TW200821330A - Antibodies against CCR5 and uses thereof - Google Patents

Description

200821330 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗CCR5抗體、其製造方法、含有該等抗 體之醫藥組合物及其用途。 【先前技術】 * 在過去幾年中，對HIV-1用以進入標靶細胞之特定機制 • 的瞭解逐漸增加。其有助於嘗試開發攻擊該過程中之不連 續階段的藥物。近來批准首個靶向進入之藥物用於臨床應 ( 用（恩福韋地（enfuvirtide)，T20 ; Lazzarin，A·等人，N·

Engl. J. Med. 348 (2003) 2186·2195)。恩福韋地為阻斷在 趨化因子受體結合後之階段之融合的肽藥物。 藉由病毒性包膜醣蛋白（Env)與由CD4加上趨化因子受體 組成之細胞受體複合物之間的相互作用而引發HIV-1感染 (Pierson，T.C·&Doms，R.W.，Immuno.Lett.85 (2003) 1 13-118 ; Kilby，J.M·及 Eron，J.J·，N. Engl. J. Med, 348 (2003) 2228-223 8)。Env具有兩個次單位：表面醣蛋白gp 120，其 〇 與細胞CD4受體相互作用且與病毒跨膜次單元gp 41非共價 結合。gp 41銷定gp 120至病毒膜上且亦產生融合。gp 120 . 與CD4結合於細胞上將觸發構型變化，該構型變化暴露或 產生使gp 120能夠與細胞表面趨化因子受體（”輔助受體”) 相互作用之結合部位。趨化因子受體為通常回應趨化因子 (具有趨化性、發炎性及其他功能之較小細胞因子）而傳遞 信號之7跨膜G蛋白偶聯受體（7 TM GPCR)。 臨床應用中之大部分藥物係針對其他7 TM GPCR且因此 124787.doc 200821330 靶向該等分子以阻斷病毒進入為一種過去藥物開發程式的 最成功類型之擴展。HIV-1分離株需要CD4及輔助受體以 便進入且感染細胞。人類CC趨化因子受體CCR5為巨噬細 胞嗜性（R5)株系之辅助受體且在HIV-1之性傳播中起關鍵 作用（Berger，E.A.，AIDS 11 (增刊 A) (1997) 3:16 ; Bieniasz，P.D.及 Cullen，B.R., Frontiers in Bioscience 3 (1998) d44-d58 ; Littman，D.R·，Cell 93 (1998) 677-680)。 人類CCR5(另外命名為"CCR5")被大多數HIV-1主要分離 株使用且為建立且維持感染的關健。此外，對於人類健康 而言，CCR5功能係非必需的。突變體CCR5等位基因 "CCR5 p 32”編碼被截斷之無功能蛋白（Samson, M.等人， Nature 382 (1996) 722-725 ; Dean，M.等人，Science 273 (1996) 1856-1862)。對於突變而言為純合的個體缺乏CCR5 表現且受到強有力地保護免受HIV-1感染。其證明無明顯 的表型後果且對Μ嗜性HIV感染高度抵抗，而雜合子個體 表現出延遲疾病進展（Schwarz，Μ.Κ.及Wells，T.N.，Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347-358)。可能因為 CCR5作為 α趨化因子ΜΙΡ-1α、ΜΙΡ·1β及RANTES之受體屬於高度冗 餘趨化因子網路之一部分，該等趨化因子享有許多重疊功 能且其大多數具有替代受體，所以CCR5之缺乏無明顯不 利後果（Rossi，D.及 Zlotnik，A·，Annu· Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242)。鑑別CCR5為HIV-1輔助受體係基於其配 位體ΜΙΡ-Ια、MIP-Ιβ及RANTES阻斷被R5感染但不阻斷被 R5X4或X4分離株感染之能力（Cocchi，F.等人，Science 270 124787.doc 200821330 (1995) 1811-1815) 〇 CCR5亦為”簇’’趨化因子受體，其主要產生於發炎性反 應期間且控制嗜中性白細胞、巨噬細胞及Τ細胞子集（Τ輔 助Thl及Th2細胞）之募集。舉例而言，Thl反應通常為涉及 有效抗病毒及腫瘤之細胞介導免疫性的反應，而咸信Th2 反應為過敏症之關鍵。因此，該等趨化因子受體之抑制劑 可用作免疫調節劑。對於Thl反應，抑制（例如）包括類風 濕性關節炎之自體免疫中的過度活化反應或對於Th2反 應，減輕哮喘發作或包括異位性皮膚炎之過敏性反應（參 見例如 Schols，D·，Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893 ; Mueller，Α·及 Strange，P.G·，Int. J. Biochem. Cell Biol· 36 (2004) 35-38 ; Kazmierski，W.M.等人，Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278 ; Lehner，T·， Trends Immunol. 23 (2002) 347-351) o

抗 CCR5 抗體為（例如）PRO 140(Olson，W.C.等人，J· Virol. 73 (1999) 4145-4155)及 2D7(Samson，M.等人，J· Biol· Chem. 272 (1997) 24934-24941)。其他抗體為以下文 獻中所提及：WO 2006/103100、US 2004/0043033、US 6,610,834、US 2003/0228306、US 2003/0195348、US 2003/0166870、US 2003/0166024、US 2003/0165988、US 2003/0152913、US 2003/0100058、US 2003/0099645、US 2003/0049251、US 2003/0044411、US 2003/0003440、US 6,528,625、US 2002/0147147、US 2002/0146415、US 2002/0106374、US 2002/0061834、US 2002/0048786、US 124787.doc 200821330 2001/0000241、EP 1 322 332、EP 1 263 791、EP 1 207 202、EP 1 161 456、EP 1 144 006、WO 2003/072766、 WO 2003/066830、WO 2003/033666、WO 2002/083172、 WO 02/22077 、 WO 01/58916 、 WO 01/58915 、 WO 01/43779、WO 01/42308 〇 本發明之目標為提供主要用作AIDS之治療劑的新穎抗 CCR5抗體。 【發明内容】

本發明包含與CCR5結合之抗體，其特徵在於重鏈可變 域包含下式之胺基酸序列：

Gln-Val-Gln-Leu-X0 l-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu_Val-X03-Pro-Ser-Gln-Ser-Leu-

Ser-Ilc-Thr-Cys-Thr-Val-Scr-Gly-Phe-Pro-Lcu-Gly-Ala-Phe-Gly-Val-His-Trp-Val-

Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val-He-Trp-Lys-Gly-Gly-

Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg-He-Thr-Lys-Asp-Asn-

Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu-Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala- X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-

Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser, 其中 X01 為 Lys 或 Gin， X02為 Gin或 Glu， X03 為 Arg 或 Lys， X04為 Leu或 Pro， X05 為 Met或 Lys， X06為 lie或 Thr， X07為 Ser或 Thr， X08 為 lie 或 Thr (SEQ ID NO:l)。 124787.doc 200821330 該抗體之特徵較佳在於，該抗體之輕鏈可變域包含下式之 胺基酸序列：

Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Glu-Thr-Val-

Thr-Ue-Thr-Cys-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-XlO-His-Gly-Tyr-Leu-Ala-Trp-Xll-Gln-

Gln-Lys-X12-Gly-Lys-X13-Pro-X14-Leu-Leu-X15-Tyr-Asn-Thr-Lys-Thr-Leu-

Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-X16-Phe-X17- X18-X19-Ile-X20-Ser-X21-Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr-Tyr-Cys-Gln-

