TW200811105A - Dialkylphenyl compounds having beta2 adrenergic receptor agonist and muscarinic receptor antagonist activity - Google Patents

Description

200811105 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於新穎二烷基苯基化合物，其具有A腎上腺 素能激動劑與毒蕈驗受體拮抗劑活性。本發明亦關於包含 此種化合物之醫藥組合物，製備此種化合物之方法與中間 物，及使用此種化合物以治療例如肺病之方法。 【先前技術】 肺病，譬如氣喘與慢性阻塞肺病（COPD)，一般係以枝氣 管擴張藥治療。用以治療肺病之枝氣管擴張藥之一種類型， 係包括A腎上腺素能受體（腎上腺素受體）激動劑，譬如舒 喘寧（albuterol)、弗莫特醇（formoterol)及沙美特醇（salmeterol)。 此等化合物一般係藉吸入投藥。枝氣管擴張藥之另一種類 係包括毒蕈鹼受體拮抗劑（抗膽鹼能化合物），譬如依普拉 搓品（ipratropium)與提歐多平（tiotropium)。此等化合物典型上 亦藉吸入投藥。 含有庆腎上腺素能受體激動劑與毒蕈鹼受體拮抗劑之組 合之醫藥組合物，係為此項技藝中已知，用於治療肺病。 例如，2002年8月13日頒予之美國專利6,433,027，揭示藥劑 組合物，其含有毒蕈鹼受體拮抗劑，譬如溴化提歐多平 (tiotropium bromide)，與/¾腎上腺素能受體激動劑，譬如弗莫 特醇（formoterol)反丁稀二酸鹽。 此外，具有/¾腎上腺素能受體激動劑與毒蕈鹼受體拮抗 劑活性兩者之化合物係為此項技藝中已知。例如，2006年 11月28曰頒予之美國專利7，141，671，揭示具有/¾腎上腺素能 120149 200811105 受體激動劑应喜蒈,Λ 毋早叉體拮抗劑活性兩者之聯苯基化合 同h具有/¾腎上腺素能受體激動劑與毒蕈鹼受體拮抗 劑活性之化合你栘&古— 物^為呵度期望的，因為此種化合物係經過 兩種獨立作用握六担# u _ 衩式棱供枝氣管擴大，而同時具有單_分子 藥物動力學。 當治療肺病時，盆#彳士 ^ /、係特別可用以提供治療劑，當藉吸入 投藥時，其具有長作立 J ’思、即至少約24小時之延續時間，

因此病患僅需要投予、、A _ 杈予〜療劑一天一次或較少。並非所有 珂於此項技蓺中娇姐- ^ ^ π中所揭不之雙作用化合物均具有此期望性 貝 0 因此:仍需要具有組腺素能受體激動劑與毒 :=τ兩者之新穎化合物，當藉吸入投予病患時， 其具有長作用期。 τ 【發明内容】

本發明係提供星右ρ α , A 體#士 γ t /、 2月I素旎受體激動劑與毒蕈鹼受 to心k劑活性兩去立 人 中，”… 穎二烧基苯基化合物。在其他性質

L: 予哺乳動物時，已發現本發明之化H 有長作用期，意即至少的2…士 、月之化口 4勿具 ,_ 、、4小卞之延續時間。因此，預湘 本發明化合物係有用曰亡& l u此預期

因此，士有利地作為治療肺病之治療劑。 因此，在本發明組合 縻J 初之方面，係關於式！化合物： 120149 200811105

其中 R1為甲基或乙基；R2為甲基或乙基；或其藥學上可接受 之鹽或溶劑合物或立體異構物。 於本發明之特定方面’式；[化合物係為具有式π之化合 物：

>與R2均如本文定義（包括任何特戈 細例），或其藥學上可接受之鹽或溶劑合物 在本絡BJ3 一人一 I η . ------ % /分翔兮物。 在本發明組合物之另一方面，係關於 其包含荜風μ叮拉☆ 也 商藥組合物 枭子上可接受之載劑與式1化合物。 右需要，則本發明化合物可與其他治療 如類固醇、、占火W 门， ^ 5併投藥， _肩火剑。因此，在本發明組合 關於一藉較益 人 另—方面… 種西+組合物，其包含⑻式j化合 治療南f。μ丄。 贫7，與（b)第二； ^ 於本發明組合物之又另一方面 乃万面’係關於—種醫_ 120149 200811105 組合物，其包含⑷式1化合物；(b)第二種治療劑及⑹藥 學上可接受之載劑。 /' 於本發明組合物之又再另一方面，係關於治療劑之組合， 此組合包含⑻式][化合物· μ 、 ’ A ()弟一種治療劑。在本發明 組合物之另一方面，伤M 一 4關於％樂組合物之組合，此組人 含⑻第一種醫藥組合物，1 4 物其包含式I化合物與第一種藥學 可接受之載劑；與（b)第二 ’、 種酉名、、且6物，其包含第二種治 療劑與第二種藥學上可接 又載劑。本發明亦關於含有此 種醫藥組合物之套件。 本發明化合物同時1古 主一 “有怂月上腺素能受體激動劑活性盥 毋覃驗受體拮抗劑活性。 八 劑使用，以治療肺病，辟、… &物可作為治療 “胛扃言如氣喘與慢性阻塞肺病。 方：此’在本發明方法之-方面，係關於-種治療肺病之 ;，：方法包括對需要治療之病患投予治療上有效量之 1 °物。本發明亦關於治療慢性阻塞肺病或氣喘之方 :/此方法包括對病患投予治療上有效量之式!化合物。此 外，在本發明方法 去之另-方面’係關於-種在哺乳動物中 座生枝氣吕擴大作用 ★ 方法，此方法包括對哺乳動物投予 技乳官擴大作用產吐旦 > 斗、τ儿人， 哺乳動你由从上 里之式化δ物。本發明亦關於一種在 、^抗毒蕈鹼受體且催動Α腎上腺素能受體之方 此方法包括對該哺乳動物投予式I化合物。 性：：Γ!!化合物同時具有爲腎上腺素能受體激動劑活 ”毋早驗叉體拮抗劑活性，此種化合物亦可作為研究 ’、使用。因此’在本發明方法之又另一方面，係闕於一 120J49 200811105 種使用式ί化合物作為研穿 t .. m ,, ~ W九工具之方法，此方法包括使用式 I化合物進行生物學檢測。 本發明化合物亦可用以評估新I員化學化合物。因此，於 本發明方法之另-方面，係關於-種在生物學檢測中評估 待測化合物之方法，此方法包括：⑻以待測化合物進行生 物學檢測，以提供第一個檢測值；⑼以式〗化合物進行生物 學k測，以提供第二個檢測值；其中步驟⑻係無論是在步 私（b)之刖、之後或同時進行；及（c)將得自步驟⑻之第一個 檢測值與得自步驟（b)之第二個檢測值作比較。 本舍明亦關於可用於製備式I化合物之方法與新穎中間 物。因此，於本發明方法之另一方面，係關於一種製備式^ 化合物之方法，此方法包括使式i化合物（如本文定義）去除 保遵’以提供式I化合物。 於本發明方法之另一方面，係關於一種製備式I化合物之 方法’此方法包括：⑷使式生化合物與式i化合物，於還原 劑存在下反應，以提供式么化合物；與（b)使式色化合物去除 保護’以提供式I化合物；其中£、i及L化合物均如本文定 義。 在本發明之一項特定具體實施例中，式I化合物係經由使 式么化合物去除保護而製成’其中羥基保護基為石夕垸基。因 此，在本發明方法之又另一方面，係關於一種製備式J化合 物之方法，此方法包括使式化化合物去除保護： 120149 -10- 200811105

其中Ra、Rb及RC係獨立選自Ci-4烷基、苯基、-Ci_4烷基-(苯 基），或R1 a、R1 b及R1 c之一為-〇-(C卜4烷基）；以提供式I化合 物。 在其他具體實施例中，本文中所述之方法進一步包括形 成式I化合物之藥學上可接受鹽之步驟。在其他具體實施例 中’本發明係關於本文中所述之其他方法；及藉任何本文 中所述方法所製成之產物。 在一項特定具體實施例中，本發明係關於式ΠΙ化合物： R2

或其鹽或立體異構物，其中γΐ係選自—CH〇、、-CH2〇H、 -CH(OR3a)〇R3b、-C(〇)〇H、_c(〇)〇r3c、溴基及碘基，其中R3a 與R3b係獨立選自Cl_6烷基，或&33與11313係接合而形成C2 6 次烷基，R3c係選自Ci-6烷基；且R1與圮均如本文定義（包括 任何特定或較佳具體實施例），該化合物可在製備式ί化合 物上作為中間物使用。在式m之一項特定具體實施例中， 120149 200811105 R1與R2為甲基。在式ΙΠ之另一頊特 — 、力 ^貝符疋具體實施例中，γι為 -CHO。在式III之又另一項特定具體實施例中，r、r2為甲 基，且Y1為-CHO。 本發明亦關於式I化合物於療法上之用途。此外，本發明 係關於式I化合物於藥劑製造上之用S，該藥劑係用於治療 肺病；及式I化合物作為研究工具之用途。本發明之其他方 面與具體實施例係揭示於本文中。 發明詳述 在本發明組合物之一方面s係、關於新賴幻化合物。式^ 化合物含有-或多個對掌中心目此本發明係針對外消旋 混合物；純立體異構物（意即對掌異構物或非對映異構物广 富含立體異構物之混合物等，除非另有指丨。t於本文中 T示或指稱一種特定立體異構物時，熟諳此藝者應明瞭的 是’除非另有指出，否則較少量之其他立體異構物可存在 於本發明之組合物中，其條件是此組合物整體之利用性不 會因為此種其他異構物之存在而被消除。 特定言之，式I化合物含有一個對掌中心在下列部份化學 式中藉由符號*所指示之碳原子處：

