請者構築具有以兩者之間的最小連接子與人類或小 • 鼠Fc域融合之人類ActRIIa胞外域的可溶性ActRIIa融合 蛋白。該等構築體分別稱作ActRIIa-hFc及ActRIIa-mFc。

f ActRIIa-hFc係於下文展示為自CHO細胞系純化（SEQ ID NO: 7 )：

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFA TWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGN MCNRKFSYFPRMF,VTOPTSNPVTPKPPTrTrTGTHTCPPCPAPKTJ,GGP SVFLFPPKPKDTT,MTSRTPF,VTC：VVVDVSHF』DPRVKFNWYVDrTVRV HNAKTKP^F.F.OYNSTYRVVSVT^TVLHODWT.NGKFYKCKVSNKAT.P VPTF-KTTSK AKGOPRFPOVYTLPPSREEMTKNOVST-TrT VlCGFYPSD (

% TAVRWRSNrTOPENNYKTTPPVLDSDfiSFFT'YSKT.TVDlCSRWOOGN

VFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK

ActRIIa-hFc蛋白及ActRIIa-mFc蛋白在CHO細胞系 中表現。考慮三個不同前導序列： (i )蜜蜂蜂毒肽（HBML ) : MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (ii )組織纖維蛋白溶酶原活化劑（ΤΡΑ )： MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP ( SEQ ID NO: 9) 67 200900076 . (iii)原生：MGAAAKLAFAVFLISCSSGA ( SEQ ID NO: 10) ° 所選形式使用TPA前導子且具有以下未經加工之胺基 酸序列：

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANW EKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDI • NCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNP

VTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT 'k CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK ( SEQ ID NO: 13 ) 此多肽係由以下核酸序列編碼：

ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCT GTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAG V ATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAA

GACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAA AGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGG TTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAAC TGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGA AGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTT TTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCC AGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCC 68 200900076

， CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCC

TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG - GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGTC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAG AATTC ( SEQ ID NO: 14 ) ^ ActRIIa-hFc與ActRIIa-mFc均顯著順應於重組性表 現。如圖1所示，蛋白質係純化成單一、充分界定之蛋白 質峰。N末端定序揭示單一序列ILGRSTQE ( SEQ ID NO: 11 )。純化可由一系列管柱層析步驟達成，該等步驟包括 (例如）以任何次序進行之以下各者中之三者或三者以 上：蛋白質A層析、Q瓊脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、尺 寸排阻層析及陽離子交換層析。純化可以病毒過濾及緩衝 液交換來完成。ActRIIa-hFc蛋白經純化至如由尺寸排阻層 69 200900076 ， 析所測定>98%且如由SDS PAGE所測定>95%之純度。

ActRIIa-hFc及ActRIIa-mFc對配位體，尤其活化素a 頒示咼親和力。使用標準胺偶合程序將GDF-1 1或活化素 A (「ActA」）固定於 Biacore CM5 晶片上。將 ActRIIa-hFc 蛋白及ActRIIa-mFc蛋白負載於系統上，且量測結合性。 ActRIIa-hFc以5 X 10·12之解離常數（Kd)與活化素結合， • 且蛋白質以9.96 x 1〇·9之KD與GDF11結合。參見圖2。 ActRIIa-mFc類似地表現。 f s A-204報導體基因檢定係用於評估ActRIla_hFc蛋白對 由GDF-11及活化素A信號轉導的影響。細胞系：人橫紋 肌肉瘤（衍生自肌肉）。報導體載體：pGL3(CAGA)12 (描 述於 Dennler 等人，1998, EMBO 17: 3091-3 100 中）。參見 圖3。CAGA12基元係存在於TGF-β反應基因（paw基 因）中’故此載體一般用於經Smad2及3進行因子信號轉 導。 第1天：使A-204細胞分裂至48孔盤中。 第2天：將A-204細胞用1〇叫pGL3(CAGA)12或 pGL3(CAGA)12 ( 10 μ§) +pRLCMv ( i 及 Fugene 轉 染。 第3天：添加因子（稀釋至培養基+〇 1〇/〇 bsa中）。 添加至細胞中前，抑制劑須與因子一起預培育丨小時。6 小時後，用PBS沖洗細胞，且將細胞溶解。 此後進行螢光素酶檢定。典型地，在此檢定中，在不 存在任何抑制劑下，活化素A顯示約1 〇倍刺激報導體基 70 200900076 • 因表現且ED5〇約2 ng/m卜GDF-ll : 16倍刺激，ED50 : 約1_5 ng/ml。GDF-8顯示類似於GDF-11之作用。 如圖4所示，ActRIIa-hFc及ActRIIa-mFc在皮莫耳濃 度下抑制GDF-8介導之信號轉導。如圖5所示，三種不同

