MX2008014550A

MX2008014550A - Co-cristal de maleato de azd1152.

Info

Publication number: MX2008014550A
Application number: MX2008014550A
Authority: MX
Inventors: Richard Storey; George Joseph Sependa
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2008-11-27
Also published as: US20080045481A1; SA07280243B1; UA95108C2; AU2007251304A1; UY30351A1; EP2027114A1; AR060963A1; IL194862A0; TW200813026A; BRPI0712791A2; JP2009537498A; ZA200809172B; GB0609621D0; ECSP088890A; WO2007132227A1; NO20084580L; US7625910B2; CN101448823A; CL2007001388A1; KR20090009297A

Abstract

La presente invención se refiere a un co-crista de novedad de 2-{etil[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1H-pirazol -3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil]amino}etil dihidrógeno fosfato (aquí referido como AZD1152) que es un inhibidor cinasa que es útil en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como cáncer.

Description

CO-CRISTAL DE MALEATO DE AZD1152 Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un nuevo co-cristal y más particularmente a una nueva forma de co-cristal de 2-{etil[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1 H-pirazol-3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil]amino}etil dihidrógeno fosfato (aquí referido como AZD1152) el cual es un inhibidor de la aurora cinasa que es útil en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tal como el cáncer. Más específicamente la invención se refiere a un co-cristal de maleato de AZD1152, con un proceso para la preparación de un co-cristal de maleato de AZD1152, con las composiciones farmacéuticas que contienen un co-cristal de maleato de AZD1152, con el uso de un co-cristal de maleato de AZD1152 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tal como el cáncer, y con métodos de tratar enfermedades hiperproliferativas tal como el cáncer en el cuerpo humano o animal administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un co-cristal de maleato de AZD1152. Esta invención también se relaciona con una forma cristalina particular de un co-cristal de maleato de AZD1152. El cáncer (y otras enfermedades hiperproliferativas) está caracterizado por una proliferación celular incontrolada la cual ocurre cuando la regulación normal de la proliferación de las células se pierde. Esta pérdida frecuentemente parece ser el resultado de un daño genético en la ruta celular que controla el progreso de la célula a través de su ciclo celular. En eucariotas, se piensa que una cascada ordenada de fosforilación de proteína controla el ciclo celular. Varias familias de proteínas cinasas que juegan papeles críticos en esta cascada han sido identificadas. La actividad de muchas de estas cinasas es incrementada en tumores humanos cuando se compara al tejido normal. Esto puede ocurrir debido a niveles incrementados de expresión de la proteína (por ejemplo como resultado de la amplificación del gen), o por cambios en la expresión de coactivadores o proteínas inhibidoras. Los primeros identificados, y más ampliamente estudiados de estos reguladores del ciclo celular son las cinasas dependientes de ciclina (o CDKs). Más recientemente, las proteínas cinasas que son estructuralmente distintas de la familia CDK han sido identificadas y encontradas para jugar papeles críticos en la regulación del ciclo celular. Estas cinasas también parecen ser importantes en la oncogénesis e incluyen homólogos humanos de las proteínas IpM Drosophila aurora y S.cerevisiae. Los tres homólogos humanos de estos genes aurora-A, aurora-B y aurora-C (también conocidos como aurora2, auroral y aurora3 respectivamente) codifican el ciclo celular regulado por las proteínas cinasas serina-treonina (resumido en Adams y colaboradores, 2001, Trends ¡n cell Biology. 11(2): 49-54). Estas muestran un pico de expresión y actividad de cinasa a través de G2 y mitosis. Varias observaciones implican la inclusión de proteínas aurora humanas en el cáncer. Los genes aurora-A trazan el cromosoma 20q13, una región que es frecuentemente amplificada en tumores humanos incluyendo tumores de mamas y colon. Aurora-A puede ser el gen objetivo principal de este amplicón, ya que el ADN aurora-A es amplificado y el ARNm sobreexpresado en más de 50% de los cánceres coloréeteles humanos primarios. En estos tumores los niveles de proteína aurora-A aparecen grandemente elevados comparados con el tejido normal adyacente. En adición, la transfección de fibroblastos de roedores con aurora-A humanos conduce a la transformación, confiriendo la capacidad de crecer en agar blando y forma tumores en ratones desnudos (Bischoff y otros, 1998, The EMBO Journal. 17(11): 3052-3065). Otro trabajo (Zhou y otros, 1998, Nature Genetics. 20(2): 189-93) ha mostrado que la sobreexpresión artificial de aurora-A conduce a un incremento en el número de centrosomas y a un incremento en aneuploide, un evento conocido en el desarrollo del cáncer. También ha sido mostrado que hay un incremento en la expresión de aurora-B (Adams y colaboradores, 2001, Chromsoma. 110(2):65-74) y aurora-C (Kimura y colaboradores, 1999, Journal de Biological Chemistry, 274(11): 7334-40) en células de tumor cuando se comparan con las células normales. Aurora-B es sobreexpresado en células de cáncer y se ha mostrado que niveles incrementados de aurora-B correlacionados con etapas avanzadas del cáncer colorectal (Katayama y colaboradores (1999) J. Nati. Cáncer Inst. 91:1160). Además, un reporte sugiere que la sobreexpresión de aurora-B induce aneuploide a través de la fosforilación incrementada de historia H3 en serina 10 y que las células que sobreexpresan aurora-B forman tumores más agresivos que desarrollan metástasis (Ota, T. y colaboradores, 2002, Cáncer Res. 62: 5168-5177). Aurora-B es una proteína de transporte del cromosoma que existe en un complejo estable con al menos otras tres proteínas de transporte, Survivin, INCENP y Borealin (Carmena M. y colaboradores 2003, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 842-854). Survivin es también sobreregulado en el cáncer y contiene un dominio BIR (Repetición del Inhibidor Baculovirus de la proteína de apoptosis (IAP)) y puede por lo tanto jugar un papel en la protección de células de tumor de la apoptosis y/o catástrofe mitótica. Con relación a aurora-C, su expresión se piensa que esté restringida al testículo pero se ha encontrado estar sobreexpresado en varias líneas de cáncer. (Katayama H y colaboradores, 2003, Cáncer and Metástasis Reviews 22: 451-464). De manera importante, ha sido también demostrado que la abrogación de la expresión y función de aurora-A por tratamiento con oligonucleótido antisentido de líneas celulares de tumor humano (WO 97/22702 y WO 99/37788) conduce a la detención del ciclo celular y ejerce un efecto antiproliferativo en estas líneas celulares de tumor. Adicionalmente, ha sido demostrado que los inhibidores de molécula pequeña de aurora-A y aurora-B tienen un efecto antiproliferativo en células tumorales humanas (Keen y colaboradores 2001, Póster #2455, reunión anual de la American Association of Cáncer Research), ya que tiene abrogación selectiva de la expresión aurora-B solo por tratamiento ARNsi (Ditchfield y colaboradores 2003, Journal of cell Biology, 161(2): 267-280). Esto indica que la inhibición de la función de aurora-A y/o aurora-B tendrá un efecto antiproleferativo que puede ser útil en el tratamiento de tumores humanos y otras enfermedades hiperproliferativas. La inhibición de aurora cinasas como una aproximación terapéutica a estas enfermedades puede tener ventajas significativas sobre las rutas de señalización objetivo corriente arriba del ciclo celular (por ejemplo aquellas activadas por el receptor del factor de crecimiento de tirosina cinasas tal como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) u otros receptores). Ya que el ciclo celular está finalmente corriente abajo de todos los diversos eventos de señalización, las terapias dirigidas al ciclo celular tal como la inhibición de las aurora cinasas serían predichas para ser activas a través de la proliferación de las células tumorales, mientras que aproximaciones dirigidas a moléculas de señalización específica (por ejemplo EGFR) podrían ser predichas para ser activas únicamente en el subconjunto de células tumorales que expresan aquellos receptores. También se cree que existe una "conversación cruzada" significativa entre estas rutas de señalización lo que significa que la inhibición de un componente puede compensarse por otro, Los inhibidores de aurora cinasas son descritos en las Solicitudes Internacionales de Patente WO 03/55491 y WO 2004/058781, y en particular WO 2004/058781 describe un compuesto que posee la siguiente fórmula estructural, referida aquí como AZD1152: AZD1152 AZD1152 es un profármaco que es rápidamente y completamente convertido (en el plasma humano) a la fracción activa referida aquí como AZD1152 HQPA: AZD1152 HQPA AZD1152 HQPA es un inhibidor reversible y ATP-competiti vo de aurora cinasas con potente actividad contra la aurora A, B-INCENP y C-INCENP (Ki's 1369 + 12.2 nM, 0.359 +0.386 nM y 17.03 +12.2 nM de K¡ respectivamente). Se ha encontrado que el AZD1152 inhibe el crecimiento de tumores en un panel de injertos de tumores de pulmón (A549, Calu-6) y coloréeteles de humano (SW620, HCT116, Colo205) con importancia estadística. AZD1152 es descrito en WO 2004/058781 como la sal de dihidrocloruro y también como la base libre en formas hidratadas. En particular la forma libre es descrita en forma de trihidrato a tetrahidrato. Desde una perspectiva de fabricación, las formas hidratadas son problemáticas ya que requieren controles para estar en el lugar durante la fabricación, secado, almacenamiento y procesamiento. En adición, obtener y mantener una muestra del compuesto con un compuesto estequiométrico consistente en relación al agua es difícil. En el caso de las formas previamente descritas de AZD1152, y en particular con la forma libre, las moléculas de agua son únicamente de forma escasa unidas a cada molécula de AZD1152, de manera que la extensión de la asociación y disociación de las moléculas de agua al fármaco AZD1152 varía ampliamente con la temperatura y la humedad relativa. Por lo tanto, para un peso dado de AZD1152, la cantidad actual de AZD1152 en términos de número de moléculas de AZD1152 dependerá de la temperatura y humedad relativa ya que el contenido de agua variará. La efectividad de cualquier dosis determinada por peso es así también dependiente de la temperatura y humedad relativa a la cual está expuesta. La Sorción de Vapor Dinámico ha sido usada para medir la variación en el nivel de agua asociado con AZD1152 con humedad. WO 2004/058781 describe, en términos generales, algunas sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el mismo. AZD1152 está únicamente descrito como sal de dihidrocloruro y como forma libre. Otras formas de AZD1152 no son mencionadas. En particular, WO 2004/058781 no describe ningún otro co-cristal de AZD1152 y ciertamente no considera si cualquiera de los co-cristales particulares de los compuestos particulares posee beneficios sorprendentes y particularmente no beneficios que pudieran mejorar los problemas discutidos aquí. Inesperadamente y sorprendentemente hemos encontrado que el co-cristal de maleato de AZD1152 existe en una forma anhidra, el cual es sustancialmente no-higroscópico. Además, aunque la relación estequiométrica del fármaco a maleato puede variar dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0.8:1 a 1.2:1, ó 0.9:1 a 1.1:1, hemos encontrado que el co-cristal de maleato de AZD1152 descrito en la presente tiene una relación estequiométrica reproducible del fármaco a maleato de sustancialmente 1:1. La efectividad de una dosis por peso de co-cristal de maleato de AZD1152 es por lo tanto afectada por la temperatura y la humedad relativa en una extensión mucho menor que aquella de forma libre, la sal de dihidrocloruro y otras formas de co-cristales de AZD1152 que han sido evaluadas.

