ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA CCR5 Y USOS DE LOS MISMOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada con anticuerpos dirigidos contra CCR5, con métodos para su producción, con composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos y con el uso de los mismos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante los últimos años ha aumentado la comprensión de los mecanismos específicos que usan el VIH-1 para introducirse en las células objetivo. Esto ha facilitado los esfuerzos para desarrollar fármacos que atacan etapas discretas de este proceso. El primer fármaco dirigido contra la entrada, ha sido aprobado recientemente para su uso clínico ( enfuvirtida , T20; Lazzarin, A., et al., N. Engl . J. Med. 348 (2003) 2186-2195) . La enfuvirtida es un fármaco peptídico que bloquea la fusión en una etapa posterior a la unión al receptor de quimiocina. La infección del VIH-1 se inicia mediante interacciones entre la glucoproteína de la cubierta viral (Env) y un complejo receptor celular que consta de CD4 y un receptor de quimiocinas (Pierson, T.C. and Doms, R.W., Immuno. Lett. 85 (2003) 113-118; Kilby, J.M. and Eron, J.J., N. Engl. J. Med. 348 (2003) 2228-2238). Env tiene dos subunidades: la glucoproteína de superficie gpl20 que interacciona con el receptor CD4 celular y que está asociada de forma no covalente REF. : 199784
con la subunidad transmembrana del virus gp41. La gp41 ancla la gpl20 a la membrana viral y también es responsable de la fusión. La unión de gpl20 a CD4 en las células inicia un cambio conformacional que expone o crea un punto de unión que permite que la gpl20 interaccione con un receptor de quimiocinas de la superficie celular, el "co-receptor". Los receptores de quimiocinas son receptores con siete pasos transmembrana acoplados a proteina G (7 TM GPCR) que transmiten normalmente señales en respuesta a las quimiocinas, pequeñas citocinas con función quimiotáctica , inflamatoria y otras funciones. Una gran proporción de los fármacos en uso en la clínica se dirigen a otros 7 TM GPCR, por lo que atacar estas moléculas para bloquear la entrada viral es una extensión del tipo de programas de desarrollo de fármaco del pasado con más éxito. El VIH-1 aislado requiere CD4 y un co-receptor para entrar e infectar las células. El receptor de quimiocina CC humano CCR5 es un co-receptor para las cepas con tropismo a los macrofagos (R5) y juega un papel crucial en la transmisión sexual del VIH-1 (Berger, E.A., AIDS 11 (Supl. A) (1997) 3-16; Bieniasz, P.D. and Cullen, B.R., Frontiers in Bioscience 3 (1998) d44-d58; Littman, D.R., Cell 93 (1998) 677-680). El CCR5 humano (denominado a partir de ahora "CCR5") lo usan la mayoría de aislamientos primarios de VIH-1 y es crítico para el establecimiento y mantenimiento de la
infección. Además la función de CCR5 no es indispensable para la salud en humanos. Un alelo mutante de CCR5, "CCR5 ?32", codifica una proteina truncada, no funcional (Samson, M., et al., Nature 382 (1996) 722-725; Dean, M . , et al., Science 273 (1996) 1856-1862) . Los individuos homocigotos para la mutación carecen de expresión de CCR5 y están altamente protegidos de la infección por VIH-1. Estos no muestran consecuencias fenotipicas manifiestas y son muy resistentes a la infección por VIH-1 M trópica, mientras que los individuos heterocigotos presentan una progresión de la enfermedad retrasada (Schwarz, M.K. and Wells, T.N., Nat . Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347-358). La ausencia de CCR5 no provoca consecuencias adversas evidentes, probablemente porque CCR5 es parte de una red de quimiocinas altamente redundante de receptores de las quimiocinas OÍ MIP-IOÍ, MIP-?ß y RANTES, que comparten muchas funciones solapadas, y la mayoría de las cuales tienen receptores alternativos (Rossi, D. and Zlotnik, A., Annu. Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242) . La identificación de CCR5 como un co-receptor del VIH-1 se basó en la capacidad de sus ligandos, MIP-la, MIP-?ß y RANTES de bloquear la infección por los aislamientos R5, pero no por los R5X4 o X4 (Cocchi, F. , et al., Science 270 (1995) 1811-1815). CCR5 también es un receptor de las quimiocinas "agrupadas" (del inglés "cluster") que se producen esencialmente durante las respuestas inflamatorias y controlan
el reclutamiento de neutrófilos, macrófagos y subgrupos de células T (células T ayudantes Thl y Th2). Las respuestas Thl son típicamente las que involucran la inmunidad mediada por células efectiva frente a virus y tumores, por ejemplo, mientras las respuestas Th2 se cree que son vitales en las alergias. Por lo tanto, los inhibidores de estos receptores de quimiocinas pueden ser útiles como inmunomoduladores . En las respuestas Thl, las respuestas hiperactivas se atenúan, por ejemplo, en la autoinmunidad, lo que incluye artritis reumatoide o, en respuestas Th2, se reducen los ataques de asma o las respuestas alérgicas, que incluye dermatitis atópica (ver, por ejemplo, Schols, D. , Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893; Mueller, A. y Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38; Kazmierski, .M., et al., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278; Lehner, T., Trends Immunol . 23 (2002) 347-351) . Los anticuerpos contra CCR5 son, por ejemplo, PRO 140 (Olson, W.C., et al., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155) y 2D7 (Samson, M . , et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 24934-24941). Otros anticuerpos se mencionan en las patentes WO 2006/103100, US 2004/0043033, US 6,610,834, US 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003440, US 6,528,625, US 2002/0147147, US 2002/0146415,
US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US
2001/0000241, EP 1,322,332, EP 1,263,791, EP 1,207,202, EP
1,161,456, EP 1,144,006, WO 2003/072766, O 2003/066830, WO
2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779 y WO 01/42308. El objetivo de la invención es proporcionar nuevos anticuerpos contra CCR5 que se usan principalmente como un agente terapéutico para el SIDA. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN invención comprende un anticuerpo que se une a CCR5, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula: Gln-Val-Gln-Leu-X01-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro-Ser-Gln-Ser-Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe-Gly-Val-His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val-Ile-Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala- Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg- Ile-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu-Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08 -Val-Ser-Ser, en donde: X01 es Lys o Gln, X02 es Gln o Glu, X03 es Arg o Lys , X04 es Leu o Pro,
X05 es et o Lys, X06 es lie o Thr, X07 es Ser o Thr, X08 es lie o Thr (SEC ID NO: 1) . De preferencia, el anticuerpo se caracteriza porque el dominio variable de la cadena ligera de tal anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula: Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Glu-Thr-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-XlO-His-Gly-Tyr-Leu-Ala-Trp-Xll-Gln-Gln-Lys-X12-Gly-Lys-X13-Pro-X14-Leu-Leu-Xl5-Tyr-Asn-Thr-Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-X16-Phe-X17-X18-X19-Ile-X20-Ser-X21-Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr-Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-X24-Glu-Ile-Lys , en donde : X10 es lie o Ala, Xll es Phe o Tyr, X12 es Gln o Pro, X13 es Ser o Ala, X14 es Gln o Lys, X15 es Val o lie, X16 es Gln o Asp, X17 es Ser o Thr,
