TW200813026A - Novel co-crystal - Google Patents

Description

200813026 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種新穎的共結晶體，且尤其關於一種碟 酸二氮2-{乙基[3-({4-[(5-{2-[(3 -氟苯基）胺基]-2 -側氧基乙 基}-1丑-吼唾-3-基）胺基]啥嗤琳-7-基}氧基）丙基]胺基}乙 酯（在本文中被稱作AZD1152)之新穎共結晶體形式，其為 適用於治療過度增生性疾病（諸如癌症）的極光激酶抑制 劑。更特定言之，本發明係關於一種AZD1152之順丁烯二 酸鹽共結晶體、一種製備AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶 體之方法、含有AZD11 52之順丁烯二酸鹽共結晶體之醫藥 組合物、AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體在製造用於治 療過度增生性疾病（諸如癌症）之藥物中的用途，及藉由投 與治療有效量之AZD 11 52之順丁烯二酸鹽共結晶體在人體 或動物體中治療過度增生性疾病（諸如癌症）的方法。本發 明亦係關於一種AZD 1152之順丁烯二酸鹽共結晶體之特定 結晶形式。 【先前技術】 癌症（及其他過度增生性疾病）之特徵在於不受控制的細 胞增殖，其在喪失細胞增殖之正常調節時發生。此喪失通 常似乎是對經由細胞週期控制其細胞發展之細胞路徑的遺 傳損傷所產生之結果。 咸信在真核細胞中，蛋白質磷酸化之有序級聯會控制細 胞週期。人們已鑑別出在此級聯中起關鍵作用之若干蛋白 激酶家族。與正常組織相比，眾多該等激酶之活性在人類 120508.doc 200813026 腫瘤中增加，此乃見諸於蛋白質之表現程度的增加（例如 由於基因擴增）或輔活化子或抑制蛋白之表現的變化。 這些細胞週期調節劑中首先經鑑別且最廣泛研究的為週 期素依賴性激酶（或CDK)。近來，結構上不同mCDK家族 之蛋白激酶已經被鑑別，且發現其在調節細胞週期中起關 鍵作用。該等激酶亦似乎在形成腫瘤中為重要的，且包括 果蜗極光及釀酒酵母（$ 蛋白之 人類同源物。該等基因之三種人類同源物極光·Α、極光_Β 及極光-C(亦分別被稱作極光2、極光1及極光3)編碼調節細 胞週期之絲胺酸-蘇胺酸蛋白激酶（概述於Adams等人， 2001，Trends in Cell Biology· 11(2): 49-54 中）。該等物質經 由G2及有絲分裂展示表現及激酶活性之峰。若干觀測暗示 在癌症中涉及人類極光蛋白。極光_ A基因定位於染色體 2〇ql3，其為通常在人類腫瘤（包括乳房腫瘤及結腸腫瘤）中 擴增的區域。極光-A可為此擴增子之主要目標基因，因為 極光-A DNA在大於50%之原發性人類結腸直腸癌中擴增且 mRNA在其中過度表現。與相鄰正常組織相比，在這些腫 瘤中，極光-A蛋白含量似乎極大提高。另外，以人類極 光-A轉染齧齒動物纖維母細胞會產生轉化，其賦予在軟瓊 脂中生長且在裸小鼠中形成腫瘤的能力（Bisch〇ff等人， 1998，The EMBO Journal· 17(11): 3052-3065)。其他著作 (Zhou等人，1998，Nature Genetics. 20(2): 189_93)已展示 極光-A之人工過度表現使得中心體數目增大且非整倍性增 加，其為癌症發展中之已知事件。 120508.doc 200813026 亦已展示與正常細胞相比，在腫瘤細胞中存在極光-B (Adams 等人，2001，Chromsoma. 110(2):65-74)及極光-C (Kimura 等人，1999，Journal of Biological Chemistry， 274(11): 7334-40)之表現的增加。極光-B在癌症細胞中過 度表現且增大含量之極光-B已展示與晚期結腸直腸癌相關 (Katayama 等人（1999) J. Natl. Cancer Inst. 91:1160)。此 外，一個報導暗示極光-B之過度表現會經由組蛋白H3在絲 胺酸10處增加之磷酸化來誘發非整倍性且過度表現極光-B 之細胞會形成逐步展開轉移之侵襲#更強之腫瘤（Ota; T•等 人，2002, Cancer Res. 62: 5168-5 177)。極光-B為存在於具 有至少三種其他乘客蛋白Survivin、INCENP及Borealin之 穩定複合物中之染色體乘客蛋白（Carmena M.等人，2003, Nat· Rev· Mol· Cell Biol· 4: 842-854)。Survivin亦在癌症中 經上調且含有BIR(桿狀病毒細胞凋亡抑制蛋白（IAP)重複 序列）域且因此可在保護腫瘤細胞免受細胞凋亡及/或有絲 分裂突變中起作用。 關於極光-C，原以為其表現限於睾丸中，但已發現其在 各種癌症株中過度表現。（Katayama η等人’ 2003，Cancer and Metastasis Reviews 22: 451-464) ° 重要地，亦已證實由人類腫瘤細胞株之反義寡核苷酸處 理造成之極光-A表現及功能的終止（WO 97/22702及WO 99/3 7788)使得細胞週期停止且在該等腫瘤細胞株中發揮抗 增生性作用。另外，已證實極光-A及極光-B之小分子抑制 劑在人類腫瘤細胞中具有抗增生性作用（Keen等人，20〇1， 120508.doc 200813026

Poster #2455，American Association of Cancer Research annual meeting)，儘管具有單獨由siRNA處理之極光_b表 現之選擇性終止⑴itchfield等人，2〇〇3，J〇urnal Cell

Biology’ 161(2): 267-280)。此指示極光-A及/或極光-B之 功能之抑制應具有可適用於治療人類腫瘤及其他過度增生 性疾病之抗增生性作用。作為該等疾病之治療方法之極光 激S#的抑制可具有優於在細胞週期上游粗向信號路徑（例 如由諸如表皮生長因子受體（EGFR)或其他受體之生長因子 受體酪胺酸激酶活化的那些路經）的顯著優點。因為細胞 週期最後在所有該等不同信號事件之下游，所以可預測細 胞週期定向之療法（諸如極光激酶之抑制）在所有增生性腫 瘤細胞中具活性，同時可預測以特異性信號分子（例如 EGFR)定向之方法僅在表現彼等受體之腫瘤細胞之子集中 具活性。亦咸信在該等信號路徑之間存在顯著”干擾”，其 意謂一種組份之抑制作用可由另一種組分來補償。 極光激酶之抑制劑描述於國際專利申請案w〇 〇3/55491 及W0 2004/058781中，且尤其W0 2004/058781揭示具有 以下結構式之化合物，其在本文中被稱作AZd 11 52:

AZD1152 120508.doc 200813026 AZD11 52為迅速且完全轉變（在人類血漿中）為在本文中 被稱作AZD1152 HQPA之活性部分之前藥：

AZD1152 HQPA a *—4 4 赠今 ▼ ίγ ττ% 蠱 \L· % t * 考 •裊 A *nr^» Skr-V I t ·-% ^ r— 、、夕 I · *1 ,