OH 在本發明之一項特定具體實施例中，藉由符號*所確認 之碳原子具有（R)組態。在此具體實施例中，式合物係 具有（R)組態在藉由符號*所確認之碳原子處，或富含在此 120149 200811105 碳原子處具有（R)組態之立體異構物形式。 式I化合物亦含有數個鹼性基團（例如胺基），因此式工化 合物可以自由態驗或各種鹽形式存在。所有此種形^均被 包含在本發明之範圍内。再者’式!化合物或其鹽之溶劑合 物’均被包含在本發明之範圍内。 因此，熟諳此藝者將明瞭的是，指稱本文之化合物，例 如指稱式!化合物或化合物6，係包括指稱該化合物之鹽與 立體異構物及溶劑合物，除非另有指出。 /此外，於本文中使用之單數形式”―種個，,及”該 係包括其相應之複數H除非使用之内文明白地另有指 述° 於本文中用以指稱本發明化合物及其中間物之命名法， 已-般性地使料射得之Au_Qm㈣（MDmea_ ⑸―）衍生。典型上，式nb合物已被指稱為聯苯各基胺 甲基酸之六氫吡啶_4-基酯衍生物。 代表性具體實施例 下列取代基與意義係意欲提供本發明之各方面盘豆體實 施例之代表性實例。此等代表性意義係意欲進一步定義與 說明此等方面與具體實施例，並不意欲排除其他具體實施 例’或限制本發明之範圍。關於此點，一種特定意義或取 代基係為較佳之描述，並不意欲以任何方式將其他意義或 取代基自本發明排除在外，除非明確指示。 於一項具體實施例中，為曱基，且义2為甲基。 於另一項具體實施例中，R1為乙基，且R2為乙基。 120149 200811105 於另一項具體實施例中，R1為甲基，且R2為乙基。 於另一項具體實施例中，R1為乙基，且R2為曱基。 因此，在本發明組合物之一方面，係關於式j化合物，選 自： 聯苯j基胺曱基酸1-[2-(4-{[(r)1(3_曱醯胺基冰羥苯基 Μ乙基月女基]甲基}-2,5-一曱基苯胺甲醯基）乙基]六氫咐σ定一 基酯（化合物Ha); 聯苯-2-基胺曱基酸l-[2-(4-{[(R)-2-(3-曱醯胺基-4-羥苯基峰 經乙基胺基]曱基}-2,5-二乙基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶 基酯（化合物lib); 聯苯-2-基胺曱基酸l-[2-(4-{[(R):(3-曱醯胺基-4-羥笨基）_2_ 經乙基胺基]甲基卜2-曱基-5-乙基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶 -4-基酯（化合物He); 聯苯冬基胺甲基酸l-[2-(4-{[(R)-2-(3-曱醯胺基-4-羥苯基）一2- 經乙基胺基]曱基卜2-乙基-5-甲基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶 -4-基g旨（化合物Ud); 或其藥學上可接受之鹽。 定義 當描述本發明之化合物、組合物、方法及製程時，下述 術語具有下述意義，除非另有指出。 ’’烷基’’ 一詞係指單價飽和烴基，其可為線性或分枝狀。 除非另有定義，否則此種烷基典型上含有1至1〇個碳原子。 代表性烷基’舉例言之，係包括曱基、乙基、正-丙基、異 丙基、正-丁基、第二-丁基、異丁基、第三·丁基、正·戍基、 120149 14 200811105 正己基、正、庚基、正-辛基、正-壬基、正-癸基等。 §對於本文中使用之特定術語意欲一特定碳原子數時， 石反原子數係緊接在此術語前顯示。例如，"Ci _3烷基"一詞係 意謂具有1至3個碳原子之烷基，其中碳原子係呈任何化學 上可接受之組態。 次烷基”一詞係指二價飽和烴基，其可為線性或分枝狀。 除非另有疋義，否則此種次烷基典型上含有1至10個碳原 子。代表性次烷基，舉例言之，係包括亞曱基、乙烷-丨，2一 一基（次乙基’’）、丙烷义2-二基、丙烷-1，3-二基、丁烷q，冬二 基、戊烷-1，5-二基等。 月女基保濩基一詞係意謂適合在胺基處預防不想要反應 之保護基。代表性胺基保護基，包括但不限於第三_丁氧羰 基（BOC) —苯曱基（Tr)、芊氧羰基（cbz)、9-第基曱氧羰基 (Fm〇C)、芊基、曱醯基、三甲基矽烷基（TMS)、第三-丁基二 曱基矽烷基（TBS)等。 緩基保濩基 闺係意謂適合在致基處預防不想要反應 之保護基。代表性隸保護基，包括但不限於_類，譬如 甲基乙基第一''丁基、卞基（Bn)、對'甲氧基芊基（PMB)、 9’基甲基(Fm)、三甲基矽烷基(TMS)、帛三·丁基二甲基矽 烧基（TBS)、二苯甲基（二苯甲基，DpM)等。 於本文中使用之”本發明化合物，，或，，式〗化合物"或"式Η 化合物”術語，係意謂所指定之化合物，或其藥學上可接受 之鹽或溶劑合物或立體異構物，除非另有指出。 ’’鹵基’’ 一詞係意謂氟基、氯基、溴基及碘基。 120149 200811105 π羥基保護基’’ 一詞係意謂適合在羥基處預防不想要反應 之保護基。代表性羥基保護基，包括但不限於矽烷基，包 括三（(C! -6烷基）矽烷基，譬如三甲基矽烷基（TMS)、三乙基 矽烷基（TES)、第三-丁基二甲基矽烷基（TBS)等；酯類（醯基）， 包括C〗_6烧酿基，譬如甲醯基、乙驢基等；芳甲基，譬如 芊基（Bn)、對-甲氧基芊基(ΡΜΒ)、9_苐基甲基（Fm)、二苯甲 基（二苯甲基’ DPM)等。此外，兩個經基亦可被保護成亞 烧基，譬如亞丙-2-基，例如經由與酮譬如丙酮之反應而形 成。 脫離基π —詞係意謂可在取代反應譬如親核性取代反應 中，被另一種官能基或原子置換之官能基或原子。舉例言 之，代表性脫離基包括氯基、溴基及碘基；磺酸酯基，譬 如甲烷磺酸自旨、甲苯磺酸醋、漠磺酸雖、壬烷磺酸酯等Υ 及醢氧基，譬如乙醯氧基、三氟乙醯氧基等。 "質量中間值直徑"或”MMD”術語，當用以指粒子時，係 意謂直徑，以致使一半粒子之質量係被包含在具有較大直 杈之粒子中’而一半係被包含在具有較小直徑之粒子中。 ”經微粉化”或”呈微粉化形式”術語’係意謂其中粒子之 至少約90百分比具有直徑小於約1〇微米，除非另有指出。 於本文中使用之”或其藥學上可接香 立w 要 鹽或溶劑合物或 立肢異構物”一詞，係意欲包括鹽、 ^ ^ ^ 〇物及立體異構物 之所有替換物’譬如細合物之立體異 党鹽之溶劑合物。 条子上叮接 ’藥學上可接受之鹽”一詞係音拍 / 心明可接雙用於投予病患譬 120149 200811105 如哺乳動物之鹽（例如對牲— Θ I (例々對特疋劑量服用法具有可接受之哺 乳動物安全性之鹽代# Mm > 代表丨生樂學上可接受之鹽包括醋酸、 抗壞血酸、苯石备酸、笨甲赌 八 枣γ S夂、知腦磺酸、檸檬酸、乙烷磺 酸、乙烧二石黃酸、反丁说-缺 . 席一 &L、旎膽酸、葡萄糖酸、酸糖 酸、麩胺酸、馬尿酸、新溴萨 ^ /吴馱、鹽酸、羥乙磺酸、乳酸、 乳基生物酸、順丁稀二酸、蘋果酸、苯乙醇酸、甲烧磺酸、 黏酸、茶石黃酸、萘-二輕、於驗酸、確 酸、乳清酸、雙經莕酸、泛酸、碟酸、號轴酸、硫酸、酒 石酸、對-甲苯磺酸及愛克辛那弗酸等之鹽。 …’工保4之何生物'•一詞係意謂肖定化合物之衍生物， 其中該化合物之—或多個官能基係被保護或阻斷基團保護 或阻斷’而免於邊香不相i 兄孓化又不心要之反應。可被保護之官能基， 舉例言之，係包括羧酸基、胺基、羥基、硫醇基、羰基等。 對此種官能基之適當保護基㈣—般熟諸此項技藝者所習 知’如以^講糾級㈣夯襪合成上之㈣差第 三版，谓ey, New风1999及其中所引述參考資料中之陳述 内容為例。 ”其鹽”-詞係意謂當酸之氫被陽離子置換時所形成之化 合物，該陽離子譬如金屬陽離子或有機陽離子等。於本發 明中，陽離子典型上係包含式1化合物之質子化形式 其中-或多個胺基已被酸質子化。此鹽較佳為藥學上可接 受之鹽，惟這對並非欲供投予病患之中間化合物之 需要。 ，，溶劑合物”一m系指藉由一或多個分子之溶f，意即式1 120149 -17- 200811105 化合物或其藥學上可接受之鹽，與 所形成之複合物或聚隹w —夕個分子之溶劑， 市肢。此種溶劑八私从 固體，具有實質上固定莫耳比之溶,、型上為結晶性 舉例言之，係包括水、甲醇、乙醇、/^|卜代表性溶劑， 溶劑為水時，所形# /、丙醇、醋酸等。當 ,,、 τ 所形成之溶劑合物為水合物。 ”治療上有效量”—詞，係 足以達成治療之量。 χ予而要治療之病患時， 於本文中使用$ π、社 進仃治療”或”治療作業"_ 病患譬如哺乳動物（特別是人類）中之$ ^ = 灯/σ療或治療作業（譬如COPD)，其包括： ⑷ (b) (〇) ⑷ 預防疾病或醫療症狀發生，意 沐笙+ 一、 W心、之預防治療， 。’矢病或醫療症狀，意即排除 ^ ^ Μ ^ 啊〜、Τ之疾病或醫 療症狀或造成其復原； 抑制疾病或醫療症狀，意即減慢或遏制疾病或醫療 症狀在病患中之發展；或 減輕疾病或醫療症狀在病患中之徵候。 於本文中使用之所有其他術語係意欲具有其一般意義， 如由一般熟諳其有關技藝者所明瞭的。 一般合成程序 本發明之化合物可使用下述一般方法與程序，或利用一 般熟諳此蟄者易於取得或所已知之其他資訊，製自易於取 得之起始物質。雖然下述程序可說明本發明之特定具體實 施例或方面，但熟諳此藝者將明瞭本發明之其他具體實施 例或各方面可使用相同或類似方法，或利用熟諳此藝者所 120149 -18- 200811105 已知之其他方法、試劑及起始物質製備。亦應明瞭的是， 在給予典型或較佳處理條件（意即反應溫度、時間、反應物 之莫耳比、溶劑、壓力等）之情況下，其他處理條件亦可使 用’除非另有述及。雖然最適宜反應條件典型上將依各種 麥數而改變，譬如所使用之反應物、溶劑及量，但一般熟 。曰此藝者可容易·地使用例行最佳化程序測定適當反應條 件。 , 下咬丞°」妮是必須 或4要的，以防止某些官能基遭受 ^ 、又卜心要之反應。對特定 吕能基之適當保護基之選擇， .x 汉關於此種官能基之俘嘈 與去除保敎g條件與㈣，係 保邊 若+面 負技藝中所習知。 而要’可使用本文所述程序中所示者以外 於-項具體實施例中，式1化合物係如 中、二土。 而得： Λ中所不合成 120149 200811105 圖式i R2 0-R3a