His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-X24-Glu-De-Lys , 其中 X10 為 lie 或 Ala， Γ' Xll 為 Phe或 Tyr， X12 為 Gin或 Pro， X13 為 Ser 或 Ala， X14 為 Gin 或 Lys， X15 為 Val 或 lie， X16 為 Gin或 Asp， X17為 Ser或 Thr， X18 為 Leu或 Ala， l X19 為 Lys 或 Thr， X20為 Asn或 Ser， X21 為 Leu或 Ala， X22 為 Gly 或 Ala， X23 為 Asn或 Thr， X24 為 Leu或 Val (SEQ ID NO: 2)。 該抗體之特徵較佳在於屬於人類IgG4同種型或人類IgGl 124787.doc -10- 200821330 同種型，該IgGl同種型視情況在鉸鏈區中^“與匸以之間 的胺基酸位置216-240處及/或在第二域間區中Ch2與Ch3之 間的胺基酸位置321331處加以修飾。 本叙明之一較佳實施例為一種包含本發明之抗體的醫藥 組合物。 本發明之一較佳實施例為本發明之抗體用於製造醫藥組 合物的用途。 本發明之一較佳實施例為一種製造包含本發明之抗體之 醫藥組合物的方法。 本發明之一較佳實施例為一種編碼能夠連同第二多肽一 起裝配之多肽的核酸，藉此該第二多肽包含選自SEQ ID NO: 2、5之多肽之群的多肽且因此該多肽包含化卩id N〇: 1、6、7或8之胺基酸序列。 本發明之一較佳實施例為一種治療患有免疫抑制性疾病 之患者的方法，其特徵在於向患者投與治療有效量之本發 明之抗體。 本發明之抗體之特徵較佳在於，該抗體與CCR5結合且 包含選自可變域之群的可變重鏈或輕鏈域，該等可變域包 含SEQ ID NO: 6、7、8之重鏈可變域、SEQ ID NO: 9、1〇 之輕鏈可變域或其CCR5結合片段。 本發明之抗體之特徵較佳在於含有選自SEq ID NO: 6、 7或8之重鏈可變域或其CCR5結合片段之群的重鏈可變域 作為重鏈可變域，且含有選自SEq ID NO: 9或10之輕鏈可 變域或其CCR5結合片段之群的輕鏈可變域作為輕鏈可變 124787.doc -11 - 200821330 域，其中該等重鏈及輕鏈可變域彼此獨立選取。 本發明之抗體之特徵較佳在於，該重鏈可變域包含選自 由SEQ ID NO: 6、7、8之重鏈可變域胺基酸序列組成之群 的胺基酸序列，更確切地說該抗體包含選自SEQ ID NO: 6、7或8之重鏈可變域或其CCR5結合片段之胺基酸序列。 本發明之抗體之特徵較佳在於，該輕鏈可變域包含選自 由SEQ ID NO·· 9、10之輕鏈可變域胺基酸序列組成之群的 胺基酸序列，更確切地說該抗體包含選自SEQ ID NO: 9或 10之輕鏈可變域或其CCR5結合片段之胺基酸序列。 本發明之抗體之特徵較佳在於該等恆定區（輕鏈及重鏈） 具有人類來源。該等恆定區（鏈）為目前的先進技術所熟知 且（例如）由Kabat描述（參見例如j〇hnson，〇及Wu，T.T·，

Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)。舉例而言，適用 之人類重鏈恆定區包含獨立選自由SEQ ID NO: 3、4組成 之群的胺基酸序列。舉例而言，適用之人類輕鏈恆定區包 含SEQ ID NO: 5之κ輕鏈恆定區的胺基酸序列。另外較佳 為，抗體來源於小鼠且根據Kabat包含小鼠抗體之抗體可 變序列框（參見例如 Johnson，G·及 Wu，T T，Nucleic Acids

Res. 28 (2000) 214-218)。 該等抗體抑制人類CCR5之一或多種功能，諸如與（：(：115 之配位體結合性、信號轉導活性（例如哺乳動物G蛋白之活 化、誘導胞内游離Ca2+濃度快速且瞬時增加及/或刺激細胞 反應（例如趨化性、胞泄作用或由白血球釋放之發炎性介 體之刺激、整合素活化））。該等抗體抑制rantes、Mip_ 124787.doc -12- 200821330 Ια、ΜΙΡ-ΐβ及/或HIV與人類CCR5之結合性且抑制由人類 CCR5所介導之功能，如白血球運輸、HIV進入細胞、T細 胞活化、發炎性介體釋放及/或白血球脫粒。 在檢定中本發明之抗體與人類CCR5特異性結合且抑制 與標靶細胞之HIV融合，該檢定包含使該等標靶細胞與抗 體在病毒存在下以在4.0 pg/ml或更低之IC5G值下有效抑制 病毒與該細胞之間的膜融合之抗體濃度接觸。 本發明之抗體與CCR5特異性結合且以1.5 pg/ml或更 低、較佳0.3 pg/ml或更低之IC5G值抑制共表現CCR5及CD4 多肽之第一細胞與表現HIV env蛋白之第二細胞之間的膜 融合。 在包含使該標靶細胞與抗體在RANTES、ΜΙΡ-1α及/或 1^11?-10存在下以1.5 08/1111或更低之1(^5()值接觸的檢定中， 本發明之抗體與CCR5特異性結合且抑制標靶細胞中之細 胞反應的刺激（較佳抑制遷移）。 本發明之抗體較佳在以至多100 pg/ml之抗體濃度與 CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR6 及 CXCR4 之結合檢定 中並不抑制趨化因子結合。 本發明之抗體較佳以至多50 pg/ml之抗體濃度並不刺激 表現CCR5及Galphal6之CHO細胞内所偵測到之細胞内Ca2+ 增加。 本發明之抗體較佳屬於人類同種型IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4，藉此較佳為IgGl或IgG4。 本發明之抗體較佳屬於IgG4同種型。本發明之抗體較佳 124787.doc -13· 200821330 屬於IgGl同種型。本發明之抗體較佳屬於具有突變S228p 之IgG4同種型。本發明之抗體（亦即重鏈及輕鏈恆定區）屬 於在鉸鏈區中CH1與CH2之間的約胺基酸位置216-24〇處、 較佳約胺基酸位置220-240處（Angal，S.等人，Mol. Immunol· 30 (1993) 105-108)及/或在第二域間區中^以與 CH3之間的約胺基酸位置327_331處（根據Kabat編號，參見 例如 Johnson，G.及 Wu，T.T·，Nucleic Acids Res· 28 (2000) 214-218)經修飾的igG14IgG4同種型。該等修飾降低或避 免效應功能（ADCC及/或CDC)。可藉由將抗體之重鏈恆定 區及輕鏈恆定域交換為來自所需類之抗體（如IgG1突變體 或IgG4)之重鍵丨亙定區及輕鍵怪定域而進行igG類之轉換。 該等方法為目前的先進技術所熟知。 本發明之抗體之特徵較佳在於屬於在L234(在胺基酸位 置 234 處之白胺酸）、L235、D270、N297、E318、K320、 K322、P331及/或P329(根據EU索引編號）中含有至少一種 突變的人類子類IgGl。該抗體較佳屬於包含突變L234A(在 胺基酸位置234處丙胺酸代替白胺酸）及L235A之人類IgGl 同種型。本發明之抗體之特徵較佳在於屬於在位置8228處 含有突變之人類IgG4同種型。 因此在一態樣中本發明係關於抗體，其特徵在於該等抗 體結合CCR5，含有源自於人類之Fc部分且並不結合人類 補體因子Clq及/或活化補體因子C3。該等抗體較佳展示與 人類Fey受體之低結合性或並不與人類Fey受體結合。 本發明進一步包含一種根據本發明編碼抗體鏈、可變域 124787.doc •14- 200821330 或其CDR之核酸分子。經編碼之多肽能夠與個別其他抗體 鏈一起裝配以產生本發明之抗CCR5抗體分子。 本發明進一步提供含有本發明之該核酸且能夠在原核或 真核宿主細胞中表現該核酸的表現載體且提供含有該等載 體之宿主細胞用於重組製備該抗體。 本發明進一步包含一種包含本發明之載體的原核或真核 ' 宿主細胞。 本發明進一步包含一種製造本發明之重組人類或人類化 1 抗體的方法，其特徵在於在原核或真核宿主細胞中表現本 發明之核酸且自該細胞或細胞培養物上清液中回收該抗 體。本發明進一步包含可由該重組方法獲得之抗體。 本發明之抗體展示對於需要CCR5靶向治療之患者的益 處。本發明之抗體具有有益於患有該疾病（尤其患有免疫 抑制，尤其患有HIV感染）之患者的新穎及創造性特性。 本發明進一步提供一種治療患有免疫抑制（尤其患有hiv 〇 感染）之患者的方法，其包含向診斷為具有該疾病（且因此 需要該治療）之患者投與有效量之本發明之與CCR5結合的 抗體。較佳以醫藥組合物形式投與該抗體。 ， 本發明進一步包含本發明之抗體作為藥物的用途，其用 - 於療免疫抑制性疾病（較佳用於治療HIV感染）、用於治 療患有免疫抑制之患者且用於製造本發明之醫藥組合物。 此外，本發明包含一種用於製造本發明之醫藥組合物的方 法。 本發明進—步包含—種含有醫藥學上有效量之本發明之 124787.doc -15- 200821330 抗體及視情況連同適用於抗體之調配物之緩衝劑及/或佐 劑用於醫藥目的的醫藥組合物。 本u進纟冑供在醫藥學上可接受之載劑巾包含該等 抗體的醫藥組合物。在一實施例中，該醫藥組合物可包括 於製品或套組中。 因此，本發明之一態樣為適用作藥物之本發明之抗體。 ‘ I發明之另~態樣為適用於治療免疫抑制性疾病之本發明 ( 《抗體。—恶樣亦為本發明之抗體s於製造用以治療免疫 抑制性疾病之藥物的用途。 【實施方式】 術語”抗體”涵蓋各種形式之抗體結構，包括（但不限於） 全抗體及抗體片段。本發明之抗體較佳為人類化抗體、嵌 口抗體、或進一步遺傳工程化之抗體，只要可保持本發明 之特性。 抗體片段’’包含全長抗體之一部分（較佳其可變域）或至 〇 少其抗原結合部位。抗體片段之實例包括雙功能抗體 (diabodies)、單鏈抗體分子、免疫毒素、及由抗體片段形 成之多特異性抗體。例如Huston，J.S·，Methods in