Adicionalmente, el co-cristal de maleato de AZD1152 es más fácil de fabricar ya que hay menos necesidad de controlar los niveles de humedad en el proceso de fabricación. La naturaleza anhidra del co-cristal de maleato significa además que sería posible formularla usando condiciones acuosas limitadas y/o ambientes de alta temperatura debido a un menor riesgo de hidratación/deshidratación durante las condiciones del procesamiento que usa ambientes acuosos por ejemplo granulación en húmedo. Adicionalmente, hemos descubierto que un co-cristal de maleato de AZD1152 sorprendentemente contiene menos impurezas que la forma libre. En particular, parece que ciertas impurezas recalcitrantes que están presentes en la forma libre están sorprendentemente presentes en una extensión mucho menor después de la conversión de la forma libre en la forma de maleato. En consecuencia, la presente invención proporciona un co-cristal de maleato de AZD1152. Para evitar dudas, los términos "co-cristal de maleato de AZD1152", "co-cristal de maleato AZD1152" o "maleato AZD1152" (o cualquier otro término similar usado aquí) se refiere a todas las formas de asociación entre AZD1152 y ácido maléico, incluyendo la forma de sales. En particular, estos términos comprenden: (i) una asociación no iónica entre el AZD1152 y ácido maléico (es decir donde ningún transferencia de protón ha ocurrido entre el fármaco y el ácido maléico); o (ii) una interacción iónica donde la transferencia de protón entre el AZD1152 y el ácido maléico ha ocurrido para formar una sal de maleato de AZD1152, o (iii) mezclas de (i) y (ii) anteriores. En una modalidad particular de la invención, el co-cristal de maleato comprende una asociación no iónica entre el fármaco AZD1152 y el ácido maléico (es decir donde no ha ocurrido uha transferencia de protones entre el fármaco y el ácido maléico). En una modalidad alternativa de la invención, el co-cristal de maleato es una sal de maleato de AZD1152. En una modalidad particular, un co-cristal de maleato de AZD1152 se forma mezclando la forma libre de AZD1152 con ácido maléico en un solvente adecuado tal como metanol, dimetil sulfóxido (DMSO) o una mezcla de DMSO con metanol, acetonitrilo, y otros solventes similares. El co-cristal de maleato puede ser aislado permitiendo que ocurra la cristalización y después aislando el material cristalino resultante. La identidad de un co-cristal de maleato de AZ1152 de la presente invención puede ser confirmada por análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) de protones. Deberá también entenderse que un compuesto o co-cristal de la invención puede exhibir el fenómeno de tautomerismo y que los dibujos de las fórmulas dentro de esta especificación pueden representar únicamente una de las posibles formas tautoméricas. Deberá entenderse que la invención comprende cualquier forma tautomérica que tiene actividad inhibidora Aurora cinasa y en particular actividad inhibidora Aurora-A y/o Aurora-B cinasa y no está limitado meramente a cualquier forma tautomérica utilizada dentro de los dibujos de las fórmulas. La presente invención también se refiere a una forma cristalina particular del co-cristal de maleato de AZD1152. Esta forma cristalina es preparada cristalizando el cristal de maleato de AZD1152 a partir de un solvente orgánico tal como una mezcla de metanol y dimetil sulfóxido (DMSO). Detalles experimentales adicionales son proporcionados en los Ejemplos. En consecuencia, la invención proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152. La forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152 está caracterizada porque proporciona un patrón de difracción de rayos-X en polvo sustancialmente como es mostrado en la Figura 1. Los picos más prominentes de difracción de rayos-X en polvo para la forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152 son mostrados en la tabla 1: Tabla 1 Ángulo 2-teta ° Intensidad % Ángulo Intensidad Relativa 2-teta ° Relativa % 5.118 100 22.425 18.8 6.446 18.8 23.228 26.8 8.158 28.1 23.583 37.7 10.171 13.1 23.994 25.7 11.917 5.9 24.271 24.1 12.861 18 24.671 23.3 13.849 48.3 25.32 19.1 14.909 25.2 25.574 32.9 15.234 36 25.813 43.8 15.738 27.6 26.21 35.3 16.506 18.8 27.122 16 16.884 23 27.946 45.4 17.232 42.5 28.418 31.6 18.134 13.8 28.847 21.7 19.327 62.7 29.725 26.1 19.82 38.8 30.521 18.8 20.082 61 31.74 15.4 20.582 61.4 33.424 14.7 21.008 32 36.181 15.3 21.663 87.3 38.106 10.8 De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con al menos un pico específico a aproximadamente de 2-teta = 15.2o.

De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con picos específicos a aproximadamente de 2-teta = 12.9°. De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con picos específicos a aproximadamente de 2-teta = 15.2 durante 10.2D. De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde dicho co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con picos específicos a aproximadamente 2-teta = 18.1 ?. De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con al menos un pico específico a aproximadamente de 2-teta = 10.2°, 12.9° 15.2°ó 18.1° De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con picos específicos a aproximadamente 2-teta = 12.9°y 15.2° y/o 10.2°. De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con picos específicos a aproximadamente 2-teta = 10.2°, 12.9°, 15.2° y 18.1°. De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con picos específicos a aproximadamente uno de cualquiera o combinación de los valores 2-teta o mostrados en la tabla 1. De acuerdo con la presente invención se proporciona una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, donde co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo sustancialmente al igual que el patrón de difracción de rayos-X en polvo mostrado en la Figura 1. Cuando se establece aquí que la presente invención se refiere a una forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152, el grado de cristalinidad determinado por datos de difracción de rayos X en polvo es convenientemente mayor que aproximadamente de 60%, más convenientemente mayor que aproximadamente de 80%, preferiblemente mayor que aproximadamente 90%. En los párrafos precedentes que definen los picos de difracción de rayos X en polvo para las formas cristalinas del co-cristal de maleato de AZD1152, el término "a aproximadamente" es usado en la expresión "a aproximadamente 2-teta =..." para indicar que la posición precisa de los picos (es decir los valores de ángulo 2-teta recitados) no deberán interpretarse como siendo valores absolutos ya que, como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, la posición precisa de los picos puede variar ligeramente entre una máquina y otra, de una muestra a otra, o como un resultado de variaciones ligeras en las condiciones de medición utilizadas. Es también establecido en los párrafos precedentes que las formas cristalinas del co-cristal de maleato de AZD1152 que proporcionan patrones de difracción de rayos-X en polvo 'sustancialmente' iguales al patrón de difracción de rayos-X en polvos mostrados en la Figura 1, y tienen sustancialmente los picos más prominentes (valores de ángulo 2-teta) mostrados en la tabla 1 y en particular a aproximadamente 2-teta = 10.2°, 12.9°, 15.2° ó 18.1°. Será apreciado que el uso del término 'sustancialmente' en este contexto también pretende indicar que los valores de ángulo 2-teta de los patrones de difracción de rayos-X en polvo pueden variar ligeramente de una máquina a otra, de una muestra a otra, o como resultado de ligeras variaciones en las condiciones de medición utilizadas, de manera que las posiciones mostradas en la Figura o cotizadas en la Tabla no son otra vez construidas como valores absolutos. A este respecto, es conocido en la técnica que un patrón de difracción de rayos-X en polvo puede ser obtenido el cual tiene uno o más errores de medición dependiendo de las condiciones de medición (tal como el equipamiento, la preparación de la muestra o la máquina usada). En particular, es generalmente conocido que las intensidades en el patrón de difracción de rayos-X en polvo pueden fluctuar dependiendo de las condiciones de medición y la preparación de la muestra. Por ejemplo, los expertos en la técnica de la difracción de rayos-X en polvo se percatarán de que la intensidad relativa de los picos puede ser afectada por, por ejemplo, granos por encima de 30 micrones en tamaño y relaciones de aspecto no-unitarios, lo que puede afectar el análisis de las muestras. El experto en la técnica también se percatará que la posición de las reflexiones puede afectarse por la altura precisa a la cual la muestra se sitúa en el difractómetro y la calibración cero del difractómetro. La planidad de la superficie de la muestra también puede tener un pequeño efecto. De ahí que un experto en la técnica apreciará que la información del patrón de difracción presentado aquí no es interpretado como absoluto (para más información ver Jenkins, R & Snyder, R.L. 'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons, 1996). Por lo tanto, será entendido que la forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152 de la presente invención no está limitado a los cristales que proporcionan patrones de difracción de rayos-X en polvo idénticos a los patrones de difracción de rayos-X en polvo mostrados en la Figura 1 y cualquiera de los cristales que proporcionan patrones de difracción de rayos-X en polvo sustancialmente iguales a aquellos mostrados en la Figura 1 caen dentro del alcance de la presente invención. Un experto en la técnica de la difracción de rayos-X en polvo es capaz de juzgar la identidad sustancial de los patrones de difracción de rayos-X en polvo. Generalmente, un error de medición de un ángulo de difracción en un difractómetro de rayos-X en polvo es aproximadamente de 2-teta = 0.5° o menos (o, más adecuadamente, aproximadamente de 2-teta = 0.2° o menos) y tal grado de un error de medición deberá tomarse en cuenta cuando se considera el patrón de difracción de rayos-X en polvo de la Figura 1, y cuando se interpretan las posiciones de los picos referidos en el texto anterior y en la Tabla 1. Por lo tanto, donde se establezca, por ejemplo, el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con al menos un pico específico a aproximadamente de 2-teta = 15.2° (o cualquiera de los otros ángulos mencionados anteriormente) entonces esto puede ser interpretado como siendo 2-teta = 15.2° más o menos 0.5°, o 2-teta = 15.2° más o menos 0.2°. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de preparar un co-cristal de maleato de AZD1152 como el aquí definido, el método comprende la etapa de mezclar una solución de forma libre de AZD1152 con ácido maléico en un solvente adecuado tal como metanol, N-metil-2-pirrolidinona, dimetil sulfóxido (DMSO) o una mezcla de DMSO con metanol, acetonitrilo, y otros solventes similares. El método puede comprender adicionalmente las etapas de cristalización y, opcionalmente, aislamiento del co-cristal de maleato cristalino de AZD1152 así formado. El proceso puede adicionalmente comprender las etapas adicionales de lavar el co-cristal de maleato de AZD1152 con un solvente adecuado; y secar el co-cristal de maleato de AZD1152.