式I化合物 其中P1為羥基保護基；且係獨立選自Ci_6烷基， 或圮3與11313係接合而形成C2_6次烷基。 如圖式I中所示，化合物1可與約〇·95至約1.05莫耳當量之 化合物圣反應，以提供化合物。此Michael反應典型上係在 120149 -20- 200811105 約〇°C至約75°C，典型上為約40°C至約45°C範圍之溫度下進 行約8至約24小時，或直到反應實質上完成為止。一般而 吕’此反應係在適當稀釋劑中進行，譬如二氣甲烧，戒二 氣甲烧與曱醇或乙醇之混合物等。在反應完成時，典蜇上 係使用習用程序單離產物，譬如萃取、再結晶作用、層析 專。或者，含有化合物丄之反應混合物可直接使用於合成之 下一步驟中。 化合物！係接著與含水酸反應，以使縮醛基水解，立提 供酸化合物i。任何適當酸可被採用於此反應中，舉例言 之，係包括鹽酸、硫酸、曱烷磺酸、對-曱苯磺酸等。此水 解反應典型上係在約至約30°C，典型上為約20°C至約25 C範圍之溫度下，進行約1至約6小時，或直到反應實質上 完成為止。一般而言，此反應係在適當稀釋劑中進行，譬 如甲醇、乙醇、異丙醇、二氣甲烷/乙醇、乙腈等。在反應 完成時，典型上係使用習用程序單離產物，譬如萃取、再 結晶作用、層析等。 化合物1係接著與約0·95至約ι·5莫耳當量之化合物[，於 還原劑存在下反應，而得化合物£。任何適當還原劑均可使 用於此反應中，以下述作為說明，係包括金屬氫化物試劑， 譬如氫化鈉、三乙臨氧基硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉等， 或氫’及金屬觸媒，譬如I巴/碳等。此還原性烧基化反應典 型上係在約-20°C至約30°C，典型上為約〇°c至約5°C範圍之 溫度下，進行約1至約6小時，或直到反應實質上完成為止。 一般而言，此反應係在適當稀釋劑與質子性溶劑中進行， 120149 200811105 言如*一氣乙烧與曱®堂 C； JZfc T知寺。在反應完成時，典型上係使用習 用私序早•產物’譬如萃取、再結晶作用、層析等。 然後，使化合物1去除保護，以提供式I化合物。用以使 化口物£去除H之特定條件係依所採用之保護基而定。例 士士㈤Ρ為矽烷基保護基(意即如本文定義之式^化合物) t Q 士第一丁基一甲基矽烷基、第三-丁基二苯基矽烷 基、二2甲基石夕烧基、二-第三-丁基甲基石夕烧基、第三-丁 乳基二苯基發烧基等’此去除保護反應典型上係經由使化 合物刚離子之來源接觸而進行。在一項特定具體實施 例中氟離子之來源為三乙胺三氟化氫。氟離子之其他適 當來源包括氟化四丁基銨’氟化鉀與队冠_6醚，氟化氫， 咐咬氟化氫等。此反應典型上係在約約贼，典型上 為、勺10 C至約25 c範圍之溫度下，進行約24至約72小時，或 直到反應貫質上完成為止。一般而言，此反應係在適當稀 釋J中進行，譬如一氯乙烷等。在反應完成時，典型上係 使用習用程序單離產物，譬如萃取、再結晶作用、層析等。 化合物1係為此項技藝中已知，或可使用已知程序，製 自市購可得之起始物質與試劑。參閱，例如美國專利申請 案公報U.S. 2004/0167167 AmR· Nait0等人，c/z·滅， 46(8)丨施-咖（溯）。舉例言之，化合物1可按圖式订中所示 製成： 120149 -22- 200811105

圖式II

^圖式11中所示，2·異氰酸聯苯酯⑺係與N-保護之4_羥基 六氫吡啶1反應，其中P2為胺基保護基，譬如芊基，以提供 胺基甲酸西旨中間物义。此反應典型上係在約耽至約i〇〇〇c ^型上為約6()°C至約贼範圍之溫度下，進行約6至約24小 =’或直到反應實質上完成為止。若需要則此反應可在適 當稀釋劑中進行’譬如二氯曱烷、甲苯等。或者，此反應 可於稀釋劑不存在下進行。在反應完成時，典型上係使用 習用程序單離產物^如萃取、再結晶翻、層析等。或 者’含有化合物2_之反應混合物係直接使用於合 + 驟中。 y 胺基保護基，p2,係接著使用習用程序自化合物i移除， 而得化合物L。例如，當声為爷基時，化合_可使用氣或 甲酸錢’於觸媒譬如，巴觸媒存在下被去除保護。代表：觸 媒，以下述作為說明’係包㈣/碳、氣氧編碳等。此 反應典型上係在約贼至約耽範圍之溫度下，典型上為約 4〇C ’進盯約6至約24小時’或直到反應實質上完成為止。 -般而言’此反應係在適當稀釋劑中進行，譬如甲醇、乙 酉子、異丙料。在反應完成日卜典型上係使用習用程序單 離化合物1，譬如萃取、再結晶作用、層析等。 120149 200811105 式—化口物係為此項技藝中已知，或可使用已知程序製 、可伃之起始*質與試劑。以τ述作為說明，式!化人 物可按圖式ΙΠ中所示製成： 一

如圖式III中所不，式址苯胺化合物，其中χ1為漠基或蛾 基，係百先在胺基上被保護，以提供式江化合物，其中 為胺基保4基’且p3 b為氫或胺基保護基。可使用任何適當 胺基保護基’譬如_基、4_甲氧基爷基H乙酿基等。 例如，式化合物可與約2或更多莫耳當量，較佳為約2.5 至約3.0莫耳當量之苄基鹵化物反應，譬如苄基氯化物、溴 化物或碘化物，而得化合物达，其中1^與]?313均為芊基。此 反應典型上係在約〇°C至約50°C範圍之溫度下，典型上為約 30°C，進行約18至約24小時，或直到反應實質上完成為止。 一般而言，此反應係在適當稀釋劑中進行，譬如曱醇、乙 醇、異丙醇等。典型上，此反應亦在適當鹼存在下進行， 譬如碳酸鉀、碳酸鈉等。在反應完成時，典型上係使用習 用程序單離化合物，譬如卒取、再結晶作用、層析等。 120149 -24 - 200811105 可:皮採用於此反應中之式触表性化合物， 二甲^石典基苯胺、A二乙基斗峨基苯胺、2-乙基七典H 甲基本胺、5_乙基斗碘基_2_曱基苯土 -屬土 —Μ-二乙基苯胺、4_溴基_2_乙基^基苯胺、‘漠基冰 乙以隹甲基苯胺等。此種化合物料市講可得（例 办咖集團有限公司，祕哪⑽，或可使用習用程序製自 市講可侍之起始物質與試劑。 然後’使化合物江與約1至約莫 觸，链^不 旲斗田里之烷基鋰試劑接 言，正-丁基鋰或第三-丁基鋰，以形成其相應之陰離子， 其中X]基團已被交換成鐘。此反應典型上係在約娘至約〇 °C範圍之溫度下，典型上為約抓，進行約〇25至約！小時， 或直到反應實質上完成為止。一般而言，此反應係在適當 稀釋劑中進行，譬如甲苯、二甲苯、四氫咬喃等。 斤开/成之鋰1¾離子並未被單离隹’但係'當場肖莫耳過量之 N，N-二甲基甲酿胺反應，以提供化合物沒。一般而言，係 使用約2至約4莫耳當量之N，N_二甲基甲醯胺。此反應典型 上h H7〇 C至約0 C ’典型上為約_2〇〇c至約〇。〇範圍之溫 度下’進行約0.5至約2小時，或直到反應實質上完成為止。 在反應完成時’典型上係使用習用程序單離化合物泛，譬 如萃取、再結晶作用、層析等。 括甲醇、乙醇、正-丙醇、乙二醇、丙二醇等 化合物！!_之醛基係接著被保護成縮醛，其方式是使化合 物11與醇或二醇，於酸性觸媒存在下反應。任何適當醇或 酉子均可使用於此反應中。例如，代表性醇類與二醇類包 般而言 120149 200811105 莫耳過里之醇或：s|係被採用於此反應中，較佳為約2至約 4莫耳當量。 ^ 可使用任何適當酸觸媒於此反應中，以促進縮醛之形 成。代表性酸催化作用，舉例言之，係包括㈣“I 苯項酸、鹽酸等。 此反應典型上係在約5(rc至約航，典型上為魏至 =圍之溫度下，進行約12至約24小時，或直到反應 實質上完成為止。一般而言，此反應係在適當稀釋劑中進 订’鲁如甲笨、二甲苯等。典型上，此反應係以會使所產 f之水被移除之方式進行，譬如藉由共滞蒸鶴或利用分子 篩。在+反應完成時，典型上係使m程序單離化合物这， 譬如萃取、再結晶作用、層析等。或者，含有化合物廷之 反應混合物可直接使用於合成之下—步驟中。 一 在形成祕之後，係使用標準則彳與條件使化合物辽之 胺基去除保護，以形成化合物址。例如，若护3與為辛^， 則化合趨可使用氫與觸媒譬如免觸媒而被去除保護丁。土代 表性觸媒，舉例言之，係包括ie/碳、氫氧化…碳等。此 ^應典型上係在約坑至約坑，典型上為約坑至約筑 範圍之溫度下，進行約4至約12小時，或直到反應實質上完 成為止。一般而言，此反應係在適當稀釋劑中進行，譬如 甲醇、乙醇、乙醇/醋酸乙酉旨混合物等。在反應完成時:典 型上係使用習用程序單離化合物过，譬如萃取、再結晶作 用、層析等。 然後，使化合物11與丙稀酿基齒化物泣反應，其中於為 120149 -26- 200811105 氯基 '溴基或碘基，以形成化合物1。此反應典型上係在約 -2〇°C至約25°C ’典型上為約〇°C至約5°C範圍之溫度下，進 行約〇·5至約6小時，或直到反應實質上完成為止。一般而 吕，此反應係在適當稀釋劑中，譬如二氯曱烷等，於適當 鹼存在下進行，譬如二異丙基乙胺、三乙胺等。一般而言， 約1至丨·2莫耳當量之丙烯醯基鹵化物與約1至約2莫耳當量 IA使用於此反應中。在反應完成時，典型上係使用習 用程序單離化合物厶，譬如萃取、再結晶作用、層析等。 式1化合物係為此項技藝中已知，或可使用已知程序製 自市講可得之起始物質與試劑。以下述作為說明，式5化合 物可按圖式IV中所示製成： 口