A乙U1 nyFA苟徑元激轉的Air就f ΐ玍且口J逆πρ市1J 劑，具有抗極光A、B-INCENP及C-INCENP (Ki分別為 1369±419·2 nM、0_359±0·386 nM及 17.03±12·2 nM)之有效 活性。已發現AZD 11 52以統計顯著性抑制一系列人類結腸 直腸腫瘤異種移植物（SW620、HCT116、C〇1〇205)及肺腫 瘤異種移植物（A549、Calu-6)中之腫瘤生長。 AZD 11 52以二鹽酸鹽形式以及以水合形式之游離鹼揭示 於WO 2004/058781中。尤其以三水合物至四水合物形式揭 示游離形式。 自製造觀點來看，當在製造、乾燥、儲存及加工期間其 需要控制在適當位置時，水合形式產生問題。另外，獲得 具有一致化學計量的化合物與水之比率的化合物樣品且將 其保持為困難的。在先前揭示之AZD11 52之形式的情況 下，且尤其關於游離形式，水分子僅鬆散地結合至每一 AZD1152分子上，因此水分子與AZD1152藥物之締合程度 120508.doc -10- 200813026 及解離程度隨著溫度及相對濕度而極大改變。因此，對於 給定重量之AZD1152，以AZDU52之分子數目計之 1152的實際里會依賴於溫度及相對濕度(因為水含量 同樣會改變）。由重量決定之任何劑量之有效性因而亦依 - 帛於其所暴露之溫度及相對濕度而f動態蒸氣吸附法已 - 用於I測與A Z D115 2相關之水含量隨著濕度的變化。 购2〇_58781概括地揭示本文中揭示之化合物之某些 ( 西藥予^可接文的鹽。AZD1152僅以二鹽酸鹽形式及游離 形式揭示。未提及AZD1152之其他形式。詳言之，购 2004/058781未揭示勘1152之任何其他共結晶體且其無疑 未考慮特定化合物之任何特定共結晶 益處，且尤其未考慮其是否會具有可改善本文中丄： 題之益處。 【發明内容】 吾人已出乎意料且驚人地發現八21)1152之順丁烯二酸鹽 U 共結晶體以無水形式存在，其大體上為非吸濕性的。此 外’儘管藥物與順丁烯二酸鹽之化學計量比率可在(例如） • 8.1至1.2.1 ’或〇 9:1至i 1:1之範圍内改變，但吾人已發 現本文中揭不iAZDU52之順丁烯二酸鹽共結晶體具有大 體上1:1之藥物與順丁稀二酸鹽之可再現性化學計量比 率口此’ AZD11 52順丁烯二酸鹽共結晶體在與已經評估 之AZD1152之游離形式、二鹽酸鹽及其他共結晶體形式相 比之下，纟重ϊ冑4之有則生受溫度及相冑濕度影響之程 度車乂】另外，AZDl 152之順丁烯二酸鹽共結晶體更易於 120508.doc -11 - 200813026 製造，因為在製造過程中較不需要控制濕度量。順丁烯二 酸鹽共結晶體之無水本質進一步意謂由於在使用含水環境 之加工條件（例如濕式造粒）期間較低之水合/脫水風險，故 有可能使用有限之含水條件及/或高溫環境予以調配。 另外，吾人已發現AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體驚 人地比游離形式含有更少之雜質。詳言之，似乎在游離形 式轉變為順丁烯二酸鹽形式之後，某些存在於游離形式中 之頑抗雜質驚人地以遠為較低之數量存在。 因此，本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶 體。 * "曰日 為避免疑問，術語"AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體，，、 ”八201152順丁烯二酸鹽共結晶體，，或”入2；]〇1152順丁烯二酸 鹽（或本文中使用之任何其他類似術語）係指八2£)1152與 順丁浠二酸之間的任何締合形式，其包括鹽形式。詳今 之，該等術語涵蓋： (i) AZD1152與順丁烯二酸之間的非離子性締合（亦即 其中在藥物與順丁烯二酸之間未發生質子轉移）· 或 (π)離子性相互作用，其中在AZD1152與順丁烯二酸之 間已發生質子轉移以形成AZD1152之順丁烯二酸 鹽，或 (iii)上述⑴與(ii)之混合物。 在本發明t一特定實施例中，m丁烯二酸鹽共結晶體包 含AZD1152藥物與順丁烯二酸之間之非離子性締合(亦即 120508.doc -12- 200813026 其中在藥物與順丁烯二酸之間未發生質子轉移 在本發明之另一特定實施例中，順丁烯二酸鹽共結晶體 為AZD1152之順丁稀二酸鹽。 ^在一特定實施例中，AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 係藉由在適合溶劑（諸如甲醇、二甲亞颯（DMS〇)或dms〇 與甲醇、乙腈及其他類似溶劑之混合物）_將八2]31152游 離形式與順丁烯二酸混合來形成。順丁烯二酸鹽共結晶體 可藉由使結晶發生且隨後分離所得結晶物質來分離。本發 明之AZ1152之順丁烯二酸鹽共結晶體的身份可由質子核磁 共振（NMR)分析來確定。 亦應瞭解本發明之化合物或共結晶體可顯示互變異構現 象且本說明書中之圖式僅可表示可能之互變異構形式中之 者。應瞭解本發明涵蓋具有極光激酶抑制活性且尤其極 光-A及/或極光激酶抑制活性之任何互變異構形式且並 不僅限於在圖式中所用之任一種互變異構形式。 本發明亦係關於一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之特定結晶形式。此結晶形式係藉由使AZD1152之順丁烯 二酸鹽結晶體自有機溶劑（諸如甲醇與二甲亞砜（DMS〇)之 混合物）中結晶來製備。其他實驗細節在實例中提供。 因此，本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶 體之結晶形式。 AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體之結晶形式的特徵在 於其提供大體上如圖1中所示之X射線粉末繞射圖。 AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體之結晶形式之最主要 120508.doc -13- 200813026 χ射線粉末繞射峰展示於表1中： 表1 角 20° 相對強度 % 角 20° 相對強度 % 5.118 100 22.425 18.8 6.446 18.8 23.228 26.8 8.158 28.1 23.583 37.7 10.171 13.1 23.994 25.7 11.917 5.9 24.271 24.1 12.861 18 24.671 23.3 13.849 48.3 25.32 19.1 14.909 25.2 25.574 32.9 15.234 36 25.813 43.8 15.738 27.6 26.21 35.3 16.506 18.8 27.122 16 16.884 23 27.946 45.4 17.232 42.5 28.418 31.6 18.134 13.8 28.847 21.7 19.327 62.7 29.725 26.1 19.82 38.8 30.521 18.8 20.082 61 31.74 15.4 20.582 61.4 33.424 14.7 21.008 32 36.181 15.3 21.663 87.3 38.106 10.8 根據本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約2Θ=15.2°下具有至 少一個特定峰之X射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD 1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約2Θ=12·9°下具有特 120508.doc -14- 200813026 定峰之x射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD115 2之順丁稀二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約2Θ=15·2。或1〇·2。下 具有特定峰之X射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約2Θ=18·1。下具有特 定峰之X射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約20=10.2。、12.9。、 15.2。 或18.1°下具有至少一個特定峰之X射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約20=12.9。及15.2。及/ 或10.2。下具有特定峰之X射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約20=10.2。、12.9。、 15.2。 及18.1。下具有特定峰之X射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有在約表1中所示之20。值 之任一者或組合下具有特定峰之X射線粉末繞射圖。 根據本發明提供一種AZD 115 2之順丁烯二酸鹽共結晶體 之結晶形式，其中該共結晶體具有與圖1中所示之X射線粉 末繞射圖大體上相同之X射線粉末繞射圖。 ¥本文中隊述本發明係關於一種AZD 11 5 2之順丁稀二酸 鹽共結晶體之結晶形式時，如由X射線粉末繞射資料所測 120508.doc -15- 200813026 定之結晶度便利地大於約60%，更便利地大於約8〇%，較 佳大於約90%。 在定義AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體之結晶形式的 X射線粉末繞射峰之前述段落中，在表達”…在約2Θ=···”中 使用之術語π在約’’指示峰之精確位置（亦即敍述之20角度 值）不應理解為絕對值’因為如熟習此項技術者應瞭解， 在不同機器、不同樣品之間，或由於所用之量測條件之輕 微變化，該等峰之精確位置可輕微改變。在前述段落中亦 陳述AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體之結晶形式提供與 圖1中所示之X射線粉末繞射圖"大體上”相同之又射線粉末 繞射圖，且大體上具有表1中所示之最主要之峰（2Θ角度值） 且尤其在約2Θ=10·2。、12.9。、15_2。或18.1。下。應瞭解在 上下文中術語’’大體上"之使用亦意欲指示χ射線粉末繞射 圖之2Θ角度值可在不同機器、不同樣品之間，或由於所用 之量測條件之輕微變化而輕微改變，因此再次重申圖中所 示或表中提供之峰位置不應理解為絕對值。 就此而論，此項技術中已知視量測條件（諸如設備、樣 品製備或所使用之機器）而定可獲得具有一或多個量測誤 差之X射線粉末繞射圖。詳言之，通常已知χ射線粉末繞 射圖之強度可視量測條件及樣品製備而波動。舉例而言， 七習X射線粉末繞射之技術者應瞭解峰之相對強度可受到 (例如）尺寸大於3 〇微米之晶粒及非單一縱橫比（其可影響樣 口口之分析）的影響。熟習此項技術者亦應瞭解反射之位置 可文到樣品處於繞射儀中之精確高度及繞射儀之零校正的 120508.doc •16- 200813026 影響。樣品之表面平坦度亦可具有較小影響。因此熟習此 項技術者應瞭解本文中呈現之繞射圖資料不應理解為絕對 的（進一步資訊參見 Jenkins，R及Snyder，RL ，Intr〇ducti〇n to X-Ray Powder Diffractometry1 John Wiley & Sons, 1996)。因此，應瞭解本發明之AZd 11 52之順丁烯二酸鹽 共結晶體的結晶形式不限於提供與圖1中所示之χ射線粉末 繞射圖相同之X射線粉末繞射圖的晶體及提供與處於本發 明之範疇内的圖1中所示之χ射線粉末繞射圖大體上相同之 X射緯粉末繞射圖的住何晶體。熟fx射線粉末繞射之技 術者能夠判斷X射線粉末繞射圖之大體上一致性。 通常，X射線粉末繞射圖中繞射角之量測誤差為約 2Θ=0·5°或更小（或，更適合地，約2θ = 〇·2。或更小），且當考 慮圖1中之X射線粉末繞射圖且當說明上文中及表丨中提及 之峰位置時，應考慮此量測誤差之程度。因此，若陳述 (例如）共結晶體具有在約2Θ=15·2。（或以上提及之其他角之 任一者）下具有至少一個特定峰之χ射線粉末繞射圖，則此 可理解為2Θ=15·2。加或減〇·5。，或2Θ=15·2。加或減〇 2〇。 根據本發明之另一態樣，提供一種製備如本文中所定義 之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體的方法，該方法包含 在適合溶劑（諸如甲醇、Ν_甲基_2_吡咯啶酮、二甲亞砜 (DMS0)或DMS0與甲醇、乙腈及其他類似溶劑之混合物) 中將AZD1152游離形式之溶液與順丁烯二酸混合的步驟。 該方法可it纟包含結晶及（視情況）分離所形成之結晶之 AZD11 52之順丁烯二酸鹽共結晶體的步驟。 120508.doc •17- 200813026 "亥方法可額外包含其他步驟：以適合溶劑洗滌AZD11 52 之順丁烯二酸鹽共結晶體；且乾燥該AZDU52之順丁烯二 酸鹽共結晶體。 適a地’將AZD1152游離形式溶解於適合溶劑（諸如二 甲亞石風、甲醇、其混合物或Ν_甲基_2•吡咯啶酮）中且通常 共順丁烯二酸（將其溶解於相同或相容性溶劑中）之溶液混 合。或者，可將固體順丁烯二酸添加至AZDU52游離形式 >谷液中（或反之亦然，亦即將人2]〇1152游離形式溶液添加 至固體順丁稀一酸中）。適合地，將溶液擾掉以促進 AZDn52游離形式與添加之順丁烯二酸之混合。該等物質 (理想但並非唯一地，以1:丨比率）可在周圍溫度下混合，但 該程序亦可在更高溫度下進行。 可使用此項技術中已知之任何用於分離結晶之Azd 11 52 之順丁烯二酸鹽形式的適合方法。適合地，藉由過濾收集 AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體。 經洗滌之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體較佳在真空 下乾燥。 一般而言，需要1:1之AZD1152游離形式：順丁烯二酸 之比率。此所需之1:1比率可藉由將組成在〇 6-14 AZD1152游離形式：1.0順丁烯二酸之範圍内的AZD1152游 離形式與順丁烯二酸混合來獲得。適合地，混合物中 AZD1152游離形式：順丁烯二酸之比率在〇·9_ι·ι且尤其在 1·0·1·1 AZD1152游離形式：1·(Μ·ι順丁烯二酸之範圍内。 通常應使用過量順丁烯二酸且尤其混合物中AZD 1152游離 120508.doc -18- 200813026 形式·順丁稀二酸之比率在〇·6_1〇且尤其在〇·9_ι 〇 AZD1152游離形式·· 1()順丁烯二酸之範圍内。 1152順丁烯一酸鹽共結晶體通常自結晶，但熟習此 項技術者應瞭解需要時或必要時可使用播晶種技術以促進 共結晶體形成。 根據本發明之另一態樣，提供一種醫藥組合物，其包含 與醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑結合之如本文中所定義 的AZDU52之順丁烯二酸鹽共結晶體。 本發明之組合物可為適於口服使用之形式（例如以鍵 ^ 口 3 d硬膝囊或軟膠囊、水性或油性懸浮液、乳 液、可分散散劑或顆粒、糖漿或酏劑形式）、適於局部使 用之形式（例如以乳膏、軟f、凝膠，或水性或油性溶液 或懸浮液形式）、適於藉由吸入投藥之形式（例如以細粉狀 粉末或液體氣溶膠形式）、適於藉由吹人投藥之形式（例如 以細粉狀粉末形式）或適於非經腸投藥之形式（例如以無菌 水性或油性溶液形式用於靜脈内、皮下、肌肉内或肌肉内 給藥，或以栓劑形式用於直腸給藥）。 本毛月之、、且a物可使用此項技術中熟知之習知醫藥賦形 知由自知&序獲彳于。因Λ ’意欲用於口服使用之組合物可 a有（例如）或夕種著色劑 '甜味劑、芳香劑及/或防腐 劑。 用於錠劑調配物之適合醫藥學上可接受之賦形劑包括 (例如）：惰性稀釋劑’諸如乳糖、碳酸鈉、磷_或碳酸 約，成粒劑及崩解劑，諸如玉米澱粉或褐藻酸；黏合劑， 120508.doc -19- 200813026 諸如澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石；防腐 劑’諸如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸丙酯；及抗氧 化劑，諸如抗壞血酸。錠劑調配物可未經塗佈或（在兩種 u况下）使用此項技術中熟知之習知塗佈劑及程序經塗佈 以改變其崩解作用及隨後活性成份在胃腸道内之吸收，或 改良其穩定性及/或外觀。 用於口服使用之組合物可為硬明膠膠囊之形式，其中活 性成份係與惰性固體稀釋劑（例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高 嶺土）混合；或為軟明膠膠囊之形式，其中活性成份係與 水或油（諸如花生油、液體石蠟、大豆油、椰子油，或較 佳撖欖油’或任何其他可接受之媒劑）混合。 水性懸浮液通常含有呈細粉狀形式之活性成份，以及一 或夕種懸浮劑，諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙 基甲基纖維素、褐藻酸納、聚乙烯D比洛咬_、黃蓍膠及阿 拉伯膠，分散或濕潤劑，諸如卵磷脂或氧化烯與脂肪酸之 i) 縮合產物（例如聚氧乙烯硬脂酸酯），或氧化乙烯與長鏈脂 族醇（例如十七伸乙基氧基十六醇）之縮合產物，或氧化乙 烯與衍生自脂肪酸及己醣醇之偏酯之縮合產物（諸如聚氧 乙稀山梨糖醇單油酸s旨），或氧化乙稀與長鍵脂族醇（例如 十七伸乙基氧基十六醇）之縮合產物，或氧化乙烯與衍生 自脂肪酸及己_醇之偏s旨之縮合產物（諸如聚氧乙稀山梨 糖醇單油酸酉旨），或氧化乙稀與衍生自脂肪酸及己醋醇肝 之偏酯之縮合產物（諸如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯）。 水性懸洋液也可含有-或多種防腐劑（諸如對經基苯甲酸 120508.doc -20 - 200813026 =或料基苯甲酸_)、抗氧化劑（諸如抗壞血酸）、著 (aspartame))。 以如庶搪、糖精或阿斯巴甜糖 油性懸浮液可藉由將活性成份懸浮於植物油 油、撖欖油、芝麻油或椰子油）或 生 來調. ,, ^ . /戶、物油（诸如液體石蠟）中 來凋配。油性懸洋液也可含有 壤或十六醇。可添加諸如上述彼等^如蜂&、固體石

