JP2003012699A - 抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、該抗体を用いるｅｌｉｓａ測定キット、該製法による系標識毒標品 - Google Patents
抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、該抗体を用いるｅｌｉｓａ測定キット、該製法による系標識毒標品Info
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- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 麻酔性貝毒の簡便で精度が高く、しかも貝毒
の種類に関係なく、感度一定に測定できるようにするこ
と。 【解決手段】 サキシトキシンの１１位にスルフヒドリ
ル基を複数持つ任意のジチオール化合物を結合させて遊
離スルフヒドリル基を持つサキシトキシンスルフヒドリ
ル誘導体を調製し、他方、スルフヒドリル基指向性の任
意の官能基をアミノ基に導入したタンパク質を調製し、
次いで上記サキシトキシンスルフヒドリル誘導体と上記
修飾タンパク質とを反応させて得られる抗原を非ヒト動
物に免疫し、該動物から麻痺性貝毒を認識する抗血清を
得ることを含む、麻痺性貝毒に対する抗体の製法、なら
びに、この抗体を用いるELISA測定キット及び上記製法
を利用して調製した標識毒標品の提供。
の種類に関係なく、感度一定に測定できるようにするこ
と。 【解決手段】 サキシトキシンの１１位にスルフヒドリ
ル基を複数持つ任意のジチオール化合物を結合させて遊
離スルフヒドリル基を持つサキシトキシンスルフヒドリ
ル誘導体を調製し、他方、スルフヒドリル基指向性の任
意の官能基をアミノ基に導入したタンパク質を調製し、
次いで上記サキシトキシンスルフヒドリル誘導体と上記
修飾タンパク質とを反応させて得られる抗原を非ヒト動
物に免疫し、該動物から麻痺性貝毒を認識する抗血清を
得ることを含む、麻痺性貝毒に対する抗体の製法、なら
びに、この抗体を用いるELISA測定キット及び上記製法
を利用して調製した標識毒標品の提供。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、麻痺性貝毒に対す
る抗体の製法およびその抗体に関する。さらに本発明
は、上記抗体を用いるELISA測定キットおよび上記製法
により得られる麻痺性貝毒結合測定法用標識毒標品に関
する。
る抗体の製法およびその抗体に関する。さらに本発明
は、上記抗体を用いるELISA測定キットおよび上記製法
により得られる麻痺性貝毒結合測定法用標識毒標品に関
する。
【０００２】
【従来の技術】麻痺性貝毒中毒は神経麻痺を主徴とする
症状を呈し、その原因毒はゴニオトキシン類およびサキ
シトキシン類であることが判明している［安元健、麻痺
性貝毒、食品衛生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生
局監修）、第300−305頁、日本食品衛生協会、1991
年]。これら原因毒は麻痺性貝毒と総称され、現在、イ
ガイ、ハマグリ等の貝類に見出される貝毒としてゴニオ
トキシン類、サキシトキシン類で 20種以上が知られて
いる。
症状を呈し、その原因毒はゴニオトキシン類およびサキ
シトキシン類であることが判明している［安元健、麻痺
性貝毒、食品衛生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生
局監修）、第300−305頁、日本食品衛生協会、1991
年]。これら原因毒は麻痺性貝毒と総称され、現在、イ
ガイ、ハマグリ等の貝類に見出される貝毒としてゴニオ
トキシン類、サキシトキシン類で 20種以上が知られて
いる。
【０００３】この貝毒はナトリウムチャネルをブロック
する性質を有する麻痺性毒であり、渦鞭毛藻に属する植
物プランクトンの数種類に含まれ、これを餌として食べ
た貝が毒をため込み毒化する。この貝を食すると死亡率
の高い食中毒を引き起こすため、水産および食品衛生上
大きな社会問題になっている。因みに、麻痺性貝毒0.5
〜1.0ｍｇ経口摂取しただけで感覚麻痺、悪心、下痢な
どの症状がでる。ヒトにおける致死量は１〜３ｍｇであ
る。麻痺性貝毒による貝類の汚染地域は世界的に拡大傾
向にあり、これらの汚染地域では毒化貝による食中毒防
除のため出荷する貝の毒性をマウス試験法あるいはHPLC
法により検査している。しかしこれらの測定法は精度、
測定にかかる費用や労力の点で多くの問題があり、毒の
簡易測定法の開発が望まれている。
する性質を有する麻痺性毒であり、渦鞭毛藻に属する植
物プランクトンの数種類に含まれ、これを餌として食べ
た貝が毒をため込み毒化する。この貝を食すると死亡率
の高い食中毒を引き起こすため、水産および食品衛生上
大きな社会問題になっている。因みに、麻痺性貝毒0.5
〜1.0ｍｇ経口摂取しただけで感覚麻痺、悪心、下痢な
どの症状がでる。ヒトにおける致死量は１〜３ｍｇであ
る。麻痺性貝毒による貝類の汚染地域は世界的に拡大傾
向にあり、これらの汚染地域では毒化貝による食中毒防
除のため出荷する貝の毒性をマウス試験法あるいはHPLC
法により検査している。しかしこれらの測定法は精度、
測定にかかる費用や労力の点で多くの問題があり、毒の
簡易測定法の開発が望まれている。
【０００４】このため麻痺性貝毒を定量する方法が種々
開発されている。たとえば公定法であるマウスを用いた
致死活性測定法[安元健、前掲；Ｊ．Ｆ．Jellettら、To
xicon,30(10)：1143-1156(1992)；W. Horwitz, Paralyt
ic shellfish poison. In "Official Methods of Analy
sisi of the Association of Official Analytical Che
mists"(Assoc. Official Anal. chem., Washingtion D.
C.) pp. 881-882(1990)］、高速液体クロマトグラフィ
ー法［Y. Oshimaら、Mycotoxins and Phycotoxins '88
(S. Natoriら編），pp.319-326, Elsevier, Amsterdam
(1989)）；特開平9-133669号公報］、神経芽細胞を用い
る方法［K. Kogureら，Toxicon, 26:191-197(1989)］、
抗体を用いる方法［F.S. Chuら，J. Agri. Food Che
m.，44：4043-4047(1996)］などが知られている。致死
活性による測定法は、マウス試験原液を腹腔内に注射
し、注射の終了した瞬間からマウスが典型的な麻痺性貝
毒による症状を示して死亡する際の最後のあえぎまでの
時間（致死時間）を秒単位で記録し、標準毒で作製した
用量一致時間曲線から毒量を推定する方法である。高速
液体クロマトグラフィー法は、麻痺性貝毒を含む試料を
高速液体クロマトグラフィーにかけて麻痺性貝毒を分離
し、溶出液に酸化剤を加えてアルカリ中で反応させた
後、生じた蛍光性物質の蛍光を測定する方法である。神
経芽細胞を用いる方法は、神経芽細胞の培養系におい
て、Ｎａ＋を細胞外に排出する酵素Ｎａ−ＫＡＴＰａｓ
ｅの活性をウアバインで阻害した系にＮａ＋流入を促進
するベラトリジンとＮａ＋の流入を阻止する毒を持抗さ
せ、ベラトリジンにより起こる細胞の膨潤死を阻止する
毒の活性からその量を推定するもので、このアッセイ系
に麻痺性貝毒を含む試料を添加したときには細胞の丸ま
りと細胞死が毒量に比例して抑制されることを利用した
方法である。さらに、免疫学的方法は、麻痺性貝毒に対
する抗体を用いて、毒に結合する抗体量を、たとえば酵
素免疫測定法（たとえばELISA）等の方法で直接測定
し、その抗体量から試料中の麻痺性貝毒を定量する方法
である。
開発されている。たとえば公定法であるマウスを用いた
致死活性測定法[安元健、前掲；Ｊ．Ｆ．Jellettら、To
xicon,30(10)：1143-1156(1992)；W. Horwitz, Paralyt
ic shellfish poison. In "Official Methods of Analy
sisi of the Association of Official Analytical Che
mists"(Assoc. Official Anal. chem., Washingtion D.
C.) pp. 881-882(1990)］、高速液体クロマトグラフィ
ー法［Y. Oshimaら、Mycotoxins and Phycotoxins '88
(S. Natoriら編），pp.319-326, Elsevier, Amsterdam
(1989)）；特開平9-133669号公報］、神経芽細胞を用い
る方法［K. Kogureら，Toxicon, 26:191-197(1989)］、
抗体を用いる方法［F.S. Chuら，J. Agri. Food Che
m.，44：4043-4047(1996)］などが知られている。致死
活性による測定法は、マウス試験原液を腹腔内に注射
し、注射の終了した瞬間からマウスが典型的な麻痺性貝
毒による症状を示して死亡する際の最後のあえぎまでの
時間（致死時間）を秒単位で記録し、標準毒で作製した
用量一致時間曲線から毒量を推定する方法である。高速
液体クロマトグラフィー法は、麻痺性貝毒を含む試料を
高速液体クロマトグラフィーにかけて麻痺性貝毒を分離
し、溶出液に酸化剤を加えてアルカリ中で反応させた
後、生じた蛍光性物質の蛍光を測定する方法である。神
経芽細胞を用いる方法は、神経芽細胞の培養系におい
て、Ｎａ＋を細胞外に排出する酵素Ｎａ−ＫＡＴＰａｓ
ｅの活性をウアバインで阻害した系にＮａ＋流入を促進
するベラトリジンとＮａ＋の流入を阻止する毒を持抗さ
せ、ベラトリジンにより起こる細胞の膨潤死を阻止する
毒の活性からその量を推定するもので、このアッセイ系
に麻痺性貝毒を含む試料を添加したときには細胞の丸ま
りと細胞死が毒量に比例して抑制されることを利用した
方法である。さらに、免疫学的方法は、麻痺性貝毒に対
する抗体を用いて、毒に結合する抗体量を、たとえば酵
素免疫測定法（たとえばELISA）等の方法で直接測定
し、その抗体量から試料中の麻痺性貝毒を定量する方法
である。
【０００５】特に、F.S. Chuら（前掲）は抗サキシトキ
シン抗体／サキシトキシン−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合体または抗ネオサキシトキシン抗体／ネオサキシ
トキシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を用いる
ELISAによって麻痺性貝毒の全量を測定するアッセイ方
法を開示している。抗体の調製は、F.S. ChuとX. Fan,
J. Assoc. Off. Anal. Chem, 1985, 68:13-16およびF.
S. Chu，J. AGACInt. 1992, 75:341-345に従って調製さ
れているが、その手順は、Johnsonら（Proc. Soc. Exp.
Biol. Med., 1964, 117, 425）の方法に準じ、牛血清
アルブミン、polylysineもしくはkeyhole limpet（カサ
ガイ）のヘモシアニンをホルマリンを含む弱酸性水溶液
中でサキシトキシンまたはネオサキシトキシンと反応さ
せて得た結合体を、ウサギに皮下注射してポリクローナ
ル抗体を得ることによっている。
シン抗体／サキシトキシン−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合体または抗ネオサキシトキシン抗体／ネオサキシ
トキシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を用いる
ELISAによって麻痺性貝毒の全量を測定するアッセイ方
法を開示している。抗体の調製は、F.S. ChuとX. Fan,
J. Assoc. Off. Anal. Chem, 1985, 68:13-16およびF.
S. Chu，J. AGACInt. 1992, 75:341-345に従って調製さ
れているが、その手順は、Johnsonら（Proc. Soc. Exp.
Biol. Med., 1964, 117, 425）の方法に準じ、牛血清
アルブミン、polylysineもしくはkeyhole limpet（カサ
ガイ）のヘモシアニンをホルマリンを含む弱酸性水溶液
中でサキシトキシンまたはネオサキシトキシンと反応さ
せて得た結合体を、ウサギに皮下注射してポリクローナ
ル抗体を得ることによっている。
【０００６】具体的には、これらの抗体の作製に用いら
れた抗原は、サキシトキシンの分子内に存在する２つの
グアニジウム基にホルマリンを介してタンパク質を結合
したもの［Johnsonら，上記；ChuとFan, 上記；V. Renz
とG. Terplan, Arch, Lebensmittelhyg., 1988, 39, 25
-56;A. Cembellaら，"Specificity and cross-reactivi
ty ofan adsorption-inhibition onzyme-linked immuno
assay for the detection ofparalytic shellfish toxi
ns. In Toxic Marine Phytoplankton"（E. Graneliら
編），Elsevier Science Publishers, New York, pp.33
9-344,1989］、サキシトキシンの１２位に存在する２つ
のOH基のうちの１つをはずし、残ったOH基にタンパク質
を結合したもの［R. Carlsonら、"Development of immu
noassays for paralytic shellfish poisoning. A radi
o immunoassay for sexitoxin. InSwafood Toxins" ,
（E.P. Ragelis編）， ACS Symposium Serics 262, Ame
ricanChemical Society, Washington, D.C., pp.181-19
2"］に大別できる。前者の抗原は、タンパク質の結合部
位が２つのグアニジウム基のいずれかあるいは両方かが
明確でなく作製された抗体の反応性は発表グループによ
り異なるが、いずれのグループの抗体もネオサキシトキ
シンとの反応性は良いもので２０％程度（但し、サキシ
トキシンとの反応性を１００％とする。）であり、サキ
シトキシンとの同様IN-H誘導体であるゴニオトキシン
２，３およびデカルバモイルサキシトキシンとの反応性
も５０％程度と低い。また、カルバモイル−Ｎ−スルフ
ェート誘導体であるＣトキシンとは全く結合しない。一
方、後者の抗体は、ネオサキシトキシンとの反応性が１
％以下と報告され、他の毒成分との反応性は調べられて
ない。さらに、同様の抗原を用いたモノクローナル抗体
の作製も試みられているが、これらは反応性、感度とも
低い（R. Hackら，Food and Agriculturel immunology,
1990,2, 47-48）。
れた抗原は、サキシトキシンの分子内に存在する２つの
グアニジウム基にホルマリンを介してタンパク質を結合
したもの［Johnsonら，上記；ChuとFan, 上記；V. Renz
とG. Terplan, Arch, Lebensmittelhyg., 1988, 39, 25
-56;A. Cembellaら，"Specificity and cross-reactivi
ty ofan adsorption-inhibition onzyme-linked immuno
assay for the detection ofparalytic shellfish toxi
ns. In Toxic Marine Phytoplankton"（E. Graneliら
編），Elsevier Science Publishers, New York, pp.33
9-344,1989］、サキシトキシンの１２位に存在する２つ
のOH基のうちの１つをはずし、残ったOH基にタンパク質
を結合したもの［R. Carlsonら、"Development of immu
noassays for paralytic shellfish poisoning. A radi
o immunoassay for sexitoxin. InSwafood Toxins" ,
（E.P. Ragelis編）， ACS Symposium Serics 262, Ame
ricanChemical Society, Washington, D.C., pp.181-19
2"］に大別できる。前者の抗原は、タンパク質の結合部
位が２つのグアニジウム基のいずれかあるいは両方かが
明確でなく作製された抗体の反応性は発表グループによ
り異なるが、いずれのグループの抗体もネオサキシトキ
シンとの反応性は良いもので２０％程度（但し、サキシ
トキシンとの反応性を１００％とする。）であり、サキ
シトキシンとの同様IN-H誘導体であるゴニオトキシン
２，３およびデカルバモイルサキシトキシンとの反応性
も５０％程度と低い。また、カルバモイル−Ｎ−スルフ
ェート誘導体であるＣトキシンとは全く結合しない。一
方、後者の抗体は、ネオサキシトキシンとの反応性が１
％以下と報告され、他の毒成分との反応性は調べられて
ない。さらに、同様の抗原を用いたモノクローナル抗体
の作製も試みられているが、これらは反応性、感度とも
低い（R. Hackら，Food and Agriculturel immunology,
1990,2, 47-48）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】致死活性測定法および
神経芽細胞法においては、動物や細胞の管理、検出感
度、精度、特異性などの点で問題があるし、高速液体ク
ロマトグラフィー法においては、操作は簡単で、精度も
高いが、高価な機器を必要とし、麻酔性貝毒の種類によ
って感度が異なること、精製された外部標準の供給がな
いことなどの欠点を有している。また、免疫学的方法に
おいては、抗体の反応性がサキシトキシン誘導体の種類
によって異なるなどの点で問題がある。したがって、麻
酔性貝毒の簡便で精度高く、しかも貝毒の種類によらず
感度一定に測定できる方法の開発が望まれてきた。
神経芽細胞法においては、動物や細胞の管理、検出感
度、精度、特異性などの点で問題があるし、高速液体ク
ロマトグラフィー法においては、操作は簡単で、精度も
高いが、高価な機器を必要とし、麻酔性貝毒の種類によ
って感度が異なること、精製された外部標準の供給がな
いことなどの欠点を有している。また、免疫学的方法に
おいては、抗体の反応性がサキシトキシン誘導体の種類
によって異なるなどの点で問題がある。したがって、麻
酔性貝毒の簡便で精度高く、しかも貝毒の種類によらず
感度一定に測定できる方法の開発が望まれてきた。
【０００８】さきに、本願発明者らは、麻酔性貝毒−グ
ルタオチン（PSP-GSH）複合体（特願平10-91797号公
報）をハプテンとし、これをタンパク質分子に導入した
抗原を調製し、ウサギに投与したところ、麻痺性貝毒を
全前成分に対して反応するポリクロナール抗体を得てこ
れを開示した（特開2000-344799号公報）。しかし、こ
のGSHとの複合体を用いる方法ではタンパク質分子に対
するハプテンの結合量が少なく、得られた抗血清の抗体
価も低く、毒をタンパク質等分子に導入するためには結
合法の改良が必要であると考えられた。
ルタオチン（PSP-GSH）複合体（特願平10-91797号公
報）をハプテンとし、これをタンパク質分子に導入した
抗原を調製し、ウサギに投与したところ、麻痺性貝毒を
全前成分に対して反応するポリクロナール抗体を得てこ
れを開示した（特開2000-344799号公報）。しかし、こ
のGSHとの複合体を用いる方法ではタンパク質分子に対
するハプテンの結合量が少なく、得られた抗血清の抗体
価も低く、毒をタンパク質等分子に導入するためには結
合法の改良が必要であると考えられた。
【０００９】本発明の第１目的は、毒をタンパク質等他
の分子に導入するための、上記欠点の改良された結合法
を用いる、麻痺性貝毒に対する抗体の製法の提供にあ
る。また本発明の第２目的は、本発明による改良結合法
を用いて調製した抗体の提供にある。さらに本発明の第
３目的は、本発明における抗体を用いる新規ELISAキッ
トの提供にある。また本発明の第４目的は、本発明にお
ける改良結合法を用いて調製される、麻痺性貝毒簡易測
定法に使用するための標識毒標品の製法およびこの製法
により調製した標識毒標品の提供にある。
の分子に導入するための、上記欠点の改良された結合法
を用いる、麻痺性貝毒に対する抗体の製法の提供にあ
る。また本発明の第２目的は、本発明による改良結合法
を用いて調製した抗体の提供にある。さらに本発明の第
３目的は、本発明における抗体を用いる新規ELISAキッ
トの提供にある。また本発明の第４目的は、本発明にお
ける改良結合法を用いて調製される、麻痺性貝毒簡易測
定法に使用するための標識毒標品の製法およびこの製法
により調製した標識毒標品の提供にある。
【００１０】この度、発明者らは、スルフヒドリル基を
複数（２つ）持つジチオール化合物を用いて遊離スルフ
ヒドリル基を持つ毒誘導体を調製し、この誘導体をスル
フヒドリル基指向性官能基をアミノ基に導入したタンパ
ク質と反応させると、毒を効率的にタンパク質に導入で
き、より多くのハプテン分子を導入した抗原の作成が可
能であることを見いだした。本発明における上記製法
は、毒とタンパク質とを別個に修飾し、両者の反応によ
り抗原を得ることに特徴がある。本発明による抗原は、