ActRIIa-hFc製劑以約200 PM之IC50抑制GDF-11信號轉 導。 " - ActRIIa-hFc在藥物動力學研究中極穩定。將大鼠以i , mg/kg、3 mg/kg 或 1〇 mg/kg 之 ActRIIa_hFc 蛋白給藥且在 24、48、72、144及168小時量測蛋白質之血漿含量。在 獨立研究中，將大鼠以i mg/kg、1〇 mg/kg或3〇 mg/kg給 藥。在大鼠中，ActRHa-hFC具有U_14天之血清半生期且 兩週後藥物之循環含量相當高（對於i mg/kg、1() mg/kg 或3〇mg/kg之初始投藥分別為u叫/〇1卜丨^叫仏丨或3〇4 Pg/ml)。在獼猴中，血漿半生期實質上長於i4天且藥物 之循％含虿對於1 mg/kg、1〇 mg/kg或3〇 mg/kg之初始投 樂分別為25 pg/m卜304 pg/mi或144〇吨/〇1卜人類中之初 % 步結果表明血清半生期係介於約2〇天與3〇天之間。 复_施例2 . AptRIla-mFCjgjg活體内骨峰長 將正常雌性小鼠（BALB/C)用缝—以i毫克/ 公斤/劑、3毫克/公斤/劑或1〇毫克/公斤/劑之含量給藥， 其中劑量每週兩次給予。由DEXA測定骨礦物密度及骨礦 物含量，參見圖6。 在BALB/C雌性小鼠中’ DEXA掃描顯示由於 ActRna-mFc治療而使骨礦物密度及含量顯著增加 71 200900076 • ( >20%)。參見圖7及圖8。 因此，ActRIIa之拮抗作用使得正常雌性小鼠之骨密 度及含量增加。作為下一步驟，測試ActRna_mFc對骨質 疏鬆症之小鼠模型之骨的影響。

Andersson等人（2001)確立印巢切除小鼠遭受實質性骨 質流失（手術後6週小梁骨流失約5〇% )，且此等小鼠之 骨質流失可以候選治療劑（諸如副甲狀腺激素）糾正。 申請者使用4-5週齡之經卵巢切除（〇νχ)或經假手 術之C57BL6雌性小鼠。手術後8週，開始用ActRIIa_mFc (10 mg/kg ’每週兩次）或對照（PBS)治療。由掃描 儀量測骨密度。 如圖9所示，6週後，未經治療之卵巢切除小鼠相對 於假對照顯示小梁骨密度之實質性流失。ActRIIa_mFc治 療使骨密度恢復至假手術小鼠之水平。治療6週及1 2週 時，ActRIIa-mFc引起0VX小鼠之小梁骨的實質性增加。 參見圖1 0。治療6週後，骨密度相對於pbs對照增加24%。 12週後，增加27%。 在假手術小鼠中，ActRIIa-mFc亦引起小梁骨的實質 性增加。參見圖11。6週及12週後，治療相對於對照產 生35%增加。 在另一組實驗中’將如上所述之卵巢切除（QVX )或 假手術小鼠用ActRIIa-mFc ( 10 mg/kg，每週兩次）或對，昭 (PBS)經12週治療。類似於上文對於ActRIIa_mFc所述 之結果，接受ActRIIa-mFc之OVX小鼠早在4週即顯示小 72 200900076 - 梁骨密度增加15%且治療12週後增加25% (圖12 )。接 受ActRIIa-mFc之假手術小鼠類似地早在4週即顯示小梁 骨密度增加22%且治療12週後增加32% (圖13 )。 用ActRIIa-mFc治療12週後，全身及活體外股骨DEXA 分析顯示治療誘導卵巢切除小鼠與假手術小鼠之骨密度增 加（分別為圖14A及圖14B )。此等結果亦由股骨中段之 活體外pQCT分析支持，該分析證實用ActRIIa-mFc治療 12週後總骨密度與皮質骨密度顯著增加。經媒劑治療之對 照卵巢切除小鼠顯示與經媒劑治療之對照假手術小鼠相當 之骨密度（圖15)。除骨密度以外，ActRHa_mFC治療後 骨含量增加。股骨中段之活體外pQC丁分析證實用 ActRIIa-mFc治療12週後總骨含量與皮質骨含量顯著增 加，而卵巢切除與假手術經媒劑對照治療之小鼠顯示相當 之骨含量（圖16 )。股骨中段之活體外pQCT分析亦顯示 經ActRIIa-mFc治療之小鼠不顯示骨膜周長的變化；然而， ACtRIIa_mFc治療使得骨内膜周長減小，其指示因於股骨 " 之内表面上生長而皮質厚度增加（圖17)。 股骨之機械測試確定ActRIIa_mFc能增加骨骼之外在 特徵（最大負載、硬度及斷裂能），其促成骨路之固有特 性（極限強度）顯著增加。經ActRHa_mFc治療之即巢切 除小鼠顯示骨強度增加至超過假手術經媒劑治療之對昭的 水平，其指示骨質疏鬆表型完全逆轉（圖18)。 此等數據證實mAetRIIa拮抗射增加正常雕性 〜、之骨密度且此外糾正骨質疏鬆症小鼠模型之骨密度、 73 200900076 . 骨含量及極限骨強度的缺陷。 在又一組實驗中，在第4週對小鼠進行卵巢切除或假 手術’且苐12週開始接受安慰劑或ActRHa_mFc( 2次/週， 10 mg/kg)(在圖19_24中亦稱作RAP-11)又歷時12週 之時段。評估多個骨參數。如圖19所示，ActRIIa_mFc增 加OVX小鼠與假手術小鼠之椎骨小梁骨體積與總體積比 - (BV/TV) 。ActRHa-mFc亦改良小梁架構（圖2〇 )，增 产 加皮質厚度（圖21)且改良骨強度（圖22)。如圖23所 不，ActRIIa-mFc在i mg/kg至！ 〇 mg/kg之劑量範圍下產 生所需效果。 在假手術小鼠中於2週時間點進行骨組織形態測定。 圖24中所呈現之此等數據證實ActRIla_mFc具有雙重作 用^抑制骨再吸收與促進骨生長。因此，ActRna_mFc刺 激月生長（同化作用）且抑制骨再吸收（抗異化作用）。 BV=骨體積；τν=總組織體積^ Βν/τν為經礦化之骨體積 . ^百分率的量測。ES =侵蝕表面；BS=骨表面。ES/BS為骨 :蝕之量测，且由RAP_〇u引起之減小證實抗再吸收或抗 /、化作用。Ms/Bs為礦化表面/骨表面比，其為骨生長或同 化作用之指標。類似地，礦質接合速率（MAR )及骨形成 f率/骨表面/天（BFR/BSd)指示骨生長。採用造骨細胞 N’n〇及破骨細胞（N〇c/BPm)之量測以探測作用 機制。 以丨2週齡起始，在雌性C57BL/6小氣中進行 、组織形態測定實驗。蔣| g κ 疋貫驗將小鼠用10 mg/kg ActRIla_mFc經腹 74 200900076 膜内每遇兩次給藥歷時2週、4週、8週或㈣。最後次 :二5二各:小鼠處死且獲取骨_分析。在施以 j μ & 9天及2天對小鼠進㈣黃綠素標記。如 圖25所不’計量顯示Ae削a_mFe促進骨生長及碌化且具 有同化作用與抗異化作用。參見，例如bv/tv比、E廳 比及MS/BS比。同化作用介,i u * J 1匕作用似子在整個給藥方案中持續，而 抗再吸收作用似乎在小鼠中持續時間較短。 方多發性骨耱,夕 _ 類模型的骨損傷 多發性骨髓瘤患者顯示特徵在於破骨細胞活性增加及 由造骨細胞形成骨減少之骨質流失病症。小鼠之骨髓瘤的 5T2MM模型係基於使用來自在老齡小鼠中形成且於小鼠中 引起與人類多發性骨髓瘤患者中所見之作用類似之作用的 自發性腫瘤類型之腫瘤細胞（5T2MM細胞）。參見，例如

