TW200908994A

TW200908994A - Vaccine

Info

Publication number: TW200908994A
Application number: TW097113719A
Authority: TW
Inventors: William Ripley Ballou; Emmanuel Jules Hanon
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2008-04-15
Publication date: 2009-03-01
Also published as: BRPI0810015B1; EA024250B1; CN105311629A; CO6251369A2; US20180339037A1; KR20100009576A; IL200859A; WO2008128939A1; ZA200906753B; AU2008240761B2; CN101678096A; MA31381B1; PE20090146A1; CA2683075C; AU2008240761A1; US10548969B2; US20170246290A1; EP2455101A2; EP2136837B1; US20090136543A1

Description

200908994 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於用於對人類進行免疫以抵抗流感疾病之济感免疫原性組合物及疫苗接種方案，其在醫藥中之用途，尤其為其在增加對各種抗原之免疫反應中之用途，且係關於製備方法。詳言之，本發明係關於流感疫苗，其包含流感病毒抗原或抗原性製劑以及水包油乳液佐劑，其中該水包油乳液佐劑包含可代謝油及乳化劑，及視情況之母育齡及/或固醇。【先前技術】 OIL感病毋為世界上最普遍存在之病毒之一，其影塑人類及家畜。流感導致顯著之經濟負擔、發病率及甚至死亡率。流感病毒為具有直徑約1 25 nm之粒度的RNA包臈病毒。其係基本上由藉由具有脂質雙層結構及外醣蛋白之病毒包臈所包圍之與核蛋白相關聯的核糖核酸（RNA)之内部核鞘或核心組成。該病毒包膜之内層係主要由基質蛋白組成且外層通常由宿主衍生之脂質物質組成。流感病毒包含兩種表面抗原，即醣蛋白神經胺糖酸酶（NA)及血球凝集素 (HA)，其在粒子表面處呈現為1〇至12 1^長之刺突。該等表面蛋白（詳言之為血球凝集素）決定流感亞型之抗原特異 I"生。病母病毋株根據宿主物種起源、地理位置及分離年伤、序列號，且對於流感A而言，藉由HA& NA亞型之血清學特性來分類。已識別流感A病毒之16種11八亞型（Ηι_ 130360.doc 200908994 H16)及 9 種 ΝΑ 亞型（Nl-N9)[Webster RG 等人，Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol. Rev. 1992;56:152-179 ; Fouchier RA等人，Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype (H16)

Obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol. 2005;79:2814-2822)。已自水鳥回收所有HA及NA亞型之病毒，但自1918 年起’僅3種HA亞型（HI、H2及H3)及2種NA亞型（N1及N2) 在人群中建立穩定譜系。僅識別流感B病毒之一種HA亞型及一種NA。流感A病毒進化且經歷連續抗原可變性[wuey d，Skehel J· The structure and the function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann. Rev. 扔oc/zem. l987;56:365-394]。缺乏藉由病毒RNA聚合酶之有效校對引起高速率之轉錄誤差，其可造成表面醣蛋白中之胺基酸取代。此稱為”抗原漂移，，。區段化病毒基因組允許第二類型之抗原變異。若2種流感病毒同時感染宿主細胞：則稱為抗原轉移，，之遺傳重分配可產生具有新表面或内P蛋白之新賴病毒。該等抗原改變，即，漂移，及轉移，均為不可預知的’且自免疫學觀點而言具有顯著影響，因為其最終導致新流感病毒株之出現^使得病毒能逃避免疫系 ::弓丨起幾乎每年發生之熟知流行病。該等遺傳修飾已引起t致在人類中之大流行的新病毒變異體。二B病毒抗原漂移比在A病毒株中之抗原漂移頻 …抗原轉移係、未知的。儘管流感B之抗原性相異譜系 130360.doc 200908994 (、书為2個’例如B/山形及B/維多利亞）可偶而以各年之間各國豕之間變化之比例共流行’但流感疫苗通常僅含有一種流感B病毒株。 HA為界定不同流感病毒株之血清特異性的最重要抗原：該75-80 kD之蛋白含有許多抗原決定子，其中若干處歷不同病毒株之序列改變的區域中（病毒株特異性決 f 疋子）且其他抗原決定子處於為許多ha分子所共有之區域中（共有決定子）。流感病毒幾乎每個冬季均弓丨起流行病，對於MB型病毒而言，感染速率經6週時期高達4〇%。流感感染產生自亞臨床感染至輕度上呼吸道感染直至嚴重病毒性肺炎之各種疾病病況。典型流感流行病引起肺炎及下呼吸道疾病之發，率增加’如住院治療或死亡率之增加率所見證。疾病 :嚴重程度主要由宿主年齡、其免疫狀況及感染位點來決疋0 ^ #钱運图冢中在所有流感相關死亡中之佔有率 ,^ ^ 虿旱達80%-90%。具有潛伏慢性疾病或具有受損免疫反應之個 1U體亦極可能經歷該等併發症。幼小嬰兒亦可遭受嚴重厌闲該專群體因此尤豆雲| 受保護。除該等，冒風險，群體 /、要健提供者進行疫苗接種。 …局亦推薦對保 4控制！年之流感流行病中，疫苗接種起關鍵作用。當二j H疫苗為失活或活的減毒流感疫疫每包含三種可能形式之抗原製劑：失活完整病毒；2 I30360.doc 200908994 毒粒子’其中純化病毒粒子經清潔劑或其他試劑破壞以溶解脂質包膜（所謂"裂解"疫苗）；或純化HA及NA(亞單位疫苗）。該等失活疫苗係經肌肉内（i.m.)、皮下（s c)或鼻内 (i.n_)給予。所有種類用於大流行病間期用途之流感疫苗通常為三價疫苗。其通常含有衍生自兩種流感A病毒病毒株及一種流感B病毒株之抗原。如由單向輻射免疫擴散法（single radial immunodiffusion ’ SRD)所量測，標準〇·5 ml可注射劑量在大多數狀況下含有（至少）15 pg來自各病毒株之血球凝集素抗原組份（J.M. Wood 等人：An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247 ; J. M. Wood等人 ’ International collaborative study of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 3 17-330)。亦已報導四價疫苗，其含有除三種經典病毒株以外之額外B病毒株（Commun Dis Intel] 2006, 30, 350-3 57)或額外 H3N2病毒株（Vaccine 1992, 10, 506-51 1)。各季欲併入流感疫苗中之大流行病間期流感病毒病毒株係由與國家衛生當局及疫苗製造商合作之世界衛生組織 (World Health Organisation)來確定。當前可用之大流行病間期流感疫苗在所有年齡群體中均視為安全的（De Donato 130360.doc 200908994 等人，1999，Vaccine, 17，3094-3 101)。然而’疫苗功效係因受者之年齡及免疫狀況及疫苗與流行流感病毒株之間的匹配而受影響。幾乎無跡象表明當前之流感疫苗在2歲以下小孩中起作用。此外，預防典型確 s忍流感疾病之經報導疫苗功效率對於老年人而言為23%-72°/。’其顯著低於對於年輕成年人所報導之6〇%_9〇%功效率（Govaert，1994，J. Am. Med. Assoc., 21, 166-1665 ; Gross, 1995, Ann Intern. Med· 123, 523-527)。已展示流感疫苗之有效性與血球凝集抑制（HI)抗體對病毒病毒株之血清效價有關，且若干研究已發現老年成年人在流感免疫後顯示比年輕成年人較低之HI效價（Murask〇，2〇〇2,

Experimental gerontology, 37，427-439) ° 作為背景而言，在大流行病間期，流行之流感病毒係與來自先前流行病之彼等流感病毒有關。該等病毒在生命早期以不同感染免疫性水平在人群之間傳播。該流行通常歷經2-3年時期而促使新病毒株之選擇，該等新病毒株已發生足夠改變以在普通群體中再次引起流行病；該過程係稱為抗原漂移’。儘管歷經若干年，，漂移變異體，之總體影響 *係類似的，但其在任何一年内在不同社區、地區、國家或洲中可具有不同影響。典型流感流行病引起肺炎及下呼吸道疾病之發生率增加，其如由住院率或死亡率之增加率所見蹬。老年人或具有潛伏慢性疾病之彼等人最有可能經歷該等併發症’但幼小嬰兒亦可遭受嚴重疾病。每隔一段不可預知之時間，新穎流感病毒伴隨完全不同 130360.doc -10- 200908994

於前-季流行之病毒株之亞型的關鍵表面抗原(血球凝集素)而出現。此時’所得抗原可自先前在人類中流行之病毒株的相應蛋白變化2()%至5Q%。稱為”抗原轉移”之該現象可f生逃避，族群免疫，之病毒且造成大流行病。換言之、田人群對其不具有免疫性之新流感病毒出現時，發生流感大流行病。據認為’至少過去之大流行病在當來自不同物種之机感病t (諸如禽類或猪流感病毒）已跨越物種障壁時發生。若該等病毒具有在人與人之間傳播之潛能，則其可在幾個月至一年内傳播至全世界範圍，導致大流行病。舉例而言，在1957年（亞洲型流感大流行（Asian Hu PandemiC))，H2N2亞型病毒替代H1N1病毒，該H1N1病毒已至少自1918年該病毒首次分離以來即在人群中流行。H2 HA及N2 ΝΑ在195 7年與1968年間經歷抗原漂移，直至1968 年（曰港型流感大流行（Hong-Kong Flu pandemic))因出現 H3N2流感亞型而替代HA，其後N2 NA繼續與H3 HA一起你移（Nakajima 等人 ’ 1991，Epidemiol. Infect, 106, 383- 395)。已執行若干臨床研究以評估在未經預致敏群體中之安全性及免疫原性，其中單價候選疫苗含有大流行病毒株，諸如非流行性H2N2或H9N2病毒株。研究已調查在具有或不具有礬佐劑化之情況下，各種HA濃度（每劑量1.9、3.8、 7 · 5或1 5 gg HA)之裂解或完整病毒調配物。H2N2亞型流感病毒自1957年流行直至1 968年，此時其經’香港型大流行病 '期間之H3N2病毒株而置換。當今，1968後出生之個體對 130360.doc 200908994 H2N2病毒株係天然免疫性的。該等疫苗候選者已展示為免疫原性及良好耐受的。結果報導於Hehme，N等人2002, Med. Microbiol. Immunol. 191，203-208 ; Hehme N.等人 2004，Virus Research 103，163-171 中；且，兩項研究以 H5N1 進行報導（Bresson JL 等人 77ze Zcmcei. 2006:367 (9523):1657-1664 ; Treanor JJ 等人 at 五j u 2006;354:Π43-1351)。其他研究已報導經MF59佐劑化之流 f

Kj 感疫苗的結果。一項研究已報導，兩劑量之經MF59佐劑化之Η5Ν3流感疫苗在經預致敏群體中加強對流感Η5Ν1之免疫性（Stephenson等人，Vaccine 2003，21，1687-1693)，且另一項研究已報導在三劑量之經MF59佐劑化之流感 H5N3疫苗後所獲得之交叉反應性抗體對H5N1病毒的反應 (Stephenson等人，j. Infect. Diseases 2〇〇5，191，121〇_ 1215)。在流感大流行狀況下存在風險之人可由於季節性流感而不同於對併發症而言之確定風險群體。根據WH〇 , 5〇%之人類病例係由在20歲以下人體中出現之禽流感病毒株 H5N1引起，90〇/〇發生在年齡小於4〇歲之彼等人體中。 (WHO, weekly epidemi〇l〇gicai rec〇rd，2006年 6 月 30 日）。在大流行病期間，抗病毒符合需求，且存在流感風險期，因此有必要研發具有大投藥潛能之合適疫苗。一種行流感疫苗之一些生產能力藥物可能不足夠符合或不有效之個體數量將大於大流行病間量產生潛能且具有有效分布及方式為快速釋放用於產生大流。然而，因為大量疫苗接種將 130360.doc •12- 200908994 僅在大流行病發作之後開始，所以無論如何，其均將產生因識別病毒株及產生第一批量所需之時間而導致之重要延遲。此外，疫苗製造商每週存在固定及因此有限之輸出量。此意謂，當前方法將幾乎必然在大流行病來襲時在全世界範圍内留下大部分未受保護之群體。可用疫苗對於大部分群體而言將太遲’且死亡率預期較高，估計全世界 1.8-3.6億人死亡。種解決該當前困境之方式為，在大流行之前產行病疫苗，且設計具有”最佳候選大流行病病毒株，，之單價疫苗替代三價疫苗，以試圖降低疫苗體積，主要因為可能必要兩劑量之疫苗以達到在天然免疫受者中之保護性抗^ 水平（Wood JM 等人 Med Mirc〇bi〇1 ^細福 2〇〇2 i9i by 2〇1, Wood JMfAPhilos Trans R See L〇nd B Βί〇1 2001 ;356:1953_1960)。該疫苗隨後可用於儲存或在大流行病間期用於預致敏人群。 =地’因為當前W完全因用於北半球及南半球以：之季節性三價疫苗的產生而整年消耗，所以上述兩種方法均係不可行的，因為不存在產生 =大流行病病毒株，，之額外生產能力土急品尋找對付大流行病間期„疫苗短缺在每年流感季節期間經常性地遇到。案，該為建立額外生產能力，然而其將需要種解決方案可論如何均不足以作為應之建構，其無 B 牛大，现仃病來襲夕士、上目則’快速獲得額外能力之解決 ^之方法。飞將為舍目短用於每年 I30360.doc 200908994 三價疫苗之生產時間。在大多數國家，每一季節均發生流感疫苗之·性短缺’其排除對於發展嚴重流感疾病及併發症而言視為高風險之群體的最佳保護。因為抗原產生為流感疫苗生產中之限速因素，所以必需探究替代性抗原節省策略。 -些方法依賴於佐劑化，其目的在於增加疫苗之免疫原性以能夠降低抗原含量（抗原節省）且因此增加可用疫苗劑量之數量。佐劑之使用亦可克服天然群體中抗原之潛在弱免疫原性。已公開若干方法。已使用經鋁鹽佐劑化之完整失活 Η2Ν2 或 Η9Ν2病毒（N. Hehme 等人 Virus Research 2004, 103, 163-171)或使用普通亞病毒粒子H5N1疫苗或經氫氧化鋁佐劑化之裂解病毒H5N1疫苗（Bresson JL等人The Lancet 2006:367 (9523):1657-1664 ； Treanor JJ#AN Engl J Med. 2006;354:1343-1351)展示實例。該後者試驗之結果指示，普通及經佐劑化H5N1病毒疫苗在至多9〇之抗原劑量下係安全的（僅作為普通亞病毒粒子疫苗進行測試）。然而，使用該高劑量之抗原與在大流行病狀況下必需賦予之抗原節省策略不可相容。呈水包油乳液形式之經佐劑Μρ59佐劑化之亞單位流感,疫苗為市㈣以用於老年人及風險群體，且已證明其誘導比以未經佐劑化亞單位疫苗所獲得之效價更高之抗體效價的能力（De D〇nat〇等人1999, 17, 3094-3101)。然而，在近期公開案中，相同疫苗未證明其與未經佐劑化裂解疫苗相比之改良概況（Puig_Barbera 等人，2004, Vaccine 23, 283-289)。 130360.doc •14· 200908994 因此仍需要有效且同時解決抗原節省考慮因素之新疫苗。該等新疫苗將具有尤其抵抗弱或非免疫原性大流行病病毒株，或用於諸如老年人群體之免疫受損個體之可接受 (右非改良）免疫原性。§亥專新疫苗亦將理想地具有交又保護潛能，以便其可用作大流行病前之疫苗或儲存疫苗，以預致敏天然免疫群體而在宣布大流行病之前或之後抵抗大流行病病毒株。【發明内容】本發明者已發現，為改良流感疫苗之供應，可研發含有佐劑之新穎有效免疫原性流感調配物，因此使得可使用較低量之流感抗原。在此提供新穎佐劑化組合物，其使得抗原節省調配物就細胞介導之免疫反應及/或體液反應而言可提供對所有年齡群體之充分保護。本發明者尤其已發現可依賴於免疫原性流感組合物，該等組合物之特徵在於，免疫原性組合物中之佐劑的每—或〔所有個別組份均具有與先前認為適用者相比更低之含量。其具有維持抵抗抗原之免疫原性水平同時降低宿主受者體内之反應原性的優點。因此，在本發明之第一態樣中，提供呈適於人類用途之劑量體積之免疫原性流感組合物，詳言之為疫苗，其包含流感病毒抗原或抗原性製劑以及水包油乳液佐劑，其中該水包油乳液佐劑包含可代謝油及乳化劑，及視情況之母育酚及/或固醇，且其中該可代謝油係以低於丨丨mg2含量存在於該人類劑量中，且該乳化劑係以低於5 mg之含量存在 130360.doc -15- 200908994 於該人類劑量中。合在太歧 pn . B存在時，該母育酚及/或固醇係以低於12叫之含量存在於該人類劑4中。合適地，每劑量每病毒株之流感抗原的量為15 μ§ΗΑ或諸如小於15 pgHA之低量。在另-態樣中’本發明提供一種疫苗套組，其包含流感病毒抗原⑽m料抗原性製劑組份抗原組份，且另外包含用於伴隨或連續投藥之：本:中: 定義之佐劑。 \ ，在第三態樣中’本發明提供—種生產用於大流行病情形、大流行病前之情形或大流行病間期（季節性）情形之流感免疫原性組合物的方法，該方法包含將流感病毒抗原或其抗原性製劑與如本文中所定義之水包油乳液佐劑混合。詳言之，本發明提供一種生產流感疫苗之方法，該方法包含將佐劑化免疫原性物與醫藥學上可接受之賦形劑混合，且提供每劑量含有至多15盹流感企球凝集素抗原之疫苗單位的步驟。流感病毒可為卵衍生、植物衍生、細胞培養物衍生的，或可為重組產生的。合適地，流感病毒抗原:為卵衍生或細胞培養物衍生的。在第四態樣中，提供一種如本文中所定義之免疫原性組合物或疫苗，其適用於治療或預防藉由流感感染引起之疾病。在相關態樣中，本發明提供流感病毒抗原或其抗原性製劑及如本文中所定義之水包油乳液在製造用於保護以抵抗藉由流感病毒引起之感染或疾病之免疫原性組合物（例如疫苗）中的用途。 130360.doc -16- 200908994 在又一態樣中，提供（a)如本文中所定義之低量來自流感病毒株的流感.病毒抗原或其抗原性製劑及如本文中所定義之水包油乳液佐劑在製造免疫原性組合物或套組中之用途，該免疫原性組合物或套組與由未經佐劑化組合物所獲得之反應相比，在人類中誘導抵抗該病毒抗原或抗原性二合物之以下反應中的至少一者：丨）改良之CD4 丁細胞免疫反應，ii)改良之B細胞記憶反應，Hi)改良之體液反應。 Γ 在另-態樣’提供-種如上文所定義之用於保護以抵抗藉由流感病毒引起之感染或疾病的方法或用途，該流感病毒為免疫原性組合物中之抗原衍生自其之病毒的變異體。在另-實施例巾，提供一種如上文所定義之用於保護以抵抗藉由病原體引起之流感感染或疾病@方法或用途，該病原體包含作為免疫原性組合物中之彼抗原之變異體的抗原。本發明亦係關於—種疫苗接種之方法，其包含傳遞抗原及如本文中所定義之水包油乳液佐劑。本發明之其他態樣及優點在其較干又丨£只知•例之以下實施方式中進一步描述。、【實施方式】本發明者已發現佐劑組合物（直肖 U、巴含可代謝油及乳化劑，及視情況之母育酚及/或固醇，复丹甲各組份係以每人類疫苗劑量比先前所用更低之含看左 3里存在）可改良對流感製劑之免疫反應，而同時比其中每人_ 一才八T母人頬劑量中佐劑組份以較咼含量（合適地’高出2倍或2倍以上）在上）存在之某些先前技術 130360.doc •17- 200908994 調配物具有更低之反應原性。本發明者另外已發現流感調配物（其包含流感病毒或其抗原性製劑以及如本文中所定義之佐劑，且視情況另外連同諸如脂質A衍生物（諸如3D-MPL)之免疫刺激劑）能夠丨）與以未經佐劑化之病毒或其抗原性製劑所獲得者相比，改良抵抗該抗原或抗原性組合物之CD4 T細胞免疫反應及/或體液免疫反應，及/或ii)產生可與以經其中各組份以較高（合適地’咼出2倍或2倍以上）含量存在之佐劑佐劑化之組合物所獲付者相當的抵抗該抗原或抗原性組合物之CD4 τ細胞免疫反應及/或體液免疫反應。經佐劑佐劑化之調配物有利地用以誘導能夠偵測藉由MHC Π類分子呈現之流感抗原决疋基之抗流感CD4-T細胞反應。本申請者已發現，其有效靶向細胞介導之免疫系統以增加抵抗同源及漂移流感病毒株（疫苗接種及感染後）之反應性。本發明之特定實施例為，適用於本發明之組合物能夠在人類中提供以下之一或兩者：⑴與未經佐劑化之組合物相比，在再疫苗接種後抵抗流感之更佳血清保護，及（ii)與其中各組份以較高含量存在之經佐劑化組合物相比，在再疫田接種後抵抗流感之相當血清保護，其係如藉由滿足保濩之任何、若干或所有流感關聯物（亦即血清轉化率、轉化因子、保護率）之人類受檢者的數目來評估。此外，另特疋男'施例為，適用於本發明之組合物亦將能夠誘導以下之—或兩者：⑴與未經佐劑化之組合物相比，在人類受檢者首次疫苗接種後更高之B細胞記憶反應，及在再疫苗 130360.doc 200908994 接種後更尚之體液反應， ,,^ Λ 〇與其中各組份以較高（合適地，尚出2倍或2倍以上 a . , ^ 里存在之經佐劑化組合物相比’在人類受檢者首次藤„ . $ 又田接種後相當之Β細胞記憶反應’及在再疫苗接種後相當之體液反應。優=!發明之經佐劑化流感組合物具有若干優點。該等佐猎由與#效未經佐劑化組合物相比，或藉由與其中各佐劑組份以較高会吾六士 ^ 门s1存在之經佐劑化組合物相比來評估：

1)與未經佐劑化組合物相比經改良之免疫原性，藉此允許t何或所有以下各者：i)將對於較少免疫原性流感 \ •^株之弱免疫反應改良至與由未經佐劑化調配物所更高之水平；ii)將諸如老年人（50歲以上，通常為65歲以上）之特定群體中的弱免疫反應恢復至在年輕人中所見之水平(抗體及/或T細胞反應)； 2) 使用佐劑可克服天然群體或幼小嬰兒（6個月至*歲之間，尤其為1歲以下兒童)中之抗原的潛在弱免疫原性’且誘導預致敏及保護作用； 3) 除提供與經典疫苗（例如市售裂解疫苗）相比至少等效之抵抗疫苗病毒株的保護以外，其可藉由產生允許建立又又預致敏策略之改良交叉保護概況：增加之交又反應丨生、抵抗變異體（漂移）流感病毒株之交叉保護作用而賦予抵抗漂移病毒株之額外保護層；其受到特殊關主其中其可用作大流行病前之疫苗，進一步使得增強抵抗（流行）大流行病病毒株之保護僅需要一劑量 130360.doc -19- 200908994 之大流行病疫苗；其亦受關注係因為其可解決傾向於比在其他大流行病間期八病毒株H1Nlt更快出現之 H3N2漂移的問題；句與由其中各組份以較高(合適地，㈣倍或2倍以上) 含量存在之組合物所獲得之彼概況相比，經佐劑化組合物之降低反應原性概況，同時維持令人滿意之免疫原性潛能。 /. 藉由進一步以降低之抗原劑量（通常低於丨5 Mg/病毒株/ 劑幻及降低之佐劑劑量達到任何或所有該等優點，此將確保在緊急狀況下或用於大流行病情形(在大流行病情形下之抗原節省）之製備性的增加之能力，且在大流行病疫苗接種季節間期提供更高數量之群體可用疫苗劑量的可能性。藉由依賴於降低之抗原劑量及/或純之佐劑劑量的组合，其將使得可研發諸如四價疫苗之更複雜流感组合物， 2四價疫苗包含第四病毒株，其可為待添加至標準三價疫苗中之第二流感B病毒株或大流行病流感病毒株。在本發明之另一態樣中，如本文中所定義之經佐劑化免疫原性組合物證明關於流感特異性（視情況為交又反應性)CD4之抗體產生及疫苗接種後頻率兩者的免疫原性結果v、4系大於或等於分別以未經佐劑化疫苗或以經其中佐劑組份以較高含量存在之佐劑佐劑化之疫苗所產生的彼等結果。該效應在兒科群體或老年人群體中尤其重要，其允 4比s別商用疫苗更高之功效，㈣與接收其中佐劑組份 130360.doc -20- 200908994 的群體相具有更高（合適地，高出2倍）量之經佐劑化疫苗比，展示更低或更少之反應原性症狀。水包油乳液佐劑〆

根據本發明之佐劑為乳液，詳言之為水包油乳液，且可視情況包含其他免疫刺激劑。詳言之，乳液系統之油相包含可代謝油。術語可代謝油之含義在此項技術中為熟知的。可代謝可定義為"能夠藉由新陳代謝轉變，，（D〇riand,s Illustrated Medical Dicti〇nary，W B Sanders c〇m卿乂，第 25版(1974))。油可為任何植物油、魚油、動物油或合成油，其對受者而言不具毒性且能夠藉由新陳代謝轉變。堅果、種子及穀物為植物油之普通來源。合成油亦為本發明之部分’且可包括市售油，諸如NeobeE®及其他者。尤其合適之可代謝油為角鯊烯。角鯊烯（2,6,1〇，15，19,23_六甲基-2,6，10，14，18,22-二十四碳己烯）為不飽和油，其可大量存在於鯊魚肝油中，而在撖欖油、麥胚芽油、米糠油及酵母中之量較少’且其為適用於本發明之油。角鯊烯由於其係膽固醇生物合成中之中間物而為可代謝油（Merck索引，第10版，登記號8619)。水包油乳液本身在此項技術中為熟知的，且已建議適用作佐劑组合物（EP399843B);亦已將水包油乳液與其他活性劑之组合描述為用於疫苗之佐劑：WO 95/17210 ; WO 98/56414 ； WO 99/12565 ； WO 99/11241 ； WO 2006/ 100109 ; WO 2006/100110 ; WO 2006/100111，其揭示以角鯊烯、（X-生育酚及TWEEN 80為主，視情況經免疫刺激劑 130360.doc •21 · 200908994 QS21及/或3D-MPL調配之乳液佐劑。已描述其他基於水包油乳液之佐劑，諸如揭示於WO 90/14837 ; 00/50006 ; WO 2007/0803 08 ; WO 2007/006939 中之彼等佐劑，其全部形成油乳液系統（尤其當以角鯊烯為主時）以形成本發明之替代性佐劑及組合物。在特定實施例中，水包油乳液包含可代謝、無毒油，諸如角鯊烷或角鯊烯；視情況之母育酚，諸如生育酚’詳言之為α生育酚（且視情況為角黨烯與α生育酚）；及乳化劑界面活性劑），諸如非離子性界面活性劑tween 8〇頂或聚山梨醇酯80。在特定實施例中，油乳液另外包含諸如膽固醇之固醇。母育酚（例如維生素Ε)亦常用於油乳液佐劑中 (ΕΡ0382271Β1 ; US 5667784; w〇95/172i〇)。用於本發明之油乳液（視情況為水包油乳液）中之母育酚可如 ΕΡ0382271Β1中所述來調配，原因在於母育料為直經視情況小於1微米之母育紛小液滴（視情況包含乳化劑）之分散液、。或者’母育盼可與另—種油組合制，以形成油乳液油相彳與母㈣組合使用之油乳液的實例係描述於本文中，諸如上文所述之可代謝油。產生水包油乳液之古 ^ 法對於熟習此項技術者而言為熟知、市 °亥方去包含將油相與諸如PBS/TWEEN80™溶液之界面活性劑混合，桩 H ^ ^ ^ - 使用均質器均質化，對於熟習此項技術者而言明顯的係頭之方法將適合於均含使混合物兩次通過注射器針 J、體積之液體。同樣地，在微流 130360.doc •22. 200908994 化器（MHOS微流化機器，在6巴之最大塵力輸入（出口壓力約850巴）下，最多通過50次，歷時2分鐘之時期）中之乳化方法可由_ f此項技術者修改以產生較小或幸交Λ體積之乳液。修改可藉由包含量測所得乳液直至以所需直徑之油小液滴實現製備的常規實驗來實現。在水包油乳液中，油及乳化劑應處於水性載劑中。水性載劑可為（例如）磷酸鹽緩衝生理食鹽水。如藉由光子相關光譜法所量測，穩定水包油乳液中所見之油小液滴之尺寸視情況小於1微米，可在大體上3〇_6〇〇 nm之範圍内，視情況直徑大體上為3〇_5〇〇 nm左右，且視情況直徑大體上為150-500 nm，且直徑尤其為約15〇 nm。就此而言，以數量計80%之油小液滴應在該等範圍内，以數量計視情況大於90%且視情況大於95%之油小液滴在所疋·義之尺寸範圍内。本發明之關鍵態樣為，存在於免疫原性組合物之佐劑中的組份具有比先前認為適用者更低之量，合適地，每人類劑置之免疫原性組合物，低於丨丨mg之可代謝油（諸如角黨細）’例如在0.5-11 mg、0.5-10 mg或0 · 5 -9 mg之間，及低於5 mg之乳化劑（合適地，諸如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯）’例如在O.i-5 mg之間。存在時，合適母育酚 (例如α-生育酚）係為低於12 mg，例如在0.5-12 mg之間。本發明之佐劑組合物包含水包油乳液佐劑，合適地，該乳液包έ 0.5-10 mg之間量的可代謝油，及0.4-4 mg之間量的乳化劑，及視情況O.tU mg之間量的母育酚。合適地，該 130360.doc •23- 200908994 乳液具有油小液、、& ’商’以強度計’該等油小液滴之至少 70%，合適地為至少 n 乂 80%具有小於1 #瓜之直徑。本發明因此提供人韦 θ 、人類劑置之經佐劑化免疫原性組合物，其中該佐劑包含水肖匕，由礼液佐劑，其包含每人類劑量低於 11 mg含量之可仲劲+ 气谢油’合適地為角鯊烯，合適地，每人類劑量包含0.5 -11、〇 ς , Λ 0-5-10、0.5-9、l-io、ι_ιι、2-10、4- f 5-6或9-10 mg)之間的可代謝油。在另μ知例中，本發明提供人類劑量之經佐劑化免疫原性、且：物纟中該佐劑包含水包油乳液佐劑，其包含每人類 d里低於5 mg含量之乳化劑，合適地為聚氧化乙烯脫水山

梨糖醇單油酸酷「# L T (诸如Tween 80或聚山梨醇酯80™)，合適地，每人類劑量包含 0.1-5、0.2-5、〇.3·5、〇.4_5、0.5_4、或2 3 mg(例如0·4_12、2_3或4_5叫）之間的乳化劑。在實轭例中，本發明提供人類劑量之經佐劑化免疫原性 σ物其中δ亥佐劑另外包含每人類劑量低於丨2 mg含量母月酚σ適地為α-生育酚，合適地，每人類劑量包含〇.5-12、1(Μ1、1-11、2_10、4-9、5-7 mg(例如 10-11、5_ 6、2,5-3·5、1_2或ι·3 mg)之間的母育酚。、〇適地’根據纟發明之人類劑量之佐劑免疫原性組合物為其中水包油乳液佐劑包含以下各者之組合物：45_5 5或、§可代°射油（合適地為角鯊烯）、5-7 mg母育酚（合適地為α-生育酚）及2_3 mg乳化劑，該乳化劑可為非離子性界面 /舌J ( σ適地為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，諸如TWeen 8〇ΤΜ或聚山梨醇酯8〇ΤΜ)。根據另一合適實施例， 130360.doc •24- 200908994 f k: 根據本發明之人類劑量之佐劑免疫原,社組合物為1中水包油乳液佐劑包含以下各者之組合物：2_3叫可代謝油(合適地為角f稀）、2.5-3,5 mg母育紛（合適地為α_生育紛）及 1-1.5 mg乳化劑（合適地為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，諸如Tween 80™或聚山梨醇酯8〇TM)。在又一實施例中，根據本發明t人類齊j量之佐劑免疫原性組合物為其中水包油乳液佐劑包含以下各者之組合物：〇·5_ΐ5 可代 2油（合適地為角業烯）、0.5」5 mg母育齡（合適地為^生育酚）及0.25-0.75 mg乳化劑（合適地為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，諸如Tween 8〇TM或聚山梨醇酯8〇tm)。在一二狀況下’有利的可為’本發明之疫苗將另外含有穩定劑0 術語”人類劑量，，意謂流感組合物劑量(在將佐劑及抗原組伤此合之後）’其係以適於人類用途之體積傳遞。通常，其在〇.25與!·5 ml之間。在-實施例巾，人類劑量為約〇.5 ml。在另一實施例中，人類劑量高於〇 $ W，例如為約 0-6 0_7 0.8、0.9或約1 ml。在另一實施例中，人類劑量在1 ml與1.5 ml之間。在另—實施例中，尤其當免疫原性組合物用於兒科群體時，人類劑量可小於0.5 ml，例如在 0.25與0.5 ml之間’或精確地為〇」m卜〇 2爪卜〇 25如、 ml或〇·4 ml本發明之特徵在於，免疫原性組合物内之佐劑之每-或所有個別組份均處於比先前認為適用更低之含罝且通常如上文所述。詳言之，合適組合物在人類劑量之最終體積（合適地為約〇5 ml或約〇 7 mI)中包含以下量 130360.doc -25- 200908994 之以下水包油（ο/w)佐劑組份（表1 ): 表1A·根據本發明之特定以ο/w乳液為主之佐劑佐劑A 佐劑B 佐劑Ε 佐劑F 佐劑c 佐劑Η 佐劑G 佐劑D ο/w乳液* 125 μΐ 100 μΐ 83.33 μΐ 62.5 μΐ 50 μΐ 41.67 μΐ 31.25 μΐ 25 μΐ 組份：生育酚(mg) 5.94 (5.6-6.2) 4.75 (4.5-5.0) 3.96 (3.8-4.2) 2.97 (2.8-3.1) 2.38 (2.3-2.5) 1.98 (19-2 1) 1.49 Π 4-1 1.19 1」角鯊烯(mg) 5.35 (5.1-5.6) 4.28 (4.1-4.5) 3.57 (3.4-3.75) 2.68 (2.5-2.8) 2.14 (2.0-2.25) 1.78 (17-19) 1.34 π ι.ι 4^ 1 ^ « X 1 J 1.07 η π.ι η 聚山梨醇酯 80 或 Tween 80 (mg) 2.43 (2.3-2.6) 1.94 (1.8-2.0) 1.62 (1.5-1.7) 1.21 (1 小 1.3) 0.97 (0.9-1.0) 0.81 (0.8-0.9) 0.61 (0,58-0.64) 0.49 (0,47-0,51) *給出合適ο/w體積用於說明但並非限制 ()括號之間者為上述值周圍之合適範圍（+/_5〇/〇) 表1B-根據本發明之特定以o/w乳液為主之佐劑佐劑I 佐劑J 佐劑κ 佐劑L 佐劑Μ 佐劑Ν 佐《ο 佐劑Ρ 組份： Span 85(mg) 0.59 (0.56-0.62) 0.47 (0.45-0.49) 0.39 (0.37-0.41) 0.29 (0-28*0.3) 0.24 (0.23-0.25) 0.2 (0.19-0.21) 0.15 (0 14-0 16) 0.12 (0 11-0 13Ί 角鯊烯(mg) 4.88 (4.6-5.1) 3.9 (3.7-4.1) 3.25 (3.1-3.4) 2.44 (2.3-2.6) 1.95 (1.85-2.05) 1.63 (1.55-1.7) 1.22 (1.2-1 3) 0.98 (0 9-1 1) 聚山梨醇酯 80 或 Tween 80(mg) 0.59 (0.56-0.62) 0.47 (0.45-0.49) 0.39 (0.37-0.41) 0.29 (0.28-0.3) 0.24 (0.23-0.25) 0.2 (0.19-0.21) 0.15 (0.14-0.16) 0.12 (0.11-0.13) ——-1—佐劑Q 1佐劑R 1佐劑s 1佐劑τ丨佐劑U丨佐劑V丨佐劑W Ma-T/J · 1 佐劑X Span 85(mg) 0.84 (0.8-0.9) 0.67 (0.64-0.7) 0.56 (0.53-0.6) 0.42 (0.4-0.44) 0.34 (0.32-0.36) 0.28 (0.27-0.3) 0.21 (0.2-0.22) 0.17 (0 16-0 18) 角鯊稀(mg) 4.88 (4.6-5.1) 3.9 (3.7-4.1) 3.25 (3.1-3.4) 2.44 (2.3-2.6) 1.95 (1.85-2.05) 1.63 (1.55-1.7) 1.22 (1.2-1.3) 0.98 (0 9-11) _聚山梨醇酯 80 或 Tween 80(mg) 0.84 (0.8-0.9) 0.67 (0.64-0.7) 0.56 (0.53-0.6) 0.42 (0.4-0.44) 0.34 (0.32-0.36) 0.28 (0.27-0.3) 0.21 (0.2-0.22) 0.17 (0.16-0.18) ()括號之間者為上述值（+/_5%)周圍之合適範圍（+/_5%) 包括表1中彼等數值之所有給定數值（例如以0/❶或以mg s十）應理解為允許5%變化，亦即，4.8 8 mg角鯊稀應理解為意s胃在4.64-5.12 mg之間。可執行各組份（o/w乳液及抗原）之預稀釋以產生傳遞所 130360.doc -26- 200908994 需HA量及所需佐劑組份量之經佐劑化疫苗。在本發明之—態樣中，本發明之經佐劑化疫苗之。Λν乳液（無論預稀釋與否）均可以不超過或合適地低於總劑量體積-半之體積來添加。藉由說明’給出表ια中說明之調配物A-Η之乳液組份的合適體積（例如在⑵以25 y之範圍變化）。因此’在本發明之一態樣中，提供一種製造經佐劑化流感疫苗之方法包含㈣_體積之水包油乳液及第二體積之包含流感病毒或其抗原性製劑之水性懸浮液混合的步驟’其中第二體積大於第二體積。合適地，第一體積之〇/w乳液係在濃縮乳液之稀釋後獲得。

或者，將大體上相等體積（無論在預稀釋後與否）之乳液及抗原懸浮液混合，以產生本發明之經佐劑化疫苗組合物：各組份之各別體積通常將隨後具有其他組份之彼體積之最大10%過里（亦即佐劑乳液：抗原懸浮液比率為至1.1:1)，合適地具有最大5%過量（亦即〇~乳液：抗原懸浮液比率為1.1.05至1.05:1) ’合適地具有最大2 5%過量（亦即佐劑乳液：抗原懸浮液比率為1:1MW)。因此，在本發明之另-態樣中’提供—種製造經佐劑化流感疫苗之方法其包3將大體上相等體積之水包油乳液及包含流感病毒或其抗原性製劑之水性懸浮液混合的步驟。合適地，第一體積之0/W乳液係在濃縮乳液之稀釋後獲得。又在另一實施例中’本發明之經佐劑化疫苗之。/w乳液佐劑係以超過總劑量體積—半之體積來添加。因此，在本發明之另—態樣中’提供-種製造經佐劑化流感疫苗之方 130360.doc •27· 200908994 法，其包含將第一體積之水包油乳液與第二體積之包含流感病毒或其抗原性製劑之水性懸浮液混合的步驟，其中第 -體積大於第二體積。合適地’第一體積之〇~乳液係在濃縮乳液之稀釋後獲得。在所有三種方法中，最終人類劑量體積之乳液組份及視十月況HA之量比先前認為適用者更低且如本文中所主張。合適地’其具有如本文中所主張之特定量。疫苗内之各個別組份之量可表示為總疫苗組合物之百分比，亦即以％ (v/幻或以％ (w/v)計。以下轉化數字將為熟習此項技術者所已知且可應用：角鯊烯〇8S5 g/ml、α-生育酚0.949 g/ml、聚山梨醇酯80 1〇8〇 g/m丨及叶抓85 〇94 g/ml。因此，可代謝油（合適地為角鯊烯）係以總疫苗體積之 0.5% 至 2% ’ 合適地為〇_25-2 或 0,25-1.75，或 0.5-1.65，或〇.6-1.5，或〇.8-1.4或1-1.25。/。卜~)油之量存在於疫苗組合物中。在另一特定實施例中，可代謝油（合適地為角鯊烯）係以疫苗組合物總體積之約丨·25%或約〇 6% (w/v)的最終量存在。在另一特定實施例中，可代謝油係以總疫苗體積之 0.25% (w/v)的最終量存在。母育酚之量亦可表示為總疫苗組合物體積之百分比。合適地，母育酚係以免疫原性組合物總體積之〇 25%至2% (w/v)的量存在於疫苗組合物中，例如總疫苗體積之〇 25_ 2，包含 0.25-2 或 0.25-1.75，或 0.5-1.65 或 0.6-1.5 ’ 或〇·8_ 1.4或1-1.25 % (w/v)母育酚。在本發明之一實施例中，母 130360.doc -28- 200908994 育酚係以疫苗組合物總體積之〇 2%與2% (v/v)之間的量存 j，或在0.5 ml疫苗劑量體積中具有125% (v/v)之量。在一特定實施例中，母㈣細免疫原性組合物的最終量存在。在另槓之，力将疋實把例中，母育紛係以，疫苗體積之0.25% (v/v)之最終量存在或纽5 mi疫苗劑 2：體積中為1.25% (v/v)或在〇.7 mi疫苗劑量體積巾為 (★)，或在0.5 ml疫苗劑量中為G 5% (v/v)或在g.7 W疫苗劑量中為 0.35-0.37%或〇.36%。在本發明之一實施例中，乳化劑係以每人類劑量(M_5、 0.2 5 0.3-5、0.4-5、0.4-1.2、〇,5_4、u、2-3 或 4-5 mg之量存在。當存在-種以上乳化劑時，諸如當存在丁咖8〇及Span 85兩者時，所主張之量應理解為乳化劑之總量。乳化劑之量可表示為總疫苗組合物體積之百分比。合適地，乳化劑係以免疫原性組合物總體積之〇125_〇 8% (w/v)的量存在於疫苗組合物中，諸如為總疫苗體積之 0.08-0.5 或(M-0.7 ’ 或〇·2_〇.6，或〇 25·〇 55，或〇 3 〇 52 或 0.4-0.5% (w/v)。在特定實施例中，乳化劑係以總疫苗組合物體積之1%、0.5%或〇,2% (w/v)之量存在。在特疋實把例中，0.5 ml疫苗劑量體積含有〇 5% (w/W)TWeen 80,且0.7 ml疫苗劑量體積含有〇35% (w/w) Tween 80。在另一特定實施例中，〇 5如疫苗劑量含有 0.2% (w/w)乳化劑，且〇 7 ml疫苗劑量含有〇 Μ% (w/w) 乳化劑。Span 85(脫水山梨糖醇三油酸酯）亦可以〇丨至1% 之含量存在於用於本發明之乳液中，合適地為約〇5%或 130360.doc -29- 200908994 0.5%以下。在特定實施例中’當存在時，Span 85係以與聚山梨醇酯80百分比相同之百分比添加至組合物中。在一些狀況下，有利的可為，本發明之免疫原性組合物及疫苗將另外含有穩定劑’例如其他乳化劑/界面活性劑，包括辛酸（merck索引第1〇版，登記號1739)，例如三辛精（Tricaprylin) 〇本發明另外提供一種佐劑組合物，其包含如上文中所定義且如上文所定義之量的個別組份，（例如）但並非如表所說明係排他的。通常，該佐劑組合物將具有人類劑量合適體積。在佐劑呈欲與液體形式抗原性組合物組合之液體形式時，佐劑組合物將具有人類劑量合適體積，其為人類劑量之預期最終體積之部分，諸如人類劑量之預期最終體積的大致-半，例如，對於07我預期人類劑量而言為 36〇μ1體積，或對於〇.5ml之預期人類劑量而言為25〇_ ^若人類疫苗劑量增加，則預期佐劑組份之量（以叫叶） ::量體積之增加(簡單而言為變得更稀) 合物與抗原組合物組合時，視需要將其其稀釋最終人類劑量。當然，該劑量之最終體積將合物的體㈣變Γ始體積及添加至佐劑組合物中之抗原組組合物代’液體佐劑係用以復水經埭乾之抗原大致等於人類劑旦’佐劑組合物之人類劑量合適體積含有經滚乾广里謂體積。將液體佐劑組合物添加至