タンパク質分子当りのハプテン量が大きいので、高い抗
体価を持つ抗血清が得られ、抗体が高収率で得られるこ
とが発明者らにより見いだされた。本発明における改良
結合法により調製した抗体を用いると、毒のELISA測定
キットの提供が可能になる。
複数（２つ）持つジチオール化合物を用いて遊離スルフ
ヒドリル基を持つ毒誘導体を調製し、この誘導体をスル
フヒドリル基指向性官能基をアミノ基に導入したタンパ
ク質と反応させると、毒を効率的にタンパク質に導入で
き、より多くのハプテン分子を導入した抗原の作成が可
能であることを見いだした。本発明における上記製法
は、毒とタンパク質とを別個に修飾し、両者の反応によ
り抗原を得ることに特徴がある。本発明による抗原は、
タンパク質分子当りのハプテン量が大きいので、高い抗
体価を持つ抗血清が得られ、抗体が高収率で得られるこ
とが発明者らにより見いだされた。本発明における改良
結合法により調製した抗体を用いると、毒のELISA測定
キットの提供が可能になる。
【００１１】また本発明における抗体の製法によれば、
毒を樹脂または蛍光物質等の担体と効率的に結合させる
得ることも発明者らは見いだした。蛍光物質等マーカー
を結合させた場合、毒性は若干低減するが、本発明によ
る抗原は毒の活性部位が露出されているので、毒性を残
したままでの標識毒標品の調製が可能になる。
毒を樹脂または蛍光物質等の担体と効率的に結合させる
得ることも発明者らは見いだした。蛍光物質等マーカー
を結合させた場合、毒性は若干低減するが、本発明によ
る抗原は毒の活性部位が露出されているので、毒性を残
したままでの標識毒標品の調製が可能になる。
【００１２】したがって、本発明の第１の態様では、サ
キシトキシンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２
つ）持つジチオール化合物を結合させて遊離スルフヒド
リル基を持つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調
製し、他方、スルフヒドリル基指向性官能基をアミノ基
に導入したタンパク質を調製し、次いで上記サキシトキ
シンスルフヒドリル誘導体と上記修飾タンパク質とを反
応させて得られる抗原を非ヒト動物に免疫し、該動物か
ら麻痺性貝毒を認識し得る抗血清を得ることを含む、麻
痺性貝毒に対する抗体の製法が提供される。
キシトキシンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２
つ）持つジチオール化合物を結合させて遊離スルフヒド
リル基を持つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調
製し、他方、スルフヒドリル基指向性官能基をアミノ基
に導入したタンパク質を調製し、次いで上記サキシトキ
シンスルフヒドリル誘導体と上記修飾タンパク質とを反
応させて得られる抗原を非ヒト動物に免疫し、該動物か
ら麻痺性貝毒を認識し得る抗血清を得ることを含む、麻
痺性貝毒に対する抗体の製法が提供される。
【００１３】スルフヒドリル基を有する上記ジチオール
化合物は、１，２−エタンジチオール、ジチオスレイト
ール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸
ジチオエリスリトールからなる群から選択するのが好ま
しい。スルフヒドリル基指向性官能基を持つ化合物は、
マレイミド、チオフタルイミド、活性ハロゲン化合物か
らなる群から選択するのが好ましい。
化合物は、１，２−エタンジチオール、ジチオスレイト
ール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸
ジチオエリスリトールからなる群から選択するのが好ま
しい。スルフヒドリル基指向性官能基を持つ化合物は、
マレイミド、チオフタルイミド、活性ハロゲン化合物か
らなる群から選択するのが好ましい。
【００１４】また本発明の第２の態様では、第１態様に
おける製法により得られた抗体が提供される。
おける製法により得られた抗体が提供される。
【００１５】また本発明の第３の態様では、第１態様に
おいて得られた抗体を用いる新規ELISAキットが提供さ
れる。
おいて得られた抗体を用いる新規ELISAキットが提供さ
れる。
【００１６】また本発明の第４の態様では、サキシトキ
シンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２つ）持つジ
チオール化合物を結合させて遊離スルフヒドリル基を持
つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調製し、次い
でチオール指向性官能基を導入したアガロースまたはビ
オチン、蛍光物質、金コロイドなどの標識化合物をこの
誘導体に反応させることからなる、麻酔性貝毒簡易結合
測定に用いるための標識毒標品が提供される。
シンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２つ）持つジ
チオール化合物を結合させて遊離スルフヒドリル基を持
つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調製し、次い
でチオール指向性官能基を導入したアガロースまたはビ
オチン、蛍光物質、金コロイドなどの標識化合物をこの
誘導体に反応させることからなる、麻酔性貝毒簡易結合
測定に用いるための標識毒標品が提供される。
【００１７】さらに本発明は第５の態様においては、上
記標識毒標品の製法を用いた標識毒標品が提供される。
本発明における毒標品は非アイソトープ系のビオチン標
識系および蛍光標識系標品であり、これらの製法を図７
に示す。
記標識毒標品の製法を用いた標識毒標品が提供される。
本発明における毒標品は非アイソトープ系のビオチン標
識系および蛍光標識系標品であり、これらの製法を図７
に示す。
【００１８】本発明における上記製法は、遊離スルフヒ
ドリル基指向性の任意の官能基、特にマレイミド、チオ
フタルイミド、活性ハロゲン等が中性水溶液中、温和な
条件下にチオール基と定量的に反応することを応用した
ものであり、PSP-GSH複合体もしくはその他のアミド縮
合を用いる結合法に比べ、本発明によれば遙かに高収率
かつ容易に麻酔性貝毒をタンパク質や標識化合物とを結
合さえることが可能である。
ドリル基指向性の任意の官能基、特にマレイミド、チオ
フタルイミド、活性ハロゲン等が中性水溶液中、温和な
条件下にチオール基と定量的に反応することを応用した
ものであり、PSP-GSH複合体もしくはその他のアミド縮
合を用いる結合法に比べ、本発明によれば遙かに高収率
かつ容易に麻酔性貝毒をタンパク質や標識化合物とを結
合さえることが可能である。
【００１９】以下、ジチオール化合物としてエタンジチ
オール（EDT）を採用した場合の本発明における抗体の
製法を述べる。
オール（EDT）を採用した場合の本発明における抗体の
製法を述べる。
【００２０】サキシトキシン−EDT複合体は、ゴニオト
キシン（ゴニオトキシン２，３、あるいはこれらの組合
せ）とジチオール基を有するEDTとを混合・加熱（約７
０℃）すると、EDTのイオウ分子を介してゴニオトキシ
ン類の１１位のＯＳＯ3 -基と置換反応することにより得
ることができる。本発明では、この複合体はいわゆるハ
プテン抗原、すなわち抗体とは結合するが抗体を誘発す
る能力のない物質である。一般にこのようなハプテン抗
原にタンパク質を共有結合させて大分子とすることによ
って免疫原とし得る場合もあることが知られているが、
本発明におけるタンパク質もまた同様の働きをもつもの
である。そのようなタンパク質として、たとえばアルブ
ミンやカサガイヘモシアニン(KLH)が例示できる。
キシン（ゴニオトキシン２，３、あるいはこれらの組合
せ）とジチオール基を有するEDTとを混合・加熱（約７
０℃）すると、EDTのイオウ分子を介してゴニオトキシ
ン類の１１位のＯＳＯ3 -基と置換反応することにより得
ることができる。本発明では、この複合体はいわゆるハ
プテン抗原、すなわち抗体とは結合するが抗体を誘発す
る能力のない物質である。一般にこのようなハプテン抗
原にタンパク質を共有結合させて大分子とすることによ
って免疫原とし得る場合もあることが知られているが、
本発明におけるタンパク質もまた同様の働きをもつもの
である。そのようなタンパク質として、たとえばアルブ
ミンやカサガイヘモシアニン(KLH)が例示できる。
【００２１】本発明はまた、第２の態様において、麻痺
性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキシン２，
３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，４、ゴニ
オトキシン５、およびＣトキシン１，２のいずれとも５
０％以上の相対反応性（但し、サキシトキシンとの反応
性を１００％とする。）を示す、麻痺性貝に対する抗体
を提供する。
性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキシン２，
３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，４、ゴニ
オトキシン５、およびＣトキシン１，２のいずれとも５
０％以上の相対反応性（但し、サキシトキシンとの反応
性を１００％とする。）を示す、麻痺性貝に対する抗体
を提供する。
【００２２】本発明の抗体は、麻痺性貝毒であるIN-H誘
導体（サキシトキシン、ゴニオトキシン２，３）、IN-O
H誘導体（ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，
４）、カルバモイル−Ｎ−ルスフェート誘導体（ゴニオ
トキシン５、およびＣトキシン１，２）のすべてをほぼ
同様に認識することができる。ここで「ゴニオトキシン
２，３」などの表現はゴニオトキシン２とゴニオトキシ
ン３との混合物を意味する。麻痺性貝毒の名称および構
造については、たとえば、安元健、麻痺性貝毒、食品衛
生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生局監修）、第30
0〜305頁、日本食品衛生協会、1901年；Intergovernmen
tal Oceanographic Commision(IOC) Manualand Guides
No.33(1995), UNESCO's Workshops, France, pp.81-94
などに記載されている。本発明の実施態様により、本発
明の抗体は上記方法によって得られたものである。
導体（サキシトキシン、ゴニオトキシン２，３）、IN-O
H誘導体（ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，
４）、カルバモイル−Ｎ−ルスフェート誘導体（ゴニオ
トキシン５、およびＣトキシン１，２）のすべてをほぼ
同様に認識することができる。ここで「ゴニオトキシン
２，３」などの表現はゴニオトキシン２とゴニオトキシ
ン３との混合物を意味する。麻痺性貝毒の名称および構
造については、たとえば、安元健、麻痺性貝毒、食品衛
生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生局監修）、第30
0〜305頁、日本食品衛生協会、1901年；Intergovernmen
tal Oceanographic Commision(IOC) Manualand Guides
No.33(1995), UNESCO's Workshops, France, pp.81-94
などに記載されている。本発明の実施態様により、本発
明の抗体は上記方法によって得られたものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明の抗体の製造において使用
される抗原は、サキシトキシン−EDT−タンパク質複合
体である。この複合体は以下のようにして製造すること
ができる。サキシトキシン部分の原料としてゴニオトキ
シン２、ゴニオトキシン３またはそれらの任意割合の混
合物を使用することができる。これらの原料成分は、イ
ガイ、ハマグリ、ホタテガイ等の貝類の0.1規定塩酸に
よる加熱抽出物から活性炭処理、ゲル濾過クロマトグラ
フィー（たとえばBio-GelP-2（バイオラッド社）使
用）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえばBio-Re
x70（バイオラッド社）使用）などの処理を経て精製す
ることができる。
される抗原は、サキシトキシン−EDT−タンパク質複合
体である。この複合体は以下のようにして製造すること
ができる。サキシトキシン部分の原料としてゴニオトキ
シン２、ゴニオトキシン３またはそれらの任意割合の混
合物を使用することができる。これらの原料成分は、イ
ガイ、ハマグリ、ホタテガイ等の貝類の0.1規定塩酸に
よる加熱抽出物から活性炭処理、ゲル濾過クロマトグラ
フィー（たとえばBio-GelP-2（バイオラッド社）使
用）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえばBio-Re
x70（バイオラッド社）使用）などの処理を経て精製す
ることができる。
【００２４】上記のようにして得られてゴニオトキシン
にEDT（還元型が好ましい。）を加熱下に反応させる
と、EDTのSH基がその電子共与性のためにゴニオトキシ
ンの１１位の炭素原子を求核攻撃し、その結果ＯＳＯ3 -
基が離脱し、該１１位の炭素原子に-S-（EDT）が結合
し、これによってサキシトキシン−EDT複合体が生成す
る。該反応は、中性条件下で反応物質を加熱することに
よって起こる。一般にpH6.5〜7.5、好ましくはph7.0〜
7.5の適切な緩衝液、たとえば燐酸アンモニウム緩衝
液、酢酸アンモニウム緩衝液等を用いて反応を行うこと
ができる。また、反応温度は、一般に室温から約100
℃、好ましくは50℃から80℃、より好ましくは約70℃で
ある。反応後、目的の生成物を、調製用高速液体クロマ
トグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相
配分クロマトグラフィー等の手段を単独で又は組合わせ
て実施し、精製することができる。生成物の同定は、赤
外分光法、質量分析法、NMR法、元素分析、アミノ酸分
析などの通常の測定法によって行うことができる。
にEDT（還元型が好ましい。）を加熱下に反応させる
と、EDTのSH基がその電子共与性のためにゴニオトキシ
ンの１１位の炭素原子を求核攻撃し、その結果ＯＳＯ3 -
基が離脱し、該１１位の炭素原子に-S-（EDT）が結合
し、これによってサキシトキシン−EDT複合体が生成す
る。該反応は、中性条件下で反応物質を加熱することに
よって起こる。一般にpH6.5〜7.5、好ましくはph7.0〜
7.5の適切な緩衝液、たとえば燐酸アンモニウム緩衝
液、酢酸アンモニウム緩衝液等を用いて反応を行うこと
ができる。また、反応温度は、一般に室温から約100
℃、好ましくは50℃から80℃、より好ましくは約70℃で
ある。反応後、目的の生成物を、調製用高速液体クロマ
トグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相
配分クロマトグラフィー等の手段を単独で又は組合わせ
て実施し、精製することができる。生成物の同定は、赤
外分光法、質量分析法、NMR法、元素分析、アミノ酸分
析などの通常の測定法によって行うことができる。
【００２５】サキシトキシンのような低分離化合物はハ
プテンに属し、それ自体は抗原性をもたないが、抗原性
をもつタンパク質を担体として、これと共有結合した複
合体はハプテンに対する特異抗体を産生する抗原とな
る。ハプテン−タンパク質複合体を免疫注射するとハプ
テン部分は抗原決定基として認識され、抗ハプテン抗体
が産生されると考えられている。このとき、余分な抗原
決定基ができにくい選択的な結合方法でハプテン抗原を
作製する必要がある。ハプテンの部分構造に対する認識
は、ハプテンと担体であるタンパク質の結合部位付近で
は弱く、より離れた部分構造を認識しやすい。したがっ
て、タンパク質と結合する際には、ハプテン中の適切な
結合位置を選択することが大切である。本発明者らによ
り先に見出されたサキシトキシンの１１位にEDT基が結
合した構造をもつサキシトキシン−EDT複合体（特願平1
0-91797号）は、免疫抗原として好ましいだけでなく、
麻痺性貝毒のほぼ全ての種類を高い反応性で検出可能と
する麻痺性貝毒を産出し得る利点をもつ。
プテンに属し、それ自体は抗原性をもたないが、抗原性
をもつタンパク質を担体として、これと共有結合した複
合体はハプテンに対する特異抗体を産生する抗原とな
る。ハプテン−タンパク質複合体を免疫注射するとハプ
テン部分は抗原決定基として認識され、抗ハプテン抗体
が産生されると考えられている。このとき、余分な抗原
決定基ができにくい選択的な結合方法でハプテン抗原を
作製する必要がある。ハプテンの部分構造に対する認識
は、ハプテンと担体であるタンパク質の結合部位付近で
は弱く、より離れた部分構造を認識しやすい。したがっ
て、タンパク質と結合する際には、ハプテン中の適切な
結合位置を選択することが大切である。本発明者らによ
り先に見出されたサキシトキシンの１１位にEDT基が結
合した構造をもつサキシトキシン−EDT複合体（特願平1
0-91797号）は、免疫抗原として好ましいだけでなく、
麻痺性貝毒のほぼ全ての種類を高い反応性で検出可能と
する麻痺性貝毒を産出し得る利点をもつ。
【００２６】担体となるタンパク質としてはアルブミ
ン、ヘモシアニンなどを使用できるが、これらに限定さ
れず、本発明の抗体を誘発可能とする任意のタンパク質
を使用できる。サキシトキシン−EDT複合体に担体タン
パク質を結合する際には、該複合体のEDT部分を利用し
て、（反応性官能基を導入した）担体タンパク質とマレ
イミド法（T. Kitagawaら，J. Bioshem. 92:585-590,19
82）やカルボジイミド法(D. Exleyら，FEBS Lett., 91:
162-165,1978）などで結合させて、サキシトキシン−GS
H−タンパク質複合体を生成することができる。たとえ
ば後述の実施例にはサキシトキシン−EDT−牛血清アル
ブミン複合体の製造例を示すが、ここでは先ずサキシト
キシン−EDT結合体を作り、一方アルブミンをその遊離
アミノ基を介してメルカプトサクシニル化し、両者を反
応させることにより担体タンパク質をサキシトキシン-E
DTに結合させる。得られた複合体の精製は、慣用のタン
パク質精製法を適宜組合わせて実施できる。そのような
方法には、たとえば、塩析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、
アフイニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマ
トフォーカシング、限外濾過などが含まれる。
ン、ヘモシアニンなどを使用できるが、これらに限定さ
れず、本発明の抗体を誘発可能とする任意のタンパク質
を使用できる。サキシトキシン−EDT複合体に担体タン
パク質を結合する際には、該複合体のEDT部分を利用し
て、（反応性官能基を導入した）担体タンパク質とマレ
イミド法（T. Kitagawaら，J. Bioshem. 92:585-590,19
82）やカルボジイミド法(D. Exleyら，FEBS Lett., 91:
162-165,1978）などで結合させて、サキシトキシン−GS
H−タンパク質複合体を生成することができる。たとえ
ば後述の実施例にはサキシトキシン−EDT−牛血清アル
ブミン複合体の製造例を示すが、ここでは先ずサキシト
キシン−EDT結合体を作り、一方アルブミンをその遊離
アミノ基を介してメルカプトサクシニル化し、両者を反
応させることにより担体タンパク質をサキシトキシン-E
DTに結合させる。得られた複合体の精製は、慣用のタン
パク質精製法を適宜組合わせて実施できる。そのような
方法には、たとえば、塩析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、
アフイニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマ
トフォーカシング、限外濾過などが含まれる。
【００２７】ゴニオトキシン２，３に換えて、ゴニオト
キシン１、ゴニオトキシン４又はそれらの混合物を原料
としてEDTと反応させる場合には、ネオサキシトキシン-
EDT複合体が得られる。さらにこの複合体を上記と同様
に担体タンパク質と反応させることによってネオサキシ
トキシン−EDT−タンパク質複合体を得ることができ、
得られた生成物はサキシトキシン−EDT−タンパク質複
合体と同様に麻痺性貝毒に対する抗体の産生に使用する
ことができる（以下参照）。
キシン１、ゴニオトキシン４又はそれらの混合物を原料
としてEDTと反応させる場合には、ネオサキシトキシン-
EDT複合体が得られる。さらにこの複合体を上記と同様
に担体タンパク質と反応させることによってネオサキシ
トキシン−EDT−タンパク質複合体を得ることができ、
得られた生成物はサキシトキシン−EDT−タンパク質複
合体と同様に麻痺性貝毒に対する抗体の産生に使用する
ことができる（以下参照）。
【００２８】本発明のサキシトキシン−EDT−タンパク
質複合体を、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、等の動物
に免疫することによって該複合体に対する抗体を作製す
ることができる。通常、免疫原溶液を、フロイントの完
全アジュバント、不完全アジュバント、リビアジュバン
トシステム（RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH INC）、ムラミ