Adecuadamente, la forma libre de AZD1152 es disuelve en un solvente adecuado (tal como dimetilsulfóxido, metanol, una mezcla de los mismos o N-metil-2-pirrolidinona) y generalmente mezclada con una solución de ácido maléico (el cual es disuelto en el mismo solvente o en uno compatible). Alternativamente, el ácido maléico sólido puede agregarse a la solución de la forma libre de AZD1152 (o viceversa, es decir la solución de la forma libre de AZD1152 puede agregarse al ácido maléico sólido). Adecuadamente, la solución es agitada para facilitar el mezclado de la forma libre de AZD1152 y el ácido maléico agregado. Los materiales (idealmente pero no exclusivamente en una relación 1: 1) pueden mezclarse a temperatura ambiente aunque el procedimiento puede también realizarse a temperaturas más altas. Cualquier método conocido adecuado en la técnica para aislar la forma de maleato cristalina de AZD1152 puede ser usado. "Adecuadamente, el co-cristal de maleato de AZD1152 es recogido por filtración. Preferiblemente el co-cristal de maleato de AZD1152 lavado es secado al vacío. En general, una relación de la forma libre de AZD1152: ácido maléico de 1:1 es deseada. Esta relación 1:1 deseada puede ser obtenida mezclando la forma libre de AZD1152 y el ácido maléico en composiciones siempre dentro del intervalo de 0.6 - 1.4 de forma libre de AZD1152 : 1.0 de ácido maléico. Adecuadamente, la relación de forma libre de AZD1152: ácido maléico en la mezcla está dentro del intervalo de 0.9 - 1.1 y particularmente 1.0 - 1.1 de la forma libre de AZD1152: 1.0 - 1.1 de ácido maléico. Generalmente un exceso de ácido maléico debe ser usado y en particular la relación de la forma libre de AZD1152: ácido maléico en la mezcla está dentro del intervalo de 0.6 - 1.0 y particularmente 0.9 - 1.0 de la forma libre de AZD1152: 1.0 de ácido maléico. El co-cristal de maleato AZD 152 normalmente autocristaliza, pero será apreciado por un experto en la técnica que la siembra puede ser usada si es requerida o deseada para promover la formación del co-cristal. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un co-cristal de maleato de AZD1152, como el definido aquí en asociación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de la invención pueden estar en un formato adecuado para uso oral (por ejemplo como tabletas, pastillas, cápsulas duras o blandas, suspensiones acuosas o oleosas, emulsiones, polvos o gránulos dispersables, jarabes o elíxires), para uso tópico (por ejemplo como cremas, ungüentos, geles o soluciones o suspensiones acuosas u oleosas), para la administración por inhalación (por ejemplo, como polvo finamente dividido o un aerosol líquido), para administración mediante insuflación (por ejemplo como un polvo finamente dividido) o para administración parenteral (por ejemplo, como solución acuosa u oleosa estéril para dosificación intravenosa, subcutánea, intramuscular o intramuscular o como un supositorio para dosificación rectal). Las composiciones de la invención pueden obtenerse mediante procedimientos convencionales, utilizando excipientes farmacéuticos convencionales, bien conocidos en la técnica. Así, las composiciones destinadas para el uso oral pueden contener, por ejemplo, uno o varios agentes colorantes, edulcorantes, saborizantes y/o conservantes. Excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para una formulación en tabletas incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes tales como lactosa, carbonato de sodio, fosfato de calcio o carbonato de calcio, agentes granulantes y desintegrantes tales como almidón de maíz o ácido algénico; agentes aglutinantes tales como almidón; agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco; conservantes tales como p-hidroxíbenzoato de etilo o propílo, y agentes antioxidantes tales como ácido ascórbíco. Las formulaciones en tabletas pueden ser o bien recubiertas o no recubiertas, para modificar su desintegración y posterior absorción del principio activo en el tracto gastrointestinal, o para mejorar su estabilidad y/o apariencia, en ambos casos, usando agentes de recubrimiento convencionales y procedimientos bien conocidos en la técnica. Las composiciones para uso oral pueden ser en forma de cápsulas de gelatina dura, en las cuales el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda, en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un aceite, tal como el aceite de cacahuete, parafina líquida, aceite de soya, aceite de coco, o preferiblemente aceite de oliva, o cualquier otro vehículo aceptable. Las suspensiones acuosas generalmente contienen el ingrediente activo en forma de polvo finamente dividido junto con uno o más agentes de suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona , goma de tragacanto y goma de acacia; agentes dispersantes o humectantes tales como lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos (por ejemplo estearato de polioxetileno), o productos de condensación del óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenooxicetanol, o productos de condensación del óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, tales como monooleato de polioxietileno sorbitol, o productos de condensación del óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenooxicetanol, o productos de condensación del óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, tal como monooleato de polioxietileno sorbitol, o productos de condensación del óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol anhídridos, por ejemplo monooleato de polietileno sorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes (tal como etil o propil p-hidroxibenzoato, antioxidantes (tal como ácido ascórbico), agentes colorantes, saborizantes y/o edulcorantes (tales como sacarosa, sacarina o aspartamo). Las suspensiones oleosas se pueden formular mediante suspensión del ingrediente activo en un aceite vegetal (tal como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco) o en un aceite mineral (tal como parafina líquida). Las suspensiones oleosas también pueden contener un agente espesante, tal como la cera de abeja, parafina dura o cetil alcohol. Agentes edulcorantes tales como los antes expuestos, y agentes saborizantes pueden añadirse para proporcionar una preparación oral agradable. Estas composiciones se pueden preservar por la adición de un antioxidante como el ácido ascórbico. Polvos y gránulos dispersables y liofilizados adecuados para la preparación de una solución o suspensión acuosa mediante la adición de agua, generalmente contienen el ingrediente activo junto con un agente dispersante o un agente humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Agentes dispersantes y humectantes apropiados y agentes de suspensión son ejemplificados por aquellos ya mencionadas anteriormente. Excipientes adicionales tales como agentes edulcorantes, colorantes y saborizantes, también pueden estar presente. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal tal como el aceite de oliva o el aceite de cacahuete, o un aceite mineral, como por ejemplo la parafina líquida o una mezcla de cualquiera de estos. Agentes emulsificantes apropiados pueden ser, por ejemplo, gomas en forma natural tales como la goma de acacia o la goma de tragacanto, fosfátidos en forma natural tales como los del frijol de soya, lecitina, un éster o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol anhídridos (por ejemplo monooleato de sorbitán), y los productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tales como monooleato de polioxietileno sorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes, saborizantes y conservantes. Los jarabes y elíxires se pueden formular con agentes edulcorantes tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol, aspartamo o sacarosa, y también pueden contener un agente emoliente, conservante, saborizante y/o colorante.

Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en forma de una suspensión oleosa o acuosa inyectable estéril, soluciones, emulsiones o sistemas particulares que pueden formularse de acuerdo con los procedimientos conocidos, utilizando uno o más agentes dispersantes o humectantes apropiados y agentes de suspensión, los cuales han sido mencionados anteriormente. Una preparación inyectable estéril también puede ser una solución inyectable estéril o suspensión en un solvente o diluyente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo una solución en polietilenglicol. Las formulaciones en forma de supositorios pueden ser preparadas mezclando el ingrediente activo con un excipiente adecuado no irritante el cual es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a la temperatura rectal y se derretirá por lo tanto en el recto para liberar el fármaco. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, mantequilla de cocoa y polietilenglicoles. Las formulaciones tópicas, tai como cremas, ungüentos, geles y soluciones o suspensiones oleosas o acuosas, pueden generalmente ser obtenidas formulando un ingrediente activo con un vehículo o diluyente convencional, aceptable de manera tópica, usando el procedimiento convencional bien conocido en la técnica Las composiciones para la administración por insuflación pueden ser en forma de un polvo finamente dividido que contienen partículas de un diámetro promedio de, por ejemplo, 30 µ?t? o mucho menos preferiblemente de 5 m o menos y más preferiblemente entre 5 pm y 1 pm, el polvo en sí mismo comprendiendo el ingrediente activo solo o diluido con uno o más portadores fisiológicamente aceptables tal como la lactosa. El polvo para la insuflación es después convenientemente retenido en una cápsula que contiene, por ejemplo, 1 a 50 mg del ingrediente activo para su uso con un dispositivo turbo inhalador, tal como es usado para la insuflación del agente conocido cromoglicato de sodio. Las composiciones para la administración por inhalación pueden ser en forma de un aerosol presurizado convencional, arreglado para dispensar el ingrediente activo ya sea como un aerosol que contiene gotitas de líquido o sólidos finamente divididos. Propelentes de aerosoles convencionales, tales como los hidrocarburos fluorados volátiles o hidrocarburos, se pueden utilizar y los dispositivos para aerosoles son convenientemente dispuestos para dispensar una cantidad dosificada del ingrediente activo. Para más información en la formulación se remite al lector al Capítulo 25.2 en el Volumen 5 de Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Jefe del Consejo Editorial), Pergamon Press 1990. Por lo tanto en un aspecto adicional de la invención se proporciona un co-cristal de maleato de AZD1152 para uso en terapia. Además se proporciona un co-cristal de maleato de AZD1152 para su uso como un medicamento. Otro aspecto de la invención proporciona un co-cristal de maleato de AZD1152 para su uso como un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tal como el cáncer y en particular el cáncer colorectal, de mama, de pulmón, de próstata, de vejiga, renal o de páncreas o leucemia o linfoma. Las leucemias y linfomas mencionados aquí pueden ser tumores de linaje mieloide tal como leucemia mieloide aguda o de linaje linfoide. Adicionalmente un co-cristal de maleato de AZD1152 es proporcionado para su uso en un método de tratamiento de un animal de sangre caliente tal como el hombre mediante terapia. Otro aspecto de la invención proporciona un co-cristal de maleato de AZD1152 para su uso en un método de tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tal como el cáncer y en particular el cáncer colorectal, de mama, de pulmón, de próstata, de vejiga, renal o de páncreas o leucemia o linfoma. En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un co-cristal de maleato de AZD1152 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad donde la inhibición de una o más aurora cinasa(s) es beneficioso. En particular se prevé que la inhibición de la aurora A cinasa y/o la aurora B cinasa puede ser beneficiosa. Preferiblemente la inhibición de la aurora B cinasa es beneficiosa. En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un co-cristal de maleato de AZD1152 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferatívas tal como el cáncer y en particular el cáncer colorectal, de mama, de pulmón, de próstata, de vejiga, renal o de páncreas o leucemia o linfoma.

