TW200909446A - Anti-IGF antibodies - Google Patents

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200909446 九、發明說明： ' 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於過度增殖性疾病之療法，尤其係關於癌症 之療法。 【先前技術】 • 胰島素樣生長因子-1(IGF-1 ; 70個胺基酸之多肽）及胰島 - 素樣生長因子-2(IGF-2 ; 67個胺基酸之多肽）係存在於血清 中之能夠有效刺激許多哺乳動物細胞生長的7.5-kD可溶性 因子（由Pollack等人綜述，2004)。儘管可在許多組織中檢 測到IGF，但循環IGF之主要來源係肝，肝響應在垂體中引 發且經由生長激素轉導之複雜信號傳導路徑分泌IGF及IGF 結合蛋白（IGFBP)。分泌至血流中後，IGF與IGFBP形成複 合物，此不僅保護其在血清中於至其靶向組織之途中免於 蛋白水解降解，且亦防止其與IGF受體締合。除IGF之該内 分泌來源外，亦已知其以自分泌或旁分泌方式在靶向組織 本身中分泌。已知此在其中IGF在組織、骨骼及器官之生 L· 長中起重要作用的正常胎兒發育期間發生。此亦在許多癌 組織中發現，吾人認為在癌組織中存在介於腫瘤細胞與基 質細胞之間的旁分泌信號傳導或藉由腫瘤細胞本身之自分 泌 IGF產生（由 LeRoith D綜述，2003)。 吾人認為IGF之活性係藉由複合物及涉及七個不同 IGFBP及其他血清蛋白之瞭解相對較少的相互作用調節。 IGF之活化涉及其在血清結合蛋白及IGFBP之蛋白水解釋 放後自該三元複合物釋放，吾人認為此在非常接近於細胞 131397.doc 200909446 表面處發生’在此處IGF隨後可自由與其受體結合並轉導 細胞内信號，最終導致細胞增殖及細胞凋亡抑制。 及IGF-2能夠與在許多正常組織上表現之IGF_i受體（IGF_ 1R)結合，就功能而言IGF-1受體係由具有類似親和力之二 聚α-及β-亞基組成之460 kD異四聚體（Rubin等人，1995)。 IGF-2亦可與IGF-2受體（亦稱為甘露糖_6_碟酸鹽受體）結 合’該IGF-2受體不具有任何已知信號傳導功能，相反認 為其起IGF-2彙集地的作用並防止IGF_2結合IGF_1R及藉助 IGF-1R信號傳導。在該態樣中，IGF_2R已經證實為腫瘤抑 制蛋白。IGF-1R與以兩種形式IR_A&IR_B存在之胰島素受 體在結構上類似，該兩種形式胰島素受體的區別在於在 IR-A之細胞外結構域中交替剪接的1 2個胺基酸外顯子缺 失。IR-B係在大多數正常成人組織中表現之主要IR同種 型’其中其起介導胰島素對代謝之效果的作用。另一方 面，已知IR-A在發育胎兒組織而非成人正常組織中高度表 現。最近研究亦已顯示IR_A而非IR_B在一些癌症中高度表 現。IR-A中之外顯子缺失對騰島素結合無影響，但確實造 成谷許IGF-2以較IR-B高得多之親和力結合的小構象變化 (Frasca等人，1999 ; pandini等人，2002)。因此，由於其 在癌組織中之表現及增加IGf_2結合之傾向，所以汛_八在 介導IGF-2於癌症中之促有絲分裂效果中可能與IGF1_R一 樣重要。 IGF與IGF- 1R之結合引發複雜的細胞内信號傳導級聯， 此導致刺激生長及抑制細胞凋亡之蛋白質活化（由p〇Uack 131397.doc 200909446 等人綜述，2004)。就生長而言，經正調節之轉譯係藉由 p70 S6激酶活化誘導，其又磷酸化S6核糖體蛋白（Dufner及 Thomas，1 999)。因此，經IGF刺激之細胞生長可藉由經填 酸化之S 6核糖體蛋白的快速增加量測。 與EGFR及Her2neu受體不同，在癌症中無IGF1-R或IR-A ' 受體之已知擴增，此表明受體活化係藉由存在活性配體控 ' 制。存在非常大量的暗示IGF在許多不同癌症類型之發 生、進展及轉移中起作用的科學、流行病學及臨床文獻 Π (由 Jerome等人，2003 ;及Pollack等人，2004綜述）。 例如，在結腸直腸癌中，與鄰近正常組織相比，在臨床 結腸直腸腫瘤標本中IGF-2 mRNA及蛋白質之表現升高 (Freier等人，1999 ; Li等人，2004)。在患有結腸直腸贅瘤 之患者中升高之IGF血清含量與增殖細胞指數亦存在正相 關性（Zhao等人，2005)。另外，升高之IGF-2循環含量與發 生結腸直腸癌及腺瘤之增加風險相關（Renehan等人， 2000a)及b) ; Hassan等人，2000)。IGF-2基因之親本印記 I 丟失（LOI)係導致IGF-2表現升高之表觀遺傳改變，其係最 近已在患有結腸直腸及其他腫瘤類型之患者中識別出的可 . 遺傳分子特徵。已顯示IGF-2印記丟失會引起結腸直腸贅 瘤（Cui 等人，2003 ; Cruz-Correa 等人，2004)及腺瘤 (Woodson等人，2004)之5倍風險。已顯示，靶向阻斷IGF 結合且使受體内在化之IGF-1R之α-亞基的抗體會延遲異種 移植結腸癌衍生細胞系（例如COLO 205)生長（Burtrum等 人，2003)。 131397.doc 200909446 IGF含量升高與人類肺腺癌之較差預後有關（Takanami等 人，1996)且許多SCLC-及NSCLC-衍生細胞系表現及分泌 IGF(Quinn等人，1996)。在鼠科動物模型中，IGF-2之轉 基因過表現誘導自發肺腫瘤（Moorhead等人，2003)。就肝 細胞癌（HCC)而言，HCC之人類臨床標本及動物模型比對 ' 應正常組織表現較高含量之IGF mRNA及蛋白質且此與增 ' 加之腫瘤生長有關（Wang等人，2003 ; Ng等人，1998)。亦 已顯示IGF-2係HCC之血清學標記，與對照相比在HCC患 Ο 者之血清中其含量升高（Tsai等人，2005)。使用Hep 3B細 胞建立HCC之常位異種移植物腫瘤模型，且用以證實使用 經甲基化之寡核苷酸抑制IGF-2表現可提高存活率（Yao等 人，2003 a)及 b))。 諸如尤因肉瘤（Ewing sarcoma)及橫紋肌肉瘤等許多兒童 實體腫瘤之生長似乎尤其依賴IGF信號傳導路徑（Scotlandi 等人，1996)。已暗示IGF-2基因之LOI係胚胎型橫紋肌肉 瘤發展中之主要基因事件（Fukuzawa等人，1999)。亦認為 自分泌IGF信號傳導在以下情形下強烈影響尤因肉瘤生 長：第1型EWS-FLI1嵌合轉錄因子係藉助導致升高之包括 IGF配體及IGF-1R之靶向基因表現及降低之IGFBP-3表現 的染色體易位表現。已顯示靶向IGF-1R之抗體及小分子化 合物可減弱異種移植兒科實體腫瘤衍生細胞系之生長 (Kolb等人，2008 ; Manara等人，2007) ° 已證實，使用IGF配體特異性抗體可抑制人類前列腺癌 細胞在植入SCID小鼠中之成年人類骨骼中之生長（Goya等 131397.doc 200909446 人，2004)。另外，經證實相同IGF配體抗體可阻斷IGF之 旁分泌供給並在氣科動物異種移植物系統中抑制人類結腸 直腸癌細胞之肝轉移（Miyamoto等人，2005)。 亦有相當多之證據表明IGF信號傳導系統可降低癌症對 化學治療劑及放射之靈敏性。該態樣中之一個最早發現係 以下證實：IGF- 1R基因剔除小鼠胚胎難以被病毒、癌基因 及過表現生長因子受體轉化（Sell等人，1993 ; Sell等人， 1994)及IGF-1R過表現可保護細胞免於UV照射及γ放射誘 (' 導之細胞凋亡（Kulik等人，1997)。而且，已發現，使用分 泌大量IGF-2之肝腫瘤細胞系，中和IGF-2可顯著增加活體 外對諸如順銘及依託泊普（etoposide)等化學治療劑（尤其以 較低之細胞生長抑制劑量）之反應，此表明IGF-2可降低對 化學治療劑之敏感性（Lund等人，2004)。與該等發現一致 的是，已證實靶向IGF-1R之抗體可增加腫瘤異種移植物對 藉由化學治療藥物及放射之生長抑制的敏感性（Goetsch等 人，2005)。 l j 已報導多種顯示與人類IGF-1及人類IGF-2交叉反應性結 合的抗體。抗體sm 1.係在人類IGF-1下培育且顯示對人類 IGF-2之40%交叉反應性且顯示可抑制經20 ng/ml人類IGF-1刺激之小鼠纖維母細胞細胞系BALB/c3T3的增殖（Russell 等人，1984)。在經設計以藉由培育單株抗體將IGF-1功能 性抗原決定部位映射到完整IGF-1蛋白質及該蛋白質之各 部分之研究中，已識別出多種與IGF-2交叉反應之抗體 (Manes等人，1997)。與IGF-2之交叉反應性百分比介於〇 131397.doc -10- 200909446 至800%範圍内且數種抗體經識別與IGF_ 1及1(^_2之反應性 相同。KM1486係與人類IGFM&IGF_2交又反應之大鼠單 株抗體且已證實KM1486可抑制人類前列腺癌細胞在植入 非肥胖型糖尿病/重症聯合免疫缺陷小鼠中之人類成人骨 骼中之生長（Goya等人，2004)。另外，已證實ΚΜΐ48ό可 抑制人類結腸直腸癌之肝轉移（Miyam〇t〇等人，2〇〇5)。 KM1486 亦闡述於 W0 〇3/〇93317、日本專利第 2〇〇3_31〇275 號、WO 2005/018671、WO 2005/028515 及 WO 2005/ 027970中。 對於治療人類疾病，高度期望具有完全人類序列之抗體 以使產生人類抗-抗體反應及中和抗體之風險最小化，產 生人類抗-抗體反應及中和抗體會快速消除體内所投與之 抗體且由此降低治療效果。因此，且鑒於jGFq及IGF_2依 賴性仏號傳導在癌症發生及進展中之作用，吾人期望獲得 可共中和兩種配體之促有絲分裂效果的高親和力完全人類 抗體。 另外’為使該抗體之治療潛能最大化，具有適宜長的終 末半衰期（TW2)甚為重要。在於人類個體中測定終末半衰 期之如，可自投與至非人類靈長類動物（例如食蟹猴）獲得 抗體人類終末半衰期之最準確估計。例如，貝伐單抗 Cbevacizumab) ’ 一種已註冊之用於治療數種人類癌症之對 抗血管内皮生長因子（VEgf)的人類化單株抗體，其在食蟹 猴中之終末半衰期為8.57 ± 0.3 8天（Lin等人，1999)，在人 類中轉變為約20天終末半衰期，容許每隔兩週單獨投與一 131397.doc 11 200909446 次（Lu 等人，2008)。 本發明之又一目的係獲得不影響胰島素與其受體之結合 的抗體。 治療劑之臨床發展係藉由藥物活性之藥效生物標記支 持。靶向IGF-1R之抗體的臨床研究已證實總血清1(}1?_1含 量增加可為該等藥劑之有用藥效標記（p〇Uack等人， 2007)。總血清IGF-1含量增加之原因可能歸於涉及自肝中 釋放IGF-1及IGFBP二者之腦垂體生長激素（GH)分泌之反 饋機制。實際上，在人類中，已證實僅佔總IGF_丨含量之 約1 %的游離或生物活性IGF-1決定反饋反應（chen等人， 2005)。因此，發明者們設法確定總血清含量是否亦 為冶療性抗-IGF抗體活性之有用藥效標記。既然如此，吾 人將期望該抗體與來自適宜動物物種（例如小鼠或大鼠）之 IGF交又反應以在臨床前已對藥效效果予以測試。 【發明内容】 本發明係關於經分離人類抗體分子，其 a) 與人類IGF-1及IGF-2結合以 i)阻止IGF-1及IGF-2與IGF-1受體結合及 u)抑制IGF-1受體介導之信號傳導， b) 與鼠科動物及大鼠IGF-1及IGF-2結合， c) 不與胰島素結合， d) 不影響藉由胰島素與胰島素受體結合介導之胰島素促 有絲分裂特性。 心中疋義之該抗-IGF抗體分子的特性之特徵在於該抗- 131397.doc -12· 200909446 IGF抗體分子分別對IGF-1及IGF-2之親和力係其對胰島素 之親和力之1000倍以上的事實。即使在非常高劑量（例如 大於1 00 mg/kg，此遠遠超過療法所考慮之任何濃度）下不 完全排除弱結合，該抗-IGF抗體分子在治療劑量下亦不與 胰島素結合。 除其抑制IGF-1受體介導之信號傳導之能力外，本發明 抗體較佳亦具有藉助胰島素受體IR-A抑制IGF-2誘導之信 號傳導的能力。 【實施方式】 在下文中，與人類IGF-1及IGF-2結合且具有如上文所定 義之額外特性之本發明抗體分子稱為"抗-IGF抗體分子”。 術語”抗-IGF抗體分子"涵蓋人類抗-IGF抗體、抗-IGF抗 體片段、抗-IGF抗體樣分子及與任何上文所提及抗體分子 之結合物。在本發明含義中，抗體包括但不限於單株、嵌 合單株及雙-或多特異性抗體。術語"抗體"將涵蓋由淋巴細 胞產生且例如存在於血液血清中之完整免疫球蛋白、由雜 交瘤細胞系分泌之單株抗體、藉由在宿主細胞中重組表現 產生之具有免疫球蛋白或單株抗體之結合特異性的多肽、 及藉由進一步處理同時保留該等免疫球蛋白、單株抗體或 多肽之結合特異性而衍生自該等免疫球蛋白、單株抗體或 多肽之分子。 具體而言，術語”抗體分子”包括包含兩條重鏈及兩條輕 鏈之完整免疫球蛋白，較佳為完全人類抗體。