U 述彼荨之甜味劑及芳香劑以提 ，、可口之口服製劑。該等組合 如抗壞血酸）來防腐。 由添加抗氧化劑(諸 適用於藉由添加水來製備水性m浮液或溶液之可分 束乾粉末及顆粒通常含有活性成份以及分散或濕潤劑、歸 洋劑及-或多種防腐劑。適合分散或濕潤劑及懸浮劑係： 上文已提及之彼等來例示。亦可存在其他賦形劑，諸如甜 味劑、芳香劑及著色劑。 本發明之醫藥組合物亦可呈水包油乳液之形式。油性相 可為植物油（諸如橄欖油或花生油）或礦物 或任何該等油之混合物)。適合乳化劑可為(例如 膠’諸如阿拉伯膠或黃蓍膠；天然存在璘月旨，諸如大豆、 即鱗脂；_生自脂肪酸及己醣醇肝之§|或偏自旨（例如脫水 山梨糖醇單油酸酯）；及該等偏酯與氧化乙烯之縮合產 物，諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸醋。該等乳液；可 含有甜味劑、芳香劑及防腐劑。 糖漿及酏劑可以甜味劑（諸如甘油、丙二醇、山梨糖 醇、阿斯巴甜糖或簾糖)調配’ i亦可含有緩和劑、防腐 120508.doc -21- 200813026 劑、芳香劑及/或著色劑。 醫藥組合物亦可為無菌可注射水性或油性懸浮液、溶 液、乳液或特定系統之形式，其可使用適當分散或濕潤劑 及懸浮劑（其已在上文提及）中之_或多者根據已知程序來 調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋 劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如於聚乙二醇 中之溶液。

栓劑調配物可藉由將活性成份與適合非刺激性賦形劑一 起混合來製備，該賦形劑在平常溫度下為固體，但在直腸 皿度下為液體’且因此會在直腸中熔融以釋放藥物。適合 賦形劑包括（例如）可可脂及聚乙二醇。 局部調配物（諸如乳膏、軟膏、凝膠及水性或油性溶液 或懸浮液）通常可使用此項技術中熟知之習知程序藉由將 活性成份與習知、局部可接受之媒劑或稀釋劑一起調配來 獲得。 用於藉由吹入投藥之組合物可為含有平均直徑為(例如) 3〇 _或更小、較不佳5 _或更小且更佳介於5 _ _ 之間之粒子之細粉狀散劑的形式，該散劑自身包含單獨或 經一或多種生理學上可接受之載劑（諸如乳糖)稀釋之活性 成份。用於吹入之散劑隨後便利地保持在含有（例如）i叫 至5〇叫活性成份之膠囊中與-渦輪·吸人器裝置-起使 用’諸如用於吹入已知藥劑色甘酸鈉。 用於藉由吸入投藥之組合物 膠或含液體液滴之氣溶膠形式 可為呈含細粉狀固體之氣溶 的經安排以分配活性成份之 120508.doc -22- 200813026 習知加壓氣溶膠的形式。可使用諸如揮發性氟化煙或烴之 習知氣溶膠推進劑且氣溶膠裝置經便利安排以分配計量量 之活性成份。 關於調配物之其他資訊，讀者可查閱c〇mprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of

Editorial Board)，Pergamon Press 1990之第 5卷第 25 2章。 因此在本發明之另一態樣中，提供一種適用於療法中之 AZD1152之順丁稀二酸鹽共結晶體。進一步提供用作藥物 之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體。本發明之另一態樣 提供一種用作藥物之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體， 其中該藥物係用於治療過度增生性疾病，諸如癌症且尤其 結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰 腺癌或白血病或淋巴瘤。本文中提及之該等白血病及淋巴 瘤可為骨髓系之腫瘤（諸如急性骨髓白血病）或淋巴系之腫 瘤。 另外提供一種適用於由療法治療溫血動物（諸如人）之方 法中的AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體。本發明之另一 態樣提供一種適用於治療過度增生性疾病（諸如癌症且尤 其結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或 胰腺癌或白血病或淋巴瘤）之方法中的AZDU52之順丁烯 二酸鹽共結晶體。 在本發明之另一態樣中，提供AZDU52之順丁烯二酸鹽 共結晶體在製備藥物中的用冑，其中該藥物係用於治療其 中一或多種極光激酶之抑制作用為有益之疾病。詳言之/，' 120508.doc -23- 200813026 預期極光A激酶及/或極光B激酶之抑制作用可為有益的。 較佳地，極光B激酶之抑制作用為有益的。在本發 :態樣mAZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體在製備 藥物中之用途’其中該藥物係用於治療過度增生性疾病， 諸如癌症且尤其結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、膀 胱癌、腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤。 根據另-態樣’提供_種適用n療患有—或多種極光 激酶之抑制作用為有益之疾病的人類之方法中之Azmi52 的順丁烯二酸鹽共結晶體，I中該方法包含向需要其之人 投與治療有效量之AZD1152之順丁烯：酸鹽共結晶體的步 驟詳σ之，預期極光A激酶及/或極光B激酶之抑制作用 可為有益的。較佳地，極光B激酶之抑制作用為有益的。 進y提供一種適用於治療患有過度增生性疾病（諸如癌 :且尤其結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、 腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤）之人類之方法中的 AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體，其中該方法包含向需 要其之人投與治療有效量之AZD i i 52之順丁烯二酸鹽共結 晶體的步驟。AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體在上述治 療人類之方法之任一者中的用途亦構成本發明之態樣。 對於上述治療用途，投與之劑量應隨著所使用之化合 物、投藥模式、所需之治療、指示病症及動物或患者之年 齡及性別1¾ ?文變。齊j量大小因必匕應根據熟知醫學原則來計 算。 在使用AZD1152之順丁烯二gt鹽共結晶體用於治療或預 120508.doc -24- 200813026 防目的中’通常應投藥以使得接收在（例如）每公斤體重 0.05 mg至50 mg之範圍内之每日劑量，假設需要時分次給 禀 奴而口 ¥使用非經腸途徑時，應投與較低劑量。 因此’例如’對於靜脈内投藥，通常應使用在（例如）每公 斤體重0.05 mg至25 mg之範圍内之劑量。類似地，對於藉 由吸入投藥’應使用在（例如）每公斤體重〇〇5 mg至25 mg 之範圍内之劑量。 本文中定義之治療可用作單獨療法或可包括除本發明之 化合物之外的習知手術或放射線療法或化學療法。此化學 療法可包括以下抗腫瘤劑之種類中之一或多者： (i)如醫學腫瘤學中所使用之抗增生性/抗贅生性藥物及 其組合’諸如烧基化劑（例如順麵（cis_platin)、卡舶 (carboplatin)、壤填醯胺、氮芥、美法侖（meiphaian)、苯 丁酸氮务（chlorambucil)、馬利蘭（busulphan)及亞石肖基 脲），抗代謝物（例如抗葉酸物，諸如氟嘴σ定，如5 -氟尿嘴 唆及喃敦唆（tegafur)、雷替曲赛（raltitrexed)、甲胺嗓呤 (methotrexate)、阿糖胞普（cytosine arabinoside)及經基 脲；抗腫瘤抗生素（例如蒽環黴素（anthracyclines)、如阿黴 素（adriamycin)、平陽黴素（bleomycin)、小紅莓 (doxorubicin)、道諾黴素（daunomycin)、表柔比星 (epirubicin)、黃膽素（idarubicin)、絲裂黴素 _C (mitomycin-C)、放線菌素 D (dactinomycin)及米拉黴素 (mithramycin);抗有絲分裂劑（例如長春花生物驗，如長 春新驗（vincristine)、長春驗（vinblastine)、長春花鹼醯胺 120508.doc -25- 200813026 (vindesine)及長春瑞賓（vinorelbine)，及紫杉醇，如紫杉齡 (taxol)及克癌易（taxotere));及拓撲異構酶抑制劑（例如表 鬼臼素（epipodophyllotoxins)，如足葉乙戒（etoposide)及替 尼泊戒（teniposide)、安 °丫 σ定（amsacrine)、拓朴替康 (topotecan)及喜樹驗（camptothecin)); (ii) 細胞生長抑制劑，諸如抗雌激素（例如他莫昔芬 (tamoxifen)、托瑞米芬（toremifene)、雷諾昔龄 (raloxifene)、 曲洛昔芬（droloxifene)及依多昔芬 C'、 (iodoxyfene))、雌激素受體下調劑（例如fulvestratrant)、抗 雄激素（例如必卡他醯胺（bicalutamide)、氟他胺 (flutamide)、尼魯胺（nilutamide)及環丙孕酮乙酸醋 (cyproterone acetate)、LHRH拮抗劑或 LHRH促效劑（例如 戈舍瑞林（goserelin)、亮丙瑞林（leuprorelin)及布舍瑞林 (buserelin))、孕激素（例如曱地孕_乙酸S旨（megestrol acetate)、芳香酶抑制劑（例如安美達錠（anastrozole)、來曲 , 嗤（letrozole)、沃拉嗤（vorazole)及依西美坦（exemestane)) \ . 及5 α-還原酶之抑制劑，諸如非那雄安（finasteride); (iii) 抑制癌症細胞入侵之藥劑（例如金屬蛋白酶抑制劑（如 馬立馬斯他（marimastat)))及尿激酶纖溶酶原活化子受體功 能之抑制劑； (iv) 生長因子功能之抑制劑，例如該等抑制劑包括生長因 子抗體、生長因子受體抗體（例如抗-erbb2抗體曲妥珠單抗 (trastuzumab)[HerceptinTM]及抗-erbbl 抗體西圖西美 (cetuximab)[C225])、法呢基轉移酶抑制劑、赂胺酸激酶抑 120508.doc -26- 200813026 制劑及絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，例如表皮生長因子家 族之抑制劑（例如EGFR家族赂胺酸激酶抑制劑’諸如#-(3-氯-4-氟苯基）-7-曱氧基-6-(3-嗎啉基丙氧基）喹唑啉-4-胺 (吉非替尼（gefitinib)、AZD1839)、Ν·(3-乙炔基苯基）-6,7· 雙（2-曱氧基乙氧基）啥吐淋-4-胺（埃羅替尼（erlotinib)、 OSI-774)及6-丙烯醯胺基-#-(3-氯-4-氟苯基）-7-(3-嗎啉基 丙氧基）喹唑啉-4-胺（CI 1033))，例如血小板源生長因子家 族之抑制劑及例如肝細胞生長因子家族之抑制劑； (v) 抗血管生成劑，諸如抑制血管内皮生長因子之作用之 彼等（例如抗血管内皮細胞生長因子抗體貝法滋美 (bevacizumab)[Avastin™]，諸如國際專利申請案WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856及 WO 98/13354 中 揭示之彼等化合物）及由其他機制起作用之化合物（例如間 四經基苯二氫0卜吩（linomide)，整合素ανβ3功能之抑制劑 及金管生長抑素）； (vi) 血管破壞劑，諸如康柏斯達汀Α4 (Combretastatin Α4) 及國際專利申請案WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434及 WO 02/08213 中 揭示之化合物； (vii) 反義療法，例如針對以上列出之目標之那些療法，諸 如 ISIS 2503，抗-i*as 反義； (viii) 基因療法方法，其包括例如替代異常基因（諸如異常 p53或異常BRCA1或BRCA2)之方法、GDEPT(基因導向性 酶前藥療法）方法（諸如使用胞嘧啶去胺酶、胸苷激酶或細 120508.doc -27- 200813026 菌硝基還原酶之彼等方法）及辦s本I m 士 広彡汉’日加患者對化學療法或放射 線療法之耐受性的方法（諸如多藥物抵抗基因療法）,·及 (ix)免疫療法方法，其包括例如增加患者腫瘤細胞之免疫 原性之離體及活體内方法，諸如以細胞激素（諸如介白素 2、介白素4或顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子）轉染，減少 T-細胞無反應性之方法，使用經轉染之免疫細胞（諸如經細 胞激素轉染之樹枝狀細胞）之方法，使用經細胞激素轉染 之腫瘤細胞株之方法及使用抗遺傳型抗體之方法。 另外，AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體可與一或多種 細胞週期抑制劑組合使用。詳言之為抑制^^^工 、bubRl 或 CDK之細胞週期抑制劑。 此聯合治療可藉助於同時、連續或分別給與治療之個別 、、且伤來達成。該專組合產物使用在本文中描述之劑量範圍 内之本發明的化合物及在其有效劑量範圍内之其他醫藥活 性劑。 根據本發明之一態樣，提供一種適用於治療細胞增生性 病症（諸如癌症）之組合，其包含上文中所定義之AZD1152 之丨員丁稀一酉文鹽共結晶體及上文中所定義之另一抗腫瘤 劑。 根據本發明之此態樣，提供一種醫藥產物，其包含用於 聯合治療細胞增生性病症（諸如癌症）之上文中所定義之 AZD11 52的順丁烯二酸鹽共結晶體及上文中所定義之另一 抗腫瘤劑。 除其在治療醫學中之用途之外，AZD1152之順丁烯二酸 120508.doc -28- 200813026 鹽共結晶體亦用作用於評估實驗動物（諸如貓、犬、兔、 猴、大鼠及小鼠）中細胞週期活性之抑制劑之效果的活體 外及活體内試驗系統之發展及標準化中的藥理學工具，作 為研究新穎治療劑之部分。 在上述其他醫藥組合物、過程、方法、用途及藥物製造 特徵中，本文中描述之本發明之化合物的替代性及較佳實 施例亦適用。 本發明之順丁烯二酸鹽共結晶體抑制極光激酶（尤其極 光A激酶及/或極光b激酶）之絲胺酸_蘇胺酸激酶活性，且 因此抑制細胞週期及細胞增殖。尤其關注抑制極光B激酶 之化合物。該等性質可（例如）使用以下提出之程序中之一 或多者來評估。 (a)活體外極光A激酶抑制測試 此檢疋測定測試化合物抑制絲胺酸_蘇胺酸激酶活性之 能力。編碼極光A之DNA可藉由總基因合成或藉由選殖來 獲得。此DNA隨後可表現於適合表現系統中以獲得具有絲 胺酸-蘇胺酸激酶活性之多肽。在極光A之情況下，編碼序 列係藉由聚合酶鏈反應（PCR)自cDNA分離且選殖入桿狀病 毒表現載體pFastBac HTc (GibcoBRL/Life technologies)之