圖式IV

σ又土言如卞基，且X3為脫離基，譬如氯基、 年土或/、基4逆化合物係為此項技藝中已知。例如，2001 ,日頒予之美國專利⑽，53顶；與R·臟等人，_ ;4發展1风2, 96·99 ;係描述Ν-[2-爷氧基-5餅2溴 120149 -27- 200811105 基小經乙基）苯基]曱酿胺（意即化合物沒之⑻對掌異構物， 其中P為下基’且X』為漠基）自漠基I宇氧基^肖基苯乙 酮開始之製備，其合成係描述於KM咖e等人，〇隱pharm 減义⑹13你1377 (1977)中。若需要，則化合物冱之外消旋 ^/式可利用非對阜性還原劑譬如硼烷硫化二甲烷複合物製 備，以還原2-漠基-4，；氧基·3,4基苯乙酮。 化合物之羥基係使用習用程序與試劑被保護，以提供 化口物ϋ，其中Ρ1為羥基保護基。在一項特定具體實施例 中’搜基保護基為石夕统基保護基，譬如二甲基異丙基石夕烧 基一乙基異丙基矽烷基、二曱基己基矽烷基、第三-丁基 二甲基矽烷基 '第三-丁基二苯基矽烷基、二苯甲基矽烷基 等。例如’化合物沒可與約〇 95至約12莫耳當量之氯化第 三-丁基二甲基矽烷，於約u至約13莫耳當量之咪唑存在 下反應，以提供化合物，其中pi為第三叮基二甲基矽烷 基。此反應典型上係在約0°c至約50〇c範圍之溫度下，典型 上在室溫下，進行約24至約48小時，或直到反應實質上完 成為止。一般而言，此反應係在適當稀釋劑中進行，譬如 N，N-二甲基曱醯胺等。在反應完成時，典型上係使用習用 程序單離化合物2^，譬如萃取、層析等。藉由進一步說明， N {2 氧基-5-[(R_)-2-漠基-1-(第三-丁基二曱基石夕烧基氧基）乙 基]苯基}甲醯胺之合成係描述於2〇〇4年12月9日公告之美國 專利公報US 2004/0248985 A1之實例2中。 化合物11係接著與芊胺（意即Bni-NH2)反應，而得化合物 ’其中Bn1為未經取代之芊基或經取代之芊基，具有1至3 120149 -28- 200811105 個取代基在爷基之苯環上，獨立選自Ci 4烧基或eh烧氧 基:代表性爷基胺類包括爷胺、3,4-二甲氧基爷胺、4_甲氧 基芊胺、4_甲芊基胺等。此反應典型上係經由使化合物辽 與約2至約4莫耳當晉-η— μ ^ 、 下胺接觸，在從約40°C至約100。〇， 典型上為約_至約·範圍之溫度τ，進行約5至約〜、 1·,或直到反應Λ負上完成為止。一般而言，此反應係在 適當2釋劑中進行’譬如Ν:甲基_2_四氫咐錢（_等。在 f應完成時’典型上係使用習用程序單離化合物18，譬如 萃取、層析、再結晶作用等。 方、疋’下基、Bn1及P4使用習用程序與試劑之移除，係庐 得化合物£。於—項具體實施例中，Bnl與以者均為爷基二 其係在相同反應混合物中被移除。典型上，此反應係^由 使化合物[與氫’於觸媒譬純觸媒存在下接觸而進行 ==包括氯氧編碳、屬等。-般而言，此脱爷 土反應係於酸存在下進行，譬如醋酸、甲酸等。此反應 典型上係在約阶至約耽範圍之溫度下，典型上在室Γ 行約6至約24小時，或直到反應實質上完成為止。： 般而5 ’此反應係在適當稀釋劑中進行，學 笠 —d — 1吁、乙酉手 辟。在—反應完成時，典型上係使用習用程序單離化合物5， 言如卒取、層析等。在—項特定具體實施例中，化 係被單離成醋酸鹽。 一般熟諳此藝者將明瞭的是，式Ϊ化合 =備。例如，其中進行合成步驟之特定:= 或可採用不同中間物。以下述作為說明，式m化合物： 120149 -29- 200811105

其中 Y1 為-CN、-C(〇)〇H 或-C(〇)〇R3c — t lU)UR ’可使用習用程序與試 劑被還原，以提供w(意即，其中。此外，此種 化合物可被還原成醇’意即’其中γ1為偶〇h，且該醇可 接著使用標準程序與試劑被氧化，以提供㈣（意即，其中 Y1 為-CHO)。 若需要，則式！化合物之藥學上可接受鹽可經由使式^匕 合物之自由態鹼形式與藥學上可接受之酸接觸而製成。 關於製備本發明代表性化合物或其中間物之特定反應條 件及其他程序之進-步細節，係描述於下文所述之實例中。 醫藥組合物、組合及配方 l. 本發明之化合物典型上❹醫藥組合物或配方之形式投 予病患。此種醫藥組合物可藉任何可接受之投藥途徑投予 病患’包括但不限於吸入、口腔、鼻、局部(包括經皮)及 非經腸投藥模式。應明瞭的適合特定投藥模式之本發 明化合物之任何形式(意即自由態驗、藥學上可接受之/ 溶劑合物等），均可使用於本文中所討論之醫藥組合物^ 因此，在本發明組合物之-方面中，係關於—種醫寧，且 合物’其包含藥學上可接受之載劑或賦形劑，&式I化人 物。典型此種醫藥組合物Μ要可視情況含有其他： 120149 -30 - 200811105 療及/或調配劑。 本發明之醫藥組合物典型上含有治療上有效量之式I化 合物。但是，熟諳此藝者將明瞭的是，醫藥組合物可含有 大於治療上有效量，意即總體組合物，或低於治療上有效 量，意即個別單位劑量，經設計以供多次投予，以達成治 療上有效量。 典型上，此醫藥組合物將含有約0.01至約95重量％之治療 劑；包括約〇.〇1至約30重量％ ;譬如約0.01至約10重量％之 治療劑。 任何習用載劑或賦形劑，均可使用於本發明之醫藥組合 物中。特定載劑或賦形劑之選擇，或載劑或賦形劑之組合， 係依用以治療特定病患或醫療症狀或疾病狀態類型之投藥 模式而定。關於此點，對特定投藥模式之適當醫藥組合物 之製備，係良好地在一般熟諳醫藥技藝者之技術範圍内。 在本發明醫藥組合物中所使用之載劑或賦形劑係為市購 可得。例如，此種物質可購自Sigma. (St. Louis，MO)。藉由進 一步說明，習用調配技術係為一般熟諳此項技藝者所習知， 如以 Remington :農 # 於學與 f 藏，第 20 版，Lippincott Williams & White，Baltimore，Maryland (2000);與 H.C· Ansel 等人，醫桌;垄7 與 ## 溪游 J 巍，第 7版，Lippincott Williams & White，Baltimore， Maryland (1999)中之陳述内容為例。 可充作藥學上可接受載劑之物質之代表性實例，包括但 不限於下列：（1)糖類，譬如乳糖、葡萄糖及蔗糖；（2)澱粉， 譬如玉米澱粉與馬鈐薯澱粉；（3)纖維素及其衍生物，譬如 120149 200811105 缓甲基纖維素納、乙基纖維素及纖維素醋酸 西黃¥樹膠；⑸夹年.以、 W 4刀末狀 一 ，（）明膠；⑺滑石；⑻賦形劑，孽如 可可豆脂與栓劑蝶類；(9)油類，譬如花生油、棉軒油：红 化油 '芝麻油、撖檀油、玉米油及大豆油；⑽二醇類，· :丙：醇，(11)多元醇類，譬如甘油、花楸醇、甘露醇及聚 (14= Γs旨類’譬如油酸乙醋與月桂酸乙酉旨；（13)壤脂； )的別，譬如氫氧化鎂與氫氧化铭；（15)海藻酸；⑽ 不含熱原水；（哨滲鹽水；⑽林格氏溶液；⑽乙 :酸鹽綾衝溶液;(21)壓縮推進劑氣體，譬如氯氟碳類與氫 ⑽類;及(22)被採用於醫藥組合物中之其他無毒性可相容 物質。 #本發明之醫藥組合物典型上係經由將本發明之化合物與 樂學上可接受之載劑及任何選用成份充分與密切混合或摻 合而製成。若必要或有需要，則可接著將所形成之均勻摻 合混合物使用習用程序與設備，製成或裝填至片劑、膠囊: 丸劑、罐子、藥筒、分配器等之中。 於：項具體實施例中，本發明之醫藥組合物係適用於吸 :投藥。供吸入投藥之適當醫藥組合物，典型上係呈氣溶 私或粉末形式。此種組合物—般係使用f知傳輸裝置投藥， 3如霧化罐吸入器、經計量之劑量吸入器（MD][)、乾粉吸入 杰（DPI)或類似傳輪裝置。 在本發明之一項特殊具體實施例中，包含治療劑之醫藥 組合物係使用霧化罐吸入器’藉吸入投藥。此種霧化罐裝 置典型上係產生高速度空氣流，其會造成包含治療劑之醫 120149 -32 - 200811105 藥組合物喷霧成為霧氣，其係被帶至病患之呼吸道中。因 此，當經調配供使用於霧化罐吸入器時，治療劑典型上係 被溶於適當载劑中，以形成溶液。或者，治療劑可被微粉 化並與適當載劑合併，以形成微粉化粒子之懸浮液。適合 藉吸入技予/σ療劑之務化罐裝置係為一般熟諳此項技藝者 所習知，或此種裝置係為市購可得。例如，代表性霧化罐 裝置或產物包括 Respimat S0ftmist 她alaler (B〇ehringer j响 AERx肺傳輪系統（Aradigm公司）；pARI Lc pius可再使用霧化 罐（Pari GmbH)等。 μ:種供使用於霧化罐吸入器之代表性醫藥組合物，包括 等◊水’合液，其包含約0·05微克/毫升至約10毫克/毫升之式 I化口物。於一項具體實施例中，此種溶液具有約4至約6 之pH值。 一在本發明之另一項特殊具體實施例中，包含治療劑之醫 ，'且:物ϋ吏帛乾粉吸人器，藉吸入投藥。此種乾粉吸入 為典型上係以自由流動性粉末投予治療劑，其係在吸氣期 間被分散於病患之氣流中。為達成自由流動性粉末，典型 ^係將治療劑與適當賦形劑一起調配，該賦形劑譬如乳糖= ，粉、甘露醇、右旋糖、聚乳酸（PLA)、聚内交醋_共_乙交 = (PLGA)或其組合。典型上’治療劑係被微粉化，且與適 :載劑合併，以形成適用於吸人之摻合物。因&，於本發 月2項具體實施例中，式1化合物係呈微粉化形式。. 供使用於乾粉吸入器之代表性醫藥組合物， 乳糠與微粉化粒子之式“匕合物。 “ 120149 -33 - 200811105 此種乾粉配方可例如經由將乳糖與活性劑合併，然後乾 摻合此等成份而製成。或者，^:需要，則治療劑可經調配 而未使用賦形劑。然後，典型上係將醫藥組合物裝填至乾 粉分配為中，或至吸入藥筒或膠囊中，與乾粉傳輸裝置一 起使用。 適合藉吸入投予治療劑之乾粉吸入器傳輸裝置係為一般 熟諳此項技藝者所習知，或此種裝置係為市購可得。例如， 代表性乾粉吸入裔傳輸裝置或產物包括Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX) ； ClickHaler (Innovata Biomed) ; Diskhaler (GlaxoSmithKline)； Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline)； Easyhaler (Orion Pharma) ； Eclipse (Aventis) ； FlowCaps (Hovione) ； Handihaler (Boehringer Ingelheim) ； Pulvinal (Chiesi) ； Rotahaler (GlaxoSmithKline)； SlcyeHaler/Certihaler (SkyePharma) ； Twisthaler (Schering-Plough)； Turbuhaler (AstraZeneca) ; Ultrahaler (Aventis)等。 在本發明之又另一項特殊具體實施例中，包含治療劑之 醫藥組合物係使用經計量之劑量吸入器，藉吸入投藥。此 種經計量之劑量吸入器典型上係使用壓縮推進劑氣體，排 放經度量數量之治療劑。因此，使用經計量之劑量吸入器 投予之醫藥組合物，典型上包含治療劑在液化推進劑中之 溶液或懸浮液。任何適當液化推進劑均可採用，包括氯氟 碳類，譬如CC13，與氫氟基烷類（HFA)，譬如1，1，1，2-四氟基 乙烷（HFA 13如）與1，151，2,3,3,3-七氟-正-丙烷（证八227)。由於顧 慮氣氟碳類會影嚮臭氧層，故含有HFA之配方一般較佳。 HFA配方之其他選用成份係包括共溶劑，譬如乙醇或戊 120149 • 34- 200811105 少完，與界面活性劑，譬如三油酸花楸聚糖醋、油酸、卵石粦 脂及甘油。 供使用於經計量之劑量吸入器之代表性醫藥組合物，包 含約0.01%至約5%重量比之式I化合物；約0%至約20%重量 比之乙醇；及約0%至約5°/。重量比之界面活性劑；而其餘部 份為HFA推進劑。 此種組合物典型上係藉由添加經急冷或加壓之氫II基烧 至含有治療劑、乙醇（若存在時）及界面活性劑（若存在時） 之適當容器中而製成。為製備懸浮液，係將治療劑微粉化， 然後與推進劑合併。然後，將配方裝填至氣溶膠罐中，其 係形成經計量之劑量吸入器裝置之一部份。 適合藉吸入投予治療劑之經計量劑量吸入器裝置係為一 般熟諳此項技藝者所習知，或此種裝置係為市購可得。例 如，代表性經計量劑量吸入器裝置或產物係包括AeroBid吸 入器系統（Forest醫藥）；溴化異丙阿托品吸入氣溶膠（Boehringei* Ingelheim) ; Flovent (GlaxoSmithKline) ; Maxair 吸入器（3M);舒喘靈 吸入器（Schering) ; Serevent 吸入氣溶膠（GlaxoSmithKline)等。 於另一項具體實施例中，本發明之醫藥組合物係適用於 口服投藥。供口服投藥之適當醫藥組合物可呈膠囊、片劑、 丸劑、錠劑、爲囊劑、糖衣鍵、粉末、顆粒形式；或作成 溶液或懸浮液，在水性或非水性液體中；或作成油在水中 型或水在油中型液體乳化液；或作成酏劑或糖漿；及其類 似物；各含有預定量之本發明化合物作為活性成份。 當欲以固體劑型（意即為膠囊、片劑、丸劑及其類似物） 120149 -35- 200811105 供口服4又藥時，本發明之醫藥組合物典型上係包含本發明 化合物作為活性成份，及一或多種藥學上可接受之載劑， 言如彳宁檬酸鋼或填酸二|弓。視情況或替代地，此種固體劑 型亦可包含··⑴填料或增量劑，譬如澱粉、乳糖、嚴糖、 葡萄糖、甘露醇及/或矽酸；（2)黏合劑，譬如羧曱基纖維素、 海藻酸鹽、明膠、聚乙烯基四氫吡咯酮、蔗糖及/或阿拉伯 膠；⑺保濕劑，譬如甘油；⑷崩解劑，譬如瓊脂、碳酸鈣、 馬鈐薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽及/或碳酸鈉丨⑸ 溶解阻滯劑，譬如石蠟；⑹吸收加速劑，譬如四級銨化合 物；⑺潤濕劑，譬如鯨蠟醇及/或單硬脂酸甘油酯；⑻吸 收劑，譬如高嶺土及/或膨土；⑼潤滑劑，譬如滑石、硬脂 酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及/或其混 合物；（10)著色劑；及緩衝劑。