在又一態樣中，該抗體分子係具有抗原結合區之抗-IGF 131397.doc -13 - 200909446 抗體-片段。為獲得抗體片段（例如Fab片段），可藉助常規 技術（例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶）來完成消化。木瓜 蛋白酶消化之實例闡述於W〇 94/29348及美國專利第 4,342,566號中。抗體之木瓜蛋白酶消化一般產生兩個相同 之抗原結合片段（所謂Fab片段，每一具有單個抗原結合位 點）及殘留Fc片段。胃蛋白酶處理可產生F(ab，）2片段該片 段具有兩個杬原結合位點且仍能夠交聯抗原。抗體片段亦 可藉由生成各自編碼DNA片段之分子生物學方法產生。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結 構域（CHO。Fab'片段因在重鏈CHi結構域之羧基端含有額 外殘基而與Fab片段有所不同，該等殘基包括一或多個來 自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。本文中Fabi_SH特指其中恆定 結構域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab,。F(ab,)2抗 體片段起初形成時係二者之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab，片 段對。 如Zapata等人，1995中所述，包括單鏈抗體及線性抗體 之抗原結合抗體片段或抗體樣分子在單個多肽上可包含可 變區，單獨或與以下之全部或部分組合：輕鏈之恆定結構 域、CH1、鉸鏈區、CH2及CH3結構域，例如所謂"SMIp" (小模塊免疫藥物（Small Modular Immunopharmaceutical)"), 其為使用單個多肽鏈作為其結合結構域以之抗體樣分子， 其與缺之恆定結構域CH1之單鏈鉸鏈及效應器結構域連接 (WO 02/056910)。SMIP可以單體或二聚體形式製備，但其 不呈現傳統抗體之二聚體之二聚體結構。亦包括在本發明 131397.doc •14- 200909446 中者係包含可變區與輕鏈之恆定結構域區域、VH1、 CH1、鉸鏈區' CH2及CH3結構域之任何組合的抗原結合 片段。 該等抗體片段或抗體樣分子可含有所有或僅一部分恆定 區，只要其展示與IGF-1/IGF-2抗原相關部分之特異性結合 ' 即可。若不期望諸如補體結合或抗體依賴性細胞毒性等效 ' 應器功能，則恆定區類型及長度之選擇主要端視抗體蛋白 之期望藥理學特性而定。該抗體分子一般為由兩個輕鏈/ Ο 重鏈對組成之四聚體，但亦可為二聚體，即由輕鏈/重鏈 對組成，例如Fab或Fv片段，或其可為單體單鏈抗體 (scFv)。 該等抗-IGF抗體樣分子亦可為單結構域抗體（與所謂”奈 米體”類似），其在單Ig樣結構域中含有抗原結合位點（闡述 於（例如）WO 03/05053 1及Revets等人，2005中）。抗體樣分 子之其他實例係免疫球蛋白超家族抗體（IgSF ; Srinivasan 及Roeske，2005)或含有CDR或CDR移植分子或"結構域抗 ^ 體"（dAb)。dAB係抗體之功能結合單元，對應於人類抗體

重鏈（VH)或輕鏈（VL)之可變區。結構域抗體之分子量約為 1 3 kDa或小於全長抗體尺寸之十分之一。已發展一系列完 全人類VH及VL dAb之大的及高功能文庫。dAB亦可用於 "雙靶向''，即dAb除與IGF-1/IGF-2結合外，亦與一個分子 中之其他靶標結合。dAb文庫、選擇及篩選方法、用於雙 靶向及賦予延長血清半衰期之dAb形式闡述於（例如）美國 專利第 6,696,245 號、W0 04/058821、W0 04/003019及 WO 131397.doc -15- 200909446 03/002609 t ° 一般而言，抗體片段及抗體樣分子充分表現於細菌、酵 母及哺乳動物細胞系統中。 在較佳實施例中，本發明抗-IGF抗體係包含兩條重鏈及 兩條輕鏈之完全人類重組完整抗體。 在較佳實施例中，該抗-IGF抗體分子係具有包含胺基酸 序列8£〇10>10:3之重鏈00113的命名為40186的抗體。 抗體40186具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6之輕鏈 l·lCDR3。抗體40186進一步具有包含胺基酸序列SEQIDNO: 1之重鏈CDR1及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2之重鏈 CDR2。抗體40186進一步具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4之輕鏈CDR1及包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之輕鏈 CDR2。 抗體40 186具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之可變重 鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 16之可變輕鏈（該序列可 在其〇端含有額外Gin)。 j 在又一較佳實施例中，該抗-IGF抗體分子係具有包含胺 基酸序列SEQ ID NO:9之重鏈CDR3的命名為40183的抗 .體。 抗體401 83具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之輕鏈 CDR3。抗體40183進一步具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 7之重鏈CDR1及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 8之重鏈 CDR2。抗體40 183進一步具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10之輕鏈CDR1及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 11之輕鏈 131397.doc •16- 200909446 CDR2。 抗體40183具有包含胺基酸序列SEq ID N〇: 18之可變重 鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之可變輕鏈（該序列可 在其C-端含有額外Gin)。 單株抗體之CDR("互補決定區"）應理解為按照Kabat等 人，1991連同Chothia及Lesk，1987與特異性抗原結合有關 之彼等胺基酸序列。 可在癌症異種移植物模型中證實，本發明抗體可用於治 C療人類疾病。 本發明抗體與鼠科動物及大鼠之交又反應性容許 在該等物種中檢驗其内分泌效果，例如對生長激素路徑之 效果。觀察到的該等抗體對總WF—i含量之藥效效果係有 用之藥效標記，該藥效效果可能緣於移除游離IGF_丨，此 會通過生長激素路徑達成反饋調節從而使肝分泌 及IGFBP3增加。該標記在動物物種中之可利用性（此容許 (] 在藥物研發初期測定劑量/效果關係）有助於準備I期臨床研 究，其中除PK分析外，亦監測患者中總IGF1及IGFBP3含 量之藥效反應。 本發明抗體之另一優點係其優異半衰期；已顯示抗體 40186在食蟹猴中之半衰期介於1〇7±16天（i mg/kg)至 12±1.4 天（10 mg/kg)範圍内。 本發明抗-IGF抗體分子亦可為序列表中所示胺基酸序列 所定義之抗體變體。本發明亦包括該等多肽之變體的抗 體。使用常規可得之技術，熟習此項技術者將能夠製備二 131397.doc -17- 200909446 測試或使用抗體40183及40186之功能變體。實例係CDR及/ 或框架中至少一個位置經改變之變體抗體、框架區（其中 存在一個種系序列之偏差）具有單個胺基酸取代之變體抗 體、具有保守胺基取代之抗體、由在嚴格條件下與編碼 40183或40186之抗體可變鏈之序列表中所呈現之dn A分子 雜交的DNA分子編碼之抗體、40183及40186之經功能相等 密碼子最佳化之變體。 變體亦可藉由使用本發明抗體作為最佳化之起始點，及 〇 使一或多個胺基酸殘基（較佳一或多個CDRs肀之胺基酸殘 基）多樣化’及藉由自所得抗體變體集合中篩選具有改良 特性之變體而獲得。尤佳係可變輕鍵之CDR3、可變重鍵 之CDR3、可變輕鏈之CDR1及/或可變重鏈之CDR2中之一 或多個胺基酸殘基多樣化。多樣化可藉由此項技術中已知 之方法達成，例如WO 2007/042309中所提及之所謂TRIM 技術。 由個別胺基酸之特性，可實施合理取代以獲得保存抗體