Enzymoh 203 (1991) 46-88中描述scFv抗體。此外，抗體 • 片段包含具有Vh域特徵（亦即能與Vl域一起裝配），或具有 與CCR5結合之vL域特徵（亦即能與Vh域一起裝配成一個功 能性抗原結合部位），因此提供抑制與標靶細胞之膜融合 或HIV融合之特性的單鏈多肽。 如本文中所用’術語"單株抗體，，或，，單株抗體組合物，，係 124787.doc -16 - 200821330 指單一胺基酸組合物之抗體分子製劑。術語，，嵌合抗體，，係 指包含一個來自小鼠之可變域（亦即結合區域）及至少一部 分之恆定區源自不同來源或物種之單株抗體，其通常由重 組DNA技術製備。包含一個小鼠可變域及一個人類怪定區 之嵌合抗體尤其較佳。該等小鼠/人類嵌合抗體為表現包 含編碼小鼠免疫球蛋白可變域之DNA片段及編碼人免疫球 蛋白恆定區之DNA片段之免疫球蛋白基因的產物。本發明 所涵蓋之其他形式之”嵌合抗體”為種類或子類由最初抗體 之種類或子類經修飾或改變之嵌合抗體。該等”嵌合”抗體 亦稱為”種類轉換抗體”。產生嵌合抗體之方法涉及此項技 術中熟知之習知重組DNA及基因轉染技術。參見例如

Morrison，S.L·等人，Proc· Natl. Acad· Sci· USA 81 (1984) 685 1-6855 ;美國專利第 5,202,238號及第 5,204,244號。 術語”人類化抗體”係指構架及/或”互補判定區"（cdr)經 修飾以包含與親本免疫球蛋白之物種相比不同的物種之免 疫球蛋白之CDR的抗體。在一較佳實施例中，將小鼠CDR 移植到人類抗體之構架區中以製備”人類化抗體”。參見例 如 Riechmann，L·等人，Nature 332 (1988) 323-327 ；及

Neuberger，M.S.等人，Nature 314 (1985) 268-270。尤其較 佳CDR相當於彼等表現識別該等上述對於般合及雙官能抗 體之抗原之序列的CDR。 如本文中所用，術語”與CCR5結合”意謂在基於細胞之 活體外ELISA檢定（CCR5表現性細胞，例如經轉型之ch〇 細胞’ L1.2細胞）中抗體與CCR5結合。若抗體在1〇〇 ng/ml 124787.doc •17· 200821330 之抗體濃度下產生5或更大、較佳1〇或更大之S/N(信號/雜 音）比，則發現存在結合性。 如本文中所用，術語”7跨膜趨化因子分子結構，，係指 CCR5當定位於細胞膜雙層中時所展示之天然結構（參見例 如 Oppermann，M·，Cell· Sig. 16 (2004) 1201-121〇)。如其 他G蛋白偶聯受體（例如G蛋白偶聯受體lb)一樣，^^以係 由細胞外N末端域、跨膜域及細胞質c末端域組成。該跨 膜域由7個由3個細胞質片段及3個胞外片段連接之疏水性 跨膜片段組成。本發明之抗體與CCR5結合於其7跨膜趨化 因子分子結構中。 術語”抗原決定基”表示能夠與抗體特異性結合之蛋白質 決定子。抗原決定基通常由分子之化學活性表面分組（諸 如胺基酸或糖侧鏈）組成且抗原決定基通常具有特定三維 結構特性以及荷質比特徵。區分構形抗原決定基與非構形 抗原決定基在於在變性溶劑存在下與前者（而非後者）之結 合消失。本發明之抗體較佳與天然CCR5特異性結合但不 與變性CCR5特異性結合。 術語"膜融合，，係指共表現CCR5&CD4#肽之第—細胞與 表見HIV env蛋白之第一細胞之間的融合。由螢光素酶報 導體基因檢定來測定膜融合。 術浯’’抑制與標靶細胞之HIV融合"係指抑制在檢定中所 量測之與標靶細胞的HIV融合，該檢定包含使標靶細胞與 抗體在該病毒存在下以有效抑制病毒與該細胞之間的膜融 合之抗體濃度接觸且量測螢光素酶報導體基因活性。 124787.doc -18- 200821330 如本文中所用，"可變域"（輕鏈可變域（Vl)、重鏈可變域 (vH))表*直接涉及抗體與抗原結合之各成對輕鏈及重鏈 域。該等輕鏈及重鏈可變域具有相同通用結構且各域包含 4個序列普遍保守且由3個"高變區，，（或互補判定區cDR)連 接之構木區（FR)。構架區採用β片構形且該等cDr可形成 連接β片結構之環。各鏈中之CDR藉由構架區保持其三維 結構且與來自其他鏈之CDR—起形成抗原結合部位。抗體 之重鏈及輕鏈CDR3區域對本發明之抗體之結合特異性/親 和力具有特別重要的作用且因此成為本發明之另一目標。 本發明之抗體之特徵較佳在於，該抗體包含選自由以下 可變域組成之組合之群的重鏈可變域及輕鏈可變域： a) 由SEQ ID NO: 6之胺基酸序列所定義之重鏈可變域及 由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列所定義之輕鍵可變域； b) 由SEQ ID NO: 6之胺基酸序列戶斤定義之重鏈可變域及 由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列所定義之輕鏈可變 域； c) 由SEQ ID NO: 7之胺基酸序列所定義之重鏈可變域及 由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列所定義之輕鏈可變域； d) 由SEQ ID NO: 7之胺基酸序列所定義之重鏈可變域及 由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列所定義之輕鏈可變 域； e) 由SEQ ID NO: 8之胺基酸序列所定義之重鏈可變域及 由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列所定義之輕鏈可變域； f) 由SEQ ID NO: 8之胺基酸序列所定義之重鏈可變域及 124787.doc -19- 200821330 由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列所定義之輕鏈可變 域。 術語’’抗體之抗原結合部分’’當本文中所用時係指引起抗 原結合之抗體的胺基酸殘基。抗體之抗原結合部分包含來 自’’互補判定區n4nCDR’’之胺基酸殘基。’’構架n4"FRn區 ' 域為彼等除如本文中所定義之高變區殘基以外的可變域區 • 域。因此，抗體之輕鏈及重鏈可變域包含來自N至C末端 之該等域 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。 1 重鏈之CDR3尤其為最促使抗原結合且限定抗體特性之區 域。根據 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD，Publication No· 91-3242 (1991)之標準定義及/或彼等來自n高變環•’之 殘基來確定CDR及FR區域。 如本文中所用，術語”核酸π或”核酸分子”意欲包括DNA , 分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股DNA，但較佳

U 為雙股DNA。 如本申請案中所用術語”胺基酸”表示天然存在之羧基α - 胺基酸之群，其包含丙胺酸（3字母代碼：ala，1字母代 ， 碼：A) '精胺酸（arg，R)、天冬醯胺酸（asn，N)、天冬胺 酸（asp，D)、半胱胺酸（cys，C)、麩醯胺酸（gin，Q)、糙胺 酸（glu，E)、甘胺酸（gly，G)、組胺酸（his，H)、異白胺酸 (ile，I)、白胺酸（leu，L)、離胺酸（lys，K)、甲硫胺酸 (met，M)、苯丙胺酸（phe，F)、脯胺酸（pro，P)、絲胺酸 124787.doc -20- 200821330 ’ S)、蘇胺酸咖，T)、色胺酸(呻，W)、酪胺酸 (tyr ’ Y)及纈胺酸（vah v)。 核酸當處於與另—核酸之功能關係中時為"可操作連接 、牛例而σ右別序列或促分泌前導區之DNA表現為 參與多肽分泌之前蛋白’則其可與多肽之DNA可操作連 # 啟動子或增強子影響序列轉錄，則其可與編碼序列 可操作連接，或若核糖體結合部位經定位使得有助於轉 ()#，則其可與編碼序列可操作連接。-般而言，"可操作 4接”意謂所連接之DNA序列為共線的且在促分泌前導區 之情況下為鄰接的且處於閱讀框架内。然而，增強子不必 為鄰接的。藉由在適當限制性部位上進行接合反應來實現 連接。若該等部位不存在，則根據習知實務使用合成寡核 苷酸銜接子或連接子。 如本文中所用，詞句，，細胞"、"細胞株"及，，細胞培養物，， 可互換使用且所有該等名稱包括子代。因此，字詞"轉型 C； 子及轉型細胞’’包括在不考慮轉移數目情況下之初始受 檢者細胞及由此衍生之培養物。亦瞭解所有子代由於蓄意 或偶然性突變而不可能在DNA含量上精確相同。包括具有 與最初轉型細胞中所篩檢相同之功能或生物活性的異變體 . 子代。 抗體之”Fc部分，，不直接涉及抗體與抗原之結合，但顯示 各種效應功能。視其重鏈之恆定區之胺基酸序列而將抗體 或免疫球蛋白分成以下各類：IgA、IgD、IgE、igG及