De acuerdo con aún otro aspecto, se proporciona un co-cristal de maleato de AZD1152 para su uso en el método de tratar un humano que sufre de una enfermedad en la cual la inhibición de una o más aurora cinasa es beneficiosa, que comprende los pasos de administrar a una persona que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un co-cristal de maleato de AZD1152. En particular se prevé que la inhibición de la aurora A cinasa y/o la aurora B cinasa puede ser beneficiosa. Preferiblemente la inhibición de la aurora B cinasa es beneficiosa. Además se proporciona un co-cristal de maleato de AZD1152 para su uso en el método de tratar a un humano que sufre de una enfermedad hiperproliferativa tal como el cáncer y en particular el cáncer colorectal, de mama, de pulmón, de próstata, de vejiga, renal o de páncreas o leucemia o linfoma, que comprende los pasos de administrar a una persona que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un co-cristal de maleato de AZD1152. El uso de un co-cristal de maleato de AZD1152 en cualquiera de los métodos de tratar un humano descritos anteriormente también forma los aspectos de esta invención . Para los usos terapéuticos mencionados la dosis administrada variará con el compuesto usado, el modo de administración, tratamiento deseado, trastorno indicado, edad y el sexo del animal o paciente. El tamaño de la dosis sería de esta manera calculado de acuerdo con principios bien conocidos de la medicina. Al usar un co-cristal de maleato de AZD1152 para propósitos terapéuticos o profilácticos este será generalmente administrado de manera que una dosis diaria en el intervalo de, por ejemplo, 0.05 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal sea recibida, dada si se requiere en dosis divididas. En general dosis inferiores serán administradas cuando una ruta parenteral es usada. De esta manera, por ejemplo, para la administración intravenosa, una dosis en el intervalo de, por ejemplo, 0.05 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal será generalmente usada. Similarmente, para la administración por inhalación, una dosis en el intervalo de, por ejemplo, 0.05 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal será usada. El tratamiento definido aquí puede ser aplicado como una terapia única o puede ser involucrado, en adición al compuesto de la invención, cirugía convencional o radioterapia o quimioterapia. Tal quimioterapia puede incluir una o más de los siguientes categorías de agentes anti-tumorales: (i) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, tal como se utiliza en oncología médica, tal como agentes alquilatantes (por ejemplo cis-platino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza nitrogenada, melfalán, clorambucil, busulfan y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo antifolatos tal como fluoropirimidinas como el 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, citosina arabinosida e hidroxiurea); antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicin, mitomicina C, dactinomicina y mitramicina); agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotere); e inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo epipodofilotoxinas como etoposido y teniposida, amsacrina, topotecan y camptotecina); (ii) agentes citostáticos tal como antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno), reguladores hacia abajo de los receptores de estrogenos (por ejemplo fulvestrant), antiandrógenos (por ejemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina), progestógenos (por ejemplo, acetato de megestrol), inhibidores de la aromatasa (por ejemplo como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) y los inhibidores de la 5*-reductasa como finasteride; (iii) agentes que inhiben la invasión de las células de cáncer (por ejemplo los inhibidores de metaloproteínasas como marimastat e inhibidores de la función del receptor activador del plasminógeno de la urocinasa); (iv) inhibidores de la función del factor de crecimiento, por ejemplo tales inhibidores incluyen los anticuerpos del factor de crecimiento, anticuerpos del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-erbb2 trastuzumab [Herceptin™] y el anticuerpo anti-erbbl cetuximab [C225]), inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de serina/treonina cinasa, por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo inhibidores de la tirosina cinasa de la familia de EGFR tales como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropox¡)quinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (Cl 1033)), por ejemplo los inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de las plaquetas y por ejemplo los inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos; (v) agentes antiangiogénicos tales como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular, (por ejemplo el anticuerpo del factor de crecimiento de células endoteliales antivascular bevacizumab [Avastin™], compuestos tales como aquellos descritos n las Solicitudes Internacionales de Patente WO 97/22596, WO 97/ 30035, WO 97/32856 y WO 98/13354) y compuestos que funcionan por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de la integrina DvD3 y angiostatina); (vi) agentes perjudiciales vasculares como Combretastatin A4 y compuestos descritos en las Solicitudes Internacionales de Patente WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213; (vii) terapias antisentido, por ejemplo aquellas que son dirigidas a los objetivos listados anteriormente, tal como ISIS 2503, una antisentido anti-ras; (viii) aproximaciones a la terapia génica, incluyendo por ejemplo aproximaciones para reemplazar los genes aberrantes tal como p53 aberrante, BRCA1 o BRCA2 aberrantes, aproximaciones GDEPT (terapia con profármacos de enzimas dirigidas a los genes) tal como aquellas que usan citosina deaminasa, timidina cinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y aproximaciones para aumentar la tolerancia del paciente a la quimioterapia o la radioterapia tal como la resistencia a múltiples drogas de la terapia génica; (ix) aproximaciones de ¡nmunoterapia, incluyendo por ejemplo aproximaciones ex vivo e in vivo para aumentar la inmunogenicidad de las células tumorales del paciente, tal como la transfección con citocinas como la interleucina 2, interleucina 4 o el factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos, aproximaciones para disminuir la anergia de células T, aproximaciones usando células inmunes transfectadas como las células dendríticas transfectadas de citoquinas, aproximaciones usando líneas celulares tumorales transfectadas de citoquinas y aproximaciones usando anticuerpos antiidiotípicos; En adición un co-cristal de maleato de AZD1152 puede ser usado en combinación con uno o más inhibidores del ciclo celular. En particular con inhibidores del ciclo celular los cuales inhiben bub1, bubFM o CDK. Tal tratamiento conjunto puede ser logrado por medio de dosificaciones simultáneas, secuenciales o separadas de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de combinación emplean los compuestos de esta invención dentro del intervalo de dosificación aquí descritos y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona una combinación adecuada para usar en el tratamiento de trastornos proliferativos de la célula (tal como el cáncer) que comprende un co-cristal de maleato de AZD1152 como el definido aquí antes y un agente antitumoral adicional como el definido aquí antes. De acuerdo con este aspecto de la invención se proporciona un producto farmacéutico que comprende un co-cristal de maleato de AZD1152 como se definió aquí anteriormente y un agente antitumoral adicional como se definió aquí anteriormente para el tratamiento conjunto de los trastornos proliferativos de las células (tal como el cáncer). En adición a su uso en la medicina terapéutica, un co-cristal de maleato de AZD1152 es también útil como una herramienta farmacológica en el desarrollo y estandarización de los sistemas de pruebas in vitro e in vivo para la evaluación de los efectos de los inhibidores de la actividad del ciclo celular en animales de laboratorio tal como gatos, perros, conejos, monos, ratas y ratones, como parte de la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos. En lo anterior otras características de fabricación del medicamento, composición farmacéutica, proceso, método y uso, las realizaciones preferidas y alternativas de los compuestos de la invención aquí descritos también aplican. El co-cristal de maleato (s) de la invención inhibe la actividad serina-treonina cinasa de las auroras cinasas, en particular aurora A cinasa y/o aurora B cinasa y de esta manera inhibe la proliferación celular y el ciclo celular. Los compuestos que inhiben la aurora B cinasa son de particular interés. Estas propiedades pueden ser valoradas por ejemplo, usando uno o más de los procedimientos establecidos a continuación. (a) Prueba de inhibición de aurora A cinasa In Vitro Este ensayo determina la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la actividad de la serina-treonina cinasa. El ADN que codifica la aurora A puede ser obtenido por síntesis de genes total o por clonación. Este ADN puede entonces ser expresado en un sistema de expresión adecuado para obtener un polipéptido con actividad de serina-treonina cinasa. En el caso de aurora A, la secuencia de codificación fue aislada a partir del ADNc por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y clonada en los sitios de la endonucleasa de restricción BamH1 y Not1 del vector de expresión de baculovirus pFastBac HTc (GibcoBRL/Life technologies) . El cebador de PCR 5' contenía una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamH1 5' para la secuencia de codificación aurora A. Esto permitió la inserción del gen aurora A en el marco con los 6 residuos de histidina, región espaciadora y sitio de escisión de proteasa rTEV codificada por el vector pFastBac HTc. El cebador PCR 3' remplazó el codón de parada aurora A con secuencia de codificación adicional seguido por un codón de parada y una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Not1. Esta secuencia de codificación adicional (5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TCT TAA 3') codificó para la secuencia de polipéptido YPYDVPDYAS. Esta secuencia, derivada de la proteína hemaglutina de influenza, es frecuentemente usada como una secuencia epítope tag que puede ser identificada usando anticuerpos monoclonales específicos. El vector recombinante pFastBac por lo tanto codificó para una proteína Aurora-A etiquetada del epítope de hemaglutina de influenza C terminal, etiquetada his 6 N terminal. Detalles de los métodos para el agrupamiento de las moléculas de ADN recombinante pueden ser encontrados en los textos estándares, por ejemplo Sambrook y otros 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2da Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press y Ausubel y otros 1999, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. La producción de virus recombinantes puede ser realizada siguiendo el protocolo de los fabricantes de GibcoBRL. Brevemente, el vector pFastBac-1 que porta el gen aurora A fue transformado en células de E. coli DHIOBac que contienen el genoma del baculovirus (ADN bácmido) y por medio de un evento de transposición en las células, una región del vector pFastBac que contiene el gen de resistencia a la gentamicina y el gen aurora A incluyendo el promotor polihedrin baculovirus fue transpuesto directamente en el ADN bácmido. Por selección de gentamicina, canamicina, tetraciclina y X-gal, las colonias blancas resultantes deben contener ADN bácmido recombinante que codifica aurora A. ADN bácmido fue extraído a partir de un cultivo a pequeña escala de varias colonias BHIOBac blancas y transfectadas en células de Spodoptera frugiperda Sf21 creciendo en medio TC100 (GibcoBRL) que contienen 10% de suero usando el reactivo CelIFECTIN (GibcoBRL) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las partículas de virus fueron cosechadas recogiendo el medio de cultivo celular 72 horas post transfección. 0.5 mi del medio fue usado para infectar 100 mi del cultivo de Sf21s en suspensión que contienen 1 x 107 células/ml. El medio de cultivo celular fue cosechado 48 horas post infección y el título del virus determinado usando un procedimiento de ensayo de placa estándar. Stocks de virus fueron usados para infectar células Sf9 y "High 5" a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 para asegurar la expresión de la proteína aurora A recombina nte.