離型劑、潤濕劑、塗覆劑，增甜、矯味及芳香劑，防腐 劑及抗氧化劑，亦可存在於本發明之醫藥組合物中。藥學 上:接受抗氧化劑之實例，包括：⑴水溶性抗氧化劑Ϊ譬 如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、酸性硫酸鈉、偏酸性硫酸 酸酉旨、丁基化經基甲苯卿HA)、丁基化經基甲苯(丽）、 卵鱗脂：沒食子酸丙s旨…育g分等；及(3)金屬螯合劑， 言如#杈酸、乙二胺四醋酸(EDTA)、花楸醇、酒石酸、磷 酸等、。供片劑、膠囊、她類似物用之塗覆劑，包括用. 於腸溶性塗層者，譬如纖維素醋酸酞酸，(CAP)、聚酞酸醋 酸乙烯酯（PVAP)、鉍$ w , 匕丙曱基纖維素酞酸酯、甲基丙烯酸、 120149 -36- 200811105 f基丙稀酸酷共聚物、纖維素醋酸苯三甲酸酷(CAT)、缓甲 基乙基纖維素（CMEC)、M丙甲基纖維素醋酸號抬酸醋 (HPMCAS)等。 若需要，則本發明之醫藥組合物亦可經調配，以提供活 性成份之緩慢或受控釋出，舉例言之，係以不同比例使用 經丙甲基纖維素；或其他聚合體基質、微脂粒及/或微球體。 _此外’本發明之醫藥組合物可視情況含有遮光劑，且可 〜周配’以致其係只有或優先在胃腸道之某—部份中釋出 活性成份，視情況以延遲方式。可使用之包埋組合物之實 例’包括聚合體物質與㈣。活性成份亦可呈微包覆形式'， 若適當，則使用一或多種上述賦形劑。 供口服投藥之適當液體劑型 …生以下述作為說明，係包括 条+上可接受之乳化液、料 ^ A 匕液、洛液、懸浮液、糖漿 及劑。此種液體劑型业剞 ^'上包含活性成份與惰性稀釋 劑，例如水或其他溶劑、促 ^ d及礼化劑，譬如乙醇、異 丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯 0日下醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、 丁二醇、油類（尤其 辨斗 π仃洛化生、玉米、胚芽、撖 見、蓖麻及芝麻油類）、甘油 r祕取 甘油、四氫呋喃基醇、聚乙二醇及 化揪I糖之脂肪酸酯類， 以及其混合物。懸浮液除了活性 成伤以外，可含有懸浮劑 取# 1如乙氧基化異硬脂基醇類、 ♦乳化乙烯花楸醇及花楸聚+杳 氧介““類、微晶性纖維素、偏氫 虱化鋁、膨土、瓊脂及西I著 /、耆祕膠，以及其混合物。 备欲供口服投藥時，本發明# ,.. 月之商樂組合物可以單位劑型 包裝。"單位劑型”一詞係竜押扁人 μ明適θ病患服藥之物理上不連 120149 -37- 200811105 買早位，.、即各單位含有經計算以產生所要治 定量活性劑，無論單獨或併用—或多個其他單位。例預 此種單位劑型可為«、η丸劑等。 ° ’ ，發明化合物亦可以經皮方式投藥，使用已 糸統與賦形劑。例如，可蔣士 寻輸 、θ〜 了將本發明化合物與渗透增強劑互 、 月敉酉义酉曰、氦環烷-2-_等， 亚I入貼藥或類似傳輪系统ψ 〜 其他賦形劑，包括膠凝劑、 礼化知彳及緩衝劑，若需要可被 便用方；此種經皮組合物中。 此外，本發明化合物可以 ^ ^ ^ 二軔万式叙樂，意即以靜脈 内方式、皮下方式或肌内方。 ^ 對非經知投藥而言，式j 化&物典型上係被溶於對非婉 度 工％奴柴為可接受之載劑中， 言如無囷水、鹽水、植物 寻以下述作為說明，靜脈内 組合物典型上係包含式〗 . 口物之無囷水溶液，其中該溶液 具有pH在約4至約7之範圍内。 若需要，則本發明化入你 口 了併用一或多種其他治療劑一 此項具體實施例中，本發明之化合物係無論是 ^物種治療劑混合，以形成含有兩種藥劑之 ^或各樂劑係存在於個別且不同組合物中，其係同 0寸或相繼地投予病患。 人式1化合物可使用習用程序與設備，與第二種治療 "二幵，以形成包含式1化合物與第二種治療劑之組合物。 广，治療劑可與藥學上可接受之载劑合併，以形成-種 么人式1化0物、第二種治療劑及藥學上可接受載劑之醫藥 組合物。在此項具體實施例中，典型上係將組合物之成份 120149 -38- 200811105 混合或摻合，以產生物理混合物。然後’使用本文中所述 之任何途徑，以治療上有效量投予該物理混合物。 或者，在投予病患之前，治療劑可仍然保持個別且不同。 在此項具體實施例中，於投藥之前，治療劑並非以物理方 式混合在一起，但係同時或相繼地以個別組合物投予。例 如’式I化合物可藉吸入盒另一插、二成 ^ /、另種療劑同時或相繼地投 樂’使用吸人傳輸裝置’其係對各治療劑採用個別隔室（例 如氣泡包裝）。或者，該組合可使用個別傳輸裝置投予，音 即，一種傳輸裝置用於一種治療劑。此外，治療劑可藉由 不同投藥途徑傳輸，意即一種藉吸入，而另—種藉口服投 藥。 可與本發明化合物相容之任何治療劑可與此種化合物合 併使用。在-項特定具體實施例中，第二種治療劑係為有 效地措吸人所投予者。以下述作為說明，可與本發明化八 物-起使用之治療劑之代表性類型，包括但不限於消炎劑， 譬如類固酵消炎劑(包括皮質類固醇與類皮質糖）、非類固 醇消炎劑（NS AID)及舰4抑制劑 、 仅虱g擴張樂，譬如PDE。 二 甘、調制劑及他腺素能受體激動劑；防二 傳“彳，譬如革蘭陽性抗生素、革 劑；抗組織胺類；蛋白酶抑制♦ 不及抗病骨 動劑與神經激肽調制劑；及 ° 认 1^ f早党體拮抗劑（抗膽鹼能 劑）。此種治療劑之咩容恭^么 b , 〜5午夕Λ例係為此項技藝中所習知。與太 發明化合物合併投予之其 果W之適當劑量，典型上伤 在約。·05微克/天至約5。。毫克/天之範圍内。 120149 -39- 200811105 在本發明之一項特定具體實施例中，式1化合物係與類固 醇消炎劑合併投藥。可與本發明化合物併用之類固醇消炎 劑之代表性實例，包括但不限於二丙酸氣地米松；布蝶松 化物，丁 氧可體丙酸鹽（bUtiX〇C〇rt pr〇pi〇nate) ; η 仏[亞 丁基雙（氧基）]如，9义二氟-11尽經基-Π尽（曱硫基）雄留斗烯_3· 酮（RPR-106541);西列松奈得（cicles〇nide);地塞米松；6⑽邙 一氟-17α-[(2-吱喃基羰基）氧基]w头羥基_16α•甲基！調基雄 留-1，4-二稀-17尽碳硫代酸氟基曱酯；6%^二氟七分經基