且口物之小瓶中。最終人類劑量可在〇 S 130360.doc -30· 200908994 與1.5 ml之間變化。在特定實施例中，人類劑量為約〇.5 ml或約〇.7 mi，在該實施例中，本發明之疫苗組合物每〇 5 ml人類劑量將包含小於11 mg或上文定義量，例如合適地為〇.5-11、1_11、2_1〇、4_8或5_611^之間（例如2_3、56或 9-10 mg)的可代謝油含量’此外在該實施例中，視佐劑組合物是否預期分別與液體或經凍乾抗原組合物組合而定，本發明之佐劑組合物每250 μΐ佐劑組合物或每500 μΐ佐劑組合物將包含小於丨丨mg或上文定義量之可代謝油含量，例如β適地為包含0.5-11、、2-1〇、4-8或5-6 mg之間 (例如2-3、5-6或9-10 mg)的可代謝油。同樣地’在其中人類劑量為0.5 mi之特定實施例中，在該實施例中，本發明之疫苗組合物每人類劑量將包含低於5 mg含量之乳化劑 (合適地為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯（諸如Tween 8〇™或聚山梨醇酯80TM))含量，合適地為每〇·5 ml人類劑量〇 3 0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-4 或 2-3 mg(例如〇.4_ 1’2、2-3或4-5 mg)之間的乳化劑，此外在該實施例中，本發明之佐劑組合物每人類劑量將包含低於5 mg含量之乳化劑（合適地為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯（諸如 Tween 8〇m或聚山梨醇酯8〇TM))含量，合適地為視佐劑組合物是否預期分別與液體或經凍乾抗原組合物組合而定，每250 μ1佐劑組合物或每500 μΐ佐劑組合物包含〇.丨_5、〇 2_ 5 〇·3_5、0.4-5、0.5-4 或 2-3 mg(例如 0.4-1.2、2-3 或 4-5 mg)之間的乳化劑。類似地，在其中人類劑量為0.5 ml之特疋實施例中，在該實施例中’本發明之疫苗組合物每人類 130360.doc 200908994 劑量將包含低於12 mg含晋夕#女、η 曰之母月酚（合適地為α-生育酚）含量，合適地為每〇.5 ml人類劑量包含〇 5_12、^ m 4-9、5-7 mg(例如 10_u、5_ 2.5-3.5或l_3 mg)之間的母育盼，此外在該實始；你丨Φ，+ ~ 曰、本發明之佐劑組合物每人類劑量將包含低於12 mg含量之讲古A θ 之母月酚（合適地為α-生育酚）含量’合適地為視佐劑組合物是 ^ 切疋否預期分別與液體或經凍乾抗原組合物組合而定，备2 s 母50 μ1佐劑組合物或每500 μΐ佐 / 劑組合物包含0.5-12、1-1丨、2 ln . 〇 110' (9、5-7 mg(例如 10- 11、5·6、2·5-3·5或1-3 mg)之間的母育酚。視情況地’油（例如角震烯）：母育驗（例如α_生育⑻之比率等於或小於1，因為其提供更穩定之乳液。

在一些狀況下，有利的可Α，士欲nR J馮本發明之疫苗將另外含有穩定劑。在免疫原性組合物中操作之佐劑的組份劑量合適地為能夠2強人類中對於抗原之免疫反應。詳言之可代謝油、母育盼及聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酿之合適量為盘未經佐劑化組合物相比改良組合物之免疫學潛能的量，或為在標乾人群中產生與經包含另更高 >量之該等組份< 佐劑佐劑化的組合物所獲得之免疫學潛能類似的免疫學潛能，同時就反應原性概況而言為可接受的量。可選免疫刺激劑在根據本發明之特定實施例中，佐劑為水包油乳液佐劑’其包含上文定義量之可代謝油(諸如角黛:烯)、母育酚 (諸如α-生育酚）及界面活性劑（諸如聚山梨醇酯8〇)，且不 130360.doc -32- 200908994 含有任何額外之免疫刺激劑，詳言之其不含有無毒脂質A 衍生物（諸如3D_MPL)或皂素（諸如QS21)。在本發明之另一實施例中，提供一種疫苗組合物其包含抗原或抗原組合物及佐劑組合物，該佐劑組合物包含水包油乳液及視情況之一或多種其他免疫刺激劑，其中該水包油乳液包含0.5-10 mg可代謝油（合適地為角鯊烯）、〇 5_ 11 mg母育齡（合適地為α_生育酚）及〇 4_4 mg乳化劑。在特定實施例中’水包油乳液佐劑視情況包含一或多種不同於QS2 1及/或MPL之額外佐劑或免疫刺激劑。在另一特定實施例中，水包油乳液佐劑及免疫原性組合物另外包含額外免疫刺激劑，其為脂多醣，合適地為脂質 A之無毒衍生物’尤其為單磷醯基脂質a或更尤其為3_去醯化單磷醯基脂質 A(3D-MPL)。3D-MPL係由 GlaxoSmithKline

Biologicals N.A.以名稱MPL出售且在整個文件中稱為MPL 或3D-MPL。參見（例如）美國專利第4,436,727號、第 4,877,61 1 號、第 4,866,034 號及第 4,912,094 號。3D-MPL 主要促進具有IFN-g(Thl)表型之CD4+ T細胞反應。3D-MPL 可根據GB222021 1 A中所揭示之方法而產生。化學上，其為3-去醯化單磷醯基脂質a與3、4、5或6個醯化鏈之混合物。在本發明之組合物中，可使用小粒子3D_MPL。小粒子3D-MPL·具有某一粒度以便其可經由ο』〗μηι過濾器經無菌過濾。該等製劑係描述於W094/21292中。諸如3D-MPL之該脂多醣可以每人類劑量免疫原性組合物1與50 pg之間的量來使用。該3D_mpl可以約25 pg，例 130360.doc •33· 200908994 如在20-30以之間’合適地在21-29 pg之間或在22與28 pg 之間或在23與27 pg之間或在24與26 pg之間或25 pg的含量來使用。在另一實施例中，人類劑量之免疫原性組合物包含約10 μ§ ’例如在5與15 pg之間，合適地在6與14 之間’例如在7與13叫之間或在8與12叫之間或在9與11叫之間或10 Mg含量之3D_MPL。在另一實施例中，人類劑量之免疫原性組合物包含約5 ’例如在1與9 pg之間或在2 與8 pg之間’或合適地在3與7 μ之間或4與6 μδ之間或5 Kg含量之3D-MPL。在另一實施例中’脂質A之合成衍生物係用作可選之額外免疫刺激劑’一些描述為TLR_4促效劑且包括（但不限於）： OM174(2-去氧-6-鄰-[2-去氧-2-[(R)-3 -十二醯氧基十四醢胺基]-4-鄰-膦酸基- β-D-葡萄t»底喃糖基]_2-[(R)-3-經基十四醯胺基]-α-D-葡萄旅喃糖基二氫構酸酯），（w〇 95/14026) OM 294DP (3S，9R)-3-[(R)-十二醯氧基十四醯胺基]_4_側氧基-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-經基十四酿胺基]癸_ι,ι〇_二醇，1，10-雙（二氫磷酸酯）（WO 99/64301及 WO 00/0462) OM 197 MP-Ac DP (3S-，9R)-3-[(R)-十二醯氧基十四醯胺基]-4-側氧基-5-氬雜- 9-[(R)-3-經基十四醯胺基]癸_1，1〇_ 二醇，1-二氫鱗酸S旨10-(6 -胺基己酸g旨）（WO 01/46127) 可使用之其他TLR4配位體為烧基葡萄胺糖填酸酯 (AGP) ’諸如WO 9850399或US 6303 347中揭示之彼等配位 130360.doc -34- 200908994 體（亦揭示AGP之製備方法），合適地為如US 6764840中所揭示之RC527或RC529，或AGP之醫藥學上可接受之鹽。一些AGP為TLR4促效劑，且一些為TLR4拮抗劑。認為兩者均適於用作佐劑。能夠經由TLR-4引起信號轉導反應（Sabroe等人，JI 2003 第1630-5頁）之其他合適TLR-4配位體為（例如）來自革蘭氏陰性細菌（gram-negative bacteria)之脂多醣及其衍生物，或其片段，詳言之為LPS之無毒衍生物（諸如3D-MPL)。其他合適TLR促效劑為：熱休克蛋白（heat shock protein， HSP)10、60、65、70、75或90;界面活性劑蛋白A、玻展酸寡醣、硫酸乙醯肝素片段、纖維結合蛋白片段、血纖維蛋白原肽及b-防禦素-2、胞壁醯基二肽（MDP)或呼吸合成病毒之F蛋白。在一實施例中，TLR促效劑為HSP 60、70 或90。其他合適TLR-4配位體係如W0 2003/011223及W0 2003/099195中所述，諸如WO 2003/01 1223之第4-5頁上或 W0 2003/099 195之第3-4頁上所揭示之化合物I、化合物II 及化合物III，且尤其為W0 2003/011223中所揭示之彼等化合物，諸如 ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、 ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680 及ER804764。合適地，該TLR-4配位體為ER804057。

Toll樣受體（TLR)為I型跨膜受體，其演化性地保存於昆蟲與人類之間。迄今為止已確立十種TLR(TLR 1-10)(8&1^〇6等人，11 2003第163 0-5頁）。1'[11家族之成員具有類似之細胞外域及細胞内域；已展示其細胞外域具有白 130360.doc -35- 200908994 胺酸虽集之重複序列，且其細胞内域類似於介白素_ 1受體 (IL-1R)之細胞内區域。TLR細胞在免疫細胞及其他2胞 (包括血管上皮細胞、脂肪細胞、心肌細胞及腸上皮細胞）之間經差異性地表現。TLR之細胞内域可與接附蛋白 Myd88相互作用，該接附蛋白Myd88在其細胞質區域中亦具有IL-1R域，引起細胞激素之NF_KB活化；該Myd88路徑為藉由TLR活化實現細胞激素釋放的一種方式。tlr之主要表現係在諸如抗原呈現細胞（例如樹突狀細胞、巨嗟細胞等）之細胞類型中。樹突狀細胞藉由經TLR刺激之活化引起樹突狀細胞之成熟’且產生諸如IL -1 2之發炎細胞激素。迄今為止進行之研究已發現TLR識別不同類型之促效劑，儘管一些促效劑為若干TLR所共有。TLR促效劑主要源自細菌或病毒，且包括諸如鞭毛蛋白或細菌脂多醣（LPS)之分子。"tlr促效劑”意謂能夠作為直接配位體或間接經由產生内源或外源配位體而經由TLR信號轉導路徑引起信號轉導反應之組份 (Sabroe等人，JI 2003 第 1630-5 頁）。在另一實施例中，TLR分子之其他天然或合成促效劑係用作可選之額外免疫刺激劑。該等促效劑可包括（但不限於）TLR2、TLR3、TLR7、TLR8及 TLR9之促效劑。因此，在一實施例中，佐劑及免疫原性組合物另外包含選自由以下各者組成之群的額外免疫刺激劑：TLR4促效劑、TLR-2促效劑、TLR-3促效劑、TLR-4促效劑、TLR-5 促效劑、TLR-6促效劑、TLR-7促效劑、TLR-8促效劑、 I30360.doc • 36- 200908994 TLR-9促效劑或其組合。在本發明之一實施例中，使用能夠經由TLR-1引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，JI 2003第1630-5 頁）。合適地，能夠經由TLR-1引起信號轉導反應之TLR促效劑係選自：三醯化脂肽（LP);苯酚-可溶性調節蛋白；結核分枝桿菌 LP(Mycobacterium tuberculosis LP); S-(2 3-雔 (十六醯氧基）-(2-RS)-丙基）-N-十六醯基_(R)_CyS_(s)_Sei·-(S)-Lys(4)-〇H，三鹽酸鹽（pam3CyS)LP，其模擬細菌脂蛋白之乙醯化胺基末端；及來自伯氏疏螺旋菌（B〇rreHa burgdorfei)之〇SpA LP。在替代性實施例中，使用能夠經由TLR_2引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，JI 2003第1630-5頁）。合適地，能夠經由丁 LR-2引起信號轉導反應之TLR促效劑為以下之一或多者：來自結核分枝桿菌、伯氏疏螺旋菌、梅毒螺旋體（Tpallidum)之脂蛋白、肽聚糖、細菌脂肽；來自包括金黃色葡萄球菌（Staphyl〇COCCUS aureus)之物種的肽聚糖；脂胞壁酸、甘露糖搭酸、奈瑟菌屬孔洞蛋白⑽说士 porin)、細菌纖毛（bacteriai fimbHae)、耶爾森氏菌屬毒性因子（Yersina Virulence factor)、CMV病毒粒子麻疹血球凝集素及來自酵母之酵母聚醣。在替代性實施例中，使用能夠經由似_3引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，n扇3第163〇-5頁）。合適地’能夠經由TLR_3引起信號轉導反應之tlr促效劑為又鏈RNA(dsRNA)，或聚肌*酸_聚胞嘴^定*玄*酸（p。^ I30360.doc -37· 200908994 ic，一種與病毒感染相關聯之分子核酸類型）。在替代性實施例中，使用能夠經由TLR-5引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，JI 2003第1630-5頁）。合適地，能夠經由TLR-5引起信號轉導反應之TLR促效劑為細菌鞭毛蛋白。在替代性實施例中，使用能夠經由TLR-6引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，JI 2003第1630-5頁）。合適地，能夠經由TLR-6引起信號轉導反應之TLR促效劑為分枝桿菌脂蛋白、二醯化LP及苯酚可溶性調節蛋白。其他 TLR6促效劑係描述於W0 2003043572中。在替代性實施例中，使用能夠經由TLR-7引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，JI 2003第1630-5頁）。合適地，能夠經由TLR-7引起信號轉導反應之TLR促效劑為單鍵 RNA(ssRNA)，洛索立賓（loxoribine，一種在 N7 及 C8 位置處之鳥苷類似物），或咪唑并喹啉化合物或其衍生物。在一實施例中，TLR促效劑為p米啥莫特（imiquimod)。其他TLR7促效劑係描述於W002085905中。在替代性實施例中，使用能夠經由TLR-8引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，JI 2003第1630-5頁）。合適地，能夠經由TLR-8引起信號轉導反應之TLR促效劑為單鏈RNA(ssRNA)，其係一種具有抗病毒活性之咪唑并喹琳分子，例如雷西啥莫特（resiquimod)(R848);雷西嗤莫特亦能夠藉由TLR-7識別。可使用之其他TLR-8促效劑包括 WO 2004071459中所述之彼等促效劑。 130360.doc -38- 200908994 在替代性實施例中，使用能夠經由TLR-9引起信號轉導反應之TLR促效劑（Sabroe等人，JI 2003第1630-5頁）。在一實施例中，能夠經由TLR-9引起信號轉導反應之TLR促效劑為HSP90。或者，能夠經由TLR-9引起信號轉導反應之TLR促效劑為細菌或病毒DNA、含有未甲基化CpG核苷酸之DNA，詳言之為稱作CpG基元之序歹ij情況。含CpG之寡核苷酸主要誘導Th 1反應。該等寡核苷酸為熟知的且描述於（例如）W0 96/02555、W0 99/33488及美國專利第 6,008,200號及第5,856,462號中。合適地，CpG核苷酸為 CpG寡核苷酸。適用於本發明之免疫原性組合物中之合適募核苷酸為含有CpG之寡核苷酸，其視情況含有兩個或兩個以上藉由至少3個，合適地至少6個或6個以上核苷酸分離之二核苷酸CpG基元。CpG基元為胞嘧啶核苷酸接著鳥嘌呤核苷酸。本發明之CpG寡核苷酸通常為去氧核苷酸。在特定實施例中，寡核苷酸中之核苷酸間鍵為二硫代磷酸酯，或合適地為硫代磷酸酯鍵，儘管磷酸二酯及其他核苷酸間鍵在本發明之範疇内。本發明之範疇内亦包括具有混合核苷酸間鍵聯之寡核苷酸。產生硫代磷酸酯募核苷酸或二硫代磷酸醋之方法係描述於US 5，666，153、US 5,278,302 及WO 95/26204中。較佳寡核苷酸之實例具有以下序列。該等序列可含有經硫代磷酸酯修飾之核苷酸間鍵聯： OLIGO 1(SEQ ID N〇：l)； TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT 130360.doc -39- 200908994 (CpG 1758)

OLIGO 3(SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006或 7909) OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) 合適地，使用硫代磷酸酯骨架CpG7909(SEQ ID NO:4)。替代性地，CpG寡核苷酸可包含上文指定之序列，因為其具有對其之不連續缺失或添加。本發明中所用之CpG募核苷酸可藉由此項技術中已知之任何方法來合成（例如參見 EP 468520)。方便地，該等寡核苷酸可利用自動合成器來合成。在另一實施例中，佐劑及免疫原性組合物另外包含皂素佐劑。適用於本發明之尤其合適皂素為Quil A及其衍生物。Quil A為自南美皂皮樹（South American tree βαροπαΓ/α Μο//πα)分離之皂素製劑且由Dalsgaard等人於 1974 年（"Saponin adjuvants", Archiv. fiir die gesamte Virusforschung，第 44卷，Springer Verlag，Berlin，第 243-254頁）首次描述為具有佐劑活性。已藉由HPLC分離Quil A 之純化片段，該等片段保留佐劑活性，而無與Quil A相關聯之毒性（EP 0 362 278)，例如QS7及QS21(亦稱為QA7及 130360.doc -40- 200908994 QA21)。QS-21為源自皂皮樹樹皮之天然皂素，其誘導 CD8 +細胞毒性T細胞（CTL) ' Thl細胞及主要IgG2a抗體反應’且在本發明之情況下為較佳皂素。在本發明之合適形式中’免疫原性組合物内之皂素佐劑為皂皮樹quil A之衍生物’諸如Quil A之免疫活性部分，諸如QS_i7或QS-21，合適地為QS-21。在一實施例中，本發明之組合物含有呈大體上純形式之免疫活性皂素部分。在一實施例中，本發明之組合物含有呈大體上純形式之qS2 1，亦即qS2 1為至少90%純’例如至少95%純或至少98%純。其他適用息素係源自植物歐洲七葉樹 hippocastanum)氙 Gyophilla struthium。已描迤於 X歒中之其他皂素包括七葉素（Escin)，其已在Merck索引（第12版： ^•錄5虎3737)中4田述為歐洲七葉樹（h〇rse chestnut tree，拉丁文為：Jescw/ws 種子中存在之皂素混合物。其分離係藉由層析及純化（卩丨^161*,^2加/«^.价/-Fonc/z. 4, 213 (1953))及藉由離子交換樹脂（Erbring等人， US 3,238，190)來描述。已純化七葉素之部分且展示具有生物學活性（Yoshikawa M，等人（Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996年 8月；44(8):1454-1464))。亦可選擇來自之皂素（R· Vochten 等人，1968, J. Pharm. Belg.， 42, 213-226)。諸如QS2 1之該免疫活性皂素可以每人類劑量免疫原性組合物1與50 pg之間的量來使用。有利地，qS2丨係以約25 Mg，例如在20-30 pg之間，合適地在21_29吨之間或在22_ 130360.doc •41 - 200908994 28 pg之間或在23-27 pg之間或在24-26 pg之間或25 pg之含量來使用。在另一實施例中，人類劑量之免疫原性組合物包含約10 pg，例如在5與15 pg之間，合適地在6-14 pg之間，例如在7-13 pg之間或在8-12 pg之間或在9-11 pg之間或10 pg之含量的QS21。在另一實施例中，人類劑量之免疫原性組合物包含約5 pg，例如在1-9 pg之間或在2-8 pg 之間’或合適地在3-7 pg之間或4-6 pg之間或5 pg之含量的 QS21 。

3D-MPL及/或QS2 1之劑量能夠合適地增強人類中對於抗原之免疫反應。詳言之，合適之3D-MPL及/或QS21量為與未經佐劑化之組合物相比或與經另一 3D_MPL或QS21量佐劑化之組合物相比，改良組合物之免疫學潛能，同時就反應原性概況而s為可接受的量。通常對於人類投藥而言，皂素（例如QS21)及/或LPS衍生物（例如3D-MPL)將以每劑量 1 pg-200 pg，諸如1〇_50 或i gg_25叫之範圍存在於人類劑量之免疫原性組合物中。在特定實施例中，根據本發明之佐劑及免疫原性組合物包含於上文所述油乳液中之皂素（例如QS21)及/或Lps衍生物（例如3D-MPL)以及固醇（例如膽固醇）。該等固醇在此項技術中為熟知的，例如在Merck索引，第丨丨版，第34丨頁中膽固醇係經揭*為見於動物脂肪中之天然存在的固醇。另外，油乳液（詳言之為水包油乳液）可含有叶⑽85及/或卵磷脂及/或三辛精。包含水包油乳液、固醇及4素之佐劑係描述於WO 99/12565中。其他#、感击丨丨批杰威丹他光疫刺激劑之實例係描述 130360.doc -42- 200908994 於本文及"Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach 1995, Pharmaceutical Biotechnology，第 6卷，編者 Powell, M.F.及 Newman, M.J·，Plenum Press，New York and London, ISBN 0-306-44867-X 中 ° 在包括角鯊烯及皂素（視情況為QS21)時，有益的為調配物亦包括固醇（視情況為膽固醇），因為其允許降低乳液中之油的總含量。其引起降低製造成本、改良疫苗接種之總體舒適性以及定性及定量改良所得免疫反應，諸如改良之 IFN γ產生。因此，本發明之佐劑系統通常包含1至 300:1範圍内之可代謝油：皂素（w/w)比率，本發明亦可以低油”形式來使用，其可選範圍為1:1至200:1，視情況為 20.1至100:1，或大體上為48:1，該疫苗保留所有組份之有益佐劑特性，具有降低更多之反應原性概況。因此，一些實施例具有1:1至250:1，或20:1至200:1，或2〇:1至1〇〇:1範圍内，或大體上為48:丨之角蔑烯：QS21(W/W)比率。視情況地，亦包括以如本文所述之皂素：固醇比率存在之固醇 (例如膽固醇）。其中視情況包括額外免疫刺激劑之佐劑尤其適用於嬰兒及/或老年人疫苗調配物。根據本發明之水包油乳液佐劑可因此視情況另外包含5_ :〇、1〇-50 或 2〇·30Μ(例如 5_15、40-50、H)、2〇、3〇、4〇或50 Mg)脂質Α衍生物（例如3D_MPL)。水包油佐劑可視情 ^# 0.025-2.5 . o.os.i.5 > 〇.〇75.〇.75 . •叫(例如 0.2-0.3、(M-CM5、0.25 或〇125 叫)固醇(例 130360.doc -43- 200908994 如膽固醇），1-60、10-50 或 20-30 pg(例如 1-10、5-15、40_ 50 ' 10、20、30、40 或 50 pg)脂質 A衍生物（例如 3D-MPL 或脂質A之任何合成衍生物），及1-60、10-50或20-30 pg(例如 1-10、5-15、40-50、10、20、30、40 或 50 μδ)4 素（例如QS21)。流感病毒病毒株及流感抗原、疫苗接種方案、給藥及功效標準該流感病毒或其抗原性製劑可為卵衍生或細胞培養物衍生的。舉例而言，根據本發明之流感病毒抗原或其抗原性製劑可藉由使流感病毒在卵中生長且純化所獲尿囊液而源自習知之胚卵方法。卵可在短期内大量積聚。或者，其可使用生長病毒或表現重組流感病毒表面抗原之細胞或細胞培養物而源自任何新穎產生方法。用於使病毒生長之合適細胞受質包括（例如）犬腎細胞，諸如MDCK或來自MDCK 純系之細胞、MDCK樣細胞；猴腎細胞，諸如AGMK細胞，包括Vero細胞；合適豬細胞系；或適於產生用於疫苗目的之流感病毒的任何其他哺乳動物細胞類型。合適細胞受質亦包括人類細胞，例如MRC-5細胞或Per_C6細胞系。合適細胞受質不限於細胞系；舉例而言，亦包括初級細胞’諸如雞胚胎纖維母細胞及禽類細胞系，諸如雞或鴨細胞系（例如EBx細胞系，諸如分別源自雞或鴨胚胎幹細胞之 EB14或EB24)。合適之昆蟲細胞為Sf9或m5。在一實施例中，根據本發明適用之流感病毒或其抗原性製劑可為裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性製劑。在替代 130360.doc •44· 200908994 性實施例諸如失活毒顆粒。劑。 &敕机感製劑可含有另一類型之失活流感抗原，正病t或純化HA& NA(亞單位疫苗）或流感病又只施例中，流感病毒可為活的減毒流感製劑= 解流感病毒或其裂解病毒抗原性製試劑破壞m :母’齊1 ’其中病毒粒子經清潔劑或其他製巧 ^ ^ f n裂解病毒或其裂解病毒抗原性地藉由將感純或失活之完整流感病毒破碎，同 ^機洛劑或清潔劑之溶解濃縮，且隨後移除所有或洛解劑及-些或大多數病毒脂質物質來製備。且裂解病毒抗原性製劑意謂裂解病毒製劑，其與裂解病毒相比可已經歷某種程度之純化，同時保留裂解病毒組份之大多舉㈣言’ #產生㈣㈣’裂解病毒可印〉可染蛋白耗盡，或當產生於細胞培養物中時，裂解病 :可自宿主細胞污染物耗盡。裂解病毒抗原性製劑可包含 :種以上病毒病毒株之裂解病毒抗原性組份。含有裂解病毒之疫苗（稱為，流感裂解疫苗’）或裂解病毒抗原性製劑通常含有殘餘基質蛋白及核蛋白且有時含有脂質，以及膜包膜蛋白。該等裂解病毒疫苗將通常含有大多數或所有病毒結構蛋白Μ盡f未必呈與其在完整病毒中所存在之相同比例。市售裂解疫苗之實例為（例如）fluarixTM、 FIUSHIELDTM或 FLUZONETM。或者，流感.病毒可呈完整病毒疫苗之形式。其在大流行病情況下可證明具有優於裂解病毒疫苗之優點，因為其使 130360.doc -45· 200908994 得對於新流感病毒病毒的不確定性得以避免。對於5可否成功產生裂解病毒疫苗解病毒之習知清潔劑可:f言’用於產生裂在使用不同清潔毋且使其不可用。儘管總存法的可处料/ /或研發用於產生裂解疫苗之不同方可用二整广:=費時間，其在大流行病情況下將不兀正病毒方法之可素痒衫古大於裂解病毒，因為在製借：疫苗生產能力亦化牛‘，'、在1備合適裂解疫苗所必需之額外純化步驟期間將損失相當大量之抗原。 # ^例中’流感病毒製劑係呈純化亞單位流感疫 “亞早位流感疫苗通常含有兩種主要包膜蛋白，及以，且可具有優於完整病毒粒子疫苗之額外優點，，為尤其在年輕受疫苗接種者中其反應原性通常較低。亞 =位，田可藉由重組或自經破壞病毒粒子純化而產生。市〇亞單位疫田之實例為（例如）AGRIPPALTM或fluvirinTM。在特疋實施例中，w。亞早位疫苗係自至少一種主要包膜組份來製備，諸如自血球凝集素（HA)、神經胺糖酸酶（NA)或 M2來製備’合適地自HA來製備。合適地，其包含兩種或兩種以上抗原之組合，諸如流感結構蛋白ha、NA、基質 ()及M2中之至少兩者的組合，合適地為HA與NA兩者之、、且σ ’視情況包含Ml。合適地，流感組份係藉由重組 DNA技術而產生’亦即自由重組操縱所得之核酸產生或自〃表現’該核酸包括活的重組載體（牛痘）或重組亞單位蛋白（梓狀病毒/昆蟲細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、酵母植物或細菌）。合適之昆蟲細胞為草地夜蛾 130360.doc -46· 200908994 /rwgf/?eriia)(Sf9)昆蟲細胞或自粉紋夜蛾 (JWc/zo/^wWa m_)(Invitrogen)研發之 High Five(Hi5)昆蟲細胞，且合適之桿狀病毒為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病病毒 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) (Baculogold，Becton Dickinson, PharMingen)或戶斤謂穿梭載體系統（Bacmid system)。在一實施例中，流感病毒製劑係呈病毒顆粒之形式。病毒顆粒為球形、單層囊泡，其在插入病毒顆粒之磷脂雙層膜中之真實構形中保留功能性病毒包膜醣蛋白HA及NA。市售病毒顆粒疫苗之實例為（例如）INFLEXAL VTM或 INVAVACTM。在另一實施例中，亞單位流感組份係以病毒樣粒子 (VLP)或衣殼體形式表現，合適地為植物製得或昆蟲細胞製得之VLP。VLP以其天然形式呈現抗原。VLP亞單位技術可完全基於流感蛋白，或可依賴於其他病毒，諸如鼠科動物白血病病毒（MLV)，且可因此包含非流感抗原，諸如 MLV gag蛋白。合適之VLP包含至少一種，合適地為至少兩種流感蛋白，視情況以及其他流感或非流感蛋白，諸如 Ml 及 HA、HA 及 NA、HA、NA 及 Ml 或 HA、NA 及 MLV gag。其可在植物細胞或昆蟲細胞中產生。VLP亦可載有來自一種以上流感病毒株之抗原，諸如自兩種季節性病毒株（例如H1N1及H3N2)製得或（例如）自一種季節性病毒株及一種大流行病病毒株（例如H3N2及H5N1)製得之VLP。因此，在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包含來 130360.doc -47- 200908994 自生長於卵或細胞培養物上之流感病毒的流感病毒抗原或其抗原性製劑。在另一實施例中，該流感病毒抗原或其抗原性製劑包含完整病毒、裂解病毒、病毒顆粒或一或多種選自HA、NA、Ml、M2之純化抗原。在另一實施例中，該（等）純化抗原係自生長於哺乳動物、禽類或昆蟲細胞中之流感病毒來製備。特定而言，該（等）純化抗原係經重組產生。其可呈病毒樣粒子之形式。流感病毒抗原或其抗原性製劑可藉由多種商業上可適用方法中之任何方法而產生，例如以引用的方式併入本文之專利第DD 300 833號及第DD 211 444號中所述之裂解流感方法。傳統上，使用溶劑/清潔劑處理，諸如磷酸三正丁酯或乙醚以及TWeenTM(稱為,，Tween_乙醚”裂解）而產生裂解流感，且該方法仍用於一些生產設施中。現使用之其他裂解劑包括清潔劑或蛋白水解酶或膽汁鹽，例如以引用的方式併入本文之專利第〇]0 1 55 875號中所述之去氧膽酸鈉。可用作裂解劑之清潔劑包括陽離子性清潔劑，例如十六烷基二甲基溴化銨（CTAB);其他離子性清潔劑，例如月桂基硫酸酯、牛黃去氧膽酸醋；或諸如上文所述者之非離子性清潔劑，包括Triton x_100(例如在Lina等人， Biologicals 28，95-103 中所述之方法中）及 Trh〇n Ν_ι〇ι ; 或任何兩種或兩種以上清潔劑之組合。裂解疫苗之製備方法可包括呈各種組合之多種不同過濾及/或其他分離步驟’諸如超速離心、超濾、區帶離心及層析(例如離子交換)步驟，及視情況(例如)用#、甲醛或 I30360.doc 48· 200908994 之前或法來進法係描 β，内醋或u.v.之失活步驟，該失活步驟可在裂解之後進行。裂解方法可以分批、連續或半連續方行1於裂解免疫原性組合物之較佳裂解及純化方述於 WO 02/097072 中。根據本發明之較佳裂解流感疫苗抗原製劑包含自生產方法剩餘之殘餘量的TWeen 80及/或丁出⑽χ_ι〇〇，儘管該等物貝可在製備裂解抗原之後添加或調整其濃度。在—實^ 例中，TWeen 80及Triton χ_1〇〇兩者均存在。該等非離: 性界面活性劑於疫苗劑量中之最終濃度的較佳範圍（自抗原性製劑產生）為： &

Tween 80 : 0.01至 1%，或約〇 1〇/〇 (ν/ν)

Triton Χ_100 : 〇.〇〇1 至〇1(% w/v)，或〇〇〇5 至〇咖 (w/v)。在特定實施例中，自抗原性製劑產生之Tween 8〇的最終濃度在0.025%-〇.〇9% w/v之範圍變化。在另一特定實施例中，抗原以2倍濃縮混合物形式來提供，其具有〇 0.2% (w/v)範圍内之Tween 8〇濃度，且必須在經佐劑化之最終調配（或於對照調配物中之缓衝液）後稀釋兩次。在另一特定實施例中，Triton X-1〇〇之最終濃产在 0_004%-0.017% w/v之範圍變化。在另一特定實施例中，抗原以2倍濃縮混合物形式來提供，其具有〇〇〇5%_〇. (w/v)範圍内2Trit〇n χ_1〇〇濃度，且必須在經佐劑化之最終調配（或於對照調配物中之緩衝液）後稀釋兩次。在一實施例中，流感製劑在低含量之硫柳汞存在下或在 130360.doc -49- 200908994 不存在硫柳汞之情況下製備。在另—實施例中，所得流感製劑在不存在有機汞防腐劑之情況下係穩定的，詳言之，忒製劑不含殘餘硫柳汞。詳言之，流感病毒製劑包含在不存在硫柳汞之情況下或在低含量硫柳汞（通常5 μ g / m丨或5 gg/ml以下）下經穩定化之血球凝集素抗原。特定而言，b 流感病毒株之穩定化作用係藉由諸如〇1生育酚丁二酸酯（亦稱為維生素E 丁二酸酯，亦即VES)之α生育酚衍生物來執行。该等製劑及製備其之方法係揭示於貨〇〇2/〇97〇72中。較佳組合物含有三種自適當流感季節之WH0推薦病毒株製備的失活裂解病毒粒子抗原。在一實施例中，根據本發明之流感病毒或其抗原性製劑及佐劑含於同一容器中。其稱為，一瓶式方法（one vial approach)'。在另一實施例中，小瓶為預填充注射器。在替代)·生實;^例中，根據本發明之流感病毒或其抗原性製劑及佐劑含於獨立容器或小瓶中且在投與受檢者體内之前或之後的短時内混合。其稱為，兩瓶式方法，。合適地，雙組伤疫田係由0.5 ml存在於^型玻璃小瓶（抗原容器）中之濃縮失活裂解病毒粒子抗原及含有〇 5 ml佐劑之預填充〗型玻璃 /主射器（佐劑谷器）組成。或者，疫苗為雙組份疫苗，其存在於2個小瓶中（-者用於抗原，—者用於佐劑，各為_ 量），以用於在室溫下，在投與第一患者前24小時内混合，且隨後在4。(：下儲存短期時間（例如至多—週）以供後續投藥。在注射時，將含有佐劑之多劑量小瓶或注射器之内含物注射至含有濃縮裂解病毒粒子抗原之小瓶中。混合之 130360.doc -50- 200908994 / ♦内3物抽取至注射器中且藉由肌肉内針替代此針。 y量、’工復水佐劑化之流感候選疫苗相應於〇 , W。在-實施例中’如藉由咖所測定，各人類劑量之免疫原性組合物每劑量每流感病毒株含有15 之HA。其尤其適用於老年人群。本么月之重要態樣為，流感抗原可以比先前已認為適用者更，之1來使用，合適地以每人類劑量之免疫原性組合 ξ物，每病毒病毒株小於15 Μ Μ之含*，例如每病毒株！與1 0 pg之間HA的含量來使用。口此在一實施例中，I人類劑量之免疫原性組合物含有低劑量之血球凝集素（HA)，其係定義為如藉由單向輪射免疫擴散法（SRD)所量測，每劑量小於15 μ§2ΗΑ，合適地為小於ίο盹之量（J.M. W00d等人：j. Bi〇i. 5 (1977) 237-247 ； J. M. Woodf Λ > J. Biol. Stand. 9 (1981) 3 0)在特疋實知例中，人類劑量之免疫原性組合物 ( 每病毒株包含約10叫，例如在5與15叫之間，合適地在6 與14 pg之間，例如在7與13叫之間或在8與12吨之間或在 9與11叫之間或10 之含量的血球凝集素（ha)劑量。在另一實施例中，人類劑量之免疫原性組合物每病毒株包含約5叫，例如在】與9叫之間或在2與8叫之間，或合適地在3與7吨之間或4與6吨之間或5吨之含量的血球凝集素 (HA)劑量。合適之量為1>9 μ§、2 5 μ§、3 8㈣、$ 〇叩、 7.5 pg或10 pg HA，或低於15叩之任何適合量iHA，其將經測定以便疫苗組合物滿足如本文所定義之功效標準。 130360.doc •51 - 200908994 有利地’可使用1叫之HA，或諸如0.5 pg之HA之甚至更小劑3：的HA劑ϊ ’其將允許滿足表2中所定義之調節標準。 HA之合適置為（例如）每人類劑量之免疫原性組合物，每流感病毒株1、2、3、4、5、6、7、8、9、1Q、^、12、 I3、14 pg(w/v)之任何量。ΗΑ之該低量可低至實際上可行之里，其限制條件為，其允許調配滿足國際（例如）eu或 FDA功效^準之疫苗，如了文所詳述（參見表2及如列舉之特定參數）。 ^ 使用〇.5 ml之疫苗劑量。1 ml之疫苗劑量（0,5 ml佐劑加G.5 ml抗原製劑）亦為合適的。有利地，根據本發明之疫苗劑量’詳言之為低HA量疫苗，彳以比習知注射裂解流感疫苗更」、夕挪& Α , 文】之體積來耠供’該體積通常為每劑量約 0-7或1 ml。根據本發明之低體積劑量合適地為每劑量低於500 ul，夺& #，„ ^吊低於300 μΐ且合適地不大於約2〇〇…或 μ '、下蜊里體積之輕微修改將視原始總樣本中之ΗΑ 辰度，或視以藉由鼻内或皮内路徑給藥之較小劑量的傳遞路位或視標靶群體(例如嬰兒可接收成年人劑量之一半而按慣例來進行。 k也欲包括在免疫原性或疫苗組合物中成 it::大流行病間期(季節-病毒株，或與大二嫉， ^ 人^大流行病爆發相關聯之潛能的病毒式。3 °適地，呈該等病毒株之多價組合物、混合物形仃病間期病毒株為（例如）在大流行病間期在全世界 130360.doc -52- 200908994 範圍内机仃之病毒株，諸如（但不限於）：H1N1、H1N2、古或市售流感疫苗為包括一種流感B病毒株及兩種 '瓜感A病毒株（H1N1、H3N2)之三價組合。士賦予其引起與大流行病流感病毒株相關聯之流感疾病大流行或爆發的潛能之流感病毒病毒株的特徵在於：其含有與田則流行病毒株中之血球凝集素相比新的金球凝集素，且因此幾乎所有人均天然免疫；其能夠在人群中水平傳播；且其對人類而言為病原性的。新血球凝集素可為在人群中歷時延長時期，可能數十年尚不明顯之血球凝集素，諸如H2。或’其可為之前尚未在人群中流行之血球凝集 ' H5 H9、H7或H6，其均發現於禽類物種（鳥類）中。在任-狀況下，大多數或至少大部分或甚至整個群體先則均未遇到抗原且對其天然免疫。目前，已由wh〇識別為可能可在人類中引起大流行病之流感A病毒為高病原性禽流感病毒。因&，根據本發明之大流行病疫苗將口適地包含H5N1病毒。適於包括在所主張組合物中之兩種其他合適病毒株為H9N2或H7N1。某些群體在大流行病情況下通常存在增加之感染流感的風險。老年人、慢性病患者及小孩尤其敏感，但許多幼兒 ^月顯健康之人亦存在風險。對於犯流感而言，1968年後之群體部分具有增加之風險。對於該等群體而言重要的係受到儘可能快且簡單方式之有效保護。〜^在增加風險之另一人群為旅行者。當今人們比過去旅行传更多，且其中悬薪、广土山 ^ 病f出現之區域，即中國及東南亞 -53- 200908994 已成為近年來流行之旅行目的地。旅行模式之該改變使新病毒能在數週而非數月或數年内到達整個地球。因此，對於該等人群而言，尤其需要疫苗接種以在大流行病情況或潛在大流行病情況下保護以抵抗流感。合適之病毒株為（但不限於）：H5N1、H5N8、H5N9、H7N4、 H9N2、H7N7、H7N3、H2N2及H7N1。人類中之其他大流行病病毒株為：H7N3(2例報導於加拿大）、H10N7(2例報導於埃及）及Η5Ν2(1例報導於日本）及H7N2。作為大流行病病毒株或易與大流行病相關聯之病毒株的流感病毒株將在本文件中簡稱為”大流行病病毒株”。本發明之流感藥劑合適地滿足某些國際疫苗標準。標準在國際上應用於量測流感疫苗之功效。對於與流感疫苗之每年批准程序相關之臨床試驗而言，血清學變數係根據用於人類用途之歐洲藥品評價署（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)標準（CHMP/BWP/214/ 96，專利醫藥品委員會（Committee for Proprietary Medicinal Products, CPMP) ，Note for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997. CHMP/BWP/21 4/ 96函件N° 96-0666:1-22)來評估（表2)。對成年人群體（18-60 歲）及老年群體（>60歲）而言，要求係不同的（表2)。對於大流行病間期流感疫苗而言，疫苗中所包括之所有流感病毒株之評估值（血清轉化因子、血清轉化率、血清保護率）中的至少一者應滿足歐洲要求。等於或大於1:40之效價比例係視為最相關的，因為預期該等效價為保護之最佳關聯數 130360.doc -54- 200908994 [Beyer W等人 1998· Clin Drug Invest.;15:l-12]。如'’大流行病流感疫苗銷售核准應用之檔案結構及内容準貝丨J (Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorisation application)(CHMP/VEG/4717/03, 2004年 4月 5 日，或更近期，2007 年 1 月 24 日標題為'Guidelines on flu vaccines prepared from viruses with a potential to cause a pandemic' 之 EMEA/CHMP/VWP/263499/2006，可在 www.emea.eu.int 得到）中所指定，在不存在用於源自非流行性病毒株之流感疫苗的特定標準之情況下，期望大流行病候選疫苗應 (至少）能夠在兩劑量疫苗後，在未經預致敏之成年人或老年人受檢者中引發足夠之免疫學反應以合適地滿足用於現存疫苗之所有3種當前標準設定。EMEA準則描述在大流行病之情形下群體將具天然免疫性的情況，且因此假定用於季節性疫苗之所有3種CHMP標準將藉由大流行病候選疫苗而得以滿足。在預疫苗接種血清陰性受檢者中，無需證明其之明確要求。本發明之組合物合適地滿足用於組合物中所包括之大流行病病毒株的至少一種該標準（一種標準足以獲得批准），合適地滿足至少兩種或通常至少所有3種如表2 A中所列舉之保護標準。表2A(CHMP標準） 18-60 歲 >60歲血清轉化率* >40% >30% 轉化因子** >2.5 >2.0 保護率*** >70% >60% 130360.doc -55- 200908994 氺 * 血清轉化率係定義為各群體中具有保護性疫苗接種後效仏义40之受檢者比例。血清轉化率簡單表示為在疫苗接種前具有<1:1〇之職價且在疫苗接種後具㈣觀職價的受檢者百分比。然而，若初始效價⑴〇,則在疫苗接種後，抗體之量需要增加至少4倍。 **轉化因子係定義為對於各疫苗病毒株而t，疫苗接種後之血清HI幾何平均效價（GMT)的增加倍數。保護率係定義為在疫苗接種之前為在（保護性）疫苗接種後職價义40或在疫苗接種之前為血清陽性且疫苗接種後效價顯著增加4倍之受檢者的比例；其通常視為指示性保護。