X18 es Leu o Ala, X19 es Lys o Thr, X20 es Asn o Ser, X21 es Leu o Ala, X22 es Gly o Ala, X23 es Asn o Thr, X24 es Leu o Val (SEC ID NO: 2) . De preferencia, el anticuerpo se caracteriza por ser del isotipo IgG4 humano o isotipo IgGl humano, y este isotipo IgGl está modificado opcionalmente en la región bisagra en la posición del aminoácido 216-240 entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región inter-dominio en la posición de aminoácido 327-331 entre CH2 y CH3. Una modalidad preferida de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Una modalidad preferida de la invención es el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la elaboración de una composición farmacéutica. Una modalidad preferida de la invención es un método para la elaboración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Una modalidad preferida de la invención es un ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de ensamblarse con
un segundo polipéptido, y este segundo polipéptido comprende un polipéptido seleccionado de entre el grupo de polipéptidos de la SEC ID NO: 2, 5, y tal polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, 6, 7 u 8. Una modalidad preferida de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad inmunodepresora , que se caracteriza por la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la invención. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia porque el anticuerpo se une a CCR5 y comprende un dominio de cadena pesada o ligera variable, seleccionado del grupo de dominios variables que comprenden los dominios variables de la cadena pesada de la SEC ID NO: 6, 7, 8, los dominios variables de la cadena ligera de SEC ID NO: 9, 10, o un fragmento de los mismos de unión a CCR5. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia por contener como dominio variable de la cadena pesada un dominio variable de la cadena pesada seleccionado del grupo de dominios variables de la cadena pesada de la SEC ID NO: 6, 7 u 8, o un fragmento de los mismos de unión a CCR5, y por contener como dominio variable de la cadena ligera un dominio variable de la cadena ligera seleccionado del grupo de dominios variables de la cadena ligera de la SEC ID NO: 9 ó 10, o un fragmento de los mismos de unión a CCR5, en los que
tales dominios variables de la cadena ligera y pesada se seleccionan independientemente el uno del otro. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia porque el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEC ID NO: 6, 7, 8, para ser más precisos el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de los dominios variables de la cadena pesada de la SEC ID NO: 6, 7 u 8, o un fragmento de los mismos de unión a CCR5. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia porque el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEC ID NO: 9, 10, para ser más precisos el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de los dominios variables de la cadena ligera de la SEC ID NO: 9 ó 10, o un fragmento de los mismos de unión a CCR5. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia porque las regiones constantes (cadenas ligera y pesada) son de origen humano. Tales regiones constantes (cadenas) son bien conocidas en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en Kabat (ver, por ejemplo, Johnson,
G. y Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Por ejemplo, una región constante de la cadena pesada humana útil comprende una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada de entre el grupo que consiste en los SEC ID NO: 3, 4. Por ejemplo, una región constante de la cadena ligera humana útil comprende una secuencia de aminoácidos de la región constante de una cadena ligera kappa de la SEC ID NO: 5. Se prefiere además que el anticuerpo sea de origen de ratón y comprenda el marco de una secuencia variable de anticuerpo de un anticuerpo de ratón de acuerdo con Kabat (ver, por ejemplo, Johnson, G. and Wu, T.T., Ácido nucleicos Res. 28 (2000) 214-218) . Los anticuerpos inhiben una o más funciones del CCR5 humano, como ligandos de unión a CCR5, de su actividad de señalización (por ejemplo la activación de una proteina G de mamífero, la inducción de un aumento rápido y transitorio de la concentración de Ca2+ libre citosólico y/o la estimulación de una respuesta celular (por ejemplo, la estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos, activación de integrinas ) ) . Los anticuerpos inhiben la unión de RANTES, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, y/o VIH al CCR5 humano e inhiben las funciones mediadas por el CCR5 humano, como el tráfico de leucocitos, la entrada del VIH en una célula, la activación de células T, liberación de mediadores inflamatorios y/o desgranulación de leucocitos.
El anticuerpo de acuerdo con la invención se une específicamente al CCR5 humano e inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo en una prueba que comprende poner en contacto tales células objetivo con el anticuerpo en presencia del virus con una concentración de anticuerpo efectiva para inhibir la fusión de la membrana entre el virus y la célula con un valor de IC50 de 4.0 µq/ml o inferior. El anticuerpo de acuerdo con la invención se une específicamente a CCR5 e inhibe la fusión de la membrana entre una primera célula que co-expresa los polipéptidos CCR5 y CD4 y una segunda célula que expresa una proteína env del VIH con un valor de IC50 de 1.5 µg/ml o inferior, de preferencia de 0.3 pg/ml o inferior. El anticuerpo de acuerdo con la invención se une específicamente a CCR5 e inhibe la estimulación de la respuesta celular en una célula objetivo, de preferencia inhibe la migración, en una prueba que comprende poner en contacto tales células objetivo con el anticuerpo en presencia de RANTES, MIP-1 alfa, y/o MIP-1 beta con un valor de IC50 de 1.5 pg/ml o inferior. Un anticuerpo de acuerdo con la invención de preferencia no inhibe la unión de quimiocinas en una prueba de unión a CCR1, CCR2, CCR3, CCR4 , CCR6 y CXCR4 a una concentración de anticuerpo de hasta 100 pg/ml. Un anticuerpo de acuerdo con la invención de preferencia
no estimula el aumento de Ca intracelular , detectado en células CHO que expresan CCR5 y Galfal6 a una concentración de anticuerpo de hasta 50 g/ml. El anticuerpo de acuerdo con la invención es de preferencia del isotipo humano IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, siendo preferibles IgGl o IgG4. El anticuerpo de acuerdo con la invención es de preferencia del isotipo IgG4. El anticuerpo de acuerdo con la invención es de preferencia del isotipo IgGl. El anticuerpo de acuerdo con la invención es de preferencia del isotipo IgG4 con la mutación S228P. El anticuerpo de acuerdo con la invención, es decir la región constante de las cadenas pesada y ligera, es del isotipo IgGl o IgG4 modificado en la región de bisagra alrededor de la posición del aminoácido 216-240, de preferencia alrededor de la posición del aminoácido 220-240, entre CH1 y CH2 (Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108), y/o en la segunda región inter-dominio alrededor de la posición del aminoácido 327-331 entre CH2 y CH3 (numeración de acuerdo con Kabat, ver, por ejemplo, Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Estas modificaciones reducen o evitan la función de efector (ADCC y/o CDC) . El cambio de clase de IgG puede realizarse mediante el intercambio de la región constante de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo por otros de un anticuerpo de la clase deseada, como los de mutantes