CJ J 40183或40186之總體分子結構的抗體變體。例如，胺基酸 取代（即"保守取代”）可基於各自胺基酸在極性、電荷、可 溶性、疏水性、親水性及/或兩親性性質方面的相似性實 施。熟習此項技術者熟悉通常實踐之胺基酸取代（如（例 如）WO 2007/042309中所述）及用於獲得由此經修飾之抗體 的方法。鑒於基因代碼及重組及合成DNA技術，可常規設 計編碼具有一或多個保守胺基酸交換之變體抗體之DNA分 子且容易地獲得各自抗體。在一個尤佳實例中，可變重鍵 131397.doc -18- 200909446 (SEQ ID NOS: 14及18)中之胺基酸位置3已自q(其係在今 位置上之天然存在胺基酸）改變成E ;在於本發明範圍内之 變體抗體中，E可改變回Q。 與本發明抗體40183或40186相比，較佳之抗體變體在 CDR區具有至少60%、更佳至少70%或80%、仍更佳至少 90%且最佳至少95%之序列一致性。較佳抗體在CDR區亦 具有至少80% '更佳90%且最佳95%之序列相似性。較佳 之抗體變體在可變區具有至少60%、更佳至少7〇%或 8 0%、仍更佳至少90%且最佳至少9 5 %之序列一致性。較 佳抗體在可變區亦具有至少80%、更佳90%且最佳95%之 序列相似性。 (兩個多肽序列間之”序列一致性11表示兩個序列間相同胺 基酸之百分比。”序列相似性"表不相同或代表保守胺基酸 取代之胺基酸的百分比。） 在又一實施例中，本發明抗-IGF抗體分子係"親和力成 熟”抗體。 "親和力成熟”抗-IGF抗體係衍生自親本抗_igf抗體（例如 40186或40183)之抗-IGF抗體，其在一或多個CDR中具有 一或多個使與各自親本抗體相比對抗原之親和力改良之改 變。一種用於產生該等抗體突變體之程序涉及噬菌體展示 (Hawkins 等人，1992 ;及 Lowman 等人，1991)。簡言之， 使若干超變區位點（例如，6至7個位點）發生突變以在每一 位點產生所有可能之胺基酸取代。如此產生之抗體突變體 當融合至包裹於每一顆粒中之M13的基因in產物時以單價 131397.doc •19- 200909446 形式自絲狀噬菌體顆粒展示出來。隨後就本文所揭示之突 變體生物活性（例如結合親和力）對經噬菌體展示之突變體 加以篩選。 親和力成熟抗體亦可藉由以下所述之方法產生：例如， Marks等人，1992，（藉由可變重鏈（VH)及可變輕鏈（VL)結 構域混編之親和力成熟（affinity maturation by variable heavy chain (VH) and variable light chain (VL) domain shuffling))，或 Barbas 等人，1994 ; Shier 等人，1995 ; C 5 Yelton 等人，1995 ; Jackson 等人，1995 ;及 Hawkins 等 人，1992，（CDR及/或框架殘基之隨機誘變（random mutagenesis of CDR and/or framework residues))。車交佳之 親和力成熟抗體將對靶抗原具有毫微莫耳或甚至皮莫耳之 親和力。 親和力成熟抗-IGF抗體亦可藉由最近由MorphoSys引入 之RapMATTM技術獲得。RapMAT™代表用於快速選擇高親 和力抗體之嵌入親和力成熟方法。該技術之基本原理係 I’ MorphoSys之HuCAL技術之模塊概念（Knappik等人， 2000)。在HuCAL文庫互補決定區（CDR)中，互補決定區定 . 義抗體之結合位點且因此其結合特異性靶分子之能力可在 簡單選殖步驟中容易地交換。使用RapMAT™，使用兩輪 標準選擇後之未經定性分析之多株產物且藉由插入預建立 之CDR盒文庫增加多樣性。此與其中選擇單個候選抗體並 藉由隨後CDR交換使其成熟的HuCAL之標準成熟方法相 反。隨後在高度嚴格條件下應用兩輪進一步選擇來選擇高 131397.doc -20- 200909446 親*和力抗體。此最終達成直接選擇對於抗體靶分子具有高 達40倍之增加之親和力的抗體。 本發明亦係關於編碼本發明抗-IGF抗體分子之DNA分 子。該等序列包括但不限於彼等編碼抗體4〇 183及40186之 如以下序列表中所示之DNA分子：SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO:15 ’分別編碼抗體4〇186之可變重鏈及輕鏈；seq ID NO:17及SEQ ID NO:19 ’分別編碼抗體40183之可變重 鍵及輕鏈；編碼可變輕鏈之SEq ID NO: 15及SEQ ID N〇.19可在其3’末端含有Gin之額外密碼子。 因此’本發明亦係關於如WO 2007/042309中所定義與序 列表中所陳述之DNA分子在高度嚴格結合及洗滌條件下雜 交之核酸分子，其中該等核酸分子編碼特性與抗體40183 或40186相當或優於抗體40183或40186之抗體或其功能片 丰又。較佳分子（就mRN A而言）係彼等與本文所述dn A分子 之一具有至少75°/。或80%(較佳至少85%、更佳至少9〇%且 隶佳至少95%)同源性或序列一致性之分子。 在本發明範圍内之再一 DNA變體種類可參閱其編碼之多 肽予以定義。該等DNA分子就其序列而言偏離彼等繪示於 序列表（SEQ ID NO : 13、15、19及2〇)中之DNA分子，但 由於基因代碼之簡併性其分別編碼具有抗體4〇183或4〇186 之相同胺基酸序列的抗體。舉例而言，鑒於在真核細胞中 表現抗體40183或40186，編碼可變輕鏈之最後三個胺基酸 之SEQ ID ΝΟ:1 9及17的各自最後九個核苷酸經設計以與真 核細胞中之密碼子使用匹配。若期望在大腸桿菌（五二⑴ 131397.doc -21 - 200909446 中表現該等抗體，則該等序列可經改變以匹配大腸桿菌密 碼子使用（例如，如SEQ ID N〇:19及15中所示，GTT CTT GGC 而非 GTC CTA GGT)。 本發明之DNA分子變體可如w〇 2007/0423 09中所述以數 種不同方式構建。 為產生本發明之重組抗_IGF抗體分子，將編碼全長輕鏈 及重鏈或其片段之DNA分子（cDNA及/或基因組J3NA)插入 至表現載體中以使該等序列與轉錄及轉譯控制序列可操作 C-1 地連接。 表現載體包括質粒、逆轉錄病毒、黏粒、EBV衍生附加 體及諸如此類。所選表現載體及表現控制序列應與所用宿 主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入至單 獨載體中。在某些實施例中，將兩個DNA序列插入至相同 表現載體中。適宜載體係彼等如上所述編碼功能完整人類 CH或CL免疫球蛋白序列之經設計具有合適限制位點以使 任何VH或VL序列皆可容易地插入及表現者。在抗體糾丨以 及40186情形下，對於抗體輕鏈，恆定鏈通常為<或人，對 於抗體重鏈，不加限制其可為任何IgG同種型（IgGi、

IgG2、IgG3、IgG4)或包括等位基因變體之其他免疫球蛋 白。 重組表現載體亦可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信 號肽。可將編碼抗體鏈之DNA選殖至載體中以便在構架中 使信號肽連接至成熟抗體鏈DNA之胺基端。信號肽可為免 疫球蛋白心號肽或來自非免疫球蛋白蛋白質之異源性肽。 131397.doc -22. 200909446 或者’編碼抗體鏈之DNA序列可已經含有信號肽序列。 除該等抗體鏈舰序列外，重組表現载體可攜帶調節序 列’該等調節序列包括啓動子、增強子、終止及多腺普酸 化信號及控制抗體鏈在宿主細胞中之表現的其他表現控制 兀件。啓動子序列(以在哺乳動物細胞中表現為例示)之實 例係衍生自（CMV)(例如CMV猴腎病毒4〇 (s V4〇)(例如s㈣ 啓動子/增強子））、腺病毒（例如，腺病毒主要晚期啓動子 (AdMLP))之啓動子及/或增料、諸如天然免疫球蛋白及 肌動蛋白啓動子等多瘤及強哺乳動物啓動子。多腺苦酸化 信號之實例係BGH P〇lyA、”4〇晚期或早期p〇lyA ;或 者’可使用免疫球蛋白基因之3，UTR等。 重組表現載體亦可攜帶調節載體在宿主細胞中之複製 (例如複製起點）的序列及可選標記基因。可按照熟習此項 技術者所熟知之轉染方法（包括脂質體介導之轉染、聚陽 離子介導之轉染、原生質體融合、微注射、磷酸鈣沈澱、 電穿孔或藉由病毒載體轉移）將編碼抗_IGF抗體之重鏈或 其抗原結合部分及/或輕鏈或其抗原結合部分的核嘴分子 及包含該等DNA分子之載體引入至宿主細胞中，例如細菌 細胞或高等真核細胞（例如哺乳動物細胞）。 可用作用於表現之宿主之哺乳動物細胞系已為熟習此項 技術者所熟知且包括（尤其）中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞、 NSO、SP2/0細胞、海拉細胞（HeLa cell)、幼倉鼠腎（βηΚ) 細胞、猴腎細胞（COS)、人類癌細胞（例如，Hep G2)、 A549細胞、3T3細胞或任何該等細胞系之衍生物/子代。可 131397.doc -23- 200909446 使用包括但不限於人類、小鼠、大鼠、猴子及齧齒類動物 細胞系之其他哺乳動物細胞、或包括但不限於酵母、昆蟲 及植物細胞之其他真核細胞或諸如細菌等原核細胞。本發 明抗-IGF抗體分子係藉由將該等宿主細胞培養足以容許該 抗體分子在該等宿主細胞中表現之時間段來產生。 抗體分子較佳自培養基中以分泌多肽形式回收或若（例 如）在無分泌信號下表現則其可自宿主細胞裂解液中回 收。需要使用用於重組蛋白質及宿主細胞蛋白質之標準蛋 白質純化方法以可獲得抗體之基本均質製劑的方式對該等

柷體分子實施純化。舉例而言，可用於獲得本發明抗_IGF 抗體分子·^先前技術純化方法包括（作為第-步驟）自培養 基或裂解液中移除細胞及/或微粒細胞碎片。隨後藉由（例 如）在免疫親和力或離子交換管柱上分級分離、乙醇沈 澱反相HPLC、葡聚糖凝膠層析法、矽石或陽離子交換 樹月旨上之層析法將抗體中之雜質可溶性蛋白f、多肽及核 酸除去。作為用於獲得抗·IGF抗體分子製劑之方法中之最 後v驟可如下文所述將該經純化之抗體分子乾燥（例如 凍乾）以用於治療應用。 在又態樣中，本發明係關於含有本發明抗_IGF抗體分 子作為活性成份之醫藥組合物。 為用於治療，將該抗_1(?1?抗體包括至適於有助於投與至 動物或人類+之醫藥組合物中。該抗-IGF抗體分子之典型 調配物可藉由將該抗_IGF抗體分子與生理學上可接受之載 W賦形蜊或穩定劑以凍乾或其他乾燥調配物或水溶液或 131397.doc -24· 200909446 水性或非水性懸浮液形式混合 σ叩展備。載劑、賦形劑、改 性劑或穩定劑在所用劑量及濃度 展復下無毒性。其包括諸如磷

酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他無機或有機酸及並睡等緩 衝液系統；包括抗壞血酸及甲硫胺酸之抗氧化劑；防腐劑 (例如十八院基二甲基节基氯化錢；氯化六f雙錢；苯紫 亂録、节索氯銨；苯齡、丁基或节基醇；諸如對經基苯甲 酸甲醋或對經基苯甲酸丙酯等對經基苯甲酸烧基醋；鄰苯 -盼；間苯二酴；環己醇；3_戊醇；及間甲紛)；諸如血清 白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質；諸如聚乙烯㈣ 咬酮或聚乙二醇（PEG)等親水性聚合物；諸如甘胺酸、麵 ，醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸等胺基酸； 單糖、二糖、寡糖或多糖及包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、 海藻糖、糊精或葡聚糖之其他碳水化合物；諸如edta等 餐合劑；諸如甘露醇或山梨醇等糖醇；豸如鈉等鹽形成抗 衡離子；金屬錯合物（例如，Zn_蛋白質錯合物）；及/或諸 如丁ween™(聚山梨醋）、plur〇nicstm或脂肪酸醋、脂肪 酸鱗或糖S旨等離子型或非離子型表面活性劑。諸如乙醇或 異丙醇等錢溶劑亦可含有纟該抗體調配物中。賦形劑亦 可具有釋放改性或吸收改性功能。 /亥等抗-IGF抗體分子亦可經乾燥(冷凍乾燥、噴霧乾 燥 '喷霧冷;東乾燥、藉助近臨界或超臨界氣體乾燥、真空 G、〃、空氣乾燥）、沈澱或結晶或俘獲於微膠囊、膠體藥 物遞送系統（例如’脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈 只顆粒及毫微型膠囊）、粗滴乳液中或（例如）藉由技術 131397.d〇, •25· 200909446 (蛋白質塗覆微晶）沈澱或固定於載劑或表面上，該等微膠 囊係藉由（例如）凝聚技術或界面聚合分別使用（例如）經甲 基纖維素或明膠及聚-(曱基丙烯酸曱酯）製備。該等技術揭 示於 Remington，2005 中。 自然，用於活體内投與之調配物必須無菌；殺菌可藉由 適宜技術完成’例如藉由藉助無菌過濾膜過渡。 增大該抗-IGF抗體之濃度以達成所謂高濃度液體調配物 (HCLF)可能有用；已闡述多種產生該等hclf之方式。 該抗-IGF抗體分子亦可含於緩釋製劑中。該等製劑包括 疏水性或親水性聚合物之固體、半固體或液體基質，且可 呈諸如薄膜、棒或微膠囊等成型物件形式且可經由施用裝 置施用。缓釋基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚（曱 基丙烯酸-2-羥基乙酯或乙酸丁酸蔗糖酯）或聚（乙烯醇））、 聚交酯（美國專利第3,773,919號）、L·麩胺酸與^麩胺酸γ乙 酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、諸如lUPR〇n DEPOT™(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林構成之可 注射微球體）等可降解之乳酸·乙醇酸共聚物、及聚_D_(+ 3笔基丁 S文儘管諸如乙烯-乙酸乙稀酯及乳酸-乙醇酸等 聚合物可使分子釋放超過1〇〇天，但某些水凝膠釋放蛋白 貝時間較短。當囊封之抗體長時間停留於體内時，在3 7。〇 下暴露於潮濕環境中會使其變性或聚集，導致生物活性損 失及免疫原性之可能改變。端視所涉及機制可設計合理策 略以保持穩定性。舉例而言，若發現聚集機制係經由硫代 二硫化物互換形成分子間s_s鍵，則穩定性可藉由修飾疏 131397.doc •26- 200909446 基殘基 '自酸溶液凍乾（例如如WO 89/0 1 1 297中所述）、控 制水分含量、使用合適添加劑及形成特定聚合物基質組合 物而達成。 亦可用於本發明抗-IGF抗體分子之調配物闡述於美國專 利第7,060,268號及美國專利第6,991，790號中。 亦可以其他施用形式納入該IGF抗體，例如分散液、懸 浮液或脂質體、錠劑、膠囊、粉劑、噴霧劑、有或無滲透 加強裝置之經皮或皮内貼劑或乳膏、粉片、鼻、口腔或肺 調配物’或可藉由植入細胞或-基因療法後_藉由個體自身 細胞產生。 抗-IGF抗體分子亦可經諸如聚乙二醇（peg)、甲基或乙 基、或碳水化合物基團等化學基團衍生化。該等基團可用 於改良抗體之生物特徵，例如延長血清半衰期或增加組織 結合。 施用之較佳方式係藉由輸注或注射（靜脈内、肌内、皮 下、腹膜腔内、皮内）之非經腸施用方式，但亦可採用諸 如吸入、經皮、鼻内、含服、經口等其他施用方式。 在較佳實施例中，本發明醫藥組合物含有10 mg/ml濃度 之抗-IGF-抗體（例如抗體40186)且進一步包含25 mM檸檬 酸鈉 pH 6、115 mM NaCn、0.02 % Tween(聚山梨醋 20)。 對於預防或治療疾病，抗體之合適劑量將端視以下而 定：擬治療疾病之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗 體之目的係預防抑或治療、先前療法、患者臨床史及對抗 體之反應以及主治醫師之決定。該抗體係一次性地或經一 131397.doc •27- 200909446 系列治療適當地投與至患者。 端視疾病類型及嚴重程度，約1 Mg/kg至15 mg/kg(例 如’ 0.1-20 mg/kg)抗體係投與至患者之初始候選劑量，無 响（例如）藉由或夕次分開投與或藉由連續輸注投與。端 視上文所提及之因素而定，典型日劑量可介於約i叫~至 _ mg/kg或更高範圍内。對於歷經數天或更長時間之重 複投與，端視病狀，治療應持續到出現疾病症狀之期望抑 帝i狀況為止。然而，可使用其它劑量方案。該療法之進程 可谷易地藉由習用技術及分析法予以監測。 擬投與抗體之"治療有效量”係預防、改善或治療疾病或 病症所需要之最小量。 本發明抗-IGF抗體分子及含有其之醫藥組合物可用於治 療過度增殖性病症。 在某些實施例中，該過度增殖性病症係癌症。 以兩種方式對癌症進行分類：藉由癌症起源之組織類型 (組織學類型）及藉由癌症首先發生之基本位點或身體部 位。發生癌症之最常見位點包括皮膚、肺、乳房、前列 腺、結腸及直腸、子宮頸及子宮。 本發明抗-IGF抗體分子可用於治療包括但不限於以下之 多種癌症： • AIDS相關癌症，例如卡波西氏肉瘤（Kap〇si，s sarc〇ma); •骨絡相關癌症’例如尤因家族腫瘤及骨肉瘤； •腦相關癌症，例如成人腦腫瘤、兒童腦幹神經膠質瘤、 兒童小腦星形細胞瘤、兒童大腦星形細胞瘤/惡性神經 131397.doc •28- 200909446 '兒童幕上原 腦神經膠質瘤 膠貝瘤、兒童室管膜瘤、兒童髓母細胞瘤 發性神經外胚層瘤、兒童視覺路徑及下丘 及其他兒童腦腫瘤； •乳癌； 消化/胃腸道相關癌症，例如直腸癌、肝外膽管癌、胃 腸道類癌瘤、膽管上皮癌、結腸癌、食道癌、膽囊癌、 成人原發性肝癌（肝細胞癌、肝母細胞瘤）、兒童肝癌、

胰腺癌、i腸癌、小腸癌及胃癌（stGmaeh咖⑽或 gastric cancer)； 内分泌相關癌症，例如f上腺皮質癌、胃腸道類癌瘤、 胰島細胞癌（内分泌胰腺）、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、 垂體瘤及甲狀腺癌； 眼睛相關癌症，例如眼内黑素瘤及視網膜母細胞瘤； 生殖泌尿相關癌症，例如膀胱癌、腎（腎細胞）癌、陰莖 癌、前列腺癌、移行細胞腎盂及輸尿管癌、睾丸癌、尿 道癌、維爾姆斯腫瘤（wilms，tum〇r)及其他兒童腎腫 生殖細胞相關癌症，例如兒童顱外生殖細胞腫瘤、性腺 外生瘦細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤及睾丸癌； 婦科癌症’例如子宮頸癌、子宮内膜癌、妊娠滋養細胞 腫瘤、卵巢上皮樣癌、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢低度潛 在惡性腫瘤、子宮肉瘤、陰道癌及外陰癌； 頭頸相關癌症，例如下咽癌、喉癌、嘴唇及口腔癌、原 發竈隱匿性轉移性鱗狀頸癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻旁竇 131397.doc -29- 200909446 及鼻腔癌、曱狀旁腺癌及延腺癌； ►血液學/血液相關癌症，例如白血病，例如成人急性成 淋巴細胞性白血病、兒童急性成淋巴細胞性白血病、成 人急性髓性白血病、兒童急性髓性白血病、慢性淋巴細 胞白血病、慢性髓性白血病及多毛細胞白血病；及淋巴 瘤’例如AIDS相關淋巴瘤、皮膚τ細胞淋巴瘤' 成人何 傑金氏淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma)、兒童何傑金氏淋 巴瘤、蛀娠期間何傑金氏淋巴瘤、蕈樣肉芽腫病、成人 非何傑金氏淋巴瘤、兒童非何傑金氏淋巴瘤、妊娠期間 非何傑金氏淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、塞紮 裏综合徵（Sezary syndrome)、皮膚τ細胞淋巴瘤及沃爾 登斯特倫巨球蛋白血症（Waldenstr5m，s macroglobulinemia)及其他血液學/血液相關癌症，例如 慢性骨趙增生病症、多發性骨髓瘤/漿細胞贅瘤、骨趙 發育不良綜合徵及骨髓發育不良/骨髓增生性疾病； •肌肉骨骼相關癌症，例如尤因家族腫瘤、骨肉瘤、骨絡 惡性纖維組織細胞瘤、兒童橫紋肌肉瘤、成人軟組織肉 瘤、兒童軟組織肉瘤及子宮肉瘤；血管肉瘤 (hemangiosarcomas及 angiosarcoma); •神經學相關癌症’例如成人腦腫瘤、兒童腦腫瘤、腦幹 神經膠質瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性 神經膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原發性神經 外胚層瘤、視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤及其他腦腫 瘤，例如神經母細胞瘤、垂體瘤及原發性中樞神經系統 131397.doc •30- 200909446 淋巴瘤； •呼吸/胸相關癌症，例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、 惡性間皮瘤、胸腺瘤及胸腺癌； •皮膚相關癌症，例如皮膚τ細胞淋巴瘤、卡波西氏肉 瘤’>、、素瘤梅克爾細胞癌（Merkel cell carcinoma)及皮 膚癌。 具體而言’本發明抗_1(317抗體分子及含有其之醫藥組合 物有益於治療包括白血病、淋巴瘤及骨髓瘤之造血系統癌 症；包括食道癌、胃癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌及膽 囊癌及膽管癌之胃腸道癌症；腎癌、前列腺癌及膀胱癌； 包括乳癌、卵巢癌、子宮頸癌及子宮内膜癌之婦科癌症； 包括惡性黑素瘤之皮膚癌及頭頸癌；諸如維爾姆斯腫瘤、 神經母細胞瘤及尤因肉瘤等兒科癌症；諸如神經膠質母細 胞瘤等腦癌；諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血 管肉瘤等肉瘤；肺癌、間皮瘤及曱狀腺癌。 在另一實施例中’本發明抗_IGF抗體分子及含有彼等之 醫藥組合物可用於非癌性過度增殖性病症，例如，但不限 於，牛皮癬及血管成形術後之再狹窄症。 另外，基於降低IGF-1活性之基因突變對長壽有正面效 果之最近觀察（Reinberg, 2008)，當本發明抗體施用於成人 時’其具有可用於減緩老化及預防老化有關疾病之療法之 潛能。