Vanderkerken 等人，Methods Mol Med. 2005;1 13:191-205。 針對在此模型中之作用來測試ActRIIa-mFc。 注射至C5 7Bl/KaLwRij小鼠中之5T2MM細胞促進破 骨細胞表面增加、溶骨病變形成且使得骨面積減小。骨病 與造骨細胞數、造骨細胞表面減小及礦化減少相關。 自5T2MM注射時間起，將負載5T2MM細胞之小鼠用 ActRIIa-mFc ( RAP-01 1 ) ( 10 mg/kg，經腹膜内，每週兩 次）或媒劑治療，歷時總共12週。近端脛骨及腰椎之 MicroCT分析證實與原生小鼠相比負載5T2MM小鼠之疏 質骨體積減小39%及21% ( ρ<〇·〇〇1及Ρ<〇.〇1 )且小梁數 75 200900076 減少37°/。及15% ( ρ<〇.〇ι及p<〇 〇5 )。當與經媒劑治療之 小鼠相比時’ RAP-011完全阻止5T2MM誘發的脛骨中之 小梁體積及數目的減小（p<0 〇〇1及p<〇 〇5 )與椎骨中之 小梁體積及數目的減小（p<0 (H及p<〇 〇5 )。當與原生小 鼠相比時，經RAP-0 1 1治療之小鼠之骨體積在脛骨中高丨9% (p=168 )且在椎骨中高12% ( p<〇 〇5 ) 。RAp_〇1 i阻止溶

骨病變發展（ρ<0·05 )。此作用說明於圖26中。儘管在此 研究中數據之初步評估未能鑑別對血清副蛋白（多發性骨 髓瘤細胞之生物標記）或骨髓瘤負荷的顯著影響，但進一 步分析指示血清副蛋白在除一隻以外之所有經治療動物中 實質上減少且進一步指示健康骨髓之體積實質上增加，其 指示骨髓瘤細胞負荷減小。 因此’ ActRIIa-mFc可用於減小由多發性骨髓瘤引起 之骨病的影響且用於治療腫瘤細胞本身。 實施例5 . ActRIIa-hFc蛋白之表徽 使用SEQ ID NO·· 9之組織纖維蛋白溶酶原前導序列， 在自PA!D4載體（SV40 ori/強化子，CMv啟動子）穩定 轉染之CHO-DUKX B11細胞中表現ActRHa_hFc融合蛋 白。如上文實施命u中戶斤述而純化之蛋白質具有seqid〇n〇. 7之序列。Fe部分為如SEQIDN〇: 7所示之人類⑽& 序列。唾液酸分析顯示蛋白質含有平均介於約i 5莫耳與 2.5莫耳之間的唾液酸/ActRIIa_hFc融合蛋白八子 此經純化之蛋白質在所測試之所右 所有動物中顯示顯著較 長之血清半生期’包括在人類患者中 天之半生期（參 76 200900076 另外’ CHO細胞所表現之物質對活