ルペプチド（Calzyme社）、水酸化アルミニウム、リポ
ポリサッカライドなどのアジュバントと乳化混合し、動
物に皮下、皮内、または筋肉に注射した後、２〜４週間
の間隔で同様の操作を行い数回追加免疫し、放血後抗血
清（ポリクローナル抗体）を得ることができる。定期的
に放血血清をサキシトキシンとの反応性について測定
し、高力価が達成されるまで追加免疫を実施する。抗原
の量は、抗原刺激を受ける動物の種類によって異なる
が、たとえばウサギの場合10μg〜数mg、マウスの場合
数μg〜数10mgである。
質複合体を、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、等の動物
に免疫することによって該複合体に対する抗体を作製す
ることができる。通常、免疫原溶液を、フロイントの完
全アジュバント、不完全アジュバント、リビアジュバン
トシステム（RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH INC）、ムラミ
ルペプチド（Calzyme社）、水酸化アルミニウム、リポ
ポリサッカライドなどのアジュバントと乳化混合し、動
物に皮下、皮内、または筋肉に注射した後、２〜４週間
の間隔で同様の操作を行い数回追加免疫し、放血後抗血
清（ポリクローナル抗体）を得ることができる。定期的
に放血血清をサキシトキシンとの反応性について測定
し、高力価が達成されるまで追加免疫を実施する。抗原
の量は、抗原刺激を受ける動物の種類によって異なる
が、たとえばウサギの場合10μg〜数mg、マウスの場合
数μg〜数10mgである。
【００２９】上記のようにして得られた麻痺性貝毒に対
する抗血清はさらに、たとえば硫安分画、ついでイオン
交換クロマトグラフィーで処理することによりIgG抗体
に精製することができる。あるいはサキシトキシンをデ
キストランゲルまたはアガロースゲルに化学的に結合さ
せたゲルを用いるアフィニティクロマトグラフィーによ
って抗体を精製することができる。抗体の作製および精
製については、たとえば生物化学実験法１５「免疫学入
門」(1982）学会出版センターに詳細に記載されており
参照可能である。
する抗血清はさらに、たとえば硫安分画、ついでイオン
交換クロマトグラフィーで処理することによりIgG抗体
に精製することができる。あるいはサキシトキシンをデ
キストランゲルまたはアガロースゲルに化学的に結合さ
せたゲルを用いるアフィニティクロマトグラフィーによ
って抗体を精製することができる。抗体の作製および精
製については、たとえば生物化学実験法１５「免疫学入
門」(1982）学会出版センターに詳細に記載されており
参照可能である。
【００３０】本発明の方法では、免疫後１ケ月程度から
抗体価の上昇が見られ、サキシトキシンに対する抗血清
の場合約４ケ月後に抗血清１mlあたり0.5nmolのサキシ
トキシンを結合する力価が得られる。本抗血清はネオサ
キシトキシンとの反応は幾分低かったが、免疫５ケ月後
の血清では両者の貝毒との反応性はほとんど差ががなか
った。また、図２に免疫４，５ケ月目の血清の麻痺性貝
毒の各種成分との反応性を示すが、４ケ月目の血清はネ
オサキシトキシンおよびゴニオトキシン１，４との反応
性が幾分劣るが、５ケ月目の血清は各成分との反応に大
きな差が認められなかった。このように、本発明の抗体
は麻痺性貝毒のほぼすべての成分と免疫学的に反応し、
特に麻痺性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキ
シン２，３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，
４、ゴニオトキシン５、およびＣトキシン（Ｃ１、Ｃ
２）のいずれとも50％以上、好ましくは60％以上の相対
反応性（但し、サキシトキシンとの反応性を100％とす
る。）を示す。これに対して従来公知の抗体の多くは、
麻痺性貝毒の全成分に共通のグアニジウム基にタンパク
質を結合させたものを抗原としているため、一部の麻痺
性貝毒成分に強い特異性を示す反面、ほとんど結合しな
い成分も存在する。貝毒の検出の信頼度を上げるために
は、抗体はほとんどすべての貝毒成分と同程度に反応す
るのが望ましい。
抗体価の上昇が見られ、サキシトキシンに対する抗血清
の場合約４ケ月後に抗血清１mlあたり0.5nmolのサキシ
トキシンを結合する力価が得られる。本抗血清はネオサ
キシトキシンとの反応は幾分低かったが、免疫５ケ月後
の血清では両者の貝毒との反応性はほとんど差ががなか
った。また、図２に免疫４，５ケ月目の血清の麻痺性貝
毒の各種成分との反応性を示すが、４ケ月目の血清はネ
オサキシトキシンおよびゴニオトキシン１，４との反応
性が幾分劣るが、５ケ月目の血清は各成分との反応に大
きな差が認められなかった。このように、本発明の抗体
は麻痺性貝毒のほぼすべての成分と免疫学的に反応し、
特に麻痺性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキ
シン２，３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，
４、ゴニオトキシン５、およびＣトキシン（Ｃ１、Ｃ
２）のいずれとも50％以上、好ましくは60％以上の相対
反応性（但し、サキシトキシンとの反応性を100％とす
る。）を示す。これに対して従来公知の抗体の多くは、
麻痺性貝毒の全成分に共通のグアニジウム基にタンパク
質を結合させたものを抗原としているため、一部の麻痺
性貝毒成分に強い特異性を示す反面、ほとんど結合しな
い成分も存在する。貝毒の検出の信頼度を上げるために
は、抗体はほとんどすべての貝毒成分と同程度に反応す
るのが望ましい。
【００３１】本発明のサキシトキシン−EDT−タンパク
質複合体を抗原として用いることによって定法によりモ
ノクロナール抗体を作製することも可能である。具体的
には、マウスやラットなどのげっ歯類に該複合体を免疫
後に脾臓を無菌的に取り出し、脾臓細胞を調製した後、
ミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマをHAT培地等
の選別用培地で選別し、動物細胞培養用培地中で継代培
養するか、または該げっ歯類の腹膣内に移植培養し腹水
からモノクロナール抗体を採取することができる。モノ
クロナール抗体の作製については、MilsteinとKholer,
Nature256:495(1976)；属性化学実験講座，免疫生化学
研究法（日本生化学会編）等に記載される方法を使用で
きる。
質複合体を抗原として用いることによって定法によりモ
ノクロナール抗体を作製することも可能である。具体的
には、マウスやラットなどのげっ歯類に該複合体を免疫
後に脾臓を無菌的に取り出し、脾臓細胞を調製した後、
ミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマをHAT培地等
の選別用培地で選別し、動物細胞培養用培地中で継代培
養するか、または該げっ歯類の腹膣内に移植培養し腹水
からモノクロナール抗体を採取することができる。モノ
クロナール抗体の作製については、MilsteinとKholer,
Nature256:495(1976)；属性化学実験講座，免疫生化学
研究法（日本生化学会編）等に記載される方法を使用で
きる。
【００３２】上記のようにして得られた抗体は、麻痺性
貝毒を含む疑いのある食品等の検体中の貝毒の測定に使
用することができる。測定は慣用の抗原抗体反応を用い
て行うことができ、固相法もしくは均質法、競合法もし
くは非競合法、サンドイッチ法などの方法を使用えき
る。たとえば、サンドイッチ法を用いる場合には、過剰
量の標識化第二抗体を用いるが、標識としてペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、125I、82
P等の放射性同位体、FITC等の蛍光物質、アクリジニウ
ムなどの化学発光物質を用いることができる。標識の種
類に依存して、ELISAなどの酵素抗体法、ラジオイムノ
アッセイ、蛍光抗体法の使用が可能である。さらに、本
発明の抗体は、臭化シアン等で活性化されたデキストラ
ン樹脂（たとえばSephadexTM類）、アガロース樹脂（た
とえばBio-GelTM類）、等の樹脂に結合するときには問
題の貝毒を分離除去するためのアフィニティーカラム担
体とすることができる。
貝毒を含む疑いのある食品等の検体中の貝毒の測定に使
用することができる。測定は慣用の抗原抗体反応を用い
て行うことができ、固相法もしくは均質法、競合法もし
くは非競合法、サンドイッチ法などの方法を使用えき
る。たとえば、サンドイッチ法を用いる場合には、過剰
量の標識化第二抗体を用いるが、標識としてペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、125I、82
P等の放射性同位体、FITC等の蛍光物質、アクリジニウ
ムなどの化学発光物質を用いることができる。標識の種
類に依存して、ELISAなどの酵素抗体法、ラジオイムノ
アッセイ、蛍光抗体法の使用が可能である。さらに、本
発明の抗体は、臭化シアン等で活性化されたデキストラ
ン樹脂（たとえばSephadexTM類）、アガロース樹脂（た
とえばBio-GelTM類）、等の樹脂に結合するときには問
題の貝毒を分離除去するためのアフィニティーカラム担
体とすることができる。
【００３３】ジチオール化合物としてエタンジチオール
(EDT)以外の化合物を採用した場合の実施形態も、上記
とほぼ同じである。
(EDT)以外の化合物を採用した場合の実施形態も、上記
とほぼ同じである。
【００３４】本発明に係わる他の関連文献は次のようで
ある： Hollingworth T. Wekell MM(1990):Paralytic shellfis
h posison. In:OfficialMethods of Analysis, 15th ed
ition, K. Hellrich ed., Association of Official An
alytical Chemists, Arlington, Virginia, pp.881-88
2. Oshima Y(1995): Post-column derivatization HPLC me
thods for paralytic shellfish poisons. In:Manual o
n Harmful Marine Algae, 10C Manuals and Guides No.
33, Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD eds.,
Intergovernmental Oceanographic Commission of UNE
SCO, Paris, pp.81-94. Sato S, Sakai R, Kodama M(2000): Identification of
thioether intermediates in the reductive transfor
mation of gonyautoxins into saxitosins by thios. B
ioorg. Med. Chem. Lett. 10:1787-1789. Sommer H. Meyer KF(1937): Paralytic shellfish pois
oning. Arch. Pathol. 24: 560-568.
ある： Hollingworth T. Wekell MM(1990):Paralytic shellfis
h posison. In:OfficialMethods of Analysis, 15th ed
ition, K. Hellrich ed., Association of Official An
alytical Chemists, Arlington, Virginia, pp.881-88
2. Oshima Y(1995): Post-column derivatization HPLC me
thods for paralytic shellfish poisons. In:Manual o
n Harmful Marine Algae, 10C Manuals and Guides No.
33, Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD eds.,
Intergovernmental Oceanographic Commission of UNE
SCO, Paris, pp.81-94. Sato S, Sakai R, Kodama M(2000): Identification of
thioether intermediates in the reductive transfor
mation of gonyautoxins into saxitosins by thios. B
ioorg. Med. Chem. Lett. 10:1787-1789. Sommer H. Meyer KF(1937): Paralytic shellfish pois
oning. Arch. Pathol. 24: 560-568.
【００３５】
【実施例】以下の実施例によって本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
【００３６】本発明の記載に関連する略号は次のようで
ある： 試料および試薬類 アジュバント： Complele Adjuvant Freund's Wako Bio-Gel P-2 ゲル濾過樹脂、mesh size: fine Bio-rad BiotinPE(AC5)2Maleimide ビオチンラベル試薬 Dojindo PAEM N-[2-(2-Pyridyiamino)ethyl]maleimide Wako BSA: 牛血清アルブミン Wako，IRA grande DMSO: ジメチルスルフォキシド Wako，特級 EDT: 1,2-エタンジチオール Wako，特級 EDTA: エチレンジアミン4酢酸 Wako，特級 GMBS： γ-マレイミト゛酪酸N-ヒト゛ロキシコハク酸イミト゛エステル Dojindo 反応プレート： ELISA plate 96-well Iwaki OPD: o-phenylenediamine-2HC1(tablet) Wako 酵素標識二次抗体：HRP標識抗ウサキ゛-ヤキ゛，使用時1000倍希釈 Dako マイクロフ゜レートリータ゛ー： MPR A4 Toso PBS(-)： Mg, Ca freeリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4） PBSB： 0.5%BSAと0.1%Tween60を含むPBS(-) PBST： 0.1%Tween20を含むPBS(-) Sephadex G-50 ゲル濾過樹脂、mesh size： fine Pharmacia THF： テトラヒドロフラン Wako，特級 ウサギ： ニュージーランドホワイト、雄、体重約1Kg
ある： 試料および試薬類 アジュバント： Complele Adjuvant Freund's Wako Bio-Gel P-2 ゲル濾過樹脂、mesh size: fine Bio-rad BiotinPE(AC5)2Maleimide ビオチンラベル試薬 Dojindo PAEM N-[2-(2-Pyridyiamino)ethyl]maleimide Wako BSA: 牛血清アルブミン Wako，IRA grande DMSO: ジメチルスルフォキシド Wako，特級 EDT: 1,2-エタンジチオール Wako，特級 EDTA: エチレンジアミン4酢酸 Wako，特級 GMBS： γ-マレイミト゛酪酸N-ヒト゛ロキシコハク酸イミト゛エステル Dojindo 反応プレート： ELISA plate 96-well Iwaki OPD: o-phenylenediamine-2HC1(tablet) Wako 酵素標識二次抗体：HRP標識抗ウサキ゛-ヤキ゛，使用時1000倍希釈 Dako マイクロフ゜レートリータ゛ー： MPR A4 Toso PBS(-)： Mg, Ca freeリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4） PBSB： 0.5%BSAと0.1%Tween60を含むPBS(-) PBST： 0.1%Tween20を含むPBS(-) Sephadex G-50 ゲル濾過樹脂、mesh size： fine Pharmacia THF： テトラヒドロフラン Wako，特級 ウサギ： ニュージーランドホワイト、雄、体重約1Kg
【００３７】実施例１
麻痺性貝毒(PSP)精製毒およびEDT-PSP複合体の調製
大船渡湾産毒化ホテタガイから常法により、gonyautoxi
n(GTX)群、saxitoxin群およびC-toxin群PSP成分（図
１）を単離した。精製した成分のうちGTX1とGTX4、GTX2
とGTX3およびC1とC2はそれぞれモル比約３：１の平衡混
合物（それぞれGTX1+4，GTX2+3，C1+2と略記）として使
用した。50μmolのGTX1+4を20%のTHFを含む50mM EDT-10
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)50mLに溶解し、室温
で２日間静置した。ジエチルエーテルで３回抽出してED
Tを除去し、水相に残存するエーテルを30%で減圧下留去
して、EDT-neoSTXを含む反応混合液を得た。これをBio-
Gel p-2のカラム（1.5x15cm）に添加し、水200mLでカラ
ムを洗浄後0.1M酢酸で吸着成分を溶出した。10mLずつ分
取し、各画分中のGTX1,4、neoSTXならび：EDT-neoSTX濃
度をHPLC蛍光法で定量しつつEDT-neoSTX複合体を単離し
た。50μmolのGTX2+3を出発物質として同様に処理し、E
DT-STXを調製し分離した。
n(GTX)群、saxitoxin群およびC-toxin群PSP成分（図
１）を単離した。精製した成分のうちGTX1とGTX4、GTX2
とGTX3およびC1とC2はそれぞれモル比約３：１の平衡混
合物（それぞれGTX1+4，GTX2+3，C1+2と略記）として使
用した。50μmolのGTX1+4を20%のTHFを含む50mM EDT-10
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)50mLに溶解し、室温
で２日間静置した。ジエチルエーテルで３回抽出してED
Tを除去し、水相に残存するエーテルを30%で減圧下留去
して、EDT-neoSTXを含む反応混合液を得た。これをBio-
Gel p-2のカラム（1.5x15cm）に添加し、水200mLでカラ
ムを洗浄後0.1M酢酸で吸着成分を溶出した。10mLずつ分
取し、各画分中のGTX1,4、neoSTXならび：EDT-neoSTX濃
度をHPLC蛍光法で定量しつつEDT-neoSTX複合体を単離し
た。50μmolのGTX2+3を出発物質として同様に処理し、E
DT-STXを調製し分離した。
【００３８】実施例２
PSPに対する特異抗体作成用抗原の作成
BSA20mgを2mLのPBS(-)に溶解し、これに5mgのGMBS100μ
LのDMSOに溶解したものを混合して室温で１時間静置し
た。これを1mMEDTAを含む0.1リン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.0）で充填したSephadex G-25のカラム(1.5x20cm)
に添加し、同溶液で溶出した。得た高分子画分を合一
し、炭酸なとりうむ溶液でpHを7.4に調整した後遠心限
外ろ過キット(UFV4BCG25，NMWL 10,000, Millipore）で
4mLに濃縮した。この2mLに5μmolのEDT-neoSTXを溶解
し、５℃で２日間静置した。次に同混合物をPBS(-)に対
して４回透析し、内液をneoSTX-BSA結合体溶液として回
収した。STX-BSA結合体も同様の手順で調製した。抗原
溶液中のBSA濃度は280nmの吸収により、結合PSP濃度はH
PLC蛍光法により算出した。
LのDMSOに溶解したものを混合して室温で１時間静置し
た。これを1mMEDTAを含む0.1リン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.0）で充填したSephadex G-25のカラム(1.5x20cm)
に添加し、同溶液で溶出した。得た高分子画分を合一
し、炭酸なとりうむ溶液でpHを7.4に調整した後遠心限
外ろ過キット(UFV4BCG25，NMWL 10,000, Millipore）で
4mLに濃縮した。この2mLに5μmolのEDT-neoSTXを溶解
し、５℃で２日間静置した。次に同混合物をPBS(-)に対
して４回透析し、内液をneoSTX-BSA結合体溶液として回
収した。STX-BSA結合体も同様の手順で調製した。抗原
溶液中のBSA濃度は280nmの吸収により、結合PSP濃度はH
PLC蛍光法により算出した。
【００３９】実施例３
ウサギへの免疫および抗体価の測定
BSA-STX結合体を500μg/mLの濃度にPBSで希釈した。等
量のアジュバントと結合したエマルジョン２ケ月に１、
２回の頻度で1mLずつ、２羽のウサギ(STX-BSA-1，STX-B
SA-2）に皮内注射した。BSA-neoSTX結合体も同様に２羽
のウサギ（neoSTX-BSA-2）に免役した。免疫中ウサギよ
り随時採血して得た血清の抗体価を下記の手順で求め
た。96wellの反応プレートの各wellに、PBS(-)に対して
50μMの濃度に調製したSTX溶液を50μLずつ分注し37℃
で２時間振とうした。プレートをPBSTで２回洗浄後、0.