二烯-17yS-碳硫代酸8_氟基甲g| ; 6α，9义二羥基·16α_曱 基-3-酮基-17义丙醯氧基雄二烯-17尽碳硫代酸⑸_(2_嗣 基四氫呋喃-3S-基）酷；氟尼梭來；丙酸福路替卡松印此 propionate);甲基氫化潑尼松；糠酸莫美塔松，·氫化潑尼松； 潑尼松；若弗澎奈得（roflep〇nide) ; ST_126，·丙酮化氟羥脫氮皮 甾知等，或其藥學上可接受之鹽。此種類固醇消炎劑係為 市購可得，或可使用習用程序與試劑製成。例如，類固醇 消炎劑之製備與用途係描述於2〇〇4年6月15日頒予之美國 專利6,750,210 B2 ; 2004年7月ό日頒予之美國專利6,759,398 Β2 , 20(b年j月25日頒予之美國專利6,537,983 ; 2〇〇2年2月14 曰么告之美國專利申請案公報us 2〇〇2/〇〇ι9378 A1 ;及其中引 述之參考資料中。 田被如用％，類固醇消炎劑當與本發明之化合物共同投 藥犄、’典型上係以會產生治療上有利作用之量投予。典型 上 ^ 口醇'肖义制係以足以提供每劑量約0.05微克至約500 120149 -40 - 200811105 微克之量投藥。 . f實施方式】 下述實例係說明本發明 ~月之代表性醫藥組.合物

實例A 乾粉組合物 使經微粉化之本發明化入 ^ ^ ^ 口物（100宅克）與經研磨之乳糠 一 不大於約85%之粒子具有為約60微米 至約而不低於15〇/〇之粒子具有應〇低於^微米二 ，糖）換合。然後，將此已摻合之混合物裝填至個別可剝離 乳泡。衣之虱泡中’其量足以提供每劑量約⑺微克至約5〇〇 微克之本發明化合物。氣泡之内含物係使用乾粉吸 藥。 。〇 實例Β 乾粉組合物 錢微粉化之本發明化合物（1克）與經研磨之乳糖_ 克）t s 以形成具有化合物對經研磨乳糖之重量比為]: 200之總體組合物。將已摻合之組合物裝填至乾粉吸入裝置 中，其每劑量能夠傳輸約1〇微克至約5〇〇微克間之本發明化 合物。

實例C 乾粉組合物 使經微粉化之本發明化合物（100毫克）及經微粉化之類 固醇消炎劑（500毫克），與經研磨之乳糠（3〇克）摻合。然後， 將此已摻合之混合物裝填至可剝離氣泡包裝之個別氣泡 120149 -41 - 200811105 中’其置足以提供每劑量約10微克至約500微克之本發明化 合物。氣泡之内含物係使用乾粉吸入器投藥。

實例D 經計量之劑量吸入器組合物 使經微粉化之本發明化合物（1〇克）分散在經由使卵磷脂 (0.2克）溶解在脫礦質水（2〇〇毫升）中所製成之溶液内。將所 形成之fe浮液噴霧乾燥，然後微粉化，以形成包含具有平 均直控小於約1.5微米之粒子之經微粉化組合物。接著，將 經微粉化之組合物裝填至含有加壓1，U，2-四氟基乙烷之經 。十里劑昼吸入益藥筒中，當藉由經計量之劑量吸入器投藥 曰守其1足以提供每劑量約10微克至約500微克之本發明化 合物。 實例E 霧化罐組合物 使本發明之化合物（25毫克）溶於檸檬酸鹽緩衝（pH 5)等 滲鹽水（125毫升）中。將混合物攪拌，並音振直到化合物溶 解為止。檢查溶液之pH值，而若必要則藉由慢慢添加1N氫 氧化鈉水溶液調整至pH 5。此溶液係使用霧化罐裝置投藥， 其係提供每劑量約1〇微克至約500微克之本發明化合物。 實例F 硬明膠膠囊 將本發明之化合物（50克）、經噴霧乾燥乳糖（440克）及硬 脂酸鎂（10克）充分地摻合。將所形成之組合物裝填至硬明 膠膠囊（每膠囊500毫克組合物）中，其係以口服方式投藥。 120149 -42 - 200811105 實例G 口服懸浮液 成：下列成份充分地混合 以形成口服投藥用之懸浮液： 量 _ 1.0克 0.5克 2.0克 0.15 克 0.05 克 25.5 克 12·85 克 1.0克 0.035毫升 0.5毫克 足量至100毫升 本發明化合物 反丁烯二酸 氯化納 對說基苯曱酸甲酉旨 對羥基苯曱酸丙酯 粒狀糖 花楸醇（70%溶液） ( $夕酸鎭紹） 矯味劑 著色劑 蒸顧水 所幵> 成之懸浮液含有每1〇毫升懸浮液1〇〇毫克活性成份。 此懸浮液係以口服方式投藥。 實例Η

可注射組合物 將本發明之化合物（〇·2克）與0.4 Μ醋酸鈉緩衝溶液（2.0毫 升）摻合。按需要，將所形成溶液之ρΗ值使用〇·5 Ν鹽酸水 溶液或0·5 Ν氫氧化鈉水溶液調整至ρΗ 4，然後，添加足夠 >主射用水，以提供總體積為20毫升。接著，將混合物麫過 無菌濾器（0.22微米）過濾，以提供適合藉注射投藥 。 ^ 带囷溶 利用性 120149 -43 - 200811105 本毛月化&物同時具有怂腎上腺素能受體激動劑與毒蕈 驗受體结抗劑活性，因此，預期此種化合物可作為治療劑 使用’以治療藉由爲腎上腺素能受體或毒孽驗受體所媒介 之醫療症狀，意即經由以岛腎上腺素能受體激動劑或毒葦 鉍又月丑拮心劑治療而被改善之醫療症狀。此種醫療症狀係 為-般熟諳此項技藝者所習知，如以峡等人，萘拿、受 μ μ φ μ .；έ # ^ ； DN&p 1〇(8χ 462_469 (ΐ997)； Em_iien α賢上腺素受Μ激動劑與拮抗劑之當前治療用途與 署力’及即辦以㈤户53⑹，3的賴㈣…及其中所 引述參考資料之陳述内容為例。此種醫療症狀，舉例言之， 係包括肺病，或與可逆氣道阻塞有關聯之疾病，譬如慢性 阻塞肺病(例如慢性與哮鳴枝氣管炎及氣腫）、氣 維變性等。並他疔妝白扛旦立 ’ 八症狀匕括早產、抑鬱、鬱血性心衰竭、皮 膚病（例如炎性、過齡柯 I破f生牛皮癬及增生性皮膚病），盆中 降低胃液素酸度係為所期望之症狀(例如消化與胃潰瘍；， 及肌肉消耗疾病。 :广因此'’於一項具體實施例中’本發明係關於-種治療肺 旦：法此方法包括對需要治療之病患投予治療上有效 二化合物。當用以治療肺病時，本發明化合物典型上 不糟吸入投藥，以每天多 。 週 一、夕…里，以早一曰服劑量或單一每 々又而口 /σ療肺病之劑量係涵蓋從約10微克/ 天至、.々500微克/天之範圍。 二發明方法之一方面，係關於-種治療慢性阻塞肺病 或乳喘之方法，此方法包括 手病患才又予治療上有效量之式j 120149 -44 - 200811105 化合物。一般而言，治療c〇pD或氣喘之劑量係涵蓋從約ι〇 微克/天至約500微克/天之範圍。，，c〇pD”一詞係為一般熟諳 此藝者所明瞭，包括多種呼吸症狀，包括慢性阻塞枝氣管 炎與氣腫，如以Bames，熳尨庳差摩免••仏g/ j她< 2〇〇〇 : 343: 269-78，及其中所引述參考資料之陳述内容為例。 §藉吸入投藥時，本發明化合物典型上具有產生枝氣管 擴大之作用。因此，在本發明方法之另一方面，係關於一 種在哺乳動物中產生枝氣管擴大之方法，此方法包括對哺 乳動物投予枝氣管擴大作用產生量之式j化合物。一般而 口，產生枝氣管擴大作用之劑量係涵蓋從約1〇微克/天至約 5〇〇微克/天之範圍。