ActRIIa-Fc ’各者具有不同N末端序列。 丨6，下文）。另外，CH0 配位體之親和力高於對在 :人既堯產复星 在奴機化、雙盲、安慰劑對照之研究中將實施例5中

,π至、acmiia-iih或安慰劑（5組活性 劑：ι組安慰劑）。劑量水平處於經靜脈内（ιν) 〇 〇1至3 〇 mg/kg 及經皮下（Sc) 〇.03 個體照此進行120天。若値 〇.〇3至0.1 mg/kg之範圍内。所有 若個體在研究入選之6個月内服用 影響骨代謝之藥物，則將其排除在研究參與者之外。按各 組進行安全性評估以確定劑量之按比例放大。除藥物動力 學（PK )分析以外，亦藉由量測骨形成及再吸收之生化標 記及FSH含量來評估ActRIIa-hFc之生物活性。 無嚴重不良事件報導於此研究中。不良事件（AE ) 一 般為輕度及短暫的。AE之初步分析包括頭痛、實驗值升 高、感冒症狀、嘔吐、靜脈内滲入及注射部位血腫。

ActRIIa-hFc之PK分析顯示隨劑量之線性特徵及約 77 200900076 25~32天之平均半生期。ActRIIa-hFc之曲線下面積（AuC ) 與劑量線性相關’且經皮下給藥後吸收基本上完全（參見 圖27及圖28 )。此等數據指示經皮下為所需之給藥方法， 此係由於其提供藥物之等效生物可用性及血清半生期，同 時避免與經靜脈内給藥之頭幾天相關之藥物血清濃度的尖 峰（參見圖28 ) 。ActRIIa-hFc引起骨特異性鹼性磷酸酶 (BAP )之血清含量快速、持續劑量依賴性增加（其為同 Γ 化骨生長之標記），及C末# i型膠原蛋白尾肽及抗酒石 酸鹽酸性磷酸酶5b含量劑量依賴性減小（其為骨再吸收 2標記）。諸如P1NP之其他標記顯示非結論性結果。BAP - 含量在最高藥物劑量下顯示接近飽和效應，其指示對此同 ‘化骨生物標記之半最大影響可在G.3 mg/kg (增加範圍至3 mg/kg )之劑$下達成。按藥物之藥效作用與'ye 計算，阳〇為51,465 (天數xng/ml)。參見圖29 2 測試之最高劑量水平τ此等骨生物標記變化持續約 、二與活化素抑制一致，血清FSH含量亦存在劑量依賴性 、-、。卞健康停經後女性之單次劑量ActRIIa_hFe :試之劑量水平範圍而言為安全的且具良好耐受性。外所 樂效作用延長表明間歇性給藥對於未來研究及 的。舉例而言，可根據每月一次或按照每兩週：：：適當 另从 之規則進仃基於血清半生期之级鏟 因此可基於藥二:遠遠超過藥物之血清滯留期， 仃給樂其忍明母三個月或每兩 78 200900076 個、三個、四個、$加 ..,、 、八個或甚至十二個月給藥可有效 地在心者中產生所要作用。此臨床試驗證實，在人類中

Fc為具有骨形成增加與骨再吸收減少之生物 的骨同化劑。 酸鹽之共同投鍪 又膦fee鹽為廣泛用於治療與低骨礙物密度相關之病症 (包括骨質疏鬆症及癌症相關骨質流失）之一類藥物。雙 膦酸鹽具有有效抗再吸收活性’其抑制破骨細胞。可能由 於破骨細胞為骨破裂與骨生長所f，因此雙膦酸鹽似乎減 小副甲狀腺激f (PTH)(僅已知同化骨生長劑中之一者） 之作用（Black 等人，N Engl J Med. 2003 年 9 月 25 日； 349(13):1207-15 ; Samadfam 等人，Endocrin〇1〇gy 2〇〇7 年 6 月；148(6):2778-87)。

為測試ActRIIa-Fc治療在先前已接受或正伴隨接受雙 膦酸鹽或其他抗再吸收療法之患者中的效用，將小鼠用經 組合之ActRIIa-mFc與°坐來膦酸鹽（一種雙膦酸鹽化合物） 進行測試。如下治療12週大C57BL/6N小鼠：