3%ゼラチンを含むPBS(-)300μLずつ分注し、PBSTで３回
洗浄した。37℃で１時間振とう後、PBSTで３回洗浄し、
PBS(-)に対して1000希釈したHRP標識二次抗体を100μL
ずつ添加した。37℃で１時間振とう後、PBSTで４回洗浄
し、発色基質溶液（OPD-H202）を100μL添加した。37℃
で３０分振とうした後、0.5N硫酸100μLを添加して反応
を停止し、マイクロプレートリーダーで492nmの吸収(O
D）を測定した。
量のアジュバントと結合したエマルジョン２ケ月に１、
２回の頻度で1mLずつ、２羽のウサギ(STX-BSA-1，STX-B
SA-2）に皮内注射した。BSA-neoSTX結合体も同様に２羽
のウサギ（neoSTX-BSA-2）に免役した。免疫中ウサギよ
り随時採血して得た血清の抗体価を下記の手順で求め
た。96wellの反応プレートの各wellに、PBS(-)に対して
50μMの濃度に調製したSTX溶液を50μLずつ分注し37℃
で２時間振とうした。プレートをPBSTで２回洗浄後、0.
3%ゼラチンを含むPBS(-)300μLずつ分注し、PBSTで３回
洗浄した。37℃で１時間振とう後、PBSTで３回洗浄し、
PBS(-)に対して1000希釈したHRP標識二次抗体を100μL
ずつ添加した。37℃で１時間振とう後、PBSTで４回洗浄
し、発色基質溶液（OPD-H202）を100μL添加した。37℃
で３０分振とうした後、0.5N硫酸100μLを添加して反応
を停止し、マイクロプレートリーダーで492nmの吸収(O
D）を測定した。
【００４０】実施例４
抗血清によるPSPの吸収試験
STX BSA-1およびneoSTX-BSA-1から得た血清および無免
疫のウサギから得た血清（正常血清）それぞれ50μLに1
μMのPSP各成分（C1+2，GTX1+4，GTX2+3，GTX5，STX，n
eoSTX）の標準溶液を等量混合し、5℃で15時間静置し
た。限外遠心ろ過キット（Ultrafree-MC，NMWL 5000, M
illipore）で得たろ液をHPLC蛍光法で分析した。
疫のウサギから得た血清（正常血清）それぞれ50μLに1
μMのPSP各成分（C1+2，GTX1+4，GTX2+3，GTX5，STX，n
eoSTX）の標準溶液を等量混合し、5℃で15時間静置し
た。限外遠心ろ過キット（Ultrafree-MC，NMWL 5000, M
illipore）で得たろ液をHPLC蛍光法で分析した。
【００４１】実施例５
ポリクロナール抗体を用いるPSPのELISA分析法の開発
96wellの反応プレートの各wellに、PBS(-)に対して50μ
Mの濃度に調製したSTX溶液を50μLずつ分注し37℃で２
時間振とうした。プレートをPBSTで２回洗浄後、0.3％
ゼラチンを含むPBS(-)300μLを添加して37℃で１時間振
とうした。PBSTで２回洗浄後、PSP各成分のPBSすなわち
C1+2，GTX1+4，GTX2+3，GTX5，GTX6，neoSTX，dcSTX，S
TXをPBS(-)で0.1、1、10、100、1000、10000nMに希釈し
た溶液をそれぞれ50μL添加した。次いでPBSBで200倍に
希釈した抗血清（BSA-STX-1）を50μLずつ添加して37℃
で１時間振とうした。同一プレート上にPSPと抗血清溶
液を添加しないwellを用意してゼロブランク(Bo）とし
た。37℃で１時間振とう後、PBSTで３回洗浄し、PBS(-)
に対して1000倍希釈したHRP標識二次抗体を100μLずつ
添加した。37℃で１時間振とう後、PBSTで４回洗浄し、
発色基質溶液を100μL添加した。37℃で３０分振とうし
た後、0.5N硫酸100μLを添加して反応を停止し、マイク
ロプレートリーダーで492nmの吸収(OD)を測定した。試
験は３連で行った。
Mの濃度に調製したSTX溶液を50μLずつ分注し37℃で２
時間振とうした。プレートをPBSTで２回洗浄後、0.3％
ゼラチンを含むPBS(-)300μLを添加して37℃で１時間振
とうした。PBSTで２回洗浄後、PSP各成分のPBSすなわち
C1+2，GTX1+4，GTX2+3，GTX5，GTX6，neoSTX，dcSTX，S
TXをPBS(-)で0.1、1、10、100、1000、10000nMに希釈し
た溶液をそれぞれ50μL添加した。次いでPBSBで200倍に
希釈した抗血清（BSA-STX-1）を50μLずつ添加して37℃
で１時間振とうした。同一プレート上にPSPと抗血清溶
液を添加しないwellを用意してゼロブランク(Bo）とし
た。37℃で１時間振とう後、PBSTで３回洗浄し、PBS(-)
に対して1000倍希釈したHRP標識二次抗体を100μLずつ
添加した。37℃で１時間振とう後、PBSTで４回洗浄し、
発色基質溶液を100μL添加した。37℃で３０分振とうし
た後、0.5N硫酸100μLを添加して反応を停止し、マイク
ロプレートリーダーで492nmの吸収(OD)を測定した。試
験は３連で行った。
【００４２】実施例６
ビオチン標識STXの作成
凍結乾燥状態の精製EDT-STX複合体(15μmol）を、1.4mL
の10mMリン酸緩衝液（pH7.4)に溶解し、これに6mg（10
μmol）のBiolin-PE(AC5)2-maleimideを600μLのDMSOに
溶解したものを混合した。5℃で一晩静置後、0.05M酢酸
で5mLで洗浄後、0.05M酢酸−メタノール（1:1v/v）10mL
で吸着成分を溶出した。含水酸性メタノール溶出液に含
まれるビオチン標識STXの濃度をHPLC蛍光法で定量する
とともに、同画分の毒性マウス試験法で調べた。
の10mMリン酸緩衝液（pH7.4)に溶解し、これに6mg（10
μmol）のBiolin-PE(AC5)2-maleimideを600μLのDMSOに
溶解したものを混合した。5℃で一晩静置後、0.05M酢酸
で5mLで洗浄後、0.05M酢酸−メタノール（1:1v/v）10mL
で吸着成分を溶出した。含水酸性メタノール溶出液に含
まれるビオチン標識STXの濃度をHPLC蛍光法で定量する
とともに、同画分の毒性マウス試験法で調べた。
【００４３】実施例７
蛍光標識STXの作成
6mgのPAEM-2塩酸塩（Mw253.69）を精製EDT-STX複合体
（23μmol）とともに2.3mLの50mMリン酸緩衝液中、室温
で２日間静置した。反応混合物をBio-GEL P-2のカラム
（1.5 x 20cm）に添加し、200mLでカラムを洗浄後0.1酢
酸、次いで0.5M酢酸で吸着成分を溶出した。希酢酸溶出
液は10mLずつ分取し、各画分をHPLC蛍光法で調べPEAE-E
DT-STX結合体（蛍光標識STX）の溶出をモニターした。
単離したPAEM-EDT-STX結合体の毒性マウス試験法で調べ
た。
（23μmol）とともに2.3mLの50mMリン酸緩衝液中、室温
で２日間静置した。反応混合物をBio-GEL P-2のカラム
（1.5 x 20cm）に添加し、200mLでカラムを洗浄後0.1酢
酸、次いで0.5M酢酸で吸着成分を溶出した。希酢酸溶出
液は10mLずつ分取し、各画分をHPLC蛍光法で調べPEAE-E
DT-STX結合体（蛍光標識STX）の溶出をモニターした。
単離したPAEM-EDT-STX結合体の毒性マウス試験法で調べ
た。
【００４４】実施例８
PSPならびにPSP−ナオール複合体の定量
供試溶液中のPSPはHPLCの蛍光法(Oshima，1995）で定量
した。溶液中の結合型PSPすなわちEDT-STX等のチオール
−PSP複合体およびタンパクに結合したPSP等の量は、溶
液の一部を10%メルカプトエタノールを含む0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.4）に希釈し５分間煮沸した後H
PLC蛍光法で分析して得られたSTX群と、メルカプトエタ
ノール処理前のGTX群の和を比較することにより算出し
た。
した。溶液中の結合型PSPすなわちEDT-STX等のチオール
−PSP複合体およびタンパクに結合したPSP等の量は、溶
液の一部を10%メルカプトエタノールを含む0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.4）に希釈し５分間煮沸した後H
PLC蛍光法で分析して得られたSTX群と、メルカプトエタ
ノール処理前のGTX群の和を比較することにより算出し
た。
【００４５】実施例９
マウス試験法
供試液のマウス毒性をA.O.A.C.法（Hollingworth and W
ekell, 1990）に従って求めた。ddy系雄マウス（体重±
１g）を使用し、１試料につき５尾のマウスを用い致死
時間の中間値からPSPの用量致死時間曲線（Sommer and
Mcyer，1937）に従った投与した毒値（mouse unil = M
U）を算出した。IMUは15分で１匹のマウスを殺す毒量に
相当する。
ekell, 1990）に従って求めた。ddy系雄マウス（体重±
１g）を使用し、１試料につき５尾のマウスを用い致死
時間の中間値からPSPの用量致死時間曲線（Sommer and
Mcyer，1937）に従った投与した毒値（mouse unil = M
U）を算出した。IMUは15分で１匹のマウスを殺す毒量に
相当する。
【００４６】実施例１０
PSP−タンパク結合体（抗原）の作成
図２に示す手順でBSA-EDT-STX結合体および同様の手順
で調製したBSA-EDT-neoSTX結合体を調製した。以前我々
はグルタチオン-PSP複合体をBSAに導入して抗原を作成
しているが、今回新たに作成したEDTを介する結合法に
より、より多数のPSP分子がタンパクを導入した抗原の
作成に成功した（表１）。
で調製したBSA-EDT-neoSTX結合体を調製した。以前我々
はグルタチオン-PSP複合体をBSAに導入して抗原を作成
しているが、今回新たに作成したEDTを介する結合法に
より、より多数のPSP分子がタンパクを導入した抗原の
作成に成功した（表１）。
【表１】
【００４７】実施例１１
ウサギ血清の抗体価の推移
図３にBSA-EDT-STX結合体を免役したウサギ（STX-EDT-B
SA-1およびSTX-EDT-STX-2）の抗体価の推移を示す。２
羽のウサギとも免疫開始後３ケ月目より抗体価の有意な
上昇が認められ、４ケ月目以降の抗体価は増減を繰り返
しながら推移した。NeoSTX-EDT-STX結合体を免役したウ
サギの抗体価もほぼ同様に推移したが、BSA-EDT-STX結
合体を免役した場合に比べて抗体価の上昇は低かった。
いずれのウサギも免疫開始後７ケ月を過ぎた時点で全採
血し、得た血清を以下の試験に用いた。
SA-1およびSTX-EDT-STX-2）の抗体価の推移を示す。２
羽のウサギとも免疫開始後３ケ月目より抗体価の有意な
上昇が認められ、４ケ月目以降の抗体価は増減を繰り返
しながら推移した。NeoSTX-EDT-STX結合体を免役したウ
サギの抗体価もほぼ同様に推移したが、BSA-EDT-STX結
合体を免役した場合に比べて抗体価の上昇は低かった。
いずれのウサギも免疫開始後７ケ月を過ぎた時点で全採
血し、得た血清を以下の試験に用いた。
【００４８】実施例１２
抗血清によるPSP成分の吸収
図４にBSA-EDT-STX-1から得た血清およびBSA-neoSTX-1
から得た血清による各PSP成分の吸収量を示した。無免
疫のウサギの血清（正常血清）は1mL当たりいずれのPSP
成分も0.1nmol未満と検出限界未満であった。これに対
してBSA-STX-1血清1mLは1 3nmolのPSPを吸収した。BSA
-neoSTX-1血清によるPSPの吸収はこれに比べ低かった。
から得た血清による各PSP成分の吸収量を示した。無免
疫のウサギの血清（正常血清）は1mL当たりいずれのPSP
成分も0.1nmol未満と検出限界未満であった。これに対
してBSA-STX-1血清1mLは1 3nmolのPSPを吸収した。BSA
-neoSTX-1血清によるPSPの吸収はこれに比べ低かった。
【００４９】実施例１３
STX固相化プレート上での各PSP成分の競合
PSP成分の顕著な吸収が認められたBSA-STX-1血清を用い
て、PSPのELISAによる定量法の開発を試みた。主々検討
の結果、STXの中性のリン酸緩衝液を添加して固相化し
た反応プレートを用いるindirect two step法により定
量的にPSP成分を分析することが可能となった。図５に
示すようにIC50値を与える濃度はSTX、GTX2+3で４ 7n
M，neoSTX，dcSTX，GTX5，GTX1+4で30 100nM，GTX6で約
200nMであった。このようにPSPの成分により抗体に対す
る反応性は若干異なるものの、いずれの成分に対しても
同法によりマウス試験法の10 100倍の高感度での検出
が可能である。抗体は、プリン骨格を持つアデノシン
（Ade）やカフェイン（Caf）、およびグアニジル基を持
つアルギニン（Arg）など、PSPと部分的に構造の類似す
る生体成分には全く反応しなかった（図６）。しかし興
味あることにBSA-STX-1抗体に対してPSPと同じ薬理作用
を持つフグ毒テトロドトキシン（TTX）は高濃度で交差
が認められた。
て、PSPのELISAによる定量法の開発を試みた。主々検討
の結果、STXの中性のリン酸緩衝液を添加して固相化し
た反応プレートを用いるindirect two step法により定
量的にPSP成分を分析することが可能となった。図５に
示すようにIC50値を与える濃度はSTX、GTX2+3で４ 7n
M，neoSTX，dcSTX，GTX5，GTX1+4で30 100nM，GTX6で約
200nMであった。このようにPSPの成分により抗体に対す
る反応性は若干異なるものの、いずれの成分に対しても
同法によりマウス試験法の10 100倍の高感度での検出
が可能である。抗体は、プリン骨格を持つアデノシン
（Ade）やカフェイン（Caf）、およびグアニジル基を持
つアルギニン（Arg）など、PSPと部分的に構造の類似す
る生体成分には全く反応しなかった（図６）。しかし興
味あることにBSA-STX-1抗体に対してPSPと同じ薬理作用
を持つフグ毒テトロドトキシン（TTX）は高濃度で交差
が認められた。
【００５０】実施例１４
標識付きPSP誘導体の調製および比毒性
マレイミド基とスルフヒドリル基は中性水溶液中穏和な
条件下で反応し結合体を形成する。マレイミド基を持つ
種々のラベル化合物が市販されているが、本試験ではこ
れらの中からビオチンラベル試薬と水溶性の蛍光ラベル
試薬を選び、これらを導入して標識付きSTX誘導体を作
成した（図７）。これら２種の誘導体に加え、スルフヒ
ドリル基のマスキング剤であるNEMを同様の手順で導入
したNEM-EDT-STX誘導体を調製した。これら標識付き誘
導体はBio-Gel P-2等のカラムクロマトグラフィーによ
り他のPSP成分から分離することが出来た（図８）。精
製して得た誘導体を腹膣内投与したマウスはPSPを投与
した場合と同じ症状を示して死亡した。グルタチオン−
PSP複合体（Sato et al., 2000）およびEDT-STX誘導体
はSTXの100分の1未満の比毒性しか示さなかったのに対
し、EDT-STXを出発物質とするこれら標識付きPSP誘導体
は、STXの３０分の１ないし７分の１と、N-sulfocarbam
oy1基を持つ天然成分（C1 4, GTX5,6）のそれに匹敵す
る比毒性を示した（図９）。
条件下で反応し結合体を形成する。マレイミド基を持つ
種々のラベル化合物が市販されているが、本試験ではこ
れらの中からビオチンラベル試薬と水溶性の蛍光ラベル
試薬を選び、これらを導入して標識付きSTX誘導体を作
成した（図７）。これら２種の誘導体に加え、スルフヒ
ドリル基のマスキング剤であるNEMを同様の手順で導入
したNEM-EDT-STX誘導体を調製した。これら標識付き誘
導体はBio-Gel P-2等のカラムクロマトグラフィーによ
り他のPSP成分から分離することが出来た（図８）。精
製して得た誘導体を腹膣内投与したマウスはPSPを投与
した場合と同じ症状を示して死亡した。グルタチオン−
PSP複合体（Sato et al., 2000）およびEDT-STX誘導体
はSTXの100分の1未満の比毒性しか示さなかったのに対
し、EDT-STXを出発物質とするこれら標識付きPSP誘導体
は、STXの３０分の１ないし７分の１と、N-sulfocarbam
oy1基を持つ天然成分（C1 4, GTX5,6）のそれに匹敵す
る比毒性を示した（図９）。
【００５１】
【発明の効果】本発明によるBSA-EDT-STXを抗原として
調製したポリクロナール抗体は、neoSTXに対する親和性
は若干低かったが、他の麻痺性貝毒にはほぼ同様の親和
性を示した。本抗体を用いて試験的に作成したELISA
は、毒成分によって値は若干異なるものの、マウス試験
の１０から１００倍の感度で毒を検出することができ
た。
調製したポリクロナール抗体は、neoSTXに対する親和性
は若干低かったが、他の麻痺性貝毒にはほぼ同様の親和
性を示した。本抗体を用いて試験的に作成したELISA
は、毒成分によって値は若干異なるものの、マウス試験
の１０から１００倍の感度で毒を検出することができ
た。
【図１】麻痺性貝毒（PSP）の構造式と非毒性を示した
図である。
図である。
【図２】本発明における抗原(BSA-EDT-PSP結合体）の製
法を示した図である。
法を示した図である。
【図３】本発明におけるBSA-EDT-STX結合体を免疫した
ウサギの抗体価を推移を示した図である。
ウサギの抗体価を推移を示した図である。
【図４】抗血清によるPSPの吸収量を示した図である。
【図５】各PSP成分のSTX固相プレート上での抗STX抗体
に対する反応を示した図である。
に対する反応を示した図である。
【図６】PSP以外の成分のSTX固相プレート上での抗STX
抗体に対する反応を示した図である。
抗体に対する反応を示した図である。
【図７】本発明における非アイソトープ系標識付きPSP
誘導体の構造を示した図である。
誘導体の構造を示した図である。
【図８】蛍光標識付きSTX（PAEM-EDT-STX）のBio-Gel P
-2カラムクロマトグラフィー上での分離を示した図であ
る。
-2カラムクロマトグラフィー上での分離を示した図であ
る。
【図９】各PSP成分、PSP−チオール複合体および標識付
きPSP誘導体の比毒性を示した図である。
きPSP誘導体の比毒性を示した図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年６月２４日（２００２．６．２
４）
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、
該抗体を用いるELISA測定キット、該製法による系標識
毒標品
該抗体を用いるELISA測定キット、該製法による系標識
毒標品
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、麻痺性貝毒に対す
る抗体の製法およびその抗体に関する。さらに本発明
は、上記抗体を用いるELISA測定キットおよび上記製法
により得られる麻痺性貝毒結合測定法用標識毒標品に関
する。
る抗体の製法およびその抗体に関する。さらに本発明
は、上記抗体を用いるELISA測定キットおよび上記製法
により得られる麻痺性貝毒結合測定法用標識毒標品に関
する。
【０００２】
【従来の技術】麻痺性貝毒中毒は神経麻痺を主徴とする
症状を呈し、その原因毒はゴニオトキシン類およびサキ
シトキシン類であることが判明している［安元健、麻痺
性貝毒、食品衛生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生
局監修）、第300−305頁、日本食品衛生協会、1991
年]。これら原因毒は麻痺性貝毒と総称され、現在、イ
ガイ、ハマグリ等の貝類に見出される貝毒としてゴニオ
トキシン類、サキシトキシン類で 20種以上が知られて
いる。
症状を呈し、その原因毒はゴニオトキシン類およびサキ
シトキシン類であることが判明している［安元健、麻痺
性貝毒、食品衛生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生
局監修）、第300−305頁、日本食品衛生協会、1991
年]。これら原因毒は麻痺性貝毒と総称され、現在、イ
ガイ、ハマグリ等の貝類に見出される貝毒としてゴニオ
トキシン類、サキシトキシン類で 20種以上が知られて
いる。
【０００３】この貝毒はナトリウムチャネルをブロック
する性質を有する麻痺性毒であり、渦鞭毛藻に属する植
物プランクトンの数種類に含まれ、これを餌として食べ
た貝が毒をため込み毒化する。この貝を食すると死亡率
の高い食中毒を引き起こすため、水産および食品衛生上
大きな社会問題になっている。因みに、麻痺性貝毒0.5
〜1.0ｍｇ経口摂取しただけで感覚麻痺、悪心、下痢な
どの症状がでる。ヒトにおける致死量は１〜３ｍｇであ
る。麻痺性貝毒による貝類の汚染地域は世界的に拡大傾
向にあり、これらの汚染地域では毒化貝による食中毒防
除のため出荷する貝の毒性をマウス試験法あるいはHPLC
法により検査している。しかしこれらの測定法は精度、
測定にかかる費用や労力の点で多くの問題があり、毒の
簡易測定法の開発が望まれている。
する性質を有する麻痺性毒であり、渦鞭毛藻に属する植
物プランクトンの数種類に含まれ、これを餌として食べ
た貝が毒をため込み毒化する。この貝を食すると死亡率
の高い食中毒を引き起こすため、水産および食品衛生上
大きな社会問題になっている。因みに、麻痺性貝毒0.5
〜1.0ｍｇ経口摂取しただけで感覚麻痺、悪心、下痢な
どの症状がでる。ヒトにおける致死量は１〜３ｍｇであ
る。麻痺性貝毒による貝類の汚染地域は世界的に拡大傾
向にあり、これらの汚染地域では毒化貝による食中毒防
除のため出荷する貝の毒性をマウス試験法あるいはHPLC
法により検査している。しかしこれらの測定法は精度、
測定にかかる費用や労力の点で多くの問題があり、毒の
簡易測定法の開発が望まれている。
【０００４】このため麻痺性貝毒を定量する方法が種々
開発されている。たとえば公定法であるマウスを用いた
致死活性測定法[安元健、前掲；J.F.Jellett等、Toxico
n, 30(10)：1143-1156(1992)； W. Horwitz, Paralytic
shellfish poison. In "Official Methods of Analysi
s of the Association of Official Analytical Chemis
ts" (Assoc. Official Anal. chem., Washington D.C.)