BamHl及Notl限制性核酸内切酶位點中。5，pCR^j子含有 編碼極光A之序列之限制性核酸内切酶BaniHi 5,的識別序 列。此容許將極光A基因插入由pFastBac HTc載體編碼之 具有6個組胺S文殘基、間隔區及rTEV蛋白酶斷裂位點之框 架中。3’ PCR引子經額外編碼序列、接著終止密碼子及限 120508.doc -29- 200813026 制性核酸内切酶Notl之識別序列替代極光A終止密碼子。 此額外編碼序列（5f TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TCT TAA 3’）編碼多肽序列 YPYDVPDYAS。來源 於流感血球凝集素蛋白之此序列通常用作可使用特異性單 株抗體鑑別之標記抗原決定基序列。重組pFastBac載體因 此編碼N末端經6 his標記、C末端經流感血球凝集素抗原 決定基標記之極光-A蛋白。用於組裝重組DNA分子之方法 之細節可見於標準教科書中，例如Sambrook等人，1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory press 及 Ausubel 等人，1999, Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons Inc. o 重組病毒之產生可根據來自GibcoBRL之製造商之方案 進行。簡言之，將帶有極光A基因之pFastBac-Ι載體轉化 入含有桿狀病毒基因組（穿梭載體DNA)之大腸桿菌（E· coli) DH1 OBac細胞中且經由該等細胞中之換位事件，含有 健他黴素（gentamycin)抵抗基因及包括桿狀病毒多角體蛋 白啟動子之極光A基因之pFastBac載體的區直接換位入穿 梭載體DNA中。通過對健他黴素、康黴素（kanamycin)、四 環素(^1^〇>^1丨1^)及乂1&1的選擇，所得白色菌落應含有編 碼極光A之重組穿梭載體DNA。將穿梭載體DNA自若干 BH1 OBac白色菌落之小規模培養物萃取且根據製造商之指 示使用CellFECTIN試劑（GibcoBRL)轉染入生長於含有10% 血清之TC100培養基（GibcoBRL)中的草地貪夜蛾 120508.doc -30- 200813026 (Spodoptera frugiperda)Sf21細胞中。藉由在轉染後72小時 收集細胞培養基來採集病毒粒子。將0.5 ml培養基用於感 染100 ml每毫升含有lx 107個細胞之Sf21的懸浮液培養物。 在感染後48小時採集細胞培養基且使用一標準空斑檢定程 序測定病毒效價。以3之感染複數（M0I)將病毒儲備用於感 染Sf9及’’高5"細胞以確定重組極光A蛋白之表現。

對於極光A激酶活性之大規模表現，Sf21昆蟲細胞在 28 °C下生長於在3 r.p.m·之Wheaton旋轉臺上補充有10%胎 牛血清（Viralex)及0.2% F68 Pluronic (Sigma)之 TC100 培養 基中。當細胞密度達到每毫升1.2x 106個細胞時，其在1之 感染複數下以空斑·純極光A重組病毒感染且在48小時後採 集。所有隨後純化步驟均在4°C下進行。將含有總數為 2.0xlO8個細胞之冷凍昆蟲細胞小球解凍且以溶解緩衝液 (25 mM HEPES (Ν-[2·羥乙基]哌嗪-Ν’-[2-乙烷磺酸])(ρΗ 7.4，在 4°C 下）、1〇〇 mM KC1、25 mM NaF、1 mM