組 1 PBS 組 2 ActRIIa-mFc ( RAP-011 ) ( 10 mg/kg )，每週兩 次（與組3及組4 一起） 組3唑來膦酸（Zoledronic Acid ) ( ZOL )，單次給 藥（20 mg/kg ) 組4 ZOL ( 1次劑量），3天後每週兩次ActRIIa-mFc (RAP-0 11 ) ( 1 mg/kg ) 79 200900076 組5 ZOL ( 1次劑量），3天後每週兩次ActRIIa-mFc (RAP-011 ) (10 mg/kg ) 給藥前及治療第3週及第8週由DEXA掃描（ΡΙΧΙ ) 測定總BMD。 如圖30所示，總BMD在所有治療組中顯著增加，其 中ZOL與ActRIIa-mFc之組合產生最大作用。此等結果指 示ActRIIa-Fc蛋白即使已接受雙膦酸鹽療法之患者中仍可 用於增加骨密度。 免碰例8 : 4^RIIa-Fc改善或預防A乳癌韓蒋弓丨杷之 骨質流失 據估計65%至75%之乳癌轉移至骨，其對骨結構產生 貫i性損傷’增加骨折危險且引起疼痛及其他副作用。吾 人測試ActRIIa-FC在已轉移至骨之乳癌之小鼠模型中的作 用。 於試管内培養人類乳癌細胞系MDA-MB-23 1之亞系 (純系2287 )且以5 X 1〇6個細胞/毫升之密度收集細胞。 MDA-MB-23 1為在接種至骨中且引起與由骨轉移引起之骨 損傷類似之骨損傷方面高度勝任之細胞系Q研究第〇天將 1〇 ml細胞注射至6週齡之雌性無胸腺裸鼠之脛骨中。研 九第10天小鼠接受ActRIIa-mFc ( l〇mg/kg/每週兩次/經皮 下）（n=8)或PBS媒劑（n=7)。以每週時間間隔由雙能 量X射線吸收測定法（PIXIMus)評估疾病進程。將小鼠 用ActRIIa-mFc治療4週且接著將其處死，且自各動物收 集腔骨（經腫瘤注射與無腫瘤）。接著對脛骨進行處理且 80 200900076 - 準備用於microCT及組織學分析。 將MDA-MB-231細胞經脛骨内注射至無胸腺裸鼠中與 對側腿相比促進經注射之脛骨中之溶骨病變發展。近端脛 骨之MicroCT分析證實，與經PBS媒劑治療之小鼠的無腫 瘤脛骨相比，負載MDA-MB-23 1脛骨之疏質骨體積減小 62%。ActRIIa-mFc治療使得與媒劑相比，原生脛骨或負載 腫瘤脛骨分別增加70%或147% (對二者而言，Ρ<0·01 )。 經ActRIIa-mFc治療之小鼠的負載腫瘤脛骨具有與經VEH v 治療之小鼠的原生脛骨類似之疏質骨密度（p=0.39 )。 因此，ActRIIa-mFc能消除與骨中乳房腫瘤細胞的存 在相關之骨損傷。 實施例9 :替代ActRIIa-Fc蛋白 替代構築體可缺失ActRIIa之胞外域之C末端尾巴（最 後15個胺基酸）。該構築體之序列呈現如下（Fc部分加 下劃線）（SEQ ID NO: 12):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFA TWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGN MCNRKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFT.FPPKPKDTT.MT SRTPKVTrVVVDVSHKDPF,VKFNWYVDGVF,VHNAKTKPRRROYNS TYRVVSVT-TVT^HODWT.NGKKYKCKVSNK AT.PVPTF.KTTSK AKGOPR RPOVYTT.PPSRRRMTKNOVST^TCT^VKrTFYPSDTAVKWF-SNGOPRNN YKTTPPVT.DSDGSFFT.YSKI.TVDKSRWOOGNVFSCSVMHKAT.HNH YTOKST,ST,SPGK 以引用方式併入 81 200900076 本文所提及之所有公開案及專利藉此以引用的方式全 部併入，如同每一個別公開案或專利特定及個別地表示以 引用的方式併入一般。 儘管已討論標的物之特定具體實例，但上述說明為說 明性的且並非限制性的。對本說明書及以下申請專利範圍 的回顧之後，許多變化對於熟習此項技術者而言將變得顯 而易見。本發明之完整範疇應藉由參考申請專利範圍連同 其等效物之完整範疇一起及本說明書連同該等變化一起而 確定。 【圖式簡單說明】 圖1展示於CHO細胞中表現之ActRIIa-hFc之純化。 蛋白質純化成單一、充分界定之峰。 圖2展示如由BiaCoreTM檢定所量測，ActRIIa-hFc與 活化素及GDF-11之結合。 圖3展示A-204報導體基因檢定之圖解。該圖展示報 V 體載體.pGL3(CAGA)12 (描述於 Dennler 等人，1998, EMBO 17: 3091_3100 中）。CAGA12 基元存在於 TGF_p 反 應基因（PAI-1基因）中，故此載體一般用於經smad 2及 3進行因子信號轉導。 圖4展示在A-204報導體基因檢定中ActRIIa_hFc (菱 形）及ActRIIa-mFc (正方形）對GDF_8信號轉導的影響。 兩種蛋白質均顯示在皮莫耳濃度下對GDF_8介導之信號轉 導的實質性抑制。 82 200900076 圖5展不在A-204報導體基因檢定中三種不同 ActRIIa-hFc製劑對GDIM1信號轉導的影響。 圖6展不12週治療時段之前（上部畫面）及12週治 療時段之後（下部畫面）經對照治療及經ActRIIa-mFc治 療之BALB/c小鼠之DEXA影像的實例。較淡色相表示骨 密度增加。 圖7展示經12週時段ActRIIa-mFc對BALB/c小鼠之 骨礦物密度之影響的量化。治療為對照（菱形）、2 mg/kg 劑畺之 ActRIIa-mFc (正方形）、6 mg/kg 劑量之 ActRIIa· mFc (三角形）及1〇 mg/kg劑量之ActRIIa_mFc (圓形）。 圖8展不經12週時段ActRIIa-mFc對BALB/c小鼠之 骨礦物含量之影響的量化。治療為對照（菱形）、2 mg/kg 劑量之 ActRIIa-mFc (正方形）、6 mg/kg 劑量之 ActRIIa· mFc (三角形）及1〇 mg/kg劑量之ActRHa_mFc (圓形）。 圖9展不經6週時段後ActRIIa-mFc對卵巢切除 (OVX)或假手術（SHAM) C57BL6小鼠之小梁骨之骨礦 物密度之影響的量化。治療為對照（PBS )或丨〇 mg/kg劑 量之 ActRIIa-mFc ( ActRIIa )。 圖10展示經12週時段ActRIIa_mFc對卵巢切除 (OVX ) C57BL6小鼠之小梁骨之影響的量化。治療為對 如、（PBS ;淺色條）或10 mg/kg劑量之ActRna_mFc (ActRIIa ;暗色條）。 圖11展不在6週或12週之治療時段後ActRna_mFc 對假手術C57BL6 +鼠之小梁骨之影響的量化。治療為對 83 200900076 ' 知（PBS ’ 淺色條）或 1〇 mg/kg 劑量之 ActRIIa-mFc (ActRIIa ;暗色條）。 圖12展示經12週治療卵巢切除小鼠之骨密度之pQCT 分析的結果。治療為對照（PBS ;淺色條）或ActRIIa-mFc (色條）。y 軸：mg/ccm。 圖13描繪經12週治療假手術小鼠之骨密度之pQCT 分析的結果。治療為對照（pBS ;淺色條）或ActRIIa_mFc (暗色條）。y軸：mg/ccm。 圖14A及圖14B展示12週治療後全身DEXA分析（A) 及股骨之活體外分析（B )。發光區域描繪高骨密度之區 域。 圖1 5展示1 2週治療後股骨中段之活體外pQCT分析。 治療為媒劑對照（PBS，暗色條）及ActRIIa_mFc(淺色條）。 左邊四個條展示總骨密度，而右邊四個條展示皮質骨密 度。每組四個條中之第一對條表示來自卵巢切除小鼠之數 據’而第二對條表示來自假手術小鼠之數據。 圖16展示12週治療後股骨中段之活體外pQCT分析 及骨幹骨含量。治療為媒劑對照（pBS，暗色條）或