pp. 881-882(1990)]、高速液体クロマトグラフィー法
［Y. Oshima等、Mycotoxins and Phycotoxins'88 (S. N
atori等編)，pp.319-326, Elsevier, Amsterdam (198
9)］；特開平9-133669号公報］、神経芽細胞を用いる方
法［K. Kogure等，Toxicon, 26:191-197(1989)］、抗体
を用いる方法［F.S. Chu等，J. Agri. Food Chem.，4
4：4043-4047 (1996)］などが知られている。致死活性
による測定法は、マウス試験原液を腹腔内に注射し、注
射の終了した瞬間からマウスが典型的な麻痺性貝毒によ
る症状を示して死亡する際の最後のあえぎまでの時間
（致死時間）を秒単位で記録し、標準毒で作製した用量
一致時間曲線から毒量を推定する方法である。高速液体
クロマトグラフィー法は、麻痺性貝毒を含む試料を高速
液体クロマトグラフィーにかけて麻痺性貝毒を分離し、
溶出液に酸化剤を加えてアルカリ中で反応させた後、生
じた蛍光性物質の蛍光を測定する方法である。神経芽細
胞を用いる方法は、神経芽細胞の培養系において、Ｎａ
＋を細胞外に排出する酵素Ｎａ−ＫＡＴＰａｓｅの活性
をウアバインで阻害した系にＮａ＋流入を促進するベラ
トリジンとＮａ＋の流入を阻止する毒を持抗させ、ベラ
トリジンにより起こる細胞の膨潤死を阻止する毒の活性
からその量を推定するもので、このアッセイ系に麻痺性
貝毒を含む試料を添加したときには細胞の丸まりと細胞
死が毒量に比例して抑制されることを利用した方法であ
る。さらに、免疫学的方法は、麻痺性貝毒に対する抗体
を用いて、毒に結合する抗体量を、たとえば酵素免疫測
定法（たとえばELISA）等の方法で直接測定し、その抗
体量から試料中の麻痺性貝毒を定量する方法である。
開発されている。たとえば公定法であるマウスを用いた
致死活性測定法[安元健、前掲；J.F.Jellett等、Toxico
n, 30(10)：1143-1156(1992)； W. Horwitz, Paralytic
shellfish poison. In "Official Methods of Analysi
s of the Association of Official Analytical Chemis
ts" (Assoc. Official Anal. chem., Washington D.C.)
pp. 881-882(1990)]、高速液体クロマトグラフィー法
［Y. Oshima等、Mycotoxins and Phycotoxins'88 (S. N
atori等編)，pp.319-326, Elsevier, Amsterdam (198
9)］；特開平9-133669号公報］、神経芽細胞を用いる方
法［K. Kogure等，Toxicon, 26:191-197(1989)］、抗体
を用いる方法［F.S. Chu等，J. Agri. Food Chem.，4
4：4043-4047 (1996)］などが知られている。致死活性
による測定法は、マウス試験原液を腹腔内に注射し、注
射の終了した瞬間からマウスが典型的な麻痺性貝毒によ
る症状を示して死亡する際の最後のあえぎまでの時間
（致死時間）を秒単位で記録し、標準毒で作製した用量
一致時間曲線から毒量を推定する方法である。高速液体
クロマトグラフィー法は、麻痺性貝毒を含む試料を高速
液体クロマトグラフィーにかけて麻痺性貝毒を分離し、
溶出液に酸化剤を加えてアルカリ中で反応させた後、生
じた蛍光性物質の蛍光を測定する方法である。神経芽細
胞を用いる方法は、神経芽細胞の培養系において、Ｎａ
＋を細胞外に排出する酵素Ｎａ−ＫＡＴＰａｓｅの活性
をウアバインで阻害した系にＮａ＋流入を促進するベラ
トリジンとＮａ＋の流入を阻止する毒を持抗させ、ベラ
トリジンにより起こる細胞の膨潤死を阻止する毒の活性
からその量を推定するもので、このアッセイ系に麻痺性
貝毒を含む試料を添加したときには細胞の丸まりと細胞
死が毒量に比例して抑制されることを利用した方法であ
る。さらに、免疫学的方法は、麻痺性貝毒に対する抗体
を用いて、毒に結合する抗体量を、たとえば酵素免疫測
定法（たとえばELISA）等の方法で直接測定し、その抗
体量から試料中の麻痺性貝毒を定量する方法である。
【０００５】特に、F.S. Chu等（前掲）は抗サキシトキ
シン抗体／サキシトキシン−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合体または抗ネオサキシトキシン抗体／ネオサキシ
トキシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を用いる
ELISAによって麻痺性貝毒の全量を測定するアッセイ方
法を開示している。抗体の調製は、F.S. ChuとX. Fan,
J. Assoc. Off. Anal. Chem, 1985, 68:13-16およびF.
S. Chu，J. AOAC Int.1992, 75:341-345に従って調製さ
れているが、その手順は、Johnson等（Proc. Soc. Exp.
Biol. Med., 1964, 117, 425）の方法に準じ、牛血清
アルブミン、polylysineもしくはkeyhole limpet（カサ
ガイ）のヘモシアニンをホルマリンを含む弱酸性水溶液
中でサキシトキシンまたはネオサキシトキシンと反応さ
せて得た結合体を、ウサギに皮下注射してポリクローナ
ル抗体を得ることによっている。
シン抗体／サキシトキシン−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合体または抗ネオサキシトキシン抗体／ネオサキシ
トキシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を用いる
ELISAによって麻痺性貝毒の全量を測定するアッセイ方
法を開示している。抗体の調製は、F.S. ChuとX. Fan,
J. Assoc. Off. Anal. Chem, 1985, 68:13-16およびF.
S. Chu，J. AOAC Int.1992, 75:341-345に従って調製さ
れているが、その手順は、Johnson等（Proc. Soc. Exp.
Biol. Med., 1964, 117, 425）の方法に準じ、牛血清
アルブミン、polylysineもしくはkeyhole limpet（カサ
ガイ）のヘモシアニンをホルマリンを含む弱酸性水溶液
中でサキシトキシンまたはネオサキシトキシンと反応さ
せて得た結合体を、ウサギに皮下注射してポリクローナ
ル抗体を得ることによっている。
【０００６】具体的には、これらの抗体の作製に用いら
れた抗原は、サキシトキシンの分子内に存在する２つの
グアニジウム基にホルマリンを介してタンパク質を結合
したもの［Johnson等，上記；ChuとFan, 上記；V. Renz
とG. Terplan, Arch, Lebensmittelhyg., 1988, 39, 25
-56;A. Cembella等，"Specificity and cross-reactivi
ty of an adsorption-inhibition enzyme-linked immun
oassay for the detection of paralytic shellfish to
xins. In Toxic Marine Phytoplankton"（E. Graneli等
編），Elsevier Science Publishers, New York, pp.33
9-344,1989］、サキシトキシンの１２位に存在する２つ
のOH基のうちの１つをはずし、残ったOH基にタンパク質
を結合したもの［R. Carlson等、"Development of immu
noassaysfor paralytic shellfish poisoning. A radio
immunoassay for saxitoxin. In Seafood Toxins" ,
（E.P. Ragelis編）， ACS Symposium Series 262, Ame
rican Chemical Society, Washington, D.C., pp.181-1
92"］に大別できる。前者の抗原は、タンパク質の結合
部位が２つのグアニジウム基のいずれかあるいは両方か
が明確でなく、作製された抗体の反応性は発表グループ
により異なるが、いずれのグループの抗体もネオサキシ
トキシンとの反応性は良いもので２０％程度（但し、サ
キシトキシンとの反応性を１００％とする。）であり、
サキシトキシンとの同様IN-H誘導体であるゴニオトキシ
ン２,３およびデカルバモイルサキシトキシンとの反応
性も５０％程度と低い。また、カルバモイル−Ｎ−スル
フェート誘導体であるＣトキシンとは全く結合しない。
一方、後者の抗体は、ネオサキシトキシンとの反応性が
１％以下と報告され、他の毒成分との反応性は調べられ
てない。さらに、同様の抗原を用いたモノクローナル抗
体の作製も試みられているが、これらは反応性、感度と
も低い（R. Hack等，Food and Agricultural immunolog
y, 1990,2, 47-48）。
れた抗原は、サキシトキシンの分子内に存在する２つの
グアニジウム基にホルマリンを介してタンパク質を結合
したもの［Johnson等，上記；ChuとFan, 上記；V. Renz
とG. Terplan, Arch, Lebensmittelhyg., 1988, 39, 25
-56;A. Cembella等，"Specificity and cross-reactivi
ty of an adsorption-inhibition enzyme-linked immun
oassay for the detection of paralytic shellfish to
xins. In Toxic Marine Phytoplankton"（E. Graneli等
編），Elsevier Science Publishers, New York, pp.33
9-344,1989］、サキシトキシンの１２位に存在する２つ
のOH基のうちの１つをはずし、残ったOH基にタンパク質
を結合したもの［R. Carlson等、"Development of immu
noassaysfor paralytic shellfish poisoning. A radio
immunoassay for saxitoxin. In Seafood Toxins" ,
（E.P. Ragelis編）， ACS Symposium Series 262, Ame
rican Chemical Society, Washington, D.C., pp.181-1
92"］に大別できる。前者の抗原は、タンパク質の結合
部位が２つのグアニジウム基のいずれかあるいは両方か
が明確でなく、作製された抗体の反応性は発表グループ
により異なるが、いずれのグループの抗体もネオサキシ
トキシンとの反応性は良いもので２０％程度（但し、サ
キシトキシンとの反応性を１００％とする。）であり、
サキシトキシンとの同様IN-H誘導体であるゴニオトキシ
ン２,３およびデカルバモイルサキシトキシンとの反応
性も５０％程度と低い。また、カルバモイル−Ｎ−スル
フェート誘導体であるＣトキシンとは全く結合しない。
一方、後者の抗体は、ネオサキシトキシンとの反応性が
１％以下と報告され、他の毒成分との反応性は調べられ
てない。さらに、同様の抗原を用いたモノクローナル抗
体の作製も試みられているが、これらは反応性、感度と
も低い（R. Hack等，Food and Agricultural immunolog
y, 1990,2, 47-48）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】致死活性測定法および
神経芽細胞法においては、動物や細胞の管理、検出感
度、精度、特異性などの点で問題があるし、高速液体ク
ロマトグラフィー法においては、操作は簡単で、精度も
高いが、高価な機器を必要とし、麻酔性貝毒の種類によ
って感度が異なること、精製された外部標準の供給がな
いことなどの欠点を有している。また、免疫学的方法に
おいては、抗体の反応性がサキシトキシン誘導体の種類
によって異なるなどの点で問題がある。したがって、麻
酔性貝毒の簡便で精度高く、しかも貝毒の種類によらず
感度一定に測定できる方法の開発が望まれてきた。
神経芽細胞法においては、動物や細胞の管理、検出感
度、精度、特異性などの点で問題があるし、高速液体ク
ロマトグラフィー法においては、操作は簡単で、精度も
高いが、高価な機器を必要とし、麻酔性貝毒の種類によ
って感度が異なること、精製された外部標準の供給がな
いことなどの欠点を有している。また、免疫学的方法に
おいては、抗体の反応性がサキシトキシン誘導体の種類
によって異なるなどの点で問題がある。したがって、麻
酔性貝毒の簡便で精度高く、しかも貝毒の種類によらず
感度一定に測定できる方法の開発が望まれてきた。
【０００８】さきに、本願発明者らは、麻酔性貝毒−グ
ルタオチン（PSP-GSH）複合体（特願平10-91797号公
報）をハプテンとし、これをタンパク質分子に導入した
抗原を調製し、ウサギに投与したところ、麻痺性貝毒を
全前成分に対して反応するポリクローナル抗体を得てこ
れを開示した（特開2000-344799号公報）。しかし、こ
のGSHとの複合体を用いる方法ではタンパク質分子に対
するハプテンの結合量が少なく、得られた抗血清の抗体
価も低く、毒をタンパク質等分子に導入するためには結
合法の改良が必要であると考えられた。
ルタオチン（PSP-GSH）複合体（特願平10-91797号公
報）をハプテンとし、これをタンパク質分子に導入した
抗原を調製し、ウサギに投与したところ、麻痺性貝毒を
全前成分に対して反応するポリクローナル抗体を得てこ
れを開示した（特開2000-344799号公報）。しかし、こ
のGSHとの複合体を用いる方法ではタンパク質分子に対
するハプテンの結合量が少なく、得られた抗血清の抗体
価も低く、毒をタンパク質等分子に導入するためには結
合法の改良が必要であると考えられた。
【０００９】本発明の第１目的は、毒をタンパク質等他
の分子に導入するための、上記欠点の改良された結合法
を用いる、麻痺性貝毒に対する抗体の製法の提供にあ
る。また本発明の第２目的は、本発明による改良結合法
を用いて調製した抗体の提供にある。さらに本発明の第
３目的は、本発明における抗体を用いる新規ELISAキッ
トの提供にある。また本発明の第４目的は、本発明にお
ける改良結合法を用いて調製される、麻痺性貝毒簡易測
定法に使用するための標識毒標品の製法およびこの製法
により調製した標識毒標品の提供にある。
の分子に導入するための、上記欠点の改良された結合法
を用いる、麻痺性貝毒に対する抗体の製法の提供にあ
る。また本発明の第２目的は、本発明による改良結合法
を用いて調製した抗体の提供にある。さらに本発明の第
３目的は、本発明における抗体を用いる新規ELISAキッ
トの提供にある。また本発明の第４目的は、本発明にお
ける改良結合法を用いて調製される、麻痺性貝毒簡易測
定法に使用するための標識毒標品の製法およびこの製法
により調製した標識毒標品の提供にある。
【００１０】この度、発明者らは、スルフヒドリル基を
複数（２つ）持つジチオール化合物を用いて遊離スルフ
ヒドリル基を持つ毒誘導体を調製し、この誘導体をスル
フヒドリル基指向性官能基をアミノ基に導入したタンパ
ク質と反応させると、毒を効率的にタンパク質に導入で
き、より多くのハプテン分子を導入した抗原の作成が可
能であることを見いだした。本発明における上記製法
は、毒とタンパク質とを別個に修飾し、両者の反応によ
り抗原を得ることに特徴がある。本発明による抗原は、
タンパク質分子当りのハプテン量が大きいので、高い抗
体価を持つ抗血清が得られ、抗体が高収率で得られるこ
とが発明者らにより見いだされた。本発明における改良
結合法により調製した抗体を用いると、毒のELISA測定
キットの提供が可能になる。
複数（２つ）持つジチオール化合物を用いて遊離スルフ
ヒドリル基を持つ毒誘導体を調製し、この誘導体をスル
フヒドリル基指向性官能基をアミノ基に導入したタンパ
ク質と反応させると、毒を効率的にタンパク質に導入で
き、より多くのハプテン分子を導入した抗原の作成が可
能であることを見いだした。本発明における上記製法
は、毒とタンパク質とを別個に修飾し、両者の反応によ
り抗原を得ることに特徴がある。本発明による抗原は、
タンパク質分子当りのハプテン量が大きいので、高い抗
体価を持つ抗血清が得られ、抗体が高収率で得られるこ
とが発明者らにより見いだされた。本発明における改良
結合法により調製した抗体を用いると、毒のELISA測定
キットの提供が可能になる。
【００１１】また本発明における抗体の製法によれば、
毒を樹脂または蛍光物質等の担体と効率的に結合させる
得ることも発明者らは見いだした。蛍光物質等マーカー
を結合させた場合、毒性は若干低減するが、本発明によ
る抗原は毒の活性部位が露出されているので、毒性を残
したままでの標識毒標品の調製が可能になる。
毒を樹脂または蛍光物質等の担体と効率的に結合させる
得ることも発明者らは見いだした。蛍光物質等マーカー
を結合させた場合、毒性は若干低減するが、本発明によ
る抗原は毒の活性部位が露出されているので、毒性を残
したままでの標識毒標品の調製が可能になる。
【００１２】したがって、本発明の第１の態様では、サ
キシトキシンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２
つ）持つジチオール化合物を結合させて遊離スルフヒド
リル基を持つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調
製し、他方、スルフヒドリル基指向性官能基をアミノ基
に導入したタンパク質を調製し、次いで上記サキシトキ
シンスルフヒドリル誘導体と上記修飾タンパク質とを反
応させて得られる抗原を非ヒト動物に免疫し、該動物か
ら麻痺性貝毒を認識し得る抗血清を得ることを含む、麻
痺性貝毒に対する抗体の製法が提供される。
キシトキシンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２
つ）持つジチオール化合物を結合させて遊離スルフヒド
リル基を持つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調
製し、他方、スルフヒドリル基指向性官能基をアミノ基
に導入したタンパク質を調製し、次いで上記サキシトキ
シンスルフヒドリル誘導体と上記修飾タンパク質とを反
応させて得られる抗原を非ヒト動物に免疫し、該動物か
ら麻痺性貝毒を認識し得る抗血清を得ることを含む、麻
痺性貝毒に対する抗体の製法が提供される。
【００１３】スルフヒドリル基を有する上記ジチオール
化合物は、１，２−エタンジチオール、ジチオスレイト
ール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸
ジチオエリスリトールからなる群から選択するのが好ま
しい。スルフヒドリル基指向性官能基を持つ化合物は、
マレイミド、チオフタルイミド、活性ハロゲン化合物か
らなる群から選択するのが好ましい。
化合物は、１，２−エタンジチオール、ジチオスレイト
ール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸
ジチオエリスリトールからなる群から選択するのが好ま
しい。スルフヒドリル基指向性官能基を持つ化合物は、
マレイミド、チオフタルイミド、活性ハロゲン化合物か
らなる群から選択するのが好ましい。
【００１４】また本発明の第２の態様では、第１態様に
おける製法により得られた抗体が提供される。
おける製法により得られた抗体が提供される。
【００１５】また本発明の第３の態様では、第１態様に
おいて得られた抗体を用いる新規ELISAキットが提供さ
れる。
おいて得られた抗体を用いる新規ELISAキットが提供さ
れる。
【００１６】また本発明の第４の態様では、サキシトキ
シンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２つ）持つジ
チオール化合物を結合させて遊離スルフヒドリル基を持
つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調製し、次い
でチオール指向性官能基を導入したアガロースまたはビ
オチン、蛍光物質、金コロイドなどの標識化合物をこの
誘導体に反応させることからなる、麻酔性貝毒簡易結合
測定に用いるための標識毒標品が提供される。
シンの１１位にスルフヒドリル基を複数（２つ）持つジ