IgGl o IgG . Estos métodos son bien conocidos en el estado de la técnica. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia por ser de la subclase IgGl humano, contener por lo menos una mutación en L234 (leucina en la posición del aminoácido 234), L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y/o P329 (numeración de acuerdo con el índice EU) . De preferencia el anticuerpo es del isotipo IgGl humano y comprende las mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición del aminoácido 234) y L235A. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia por ser del isotipo IgG4 humano y contener una mutación en la posición S228. Por lo tanto, la invención se relaciona en un aspecto con los anticuerpos, caracterizados porque estos anticuerpos se unen a CCR5, contienen una parte Fe de origen humano, y no se unen al factor del complemento humano Clq y/o activan el factor del complemento C3. De preferencia los anticuerpos muestran una unión reducida o no se unen al receptor Fcy humano . La invención comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena de anticuerpo, un dominio variable, o una RDC de los mismos de acuerdo con la invención. Los polipéptidos codificados son capaces de ensamblarse junto con otra cadena respectiva de anticuerpo para dar lugar a una molécula de anticuerpo contra CCR5 de acuerdo con la
invención . La invención también proporciona vectores de expresión que contienen tal ácido nucleico de acuerdo con la invención, capaces de expresar el ácido nucleico en una célula hospedera procariótica o eucariótica, y las células hospederas que contienen estos vectores para la producción recombinante de tal anticuerpo. La invención también comprende una célula hospedera procariótica o eucariótica que comprende un vector de acuerdo con la invención. La invención también comprende un método para la producción de un anticuerpo recombinante humano o humanizado de acuerdo con la invención, caracterizado por expresar un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula hospedera procariótica o eucariótica y recuperar tal anticuerpo a partir de la célula o del sobrenadante del cultivo celular. La invención también comprende el anticuerpo que puede obtenerse mediante tal método recombinante. Los anticuerpos de acuerdo con la invención son benéficos para los pacientes con necesidad de una terapia de ataque a CCR5. Los anticuerpos de acuerdo con la invención tienen propiedades nuevas y originales que dan lugar a beneficios en un paciente que padece tal enfermedad, especialmente si padece inmunodepresion, especialmente si padece una infección por
VIH. La invención también proporciona un método para el tratamiento de un paciente que padece inmunodepresión, especialmente si padece una infección por VIH, que comprende la administración a un paciente diagnosticado de tal enfermedad (y por lo tanto en necesidad de tal terapia) de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se une a CCR5 de acuerdo con la invención. El anticuerpo se administra de preferencia en una composición farmacéutica. La invención también comprende el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención como un medicamento, para el tratamiento de una enfermedad inmunodepresora , de preferencia para el tratamiento de la infección por VIH, para el tratamiento de un paciente que padece inmunodepresión, y para la elaboración de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Además, la invención comprende un método para la elaboración de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención . La invención también comprende una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de acuerdo con la invención en una cantidad farmacéuticamente efectiva, opcionalmente junto con un amortiguador y/o un adyuvante útiles para la formulación de los anticuerpos con propósitos farmacéuticos . La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos en un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica puede incluirse en un articulo de manufactura o kit . Por lo tanto un aspecto de la presente invención es un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento. Otro aspecto de la invención es un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso para el tratamiento de una enfermedad inmunodepresora . También es un aspecto, el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inmunodepresora. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "anticuerpo" incluye las diferentes formas de estructura de anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo de acuerdo con la invención es de preferencia un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico u otros anticuerpos obtenidos genéticamente con tal de que se mantengan las propiedades características de acuerdo con la invención . Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo completo, de preferencia el dominio variable del mismo, o por lo menos el punto de unión al antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen diacuerpos,
moléculas de anticuerpo de cadena simple, inmunotoxinas y anticuerpos multi-especificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden los polipéptidos de cadena simple con las características de un dominio VH, es decir que son capaces de ensamblarse con un dominio VL, o de un dominio VL que se une a CCR5, es decir que son capaces de ensamblarse con un dominio VH a un lugar de unión a antígeno funcional y de este modo, proporcionan la propiedad de inhibir la fusión de la membrana o fusión del VIH con una célula obj etivo . Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usan en la presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo con una única composición de aminoácidos. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable, es decir una región de unión, de ratón y por lo menos una porción de una región constante derivada de un origen o especie diferente, obtenida normalmente mediante técnicas de ADN recombinante . Los anticuerpos quiméricos que comprenden un dominio variable de ratón y una región constante humana se prefieren especialmente. Estos anticuerpos quiméricos ratón/humano son el producto de la expresión de genes de inmunoglobulina que comprenden segmentos de ADN que
codifican los dominios variables de una inmunoglobulina de ratón y segmentos de ADN que codifican las regiones constantes de una inmunoglobulina humana. Otras formas de "anticuerpos quiméricos" incluidos en la presente invención son aquellos en los que se ha modificado o cambiado la clase o subclase del anticuerpo original. Tales anticuerpos "quiméricos" también se denominan "anticuerpos con cambio de clase". Los métodos para la producción de anticuerpos quiméricos involucran las técnicas convencionales de ADN recombinante y transfección génica bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, orrison, S.L., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; patentes US Nos. 5,202,238 y 5,204,244. El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que el marco y/o las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR, por sus siglas en inglés) se han modificado para que comprenda la CDR de una inmunoglobulina de una especie diferente comparado con la inmunoglobulina progenitor. En una modalidad preferida, una CDR de ratón se introduce en la región marco de un anticuerpo humano para obtener el "anticuerpo humanizado". Ver, por ejemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Las CDRs particularmente preferidas corresponden a las que presentan las secuencias de reconocimiento de antigenos que se indican anteriormente para los anticuerpos quiméricos y bifuncionales .