AetRIIa-mFc (淺色條）。左邊四個條展示總骨含量，而右 邊四個條展示皮質骨含量。每組四個條中之第一對條表示 來自卵巢切除小鼠之數據，而第二對條表示來自假手術小 机之數據。 圖17展示股骨中段及股骨皮質厚度之活體外pQCT分 析。治療為對照（PBS，暗色條）及ActRIla-mFc(淺色條）。 84 200900076 - 左邊四個條展示骨内膜周長，而右邊四個條展示骨膜周 長。每組四個條中之第一對條表示來自卵巢切除小氣之數 據，而第二對條表示來自假手術小鼠之數據。 圖18描繪12週治療後股骨之機械測試之結果。治療 為對照（PBS，暗色條）及ActRIIa_mFc (淺色條）。左邊 兩個條表示來自卵巢切除小鼠之數據，而最後兩個條表示 ' 來自假手術小鼠之數據。 、 圖19展示Actrlla-mFc對小梁骨體積的影響。 圖20展示Actrlla-mFc對遠端股骨中之小梁架構的麥 響。 • 圖21展示Actrlla-mFc對皮質骨的影響。 圖22展示ActrIIa_mFc對骨骼之機械強度的影響。 圖23展示在三種不同劑量下不同劑量之ActRIIa_mFc 對骨特徵的影響。 圖24展示指示ActRIIa-mFc具有同化與抗再吸收雙重 活性之骨組織形態測定。 圖25展示其他組織形態測定數據。 圖26展示來自原生小鼠及負載腫瘤小鼠之小鼠股骨的 衫像’及ActRIIa-mFc治療對多發性骨髓瘤模型之骨形態 的影響。負載多發性骨髓瘤（5T2 )之小鼠相對於正常小 取（原生）顯示骨絡之明顯坑洞及退化。用ActRIIa-mFc 治療消除此效果。 圖27展示來自實施例6中所述之人類臨床試驗之結 果’其中無論ActRIIa-hFc係經靜脈内（IV)抑或係經皮 85 200900076 - 下（SC )投予，曲線下面積（AUC )與之所投予ActRIIa- hFc劑量具有線性相關性。 圖28展示經靜脈内或經皮下投予之患者之ActRIIa-hFc血清含量的比較。 圖29展示回應不同ActRIIa-hFc劑量水平的骨赂驗性 磷酸酶（BAP )含量。BAP為同化骨生長之標記。 圖30展示小鼠中ActRIIa-mFc ( RAP-011 )與雙膦酸 鹽藥劑（α坐來膦酸鹽，zoledronate )之協同效應。 【主要元件符號說明】 無 \ 86

Claims (1)