Na3V04、1 mM PMSF(苯基甲基磺醯基氟化物）、2 mM 2-

i J Μ基乙醇、2 mM哺峻、1 pg/ml抗蛋白酶、1 pg/ml抑肽 素、1 pg/ml亮抑蛋白酶肽）稀釋，每3xl07個細胞使用1.0 ml。使用杜恩斯均質機（dounce homogeniser)達成溶解，其 後在41,000 g下將細胞溶菌液離心35分鐘。將經吸氣上層 清液抽吸於一含有500 μΐ Ni NTA(氮基三乙酸）瓊脂糖 (Qiagen，產品號30250)(其已於溶解緩衝液中平衡）之5 mm 直徑層析管柱上。在以12 ml溶解緩衝液、接著7 ml洗滌緩 衝液（25 mM HEPES (pH 7.4，在4°C下）、1〇〇 mM KCn、20 120508.doc -31 - 200813026 mMu米峻、2 mM 2-M基乙醇）洗滌該管柱之後，達到溶離 劑之UV吸光度之基準線。使用溶離緩衝液（25 mM HEPES (pH 7.4，在 4°C 下）、1〇〇 mM KC1、400 mM咪唑、2 mM 2-酼基乙醇）將結合極光A蛋白自管柱溶離。收集對應於UV 吸光度之峰之溶離份（2·5 ml)。將含有活性極光A激酶之溶 離份對透析緩衝液（25 mM HEPES (pH 7.4，在4°C下）、 45%甘油（v/v)、100 mM KC1、0.25% Nonidet P40 (v/v)、1 mM二硫蘇糖醇）徹底透析。 藉由以酶稀釋劑（25 mM Tris-HCl pH 7.5、12·5 mM KC1、0.6 mM DTT)稀釋將極光Α酶之每一批新料在檢定中 滴定。對於典型批料（其可獲自Upstate)，以每毫升1微升 酶稀釋劑來稀釋儲備酶且將20 μΐ稀釋酶用於每一檢定孔。 以水稀釋測試化合物（於二甲亞颯（DMSO)中為10 mM)且將 10 μΐ稀釋化合物轉移至檢定板之孔中。”全部”及’’空白’’對 照孔含有2.5% DMSO，而非化合物。將20微升新鮮稀釋之 酶添加至除"空白π孔之外的所有孔中。將20微升酶稀釋劑 添加至’’空白”孔中。隨後將20微升含有0.2 μΟΜ [γ33Ρ]ΑΤΡ (Amersham Pharmacia，特異活性22500 Ci/mmol)之反應混 合物（25 mM Tris-HCn、12.7 mM KC1、2.5 mM NaF、0.6 mM二硫蘇糖醇、6.25 mM MnCl2、7.5 mM ATP、6.25 μΜ 肽底物[生物素-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]) 添加至所有測試孔中以起始反應。將該等板在室溫下培養 60分鐘。為終止反應，將1〇〇 μΐ 20% v/v正磷酸添加至所 有孔中。使用96孔板採集器（TomTek)將肽底物捕捉於帶正 120508.doc -32- 200813026 電之硝基纖維素P30過濾墊（Whatman)上且隨後以# 數器檢定33P之併入。”空白”（無酶）及，，全部”（無化合物）對 照值係用於確定測試化合物之稀釋範圍，其給出酶活性 50%抑制（IC50值）。 (b)活體外極光B激酶抑制測試 此檢定測定測試化合物抑制絲胺酸-蘇胺酸激酶活性之 能力。編碼極光B之DNA可藉由總基因合成或藉由選殖來 獲得。此DNA隨後可表現於適合表現系統中以獲得具有絲 胺酸-蘇胺酸激酶活性之多肽。在極光B之情況下，編碼序 列係藉由聚合酶鏈反應（PCR)自cDNA分離且以類似於上述 關於極光A之方式選殖入pFastBac系統中（亦即以導向經卜 組胺酸標記之極光B蛋白之表現）。 對於極光B激酶活性之大規模表現，Sf21昆蟲細胞在 28 C下生長於在3 r.p.m·之Wheaton旋轉臺上補充有1〇%胎 牛血清（Viralex)及 〇篇 F68 Pluronic (Sigma)之 Tci〇〇 培養 基中。當細胞密度達到每毫升K2M06個細胞時，其在 感染複數下以空斑-純極光B重组病毒感染且在48小時後採 集。所有隨後純化步驟均在4。(：下進行。將含有總數為 2.0X108個細胞之冷凍昆蟲細胞小球解凍且以溶解緩衝液 (50 mM HEPES (Ν-[2·經乙基]旅嗪乙烧績酸])(pH 7.4，在4 C下）、1 mM Na3V04、1 mM PMSF(苯基甲基磺 醯基氟化物）、1 mM二硫蘇糖醇、i μ§/ιη1抗蛋白酶、i pg/ml抑肽素、1 pg/mi売抑蛋白酶肽）稀釋，每個細 胞使用Und。使用超音均f機達成溶解，其後糾，綱客 120508.doc -33- 200813026 下將細胞溶菌液離心3 5分鐘。將經吸氣上層清液抽吸於一 含有 1.0 ml CM 瓊脂糖 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech)(其已於溶解缓衝液中平衡）之5 mm直徑層析管柱 上。在以12 ml溶解緩衝液、接著7 ml洗滌緩衝液（50 mM HEPES (pH 7·4，在4〇C下）、1 mM二硫蘇糖醇）洗滌該管柱 之後，達到溶離劑之UV吸光度之基準線。使用溶離緩衝 液之梯度（50 mM HEPES (pH 7.4，在 4°C 下）、0.6 Μ NaCl、1 mM二硫蘇糖醇，以0.5 ml/min之流速經15分鐘自 0%溶離緩衝液流至100%溶離缓衝液）將結合極光B蛋白自 管柱溶離。收集對應於UV吸光度之峰之溶離份（1.0 ml)。 將該等溶離份對透析緩衝液（25 mM HEPES (pH 7.4，在 4°C 下）、45% 甘油（v/v)、100 mM KC1、0.05% (v/v) IGEPAL CA630(Sigma Aldrich)、1 mM二硫蘇糖醇）徹底透 析。檢定經透析溶離份之極光B激酶活性。 極光B-INCENP酶（如由Upstate供應）係藉由在30°C下以 0·1 mg/ml GST-INCENP [826-919]於 50 mM Tris-HCl (pH 7·5)、0·1 mM EGTA、0.1% 2-魏基乙醇、〇·ΐ mM飢酸鈉、 10 mM乙酸鎂、0.1 mM ATP中活化極光Β(5 μΜ) 30分鐘來 製備。 藉由以酶稀釋劑（25 mM Tris-HCl pH 7.5、12.5 mM KC1、0.6 mM DTT)稀釋將極光B-INCENP酶之每一批新料 在檢定中滴定。對於典型批料，以每毫升15 μΐ酶稀釋劑來 稀釋儲備酶且將20 μΐ稀釋酶用於每一檢定孔。以水稀釋測 試化合物（於二甲亞砜（DMSO)中為1〇 mM)且將10 μΐ稀釋化 120508.doc -34- 200813026 合物轉移至檢定板之孔中。”全部”及”空白”對照孔含有 2.5% DMSO，而非化合物。將20微升新鮮稀釋之酶添加至 除”空白”孔之外的所有孔中。將20微升酶稀釋劑添加至 π空白”孔中。隨後將20微升含有0.2 pCi [γ33Ρ]ΑΤΡ (Amersham Pharmacia，特異活性22500 Ci/mmol)之反應混 合物（25 mM Tris-HCn、12.7 mM KCM、2·5 mM NaF、0.6 mM二硫蘇糖醇、6.25 mM MnCl2、15 mM ATP、6·25 μΜ 肽底物[生物素-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG])添 加至所有測試孔中以起始反應。將該等板在室溫下培養60 分鐘。為終止反應，將100 μΐ 20% v/v正磷酸添加至所有 孔中。使用96孔板採集器（TomTek)將肽底物捕捉於帶正電 之石肖基纖維素P30過滤墊（Whatman)上且隨後以Beta板計數 器檢定33P之併入。π空白”（無酶）及’’全部”（無化合物）對照 值係用於確定測試化合物之稀釋範圍，其給出酶活性之 50%抑制（IC50值）。 (c)活體外細胞表型及底物磷酸化檢定 此檢定用於在活體外於SW620人類結腸腫瘤細胞上測定 化合物之細胞效應。化合物通常會抑制磷酸組蛋白Η3之含 量且增大細胞之核區。 將每孔1〇4個SW620細胞塗於costar 96孔板中之100 μΐ DMEM培養基（含有10% FCS及1%麵醯胺酸）(DMEM為 Dulbecco 改良伊氏培養基（Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium，Sigma D6546))且在 37°C及附著 5% C02下保持隔 夜。隨後將該等細胞以於培養基中稀釋之化合物給藥（添 120508.doc •35- 200813026 加50 μΐ至每一孔中以得到〇〇〇〇15 μΜ濃度之化合物） 且在以化合物治療24小時後，將細胞固定。 首先使用一光學顯微鏡觀測細胞且記錄任何細胞形態變 化。隨後將100 μΐ 3.7%甲醛添加至每一孔中，且使板在室 溫下保持至少30分鐘。於紙巾上傾析且輕拍板移除固定物 且Ik後使用自動板洗滌器於PBS (Dulbecco之經磷酸鹽緩 衝之鹽水（Sigma D8537))中將板洗滌一次。添加1〇〇 μ1 PBS及0.5°/。氚核Χ-100且將板置於震盪器上5分鐘。將板於 100 μΐ PBS中洗滌且將溶液傾倒出。添加5〇 μ1 一級抗體、 於PBS 1% BSA(牛血清白蛋白）中之1:5〇〇兔抗磷酸組蛋白 Η3及0.5%非離子活性劑。抗磷酸組蛋白Η3兔多株〇6_75〇 係購自Upstate Biotechnology。將板在室溫下於震盪器上 保持1小時。 第二天，傾倒出抗體且以PBS將板洗滌兩次。在無燈光 區域中，添加50 μΐ二級抗體、於pBS 1% BSA中之 1:10,000 Hoechst及 1:200 Alexa Fluor 488山羊抗兔igGA(目 錄號11008分子探針）、0.5%非離子活性劑。將板包裹於錫 箔中且在室溫下震盪1小時。傾倒出抗體且以pBS將板洗滌 兩次。添加200 μΐ PBS至每一孔中，且將板震盪1〇分鐘， 移除PBS°添加100 μΐ PBS至每一孔中且將板密封以備分 析。使用Arrayscan標靶活性算法進行分析以量測磷酸組蛋 白H3之細胞含量及核區之變化。結果報導為5〇%抑制磷酸 組蛋白H3含量及類似地50%增大細胞之核區域所需之有效 濃度（EC50值）。 120508.doc -36- 200813026 在本文中本發明係藉助於非限制性實例、資料及圖式來 說明，其中，除非另外指出，否則·· (i)產率僅為說明而給出且並非必定為可獲得之最大 值； (π)若產物係用於播晶種，則其可由先前已知方法（諸 如WO 2004/058781中描述之那些方法）獲得； (iii)如本文中所述製備之AZDU52順丁烯二酸鹽共結晶 體之身份係於六氘化二甲亞颯中在4〇〇 MHz下藉由 H NMR來確定，其中添加四甲基矽烷（TMS)作為參 照（TMS = 0.00 ppm)。 如本文中所述，AZD1152及AZD1152 HQPA揭示於WO 2004/058781 中。關於AZD1152、AZD1152 HQPA之方法細 節提供於WO 2004/058781中且該等化合物之途徑中之所有 中間物係以引用的方式全部併入本文中。 製備方法1 步称1 ·製備7-(3_經基丙氧基）啥峻嚇^4(311)_酮 將2-胺基-4-氟笨甲酸與i，3_丙二醇一起攪拌且加熱至 120°C °添加甲脒乙酸鹽且將混合物攪拌3·5小時以產生7_ 氟喹唑啉-4_酮。隨後經2小時50分鐘之時期將氫氧化鉀於 1，3-丙二醇中之溶液添加至混合物中，隨後將其冷卻 15°C。此後，將該混合物加熱至125艺歷時5小時，隨後冷 卻至75 C。將稀鹽酸（約6% w/w)逐漸添加至反應混合物中 直至pH值達到4.5。經6小時將混合物冷卻至〇它且又在彼 溫度下保持一小時，隨後藉由離心分離粗產物。將粗物質 120508.doc •37- 200813026 以水洗滌且在真空中乾燥，隨後在平緩回流下溶解於甲醇 中且在42 C之，皿度下在減壓下部分濃縮。豸後經3小時之 時期將此溶液冷卻至0。。且藉由過濾分離所得產物，隨後 在真空中乾燥。以73〇/〇產率回收7_(3_經基丙氧基）啥咬淋_ 4(3H)-酮。 ^-NMR (DMSO d6): 11.90 (br s, 1H), 8.04 (s, 1H), 8.00 (d, 1H), 7.10 (m, 2H), 4.17 (t, 2H), 3.58 (t, 2H), 1.92 (m, 2H)： MS (+ve ESI): 221 (M+H)+ 〇 步称2-製備4-氣_7_(3_氣丙氧基）喹唾琳 將7-(3-羥基丙氧基）喹唑啉_4(3H)_酮、甲苯及况沁二異 丙基-甲醯胺（DIPF)—起混合且加熱至76。