由所欲治療之病症而定，本發明抗_IGF抗體分子可單獨 或與一或多種其他治療劑組合使用，治療劑尤其選自dNA 131397.doc 200909446 破壞劑或抑制血管生成、信號傳導路徑或癌細胞有絲分裂 關卡（checkpoints)之治療活性化合物。 該其他治療劑可與該抗-IGF抗體分子同時投與，視情況 作為相同藥物製劑之組份，或在該抗-IGF抗體分子投與之 前或之後投與。 在某些實施例中，該其他治療劑可為（不限於）一或多種 選自由 EGFR、VEGFR、HER2-neu、AuroraA ' AuroraB、 PLK 及 PI3 激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP 或 PDK1 抑制 劑群組之抑制劑。 其他治療劑之其他實例係CDK、Akt、src/bcr-abl、 cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90抑制劑、刺猬拮抗 劑、JAK/STAT、Mek、mTor、NFkB、蛋白酶體、Rho抑 制劑、wnt信號傳導抑制劑或泛素化路徑抑制劑。

Aurora抑制劑之實例係（不限於）卩11八-739358、八70-1152、AT-9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、 MLN-8045、PF-3814735。 PLK抑制劑之實例係GSK-461364。 raf抑制劑之實例係BAY-73-4506(亦為VEGFR抑制劑）、 PLX-4032、RAF-265(另外亦為VEGFR抑制劑）、索拉非尼 (sorafenib)(另外亦為 VEGFR抑制劑）及 XL-281。 KSP抑制劑之實例係伊帕尼西（ispinesib)、ARRY-520、 AZD-4877、CK-1 122697、GSK-246053A、GSK-923295、 MK-0731 及 SB-743921。 src及/或bcr-abl抑制劑之實例係達沙替尼（dasatinib)、 131397.doc -32- 200909446 AZD-0530、博舒替尼（bosutinib)、XL-228(亦為 IGF-1R抑 制劑）、尼羅替尼（nilotinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑）、 伊馬替尼（imatinib)(亦為cKit抑制劑）及NS-1 87。 PDK1抑制劑之實例係BX-5 17。

Rho抑制劑之實例係BA-2 10。 PI3激酶抑制劑之實例係PX-866、BEZ-235(亦為mTor抑 制劑）、XL-418(亦為Akt抑制劑）、乂1^-147及又1^-765(亦為 mTor抑制劑）。 〇 cMet或HGF抑制劑之實例係XL-184(亦為VEGFR、 cKit、Flt3抑制劑）、PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦為 VEGFR抑制劑）、MGCD-265(亦為 VEGFR、Ron、Tie2抑制 劑）、SU-1 1274、PHA-665752、AMG-102及 AV-299 ° c-Myc抑制劑之實例係CX-3543。

Flt3抑制劑之實例係AC-220(亦為cKit及PDGFR抑制 劑）、KW-2449、來他替尼（lestaurtinib)(亦為 VEGFR、 PDGFR、PKC抑制劑）、TG-101348(亦為 JAK2 抑制劑）、 XL-999(亦為 cKit、FGFR、PDGFR及 VEGFR抑制劑）、舒 尼替尼（sunitinib)(亦為PDGFR、VEGFR及cKit抑制劑）及坦 度替尼（tandutinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑）。 HSP90抑制劑之實例係坦螺旋黴素（tanespimycin)、阿螺 旋黴素（alvespimycin)、IPI-504及 CNF-2024。 JAK/STAT抑制劑之實例係CYT-997(亦與微管蛋白相互 作用）、TG-101348(亦為Flt3抑制劑）及XL-019。

Mek抑制劑之實例係 ARRY-142886、PD-325901、AZD- 131397.doc -33- 200909446 8330及 XL-518。 mTor抑制劑之實例係坦西莫司（temsirolimus) ' AP-23573(其亦起VEGF抑制劑作用）、依維莫司 (everolimus)(亦為VEGF抑制劑）、XL-765(亦為PI3激酶抑 制劑）及BEZ-235(亦為PI3激酶抑制劑）。

Akt抑制劑之實例係派立福辛（perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱（triciribine) ° cKit抑制劑之實例係AB-1010、OSI-930(亦起VEGFR抑 制劑作用）、AC-220(亦為Flt3及PDGFR抑制劑）、坦度替尼 (亦為Flt3及PDGFR抑制劑）、阿西替尼（axitinib)(亦為 VEGFR 及 PDGFR抑制劑）、XL-999(亦為 Flt3、PDGFR、 VEGFR、FGFR抑制劑）、舒尼替尼（亦為Flt3、PDGFR、 VEGFR抑制劑）及XL-820(亦起VEGFR及PDGFR抑制劑作 用）、伊馬替尼（亦為bcr-abl抑制劑）、尼羅替尼（亦為bcr-abl及PDGFR抑制劑）。 刺猬拮抗劑之實例係IPI_6〇9及CUR-6U14。 CDK抑制劑之實例係塞利西裏（seliciclib)、AT-75 19、P-276、ZK-CDK(亦抑制 VEGFR2APDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及 AG-024322 ° 蛋白酶體抑制劑之實例係棚替佐米（bortezomib)、卡夫 佐米（carfilzomib)及 NPI-0052(亦為 NFkB抑制劑）。 NFkB路徑抑制劑之實例係ΝΡΙ-0052。 泛素化路徑抑制劑之實例係HBX-411 08。 抗血管生成劑之實例係FGFR、PDGFR及VEGFR抑制劑 13I397.doc •34- 200909446 及沙立度胺（thalidomide)，該等藥劑選自（不加限制）貝伐 單抗、莫特撒尼（motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉 替尼（telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(亦為 CDK抑制劑）、 ABT-869 ' BMS-690514 ' RAF-265 ' IMC-KDR ' IMC-18F1 、IMiD、沙立度胺、CC-4047、來那度胺 (lenalidomide)、ENMD-0995、IMC-D11、Ki-23057、布瑞 法尼（brivanib)、西地尼布（cediranib)、XL-999(亦為 cKit及 Flt3 抑制劑）、1B3、CP-868596、IMC-3G3、R-1530(亦為 〇 Flt3抑制劑）、舒尼替尼（亦為cKit及Flt3抑制劑）、阿西替 尼（亦為cKit抑制劑）、來他替尼（亦為Flt3及PKC抑制劑）、 瓦他拉尼（vatalanib)、坦度替尼（亦為Flt3及cKit抑制劑）、 易瑞莎（pazopanib)、GW-786034 ' PF-337210 ' IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR-258、索 拉非尼曱苯磺酸鹽（亦為Raf抑制劑）、RAF-265(亦為Raf抑 制劑）、凡德他尼（vandetanib)、CP-547632、OSI-930、 AEE-7 8 8(亦為 EGFR及 Her2抑制劑）、BAY-57-9352(亦為 Raf抑制劑）、BAY-73-4506(亦為 Raf抑制劑）、XL-880(亦為 cMet抑制劑）、XL-647(亦為EGFR及EphB4抑制劑）、XL-. 820(亦為cKit抑制劑）及尼羅替尼（亦為cKit及brc-abl抑制 劑）。 該額外治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子 EGFR抑制劑或抗-EGFR抗體。抗-EGFR抗體之實例係（不 加限制）西土西單抗（cetuximab)、 帕尼單抗 (panitumumab)、馬妥珠單抗（matuzumab);小分子 EGFR抑 131397.doc -35- 200909446 制劑之實例係吉非替尼（gefitinib)。EGFR調節劑之另一實 例係EGF融合毒素。 可用於與本發明抗-IGF抗體分子組合之EGFR及Her2抑 制劑包括拉帕替尼（lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼 (erlotinib)、西土西單抗、曲司佐單抗（trastuzumab)、尼妥 珠單抗（nimotuzumab)、紮妥木單抗（zaiutumumab)、凡德 他尼（亦為VEGFR抑制劑）、帕妥珠單抗（口61^1121111^1))、乂1^-647、HKI-272、BMS-599626 ARRY-334543、AV-412、 mAB_806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦為 VEGFR抑制劑）、ARRY-333 786、IMC-11F8、Zemab。 擬與本發明抗-IGF抗體分子組合之額外藥物亦可為如培 加尼布（pegaptanib)等VEGF抑制劑或抗-VEGF抗體貝伐單 抗。 可有利地在療法中與本發明抗-IGF抗體分子組合之其他 藥劑係托西莫單抗（tositumomab)及替坦異貝莫單抗 (ibritumomab tiuxetan)(兩種經放射標記之抗-CD20抗體）、 阿侖珠單抗（alemtuzumab)(抗-CD52抗體）、狄諸塞麥 (denosumab)(破骨細胞分化因子配體抑制劑）、加利昔單抗 (galiximab)(CD80拮抗劑）、奥法妥木單抗 (ofatumumab)(CD20抑制劑）、紮木單抗（zanolimumab)(CD4 拮抗劑）、SGN40(CD40配體受體調節劑）、利妥昔單抗 (rituximab)(CD20 抑制劑）或麥妥木單抗（mapatumumab) (TRAIL-1受體激動劑）。 可用於與本發明抗-IGF抗體分子組合之其他化學治療藥 131397.doc -36· 200909446