由歐洲健康管理機構（Eur〇pean heahh regulat〇ry amh〇rity)(CHMP_ 人用藥品委員會（c〇mmittee f〇r Medieinai Products f〇r Human Use))定義之7〇%血清保護率為通常要求滿足每年季節性流感疫苗的3種標準之一，且亦預期該 CHMP滿足大流行病候選疫苗。然而，數學模型建立已指不，在群體含量下，抵抗某些漂移病毒株僅3〇%有效之疫苗亦可有益於幫助降低大流行病之量值，且使用抵抗大流行病病毒株具有30%功效（30%之交叉保護）之（大流行病前）疫苗的大流行病疫苗接種行為可有效地使臨床發病率降低 75%，且因此降低群體中之發病率/死亡率（Fergus〇n等人，

Nature 2006) ° FDA已公開_對支持大流行病流感疫苗之許可所需之臨床資料（Clinical Data Needed to Support the Licensure 〇f 130360.doc -56· 200908994

Pandemic Influenza Vaccines)的指引草案（CBER標準草案）（可得自 the Office of Communication，Training and

Manufacturers Assistance (HFM-40), 1401 Rockville Pike,

Suite 200N，Rockville, MD 20852-1448，或藉由呼叫 i_8〇〇_ 835-4709或301-827-1800得到，或可得自網際網路 http://www.fda.gov/cber/guidelines.htin)，且所建議之標準亦係基於CHMP標準。FDA使用稍有不同之年齡截止點。適當終點類似地包括：1}達到扪抗體效價21:4〇之受檢者百分比，且2)血清轉化率，其係定義為疫苗接種後m 抗體效價之4倍升高。幾何平均效價（GMT)應包括在結果中但資料應不僅包括點估算，而且包括血清轉化發生率之95%信賴區間的下限，且m效價>1:4〇之第42天發生率必須超過目標值。因& ’應提供該等評估之點估算的該等資料及咖信賴區間（CI)。FDA指引草案需要滿足兩種目標。其概括於表2B中。表2B(CBER標準草案）血清轉化率— HI效價军風 ----l—__ >60% 化㈣定義為：對於基線效價训0之受檢者而 :。或4倍以上升高；或b)對於基線效價之而s ’升而至>1:40。

必須在真實值之W 因此，，下限處滿足該等標準。在本發明之一態樣中，一之組合物、方法$ H ^ 棱仏一種如本文中所主張或用途，其+ μ t '宁藉由技與所涵蓋之流感組合 130360.doc •57· 200908994 物誘導之該免疫反應或保護滿足所有三種關於流感疫苗功效之EU管理標準。合適地，對於病毒株或組合物之各病毒株而言，滿足以下標準之至少—種，合適地為兩種或三種： -在成年人群體（年齡18_60歲）及/或亦合適地在老年人群體 (年齡>60歲）中’ >50%、>6〇%、>7〇%，合適地為〉8〇%或 > 9 0 %之血清轉化率·， -在成年人群體（年齡18_6〇歲）及/或亦合適地在老年人群體 (年齡>60歲）中’ >75%、>80%、>85%，合適地為〉9〇%之保護率；在成年人群體（年齡18_60歲）及/或Μ適地在老年人群體 (年齡 >60歲)中，>4.0、>5.〇、>6〇、>7〇、>8〇、>9〇或為10或10以上之轉化因子。在特定實施例中’根據本發明之組合物將在成年人群體中滿足>60%或〉7G%或合適地·。之血清轉化率及

>广，合適地>80%之保護率兩者。在另一特定實施例，根據本發明之組合物將在成年人群 >7·〇或合適地>100之棘作阳工H c ^ >8Λ〇/ .G之轉化因子及>6㈣或>70%或合適地 >8〇/。之血清轉化率兩者。旅昍夕^人力特疋貝鼽例中，根據本 ⑽〇之Γ物將在成年人群體中滿足>5.M>7.M合適地又一特一：因子及>75%，合適地>8〇%之保護率兩者。在特疋實施例中，根據本發 10.〇以上之隸彳卜物將滿足lo.o或上之轉化因子、80%或80%以上 _或嶋以上之保護率。月轉化率，及 I30360.doc -58· 200908994 在另實細*例中’所主張之疫苗’合適地為含有大流行病病毒株或易與大流行病相關聯之病毒株的大流行病前疫苗’將具有抵抗流行大流行病病毒株之30°/。功效（30%之交又保護）。詳言之’所主張之疫苗將滿足抵抗漂移病毒株之至少30%的血清保護率，合適地為抵抗漂移病毒株之至少4〇%或>5 0%或>60%之血清保護率。合適地，血清保護率將為抵抗漂移病毒株之>70%，或合適地為>80%。能夠賦予父叉保護之該大流行病前疫苗將能夠使總感染發病率大體上降低至少50°/。’或合適地為至少75%，且因此降低群體中之發病率/死亡率。在又一實施例中，所主張之經佐劑化疫苗能夠在至少 50%之受檢者，至少6〇%，合適地至少7〇%或合適地大於 75 /。之文檢者中誘導抵抗漂移病毒株或來自不同分枝之病毒株的中和抗體。合適地，該效應係以低劑量之抗原，諸如以7.5叫HA或甚至更低抗原劑量，諸如3 8㈣或丨9叫之HA來實現。口適地，對於其他群體，諸如兒童及任何免疫受損群體而s，亦滿足任何或所有該等標準。在本發月之怨樣中，人類劑量之免疫原性組合物含有來自早一流感病毒株之血球凝集素（HA)，且稱為，，單價"流感組合物。在本發明> ^ θ 之另一悲樣中，人類劑I之免疫原性、、且&物匕3來自一種以上流感病毒株之血球凝集素（ΗΑ)，且稱為”多價”流感組合物。根據本發明之合適多價組合物為一彳貝、’且σ物（包含來自兩種流感病毒病毒株之血球凝集 130360.doc -59· 200908994 素_，該等病毒株諸如（而不排他地）兩種與大流行病相關聯或易與大流行病相關聯之病毒株，例如h5=h幻’三價組合物(包含來自三種流感病毒病毒株，視情況來自：種A病毒株及-種B病毒株之血球凝集素（ha)，該等病毒株諸如（但不限於）B/山形或B/維多利亞），四價組合物（包含來自四種流感病毒病毒株之灰球凝集素（ha))或五價組合物（包含來自五種流感病毒病毒株之血球凝集素（ha))。合適之四價組合物包含來自兩種A病毒株及兩種來自不同譜系（諸如B/山形或B/維多利亞）之8病毒株的血球凝集素。或者，四價組合物包含來自三種A病毒株（視情況為 H1N1 H3N2 ’及與大流行病相關聯或易與大流行病相關聯之種A病毋株）及一種B病毒株（諸如B/山形或維多利亞）之血球凝集素。另—替代性四價組合物包含來自四種A 病毒株之血球凝集素，該等A病毒株係來自與大流行病相關聯或易與大流行病相關聯之病毒株，諸如禽類病毒株，諸如H5+H2+H7+H9。特定而言，諸如大流行病二價（例如 H5+H2)或二價或四價（例如H5+H2+H7+h9)組合物之多價經佐劑化大流行病組合物提供抵抗大流行病流感A威脅亞型之預先免疫及抵抗威脅亞型之耐久性預致敏的優點。通予，使用便利時程（例如間隔6_12個月）及視情況週期性加強預見（例如10年），自6週年齡起給予兩劑量。視情況，該大流行病疫苗可與季節性疫苗組合。多價組合物亦可包含5種以上流感病毒株，諸如6、7、 8、9或10種流感病毒株。 130360.doc •60· 200908994 當兩種B病毒株用於多價季節性組合物中時，其可來自 =種不同譜系（視情況來自B/維多利亞及B/山形）。該8病毒株之至少一者，合適地為兩種B病毒株將來自流行譜系。該組合物尤其適用於兒童。合適地，當適用於兒童之多價組合物包括兩種B病毒株時，通常分配至&病毒株之 f原量在兩種3病毒株之間分配。特定言之，經佐劑化四價（H1+H3+兩種B譜系）流感疫苗提供以下優點：以其與未 ^佐劑化疫苗相比（就同源性及漂移保護，及其抵抗兩種流行B譜系之功效而言）優越之功效用於天然兒童之增強預防作用，及基於年齡之可能全年性免疫。一劑量或兩劑量。適地係早在自6週年齡起或在6至35個月之間年齡時投與。在特定實施例中，人類劑量之免疫原性組合物為三價免疫原性或疫苗組合物，纟包含來自兩種Α病毒株（視情況為 H1N1 ' H3N2)及一種b病毒株之血球凝集素（ha)。合適地，每病毒株之HA為低量之HA(視情況每病毒株1〇 μβΗΑ 或10 以下）且其係如上文所定義。合適地，每病毒株之 ΗΑ係約5吨或5叫以下’約2 5㈣或以μ以下。佐劑係如本文中所定義且尤其如表！中所定義。合適&，佐劑組合物為每劑量分別包含5_6 mg之間，5_6叫之間及Μ叫之間量的角鯊烯、α-生育酚及聚山梨醇酯8〇之水包油乳液。或者，佐劑組合物為每劑量分別包含仏以叫之間，2-3 mg之間及丨_2 mg之間量的角鯊烯、α_生育酚及聚山梨醇自旨80的水包油乳液。該等經佐劑化免疫原性組合物 130360.doc • 61 - 200908994 或疫苗尤其適用於成年人⑽60歲）或年長兒童…巧）群體，且可提供抵抗刪2漂移變異體及抵抗來自不同譜系之B病毒株的交叉保護。在另-特^實施例中’人類劑量之免疫原性組合物為四價免疫原性或疫苗組合物’丨包含來自兩種A病毒株（視情況為Η1Ν1、H3N2)及兩種b病毒株（視情況來自不同譜系，諸如來自B/維多利亞及B/山形）之血球凝集素（ha)。合適地，每病毒株每劑量之HA係為約15邸。合適地，每病毒株之HA為低量之HA(視情況每病毒株每劑量約1〇 ha或 1(> Mg以下，以便達成每劑量4〇_45叫HA之最大值）且係如上文所定義。合適地，每病毒株之HA係為約5叫或5叫以下約2·5 Pg或2,5 pg以下。佐劑係如本文中所定義且尤其如表1中所定義。合適地，佐劑組合物為每劑量分別包 3 5-6 mg之間，5-6 mg之間及2-3 mg之間量的角鯊烯、α_ 生育酚及聚山梨醇酯80之水包油乳液。或者，佐劑組合物為每劑量分別包含2.5-3.5 mg之間，2-3 mg之間及卜2 mg 之間量的角鯊烯、α-生育酚及聚山梨醇酯8〇之水包油乳液。包含弟二Β病毒株之該組合物尤其適用於極幼小兒里’尤其在預先暴露或預致敏係重要之時。佐劑將提供向該群體傳遞增加保護之優點。用於兒童群體之人類劑量的免疫原性組合物合適地為成年人劑量之一半，且將合適地每病毒株包含2.5 之ΗΑ及水包油乳液，該水包油乳液每劑量包含2.5-3.5 mg之間，2-3 mg之間及1-2 mg之間量的角鯊烯、α-生育酚及聚山梨醇酯80。 130360.doc -62- 200908994 或者 σ適地具有上文關於四價組合物所定義之特徵及里的"亥額外Β病毒株可以如上文所述之單價組合物至三價組合物形式來、添加。使用諸如10 μΒ或低於10 ，或5叫或低於5 ，或視情況對於幼小兒童而言，2 5叫或低於 M g的低量Η Α將具有限制添加流感病毒株對全球疫苗供應之影響的優點。合適地，f兩種B病毒株包括在疫苗組合物中時，通常分配至B病毒株之抗原量在兩種B病毒株之間分配。在另一特定實施例中，人類劑量之免疫原性組合物為四偏免疫原)生或疫田組合物，丨包含來自兩種大流行病間期 A病毒株（視情況為H1N1、H3N2)’ 一種匕病毒株及一種與大μ行病相關聯或易與大流行病相關聯之a病毒株（視情況為 H5N1 、 H9N2 、 H7N7 、 H5N8 、 H5N9 、 H7N4 、 H7N3 、 H2N2、H10N7、H5N2、H7N2 及 H7N1)的血球凝集素 (HA)。合適地，每病毒株之HA為低量之HA(視情況每病毒株1〇 Pg HA或1〇以下）且其係如上文所定義。合適地，每病毒株之ΗΑ係為約5叫或5 以下，約2.5 或2.5 以下。佐劑係如本文中所定義且尤其如表丨中所定義。合適地，佐劑組合物為每劑量分別包含5_6 mg之間，5-6 mg 之間及2-3 mg之間量的角鯊烯、心生育酚及聚山梨醇酯肋之水包油乳液。或者，佐劑組合物為每劑量分別包含2.5_ 3·5 mg之間，2-3 mg之間及在丨_2 mg之間量的角鯊烯、α_ 生育酚及聚山梨醇酯80之水包油乳液。在另一特定實施例中，人類劑量之免疫原性組合物為四 130360.doc •63- 200908994 價免疫原性或疫苗組合物，其包含來自三種大流行病間期 A病毒株（視情況為H1N1及兩種H3N2病毒株）及一種B病毒株之血球凝集素（HA)。合適地，每病毒株之HA為低量之 HA(視情況為每病毒株10 ha或10 pg以下）且其係如上文所定義。合適地，每病毒株之HA係為約5 pg或5 pg以下，約2.5 或2.5 pg以下。佐劑係如本文中所定義且尤其如表1中所定義。合適地，佐劑組合物為每劑量分別包含5-6 mg之間，5-6 mg之間及2-3 mg之間量的角鯊烯' α· 生育盼及聚山梨醇酯80之水包油乳液。或者，佐劑組合物為每劑量分別包含2.5-3.5 mg之間，2-3 mg之間及1-2 mg 之間量的角鯊烯、α-生育酚及聚山梨醇酯8〇之水包油乳液。包含第三季節性Α病毒株之該組合物尤其適用於極幼小兒童。合適地’三種大流行病間期病毒株中之兩者為 H3N2病毒株，第二H3N2病毒株與第一 H3N2病毒株相比具有最接近或疏遠分枝。佐劑將提供向該群體傳遞增加保護之優點。用於兒童群體之人類劑量之免疫原性組合物合適地為成年人劑量之一半，且將合適地每病毒株包含2 5叫之HA及水包油乳液，該水包油乳液每劑量包含25_3.5 mg 之間2 3 mg之間及1 _2 mg之間量的角鯊烯、α_生育齡及聚山梨醇酯8 0。在另一特定實施例中，人類劑量之免疫原性組合物為五價免疫原性或疫苗組合物，其包含來自兩種大流行病間期 Α病毒株（視情況為Η1Ν1、Η3Ν2)，兩種Β病毒株（視情況來自不同崤系，諸如來自Β/維多利亞及Β/山形）及一種與大 130360.doc -64- 200908994 流行病相關聯或易與大流行病相關聯之A病毒株（視情況為 H5N1、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、 H2N2、H10N7、H5N2及H7N1)之血球凝集素（HA)。合適地，每病毒株每劑量之HA係約1 5 pg。合適地，每病毒株之HA為低量之HA(視情況每病毒株每劑量約1 〇 gg ha或1 〇 pg以下，以便達成每劑量40-45 pg HA之最大值）且係如上文所定義。合適地’每病毒株之HA係約5 pg或5 pg以下，約2·5 pg或2.5 pg以下。佐劑係如本文中所定義且尤其如表1中所疋義。合適地，佐劑組合物為每劑量分別包含5 _ & mg之間，5-6 mg之間及2-3 mg之間量的角鯊烯、α_生育紛及聚山梨醇酯8 0之水包油乳液。或者’佐劑組合物為每劑量分別包含2.5-3.5 mg之間’ 2-3 mg之間及1-2 mg之間量的角鯊烯、α-生育酚及聚山梨醇酯8〇之水包油乳液。在另一特定實施例中，人類劑量之免疫原性組合物為五價免疫原性或疫苗組合物，其包含來自三大流行病間期A 病毒株（視情況為H1N1及兩種H3N2病毒株）及兩種B病毒株 (視情況來自不同譜系，諸如來自B/維多利亞及b/山形）之血球凝集素（HA)。合適地，每病毒株之HA為低量2HA(視情況為每病毒株10 HA或10 以下）且其係如上文所定義。合適地，每病毒株之HA係約5叫或5吨以下，約2 5 Mg或2.5 pg以下。佐劑係如本文中所定義且尤其如表工中所定義。合適地，佐劑組合物為每劑量分別包含5_6 ^^之間，5-6 mg之間及2-3 mg之間量的角紧烯、α_生育酚及聚山梨醇醋80之水包油乳液。或者，佐劑組合物為每劑量分 130360.doc -65- 200908994 別包含2.5-3.5 mg之間，2-3 mg之間及1-2 mg之間量的角鯊烯、（X-生育酚及聚山梨醇酯80之水包油乳液。因此，在特定實施例中，本發明提供一種包含角鯊烯及 HA之流感免疫原性組合物，其中角鯊烯：HA總量（所包括之所有流感病毒株）重量比係在約50-150或約150-400之間 (例如約200-300)之範圍内。該等組合物合適地（但不排他地）用於老年群體且具最佳平衡反應原性及免疫原性。在另一實施例中，本發明提供一種包含角鯊烯及HA之流感免疫原性組合物，其中角鯊烯：HA總量（所包括之所有流感病毒株）重量比係在約50-400，例如約50-100、75-150、 75-200、75-400、100-200、100-250 或 200-400 之範圍内。對於特定群體而言’至少符合兩種’適當地是三種所有保護標準（表2)，則該比率將是合適地。TLR促效劑可包括在内’合適地為TLR-4(例如選自：3D-MPL、MPL ; AGP分 \ 子，諸如RC527或RC529，或ER804057)或TLR-9(合適地為 CpG寡核苷酸，例如cPG7909)促效劑。合適之角鯊烯：TLR-4 重量比係在約 100_450，例如 5〇_25〇、5〇_15〇、 100-250、200-250、35G-45G之間。合適之角 “：TLR_9f 虿比係在約 50-1000，例如 5〇_5〇〇、1〇〇1〇〇〇、、 400-600之間。HA可來自季節性流感病毒株。該等組合物合適地（但不排他地）用於成年人或小兒科群體且具最佳平衡反應原性及免疫原性。合適地，11八來自至少三種、少四種流感病毒株。合適地，存在三種季節性（例如 H1N1、H3N2、B)病毒株。合適地，當存在四種病毒株 130360.doc -66 - 200908994 時，其來自以下各群：四種季 p性病毒株（例如H1N1、 H3N2、兩種b病毒株；或一種大泣耔B、兩種H3N2病毒株）或酬、刪、B)之群㈣加：種季節性病毒株（例如所有主張之經佐劑化免疫原性組合物或疫苗可有利地依賴於佐劑以提供持久免疫反應，心歷經超過6個月之時期，合適地為疫苗接種後之12個月。 ’ 合適地’上述反應係在同時進行之初級免疫反應期間投與之一劑量後或通常在兩劑量後獲得。所主張之組合物之特疋優點在於’免疫反應係在僅一劑量之經佐劑化組合物或疫苗之後獲得。亦合適的’在同時進行之初級免疫反應期間投與兩劑量，其適用於天然:或免疫受損群體或個體= 合適地’在兒童中可能需要兩劑量，尤其在低於6歲或％ 10歲之年齡’先前未經疫苗接種時需要。因此，在本發明之一態樣中提供一種非活大流行病流感病毒抗原製劑，尤其為裂解流感病毒或其抗原性製劑在製造用於抵抗流感之一劑量或兩劑量疫苗接種之疫苗組合物中的用途，其中一劑量或兩劑量疫苗接種產生滿足關於流感疫田之至少一個，合適地為兩個或三個國際管理要欠的免疫反應。在另一特定實施例中’該一劑量疫苗接種亦或另外產生CD4 T細胞免疫反應及/或B細胞記憶反應，其比用未經佐劑化疫苗所獲得之彼反應更高，在特定實施例中，該免疫反應為交叉反應性抗體反應或交又反應性CD4 T細胞反應或兩者。在特定實施例中，人類患者對疫苗接 130360.doc • 67· 200908994 種病毒株具天然免疫性（亦即不具有預存在之免疫性）。特定言之，疫苗組合物含有低HA抗原量及具有比先前已認為適用之含量更低含量之組份的水包油乳液佐劑，且該等量係如本文中所定義。特定言之’疫苗組合物係如本文中所定義。詳言之，疫苗組合物之免疫原性特性係如本文中所定義。合適地’疫苗係經肌肉内投與。用於本發明之疫苗接種（視情況為首次疫苗接種）之免疫原性組合物的免疫原性特性在本發明中，與用未經佐劑化，亦即不含有任何外源性佐劑之相應組合物（本文中亦稱為”普通組合物”）所獲得之 CD4+T細胞免疫反應減，經佐劑化之免疫原性組合物合適地能夠料抵&或抵抗組份抗原或抗原性組合物中之至少-者的改良CD4+T細胞免疫反應。在特定實施例中，當免疫原性流感組合物來自若干流感病毒株，其中一者為第二B病毒株或第三大流行病間期A病毒株或大流行病病毒株時2改良之CD4+T細胞免疫反應係抵抗該等病毒株中之至少-者。在另—實施例中’經佐劑化之免疫原性組合物其中佐劑組份具有比先前認為適用者更低之含量且通常^文所定義’合適地能夠誘導抵抗或抵抗組份抗原或合物中之至少一者的CD4+、胞免疫反應，其至反應相當。該特徵在下文中⑽ 反應”。政在下文中將知為相當CD4+ τ細胞免疫經改良之CD4 + T細胞免疫反應，，意謂在投與如本文所定 130360.doc -68· 200908994 義之經佐劑化免疫原性組合物後，在人類患者中獲得比投與不含佐劑之相同組合物後獲得之彼者更高的CD4+反應。舉例而言，與投與包含流感病毒或其抗原性製劑之未經佐劑化免疫原性組合物後誘導之反應相比，在投與包含流感病毒或其抗原性製劑以及水包油乳液佐劑之免疫原性組合物後，在人類患者中獲得更高2CD4+ τ細胞反應，該水包油乳液佐劑包含可代謝油（視情況為角鯊烯）、母育酚 (視情況為CX生育酚）及乳化劑（視情況為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，諸如Tween 80ΤΜ或聚山梨醇酯80ΤΜ)。該經佐劑化之調配物將有利地用以誘導抗流感CD4+ τ細胞反應，其能夠偵測藉由MHC II類分子呈現之流感抗原決定基。合適地，藉由適用於本發明之經佐劑化裂解流感組合物誘導之該免疫學反應高於藉由任何其他未經佐劑化之流感習知疫苗（諸如亞單位流感疫苗或完整流感病毒疫苗）所誘導之免疫學反應。詳言之（但不排他地）’該”經改良之CD4+ τ細胞免疫反應"或"相當CD4+ Τ細胞免疫反應"係在經免疫未預致敏患者，亦即對該流感病毒或抗原為企清陰性之患者中獲得。 »玄血a陰性可為從未面臨該病毒或抗原（所謂，天然，患者）或者一旦遇到時未能對該抗原反應之該患者的結果◎合適地，該經改良之CD4+ T細胞免疫反應係在免疫受損受檢者諸如通丰至少50歲，通常65歲或65歲以上之老年人，或小於65歲之具有高風險醫學病狀之成年人（,高風險，成年 130360.doc •69· 200908994 人），或2歲以下兒童中獲得。 (經改良之）CD4+ T細胞免疫反應可藉由量測產生以下細胞激素中任何者之細胞數量來評估： •產生至少兩種不同細胞激素（CD40L、IL-2、IFNy、 TNFa)之細胞 •產生至少CD40L及另一細胞激素（IL-2、TNFa、IFNy) 之細胞 •產生至少IL-2及另一細胞激素（CD40L、TNFtx、IFNy) 之細胞 •產生至少IFNy及另一細胞激素（IL-2、TNFa、CD40L) 之細胞 •產生至少TNFa及另一細胞激素（IL-2、CD40L、IFNy) 之細胞。與投與未經佐劑化之組合物相比，當產生任何上述細胞激素之細胞在投與經佐劑化組合物後具有更高量時，存在 "經改良之”CD4+ T細胞免疫反應。通常，將滿足上文中所提及之5種條件之至少一者，合適地為兩者。在特定實施例中，與未經佐劑化之群組比較，在經佐劑化之群組中，產生所有四種細胞激素之細胞將以更高量存在。與用經一些先前技術佐劑（亦即，經高含量之相同組份）佐劑化之組合物所獲得之CD4+ T細胞免疫反應相比，當在用經佐劑化之免疫原性組合物獲得之反應中無顯著，視情況無統計學顯著降低時，存在”相當”CD4+ T細胞免疫反應，其中佐劑組份具有比先前認為適用者更低之含量且通常係如本文中 130360.doc -70- 200908994 所定義。在特定實施例中，經改良之CD4 T細胞免疫反應可藉由本發月之經佐劑化流感組合物來賦予，且可理想地在一次 :才又藥後€ #。單一劑量方法將（例如）在快速演化爆發『月況下具極端相關性。在某些情況下，尤其對於老年人群體而言，或在首次接受疫苗接種以抵抗流感之幼小兒童（9 歲以下）之狀況下，或在大流行病之狀況下，投與兩劑量用於彼季筇之相同組合物可為有益的。第二劑量之該相同、、且s物（仍視為用於首次疫苗接種之組合物，）可在進行中之初級免疫反應期間投與且適當間隔。通常，第二劑量之組合物係在首次劑量後數週，或約1個月，例如2週、3週、4 週5週或6週時給予，以有助於在無反應或反應不良之個體中使免疫系統預致敏。在特定態樣中，首次疫苗接種後接著含有異源性流感病毒株之經佐劑化疫苗產物的後續疫田接種過程〇在特定實施例中，與在以未經佐劑化組合物免疫之個體中誘導之B記憶細胞反應相比，該免疫原性組合物之投藥或者或另外在以經佐劑化免疫原性組合物投藥之患者中誘導經改良之B記憶細胞反應。經改良之B記憶細胞反應意欲意謂如藉由活體外分化作用之刺激所量測（參見實例部分，例如Elispot B細胞記憶之方法），在遭遇抗原後能夠为化成分泌抗體之血聚細胞的周邊企液B淋巴細胞之增加頻率。在另一實施例中，經佐劑化之免疫原性組合物（其中佐劑組份具有比先如δ忍為適用者更低之含量且通常如上 130360.doc -71- 200908994 文所疋義）能夠合適地誘導抵抗或抵抗組份抗原或抗原性組合物中至+ — _ 乂一省之B記憶細胞反應，其與用經一些先前 4丨佐劑化之組合物所獲得之反應相當（亦即無顯著見凊况、、’充5十學顯著之劣勢）。該特徵在文中將稱為”相當 B記憶細胞反應”。在又特定實施例中，用經佐劑化之組合物用於首次疫田接種之疫苗接種對CD8反應具有不可量測之影響。〇適地，包含用水包油乳液佐劑調配之流感病毒或其抗原！·生製劑之所主張組合物將有效促進免疫受損或天然免疫群中之T細胞反應，詳言之該水包油乳液佐劑包含諸如上文所疋義之低量的可代謝油（視情況為角鯊烯）、母育酚 (#視情況為生育酚）及乳化劑（視情況為聚氧化乙烯脫水山朵糖醇單油酸酯，諸如Tween 8〇ΤΜ或聚山梨醇酯。合適地如本發明中所述，如藉由用於流感疫苗之保護關聯數所評估，在抵抗流感之再疫苗接種後，投與單一劑量之 Α佐劑化免疫原性組合物用於首次疫苗接種將能夠提供比用未經佐劑化流感疫苗之疫苗接種所得者更佳之血清保護。與用未經佐劑化之調配物所獲得者相比，所主張之經佐劑化調配物亦將有利地誘導抵抗流感病毒之經改良CD4 T細胞免疫反應。該特性可與對流感抗原性暴露之疫苗接種或感染後增加之反應性相關聯。此外，其亦可與交又反應性相關聯，亦即反應以抵抗變異體流感病毒株之更高能力°亥疋性及/或定罝改良之反應可在大流行病之狀況下有益於所有群體，且尤其有益於諸如老年人群體（65歲及 130360.doc -72- 200908994 65歲以上）及尤其兩風險老年人群體之免疫受損人群。其亦可有益於大多數天然嬰兒群體（5歲以下，合適地2歲以下）。當組合物包含至少一種大流行病病毒株時，該經改良之反應就用於預致敏而言係有益的’（例如）在大茂行病爆發之前或開始時受益於含有漂移變異體之儲存疫苗。其可導致總發病率及死亡率降低且預防由於肺炎及其他流感類疾病而入院之緊急事件。此外’其允許誘導CD4 τ細胞反應，與用未經佐劑化調配物所誘導之反應相比，其在時間上更持久，例如在首次疫苗接種後仍存在一年。所有該等優點可用所主張之佐劑組合物而獲得，同時與具有更高組份量之佐劑相比降低總的反應原性。合適地’ CD4 T細胞免疫反應（諸如在未預致敏受檢者中獲得之”經改良”或，，相當"CD4 T細胞免疫反應）涉及交又反應性CD4 T佐劑化反應之誘導。詳言之，交叉反應性cD4 T細胞之量增加。’交叉反應性iCD4反應意謂cd4 T細胞乾向視情況來自不同分枝或譜系之流感病毒株之間的共用抗原決定基。通常’可用流感疫苗僅有效抵抗具有擁有類似抗原性特徵之血球凝集素之流感病毒的感染病毒株。當感染（流行）流感病毒已經歷造成表面醣蛋白（詳言之為血球凝集素）中之胺基酸改變（抗原性漂移變異體病毒病毒株）的微小改變 (諸如點突變或點突變積聚）時，疫苗仍可提供一些保護，儘管其僅可提供有限保護，因為新產生之變異體可逃避藉由先前流感感染或疫苗接種所誘導之免疫性。抗原性漂移 130360.doc -73- 200908994 引起在大流行病間期發生之每年流行病（WUey & skehei， 1987, Ann. Rev. Biochem· 56, 365·394)。交又反應性CD4 τ 細胞之誘導向本發明之組合物提供額外優點，即其亦可提供交又保護，換言之，抵抗異源性感染之保護，亦即，抵抗藉由作為免疫原性組合物中所含之流感病毒株之變異體 (例如漂移變異體）的流行流感病毒株所引起之感染的保護。當流行病毒株難以在卵中增殖或難以在細胞培養物中產生時，此可為有利的，使得漂移病毒株之用途具有研究替代性。當受檢者間隔若干月或一年來接收首次及第二次疫苗接種時’在匕亦可為有利的’且用於第二次免疫之免疫原性組合物中之流感病#株為用於首次疫苗接種之組合物中所用病毒株之漂移變異病毒株。因此，如本文中駭義之經佐劑化流感免疫原性組合物在經疫苗接種之老年或年幼兒童受檢者中具有誘導企清保護及交又反應性CD4 Τ細胞之較高能力。該特徵可與反應以減存在於免疫原性組合物中之病毒株之變異病毒株的較高能力相關聯。其可經證明為在大流行病情況下之重要優點。舉例而t ’包含至少-種大流行病病毒株（視情況為出、扣、則17細病毒株中之任何者）之免疫原性流感組合物可在經該漂移病毒株後續疫苗接種後或在紋該漂移病毒株感染後，提供反應以抵抗大流行病變異體（亦即該大流行病病毒株之漂移病毒株)之較高能力。舉例而言，經佐劑化疫苗組合物包含A/印度尼西亞病毒株且能夠產生抵抗-種，合適地為—種以上漂移病毒株，諸如A〆香 130360.doc -74- 200908994 港、A/土耳其、A/越南及/或A/安徽病毒株之交叉保護性及/或交叉反應性免疫反應。在用流感疫苗之疫苗接種後偵測交叉反應性CD4 T細胞在經典三價流感疫苗投藥（3週）後，對應於與疫苗中存在之病毒株製劑（H3N2 : A/巴拿馬/2007/99，H1N1 : A/新喀裏多尼亞/20/99，B : B/山東/7/97)同源之抗原性病毒株製劑（完整病毒或裂解抗原）的周邊血液CD4 T細胞之頻率存在實質上增加（參見實例III)。若周邊血液CD4 T細胞經分類為漂移病毒株之流感病毒株（H3N2 : A/悉尼/5/97， H1N1 : A/北京 /262/95，B : B/山梨 /166/98)再刺激，則可見頻率之相當增加。相反，若周邊血液CD4 T細胞由該領域中之專家以分類為轉移病毒株（H2N2 : A/新加坡/1/57， H9N2 : A/香港/1073/99)之流感病毒株再刺激，則在疫苗接種後不存在可觀測之增加。能夠識別同源性及漂移流感病毒株之CD4 T細胞已在本文件中命名為π交叉反應性的”。如本文中所述之經佐劑化流感組合物已能夠展示異源亞型交叉反應性，因為存在可觀測之抵抗漂移流感病毒株的交叉反應性。如上文所述，包含至少一種大流行病病毒株之疫苗調配物有效抵抗漂移大流行病病毒株之能力可證明為大流行病狀況下之重要特徵。與上述觀測一致，已在人類中識別由不同流感病毒株共用之CD4 Τ細胞抗原決定基（Gelder C等人1998, Int Immunol. 10(2):211-22 ; Gelder CM 等人 1996 J Virol· 130360.doc -75- 200908994

Virol. 1995 7〇(7):4787-90 ; Gelder CM 等人 1995 69(12):7497-506)。由於其免疫原性特性’所主張之組合物可人類流感大流行病咸脅之主動疫苗接種策略，包括病前疫苗之儲存，以更佳# "丨1仃文1土應付大抓仃病之開始。亦建立抵抗流行病毒株之主動.苗接錄& μ 外及主動疫田接種朿略，該流行病毒可不與疫苗組合物中所存在之病毒株精確匹配。在特施例中，經佐劑化之組合物可賦予提供抵抗血球凝集素中之已經歷主要改變(諸如(例如)兩種不同物種之間的基因重組X抗原性轉移）之流行病毒株的更佳保護當前可用疫苗不具有抵抗該等流行病毒株之功效。