〇，隨後在76。〇下 經1小時之時期添加亞硫醯氣。隨後經丨小時之時期又添加 亞硫醯氣，其後將溫度在76t下保持〗小時。將混合物回 流11小時以產生澄清溶液，將其冷卻至38t且經受真空蒸 餾以移除甲苯及亞硫醯氯。隨後添加甲苯且將溶液保持在 35 C下，同時以助濾劑（矽藻土或harborlite及活性碳）將其 澄清。將所得溶液部分濃縮，隨後添加庚烷且將混合物冷 部至0 C且攪拌23小時。將形成之淺棕色懸浮液藉由過濾 分離、以冷庚烷洗滌，隨後在3〇。〇下在真空中乾燥以產生 4·氯-7_(3·氯丙氧基）喹唑啉（63.6%) ^-NMR (DMSO d6): 13.25 (br s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.06 (d, 1H), 7.17 (m, 2H), 4.21 (t, 2H), 3.83 (t, 2H), 2.23 (m, 2H): MS (+ve ESI): 257, 259 (M+H)+。 步驟3 -製備（3-{[7-(3·氣丙氧基）喹唑啉_4_基】胺基}-1丑比 120508.doc -38 - 200813026 嗤·5-基）乙酸 將4-氯-7-(3-氯丙氧基）喹唑啉添加至丨莫耳當量之（3_胺 基-1/7-吡唑-5-基）乙酸於^曱基吡咯啶酮（NMp)中之溶液 中且隨後保持12小時之時期。在播晶種及未播晶種之情況 下以及在添加作為反溶劑之乙腈及未添加乙腈之情況下觀 測到產物的結晶作用。將所得固體藉由過濾分離、以^甲 基吡咯啶酮及乙腈洗滌且隨後在真空中乾燥以產生呈灰白 色固體狀的（3-{[7-(3 -氯丙氧基）喹唑琳-4_基]胺基卜丨丑—叶匕 唑-5-基）乙酸·鹽酸鹽： H-NMR (DMSO d6 ;含有 NMP作為溶劑合物）：8.92 (s， 1H)，8.8 (d，1H)，7.46 (雙重峰之pr，1H)，7 38 (d，1H)，6 7 (s, 1H)，4.32 (t，2H)，3·85 (t，2H)，3.73 (s，2H)，3.3 (t，2H)， 2.7 (s? 3H)? 2.51 (m5 6H)5 2.27 (m5 2H)5 2.18 (t? 2H)5 1.93 (m，2H) 〇 MS (+ve ESI)·· 362.1015 (M+H)+。 步驟4 -製備2-(3-{[7-(3-氣丙氧基）喹唑啉基】胺基丨“及_ 啦唑-5-基）-7V-(3-氟苯基）乙醯胺 將4_二曱胺基吡啶（DMAp)、沁甲基嗎啉及％氟苯胺（大 量過量）添加至（3-{[7-(3_氯丙氧基）喹唑啉_4_基]胺基卜丨扒 吡唑-5-基）乙酸·鹽酸鹽於愚沁二甲基乙醯胺（DMA)中之懸 浮液中且在室溫下或低於室溫下攪拌所得漿料。隨後經8 小時之時期以受控方式添加先前溶解於水中之丨_乙基_ (3-二曱胺基丙基）碳化二醯亞胺鹽酸鹽（EDci hci)之溶液 以將反應保持在周圍溫度。將混合物以少量產物播晶種且 120508.doc -39- 200813026 使其攪拌若干小時。亦添加反溶劑乙腈，接著添加水以沉 殿更多產物。藉由過遽分離物質且將濾、餅以iV-二甲基乙 醯胺··水：乙腈之混合物、溫乙腈洗滌且隨後乾燥（在真 空中或在氮氣流下）以產生2-(3-{[7-(3-氯丙氧基）喹唑琳_4_ 基]胺基}-1孖-吡唑-5-基）_iV_(3·氟苯基）乙醯胺。 W-NMR (DMSO d6 ;含有殘餘DMA): 10.4 (s，1H)，8.9 (s， 1H)，8.8 (d，1H)，7.59 (多重峰之 pr, 1Η)，7·46(雙重峰之 pr， 1H)，7.33 (m，2H)，7.29 (d，1H)，6.85 (m，1H)，6.75 (s，1H)， 4 ^5 (t, 2H), 3.85 (t, 4H)5 2.95 (s)? 2.83 (s)? 2.56 (s)? 2.25 (m，2H)，1.95 (s): MS (+ve ESI): 455 (M+H)+。 步驟5 -製備2-{3_[(7-{3-[乙基（2_羥乙基）胺基]丙氧基卜喹 嗤琳_4_基）胺基]_1及-啦唑_5_基}-ΛΓ-(3·氣苯基）乙醯胺 (AZD1152 HQPA) 在惰性氣氛下（諸如由氮提供）將2-(3-{[7-(3-氣丙氧基）喹 嗤琳-4·基]胺基}-1丑_吼唑_5_基卜#_(3_氟苯基）乙醯胺及2_ (乙胺基）乙醇（12莫耳當量）添加至^二甲基乙醯胺中且 在攪拌下將混合物加熱至90°C。12小時後，以受控方式添 加水且在熱時以產物播晶種批料。以小心受控方式將混合 物冷卻至20°C以結晶所需形式之產物。隨後將產物過濾且 以水/W-二甲基乙醯胺之混合物及乙腈洗滌。此後，將 濾餅以溫乙腈（4〇。〇製成漿料一段時期、過濾、以更多乙 腈洗滌且隨後乾燥（在真空中或在氮氣流下）以得到以約 90%產率之呈灰白色固體狀的無水2_{3_[(7_{3_[乙基卩_羥 120508.doc -40- 200813026 乙基）胺基]丙氧基}-喹唑啉-4-基）胺基]唑-5-基}-iV-(3-氟苯基）乙醯胺。 ^-NMR (DMSO d6)： 10.55 (s5 1H), 9.45 (br s, 1H), 8.98 (s? 1H)，8.8 (d，1H)，7.63 (多重峰之 pr，ih)，7·47 (雙重峰之 pr， 1H)，7.37 (m，2H)，7.32 (d，1H)，6.9 (m，1H)，6.77 (s，1H)， 4.32 (t，2H)，3.83 (br s，2H)，3.76 (t，2H)，3.35 (m，2H)， 3.25 (m，4H)，2.25 (m，2H)，1.25 (t，3H): MS (+ve ESI): 508.4 (M+H)+。 步驟6 -製備磷酸單（第三丁基）2-丨丨丨氟苯 基）胺基]-2-側氧基乙基卜1私吡唑_3-基）胺基卜喹唑啉 基}氧基）丙基】（乙基）胺基]乙基酯[AZD1152 t_Bu P(5)酯】 將2-{3-[(7_{3-[乙基（2-羥乙基）胺基]丙氧基卜喹唑啉_4_ 基）胺基]-1仏吡唑-5-基卜#-(3-氟苯基）乙醯胺及吡啶·鹽酸 鹽混合於W-二甲基乙醯胺中且將溶液冷卻至_15。〇。隨後 添加二第三丁基二乙基胺基磷酸酯（15_21莫耳當量），同 時保持溫度。以30% w/w過氧化氫（約4.2莫耳當量）原位處 理反應混合物，同時將溫度保持在低於周圍溫度下。藉由 添加偏亞硫酸氫鈉（以丨0% w/v水溶液形式）來破壞剩餘過 氧化氫，同時將溫度保持在低於4{rc下。隨後將所得磷酸 二（第三丁基）2-[[3-({4·[(5_{2-[(3-氟苯基）胺基]_2_侧氧基 乙基卜If吡唑基）胺基]喹唑啉_7_基}氧基）丙基](乙基） 胺基]乙基酯溶液加熱至4(rc且添加氫氧化鈉溶液（2 以 調節至PH 5_6·5 °在播晶種下將溫度及pH值保持約90分鐘 之時期。隨後饋入水且將pH值進一步調節至pH 8_9之範圍 120508.doc -41 · 200813026 内以優化回收。將溫反應混合物直接過濾以得到磷酸單 (第三丁基）2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基）胺基]-2-側氧基乙 基}-1//·吼唑-3-基）胺基]喹唑啉-7-基}氧基）丙基](乙基）胺 基]乙基酯，將其以愚f二甲基乙醯胺/水之混合物及水洗 滌且最後乾燥（在真空中或適合惰性氣體流中）以得到產率 介於86%-93%之間之呈灰白色固體狀的磷酸單（第三丁基） 2-[[3-({4_[(5-{2·[(3·氟苯基）胺基]_2·側氧基乙基}_1//_口比 嗤-3-基）胺基]-喹唑啉-7-基}氧基）丙基](乙基）胺基]乙基 酉旨。 'H-NMR (DMSO d6): 10.48 (s? 1H)5 9.75 (br s? 1H)? 8.98 (s5 1H)，8.85 (d，1H)，7.67 (多重峰之pr，1H)，7.48(雙重峰之pr， 1H)，7.37 (m，2H)，7·3 (d，1H)，6.87 (m，1H)，6·83 (s，1H)， 4.34 (t，2H)，4.28 (m，2H)，3.88 (s，2H)，3.53 (m，2H)，3.43 (m，2H)，3_33 (m，2H)，2.3 (m, 2H)，1.47 (s，9H)，1.32 (t， 3H): MS (+ve ESI): (M+H)+ 644.2761 片段（較少 丁基）588 2147。 步驟7 -製備構酸二氫2_{乙基[3_({4-[(5_{2_[(3-氟苯基）胺 基】-2-側氧基乙基}-1及-嗤-3-基）胺基]啥唾琳_7-基}氧基） 丙基】胺基}乙酯（AZD1152) 將鱗酸單（第三丁基）氟苯基）胺基]· 2 -側氧基乙基} -1 if - η比嗤-3-基）胺基]-啥唾琳_7_基丨氧某）丙 基](乙基）胺基]乙基δ旨懸浮於水/四氫吱喃（thf)之1 · 1混合 物中且在高溫下（較佳50°C-60°C)以過量介於15莫耳當量與 3.0莫耳當量之間的鹽酸處理約1小時之時期。隨後使用2 〇 120508.doc -42- 200813026 Μ氫氧化鈉將熱溶液鹼化至pH 4.5-5.5之範圍内，冷卻至 60 C且播晶種。以受控方式將水添加至漿料中，同時將結 晶混合物受控冷卻至室溫且藉由過濾分離產物。將濾餅以 水洗滌且在真空中乾燥。乾燥後，將固體磷酸二氫2_ (乙 基[3·({4-[(5-{2-[(3-氟苯基）胺基]-2-侧氧基乙基卜比唑、 3-基）胺基]喹嗤啉_7_基}氧基）丙基]胺基}乙醋在周圍條件 下平衡至恒定重量以得到呈淡黃色針狀物質之水合形式。 ^-NMR (DMSO d6)： MS (+ve ESI): 587.8 (M+H)+ iH-NMR (DMSO d6): 10.53 (s，1H)，8.57 (s，1H)，8.54 (d， 1H)，7.62 (d，1H)，7.37 (m，2H)，7·27 (s，1H)，7.21 (d，1H)， 6.88 (m，1H)，6·65 (s，1H)，4.27 (t，2H)，4.05 (m，2H)，3.75 (s，2H)，3.24 (m，2H)，3.21 (t，2H)，3.13 (q，2H)，2.18 (m， 2H)，1.24 (t，3H): MS (+ve ESI): 588 (M+H)+。 C26H31FN7O6P+3.0 H20要求 C，48.7%; H，5.8%; N，15.3% ; 實驗值 C，48.8%; H，5.3 5%; N，15.15%。 步驟8 ·製備磷酸二氫2-{乙基[3-({4-[(5-{2_[(3-氟苯基）胺 基]-2-側氧基乙基}-1及·!!比唑_3_基）胺基]喹唑啉基}氧基） 丙基]胺基}乙酯·順丁烯二酸鹽[AZD1152順丁烯 二 酸鹽] 將2· 丁烯二酸（Ζ)(1·57莫耳當量；449.80微莫耳；52.21 mg)溶解於甲醇（123.54毫莫耳；5.00 ml ; 3.96 g)中且向此 溶液中添加先前製備之AZD11 52之甲醇溶液（呈游離形式 三水合物-1.00莫耳當量，286· 14微莫耳；40.00 mL ; 31.87 120508.doc -43· 200813026 g)，接著添加更多甲醇（123 x 笔旲斗，5.00 mL ; 3.96 g)。使混合物在室溫下攪拌。 ^ # ώ生成白色懸浮液且將固 體精由過濾回收，隨後在直 一 ^ yl 一 肀乾燥。精由NMR分析確定 …晶體為順丁烯二酸鹽。 替代性步驟8 : 將粗AZD1152(估計為7.44 g @ 1〇〇%，u 61毫莫耳）添加 至二甲亞碾（36ml)且留在周圍條件下以生成淡棕色溶液。 向此溶液中添加順丁烯二酸(176 g，1516毫莫耳，131莫 =當们於甲醇（36 ml)中之溶液且使混合物在周圍溫度下 靜置隔仪。第一天將澄清溶液之等分試樣轉移至一小瓶 中’劃線且密封保持若干小時。形成白色固體之沈積物且 將此轉移至燒航中且對其授拌。溶液逐漸變混濁且固體沈 積。將漿料靜置若干天且最後過濾。將濾餅以二甲亞砜/ 曱醇之1 · 1/吧合物（總共i 5 ml)洗滌，以甲醇（3x25 ml)原位 製成水料且隨後在真空中乾燥。nmr確定固體為azdii52 之順丁烯二酸鹽共結晶體（約78.7%產率）。 製備方法2 步驟1 -製備2-(3-{[7-(3_氣丙氧基）喹唑啉-4-基]胺基}-1好-咐^·5_基）-7V_(3-氟苯基）乙醯胺 向（3-{[7·(3-氯丙氧基）喹唑啉_4_基]胺基}_1丑_吡唑_5·基） 乙酸·鹽酸鹽（如上文製備方法1中所述經製備）於二甲 基乙醯胺（DMA)中之懸浮液中添加4_二甲胺基吡啶 (DMAP)，同時將溫度保持在15°C-25°C (理想地為15。