IgM，且若干該等類可進一步分成子類（同種型），例如IgG 124787.doc -21 - 200821330 分成 IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4，IgA 分成 IgAl 及 IgA2。根 據重鏈恆定區，將不同類之免疫球蛋白分別稱作α、δ、 ε、γ及μ。本發明之抗體較佳屬於IgG型。 如本文中所用，術語”源自於人類來源之Fc部分π表示屬 於子類IgG4之人類抗體之Fc部分或子類IgGl、IgG2或IgG3 之人類抗體之Fc部分的Fc部分，包括其突變形式。子類 IgGl、IgG2或IgG3之人類抗體之Fc部分較佳以此方式經修 飾使得相對於未經修飾之Fc部分可偵測到如以下所定義之 FcY受體（FcYR，亦即FcyRIIIa)結合性降低或無FcY受體結 合性及/或Clq結合性降低或無Clq結合性。’’抗體之Fc部分’’ 為熟習此項技術者所熟知之術語且基於抗體之番木瓜蛋白 酶裂解而加以定義。本發明之抗體含有充當Fc部分之源自 人類來源之Fc部分且較佳含有人類恆定區之所有其他部 分。Fc部分較佳為人類Fc部分且尤其較佳來自人類IgG4子 類或來自人類IgGl子類或來自人類IgGl子類之突變Fc部 分。最佳為展示於SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、具有突 變 L234A及 L23 5A之 SEQ ID NO·· 3、具有突變 S228P之 SEQ ID NO: 4中之Fc部分及重鏈恆定區。 儘管IgG4展示FcY受體（FcyRIIIa)結合性降低，但其他 IgG子類之抗體展示較強結合性。然而pr〇238、Asp265、 Asp270、Asn297(缺失 Fc醣）、Pro329、Leu234、Leu235、 Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、 Gln311、Asn434及His435為（若改變）亦提供Fc受體結合性 降低之殘基（Shields，R.L·等人，J. Biol· Chem. 276 (2001) 124787.doc -22- 200821330 6591-6604 ; Lund，J.等人，FASEB J. 9 (1995) 1 15-1 19 ； Morgan，A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ; EP 〇 307 434)。本發明之抗體較佳與IgG4子類或IgGl或IgG2子 類之Fey受體結合有關，在S228、L234、L23 5及/或D265處 具有突變且/或含有PVA236突變。較佳為該等突變 S228P、L234A、L235A、L235E 及 / 或 PVA236(PVA236 意 謂來自IgGl之胺基酸位置233至236之胺基酸序列ELLG(以 1字母胺基酸代碼給出）或IgG4之EFLG經PVA置換）。尤其 較佳為該等突變IgG4之S228P及IgGl之L234A、L235A。

抗體之Fc部分與ADCC(抗體依賴性細胞介導型細胞毒 性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）直接有關。藉由使補體因 子Clq與大多數IgG抗體子類之Fc部分結合來引發補體活化 (CDC)。藉由限定蛋白_蛋白在所謂之結合部位處相互作用 而引發Clq與抗體的結合。該等Fc部分結合部位為目前的 先進技術所已知且例如藉由以下文獻進行描述：Lukas， T.J.等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ; Brunhouse， R·及 Cebra，J.J·，Mol. Immunol· 16 (1979) 907-917 ; Burton， D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen，J.E·等 人，Mol· Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie，E.E.等 人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh, M.等 人，J. Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan，A.等人， Immunology 86 (1995) 319-324 ;及 EP 0 307 434 ° 該等 Fc 部分結合部位以（例如）胺基酸L234、L235、D270、 N297、E318、K320、K322、P331 及 P329(根據 Kabat 之 EU 124787.doc -23- 200821330 索引編號）為特徵。子類IgGl、IgG2及IgG3之抗體通常展 示包括Clq及C3結合之補體活化，而IgG4並不活化補體系 統且並不結合Clq及C3。 亦即，在需要ADCC及/或CDC之情況下，IgGl子類之Fc 部分為較佳，在需要低ADCC及/或CDC或不需要ADCC及/ 或CDC之情況下，；[gG4子類或經修飾/突變之IgGl子類之 Fc部分為較佳。在一態樣中，本發明涉及一種結合CCR5 且展示與受體及/或補體因子Clq之低結合性或並不結 合FcY受體及/或補體因子ciq的抗體。不結合Fc受體及/或 補體因子Clq之抗CCR5抗體並不引發抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性（Cdc)，而展示與Fc受 體及/或補體因子C 1 q之低結合性之抗CCR5抗體展示低 ADCC及/或CDC。該抗體之特徵較佳在於，其結合 CCR5，含有源自人類來源之fc部分且並不結合以受體及/ 或補體因子Clq或展示Fc受體及/或補體因子Clq之低結合 性。該抗體更佳為人類或人類化抗體或T細胞抗原耗盡 (depleted)之抗體。可根據 idusogie，E.E·等人，J. lmmunol. 164 (2000) 4178-4184量測Clq結合性。若在該檢定中在 492-405 nm下測試抗體之光學密度（〇D)低於未經修飾野生 型抗體Fc部分在8 pg/ml之抗體濃度下之人類ciq結合性之 值的15%，則說明無”Clq結合性”。低”Clq結合性，，處於未 經修飾野生型抗體Fc部分在相同條件下之人類Clq結合性 之值之15%至30。/。的範圍内。可將ADCC量測為抗體與人類 FcyRIIIa於人類NK細胞上之結合性。在2〇 gg/mi之抗體濃 124787.doc -24- 200821330 度下測定結合性。’’無Fey受體結合性”或”無ADCC”意謂在 20 pg/ml之抗體濃度下與人類IgGl(SEQ ID NO·· 3)相同之 抗體之結合性相比與人類FcyRIIIa於人類NK細胞上至多 30%的結合性。M&Fcy受體結合性”或”低ADCC’，意謂與人 類IgGl(SEQ ID NO: 3)相同之抗體之結合性相比與人類 FcyRIIIa於人類NK細胞上30%至多60%的結合性。 本發明之另一態樣為一種結合CCR5以及結合Fey受體及/ 或補體因子Clq之抗體。結合Fc受體及/或補體因子Clq之 抗CCR5抗體引發抗體依賴性細胞毒性（ADCC)及/或補體依 賴性細胞毒性（CDC)。該抗體之特徵較佳在於，其結合 CCR5，含有源自人類來源之Fc部分且亦結合Fc受體及/或 補體因子Clq。該抗體更佳為人類或人類化抗體或τ細胞抗 原耗盡之抗體。可根據Idusogie，E.E.等人，J. Innnunol. 164 (2000) 4178-4184量測Clq結合性。可將ADCC量測為 抗體與人類FcyRIIIa於人類NK細胞上之結合性。在20 Kg/ml之抗體濃度下測定結合性。 此外，本發明之抗體包括該等具有”保守序列修飾"（變 異體抗體）、核苷酸及胺基酸序列修飾之抗體，該尊修飾 並不影響或改變本發明之抗體的上述特徵。可藉由在此項 技術中已知之標準技術（諸如定點突變及PCR介導型突變） 引入修飾。保守胺基酸取代基包括胺基酸殘基經具有相似 側鏈之胺基酸殘基置換的取代基。具有相似侧鏈之胺基酸 殘基家族已在此項技術中所定義。該等家族包括具有鹼性 側鏈之胺基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈 124787.doc -25 - 200821330 之胺基酸（例如天冬胺酸、麵胺酸）、無電荷極性側鏈之胺 基酸（例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇 胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈之胺基 酸（例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、 苯丙胺酸、甲硫胺酸）、β支鏈側鏈之胺基酸（例如蘇胺酸、 纈胺酸、異白胺酸）及芳族側鏈之胺基酸（例如酪胺酸、苯 丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。因此，在人類抗CCR5抗體中 經預測之非必需胺基酸殘基可較佳經另一來自相同側鏈家 族之胺基酸殘基置換。因此”變異體”抗CCR5抗體本文中 係指一種在胺基酸序列上與”親本”抗CCR5抗體之胺基酸 序列不同的分子，不同之處在於在親本抗體之一或多個可 變區中至多10個、較佳約2個至約5個添加、缺失及/或取 代。可藉由基於如由Riechmann，L·等人，Nature 332 (1988) 323_327及 Queen，C.等人，Proc· Natl· Acad. Sci· USA 86 (1989) 10029_10033所描述之分子模型化之突變進 行胺基酸取代。 本發明之另一實施例為一種製造不結合Fey受體及/或 Clq或展示與FcY受體及/或Clq低結合性之抗CCR5抗體的 方法’其特徵在於編碼與CCR5結合之人類igGl型抗體之 重鏈之核酸序列以此方式經修飾使得該經修飾抗體不結合 Clq及/或Fey受體或展示Clq及/或Fey受體之低結合性，將 該經修飾核酸及編碼該抗體之輕鏈之核酸插入表現載體 中，將該載體插入真核宿主細胞中，使經編碼之蛋白表現 且自宿主細胞或上清液中回收。該抗體較佳藉由，，類轉換” 124787.doc -26- 200821330 來修飾，亦即Fc部分之改變或突變（例如。⑴至“以及/或 IgGl/IgG4 突變），較佳定義為 IgGlvl (ρνΑ·236 ; GLPSS331) 、 IgGlv2 (L234A ; L235A) 、 IgGlv3 (S228P ; L235E)、IgGlx (S228P)、IgG4vl (PVA-236)。GLPSS331 意謂突變 E233P、L234V、L235A、AG236、A327G、 A330S 、 P331S 。 本文中將相對於序列之一致性或同源性定義為在比對序 列且引入間隙（必要時）以實現最大百分數序列一致性之後 候選序列中與親本序列一致之胺基酸殘基的百分數。抗體 序列中無N末端、無C末端或内部延伸、缺失或插入將被 視為影響序列一致性或同源性。該變異體保持結合人類 CCR5之能力且較佳具有優於親本抗體之彼等特性的特 性。舉例而言，該變異體可在治療期間具有低副作用。 本文中”親本”抗體為一種由用於製備變異體之胺基酸序 列編碼的抗體。該親本抗體較佳具有人類構架區且（若存 在）具有人類抗體恆定區或人類抗體恆定域。舉例而言， 该親本抗體可為人類化或人類抗體。 較佳藉由重組方法產生本發明之抗體。該等方法為目前 :先進技術中所普遍熟知且包含於原核及真核細胞；蛋： 貝表現’然後分離抗體多肽且通f純化至醫藥學上可接受 之純度。對於蛋自f表⑽言，將編碼輕鏈及重鏈之 或其片段藉由標準方法插入表現載體中。於適當原核或： 核宿主細胞（諸如CH0細胞、祖細胞、PER C 細 細胞，/〇細胞、HEK 293細胞、⑽細胞= 124787.doc -27- 200821330 桿菌（Ε· coli)細胞）中進行表現且自該等細胞中（自上清液中 或在細胞分解之後）回收抗體。 抗體之重組製備為目前的先進技術中所熟知且（例如）描 述於以下綜論中：Makrides，S_C·，Protein Expr· Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse，S.等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ； Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160 ; Werner，R.G·，Arzneimittelforschung-Drug Res. 48 (1998) 870-880 〇 該等抗體可以全細胞、細胞溶胞物或以部分純化或大體 上純化形式存在。藉由標準技術（包括鹼/SDS處理、CsCl 顯帶（banding)、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及其他在此項 技術中所熟知之技術）進行純化以便除去其他細胞組份或 其他污染物（例如其他細胞核酸或蛋白質）。參見Ausubel， F.等人，（編）Current Protocols in Molecular Biology，

Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。 NS0細胞中之表現由（例如）Barnes，L.M·等人， Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ; Barnes，L.M·等人， Biotech· Bioeng. 73 (2001) 261-270描述。瞬時表現由（例 如）Durocher，Υ·等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9描 述。可變域之選殖由Orlandi，R·等人，Proc. Natl. Acad· Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter，P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ； Norderhaug, L. 等人，J. Immunol· Methods 204 (1997) 77-87描述。較佳瞬 124787.doc • 28 · 200821330 時表現系統（HEK 293)由 Schlaeger，Ε.-J·及 Christensen，Κ· 於 Cytotechnology 30 (1999) 71-83 中且由 Schlaeger，E _j.， 於 J· Immunol· Methods 194 (1996) 191-199 中描述。 藉由習知免疫球蛋白純化程序（諸如蛋白質A_瓊脂糠 法、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、滲析或親和性層析）以 適當方式自培養基中分離單株抗體。編碼單株抗體之DN A 及RNA易於使用習知程序分離且測序。融合瘤細胞可充當 该DNA及RNA之來源。一旦分離後，可將DNA插入表現載 體中’隨後將該等表現載體轉染於不另外產生免疫球蛋白 之宿主細胞（諸如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞） 中以於宿主細胞中實現重組單株抗體之合成。 藉由將適當核苷酸變化引入編碼抗體之DN A中或藉由肽 合成來製備人類CCR5抗體之胺基酸序列變異體。然而， 僅可在（例如）如上所述之極有限範圍内進行該等修飾。舉 例而言’該等修飾並不改變上述抗體特徵，諸如IgG同種 型及抗原決定基結合性，但可改良重組製備之產率、蛋白 質穩定性或有助於純化。 任何不涉及維持抗CCR5抗體之合適構形之半胱胺酸殘 基亦可通常經絲胺酸取代以提高分子之氧化穩定性且防止 異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加於抗體中以提高 其穩定性（尤其當抗體為抗體片段，諸如Fv片段時）。 抗體之另一類型之胺基酸變異體改變抗體之原始糖基化 模式。”改變’’意謂移除一或多個可見於抗體中之醣部分及/ 或添加一或多個不存在於抗體中之糠基化部位。抗體之糖 124787.doc -29· 200821330 基化通常為N-連接的。術語"N-連接，，係指醣部分與天冬醯 胺酸殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸_χ_絲胺酸及 天冬酿胺酸-X-蘇胺酸（其中χ為除脯胺酸之外之任何胺基 酸）為膽部分與天冬醯胺酸側鏈酶促連接的識別序列。因 此’在多狀中存在該等三肽序列中之任一者會產生潛在糖 基化部位。藉由改變胺基酸序列便利地將糖基化部位添加 至抗體中使得其含有上述三肽序列中之一或多者（對於Ν_ 連接糖基化部位而言）。 由此項技術中已知之多種方法製備編碼抗CCR5抗體之 胺基酸序列變異體的核酸分子。該等方法包括（但不限 於）·自天然來源分離（在天然存在胺基酸序列變異體之情 況下），或藉由早期所製備之變異體或非變異體形式之人 類化抗CCR5抗體的养核苦酸介導（或定點（site-突 變、PCR突變及盒式（cassette)突變來製備。 另一類型之共價修飾涉及醣苷經化學或經酶偶合至抗 體。該等程序不需要在宿主細胞中產生能夠N或〇連接糖 基化之抗體因而有利。視所用偶合模式而定，該（等）糖可 連接於（a)精胺酸及/或組胺酸；（b)游離羧基；（c)游離硫氫 基，諸如半胱胺酸之硫氫基；（d)游離羥基，諸如絲胺酸、 蘇胺酸或羥脯胺酸之羥基；（e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、 酪胺酸或色胺酸之殘基；或（f)麩醯胺酸之醯胺基。該等方 法描述於 WO 87/05330，及 Aplin，J.D.及 Wriston，J.C. Jr.， CRC Crit· Rev· Biochem. 10 (1981) 259-306 中。 可以化學方式或酶方式達成移除任何存在於抗體上之聽 124787.doc •30- 200821330 部分。化學去糖基化需要使抗體暴露於化合物三氟甲烷磺 酸或等效化合物。該處理導致除連接糖（N-乙醯葡糖胺或 N-乙醯半乳糖胺）外之大多數或所有糖裂解，同時保留抗 體完整性。化學去糖基化由Sojar，H.T.及Bahl，O.P.，Arch.

Biochem· Biophys· 259 (1987) 52-57; Edge，A.S·等人， Anal· Biochem· 1 18 (1981) 13 1-137描述。酶裂解抗體上之 醣部分可藉由使用多種内醣苷酶及外醣苷酶達成，如