V 特疋而έ，大流行病前疫苗為包含至少一種類似於當前群中"il行之病f株的大流行病病毒株（視情況為Η5Ν1 (禽流感））且已（例如）經由使用反向遺傳學而產生之疫苗。以對大流行病前疫苗反應而發展之免疫性可允許免疫系統在準備就緒之情況下經，預致敏，或I培養I，且藉此允許在遇到實際大流行病病毒病毒株後更快速地發展保護性免疫反應，引起對流感之相關大流行病病毒株之敏感性降低。— 旦WHO已宣布大流行病，且識別最終大流行病病毒株（其可為漂移病毒株或不可為漂移病毒株），大流行病前疫苗亦將在當大流行病疫苗變為可用時允許對大流行病疫苗更快速之免疫反應。再疫苗接種及用於再疫苗接種之組合物（加強組合物）在本發明之一態樣中，提供以下各者： 130360.doc -76- 200908994 Ο)來自第一流感病毒株之流感病毒或其抗原性製劑，及 (b)如本文中所定義之水包油乳液佐劑在製造如本文中所定義之用於保護以抵抗由作為該第一流感病毒株之變異體之流感病毒株引起的流感感染之免疫原性組合物中的用途。亦提供一種免疫原性組合物，其包含來自第一流感病毒株之流感病毒或其抗原性製劑，及如本文中所定義之水包油乳液佐劑，其適用於保護人類或人群抵抗由作為該第一流感病毒株之變異體之流感病毒株引起的流感感染。本發明之態樣提供流感抗原在製造用於對先前經如本文中所定義之經佐劑化流感組合物疫苗接種（一或兩劑量）的人類進行再疫苗接種之流感免疫原性組合物中的用途。亦提供一種免疫原性組合物，其包含流感病毒或其抗原性製劑’視情況以及如本文中所定義之水包油乳液佐劑，其適用於對先前經如本文中所定義之經佐劑化流感組合物疫苗接種之人類進行再疫苗接種。在實施例中’用於再疫苗接種之免疫原性組合物含有流感病毒或其抗原性製劑’其與用於首次疫苗接種之流感病毒或其抗原性製劑共用共同之CD4 T細胞抗原決定基。共同之CD4 T細胞抗原決定基意欲意謂來自可由相同cd4細胞識別之不同抗原的肽/序列/抗原決定基（參見以下各者中所述抗原決定基之實例：Gelder c等人1998, Int Immun〇1 10(2):211-22: Gelder CM 等人 1996 J Virol. 70(7):4787- 90 ; Gelder CM等人 1995 J Vir〇l. 1995 69(12):7497_5〇6)。 130360.doc •77· 200908994 在本發明之一態樣中，提供央、叔杈供來自第一流感（視情況為大 ^行病）病毒株之流感病毒或其抗原性製劑在製造如本中所定義之用於保護以抵抗由作Λ哕笛仉宙作為°玄第一流感（視情況為大、行病)病毒株之變異體之流感病毒株引起的流感感染之經佐劑化免疫原性組合物中的用途。亦提供—種經佐^ 化免疫原性組合物’其包含來自第一流感(視情況為大；行病）病毒株之流感病毒或其抗原性製劑，及如本文中所定義之佐齊】’其適用於保護以抵抗由作為該第一流感⑽ 情況為大流行病）病毒株之變異體之流感病毒株引起感感染。 ~ 在另-態樣中’本發明提供流感病毒或其抗原性製劑在製造用於對先前經如本文中所主張之經佐劑化流感組合物或經包含變異m病毒株之經佐劑化流感組合物（該佐劑如本文中所定義）疫苗接種的人類進行再疫苗接種之流感免疫原性組合物中的用途。亦提供一種流感免疫原性組合物’其包含流感病毒或其抗原性製劑，視情況以及如本文中所定義之水包油乳液佐劑，其適用於對先前經如本文中所主張之經佐劑化流感組合物或經包含變異體流感病毒株之經佐劑化流感組合物（該佐劑如本文中所定義）疫苗接種的人類進行再疫苗接種。在另一態樣中，本發明提供一種對人群或個體進行疫苗接種、抵抗種流感病毋病毒株，繼而對該人類或群體進行再疫苗接種以抵抗變異體流感病毒病毒株之方法，該方法包含向該人類投與⑴包含來自第_流感病毒病毒株之流 130360.doc -78- 200908994 感病毒或其抗原性製劑及如本文中所定義之佐劑的第一組。物及⑻包含該第—流感病毒病毒株之流感病毒病毒株I二體之第一免疫原性組合物。在特定實施例中，該第株與大&订病相關聯或具有與大流行病爆發相關聯之/曰此。在另—特定實施例中，該變異體病毒株與大流行病相關聯或具有與大流行病相關聯之潛能。詳言之，再疫苗接種係由包含至少—種作為流行大流行病病毒株之病毒 >· $ ί σ #來進行。在另—實施例中，該變異體病毒株為你移變異體，其視情況來自用作第-病毒株之Η3Ν2 的鄰近分枝或合適地疏遠分枝。在另一實施例中’該變異體病毒株為不同於第—Β病毒株譜系之譜系的Β病毒株（諸如Β/山形或Β/維多利亞，屬於不同譜幻。預致敏組合物及加強組合物兩者均可為單價或合適地多價，亦即可含有至^兩種流感病毒病毒株，諸如二價、三價、四價或五價疫田s組合物為多價時’至少—種病毒株係合適地選自由以下各者組成之群：大流行病病毒株、Β病毒株（諸如Β/ 山形或Β/維多利亞）、Η3Ν2病毒株，且視情況為存在於用於1次疫苗接種之疫苗中之病#株的漂移變異體。首次疫苗接種可合適地包含兩劑量，如上文所定義，其在同時進行中之免疫反應期間的數週内投與。通常，再疫 :接種係在首次疫苗接種後若干個月内進行，合適地為= 次疫苗接種後之至少3個月或4個月，合適地為其後之8至 ^個^合適地為其後之約10至12個月或甚至更長。合適再疫田接種係在首次疫苗接種後至少6個月進行。合 I30360.doc -79- 200908994 適地，再疫苗接種在接近下一流感季節或在時進行，例如在第—免疫原性組合物後大致—年=季卽加強組合物亦可在隨後之每年給予(第三、第：苗接種等等）。弟五疫 (適因二=實施例中，本發明提供一種疫苗接種流程 =用於該流程之組合物）’其包含⑴在—年中之任何時間如、即流感季節之外），以給予―或兩劑量（合適地間隔，'例 / 二=週，或間隔3侧魏據本發明之經佐劑化組口物進订之初級疫苗接種，繼而為⑼在首次疫苗接種後之至少6週至i年時所投與之加強疫苗接種。當在初好苗接種時投與兩劑量時，第一劑量可用經佐劑化之三價或四價季節性疫苗，繼而為第二劑量之大流行病(例如單價)經佐劑化疫苗。合適地’在首次疫苗接種後至少6週及在常 ^免疫處=日程（例如對兒童而言）中之任何時間，或在下 -流感季節時投與加強組合物。加強組合物可用任何商業上認可之流感疫苗(例如經典三價未經佐劑化或經佐劑化疫田’諸如FluAd M) ’或用根據本發明之經佐劑化組合物 (例如經佐劑化之三價或四價組合物）。合適地，加強植人物包含用於彼季節之流行季節性病毒株，其可為來自存^ 於初級疫苗中之病毒株的漂移變異體。該疫苗接種流程適於小兒科群體’該群體可在生命早期(例如在6個月以下或 2個月以下）經可用疫苗預致敏，且隨後用包含流行病毒株之組合物加強’該流行病毒株可為來自存在於初級組合物中之病毒株的漂移變異體。 130360.doc -80· 200908994 :再疫田接種之免疫原性組合物（加強組合物）可含有任何類型之抗原製劑，其為失活或活減毒的。其可含有與用於首次疫苗接種之免疫原性組合物相同類型之抗原製劑，例如裂解流感病毒或其抗原性製劑、完整病毒粒子或 :化HA及NA(亞單位)疫苗。加強組合物可含有與用於首次疫苗接種之流感抗原相同亞型的流感抗原。舉例而言，當首次疫苗接種係在宣布大流行病時進行且再疫苗接種在其後進行時，再疫苗接種係用包含具有與用於首次疫苗接種之流感病毒株（例如H5N1越南）相同亞型之流感病毒株 (例如H5N1越南）的疫苗來進行。或者加強組合物可含有與用於首次疫苗接種之流感抗原（例如Η5Ν1印度尼西亞）相同亞型之流感抗原的漂移病毒株。在另一實施例中，用於再疫苗接種之該流感病毒株為轉移病毒株，亦即不同於用於首次疫苗接種之病毒株，例如其具有不同之Μ或财亞型’諸如则2(與Η5Ν1相同之ΗΑ亞型，但不同财亞型）或麵（不同於Η5ΝκΗΑ亞型，但相同να亞型舉例而言，用於首次免疫處理之疫苗組合物包含Α/印度尼西亞病毒株且加強組合物包切香港、Α/土耳其、α/越南及/或 Α/安徽病毒株。在實把例中，使用裂解病毒。加強組合物可為經佐劑化或未經佐劑化的。未經佐劑化加強組合物可為經肌肉内給予之Π騰心/a_Rix⑧/Influspl⑽，其含有三種自適當流感季即之WHO推薦病毒株製備之失活裂解病毒粒子抗原。詳言之’流感病毒病毒株或其抗原性製劑係根據世界衛生 130360.doc 200908994 組織（World Health 〇rganisati〇n)發布之參考物質來選擇，以便使其適應於在再疫苗接種#年流行之流感病毒株。經佐劑化之加強組合物可合適地包含如本文中所定義之水包油乳液佐齊卜視情況以及諸如T L R _ 4配位體之額外免疫刺激劑，諸如3D-MPL或皂素。合適地，與在用未經佐劑化流感病毒或其抗原性製劑進行首次疫苗接種後誘導之等效反應相比，用包含如本文中所疋義之佐劑之組合物進行的再疫苗接種誘導以下反應中之任何者，合適地為兩者或所有反應：⑴抵抗流感病毒或其抗原性製劑之經改良CD4+ T細胞免疫反應，或⑻經改良之B細胞記憶反應或（iu)經改良之體液反應。合適地，與在用經其中各組份以較高含量存在之佐劑佐劑化之流感病毒或其抗原性製劑進行首次疫苗接種後料之等效反應相比’用包含如本文中所定義之佐劑之組合物進行的再疫苗接種料以下反應中之任何者，合適地為兩者或所有反應：⑴抵抗流感病毒或其抗原性製劑之相當CD4+ τ細胞免疫反應，或（u)相當之6細胞記憶反應或（Hi)相當之體液反應。在根據本發明之-態樣巾，用包含流感病毒及水包油乳液佐劑之加強組合物對受檢者進行再疫苗接種將展示比在用未經佐㈣組合物進行首錢苗接種且用未經佐劑化組合物加強之人群中的相應值更高之抗體效價，該水包油乳液佐劑包含如上文所定義量之可代謝油（視情況為角酱視情況為《-生育盼）及乳化劑（視情況為聚氧 130360.doc •82- 200908994 化乙稀脫水山梨糖醇單油酸)。佐劑在增強對再疫苗接種之抗體反應中的效應在老年人群體或年幼兒童中尤1重要’、該老年人群體或年幼兒童已知對流感病毒之疫苗接種或感木具有低反應。詳言之’與經佐劑化組合物相關聯之益處就改良再疫苗接種後之CD4 τ細胞反應而言亦將係顯著的。與對照疫苗賦予之保護相比，用於再疫苗接種之經佐劑化組合物將能夠誘導抵抗漂移病毒株(來自下-流感季節之流感病毒株）之更佳交又反應性。㈣未經佐劑化調配物獲侍之交叉反應性相比，該交叉反應性已展示更高持久性。佐劑在增強抵抗漂移病毒株之交叉反應性中之效應在大流行病情況下為重要的。在另實施例中，本發明係關於一種疫苗接種方案，其中首次疫苗接種係用流感組合物，合適地為裂解流感組合物來進行，該流感組合物含有可潛在地引起大流行病之流感病毒株，且再疫苗接種係用單價或多價組合物來進行，該組合物包含至少一種流行病毒株，其係大流行病病毒株或經典病毒株。在特定實施例中，用於再疫苗接種之人類劑量之免疫原性組合物係經水包油乳液佐劑來佐劑化。合適地（但不排他地），該佐劑包含母育酚。合適地，每病毒株每劑量之 HA係約15 。在特定實施例中，每病毒株之ha為低量之 HA(視情況每病毒株每劑量約1 0 pg HA或1 〇 pg以下，以便達成每劑量40-45 pg HA之最大值）且其係如上文所定義。 130360.doc •83- 200908994 合適地，每病毒株之HA係約5 pg或5 pg以下，約2.5 pg或 2.5 pg以下。合適地’佐劑組合物為每劑量分別包含5_6 mg之間，5-6 mg之間及2-3 mg之間量的角鯊烯、α•生育酚及聚山梨醇酯80之水包油乳液。或者，佐劑組合物為每劑量分別包含2.5-3_5 mg之間’ 2-3 mg之間及1-2 mg之間量的角鯊烯、α-生育酚及聚山梨醇酯8〇之水包油乳液。用於再疫苗接種之人類劑量之免疫原性組合物合適地包含水包油乳液佐劑，該水包油乳液佐劑包含存在於用於初級疫苗接種之組合物中之組份的一半；且將合適地包含水包油乳液，該水包油乳液每劑量包含2.5-3.5 mg之間，2-3 mg之間及1 -2 mg之間量的角鯊烯、α_生育盼及聚山梨醇酯8〇。在特疋η施例中’該再疫苗接種劑量在初級疫苗接種後約一年或約兩年時給予。 ΗΑ中之CD4抗原決定基該抗原性漂移主要駐留於病毒表面蛋白血球凝集素（ΗΑ) 及神經胺糖酸酶（ΝΑ)之抗原決定基區域内。已知不同流感病毒株之間的CD4及Β細胞抗原決定基中的任何差異均將在流感疫苗接種中起主要作用，該差異係由病毒使用以逃避宿主免疫系統之適應性反應。由不同流感病毒株共用之CD4 Τ細胞抗原決定基已在人類中識別（例如參見：Gelder C等人1998, Int Immunol. 10(2):211-22，Gelder CM 等人 1996 J Virol. 70(7):4787_ 90 ;及 Gelder CM 等人 1995 J Virol. 1995 69(12):7497- 506)。 130360.doc •84- 200908994 在特定實施例中’再疫苗接種係藉由使用加強組合物來進行，該加強組合物含有流感病毒或其抗原性製劑，其與用於首次疫苗接種之流感病毒抗原或其抗原性製劑共用共同之CD4 T細胞抗原決定基。本發明因此係關於包含大流行病流感病毒或其抗原性製劑及如上文所定義之水包油乳液佐劑之免疫原性組合物在製造多劑量疫苗之第一疫苗接種組伤中的用途，該多劑量疫苗另外包含作為加強劑量之流感病毒或其抗原性製劑，其與首次疫苗接種時所給予劑量之大"IL行病流感病毒抗原或其病毒抗原性製劑共用共同之CD4 T-細胞抗原決定基。疫苗接種方式本發明之組合物可藉由任何合適傳遞路徑，諸如皮内、經黏膜’例如鼻内、經口、肌肉内或皮下路徑來投與。其他傳遞路徑在此項技術中為熟知的。 t 肌肉内傳遞路徑尤其適於經佐劑化之流感組合物。根據本發明之組合物可存在於單劑量容器巾或者尤其適於大流行病疫苗之多劑量容器中。在該情況下，通常存在諸如硫柳汞之抗菌防腐密丨丨a A m 肖以在使用期間預防污染。硫柳汞濃度可為25 WO.5 "1劑量(亦即一。合適地，存在5 心〇.5岀劑量(亦即1〇—)或1〇球5_(亦即20 μ§/ΐΏΐ)之硫柳汞濃度。可使用合適之IM傳遞裝置，諸如益針液體喷射注入裝[例如2_(叫二 Portland，OR)。或者，，遞的筆式注射裳置以允==於腎上腺素之家用傳作左田之自身投藥。該等傳遞裝置 I30360.doc -85- 200908994 之使用可尤其料諸如將在疫行為。 n —f要之大規模免皮内傳遞為另—合適路徑。任馇# m 7σ適裝置均可用於皮内傳遞，例如短針裝置。皮内疫之右兮办、* Ε 」错由限制針進入皮膚度的裝置來投與’諸如w◦細850及 EP1092444中所述之彼等裝置以直土& "功此等效物，該等參考案以引用的方式併入本文中。哭^適者為，經由液體射流 1§或經由刺入角質層且吝 mu/ 皮之噴射的針將液體疫田傳遞至真皮的射流裝置。、者為使用壓縮氣體來促使呈私末形式之疫苗穿過皮膚皮w r層運到真皮之彈道粉末/ 粒子傳遞裝置。另外，習知為知之庄射态可用於皮内投藥之經典孟陀式（mantoux)方法中。另一合適投藥路徑為皮下路徑。任何合適裝置均可用於皮下傳遞’例如經典的針。合適地，使用無針射流器機構 (―)。合適地’該裝置經液體疫苗調配物預填充。。或者’經鼻内投與疫苗。通常’將疫苗局部投與至鼻咽品或口適地不經吸人肺中。希望使用將疫苗調配物傳遞

至鼻咽區域而不或女种L 次大體上不使其進入肺中之鼻内傳遞裝置。用於根據本發明疫苗之鼻内投藥的合適裝置為喷霧裝置〇適之市售鼻噴霧裝置包括AccusprayTM(Becton Dickinson)。噴霧器產生可易於吸入肺中之極精細喷霧，且因此並未有效達至鼻黏膜。因此，喷霧器並非較佳。用於鼻内用途之合適喷霧裂置為裝置效能並非取決於使 130360.doc -86· 200908994 用者施加之壓力的裝置。已知該等裝置為壓力臨限裝置。僅當施加臨限壓力時，自噴嘴釋放液體。該等裝置使其更易於達成具有規則液滴尺寸之喷霧。適於供本發明使用之壓力臨限裝置在此項技術中為已知的且描述於（例如）w〇 91/13281及EP 311863B及EP 516636中，該等專利以引用的方式併入本文中。該等裝置可購自Pfeiffer GmbH且亦描述於 Bommer，R. Pharmaceutical Technology EUrope，1999年 9 月中。合適之鼻内裝置產生1至200 μηι，合適地1〇至12〇 μηι範圍内之小液滴（使用水作為液體來量測）。低於1〇 μιη時，存在吸入風險，因此希望具有至多約5%之小液滴低於1〇 μιη。120 μηι以上之小液滴以及稍小之小液滴不傳播因此希望具有至多約5%之小液滴超過丨2〇 μιη。雙劑量傳遞為供根據本發明之疫苗使用之鼻内傳遞系統的另一合適特徵。雙劑量裝置含有兩亞劑量之單一疫苗劑量，一亞劑量用於投藥至每一鼻孔。通常，兩亞劑量存在於單一腔室中且裝置之建構允許一次性有效傳遞單一亞劑量。或者，單劑量裝置可用於投與根據本發明之疫苗。或者，表皮或經皮疫苗接種路徑亦涵蓋於本發明令。在本發明之一態樣中，用於首次投藥之經佐劑化免疫原性組合物可經肌肉内給予，且經佐劑化或未經佐劑化之加強組合物可經由不同路徑，例如經皮内、皮下或鼻内投與。在特定實施例中，用於首次投藥之組合物含有用於大抓行病流感病毒株之小於丨5叫的ΗΑ量，且加強組合物可 130360.doc -87· 200908994 含有U叫之標準量或合適地低量之ha，亦即15叩以下，視投樂路徑而定’其可以更小體積來給予。儘管本發明之疫苗可作為單—劑量投與，但其組份亦可同％一起共同投與或在不同時間投與（例如流感抗原可單獨投與’合適地與佐劑之投藥同時投與)。除單一投藥路 :之外，當投與兩次注射時’可使用兩種不同的投藥路位+例而。’經佐劑化流感抗原之首次投藥(例如預致敏劑量）可經1M(或1D)投與，且第二次投藥（例如加強劑量）可㈣(或ID)投與。另夕卜，本發明之疫苗對於預致敏劑量而。可、·’里IM杈與且對於加強劑量而言可經投與。疫田中流感抗原之含量通常將在每流感病毒株Ο」」之乾圍内，合適地為1-10 Μ，最通常在1-8 jug範圍内。流感抗原之合適含量將小於或精確地為每包括於疫苗中，流感病毒株5 Μ HA。初始疫苗接種之後受檢者可接欠-人加強免疫或若干次適當間隔之加強免疫。疫苗接種之群體疫苗接種之目標群體為整個人群，例如健康年輕成年人 (例如年齡為i 8-50歲或18_6〇歲）、老年人（通常年齡在歲以上)或嬰兒/兒童。目標群體可尤其為免疫受損的。免疫又相人類通*與健康成年人相比，較差能夠對抗原作出良好反應，尤其對流感抗原作出反應。在根據本發明之—態樣巾，目標群體為針料感未經預致：之群體’其為天然的(諸如相對於大流行病病毒株)或先前未能對流感感染或疫苗接種作出反應。合適地，目標 130360.doc -88- 200908994 群體為合適地年齡至少60歲，或至少65歲及65歲以上之老年人，諸如在衛生機構中工作之人的年輕高風險成年人 (亦即18歲與6G歲之間）或具有諸如心金管疾病及肺病或糖尿病之風險因素的彼等年輕成人n標群體為自出生或年齡在2個月及2個月以上’或年齡在6個月及6個月以上的所有兒里’尤其為年齡在6_23個月之經歷相對高之流感相關住院治療率的兒童。另—目標群體為自出生至年齡^ 6個月之更年幼兒童。中請案中之所有參考案（包括專利申請案及許可專利）之教示完全以引用的方式併入本文中。本申請案所主張優先權之任何專”請案均以本文#對公開案及參考案所述之方式，以全文引用的方式併入本文中。 /在每一情形下，為避免疑慮，本文中本發明者所欲指之術語”包含"視情況可經術語”由…組成"取代。本文中關於本發明之"疫苗組合物"之實施例亦適用於關於本發明之 ”免疫原性組合物'’的實施例’且反之亦然。所有數值中之術έ吾”約"（或"大約”）允件^。〆鐵几 )允奔5/。變化，亦即約125%之值將意謂在1.19%-1.31 %之間。本發明將另外藉由I # ιν τ β Α 精由 > 考以下非限制性實例來描述：實例I描述用於小鼠、雪沪、出方法。豬及人類研究中之免疫學讀實例II描述用於例製備。不研究中之水包油乳液及佐劑調配物之體中用含有裂解流實例ΠΙ展示在年齡為18_59歲成年人群 130360.doc -89- 200908994 感抗原製劑及兩劑量之AS03佐劑之疫苗的臨床試驗。實例IV展示在預致敏BALB/c小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解流感疫苗（包含各種劑量之AS03佐劑）的臨床前評估。實例V展示在預致敏C57BI/6小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解流感疫苗（包含各種劑量之AS03佐劑）的臨床前評估。實例VI展示在預致敏C57B1/6小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解流感疫苗（包含各種劑量之AS〇3佐劑及低劑量抗原）的臨床前評估。實例vn展示在天然C5則6小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解H5N!疫苗（包含各種劑量之AS〇3佐劑及抗原）的臨床前評估。實例VIII展示在預致敏大白豬中之經佐劑化及未經佐劑化流感疫苗的臨床前評估。實例IX展示在天然及預致敏C57B1/6小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解TIV及QIV季節性疫苗（包含各種劑量之 AS03佐劑及抗原）的臨床前評估。實例X展示在年齡為18_64歲之成年人群體中用含有裂解流感抗原製劑及各種劑量之AS〇3佐劑之疫苗的臨床試驗。抓實例幻展示在年齡為65歲以上之老年人群體中用含有” 流感抗原製劑及各種佐劑之疫苗的臨床試驗。實例I-免疫學讀出方法 ι·ι·小鼠方法 130360.doc -90- 200908994 1.1.1.血球凝集抑制測試測試原理（經典程序）。使用血球凝集抑制測試（η D測定三種（季節性）流感病毒病毒株之抗血球凝集素抗體效價。ΗΙ測試之原理係基於特定抗流感抗體藉由流感病毒血球凝集素抑制紅血球 (RBC)之血球凝集作用的能力。藉由高嶺土及rbc處理熱失活血清以移除非特異性抑制劑。預處理之後，用4個血球凝集單位之各流感病毒株培育血清之兩倍稀釋液。隨後添加紅血球且對凝集之抑制作用計分。效價表示為完全抑制血球凝集作用之血清之最高稀釋度的倒數。當企清之第一稀釋度為1:20時，將不可偵測之含量計分為等於丨〇之效價。用於H5N1之修改（使用馬紅血球之HI的特定描述）：因為用於測定抗HA抗體之經典HI檢定備案為對出川病毒株不可充分作用，所以使用利用馬RBC之修改實驗方案。馬之紅企球用於H5N1大流行病病毒株。於含有〇· 5 〇/〇 BSA(牛血清白蛋白，終點濃度）之磷酸鹽緩衝液中之〇 5 %(終點》農度）馬紅血球懸浮液。該懸浮液每天藉由用相同磷酸鹽緩衝液洗滌紅血球及隨後之離心步驟〇〇 min，2000 rpm)來製備。該洗滌步驟必須重複一次。在將馬紅血球添加至血清及病毒懸浮液之反應混合物中之後；由於馬紅血球之低沈降速率，因此必須將培育板在室溫（RT，20°c +/_ 2 °C )下培育2小時。 130360.doc -91 - 200908994 統計分析使用UNISTAT對疫苗接種後HI效價執行統計分析。用於變異數分析之實驗方案可如下簡要描述： ♦資料之對數轉換 ♦對各群體（群組）進行Shapiro-WiIk測試以驗證群組分布之正態性； ♦進行Cochran測試以驗證不同群體（群組）之間變異數的同質性； ♦對所選資料之變異數分析。 ♦對雙因素ANOVA(two-way ANOVA)之相互作用的測試 ♦用於多重比較之Tukey-HSD測試 1.1.2.細胞内細胞激素染色該技術允許基於細胞激素產生來定量抗原特異性T淋巴細胞：效應子T細胞及/或效應子記憶τ細胞產生IFN-γ及/或中央記憶T細胞產生IL-2。在免疫後7天收穫PBMC。在分泌抑制劑（布雷菲特菌素（Brefeldine))存在下，對淋巴樣細胞進行活體外再刺激。隨後，使用螢光抗體（CD4、 CD8、IFN-γ及IL-2)，藉由習知免疫螢光程序處理該等細胞。結果表示為細胞激素陽性細胞在CD4/CD8 T細胞内之頻率。在第二次免疫後7天，對PBMC執行T細胞之細胞激素的細胞内染色。自小鼠收集血液且彙集於肝素化培養基 RPMI + Add中。對血液而言，將經RPMI+Add稀釋之PBL懸浮液根據推薦實驗方案（在2500 rpm及R.T下離心20 min)層化至淋巴細胞-哺乳動物梯度上。將界面處之單核細胞移 130360.doc -92· 200908994 除，在RPMI+Add中洗滌2次，且在rpmi 5%胎牛血清中將 PBMC懸浮液調整至2χ106個細胞/毫升。在1 X 1 07個細胞/毫升（FACS管）之最終濃度下，用完整 FI(1 gg HA/病毒株）進行PBMC之活體外抗原刺激，且隨後在37°C下以添加抗-CD28及抗-CD49<1(兩者均為1 pg/ml)培育2小時。在抗原再刺激步驟之後，在布雷菲特菌素（1 pg/ml)存在於3 7°C下將PBMC在3 7°C下培育隔夜以抑制細胞激素分泌。 IFN-y/IL-2/CD4/CD8染色如下執行：洗務細胞懸浮液’ 再懸浮於含有2% Fc阻斷試劑（1/50 ; 2.4G2)之50 μΐ PBS 1% FCS中。在4°C下培育10 min後，添加50 μΐ之抗CD4-ΡΕ(2/50)及抗CD8 perCp(3/50)之混合物且在4°C下培育30 min。在PBS 1% FCS中洗滌之後，藉由再懸浮於200 μΐ之 Cyt〇nx-Cytoperm(Kit BD)中將細胞滲透化且在4°C下培育 20 min。隨後，將細胞用Perm Wash(Kit BD)洗滌，且用稀釋於 Perm Wash 中之 50 μΐ 之抗 IFN-γ APC(l/50)+抗 IL-2 FITC(l/50)的混合物將其再懸浮。在4°C下最多培育2 h隔夜後，將細胞用Perm Wash洗滌且再懸浮於PBS 1% FCS+1 %三聚甲醛中。藉由FACS執行樣本分析。閘控活細胞（FSC/SSC)且在CD4+ T細胞上執行對約20,000個事件（淋巴細胞）或35,000個事件之獲取。對CD4 +及CD8+閘控群體計算IFN-y+或IL2 +之百分比。 Ι_1·3·抗 H5N1 ELISA 〇藉由ELISA，使用裂解H5N1作為塗層執行抗H5N1 Ig、 130360.doc -93- 200908994

IgGl及IgG2b抗體效價之定量。以每孔loo μ!來使用病毒及抗體溶液。以於PB S中之1 Kg/mi之最終濃度稀釋裂解病毒H5N1且在4°C下吸附隔夜至96孔微量滴定板（Maxis〇rb Immunoplate Nunc 439454)之孔中。隨後，在 37〇c 下，用每孔200 μΐ含有1。/。BSA及0.1% Tween 20(飽和緩衝液）之 PBS將培育板培育1小時。將12份血清於飽和緩衝液中之兩倍稀釋液添加至經H5N1塗佈之培育板中且在37〇c下培育j 小時30鐘。用PBS 0·1〇/〇 Tween 20將培育板洗滌4次。將在 PBS 1% BSA 0.1% Tween 20中以1/500稀釋之生物素標記結合抗小鼠Ig(Prozan-E0413)或以1/4000稀釋之生物素標記結合抗小鼠IgGl(Imtech 1070-08)或生物素標記抗小鼠

IgG2b (Imtech 1090-08)添加至各孔中且在37°C下培育1小時30鐘；洗滌步驟後，用在pbs 1% BSA Tween 20中以 1/10000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-生物素-過氧化酶 (Streptavidine-Biotine -Preoxidase)結合物（Prozan P0397) 將培育板培育30 min。對比色顯示而言’在22°C下’用鄰苯基二胺（Sigma ?4664)0.04%；»2〇2 0.03%於卩114.2之0.11^檸檬酸鹽緩衝液中之溶液將培育板培育20 min。用H2S04 2N終止反應且在 490-63 0 nm下閱讀微板。 1.2.雪貂方法 1.2.1.血球凝集抑制測試（hi) 測試程序使用血球凝集抑制測試（HI)測定三種流感病毒病毒株之抗血球凝集素抗體效價。HI測試之原理係基於特定抗流感 130360.doc -94- 200908994 抗體藉由流感病毒血球凝集素（HA)抑制雞紅血球（rbc)之血球凝集作用的能力。首先用25%神經胺糖酸酶溶液 (RDE)處理血清且將其熱失活以移除非特異性抑制劑。預處理之後，用4個血球凝集單位之各流感病毒株培育血清之兩倍稀釋液。隨後添加雞紅血球且對凝集之抑制作用計刀。效饧表示為完全抑制球凝集作用之血清之最高稀釋度的倒數。當血清之第一稀釋度為丨：；! 〇時，將不可偵測之含量計分為等於5之效價。統計分析使用UNISTAT對HI效價（第41天，攻毒之前）執行統計分析。用於變異數分析之實驗方案可如下簡要描述：資料之對數轉換。對各群體（群組）進行Shapiro-Wilk測試以驗證群組分布之正態性。進行Cochran測試以驗證不同群體（群組）之間變異數的同質性。對單因素AN0VA之相互作用的測試。用於多重比較之Tuckey-HSD測試。 1.2.2.體溫監控在攻毒期間以傳輸器及藉由遙測記錄來監控個體溫度。對所有植入物進行檢查且整修，且在置於腹膜腔内之前藉由 DSI(Data Sciences International, Centaurusweg 123，5015 TC Tilburg，The Netherlands)執行新的校正。在該等量測期間，將所有動物個別地收容於單一籠中β 130360.doc -95- 200908994 攻毒前4天，每15分鐘記錄溫度直至攻毒後7天。 I·2·3.鼻洗務物藉由將5 ml PB S投與喚醒動物之兩個鼻孔中來執行鼻先滌。將接種物收集於皮氏培養皿（PetH dish)中且置於乾水上之樣本容器中。 ' 鼻洗滌物之病毒滴定首先將所有鼻樣本經由Spin X過濾器（c〇star)無菌過淚以移除任何細菌污染。將鼻洗滌物之50 μΙ連續丨0倍稀釋液轉移至含有50 μΐ培養基之微量滴定板（10個孔/稀釋液）。隨後將1 00 μΐ之MDCK細胞（2.4χ 105個細胞/毫升）添加至各孔中且在35°C下培育5-7天。培育5-7天後，輕輕移除培養基且添加1〇〇 μ1含有1/2〇 W S Τ-1之培養基，且再培育1 8小時。在病毒滴定檢定結束時，WST-1藉由活細胞還原所產生之黃甲臢染料的濃度與孔中所存在之活細胞的數量成比例，且藉由在適當波長（450奈米）下量測各孔之吸光度來定量。將截止值定義為未經感染對照細胞之〇D平均值_〇.3 〇D(0.3 OD相應於未經感染對照細胞之+/_3 StDev之〇d)。當OD<截止值時定義為正計分，且相反，當〇d >截止值時定義為負計分。藉由"Reed及Muench"測定病毒排毒效價且將其表不為Log TCID50/ml。 Ι·3.豬方法 1.3.1.血球凝集抑制測試（jjl) 測試程序。 130360.doc • 96- 200908994 使用企球凝集抑制測試（HI)測定三種流感病毒病毒株之抗血球凝集素抗體效價。肋則試之原理係基於特定抗流感抗體藉由流感病毒血球凝集素（HA)抑制雞紅血球之血球凝集作用的能力。首先用25〇/〇神經胺糖酸酶溶液 (觀）處理血清且將其熱失活以移除非特異性抑制劑。預處理之後14個▲球凝集單位之各流感病毒株培育血清之兩倍稀釋液。隨後，添加雞紅血球且對凝集之抑制作用計分。效價表示為完全抑制血球凝集作用之血清之最高稀釋度的倒數。當血清之第一稀釋度為1:1〇時，將不可偵測之含量計分為等於5之效價。統計分析。使用umsTAT對HI效價（第41天，攻毒之前）執行統計分析。用於變異數分析之實驗方案可如下簡要描述：資料之對數轉換。對各群體（群組）進行Shapiro-Wilk測試以驗證群組分布之正態性；進行Cochran測試以驗證不同群體（群組）之間變異數的同質性。對單因素ANOVA之相互作用的測試。用於多重比較之Tuckey-HSD測試。 1.4.評估人類免疫反應之檢定 1.4.1.血球凝集抑制檢定使用 WHO Collaborating Centre for inHuenza, Centres for

Disease Control，Atlanta，USA(1991)所述之方法，藉由量 130360.doc -97- 200908994 測HI抗體來測定免疫反應。使用4個企球凝集抑制單位（4 mu)之適當抗原及0 5%家禽紅血球懸汁液’用標準化及綜合驗證之微量法對解床之冷來血清樣本進行抗體效價量測。非特異性血清抑制劑藉由熱處理及受體破壞酶來移除。 9 "平估所獲彳于血清之HI抗體含量。以丨：丨〇之初始稀釋度開始’製備連續稀釋液（以2之因子）直至1:2〇彻之終點稀釋度。將滴定終點視為展示完全抑制（1〇〇%)血球凝集作用之最高稀釋步驟。所有檢定均重複進行2次。 1.4.2.神經胺糖酸梅抑制檢定在經胎球蛋白塗佈之微量滴^板中執行檢定。製備抗血清之2倍連續稀釋液且與標準化量之流感a H3N2、出…或流感B病毒混合。該測試係基於神經胺糖酸酶之生物活性，該神經胺糖酸酶自胎球蛋白酶促釋放神經胺糖酸。在末端神經胺糖酸裂解之後，露出β_〇_半乳糖乙醯基_半乳胺糖。將特異性地結合至半乳糖結構之經辣根過氧化物酶（HRP)標記的花生凝集素（來自落花生（入咖… hyP〇gaea))添加至孔中。結合凝集素之量可在與四甲基聯笨fee (TMB)i夂質反應中偵測及定量。仍抑制病毒神經胺糖酸酶活性至少50%之最高抗體稀釋度指示為NI效價。 Ι·4·3.中和抗體檢定對解/東之冷柬血清樣本進行中和抗體量測。在微量中和檢定中測定藉由血清中所含抗體之病毒中和作用。血清在不經其他處理之情況下即用於檢定中。 n0360.doc -98- 200908994 將各血清重複測試三次。將標準化量之病毒與血清之連續稀釋液混合且培育以使抗體可與病毒結合。隨後，將含有確定量MDCK細胞之細胞懸浮液添加至病毒及抗血清之混合物中’且在33〇C下培育。培育期之後，藉由雞紅血球之血球凝集觀測病毒複製。血清之5()%巾和效價係藉由 Reed及Muench之方法來計算。 I.4.4·藉由細胞激素流式細胞儀（Cyt〇kine F丨〇w Cyt〇metry， CFC)評估細胞介導之免疫性右用其相應抗原來培育’則周邊血液抗原特異性cd4及 CD8 T細胞可經活體外再刺激以產生il_2 ' cd慨、及 IFN。因此在、.、田胞表型之習知免疫榮光標記以及細胞内細胞激素產生之後’可藉由流式細胞儀對抗原特異性cd4及 CD8 T細胞進行計數。在本研究中，冑流感疫苗抗原以及

源自特定流感蛋白之肤田M <耿用作抗原以再刺激流感特異性T細胞。將、结果表示為細胞激素陽性CD4或CD8 丁細胞在CD4 或CD8T細胞亞群中之頻率。 1.4.5.統計方法 1.4.5 · 1.初級終點在疫田接種後7天後繼時期(亦即疫苗接種當天及隨後6天) 期間及整個％期’所請求之局部及全身徵象及症狀的百分比、強度及與疫苗接種之關係。在疫田接種後2 1天後繼時期(亦即疫苗接種當天及隨後天）期門及正個時期，未經請求之局部及全身徵象及症狀 I30360.doc •99- 200908994 的百分比、強度及與疫苗接種之關係。 •在整個研究期間之嚴重不良事件的發生。 1.4.5.2.二級終點對體液免疫反應而言：所觀測之變數： •在第0天及第21天：分別抵抗疫苗中所提供之三種流感病毒病毒株（抗H1N1、抗H3N2及抗B-抗體）之每一者所測試的血清血球凝集抑制（HI)及NI抗體效價。 •在第0天及第2 1天··分別抵抗疫苗中所提供之三種流感病毒病毒株之每一者所測試的t和抗體效價。導出變數（95%信賴區間）： •疫苗接種前及後具有95%信賴區間（95% CI)之血清HI抗體的幾何平均效價（GMT) •第21天具有95% CI之血清轉化率* •第21天具有95°/。CI之轉化因子** •第21天具有95% CI之血清保護率"* •在所有時間點之血清NI抗體GMT(具有95%信賴區間）。 *血清轉化率，其定義為對於各疫苗病毒株而言，與第〇天相比’第21天之血清出效價至少增加4倍之受疫苗接種者的百分比。 **轉化因其定義為對於各疫苗病毒株而言，與第。天相比，第2 1天之血清HI GMT的增加倍數。 Γ保護率，其定義為在疫苗接種後（對於各疫苗病毒株而以清m效價=40之受疫苗接種者的百分比，通常將其接 130360.doc -100- 200908994 受為保護指示。應瞭解，對於一些臨床試驗而言，反應原性/安全性可為二級終點，且免疫原性可為初級終點。對細胞介導之免疫（CMI)反應而言所觀測之變數在第0天及第2 1天：在不同測試中，每1 〇6個中細胞激素陽性CD4/CD8細胞之頻率。各測試將CD4/CD8 T細胞之反應定量為： •肽流感（pf)抗原（需要給予/解釋該等抗原之準確性質及起源） •裂解流感（sf)抗原 •完整流感（wf)抗原。導出變數： •產生至少兩種不同細胞激素（CD40L、IL-2、IFNy、TNFa) 之細胞 •產生至少CD40L及另一細胞激素（IL-2、TNFa、IFNy)之細胞 •產生至少IL-2及另一細胞激素（CD40L、TNFa、IFNy)之細胞 •產生至少IFNY及另一細胞激素（IL-2、TNFa、CD40L)之細胞 •產生至少TNFcx及另一細胞激素（IL-2、CD40L、IFNy)之細胞 1.3.5.3 .免疫原性分析 130360.doc -101 - 200908994 免疫原性分析係基於總疫苗接種組。對各處理群組而言，計算以下參數（95°/。信賴區間）： •第0天及第21天之HI及NI抗體效價之幾何平均效價 (GMT)。 •第0天及第2 1天之中和抗體效價之幾何平均效價（GMT)。 •第21天之轉化因子。 •第2丨天之血清轉化率（sc)，其定義為與第〇天相比，第21 天之血清HI效價增加至少4倍的受疫苗接種者之百分比。 •第21天之保護率，其定義為血清出效價=1:4〇之受疫苗接種者的百分比。 •在各時間點（第0天、第21天）且對於各抗原（肽流感（pf)、裂解流感（sf)及完*流感（wf))而·^，對各疫苗接種群組概括（描述性統計學）在反應中分泌之CD4/CD8 τ_淋巴細胞之頻率。 •在各5次不同測試時，對各疫苗接種群組及各抗原化卜^ 及而言’在時間點（p〇st_Pre)反應之間的個別差異之描述性統計學。 •非參數測試(KrUskall_Wallis測試)用“^^ 1立詈莫思 ",且在各5次不同測試時，對各抗原而言計算統所有顯著性測試均為雙尾的。小於或等於〇〇5 之P值視為統計學顯著的。實例II-水包油乳液及佐劑調配物之製備由2除非另外陳述，否則用於隨後實例中之油/水乳液包含油（α_生育酚及角！烯）組成之有機相及含有Tween 】30360.doc 200908994 8〇TM或聚山梨醇酯8〇TM作為乳化劑之PBS水相。除非另外陳述，否則製備用於隨後實例中之水包油乳液佐劑調配物，其包含以下水包油乳液組份（給出最終濃度）：2.5%角鯊烯（Wv)、2.5% α-生育酚（v/v)、〇.9%聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯（v/V)(Tween 80)，參見WO 95/17210。如下製備在隨後實例中稱為AS03之呈2倍濃縮物形式之該乳液。 H.1·乳液SB62之製備該方法用於在臨床及臨床前實例部分報導之研究中。 SB62乳液之製備係藉由在強力攪動下將包含疏水性組份 (DL α生月酌·及角餐稀）之油相及含有水溶性組份（陰離子性清潔劑丁ween 80及pH 6.8之PBS mod(經改質））之水相混合來進行。在攪拌同時，將油相（1/1〇總體積）轉移至水相 (9/10總體積且在室溫下將混合物攪拌15分鐘。隨後，使所得混合物在微流化床之相互作用腔室中經受剪切、衝擊及空蝕力（15000 PSI-在用於實例ΠΙ報導之臨床試驗中之佐劑中8次循環或3次循環），以產生次微米級小液滴（分布於100與200 nm之間）。所得pH在6.8 土 0.1之間。隨後，藉由經由0.22 μιη膜過濾將SB62乳液滅菌，且在2至8°C下，在Cupac容器中冷凍儲存無菌本體乳液。將無菌惰性氣體 (氮或氬）沖入死體積之SB62乳液最終本體容器中歷時至少 15秒鐘。 S B 6 2乳液之最終組成如下：

Tween 80 : 1.8 〇/〇 (v/v)丄 9.4 mg/ml ;角鯊烯：5 0/〇 (v/v) 130360.doc -103 - 200908994 42.8 mg/ml ; α-生育酚：5。/。（^~)47.5 11^/1111;?88- mod . NaCl 121 mM、KC1 2.38 mM、Na2HP〇4 7.14 mM、 KH2P〇4 1.3 mM ; pH 6.8 ± 0.1。實例III-在年齡為18-59歲成年人群體中用含有裂解流感抗原製劑及兩劑量之AS03佐劑（Fiu_LD-004)之疫苗進行的臨床試驗。 III.1.介紹 2006年’在年齡為18-59歲之成年人群體中進行II期、受控' 隨機化、單盲研究，以評估具有兩劑量之AS03佐劑之 GlaxoSmithKline Biol〇gicals低劑量流感候選疫苗（亦即每病毒株含有5 pg HA)的免疫原性、安全性及反應原性。在經肌肉内投與一劑量之經AS03佐劑化疫苗後21天時量測體液免疫反應（亦即抗血球凝集素）。FluarixTM用作參考物。 ΙΙΙ·2·研究設計三群受檢者經肌肉内平行接受以下疫苗： V .. 一群100個受檢者接受含有5 pg ΗΑ之經AS03(FluLDl/l) 佐劑化之低劑量裂解病毒流感疫苗的1次注射一群1 00個受檢者接受含有5 gg HA之經一半劑量 AS03(AS03i/2)(FlULDl/2)佐劑化之低劑量裂解病毒流感疫苗的1次注射 —群100個受檢者接受一劑量之Fluarix™(Fluarix)

時程：在第0天流感疫苗之1次IM注射，在第0天及第21天進行研究位點訪問，同時在第3 0天進行血液樣本收集（HI 130360.doc -104- 200908994 抗體測定）及額外電話聯繫（研究結論）。用於該研究中之標準三價裂解流感疫苗_FluarixTM為來自由 GlaxoSmithKline Bi〇l〇gicals研發且製造之2〇〇6/2〇〇7 年 Northern Hemisphere之商用疫苗。 III.3.研究目標 III.3.1.主要目標 -為評估就抗血球凝集素抗體效價而言，藉由研究疫苗誘導之體液免疫反應：第0天及第21天所觀測之變數：血清血球凝集抑制抗體效價。導出變數（95%信賴區間）： -第0天及第21天之血清抗體的幾何平均效價（GMT) -第21天之血清轉化率* -第21天之血清轉化因子** -第0天及第21天之血清保護率*** I *血球凝集素抗體反應之血清轉化率，其定義為具有疫苗接種前效價<1: 1G及疫苗接種後效價^丨：4()或疫苗接種前效價21:10且疫苗接種後之效價增加至少4倍之受疫苗接種者的百分比 **血清轉化因子，其定義為與"天相比，疫苗接種後血清HI GMT之增加倍數；血^保濩率，其定義為在疫苗接種後血清HI效價2丨·4〇之受疫苗接種者的百分比，通常將其接受為保護指示。· ΙΙΙ.3.2.二級目標 I30360.doc -105- 200908994 為評估就所請求之局部及全身不良事件、未經請求之不良事件及嚴重不良事件而言之研究疫苗的安全性及反應原性： 1. 在各群組中，各疫苗接種後7天後繼時期（亦即疫苗接種當天及隨後6天）期間，所請求之局部及全身徵象及症狀的發生、強度及與疫苗接種之關係。 2. 在各群組中，疫苗接種後30天後繼時期（亦即疫苗接種當天及隨後29天）期間，未經請求之局部及全身徵象及症狀的發生、強度及與疫苗接種之關係。 3 .在各群組中，整個研究時期期間，嚴重不良事件之發生及關係。 III.4.疫苗組合物及投藥 III.4.1.疫苗製備未經佐劑化流感疫苗為三價裂解病毒粒子、失活流感疫苗，其係由三種單價病毒抗原本體（分別自流感病毒株 A/H1N1、A/H3N2及B製備）組成。存在於該疫苗中之抗原與經批准之疫苗相同，該疫苗自1992年起在市場上作為市售且每劑量含有1 5 pg HA/病毒株。FluLD臨床批量中所包括之流感病毒株為對於 2006/2007 Northern Hemisphere所選擇之病毒株： • A/新喀裏多尼亞/20/99(Η1Ν1)類病毒株：A/新喀裏多尼亞 /20/99(HlNl)IVR-116 • A/威斯康星/67/2005(H3N2)類病毒株：A/威斯康星 /67/2005(H3N2)NYMCX-161 130360.doc -106- 200908994 • B/馬來西亞/2506/2004。抗原係源自卵生長病毒。裂解係在失活步驟之前用去氧膽酸鈉來進行，其經由去氧膽酸鈉與曱醛之隨後作用來執行。經AS03佐劑化之低劑量流感（FluLD)疫苗（臨床批量）係以市售之疫苗（分別自流感病毒株A/H1N1、 Α/Η3Ν2及Β製備）為主，但具有較低抗原含量且經GSK佐劑系統AS03來佐劑化。AS03係由水包油乳液（SB62)組成，該水包油乳液含有兩種可生物降解油，即角鯊烯及α-生育紛（維生素Ε);及界面活性劑，聚山梨醇g旨80(Tween 80)。流感抗原藉由與乳液簡單混合而經併入佐劑系統之水相中。已測試兩種調配物，其不同之處在於在疫苗批量中經Flu抗原所引入之佐劑的量。經佐劑化之疫苗每劑量含有5 pg血球凝集素（HA)之各流感病毒病毒株，以及全劑量（AS03)或半劑量0803½)之佐劑系統AS03。賦形劑為以下各者：聚山梨醇S旨80(Tween 80)、辛苯昔醇10(octoxynol 10)(Triton Χ-100)、α -生育盼氫丁二酸酯、氣化鈉、鱗酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、注射用水。經AS03佐劑化之低劑量流感疫苗（FluLD，全或半劑量之AS03)為不含防腐劑之疫苗。然而，其自製造方法之早期即含有痕量之硫柳汞（每劑量<1.25 pg之Hg)。其均以0.5 ml/劑量之體積，以單劑量疫苗形式存在於玻璃（I型）預填充注射器中。 III.4.1.1.經AS03佐劑化流感疫苗之組成 130360.doc -107- 200908994 一劑量之FluLD(全或半劑量之AS03)相應於0.5 ml。組成提供於表3中。對於兩種調配物而言，每劑量之Η A含量為5 gg，唯一差異為存在於最終容器中之AS03的量。表3經AS03佐劑化之低劑量流感疫苗（全及半劑量之AS03) 的組成組份每劑量(0.5 ml)之量失活裂解病毒粒子 -A/新喀裏多尼亞/20/99(HlNl)IVR-116 -A/威斯康星/67/2005(H3N2)NYMCX-161 -B/馬來西亞/2506/2004 5μΕΗΑ 5 pg HA 5μ§ΗΑ 佐劑(全劑量/半劑量） -SB62乳液(總體積） •角鯊烯 •DL-α-生育紛 •聚山梨醇醋80(Tween 80) 0.250 mL 10.70 mg/5.35 mg 11.88 mg/5.94 mg 4.85 mg/2.425 mg 聚山梨醇醋80(Tween 80) 0.122 mg 辛苯昔醇 10(TritonX-100) 0.0283 mg oc生育酚氫丁二酸酯 0.01665 mg 氣化納 4 mg 填酸氮二納 0.575 mg 磷酸二氫鉀 0.100 mg 氣化鉀 0.101 mg 注射用水足量至0.50 ml 縮寫：HA=m球凝集素。當使用AS03全劑量時，聚山梨醇酯80中之總含量相應於每劑量4.972 mg，且當使用AS03半劑量時，相應於每劑量 2.547 mg 〇 III.4.1.2.裂解失活流感抗原製劑之產生流感抗原與(流感病毒疫苗）中所包括之彼等抗原相同。單價本體係由純化失活裂解病毒組成，其係自流感病毒之三種病毒株（即A型（H1N1及H3N2)及B型）之研究 130360.doc -108- 200908994 種子所製備’該等研究種子個別地生長於含胚雞卵中。該等研究種子係源自由WHO協作中心按照每年WHO推薦所接％之病毒株。對於製備方法而言，經由說明對 02/097072給出抗原參考物。三種單價本體之體積係基於調配之前各單價本體中所量測之HA含量及目標製造體積計。將10倍濃縮磷酸鹽緩衝生理食鹽水（當1倍濃縮時pH為 7.4)及Tween 80與α-生育酚氫丁二酸酯之預混合物稀釋於注射用水中，繼而在室溫下攪拌5_3〇分鐘期間。隨後，將三種濃縮單價本體依次稀釋於所得磷酸鹽緩衝生理食鹽水/Tween 80-α-生育酚氫丁二酸酯溶液中以達到以下濃度： 2〇 Pg ΗΑ之各Α單價本體（Η1Ν1、Η3Ν2) 23·32叫HA之B單價本體每mL中間三價本體（5畔ΗΑ之各Α單價本體及583叫 ΗΑ之Β/500 μΐ三價最終本體）。在各單價本體之添加之間，在室溫下將混合物攪拌logo分鐘且在最後單價本體之添加後攪拌15_3〇分鐘。亦稱為”預池（pre-pool)”之該中間三價本體可保持於+2_+8。〇下，或另外在當天經處理至最終調配步驟。預池之最終體積為每劑量250 μΐ。 ΠΙ.4.1.3.具有AS03佐劑之疫苗組合物的製備經佐劑化之疫苗：LD AS03 1/1(表4) 將10倍濃縮之PBS mod(當1倍濃縮時阳7 4 ; 137 130360.doc -109- 200908994