物係選自但不限於激素、激素類似物及抗激素（例如他莫 昔芬（tamoxifen)、托瑞米芬（toremifene)、雷洛昔芬 (raloxifene)、氟維司群（fulvestrant)、乙酸甲地孕鲷 (megestrol acetate)、氟他胺（flutamide)、尼魯米特 (nilutamide)、比卡魯胺（bicalutamide)、乙酸環丙孕 _ (cyproterone acetate)、非那雄胺（finasteride)、乙酸布舍瑞 林（buserelin acetate)、氟氫可的松（fludrocortinsone)、氣 曱睾網（fluoxymesterone)、曱經孕酮（medroxyprogesterone)、 奥曲肽（octreotide)、阿佐昔芬（arzoxifene)、帕瑞肽 (pasireotide)、伐普肽（vapreotide))、芳香酶抑制劑（例如阿 那曲 0坐（anastrozole)、來曲 °坐（letrozole)、利阿唾 (liarozole)、依西美坦（exemestane)、阿他美坦 (atamestane)、福美坦（formestane))、LHRH激動劑及拮抗 劑（例如乙酸戈舍瑞林（goserelin acetate)、亮丙瑞林 (leuprolide)、阿巴瑞克（abarelix)、西曲瑞克（cetrorelix)、 地洛瑞林（deslorelin)、組胺瑞林（histrelin)、曲普瑞林 (triptorelin))、抗代謝物（例如，諸如甲胺蝶吟 (methotrexate)、培美曲塞（pemetrexed)等抗葉酸藥、諸如 5-氟尿 密 σ定（5-fluorouracil)、卡培他濱（capecitabine)、地 西他濱（decitabine)、耐拉濱（nelarabine)、及吉西他濱 (gemcitabine) 等嘧啶類似物、諸如巯嘌呤 (mercaptopurine)、硫鳥嘌呤（thioguanine)、克拉屈濱 (cladribine)及噴司他丁（pentostatin)、阿糖胞普 (cytarabine)、敗達拉濱（fludarabine)等嗓吟及腺苷類似 131397.doc -37· 200909446 物），抗腫瘤抗生素（例如蒽環抗生素（anthracycline) ’如多 柔比星（doxorubicin)、柔紅黴素（daunorubicin)、表柔比星 (epirubicin)及伊達比星（idarubicin)、絲裂黴素（mitomycin_

C)、博來黴素（bleomycin)、放線菌素 D (dactinomycin)、 普卡黴素（plicamycin)、米托蒽醌（mitoxantrone)、匹克生 瓊（pixantrone)、鏈尿黴素（streptozocin));始衍生物（例如 順始、奥沙利鉑（oxaliplatin)、卡翻（carboplatin)、洛在白 (lobaplatin)、沙鉑（satraplatin));烷基化劑（例如雌莫司丁 (estramustine)、美克洛噻胺（meclorethamine) ' 美法命 (melphalan)、苯丁 酸氮芥（chlorambucil)、白消安 (busulphan)、達卡巴嗪（dacarbazine)、環碟醯胺 (cyclophosphamide)、異環磷醯胺（ifosfamide)、經基脲 (hydroxyurea)、替莫α坐胺（temozolomide)、諸如卡莫司汀 (carmustine)及洛莫司汀（lomustine)等亞硝基脲、嗟替派 (thiotepa));抗有絲分裂劑（例如長春花生物鹼，如長春鹼 (vinblastine)、長春地辛（vindesine)、長春瑞濱 (vinorelbine)、 長春氟寧（vinflunine)及長春新驗 (vincristine);及紫杉烧（taxane)，如紫杉醇（paclitaxel)、 多西他賽（docetaxel)及其調配物、拉洛他赛（larotaxel);西 莫他賽（simotaxel)及埃坡黴素，如伊沙匹隆 (ixabepilone)、帕妥匹隆（patupilone)、ZK-EPO);拓撲異 構酶抑制劑（例如表鬼抬毒素（epipodophyllotoxin)，如依託 泊苷（etoposide)及凡畢複（etopophos)、替尼泊苷 (teniposide)、安0丫咬（amsacrine)、托泊替康（topotecan)、 131397.doc -38- 200909446 伊立替康（irinotecan))及諸如胺碟丁（amifostine)、阿那格 雷（anagrelide)、干擾素α、丙卡巴肼（pr〇carbazine)、米托 坦（mitotane)、及σ卜菲爾納（porfimer)、貝沙羅丁 (bexarotene)、塞來昔布（ceiecoxib)等各種化學藥物。 為潛在地增強靶向IGF信號傳導，本發明抗_igF抗體分 子以及任何其他抗-IGF抗體分子亦可與靶向IGF_丨R之藥劑 組合。該等藥劑包括與IGF-1R結合之抗體（例如CP-75 1871 ' AMG-479 > IMC-A12 ' MK-0646 > AVE-1642 ' R-15 07、BIIB-022)及靶向IGF1-R之激酶結構域的新穎化學 個體（例如 OSI-906 或 AEW-541)。 本發明抗-IGF抗體分子亦可用於與其他療法組合，該等 其他療法包括外科手術、放射療法、内分泌療法、生物反 應改性劑、過熱及冷凍療法及削弱任何不利效果之藥劑 (例如止吐藥）。 本發明抗-IGF抗體分子亦可用於診斷癌症’其中 及/或IGF-2之血清含量升高與疾病之發生或進展相關，例 如對於確定由於印記丟失（L〇i)而導致之igF-2含量升高， 印記丟失係改變胰島素樣生長因子π基因之表觀遺 傳改變。在某些實施例中，用於診斷應用之抗體（例如用 於藉由免疫組織學染色檢測人類組織切片中之IGF·丨）係衍 生自人類抗體之嵌合抗體。在該抗體中，恆定區或其部分 已藉由來自另外物種（例如小鼠）之抗體的相應序列替換。 藉由使用該敌合抗體作為一級抗體，二級抗體（例如與鼠 科動物Fc部分特異性反應之山羊抗體）將特異性地識別該 131397.doc -39· 200909446 嵌合一級抗體之鼠科動物序列且不與存在於任何組織樣品 中之其他人類免疫球蛋白分子之Fc部分結合。因此，可避 免不期望之背景染色。 材料及方法 藉由噬菌體展示選擇IGF-1結合抗體（由抗體輕鏈及重鏈可 變區與恆定區結構域CH1構成之Fab片段） 自組合HuCAL Gold文庫（Knappik等人，2000)中選擇特 異性嗟菌體純系（淘選）係基本上如Rauchenberger等人 (2003)所述以三個淘選週期實施。噬菌粒拯救、噬菌體擴 增及Fab純化係如Krebs等人（2001)所述實施。來自第2輪及 第3輪淘選之純系池之噬菌粒〇ΝΑ係用市售質粒套組 (Qiaprep旋轉小量製備套組（Qiaprep spin miniprep kit); Qiagen)製備並對Fab片段進行分離且選殖至表現載體 pMORPH9_FH(歐洲專利第859841號）中且轉化為大腸桿菌 TGI F_。將所獲得之純系轉移至384_孔微量滴定主板 (Nunc)中並進行培養。對用於表現之複製板實施接種並用 0.5 mM IPTG誘導大腸桿菌Fab純系並在22〇c下生長過夜。 用於篩選之含有Fab片段之裂解液係藉由向65 y大腸桿菌 培養物中添加15 μΐ BEL裂解緩衝液（2BBS/EDTA/溶菌酶） 製備。在1，5 hr後’添加15 μ1阻斷緩衝液（1 5% BSA/TBS 或存於PBS/Tween_20中之12 5%奶粉）並在22<t及4〇〇 rpm 下再培育30分鐘。 IGF-i陽性Fab純系之EUSA筛選係藉由將淋 孔板在代下用存於1X塗覆緩衝液（Gibe。）中之5 pg/ml重組 131397.doc 200909446 人類IGF-l (Gropep)塗覆過夜實施。將孔用lx TBS-Τ洗務 並用lx阻斷緩衝液（Gibco)在室溫下阻斷1 h。在室溫下於 1.5 hr内添加含有抗體Fab片段之細菌裂解液，隨後用iχ TBS-T洗滌五次並用以1:1〇,〇〇〇稀釋之結合鹼性碟酸酶之 Affini Pure山羊抗-人類IgG F(ab’）2.片段特異性Mab (Dianova)檢測並且用Attophos受質（Roche)顯影。榮光讀數 係在Tec an螢光讀數器上於激發430 nm及發射535 nm下實 施。 與重組鼠科動物IGF-1(R&D系統）、重組人類igf_2 (Gropep)、重組鼠科動物IGF-2(R&D系統）及重組人類胰島 素（Roche)之交叉反應性係藉由ELISA使用與上文相同之程 序（只是用1 μg/ml塗覆稀釋液）來實施。 與重組人類IGF-1、氣科動物IGF-1、鼠科動物IGF_ 2(R&D系統）、重組人類IGF-2、大鼠IGF-1、大鼠IGF-2 (Gropep)及重組人類騰島素（Roche)之交叉反應性係藉由 ELIS A使用與上文相同之程序（只是用1 pg/mi塗覆稀釋液） 來實施。 選擇中和IGF-1及IGF-2與IGF-1R之結合的抗體 為識別中和IGF-1及IGF-2與IGF-1R結合之能力的IGF抗 體’藉由用容許生物素化IGF-1及生物素化IGF-2結合之1.5 pg/ml重組人類IGF-1R(R&D系統）塗覆板實施ELISA。使用 結合鹼性磷酸酶之抗生蛋白鏈菌素（1:1〇,〇〇〇稀釋）(Roche) 來檢測結合之IGF-1或IGF-2。抗體Fab片段之中和效能係 藉由僅在添加生物素化IGF-1或IGF-2配體之前向塗覆有 131397.doc -41 · 200909446 IGF-1R之該等孔中添加0.1 -1 pg/ml Fab來量測。阻斷生物 素化配體結合之抗體Fab片段係藉由螢光測定信號之減少 來識別。