El término "que se une a CCR5" como se usa en la presente significa la unión del anticuerpo a CCR5 en una prueba ELISA in vitro basado en células (que expresan CCR5, por ejemplo células CHO transformadas, células L1.2). La unión se encuentra si el anticuerpo causa una relación S/N (relación de señal/ruido) de 5 o más, de preferencia de 10 o más, a una concentración de anticuerpo de 100 ng/ml. El término "estructura molecular de quimiocina de siete pasos de transmembrana" como se usa en la presente, se refiere a la estructura natural que CCR5 muestra cuando se encuentra localizado en la bicapa de la membrana celular (ver, por ejemplo, Oppermann, M . , Cell. Sig. 16 (2004) 1201-1210) . Como otros receptores acoplados a la proteina G (por ejemplo el receptor acoplado a proteina G Ib) , CCR5 se compone de un dominio N-terminal extracelular , un dominio transmembrana y un dominio C-terminal citoplasmático . El dominio transmembrana consiste de siete segmentos hidrofóbicos de transmembrana, unidos por tres segmentos citoplasmáticos y tres segmentos extracelulares . El anticuerpo de acuerdo con la invención se une a CCR5 en su estructura molecular de quimiocina de siete pasos de transmembrana. El término "epitopo" indica un determinante proteico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten normalmente de agrupaciones en la superficie químicamente activa de las moléculas como aminoácidos o
cadenas laterales de azúcares, y normalmente los epítopos tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero, pero no al segundo se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes. De preferencia un anticuerpo de acuerdo con la invención se une específicamente al CCR5 nativo pero no al desnaturalizado. El término "fusión de membrana" se refiere a la fusión entre una primera célula que co-expresa los polipéptidos CCR5 y CD4, y una segunda célula que expresa una proteína env del VIH. La fusión de membrana se determina mediante la prueba del gen marcador de la luciferasa. El término "inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo" se refiere a la inhibición de la fusión del VIH con una célula objetivo, medida en una prueba que comprende poner en contacto la célula objetivo con el anticuerpo en presencia del virus con una concentración efectiva de anticuerpo para inhibir la fusión de la membrana entre el virus y la célula, y medir la actividad de gen marcador de luciferasa. El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , dominio variable de una cadena pesada (VH) ) como se usa en la presente, indica cada uno de los pares de dominios de la cadena ligera y pesada que están directamente involucrados en la unión del anticuerpo al antígeno. Los
dominios variables de la cadena ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR, por sus siglas en inglés), cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDRs) . Las regiones marco adoptan una conformación laminar ß y las CDR pueden formar espiras que conectan la estructura laminar ß. Las CDRs en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional mediante las regiones marco y forman junto con las CDRs de la otra cadena el lugar de unión de antigeno. Las regiones CDR3 de la cadena pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo tanto proporcionan un nuevo objetivo de la invención. El anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia porque el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo de combinaciones que consiste de: a) el dominio variable de la cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6 y el dominio variable de la cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 9; b) el dominio variable de la cadena pesada definido por
la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6 y el dominio variable de la cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10; c) el dominio variable de la cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 y el dominio variable de la cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9; d) el dominio variable de la cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 y el dominio variable de la cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10; e) el dominio variable de la cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8 y el dominio variable de la cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9; f) el dominio variable de la cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8 y el dominio variable de la cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10. El término "porción de unión al antigeno de un anticuerpo" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antigeno. La porción de unión al antigeno de un anticuerpo comprende los residuos de los aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Las
regiones "marco" o "FR" son las regiones del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se ha definido en la presente. Por lo tanto, los dominios variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo comprenden de N-terminal a C-terminal los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 , CDR3 y FR4. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión al antigeno y define las propiedades del anticuerpo. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta. Ed . , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Publicación No. 91-3242 (1991) y/o los residuos de una "espira hipervariable". Los términos "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico", como se usa en la presente, pretenden incluir las moléculas de ADN y moléculas de ARN . Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, pero de preferencia es ADN de doble cadena. El término "aminoácido" como se usa en esta solicitud indica el grupo de carboxi de aminoácidos a que aparecen en la naturaleza, que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R) , asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D) , cisteina (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I), leucina (leu, L) ,
lisina (lys, K) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S), treonina (thr, T) , triptófano (trp, ) , tirosina (tyr, Y) y valina (val, V) . Un ácido nucleico está "ligado operativamente" cuando se sitúa en una relación funcional con otro ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder de secreción está ligado operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un lugar de unión de ribosomas está ligado operativamente a una secuencia codificante si se sitúa de forma que facilita la traducción. En general, "ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN ligadas son co-lineales, y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen se usan oligonucleótidos adaptadores o enlazadores sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Como se usa en la presente, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen su progenie. Así, las palabras "transformantes" y "células
transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados a partir de ésta, independientemente del número de transferencias. Se entenderá también que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha observado en la célula transformada original. La "parte Fe" de un anticuerpo no está directamente involucrada en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero muestra varias funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y muchas de estas pueden también dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo IgG en IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA en IgAl e IgA2. De acuerdo con las regiones constantes de la cadena pesada las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Los anticuerpos de acuerdo con la invención son de preferencia de tipo IgG. Como se usa en la presente el término "parte Fe derivado de origen humano" indica una parte Fe que es o una parte Fe de un anticuerpo humano de la subclase IgG4 o una parte Fe de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2 o IgG3, incluyendo las formas mutadas de las mismas. De preferencia la parte Fe
de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2 o IgG3 se modifica de tal forma que puede detectarse una unión reducida o nula al receptor de Fcy (FcyR, es decir, FcYRIIIa) y/o una unión reducida o nula a Clq como se define a continuación con respecto a la parte Fe no modificada. Una "parte Fe de un anticuerpo humano" es un término bien conocido para los experimentados y se define en base a la escisión de los anticuerpos con papaina. Los anticuerpos de acuerdo con la invención contienen como parte Fe una parte Fe derivada de origen humano y de preferencia todas las otras partes de la región constante de humano. De preferencia la parte Fe es una parte Fe humana, y se prefiere especialmente que sea de la subclase IgG4 humana o la subclase IgGl humana, o una parte Fe mutada de la subclase IgGl humana. Las más preferidas son la parte Fe y la región constante de la cadena pesada que se muestran en la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 3 con las mutaciones L234A y L235A y la SEC ID NO: 4 con la mutación S228P. Mientras que IgG4 muestra una unión reducida al receptor de Fcy (FcyRIIIa), los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran una fuerte unión. Sin embargo, la Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 son residuos que, si se alteran, proporcionan también una unión reducida al receptor Fe
(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Imraunology 86 (1995) 319-324; EP 0,307,434) . De preferencia, un anticuerpo de acuerdo con la invención es de la subclase IgG4 con respecto a la unión al receptor Fcy, o de subclase IgGl o IgG2, con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. Se prefieren las mutaciones S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236 (PVA236 significa que la secuencia de aminoácidos ELLG (dada en código de aminoácidos de una letra) de la posición de aminoácido 233 al 236 de IgGl o EFLG de IgG4 se ha reemplazado por PVA) . Se prefieren, especialmente las mutaciones S228P de IgG4, y L234A, L235A de IgGl. La parte Fe de un anticuerpo está directamente involucrada en la ADCC ( citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) y la CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) . La activación del complemento (CDC) se inicia mediante la unión del factor del complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpos IgG. La unión de Clq a un anticuerpo se produce por interacciones proteína-proteína definidas en el llamado lugar de unión. Tales lugares de unión de la parte Fe son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Lukas, T.J., et al., J. Immunol . 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344;
Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. , et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324 ; y la EP 0, 307, 434. Estos lugares de unión de la parte Fe se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de las subclases IgGl, IgG2 e IgG3 muestran normalmente activación del complemento, lo que incluye la unión de Clq y C3, mientras IgG4 no activa el sistema de complemento y no se une a Clq y C3. Es decir, en los casos en los que son necesarias la ADCC y/o CDC, se prefieren las partes Fe de subclase IgGl, en los casos en los que son necesarias ADCC y/o CDC reducidas o nulas, es preferible una parte Fe de subclase IgG4, o de subclase IgGl modificada/mutada . La presente invención se relaciona en un aspecto con un anticuerpo que se une CCR5 y muestra una unión reducida o nula al receptor Fcy y/o al factor del complemento Clq. Un anticuerpo anti-CCR5 que no se une al receptor Fe y/o al factor del complemento Clq no provoca citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , mientras un anticuerpo anti-CCR5, que muestra una unión reducida al receptor de Fe y/o al factor del complemento Clq, muestra una ADCC y/o CDC reducida. De preferencia, tal
anticuerpo se caracteriza porque se une a CCR5, contiene una parte Fe derivada de origen humano, y no se une o muestra una unión reducida a los receptores de Fe y/o al factor del complemento Clq. Más preferentemente, este anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado o un anticuerpo agotado del antigeno de las células T. La unión de Clq puede medirse de acuerdo con Idusogie, E.E., et al., J. Immunol . 164 (2000) 4178-4184. No hay "unión a Clq" si en tal prueba la densidad óptica (DO) a 492-405 nm es inferior para el anticuerpo de prueba al 15% del valor de unión al Clq humano de la parte Fe del anticuerpo salvaje no modificada a una concentración de anticuerpo de 8 pg/ml. La "unión a Clq" reducida está en el intervalo de 15% a 30% del valor de unión al Clq humano de la parte Fe del anticuerpo salvaje no modificada en las mismas condiciones. La ADCC puede medirse como unión del anticuerpo al FcyRIIIa humano en células humanas NK. La unión se determina a una concentración de anticuerpo de 20 pg/ml. "No unión al receptor de Fcy" o "no ADCC" significa una unión de hasta 30% al FcyRIIIa humano en células NK humanas a una concentración de anticuerpo de 20 pg/ml comparado con la unión del mismo anticuerpo como IgGl humana (SEC ID NO: 3). "Unión reducida al receptor de Fcy" o "ADCC reducida" significa una unión de 30% a 60% al FcyRIIIa humano en células NK humanas comparado con la unión del mismo anticuerpo como IgGl humana (SEC ID NO: 3) .