NaCl、2.7 mM KC1、8.1 mM Na2HP04、1.47 mM KH2P04，pH 7.4)以及含有 Tween80、Triton X-100 及 VES(量考慮存在於病毒株中之清潔劑）之混合物添加至注射用水中。5至30分鐘攪拌後，添加每ml之各病毒株H1N1 及H3N2中20 HA及每ml之B病毒株中23.32 pg HA，同時在每次添加之間攪拌10至30分鐘。攪拌15至30分鐘後，丟棄小體積之所謂”中間本體以用於分析，且儲存於+2與 + 8°C之間。中間本體係處於1倍濃縮之PBS mod中。目標清潔劑濃度為每 ml 488 Tween 80、每 ml 73.6 pg Triton X-100 及每 ml 66.6 pg VES。隨後製備最終調配物：將相等體積之SB62(參見實例II 中之製備）添加至各250 μΐ之預池中間本體中，且在室溫下在30至60分鐘期間混合。檢查pH在6.8與7·5之間之範圍内。用氮沖洗調配物且隨後在填充之前將其儲存於+2與 8°C之間。表4經AS03佐劑化之低劑量疫苗組份濃度艎積(ml) 步驟1 :預池 A/新喀裏多尼亞單價本體 104 pg/ml 302.88 A/威斯康星單價本體 85 pg/ml 370.59 B/馬來西亞單價本體 110 pg/ml 333.90 PBS mod(l) 參見腳註 56.76 Tween 80 48000 pg/ml 5.24 Triton X-100 來自H3N2病毒株之殘餘物 α-生育酚氫丁二酸酯 26480 pg/ml 1.2 過濾水 504.43 總體積=1575(ml) 取回75 ml預池樣本用於測試剩餘預池體積=1500(ml) 130360.doc -110- 200908994 步驟2 :添加至預池中乳液 1500 最終本體之總體積=3000(ml) (1):緩衝液最終本體組成為：137 mM NaCl、2.7 mM KC1 ' 8.1 mM Na2HP04 ' 1.47 mM KH2P04 ' pH 7.4 經佐劑化之疫苗：LD AS03 1/2(表5) 將10倍濃縮之PBS mod物（當1倍濃縮時pH 7.4-參見上文組合物）以及含有Tween 80、Triton X-100及VES(量考慮存在於病毒株中之清潔劑）之混合物添加至注射用水中。5至 30分鐘攪拌後，添加每ml之各病毒株H1N1及H3N2中20 HA及每ml之Β病毒株中23.3 2 pg HA，同時在每次添加之間攪拌10至30分鐘。攪拌15至30分鐘後，丟棄小體積之所謂”中間本體”以用於分析，且將其儲存於+2與+8°C之間。 PBS mod為於中間本體中之1倍濃縮物。目標清潔劑濃度為每 ml 488 pg Tween 80、每 ml 73.6 pg Triton X-100 及每 ml 66.6 pg VES。隨後製備最終調配物：首先用PBS mod緩衝液稀釋SB62 且在室溫下攪拌1 5-30分鐘。隨後將相等體積之該經稀釋 SB62添加至各250 μΐ之中間本體預池中。在室溫下攪拌30 至60分鐘後，檢查pH在6.8與7.5之間之範圍内。用氮沖洗調配物且隨後在填充之前將其儲存於+2與8°C之間。兩種調配物之最終體積均為每劑量500 μΐ且最終HA濃度均為每ml三價最終本體10 pg之各Α單價本體及11.66 之 Β單價本體。最終Tween 80、Triton Χ-100(來自Η3Ν2單本體製造之殘餘物）及α-生育酚氫丁二酸酯（α-生育酚氫丁二 130360.doc -111 - 200908994 酸酯為RRR(D異構體）-α-生育酚之酯形式）目標濃度分別為 244 pg/ml、5 8.6 pg/ml及 33.3 pg/ml ° 表5經AS03佐劑化之低劑量疫苗（半劑量之佐劑）組份濃度體積(ml) 步驟1 :預池 A/新喀裏多尼亞單價本體 104 pg/ml 300.96 A/威斯康星單價本體 85 pg/ml 368.24 B/馬來西亞單價本體 110 pg/ml 331.78 PBS mod(l) 參見圖例 56.4 Tween 80 48000 pg/ml 5.2 Triton X-100 來自H3N2病毒株之殘餘物 α-生育酚氫丁二酸酯 26480 pg/ml 1.2 過遽水 501.22 總體積=1565(ml) 取回65 ml預池樣本用於測試剩餘預池體積=1500(ml) 步驟2 :添加至預池中乳液SB62 750 PBS mod(l) 參見圖例 75 過遽水 675 最終本體之總體積=3000(ml)

(1):緩衝液最終本體組成為：137 mM NaCl、2.7 mM KCM、8.1 mM Na2HP04、1.47 mM KH2P〇4，pH 7·4 III.4.2.疫苗投藥將疫苗填充至1.25 ml無菌I型（Ph. Eur.)玻璃注射器中。將各注射器填充至0.57 ml之標靶（範圍：0.54-0.60 ml)。在非支配臂之三角肌區域中經肌肉内投與疫苗。所有疫苗均作為預填充之注射器（0.5 ml)存在。為確保疫苗之適當IM 注射，使用至少25 G且長度至少為2.5 cm之針。 III.5研究群體結果總計300個受檢者登記於該研究中：3個群組之每一群組 130360.doc -112- 200908994 為1 0 0個又檢者。在疫苗接種時之總疫苗接種組的平均年齡為36·7歲，標準偏差為13.67歲。3個疫苗群組之間各受檢者之平均年齡及性別分布係類似的。 ΙΙΙ·6免疫原性結果對免疫原性之ΑΤΡ組（297個受檢者）執行免疫原性分析。想液免疫反應為評估藉由經AS03佐劑化之低劑量流感候選疫苗誘導之體液免疫反應，對各處理群組計算以下參數（95%信賴區間）：第〇天及第2 1天之HI抗體效價的幾何平均效價（GM丁）； •第21天之血清轉化率（sc); •第21天之轉化因子； •第〇天及第21天之保護率。 III.6.1 HI幾何平均效價（gmt) 具有抓CI之職體的GMT展示於表6及圖4。群組之間的經調整GMT比率展示於表7中。在3個處理群組中，所有3種癌# 丨π裡反田病毒株之HI抗體的疫苗接種前GMT均在相同範圍内。一罕_ 1對所有3種病毒株而言，第 2 1天對經佐劑化群組所觀測之 MT傾向於比Fluanx群組高’且對A/威斯康星疫苗病毒休而 s 在FluLDl/1 與Fluarix 之間具有統計學差異（95%CI盔重& β …、皇i且經調整之GMT比率不含值1)。對B/馬來西亞疫苗病毒勢徠而言，亦在FluLDl/2與

Fluarix之間觀測到統計學差里調整之GMT比率不含值 1)。 130360.doc -113- 200908994 表6-第0天及第21天之抗HA抗體的血清陽性率及幾何平均效價（GMT)(免疫原性之ATP組）抗體群組時間 N n >10 % 1/DII 95°/ LL j 〇CI UL 1/DL GMT 95°/ LL [>CI UL Min Max FluLDl/1 PRE 99 80 80.8 71.7 88.0 31.9 23.5 43.4 <10.0 2560.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 475.4 352.2 641.6 20.0 7240.0 A/新喀襄多尼亞 FluLDl/2 PRE 99 BO 80.8 71.7 88.0 36.1 26.9 48.5 <10.0 3620.0 PI(D21) 99 98 99.0 94.5 100 399.0 294.7 540.2 <10.0 7240.0 Fluarix PRE 98 85 86.7 78.4 92.7 26.1 20.5 33.2 <10.0 1280.0 PI(D21) 98 98 100 96,3 100 380.6 274.2 528.4 10.0 7240.0 FluLDl/1 PRE 99 61 61.6 51.3 71.2 16.8 13.1 21.5 <10.0 453.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 276.2 223.5 341.3 28.0 5120.0 A/威斯康星 FluLDl/2 PRE 99 66 66.7 56.5 75.8 19.9 15.2 25.9 <10.0 640.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 241.9 192.9 303.4 20.0 5120.0 Fluarix PRE 98 58 59.2 48,8 69.0 14.7 11.6 18.6 <10.0 320.0 PI(D21) 98 97 99.0 94.4 100 172.3 136.4 217.6 <10.0 5120.0 FluLDl/1 PRE 99 72 72.7 62.9 81.2 20.4 15.9 26.1 <10.0 453.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 268.6 221.3 326.0 28.0 2560.0 B/馬來西亞 FluLDl/2 PRE 99 76 76.8 67.2 84.7 22.2 17.6 27.9 <10.0 320.0 PI(D21) 99 99 100 96.3 100 301.5 246.1 369.4 28.0 3620.0 Fluarix PRE 98 76 77.6 68.0 85.4 26.5 20.9 33.6 <10.0 320.0 PI(D21) 98 97 99.0 94.4 100 219.2 171.4 280.2 <10.0 5120.0

FluLDl/l =具有全劑量AS03佐劑之低劑量流感疫苗（5 pg HA/病毒株）

FluLDl/2=具有半劑量AS03佐劑之低劑量流感疫苗（5 pg HA/病毒株）

Fluarix=Fluarix 疫苗 GMT=幾何平均抗體效價 N=具有可用結果之受檢者的數量 n/% =血清陽性受檢者（HI效價>=1:1 0)之數量/百分比 95% CI = 95%信賴區間，LL=下限，UL =上限 MIN/MAX=最小值/最大值 PRE =疫苗接種前，第0天 PI (D21)=疫苗接種後，第21天表7-對各疫苗病毒株而言，第21天各群組之間的經調整 -114- 130360.doc 200908994 GMT比率（免疫原性之ATP組）抗體群組描述 N 經調整之 GMT 群組描述 N 經調整之 GMT 經調整比率次序之GMl 值「比率 95 LL %CI UL A/新喀裏多尼亞 FluLDl/1 99 472,4 FluLDl/ 2 99 385.0 FluLDl/1 /FluLDl/2 1.23 0.80 L88 FluLDl/1 99 472.3 Fluarix 98 396.9 FluLDl/1 /Fluarix 1.19 0.78 1.82 (1/DIL) FluLDl/2 99 385.0 Fluarix 98 397.0 FluLDl/2 /Fluarix 0.97 0.63 1.49 A/威斯康星 FluLDl/1 99 277.3 FluLDl/ 2 99 230.0 FluLDl/1 /FluLDl/2 1.21 0.90 1.62 (1/DIL) FluLDl/1 99 277.5 Fluarix 98 180.8 FluLDl/1 /Fluarix 1.54 1.14 2.06 FluLDl/2 99 230.0 Fluarix 98 180.6 FluLDl/2 /Fluarix 1,27 0.95 1.71 B/馬來西亞 FluLDl/1 99 275.1 FluLDl/ 2 99 303.4 FluLDl/1 /FluLDl/2 0.91 0.68 1.22 (1/DIL) FluLDl/1 99 275,2 Fluarix 98 212.7 FluLDl/1 /Fluarix 1.29 0.96 1.74 FluLDl/2 99 303,4 Fluarix 98 212.6 FluLDl/2 /Fluarix 1.43 1.06 1.92

FluLDl/2=具有半劑量AS03佐劑之低劑量流感疫苗（5 HA/病毒株）

Fluarix=Fluarix 疫苗經調整之GMT=對基線效價而言經調整之幾何平均抗體效價 N=具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 95% CI =經調整GMT比率之95%信賴區間（Ancova模型：對 2個以上群組之基線效價-合併變異數的調整）；LL =下限、 UL=上限 III.6.2抗HI抗體效價之血清轉化因子、血清保護率及血清轉化率（當建立用於人類之流感疫苗時，保護之關聯性） -115- 130360.doc 200908994 血清保護率之結果呈現於表8_圖2中，血清轉化率之結果呈現於表9-圖3中且轉化因子之結果呈現於表1〇_圖4中。歐'州田局（European Authorities)關於血清保護率所要求之臨限（70%)在所有群組中均達到（至少94 9%)。對於各疫田病毒株而言，對3個群組而言，第21天之血清保護率係在相同範圍内。歐洲當局關於血清轉化率所要求之臨限（4〇%)在所有群組中均達到（至少65%)。對A/新π客裏多尼亞疫苗病毒株而言，對3個群組而言，第21天之SCR係在相同範圍内。對Α/威斯康星疫苗病毒株而言，對FluLD1/1群組而言，第21天之SCR與Fluarix群組相比傾向於更高。對fiuLD1/2 群組而§ ’第21天之SCR與Fluarix群組相比係在相同範圍内。對B/馬來西亞疫苗病毒株而言，對fiuld1/2群組而言，第21天之SCR與Fluarix群組相比傾向於更高。對FiuLD 1/1 群組而言，第21天之SCR與Fluarix群組相比係在相同範圍内。歐洲當局關於血清轉化因子所要求之臨限（2.5)在所有群組中均達到（至少6.2)。對A/新喀裏多尼亞疫苗病毒株而言，對3個群組而言，第21天之SCF似乎在相同範圍内。對FluLDl/2群組所觀測之值低於對Fluarix群組所觀測之值，但可藉由FiuLD 1/2群組中較高之疫苗接種前血清保護率來解釋。 130360.doc •116· 200908994 對A/威斯康星疫苗病毒株而言，對FluLDl/l群組而言，第21天之SCF與Fluarix群組相比傾向於更高。對FluLDl/2 群組而言，第21天之SCF與Fluarix群組相比係在相同範圍内。對B/馬來西亞疫苗病毒株而言，對2個經佐劑化群組而言’第21天之SCF與Fluarix群組相比傾向於更高。表8_第0天及第21天之HI抗體效價的血清保護率（SPR)(免疫原性之ATP組）疫苗病毒株群組時間 N SPR n 95% Cl % LL UL A/新喀裏多尼亞 FluLDl/l PRE 99 41 41.4 31.6 51.8 PI(D21) 99 95 96.0 90.0 98.9 FluLDl/2 PRE 99 55 55.6 45.2 65.5 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 Fluarix PRE 98 35 35.7 26.3 46.0 PI(D21) 98 93 94.9 88.5 98.3 A/威斯康星 FluLDl/l PRE 99 32 32.3 23.3 42.5 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 FluLDl/2 PRE 99 37 37.4 27.9 47.7 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 Fluarix PRE 98 25 25.5 17.2 35.3 PI(D21) 98 93 94.9 88.5 98.3 B/馬來西亞 FluLDl/l PRE 99 31 31.3 22.4 41.4 PI(D21) 99 97 98.0 92.9 99.8 FluLDl/2 PRE 99 39 39.4 29.7 49.7 PI(D21) 99 98 99.0 94.5 100 Fluarix PRE 98 44 44.9 34.8 55.3 PI(D21) 98 94 95.9 89.9 98.9

FluLDl/l =具有全劑量AS03佐劑之低劑量流感疫苗（5 HA/病毒株）

Fluarix=Fluarix 疫苗 130360.doc -117- 200908994 具有可用結果之受檢者的數量 n/% =經血清保護受檢者（HI效價>=40 1/DIL)之數量/百分比 95% CI = 95%信賴區間，LL =下限，UL =上限 PRE =疫苗接種前，第0天 PI (D21) =疫苗接種後，第21天資料來源=附錄表ΙΠΑ 表9-第21天之HI抗艚效價的血清轉化率（SCR)(免疫原性之 ATP 組）疫苗病毒株群組 N SCR n % 95% Cl LL UL A/新喀裏多尼亞 FluLDl/1 99 69 69.7 59.6 78.5 FluLDl/2 99 64 64.6 54.4 74.0 Fluarix 98 66 67.3 57.1 76.5 A/威斯康星 FluLDl/l 99 88 88.9 81.0 94.3 FluLDl/2 99 79 79.8 70.5 87.2 Fluarix 98 73 74.5 64.7 82.8 B/馬來西亞 FluLDl/l 99 76 76.8 67.2 84.7 FluLDl/2 99 82 82.8 73.9 89.7 Fluarix 98 65 66.3 56.1 75.6

FluLDl/l =具有全劑量AS03佐劑之低劑量流感疫苗（5 pg HA/病毒株） ?111!^1/2=具有半劑量八803佐劑之低劑量流感疫苗（5#经 HA/病毒株）

Fluarix=Fluarix 疫苗血清轉化定義為：

對最初血清陰性受檢者而言，疫苗接種後之抗體效價>=40 1/DIL 130360.doc -118- 200908994 對最初血清陽性受檢者而言，疫苗接種後之抗體效價> =4 倍疫苗接種前之抗體效價 N=具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 n/% =經血清轉化受檢者之數量/百分比 95% CI = 95%信賴區間，LL =下限，UL =上限表10-第21天之HI抗體效價的血清轉化因子（SCF)(免疫原性之ATP組）疫苗病毒株群組 N SCF 值 95% Cl LL UL A/新喀裏多尼亞 FluLDl/1 99 14.9 10.4 21.3 FluLDl/2 99 11.0 7.7 15.9 Fluarix 98 14.6 9.9 21.6 A/威斯康星 FluLDl/l 99 16.5 13.0 20.9 FluLDl/2 99 12.2 9.2 16.1 Fluarix 98 11.7 8.8 15.6 B/馬來西亞 FluLDl/l 99 13.2 10.0 17.4 FluLDl/2 99 13.6 10.2 18.0 Fluarix 98 8.3 6.2 11.0

FluLDl/l =具有全劑量AS03佐劑之低劑量流感疫苗（5 HA/病毒株）

FluLDl/2=具有半劑量AS03佐劑之低劑量流感疫苗（5 HA/病毒株）

Fluarix=Fluarix 疫苗 N=具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 SCF=血清轉化因子或幾何平均比率（平均[loglO(PI(D21)/ PRE)]) 95% CI = 95°/〇信賴區間，LL =下限，UL =上限 III.7安全性結論 130360.doc -119- 200908994 就經佐劑化疫苗群組中之所請求（局部/全身）及未經請求症狀而言，與Fluarix群組相比之更高反應原性為該研究中所觀測之總體趨勢。經佐劑化疫苗中AS03含量之降低對所有全身及局部3級症狀均具有顯著影響。與Fluarix群組（35%)相比，未經請求症狀之發生率在經佐劑化疫苗群組中傾向於更高（55%及47%之受檢者）。自該等結果可推斷，候選疫苗之反應原性及安全性概況係令人滿意且在臨床上可接受的。 III.8.總結論 III.8.1.免疫原性結果該研究之主要目標為評估藉由具有兩種不同濃度之 AS03佐劑之低劑量流感疫苗及藉由Fluarix引發之體液免疫反應（抗HI抗體效價）。第2 1天，三種疫苗超過歐洲當局關於每年登記之裂解病毒粒子流感疫苗的要求（用於每年病毒株改變之免疫邏輯言平估之"Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenza Vaccines"-CPMP/BWP/214/96)。與 Fluarix群組相比，經佐劑化群組中之GMT傾向於更高，對A/威斯康星（FluLD 1/1相對Fluarix)及B/馬來西亞疫苗病毒株 (FluLDl/2相對Fluarix)觀測到統計學顯著差異。在所有三個群組中均觀測到類似血清保護率，其係在94.9%至99% 之範圍内。在經佐劑化群組中，觀測到血清轉化率及血清轉化因子比Fluarix群組中高。來自該試驗之資料亦揭示， 130360.doc -120- 200908994 藉由具有半劑量A S 〇 3佐劑之疫苗所誘導之免疫原性相當於用全劑量佐劑所誘導之免疫原性。 ΙΙΙ·8·2·反應原性及安全性結果在該研究群體中，亦即年齡在18與59歲之間的成年人中，投與經AS03佐劑化之低劑量流感候選疫苗為安全的且在臨床上具良好耐受性。與全劑量佐劑化之疫苗相比，半劑量佐劑化之疫苗展示所請求之局部及全身症狀的發生率顯著降低。實例IV-在預致敏BALB/C小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解流感疫苗（包含各種劑量之AS03佐劑）的臨床前評估 IV.1.實驗設計及目標在經流感預致敏小鼠中執行實驗以評估藉由經該水包油佐劑調配之流感疫苗所誘導之AS03的體液反應之增加。為更接近人類情況（人由於大致每兩年經漂移病毒株反覆感染而為血清陽性的），使用經異源亞型病毒株預致敏之動物進行該實驗。與用同型病毒株預致敏相比，異源亞型預致敏亦為更嚴格之模型’且為在不同佐劑之間進行辨別之較佳模型。 IV.1.1.處理/群組（表11) 具有27隻成年雌性BALB/C小鼠之群組在第〇天，用三價完整、福馬林（formalin)失活流感病毒（對各病毒株而言，5 gg HA)經鼻内預致敏（體積20 μΐ)。由彼等病毒株之較早期漂移變異體（5 pg ΗΑ完整失活Η1Ν1 Α/約翰内斯堡/82/96、 H3N2 A/悉尼/5/97、B/哈爾濱/7/94)組成之預致敏病毒株包 130360.doc • 121 - 200908994 括在疫苗中。28天後，用單一劑量之疫苗候選物，以50 μΐ 之總體積經肌肉内對小鼠進行疫苗接種。用僅含有裂解抗原（三價裂解普通抗原）之調配物或含有經兩劑量AS03(全或1/5)佐劑化之裂解抗原的調配物對小鼠進行免疫。用於免疫之病毒株包括H1N1 A/新喀裏多尼亞/20/99、H3N2 A/ 巴拿馬/2007/99、B/山東/7/97病毒抗原（1.5 pg/病毒株、 1 /1 0之人類劑量）。表11

群組抗原/調配物其他處理 1 三價裂解/普通(未經佐劑化）異源性預致敏D0 2 三價裂解/AS03 異源性預致敏DO 3 三價裂解/AS03 1/5 異源性預致敏DO IV.1.2.疫苗調配物之製備製備Tween 80、Triton XI 00及維生素E丁二酸酯（VES)之預混物以使最終濃度達成具有750 pg/ml之Tween 80、110 pg/ml之Triton X100及100 pg/ml之VES的疫苗。用於預混物中之量係考慮已存在於病毒株中之清潔劑及VE S之量來計算。製備1公升之10倍濃縮生理食鹽水緩衝液（PBS pH 7.4): 向 0.800 1注射用水中添加NaCl 80 g、KC1 2 g、Na2HP04 11.44 g、KH2P04 2 g。溶解後，用注射用水調整至1.0 L。當10倍稀釋時，pH將為7.4。三價裂解/普通根據以下次序臨時製備一 50 μΐ劑量之調配物：注射用水 +生理食鹽水緩衝液（10倍濃縮PBS pH 7.4) +預混物，在室 130360.doc •122· 200908994 溫下5 min磁力攪拌，+1.5 pg HA H1N1病毒株’在室溫下 10 min磁力攪拌，+1.5 pg HA H3N2病毒株，在室溫下10 min磁力攪拌，+1.5 HA B病毒株，在室溫下15 min磁力攪拌。在其製備結束後之該小時内注射調配物。三償裂解/AS03 製備Tween 80、Triton XI00及維生素E丁二酸酯（VES)之預混物以使最終濃度達成具有750 pg/ml之Tween 80、110 Mg/ml之丁rit〇n \10〇及1〇〇 μ§/ιη12νΕ8的疫苗。用於預混物中之量係考慮已存在於病毒株中之清潔劑及VES之量來計算。根據以下次序臨時製備一 50 μΐ劑量之調配物：注射用水 +生理食鹽水緩衝液（10倍濃縮PBS pH 7_4)+預混物，在室溫下5 min磁力攪拌’ +1·5叫ha H1N1病毒株，在室溫下 1〇 min磁力攪拌’ +1·5叫ha H3N2病毒株，在室溫下10 min磁力攪拌’ +15叫ha B病毒株，在室溫下15 min磁力攪拌’ +25 μΐ SB62乳液（對全劑量AS03而言）或5 μΐ SB62 乳液（對1/5劑量AS03而言）’在室溫下15 min磁力授拌。在其製備結束後之該小時内注射調配物。 ΐν·1·3.讀出（表 12) 在免疫之前（第28天）及免疫後14天（27隻小鼠/群組）量測疫®接種之體液免疫反應。藉由血球凝集抑制（Η〗）測試來測試血清樣本。 130360.doc -123- 200908994

表12 讀出時間點樣本類型分析方法體液反應 D28, D42 jk清 IHA IV.2.結果 IV.2.1.體液免疫結果呈現於圖5中。在異源亞型預致敏繼而為單一疫苗接種之該小鼠模型中，已展示AS03及其稀釋液誘導與普通疫苗相比更高之HI效價。對所有流感A病毒株而言，觀測到HI效價之統計學顯著增加（p<〇.〇5)。對H1N1病毒株而言，亦在AS03與AS03 1/5之間觀測到HI效價之顯著差異 (p<0_05)。與普通疫苗相比，對B病毒株而言，降低劑量之 AS03未能增加HI效價。針對B病毒株（B/山東）觀測到極低反應；其可能歸因於用於預致敏之B病毒株與疫苗之間的顯著抗原性漂移。 IV. 3.結果及結論之概要總之，與普通疫苗相比，當使用經AS03佐劑化之疫苗時，在經異源亞型病毒株預致敏之動物中觀測到HI效價之增加。對獲得抵抗所有三種流感疫苗病毒株之穩固HI效價而言，全劑量之AS03為最佳的。實例V-在預致敏C57B1/6小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解流感疫苗（包含各種劑量之AS03佐劑）的臨床前評估 V. I.實驗設計及目標在流感預致敏小鼠中執行實驗，以評估藉由經該水包油佐劑調配之流感疫苗所誘導之AS03的體液及細胞反應之增 I30360.doc -124- 200908994 加。為模擬人類情況，使用經異源亞型病毒株預致敏之小鼠進行實驗。 V.I.I.處理/群組（表13) 具有25隻成年雌性C57B1/6小鼠之群組在第0天，用三價完整、福馬林失活流感病毒（對各病毒株而言，5 pg HA) 經鼻内預致敏（體積20 μΐ)。由彼等病毒株之較早期漂移變異體（5 pg ΗΑ完整失活Η1Ν1 Α/北京/262/95、Η3Ν2 Α/巴拿馬/2007/99、B/山東/7/97)組成之預致敏病毒株包括在疫苗中。28天後，用單一劑量之疫苗候選物以100 μΐ之總體積經肌肉内對小鼠進行疫苗接種。用僅含有裂解抗原（三價裂解普通抗原）之調配物或含有經三劑量AS03(全、1/2 或1/5)佐劑化之裂解抗原的調配物對小鼠進行免疫。用於免疫之病毒株包括H1N1 A/新喀裏多尼亞/20/99、H3N2 A/ 紐約/5 5/2004、B/江蘇/10/2003病毒抗原（1.5 pg/病毒株、 1 /1 0之人類劑量）。表13

群組抗原/調配物其他處理 1 三價裂解/普通(未經佐劑化）異源預致敏D0 2 三價裂解/AS03 異源預致敏DO 3 三價裂解/AS03 1/2 異源預致敏DO 4 三價裂解/AS03 1/5 異源預致敏DO 5 PBS 異源預致敏DO V.I.2.疫苗調配物之製備三價裂解/普通根據以下次序臨時製備1 〇〇 μΐ劑量之調配物：注射用水 130360.doc -125 - 200908994 …里食鹽水緩衝液(如實#πν中教示所製備之1〇倍濃縮 PBS pH 7_4)+Fluarix L〇t DFLUA〇14(最終劑量中，每病毒株 1.5 pg)。三價裂解/AS03 根據以下次序臨時製備100 μ1劑量之調配物：注射用水 +生理食鹽水緩衝液（如實例IV中教示所製備之ι〇倍濃縮 PBS pH 7.4)+Fluarix L〇t DFLUA〇14(最終劑量中每病毒株1·5 μδ)+25 μ1 SB62乳液（對全劑量而言）或i25 y沾62 乳液（對％劑量而言）或5 μ1 SB62乳液（對1/5劑量而言）。在氣備結束後之s亥小時内注射調配物。 V.I.3.讀出（表 14) 在免疫後21天（1 〇隻小鼠/群組）量測對疫苗接種之體液免疫反應且藉由血球凝集抑制（HI)測試來測試血清樣本。藉由細胞内細胞激素染色（ICS)，在免疫後7天測試細胞免疫反應（每群組1 5隻小鼠）。表14 讀出時間點樣本―型分析方法 IHA 體液反應 D49 血清細胞反應 ^35 ^PBMC Tcs " V.2.結果 V.2.l.體液免疫（10隻小鼠/群組）。結果呈現於圖6中。在異源亞型預致敏繼而單一疫苗接種之該小鼠模型中’展示AS03及其稀釋液（1/2及丨/5)誘導與普通疫苗相比更高之HI效價。對所有三種病毒株而言，在接受經全劑量AS03或降低劑量AS03佐劑化之疫苗的小 130360.doc -126· 200908994 鼠之間未觀測到HI效價之差異。 V·2·2·細胞免疫性（15隻小鼠/群組）。結果呈現於圖7中。無論AS03之稀釋度如何，與經三價裂解普通疫苗免疫之小鼠相比，在經AS03佐劑化之三價裂解疫苗免疫之小鼠中觀測到更高之CD4+ T細胞反應。與在用經全劑量AS03佐劑化之三價裂解物免疫之小鼠中所誘導之反應相比’當用經更低劑量AS03佐劑化之三價裂解物對小鼠進行免疫時’觀測到更低細胞反應之趨勢。 V. 3.結果及結論之概要總之，與普通疫苗相比，當使用經AS03佐劑化之疫苗時’在經異源亞型病毒株預致敏之動物中觀察到體液及細胞反應會增加。在經全劑量或部分劑量AS03佐劑免疫的小鼠之間’觀測到類似數值變化之體液反應。然而，佐劑劑董之降低與CD4+ T細胞反應降低幅度的趨勢有關聯。實例VI-在預致敏C57B1/6小鼠中藉由經佐劑化及未經佐劑化裂解流感疫苗（包含各種劑量之AS03佐劑及低劑量抗原）所誘導之細胞免疫反應的臨床前評估 VI. 1.實驗設計及目標在流感預致敏小鼠中執行實驗以評估藉由含有低劑量抗原（0.5 pg/病毒株，1 /3〇之人類劑量）且經該水包油佐劑調配之流感疫苗所誘導之AS03的細胞免疫反應之增加。為模擬人類情況，使用經異源亞型病毒株預致敏之小鼠進行實驗。 VI.1.1.處理/群組（表15) 130360.doc •127- 200908994 具有1 5隻成年雌性C57B1/6小鼠之群組在第〇天，用三價完整、福馬林失活流感病毒（對各病毒株而言，5 ΗΑ) 經鼻内方式預致敏（體積20 μ1)〇由彼等病毒株之較早期漂移變異體（5 pg ΗΑ完整失活Η1Ν1 Α/北京/262/95、Η3Ν2 A/巴拿馬/2007/99、B/山東/7/97)組成之預致敏病毒株包括在疫苗中。28天後，用單一劑量之疫苗候選物以5〇 y之總體積經肌肉内對小鼠進行疫苗接種。用僅含有裂解抗原 (二價裂解普通抗原）之調配物或含有經三劑量AS〇3(全、 1/2或1/5)佐劑化之裂解抗原的調配物對小鼠進行免疫。用於免疫之病毒株包括H1N1 A/新喀裏多尼亞/2〇/99、H3N2 A/紐約/55/2004、B/江蘇/10/2〇〇3病毒抗原（〇5叩/病毒株、1 / 3 0之人類劑量）。表15 群組 ^ U / P® S己斗勿其他處理 1 二價裂解/普通(未經佐劑化）吳源預致敏D0 2 二價裂解/AS03 預致鲮DO 3 三價裂解/AS031/2 4 二價裂解/AS03 1/5 /、仰、了貝双敏ι)π 致敏DO 5 PBS ~~'— 敏 DO ~~—--— νι·ι·2.疫苗調配物之製備三價裂解/普通根據以下次序臨時製備50 μΐ劑量之調配物：注射用水+ 生理食鹽水緩衝液（如實例iv中教示所製備之1〇倍濃縮pBs pH 7’4)+Fluarix Lot DFLUA014(最終劑量中，每病毒株〇 5 Mg)。三償裂解/AS03 130360.doc -128- 200908994 根據以下次序臨時製備50 μΐ劑量之調配物：注射用水+ 生理食鹽水緩衝液（如實例iv中教示所製備之1〇倍濃縮pBs pH 7_4)+Fluarix Lot DFLUA014(最終劑量中，每病毒株〇 $ Mg)+25 μΐ SB62乳液（對全劑量而言）或125 μ1犯a乳液 (對/2劑量而言）或5 μΐ SB62乳液（對1/5劑量而言）^在製備結束後之該小時内注射調配物。 VI.1.3.讀出（表 16) 藉由細胞内細胞激素染色，在免疫後7天測試細胞免疫反應。表16

讀出時間點樣本類型分析方法細胞反應 D35 PBMC ICS VI.2.結果 VI.2.1.細胞免疫性結果呈現於圖8中。與用三價裂解普通疫苗免疫之小鼠相比’在用經AS03(全或1/2劑量）佐劑化之三價裂解疫苗免疫之小鼠中觀測到邊緣性更高之CD4+ T細胞反應。與在用三價裂解普通疫苗或經全劑量或半劑量AS03佐劑化之三價裂解疫苗進行免疫之小鼠中所誘導之反應相比，當用經 1/5之AS03劑量佐劑化之三價裂解疫苗對小鼠進行免疫時’觀測到更高之細胞反應。 VI.3·結果及結論之概要總之’與普通疫苗相比，當使用經AS03佐劑化之疫苗時’在經異源亞型預致敏之動物中觀測到CD4+ T細胞反應 130360.doc -129- 200908994 之最小增加。在該實驗中未觀測到佐劑劑量反應，且的破’ 1/5之AS03劑量誘導比用更高佐劑劑量所見者更高頻率之抗原特異性CD4+ T細胞。總之，使用每病毒株〇.5 μ HA所產生之該等資料不類似於來自使用每病毒株丨5叩 HA所產生之其他臨床前實驗的資料。實例VII_在天然C57B1/6小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解H5N1疫苗（包含各種劑量之AS〇3佐劑及抗原）的臨床前評估 VII.1·實驗設計及目標在hsni天然小鼠中執行實驗以評估藉由經該水包油佐劑調配之H5N1裂解疫苗所誘導之AS03的體液及細胞免疫反應之增加。在大流行病之狀況下，預期整個世界人群將對新流行之大流行病流感病毒株天然免疫。由於該天然免疫狀態，大流行病疫苗將可能需要兩疫苗劑量以保護個體以避免由新流感病毒株所引起之感染及嚴重疾病。為表示该先前暴露之缺乏’研發天然小鼠模型以評估疫苗之免疫原性。 VII.1.1·處理/群組（表17) 具有15隻成年雌性天然C57B1/6小鼠之群組在第〇天及第 2 1天，用大流行病Η 5 N1疫苗候選物以5 〇 μ 1之總體積經肌肉内進行免疫。用僅含有裂解Η5Ν1抗原（Η5Ν1裂解普通抗原）之調配物或含有經不同劑量AS03(雙倍、全、1/2或1/5) 佐劑化之裂解抗原的調配物對小鼠進行免疫。用於免疫之病毒株包括H5N1 A/越南/1194/04病毒抗原（1.5或0.38 μ8/ 130360.doc -130- 200908994 病毒株相應於1 /1 〇之人類劑量）。未用雙倍AS03劑量進行調配，而進行一 50 μΐ H5N1裂解/AS03全劑量+— 50 μ卜創量AS03之伴隨注射。表17

群組抗原/調配物抗原劑量 1 H5N1裂解/普通(未經佐劑化） 1.5 pg 2 H5N1裂解/雙倍劑量AS03 1.5 pg 3 H5N1 裂解/AS03 1.5 pg 4 H5N1 裂解/AS03 1/2 1·5 μξ 5 H5N1 裂解/AS03 1/5 1.5 pg 6 H5N1裂解/普通(未經佐劑化） 0.38 pg 7 H5N1裂解/雙倍劑量AS03 0.38 pg 8 H5N1 裂解/AS03 0,38 pg 9 H5N1 裂解/AS03 1/2 0.38 pg 10 H5N1 裂解/AS03 1/5 0.38 pg 11 PBS VII.1.2.疫苗調配物之製備 1公升最終本體緩衝液（PBS pH 7.2 ± 0.2)之製備：向 0.800 1 注射用水中添加 NaCl 7.699 g、KC1 0.200 g、 MgCl2x6H20 0.100 g、Na2HP04xl2 H20 2.600 g、KH2P〇4 0.3 73 g。溶解後，用注射用水調整至1.0 L。 H5N1裂解/普通 50 μΐ劑量之製備：將硫柳汞（量考慮其在病毒株中之濃度）及Triton Χ100添加至最終本體緩衝液中。因為調配物中之含量目標係由病毒株之Tween濃度達成，所以不添加Tween 80。在1.5 pg調配物劑量中，硫柳汞之最終濃度為1 0 Mg/ml，Tween 80之最終濃度為368 pg/ml且Triton X100之最終濃度為35 pg/ml。在0.38 pg調配物劑量中，硫柳汞之最終濃度為1 0 130360.doc -131 - 200908994

Mg/ml ’ Tween 80 之最終濃度為 93 pg/mmit〇n χΐ00 之最終濃度為8.9 pg/ml。5-30 min磁力攪拌後，添加1 5或〇 38 Mg之HA(H5N1病毒株）。將調配物攪拌3〇_6〇分鐘。檢查 pH。在調配結束後之該小時内進行注射。 H5N1 裂解/AS03 50 μΐ劑量之製備：將硫柳汞（量考慮其在病毒株中之濃度）及Trh〇n XI〇〇添加至最終本體緩衝液中。因為調配物中之含量目標係由病毒株之Tween濃度達成，所以不添加Tween 80。在u叫調配物劑量中’硫柳汞之最終濃度為1〇 μ§/πι1，Tween 80之最終濃度為368 pg/ml且Triton X100之最終濃度為35 pg/m卜在0_3 8 pg調配物劑量中，硫柳汞之最終濃度為1〇 pg/ml ’ Tween 80 之最終濃度為 93 pg/ml 且 Triton X100 之最終濃度為8.9 pg/ml。5-30 min磁力攪拌後，添加1.5或0.38 pg之HA(H5N1病毒株）。30-60分鐘磁力攪拌後，添加25或 12.5或5 μΐ之SB62乳液。將調配物攪拌30-60分鐘。檢查 pH。在調配結束後之該小時内進行注射。 VII.1.3.讀出（表 18A) 藉由抗Ig、IgGl及IgG2b抗體效價，在免疫後第14天量測體液免疫反應（1 0隻小鼠/群組）（圖9，A-F)。亦藉由抗 H5N1血球凝集抑制檢定，在免疫後第21天量測體液免疫反應（10隻小鼠/群組）（圖1〇，A-B)。藉由流式細胞儀所讀數之抗原特異性CD4+ T細胞之細胞内細胞激素染色（ICS)，在免疫後第6天測試細胞免疫反 130360.doc •132· 200908994

應（5個池，每群組3隻小鼠）（圖11，A-B)。表18A

讀出時間點樣本類型分析方法體液反應 D42 血清 ELISA、同型及HI效價細胞反應 D47 PBMC ICS VII.2.結果 VII.2.1.體液免疫反應：ELISA及同型。結果呈現於圖9及表18B中。