IgGl抗體之選殖及重組表現 藉由限制性酶消化（VH消化：Mfel-Blpl ; VL-λ : EcoRV-Hpal)將可變重鏈區（VH)及可變輕鏈區（VL)自Fab表 現載體中切除並連接至pMORPH_h_IgGl (EcoRI-BlpI)及 pMORPH_h_IgXEcoRV-HpaI)之相容限制性酶位點中。兩 種質粒分別係基於pcDNA3.1之含有人類IgGl重鏈及人類 Igk輕鏈恆定區之質粒。製備EndoFree質粒製劑（Qiagen)並 按照供應商之方案以1 mg/L每一質粒之濃度將重鏈及輕鏈 質粒共轉染至HEK293自由式細胞（Invitrogen)中。72小時 後收穫上清液並藉由ELISA測定IgG濃度。將抗體在修飾 蛋白質A管柱（GE Healthcare)上純化、溶析至擰檬酸鹽緩 衝液中，隨後透析至存於PBS中之2.5 mg/ml濃度。 用於測定中和效能之活體外細胞分析 在無血清RPMI培養基中將COLO 205結腸癌衍生細胞系 (ATCC # CCL-222)以1000個細胞/孔之細胞密度鋪板於96-孔板中。在存在或不存在對照抗體或5及30 pg/ml濃度抗體 40183及40186下添加10 ng/ml IGF-1或IGF-2。將細胞培養 5天，隨後使用CellTiter-Glo發光細胞生存能力分析儀 (Promega)測定每一孔中之細胞數量。使用XFluor GENios Pro 4記錄發光。 尤因肉瘤衍生細胞系生長分析 131397.doc •42· 200909446 在含有1 χΝΕΑΑ ' 1 χ丙酮酸鈉、ΐχ giutamax及10%胎牛 血清（FCS)之DMEM培養基中將尤因肉瘤衍生細胞系TC_71 (ATCC # ACC516)及 SK-N-MC (ATCC # HTB86)以 1000個 細胞/孔之密度鋪板於96-孔板中並在37°C及5% C02下於濕 潤氣氛中培育過夜。第二天’向該等細胞中添加測試抗體 及人類化同種型對照抗體（靶向CD44-V6之人類化IgGl抗 體）之一系列稀釋液。所用典型濃度係10、3.33、1.11、 0.3 7、0.13及0.04 pg/ml且每一稀釋液係以一式三份孔實 施。隨後將細胞加上抗體培育120小時，此時間段後使用 CellTiter-Glo發光細胞生存能力分析儀（promega^j定每一 孔中之相對細胞數量。使用XFluor GENios Pro 4記錄發光 並取一式三份孔之平均值用於數據分析並且藉由使用S形 曲線分析程式（Graph Pad Prism)用可變希爾斜率（Hill slope)反覆計算擬合。 填酸化核糖體S6之西方墨點分析 在含有10°/。血清之培養基中將COLO 205細胞鋪板於6-孔 板中並在兩天後收穫細胞且再鋪板於無血清培養基中。隨 後將該等細胞與10 ng/ml IGF-1或IGF-2在有或無30 pg/ml IGF抗體下培育4小時，然後裂解細胞且在利用Bradf〇rd分 析測定蛋白質濃度後將細胞裂解液冷凍。西方墨點法係藉 由將13 pg蛋白質裂解液施用至SDS PAGE凝膠（BioRad)中 來實施且在Citerian凝膠墨點夾層上形成凝膠墨點。將西 方墨點與以1 :1000稀釋於1 %奶粉中之兔抗_β肌動蛋白（對 照）抗體及兔抗-填酸-S6核糖體蛋白（Ser235/236)抗體（細胞 131397.doc • 43 - 200909446 信號傳導）二者培育過夜。在於TBS中洗滌後，應用1小時 抗兔IgG結合HRPO之二級抗體（Amersham)並在於TBS中 進一步洗滌後藉由ECL檢測抗體反應性並俘獲於Hyperfilm (Amersham)上。 活體内異種移植物研究 在雌性無胸腺NMRI裸小鼠（6-8週齡）之右肋腹中經皮下

接種COLO 205人類結腸腫瘤衍生細胞系（ATCC # CCL-222)(5x106 個，存於 μΐ 林格溶液（Ringer solution)中）。 藉由每週三次使用測徑器及公式：π/6 χ較大直徑“較小直 徑）量測腫瘤體積來評定腫瘤細胞生長。治療係經靜脈内 投與至ίο只小鼠群組且當腫瘤生長到13〇至27〇 mm3尺寸時 開始/口療。治療時間表由每週兩次靜脈内輸注媒劑及2 5 mg/kg劑量之抗體40186組成，持續兩個治療週期。在抗體 與5FU之組合中，每週投與5〇 mg/kg劑量之5ρυ。當腫瘤 達到150G mm3平均尺寸時終止研究。所有動物實驗皆按照 奥地利法定要求以及美國實驗動物科學學會（aalas)之方 針實施。 測定對總鼠科動物血清IGF-1含量之效果 單次靜脈内(推注)投與12.5、25、5〇及1〇〇响抗體 40丨86至雌性無胸腺NMRI裸小鼠（6_8週齡）(n=5)中。投與 後24小時採集血液樣品，收集血清，並使用〇cteia大鼠/ 小鼠總服-i免疫細胞計數分析測定總鼠科動物igf# 量。該分析係按照製造商說明實施 並使用SoftMax Pro軟體進行評價。 ，在450 nm量測吸收度 使用標準曲線來測定以 131397.doc -44- 200909446 ng/ml計之總IGF-1之血清濃度。使用GraphPad prism軟體 來實施統計學分析。 在食蟹猴中測定半衰期 單次靜脈内（推注）投與1及10 mg/kg(呈含有25 mM檸檬 酸鈉 pH 6、115 mM NaCM、0.02%聚山梨酯 20 (Tween)之 調配物形式）抗體至食蟹猴（對於每一投與劑量，n==3)中。 在每次施用後0.5、2、8、24、48、72、168、336及 504 小 時採集也液樣品並藉由ELISA測定血漿中之人類抗體濃 〇 度。 實例1 選擇中和IGF-1R相互作用且不與胰島素結合之⑷^一及 IGF-2交又反應性完全人類抗體 自噬菌體展示抗體文庫分離結合IGF-1且與IGF-2交叉反 應之完全人類抗體（最初以Fab分子形式）。除人類IGF-1及 IGF-2結合外’選擇亦結合鼠科動物及大鼠igf_1&igf_2 但不與人類胰島素結合之Fab抗體片段。對所選擇之Fab進 行選殖並以IgG分子形式（IgG 1重鏈及人類輕鏈恒定）表 現。如圖1A-H中所示，抗體401 83及401 86顯示與人類IGF-- 1 (1 A)、人類IGF-2 (1B)、鼠科動物IGF-1 (1C)、氣科動物 IGF-2 (1D)、大鼠IGF-1 (1E)、大鼠IGF-2 (1F)之濃度依賴 性結合，但不與人類胰島素（1G)或塗覆塑膠（1H)結合。 已證實抗體40183及40186結合IGF-1及IGF-2二者，將對 該等抗體在ELISA分析中中和IGF-1及IGF-2與IGF-1R之相 互作用的能力予以測試。如圖2中所示，兩種抗體顯示劑 131397.doc -45- 200909446 量依賴性抑制IGF-1配體結合，該分析中之IC5G值約為5 ng/ml (0.03 nM) ° 實例2 對IGF-1及IGF-2-誘導之細胞生長的效果 抗體40183及40186對IGF-1、IGF-2及胰島素誘導之 COLO 205結腸癌細胞系生長之效果顯示於圖3 a_c中。該 等抗體顯示劑量依賴性抑制IGF-1 (3A)及IGF-2 (3B)誘導 之細胞生長，但重要的是對胰島素（3C)促進細胞生長之能 力無效果’此與該等抗體不與騰島素結合之發現（實例1 ) 一 致。 藉由抗體40 1 86例示，為進一步證實該等抗體對IGF_ i及 IGF-2誘導之細胞生長之生長抑制效果係由於中和IGF及抑 制造成細胞生長之細胞内信號傳導路徑所致，分析對核糖 體S6蛋白質磷酸化之效果。如圖4中所示，單獨添加an 或IGF-2均導致核糖體S6鱗酸化之較大增加。然而，添加 抗體40186完全中和了1〇?-1及1〇?-2誘導之峨酸化。 實例3 對尤因肉瘤衍生細胞系生長之效果 抗體401 86對於含有10% FCS之培養基中生县夕七m τ王我之尤因肉 瘤衍生細胞系TC-7 1及SK-N-MC生長之效果顯示於圖$中 相對於人類化同種型對照抗體，401 86顯示劑量依賴丨生# 制TC-71(圖5A)及SK-N-MC(圖5B)細胞系二者之 、 <、'、曰胞生 長。 實例4 131397.doc -46 - 200909446 結腸直腸細胞腫瘤之生長抑制 為證實IGF-1/IGF-2交叉反應性中和抗體以干擾活體内 腫瘤細胞生長之能力，每週用25 mg/kg抗體40186對具有 確定皮下COLO 205腫瘤之裸小鼠實施兩次治療。如圖6中 所示’與用媒劑治療之小鼠相比，用4〇 i 86治療之小鼠顯 示中值腫瘤生長之45%降低。 另外，量測25 mg/kg抗體40186與每週一次50 mg/kg細胞 毒性劑5FU之組合對COLO 205異種移植物腫瘤生長之效 果。如圖7中所示，與單獨使用50 mg/kg 5FU之30%相比， 用25 mg/kg 40186抗體及50 mg/kg 5FU之組合治療之小鼠 顯示中值腫瘤生長之60%降低。 實例5 對總鼠科動物IGF-1含量之效果 預期用靶向IGF之抗體中和活性igF-Ι可導致通過生長激 素路徑之内分泌反饋，此導致總血清IGF-1及IGFBP3含量 升高。抗體40183及40186可與小鼠及大鼠igF-Ι交又反 應，此容許在該等物種中量測任何對總血清IGF_ 1含量之 藥效效果。如圖8中所示’向無胸腺NMRI裸小鼠中投與抗 體401 86可在投與後24小時達成劑量依賴性血清總鼠科動 物IGF-Ι含量升高。此代表可在臨床發展期間於人類中測 έ式之該等抗體活性之有用藥效標記。 實例6 在食蟹猴中之终末半衰期 藉由量測1及10 mg/kg單次靜脈内（推注）施用在食蟹猴血 131397.doc -47- 200909446 漿中之終末半衰期獲得抗體40186在人類中之終末半衰期 的臨床前估計。如表1中所示，40 186在食蟹猴中之半衰期 介於 10_7±1.6 天（1 mg/kg)至 12±1.4 天（10 mg/kg)範圍内。 表1. 抗體40 186在食蟹猴企漿中之終末半衰期 抗體劑量 終末半衰期(天） n=3 1 mg/kg 10.7±1.6 10 mg/kg 12±1.4 131397.doc -48 - 200909446 參考文獻

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L 131397.doc • 54- 200909446 序列表 <110> 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 <120> 抗-IGF抗體 <130> 12-0271-ff <140> <141> 097122727 2008-06-18 <150> <151> 07110587.8 2007-06-19 <160> 20 <170> Patentln version 3.3 <210> <211> <212> <213> 1 5 PRT 智人 <400> 1

Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> <211> 2 17 <212> <213> PRT 智人 <400> 2

Gly lie Ser Gly Trp Ser Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 3 13 PRT 智人 <400> 3

Phe Gly lie Asp Ala Tyr Thr Lys Val Tyr Phe Asp Tyr 15 10 131397·序列表.doc 200909446 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 4

Ser Gly Asp Asn lie Pro Leu Lys Tyr Val Ser 15 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> 智人 <400> 5

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 智人 <400> 6

Gin Ser Trp Ala Ser Thr Gly Val Val 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> 智人 <400> 7

Ser Phe Ala Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> 智人 <400> 8

Tyr lie Ser Tyr Leu Gly Ser Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 -2- 131397-序列表.doc 200909446

Gly <210> 9 <211> <212> <213> 6 PRT 智人 <400> 9

Gly Thr Lys Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 、 <211> ? <212> <213> 13 PRT 智人 <400> 10

Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Thr Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 11 <211> <212> <213> 7 PRT 智人 <400> 11

Ser Asn Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> <213> PRT 智人 <400> 12