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo que se une a CCR5 y también se une al receptor de Fcy y/o factor del complemento Clq. Un anticuerpo anti-CCR5 que se une al receptor Fe y/o al factor del complemento Clq provoca una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . De preferencia, este anticuerpo se caracteriza porque se une a CCR5, contiene una parte Fe derivada de origen humano, y también se une a los receptores de Fe y/o al factor del complemento Clq. Más preferentemente, este anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado o un anticuerpo agotado del antigeno de las células T. La unión de Clq puede medirse de acuerdo con Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184. La ADCC puede medirse como la unión del anticuerpo al FcyRIIIa humano en células NK humanas. La unión se determina a una concentración de anticuerpo de 20 pg/ml. Los anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen, además, tales anticuerpos con "modificaciones de secuencias conservadoras" (anticuerpos variantes), modificaciones de la secuencia nucleotidica y aminoácidos, que no afectan o alteran las características mencionadas anteriormente del anticuerpo de acuerdo con la invención. Las modificaciones pueden introducirse mediante técnicas estándares conocidas en la materia, como la mutagénesis dirigida y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadores
incluyen aquellas en las el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido con cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales no cargadas polares (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina , triptófano, histidina). Asi, un residuo de aminoácido que se predice como no esencial en un anticuerpo anti-CCR5 humano puede estar reemplazado de preferencia con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Por lo tanto, un anticuerpo anti-CCR5 "variante", en la presente se refiere a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-CCR5 "progenitor" en hasta diez, de preferencia de aproximadamente dos y aproximadamente cinco, adiciones, eliminaciones y/o sustituciones en una o más regiones variables del anticuerpo progenitor. Las sustituciones de aminoácido pueden realizarse mediante mutagénesis basada en el
modelado molecular como se describe en Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 y Queen, C., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033. Una modalidad de la invención es un método para la producción de un anticuerpo contra CCR5 que no se une o muestra una unión reducida al receptor de Fcy y/o Clq, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo humano de tipo IgGl que se une a CCR5 se modifica de tal forma que el anticuerpo modificado no se une o muestra una unión reducida a Clq y/o al receptor de Fcy, este ácido nucleico modificado y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera de tal anticuerpo se insertan en un vector de expresión, este vector se inserta en una célula hospedera eucariótica, la proteina codificada se expresa y se recupera de la célula hospedera o del sobrenadante. De preferencia, el anticuerpo se modifica mediante "cambio de clase", es decir cambio o mutación de la parte Fe (por ejemplo de IgGl a IgG4, y/o mutación IgGl/IgG4) definido de preferencia como IgGlvl (PVA-236; GLPSS331), IgGlv2 (L234A; L235A) , IgGlv3 (S228P; L235E) , IgGlx (S228P), IgG4vl (PVA-236). GLPSS331 indica las mutaciones E233P, L234V, L235A, delta G236, A327G, A330S, P331S. La identidad u homología con respecto a la secuencia se define en la presente como un porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a la
secuencia progenitor, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, eliminaciones o inserciones N-terminal, C-terminal o internas en la secuencia del anticuerpo deben realizarse de forma que afecten la identidad u homología de secuencia. Las variantes retienen la capacidad de unirse al CCR5 humano y tienen de preferencia propiedades que son superiores a las del anticuerpo progenitor. Por ejemplo, las variantes pueden tener efectos colaterales reducidos durante el tratamiento. El anticuerpo "progenitor" en la presente es el que está codificado por una secuencia de aminoácidos usada para la obtención de la variante. De preferencia, el anticuerpo progenitor tiene una región marco humana y, si está presente, tiene una región constante del anticuerpo humana o dominios constantes de anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo progenitor puede ser un anticuerpo humanizado o humano. Los anticuerpos de acuerdo con la invención se producen de preferencia mediante los métodos recombinantes . Tales métodos se conocen ampliamente en el estado de la materia y comprenden expresión de proteínas en células procarióticas y eucarióticas con el posterior aislamiento del polipéptido del anticuerpo y normalmente la purificación en una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de proteínas, se insertan ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas
y ligeras, o fragmentos de las mismas, en vectores de expresión mediante métodos estándares. La expresión se realiza en células hospederas procarióticas o eucarióticas adecuadas, como las células CHO, células BHK, células PER.C6®, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, levaduras, o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o tras la lisis de las células) . La producción recombinante de anticuerpos es bien conocida en el estado de la técnica y se describe, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; erner, R.G.,
Arzneimittelforschung-Drug Res. 48 (1998) 870-880. Los anticuerpos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en forma parcialmente purificada, o sustancialmente pura. La purificación se realiza para eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándares, que incluyen tratamiento alcalino/SDS , gradiente de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas bien conocidas en la materia. Ver Ausubel, F. , et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience , New York (1987).