チオール化合物を結合させて遊離スルフヒドリル基を持
つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調製し、次い
でチオール指向性官能基を導入したアガロースまたはビ
オチン、蛍光物質、金コロイドなどの標識化合物をこの
誘導体に反応させることからなる、麻酔性貝毒簡易結合
測定に用いるための標識毒標品が提供される。
【００１７】さらに本発明は第５の態様においては、上
記標識毒標品の製法を用いた標識毒標品が提供される。
本発明における毒標品は非アイソトープ系のビオチン標
識系および蛍光標識系標品であり、これらの製法を図７
に示す。
記標識毒標品の製法を用いた標識毒標品が提供される。
本発明における毒標品は非アイソトープ系のビオチン標
識系および蛍光標識系標品であり、これらの製法を図７
に示す。
【００１８】本発明における上記製法は、遊離スルフヒ
ドリル基指向性の任意の官能基、特にマレイミド、チオ
フタルイミド、活性ハロゲン等が中性水溶液中、温和な
条件下にチオール基と定量的に反応することを応用した
ものであり、PSP-GSH複合体もしくはその他のアミド縮
合を用いる結合法に比べ、本発明によれば遙かに高収率
かつ容易に麻酔性貝毒をタンパク質や標識化合物とを結
合さえることが可能である。
ドリル基指向性の任意の官能基、特にマレイミド、チオ
フタルイミド、活性ハロゲン等が中性水溶液中、温和な
条件下にチオール基と定量的に反応することを応用した
ものであり、PSP-GSH複合体もしくはその他のアミド縮
合を用いる結合法に比べ、本発明によれば遙かに高収率
かつ容易に麻酔性貝毒をタンパク質や標識化合物とを結
合さえることが可能である。
【００１９】以下、ジチオール化合物としてエタンジチ
オール（EDT）を採用した場合の本発明における抗体の
製法を述べる。
オール（EDT）を採用した場合の本発明における抗体の
製法を述べる。
【００２０】サキシトキシン−EDT複合体は、ゴニオト
キシン（ゴニオトキシン２，３、あるいはこれらの組合
せ）とジチオール基を有するEDTとを混合・加熱（約７
０℃）すると、EDTのイオウ分子を介してゴニオトキシ
ン類の１１位のOSO3-基と置換反応することにより得る
ことができる。本発明では、この複合体はいわゆるハプ
テン抗原、すなわち抗体とは結合するが抗体を誘発する
能力のない物質である。一般にこのようなハプテン抗原
にタンパク質を共有結合させて大分子とすることによっ
て免疫原とし得る場合もあることが知られているが、本
発明におけるタンパク質もまた同様の働きをもつもので
ある。そのようなタンパク質として、たとえばアルブミ
ンやカサガイヘモシアニン(KLH)が例示できる。
キシン（ゴニオトキシン２，３、あるいはこれらの組合
せ）とジチオール基を有するEDTとを混合・加熱（約７
０℃）すると、EDTのイオウ分子を介してゴニオトキシ
ン類の１１位のOSO3-基と置換反応することにより得る
ことができる。本発明では、この複合体はいわゆるハプ
テン抗原、すなわち抗体とは結合するが抗体を誘発する
能力のない物質である。一般にこのようなハプテン抗原
にタンパク質を共有結合させて大分子とすることによっ
て免疫原とし得る場合もあることが知られているが、本
発明におけるタンパク質もまた同様の働きをもつもので
ある。そのようなタンパク質として、たとえばアルブミ
ンやカサガイヘモシアニン(KLH)が例示できる。
【００２１】本発明はまた、第２の態様において、麻痺
性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキシン２，
３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，４、ゴニ
オトキシン５、およびＣトキシン１，２のいずれとも５
０％以上の相対反応性（但し、サキシトキシンとの反応
性を１００％とする。）を示す、麻痺性貝に対する抗体
を提供する。
性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキシン２，
３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，４、ゴニ
オトキシン５、およびＣトキシン１，２のいずれとも５
０％以上の相対反応性（但し、サキシトキシンとの反応
性を１００％とする。）を示す、麻痺性貝に対する抗体
を提供する。
【００２２】本発明の抗体は、麻痺性貝毒であるIN-H誘
導体（サキシトキシン、ゴニオトキシン２,３）、IN-OH
誘導体（ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１,
４）、カルバモイル−Ｎ−スルフェート誘導体（ゴニオ
トキシン５、およびＣトキシン１,２）のすべてをほぼ
同様に認識することができる。ここで「ゴニオトキシン
２,３」などの表現はゴニオトキシン２とゴニオトキシ
ン３との混合物を意味する。麻痺性貝毒の名称および構
造については、たとえば、安元健、麻痺性貝毒、食品衛
生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生局監修）、第30
0〜305頁、日本食品衛生協会、1901年；Intergovernmen
tal Oceanographic Commission (IOC) Manualand Guide
s No.33(1995), UNESCO's Workshops, France, pp.81-9
4などに記載されている。本発明の実施態様により、本
発明の抗体は上記方法によって得られたものである。
導体（サキシトキシン、ゴニオトキシン２,３）、IN-OH
誘導体（ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１,
４）、カルバモイル−Ｎ−スルフェート誘導体（ゴニオ
トキシン５、およびＣトキシン１,２）のすべてをほぼ
同様に認識することができる。ここで「ゴニオトキシン
２,３」などの表現はゴニオトキシン２とゴニオトキシ
ン３との混合物を意味する。麻痺性貝毒の名称および構
造については、たとえば、安元健、麻痺性貝毒、食品衛
生検査指針（理化学編、厚生省生活衛生局監修）、第30
0〜305頁、日本食品衛生協会、1901年；Intergovernmen
tal Oceanographic Commission (IOC) Manualand Guide
s No.33(1995), UNESCO's Workshops, France, pp.81-9
4などに記載されている。本発明の実施態様により、本
発明の抗体は上記方法によって得られたものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明の抗体の製造において使用
される抗原は、サキシトキシン−EDT−タンパク質複合
体である。この複合体は以下のようにして製造すること
ができる。サキシトキシン部分の原料としてゴニオトキ
シン２、ゴニオトキシン３またはそれらの任意割合の混
合物を使用することができる。これらの原料成分は、イ
ガイ、ハマグリ、ホタテガイ等の貝類の0.1規定塩酸に
よる加熱抽出物から活性炭処理、ゲル濾過クロマトグラ
フィー（たとえばBio-GelP-2(バイオラッド社）使用)、
イオン交換クロマトグラフィー（たとえばBio-Rex70(バ
イオラッド社）使用)などの処理を経て精製することが
できる。
される抗原は、サキシトキシン−EDT−タンパク質複合
体である。この複合体は以下のようにして製造すること
ができる。サキシトキシン部分の原料としてゴニオトキ
シン２、ゴニオトキシン３またはそれらの任意割合の混
合物を使用することができる。これらの原料成分は、イ
ガイ、ハマグリ、ホタテガイ等の貝類の0.1規定塩酸に
よる加熱抽出物から活性炭処理、ゲル濾過クロマトグラ
フィー（たとえばBio-GelP-2(バイオラッド社）使用)、
イオン交換クロマトグラフィー（たとえばBio-Rex70(バ
イオラッド社）使用)などの処理を経て精製することが
できる。
【００２４】上記のようにして得られてゴニオトキシン
にEDT（還元型が好ましい。）を加熱下に反応させる
と、EDTのSH基がその電子共与性のためにゴニオトキシ
ンの１１位の炭素原子を求核攻撃し、その結果OSO3-基
が離脱し、該１１位の炭素原子に-S-（EDT）が結合し、
これによってサキシトキシン−EDT複合体が生成する。
該反応は、中性条件下で反応物質を加熱することによっ
て起こる。一般にpH6.5〜7.5、好ましくはpH7.0〜7.5の
適切な緩衝液、たとえば燐酸アンモニウム緩衝液、酢酸
アンモニウム緩衝液等を用いて反応を行うことができ
る。また、反応温度は、一般に室温から約100℃、好ま
しくは50℃から80℃、より好ましくは約70℃である。反
応後、目的の生成物を、調製用高速液体クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相配分クロ
マトグラフィー等の手段を単独で又は組合わせて実施
し、精製することができる。生成物の同定は、赤外分光
法、質量分析法、NMR法、元素分析、アミノ酸分析など
の通常の測定法によって行うことができる。
にEDT（還元型が好ましい。）を加熱下に反応させる
と、EDTのSH基がその電子共与性のためにゴニオトキシ
ンの１１位の炭素原子を求核攻撃し、その結果OSO3-基
が離脱し、該１１位の炭素原子に-S-（EDT）が結合し、
これによってサキシトキシン−EDT複合体が生成する。
該反応は、中性条件下で反応物質を加熱することによっ
て起こる。一般にpH6.5〜7.5、好ましくはpH7.0〜7.5の
適切な緩衝液、たとえば燐酸アンモニウム緩衝液、酢酸
アンモニウム緩衝液等を用いて反応を行うことができ
る。また、反応温度は、一般に室温から約100℃、好ま
しくは50℃から80℃、より好ましくは約70℃である。反
応後、目的の生成物を、調製用高速液体クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相配分クロ
マトグラフィー等の手段を単独で又は組合わせて実施
し、精製することができる。生成物の同定は、赤外分光
法、質量分析法、NMR法、元素分析、アミノ酸分析など
の通常の測定法によって行うことができる。
【００２５】サキシトキシンのような低分離化合物はハ
プテンに属し、それ自体は抗原性をもたないが、抗原性
をもつタンパク質を担体として、これと共有結合した複
合体はハプテンに対する特異抗体を産生する抗原とな
る。ハプテン−タンパク質複合体を免疫注射するとハプ
テン部分は抗原決定基として認識され、抗ハプテン抗体
が産生されると考えられている。このとき、余分な抗原
決定基ができにくい選択的な結合方法でハプテン抗原を
作製する必要がある。ハプテンの部分構造に対する認識
は、ハプテンと担体であるタンパク質の結合部位付近で
は弱く、より離れた部分構造を認識しやすい。したがっ
て、タンパク質と結合する際には、ハプテン中の適切な
結合位置を選択することが大切である。本発明者らによ
り先に見出されたサキシトキシンの１１位にEDT基が結
合した構造をもつサキシトキシン−EDT複合体（特願平1
0-91797号）は、免疫抗原として好ましいだけでなく、
麻痺性貝毒のほぼ全ての種類を高い反応性で検出可能と
する麻痺性貝毒を産出し得る利点をもつ。
プテンに属し、それ自体は抗原性をもたないが、抗原性
をもつタンパク質を担体として、これと共有結合した複
合体はハプテンに対する特異抗体を産生する抗原とな
る。ハプテン−タンパク質複合体を免疫注射するとハプ
テン部分は抗原決定基として認識され、抗ハプテン抗体
が産生されると考えられている。このとき、余分な抗原
決定基ができにくい選択的な結合方法でハプテン抗原を
作製する必要がある。ハプテンの部分構造に対する認識
は、ハプテンと担体であるタンパク質の結合部位付近で
は弱く、より離れた部分構造を認識しやすい。したがっ
て、タンパク質と結合する際には、ハプテン中の適切な
結合位置を選択することが大切である。本発明者らによ
り先に見出されたサキシトキシンの１１位にEDT基が結
合した構造をもつサキシトキシン−EDT複合体（特願平1
0-91797号）は、免疫抗原として好ましいだけでなく、
麻痺性貝毒のほぼ全ての種類を高い反応性で検出可能と
する麻痺性貝毒を産出し得る利点をもつ。
【００２６】担体となるタンパク質としてはアルブミ
ン、ヘモシアニンなどを使用できるが、これらに限定さ
れず、本発明の抗体を誘発可能とする任意のタンパク質
を使用できる。サキシトキシン−EDT複合体に担体タン
パク質を結合する際には、該複合体のEDT部分を利用し
て、（反応性官能基を導入した）担体タンパク質とマレ
イミド法（T. Kitagawaら，J. Bioshem. 92:585-590,19
82）やカルボジイミド法(D. Exleyら，FEBS Lett., 91:
162-165,1978）などで結合させて、サキシトキシン−GS
H−タンパク質複合体を生成することができる。たとえ
ば後述の実施例にはサキシトキシン−EDT−牛血清アル
ブミン複合体の製造例を示すが、ここでは先ずサキシト
キシン−EDT結合体を作り、一方アルブミンをその遊離
アミノ基を介してメルカプトサクシニル化し、両者を反
応させることにより担体タンパク質をサキシトキシン-E
DTに結合させる。得られた複合体の精製は、慣用のタン
パク質精製法を適宜組合わせて実施できる。そのような
方法には、たとえば、塩析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマ
トフォーカシング、限外濾過などが含まれる。
ン、ヘモシアニンなどを使用できるが、これらに限定さ
れず、本発明の抗体を誘発可能とする任意のタンパク質
を使用できる。サキシトキシン−EDT複合体に担体タン
パク質を結合する際には、該複合体のEDT部分を利用し
て、（反応性官能基を導入した）担体タンパク質とマレ
イミド法（T. Kitagawaら，J. Bioshem. 92:585-590,19
82）やカルボジイミド法(D. Exleyら，FEBS Lett., 91:
162-165,1978）などで結合させて、サキシトキシン−GS
H−タンパク質複合体を生成することができる。たとえ
ば後述の実施例にはサキシトキシン−EDT−牛血清アル
ブミン複合体の製造例を示すが、ここでは先ずサキシト
キシン−EDT結合体を作り、一方アルブミンをその遊離
アミノ基を介してメルカプトサクシニル化し、両者を反
応させることにより担体タンパク質をサキシトキシン-E
DTに結合させる。得られた複合体の精製は、慣用のタン
パク質精製法を適宜組合わせて実施できる。そのような
方法には、たとえば、塩析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマ
トフォーカシング、限外濾過などが含まれる。
【００２７】ゴニオトキシン２，３に換えて、ゴニオト
キシン１、ゴニオトキシン４又はそれらの混合物を原料
としてEDTと反応させる場合には、ネオサキシトキシン-
EDT複合体が得られる。さらにこの複合体を上記と同様
に担体タンパク質と反応させることによってネオサキシ
トキシン−EDT−タンパク質複合体を得ることができ、
得られた生成物はサキシトキシン−EDT−タンパク質複
合体と同様に麻痺性貝毒に対する抗体の産生に使用する
ことができる（以下参照）。
キシン１、ゴニオトキシン４又はそれらの混合物を原料
としてEDTと反応させる場合には、ネオサキシトキシン-
EDT複合体が得られる。さらにこの複合体を上記と同様
に担体タンパク質と反応させることによってネオサキシ
トキシン−EDT−タンパク質複合体を得ることができ、
得られた生成物はサキシトキシン−EDT−タンパク質複
合体と同様に麻痺性貝毒に対する抗体の産生に使用する
ことができる（以下参照）。
【００２８】本発明のサキシトキシン−EDT−タンパク
質複合体を、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、等の動物
に免疫することによって該複合体に対する抗体を作製す
ることができる。通常、免疫原溶液を、フロイントの完
全アジュバント、不完全アジュバント、リビアジュバン
トシステム(RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH INC)、ムラミル
ペプチド（Calzyme社）、水酸化アルミニウム、リポポ
リサッカライドなどのアジュバントと乳化混合し、動物
に皮下、皮内、または筋肉に注射した後、２〜４週間の
間隔で同様の操作を行い数回追加免疫し、放血後抗血清
（ポリクローナル抗体）を得ることができる。定期的に
放血血清をサキシトキシンとの反応性について測定し、
高力価が達成されるまで追加免疫を実施する。抗原の量
は、抗原刺激を受ける動物の種類によって異なるが、た
とえばウサギの場合10μg〜数mg、マウスの場合数μg〜
数10mgである。
質複合体を、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、等の動物
に免疫することによって該複合体に対する抗体を作製す
ることができる。通常、免疫原溶液を、フロイントの完
全アジュバント、不完全アジュバント、リビアジュバン
トシステム(RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH INC)、ムラミル
ペプチド（Calzyme社）、水酸化アルミニウム、リポポ
リサッカライドなどのアジュバントと乳化混合し、動物
に皮下、皮内、または筋肉に注射した後、２〜４週間の
間隔で同様の操作を行い数回追加免疫し、放血後抗血清
（ポリクローナル抗体）を得ることができる。定期的に
放血血清をサキシトキシンとの反応性について測定し、
高力価が達成されるまで追加免疫を実施する。抗原の量
は、抗原刺激を受ける動物の種類によって異なるが、た
とえばウサギの場合10μg〜数mg、マウスの場合数μg〜
数10mgである。
【００２９】上記のようにして得られた麻痺性貝毒に対
する抗血清はさらに、たとえば硫安分画、ついでイオン
交換クロマトグラフィーで処理することによりIgG抗体
に精製することができる。あるいはサキシトキシンをデ
キストランゲルまたはアガロースゲルに化学的に結合さ
せたゲルを用いるアフィニティクロマトグラフィーによ
って抗体を精製することができる。抗体の作製および精
製については、たとえば生物化学実験法１５「免疫学入
門」(1982）学会出版センターに詳細に記載されており
参照可能である。
する抗血清はさらに、たとえば硫安分画、ついでイオン
交換クロマトグラフィーで処理することによりIgG抗体
に精製することができる。あるいはサキシトキシンをデ
キストランゲルまたはアガロースゲルに化学的に結合さ
せたゲルを用いるアフィニティクロマトグラフィーによ
って抗体を精製することができる。抗体の作製および精
製については、たとえば生物化学実験法１５「免疫学入
門」(1982）学会出版センターに詳細に記載されており
参照可能である。
【００３０】本発明の方法では、免疫後１ケ月程度から
抗体価の上昇が見られ、サキシトキシンに対する抗血清
の場合約４ケ月後に抗血清１mlあたり0.5nmolのサキシ
トキシンを結合する力価が得られる。本抗血清はネオサ
キシトキシンとの反応は幾分低かったが、免疫５ケ月後
の血清では両者の貝毒との反応性はほとんど差ががなか
った。また、図２に免疫４，５ケ月目の血清の麻痺性貝
毒の各種成分との反応性を示すが、４ケ月目の血清はネ
オサキシトキシンおよびゴニオトキシン１，４との反応
性が幾分劣るが、５ケ月目の血清は各成分との反応に大
きな差が認められなかった。このように、本発明の抗体
は麻痺性貝毒のほぼすべての成分と免疫学的に反応し、
特に麻痺性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキ
シン２，３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，
４、ゴニオトキシン５、およびＣトキシン（Ｃ１、Ｃ
２）のいずれとも50％以上、好ましくは60％以上の相対
反応性（但し、サキシトキシンとの反応性を100％とす
る。）を示す。これに対して従来公知の抗体の多くは、
麻痺性貝毒の全成分に共通のグアニジウム基にタンパク
質を結合させたものを抗原としているため、一部の麻痺
性貝毒成分に強い特異性を示す反面、ほとんど結合しな
い成分も存在する。貝毒の検出の信頼度を上げるために
は、抗体はほとんどすべての貝毒成分と同程度に反応す
るのが望ましい。
抗体価の上昇が見られ、サキシトキシンに対する抗血清
の場合約４ケ月後に抗血清１mlあたり0.5nmolのサキシ
トキシンを結合する力価が得られる。本抗血清はネオサ