Thotakura，N.R.及 Bahl，O.P.，Meth· Enzymol. 138 (1987) 350-359所描述。 另一類型之抗體共價修飾包含以美國專利第4,640,835 號、第 4,496,689號、第 4,301，144號、第 4,670,417號、第 4,791，192號、第4，179,337號中所闡明之方式將抗體連接至 多種非蛋白質聚合物之一（例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚 烧二醇（polyoxyalkylenes))。 本發明之重鏈及輕鏈可變域與啟動子、轉譯起始、恆定 區、3未轉譯區域、聚腺核皆酸化、及轉錄終止之序列組 合形成表現載體構築體。該重鏈及輕鏈表現構築體可組合 成單一載體’共轉染、連續轉染或分別轉染於宿主細胞 中’ Ik後该等宿主細胞融合形成表現兩種鏈之單個宿主細 胞。 本發明進一步包含本發明之抗體用於診斷活體外aids 易感性的用途，其較佳藉由測定人類血漿試樣（Tsimanis， T·’ Immunology Letters 96 (2005) 55-01)之可溶性 CCR5 與 本發明之抗體之間的結合性之免疫學檢定來診斷。ccR5 124787.doc -31- 200821330 之表現與疾病進展具有相關性且可用於鑑別aids易感性 之較低或較高風險個體。為達到診斷目的，該等抗體或抗 原結合片段可經標記或不經標記。—般而言，診斷檢定需 要谓測由抗體或抗體片段與CCR5結合所產生之複合 形成。 在另$樣中’本發明提供—種含有與醫藥學上可接受 之載劑-起調配之-種本發明之單株抗體或單株抗體組合 或其抗原結合部分的組合物(例如醫藥組合物)。 如本文中所用，”醫藥學上可接受之載劑"包括任何及所 =理上可相容之溶劑'分散介質、塗料、抗細菌劑及抗 J劑、4參劑及吸收/再吸收延遲劑及其類似物。該載 劑較佳適合於注射或灌注。 可由多種此項技術中已知之方法投與本發明之組合物。 二:果習：項技術者將瞭解，投藥之途徑及/或模式將視 所而結果而不同0 制借^可接又之载劑包括無菌水溶液或分散液及用於 :囷：注射溶液或分散液之無菌散劑。該等介質及藥 诏用於醫藥學活性物質 、” ^ t 用途為在此項技術中所已知。除 水之外，載劑可為(例如)等滲緩衝鹽水溶液。 已：二慮：選給藥途徑之情況下’藉由熟習此項技術者 物及/戈本雜可以適當水合形式使用之本發明之化合 物及/或本發明之醫蘿 型。 _梁、、且，物調配成醫藥學上可接受之劑 本發明之醫筚纟日人< a • ’、、σ 之活性成份的實際劑量可改變以 124787.doc 200821330 =對t定—患者無毒性之情況下獲得有效實現該患者、組 旦及技藥方式所需之治療反應的活性成份之量（有效 里）所k劑里將視多種藥物代謝動力學因素而定，其包 本卷月所用之特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、終 藥途徑、投藥時間、所用特定化合物之排泄速率、其他: 所用特疋組合物組合使用之藥物、化合物及/或物質、欲 治療患者之年齡、性別、體重、病狀、全身健康情況及前 病史及醫學技術中所熟知之類似因素。 本發明包含本發明之抗體用於治療患有免疫抑制之患 者，諸如治療患有免疫缺陷症候群（諸如Ams)之患者、經 受會產生纽抑制之放射治療、化療法、自體免疫疾㈣ 法或其他藥物療法（例如皮質類固醇療法）之患者的免疫抑 制，或用於治療患有GvHD或HVGD之患者（例如移植後）的 用返本發明亦包含一種治療患有該免疫抑制之患者的方 法。 本發明進一步提供一種製造包含有效量之本發明之抗體 以及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物的方法及本發明 之抗體用於忒方法的用途。本發明亦提供一種適用作藥物 之本發明的抗體。亦提供一種用於治療免疫抑制性疾病之 本發明的抗體。 本發明進一步提供有效量之本發明之抗體用於製造用以 治療患有免疫抑制之患者之藥劑（較佳連同醫藥學上可接 受之載劑）的用途。 本發明亦提供有效量之本發明之抗體用於製造用以治療 124787.doc -33- 200821330 患有由CCR5所介導之發炎性介體釋放的患者之藥劑(較佳 連同醫藥學上可接受之載劑）的用途。 土 提供下列實例及序列表以幫助理解本發明，其真實範疇 於附加申請專利範圍中闡明。應瞭解在不悖離本發明之= 神的情況下可對所闡明之程序進行修改。 序列描述 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 實例1

Ο 式I ’重鏈，可變域 式II，輕鏈，可變域 γ 1重鏈恆定區. γ4重鏈恆定區. κ輕鏈恆定區 重鏈可變域 重鏈可變域 重鏈可變域 輕鏈可變域 輕鏈可變域 重組製備抗體 已如下構建用於表現本發明之抗體之載體。藉由在表現 載體pSVgpt中將重鏈可變域連接至人類IgG1(SEQ ID NO: 3)恆定區來構建重鏈表現載體。藉由在表現載體pSVhyg中 將輕鏈可變域連接至人類κ輕鏈（SEQ ID NO: 5)恆定區來構 建輕鍵表現載體。使用載體VH-PCR1及VK-PCR1作為模板 引入包括前導區信號肽、前導區内含子及鼠類免疫球蛋白 124787.doc -34- 200821330 啟動子之5’侧接序列及包括剪接位點及内含子序列之3’側 接序列。將重鏈及輕鏈表現載體共轉染於NS0細胞 (ECACC No 85110503，一種產生小鼠骨髓瘤之非免疫球 蛋白）中。篩檢經轉染之細胞純系以便藉由ELISA製備人類 IgG之人類抗體。 實例2 構建突變體（變異體）抗CCR5抗體之表現質體 編碼突變體抗CCR5抗體重鏈及輕鏈之表現質體係藉由 f) 使用QuickChange™定點突變套組（Stratagene)進行表現質 體定點突變而產生且描述於表1中。根據EU編號系統對胺 基酸進行編號（Edelman，G.M· 等人，Proc·Natl·Acad·Sci· USA 63 (1969) 78_85 ; Kabat，Ε·Α·等人，Sequences of

Proteins of Immunological Interest，第 5 版 ’ National

Institutes of Health, Bethesda, MD, Publication No. 91-3242 (1991))。 , 表1展示恒定鏈（？〇)之突變體。

U 表1 : 同種型 縮寫 突變 描述___-. IgGl IgGlv2 L234A ； L235A 人類γΐ-重鏈之胺基酸序列 LeU234LeU235經胺基酸序列 Ala234Ala235 置換________ 突變說明：L234A意謂Kabat胺基酸位置234處之白胺酸變 成丙胺酸。 實例3 細胞-細胞融合檢定 在第1天時，將gpl60表現性HeLa細胞（2xl〇4個細胞/50 124787.doc -35- 200821330 微升/孔）接種於補充有10%(v/v)FCS及2 pg/ml多西環素 (doxycycline)之DMEM培養基之白色96孔微量滴定盤中。 在第2天時，將每孔100 μΐ上清液試樣或抗體對照添加於澄 清96孔微量滴定盤中。隨後添加100 μΐ含有8 xlO4個細胞於 培養基中之CEM-NKr-Luc懸浮液且在37°C下培育30分鐘。 自96孔滴定盤中吸出HeLa細胞培養基，添加來自200 μΐ抗 體/CEM-NKr-Luc混合物之100 μΐ且在37°C下培育隔夜。在 第3天時，添加100微升/孔Bright-GloTM螢光素酶檢定受質 (1，4-二硫蘇糖醇及二硫亞磺酸鈉；Promega Corp.，USA)且 在RT下培育最少15分鐘後量測發光性。 物質： 將HeLa-R5_16細胞（一旦多西環素誘導後表現HIV gpl60 之細胞株）培養於含有營養素及10%(v/v)具有400 pg/ml G418 及 200 pg/ml 勻黴素（Hygromycin)B 之 FCS 的 DMEM培 養基中。 CEM.NKR-CCR5-Luc(產品目錄號：5198)為由 NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson

BioServices Corporation Germantown，MD 20874，USA獲得 之T細胞株。細胞類型··將CEM.NKR-CCR5(產品目錄號 4376)轉染（電穿孔）以在HIV-2 LTR之轉錄調控下表現螢光 素酶基因且增殖於含有10%胎牛血清、4 mM麵醯胺酸、青 黴素/鏈黴素及0.8 mg/ml遺傳黴素硫酸鹽（G418)之RPMI 1640中。生長特點：圓形淋巴樣細胞，形態不太可變。細 胞以單個細胞形式生長於懸浮液中且可形成小塊。每週以 124787.doc •36- 200821330 1:10分裂兩次。特點··在轉錄激活HIV-2 LTR之後表現螢 光素酶活性。適合於以主要HIV分離株感染而用於中和及 藥物敏感性檢定（Spenlehauer，C·等人，Virology 280 (2001) 292-300 ; Trkola，Α·等人，J. Virol· 73 (1999) 8966-8974)。經由來自 Drs. John Moore及 Catherine Spenlehauer 之 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, . NIAID，NIH獲得細胞株。

Bright-GloTM勞光素酶檢定緩衝劑（Promega Corp·，USA， ^ Part No E2264B)