當作為治療劑使用時，本發明化合物係視情況併用另一 種或多種治療劑一起投藥。特定言之，經由將本發明化合 物與類固醇消炎劑一起投藥，三重療法，意即岛腎上腺^ 能党體激動劑活性、毒蕈鹼受體拮抗劑活性及消炎活性， 可僅使用兩種治療劑達成。由於含有兩種治療劑之醫藥組 。物（與組合），與含有三種治療劑之組合物比較，典型上 較易於調配及/或投藥，故此種兩成份組合物係提供勝過含 有三種治療劑之組合物之一項重要優點。 6 — 口此，在一項特 疋具體實施例中，本發明之醫藥組合物、 、、丑δ及万法係進 一步包含類固醇消炎劑。 由於本發明化合物同時具有戍腎上腺 主一 ’丁、月匕激動劑活性與 毒葦驗受體拮抗劑活性，故此種化合物亦 一 」介馮所艽工具 使用，以探查或研究具有啟腎上腺素能受一 人to或毋覃驗受體 120149 -45 - 200811105 之生物糸統或試樣。此外， 以發現例如同時呈有P上^ 物可用於筛選檢測， 4 ’、 r、能激動劑活性與毒蕈鹼受 體拮抗糾活性之新丨g彳卜入从 …… 物。此種生物系統或試樣可包含 岛月上腺素月色雙體及/式盖装 讀受體。具有爲腎上腺素能及 /或毋覃鹼X體之任何商杏 , ^ , 田 糸統或試樣，均可被採用於 此種研九中’其可益兮人專. j無响疋在活體外或活體内進行。適合此 種研究之代表性生物李_ # ^ 不、、充或成樣，包括但不限於細胞、細 也卒取物、漿膜、組織試樣 g礼動物（譬如老鼠、大白鼠、 天三既、兔子、狗、豬等）等。 當作為研究工具使用時，並 ., 〇孓上係使包含历腎上腺素能 叉體及/或毒蕈驗受妒夕吐4 ^ 且、物乐、’先或試樣，與/¾腎上腺素能 受體催動或毒蕈鹼受妒抽浐θ 早双又紅扣抗1之本發明化合物接觸。藉此 化合物所造成對生物♦缔武 先成5式樣之作用，係接著使用習用 程序與没備在哺乳動物中 勒物中測疋或度量，譬如藉由度量放射 配位體結合檢測中夕么士人 人 η 、之、、、° 5，或功能性檢測中之配位體所媒 介之改變’或藉由在枝氣管保護檢測中測定由化合物所提 :之枝^管保護量。在功能性檢測中之代表性配位體所媒 之改變，係包括在胞内環腺苷單磷酸（cAMP)中之配位體 斤某^丨之改又，在酵素腺甞基環化酶（其會合成cAMP)之活 丨上之配位版所媒介之改變；在鳥σ票吟核糖甚办(硫基）三 磷酸鹽（[35 S]GTP S)經由[35 S]G丁p s對咖之受體催化交換， 摻入經單離細胞膜中，配位體所媒介之改變；在自由態胞 内赶離子上配位體所媒介之改變（例如，以得自Molecular Devices公司之螢光連結成像板讀取器或FLipw度量）等。預 120149 -46- 200811105 期本發明化八你yu j _ ' 〇 在本文列示之功能性檢測中或在類似性質 之檢測中，合俏私斗、4丄、^ s 、 、9 力或^成怂月上腺素能受體之活化作用， 口或卜低毋覃驗受體之活化作用。本發明化合物典型 將在、力0.1笔微莫耳濃度至約1〇〇毫微莫耳濃度範圍之濃 度下，使用於此等研究中。 此外本發明化合物可作為研究工具使用，以評估其他 化子化D物。在本發明之此方面，式〗化合物係在一項檢測 :作為標準物使用，以允許以待測化合物與式I化合物所獲 付、·Ό果之比較。例如，係將關於一種待測化合物或一組待 、J化& ,物之/?2月上腺素能受體及/或毒蕈驗受體結合數據 (例如田藉活體外放射配位體置換檢測測定時），與關於式I 化口物之万2腎上腺素能受體及/或毒蕈鹼受體結合數據作 比較，以確認此等待測化合物具有所要之結合，意即待測 化合物具有約等於或優於式I化合物之結合，若具有時。或 者，例如枝氣管保護作用可在枝氣管保護檢測中，於哺乳 動物中’對待測化合物與式I化合物測定，並比較此數據， 以確認待測化合物提供約等於或優越枝氣管保護作用。本 發明之此方面’作為個別具體實施例，係包括（i)比較數據 之產生（使用適當檢測）與（ii)試驗數據之分析兩者，以確認 吾人感興趣之待測化合物。 本發明化合物之性質與利用性可使用一般熟諳此藝者所 習知之各種活體外與活體内檢測証實。例如，代表性檢測 係進一步詳述於下述實例中。 120149 -47- 200811105 實例 提供下述製備與實例，以說明本發明之特殊具體實施例 與諸方面。但是，特殊具體實施例與諸方面之說明，並不 意欲以任何方式限制本發明之範圍，除非明確地指出。 於下述實例中使用之全部試劑、起始物質及溶劑係購自 市售供應商（譬如Aldrich、Fluka、Sigma等），且使用之而無 需進一步純化，除非另有指出。 在下述實例中，HPLC分析典型上係使用Agilent (Palo Alto, CA)系歹ij 1100儀器進行，具有Zorbax Bonus RP 2.1 x 50毫米管 柱，由Agilent提供（C14管柱），具有3.5微米粒子大小。偵測 係藉由214毫微米下之UV吸光率。流動相’’Α"為2%乙腈、 97.9%水及0.1%三氟醋酸（ν/ν/ν);而流動相ΠΒ”為89.9%乙月t、 10%水及0.1%三氟醋酸（v/v/v)。HPLC (10-70)數據係以流率0·5 毫升/分鐘，10%至70%流動相Β梯度液，歷經6分鐘期間獲 得；HPLC (5_35)數據係以流率0.5毫升/分鐘，5%至35%流動 相Β梯度液，歷經5分鐘期間獲得；及扭>1^(10-90)數據係以 流率0.5毫升/分鐘，10%至90%流動相Β梯度液，歷經5分鐘 期間獲得。 液相層析法質量光譜法（LCMS)數據典型上係以應用生物 系統（Foster City, CA) APM50EX 型儀器獲得。LCMS 10-90 數據係 以10%至90%流動相B梯度液，歷經5分鐘期間獲得。 小規模純化典型上係使用得自應用生物系統（Applied Biosystems)之API 150EX Perp工作站系統進行。流動相ΠΑΠ為含 有0.05%三氟醋酸（ν/ν)之水；而流動相ΠΒΠ為含有0.05%三氟 120149 -48 - 200811105 醋酸（v/v)之乙腈。 回收之試樣