キシトキシンとの反応は幾分低かったが、免疫５ケ月後
の血清では両者の貝毒との反応性はほとんど差ががなか
った。また、図２に免疫４，５ケ月目の血清の麻痺性貝
毒の各種成分との反応性を示すが、４ケ月目の血清はネ
オサキシトキシンおよびゴニオトキシン１，４との反応
性が幾分劣るが、５ケ月目の血清は各成分との反応に大
きな差が認められなかった。このように、本発明の抗体
は麻痺性貝毒のほぼすべての成分と免疫学的に反応し、
特に麻痺性貝毒成分であるサキシトキシン、ゴニオトキ
シン２，３、ネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１，
４、ゴニオトキシン５、およびＣトキシン（Ｃ１、Ｃ
２）のいずれとも50％以上、好ましくは60％以上の相対
反応性（但し、サキシトキシンとの反応性を100％とす
る。）を示す。これに対して従来公知の抗体の多くは、
麻痺性貝毒の全成分に共通のグアニジウム基にタンパク
質を結合させたものを抗原としているため、一部の麻痺
性貝毒成分に強い特異性を示す反面、ほとんど結合しな
い成分も存在する。貝毒の検出の信頼度を上げるために
は、抗体はほとんどすべての貝毒成分と同程度に反応す
るのが望ましい。
【００３１】本発明のサキシトキシン−EDT−タンパク
質複合体を抗原として用いることによって定法によりモ
ノクローナル抗体を作製することも可能である。具体的
には、マウスやラットなどのげっ歯類に該複合体を免疫
後に脾臓を無菌的に取り出し、脾臓細胞を調製した後、
ミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマをHAT培地等
の選別用培地で選別し、動物細胞培養用培地中で継代培
養するか、または該げっ歯類の腹膣内に移植培養し腹水
からモノクローナル抗体を採取することができる。モノ
クローナル抗体の作製については、MilsteinとKholer,
Nature256: 495(1976)；属性化学実験講座，免疫生化
学研究法（日本生化学会編）等に記載される方法を使用
できる。
質複合体を抗原として用いることによって定法によりモ
ノクローナル抗体を作製することも可能である。具体的
には、マウスやラットなどのげっ歯類に該複合体を免疫
後に脾臓を無菌的に取り出し、脾臓細胞を調製した後、
ミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマをHAT培地等
の選別用培地で選別し、動物細胞培養用培地中で継代培
養するか、または該げっ歯類の腹膣内に移植培養し腹水
からモノクローナル抗体を採取することができる。モノ
クローナル抗体の作製については、MilsteinとKholer,
Nature256: 495(1976)；属性化学実験講座，免疫生化
学研究法（日本生化学会編）等に記載される方法を使用
できる。
【００３２】上記のようにして得られた抗体は、麻痺性
貝毒を含む疑いのある食品等の検体中の貝毒の測定に使
用することができる。測定は慣用の抗原抗体反応を用い
て行うことができ、固相法もしくは均質法、競合法もし
くは非競合法、サンドイッチ法などの方法を使用するこ
とができる。たとえば、サンドイッチ法を用いる場合に
は、過剰量の標識化第二抗体を用いるが、標識としてペ
ルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、
125I、82P等の放射性同位体、FITC等の蛍光物質、アク
リジニウムなどの化学発光物質を用いることができる。
標識の種類に依存して、ELISAなどの酵素抗体法、ラジ
オイムノアッセイ、蛍光抗体法の使用が可能である。さ
らに、本発明の抗体は、臭化シアン等で活性化されたデ
キストラン樹脂（たとえばSephadexTM類）、アガロース
樹脂（たとえばBio-GelTM類）、等の樹脂に結合すると
きには問題の貝毒を分離除去するためのアフィニティー
カラム担体とすることができる。
貝毒を含む疑いのある食品等の検体中の貝毒の測定に使
用することができる。測定は慣用の抗原抗体反応を用い
て行うことができ、固相法もしくは均質法、競合法もし
くは非競合法、サンドイッチ法などの方法を使用するこ
とができる。たとえば、サンドイッチ法を用いる場合に
は、過剰量の標識化第二抗体を用いるが、標識としてペ
ルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、
125I、82P等の放射性同位体、FITC等の蛍光物質、アク
リジニウムなどの化学発光物質を用いることができる。
標識の種類に依存して、ELISAなどの酵素抗体法、ラジ
オイムノアッセイ、蛍光抗体法の使用が可能である。さ
らに、本発明の抗体は、臭化シアン等で活性化されたデ
キストラン樹脂（たとえばSephadexTM類）、アガロース
樹脂（たとえばBio-GelTM類）、等の樹脂に結合すると
きには問題の貝毒を分離除去するためのアフィニティー
カラム担体とすることができる。
【００３３】ジチオール化合物としてエタンジチオール
(EDT)以外の化合物を採用した場合の実施形態も、上記
とほぼ同じである。
(EDT)以外の化合物を採用した場合の実施形態も、上記
とほぼ同じである。
【００３４】本発明に係わる他の関連文献は次のようで
ある： Hollingworth T. Wekell MM(1990): Paralytic shellfi
sh poison. In: Official Methods of Analysis, 15th
edition, K. Hellrich ed., Association of Official
Analytical Chemists, Arlington, Virginia, pp.881-8
82. Oshima Y (1995): Post-column derivatization HPLC m
ethods for paralytic shellfish poisons. In: Manual
on Harmful Marine Algae, 10C Manuals and Guides N
o.33, Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD ed
s., Intergovernmental Oceanographic Commission of
UNESCO, Paris, pp.81-94. Sato S, Sakai R, Kodama M (2000): Identification o
f thioether intermediates in the reductive transfo
rmation of gonyautoxins into saxitoxins by thios.
Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1787-1789. Sommer H. Meyer KF (1937): Paralytic shellfish poi
soning. Arch. Pathol.24: 560-568.
ある： Hollingworth T. Wekell MM(1990): Paralytic shellfi
sh poison. In: Official Methods of Analysis, 15th
edition, K. Hellrich ed., Association of Official
Analytical Chemists, Arlington, Virginia, pp.881-8
82. Oshima Y (1995): Post-column derivatization HPLC m
ethods for paralytic shellfish poisons. In: Manual
on Harmful Marine Algae, 10C Manuals and Guides N
o.33, Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD ed
s., Intergovernmental Oceanographic Commission of
UNESCO, Paris, pp.81-94. Sato S, Sakai R, Kodama M (2000): Identification o
f thioether intermediates in the reductive transfo
rmation of gonyautoxins into saxitoxins by thios.
Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1787-1789. Sommer H. Meyer KF (1937): Paralytic shellfish poi
soning. Arch. Pathol.24: 560-568.
【００３５】
【実施例】以下の実施例によって本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
【００３６】本発明の記載に関連する略号は次のようで
ある： 試料および試薬類 アジュバント： Complete Adjuvant Freund's Wako Bio-Gel P-2 ゲル濾過樹脂、mesh size: fine Bio-Rad Biotin-PE(AC5)2 -Maleimide ビオチンラベル試薬 Dojindo PAEM N-[2-(2-Pyridyiamino)ethyl]maleimide Wako BSA: 牛血清アルブミン Wako，IRA grade DMSO: ジメチルスルフォキシド Wako，特級 EDT: 1,2-エタンジチオール Wako，特級 EDTA: エチレンジアミン4酢酸 Wako，特級 GMBS： γ-マレイミト゛酪酸N-ヒト゛ロキシコハク酸イミト゛エステル Dojindo 反応プレート： ELISA plate 96-well Iwaki OPD: o-phenylenediamine-2HC1(tablet) Wako 酵素標識二次抗体：HRP標識抗ウサキ゛-ヤキ゛，使用時1000倍希釈 Dako マイクロフ゜レートリータ゛ー：MPR A4 Toso PBS(-)： Mg, Ca freeリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4） PBSB： 0.5%BSAと0.1%Tween60を含むPBS(-) PBST： 0.1%Tween20を含むPBS(-) Sephadex G-50 ゲル濾過樹脂、mesh size： fine Pharmacia THF： テトラヒドロフラン Wako，特級 ウサギ： ニュージーランドホワイト、雄、体重約1Kg
ある： 試料および試薬類 アジュバント： Complete Adjuvant Freund's Wako Bio-Gel P-2 ゲル濾過樹脂、mesh size: fine Bio-Rad Biotin-PE(AC5)2 -Maleimide ビオチンラベル試薬 Dojindo PAEM N-[2-(2-Pyridyiamino)ethyl]maleimide Wako BSA: 牛血清アルブミン Wako，IRA grade DMSO: ジメチルスルフォキシド Wako，特級 EDT: 1,2-エタンジチオール Wako，特級 EDTA: エチレンジアミン4酢酸 Wako，特級 GMBS： γ-マレイミト゛酪酸N-ヒト゛ロキシコハク酸イミト゛エステル Dojindo 反応プレート： ELISA plate 96-well Iwaki OPD: o-phenylenediamine-2HC1(tablet) Wako 酵素標識二次抗体：HRP標識抗ウサキ゛-ヤキ゛，使用時1000倍希釈 Dako マイクロフ゜レートリータ゛ー：MPR A4 Toso PBS(-)： Mg, Ca freeリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4） PBSB： 0.5%BSAと0.1%Tween60を含むPBS(-) PBST： 0.1%Tween20を含むPBS(-) Sephadex G-50 ゲル濾過樹脂、mesh size： fine Pharmacia THF： テトラヒドロフラン Wako，特級 ウサギ： ニュージーランドホワイト、雄、体重約1Kg
【００３７】実施例１
麻痺性貝毒(PSP)精製毒およびEDT-PSP複合体の調製
大船渡湾産毒化ホタテガイから常法により、gonyautoxi
n(GTX)群、saxitoxin群およびC-toxin群PSP成分（図
１）を単離した。精製した成分のうちGTX1とGTX4、GTX2
とGTX3およびC1とC2はそれぞれモル比約３：１の平衡混
合物（それぞれGTX1+4，GTX2+3，C1+2と略記）として使
用した。50μmolのGTX1+4を20%のTHFを含む50mM EDT-10
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)50mLに溶解し、室温
で２日間静置した。ジエチルエーテルで３回抽出してED
Tを除去し、水相に残存するエーテルを30%で減圧下留去
して、EDT-neoSTXを含む反応混合液を得た。これをBio-
Gel P-2のカラム（1.5x15cm）に添加し、水200mLでカラ
ムを洗浄後0.1M酢酸で吸着成分を溶出した。10mLずつ分
取し、各画分中のGTX1,4、neoSTXならびにEDT-neoSTX濃
度をHPLC蛍光法で定量しつつEDT-neoSTX複合体を単離し
た。50μmolのGTX2+3を出発物質として同様に処理し、E
DT-STXを調製し分離した。
n(GTX)群、saxitoxin群およびC-toxin群PSP成分（図
１）を単離した。精製した成分のうちGTX1とGTX4、GTX2
とGTX3およびC1とC2はそれぞれモル比約３：１の平衡混
合物（それぞれGTX1+4，GTX2+3，C1+2と略記）として使
用した。50μmolのGTX1+4を20%のTHFを含む50mM EDT-10
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)50mLに溶解し、室温
で２日間静置した。ジエチルエーテルで３回抽出してED
Tを除去し、水相に残存するエーテルを30%で減圧下留去
して、EDT-neoSTXを含む反応混合液を得た。これをBio-
Gel P-2のカラム（1.5x15cm）に添加し、水200mLでカラ
ムを洗浄後0.1M酢酸で吸着成分を溶出した。10mLずつ分
取し、各画分中のGTX1,4、neoSTXならびにEDT-neoSTX濃
度をHPLC蛍光法で定量しつつEDT-neoSTX複合体を単離し
た。50μmolのGTX2+3を出発物質として同様に処理し、E
DT-STXを調製し分離した。
【００３８】実施例２
PSPに対する特異抗体作成用抗原の作成
BSA20mgを2mLのPBS(-)に溶解し、これに5mgのGMBS100μ
LのDMSOに溶解したものを混合して室温で１時間静置し
た。これを1mMEDTAを含む 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.0）で充填したSephadex G-25のカラム(1.5x20cm)
に添加し、同溶液で溶出した。得た高分子画分を合一
し、炭酸ナトリウム溶液でpHを7.4に調整した後、遠心
限外濾過キット(UFV4BCG25，NMWL 10,000, Millipore）
で4mLに濃縮した。この2mLに5μmolのEDT-neoSTXを溶解
し、５℃で２日間静置した。次に同混合物をPBS(-)に対
して４回透析し、内液をneoSTX-BSA結合体溶液として回
収した。STX-BSA結合体も同様の手順で調製した。抗原
溶液中のBSA濃度は280nmの吸収により、結合PSP濃度はH
PLC蛍光法により算出した。
LのDMSOに溶解したものを混合して室温で１時間静置し
た。これを1mMEDTAを含む 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.0）で充填したSephadex G-25のカラム(1.5x20cm)
に添加し、同溶液で溶出した。得た高分子画分を合一
し、炭酸ナトリウム溶液でpHを7.4に調整した後、遠心
限外濾過キット(UFV4BCG25，NMWL 10,000, Millipore）
で4mLに濃縮した。この2mLに5μmolのEDT-neoSTXを溶解
し、５℃で２日間静置した。次に同混合物をPBS(-)に対
して４回透析し、内液をneoSTX-BSA結合体溶液として回
収した。STX-BSA結合体も同様の手順で調製した。抗原
溶液中のBSA濃度は280nmの吸収により、結合PSP濃度はH
PLC蛍光法により算出した。
【００３９】実施例３
ウサギへの免疫および抗体価の測定
BSA-STX結合体を500μg/mLの濃度にPBSで希釈した。等
量のアジュバントと混合したエマルジョンを２ヶ月に
１、２回の頻度で1mLずつ、２羽のウサギ(STX-BSA-1、S
TX-BSA-2)に皮内注射した。BSA-neoSTX結合体も同様に
２羽のウサギ（neoSTX-BSA-1、neoSTX-BSA-2）に免疫し
た。免疫中ウサギより随時採血して得た血清の抗体価を
下記の手順で求めた。96wellの反応プレートの各well
に、PBS(-)に対して50μMの濃度に調製したSTX溶液を50
μLずつ分注し37℃で２時間振とうした。プレートをPBS
Tで２回洗浄後、0.3%ゼラチンを含むPBS(-)300μLを添
加して37℃で１時間振とうした。PBSTで２回洗浄後、PB
SBに対して、100倍希釈した抗血清を、50μLずつ分注
し、PBSTで３回洗浄した。37℃で１時間振とう後、PBST
で３回洗浄し、PBS(-)に対して、1000倍希釈したHRP標
識二次抗体を、100μLずつ添加した。37℃で１時間振と
う後、PBSTで４回洗浄し、発色基質溶液（OPD-H202）を
100μL添加した。37℃で３０分振とうした後、0.5N硫酸
100μLを添加して反応を停止し、マイクロプレートリー
ダーで492nmの吸収(OD）を測定した。
量のアジュバントと混合したエマルジョンを２ヶ月に
１、２回の頻度で1mLずつ、２羽のウサギ(STX-BSA-1、S
TX-BSA-2)に皮内注射した。BSA-neoSTX結合体も同様に
２羽のウサギ（neoSTX-BSA-1、neoSTX-BSA-2）に免疫し
た。免疫中ウサギより随時採血して得た血清の抗体価を
下記の手順で求めた。96wellの反応プレートの各well
に、PBS(-)に対して50μMの濃度に調製したSTX溶液を50
μLずつ分注し37℃で２時間振とうした。プレートをPBS
Tで２回洗浄後、0.3%ゼラチンを含むPBS(-)300μLを添
加して37℃で１時間振とうした。PBSTで２回洗浄後、PB
SBに対して、100倍希釈した抗血清を、50μLずつ分注
し、PBSTで３回洗浄した。37℃で１時間振とう後、PBST
で３回洗浄し、PBS(-)に対して、1000倍希釈したHRP標
識二次抗体を、100μLずつ添加した。37℃で１時間振と
う後、PBSTで４回洗浄し、発色基質溶液（OPD-H202）を
100μL添加した。37℃で３０分振とうした後、0.5N硫酸
100μLを添加して反応を停止し、マイクロプレートリー
ダーで492nmの吸収(OD）を測定した。
【００４０】実施例４
抗血清によるPSPの吸収試験
STX BSA-1およびneoSTX-BSA-1から得た血清および無免
疫のウサギから得た血清（正常血清）それぞれ50μLに1
μMのPSP各成分（C1+2，GTX1+4，GTX2+3，GTX5，STX，n
eoSTX）の標準溶液を等量混合し、5℃で15時間静置し
た。限外遠心濾過過キット（Ultrafree-MC，NMWL 5000,
Millipore）で得たろ液をHPLC蛍光法で分析した。
疫のウサギから得た血清（正常血清）それぞれ50μLに1
μMのPSP各成分（C1+2，GTX1+4，GTX2+3，GTX5，STX，n
eoSTX）の標準溶液を等量混合し、5℃で15時間静置し
た。限外遠心濾過過キット（Ultrafree-MC，NMWL 5000,
Millipore）で得たろ液をHPLC蛍光法で分析した。
【００４１】実施例５
ポリクローナル抗体を用いるPSPのELISA分析法の開発
96wellの反応プレートの各wellに、PBS(-)に対して50μ
Mの濃度に調製したSTX溶液を50μLずつ分注し、37℃で
２時間振とうした。プレートをPBSTで２回洗浄後、0.3
％ゼラチンを含むPBS(-)300μLを添加して37℃で１時間
振とうした。PBSTで２回洗浄後、PSP各成分のPBSすなわ
ちC1+2、GTX1+4、GTX2+3、GTX5、GTX6、neoSTX、dcST