La expresión en células NSO se describe en, por ejemplo, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y., et al., Nucí. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Cárter, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK 293) se describe en Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83, y por Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199. Los anticuerpos monoclonales se separan de forma adecuada del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como, por ejemplo, proteina A-Sefarosa, cromatografía en hidroxiapatita , electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN que codifican los anticuerpos monoclonales se aislan y secuencian fácilmente utilizando los procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de tales ADN y ARN. Una vez aislados, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que se transfectan entonces en las células hospederas, como las células HEK 293, células CHO, o células de mieloma que no producen de otra manera la proteína de
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células hospederas. Las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo CCR5 humano se preparan mediante la adecuada introducción de cambios de nucleótidos en el ADN que codifica el anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones pueden realizarse, no obstante, sólo en un intervalo muy limitado, por ejemplo como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las variantes no alteran las características del anticuerpo mencionadas anteriormente como el isotipo de IgG y la unión de epítopo, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante , la estabilidad de proteína, o facilitar la purificación. Cualquier residuo de cisteína que no esté involucrado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo anti-CCR5 también puede sustituirse, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y para prevenir un entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, los enlaces de cisteína se pueden añadir al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como un fragmento Fv) . Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón original de glucosilación del anticuerpo. Por "alterar" se entiende eliminar uno o más porciones de carbohidratos encontrados en el anticuerpo y/o añadir uno o
más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de anticuerpos es normalmente de tipo N-unido. El término "N-unido" se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a tal cadena de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina , en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Asi, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se logra de forma adecuada mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos que contiene uno o más de las secuencias anteriores de tripéptidos (para los sitios de glucosilación unidos a N) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácido de anticuerpo anti-CCR5 se preparan mediante una serie de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que aparecen naturalmente) o preparación mediante mutagénesis mediada (o dirigida) por oligonucleótidos , mutagénesis por PCR, y mutagénesis en cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante de un anticuerpo anti-CCR5 humanizado.
Otro tipo de modificación covalente involucra el acoplamiento de glucósidos química o enzimáticamente al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no necesitan la producción del anticuerpo en una célula hospedera que sea capaz de realizar una glucosilación unidad a N- 0- . Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azúcar (es) (s) pueden unirse a (a) arginina y/o histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina , (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina , tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en la WO 87/05330, y en Aplin, J.D. y Wriston, J.C. Jr . , CRC Crit . Rev. Biochem. 10 (1981) 259-306. La eliminación de cualquier porción de carbohidrato presente en el anticuerpo puede lograrse química o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere de la exposición del anticuerpo al compuesto del ácido trifluorometansulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto del azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando el anticuerpo intacto. La desglucosilación química se describe en Sojar, H.T. y Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57; Edge, A.S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. La escisión enzimática
de las porciones de carbohidrato en los anticuerpos, puede conseguirse mediante el uso de una serie de endo- y exoglucosidasas como se describe en Thotakura, N.R. y Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359. Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de una serie de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma descrita en las Patentes US Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337. El dominio variable de las cadenas ligeras y pesadas de acuerdo con la invención se combinan con secuencias de promotores, de inicio de la traducción, región constante, región 3' sin traducir, poliadenilación y finalización de la transcripción para formar construcciones de vectores de expresión. Construcciones de expresión de cadena ligera y pesada pueden combinarse en un sólo vector, pueden co-transfectarse, transíectarse de forma seriada, o transíectarse de forma separada en células hospederas, que luego se fusionan para formar una única célula hospedera que expresa ambas cadenas . La invención también comprende el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para el diagnóstico de susceptibilidad al SIDA in vitro, de preferencia mediante una prueba inmunológica que determina la unión entre CCR5 soluble
de una muestra de plasma humano (Tsimanis, T . , Immunology Letters 96 (2005) 55-61) y el anticuerpo de acuerdo con la invención. La expresión de CCR5 posee una correlación con la progresión de la enfermedad, y puede usarse para identificar individuos de bajo o alto riesgo de susceptibilidad al SIDA. Para los propósitos de diagnóstico, los anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno pueden estar marcados o no marcados. Normalmente, las pruebas de diagnóstico involucran la detección de la formación del complejo resultante de la unión de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo a CCR5. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales de la presente invención, o la porción de unión a antigeno de los mismos, formulada junto con un transportador farmacéuticamente aceptable . Como se usa en la presente, "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos , agentes isotónicos retardantes de la absorción/resorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. De preferencia, el transportador es adecuado para inyección o infusión. Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una serie de métodos conocidos en la
técnica. Como podrá apreciar el experimentado, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados . Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de estos medios y agentes con las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Además del agua, el portador puede ser, por ejemplo, una solución salina isotónica amortiguada. Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, están formuladas en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante los métodos convencionales conocidos por los experimentados en la técnica. Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para alcanzar la respuesta terapéutica adecuada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxica para el paciente (cantidad efectiva). El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una serie de factores farmacocinéticos que
incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, sal o amida de la misma, de la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular a emplear, de otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, de la edad, sexo, peso, estado, salud general e historia médica previa del paciente a ser tratado, y de factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. La invención comprende el uso de anticuerpos de acuerdo con la invención para el tratamiento de un paciente que padece inmunodepresión, como la inmunodepresión en un paciente con síndromes de inmunodeficiencia como el SIDA, en un paciente que sometido a terapia de radiación, quimioterapia, terapia para una enfermedad autoinmunitaria u otra terapia farmacológica (por ejemplo, terapia con corticosteroides ) , que provoque inmunodepresión, o para el tratamiento de un paciente que padece GvHD o HvGD (por ejemplo tras un trasplante) . La invención comprende también un método para el tratamiento de un paciente que padece tal inmunodepresión. La invención también proporciona un método para la manufactura de una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable, y el uso del anticuerpo de acuerdo con la invención para tal método. La
invención también proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como medicamento. También se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para el tratamiento de una enfermedad inmunodepresora. La invención también proporciona el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva para la elaboración de un agente farmacéutico, de preferencia junto con un transportador farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un paciente que padece inmunodepresión . La invención también proporciona el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva para la elaboración de un agente farmacéutico, de preferencia junto con un transportador farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un paciente que sufre una liberación de mediadores inflamatorios mediada por CCR5. Los siguientes ejemplos y listado de secuencias se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, pero el verdadero alcance de la misma se describe en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos descritos sin alejarse del espíritu de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
SEC ID NO: 1 Fórmula I, cadena pesada, dominio variable SEC ID NO: 2 Fórmula II, cadena ligera, dominio variable
SEC ID NO: 3 región constante de la cadena pesada Yl SEC ID NO: 4 región constante de la cadena pesada Y4 SEC ID NO: 5 región constante de la cadena ligera ? SEC ID NO: 6 dominio variable de la cadena pesada SEC ID NO: 7 dominio variable de la cadena pesada SEC ID NO: 8 dominio variable de la cadena pesada SEC ID NO: 9 dominio variable de la cadena ligera SEC ID NO: 10 dominio variable de la cadena ligera Ejemplo 1 Producción recombinante de anticuerpos Los vectores para la expresión de anticuerpos de acuerdo con la invención, se construyeron como sigue. Se construyó un vector de expresión de cadena pesada uniendo un dominio variable de la cadena pesada a la región constante de la IgGl humana (SEC ID NO: 3) en el vector de expresión pSVgpt. Se construyó un vector de expresión de cadena ligera uniendo un dominio variable de la cadena ligera a una región constante de la cadena ligera Kappa humana (SEC ID NO: 5) en el vector de expresión pSVhyg. Se introdujeron secuencias flanqueantes 5', que incluyen el péptido señal líder, el intrón líder y el promotor de la inmunoglobulina de murino y las secuencias flanqueantes 3' , que incluyen el sitio de corte y empalme, y la secuencia de intrón se introdujo usando los vectores VH-PCR1 y VK-PCR1 como moldes. Los vectores de expresión de las cadenas ligera y pesada se co-transfectaron en células NSO
(ECACC No. 85110503, un mieloma de ratón que no produce inmunoglobulina) . Los clones de células transfectadas se cribaron para la producción de anticuerpo humano mediante un ELISA para la IgG humana. Ejemplo 2 Constxucción de plásmidos de expresión para los anticuerpos anti-CCR5 mutantes (variante) Los plásmidos de expresión que codifican anticuerpos anti-CCR5 mutantes de cadenas ligera y pesada se crearon mediante mutagénesis dirigida al sitio de los plásmidos de expresión usando el equipo de mutagénesis dirigida QuickChange™ (Stratagene) y se describen en la Tabla 1. Los aminoácidos se numeran de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta. ed., National Institutes of Health, Bethesda, D, Publicación No. 91-3242 (1991) ) . La Tabla 1 muestra las mutantes de cadenas constantes (Fe) . Tabla 1
Isotipo Abreviatura Mutaciones Descripción IgGl IgGlv2 L234A; La secuencia de L235A aminoácidos Leu234Leu235 de la cadena pesada ?? humana, se sustituye por la secuencia de aminoácidos Ala234Ala235
Explicación de las mutaciones: L234A indica que la leucina en la posición de aminoácido 234 según Kabat cambia a alanina . Ejemplo 3 Prueba de fusión célula-célula En el día 1, las células HeLa que expresan gpl60 (2 x 104 células/50 µ?/????) se sembraron en una placa blanca de microtitulación de 96 pozos en medio DMEM suplementado con FCS al 10% (v/v) y 2 µg/ml de doxiciclina. En el día 2, se añadieron 100 µ? de muestra de sobrenadante o anticuerpo de control por pozo en una placa transparente de microtitulación de 96 pozos. Después se añadieron 100 µ? de medio que contenia 8xl04 células CEM-NKr-Luc en suspensión y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. El medio de cultivo de células HeLa se aspiró de la placa de 96 pozos, se añadieron 100 µ? de la mezcla de 200 µ? de anticuerpo/CEM-NKr-Luc y se incubó durante la noche a 37°C. En el día 3, se añadieron 100 µ?/???? de sustrato de la prueba de la Luciferasa Bright-Glo™ (1,4-ditiotreitol y ditionito sódico; Promega Corp., USA) y se midió la luminiscencia tras un mínimo de 15 minutos de incubación a TA. Materiales : Las células HeLa-R5-16 (línea celular que expresa gpl60 de VIH hasta la inducción con doxiciclina) se cultivaron en medio DMEM que contenía nutrientes y FCS al 10% (v/v) con G418
400 pg/ml e higromicina B 200 pg/ml. CEM.NKR-CCR5-Luc (Número de Catálogo: 5198) es una línea celular de células T disponible en el NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA . Tipo celular: CEM . KR-CCR5 (Número de Catálogo: 4376) se transfectó (electroporación) para expresar el gen de la luciferasa bajo el control transcripcional del LTR del VIH-2 y se hizo crecer en RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%, glutamina 4 mM, penicilina/estreptomicina y sulfato de geneticina 0.8 mg/ml (G418). Características de crecimiento: células linfoides redondeadas, morfología no muy variable. Las células crecieron en suspensión como células libres, que podían formar pequeños grupos. Resiembra 1:10 dos veces a la semana. Características especiales: Expresión de la actividad luciferasa tras la transactivación del LTR del VIH-2. Adecuado para la infección con aislamientos primarios de VIH, para pruebas de neutralización y sensibilidad a fármacos ( Spenlehauer , C, et al., Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974) . La línea celular se obtuvo a través del NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH de Drs . John Moore y Catherine Spenlehauer. Amortiguador de la prueba de Luciferasa Bright-Glo™ (Promega Corp., USA. Parte No. E2264B) . Sustrato de prueba Luciferasa Bright-Glo™ (Promega
Corp., EE.UU., parte No. EE26B) . Resultados : Los resultados se presentan en la Tabla 2. Los valores IC50 están entre 46 y 399 ng/ml. La región constante anticuerpo es un IgGl mutada (IgGlv2). Tabla 2
Ejemplo 4 Prueba antiviral con virus vivo Se prepararon PBMCs a partir de aislado de la capa leucocitaria mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Lymphoprep™ (Nycomed Pharma AG, Oslo, Noruega). Las células de cuatro donantes diferentes se mezclaron, se estimularon durante 1 día con PHA y se cultivaron posteriormente en medio RPMI gue contenia penicilina/estreptomicina al 1% (p/v) , GlutaMAX™ al 1% (Invitrogen Corp., EE.UU., No. Cat . 35050-038), piruvato