1. 200900076 . 十、申請專利範圍： 1.—種包含自CHO細胞表現之ActRIIa-Fc融合蛋白之 醫藥組合物，其中該ActRIIa-Fc融合蛋白為由藉由雙硫鍵 鍵結而接合之兩個SEQ ID NO:7多肽所形成之二聚體，.其 限制條件為該等多肽中之一或兩者可在胺基末端或羧基末 • 端具有比SEQ ID NO:7所示少一個之胺基酸，且其中該二 • 聚體具有介於3個與5個之間的唾液酸部分。 2·如申請專利範圍第1項之醫藥製劑，其中該二聚體 具有4個唾液酸部分。 3.如申請專利範圍第1項之醫藥製劑，其中該 ACtRIIa-Fc融合蛋白在正常、健康人中具有平均乃至w • 天之血清半生期且當經靜脈内或經皮下投予時具有等效生 物可用性。 4_如申請專利範圍帛1項之醫藥製劑，其中該醫藥製 劑適合於經皮下投藥。 5_如申請專利範圍第1項之醫藥製劑，其中該 ACtRlIa_Fc融合蛋白相對於其他蛋白質組份之純度為至少 -β —〜叩迎’丹你用於製造供 治療或預防人類患者之痒拧 <么症相關骨質流失用之醫藥品。 7.如申請專利範圍第 ’、 -丄人 貝之用途，其中該ActRIIa-Fc 融δ蛋白係選自由以下各者組成之群： a _ 包含與 "> :2至少9〇% —致之胺基酸序 列的多肽； 200900076 b.包含與SEQ ID NO: 3至少90% —致之胺基酸序 列的多肽；及 c包含SEQ id NO: 2之至少50個連續胺基酸的 多肽。 8·如申δ月專利範圍第7項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白具有以下特徵中之一或多者： 1以至少10·7 Μ之KD與ActRIIa配位體結合；及 Π·抑制細胞中之ActRIIa信號轉導。 9·如申5青專利範圍第6項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包括一或多個選自以下各者之經修飾胺基酸殘 基：糖基化胺基酸、PEG化胺基酸、法呢基化胺基酸、乙 酿化胺基酸、經結合生物素之胺基酸、與脂質部分結合之 胺基酸、及與有機衍生劑結合之胺基酸。 10. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少90%—致 之胺基酸序列。 11. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含與SEQ id NO: 3之胺基酸序列至少95%—致 之胺基酸序列。 12. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。 13. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。 14. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該ActRIIa-Fc 2 200900076 融合蛋白為由兩個各包含與Seq id NO: 2之胺基酸序列至 少90% 一致之胺基酸序列的多肽形成之二聚體且其中該 ActRIIa-Fc融合蛋白包含三個或更多個唾液酸部分。 15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。 16. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含介於3個與5個之間的唾液酸部分。

   1 7.如申凊專利範圍第6項之用途，其中該醫藥品在投 予u ’“者後使彳牙該患者之骨絡肌質量增加小於1 〇 %。 18·如申請專利範圍第6項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白經投予以在該患者中達到至少200 ng/mL之血清 濃度。 19·如申請專利範圍第18項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融&蛋白經投予以在該患者中達到至少1 000 ng/mL·之血清 濃度。 20’如申睛專利範圍第6項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融口 ^白具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。 .如申請專利範圍第6項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白在正音 . 甘止吊、健康之人中具有介於15天與40天之間 的血清半生期。 該 ActRIIa-Fc 該 ActRIIa-Fc 一 ·甲請專利範圍第20項之用i 融合蛋白投予該患者之頻率不高於每 如申請專利範園第2〇項之用土 w虫合蛋白投予# # + 予遠患者之頻率不高於每 3 200900076 如申請專利範圍第

   •如申δ青專利範圍第 ，圍第20項之用途，其中該ActRIIa-Fc 率不高於每三個月一次。

   其中該醫藥品係與放射線療法、細胞毒性劑或化學治療齊 組合施予該人類患者。 圍第6項至第24項中任—項之用途， 路抗再吸收療法或在投予ActRIIa-Fc 第25項之用途’其中該抗再吸收 成之群：雙膦酸鹽藥劑、RANK配 ’ 印專利範圍第6項至第24項中任一項之用途， 28.如申請專利範圍第6項至第24項中任一項之用途， 其中该患者患有多發性骨髓瘤。

   29.—種活化素_ActRHa 供治療或預防癌症相關骨質流失用之藥劑。 30_如申請專利範圍第29項之用途，其中該活化素-ActRIIa拮抗劑為活化素或ActRIIa结抗劑多肽。 3 1 _如申請專利範圍第29項之用途，其中該活化素-ActRIIa拮抗劑為選自由以下各者組成之群的抗體： a. 抗活化素抗體；及 b. 抗 ActRIIa 抗體。 32. 如申請專利範圍第29項之用途，其中該個體患有 多發性骨髓瘤。 33. —種ActRIIa-Fc融合蛋白之用途，其係用於製造供 4 200900076 :足進患者之骨生長且抑制患者之骨再吸收用之藥劑，其中 Rlla Fc融合蛋白為由兩個各包含與sEq ID N〇: 2 ，胺基酸序列至少9G%—致之胺基酸序列的多肽形成之二 / 〃中AetRIIa_Fe融合蛋白包含三個或更多個唾液 酸部分。 34·如申明專利範圍第33項之用途，其中該 融合蛋白包含SEQIDNq:22胺基酸序列。