X、STXをPBS(-)で0、0.1、1、10、100、1000、10000 nM
に希釈した溶液をそれぞれ50μL添加した。次いでPBSB
で200倍に希釈した抗血清(BSA-STX-1)を50μLずつ添加
して37℃で１時間振とうした。同一プレート上にPSPと
抗血清溶液を添加しないwellを用意してゼロブランク(B
o)とした。37℃で１時間振とう後、PBSTで３回洗浄し、
PBS(-)に対して、1000倍希釈したHRP標識二次抗体を、1
00μLずつ添加した。37℃で１時間振とう後、PBSTで４
回洗浄し、発色基質溶液を100μL添加した。37℃で３０
分振とうした後、0.5N硫酸100μLを添加して反応を停止
し、マイクロプレートリーダーで492nmの吸収(OD)を測
定した。試験は３連で行った。
Mの濃度に調製したSTX溶液を50μLずつ分注し、37℃で
２時間振とうした。プレートをPBSTで２回洗浄後、0.3
％ゼラチンを含むPBS(-)300μLを添加して37℃で１時間
振とうした。PBSTで２回洗浄後、PSP各成分のPBSすなわ
ちC1+2、GTX1+4、GTX2+3、GTX5、GTX6、neoSTX、dcST
X、STXをPBS(-)で0、0.1、1、10、100、1000、10000 nM
に希釈した溶液をそれぞれ50μL添加した。次いでPBSB
で200倍に希釈した抗血清(BSA-STX-1)を50μLずつ添加
して37℃で１時間振とうした。同一プレート上にPSPと
抗血清溶液を添加しないwellを用意してゼロブランク(B
o)とした。37℃で１時間振とう後、PBSTで３回洗浄し、
PBS(-)に対して、1000倍希釈したHRP標識二次抗体を、1
00μLずつ添加した。37℃で１時間振とう後、PBSTで４
回洗浄し、発色基質溶液を100μL添加した。37℃で３０
分振とうした後、0.5N硫酸100μLを添加して反応を停止
し、マイクロプレートリーダーで492nmの吸収(OD)を測
定した。試験は３連で行った。
【００４２】実施例６
ビオチン標識STXの作成
凍結乾燥状態の精製EDT-STX複合体(15μmol)を、1.4mL
の10mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解し、これに6mg（10
μmol）のBiotin-PE(AC5)2-maleimideを600μLのDMSOに
溶解したものを混合した。5℃で一晩静置後、0.05M酢酸
で5mLに定容し、３連のSepPak C18 plusカートリッジを
0.05M酢酸15mLで洗浄後、0.05M酢酸−メタノール（1:1
v/v）10mLで吸着成分を溶出した。含水酸性メタノール
溶出液に含まれるビオチン標識STXの濃度をHPLC蛍光法
で定量するとともに、同画分の毒性をマウス試験法で調
べた。
の10mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解し、これに6mg（10
μmol）のBiotin-PE(AC5)2-maleimideを600μLのDMSOに
溶解したものを混合した。5℃で一晩静置後、0.05M酢酸
で5mLに定容し、３連のSepPak C18 plusカートリッジを
0.05M酢酸15mLで洗浄後、0.05M酢酸−メタノール（1:1
v/v）10mLで吸着成分を溶出した。含水酸性メタノール
溶出液に含まれるビオチン標識STXの濃度をHPLC蛍光法
で定量するとともに、同画分の毒性をマウス試験法で調
べた。
【００４３】実施例７
蛍光標識STXの作成
6mgのPAEM-2塩酸塩（Mw253.69）を精製EDT-STX複合体
（23μmol）とともに2.3mLの50mMリン酸緩衝液中、室温
で２日間静置した。反応混合物をBio-GEL P-2のカラム
(1.5 x 20cm)に添加し、200mLでカラムを洗浄後0.1M酢
酸、次いで0.5M酢酸で吸着成分を溶出した。希酢酸溶出
液は10mLずつ分取し、各画分をHPLC蛍光法で調べPEAE-E
DT-STX結合体（蛍光標識STX）の溶出をモニターした。
単離したPAEM-EDT-STX結合体の毒性をマウス試験法で調
べた。
（23μmol）とともに2.3mLの50mMリン酸緩衝液中、室温
で２日間静置した。反応混合物をBio-GEL P-2のカラム
(1.5 x 20cm)に添加し、200mLでカラムを洗浄後0.1M酢
酸、次いで0.5M酢酸で吸着成分を溶出した。希酢酸溶出
液は10mLずつ分取し、各画分をHPLC蛍光法で調べPEAE-E
DT-STX結合体（蛍光標識STX）の溶出をモニターした。
単離したPAEM-EDT-STX結合体の毒性をマウス試験法で調
べた。
【００４４】実施例８
PSPならびにPSP−ナオール複合体の定量
供試溶液中のPSPはHPLCの蛍光法(Oshima，1995)で定量
した。溶液中の結合型PSPすなわちEDT-STX等のチオール
−PSP複合体およびタンパクに結合したPSP等の量は、溶
液の一部を、10%メルカプトエタノールを含む0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で希釈し、５分間煮沸し
た後HPLC蛍光法で分析して得られたSTX群と、メルカプ
トエタノール処理前のGTX群とSTX群の和を比較すること
により算出した。
した。溶液中の結合型PSPすなわちEDT-STX等のチオール
−PSP複合体およびタンパクに結合したPSP等の量は、溶
液の一部を、10%メルカプトエタノールを含む0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で希釈し、５分間煮沸し
た後HPLC蛍光法で分析して得られたSTX群と、メルカプ
トエタノール処理前のGTX群とSTX群の和を比較すること
により算出した。
【００４５】実施例９
マウス試験法
供試液のマウス毒性をA.O.A.C.法（Hollingworth and W
ekell, 1990）に従って求めた。ddY系雄マウス（体重２
０±１g）を使用し、１試料につき５尾のマウスを用い
致死時間の中間値からPSPの用量致死時間曲線（Sommer
and Meyer， 1937）に従って投与した毒値（mouse unit
= MU）を算出した。１MUは15分で１匹のマウスを殺す
毒量に相当する。
ekell, 1990）に従って求めた。ddY系雄マウス（体重２
０±１g）を使用し、１試料につき５尾のマウスを用い
致死時間の中間値からPSPの用量致死時間曲線（Sommer
and Meyer， 1937）に従って投与した毒値（mouse unit
= MU）を算出した。１MUは15分で１匹のマウスを殺す
毒量に相当する。
【００４６】実施例１０
PSP−タンパク結合体（抗原）の作成
図２に示す手順でBSA-EDT-STX結合体および同様の手順
で調製したBSA-EDT-neoSTX結合体を調製した。以前我々
はグルタチオン-PSP複合体をBSAに導入して抗原を作成
しているが、今回新たに作成したEDTを介する結合法に
より、より多数のPSP分子がタンパクを導入した抗原の
作成に成功した（表１）。
で調製したBSA-EDT-neoSTX結合体を調製した。以前我々
はグルタチオン-PSP複合体をBSAに導入して抗原を作成
しているが、今回新たに作成したEDTを介する結合法に
より、より多数のPSP分子がタンパクを導入した抗原の
作成に成功した（表１）。
【表１】
【００４７】実施例１１
ウサギ血清の抗体価の推移
図３にBSA-EDT-STX結合体を免疫したウサギ（STX-EDT-B
SA-1およびSTX-EDT-STX-2）の抗体価の推移を示す。２
羽のウサギとも免疫開始後３ケ月目より抗体価の有意な
上昇が認められ、４ケ月目以降の抗体価は増減を繰り返
しながら推移した。NeoSTX-EDT-STX結合体を免疫したウ
サギの抗体価もほぼ同様に推移したが、BSA-EDT-STX結
合体を免疫した場合に比べて抗体価の上昇は低かった。
いずれのウサギも免疫開始後７ケ月を過ぎた時点で全採
血し、得た血清を以下の試験に用いた。
SA-1およびSTX-EDT-STX-2）の抗体価の推移を示す。２
羽のウサギとも免疫開始後３ケ月目より抗体価の有意な
上昇が認められ、４ケ月目以降の抗体価は増減を繰り返
しながら推移した。NeoSTX-EDT-STX結合体を免疫したウ
サギの抗体価もほぼ同様に推移したが、BSA-EDT-STX結
合体を免疫した場合に比べて抗体価の上昇は低かった。
いずれのウサギも免疫開始後７ケ月を過ぎた時点で全採
血し、得た血清を以下の試験に用いた。
【００４８】実施例１２
抗血清によるPSP成分の吸収
図４にBSA-EDT-STX-1から得た血清およびBSA-neoSTX-1
から得た血清による各PSP成分の吸収量を示した。無免
疫のウサギの血清（正常血清）は1mL当たりいずれのPSP
成分も0.1nmol未満と検出限界未満であった。これに対
して BSA-STX-1血清1mLは1〜3nmolのPSPを吸収した。BS
A-neoSTX-1血清によるPSPの吸収はこれに比べ低かっ
た。
から得た血清による各PSP成分の吸収量を示した。無免
疫のウサギの血清（正常血清）は1mL当たりいずれのPSP
成分も0.1nmol未満と検出限界未満であった。これに対
して BSA-STX-1血清1mLは1〜3nmolのPSPを吸収した。BS
A-neoSTX-1血清によるPSPの吸収はこれに比べ低かっ
た。
【００４９】実施例１３
STX固相化プレート上での各PSP成分の競合
PSP成分の顕著な吸収が認められたBSA-STX-1血清を用い
て、PSPのELISAによる定量法の開発を試みた。種々検討
の結果、STXの中性リン酸緩衝液を添加して固相化した
反応プレートを用いるindirect two step法により定量
的にPSP成分を分析することが可能となった。図５に示
すようにIC50値を与える濃度はSTX、GTX2+3で４〜7nM，
neoSTX，dcSTX，GTX5，GTX1+4で30〜100nM，GTX6で約20
0nMであった。このようにPSPの成分により抗体に対する
反応性は若干異なるものの、いずれの成分に対しても同
法によりマウス試験法の10〜100倍の高感度での検出が
可能である。抗体は、プリン骨格を持つアデノシン （A
de）やカフェイン（Caf）、およびグアニジル基を持つ
アルギニン（Arg）など、PSPと部分的に構造の類似する
生体成分には全く反応しなかった（図６）。しかし興味
あることにBSA-STX-1抗体に対してPSPと同じ薬理作用を
持つフグ毒テトロドトキシン（TTX）は高濃度で交差が
認められた。
て、PSPのELISAによる定量法の開発を試みた。種々検討
の結果、STXの中性リン酸緩衝液を添加して固相化した
反応プレートを用いるindirect two step法により定量
的にPSP成分を分析することが可能となった。図５に示
すようにIC50値を与える濃度はSTX、GTX2+3で４〜7nM，
neoSTX，dcSTX，GTX5，GTX1+4で30〜100nM，GTX6で約20
0nMであった。このようにPSPの成分により抗体に対する
反応性は若干異なるものの、いずれの成分に対しても同
法によりマウス試験法の10〜100倍の高感度での検出が
可能である。抗体は、プリン骨格を持つアデノシン （A
de）やカフェイン（Caf）、およびグアニジル基を持つ
アルギニン（Arg）など、PSPと部分的に構造の類似する
生体成分には全く反応しなかった（図６）。しかし興味
あることにBSA-STX-1抗体に対してPSPと同じ薬理作用を
持つフグ毒テトロドトキシン（TTX）は高濃度で交差が
認められた。
【００５０】実施例１４
標識付きPSP誘導体の調製および比毒性
マレイミド基とスルフヒドリル基は中性水溶液中穏和な
条件下で反応し結合体を形成する。マレイミド基を持つ
種々のラベル化合物が市販されているが、本試験ではこ
れらの中からビオチンラベル試薬と水溶性の蛍光ラベル
試薬を選び、これらを導入して標識付きSTX誘導体を作
成した（図７）。これら２種の誘導体に加え、スルフヒ
ドリル基のマスキング剤であるNEMを同様の手順で導入
したNEM-EDT-STX誘導体を調製した。これら標識付き誘
導体はBio-Gel P-2等のカラムクロマトグラフィーによ
り他のPSP成分から分離することが出来た(図８)。精製し
て得た誘導体を腹膣内投与したマウスはPSPを投与した
場合と同じ症状を示して死亡した。グルタチオン−PSP
複合体（Sato et al., 2000）およびEDT-STX誘導体はST
Xの100分の1未満の比毒性しか示さなかったのに対し、E
DT-STXを出発物質とするこれら標識付きPSP誘導体は、S
TXの３０分の１ないし７分の１と、N-sulfocarbamoy1基
を持つ天然成分（C1〜4, GTX5）のそれに匹敵する比毒
性を示した（図９）。
条件下で反応し結合体を形成する。マレイミド基を持つ
種々のラベル化合物が市販されているが、本試験ではこ
れらの中からビオチンラベル試薬と水溶性の蛍光ラベル
試薬を選び、これらを導入して標識付きSTX誘導体を作
成した（図７）。これら２種の誘導体に加え、スルフヒ
ドリル基のマスキング剤であるNEMを同様の手順で導入
したNEM-EDT-STX誘導体を調製した。これら標識付き誘
導体はBio-Gel P-2等のカラムクロマトグラフィーによ
り他のPSP成分から分離することが出来た(図８)。精製し
て得た誘導体を腹膣内投与したマウスはPSPを投与した
場合と同じ症状を示して死亡した。グルタチオン−PSP
複合体（Sato et al., 2000）およびEDT-STX誘導体はST
Xの100分の1未満の比毒性しか示さなかったのに対し、E
DT-STXを出発物質とするこれら標識付きPSP誘導体は、S
TXの３０分の１ないし７分の１と、N-sulfocarbamoy1基
を持つ天然成分（C1〜4, GTX5）のそれに匹敵する比毒
性を示した（図９）。
【００５１】
【発明の効果】本発明によるBSA-EDT-STXを抗原として
調製したポリクローナル抗体は、neoSTXに対する親和性
は若干低かったが、他の麻痺性貝毒成分にはほぼ同様の
親和性を示した。本抗体を用いて試験的に作成したELIS
Aは、毒成分によって値は若干異なるものの、マウス試
験の１０〜１００倍の感度で毒を検出することができ
た。
調製したポリクローナル抗体は、neoSTXに対する親和性
は若干低かったが、他の麻痺性貝毒成分にはほぼ同様の
親和性を示した。本抗体を用いて試験的に作成したELIS
Aは、毒成分によって値は若干異なるものの、マウス試
験の１０〜１００倍の感度で毒を検出することができ
た。
【図面の簡単な説明】
【図１】麻痺性貝毒（PSP）の構造式と比毒性を示した
図である。
図である。
【図２】本発明における抗原(BSA-EDT-PSP結合体）の製
法を示した図である。
法を示した図である。
【図３】本発明におけるBSA-EDT-STX結合体を免疫した
ウサギの抗体価を推移を示した図である。
ウサギの抗体価を推移を示した図である。
【図４】抗血清によるPSPの吸収量を示した図である。
【図５】各PSP成分のSTX固相プレート上での抗STX抗体
に対する反応を示した図である。
に対する反応を示した図である。
【図６】PSP以外の成分のSTX固相プレート上での抗STX
抗体に対する反応を示した図である。
抗体に対する反応を示した図である。
【図７】本発明における非アイソトープ系標識付きPSP
誘導体の構造を示した図である。
誘導体の構造を示した図である。
【図８】蛍光標識付きSTX（PAEM-EDT-STX）のBio-Gel P
-2カラムクロマトグラフィー上での分離を示した図であ
る。
-2カラムクロマトグラフィー上での分離を示した図であ
る。
【図９】各PSP成分、PSP−チオール複合体および標識付
きPSP誘導体の比毒性を示した図である。
きPSP誘導体の比毒性を示した図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B064 AG26 CA10 DA10 DA11 DA13
4C050 AA01 BB05 CC04 DD02 EE05
FF02 GG05 HH01
4H045 AA11 AA20 AA30 CA50 DA75
EA50 FA71 GA10
Claims (10)
- 【請求項１】 サキシトキシンの１１位にスルフヒドリ
ル基を複数持つ任意のジチオール化合物を結合させて遊
離スルフヒドリル基を持つサキシトキシンスルフヒドリ
ル誘導体を調製し、他方、スルフヒドリル基指向性の官
能基をアミノ基に導入したタンパク質を調製し、次いで
上記サキシトキシンスルフヒドリル誘導体と上記修飾タ
ンパク質とを反応させて得られる抗原を非ヒト動物に免
疫し、該動物から麻痺性貝毒を認識する抗血清を得るこ
とを含む、麻痺性貝毒に対する抗体の製法。 - 【請求項２】 スルフヒドリル基を有するジチオール化
合物が、１，２−エタンジチオール、ジチオスレイトー
ル、ジチオエリスリトール、２，３−ジメルカプト−１
−プロパンスルホン酸からなる群から選択される、請求
項１に記載の抗体の製法。 - 【請求項３】 スルフヒドリル基指向性の任意の官能基
が、マレイミド、チオフタルイミド、活性ハロゲン基か
らなる群から選択される、請求項１に記載の抗体の製
法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の方法により得られる抗
体。 - 【請求項５】 請求項１に記載の製法により得られる抗
体を用いるELISA測定キット。 - 【請求項６】 サキシトキシンの１１位にスルフヒドリ
ル基を複数持つ任意のジチオール化合物を結合させて遊
離スルフヒドリル基を持つサキシトキシンスルフヒドリ
ル誘導体を調製し、他方、スルフヒドリル基指向性の任
意の官能基導入した標識化合物を調製し、次いで上記サ
キシトキシンスルフヒドリル誘導体と上記修飾標識化合
物とを反応させて得られる、麻痺性貝毒簡易結合測定法
に使用するための標識毒標品の製法。 - 【請求項７】 スルフヒドリル基を有するジチオール化
合物が、１，２−エタンジチオール、ジチオスレイトー
ル、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸か
らなる群から選択される、請求項６に記載の標識毒標品
の製法。 - 【請求項８】 スルフヒドリル基指向性の任意の官能基
が、マレイミド、チオフタルイミド、活性ハロゲン基か
らなる群から選択される、請求項６に記載の標識毒標品
の製法。 - 【請求項９】 標識化合物が、アガロース、ビオチン、
蛍光物質および金コロイドからなる群から選択される、
請求項６に記載の標識毒標品の製法。 - 【請求項１０】 請求項６記載の製法により得られる標
識毒標品。
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|---|---|---|---|
| JP2001203454A JP2003012699A (ja) | 2001-07-04 | 2001-07-04 | 抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、該抗体を用いるｅｌｉｓａ測定キット、該製法による系標識毒標品 |
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| JP2001203454A JP2003012699A (ja) | 2001-07-04 | 2001-07-04 | 抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、該抗体を用いるｅｌｉｓａ測定キット、該製法による系標識毒標品 |
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| JP2016204270A (ja) * | 2015-04-16 | 2016-12-08 | 学校法人北里研究所 | デカルバモイルサキシトキシン及びその類縁体の製造方法 |
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012526147A (ja) * | 2009-05-07 | 2012-10-25 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 疼痛の研究、画像化および治療方法、ならびに疼痛の研究、画像化および治療のための組成物 |
| JP2016204270A (ja) * | 2015-04-16 | 2016-12-08 | 学校法人北里研究所 | デカルバモイルサキシトキシン及びその類縁体の製造方法 |
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