表18B H5N1 裂解普通 H5N1裂解 2xAS03 H5N1 裂解 AS03 H5N1 裂解 AS03/2 H5N1 裂解 AS03/5 PBS Ig反應(ELISA中點效價） 1.5 pg/小鼠 177 81680 59734 67772 57697 50 0.38 μ〆小鼠 120 91319 76144 49162 54566 IgGl反應(ELISA中點效償） 1.5 pg/小鼠 124 54683 44965 40558 39854 50 0.38 pg/小鼠 144 62445 44381 31855 39269 IgG2b反應(ELISA中點效子 1) 1.5 pg/小鼠 190 10928 10625 11215 7903 79 0.38 pg/小鼠 60 20993 12617 9352 9565 比率 IgGl/IgG2b 1.5 pg/小鼠 0.7 5 4.2 3.6 5 0.6 0.38 pg/小鼠 2.4 3 3.5 3.4 4.1 在H5N1裂解疫苗之各劑量下，與未經佐劑化H5N1裂解疫苗相比，所有經佐劑化群組誘導更高之抗H5N1 Ig、 IgGl及IgG2b抗體效價（圖9-A至F)。在H5N1裂解疫苗之各劑量下；抗H5N1 IgGl抗體反應比抗H5N1 IgG2b抗體反應高4-5倍（圖9-C至F)。用1.5 pg HA之H5N1裂解疫苗之劑量且與各劑量之佐劑組合，未觀測到抗H5N1 Ig、IgGl及 IgG2b抗體反應之差異（圖9-A、C及E)。 130360.doc •133- 200908994 用0.38 pg HA之H5N1裂解疫苗之劑量時，與藉由經 AS03/2(p=0.7315)及 AS03 l/5(p = 0.9744)佐劑化之 H5N1 裂解疫苗誘導之反應相比，在用經2X全劑量佐劑化之H5N1 裂解疫苗免疫後，獲得更高抗H5N1 Ig效價之趨勢（圖9_ B) °對於抗H5N1 IgG 1抗體反應而言亦觀測到該趨勢（圖9_ D) ^然而，動力（power)不足以觀測到統計學顯著差異（對 1.7倍差異而言為25〇/〇動力，或對2倍差異而言為47%)。 νΐΙ·2·2.體液免疫反應：HI效價。用1.5 pg ΗA/小鼠之劑量時：在各佐劑劑量下’與在用未經佐劑化Η5Ν1裂解疫苗免疫之小鼠中所獲得之反應相比’用AS03佐劑化Η5Ν1裂解疫苗免疫之所有小鼠誘導更高之HI效價（圖ι〇·a)。當Η5Ν1 裂解疫苗經一定劑量範圍之AS03佐劑化時，未觀測到HI 效價之統計學顯著差異（圖i 〇_A)。用〇·38 HA/劑量之劑量時在各佐劑劑量下，與在用未經佐劑化H5N丨裂解疫苗免疫之小鼠中所獲得之反應相比，用AS03佐劑化H5N1裂解疫田免疫之所有小鼠誘導更高之HI效價（圖1 〇B)。與用經AS03/2佐劑化之H5N1裂解疫苗所獲得之反應相比（對4倍差異而言p=〇〇32)，用經2χ全劑量AS〇3佐劑化之 H5N1裂解疫苗觀察到顯著更高之HI效價（圖10B)。在用經2x全劑量AS03或全劑量AS03佐劑化之H5N1裂解疫苗免疫之小鼠中，或在用經AS03/2或AS03/5佐劑化之 H5N1裂解疫苗免疫之小鼠之間，未觀測到HI效價之統計 130360.doc -134- 200908994 學顯著差異（圖1 OB)。抗原劑量（1.5 pg或0.38科笆）之間的比較：除在用經AS03/5佐劑化之15 HA裂解H5N1免疫之小鼠之間展示比用經2χ全劑量AS03佐劑化之0.38 pg HA裂解 H5N1免疫之小鼠顯著更低的HI效價= 〇〇1)以外，在用各 HA劑量之經AS03、AS03/2或AS03/5佐劑化之H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之間未觀測到HI效價之統計學顯著差異（圖 10)。 VII.2.3.細胞免疫反應為評估由三價季節性流感疫苗誘導之細胞免疫反應，每病毒株1 pg HA之裂解抗原用於CD4 T細胞之再刺激。為對於單價H5N1流感疫苗維持相同再刺激條件，在該實驗中使用3 pg HA之單價裂解抗原。對在不同佐劑之間的辨別而言，該濃度亦展示為最佳的。結果呈現於圖丨丨中。在H5N1裂解疫苗之各劑量（1.5或〇38叫）下，與用未經佐劑化H5N1裂解疫苗進行免疫之小鼠相比，在用經各種劑量之AS03佐劑化之H5N1裂解疫苗進行免疫之小鼠中觀測到更高之CD4+ T細胞反應。在1.5 pg H5N1裂解疫苗之劑量下，AS03劑量之降低相應於CD4+ T細胞頻率之降低（圖11A)。然而，在〇·38 Η5Ν1裂解疫苗之劑量下，在用經AS〇3佐劑化之Η5Ν1裂解疫w進行免疫之小鼠中，在不同佐劑劑量之間未觀測到 CD4+ Τ細胞反應之差異（圖1 iB)。 VII.3·結果及結論之概要 130360.doc -135- 200908994 小鼠中之免疫原性研究展示’經佐劑化之h5N1裂解疫苗誘導比藉由未經佐劑化H5N1裂解疫苗誘導之彼等反應顯著更咼之體液（抗H5N1 ELISA及HI效價）及細胞（CD4+ T 細胞）反應。除在VII.2.2部分中所提及之兩個群組外，在用丨5 及 0.38 pg經佐劑化H5N1$解疫苗進行免疫之小鼠之間，未觀測到體液免疫反應之抗原劑量反應效應，其暗示在佐劑之存在下’該模型中可能需要甚至更低劑量之ha以觀測劑量反應效應。與普通H5N1疫苗相比’當使用經as〇3佐劑化之H5N1大流行病疫苗時’在天然小鼠中觀測到CD4+ T細胞反應之強烈增加。當0.38 pg劑量之H5N1裂解疫苗用作疫苗候選物時，未觀測到AS03稀釋液之影響，而當丨.5 pg H5N1裂解疫苗經降低劑量之AS03佐劑化時，觀測到CD4 T細胞反應之降低。如先前所觀測’在用經全劑量AS03或經AS03/2佐劑化之H5N1裂解疫苗（在任一抗原劑量下）進行免疫之小鼠之間，未觀測到體液及細胞免疫反應的差異。當2χ全劑量 AS03用於疫苗調配物中時，偵測到免疫反應之一些增強，且因此當AS03/5用於疫苗調配物中時，偵測到免疫反應之降低。總之，在此報導之資料證明該新穎佐劑系統於該疫苗調配物中之效能。實例VIII-預致敏大白豬中之經佐劑化及未經佐劑化流感 130360.doc -136· 200908994 疫苗的臨床前評估 VIII.1.實驗設計及目標在流感預致敏豬中執行實驗以評估藉由經該水包油佐劑調配之流感疫苗誘導之AS03的體液反應之增加。使用豬以在接近於人類之動物模型中評估AS03之劑量範圍。猪展示長系列之確定該動物之生物學類似性，因為生理學上最接近於人類，極個別例外（Douglas R., 1972)。此外，在豬中通常觀測到流感感染之表現。 VIII.1.1.處理/群組（表19) 具有10隻成年雌性大白豬之群組在第〇天，用三價完整、福馬林失活流感病毒（對各病毒株而言25 pg HA)以 2 00 μΐ之總體積經鼻内預致敏。預致敏病毒株係由與疫苗病毒株同源之病毒株（25 pg ΗΑ完整失活Η1Ν1 Α/新喀裏多尼亞 /20/99、H3N2 A/ 巴拿馬 /2007/99 及 B/ 山東 /7/97)組成。28天後，用單一劑量之疫苗候選物以500 μΐ之總體積經肌肉内對豬進行疫苗接種。用僅含有裂解抗原（三價裂解普通抗原）之調配物或含有經一定劑量範圍之AS03(全、 1/2或1/5)佐劑化之裂解抗原的調配物對豬進行免疫。用於免疫之病毒株包括H1N1 A/新喀裏多尼亞/20/99、H3N2 A/ 巴拿馬/2007/99及B/山東/7/97病毒抗原（如在一人類劑量中，15 HA之H1N1 A/新喀裏多尼亞/20/99、H3N2 A/巴拿馬/2007/99病毒株及17.5 pg Β/山東/7/97病毒株）。 130360.doc •137- 200908994

表19 群組抗原/調配物其他處理 1 三價裂解/普通(未經佐劑化）同源預致敏D0 2 三價裂解/AS03 同源預致敏DO 3 三價裂解/AS03 1/2 同源預致敏DO 4 三價裂解/AS03 1/5 同源預致敏DO VIII.1.2.疫苗調配物之製備三價裂解/普通製備Tween 80、Triton XI 00及維生素E丁二酸酯（VES)之預混物以使最終濃度達成具有750 pg/ml之Tween 80、110 pg/ml之Triton X100及100 pg/ml之VES的疫苗。用於預混物中之量考慮其於病毒株中之含量。根據以下次序臨時製備一 500 μΐ劑量之調配物：注射用水+生理食鹽水緩衝液（如實例IV中教示所製備之1 0倍濃縮 PBS pH 7.4)+預混物，在室溫下5 min磁力攪拌，+15 pg HA HIN1病毒株，在室溫下10 min磁力授:拌，+15 pg HA H3N2病毒株，在室溫下10 min磁力攪拌，+17.5 pg HA B 病毒株，在室溫下1 5 min磁力攪拌。在其製備結束後之該小時内注射調配物。三價裂解/AS03 製備Tween 80、Triton X1 00及維生素E 丁二酸I旨（VES)之預混物以使最終濃度達成具有750 pg/ml之Tween 80、110 pg/ml之Triton X100及100 pg/ml之VES的疫苗。用於預混物中之量考慮其於病毒株中之含量。根據以下次序臨時製備一 500 μΐ劑量之調配物：注射用水+生理食鹽水緩衝液（如實例IV中教示所製備之1 0倍濃縮 130360.doc -138- 200908994 PBS pH 7.4) +預混物，在室溫下5 min磁力攪拌，+15 HA Η1Ν1病毒株’在室溫下1〇 min磁力授拌，+15叫ha H3N2病毒株’在室溫下i〇 min磁力揽拌，+17 5叫ha B 病毒株，在室溫下15 min磁力攪拌，+250 μΐ SB62乳液（對全劑置AS03而言）或125 μΐ SB62乳液（對1/2劑量AS03而言）或50 μΐ SB62乳液（對1/5劑量AS〇3而言），在室溫下15瓜化磁力攪拌。在其製備結束後之該小時内注射調配物。 VIII.1.3·讀出（表 20) 在鼻内預致敏之前（第〇天），免疫之前（第28天）及免疫後第14天量測對疫苗接種之體液免疫反應（丨〇隻豬/群組卜血清樣本係藉由血球凝集抑制（HI)測試來測試。表20

讀出時間點樣本類型分析方法體液反應 DO, D28, D42 血清 IHA 結果呈現於圖12中。無論佐劑之稀釋度如何，在同源預致敏之該模型中，經AS03佐劑化之三價裂解調配物比普通三價調配物誘導對所有病毒株而言更強之出反應，儘管對於所有三種病毒株而言，並非總達到統計顯著性。觀測到佐劑劑量效應在各病毒株之間存在輕微差異。對諸如b/山東之較小免疫原性病毒株而言，僅經全劑量之八训3佐劑化之三價裂解疫苗顯著不同於普通疫苗。與經全劑量之八8〇3 佐劑化之三價裂解疫苗相反，降低劑量之AS〇3未能使所有 130360.doc -139- 200908994 三種病毒株之HI效價增加高於用普通疫苗所見之彼等效價。實例IX-在天然及預致敏C57B1/6小鼠中之經佐劑化及未經佐劑化裂解二價或四價（含有第二B病毒株）疫苗的臨床前評估 IX.1·實驗設計及目標在天然及預致敏小鼠中執行實驗以評估藉由經該水包油乳液佐劑（AS03或AS03半劑量）調配之流感裂解三價或四價 (含有第二B病毒株）疫苗所誘導之體液免疫反應的增加。近期分離流感B病毒之Η A基因的系統發生分析證明，自2 〇世紀80年代中期起’該基因已進化為兩個抗原性相異的譜系’其係藉由B/維多利亞/2/87類及B/山形/16/88類病毒來表示。該等實驗評估與由三價流感疫苗（TIV)誘導之反應相比，第二Β病毒株於四價流感疫苗（qiv)中之存在對體液免疫反應之影響。 IX.1.1.處理/群組（表21) 藉由使用具有10隻成年雌性C57B1/6天然小鼠或經與疫 ®病毒株相比異源之病毒株預致敏的小鼠之群組執行該等實驗。在第0天及第28天，用三價或四價流感疫苗候選物以 1 000 μΐ之總體積經肌肉内對天然小鼠進行免疫。在第〇天，預致敏小鼠首先接收用三價完整、福馬林失活流感病毒（對各病毒株而言5 ΗΑ)之鼻内投藥（20 y體積）。由彼等病毒株之漂移變異體（5叫HA完整失活出川 130360.doc -140· 200908994 A/北京/262/95、H3N2 A/惠靈頓/1/04及B/布裏斯班/32/02) 組成之預致敏病毒株包括在疫苗中。28天後，用單一劑量之疫苗候選物以1 00 μΐ之總體積經肌肉内對小鼠進行疫苗接種。用僅含有TIV或QIV(普通疫苗）之調配物或含有經不同劑量之AS03(全或半（1/2))佐劑化之TIV或QIV的調配物對小鼠進行免疫。用於免疫之病毒株包括H1N1 A/新喀裏多尼亞/20/99、H3N2 A/威斯康星/52/05及B/山東/7/97(包括於 TIV及QIV中之B/維多利亞譜系）且對QIV疫苗而言亦包括 B/江蘇/10/03(僅包括於QIV中之B/山形譜系）（1.5 pg/病毒株相應於1/10之人類劑量）。表21

群組抗原/調配物抗原劑量 1 TIV普通(未經佐劑化） 1.5 pg 2 TIV AS03 1·5 3 TIVAS03/2 1.5 pg 4 QIV普通(未經佐劑化） 1.5 pg 5 QIV AS03 1.5 pg 6 QIVAS03/2 1.5 μβ 7 PBS IX.1.2.疫苗調配物之製備 TIV普通（未經佐劑化） 1〇〇 μ丨劑量之製備：將10倍濃缩之PBS及Tween 80、Triton Χ-100與VES之預混物（量考慮存在於病毒株中之清潔劑）添加至注射用水中。在調配物中，Tween 80之最終濃度為354 pg/ml， Triton X-100之最終濃度為52 pg/ml、VES之最終濃度為 130360.doc • 141 - 200908994 47.37 Mg/m卜5 min磁力攪拌後，添加15叫之各病毒株 (H1N1、H3N2、B病毒株）’在各次添加之間伴隨1〇 min磁力攪拌。隨後，將調配物攪拌15 min。檢查pH。在調配結束後之該小時内進行注射。 TIV AS03 或 AS03 1/2 100 μ丨劑量之製備：將10倍派縮之PBS及Tween 80、Triton X-1 〇〇與VES之預此物（量考慮存在於病毒株中之清潔劑）添加至注射用水中。在調配物中，Tween 80之最終濃度為354 μ§/πι1， Triton Χ-100之最終濃度為52㈣/爪卜VES之最終濃度為 47.37 pg/m卜5 min磁力攪拌後，添加丨5叫之各病毒株 (H1N1、H3N2、B病毒株），在各次添加之間伴隨1〇 min磁力攪拌。15 min磁力攪拌後，添加25 μΐ或12.5 μΐ之SB62乳液。隨後將調配物擾拌1 5 min。檢查pH。在調配結束後之該小時内進行注射。 QIV普通（未經佐劑化） 100 μ丨劑量之製備·· 將10倍濃縮之PBS及Tween 80、Triton Χ-100與VES之預混物（量考慮存在於病毒株中之清潔劑）添加至注射用水中。在調配物中，Tween 80之最終濃度為472 pg/ml， Triton X-100之最終濃度為69.44 pg/nU、VES之最終濃度為63.16 pg/ml。5 min磁力攪拌後，添加1.5 pg之各病毒株 (H1N1、H3N2、兩種B病毒株），在各次添加之間伴隨1〇 min磁力授掉。隨後將調配物授摔1 $ min。檢查pH。在調 130360.doc •142· 200908994 配結束後之該小時内進行注射。 QIV AS03 或 AS03 1/2 100 μι劑量之製備：將10倍濃縮之PBS及Tween 80、Triton X· 100與VES之預混物（量考慮存在於病毒株中之清潔劑）添加至注射用水中。在調配物中，Tween 80之最終濃度為472 μ§/ηιΐ， Triton Χ-100之最終濃度為69 44叫/d、VEs之最終濃度為63.16 Hg/m卜5 min磁力攪拌後，添加丨5叫之各病毒株 (H1N1、H3N2、兩種B病毒株），在各次添加之間伴隨1〇 min磁力攪拌。15 min磁力攪拌後，添加25卜丨或12 $ μ之 SB62乳液。隨後將調配物攪拌15 min。檢查ρΗ。在調配結束後之該小時内進行注射。 ΙΧ.1.3·讀出（表 22) 在天然小鼠中，在每群組之10隻小鼠中藉由血球凝集抑制檢定在第一免疫後28天（D28 Post-I)及第二免疫後21天 (D21 Post-ΙΙ)量測體液免疫反應（圖13)。在預致敏小鼠中’在每群組之1 〇隻小鼠中藉由血球凝集抑制檢定在預致敏後28天（第28天Post-Prim)及單—免疫後21天（D2 1 P〇st-Imm)量測體液免疫反應（圖14)。為簡化且集中於該實驗之目標，僅描述抵抗B病毒株所誘導之體液免疫反應。表22 讀出時間點樣本類型分析方法體液反應第28天及第49天血清只15£價 130360.doc -143 - 200908994 IX.2.結果 ΙΧ·2·1·天然小鼠中之體液免疫反應：ηι效價。與在用未錄劑化Μ裂解疫苗進行Μ之錢中所獲得的反應相比，用經佐劑化流感裂解疫苗進行免疫之天^ 小鼠誘導更高之HI效價（圖13，Α及Β)。無論佐劑為何種佐劑（AS〇3或AS〇3/2)，用經佐劑化 TIV或經佐劑化QIV進行免疫之天然小鼠均誘導抵㈣山東"/97(包括於TIV及QIV兩者中之B/維多利亞類病旬之類似HI效價（圖13 ; A)。無論佐劑為何種佐劑（AS〇3或AS〇3/2)，與在用經佐劑化TIV進行免疫之天然小鼠中所觀測之缺少钔效價相比二用經佐劑化QIV進行免疫之天然小氣均誘導抵抗B/ 江蘇/1 _3(僅包括於QIV中之B/山形類病毒）之更高出效價 (圖 1 3 ; B) 〇 IX.2.2.預致敏小鼠中之髏液免疫反應：hi效價。與在用未經佐劑化流感裂解疫苗進行免疫之小氣中所獲得的反應相比，用B/維多利亞類病毒預致敏且用經佐劑= 流感裂解疫苗進行免疫之小鼠誘導更高之HI效價（圖14，A 及B)。無論佐劑為何種佐劑（AS03或AS03/2)，用維多利亞類病毒預致敏且用經佐劑化TIV或經佐劑化QIV進行免疫之小鼠均誘導抵抗B/山東/7/97病毒（包括於TIV及QIV兩者中之 B/維多利亞類病毒）之類似HI效價（圖丨4 ; B)。無論佐劑為何種佐劑（AS03或AS03/2)，與在用經佐劑化 130360.doc •144- 200908994 7進行免疫之天然小鼠中所觀測之缺少峨價相比，用、准夕利亞類病毒預致敏且I經佐劑轉v進行免疫之小鼠均誘導抵抗B/江蘇/ι〇/〇3(僅包括一 V丨里匕栝於QIV中之B/山形類病毒）之更高HI效價（圖μ; B)。 ΙΧ·3·結果及結論之概要』鼠或用Β/維多利亞類病毒預致敏且用經佐劑化 (AS03或AS03/2)TIV或QIV疫苗進行免疫之小鼠展示抵抗疫苗中所包括之同型B/維多利亞類病毒或屬於相同b/維多利亞譜系之異源亞型病毒的交又反應性。天然小鼠或用b/ 維多利亞類病毒預致敏且用經佐劑化（AS〇3或as〇3/2)tiv 疫苗進行免疫之小鼠與疫苗中所包括之B病毒相比，不展不抵抗屬於另一譜系之異源亞型病毒（該實例中之B/山形類病毒）的任何交叉反應性。該等實驗證明’需要第二B病毒株及佐劑（AS〇3或 AS03/2)以誘導抵抗屬於B/維多利亞譜系及B/山形譜系之b 病毒的交又反應。實例X-在年齡為18-64歲之群體中用含有裂解流感抗原製劑及各種劑量之AS03佐劑（Flu-LD-012)之疫苗的臨床試驗。 X.I.介紹在2007年，在年齡為18-64歲之成年人群體中進行II期、受控、隨機化、單盲研究，以評估與用作參考之 FluarixTM(Glax〇SmithKline Biologicals)相比，經肌肉内投與之具有各種劑量AS03佐劑之GlaxoSmithKline Biologicals低 130360.doc •145- 200908994 劑量流感候選疫苗（亦即每病毒株含有5 pg HA)的免疫原性、安全性及反應原性。 X.2.研究設計 5個受檢者群組（每群組200人）經IM平行接收以下疫苗： -FluLDl/1 : 5 HA/病毒株之經1/1劑量AS03佐劑化的流感疫苗 -FluLDl/2: 5 Mg HA/病毒株之經1/2劑量AS03佐劑化的流感疫苗 -FluLDl/4: 5 pg HA/病毒株之經1/4劑量AS03佐劑化的流感疫苗 -FluLDl/8 : 5 HA/病毒株之經1/8劑量AS03佐劑化的流感疫苗 -一個200個受檢者之群組接首一次全劑量之FluarixTM 1 5 pg HA/病毒株時程：在第0天，流感疫苗之一次IM注射，在疫苗接種後第0天、第21天及第180天進行血液樣本收集。用於該研究中之標準三價裂解流感疫苗-Fluarix™為來自由 GlaxoSmithKline Biologicals研發且製造之 2007/2008 年 Northern Hemisphere 的商用疫苗。 X.2.研究目標 X.2.I.主要目標：免疫原性為證明在所有受檢者中，在疫苗接種後2 1天，經 AS03(1/1、1/2、1/4、1/8劑量之AS03)佐劑化之低劑量流感疫苗相對於F/war/x的免疫學非次等性（GMT)。 130360.doc -146- 200908994 所觀測之變數： •第〇天及第21天：在所有受檢者中，抵抗三種疫苗病毒株之每一者的血清血球凝集抑制（HI)抗體效價。導出變數：弟0天及苐21天之HI抗體效價的幾何平均效價丁）。 X.2.2·二級目標 •為評估在所有受檢者中，在疫苗接種後2丨天，就藉由經 AS03(1/1、1/2、1/4、W8劑量之AS03)佐劑化之低劑量流感疫苗及藉由F/waWx所引發之抗血球凝集素（HI)抗體效價而言的體液免疫反應。 •為評估在所有受檢者中，在疫苗接種後1 8〇天，經 AS03(1/1、1/2、1/4、1/8劑量之AS03)佐劑化之低劑量流感疫苗及藉由Fluarix之HI抗體的持續性。 •為s平估在受檢者之子集中，在第〇天、第21天及第天’就流感特異性CD4/CD8 T淋巴細胞之頻率而言，藉由經AS03(1/1、1/2、1/4、1/8劑量之AS03)佐劑化之低劑量流感疫苗及F/warz'x所誘導之細胞介導免疫反應。 •為評估在受檢者之子集中，在第0天、第21天及第18〇天，就藉由經AS03(1/1、1/2、1/4、1/8劑量之AS03)佐劑化之低劑量流感疫苗及F/war/x所誘導之中和抗體效價而言的體液免疫反應。 •為評估所有受檢者中，在整個研究時期期間，經 AS03(1/1、1/2、1/4、1/8劑量之AS03)佐劑化之低劑量流感疫苗及Fluarix的安全性及反應原性（在7天期間伴隨之所 130360.doc -147- 200908994 請求症狀，在21天期間伴隨之未經請求症狀，在6個月期間伴隨之嚴重不良事件及醫學顯著病狀）。 ’ 關於體液反應所觀測之變數： •第0天、第21天及第18G天··在所有受檢者中，抵抗三種疫苗病毒株之每一者的血清血球凝集抑制（HI)抗體效價。 •第〇天、第天及第180天：在受檢者之子集中對獨立抵抗疫苗中所存在之三種流感病毒病毒株之每—者所測試之中和抗體效價。導出變數： .第〇天、f 21天及第180天之HI抗體效價#幾何平均效價 (GMT)。 •第21天之血清轉化率* •第2 1天之血清轉化因子" •弟〇天及弟21天之企清保護率*** *金清轉化率，其定義為具有疫苗接種前效價<1:10及疫苗接種後效價>1:40或疫苗接種前效價y:1()及疫苗接種後效價增加至少4倍之受疫苗接種者的百分比。 "血清轉化因+，其定義為與第〇天相比，疫苗接種後血清HI GMT之增加倍數；血清保護速率，其定義為具有血清m效價>1:4〇之受疫苗接種者的百分比，其通常接受為保護指示。關於CM_所觀測之變數(在受檢者之子集中）： •第〇天、第21天及第180天：在測„式中產生至少兩種不同信號分子（仏_2、卟、丁 130360.doc •148· 200908994 α及CD4〇L)之每106個細胞激素陽性CD4/CD8細胞的頻率。 -在測試中產生至少CD40L及另一信號分子（IL-2、IFN-γ、 TFN-oi)之每106個細胞激素陽性CD4/CD8細胞的頻率。 -在測試中產生至少IL-2及另一信號分子（CD40L、IFN-γ、 TFN-ot)之每106個細胞激素陽性CD4/CD8細胞的頻率。 -在測試中產生至少TFN-α及另一信號分子（IL-2、IFN-γ、 CD40L)之每1 〇6個細胞激素陽性CD4/CD8細胞的頻率。 -在測試中產生至少IFN-γ及另一信號分子（CD40L、IL-2、 TFN-α)之每106個細胞激素陽性CD4/CD8細胞的頻率。導出變數 •對各測試而言，在第0天、第2 1天、第1 80天，特異性流感CD4/CD8 T淋巴細胞的幾何平均值（GM)。 X.2.3·其他目標： •為評估在受檢者之子集中，在第0天、第21天及第180天時’就疫苗異源性HI效價（抵抗漂移病毒株之血清血球凝集抑制（HI)抗體效價）而言之體液免疫反應。 •為評估在受檢者之子集中，在第〇天、第21天及第180天時，就疫苗異源性中和抗體效價（交又反應性流感特異性病毒病毒株（漂移病毒株））而言之體液免疫反應。 •為評估在受檢者之子集中，在第〇天、第21天及第180天時’就交又反應性流感特異性CD4/CD8 T淋巴細胞（異源性病毒株）（漂移病毒株或經保存流感抗原決定基）而言之CMI 反應。 •導出變數及標準（血清保護、血清轉化率及血清轉化因子） 130360.doc •149· 200908994 係如上文所述。 X.3.疫苗組合物及投藥 X.3.1.疫苗製備用於該研究中之經AS03佐劑化低劑量流感疫苗為相等量（亦即3x5 pg HA)之三種經AS03佐劑化之不同裂解失活流感抗原的液體混合物。其以0.5 ml/劑量之體積以單劑量疫苗形式存在於玻璃（I型）預填充注射器中。經AS03佐劑化之低劑量流感候選調配物含有以下病毒株： _ A/所羅門群島/3/2006(Η1Ν1)類病毒株：A/所羅門群島 /03/2006(IVR-145) > _ A/威斯康星/67/2005(H3N2)類病毒株：A/威斯康星/67/ 2005(NYMCX)-161B， B/馬來西亞/2506/2004類病毒株：B/馬來西亞/2506/ 2004 ° 疫苗每劑量含有5 pg血球凝集素（HA)之各流感病毒病毒株，以及全劑量、半劑量、1 / 4劑量或1 / 8劑量之佐劑系統 A S 0 3。流感抗原藉由與乳液簡單混合而併入佐劑系統之水相中。疫苗含有源自藥物物質製造方法之以下殘餘物：硫柳汞、卵白蛋白、蔗糖、甲醛及去氧膽酸鈉，及來自製造方法早期階段之殘餘含量的硫柳汞（每劑量< 1 pg)。按照商用 FluarixTA/疫苗之製造方法，執行失活裂解病毒粒子抗原之三種單價本體之生產。其如III.4.1.2部分中所解釋來進行。在失活步驟之前，用去氧膽酸鈉進行裂解，其係用甲 130360.doc -150- 200908994 搭來執行。 X.3.2.疫苗組合物一劑量之FluLD(全、半劑量、1/4劑量或1/8劑量之 A S 0 3 )相應於0.5 m 1。組成提供於表2 3中。對所有調配物而言，每劑量之HA含量為約5 pg，唯一差異在於存在於最終容器中之AS03的量。表23經AS03佐劑化之低劑量流感疫苗的組成

組份每劑量(0.5 ml)之量失活裂解病毒粒子 -A/所羅門群島/03/2006 (IVR-145) 5.0 μξ HA -A/威斯康星/67/2005(H3N2)NYMCX- 161B 5.0 pg HA -B/馬來西亞/2506/2004 5.0 μgϋA 佐劑全劑量半劑量 1/4劑量 1/8劑量 -SB62乳液(總體積） 0.250 mL 0.125 mL 0.0625 mL 0.031 mL •角鯊烯 10.70 mg 5.35 mg 2.675 mg 1.337 mg •DL-α-生育盼 11.88 mg 5.94 mg 2.97 mg 1.5 mg •聚山梨醇S旨80 (Tween 80) 4.85 mg 2.425 mg 1.21 mg 0.6 mg PBS mod 足量至0.250 mL 賦形劑（目標值）聚山梨醇S旨80 (Tween-80) 0.40 mg 辛苯昔醇 10 (Triton® X-100) 0.05 mg a-生育酚氫丁二酸酯 0.05 mg 氣化納 4 mg 氣化鎂 0.03 mg 磷酸氫二鈉 1.30 mg 磷酸二氫鉀 0.19 mg 氣化鉀 0.10 mg 注射用水足量至0.50 mL 縮寫：HA=血球凝集素；當使用AS03全劑量時，聚山梨醇酯80中之總含量相應於每劑量4.972 mg，且當使用AS03半劑量時，相應於每劑量2.5 4 7 m g。 X.3.3.具有AS03佐劑之疫苗組合物的製備 130360.doc -151 - 200908994 抗原製劑（”中間本體"）：將Tween 80、Triton X-100及 VES以一定量添加至PBS mod Na/K(132.7 mM NaCM、2.7 mM KC1 ' 1.1 mM MgCl2 ' 7.26 mM Na2HP04 ' 2.72 mM KH2P04，pH 7.2)中以使得在中間本體中之最終濃度分別為 952.5 pg/mL、130.9 pg/ml 及 119.1 pg/mL。15 至 45 分鐘攪拌後，添加每ml 35.71 pg HA之各病毒株H1N1、36.90 pg/mL病毒株H3N2及每ml 39·29 pg HA之B病毒株。經佐劑化之疫苗：將PBS mod Na/K(132.7 mM NaCl、 2.7 mM KC卜 1.1 mM MgCl2、7.26 mM Na2HP04、2.72 mM KH2P04，pH 7.2)添加至注射用水中，以達成每人類劑量0.5 mL之最終體積。15至45 min攪拌後，添加一定體積之所謂”中間本體”且混合1 5-45 min。隨後，添加PBS mod 2〇x 濃縮物（2.74 M NaCl、54 mM KC1、142.8 mM Na2HP〇4、26 mM KH2P〇4，pH 6.8)且混合 15 至 45 min。該 PBS mod 2〇χ濃縮物具有與AS03乳液相同之組成且添加量為AS03劑量之函數，且經計算以保持疫苗之離子組成恆定同時降低乳液含量。最終，添加其所需之乳液（3 1.25或 62.5或125或250 μΐ/劑量）且混合15至45 min以達成表23中說明之最終目標值。 X.4.免疫原性結果-體液免疫反應 X.4.1 HI幾何平均效價（GMT) 具有95% CI之HI抗體的GMT展示於表24及圖15中。每年齡群組（18-49歲及50-64歲）95%之HI抗體的GMT展示於表 25中。 130360.doc -152- 200908994

表24_第0天及第21天之HI抗體效價的血清陽性率及GMT (免疫原性之ATP組） >-10 1/DIL GMT 95% Cl 95% Cl 抗體群組時間 N n % LL UL 值 LL UL Min Max A/所羅門 FluLDll PRE 187 94 50.3 42.9 57.6 13.0 10.9 15.5 <10.0 905.0 PI(D21) 187 187 100 98.0 100 203.2 171.7 240.3 10.0 5120.0 FluLD12 PRE 189 83 43.9 36.7 51.3 12.3 10.2 14.8 <10.0 1280.0 PI(D21) 189 185 97.9 94.7 99.4 155.8 128.2 189.4 <10.0 2560.0 FluLD14 PRE 190 84 44.2 37.0 51.6 12.9 10.6 15.8 <10.0 1280.0 PI(D21) 190 186 97.9 94.7 99.4 164.9 137.6 197.8 <10.0 2560.0 FluLD18 PRE 192 100 52.1 44.8 59.3 14.9 12.3 18.2 <10.0 640.0 PI(D21) 192 187 97.4 94,0 99.1 151.1 124.7 183.1 <10.0 3620.0 Fluarix PRE 185 106 57.3 49.8 64.5 15.1 12.5 18.2 <10.0 640.0 PI(D21) 185 183 98.9 96.1 99.9 191.0 158.5 230.2 <10.0 3620.0 A/威斯康星 FluLDll PRE 187 142 75.9 69.2 81.9 29.4 23.8 36.4 <10.0 1280.0 PI(D21) 187 187 100 98.0 100 380.1 321.3 449.8 14.0 5120.0 FluLD12 PRE 189 141 74.6 67.8 80.6 30.0 24.3 37.2 <10.0 1280.0 PI(D21) 189 188 99.5 97.1 100 326.4 275.6 386.7 <10.0 5120.0 FluLD14 PRE 190 141 74.2 67.4 80.3 29.9 24.5 36.5 <10.0 640.0 PI(D21) 190 188 98.9 96.2 99.9 319.9 270.0 379.1 <10.0 20480.0 FluLD18 PRE 192 149 77.6 71.0 83.3 27.2 22.6 32.8 <10.0 905.0 PI(D21) 192 191 99.5 97.1 100 273.9 232.0 323.3 <10.0 5120.0 Fluarix PRE 185 155 83,8 77.7 88.8 37.4 30.2 46.4 <10.0 1280.0 PI(D21) 185 185 100 98.0 100 335.3 286.2 392.7 20.0 5120.0 B/馬來西亞 FluLDll PRE 187 142 75.9 69.2 81.9 25.8 21.3 31.3 <10.0 2560.0 PI(D21) 187 187 100 98.0 100 225.8 195.3 261.1 20.0 2560.0 FluLD12 PRE 189 145 76.7 70.0 82.5 27.3 22.6 32.9 <10.0 3620.0 PI(D21) 189 188 99.5 97.1 100 246.1 210.9 287.2 <10.0 3620.0 FluLD14 PRE 190 138 72.6 65.7 78.8 22.6 18.8 27.1 <10.0 1280.0 PI(D21) 190 188 98.9 96.2 99.9 195.5 165.1 231.4 <10.0 2560.0 FluLD18 PRE 192 142 74.0 67.1 80.0 23.2 19.5 27.8 <10.0 1280.0 PI(D21) 192 188 97.9 94.8 99.4 171.2 144.2 203.2 <10.0 5120.0 Fluarix PRE 185 139 75.1 68.3 81.2 27.0 22.2 32.7 <10.0 1280.0 PI(D21) 185 183 98.9 96.1 99.9 217.8 184.3 257.4 <10.0 3620,0

FluLDll =具有 1/1 劑量 AS03 之 5 pg HA/病毒株；FluLD12 = 具有1/2劑量AS03之5 HA/病毒株；FluLD14 =具有1/4劑量AS03之5 pg HA/病毒株；FluLD18 =具有1/8劑量AS03之 5 pg HA/病毒株；Fluarix=Fluarix(15 pg HA/病毒株） N=具有可用結果之受檢者的數量 n/%=血清陽性受檢者（HI效價>=1:10)之數量/百分比 95% CI = 95%信賴區間，LL =下限，UL =上限 GMT=幾何平均抗體效價 ;PRE=疫苗接種前第0天； -153 - 130360.doc 200908994 ^^/^八乂二最小值/最大值 PI(D2 1)=疫苗接種後第21天

表25-在dO及d21，按年齡分類之HI抗體效價的血清陽性率及GMT >=10 1/DIL GMT 95% Cl 95% Cl 抗體亞群群組時間 N n % LL UL 值 LL UL Min Max A/所羅門 18*49 歲 FluLDll PRE 129 68 52.7 43.7 61.6 14.7 11.7 18,5 <10.0 905.0 PI(D21) 129 129 100 97.2 100 271.6 224.5 328.5 10.0 5120.0 FluLD12 PRE 128 58 45.3 36.5 54.3 14.1 11.0 18.0 <10.0 1280.0 PKD21) 128 125 97.7 93.3 99.5 195.4 153.3 249.0 <10.0 2560.0 FluLDH PRE 130 62 47.7 38.9 56.6 15.3 11.7 20.0 <10.0 1280.0 PI(D21) 130 128 98.5 94.6 99.8 205.5 167.0 252.8 <10.0 2560.0 FluLD18 PRE 132 73 55.3 46.4 64.0 17.2 13.4 22.0 <10.0 640.0 PI(D21) 132 130 98.5 94.6 99.8 195.7 156.2 245.1 <10.0 3620.0 Fluarix PRE 130 70 53.8 44.9 62.6 15.1 12.0 19.2 <10.0 640.0 PI(D21) 130 128 98.5 94.6 99.8 247.6 197.7 310.0 <10.0 3620.0 A/威斯康星 50-64歲 FluLDll PRE 58 26 44.8 31.7 58.5 9.9 7.8 12.5 <10.0 113.0 PI(D21) 58 58 100 93.8 100 106.5 80.5 141.0 10.0 905.0 FluLD12 PRE 61 25 41.0 28.6 54.3 9.3 7.4 11.8 <10.0 80.0 PI(D21) 61 60 98.4 91.2 100 96.9 71.9 130.8 <10.0 1810.0 FluLDH PRE 60 22 36.7 24.6 50.1 9.0 7.1 11.4 <10.0 160.0 PI(D21) 60 58 96.7 88.5 99.6 102.5 73.2 143.4 <10.0 1280.0 FluLD18 PRE 60 27 45.0 32.1 58.4 11.0 8.1 14.8 <10.0 453.0 PI(D21) 60 57 95.0 86.1 99.0 85.6 61.7 118.8 <10.0 1280.0 Fluarix PRE 55 36 65.5 51.4 77.8 14.9 11.2 19.9 <10.0 226.0 PI(D21) 55 55 100 93.5 100 103.5 77.9 137.3 20.0 2560.0 18-49 歲 FluLDll PRE 129 98 76.0 67.7 83.1 28.7 22.2 37.1 <10.0 1280.0 PI(D21) 129 129 100 97.2 100 360.1 294.7 440.1 14.0 5120.0 FluLD12 PRE 128 95 74.2 65.7 81.5 31.2 23.9 40.6 <10.0 1280.0 PI(D21) 128 127 99.2 95.7 100 335.0 271.4 413.4 <10.0 5120.0 FluLDH PRE 130 99 76.2 67.9 83.2 32.1 25.2 41.0 <10,0 640.0 PI(D21) 130 130 100 97.2 100 334,8 276.0 406.1 10.0 20480.0 FluLD18 PRE 132 105 79.5 71.7 86.1 27.7 22.2 34.5 <10.0 905.0 PI(D21) 132 131 99.2 95.9 100 273.2 223.8 333.6 <10.0 3620,0 Fluarix PRE 130 106 81.5 73.8 87.8 34.0 26.6 43.4 <10.0 1280.0 PI(D21) 130 130 100 97.2 100 360.7 299.2 434.8 20.0 5120.0 50-64歲 FluLDll PRE 58 44 75.9 62.8 86.1 31.1 20.9 46.4 <10.0 1280.0 PI(D21) 58 58 100 93.8 100 428.8 312.7 587.9 20.0 2560.0 FluLD12 PRE 61 46 75.4 62.7 85.5 27.8 19.2 40.2 <10.0 640.0 PI(第21天） 61 61 100 94.1 100 309.2 231.0 413.9 20.0 5120.0 FluLDM PRE 60 42 70.0 56.8 81.2 25.6 17.9 36.6 <10.0 640.0 PI(D21) 60 58 96.7 88.5 99.6 290.0 205.5 409.1 <10.0 2560.0 -154- 130360.doc 200908994 >=10 1/DIL GMT 抗艎 B/馬來西亞 ------ 95% Cl 95% Cl 亞群群組時間 N n % LL UL 值 LL UL Min Max -~~~_ FluLD18 PRE 60 44 73.3 60.3 83,9 26.2 18.3 37.6 <10.0 640.0 PI(D21) 60 60 100 94.0 100 275.3 202.4 374.4 10.0 5120.0 Fluarix PRE 55 49 89.1 77.8 95.9 47.1 30.4 72.9 <10.0 1280.0 PI(D21) 55 55 100 93.5 100 282.0 208.9 380.6 40.0 2560.0 18-49 歲 FluLDll PRE 129 101 78.3 70.2 85.1 26.3 20.8 33.4 <10.0 2560.0 PI(D21) 129 129 100 97.2 100 281.2 237.9 332.4 40.0 2560.0 FluLD12 PRE 128 98 76.6 68.3 83.6 27.2 21.5 34.4 <10.0 3620.0 PI(D21) 128 128 100 97.2 100 335.9 283.3 398.3 28.0 3620.0 FluLD14 PRE 130 94 72.3 63.8 79.8 22.7 18.2 28.2 <10.0 640.0 PI(D21) 130 128 98.5 94.6 99.8 219.1 179.8 266.9 <10.0 2560.0 FluLD18 PRE 132 95 72.0 63.5 79.4 23.9 19.1 30.0 <10.0 1280.0 PI(D21) 132 130 98.5 94.6 99.8 203.5 166.7 248.5 <10.0 5120.0 Fluarix PRE 130 98 75.4 67.1 82.5 27.4 21.7 34.4 <10.0 453.0 PI(D21) 130 129 99.2 95.8 100 250.9 206.9 304.3 <10.0 2560.0 50-64歲 FluLDll PRE 58 41 70.7 57.3 81.9 24.8 17.7 34.7 <10.0 320.0 PI(D21) 58 58 100 93.8 100 138.6 108.1 177.6 20.0 1280.0 FluLD12 PRE 61 47 77.0 64.5 86.8 27.5 19.9 37.8 <10.0 640.0 PI(D21) 61 60 98.4 91.2 100 128.1 99.3 165.1 <10.0 1280.0 FluLD14 PRE 60 44 73.3 60.3 83.9 22.4 15.9 31.6 <10.0 1280.0 PI(D21) 60 60 100 94.0 100 152.7 110.9 210.3 10.0 2560.0 453.0 FluLD18 PRE 60 47 78.3 65.8 87.9 21.8 16.2 29.2 <10.0 PI(D21) 60 58 96.7 88.5 99.6 117.0 85.4 160.3 <10.0 1810.0 Fluarix PRE 55 41 74.5 61.0 85.3 26,0 18.0 37.6 <10.0 1280.0 PI(D21) 55 54 98.2 90.3 100 155.9 113.0 215.0 <10.0 3620.0 中間結論對A/所羅門群島（H1N1)而言’所有研究群組之GMT係在相同範圍内。對所有病毒株及所有年齡分類而言’所有經佐劑化群組非次於Fluarix群組。對A/威斯康星（H3N2)而言，展示免疫反應隨AS03濃度降低而降低之趨勢，不具有統計學顯著差異。對B /馬來西亞而言，亦展示免疫反應隨 A S 0 3濃度降低而降低之趨勢，但對該病毒株而言，僅在經 FluLDl/2與FluLDl/8誘導之GMT之間展示統計學顯著差異 (參見圖15) ° 當藉由年齡群組分析資料時，可見類似結果。然而對B/ 130360.doc -155- 200908994 馬來西亞而言，在較年輕年齡群組（18-49歲）中，經 FluLDl/2誘導之GMT比經FluLDl/4誘導之GMT在統計學上顯著更高。 X.4.2抗HI抗體效價之血清轉化因子、血清保護率及血清轉化率（當建立用於人類之流感疫苗時，保護之關聯性）血清保護率之結果呈現於表26及27-圖16中，血清轉化率之結果呈現於表28及29-圖17A及17B中，且轉化因子之結果呈現於表30及31-圖17。表26-在D0及D21之HI抗體效價的血清保護率（SPR) SPR 95% Cl 疫苗病毒株群組時間 N n % LL UL A/所羅門 FluLDll PRE 187 45 24.1 1B.1 30.8 Π(第21天） 187 177 94.7 90.4 97.4 FluLD12 PRE 189 46 24.3 18.4 31.1 PI(第21天） 189 170 89.9 84.7 93.8 FluLD14 PRE 190 43 22.6 16.9 29.2 PI(第21天） 190 169 88.9 83.6 93.0 FluLD18 PRE 192 52 27.1 20.9 34.0 Π(第21天） 192 166 86.5 80.8 91.0 Fluarix PRE 185 50 27.0 20.8 34.0 PI(第21天） 185 172 93.0 88.3 96.2 A/威斯康星 FluLDll PRE 187 90 48.1 40.8 55.5 PI(第21天） 187 183 97.9 94.6 99.4 FluLD12 PRE 189 90 47.6 40.3 55.0 PI(第21天） 189 186 98.4 95.4 99.7 FluLD14 PRE 190 96 50.5 43.2 57.8 PI(第21天） 190 185 97.4 94.0 99.1 FluLD18 PRE 192 91 47.4 40.2 54.7 PI(第21天） 192 184 95.8 92.0 98.2 Fluarix PRE 185 95 51.4 43.9 58.8 PI(第21天） 185 183 98.9 96.1 99.9 B/馬來西亞 FluLDll PRE 187 80 42.8 35.6 50.2 PI(第21天） 187 183 97.9 94.6 99.4 FluLD12 PRE 189 88 46.6 39.3 53.9 PI(第21天） 189 186 98.4 95.4 99.7 FluLD14 PRE 190 81 42.6 35.5 50.0 130360.doc -156- 200908994 SPR 95% CI 疫苗病毒株群組時間 N η % LL UL PI(第21天） 190 180 94.7 90.5 97.4 FluLD18 PRE 192 86 44.8 37.6 52.1 PI(第21天） 192 180 93.8 89.3 96.7 Fluarix PRE 185 88 47.6 40.2 55.0 PI(第21天） 185 178 96.2 92.4 98.5 FluLDll =具有1/1劑量AS03之5 pg HA/病毒株；