   -一 35.如申μ專利範圍第34項之用途，其中該ActRIIa_Fc 融合蛋白包含介於3個與5個之間的唾液酸部分。 ^ j6.如申請專利範圍第33項之用途，其中該醫藥品在 又予忒心者後使得該患者之骨骼肌質量增加小於丨。 一 37·如申凊專利範圍第33項之用途，其中該ActRHa_Fc 南虫合蛋白經投千以a # & + , 又卞以在该患者中達到至少200 ng/mL之血清 a 38.如申請專利範圍第33項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合3蛋$白具有SEQIDN〇: 7之胺基酸序列。 9·如申請專利範圍第33項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白在正當、絲由 吊 健康人中具有介於15天與40天之間的 血清半生期。 _ ’和闽珩項之用途，其m AGLiviia-r c 融合蛋白投予兮玄击i 卞°亥患者之頻率不高於每週一次。 •如申清專利範圍第33項之用途，其中該ActRIIa-Fc 42仅予^亥患者之頻率不高於每月一次。 申月專利範圍第33項之用途，其中該ActRIIa-Fc 5 200900076 " 融合蛋白投予該患者之頻率不高於每三個月一次。 申明專利範圍第3 3項之用途，其中該患者在投 予ActRIIa_Fc融合蛋白前一年内已接受抗再吸收療法。 44·如申清專利範圍帛33項之用it，其中該患者在投 tRIIa Fc㉔合蛋白同時正接受抗再吸收療法。 45. 如申請專利範圍帛33項之用途，其中該藥劑係與 ' 抗再吸收劑組合投予。 46. 如申請專利範圍第43項至第45項中任一項之用 项·，其中该抗再吸收劑為雙膦酸鹽藥劑。 47·如申請專利範圍第43項至第45項中任一項之用 — 途，其中該抗再吸收劑為RANK配位體拮抗劑或護骨素拮 抗劑。 48·種ActRIIa-Fc融合蛋白之用途，其係用於製造供 治療或預防人類患者之多發性骨髓瘤用之醫藥品。 49.如申凊專利範圍第48項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白係選自由以下各者組成之群： a.包含舆SEQ ID NO: 2至少90% —致之胺基酸序 列的多肽； b’包含與SEQ ID NO: 3至少90% —致之胺基酸序 列的多肽；及 c·包含SEQ ID NO: 2之至少50個連續胺基酸的 多肽。 5〇.如申請專利範圍第49項之用途，其中該ActRlIa-Fe 融合蛋白具有以下特徵中之一或多者： 6 200900076 1·以至少1〇_7 Μ之KD與ActRIIa配位體結合；及 抑制細胞中之ActRIIa信號轉導。 5 1.如申請專利範圍第48項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包括一或多個選自以下各者之經修飾胺基酸殘 基·糖基化胺基酸、peg化胺基酸、法呢基化胺基酸、乙 醯化胺基酸、經結合生物素之胺基酸、與脂質部分結合之 胺基酸、及與有機衍生劑結合之胺基酸。 52.如申請專利範圍第49項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少90%—致 之胺基酸序列。 53 ·如申請專利範圍第49項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含與SEq ID NO: 3之胺基酸序列至少95%—致 之胺基酸序列。 54·如申請專利範圍第49項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。 55 ·如申請專利範圍第49項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。 56.如申請專利範圍第48項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白為由兩個各包含與SEq m NO: 2之胺基酸序列至 少90 /〇 —致之胺基酸序列的多肽形成之二聚體且其中該 ActRIIa-Fc融合蛋白包含三個或更多個唾液酸部分。 57·如申清專利範圍第56項之用途，其中該ActRIIa-Fc 融合蛋白包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。 58.如申請專利範圍第57項之用途，其中該ActRIIa-Fc 7 200900076 融合蛋白包含介於3個與5個之間的唾液酸部分。 59.如申請專利範圍第48項之用途，其中該醫藥品在 又予該患者後使得該患者之骨絡肌f f增加小於·。 s 6〇·如申請專利範圍第Μ項之用途，其中該ActRIIa_Fc 3 口蛋白、’“又予以在該患者中達到至少、工。⑽叫/紅之血清 濃度。 3 1 ·如申°月專利範圍第項之用途，其中該ActRIIa-Fc 岫合蛋白具有SEQidn〇:7之胺基酸序列。 s 62.如申清專利範圍第48項之用途，其中該ActRIIa-Fc 成合蛋白在正常 ^ 健康人中具有介於15天與40天之間的 灰清半生期。 3, . 士申μ專利範圍第61項之用途，其中該ActRIIa-Fc 喊合蛋白投予該φ 64 茨心者之頻率不高於每週一次。 融入^申4專利範圍第61項之用途，其中該ActRIIa-Fc I*投申？患者，頻率不高於每月-次。 融合恭么 叫專利範圍第61項之用途，其中該ActRIIa-Fc 白投予該·丰土^ 心者之頻率不高於每三個月一次。 十一、圖式： 如次頁 8