Ser lie Thr Arg Val 1 5 <210> <211> <212> <213> 13 366 DNA 智人 131397-序列表.doc 48200909446 <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 13

cag gtg gaa ttg gtg gaa age ggc ggc ggc ctg gtg caa ccg ggc ggc Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 age ctg cgt ctg age tgc geg gee tee gga ttt acc ttt tet aat tat Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 tgg atg cat tgg gtg ege caa gee cct ggg aag ggt etc gag tgg gtg Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 age ggt ate tet ggt tgg tet age tgg acc tat tat geg gat age gtg Ser Gly lie Ser Gly Trp Ser Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aaa ggc cgt ttt acc att tea cgt gat aat teg aaa aac acc ctg tat Lys Gly Arg Phe Thr 工le Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age ctg cgt geg gaa gat aeg gee gtg tat tat tgc Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 geg cgt ttt ggt att gat get tat act aag gtt tat ttt gat tat tgg Ala Arg Phe Gly lie Asp Ala Tyr Thr Lys Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 ggc caa ggc acc ctg gtg aeg gtt age tea Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 96 144 192 240 288 336 366

<210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> 智人 <400> 14 Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 131397-序列表.doc -4- 200909446

Ser Gly lie Ser Gly Trp Ser Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Phe Gly lie Asp Ala Tyr Thr Lys Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 gat ate gaa ctg acc cag ccg cct tea gtg age gtt gca cca ggt cag Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15 acc geg cgt ate teg tgt age ggc gat aat att cct ett aag tat gtt Thr Ala Arg 工le Ser Cys Ser Gly Asp Asn lie Pro Leu Lys Tyr Val 20 25 30 tet tgg tac cag cag aaa ccc ggg cag geg cca gtt ett gtg att cat Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie His 35 40 45 gat gat aat aag cgt ccc tea ggc ate ccg gaa ege ttt age gga tcc Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 48 96 144 192 <210> 15 <211> 321 <212> DNA <213> 智人 <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 15 240 aac age ggc aac acc geg acc ctg acc att age ggc act cag geg gaa

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80 gac gaa geg gat tat tat tgc cag tet tgg get tet act ggt gtt gtg

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Ala Ser Thr Gly Val Val 85 90 95 131397-序列表.doc 288 200909446 ttt ggc ggc ggc acg aag tta acc gtc eta ggt Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> 智人 <400> 16

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Ser Cys Ser Gly Asp Asn lie Pro Leu Lys Tyr Val 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val 工le His 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Ala Ser Thr Gly Val Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105

<210> 17 <211> 345 <212> DNA <213> 智人 <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 17 cag gtg gaa ttg gtg gaa age ggc ggc ggc ctg gtg caa ccg ggc ggc

Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 131397-序列表.doc 200909446 age ctg cgt ctg age tgc Ser Leu Arg Leu Ser Cys 20 get atg tet tgg gtg ege Ala Met Ser Trp Val Arg 3S age tat ate tet tat ett Ser Tyr lie Ser Tyr Leu 50 aaa ggc cgt ttt acc att Lys Gly Arg Phe Thr lie 65 70 ctg caa atg aac age ctg Leu Gin Met Asn Ser Leu 85 geg cgt ggt act aag ttt Ala Arg Gly Thr Lys Phe 100 gtt age tea Val Ser Ser 115

geg gee tee gga ttt acc Ala Ala Ser Gly Phe Thr 25 caa gee cct ggg aag ggt Gin Ala Pro Gly Lys Gly 40 ggt age tat acc ggt tat Gly Ser Tyr Thr Gly Tyr 55 60 tea cgt gat aat teg aaa Ser Arg Asp Asn Ser Lys 75 cgt geg gaa gat aeg gee Arg Ala Glu Asp Thr Ala 90 gat tat tgg ggc caa ggc Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 tgg tet tet ttt 96

Trp Ser Ser Phe 30 etc gag tgg gtg 144

Leu Glu Trp Val 45 geg gat age gtg 192

Ala Asp Ser Val aac acc ctg tat 240

Asn Thr Leu Tyr 80 gtg tat tat tgc 288

Val Tyr Tyr Cys 95 acc ctg gtg aeg 336

Thr Leu Val Thr 110 345 <210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> 智人 <400> 18 Gin Val .Glu Leu Val Glu 1 5 Ser Gly Gly Gly Leu Val 10

Gin Pro Gly Gly 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Trp Ser Ser Phe 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Tyr Leu Gly Ser Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 131397-序列表.doc 200909446

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 315 <212> DNA <213> 智人

<220> <221> CDS <222> (1) . . (315) <400> 19 gat ate gtg ctg acc cag ccg cct tea gtg agt ggc gca cca ggt cag Asp lie Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15 48

cgt gtg acc ate teg tgt aeg ggc age age age aac att ggt act tat Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Thr Tyr 20 25 30 gat gtg cat tgg tac cag cag ttg ccc ggg aeg geg ccg aaa ett ctg Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 att tat tet aat tet aag cgt ccc tea ggc gtg ccg gat cgt ttt age lie Tyr Ser Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 gga tee aaa age ggc acc age geg age ett geg att aeg ggc ctg caa Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80 age gaa gac gaa geg gat tac tat tgc tet att act cgt gtg ttt ggc Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser lie Thr Arg Val Phe Gly 85 90 95 ggc ggc aeg aag tta acc gtc eta ggt Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 96 144 192 240 288 315 131397-序列表 _doc 200909446 <210> 20 <211> 105 <212> PRT <213> 智人 <400> 20

Asp lie Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Thr Tyr 20 25 30

Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

lie Tyr Ser Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser lie Thr Arg Val Phe Gly 85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105

9- 131397-序列表.doc

Claims (1)

1. 200909446 十、申請專利範圍： 1. 一種分離之人類抗體分子，其 a) 與人類IGF-1及IGF-2結合以 i) 阻止IGF-1及IGF-2與IGF-1受體結合及 ii) 抑制IGF-1受體介導之信號傳導； ' b)與鼠科動物及大鼠IGF-1及IGF-2結合， • c)不與胰島素結合， d)不影響藉由胰島素與胰島素受體結合所介導之胰島素 f、 促有絲分裂特性。 2. 如請求項1之分離之人類抗體分子，其係重組人類抗體 分子。 3. 如請求項2之分離之人類抗體分子，其具有包含胺基酸 序列SEQ ID NO:3之重鏈CDR3。 4. 如請求項3之分離之人類抗體分子，其具有包含胺基酸 序列8£卩10 1^0:6之輕鏈00113。 5. 如請求項4之分離之人類抗體分子，其具有 Ο a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈CDR1，及 b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2之重鏈CDR2。 6. 如請求項5之分離之人類抗體分子，其具有 a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4之輕鏈CDR1，及 b) 包含胺基酸序列SEQIDNO:5之輕鏈CDR2。 7. 如請求項3之分離之人類抗體分子，其具有包含胺基酸 序列SEQ ID NO·· 14之可變重鏈。 8. 如請求項7之分離之人類抗體分子，其具有包含胺基酸 131397.doc 200909446 序列SEQ ID NO: 16之可變輕鏈。 9·如請求項2之分離之人類抗體分子，其具有包含胺基酸 序列SEQ IDNO:9之重鏈CDR3。 10. 如請求項9之分離之人類抗體分子，其具有包含胺基酸 序列SEQIDNO:12之輕鏈cDR3。 11. 如請求項10之分離之人類抗體分子’其具有 a) 包含胺基酸序列SEqIdn〇:7之重鏈cdri，及 b) 包含胺基酸序列SEQ lDN〇: 8之重鏈CDR2。 O I2·如請求項11之分離之人類抗體分子，其具有 a) 包3 fe基酸序列SEQ ID NO: 1 〇之輕鍵CDR1，及 b) 包含胺基酸序列SEq ID n〇:11之輕鏈cdR2。 13. 如請求項9之分離之人類抗體分子，其具有包含胺基酸 序列SEQ ID NO: 18之可變重鏈。 14. 如請求項13之分離之人類抗體分子’其具有包含胺基酸 序列SEQ ID NO: 20之可變輕鏈。 15. —種分離之人類抗體分子，其係如請求項丨至14中任一 () 項之抗體分子的衍生物，其與親本抗體相比具有增加之 親和力’且其係藉由交換可變重鏈或可變輕鏈中之一個 CDR獲得。 16. 如請求項2至15中任一項之分離之人類抗體分子，其包 含一個選自由 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及 IgE怪定區組成之群之重鏈恆定區。 17. 如請求項16之分離之人類抗體分子，其中該抗體重鏈恆 定區係IgGl。 131397.doc 200909446 18_如請求項！之分離之人類抗體分子，其係Fab片段。 19. 如請求項！之分離之人類抗體分子，其係F(ab，）2片段。 20. 如請求項！之分離之人類抗體分子，其係單鏈&片段。 21. —種DNA分子，其編碼如請求項2至14中任一項之抗體 分子或其片段或變體的可變重鏈或可變輕鏈。 22. 如請求項21之DNA分子，其如SEQ ID NO: 13中所示，編 碼抗體40186之可變重鏈。 23. 如請求項21之DNA分子，其如SEQ ID NO: 15中所示，編 C ? 碼抗體4 01 8 6之可變輕鏈。 24·如請求項21之DNA分子，其如SEQ ID NO: 17中所示，編 碼抗體40183之可變重鏈。 25. 如請求項21之DNA分子，其如SEQ ID NO: 19中所示，編 碼抗體40183之可變輕鍵。 26. —種表現載體，其包含一或多個如請求項21之dNa分 子。 27. —種表現載體，其包含如請求項22&232dna分子。 C 28，一種表現載體’其包含如請求項24及25之DNA分子。 29. —種宿主細胞，其攜帶—或多個如請求項26至28中任一 項之表現載體。 30. 如請求項29之宿主細胞，其為哺乳動物細胞。 31. —種產生如請求項2至14中任—項之抗體分子的方法， 其包含用如請求項26至28中任一項之載體轉染哺乳動物 宿主細胞，培養該宿主細胞，及回收及純化該抗體分 子0 131397.doc 200909446 32. —種醫藥組合物，其包含如請求項1至2〇中任一項之分 離之人類抗體分子及醫藥上可接受之載劑。 33. 如吻求項32之醫樂組合物，其進一步包含一或多種其他 治療劑，選自DNA破壞劑或抑制信號傳導路徑或癌細胞 有絲分裂關卡（checkpoints)之治療活性化合物。 3 4.如明求項3 3之醫藥組合物，其中該一或多種化合物係選 自 EGFR、VEGF、HER2-neu、AuroraB、Plkl 或 PI3 激酶 抑制劑群組。 D 35.如請求項32至34中任一項之醫藥組合物，其係用於治療 包括白血病、淋巴瘤及骨髓瘤之造血系統癌症；包括食 道癌、胃癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌及膽囊癌及膽 管癌之胃腸道癌症；腎癌、前列腺癌及膀胱癌；包括乳 癌、卵巢癌、子宮頸癌及子宮内膜癌之婦科癌症；包括 惡性黑素瘤之皮膚癌及頭頸癌；兒科癌症，諸如維爾姆 斯腫瘤（Wilms' tumour)、神經母細胞瘤及尤因肉瘤 (Ewing sarcoma);腦癌，諸如神經膠質母細胞瘤；肉 / ：：ί ; 瘤’諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉 瘤；肺癌、間皮瘤及甲狀腺癌。 131397.doc