FluLD12 =具有1/2劑量AS03之5 pg HA/病毒株； ?1111^14 =具有1/4劑量入8 03之5 4§11八/病毒株；

FluLD18 =具有1/8劑量AS03之5 pg HA/病毒株； Fluarix=Fluarix(15 pg HA/病毒株）血清保護率定義為具有血清HI效價21:40之受疫苗接種者的百分比 N=具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 n/%=經血清保護受檢者之數量/百分比 95% CI=95%信賴區間，LL =下限，UL =上限 PRE =疫苗接種前，第0天；PI(第21天）=疫苗接種後，第 21天表27-在D0及D21，按年齡分類之HI抗體效價的血清保護率（SPR) SPR 95% CI 疫苗病毒株亞群群組時間 N n % LL UL Α/所羅門 18-49歲 FluLDll PRE 129 36 27.9 20.4 36.5 PI(第21天） 129 127 98.4 94.5 99.8 FluLD12 PRE 128 35 27.3 19.8 35.9 PI(第21天） 128 117 91.4 85.1 95.6 FluLD14 PRE 130 35 26.9 19.5 35.4 PI(第21天） 130 119 91.5 85.4 95.7 FluLD18 PRE 132 43 32.6 24.7 41.3 I>I(第 21 天） 132 119 90.2 83.7 94.7 130360.doc -157 - 200908994 SPR 95% Cl 疫苗病毒株亞群群組時間 N n % LL UL Fluarix PRE 130 34 26.2 18.8 34.6 PI(第21天） 130 124 95.4 90.2 98.3 A/威斯康星 50-64歲 FluLDll PRE 58 9 15.5 7.3 27.4 PI(第21天） 58 50 86.2 74.6 93.9 FluLD12 PRE 61 11 18.0 9.4 30.0 PI(第21天） 61 53 86.9 75.8 94.2 FluLD14 PRE 60 8 13.3 5.9 24.6 PI(第21天） 60 50 83.3 71.5 91.7 FluLD18 PRE 60 9 15.0 7.1 26.6 PI(第21天） 60 47 78.3 65.8 87.9 Fluarix PRE 55 16 29.1 17.6 42.9 Π(第21天） 55 48 87.3 75.5 94.7 18-49 歲 FluLDll PRE 129 62 48.1 39.2 57.0 PI(第21天） 129 127 98.4 94.5 99.8 FluLD12 PRE 128 62 48.4 39.5 57.4 PI(第21天） 128 126 98.4 94.5 99.8 FluLD14 PRE 130 68 52.3 43.4 61.1 PI(第21天） 130 128 98.5 94.6 99.8 FluLD18 PRE 132 62 47.0 38.2 55.8 PI(第21天） 132 127 96.2 91.4 98.8 Fluarix PRE 130 66 50.8 41.9 59.6 Π(第21天） 130 128 98.5 94.6 99.8 B/馬來西亞 50-64歲 FluLDll PRE 58 28 48.3 35.0 61.8 PI(第21天） 58 56 96.6 88.1 99.6 FluLD12 PRE 61 28 45.9 33.1 59.2 PI(第21天） 61 60 98.4 91.2 100 FluLD14 PRE 60 28 46.7 33.7 60.0 PI(第21天） 60 57 95.0 86.1 99.0 FluLD18 PRE 60 29 48.3 35.2 61.6 PI(第21天） 60 57 95.0 86.1 99.0 Fluarix PRE 55 29 52.7 38.8 66.3 PI(第21天） 55 55 100 93.5 100 18-49 歲 FluLDll PRE 129 53 41.1 32.5 50.1 PI(第21天） 129 129 100 97.2 100 FluLD12 PRE 128 59 46.1 37.2 55.1 PI(第21天） 128 127 99.2 95.7 100 FluLD14 PRE 130 57 43.8 35.2 52.8 PI(第21天） 130 125 96.2 91.3 98.7 FluLD18 PRE 132 61 46.2 37.5 55.1 PI(第21天） 132 128 97.0 92.4 99.2 Fluarix PRE 130 61 46.9 38.1 55.9 PI(第21天） 130 126 96.9 92.3 99.2 50-64歲 FluLDll PRE 58 27 46.6 33.3 60.1 PI(第21天） 58 54 93.1 83.3 98.1 130360.doc •158- 200908994 SPR 95% CI 疫苗病毒株亞群群組時間 N η % LL UL FluLD12 PRE 61 29 47.5 34.6 60.7 PI(第21天） 61 59 96.7 88.7 99.6 FluLD14 PRE 60 24 40.0 27.6 53.5 PI(第21天） 60 55 91.7 81.6 97.2 FluLD18 PRE 60 25 41.7 29.1 55.1 PI(第21天） 60 52 86.7 75.4 94.1 Fluarix PRE 55 27 49.1 35.4 62.9 PI(第21天） 55 52 94.5 84.9 98.9 與表24中相同之圖例中間結論對所有群組及所有三種病毒株而言，SPR滿足CHMP(平均值>70)及FDA標準（具有95% CI之LL >70)。展示所有群組之SPR係在相同範圍内。表28-在PI(第21天）之HI抗體效價的血清轉化率（SCR) SCR 95% CI 疫苗病毒株群組時間 N η % LL UL Α/所羅門 FluLDll PI(第21天） 187 154 82.4 76.1 87.5 FluLD12 PI(第21天） 189 141 74.6 67.8 80.6 FluLD14 PI(第21天） 190 133 70.0 62.9 76.4 FluLD18 PI(第21天） 192 119 62.0 54.7 68.9 Fluarix PI(第21天） 185 131 70.8 63.7 77.2 Α/威斯康星 FluLDll PI(第21天） 187 150 80.2 73.8 85.7 FluLD12 PI(第21天） 189 147 77.8 71.2 83.5 FluLD14 PI(第21天） 190 142 74.7 67.9 80.7 FluLD18 PI(第21天） 192 142 74.0 67.1 80.0 Fluarix PI(第21天） 185 118 63.8 56.4 70.7 Β/馬來西亞 FluLDll PI(第21天） 187 136 72.7 65.7 79.0 FluLD12 PI(第21天） 189 127 67.2 60.0 73.8 FluLD14 PI(第21天） 190 128 67.4 60.2 74.0 FluLD18 PI(第21天） 192 127 66.1 59.0 72.8 Fluarix PI(第21天） 185 125 67.6 60.3 74.3

FluLDll =具有 1/1 劑量 AS03 之 5 pg HA/病毒株；FluLD12 = 具有1/2劑量AS03之5 pg HA/病毒株；FluLD14=具有1/4劑 130360.doc -159- 200908994 量AS03之5 pg HA/病毒株；FluLD18 =具有1/8劑量AS03之 5 pg HA/病毒株；Fluarix=Fluarix(15 pg HA/病毒株）血清轉化定義為：

對最初血清陰性受檢者而言，疫苗接種後抗體效價> = 40 1/DIL 對最初血清陽性受檢者而言，疫苗接種後之抗體效價>=4 倍疫苗接種前之抗體效價 N=具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 n/% =經血清轉化受檢者之數量/百分比 95% CI = 95%信賴區間，LL =下限，UL =上限 PI(第21天）=疫苗接種後，第21天表29-在PI(第21天），按年齡分類之HI抗體效價的血清轉化率（SCR) SCR 95% CI 疫苗病毒株亞群群組時間 Ν η % LL UL A/所羅門 18-49 歲 FluLDll PI(第21天） 129 113 87.6 80.6 92.7 FluLD12 PI(第21天） 128 96 75.0 66.6 82.2 FluLD14 PI(第21天） 130 91 70.0 61.3 77.7 FluLD18 第21天） 132 84 63.6 54.8 71.8 Fluarix Π(第21天） 130 101 77.7 69.6 84.5 50-64歲 FluLDll PI(第21天） 58 41 70.7 57.3 81.9 FluLD12 PI(第21天） 61 45 73.8 60.9 84.2 FluLD14 PI(第21天） 60 42 70.0 56.8 81.2 FluLD18 PI(第21天） 60 35 58.3 44.9 70.9 Fluarix PI(第21天） 55 30 54.5 40.6 68.0 A/威斯康星 18-49 歲 FluLDll PI(第21天） 129 104 80.6 72.7 87.0 FluLD12 PI(第21天） 128 101 78.9 70.8 85.6 FluLD14 PI(第21天） 130 97 74.6 66.2 81.8 FluLD18 Π(第21天） 132 96 72.7 64.3 80.1 Fluarix ΡΙ(第21天） 130 89 68.5 59.7 76.3 50_64歲 FluLDll ΡΙ(第21天） 58 46 79.3 66.6 88.8 FluLD12 ΡΙ(第21天） 61 46 75.4 62.7 85.5 130360.doc -160- 200908994 ~------ SCR 疫苗病毒株 95% CI 亞群群組時間 N η % LL UL B/馬來西亞 —'— FluLD14 PI(第21天） 60 45 75.0 62.1 85.3 FluLD18 PI(第21天） 60 46 76.7 64.0 86.6 Fluarix PI(第21天） 55 29 52.7 38.8 66.3 18-49 歲 FluLDll PI(第21天） 129 102 79.1 71.0 85.7 FluLD12 第21天） 128 96 75.0 66.6 82.2 FluLD14 PI(第21天） 130 93 71.5 63.0 79.1 FluLD18 PI(第21天） 132 96 72.7 64.3 80.1 Fluarix PI(第21天） 130 94 72.3 63.8 79.8 50-64歲 FluLDll PI(第21天） 58 34 58.6 44.9 71.4 FluLD12 PI(第21天） 61 31 50.8 37.7 63.9 FluLD14 PI(第21天） 60 35 58.3 44.9 70.9 FluLD18 PI(第21天） 60 31 51.7 38.4 64.8 Fluarix PI(第21天） 55 31 56.4 42.3 69.7 與表26相同之圖例中間結論對所有研究疫苗及所有三種病毒株而言，SCR滿足 CHMP標準（平均值>40)及FDA標準（具有95% CI之LL >40)。除B/馬來西亞外，展示SCR隨AS03含量降低而降低之趨勢（其中展示所有結果係在相同範圍内）。對A/所羅門群島而言，與FluLDl/8相比，FluLDl/Ι誘導統計學上顯著更高之SCR。對所有群組而言，FluLDl/2及FluLDl/4誘導之SCR係在相同範圍内。表30-在D21之HI抗體效價的血清轉化因子（SCF) SCF 95% CI 疫苗病毒株群組時間 Ν 值 LL UL Α/所羅門(1/DIL) FluLDll Π(第21天） 187 15.6 12.7 19.2 FluLD12 PI(第21天） 189 12.7 10.2 1Ϊ8 FluLD14 PI(第21天） 190 12.8 10.1 16.1 FluLD18 PI(第21天） 192 10.1 8.0 12.8 Fluarix PI(第21天） 185 12.7 9.9 16.2 Α/威斯康星(1/DIL) FluLDll Π(第21天） 187 12.9 10.5 16.0 FluLD12 ΡΙ(第21天） 189 10.9 8.9 13.3 130360.doc • 161 - 200908994 SCF 95% CI 疫苗病毒株群組時間 N 值 LL UL FluLD14 PI(第21天） 190 10.7 8.6 13.2 FluLD18 PI(第21天） 192 10.1 8.2 12.3 Fluarix Π(第21天） 185 9.0 7.2 11.2 B/馬來西亞(1/DIL) FluLDll PI(第21天） 187 8.7 7.2 10.6 FluLD12 PI(第21天） 189 9.0 7.3 11.2 FluLD14 PI(第21天） 190 8.7 7.0 10.8 FluLD18 PI(第21天） 192 7.4 6.1 8.9 Fluarix PI(第21天） 185 8.1 6.6 9.9

FluLDll =具有 1/1 劑量 AS03 之 5 pg HA/病毒株；FluLD12 = 具有1/2劑量AS03之5 pg HA/病毒株；FluLD14=具有1/4劑量AS03之5 pg HA/病毒株；FluLD18 =具有1/8劑量AS03之 5 pg HA/病毒株；Fluarix=Fluarix(15 pg HA/病毒株） N=具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 SCF=血清轉化因子或幾何平均比率（平均[loglO(POST/ PRE)]) 95°/。CI = 95%信賴區間，LL =下限，UL =上限 PI(第21天）=疫苗接種後，第21天表31-在D21，藉由年齡分類之HI抗體效價的血清轉化因子 (SCF) SCF 95% CI 疫苗病毒株亞群群組時間 N 值 LL UL A/所羅門(1/DIL) 18-49 歲 FluLDll PI(第21天） 129 18.5 14.3 23.8 FluLD12 PI(第21天） 128 13.9 10.5 18.4 FluLD14 PI(第21天） 130 13.4 10.1 17.8 FluLD18 PI(第21天） 132 11.4 8.4 15.4 Fluarix PI(第21天） 130 16.3 12.1 22.1 50-64歲 FluLDll PI(第21天） 58 10.8 7.7 15.1 FluLD12 PI(第21天） 61 10.4 7.4 14.6 FluLD14 PI(第21天） 60 11.4 7.7 17.1 FluLD18 PI(第21天） 60 7.8 5.5 11.2 Fluarix PI(第21天） 55 6.9 4.6 10.4 130360.doc -162- 200908994 SCF 95% CI 疫苗病毒株亞群群組時間 Ν 值 LL UL A/威斯康星（1/ IL) 18-49 歲 FluLDll PI(第21天） 129 12.5 9.8 16.0 FluLD12 PI(第21天） 128 10.7 8.5 13.7 FluLD14 PI(第21天） 130 10.4 8.0 13.5 FluLD18 PI(第21天） 132 9.9 7.8 12.5 Fluarix PI(第21天） 130 10.6 8.2 13.8 50-64歲 FluLDll PI(第21天） 58 13.8 9.0 21.2 FluLD12 PI(第21天） 61 11.1 7.5 16.4 FluLD14 PI(第21天） 60 11.3 7.7 16.7 FluLD18 PI(第21天） 60 10.5 7.0 15.7 Fluarix PI(第21天） 55 6.0 4.0 8.9 B/馬來西亞 (1/DIL) 18-49 歲 FluLDll Π(第21天） 129 10.7 8.4 13.5 FluLD12 ΡΙ(第21天） 128 12.4 9.5 16.1 FluLD14 ΡΙ(第21天） 130 9.7 7.4 12.6 FluLD18 ΡΙ(第21天） 132 8.5 6.8 10.7 Fluarix ΡΙ(第21天） 130 9.2 7.2 11.7 50-64歲 FluLDll ΡΙ(第21天） 58 5.6 4.0 7.7 FluLD12 ΡΙ(第21天） 61 4.7 3.4 6.5 FluLD14 ΡΙ(第21天） 60 6.8 4.6 10.0 FluLD18 ΡΙ(第21天） 60 5.4 3.8 7.5 Fluarix ΡΙ(第21天） 55 6.0 4.1 8.8 與表2 8中相同之圖例中間結論對所有研究疫苗而言，所有三種病毒株之SCF遠高於 CHMP標準（>2)。對所有研究疫苗而言，SCF係在相同範圍内。 X.4.3佐劑化低劑量疫苗相對於Fluarix(GMT)之非次等性就第21天時三種病毒之GMT比率而言，經佐劑化低劑量疫苗相對於Fluarix之非次等性展示於表32中。表32-就D21時3種病毒病毒株之GMT比率而言，經佐劑化低劑量疫苗相對於Fluarix之非次等性 130360.doc -163- 200908994 流感低劑量 95% CI Fluarix 95% CI AS03劑量 (μί) 劑量比例抗體 Ν GMT LL UL Ν GMT LL UL 250 1/1 Α/Η1Ν1 187 202.3 168.3 243.2 185 191.0 158.7 229.9 Α/Η3Ν2 187 378.6 320.0 447.8 185 335.3 286.5 392.3 Β 187 236.0 206.1 270.4 185 217.8 184.5 257.2 125 1/2 Α/Η1Ν1 189 160.5 135.7 189.9 185 191.0 158.7 229.9 Α/Η3Ν2 189 336.0 288.2 391.8 185 335.3 286.5 3()2 3 Β 189 226.2 204.8 249.7 185 217.8 184.5 257.2 62.5 1/4 Α/Η1Ν1 190 155.5 139.2 173.7 185 191.0 158.7 229.9 Α/Η3Ν2 190 302.0 272.9 334.1 185 335 3 '286.5 392.3 Β 190 205.7 181.9 232.6 185 217.8 184.5 257.2 31.2 1/8 Α/Η1Ν1 192 156.3 132.8 183.8 185 191.0 158.7 229.9 Α/Η3Ν2 192 282.9 244.0 328.1 185 335.3 286.5 392.3 Β 192 169.4 145.1 197.7 185 217.8 184,5 257.2 LD/Fluarix 90% CI AS03劑量 (ML) 劑量比例抗體比率 LL UL 250 1/1 A/H1N1 1.06 0.85 1.32 A/H3N2 1.13 0.93 1.37 B 1.08 0.91 1.30 125 1/2 A/H1N1 0.84 0.68 1.04 A/H3N2 1.00 0.83 1.20 B 1.04 0.88 1.22 62.5 1/4 A/H1N1 0.81 0.68 0.98 A/H3N2 0.90 0.77 1.05 B 0.94 0.79 1.12 31.2 1/8 A/H1N1 0.82 0.67 1.01 A/H3N2 0.84 0.70 1.01 B 0.78 0.64 0.94 N=具有可用結果之受檢者的數量 95% CI=95%信賴區間，90% CI = 90°/。信賴區間，LL=下限’ UL =上限 GMT=幾何平均抗體效價中間結論就所有三種病毒株之GMT比率而言，展示FluLDl/Ι、 1/2、1/4並非次於Fluarix。對於H1N1及H3N2病毒株而非 130360.doc -164- 200908994 對於B而言，展示FluLD 1/8並非次於Fluarix。 X. 5.結論 X · 5.1安全結論與用市售Fluarix疫苗所展示之反應原性相比，用經佐劑化疫苗展示更高之反應原性。對經佐劑化疫苗而言，展示反應原性隨AS03之量降低而降低之趨勢。總之，用 FluDLl/4及FluDLl/8獲得類似反應原性概況。所有疫苗群組之未經請求症狀係相同的。 Χ·5.2免疫原性結論該研究之主要目標為，評估D21時LD疫苗調配物相對於

Fluarix之非次等性（GMT)。在用一劑量經佐劑化疫苗FluDL1/1、FluDL1/2及 FluDLl/4進行疫苗接種後第21天，展示所有三種病毒株之 GMT比率並非次於用？111&1<匕獲得之彼等比率。在彼研究中，對於H1N1及H3N2病毒株而非對於]3病毒株而言，展示用疫苗FluDLl/8獲得之GMT比率並非次於FiuaHx。不官免疫反應所展示之隨佐劑之量降低而降低之趨勢，所有疫苗均展示滿足用於所有病毒株之所有三種關於監控認可的CHMP標準。實例XI-在年齡為65歲以上之老年人群體中用含有裂解流

感抗原製劑及各種佐劑之疫苗的臨床試驗P XI. 1.介紹諸如FlUarixm之經典裂解流感疫苗在老年成年人中之功效比在成年人或青年人群中顯著更低。表明免疫系統之老 130360.doc -165- 200908994 化（亦即免疫衰老）係老年成年人中所見之功效相對缺乏的根本原因，因此為藉由刺激更強免疫反應而改良疫苗留有餘地。因此，在2007年，在年齡為65歲以上之老年人群體中進行II期、受控、隨機化、單盲研究以評估與用作參考之 FluarixTM(GlaxoSmithKline Biologicals)相比’具有八種不同佐劑調配物之流感候選疫苗在經肌肉内投與時之免疫原性、安全性及反應原性。已測試包含水包油乳液且每劑量包含25 Hg 之經佐劑化流感疫苗且證明其有效性（WO 2006/100111)。在彼研究中，各組份之量固定為W之水包油乳液及25 pg之 MPL。本研究旨在測定最佳疫苗調配物，使所觀測反應原性/安全性概況之可接受性與免疫原性概況之可接受性相平衡。 XI.2.研究設計及目標十群組受檢者（除年齡為18-40歲之群組Fluarix YNG外，每群組年齡265歲之200個受檢者）經肌肉内（i.m.)平行接收以下流感疫苗： •FluAS03 1/1 :經全劑量o/w乳液（AS03 1/1)佐劑化之疫苗 •FluAS03 1/2 :經1/2劑量o/w乳液（AS03 1/2)佐劑化之疫苗 •FluAS03 1/4 :經1/4劑量o/w乳液（AS03 1/4)佐劑化之疫苗 •FluAS25 1/1 :經 25 pg MPL +全劑量 o/w乳液（AS25A)佐劑化之疫苗 •FluAS25 1/2 :經 25 pg MPL+1/2 劑量 o/w 乳液（AS25B)佐劑化之疫苗 130360.doc -166 - 200908994 •FluAS25 1/4 :經 25 pg MPL+1/4劑量 o/w乳液（AS25C)佐劑化之疫苗 •FluAS50 1/2 :經 50 pg MPL+1/2 劑量 o/w乳液（AS25E)佐劑化之疫苗 •FluAS50 1/4 ：經 50 pg MPL+1/4劑量 o/w乳液（AS25F)佐劑化之疫苗 •Fluarix ELD(265歲）：Fluarix™ •Fluarix YNG(18-40歲）：Fluarix™ 時程：在第0天，流感疫苗之一次IM注射，疫苗接種後第0 天、第21天及第180天進行血液樣本收集。用於該研究之標準三價裂解流感疫苗-Fluarix™與實例X中所用之彼流感疫苗相同。疫苗調配物描述於表3 1-32中。 XI.2.1.主要目標：免疫原性為基於疫苗接種後2 1天對於三種疫苗病毒株之免疫原性 (GMT)，識別與Fluarix相比，在年齡265歲之受檢者中經肌肉内給予之經佐劑化流感疫苗的最佳調配物（一劑量o/w 乳液與一劑量MPL之組合）。變數係如實例X.2.1中且用於年齡為65歲以上之受檢者的變數（第2 1天之HI抗體效價及 HI抗體效價之GMT)。 X.2.2.二級目標為評估以下各者： •在用流感疫苗進行疫苗接種之所有受檢者中的安全性及反應原性 •疫苗接種後2 1天，在所有受檢者中，流感疫苗之免疫原 130360.doc -167- 200908994 性（GMT、SCF、SCR及 SPR)。 •首次疫苗接種後180天，所有受檢者中之HI抗體的持續性。 •在第0天、第21天及第180天，就產生至少兩種不同細胞激素（IFN-γ、IL-2、CD40L或TNF-α)之流感特異性 CD4/CD8 T淋巴細胞的頻率而言，藉由流感疫苗誘導之細胞介導免疫（CMI)反應（僅對受檢者之子集而言）。所觀測及導出之變數（及定義）係如實例X中所述。 XI.3.疫苗組合物及投藥經佐劑化流感疫苗係以市售Fluarix疫苗為主，其自1992 年起由GSK Bio銷售。候選調配物由三價裂解病毒粒子、失活流感抗原（其包含三種單價病毒抗原本體（分別自經推薦用於2007/2008 Northern Hemisphere之流感病毒株 A/H1N1、A/H3N2及B製備，參見實例X))以及以MPL及/或水包油（ο/w)乳液為主之佐劑系統組成。將在彼試驗中測試兩個家族之GSK Bio專利佐劑系統：、 -藉由每人類劑量經佐劑化疫苗之乳液量分類（l/ld-·.·) 的AS03家族； -經MPL補充且藉由每人類劑量經佐劑化疫苗之各組份的量分類（A、B、…）的水包油乳液之AS25家族。 XI.3.1.疫苗組合物已描述產生自個別生長於含胚雞卵中之三種流感病毒病毒株（即A型（H1N1及H3N2)及B型）之研究種子製備的裂解失活病毒粒子抗原之三種單本體（參見實例X)。臨床批量 130360.doc -168- 200908994 每劑量含有1 5 μg血球凝集素（ΗA)之各流感病毒病毒株。流感抗原係經3-0-去醯基-4’-單磷醯基脂質A(MPL)及/或水包油（o/w)乳液AS03佐劑化。AS之八種不同調配物欲與裂解病毒粒子流感抗原組合。佐劑之製備方法係自WO 2006/100111之實例II中所述彼方法改編，其中個別組份之量係根據表3 1及32中所給之資訊改編。賦形劑為以下各者：聚山梨醇酯80(Tween-80)、辛苯昔醇10(Triton® X-1 00)、α-生育酚氫丁二酸酯、氯化鈉、氯化鎂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀及注射用水。經佐劑化流感疫苗之不同調配物為不含防腐劑之調配物。然而，其含有來自藥物物質製造方法之早期階段的痕量硫柳汞（每劑量<1.25 pg之Hg)，在該製造方法中添加硫柳汞以降低生物負荷。經佐劑化之流感疫苗為經佐劑化裂解純化流感病毒之注射用無菌微白色乳液。其以雙組份疫苗形式存在，該雙組份疫苗由含有抗原（懸浮液）之I型玻璃小瓶及含有佐劑（乳液）之預填充I型玻璃注射器（PFS)組成。將疫苗儲存於2至 8 °C下。在注射時，將抗原預填充注射器之内含物注射至含有濃縮三價失活裂解病毒粒子抗原之小瓶中。混合後，將内含物抽取至注射器中且以肌肉内針來替換針。一劑量之復水經佐劑化流感候選疫苗相應於0.7 mL(表33及34)。表33疫苗調配物佐劑系統〇/w乳液之體積 MPL 之量抗原流感ΝΗ 2007/2008 AS25A(AS25_1_1) 250 μΐ 25 μκ Α/所羅門群島/3/2006(Η 1Ν1 )Ι VR-145 Α/威斯康星/67/2005(H3N2)NYMCX- 161Β AS25B (AS25_1_2) 125 μΐ 25 \ig AS25C (AS25_1_4) 62.5 μΐ 25 μκ AS03 1/1 (AS03_1^1) 250 μΐ 〇 130360.doc -169- 200908994 AS03 1/2(AS03_1一2) 125 μΐ 〇 “g Β/馬來西亞/2506/2004 AS03 1/4 (AS03_1_4) 62.5 μΐ 〇 AS25E -AS50 1/2 (AS50丄2) 125 μΐ 50 μκ AS25F -AS50 1/4 (AS50—1—4) 62.5 μΐ 50 表34經佐劑化流感疫苗之組成組份每劑量(0.7 ml)之量活性成份失活裂解病毒粒子 -Η1Ν1 15 pgHA -Η3Ν2 15 pgHA -Β 15 pgHA 佐劑 AS25A AS25B AS25C AS031/1 AS031/2 AS031/4 AS25E AS25F -乳液(μί) 250 125 62.5 250 125 62.5 125 62.5 •角鯊烯(mg) 10.69 5.34 2.67 10.69 5.34 2.67 5.34 2.67 •DL-α-生育盼(mg) 11.86 5.93 2.97 11.86 5.93 2.97 5.93 2.97 •聚山梨醇酯 80(Tween-80) (mg) 4.86 2.43 1.22 4.86 2.43 1.22 2.43 1.22 -MPL 25 pg 25 pg 25 pg / / / 50 μβ 50 pg

賦形劑（目標值）聚山梨醇酯80 (Tween-80) 0.40 mg 辛苯昔醇 10(Triton® X-100) 0.05 mg a-生育酚氫丁二酸酯 0.05 mg 氯化細 3.92 mg 氯化鎂 0.03 mg 鱗酸鼠二納 0.54 mg 填酸二氫鉀 0.16 mg 氯化鉀 0.10 mg 注射用水足量至0.70 mL XI.3.2.疫苗製備 AS03調配物係藉由用注射用水稀釋磷酸鹽緩衝液（Na/K 191.4 mM P043' ' 2.74 mM NaCl ' 54 mM KCL > pH 6.8 -足量至9.57 mM P043)(在RT下攪拌15-45 min直至均質）來製備。隨後添加適當量之水包油乳液本體。在室溫下，將混合物擾拌1 5-45分鐘，且量測pH。隨後，藉由經由0.2 μηι 膜過濾將混合物滅菌。執行無菌惰性氣體（氮）沖洗，以在最小1分鐘期間在經填充容器中產生惰性頂部空間。將無 170· 130360.doc 200908994 菌AS03佐劑儲存於+2_8r下直至無菌填充至125 ml無菌工型（Ph. Eur.)玻璃注射器中。各注射器含有6〇…之體積過量（280 μ1 + 60 μΐ過滿）。 AS25調配物係藉由用注射用水稀釋磷酸鹽缓衝液來製備（在室溫下攪拌15-45 min直至均質）。隨後添加適當量之 SB62本體及MPL液體本體。剩餘程序如上所述。一劑量之復水經佐劑化流感疫苗相應於0.7 mL。最終 ΗA浪度為每mL二價最終本體21.4 之各單價本體。將抗原（Ag)之最終本體填充於3 ml玻璃小瓶中，一劑量之三價流感抗原相應於0.42 ml之體積。將佐劑最終本體填充於 1.25 ml玻璃PFS中，一劑量相應於0.28 ml之體積。復水後之最終疫苗劑量將為0.7 nU。為允許復水後標稱體積（0.7 mL)之注射，用0.51 ml之目標體積填充各Ag小瓶且用0.34 ml之目標體積填充各AS注射器。 XI.4.免疫原性結果-體液免疫反應 XI.4.1 HI幾何平均效價（GMT) 具有95% CI之HI抗體的GMT展示於表35及圖19中。表35-第0天及第21天之HI抗體效價的血清陽性率及 GMT(免疫原性HI之ATP組） >=10 1/DIL GMT 95% CI 95% CI 抗醴群組時間 N η % LL UL 值 LL UL Min Max A/所羅門群島 AS03_1_4 PRE 191 97 50.8 43.5 58.1 10.6 9.3 12.2 <10.0 453.0 PI(D21) 191 184 96.3 92.6 98.5 82.3 69.7 97.1 <10.0 2560.0 AS03—1—2 PRE 191 91 47.6 40.4 55.0 10.8 9.4 12.4 <10.0 226.0 PI(D21) 192 188 97.9 94.8 99.4 102.2 87.0 119.9 <10.0 1280.0 AS03 1_1 PRE 189 86 45.5 38.3 52.9 10.1 8.8 11.5 <10.0 320.0 PI(D21) 189 185 97.9 94.7 99.4 98.2 84.3 114.3 <10.0 3620.0 130360.doc -171 - 200908994 >=10 1/DIL GMT 95% Cl 95% Cl 抗體群組時間 N n % LL UL 值 LL UL Min Max AS25 丄4 PRE 194 97 50.0 42.8 57.2 10.6 9.3 12.1 <10.0 226.0 PI(D21) 194 189 97.4 94,1 99.2 91.7 76.9 109.3 <10.0 1810.0 AS25」_2 PRE 192 97 50.5 43.2 57.8 12.0 10.3 14.0 <10,0 320.0 PI(D21) 192 190 99.0 96.3 99.9 113.2 96.0 133.6 <10.0 2560.0 AS25J1 PRE 193 88 45.6 38.4 52.9 9.9 8.6 11.3 <10.0 320.0 PI(D21) 193 188 97.4 94.1 99.2 114.4 97.1 134.8 <10.0 1810,0 AS50丄4 PRE 192 87 45.3 38.1 52.6 10.2 8.9 11.7 <10.0 160.0 PI(D21) 192 183 95.3 91.3 97.8 78.5 65.9 93.5 <10.0 1280.0 AS50 一 1—2 PRE 189 91 48.1 40.8 55.5 10.3 9.0 11.9 <10.0 640.0 PI(D21) 189 183 96.8 93.2 98.8 111.8 93.3 134.0 <10.0 1280.0 Flu—ELD PRE 187 88 47.1 39.7 54.5 10.7 9.2 12.4 <10.0 2560.0 PI(D21) 188 177 94.1 89.8 97.0 59.6 49.6 71.7 <10.0 3620.0 FluYNG PRE 197 122 61,9 54.8 68.7 21.3 17.1 26.5 <10.0 1810.0 PI(D21) 197 195 99.0 96.4 99.9 271.6 224.6 328.4 <10.0 5120.0 A/威斯康星 AS03J—4 PRE 191 176 92.1 87.4 95.5 59.9 49.5 72.4 <10.0 1280.0 PI(D21) 191 190 99.5 97.1 100 276.2 238.8 319.6 <10.0 5120.0 AS03 丄2 PRE 191 168 88.0 82.5 92.2 51.2 41.9 62.4 <10.0 905.0 PI(D21) 192 192 100 98.1 100 350.2 298.0 411.4 14.0 14480.0 AS03 一 1—1 PRE 189 168 88.9 83.5 93.0 44.4 36.5 54.0 <10.0 2560.0 PI(D21) 189 189 100 98.1 100 351.3 304.8 404.8 28.0 5120.0 AS25—1—4 PRE 194 175 90.2 85.1 94.0 65.7 53.7 80.4 <10.0 2560.0 PI(D21) 194 194 100 98.1 100 309.2 264.9 361,0 10.0 5120.0 AS25 丄2 PRE 192 174 90.6 85.6 94.3 61.1 50.6 73.8 <10.0 1280.0 PI(D21) 192 192 100 98.1 100 331.1 289.6 378.6 40.0 5120.0 AS25—1—1 PRE 193 173 89.6 84.4 93.6 55.8 46.2 67.4 <10.0 1280.0 PI(D21) 193 192 99.5 97.1 100 438.1 379.7 505.4 <10.0 3620.0 AS50 丄4 PRE 192 168 87.5 82.0 91.8 54.6 44.5 67.0 <10.0 2560.0 PI(D21) 192 191 99.5 97.1 100 263.3 225.3 307.7 <10.0 5120.0 AS50—1—2 PRE 189 166 87.8 82.3 92.1 57.8 47.1 70.9 <10.0 2560.0 PI(D21) 189 188 99.5 97.1 100 347.5 296.4 407.3 <10.0 2560.0 Flu—ELD PRE 187 169 90.4 85.2 94.2 61.0 49.8 74.7 <10.0 1810.0 PI(D21) 188 188 100 98.1 100 186,7 158.0 220.7 10.0 2560.0 Flu YNG PRE 197 166 84.3 78.4 89.1 47.8 39.2 58.4 <10.0 1280.0 PI(D21) 197 197 100 98.1 100 380.2 331.6 435.9 40.0 5120.0 B/馬來西亞 AS03 丄 4 PRE 191 178 93.2 88.6 96.3 58.6 49.8 68.9 <10.0 2560.0 PI(D21) 191 190 99.5 97.1 100 147.1 129.1 167.6 <10.0 2560.0 AS03—1_2 PRE 191 180 94.2 89.9 97.1 53.7 45.7 63.2 <10.0 640.0 PI(D21) 192 192 100 98.1 100 163.1 142.5 186.6 14.0 2560.0 AS03J — 1 PRE 189 177 93.7 89.2 96.7 57.0 48.2 67.5 <10.0 2560.0 PI(D21) 189 189 100 98.1 100 172.1 149.9 197.6 14.0 2560.0 AS25丄4 PRE 194 183 94.3 90.1 97.1 62.6 53.3 73.4 <10.0 1810.0 PI(D21) 194 194 100 98.1 100 152.4 134.4 172/7 20.0 2560.0 AS25__1_2 PRE 192 1S4 95.8 92.0 98.2 77.8 66.0 91.7 <10.0 1280.0 PI(D21) 192 192 100 98.1 100 181.4 158.9 207.1 10.0 2560.0 AS25—1—1 PRE 193 186 96.4 92.7 98.5 62.9 53.9 73.4 <10.0 2560.0 PI(D21) 193 193 100 98.1 100 202.0 179.7 227.1 20.0 3620.0 AS50_1_4 PRE 192 179 93.2 88.7 96.3 58.2 49.0 69.1 <10.0 1280.0 PI(D21) 192 192 100 98.1 100 155.7 134.8 179.8 20.0 5120.0 AS50—1_2 PRE 189 176 93.1 88.5 96.3 62.6 53.0 74.0 <10.0 1280.0 PI(D21) 189 189 100 98.1 100 174.6 152.0 200.7 10.0 2560.0 Flu ELD PRE 187 179 95.7 91.7 98.1 66.5 56.5 78.3 <10.0 905.0 PI(D21) 188 188 100 98.1 100 153.0 135.2 173.1 20.0 1280.0 Flu-YNG PRE 197 135 68.5 61.5 74.9 23.4 19.1 28.7 <10.0 1280.0 PI(D21) 197 197 100 98.1 100 281.9 241.7 328.7 20.0 5120.0