Para la expresión a gran escala de la actividad de la aurora A cinasa, células de insectos Sf21 fueron cultivadas a 28°C en un medio TC100 suplementado con 10% de suero fetal de ternero (Viralex) y 0.2% F68 Pluronic (Sigma) en un arreglo de rodillos Wheaton a 3 r.p.m. Cuando la densidad celular alcanzó 1.2x106 células ml-1 estas fueron infectadas con virus recombinante aurora A de placa puro a una multiplicidad de infección de 1 y cosechadas 48 horas después. Todos los pasos de purificación posteriores fueron realizados a 4°C. Las peloticas de células de insectos congeladas que contienen un total de 2.0 x 108 células fueron descongeladas y diluidas con amortiguador lisis (25 mM HEPES (N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[2-ácido etanosulfónico]) pH7.4 a 4°C, 100 mM KCI, 25 mM NaF, 1 mM Na3V04, 1 mM PMSF (fenilmetilsulfonil fluoruro), 2 mM 2-mercaptoetanol, 2 mM imidazol, 1 pg/ml aprotinin, 1 pg/ml pepstatina, 1 pg/ml leupeptina), usando 1.0 mi por 3 x 107 células. La lisis fue alcanzada usando un homogenizador dounce, seguido de lo cual el lisato fue centrifugado a 41,000g durante 35 minutos. El sobrenadante aspirado fue bombeado a una columna de cromatografía de 5 mm de diámetro que contiene 500 µ? Ni NTA (ácido nitrilo-tri-acético) agarosa (Qiagen, producto no. 30250) la cual había sido equilibrada en amortiguador de lisis. Un nivel de línea base de absorbancia UV para el eluyente fue alcanzado después de lavar la columna con 12 mi de amortiguador de lisis seguido por 7 mi de amortiguador de lavado (25 mM HEPES pH7.4 a 4°C, 100 mM KCI, 20 mM imidazol, 2 mM 2-mercaptoetanol). La proteína aurora A unida fue eluida de la columna usando el amortiguador de elusión (25 mM HEPES pH7.4 a 4°C , 100 mM KCI, 400 mM imidazol, 2 mM 2-mercaptoetanol). Una fracción de elusión (2.5 mi) correspondiente al pico en absorbancia UV fue recogida. La fracción de elusión, que contiene aurora A cinasa activa, fue dialisada exhaustivamente contra el amortiguador de diálisis (25 mM HEPES pH7.4 a 4°C , 45% glicerol (v/v), 100 mM KCI, 0.25% Nonidet P40 (v/v), 1 mM ditiotreitol). Cada nuevo lote de la enzima aurora A fue titulado en el ensayo mediante dilusión con diluyente de enzima (25mM Tris-HCI pH7.5, 12.5mM KCI, 0.6mM DTT). Para un lote típico (el cual puede ser obtenido de Upstate), el stock de enzima es diluido 1 µ? por mi con diluyente de enzima y 20 µ? de la enzima diluida es usado para cada pozo de ensayo. Los compuestos de prueba (a 10mM en dimetilsulfóxido (DMSO) fueron diluidos con agua y 10 µ? del compuesto diluido fue transferido a los pozos en las placas de ensayo. Los pozos de control "total" y "blanco" contenían 2.5% DMSO en vez del compuesto. Veinte microlitros de enzima diluida fresca fue añadida a todos los pozos, aparte de los pozos "blanco". Veinte microlitros de diluyente de enzima fue añadido a los pozos "blanco". Veinte microlitros de la mezcla de reacción (25mM Tris-HCI, 12.7mM KCI, 2.5mM NaF, 0.6mM ditiotreitol, 6.25mM MnCI2, 7.5mM ATP, 6.25 µ? sustrato péptido [biotina-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]) que contienen 0.2 µ? Ci [?33?]??? (Amersham Pharmacia, actividad específica =2500Ci/mmol) fue después añadida a todos los pozos de prueba para iniciar la reacción. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 60 minutos. Para detener la reacción 100 µ? 20% v/v de ácido ortofosfórico fue añadido a todos los pozos. El sustrato péptido fue capturado sobre una almohadilla del filtro P30 de nitrocelulosa positivamente cargada (Whatman) usando un cosechador de placas de 96 pozos (TomTek) y después ensayado para la incorporación de 33P con un contador de placa Beta. Valores de control "blanco" (sin enzima) y "total" (sin compuesto) fueron usados para determinar el intervalo de dilusión del compuesto de prueba que dio 50% de inhibición de la actividad de la enzima (valores IC50). (b) Prueba de inhibición de la aurora B cinasa In Vitro Este ensayo determina la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la actividad serina-treonina cinasa. El ADN que codifica la aurora B puede ser obtenido por síntesis de genes total o por clonación. Este ADN puede entonces ser expresado en un sistema de expresión adecuado para obtener el polipéptido con actividad serina-treonina cinasa. En el caso de aurora B, la secuencia de codificación fue aislada a partir de cADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y clonada en el sistema pFastBac en una manera similar a aquella descrita anteriormente para aurora A (es decir dirigir la expresión de una proteína aurora B etiquetada 6-histidina). Para la expresión a gran escala de la actividad de la aurora B cinasa, células de insectos Sf21 fueron cultivadas a 28°C en medio TC100 suplementado con 10% de suero fetal de ternero (Viralex) y 0.2% F68 Pluronic (Sigma) en un arreglo de rodillos Wheaton a 3 r.p.m. Cuando la densidad celular alcanzó 1.2x106 células ml-1 estas fueron infectadas con virus recombinante aurora B de placa puro a una multiplicidad de infección de 1 y cosechadas 48 horas después. Todas las etapas de purificación posteriores fueron realizadas a 4o. Las peloticas de células de insectos congeladas que contienen un total de 2.0 x 108 células fueron descongeladas y diluidas con amortiguador de lisis (50 mM HEPES (N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[2-ácido etanosulfónico]) pH7.5 a 4°C, 1 mM Na3V04, 1 mM PMSF (fenilmetilsulfonil fluouro), 1 mM d itiotre itoi , 1 g/ml aprotinina, 1 pg/ml pepstatina, 1 pg/ml leupeptina), usando 1.0 mi por 2 x 107 células. La lisis fue alcanzada usando un homogenizador de sonicación, seguido de lo cual el Usado fue centrifugado a 41,000g durante 35 minutos. El sobrenadante aspirado fue bombeado a una columna de cromatografía de 5 mm de diámetro que contiene 1.0 mi de CM sefarosa Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) que había sido equilibrada en un amortiguador de lisis. Un nivel de línea base de absorbancia UV para el eluyente fue alcanzado después de lavar la columna con 12 mi de amortiguador de lisis seguido por 7 mi de amortiguador de lavado (50 mM HEPES pH7.4 a 4°C, 1 m ditiotreitol). La proteína aurora B unida fue eluida a partir de la columna usando un gradiente de amortiguador de elusión (50 mM HEPES pH7.4 a 4°C, 0.6 M NaCI, 1 mM ditiotreitol, corriendo desde 0% de amortiguador de elusión a 100% de amortiguador de elusión durante 15 minutos a una tasa de flujo de 0.5 ml/min). Las fracciones de elusión (1.0 mi) correspondientes al pico en la absorbancia UV fueron recogidas. Las fracciones de elusión fueron dializadas exhaustivamente contra el amortiguador de diálisis (25 mM HEPES pH7.4 a 4°C, 45% glicerol (v/v), 100 mM KCI, 0.05% (v/v) IGEPAL CA630 (Sigma Aldrich), 1 mM ditiotreitol). Las fracciones dialisadas fueron ensayadas para la actividad de la aurora B cinasa. La enzima Aurora B-INCENP (como la suministrada por Upstate) fue preparada mediante la activación de aurora B (5DM) en 50 mM de Tris-HCI pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 0.1 % 2-mercaptoetanol, 0.1 mM de vandato de sodio, 10 mM acetato de magnesio, 0.1 mM ATP con 0.1 mg/ml GST-INCENP [826 - 919] a 30 °C durante 30 minutos. Cada nuevo lote de la enzima aurora B-INCENP fue titulado en el ensayo mediante la dilusión con diluyente de enzima (25mM Tris-HCI pH7.5, 12.5mM KCI, 0.6mM DTT). Para un lote típico, la enzima madre es diluida en 15 µ? por mi con diluyente de enzima y 20 µ? de la enzima diluida en cada pozo de ensayo. Los compuestos de prueba (a 10mM en dimetilsulfóxido (DIVISO) fueron diluidos con agua y 10 µ I del compuesto diluido fueron transferidos a los pozos en las placas de ensayo. "Los pozos de control "total" y "blanco" contenían 2.5% DMSO en vez del compuesto. Veinte microlitros de enzima diluida fresca fue añadida a todos los pozos, aparte de los pozos "blanco". Veinte microlitros de diluyente de enzima fue añadido a los pozos "blanco". Veinte microlitros de la mezcla de reacción (25mM Tris-HCI, 12.7mM KCI, 2.5mM NaF, 0.6mM ditiotreitol, 6.25mM MnCI2, 15mM ATP, 6.25DM sustrato péptido [biotina-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]) que contienen 0.2 pCi [?3?]??? (Amersham Pharmacia, actividad específica =2500Ci/mol) fue después añadida a todos los pozos de prueba para iniciar la reacción. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 60 minutos. Para detener la reacción de 100 µ? 20% v/v de ácido ortofosfórico fue añadido a todos los pozos. El sustrato péptido fue capturado en una almohadilla del filtro P30 de nitrocelulosa positivamente cargada (Whatman) usando un cosechador de placas de 96 pozos (TomTek) y después ensayado para la incorporación de 33P con un contador de placa Beta. Valores de control "blanco" (sin enzima) y "total" (sin compuesto) fueron usados para determinar el intervalo de dilusión del compuesto de prueba que dio 50% de inhibición de la actividad de la enzima (valores IC50). (c) Ensayo de fosforilación del sustrato y el fenotipo de la célula ln Vitro Este ensayo es usado para determinar los efectos celulares de los compuestos en las células tumorales SW620 del colon humano ¡n vitro. Los compuestos normalmente causan inhibición de los niveles de fosfohistona H3 y un incremento en el área nuclear de las células. 104 células SW620 por pozo fueron colocadas en 100 µ? del medio DMEM (que contiene 10 % FCS y 1% glutamina) (DMEM es el Dulbecco's Modified Eagle's Médium (Sigma D6546)) en placas costar de 96 pozos y se durante la noche a 37°C y 5% C02 para adherirse. Las células fueron después dosificadas con el compuesto diluido en el medio (50 µ? es añadido a cada pozo para dar concentraciones del compuesto de 0.00015 µ - 1 µ?) y después de 24 horas de tratamiento con el compuesto, las células fueron fijadas. Las células fueron primero examinadas usando un microscopio de luz y cualquiera de los cambios celulares en morfología fue anotado. 100 µ? de 3.7 %de formaldehído fue después añadido a cada pozo, y la placa se dejó durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Decantar y golpear la placa en una toalla de papel eliminó el fijador y las placas fueron después lavadas una vez en PBS (Salina Amortiguada con Fosfato de Dulbecco (Sigma D8537)) usando un lavador de placas automatizado. 100 µ? de PBS y 0.5 % de tritón X-100 fue añadido y las placas fueron puestas en un agitador durante 5 minutos. Las placas fueron lavadas en 100 µ? de PBS y la solución balanceada. 50 µ? del anticuerpo primario, 1:500 anti-fosfohistona H3 de conejo en PBS 1% BSA (albúmina de suero bovino) y 0.5 % de tween, fue añadido. Anti-fosfohistona H3 de conejo policlonal 06-750 fue comprada de Upstate Biotechnology . Las placas se dejaron 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. Al día siguiente, el anticuerpo fue vertido y las placas fueron lavadas dos veces con PBS. En un área sin luz, 50 µ? del anticuerpo secundario, 1:10,000 Hoechst y 1:200 Alexa Fluor 488 IgGA de cabra anti-conejo (cat no. 11008 sondas moleculares) en PBS 1 % de BSA, 0.5 % de tween fue añadido. Las placas fueron enrolladas en papel de aluminio y agitadas durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo fue vertido y las placas fueron lavadas dos veces con PBS. 200 µ? de PBS fueron añadidos a cada pozo, y las placas fueron agitadas durante 10 minutos, el PBS fue eliminado. 100 µ? de PBS fueron añadidos a cada pozo y las placas fueron selladas rápidamente para el análisis. El análisis fue llevado a cabo usando un algoritmo Arrayscan Target Activation para medir los niveles celulares de fosfohistona H3 y los cambios en el área nuclear. Los resultados fueron reportados como la concentración efectiva requerida para dar 50% de inhibición de los niveles de fosfohistona H3 y de manera similar para un 50% de incremento en el área nuclear de las células (valores EC50). La invención es ilustrada en la presente por medio de Ejemplos no limitativos, datos y Figuras en los cuales, a menos que otra cosa sea declarada: (i) los rendimientos son dados para la ilustración solamente y no son necesariamente el máximo alcanzable; (ii) donde el producto es usado para la siembra puede ser obtenido por procesos conocidos previamente tal como aquellos descritos en WO 2004/058781; (iii) la identidad del co-cristal de maleato AZD1152 preparado como se describió aquí fue confirmada por 1H RMN a 400 MHz en dimetilsulfóxido hexadeuterado con tetrametilsilano (TMS) añadido como referencia (TMS = 0.00 ppm). Como se describió aquí AZD1152 y AZD1152 HQPA son descritos en WO 2004/058781. Los detalles del proceso proporcionado en WO2004/058781 con relación a AZD1152, AZD1152 HQPA y todos los productos intermedios en la ruta á los compuestos son incorporados aquí como referencia en su totalidad. Método de Preparación 1 Etapa 1 - Preparación de 7-(3-hidroxipropoxi)quinazolin-4(3H)-ona Ácido 2-amino-4-fluorobenzoico y 1 ,3-propanodiol fueron agitados juntos y calentados hasta 120°C. Acetato de formamidina fue añadido y la mezcla agitada durante 3.5 horas para producir 7-fluoroquinazolina-4-ona. Una solución de hidróxido de potasio en 1 ,3-propanodiol fue después añadida a la mezcla durante un período de 2 horas y 50 minutos, la cual fue después enfriada a 15°C. A continuación de esto, la mezcla fue calentada hasta 125°C durante 5 horas antes de enfriar hasta 75°C. Ácido clorhídrico diluido (aproximadamente de 6% p/p) fue gradualmente añadido a la mezcla de reacción hasta que el pH 4.5 fue alcanzado. La mezcla fue enfriada hasta 0°C durante 6 horas y mantenida a esa temperatura durante una hora adicional antes del aislamiento del producto crudo por centrifugación. El material crudo fue lavado con agua y secado al vacío antes de disolverse en metanol a reflujo moderado y parcialmente concentrase a presión reducida a una temperatura de 42°C. Esta solución fue después enfriada hasta 0°C durante un período de 3 horas y el producto resultante fue aislado por filtración, antes del secado al vacío. 7-(3-Hidroxipropoxi)quinazolin-4(3H)-ona fue recuperada en un rendimiento de 73%. H RMN (DMSO d6): 11.90 (s amplio, 1H), 8.04 (s, 1H), 8.00 (d, 1H), 7.10 (m, 2H), 4.17 (t, 2H), 3.58 (t, 2H), 1.92 (m, 2H): MS (+ve ESI) : 221 (M + H) + Etapa 2 - Preparación de 4-cloro-7-(3-cloropropoxi)quinazol ¡na 7-(3-Hidroxipropoxi)quinazolin-4(3H)-ona, tolueno y N,N-diisopropil-formamida (DIPF) fueron mezclados juntos y calentados hasta 76°C, antes que el cloruro de tionilo fuera añadido durante un período de 1 hora a 76°C. Cloruro de tionilo adicional fue después añadido durante un período de 1 hora después de lo cual la temperatura fue mantenida a 76°C durante 1 hora. La mezcla fue refluida durante 11 horas para efectuar una solución clara la cual fue enfriada hasta 38°C y sometida a destilación al vacío para eliminar el tolueno y el cloruro de tionil. Tolueno fue después añadido y la solución mantenida a 35°C mientras fue aclarada con la ayuda de un filtro (celita o harborlita y carbón activado). La solución resultante fue parcialmente concentrada antes que el heptano fuera añadido y la mezcla enfriada hasta 0°C y agitada durante 23 horas. La suspensión marrón clara que se formó fue aislada por filtración, lavada con heptano frío y después secada al vacío a 30°C para producir 4-cloro-7-(3-cloropropoxi)quinazolina (63.6%) 1H RMN (DMSO d6): 13.25 (s amplio, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.06 (d, 1H), 7.17 (m, 2H), 4.21 (t, 2H), 3.83 (t, 2H), 2.23 (m, 2H): MS ( + ve ESI): 257, 259 (M + H) + . Etapa 3 - Preparación de ácido (3-(G7-(3-cloro ropoxi)quinazolin-4-iMamino -1H-pirazol-5-il)acético 4-Cloro-7-(3-cloropropoxi)quinazolina fue añadido a 1 equivalente molar de una solución de ácido (3-amino-1 H-pirazol-5-il)acético en N-metilpirrolidinona (NMP) y después se dejó por un período de 12 horas. La cristalización del producto fue observada que ocurrió con y sin siembra y con y sin la adición de acetonitrilo como un antisolvente. El sólido resultante fue aislado por filtración, lavado con N-metilpirrolidinona y acetonitrilo y después secado al vacío para producir ácido (3-{[7-(3-cloropropoxi)quinazolin-4-il]amino}-1 H-pirazol-5-il)acético hidrocloruro como un sólido blanco hueso: 1H RMN (DMSO d6; contiene NMP como un solvato) : 8.92 (s, 1H), 8.8 (d, 1H), 7.46 (pr de d, 1H), 7.38 (d, 1H), 6.7 (s, 1H), 4.32 (t, 2H), 3.85 (t, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.3 (t, 2H), 2.7 (s, 3H), 2.51 (m, 6H), 2.27 (m, 2H), 2.18 (t, 2H), 1.93 (m, 2H). MS ( + ve ESI) : 362.1015 (M + H) + . Etapa 4 - Preparación de 2-(3-( r7-(3-cloropropoxi)quinazolin-4-il1amino)-1 H-pirazol-5-il)-N-(3-fluorofenil)acetamida 4-DimetMaminopiridina (DMAP), N-metilmorfolina y 3-fluoroanilina (en gran exceso) fueron añadidos a una suspensión de ácido (3-{[7-(3-cloropropoxi)quinazolin-4-il]amino}-1 H-pirazol-5-il)acético hidrocloruro en N , N-dimetilacetamida (DMA) y la lechada resultante fue agitada a o por debajo de la temperatura ambiente. Una solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro (EDCI.HCI) previamente disuelta en agua fue después añadida de una manera controlada durante un período de 8 horas de forma para mantener la reacción a temperatura ambiente. La mezcla fue sembrada con una pequeña cantidad del producto y se dejó agitar por varias horas. Acetonitrilo antisolvente seguido por agua fueron también añadidos para precipitar más producto. El material fue aislado por filtración y la torta lavada con una mezcla de N,N-dimetilacetamida agua acetonitrilo, acetonitrilo caliente y después secado (al vacío o bajo una corriente de nitrógeno) para producir 2-(3-{[7-(3-cloropropoxi)quinazolin-4-il]amino}-1 H- p¡razol-5-il)-N-(3-fluorofenil)acetamida. 1H RMN (DMSO d6; contiene DMA residual): 10.4 (s, 1H), 8.9 (s, 1H), 8.8 (d, 1H), 7.59 (pr de m, 1H), 7.46 (pr de d, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.29 (d, 1H), 6.85 (m, 1H), 6.75 (s, 1H), 4.35 (t, 2H), 3.85 (t, 4H), 2.95 (s), 2.83 (s), 2.56 (s), 2.25 (m, 2H), 1.95 (s) : MS (+ve ESI): 455 (M + H) + . Etapa 5 - Preparación de 2-(3-G(7-( 3-retil( 2-hidroxietil)amino1propoxi>-quinazolin-4-il)amino1-1H-pirazol-5- N-(3-fluorofenil)acetamida (AZD1152 HQPA 2-(3-{[7-(3-Cloropropoxi)quinazolin-4-il]amino}-1 H-pirazol-5-il)-N-(3-fluorofenil)acetamida y 2-(etilamino)etanol (12 equivalentes molares) fueron añadidos a N,N-dimetilacetamida bajo una atmósfera inerte (tal como proporcionada por nitrógeno) y la mezcla calentada hasta 90°C con agitación. Después de 12 horas, fue añadida agua de una manera controlada y el lote sembrado con el producto mientras estaba caliente. La mezcla fue enfriada hasta 20°C de una manera cuidadosamente controlada para cristalizar el producto en la forma requerida. El producto fue después filtrado y lavado con una mezcla de agua/ N,N-dimetilacetamida y acetonitrilo. A continuación de esto, la torta fue hecha una lechada durante un período con acetonitrilo caliente (40°C), filtrada, lavada con más acetonitrilo y después secada (al vacío o bajo una corriente de nitrógeno) para proporcionar la 2-{3-[(7-{3-[etil(2-hidroxietil)amino]propoxi}-quinazolin-4-il)amino]-1H-pirazol-5-il}-N-(3-fluorofenil)acetamida anhidra como un sólido blanco hueso en un rendimiento de ~90%. 1 H-RMN (DMSO d6): 10.55 (s, 1H), 9.45 (s amplio, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.8 (d, 1H), 7.63 (pr de m, 1H), 7.47 (pr de d, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.32 (d, 1H), 6.9 (m, 1H), 6.77 (s, 1H), 4.32 (t, 2H), 3.83 (s amplio, 2H), 3.76 (t, 2H), 3.35 (m, 2H), 3.25 (m, 4H), 2.25 (m, 2H), 1.25 (t, 3H): MS (+ve ESI) : 508.4 (M + H) + . Etapa 6 - Preparación de mono(terc-butil) 2-GG3-(( 4-G(5-( 2-G? 3-f luorofenil)amino1-2-oxoetil)-1 H-pirazol-3-il)amino1-quinazolin-7-¡l>ox¡)propill(et¡naminoletil fosfato G???1152 t-Bu P(5)ésterl 2-{3-[(7-{3-[Etil(2-hidroxietil)amino]propoxi}-quinazolin-4-il)amino]-1 H-pirazol-5-il}-N-(3-fluorofenil)acetamida y piridina.hidrocloruro fueron mezclados en ?,?-dimetilacetamida y la solución enfriada hasta -15°C. Dietilfosforamidita de di-terc-butilo (1.5 - 2.1 equivalentes molares) fue después añadido mientras la temperatura fue mantenida. La mezcla de reacción fue tratada in situ con 30% p/p de peróxido de hidrógeno (aproximadamente de 4.2 equivalentes molares) mientras la temperatura fue mantenida por debajo de la temperatura ambiente. El peróxido de hidrógeno remanente fue destruido por la adición de metabisulfito de sodio (como una solución acuosa 10% p/v) mientras se mantiene la temperatura por debajo de 40°C. La solución resultante de di-terc-butil 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino] -2-oxo eti I}- H-pi ra zol-3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)amino]etil fosfato fue después calentada hasta 40°C y la solución de hidróxido de sodio (2M) fue añadida para ajusfar hasta pH 5 - 6.5. La temperatura y el pH fueron mantenidos durante un período de aproximadamente 90 minutos con siembra. Después fue cargada agua y el pH ajustado adicionalmente hasta dentro del intervalo de pH 8 - 9 para optimizar la recuperación. La mezcla de reacción caliente fue filtrada directamente para proporcionar mono-terc-butil 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1 H-pirazol-3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)amino]etil fosfato el cual fue lavado con una mezcla de ?,?-dimetilacetamida/agua y agua y finalmente secado (al vacío o una corriente de un gas inerte adecuado) para proporcionar mono(terc-butil) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofen¡l)amino]-2-oxoetil}-1 H-pirazol-3-il)amino]-quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)amino]etil fosfato como un sólido blanco hueso a un rendimiento de entre 86 - 93%. H-RMN (DMSO d6): 10.48 (s, 1H), 9.75 (s amplio, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.85 (d, 1H), 7.67 (pr de m, 1H), 7.48 (pr de d, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.3 (d, 1H), 6.87 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 4.34 (t, 2H), 4.28 (m, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.53 (m, 2H), 3.43 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.32 (t, 3H): MS ( + ve ESI): (M + H)+ 644.2761 fragmento (menos butil) 588.2147. Etapa 7 - Preparación de 2-(etiir3-((4-r(5-( 2-í(3-fluorofenil)amino1-2-oxoeti H -p ¡razo I -3 -il)am i nol quinazo lin-7-il)oxi)propinamino>etil dihidrógeno fosfato (AZD1152) Mono(terc-butil) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2- oxoetil}-1H-pirazol-3-il)amino]-quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)amino]etil fosfato fue suspendido en una mezcla 1:1 de agua/tetrahidrofurano (THF) y tratada a elevadas temperaturas (preferiblemente 50-60°C) con un exceso de entre 1.5 y 3.0 equivalentes molares de ácido clorhídrico durante un período de aproximadamente 1 hora. La solución caliente fue después basificada usando 2.0M hidróxido de sodio dentro del intervalo de pH 4.5-5.5, enfriada hasta 60°C y sembrada. Fue añadida agua a la lechada de una manera controlada con enfriamiento controlado de la mezcla de cristalización hasta temperatura ambiente y el producto fue aislado por filtración. La torta del filtro fue lavada con agua y secada al vacío. Después de secarse, el sólido 2-{etil[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amin o]-2-oxoetil}-1 H-pirazol-3-il)amino]quinazorin-7-il}oxi)propil]amino}etil dihidrógeno fosfato fue equilibrado bajo condiciones ambiente hasta el peso constante para dar una forma hidratada como un material en forma de aguja amarillo pálido. 1 H-RM N (DMSO d6): MS ( + ve ESI): 587.8 (M + H) + 1 H-RMN (DMSO d6) : 10.53 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.54 (d, 1H), 7.62 (d, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.21 (d, 1H), 6.88 (m, 1H), 6.65 (s, 1H), 4.27 (t, 2H), 4.05 (m, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.24 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 3.13 (q, 2H), 2.18 (m, 2H), 1.24 (t, 3H) : MS ( + ve ESI): 588 (M + H) + . C26H3iFN706P + 3.0 H20 requiere C, 48.7%; H, 5.8%; N, 15.3%; Encontrado C, 48.8%; H, 5.35%; N, 15.15%. Etapa 8 - Preparación de 2-(ß??G3-((4-G( 5-(2-G(3-fluorofenil)amino1-2-oxoetil)-1 H-pirazol-3-il)amino1quinazolin- 7-il)oxi)propiHamino)etil dihidrógeno fosfato.maleato G???1152 maleatol Acido 2-butenodioico (Z) (1.57 equivalentes molares; 449.80 pmoles; 52.21 mg) fue disuelto en metanol (123.54 moles; 5.00 mi; 3.96 g) y a esta solución fue añadida una solución metanólica de AZD1152 previamente preparada (como el trihidrato en forma libre - 1.00 equivalentes molares, 286.14 pmoles; 40.00 ml_; 31.87 g) seguido por más metanol (123.54 moles; 5.00 ml_; 3.96 g). La mezcla se dejó agitar toda la noche a temperatura ambiente. Una suspensión blanca fue producida y el sólido recuperado por filtración después secado al vacío. El análisis por RMN confirmó que el co-cristal era el maleato. Etapa Alternativa 8: AZD1152 crudo (estimado a 7.44g @ 100%, 11.61 milimoles) fue añadido a dimetilsulfóxido (36ml) y dejado al ambiente para producir una solución marrón pálido. A esta solución fue añadida una solución de ácido maléico (1.76g, 15.16 milimoles, 1.31 equivalentes molares) en metanol (36ml) y la mezcla se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente una alícuota de la solución clara fue transferida a un frasco, rayado y se dejó sellado por varias horas. Un depósito de sólido blanco se formó y esto fue transferido al frasco y se agitó.