Bright-GloTM 登光素酶檢定受質（Promega Corp·，USA， Part No EE26B) 結果： 該等結果呈現於表2中。IC5〇值介於46與399 ng/ml之 間。抗體之恆定區為經突變之IgGl(IgGlv2)。 表2 : 重鏈可變域 輕鏈可變域 IC5〇 [ng/ml] SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 9 108 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 10 399 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 46 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 10 152 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 132 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10 76 實例4 以活病毒進行之抗病毒檢定 由藉由使用 LymphoprepTM (Nycomed Pharma AG，Oslo, Norway)進行密度梯度離心所分離之血塊黃層（buffy coat) 製備PBMC。將來自4種不同供體之細胞混合、以PHA刺激 124787.doc •37· 200821330 1天且隨後在5 U/ml IL-2(介白素-2)存在下於含有l%(w/v) 青黴素 / 鏈黴素、1% GlutaMAXTM (Invitrogen Corp·， USA，產品目錄號35050-038)、1%丙酮酸鈉、l%(w/v)非 必需胺基酸及10% FBS之RPMI培養基中培養2天。 將50 μΐ 1〇〇,〇〇〇個PBMC (末梢血液單核細胞）添加至100 μΐ抗體溶液中（連續稀釋於RPMI補充培養基中至範圍介於 0.006-17.5 pg/ml之間），且以 50 μΐ體積之 250 TCID50(半數 組織培養感染量）之NLBal (具有BaL(gpl20)之env之NL4.3 病毒株（Adachi，A.等人，J· Virol. 59 (1986) 284-291))或者 JRCSF (O’Brien，W.A.等人，Nature 348 (1990) 69-73)感 染。將混合物於C02恆溫箱中在37°C下培育6天。將上清液 收集且隨後使用5 U/ml補充有IL-2之RPMI培養基以1:50稀 藉由 HIV-1 p24 ELISA (Perkin-Elmer，USA)量測 p24。隨 後將試樣中和且轉移至塗佈有對HIV-1 p24具有高度特異 性之小鼠單株抗體的微板孔中。經固定之單株抗體捕捉 HIV-1 P24。無需破環細胞培養物試樣且將其直接添加至 塗有單株抗體之微板孔中。使捕捉抗原與HIV-1 p24之經 生物素化多株抗體、接著抗生蛋白鏈菌素-HRP(辣根過氧 化物酶）結合物複合。藉由使用產生與被捕捉之HIV-1 p24 之量成正比之黃顏色的鄰苯二胺-HC1 (OPD)進行培育來偵 測所得複合物。使用微板讀取器測定各微板孔之吸光率且 相對於HI V-l p24抗原標準物或標準曲線之吸光率進行校 準。 124787.doc • 38 - 200821330 結果： 為抑制HIV於人類PBMC中之生長，對於包含重鏈（SEQ ID NO:6、7、8)及輕鏈（SEQ ID NO:9、10)可變域與IgGl 同種型之不同組合的抗CCR5抗體，已測定IC5〇值介於2.27 ng/ml與14·21 ng/ml之間。對於該等組合，IC9〇值係在9_77 ng/ml至 74.06 ng/ml之範圍内。 對於包含突變IgGl恆定區（IgGlv2)之抗CCR5抗體，已 測定重鏈及輕鏈可變域之不同組合之IC5G值係在8.22 ng/ml 至43 · 11 ng/ml之範圍内，而測定1C9〇值為5 1.95 ng/ml至 311.38 ng/ml之範圍内。 實例5

CCR5細胞 ELISA 將20,000個重組表現CCH5之CHO細胞以每90孔滴定盤接 種且在37°C下培育隔夜。此後吸出培養基且添加40 μΐ新鮮 培養基。添加10 μΐ於培養基中經稀釋之第一抗體且在4°C 下培育2小時。吸出培養基，添加100 μΐ戊二醛（c=0.05%於 磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)中）且在室溫下培育10分鐘。 在以200 μΐ PBS洗滌3次後，添加50 μΐ偵測抗體（以1:1，000 至1:2,000稀釋於ELISA阻斷緩衝液中）且在室溫下培育2小 時。添加50 μΐ 3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺且在7分鐘後停止反 應。在45 0 nm(以620 nm對比）下量測光學密度。 弟一抗體·待檢驗之抗體 第二（偵測）抗體··綿羊抗人類IgG-γ特異性過氧化酶結合 性抗體（結合位點目錄AP004)，以1:2,000 (6 μ1/12 ml)稀釋 124787.doc -39- 200821330 於PBS 10 %阻斷緩衝液中 培養基：具有 GlutaMAX™之HAM，s F_12或GIBCO、10% FCS、200 pg/ml 勻黴素（Roche Diagnostics GmbH， Germany) ELISA-阻斷緩衝液:Roche Diagnostics GmbH， Germany, #1 1 125 89，10% (v/v)水溶液，以 1:10稀釋於 PBS 中 TMB : Roche Diagnostics GmbH, Germany，#1432559， 備用溶液 結果： CCR5細胞ELISA之結果展示，包含重鏈（SEQIDNO:6、 7、8)及輕鏈（SEQ ID NO:9、10)可變域之不同組合之抗 CCR5抗體與人類CCR5的結合性在1000 ng/ml之濃度下係 在 2.71 至 3.13(OD 450/620)之範圍内。 實例6 CCR5 MAb與FcyRIIIa結合於NK細胞上之潛在性 為測定本發明之抗體結合FcyRIIIa (CD16)於自然殺傷 (NK)細胞上之能力，將末梢血液單核細胞（PBMC)分離且 以20 pg/ml抗體及對照抗體在存在或不存在20 pg/ml阻斷 FcyRIIIa之小鼠抗體（抗 CD16，純系 3G8，RDI，Flanders， NJ)的情況下培育以檢驗經由FcyRIIIa之結合性。使用不結 合FcyRIIIa之人類IgG2及IgG4 (結合位點）作為負對照。包 括人類IgGl及IgG3 (結合位點）作為FcyRIIIa結合性之正對 照。藉由使用與經FITC標記山羊F(ab)2抗人類IgG(Fc)抗體 124787.doc -40- 200821330 (Protos Immunoresearch，Burlingame，USA)組合之經PE標 記小鼠抗人類CD56(NK細胞表面標記）抗體（BD Biosciences Pharmingen，San Diego, USA)進行 FACS 分析偵 測結合於NK細胞上之抗體。在20 pg/ml之抗體濃度下測定 最大結合性（Bmax)。對照抗體（人類IgG4)與人類IgGl之 100% Bmax相比展示出至多30% Bmax。因此，”無FcyRIIIa 結合性或無ADCCn意謂在20 pg/ml之抗體濃度下與人類 IgGl相比至多30%的Bmax值。 實例7 CCR5趨化性檢定 將L1.2hCCR5細胞培養於含有10%胎牛血清、lx青黴素/ 鏈黴素、lx麩醯胺酸、lx丙酮酸鈉、Ιχβ-酼基乙醇及250 pg/ml G418 (所有皆來自 Invitrogen Inc·，USA)之 RPMI 1640中。僅在開始趨化性檢定之前，將該等細胞旋轉下來 且再懸浮於趨化性緩衝液（含有0.1% BSA及10 mM HEPES 之漢克氏平衡鹽溶液（Hank，s Balanced Salt Solution)HBSS (Invitrogen))中。將該等細胞在5xl06細胞/毫升之最終濃度 下用於趨化性檢定。將該等CCR5配位體人類ΜΙΡΙα、人類 ΜΙΡΙβ或人類RANTES (R&D Systems，USA)稀釋於趨化性 缓衝液中且在20 nM之最終濃度下使用。將測試抗體或適 當同種型對照抗體稀釋於HBSS中。在0.5 μιη孔隙96孔 ChemoTx® 系統（Neuroprobe Inc·，USA)中開始趨化性檢 定。將各抗體與該等CCR5配位體中之一者混合且將30 μΐ 該混合物置於ChemoTx㊣系統之底部孔中。將過濾網置於 124787.doc -41- 200821330

底部孔之頂部。將各抗體與L1.2hCCR5細胞混合且將20 μΐ 該混合物置於濾器上。隨後將該等板置於增濕腔室中且在 37°C及5% C02下培育3小時。培育後，將該等細胞自濾器 上刮掉且將該等板於桌上型離心機中在2,000 rpm下旋轉10 分鐘。隨後將濾器移出且根據製造商之用法說明書使用 ' CyQUANT® 細胞增生檢定套組（Invitrogen)及 Spectra MAX - GeminiXS板讀取器（Molecular Devices，Wokingham，UK)憤 測已遷移至底部孔中之細胞的密度。使用Prism ( 4(GraphPad Inc·，USA)計算 IC5〇值。 人類ΜΙΡ-1α、人類MIP-Ιβ及人類RANTES對於重鏈可變 域及輕鏈可變域與IgGl同種型恆定區之不同組合的IC50值 係分別介於 〇·8〇 nM 至 0·91 ηΜ、0·72 nM 至 1·08 nM 及 0.85 nM至2.69 nM之範圍内。 在突變IgGl同種型（IgGlv2)之情況下，人類ΜΙΡ·1α、人 類MIP-Ιβ及人類RANTES之IC5G值係分別介於2·21 nM至 6.28 nM、2.16 nM至 6.87 nM及 3.59 nM至 5.03 nM範圍内。 〇 124787.doc -42- 200821330 序列表 <110〉 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120> 抗CCR5抗體及其用途 <130> 23961 FT <140> 096136004 <141> 2007-09-27 <150> EP 06020646.3 <151〉 2006-09-29 <160> 10 <170> Patentln Version 3.2 <210> • <211> <212> <213> 1 117 PRT 小鼠 Γ: <220> <221> <222> <223> misc feature (5) .7(5) Xaa為X01，為Lys或Gin <220> <221> <222> <223> mi sc feature (6) .7(6) Xaa為X02，為Gin或Glu <220> <221> <222> <223> mi sc feature (13)T.(13) Xaa為X03，為Arg或Lys <220> <221> <222> Ο <223> mi sc feature (45)7.(45) Xaa為X04，為Leu或Pro <220> <221> <222> <223> mi sc feature (64)7.(64) Xaa為X05，為Met或Lys * <220> <221> <222> * <223> mi sc feature (92)7. (92) Xaa為X06，為lie或Thr .<220> <221> <222> <223> mi sc feature (112T_ · (112) Xaa為X07，為Ser或Thr <220> <221> <222> <223> misc feature (114T. . (114) Xaa為X08，為lie或Thr 124787.doc 200821330 <400> 1