〇， 接著添加TV—甲基嗎啉，同時亦保持該溫度。以保持溫度低 120508.doc -44- 200813026 於25C的速率添加3-氟苯胺（大量過量，其理想地為1〇莫耳 當量-15莫耳當量）。同時將丨_乙基_3_(3_二甲胺基丙基）碳 化二醯亞胺鹽酸鹽（EDCI.HC1)溶解於水中以得到約42〇/〇 w/v之溶液（存在之水量對後來過程中結晶之結果為重要 的）。經8小時之時期以受控方式將此溶液添加至漿料中以 保持反應介於20°C-25°C之間；隨後以產物之較佳形式晶體 (理想地為預期產率之約1%之量）播晶種混合物。將混合物 ( 攪拌約16小時，同時保持溫度（理想地為2〇。〇_25。〇，隨後 < 以受控方式添加反溶劑乙腈，接著添加水，且保持溫度介 於20C-25°C之間，接著延長攪拌約21小時；此舉為優化回 收且形成產物。藉由過濾分離物質且將濾餅以坨I二曱基 乙醯胺：水··乙腈之混合物（體積比為5:3:2)、乙腈洗滌且 隨後乾燥（在真空中或在氮氣流下）以得到約76%_78%產率 之含有一些DMA之2-(3-{[7-(3-氣丙氧基）喹唑啉_4_基]胺 基}-17/_吼唑-5·基）4(3-1苯基）乙醯胺。 () H-NMR (DMSO d6 ;含有殘餘DMA): 1〇 4 (s，1H)，8 9 (s 1H)’ 8·8 (d，1H)，7.59 (多重峰之队 1H)，7 46(雙重峰之γ 1Η)，7.33 (m，2Η)，7.29 (d，1Η)，6.85 (m，1Η)，6.75 (s，1Η) 4·35 (t，2H)，3·85 (t，4H)，2.95 ⑷，2·83 ⑷，2·56 (s) (m，2H)，1.95 (s): ’ · MS (+ve ESI): 455 (M+H)+ 〇 步称2 _製備2·{3·[(7♦[乙基（2，乙基）胺基】丙氧基}喹 嗤啉-4-基）胺基】比嗤·5_基}_#_(3_襄笨基）乙酿胺 (AZD1152 HQPA) 120508.doc -45- 200813026 在惰性氣氛下（諸如由氮提供）將2-(3_{[7_(3-氯丙氧基）喹 唑啉-4-基]胺基卜1Λγ_吼唑_5_基）j—(3-氟苯基）乙醯胺及孓 (乙胺基）乙醇（理想地為12莫耳當量）添加至愚#•二甲基乙 醯胺中且在授拌下將混合物加熱至9〇。在〗2_丨6小時（理 想地為12小時）之時期後，將反應冷卻回至約85。(：且以受 控方式添加水以保持溫度介K8(rc_85t：之間。將批料調節 至80 C且以產物之較佳形式之晶體（理想地為預期產率之 約1%之量）播晶種。經約2〇小時之時期以小心受控方式將. 混合物冷卻至201以結晶呈所需形式且具有足以提供良好 過濾速率之尺寸的產物。隨後將該產物過濾且以水/恳尽 二甲基乙醯胺之混合物及乙腈洗滌且適當脫水以得到產物 之水合形式。此後，將濾餅以溫乙腈（理想地在4〇它之溫 度下）原位製成漿料一段時期（理想地為2小時），隨後過 慮、以更多乙腈洗滌且隨後乾燥（在真空中或在氮氣流下） 以得到85%-90%之產率之呈灰白色固體狀的幾乎無水2_p_ [(7_{3-[乙基（2-羥乙基）胺基]丙氧基卜喹唑啉-4_基）胺基]_ 1//•吧嗤-5-基}沁（3_氟苯基）乙醯胺。 H-NMR (DMSO d6): 10.55 (s，1H)，9.45 (br s，1H)，8.98 (s， 1H)，8·8 (d，1H)，7.63 (多重峰之pr，iH), 7.47 (雙重峰之pr， 1H)，7.37 (m，2H)，7.32 (d，1H)，6·9 (m，1H)，6·77 (s，1H)， 4.32 (t，2H), 3.83 (br s，2H)，3.76 (t，2H)，3·35 (m，2H)， 3.25 (m，4H)，2.25 (m，2H)，1.25 (t，3H): MS (+ve ESI): 508.4 (M+H)+。 步驟3-製備磷酸單（第三丁基）2-[[3({4-[(5{2[(3氟苯基） 120508.doc -46- 200813026 胺基卜2-側氧基乙基卜ι/Γ-n比唑_3-基）胺基卜喹唑啉-7-基}氧 基）丙基】（乙基）胺基]乙基酯[AZD1152 t-Bu P(5)酯] 經延長之時期（理想地為3小時）向吼咬·鹽酸鹽於凡#·二 甲基乙醯胺中之漿料中饋入2-{3-[(7-{3-[乙基（2-羥乙基）胺 基]丙氧基卜喧唾琳-4-基）胺基]-1丑比u坐-5-基卜(3·氟苯 基）乙醯胺及二（第三丁基）二乙基胺基磷酸酯（理想地為1莫 耳當量）於TV，7V-二甲基乙醯胺中之溶液且將溫度保持 在_20°C至-10°C之間（理想地為-i5°C)。此後在i小時之時期 内接著進一步添加二（第三丁基）二乙基胺基磷酸酯（理想地 為〇·5莫耳當量），亦將溫度保持在_2〇。(：至_1〇。(：之間（理想 地為-15°C)。 以30% w/w過氧化氫（約4·2莫耳當量）原位處理反應混合 物，同時將溫度保持在低於-1(rc(理想地為 且在此溫度下保持一段時期（理想地為16小時）。藉由添加 偏亞硫酸氫鈉（呈10% w/v水溶液形式）來破壞剩餘過氧化 氫，同時保持溫度低於4〇°C。 隨後將所得磷酸二（第三丁基）2-[[3_({4-[(5_{2_[(3_氟苯 基）胺基]-2-侧氧基乙基丨-丨开^比唑_3_基）胺基]喹唑啉_7_基} 氧基）丙基](乙基）胺基]乙基酯之溶液加熱至4(rc且添加氫 氧化鈉溶液.（理想地為2 M)以調節至ρΗ 5·5_6·5(理想地為 pH 6)，其中以適合結晶物質播晶種。保持溫度且藉由添 加額外氫氧化鈉溶液保持pH 5_6之範圍至少2小時之時 期。隨後饋入水且將pH值進一步調節至pH 8-9之範圍内 (理想地為pH 8.8)，同時保持溫度（理想地4〇。〇，但在35它_ 120508.doc -47· 200813026 45°C之範圍内）16小時之時期以優化回收。將溫反應混合 物直接過濾以得到磷酸單（第三丁基）2_[[3_({4_[(5_{2_[(3_ 氟笨基）胺基]-2-側氧基乙基}_17/_ϊϊ比唑_3_基）胺基]喹唑琳_ 7-基}氧基）丙基](乙基）胺基]乙基酯，將其以水洗滌若干次 且最後乾燥（在真空中或適合惰性氣體流中）以得到產率介 於86%-93%之間的呈灰白色固體狀的磷酸單（第三丁基）孓 [[3-({4-[(5·{2-[(3·氟苯基）胺基]_2_側氧基乙基丨“丑·π比唑_ 3-基）胺基]-喹唑啉-7-基}氧基）丙基](乙基）胺基]乙基酯。 H-NMR (DMSO d6)： 10.48 (s, 1H), 9.75 (br s, 1H), 8.98 (s, 1H)，8.85 (d，1H)，7.67 (多重峰之pr，1H)，7.48(雙重峰之pr， 1H)，7.37 (m，2H)，7.3 (d，1H)，6·87 (m，1H)，6.83 (s，1H)， 4.34 (t，2H)，4.28 (m，2H)，3.88 (s，2H)，3.53 (m，2H)，3.43 (m, 2H)，3.33 (m，2H)，2·3 (m，2H)，1.47 (s，9H)，1.32 (t， 3H): MS (+ve ESI): (M+H)+ 644.2761 片段（較少丁基）588.2147。 步驟4 -製備磷酸二氫2_{乙基[3-({4·[(5-{2-[(3-氟苯基）胺 基]-2-側氧基乙基唑基）胺基]喹唑啉-7-基丨氧基） 丙基】胺基}乙酯（AZD1152) 將磷酸單（第三丁基）2-[[3-({4·[(5-{2-[(3_氟苯基）胺基]-2-側氧基乙基}·l//r-«比唑-3-基）胺基]-喹唑啉-7·基}氧基）丙 基](乙基）胺基]乙基酯懸浮於水/四氫η夫喃（THF)之混合物 中且以過量介於1.5莫耳當量與3 ·0莫耳當量之間的鹽酸（理 想地為2 Μ之濃度且含有1.5莫耳當量）處理。將混合物加 熱至55°C-65°C(理想地60°C)且在60°C下保持約1小時。隨後 -48- 120508.doc 200813026 使用氫氡化鈉（較佳為2 Μ濃度且含有1·7莫耳當量）將熱溶 液鹼化以得到在pH 5.0-5.5之範圍内之pH值且隨後在55。〇 65°C (理想地為60°C )下以產物之較佳形式之晶體（理想地為 預期產率之約0.05% w/w之量）播晶種。將混合物在此溫度 下攪拌至少一小時，隨後添加水且將漿料攪拌且經約丨2小 時之時期以受控方式冷卻，隨後在周圍溫度下擾拌至少4 小時且隨後藉由過濾分離產物。將渡餅以水、隨後THF依 次洗滌且在真空中或使用增濕程序乾燥，藉此使經水蒸氣 濕潤之惰性氣體穿過固體直至獲得恆定重量。在真空中乾 燥後，將固體磷酸二氫2-{乙基[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基）胺 基]-2-側氧基乙基比。坐-3-基）胺基]噎σ坐琳j-基}氧基） 丙基]胺基}乙S旨在周圍條件下平衡至怔定重量以得到呈淡 黃色針狀物質之水合形式。獲得約81%產率之產物。 ^-NMR (DMSO d6): MS (+ve ESI): 587.8 (M+H)+ 咕-NMR (DMSO d6): 10.53 (s，1H)，8.57 (s，1H)，8.54 (d， 1H)，7·62 (d，1H)，7.37 (m，2H)，7.27 (s，1H)，7.21 (d，1H)， 6.88 (m，1H)，6.65 (s，1H)，4.27 (t，2H)，4.05 (m，2H)，3.75 (s，2H)，3.24 (m，2H)，3.21 (t，2H)，3.13 (q，2H)，2.18 (m， 2H)，1.24 (t，3H): MS (+ve ESI): 588 (M+H)+。 C26H31FN7O6P+3.O H20要求 C5 48·7%; H，5·8%; N，15·3% ; 實驗值 C，48·8%; H，5.35%; N，15.15%。 步驟5 _製備磷酸二氫乙基氣苯基）胺 120508.doc -49- 200813026 基卜2-侧氧基乙基卜1丑-11比嗤-3-基）胺基]喧唾琳-7-基}氧基） 丙基】胺基}乙酯·順丁烯二酸鹽[AZD1152順丁烯二酸鹽】 將2-丁烯二酸（Ζ)(1·57莫耳當量；449·8〇微莫耳；52.21 mg)溶解於甲醇（123·54毫莫耳；5·00 ml; 3 96 g)中且向此 溶液中添加先前製備之AZD1152之甲醇溶液（呈游離形式 三水合物-1·00莫耳當量，286.14微莫耳；4〇_〇〇 mL ; 31.87 g)，接著添加更多甲醇（123.54毫莫耳；5.00 mL ; 3.96 g)。使混合物在室溫下攪拌隔夜。生成白色懸浮液且將固 體藉由過濾回收，隨後在真空中乾燥。藉由NMR*析確定 共結晶體為AZD1152之順丁烯二酸鹽。 上述步驟5之替代步驟： 將粗AZD1152(估計為7.44g @ 1〇〇。/。，11β61毫莫耳）添加 至二甲亞砜（36 ml)中且留在周圍條件下以製備淡棕色溶 液。向此溶液中添加順丁烯二酸（1·76 g，1516毫莫耳， 1.31莫耳當量）於甲醇（36 ml)中之溶液且使混合物在周圍溫 度下靜置隔仪。第二天將澄清溶液之等分試樣轉移至一小 瓶中，劃線且密封保持若干小時。形成白色固體之沈積物 且將此轉移至燒瓶中且對其擾拌。溶液逐漸變混濁且固體 沈積。將漿料靜置若干天且最後過濾。將濾餅以二甲亞颯/ 甲醇之1:1混合物（總共15 mi)洗滌，以甲醇（3x25 ml)原位 製成漿料且Ik後在真空中乾燥。由NMR分析確定共結晶體 為八201152之順丁烯二酸鹽（約78.7%產率）。 上述步驛5之另一替代步驟： 將AZD1152(呈游離形式三水合物_1〇〇莫耳當量，8·5ι 120508.doc -50- 200813026 笔莫耳，5·74 g)及2· 丁烯二酸⑺㈤❹莫耳當量；ι〇·2毫莫 耳，L19 g)’谷解於二甲亞砜（35 ml)中且加熱至6〇°C。將反 /合劑乙腈(20 mi)添加至熱混合物中，p遺後將該混合物以產 ，AZD1152順丁烯二酸鹽之較佳形式之晶體⑺駕莫耳當 置，42·6微莫耳；30·7 mg·理想地為預期產率之約〇5% w/w之里）播晶種。將反應混合物在⑼它下保持$小時，隨 後經3小時之時期又添加乙腈饋料（4〇 mi)。將混合物在 6〇 C下攪拌12-20小時（理想地為16小時）。以受控方式將反 應冷卻至20 C且藉由過濾分離產物。將濾餅以二甲亞碾/乙 腈（1·2體積比）之混合物洗滌、接著以乙腈洗滌。將固體在 真空中或在溫惰性氣體流下乾燥（理想地為4〇〇以得到約 88%產率之呈白色固體狀的AZD1152順丁烯二酸鹽。 【實施方式】 表徵資料 核磁共振譜 共結晶體中組份之結構及近似比可由質子NMR譜來破 定。典型資料展示於下。