sódico al 1%, aminoácidos no esenciales al 1% (p/v) y FBS al 10%, durante dos días en presencia de 5 U/ml de IL-2 ( interleucina-2 ) . Se añadieron 100,000 PBMC en 50 µ? (células mononucleares de sangre periférica) a 100 µ? de una solución de anticuerpos (dilución seriada entre 0.006-17.5 pg/ml, en medio RPMI suplementado y se infectaron con 250 TCID50 (mediana de la dosis infectiva en tejido cultivado) de NLBal (cepa NL4.3 (Adachi, A., et al., J. Virol. 59 (1986) 284-291) con el env de BaL (gpl20)) o alternativamente JRCSF (O'Brien, W.A., et al., Nature 348 (1990) 69-73) en un volumen de 50 µ?. La mezcla se incubó durante 6 días a 37 °C en un incubador de CO2. Se recogió el sobrenadante y se diluyó posteriormente 1:50 con medio RPMI suplementado con 5 U/ml de IL-2. La medición de p24 se realizó mediante un ELISA de p24 del VIH-1 ( Perkin-Elmer , USA). Las muestras después se neutralizaron y se transfirieron a placas de pozos que se cubrieron con un anticuerpo monoclonal de ratón altamente especifico para la p24 del VIH-1. El anticuerpo monoclonal inmovilizado captura la p24 del VIH-1. Las muestras del cultivo celular no necesitan interrupción y se añadieron directamente a las placas de micropozos cubiertos con anticuerpo monoclonal. El antigeno capturado forma un complejo con el anticuerpo policlonal biotinilado dirigido contra la p24 del VIH-1, seguido de un conjugado de estreptavidina-HRP
(peroxidasa de rábano picante). El complejo resultante se detectó mediante la incubación con orto-fenilendiamina-HCl (OPD) que produce un color amarillo que es directamente proporcional a la cantidad de p24 del VIH-1 capturado. La absorbancia de cada pozo de la placa se determinó usando un lector de placas y se calibró frente a la absorbancia de un de antigeno estándar p24 del VIH-1 o una curva estándar. Resultados : Para la inhibición del crecimiento de VIH en PBMC humanas, se determinaron los valores de IC50 en el intervalo de 2.27 ng/ml a 14.21 ng/ml para los anticuerpos anti-CCR5 que comprenden las diferentes combinaciones de dominios variables de cadenas pesadas (SEC ID NO: 6, 7, 8) y ligeras (SEC ID NO: 9, 10) y de un isotipo de IgGl. Para estas combinaciones, los valores de ICg0 están en el intervalo de 9.77 ng/ml a 74.06 ng/ml . Para los anticuerpos anti-CCR5 que comprenden una región constante de IgGl mutada (IgGlv2), se determinaron los valores de IC5o de las diferentes combinaciones de dominios variables de cadenas pesadas en el intervalo de 8.22 ng/ml a 43.11 ng/ml mientras que los valores de IC90 se determinaron en el intervalo de 51.95 ng/ml a 311.38 ng/ml. Ejemplo 5 ELISA de células CCR5 Se sembraron 20,000 células CHO que expresan de forma
recombinante CCR5 en placas de 96 pozos, y se incubaron durante la noche a 37°C. Después de esto, se aspiró el medio y se añadieron 40 µ? de medio fresco. Se añadieron 10 µ? del primer anticuerpo diluido en el medio y se incubó dos horas a 4°C. El medio se aspiró, se añadieron 100 µ? de glutardialdehido (c = 0.05% en solución salina amortiguada con fosfato (PBS)) y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con 200 µ? de PBS, se añadieron 50 µ? de anticuerpo de detección (1:1000 hasta 1:2000 diluido en amortiguador de bloqueo de ELISA) y se incubó dos horas a temperatura ambiente. Se añadieron 50 µ? de 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y la reacción se paró tras 7 min. La densidad óptica se midió a 450 nm (contra 620 nm) . Primer anticuerpo: anticuerpo a examinarse Segundo anticuerpo (detección): anticuerpo de oveja especifico anti-IgG-gamma humana conjugado con peroxidasa (The Binding site No. Cat. AP004) 1:2000 (6 µ1/12 mi) diluido en amortiguador de bloqueo PBS al 10%. Medio: F-12 de HAM o GIBCO con GlutaMAX™, FCS al 10%, Higromicina 200 µg/ml (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) Bloqueo de ELISA: Roche Diagnostics GmbH, Alemania, No. 1112589, solución al 10% (v/v) en agua, diluido 1:10 en PBS TMB: Roche Diagnostics GmbH, Alemania, No. 1432559, solución lista para usarse.
Resultados : Los resultados del ELISA de células CCR5 muestran que la unión al CCR5 humano de los anticuerpos anti-CCR5, que comprende las diferentes combinaciones de dominios variables de cadenas pesadas (SEC ID NO: 6, 7, 8) y ligeras (SEC ID NO: 9, 10) está en el intervalo de aproximadamente 2.71 a 3.13 (DO 450/620) a una concentración de 1000 ng/ml. Ejemplo 6 Potencial de los MAb CCR5 de unirse a FcyRIIIa en células NK Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse a FcYRIIIa (CD16) sobre células Natural Killer (NK) , se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se incubaron con 20 pg/ml de anticuerpo y anticuerpos control en presencia o ausencia de 20 g/ml de un anticuerpo bloqueador de ratón contra FcyRIIIa (anti-CD16, clon 3G8, RDI, Flanders, NJ) , para verificar la unión mediante FcyRIIIa. Como controles negativos, se usaron las IgG2 y IgG4 humanas (The Binding Site), que no se unen a FcyRIIIa. IgGl y IgG3 humanas (The Binding Site) se incluyen como controles positivos para la unión de FcyRIIIa. Los anticuerpos unidos sobre las células NK se detectaron mediante análisis de FACS usando un anticuerpo de ratón anti-CD56 (marcador de superficie celular de NK) humano marcado con PE (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA) en combinación con un anticuerpo F(ab)2 de cabra anti-IgG (Fe) humano marcado con
FITC (Protos Immunoresearch, Burlingame, USA) . La unión máxima (Bmáx) se determinó a una concentración de anticuerpo de 20 µ?/???. El anticuerpo control (IgG4 humano) muestra hasta un 30% Bmax en comparación al 100% de Bmáx para la IgGl humana. Por lo tanto "sin unión de FcYRIIIa o sin ADCC" indica a una concentración de anticuerpo de 20 pg/ml un valor de Bm¿x de hasta un 30% en comparación con la IgGl humana. Ejemplo 7 Prueba de quimiotaxis de CCR5 Las células L1.2hCCR5 se cultivaron en RPMI 1640 que contenia suero de bovino fetal al 10%, 1 x Penicilina/Estreptomicina, 1 x glutamina, 1 x piruvato sódico, 1 x ß-mercaptoetanol y 250 g/ml de G418 (todos de Invitrogen Inc., USA) . Justo antes del inicio de la prueba de quimiotaxis, las células se centrifugaron y resuspendieron en amortiguador de quimiotaxis (solución salina equilibrada de Hank HBSS (Invitrogen) que contiene BSA al 0.1% y HEPES 10 mM) . Las células se usaron en la prueba de quimiotaxis a una concentración final de 5 x 106 células/ml. Los ligandos humanos de CCR5 , ????a, ????ß o RANTES (R&D Systems, USA) se diluyeron en el amortiguador de quimiotaxis y se usaron a una concentración final de 20 nM. Los anticuerpos de prueba o los anticuerpos adecuados de control de isotipo se diluyeron en HBSS. La prueba de quimiotaxis se inició en el sistema ChemoTx® de 96 pozos y de 0.5 µ?? de poro (Neuroprobe Inc.,
USA) . Cada anticuerpo se mezcló con uno de los ligandos de CCR5 y 30 µ? de esta mezcla se colocaron al fondo del pozo del sistema ChemoTx®. El filtro se colocó por encima del fondo del pozo. Cada anticuerpo se mezcló con las células L1.2hCCR5 y 20 µ? de esta mezcla se colocó sobre el filtro. Las placas se situaron entonces en una cámara de humidificación y se incubaron a 37°C y con CO2 al 5% durante tres horas. Después de la incubación, las células se rascaron del filtro y se centrifugaron las placas en una centrifuga de sobremesa a 2000 rpm durante 10 min. Después el filtro se eliminó y la densidad de las células que han migrado al fondo de los pozos se detectó usando un kit de prueba de proliferación celular CyQUANT® (Invitrogen) y el lector de placas Spectra MAX GeminiXS (Molecular Devices, Wokingham, UK) según las instrucciones del fabricante. Los valores de IC50 se calcularon usando Prism 4 (GraphPad Inc., USA). Los valores de IC50 para los ???-? humano, ???-1ß humano, y RANTES humano para las diferentes combinaciones de dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras con una región constante del isotipo IgGl están en el intervalo de aproximadamente 0.80 nM a 0.91 nM, de aproximadamente 0.72 nM a 1.08 nM, y aproximadamente 0.85 nM a 2.69 nM, respectivamente . En el caso de un isotipo IgGl mutado (IgGlv2) los valores de IC50 para los ???-? humano, MIP-?ß humano, y RANTES humano
están en el intervalo de aproximadamente 2.21 nM a 6.28 nM, de aproximadamente 2.16 nM a 6.87 nM, y de entre 3.59 nM a 5.03 nM, respectivamente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.