Gradualmente la solución se tornó turbia y el sólido fue depositado. La suspensión se dejó asentar por varios días y finalmente fue filtrada. La torta fue lavada con una mezcla 1:1 de dimetilsulfóxido/metanol (15ml en total), hecha una suspensión in situ con metanol (3 x 25ml) y después secada al vacío. La RMN confirmó que el sólido era el co-crital de maleato de AZD1152 (con un rendimiento de aproximadamente de 78.7%). Método de Preparación 2 Etapa 1 - Preparación de 2-(3-f r7-(3-cloropropoxi)qu¡nazolin-4-iHamino)-1 H-pirazol-5-il)-N-(3-f luorofeniQacetamida A una suspensión de ácido (3-{[7-(3-cloropropoxi)quinazolin-4-il]amino}-1H-pirazol-5-il)acético.hidrocloruro (preparada como es descrito en el Método de Preparación 1 anterior) en N,N-dimetilacetamida (DMA) es añadida 4-dimetilaminopiridina (DMAP) mientras se mantiene a temperatura de 15 - 25°C (idealmente 15°C) seguido por N-metilmorfolina mientras también se mantiene la temperatura. 3-Fluoroanilina (en un gran exceso el cual idealmente está entre 10 - 15 equivalentes molares) es añadida a una velocidad tal de manera que se mantenga la temperatura por debajo de 25°C. Mientras tanto 1-et¡l-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro (EDCI.HCI) es disuelto en agua para proporcionar una solución de aproximadamente 42% p/v (la cantidad de agua presente es importante para el resultado de la cristalización posteriormente en el proceso). Esta solución es añadida de una manera controlada a la lechada durante un período de 8 horas de manera que se mantenga la reacción entre 20 - 25°C; después la mezcla es sembrada con cristales de la forma preferida del producto (idealmente una cantidad de aproximadamente de 1% del rendimiento esperado). La mezcla es agitada durante aproximadamente 16 horas mientras se mantiene la temperatura (idealmente 20 - 25°C) después acetonitrilo antisolvente seguido por agua son añadidos en una manera controlada y para mantener la temperatura entre 20 - 25°C seguido por una agitación extendida de aproximadamente 21 horas; esto es para optimizar la recuperación y formar el producto. El material es aislado por filtración y la torta lavada con una mezcla de N,N-dimetilacetamida :agua: acetonitrilo (relaciones en volumen de 5:3 : 2), acetonitrilo y después secado (al vacío o bajo una corriente de nitrógeno) para proporcionar 2-(3-{[7-(3-cloropropoxi)quinazolin-4-il]amino}-1H-pírazol-5-il)-N-(3-fluorofenil)acetamida que contiene algo de DMA con rendimiento de aproximadamente de 76 - 78% . H RMN (DMSO d6; contiene DMA residual): 10.4 (s, 1H), 8.9 (s, 1H), 8.8 (d, 1H), 7.59 (pr de m, 1H), 7.46 (pr de d, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.29 (d, 1H), 6.85 (m, 1 H), 6.75 (s, 1H), 4.35 (t, 2H), 3.85 (t, 4H), 2.95 (s), 2.83 (s), 2.56 (s), 2.25 (m, 2H), 1.95 (s) : MS (+ve ESI): 455 (M + H) + . Etapa 2 - (Preparación de 2-(3-G(7-{ 3-Teti 1(2-hidroxietil)amino1propoxi)-quinazolin-4-il)amino1-1 H-pirazol-5- \\\- N-O-fluorofenihacetamida (AZD1152 HQPA) 2-(3-{[7-(3-Cloropropoxi)quinazolin-4-il]amino}-1H-pirazol-5-il)-N-(3-fluorofenil)acetamida y 2-(et¡lamino)etanol (idealmente 12 equivalentes molares) fueron añadidos a N, N-dimetilacetamida bajo una atmósfera inerte (tal como proporcionado por nitrógeno) y la mezcla calentada hasta 90°C con agitación. Después de un período de 12 - 16 horas (idealmente 12 horas) la reacción es enfriada de nuevo hasta aproximadamente de 85°C y es añadida agua de una manera controlada para mantener la temperatura entre 80 - 85°C. El lote es ajustado hasta 80°C y sembrado con cristales de la forma preferida del producto (idealmente una cantidad de aproximadamente 1% del rendimiento esperado). La mezcla fue enfriada hasta 20°C de una manera cuidadosamente controlada durante un período de aproximadamente 20 horas para cristalizar el producto en la forma requerida y de un tamaño suficiente para proporcionar una buena velocidad de filtración. El producto es después filtrado y lavado con una mezcla de agua / N, N-dimetilacetamida y acetonitrilo y extraído el licor adecuadamente para proporcionar una forma hidratada del producto. A continuación de esto, la torta es hecha una lechada in situ durante un período (idealmente 2 horas) con acetonitrilo caliente (idealmente a una temperatura de 40oC) después filtrada, lavada con más acetonitrilo y después secada (al vacío o bajo una corriente de nitrógeno) para proporcionar la 2-{3-[(7-{3-[etil(2-hidroxietil)amino]propoxi}-quinazolin-4-il)amino]-1H- pirazol-5-il}- N-(3-fluorofenil)acetamida casi anhidra como un sólido blanco hueso con un rendimiento de 85 - 90%. 1H-RMN (DMSO d6): 10.55 (s, 1H), 9.45 (s amplio, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.8 (d, 1H), 7!63 (pr de m, 1H), 7.47 (pr de d, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.32 (d, 1H), 6.9 (m, 1H), 6.77 (s, 1H), 4.32 (t, 2H), 3.83 (s amplio, 2H), 3.76 (t, 2H), 3.35 (m, 2H), 3.25 (m, 4H), 2.25 (m, 2H), 1.25 (t, 3H): MS (+ve ESI): 508.4 (M + H) + . Etapa 3 - Preparación de mono(terc-butil) 2-GG3-({4-G(5-(2-G(3-f luorofenil)amino1-2-oxoeti H-pirazol -3 -ihaminol -quinazo lin-7-il oxi)prop¡ll(etil)aminoletil fosfato G???1152 t-Bu P(5)ésterl A una suspensión de piridina.hidrocloruro en N,N-dimetilacetamida fue cargada una solución de 2-{3-[(7-{3-[Etil(2-hidroxietil)amino]propoxi}-quinazolin-4-il)amino]-1H-pirazol-5-il}-N-(3-fluorofenii)acetamida y di-terc-butil dietilfosforamidita (idealmente 1 equivalente molar) en ?,?-dimetilacetamida durante un período extendido (idealmente 3 horas) y se mantiene la temperatura entre -20 a -10°C (idealmente -15°C). Esto es seguido por la adición posterior de di-terc-butil dietilfosforamidita (idealmente 0.5 equivalentes molares) durante un período de 1 hora también para mantener la temperatura entre -20 a -10°C (idealmente -15°C). La mezcla de reacción es tratada in situ con 30% p/p de peróxido de hidrógeno (aproximadamente de 4.2 equivalentes molares) mientras la temperatura fue mantenida por debajo de - 10°C (idealmente -12 a -8°C) y mantenida durante un período a esta temperatura (idealmente 16 horas). El peróxido de hidrógeno remanente es destruido por la adición de metabisulfito de sodio (como una solución acuosa 10% p/v) mientras se mantiene la temperatura por debajo de 40°C. La solución resultante de di-terc-butil 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1 H-pirazol-3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)amino]etil fosfato fue después calentada hasta 40°C y la solución de hidróxido de sodio (idealmente 2M) fue añadida para ajustar hasta pH 5.5 - 6.5 (idealmente pH 6) con siembra con material adecuadamente cristalino. La temperatura es mantenida y un intervalo de pH 5-6 es mantenido por la adición de una solución de hidróxido de sodio extra durante un período de al menos 2 horas. Después es cargada agua y el pH ajustado adicionalmente hasta dentro del intervalo de pH 8 - 9 (idealmente pH 8.8) mientras se mantiene la temperatura (idealmente 40°C pero dentro del intervalo de 35 - 45°C) durante un período de 16 horas para optimizar la recuperación. La mezcla de reacción caliente es filtrada directamente para proporcionar mono-terc-butil 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1H-pirazol-3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)am¡no]etil fosfato el cual fue lavado varias veces con agua y finalmente secado (ya sea al vacío o una corriente de un gas inerte adecuado) para proporcionar el mono(terc-butil) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1 H-pirazol-3-il)amino]-quinazolin-7- ¡l}oxi)prop¡l](etil)amino]et¡l fosfato como un sólido blanco hueso a un rendimiento de entre 86 - 93%. 1 H-RMN (DMSO d6): 10.48 (s, 1H), 9.75 (s amplio, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.85 (d, 1H), 7.67 (pr de m, 1H), 7.48 (pr de d, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.3 (d, 1H), 6.87 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 4.34 (t, 2H), 4.28 (m, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.53 (m, 2H), 3.43 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.32 (t, 3H): MS ( + ve ESI): (M + H)+ 644.2761 fragmento (menos butilo) 588.2147. Etapa 4 - Preparación de 2-(T???G3-({4-G(5-(2-G(3-f luorof enil)amino1-2-oxoetil>-1 H-pirazol-3-il)aminoTquinazolin-7-il)oxi)propiHamino)etM dihidrógeno fosfato (AZD1152) Mono(terc-butil) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1H-pirazol-3-il)amino]-quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)amino]etil fosfato fue suspendido en una mezcla de agua/tetrahidrofurano (THF) y tratado con un exceso de entre 1.5 y 3.0 equivalentes molares de ácido clorhídrico (idealmente de una concentración de 2M y conteniendo 1.5 equivalentes molares). La mezcla es calentada hasta 55 - 65°C (idealmente 60°C) y mantenida a 60°C durante aproximadamente de 1 hora. La solución caliente es después basificada usando hidróxido de sodio (preferiblemente de 2M de concentración y conteniendo de 1.7 equivalentes molares) para proporcionar un pH dentro del intervalo de pH 5.0 - 5.5 y después sembrada a 55 - 65°C (idealmente 60°C) con cristales de la forma preferida del producto (idealmente una cantidad de aproximadamente de 0.05% p/p del rendimiento esperado). La mezcla es agitada a esta temperatura durante al menos una hora antes que el agua sea añadida y la lechada agitada y enfriada de una manera controlada durante un período de aproximadamente de 12 horas antes de agitar a temperatura ambiente durante al menos 4 horas y después aislar el producto por filtración. La torta del filtro es lavada sucesivamente con agua después THF y secada ya sea al vacío o usando un procedimiento de humidificación mediante el cual un gas inerte humedecido con vapor de agua es pasado sobre el sólido hasta que un peso constante es obtenido. Después del secado al vacío el sólido 2-{etil[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1H-pirazol-3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil]amino}etil dihidrógeno fosfato es equilibrado bajo condiciones ambiente hasta el peso constante para dar una forma hidratada como un material en forma de aguja amarillo pálido. El producto es obtenido con un rendimiento de aproximadamente de 81%. 1H-RMN (DMSO d6) MS (+ve ESI): 587.8 (M + H)+ H-RMN (DMSO d6) : 10.53 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.54 (d, 1H), 7.62 (d, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.21 (d, 1H), 6.88 (m, 1H), 6.65 (s, 1H), 4.27 (t, 2H), 4.05 (m, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.24 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 3.13 (q, 2H), 2.18 (m, 2H), 1.24 (t, 3H) : MS (+ve ESI): 588 (M + H) + .