120508.doc -51- 200813026 化學位移/ppm 化學位移/ppm 原子 原子

I Γ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 7.63 (m) NR 6.89 (m) 7.33 (m) 7.37 (m) NR 9.76* (s，寬） 6.77 (s) NR 3.85 (s) NR 10.51 (s) 11.99* (s，寬） 7.48 (dd5 9.1,2.4) NR 7.29 (d，2.4) 8.81(d，9.3) 8.98 ⑻

NR NR 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 4.32 (2Ht，5.8) 2.25 (m) 3.37 (m) NR 3.48 (m) 4.22 (m) 3.30 (2Hq，7.1) 1.28 (3Ht? 7.1) 14.0 (s，寬） 14.0 (s，寬） 6.28 (s) 6.28 (s) NR NR 14.0 (s，寬) NR NR 14.0 (s，寬） NR=無共振 NMR積分約符合1:1.04之順丁烯二酸與AZD11 52比率 差示掃描熱量測定 使用一 Mettler DSC820e對根據製備方法1及2製備 AZD1152順丁烯二酸鹽共結晶體進行差示掃描熱量測 (DSC)分析。以每分鐘10°C之恆定加熱速率將包含於一 之 定 裝 120508.doc -52- 200813026 備有一穿孔蓋之40 μΐ鋁盤中之通常小於5 mg物質的樣品在 25 C至325 C之溫度範圍内加熱。使用為氮氣之淨化氣體_ 流動速率為每分鐘1〇() ml。 根據上述方法1製備之AZD1152順丁烯二酸鹽共結晶體 之批料的結果（參見圖2)指示順丁烯二酸鹽共結晶體展示具 有180°C之起始溫度（歸因於熔融）之大的尖銳吸熱峰。在熔 融之後，歸因於順丁烯二酸在熔融後降解，觀測到大的吸 (x 熱事件。應瞭解Dsc之起始及/或峰值溫度值可在不同機 器不同方法或不同樣品之間輕微改變，且因此提供之值 不應理解為絕對值。 由上述方法2製備之AZD1152順丁烯二酸鹽共結晶體之 結果（參見圖3)指示順丁烯二酸鹽共結晶體展示具有183它 之起始溫度（歸因於熔融）之大的尖銳吸熱峰。在熔融之 後知因於順丁婦一酸在溶融後降解，觀測到大的吸熱事 件。應瞭解DSC之起始及/或峰值溫度值可在不同機器、不 1； 同方法或不同樣品之間輕微改變，且因此提供之值不應理 解為絕對值。 動態蒸氣吸附 分析儀器：表面量測系統動態蒸氣吸附分析儀 C下在以下相對濕度（rh)下：〇%、20%、40%、 6〇/〇 80/〇、95%、80%、60%、4〇〇/0、20%、0〇/〇 RH下， 使在特定溫度下包含於一石英固持器中之約5叫物質經受 氮流動速率為每分鐘2〇〇 ml之濕潤氛，重複兩次。 監測在特定相對濕度下之物質重量直至根據由1〇分鐘所 120508.doc -53- 200813026 ::的每分鐘〇.。02%重量變化之重量標準其為 重*仍改變，則將其保持在特定相對濕度下 (直至12小時之最大時間）。 夏里私疋 根據方法1製備之AZD1! 52順丁婦二酸鹽共結晶體之批 料之結果展示於圖4中。根據上述方法2製備之αζ〇㈣順 丁烯二酸鹽共結晶體之批料之結果展示於圖5中。

圖4及圖5中展示之動態蒸氣吸附結果指示樣品為非吸濕 性的且重量上升歸因於表面吸附。在循環丨中圖5中觀測到 之重量損失歸因於因製造存在於樣品中的少量溶劑。此由 在0% RH下降低之重量證實。一旦此溶劑蒸發，則在 RH下物質維持其重量。熟習此項技術者應完全瞭解此觀 測0 AZD1152游離形式之動態蒸氣吸附展示於圖6中。 AZD1152游離形式之動態蒸氣吸附指示視儲存之相對濕 度而定，水之含量為完全可變的。此水含量之變化係歸因 於不同水合狀態，其可在脫水狀態至四水合狀態及更高水 合狀態之範圍内。 X射線粉末繞射 上文陳述AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體之X射線粉 末繞射圖展示於圖1中。 AZD1152順丁烯二酸鹽之另一製造方法已呈現於上文方 法2中。由方法2製造之AZD 1152之順丁烯二酸鹽共結晶體 的X射線粉末繞射圖展示於圖7中。關鍵峰展示於以下表2 中〇 120508.doc -54- 200813026 表2

角(2Θ) 5.13 6.45 8.14 10.18 11.96 12.85 13.85 14.96 15.27 15.75 16.53 17.29 19.31 19.78 20.10 20.60 21.01 21.68 度.3.9.518.4.3.5.7.7.60.1.5.5.5.3 途 ο· 7· ο· ?· 7·8.4.2.5.139.3· ο 5_ 9· ο· ο· 2. ^7 8 5 4 9 ^ 5 112 12159428 對 目 角(2Θ) 22.45 23.22 23.58 23.98 24.30 24.65 25.56 25.83 26.37 27.98 28.44 28.91 29.72 30.34 32.72 36.21 38.18 相對強度(％) 13.5 21.8 33.8 20.8 14.8 16.1 27.8 52.5 35.6 38.4 34.3 16.9 29.6 13 14.5 22.3 11.9 如上所述，此項技術中已知視量測條件（諸如設備、樣 品製備或所使用之機器）而定可獲得具有一或多個量測誤 差之X射線粉末繞射圖。詳言之，通常已知χ射線粉末繞 射圖之強度可視量測條件及樣品製備而波動。舉例而言， 熟習X射線粉末繞射之技術者應瞭解峰之相對強度可受到 (例如）尺寸大於30微米之晶粒及非單一縱橫比（其可影響樣 品之分析）的影響。熟習此項技術者亦應瞭解反射之位置 可文到樣品處於繞射儀中之精確高度及繞射儀之零校正的 影響。樣品之表面平坦度亦可具有較小影響。因此熟習此 項技術者應瞭解本文中呈現之繞射圖資料不應理解為絕對 的（進步資訊參見 Jenkins，R及 Snyder，R.L· Introduction 120508.doc •55- 200813026 to X_Ray Powder Diffractometry，John Wiley & Sons，1996) 〇 一般而言，以上亦陳述X射線粉末繞射圖中繞射角之量 測誤差為約2Θ=0·5。或更小（或，更適合地，約2θ：=〇·2。或更 小），且當考慮圖1中之X射線粉末繞射圖且當說明上文中 及表1中提及之峰位置時，應考慮此量測誤差之程度。 鑒於此，熟習此項技術者應瞭解上文圖7及表2中呈現之 資料指示由方法2生成之AZD1152之順丁浠二酸鹽共結晶 體為與由方法1生成之AZD11 52之順丁烯二酸鹽共結晶體 ( (且展示於圖1及表1中）相同的結晶形式。 【圖式簡單說明】 圖1為AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體（由上述方法1 製備）之X射線粉末繞射圖，其中20值繪於水平軸上且相對 譜線強度（計數）繪於垂直軸上。 圖2為根據上述方法1製備之azd 11 52順丁烯二酸鹽共結 晶體之差示掃描熱量測定溫度記錄圖。 圖3為根據上述方法2製備之AZD1152順丁烯二酸鹽共結 ij 晶體之差示掃描熱量測定溫度記錄圖。 圖4為根據上述方法1製備之azd 11 52順丁烯二酸鹽共結 晶體之批料之動態蒸氣吸附等溫線圖。 圖5為根據上述方法2製備之AZD1152順丁烯二酸鹽共結 晶體之批料之動態蒸氣吸附等溫線圖。 圖6為AZD1152游離形式之動態蒸氣吸附等溫線圖。 圖7為AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體（由上述方法2 製備）之X射線粉末繞射圖，其中2 0值繪於水平軸上且相 對譜線強度（計數）緣於垂直軸上。 120508.doc -56 -

Claims (1)

1. 200813026 十、申請專利範圍： 1. 一種AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體，其中AZD1152為

   2. 一種如請求項1之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體的結 (. 晶形式。 3 ·如請求項2之AZD11 52之順丁稀二酸鹽共結晶體的結晶形 式，其中該共結晶體具有一在約2Θ=12·9。及15.2。及/或 10.2°下具有特定峰之X射線粉末繞射圖。 4. 一種用於製備如請求項1之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結 晶體的方法，該方法包含在諸如甲醇、二曱亞颯 (DMSO)或其混合物之適合溶劑中將AZD11 52游離形式之 溶液與順丁烯二酸混合的步驟。 Q c 5. 一種醫藥組合物，其包含與醫藥學上可接受之稀釋劑或 載劑結合的如請求項1之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶 體。 6. 如請求項1之AZD1152的順丁烯二酸鹽共結晶體，係用於 療法中。 7· —種如請求項iiAZDnw之順丁烯二酸鹽共結晶體用於 製備藥物的用途，其中該藥物係用於治療一或多種極光 激酶之抑制作用為有益的疾病。 120508.doc 200813026 8. 一種如請求項1之AZD1152之順丁烯二酸鹽共結晶體用於 製備藥物的用途，其中該藥物係用於治療過度增生性疾 病，諸如癌症。 120508.doc