Flu_ELD=Fluarix，老年人（年齡 > = 65歲）； -172- I30360.doc 200908994

Flu_YNG=Fluarix > 年輕人（年齡 1 8-40歲） GMT=對所有受檢者計算之幾何平均抗體效價 N=具有可用結果之受檢者的數量 n/% =具有特定範圍内之效價之受檢者的數量/百分比 95% CI = 95%信賴區間；LL=下限，UL二上限；MIN/MAX= 最小值/最大值 PRE =疫苗接種前劑量1(第0天）；PI(D21)=疫苗接種後劑量 1(第21天）；中間結論在年齡>65歲之受檢者中，與Fluarix相比，經一全劑量之AS03及25 pg之MPL(AS25_1_1)佐劑化之流感疫苗對B/ 馬來西亞病毒株引發統計學上顯著更高之HI反應。在該研究中，在年齡265歲之受檢者中，與Fluarix相比，對其他兩種病毒株而言，除具有四分之一劑量之AS03的疫苗之外，所有經佐劑化疫苗結果均良好。 XI.4.2抗HI抗體效價之血清轉化因子、血清保護率及血清轉化率（當建立用於人類之流感疫苗時，保護之關聯性）血清保護率之結果呈現於表36-圖20(每病毒株1個）中，血清轉化率之結果呈現於表37-圖21中，且血清轉化因子之結果呈現於表38-圖22中。表36-D0及D21之HI抗體效價的SPR(HI之ATP組） SPR 95% Cl 疫苗病毒株群組時間 N η % LL UL A/所羅門群島 AS03j—4 PRE 191 27 14.1 9.5 19.9 PI(D21) 191 160 83.8 77.8 88.7 130360.doc -173 - 200908994 SPR 95% Cl 疫苗病毒株群組時間 N n % LL UL AS03—1—2 PRE 191 31 16.2 11.3 22.2 PI(D21) 192 168 87.5 82.0 91.8 AS03—1—1 PRE 189 25 13.2 8.7 18.9 PI(D21) 189 171 90.5 85.4 94.3 AS25 丄4 PRE 194 33 17.0 12.0 23.1 PI(D21) 194 158 81.4 75.2 86.7 AS25—1—2 PRE 192 44 22.9 17.2 29.5 PI(D21) 192 169 88.0 82.6 92.3 AS25—1 一 1 PRE 193 23 11.9 7.7 17.3 PI(D21) 193 172 89.1 83.8 93.1 AS50_1_4 PRE 192 22 11.5 7.3 16.8 PI(D21) 192 153 79.7 73.3 85.1 AS50—1—2 PRE 189 26 13.8 9.2 19.5 PI(D21) 189 163 86.2 80.5 90.8 Flu一 ELD PRE 187 31 16.6 11.6 22.7 PI(D21) 188 132 70.2 63.1 76.6 FluYNG PRE 197 69 35.0 28.4 42.1 PI(D21) 197 182 92.4 87.8 95.7 A/威斯康星 AS03__1_4 PRE 191 133 69.6 62.6 76.1 PI(D21) 191 188 98.4 95.5 99.7 AS03_1_2 PRE 191 124 64.9 57.7 71.7 PI(D21) 192 189 98.4 95.5 99.7 AS03_1_1 PRE 189 113 59.8 52.4 66.8 PI(D21) 189 188 99.5 97.1 100 AS25—1—4 PRE 194 139 71.6 64.8 77.9 PI(D21) 194 190 97.9 94.8 99.4 AS25—1—2 PRE 192 131 68.2 61.1 74.7 PI(D21) 192 192 100 98.1 100 AS25—1—1 PRE 193 139 72.0 65.1 78.2 PI(D21) 193 191 99.0 96.3 99.9 AS50丄 4 PRE 192 130 67.7 60.6 74.3 PI(D21) 192 187 97.4 94.0 99.1 AS50—1—2 PRE 189 134 70.9 63.9 77.3 PI(D21) 189 185 97.9 94.7 99.4 Flu—ELD PRE 187 132 70.6 63.5 77.0 PI(D21) 188 179 95.2 91.1 97.8 Flu_YNG PRE 197 122 61.9 54.8 68.7 PI(D21) 197 197 100 98.1 100 B/馬來西亞 AS03—1—4 PRE 191 138 72.3 65.3 78.5 PI(D21) 191 183 95.8 91.9 98.2 AS03—1—2 PRE 191 140 73.3 66.4 79.4 PI(D21) 192 183 95.3 91.3 97.8 AS03—1—1 PRE 189 138 73.0 66.1 79.2 PI(D21) 189 184 97.4 93.9 99.1 AS25 一 1—4 PRE 194 148 76.3 69.7 82.1 PI(D21) 194 187 96.4 92.7 98.5 AS25 1 2 PRE 192 156 81.3 75.0 86.5 130360.doc -174- 200908994 SPR 95% Cl 疫苗病毒株群組時間 N n % LL UL PI(D21) 192 186 96.9 93.3 98.8 AS25—1_1 PRE 193 149 77.2 70.6 82.9 PI(D21) 193 192 99.5 97.1 100 AS50_1_4 PRE 192 139 72.4 65.5 78.6 PI(D21) 192 182 94.8 90.6 97.5 AS50丄2 PRE 189 145 76.7 70.0 82.5 PI(D21) 189 184 97.4 93.9 99.1 Flu—ELD PRE 187 144 77.0 70.3 82.8 PI(D21) 188 183 97.3 93.9 99.1 Flu_YNG PRE 197 77 39.1 32.2 46.3 PI(D21) 197 195 99.0 96.4 99.9 表37-第21天之HI抗體效價的SCR(免疫原性HI之ATP組） SCR 95% Cl 疫苗病毒株群組 N n % LL UL A/所羅門群島 AS03_1_4 191 133 69.6 62.6 76.1 AS03 1 2 191 138 72.3 65.3 78.5 AS03 1 1 189 154 81.5 75.2 86.7 AS25 1 4 194 130 67.0 59.9 73.6 AS25 1 2 192 142 74.0 67.1 80.0 AS25 1 1 193 151 78.2 71.7 83.8 AS50 1 4 192 129 67.2 60.1 73.8 AS50 1 2 189 146 77.2 70.6 83.0 Flu ELD 187 99 52.9 45.5 60.3 Flu YNG 197 135 68.5 61.5 74.9 A/威斯康星 AS03—1—4 191 108 56.5 49.2 63.7 AS03 1 2 191 124 64.9 57.7 71.7 AS03 1 1 189 141 74.6 67.8 80.6 AS25 1 4 194 104 53.6 46.3 60.8 AS25 1 2 192 124 64.6 57.4 71.3 AS25 1 1 193 142 73.6 66.8 79.6 AS50 1 4 192 110 57.3 50.0 64.4 AS50 1 2 189 131 69.3 62.2 75.8 Flu ELD 187 69 36.9 30.0 44.2 Flu YNG 197 130 66.0 58.9 72.6 B/馬來西亞 AS03—1—4 191 47 24.6 18.7 31.3 AS03 1 2 191 73 38.2 31.3 45.5 AS03 1 1 189 65 34.4 27.6 41.6 AS25 1 4 194 44 22.7 17.0 29.2 AS25 1 2 192 45 23.4 17.6 30.1 AS25 1 1 193 79 40.9 33.9 48.2 AS50 1 4 192 50 26.0 20.0 32.9 AS50 1 2 189 55 29.1 22.7 36.1 Flu ELD 187 47 25.1 19.1 32.0 Flu YNG 197 147 74.6 67.9 80.5 130360.doc -175- 200908994 血清轉化定義為：

4最初i ’月陰性受檢者而言，疫苗接種後抗體效價 1/DIL 對最初血清陽性受檢者而言，疫苗接種後之抗體效價倍疫苗接種前之抗體效價 N具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 n/%=經血清轉化受檢者之數量/百分比 95% CI = 95%信賴區間，LL=下限，UL=上限表38-第21天之HI抗體效價的SCF(免疫原性HI之ATP組） - -- SCF 95% Cl 疫苗病毒株群組 N 值 LL UL A/所羅門群島 AS03丄4 191 7.7 6.5 9.2 AS03 1 2 191 9.4 11.3 AS03 1 1 189 9.8 8.3 11.5 AS25 1 4 194 8.6 7.2 10.4 AS25 1 2 192 9.4 8.0 11.1 AS25 1 1 193 11.6 9.7 13.9 AS50 1 4 192 7.7 6.5 9.2 AS50 1 2 189 10.8 9.0 13.0 Flu ELD 187 5.6 4.7 6.8 Flu YNG 197 12.8 10.0 16.3 &威斯康星 AS03—1—4 191 4.6 3.9 5.4 AS03 1 2 191 6.8 8.1 AS03 1 1 189 7.9 6.6 9.5 AS25 1 4 194 4.7 4.0 5.5 AS25 1 2 192 5.4 4.6 6.3 AS25 1 1 193 7.8 1 6.5 9.5 AS50 1 4 192 4.8 4.1 5.7 AS50 1 2 189 6.0 5.1 7.1 Flu ELD 187 3.1 2.6 3.6 Flu YNG 197 7.9 6.4 9.8 B/馬來西亞 AS03—1—4 191 2.5 2.2 2.8 AS03 1 2 191 3.0 2.6 3.5 AS03 1 1 189 3.0 2.6 3.5 AS25 1 4 194 2.4 2.2 2.8 AS25 1 2 192 2.3 2.1 2.6 AS25 1 1 193 3.2 2.8 3.7 AS50 1 4 192 2.7 2.3 3.1 130360.doc -176· 200908994 SCF 95% Cl 疫苗病毒株群組 N 值 LL UL AS50 1 2 189 2.8 2.4 3.2 Flu ELD 187 2.3 2.0 2.6 Flu YNG 197 12.0 9.7 15.0 N=具有疫苗接種前及疫苗接種後可用結果之受檢者的數量 SCF=血清轉化因子或幾何平均比率（平均[l〇glO(P〇ST/ PRE)]) 95% CI=95%信賴區間，LL =下限，UL=上限資料來源=附錄表ΙΠΑ 體液免疫反應之中間結論 AS03(水包油乳液）之明顯劑量效應可見於HI資料中。與Flu_ELD群組相比，對A/所羅門群島病毒株（除 AS03_1_4及AS50_1_4外）及A/威斯康星病毒株而言，經佐劑化流感疫苗群組中之GMT在統計學上顯著更高。對B/馬來西亞病毒株而言，與Flu_ELD群組相比，在AS25_1_1群組中，GMT在統計學上顯著更高。對H3N2病毒株（A/威斯康星）而言，除在其中使用％劑量乳液之群組中以外，所有經佐劑化流感疫苗群組之體液反應均增加至年輕成年人中所見之水平。與Flu_ELD群組相比，對A/所羅門群島病毒株（除 AS25_1_4及AS50_1_4外）及A/威斯康星病毒株而言，經佐劑化流感疫苗群組中之SCR在統計學上顯著更高。對B/馬來西亞病毒株而言，與Flu_ELD群組相比，AS25_1_1群組中之SCR在統計學上顯著更高。 XI.5.細胞介導免疫反應之分析 130360.doc -177- 200908994 對用經彙集疫苗病毒株再刺激之細胞而言，在第0天及第2 1天產生至少兩種細胞激素（全部加倍）之流感特異性 CD4T細胞的頻率呈現於表39及圖23中。表39-在第0天及第21天，經彙集病毒株之細胞激素陽性 CD4 Τ細胞頻率（每百萬CD4 Τ細胞）（免疫原性CMI之ΑΤΡ 組）測試描述群組時間 N Nmiss GM SD Min Ql 中值 Q3 Max CD4-全部加倍 AS03—1 一4 PRE 42 1 1013.57 679.94 1.00 819.00 1202.00 1790.00 2841.00 PI(D21) 43 0 2038.17 1508.79 422.00 1479.00 2156.00 3215.00 6834.00 AS03丄 2 PRE 38 1 1085.68 912.10 1.00 939.00 1382.50 1921.00 3502.00 PI(D21) 39 0 2780.75 1529.68 426.00 2023.00 2851.00 4126.00 8108.00 AS03_1—1 PRE 48 1 870.96 1342.41 1.00 685.00 1035.50 1534.50 6956.00 PI(D21) 49 0 2563.84 1840.16 280.00 1907.00 2826.00 3636.00 8830.00 AS25J4 PRE 47 0 1089.72 853.67 139.00 664.00 1177.00 1933.00 3321.00 PI(D21) 47 0 2186.84 1776.15 506.00 1447.00 2155.00 3234.00 9385.00 AS25 丄 2 PRE 41 2 1124.53 1071.90 384.00 674.00 1194.00 1717.00 4917.00 PI(D21) 43 0 2153.42 1871.41 348.00 1383.00 1978.00 3751.00 8426.00 AS251—1 PRE 44 0 1106.74 3071.01 140.00 669.00 1140.50 1731.00 20615.00 PI(D21) 44 0 2771.86 2784.80 526.00 1742.00 2773.50 4855.00 15247.00 AS50丄4 PRE 41 2 867.17 666.69 77.00 559.00 835.00 1364.00 2671.00 PI(D21) 43 0 2067.82 1008.33 303.00 1560.00 2142.00 2949.00 5044.00 AS50—1一2 PRE 41 6 1067.79 1038.58 169.00 794.00 1192.00 1512.00 6122.00 PI(D21) 47 0 2421.78 6581.38 202.00 1447.00 2389.00 4010.00 46387,00 Flu—ELD PRE 42 3 960.35 998.67 189.00 561.00 863.50 1706.00 4356.00 PI(D21) 45 0 1509.05 2074.14 211.00 897.00 1452.00 2818.00 11117.00 Flu_YNG PRE 40 6 1681.05 1196.39 225.00 1144.00 1907.50 2611.00 5110.00 PI(D21) 46 0 2687.64 2151.90 830.00 1900.00 2459.50 4241.00 11758.00 CD4- CD40L AS03_1_4 PRE 42 1 967.13 664.97 1.00 842.00 1186.50 1742.00 2748.00 PI(D21) 43 0 1916.56 1502.81 168.00 1353.00 2102.00 3122.00 6538.00 AS03_1_2 PRE 38 1 1060.88 878.50 1.00 891.00 1384.00 1921.00 3398.00 PI(D21) 39 0 2714.74 1519.80 486.00 1957.00 2829.00 4076.00 8038.00 AS03—1一1 PRE 48 1 762.13 1329.02 1.00 645.00 1022.50 1541.00 6797.00 PI(D21) 49 0 2428.54 1856.48 210.00 1862.00 2733.00 3589.00 8809.00 AS25_1_4 PRE 47 0 994.17 865.71 35.00 579.00 1076.00 1912.00 3340.00 PI(D21) 47 0 1982.33 180L26 73.00 1293.00 2055.00 3159.00 9312.00 AS25_1—2 PRE 41 2 1039.63 1062.10 116.00 596.00 1152.00 1715.00 4899.00 PI(D21) 43 0 1998.69 1842.77 309.00 1396.00 1946.00 3459.00 8149.00 AS25 丄 1 PRE 44 0 1048.77 1485.48 145.00 674.00 1108.50 1632.50 8844.00 PI(D21) 44 0 2529.59 2189.87 102.00 1599.50 2763.00 4419.50 9999.00 AS501—4 PRE 41 2 847.56 663.49 95.00 549.00 842.00 1350.00 2588.00 PI(D21) 43 0 1673.39 1043.51 1.00 1413.00 2062.00 2880.00 4884.00 AS5012 PRE 41 6 1037.41 982.61 171.00 799.00 1168.00 1492.00 5650.00 PI(D21) 47 0 2268.52 6584.73 117.00 1447.00 2245.00 3739.00 46410,00 Flu—ELD PRE 42 3 923.98 976.85 110.00 607.00 816.50 1597.00 4296.00 PI(D21) 45 0 1299.05 2034.85 1.00 896.00 1545.00 2818.00 10836.00 Flu—YNG PRE 40 6 1636.72 1186.79 233.00 1068.00 1878.50 2418.00 5088,00 PI(D21) 46 0 2575.50 2169.43 456.00 1862.00 2331.50 4178.00 11718.00 130360.doc -178- 200908994 測試描述群組時間 N Nmiss GM SD Min Q1 中值 Q3 Max CD4- IFNy AS0314 PRE 42 1 721.19 483.64 114.00 475.00 772.00 1142.00 2052.00 PI(D21) 43 0 1394.52 1096.51 347.00 898.00 1305.00 2261.00 5075.00 AS03—1一2 PRE 38 1 712.34 598.18 1.00 566.00 936.50 1412.00 2422.00 PI(D21) 39 0 1894.63 1156.37 581.00 1297.00 2083.00 3016.00 6342.00 AS03J1 PRE 48 1 527.46 1053.96 1.00 395.00 544.00 985.50 6583.00 PI(D21) 49 0 1623.21 1383.09 104.00 1208.00 1652.00 2380.00 6983.00 AS25丄4 PRE 47 0 741.88 643.41 36.00 430.00 770.00 1401.00 2602.00 PI(D21) 47 0 1433.90 1206.49 246.00 861.00 1374.00 2301.00 5754.00 AS25—1一2 PRE 41 2 670.69 656.68 218.00 3S0.00 596.00 1151.00 3664.00 PI(D21) 43 0 1279.87 1279.29 173.00 617.00 1330.00 2402.00 5385.00 AS25」—1 PRE 44 0 597.78 2794.11 1.00 372.50 652.50 1226.00 18946.00 PI(D21) 44 0 1802.95 2189.25 258.00 1133.50 1970.00 3238.00 13164.00 AS50」—4 PRE 41 2 571.79 448.58 134.00 335.00 597.00 945.00 1901.00 PI(D21) 43 0 1325.52 769.76 188.00 936.00 1428.00 1959.00 3841.00 AS50_1_2 PRE 41 6 601.27 513.44 32.00 485.00 743.00 1025.00 2283.00 PI(D21) 47 0 1550.79 6051.21 41.00 1016.00 1624.00 2710.00 42697.00 FluJELD PRE 42 3 584.91 588.62 77.00 396.00 598.00 955.00 2680.00 PI(D21) 45 0 980.97 1396.79 137.00 614.00 876.00 1662.00 6633.00 Flu_YNG PRE 40 6 1156.67 945.24 126.00 731.50 1248.00 2152.50 3774.00 PI(D21) 46 0 1811.65 1618.60 411.00 1162.00 1813.00 2524.00 8432.00 CD4- IL2 AS03丄4 PRE 42 1 805.41 572.67 1.00 683.00 971.50 1429.00 2562.00 PI(D21) 43 0 1563.40 1203.93 296.00 1116.00 1509.00 2516.00 5786.00 AS03—1—2 PRE 38 1 881.32 713.88 1.00 727.00 1191.50 1605.00 2791.00 PI(D21) 39 0 2057.58 1251.53 205.00 1522.00 2184.00 3140.00 7019.00 AS03_1_1 PRE 48 1 640.10 1098.72 1.00 513.50 813.50 1240.50 6391.00 PI(D21) 49 0 1955.75 1528.09 232.00 1407.00 2088.00 2874.00 7173.00 AS25」4 PRE 47 0 864.60 696.78 117.00 557.00 896.00 1612.00 2771.00 PI(D21) 47 0 1629.80 1344.02 330.00 1080.00 1595.00 2504.00 6819.00 AS25_1_2 PRE 41 2 887.73 863.40 275.00 554,00 924.00 1431.00 4256.00 PI(D21) 43 0 1656.36 1486.45 316.00 1128.00 1617.00 2760.00 6311.00 AS25_1_1 PRE 44 0 834.27 755.62 131.00 537.00 877.00 1457.50 4105,00 PI(D21) 44 0 2028.18 1595.73 325.00 1334.00 2044.50 3624.00 7175.00 AS50_1—4 PRE 41 2 690.38 574.37 35.00 466.00 730.00 1132.00 2423.00 PI(D21) 43 0 1533.43 780.68 194.00 1145.00 1477.00 2269.00 3752.00 AS50 丄2 PRE 41 6 831.91 720.68 102.00 620.00 879.00 1221.00 3918.00 PI(D21) 47 0 1862.37 5848.13 158.00 1154.00 1852.00 3278.00 41253.00 Flu ELD PRE 42 3 729.05 856.17 177.00 369.00 716.00 1299.00 3514.00 PI(D21) 45 0 1191.28 1688.15 145.00 620.00 1301.00 2414.00 9166.00 Flu YNG PRE 40 6 1210.88 920.74 138.00 747.00 1308.50 1909.50 3925.00 PI(D21) 46 0 2033.00 1700.20 684.00 1429.00 1940.50 3296.00 9375.00 CD4- TNFa AS03丄4 PRE 42 1 652.51 499.99 1.00 538.00 778.00 1141.00 2037.00 PI(D21) 43 0 1147.97 942.25 126.00 677.00 1251.00 2054.00 4142.00 AS03_1_2 PRE 38 1 755.02 646.69 1.00 607.00 985.00 1429.00 2844.00 PI(D21) 39 0 1596.30 975.22 295.00 1113.00 1695.00 2577.00 4927.00 AS03—1—1 PRE 48 1 550.23 1016.73 1.00 343.50 605.50 1001.00 5709.00 PI(D21) 49 0 1445.35 1172.61 132.00 989.00 1578.00 2128.00 5107.00 AS25 丄 4 PRE 47 0 673.18 622.76 91.00 352.00 673.00 1460.00 2299.00 PI(D21) 47 0 1172.10 1122.07 193.00 722.00 1122.00 1987.00 6086.00 AS25—1—2 PRE 41 2 708.33 761.85 191.00 447.00 730.00 1004.00 3592.00 PI(D21) 43 0 1228.68 1330.12 171.00 671.00 1224.00 2452.00 6334.00 AS251—1 PRE 44 0 693.62 2910.36 116.00 358.00 615.00 1077.00 19515.00 PI(D21) 44 0 1435.67 2242.66 13.00 908.50 1490.00 3017.00 13332.00 AS50丄4 PRE 41 2 538.80 433.49 37.00 331.00 655.00 935.00 1648.00 PI(D21) 43 0 1204.59 698.67 364.00 814.00 1295.00 1934.00 3219.00 AS50 1 2 PRE 41 6 658.48 764.82 75.00 440.00 810.00 1078.00 4501.00 130360.doc - 179- 200908994 測試描述群組時間 N Nmiss GM SD Min Ql 中值 Q3 Max PI(D21) 47 0 1349.54 4822.50 39.00 895.00 1297.00 2514.00 33798.00 Flu_ELD PRE 42 3 558.80 704.36 40.00 326.00 627.00 1189.00 2767.00 PI(D21) 45 0 819.29 1407.45 1.00 543.00 969.00 1694.00 7960.00 Flu_YNG PRE 40 6 1056.84 852.19 221.00 633.00 1129.50 1724.50 3947.00 PI(D21) 46 0 1426.37 1615.23 385.00 852.00 1505.00 2355.00 9378.00 N=具有可用結果之受檢者的數量 Nmiss =具有丢失結果之受檢者的數量 GM=幾何平均 SD=標準偏差 Q1,Q3 =第一及第三四分位數 Min/Max=最小值/最大值細胞介導免疫反應之中間結論在年齡26 5歲之受檢者中，對所有細胞激素組合，就個別差異（D2 1-D0)而言，與F/war/x相比，五種經佐劑化疫苗 (AS03_1_1 、 AS03_1_2 、 AS25_1_1 、 AS50—1_2 及 AS5 0_1_4)對經彙集病毒株誘導顯著更高之CMI反應。在較年輕成年人中，對所有細胞激素組合，就個別差異（第 21天-第0天）而言，與F/war/x相比，三種該等經佐劑化疫苗（AS03_1_1、AS03_1_2及AS25_1_1)亦對經彙集病毒株誘導顯著更高之CMI反應。 XI.6.反應原性局部症狀已使用用於可定量症狀之EMEA及FDA分級來評估在疫苗接種後之7天時期期間，報導所請求局部症狀（任何級別/3級）之受檢者的百分比。 EMEA分級：於斑（任何級別[>0 mm]及3級[>50 mm]); 130360.doc -180- 200908994 疼痛（任何級別）；3級疼痛；充血（任何級別[>0 mm]及3級 [>50 mm])及腫脹（任何級別[>0 mm]) ; 3級腫脹（>50 mm)。 FDA分級：淤斑（任何級另丨J 〇25 mm]及3級[>100 mm])、3級充血（>1〇〇 mm) ; 3級腫脹（>100 mm)，充血（任何級別[2 25 mm]);腫脹（任何級別[225 mm])。全身症狀 EMEA 分級：發熱〇37.5°C)、3 級發熱（>39.0。〇。FDA 分級：發熱（238°C)及3級發熱（>40。〇。在疫苗接種後之7天（第0-6天）時期期間，所報導之任何級別及3級請求及未經請求症狀的總發生率及性質呈現於圖24中。結論與Flu_ELD群組相比，在經佐劑化流感疫苗群組中，報導至少一種全身症狀之受檢者的百分比在統計學上顯著更高，但對Flu_YNG群組（除以外）而言係在相同範圍内。對所有群組而言，報導至少一種3級全身症狀之受檢者的百分比係在相同範圍内。與Flu 一 ELD群組相比在經佐劑化流感疫苗群組中，且與 Flu—YNG群組相比在asm —丨」群組中，報導至少一種症狀之受檢者的百分比在統計學上顯著更高。。邻與Flu—ELD及Flu_YNG群組相比，在as〇3丄^、 AS25丄2、AS'Lmssojj群組中，報導至少二種3 級局部症狀之受檢者的百分比在統計學上顯著更高。 130360.doc • 181 - 200908994 XI.7. —般結論該等資料對適當平衡人群中之免疫反應/不良效應而言係重要的。就HI免疫原性而言，對所有佐劑劑量而言，尤其因 H1N1及H3N2之顯著增加而證明明顯之佐劑效應。對b病毋株而5 ’主要用AS25 1/1’而且用AS03 1/1、AS03 1/2 及AS50 %獲得顯著增加。佐劑之水包油乳液組份展示劑量效應’且對佐劑之MPL組份而言亦如此，儘管後者較為不明顯。就細胞介導之免疫反應而言，在老年人中，對As〇3 1/1、AS03 %、AS25 1/1及AS50 /2之經彙集病毒株（頻率，所有量度）而言’與Fluarix相比，亦證明具有顯著差異之佐劑效應。用AS25 1/1、AS03 1/1及AS03 1/2獲得最高反應。就反應原性而言，經佐劑化疫苗比Fluarix更具反應原性，其與疫苗之水包油乳液組份相關聯；儘管較不顯著，但亦存在MPL之劑量效應。AS03 1/2比AS03 1/1具更小反應原性，同時在該老年人群體中顯示令人滿意之免疫原性概況。【圖式簡單說明】囫1臨床試驗：抗HA抗體在不同時間點之幾何平均效價 (GMT)(免疫原性之ATP組）。圖2臨床試驗：在第0天及第21天，具有95%信賴區間之 HI抗體效價的血清保護率（SPR)(免疫原性之ATP組）。 130360.doc • 182- 200908994 圖3臨床試驗：在第21天，具有95%信賴區間之HI抗體效價的血清轉化率（SCR)(免疫原性之ATP組）。圖4臨床試驗：在第21天，具有95°/。信賴區間之HI抗體效價的血清轉化因子（SCF)(免疫原性之ATP組）。圖5小鼠研究：在經異源亞型病毒株（劑量範圍AS03)預致敏之BALB/c小鼠中之血球凝集素抑制測試（GMT +/-IC95)。圖 5A :抗 A/新嗔裏多尼亞（Caledonia)/20/99 HI 效價；圖 5B :抗 A/巴拿馬（Panama)/2007/99 HI效價。圖 5C ·· 抗B/山東/7/97 HI效價。圖6小鼠研究：在經異源亞型病毒株（劑量範圍AS03)預致敏之C57B1/6小鼠中之血球凝集素抑制測試（GMT +/-IC95)° 圖7小鼠研究：在來自經異源亞型病毒株（劑量範圍 AS03)預致敏之C57B1/6小鼠之PBMC中的細胞免疫反應 (CD4+ T細胞）。圖8小鼠研究：在來自經異源亞型病毒株預致敏且經以劑量範圍AS03佐劑化之低劑量抗原（0.5 pg)免疫之C57B1/6 小鼠的PBMC中之細胞免疫反應（CD4+ T細胞）。圖9小鼠研究：在免疫（GMT +/-IC95)後第14天’對於兩種不同抗原劑量：1.5 pg(A、C及E)或0.38 pg(B、D及F)之 H5N1特異性血清Ig ELISA效價（A及B)及抗H5N1 IgGl(C及 D)及IgG2b(E及F)同型反應。圖10小鼠研究：在免疫（GMT IC95)後第21天’對於兩種不同抗原劑量：i.5料(A)或〇.38 μβ(Β)之血球凝集抑 130360.doc -183- 200908994 制測試（GMT +/- IC95)。圖11小鼠研究：在經不同劑量之以劑量範圍AS03佐劑化之 H5N1 疫苗（1.5 或 0.38 pg) : (a)1.5 pg HA Ag(抗原）或 (B)0.38 pg HA Ag(抗原）免疫之天然C57B1/6小鼠中的細胞免疫反應（CD4+ T細胞）。圖12豬研究。在經同源病毒株（劑量範圍as〇3)預致敏之豬中的血球凝集素抑制測試（GMT +/- IC95)。囷13在經普通或以AS03或AS03/2佐劑化之TIV或QIV免疫之C5 7B1/6天然小鼠中的血球凝集素抑制測試（Gmt +/_ IC95)。圖14在經B/維多利亞類（Victoria-like)病毒預致敏且經普通或以AS03或AS03/2佐劑化之TIV或QIV免疫之C57B1/6小鼠中的血球凝集素抑制測試（GMT +/_ IC95)。圖15人類臨床試驗（佐劑劑量範圍）：在d0及d21時之HI 抗體效價的GMT。囷16人類臨床試驗（成人中之佐劑劑量範圍）：在D〇及 D21時之HI抗體效價的血清保護率（spr)。圓17人類臨床試驗（成人中之佐劑劑量範圍）：圖丨7 a : 在PI(第21天）時之出抗體效價的血清轉化率（SCR);圖 1 7B :每一年齡分類。圓18人類臨床試驗（成人中之佐劑劑量範圍）：圖1 8 A : 在PI(第21天）時之HI抗體效價的血清轉化因子（SCF);圖 1 8B :每一年齡分類。圓19人類臨床試驗（老年人中之佐劑劑量範圍）：在d0及 130360.doc 184· 200908994 d2 1時之HI抗體效價的GMT。蹰20人類臨床試驗（老年人中之佐劑劑量範圍）··在第〇天及第2 1天，具有95%信賴區間之ΗΙ抗體效價的血清保護率（SPR) 〇圖21人類臨床試驗（老年人中之佐劑劑量範圍）：在"（第 2 1天）時之hi抗體效價的血清轉化率（scr)。 ^22人類臨床試驗（老年人令之佐劑劑量範園）：在第21 才八有95/〇 CI之HU几體效價的SCF(免疫原性沿之ATp 組）。圖。人類臨床試驗(老年人中之佐劑劑量範圍卜在D〇及 D21時之㈣集病毒株的細胞激素陽性CD4 T細胞（⑽之 ATP 組）。 =4人類臨床試驗（老年人中之佐劑劑量範圍）：在疫苗症狀(lit t7天期間(第〇·6天”報導相關請求及未經請求广正狀（所有級助級）之受檢者的百分比（總疫苗接種組）。 130360.doc -185- 200908994 序列表 <110>比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 <120>疫苗 <130> VB62342 <140> 097113719 <14 1> 2008-04-15 <150> 0707697.9 ; 0711357.4 ; 0712062.9 : PCT/EP2007/060743 ; 0724651.5 <151> 2007-04-20 ； 2007-06-12 ； 2007-06-21 ； 2007-10-10 ； 2007-12-18 <160> 6 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 合成序列，含未經曱基化CG之序列 <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成序列，含未經曱基化CG之序列 <400> 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 3 <211> 30

<212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成序列，含未經曱基化CG之序列 <400> 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 4 <211> 24 130360.doc 200908994 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>合成序列，含未經甲基化CG之序列 <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成序列，含未經甲基化CG之序列 <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成序列: ，含未經曱基化CG之序列 <400> 6 tcgacgtttt cggcgcgcgc eg 22 130360.doc 2-

Claims

200908994 十、申請專利範圍： 1 . 一種呈、Si 物，其、'、人類用途之劑量體積之免疫原性流感組合 ^包含併與水包油乳液佐劑組合之流感病毒抗原或机原性.杰丨化劑，M ,其中該水包油乳液佐劑包含可代謝油及乳 1 θ且其中該可代謝油係以每該人類劑量低於丨丨 =3直存在’且該乳化劑係以該人類劑量低於5呵之含量存在。士》月求項1之免疫原性組合物，其中該可代謝油為角鯊 3. :請求項1或2之免疫原性組合物’其中該可代謝油係以母人類劑量 0.5-10、0.5_9、^0、2_1〇、4 8、I。、2_ 3、4·5-5.5、5-6 或 9-10 mg 之量存在。 4. 如請求項丄或2之免疫原性組合物，纟中該乳化劑為非離子性界面活性劑。 5·如請求項4之免疫原性組合物，其中該乳化劑為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯或脫水山梨糖醇三油酸酯或兩者之混合物。乙烯脫水聚山梨醇 6.如請求項5之免疫原性組合物，其中該聚氧化山梨糖醇單油酸酯係選自包含以下各者之群：醋80或Tween㊣80,且脫水山梨糖醇三油酸自抓 85 ° 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該乳化劑係以每人類劑量 0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、〇 4 】1 •4_1.2 、 0.5-4 、 1-2、2-3或4-5 mg之量存在。 130360.doc 200908994 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 士 β求項1或2之免疫原性組合物，其中該佐劑另人母育酚、固醇或兩者。 I 3 如D月求項8之免疫原性組合物，其中該母育紛為古酚。用如叫求項8之免疫原性組合物，其中該母育酚係以每人類劑 3： 0.5-12、1-11、2-1〇、4-9、5-6、5-7、2.5-3 5、1 2 1-3或10-11 mg之量存在。如吻求項1或2之免疫原性組合物，其中該佐劑係選自由以下各者組成之群··（i)每人類劑量包含4 5_5 5或5_6 可代謝油、2·3 mg乳化劑，且當存在時5-7 mg母育酚之佐劑；（ii)每人類劑量包含2_3 mg可代謝油、Μ 5叫乳化州’且當存在時2·5_3.5 mg母育紛之佐劑；（出）每人類劑里包含〇·5-1.5 mg可代謝油、0.25-0_75 mg乳化劑，且虽存在時〇.5-l-5mg母育酚之佐劑。如晴求項8之免疫原性組合物’其中該固醇為膽固醇。如睛求項8之免疫原性組合物，其中該固醇係以每人類劑量 0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3 或〇,!25· 0·25 mg(例如 0.2-0.3、0.1-0.15、0.25 或 0.125 mg)之量存在。如睛求項1或2之免疫原性組合物，其中該佐劑另外包含選自以下各者之TLR配位體：TLR-1、TLR-2、TLR-3、 TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9或其組合。如請求項14之免疫原性組合物，其中該TLR-4配位體係選自：脂質A衍生物、胺基烷基葡萄胺糖磷酸酯衍生物 130360.doc 200908994 (AGP)及選自以下各者之群的化合物：ER803022、 ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、 ER804058 、 ER804059 、 ER804442 、 ER804680 及 ER804764 。 16. 如請求項15之免疫原性組合物，其中該脂質a衍生物為 3D-MPL或脂質A之任何合成衍生物。 17. 如請求項15之免疫原性組合物，其中該位體係以每人類劑量 5-60、40-50、1〇_5〇、20-30、5-15、10、 20 ' 30、40或50 pg之量存在。 1 8.如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該佐劑另外包含皂素或其衍生物。 19.如請求項18之免疫原性組合物，其中該皂素或其衍生物為 QS21 。 2 0.如請求項1 8之免疫原性組合物，其中該皂素係以每人類劑量 5-60、40-50、10-50、20-30、5-15、1〇、20、30、 40或50 pg之量存在。 21·如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該病毒抗原或抗原性製劑每流感病毒株每人類劑量為1 5叫或低於丨5 Μ HA。 22_如請求項21之免疫原性組合物，其中該病毒抗原或抗原性製劑每流感病毒株每人類劑量係低於丨〇 ,或低於8 ’或低於4邮’或低於2 pg ΗΑ，或低於1阳ΗΑ，或低於0.5，或低於〇. 1 HA。 23.如請求項21之免疫原性組合物，其中該病毒抗原或抗原 130360.doc 200908994 性製劑每流感病毒株每人類劑量係介於2_7.5 或1 _5 pg 之間的HA。 24.如請求項21之免疫原性組合物，其中該病毒抗原或抗原性製劑每流感病毒株每人類劑量係低於或精確地為5叫 HA，或低於或精確地為2·5 gg，或低於或精確地為ι Mg 0 25·如請求項丨或2之免疫原性組合物，其中該組合物為單價組合物，其包含來自至少一種與大流行病爆發相關聯或具有與大流行病爆發相關聯之潛能之流感病毒株的病毒抗原或抗原性製劑。 2 6.如叫求項1或2之免疫原性組合物，其中該組合物為多價且s物其包含來自至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種流感病毒株之病毒抗原或抗原性製劑。 27. 如請求項26之免疫原性組合物，其中該組合物包含來自至少三種流感季節性（大流行病間期）病毒株之病毒抗原或抗原性製劑，且視情況包含來自至少一種與大流行病爆發相關聯或具有與大流行病爆發相關聯之潛能之流感病毒株的病毒抗原或抗原性製劑。 28. 如請求項26之免疫原性組合物，其中該多價組合物包含選自由以下各者組成之群之病毒抗原或抗原性製劑：（i) 兩種選自以下各者之群之大流行病間期A病毒株：hiN1 及H3N2，及兩種選自以下各者之群之B病毒株：b/山形 (yamagata)及B/維多利亞（Vict〇ria);⑴）三種選自以下各者之群之大流行病間期A病毒株：H1N1&H3N2，及一種 130360.doc 200908994 選自以下各者之群之B病毒株：B/山形及B/維多利亞； (iii)兩種選自以下各者之群之大流行病間期A病毒株：削以出犯，-種大流行病A病毒株，其中該病毒株為 H5N1 ’及-種選自以下各者之群之B病毒株：b/山形及 B/維多利亞。 29. 如請求項25之免疫原性組合物，其中該大流行病流感病毒病毒株係選自由以下各者組成之群：H5N1、H9N2、 H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H2N2、Hl〇N7、H5N2、 H7N2、H7N1 及 H7N3。 30. 如請求項1或2之免疫原性組合物，其令該流感病毒抗原或其抗原性製劑係來自生長在卵或細胞培養物上之流感病毒。 31. 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該流感病毒抗原或其抗原性製劑包含完整病毒、裂解病毒、病毒顆粒或一或多種選自以下各者之純化抗原：HA、NA、M1、 M2 〇 .( 32·如請求項3 1之免疫原性組合物，其中該或該等純化抗原係自生長在哺乳動物、禽類或旯蟲細胞中之流感病毒而製備。 33. 如請求項31之免疫原性組合物，其中該或該等純化抗原係經以重組方式產生。 34. 如請求項丨或2之免疫原性組合物，其中該人類劑量係選自··等於或低於0.5 m卜介於0.5與！·5 mi之間、介於〇 2 與1·2 ml之間、介於0.2與0.7 mi之間，及低於或精確地 130360.doc 200908994 為0.25或〇·5或〇 7或i⑹。種裝備如清求項i至34中任一項之經佐劑化流感疫苗之方法其包含將第-體積之水包油乳液與第二體積之包含流感或其抗原+ 生製#j之水性懸浮液混合之# 驟，其中該第-體積係大於該第二體積。種裏備如明求項i至34中任_項之經佐劑化流感疫苗之方法其包含將大體上相等體積之水包油乳液與包含流感病毒或其抗原性製劑之水性懸浮液混合之步驟。 37. -種製備如請求項㈣令任一項之經佐劑化流感疫苗之方法’其包含將第—體積之水包油乳液與第二體積之包含流感病毒或其抗原性製劑之水性懸浮液混合之步驟其中該帛二體積係大於該第二體積。 381請求項35至37中任一項之方法，其包含稀釋該水包油夜之後將a亥所知稀釋乳液與該流感水性懸浮液混人之步驟。 ° 39· —種疫苗套組，1白冬、咬+、右… ，、包3如—求項21至34中任-項所定義之-感病毒抗原組份或流感病毒抗原性製劑組份外包含用於伴隨或連續投藥之如請求項120中任一項所定義之佐劑。貝 40 一種疫苗’其包含如請求項1至34中任一項之免組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。，、‘ 41 「種製造如請求項4。之疫苗之方法，其包含將如請求項 4中任-項之免疫原性組合物與醫藥、賦形劑混合之步驟。接又之 130360.doc 200908994 η-種如請求項㈣中任一項之免疫原性組合物或如請求項40之疫苗之用途，其係用於製造用以對人類宿主二行免疫以抵抗由流感感染引起之疾病的藥劑。 43. 如請求項42之用途，其中該人類宿主為年齡⑹〇歲之成年人、年齡18-65歲之成年人、年齡65歲或65歲以上之老年人或年齡(Μ8歲之兒童，且該疾病為季節性或大流行病流感感染之任一或兩者。 44. 如請求項42或43之用途，其中該人類宿主為老年人，且該疾病為季節性或大流行病流感感染之任一或兩者。 45. 如請求項丨或2之免疫原性組合物，其係用於醫藥令。 46. 如凊求項i或2之免疫原性組合物，其係用於治療或預防由流感感染引起之疾病。 47. 如請求項40之疫苗，其係用於醫藥中。 48. 如請求項4〇之疫苗，其係用於治療或預防由流感感染引起之疾病。 49. 如請求項46之供使用組合物，其中該組合物能夠在人類中誘導以下反應中之至少一者或至少兩者或所有：⑴與未經佐劑化組合物所獲得之反應相比’可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之經改良CD4 丁細胞免疫反應，（ii)與未I佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之經改良體液免疫反應，與未經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之經改良B記憶細胞反應。 50. 如作求項46之供使用組合物，其中該組合物能夠在人類 I30360.doc 200908994 中誘導以下反應中之至少一者或至少兩者或所有：⑴與其中存在更高量該等佐劑組份之經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之相當 CD4 T細胞免疫反應’（ii)與其中存在更高量該等佐劑I 份之經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之相當體液免疫反應，（⑴）與其中存在更高量該等佐劑組份之經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之相當B記憶細胞反應。 51·如請求項49或50之供使用組合物，其中該CD4 τ細胞免疫反應與誘導交又反應性CD4 T佐劑化子反應有關。 52. 如請求項49或50之供使用組合物，其_該體液免疫反應與誘導交又反應性體液免疫反應有關。 53. —種如請求項！至2〇中任一項所定義之（a)流感病毒抗原或其抗原性製劑及（b)水包油乳液之用途，其係用於製造用以治療或預防由流感感染引起之疾病的免疫原性組合物。 54. 如請求項53之用途，其中該組合物能夠在人類中誘導以下反應中之至少一者或至少兩者或所有：⑴與未經佐劑化組合物所獲得之反應相比’可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之經改良CD4 T細胞免疫反應，（ii)與未經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之經改良體液免疫反應，（iii)與未經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性 130360.doc 200908994 製劑之經改良B記憶細胞反應。 55 ·如請求項53之用途’其中該組合物能夠在人類中誘導以下反應中之至少一者或至少兩者或所有：⑴與其中存在更南量3亥等佐劑組份之經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之相當CD4 丁細胞免疫反應’（11)與其中存在更高量該等佐劑組份之經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之相當體液免疫反應’（丨丨丨）與其中存在更高量該等佐劑組份之經佐劑化組合物所獲得之反應相比，可誘導抵抗該抗原或其抗原性製劑之相當B記憶細胞反應。 56. 如請求項54或55之用途，其中該CD4 丁細胞免疫反應與誘導交又反應性CD4 T佐劑化子反應有關。 57. 如請求項54或55之用途，其中該體液免疫反應與誘導交叉反應性體液免疫反應有關。 58. 如請求項！或2之免疫原性組合物，其適用於治療或預防由流感病原體引起之疾病，該流感病原體為衍生自該免疫原性組合物中抗原之該病原體的變異體。 59. 如請求項4〇之疫苗’其適用於治療或預防由流感病原體引起之疾病’該流感病原體為衍生自該免疫原性組合物中抗原之該病原體的變異體。 6〇· 一種如請求項1至20中任一項所定義之（a)流感病毒抗原或其抗原性製劑及（b)水包油乳液之用途，其係用於製造用以’α療或預防由流感病原體引起之疾病的免疫原性組 130360.doc 200908994 61 62 63 64. 65. 66. 67.68. 合物’該流感病原體為衍生自該免疫原性組合物中抗原之該病原體的變異體。 .如請求項54或55之用途，其係用於保護以抵抗由包含抗原之病原體引起之感染或疾病，該抗原為該免疫原性組合物中彼抗原之變異體。 .如請求項49或50之供使用組合物，其係用於保護以抵抗由包含抗原之病原體引起之感染或疾病，該抗原為該免疫原性組合物中彼抗原之變異體。 .一種免疫原性流感組合物，其係用於對先前經如請求項 1 - 3 4之免疫原性組合物或如請求項4 〇之疫苗進行疫苗接種之個體進行再疫苗接種。一種抗原之用途，其係用於製造用以對先前經如請求項 1 34之免疫原性組合物或如請求項4〇之疫苗進行疫苗接種之個體進行再疫苗接種的免疫原性組合物。如凊求項64之用途，其中該用於進行再疫苗接種之組合物包含與用於先前疫苗接種之該組合物之抗原共用共同之CD4T細胞抗原決定基的流感抗原。如4求項63之供使用組合物，其中該用於進行再疫苗接種之組合物包含與用於先前疫苗接種之該組合物之抗原共用共同之CD4 T細胞抗原決定基的流感抗原。如請求項64或65之用途’其中該用於進行再疫苗接種之抗原或抗原性組合物係經佐劑化的，。如請求項67之用途，其中該佐劑為如請求項1至2〇中任一項所定義之水包油乳液佐劑。 130360.doc •10· 200908994 69.如唄求項53至”、6〇及61中任一項之用途，其中該疾病為選自由以下各者組成之群之人類宿主或人群的季節性或大流行病流感感染其中一者或兩者：年齡為65歲或65 歲以上之老年人類、年齡為18-50歲或18-65歲之成年人、年齡為0-1 8歲之兒童。 130360.doc