Gin Val Gin Leu Xaa Xaa Ser Gly Pro Gly Leu Val Xaa Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser 工le Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ala Phe 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Xaa Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val 工le Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Xaa 50 55 60

Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa 100 105 110

Val Xaa Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> 小鼠 u <220> <221> misc_feature <222> (29)7.(29) <223〉Xaa為X10，為lie或Ala <220〉 <221> misc_feature <222> (36)7.(36) <223〉Xaa為XI1，為Phe或Tyr ' <220> <221> misc_feature <222> (40)7.(40) <223〉Xaa為X12，為Gin或Pro <220> <221> misc—feature <222〉 (43)7.(43) <223> xaa為χΐ3，為Ser或Ala 124787.doc - 2 - 200821330 <220> <221> <222> <223> misc feature (45)7.(45) Xaa為X14，為Gin或Lys <22〇> <221> <222> <223> misc feature (48)7.(48) Xaa為X15，為Val或lie <220> <221> <222> - <223> misc feature (70)7.(70) Xaa為XI6，為Gin或Asp <220> • <221> <222> <223> misc feature (72)7.(72) Xaa為 XI7，為Ser 或Thr f, <220> ^ ； <221〉 <222> <223> misc feature (73)7.(73) Xaa為X18，為Leu或Ala <220> <221> <222> <223> misc feature (74)7.(74) Xaa為XI9，為Lys或Thr <220> <221> <222> <223> misc feature (76)7.(76) Xaa為X20，為Asn或Ser <220> <221> <222> <223> misc feature (78)7.(78) Xaa為X21，為Leu或Ala O <220> <221> <222> <223> misc feature (84)7.(84) Xaa為X22，為Gly或Ala <220> , <221> <222> <223> misc feature (85)7.(85) Xaa為X23，為Asn或Thr " <220〉 <221> <222> <223> misc feature (104Y..(104) Xaa為X24，為Leu或Val <400> 2

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 124787.doc 200821330

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Xaa His Gly Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Xaa Gin Gin Lys Xaa Gly Lys Xaa Pro Xaa Leu Leu Xaa 35 40 45

Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Xaa Xaa Xaa 工le Xaa Ser Xaa Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu lie Lys 100 105 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213〉智人 <400> 3

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 o

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 -4- 124787.doc 200821330

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 130 135 140

Thr Cys

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 145 150 155

Asn Trp 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 165 170

Arg Glu 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 180 185 190

Val Leu

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 195 200 205

Ser Asn

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 210 215 220

Lys Gly

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 225 230 235

Asp Glu 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 245 250

Phe Tyr 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 260 265 270

Glu Asn

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 275 280 285

Phe Phe o

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 290 295 300

Gly Asn

Tyr Thr 320

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 305 310 315

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 327 <212> PRT <213〉智人 <400> 4 124787.doc 200821330

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

o

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp -6- 124787.doc 200821330 245 250 255 工le Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> 智人 <400> 5 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 o

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 6 <211> 117

<212> PRT 124787.doc 200821330 <213> 人造 <220> <223>重鏈可變域 <400> 6

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ala Phe 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu 35 40 45 o o

Gly Val lie Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 7 <211> 117 <212> PRT <213〉人造 <220> <223>重鏈可變域 <400> Ί

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ala Phe 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 124787.doc 200821330

Gly Val lie Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 c <210〉 8 <211> 117 <212> PRT <213> 人造 <220> <223〉重鏈可變域 <400> 8 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser 工le Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ala Phe 20 25 30 u

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val 工le Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 124787.doc 9- 200821330 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> 人造 <220> <223>輕鏈可變域 <400> 9

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ala His Gly Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Γ

Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys 工le Asn Ser Ala Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 10 <211〉 107 u <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉輕鏈可變域 <400> 10

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ala His Gly Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 -10- 124787.doc 200821330

Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys 工le Asn Ser Ala Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 u -11 - 124787.doc

Claims (1)

1. 200821330 十、申請專利範圍： 1 · 一種與CCR5結合之抗體，其特徵在於重鏈可變域包含 SEQ ID NO: 1之胺基酸序列·· Gln-Val-Gln-Leu-X01-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro-Ser-Gln-Ser- Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe-Gly-Val- His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-XCM-Glu-Trp-Leu-Gly-Val-De- Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-X05-Ser-Arg-Leu- Arg-He-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser- Leu-Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu- Ala-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser ，

   L) 其中 X01 為 Lys 或 Gin，X02 為 Gin 或 Glu，X03 為 Arg 或 Lys，X04 為 Leu 或 Pro，X05 為 Met 或 Lys，X06 為 lie 或 Thr，X07為 Ser 或 Thr，X08 為 lie或 Thr。 2·如請求項1之與CCR5結合之抗體，其特徵在於輕鏈可變 域包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列： Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-AJa-Ser-Val-Gly-Glu-Thr-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-XlO-His-Gly-Tyr-Leu-Ala-T rp-X 11 -Gln-Gln-Ly s-X 12-Gly-Ly s-X 13 -Pro-X 14-Leu-Leu-X 15 -Ty r-Asn-Thr-Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-X16-Phe-X17-X18-X19.Ile-X20-Ser-X21-Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr-Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-X24-Glu-De-Lys ， X12為Gin或 X15為Val或 X18為Leu或 X21為Leu或 X24為Leu或 其中 X10 為 lie 或 Ala、Xll 為 Phe 或 Tyr、 Pro、X13 為 Ser 或 Ala、X14 為 Gin 或 Lys、 lie、XI6 為 Gin 或 Asp、XI7 為 Ser 或 Thr、 八1&、又19為1^8或！^1'、又20為八811或861·、 Ala、X22 為 Gly 或 Ala、X23 為 Asn 或 Thr、 Va卜 3.如請求項1或2之與CCR5結合之抗體，其特徵在於該抗體 124787.doc 200821330 包含一個重鏈可變域選自SEQ ID NO: 6、7或8之重鏈可 變域或其CCR5結合片段。 4. 如請求項1或2之與CCR5結合之抗體，其特徵在於該抗體 包含一個輕鏈可變域選自SEQ ID NO: 9或10之輕鏈可變 域或其CCR5結合片段。 5. 如請求項3之與CCR5結合之抗體，其特徵在於該抗體包 含選自SEQ ID NO: 6、7或8之重鏈可變域或其CCR5結合 片段及包含選自SEQ ID NO: 9或10之輕鏈可變域或其 CCR5結合片段，其中該等重鏈及輕鏈可變域彼此獨立選 擇。 6. 如請求項1或2之與CCR5結合之抗體，其特徵在於該抗體 包含人類來源之恆定區。 7. 如請求項6之與CCR5結合之抗體，其特徵在於該重鏈恆 定區為人類IgG4同型（isotype)或人類IgGl同型在鉸鏈區 中CH1與CH2之間的胺基酸位置216-240及/或在第二域間 (inter-domain)區中CH2與CH3之間的胺基酸位置327- 33 1 經修飾之重鏈恨定區。 8. 如請求項6之與CCR5結合之抗體，其特徵在於該抗體包 含SEQ ID NO: 3或4之重鏈恆定區及包含SEQ ID NO: 5之 輕鏈恆定區。 9. 如請求項6之與CCR5結合之抗體，其特徵在於該抗體為 人類IgGl同型抗體且包含突變L234A及L235A，或該抗 體為包含突變S228P之人類IgG4同型抗體。 10· —種包含醫藥學上有效量之如請求項1或2之抗體的醫藥 124787.doc 200821330 組合物。 U. 一種製造包含醫藥學上有效量之如請求項1或2之抗體之 醫藥組合物的方法。 種如明求項1或2之抗體用於製造醫藥組合物之用途。 13 ·如睛求項1或2之抗體，其用作藥物。 14.如請求項13戈2之抗體’其用於治療免疫抑制性疾病。 種如明求項1或2之抗體的用途，其用於製造用以治療 免疫抑制性疾病之藥物。 16·種核酉文，其編碼一種能夠與第二多肽一起裝配之多 狀’其中該第二多肽包含選自SEq ID N〇: 2、5之多肽之 群的多肽，及其中該多肽包含SEq ID N0: 1、6、7或8之 胺基酸序列。 17· —種編碼與CCR5結合之抗體鏈的核酸，其特徵在於該編 碼鏈能夠與一個其他抗體鏈一起裝配以產生如請求項i 或2之與CCR5結合的抗體分子。 18· —種編碼如請求項1或2之與CCR5結合之抗體的核酸。 19· 一種包含如請求項18之核酸的真核細胞。 20· —種製造如請求項之重組人類或人類化抗體的方 法，其特徵在於使如請求項18之核酸於原核或真核宿主 細胞中表現及自該細胞或細胞培養物上清液中回收該重 組抗體。 124787.doc 200821330 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 124787.doc