CaeHaiF.NyOeP + 3.0 H20 requiere C, 48.7%; H, 5.8%; N, 15.3%; Encontrado C, 48.8%; H, 5.35%; N, 15.15%. Etapa 5 - Preparación de 2-( eti I G3-((4-G(5-(2-G( 3-fluorofenil)amino1-2-oxoetil>-1 H-pirazol-3-il)amino1quinazolin- 7-il)oxi)propinamino)etil dihidrógeno fosfato. maleato G???1152 maleatol Ácido 2-Butenodioico (Z) (1.57 equivalentes molares; 449.80 µ?-noles; 52.21 mg) fue disuelto en metanol (123.54 moles; 5.00 mi; 3.96 g) y a esta solución fue añadida una solución metanólica previamente preparada de AZD1152 (como el trihidrato en forma libre - 1.00 equivalentes molares, 286.14 pmoles; 40.00 ml_; 31.87 g) seguido por más metanol (123.54 moles; 5.00 ml_; 3.96 g). La mezcla se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Una suspensión blanca fue producida y el sólido recuperado por filtración y después secado al vacío. El análisis por RMN confirmó que el co-cristal era el maleato de AZD1152. Alternativa a la Etapa 5 anterior: AZD1152 crudo (estimado a 7.44g @ 100%, 11.61 milimoles) fue añadido a dimetiisulfóxido (36ml) y dejado al ambiente para producir una solución marrón pálido. A esta solución fue añadida una solución de ácido maléico (1.76g, 15.16 milimoles, 1.31 equivalentes molares) en metanol (36ml) y la mezcla se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente una alícuota de la solución clara fue transferida a un frasco, rayado y se dejó sellado por varias horas. Un depósito de sólido blanco se formó y esto fue transferido al frasco y se agitó. Gradualmente la solución se tornó turbia y el sólido fue depositado. La lechada se dejó asentar por varios días y finalmente se filtró. La torta fue lavada con una mezcla 1:1 de dimetilsulfóxido/metanol (15ml en total), hecha una suspensión in situ con metanol (3 x 25ml) y después secada al vacío. El análisis por RMN confirmó que el co-cristal fue maleato de AZD1152 (con un rendimiento de aproximadamente de 78.7%). Alternativa adicional al Paso 5 anterior: AZD1152 (como el trihidrato en forma libre - 1.00 equivalente molar, 8.51 moles; 5.74 g) y ácido 2-butenodioico (Z) (1.20 equivalentes molares; 10.2 mmoles; 1.19 g) son disueltos en dimetilsulfóxido (35 mi) y calentados hasta 60°C. El acetonitrilo antisolvente (20 mi) fue añadido a la mezcla caliente después la mezcla es sembrada con cristales de la forma preferida del producto AZD1152 Maleato (0.005 equivalentes molares; 42.6 micromoles; 30.7 mg - idealmente una cantidad de aproximadamente 0.5% p/p del rendimiento esperado). La mezcla de reacción es mantenida a 60°C durante 4 horas antes que una carga adicional de acetonitrilo (40 mi) sea añadida durante un período de 3 horas. La mezcla se deja agitando a 60°C durante 12 - 20 horas (idealmente 16 horas). La reacción es enfriada hasta 20°C de una manera controlada y el producto es aislado por filtración. La torta es lavada con una mezcla de dimetilsulfóxido/acetonitrilo (relación en volumen 1:2) seguido por acetonitrilo. El sólido es secado al vacío o bajo una corriente de gas inerte caliente (idealmente 40"C) para proporcionar el AZD1152 Maleato como un sólido blanco con un rendimiento aproximadamente de 88%. Breve Descripción de los Dibujos Figura 1: Patrón de difracción de rayos-X en polvo para el co-cristal de maleato de AZD1152 (preparado por el Método 1 anterior) - con los valores 2T trazados en el eje horizontal y la intensidad lineal relativa (conteo) trazada en el eje vertical. Figura 2: Un Termograma de Calorimetría Diferencial de Barrido para el co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con el Método 1 anterior. Figura 3: Un Termograma de Calorimetría Diferencial de Barrido para el co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con el Método 2 anterior. Figura 4: Trazo de la Isoterma de Sorción de Vapor Dinámico para un lote del co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con el Método 1 anterior. Figura 5: Trazo de la Isoterma de Sorción de Vapor Dinámico para un lote del co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con el Método 2 anterior. Figura 6: Trazo de la Isoterma de Sorción de Vapor Dinámico para la forma libre de AZD1152. Figura 7: Patrón de difracción de rayos-X en polvo para el co-cristal de maleato de AZD1152 (preparado por el Método 2 anterior) - con los valores 2? trazados en el eje horizontal y la intensidad lineal relativa (cuenta) trazada en el eje vertical. Datos de Caracterización Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear La estructura y la relación aproximada de componentes en el co-cristal pueden ser confirmadas con la espectroscopia RMN del protón. Los datos típicos son mostrados a continuación.

Desviación química/ppm Desviación química/ppm Átomo 1H Átomo 1H 1 NR 27 NR 2 7.63 (m) 28 4.32(2Ht, 5.8) 3 NR 29 2.25 (m) 4 6.89 (m) 30 3.37 (m) 5 7.33 (m) 31 NR 6 7.37 (m) 32 3.48 (m) 7 NR 33 4.22 (m) 8 9.76* (s, amplio) 34 3.30 (2H q, 7. 9 NR 35 1.28 (3H t, 7.1) 10 NR 36 NR 11 6.77 (s) 37 NR 12 NR 38 NR 13 3.85 (s) 39 NR 14 NR 40 NR 15 10.51 (s) 41 NR 16 11.99* (s, amplio) 42 14.0 (s, amplio) 17 7.48 (dd, 9.1 , 2.4) 43 14.0 (s, amplio) 18 NR 44 6.28 (s) 19 7.29 (d, 2.4) 45 6.28 (s) 20 8.81(d, 9.3) 46 NR 21 NR 47 NR 22 NR 48 14.0 (s, amplio) 23 NR 49 NR 24 8.98 (s) 50 NR 25 NR 51 14.0 (s, amplio) 26 NR NR = No Resonancia La integración RMN se ajusta aproximadamente con una relaciona 1: 1.04 de ácido maléico a AZD1152. Calorimetría de Escaneado Diferencial El análisis por Calorimetría de Escaneado Diferencial (DSC) fue conducido en el co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con los Métodos de Preparación 1 y 2 usando un Mettler DSC820e. Muestras de normalmente menos de 5 mg de material contenidas en una cacerola de 40 µ? aluminio ajustada con una tapa perforada fueron calentadas por encima del intervalo de temperatura 25°C a 325°C a una tasa de calentamiento constante de 10°C por minuto. Un gas de purga usando nitrógeno fue usado - tasa de flujo 100 mi por minuto. Los resultados para un lote del co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con el Método 1 anterior (ver figura 2) indica que el co-cristal de maleato muestra una endoterma puntiaguda, grande con una temperatura de inicio de 180°C debido a la fusión. A continuación de la fusión un gran evento endotérmico es observado debido a la degradación del ácido maléico seguido de la fusión. Se entenderá que los valores de temperatura pico y/o de inicio de la DSC pueden variar ligeramente desde una máquina a otra, un método a otro o de una muestra a otra, y por lo tanto los valores cotizados no son interpretados como absolutos. Los resultados para el co-cristal de maleato de AZD1152 preparado por el Método 2 anterior (ver figura 3) indican que el co-cristal de maleato muestra una endoterma puntiaguda, grande con una temperatura de inicio de 183°C debido a la fusión. A continuación de la fusión un gran evento endotérmico es observado debido a la degradación del ácido maléico seguido de la fusión. Se entenderá que los valores de temperatura pico y/o de inicio de la DSC pueden variar ligeramente desde una máquina a otra, un método a otro o de una muestra a otra, y por lo tanto los valores cotizados no son interpretados como absolutos. Sorción de Vapor Dinámico Instrumento Analítico: Analizador de Sorción de Vapor Dinámico de Sistemas de Mediciones de Superficie. Aproximadamente de 5 mg de material contenido en un sujetador de cuarzo a una temperatura especificada fue sometido a nitrógeno humidificado a una tasa de flujo de 200 ml/minuto de nitrógeno a 25°C a las siguientes humedades relativas (HR): 0, 20, 40, 60, 80, 95, 80, 60, 40, 20, 0% HR en duplicado. El peso del material a una humedad relativa particular fue monitoreado hasta que fue estable de acuerdo con un criterio de peso de 0.002% de cambio de peso por minuto promediado en 10 minutos. Si el peso siguió cambiando entonces este se quedó a una humedad relativa particular hasta que el peso fue estable (hasta un tiempo máximo de 12 horas). Los resultados para un lote del co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con el Método 1 son mostrados en la Figura 4. Los resultados para un lote del co-cristal de maleato de AZD1152 preparado de acuerdo con el Método anterior 2 son mostrados en la Figura 5. Los resultados de la Sorción de Vapor Dinámico mostrados en las Figuras 4 y 5 indican que la muestra no es higroscópica y la ganancia de peso es atribuida a la adsorción superficial. La pérdida de peso observada en la Figura 5 durante el Ciclo 1 es atribuida a una pequeña cantidad de solvente presente en la muestra de fabricación. Esto se confirmó por el peso reducido a 0%HR. Una vez que este solvente se ha evaporado el material mantiene su peso a 0%HR. Esta observación será completamente entendida por el experto en la técnica. La Sorción de Vapor Dinámico de la forma libre de AZD1152 es mostrada en la Figura 6. La Sorción de Vapor Dinámico de la forma libre de AZD1152 indica que el nivel de agua es casi variable dependiendo de la humedad relativa de almacenamiento. Este cambio en el nivel de agua se debe a los diferentes estados de hidratación que pueden oscilar desde un estado deshidratado a un estado tetrahidratado y superior. Difracción de Rayos X en Polvo Se declaró anteriormente que el patrón de difracción de rayos-X en polvo para el co-cristal de maieato de AZD1152 es mostrado en la Figura 1. Un método de fabricación adicional para el maieato de AZD1152 ha sido presentado en el método 2 anterior. El patrón de difracción de rayos-X en polvo para el co-cristal de maieato de AZD1152 producido por el Método 2 es mostrado en la Figura 7. Los picos son mostrados en la tabla 2 a continuación. Tabla 2 Ángulo (2-teta) Intensidad Ángulo(2-teta) Intensidad relativa (%) relativa (%) 5.13 80.3 22.45 13.5 6.45 57.9 23.22 21.8 8.14 40.5 23.58 33.8 10.18 9.1 23.98 20.8 11.96 7.8 24.30 14.8 12.85 58.4 24.65 16.1 13.85 14.3 25.56 27.8 14.96 12.5 25.83 52.5 15.27 25.7 26.37 35.6 15.75 13 27.98 38.4 16.53 19.7 28.44 34.3 17.29 23.6 28.91 16.9 19.31 100 29.72 29.6 19.78 55.1 30.34 13 20.10 99.5 32.72 14.5 20.60 40.5 36.21 22.3 21.01 20.5 38.18 11.9 21.68 82.3 Como se declaró anteriormente, es conocido en la técnica que el patrón de difracción de rayos-X en polvo puede ser obtenido el cual tiene uno o más errores de medición dependiendo de las condiciones de medición (tal como el equipamiento, preparación de la muestra o máquina usada). En particular, es generalmente conocido que las intensidades en el patrón de difracción de rayos-X en polvo pueden fluctuar dependiendo de las condiciones de medición y la preparación de la muestra. Por ejemplo, los expertos en la técnica de difracción de rayos-X en polvo se percatarán de que la intensidad relativa de los picos puede ser afectada por, por ejemplo, granos por encima de 30 micrones de tamaño y relaciones de aspecto no unitarios, los cuales pueden afectar el análisis de las muestras. El experto también se percatará de que la posición de las reflexiones puede ser afectada por la altura precisa a la cual la muestra se sitúa en el difractómetro y la calibración cero del difractómetro. La planidad de la superficie de la muestra también puede tener un pequeño efecto. Por lo tanto el experto en la técnica apreciará que la información del patrón de difracción presentada en la presente no es interpretada como absoluta (para más información ver Jenkins, R & Snyder, R.L. 'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons, 1996). Es también declarado anteriormente que, en general, un error de medición de un ángulo de difracción en un difractograma de rayos-X en polvo es aproximadamente de 2-teta = 0.5D o menos (o, más adecuadamente, aproximadamente de 2-teta = 0.2D o menos) y tal grado de de un error de medición debe ser tomado en cuenta cuando se considera el patrón de difracción de rayos-X en polvo en la Figura 1, y cuando se interpretan las posiciones de los picos con referencia al texto anterior y en la Tabla 1.

Con esto en mente, un experto en la técnica apreciará que la información presentada en la Figura 7 y la Tabla 2 anterior indican que el co-cristal de maleato de AZD1152 producido por el Método 2 es la misma forma cristalina que el co-cristal de maleato de AZD1152 producido por el Método 1 (y mostrados en las Figura 1 y Tablal ).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Co-cristal de maleato de AZD1152, donde AZD1152 es

2. Forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152 de conformidad con la reivindicación 1.

3. Forma cristalina del co-cristal de maleato de AZD1152 de conformidad con la reivindicación 2, donde el co-cristal tiene un patrón de difracción de rayos-X en polvo con picos específicos a aproximadamente de 2-teta = 12.9° y 15.2° y/o 10.2°

4. Método para preparar un co-cristal de maleato de AZD1152 como se define en la reivindicación 1, que comprende la etapa de mezclar una solución de la forma libre de AZD1152 con ácido maléico en un solvente adecuado tal como metanol, dimetilsulfóxido (DMSO) o una mezcla de los mismos.

5. Composición farmacéutica que comprende un co-cristal de maleato de AZD1152, de conformidad con la reivindicación 1, en asociación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

6. Co-cristal de maleato de AZD1152 de conformidad con la reivindicación 1, para uso en terapia.

7. Uso de un co-cristal de maleato de AZD1152 de conformidad con la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad donde la inhibición de una o más aurora cinasa(s) es beneficioso. 5.

8. Uso de un co-cristal de maleato de AZD1152 de conformidad con la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tal como el cáncer.