升/分鐘流率；30分鐘梯度液 。對於小试樣（約3至50毫克經 /、型上係使用下列條件：60毫 -，及41.4 毫米 x25〇 毫米 Micr〇s〇rb BDS官柱，具有1〇微米粒子（Varian，pai〇論〇,以）。 實例1 聯苯-2-基胺甲基酸六氫p比咬—4-基酉旨 將2-異氰酸聯苯酯（97.5克，521亳莫耳）與4_羥基小芊基六 氫吡啶（105克，549毫莫耳）（兩者均可市購得自Aldrich， Milwaukee, WI))於70t下一起加熱12小時，於此段時間内， 聯苯-2-基胺甲基酸1-芊基六氫吡啶4基酯之形成係藉lcms 監測。然後，使反應混合物冷卻至50°C，並添加乙醇（1升）， 接著慢慢添加6M鹽酸（191毫升）。然後，使反應混合物冷卻 至環境溫度，並添加甲酸銨（98.5克，1·56莫耳），且使氣氣 激烈起泡經過此溶液20分鐘。接著添加絶（1〇重量％ (乾重 為基準），於活性碳上）（20克）。將反應混合物在4〇°c下加熱 12小時，然後經過;5夕藻土墊過濾、。接著在減壓下移除溶劑， 並將1M鹽酸（40毫升）添加至粗製殘留物中。然後添加氮氧 化鈉（10N)，以調整pH至12。將水層以醋酸乙酯（2 X 15〇毫升） 萃取，並脫水乾無（硫酸鎮）’接著於減壓下移除溶劑，獲 得聯苯-2-基胺甲基酸六氫吡啶基酯（155克，1〇〇%)。ΗΡΐχ (10-70) Rt= 2.52 ; MS m/z : [M+H+]對 C18H2〇N2〇2 之計算值 120149 -49 - 200811105 297·15 ;實測值 297.3. 實例2 3-[4_(聯苯-2-基胺曱醯基氧基）六氫吡啶小基】丙酸 於聯苯-2-基胺曱基酸六氫吡啶冬基酯（5〇克，67.6毫莫耳） 在二氯.曱烷（500毫升）中之溶液内，添加丙烯酸（15 〇5毫升， 100宅莫耳）。將所形成之混合物在50°C及回流下加熱18小 時’然後移除溶劑。添加曱醇（600毫升），並將此混合物於 75°C下加熱2小時，接著冷卻至室溫，以形成濃稠漿液。藉 過渡收集固體，以甲醇（5〇毫升）洗滌，及風乾，而得3-[4_(聯 苯冬基胺曱醯基氧基）六氫吡啶小基]丙酸（61克，96()/。純度）， 為白色粉末。 實例3 N-{5-[(R)-2-胺基小(第三-丁基二甲基矽烷基氧基）乙基】_2_經苯 基卜甲醯胺醋酸鹽 步驟A - N-{5-[(R)_2_苄胺基小(第三-丁基二甲基矽烷基氧基） 乙基]-2-芊氧基苯基}甲醯胺 於500毫升三頸圓底燒瓶中，添加队{2-芊氧基各溴基 -1-(弟二-丁基一甲基石夕烧基氧基）乙基]苯基}曱酸胺（1〇〇克， 215毫莫耳）與N-甲基-2-四氫吡咯酮（300毫升）。添加芊胺 (69·4毫升，648莫耳），並將反應混合物以氮沖洗。接著， 將反應混合物加熱至90°C，並攪拌約8小時。然後，使反應 混合物冷卻至室溫，且添加水（1.5升）與醋酸乙酯（ι·5升）。 分離液層，並將有機層以水（500毫升），水與飽和鹽水之】：1 混合物（總計500毫升），接著再一次以水（5〇〇毫升）洗滌。然 120149 -50- 200811105 後，使有機層以無水硫酸鎂脫水乾燥，過濾，及在減壓下 濃縮，以提供粗製N-{5-[(R)冬苄胺基小(第三·丁基二甲基石夕 烷基氧基）乙基]-2-芊氧基苯基}曱醯胺（100克，90%產率， 75-80%純度），為橘褐色濃稠油。 步驟B - N]5-[(R)-2-胺基小(第三-丁基二曱基矽烷基氧基）乙 基]-2-羥苯基甲醯胺醋酸鹽 使粗製N-{5‘[(R)-2-芊胺基-1-(第三-丁基二甲基矽烷基氧基） 乙基]-2-+氧基苯基}曱醯胺（1〇〇克，194毫莫耳）溶於曱醇（1 升）與醋酸（25亳升，291毫莫耳）中。將所形成之混合物以乾 無氮;條氣’然後添加碳上之氫氧化纪（2〇克，20重量％，約 50°/〇水）。使氫起泡經過反應混合物，並在室溫下攪拌約1〇 小時。接著’將混合物以乾燥氮滌氣，並使混合物經過石夕 藻土過濾。使濾液於迴轉式蒸發器上濃縮，且將醋酸乙酯 (600毫升）添加至殘留物中。將此混合物攪拌約2小時，此 時已發展成濃稠黃色漿液。過濾漿液，並使沉澱物風乾， 以提供N-dR)-2-胺基小(第三-丁基二甲基矽烷基氧基）乙 基]-2-經苯基}甲醯胺醋酸鹽（仙克，98〇/。純度），為黃白色固 體。LCMS (10-70) Rt= 3.62 ; [M+H+]實測值 311.3. 實例4 聯苯-2-基胺甲基酸142_(4][(R)-2普曱醯胺基冰羥苯基經乙 基胺基]甲基}-2,5-二甲基苯胺甲醯基）乙基】六氫吡啶冰基酯 步驟A - 2,5-二甲基-4-硝基苯甲酸甲酯 於2,5-二甲基-4-硝基苯甲酸（48〇毫克，2·4毫莫耳）在無水甲 醇（8.2毫升）中之經攪拌溶液内，在〇〇c及乾燥氮下，添加二 120149 200811105 氯化亞硫醯（0.538毫升，7·38毫莫耳）。使所形成之混合物溫 熱至室溫，並攪拌約7小時。添加另外之二氯化亞硫醯（〇 3〇〇 笔升），並在至溫下持續擾拌過夜。於減壓下移除溶劑，並 使殘留物溶於醋酸乙酯中。將此溶液以飽和碳酸氫鈉水溶 液洗滌，以無水硫酸鈉脫水乾燥，及在減壓下濃縮，以提 供2,5-二甲基冬硝基苯甲酸曱酯（578毫克），為淡黃色固體。 HPLC (10-70) 4.61; 1H NMR (300 MHz，CDC13) 5 2·57 (3¾ s)5 2.61 (3H，s)，3·94 (3H，s)，7.82 (1¾ s)，7·87 (1H，s). 步驟β - 4-胺基-2,5-二甲基苯甲酸甲酉旨 於2,5-二甲基冰硝基苯甲酸甲酯（523毫克，2 5毫莫耳）在甲 醇與水之9: 1混合物（總計25毫升）中之經攪拌溶液内，在〇 c下，添加氯化銨（4〇1毫克，7·5毫莫耳）。分次添加鋅仏63 克25笔莫耳），並將所形成之混合物於室溫下攪拌過夜。 然後，使反應混合物經過碎藻土過渡，並以甲醇洗務碎藻 土墊。使濾、液在減壓下濃、缩，且使所形成之殘留物溶於醋 ，酸乙酯中。將此溶液以飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，以無水 硫酸鈉脫水乾燥，及在減壓下濃縮，以提供4·胺基办二甲 基苯甲酸甲酯（450毫克），為黃色油。lHNMR (3〇〇廳，⑶⑹ 5 2.14 (3H? s)? 2.53 (3H5 s)5 3.83 (3H5 s)5 3.85 (2H? br s)? 6.48 (1H? s)? 7.72 (1H? s). ’ 步驟C - 4仰-(聯以基胺甲醯基氧基）六氫㈣小基]丙醢 基胺基}-2,5-二甲基苯曱酸甲酉旨 於3-[4-(聯苯-2-基胺曱醯基氧基）六氫说。定小基]丙酸_毫 克’ 1.82毫莫耳）與4_胺基_2,5_二甲基苯甲酸甲錯㈣毫克， 120149 -52 - 200811105 2.18毛莫耳）在一氯曱烧（36毫升）與二異丙基乙胺（0.413毫 升）中之經攪拌溶液内，添加六氟磷酸〇_(7_氮苯并三唑」· 基）-1，1，3,3-四甲基錁（HATU) (829毫克，218毫莫耳）。將所形 成之混合物於室溫下攪拌過夜。然後以飽和碳酸氫鈉水溶 液洗滌混合物，以無水硫酸鈉脫水乾燥，過濾，及在減壓 下濃縮。使殘留物籍矽膠層析純化，以含有3%至甲醇之 二氣曱烷溶離，以提供4_{3_[4•(聯苯冬基胺甲醯基氧基）六氫 吡啶小基]丙醯基胺基卜二甲基苯曱酸甲酯（568毫克，％% 產率）。LCMS (10-70) 4·55 ; [M+H+]實測值 530.4. 步驟D -聯苯士基胺甲基酸Η2_(4_羥甲基二甲基苯胺甲 醯基）乙基】六氫Ρ比唆-4-基酯 於1Μ氫化鋰鋁在THF中之經攪拌溶液（L52毫升，152毫莫 耳）内，在0°C下，添加4-{3-[4-(聯苯-2-基胺甲醯基氧基）六氫 吡啶-1-基]丙醯基胺基}-2,5-二甲基苯甲酸曱酯（4〇〇毫克，〇 76 毫莫耳）。將所形成之混合物於〇它下攪拌3〇分鐘，然後添 加1M氫氧化鈉水溶液（5毫升）與水（5毫升）之2 ·· 2混合物， 並持續攪拌2小時。添加二氯甲烷，並分離有機層，以硫酸 鈉脫水乾燥，及在減壓下移除溶劑。使殘留物藉矽膠層析 純化，以含有5%甲醇之二氯曱烷溶離，以提供聯苯j基胺 曱基酸羥甲基二甲基苯胺甲醯基）_乙基]六氫吡啶 -4-基酯。LCMS (10-70) 3.94 ; [M+H+]實測值 502 5 步驟E -聯苯-2-基胺甲基酸H2-(4-甲醯基_2片二甲基苯胺甲 醯基）乙基]六氫p比咬-4-基酉旨 於聯苯-2-基胺甲基酸1-[2-(4-羥甲基二甲基笨胺甲酿 120149 -53 - 200811105 基）乙基]六氫吡啶斗基醋（151毫克，〇·3毫莫耳）在二氯甲烷 (=毫升）中之溶液内，在(TC下，添加二甲亞仰職升^ *莫耳）與二異丙基乙胺（157微升，〇9毫莫耳）。15分鐘後， 添加二氧化硫吡啶複合物（143毫克，〇 9毫莫耳），並在〇艺 下持續攪拌1小時。添加水，以使反應淬滅，並分離液層。 使有機層以無水硫酸鈉脫水乾燥，過濾，及在減壓下移除 溶劑，獲得聯苯-2-基胺甲基酸H2_(4_甲醯基_2,5_二甲基苯胺 甲im基）乙基]，、氫吡啶_4_基酯（15〇毫克，產率），使用 之而無需進一步純化。[M+H+]實測值500.4· 步驟F -聯苯-2-基胺甲基酸(第三_丁基二甲基矽 烷基氧基）-2-(3-甲醯胺基_4_羥苯基）乙胺基]甲基卜2,5_二甲基 本胺甲醯基）乙基】六氫p比咬冬基酯 將耳外本2-基月女曱基酸μ[2-(4_曱醯基_255-二甲基苯胺甲驢 基）乙基]八氫叶b。疋-4·-基酯（15〇毫克，0.30毫莫耳）與N-{5-[(R)-2-月女基-1-(第二-丁基二曱基矽烷基氧基）乙基pi羥苯基）甲醯 胺（112毫克，〇·36毫莫耳）在二氣曱烷與曱醇之1:丨混合物 (總計3·0毫升）中之溶液，於室溫下攪拌3〇分鐘。添加三乙 醯氧基硼氫化鈉（191毫克，〇·9毫莫耳），並將所形成之混合 物於室溫下攪拌過夜。添加醋酸，以使反應淬滅，且使混 合物在減壓下濃縮，獲得聯苯：基胺曱基酸(第 二-丁基一曱基碎烷基氧基）_2_(3_甲醯胺基羥苯基）乙胺基] 甲基卜2,5-二甲基苯胺曱醯基）_乙基]六氫吡啶基酯，使用 之而無需進一步純化。LCMS (10-70) Rt= 4.55 ; [M+H+]實測值 794.6. 120149 -54 - 200811105 步驟G -聯苯1基胺甲基酸^[2-(44(11)-2-(3-甲醯胺基·4邊苯 基Η-經乙基胺基】曱基卜2,5-二曱基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡 啶-4-基酯 於聯苯-2-基胺曱基酸μ[2_(4_{[(Ιι)-2-(第三-丁基二曱基石夕烧 基氧基）-2-(3-曱醯胺基冰羥苯基）乙胺基]甲基卜2,5-二曱基苯 胺曱醢基）—乙基]六氫吡啶-4-基酯（238毫克，0.30毫莫耳）在二 氯曱烧（3·0毫升）中之懸浮液内，添加三乙胺三氟化氫（147 微升0.90毫莫耳）。將此混合物於室溫下攪拌過夜，然後， 使混合物在減壓下濃縮。使殘留物藉預備之純化 (梯度液：水中之2至50%乙腈，具有0.05% TFA)。收集適當 溶離份，且合併，及凍乾，獲得聯苯冬基胺曱基酸 l-[2-(4-{[(R)-2-(3-曱醯胺基羥苯基）-2-羥乙基胺基]曱基}-2,5- 一甲基笨月女曱醒基）乙基]六氫？比咬冰基酷，為二（三氟錯酸 鹽）(5〇 毫克，97°/。純度）。LPLC (2-90) Rt= 2.76 ; [M+H+]實測值 680.8. 實例5 聯苯-2-基胺甲基酸1-[2_(4_{[(11) 曱醯胺基冬羥苯基）_2_羥 乙基胺基]甲基卜2,5-二曱基苯胺曱醯基）乙基】六氫吡啶基 酯 步驟A -二苄基碘基-2,5-二甲基苯基）胺 於衣有木空报拌器、溫度控制及添液漏斗之2升圓底燒 瓶中’添加4-碘基'5-二曱苯胺（loo.o克，0.405莫耳）（得自 Spectia集團有限公司，Millbury，OH)。添加乙醇（1升）與固體碳 酸鉀（160克，U59莫耳），然後以一份添加不含溶劑之溴化 120149 -55- 200811105 下（140笔升，U79莫耳）。將所形成之混合物於30°C下攪拌 約18小4 ’此時HPLC顯示大於娜之轉化率。接著，使混 e物7卻至至μ，並添加己烷（丨升）。將此混合物攪拌υ分 鐘，然後經過濾、紙過遽，以移除固體，且以己烧（200毫升） 洗滌濾、餅。使用迴轉式蒸發器，錢液之體積降至約鄉毫 升二及添加濃鹽酸（3〇毫升）。然後，將殘留溶劑使用迴轉 式蒸發器移除。於所形成之殘留物中，添加己烷（5〇〇毫升）， 並將此混合物攪拌約3〇分鐘，此時，自由流動性漿液已形 成。過濾漿液，並以己烷（2〇〇毫升）洗滌滤餅，及乾燥，以 提供二芊基破基_2,5_二曱基苯基）胺鹽酸鹽（出克，產 率’ 97.5%純度），為帶有綠色之固體。 將二芊基-(4-峨基_2>二f基苯基）胺鹽酸鹽轉移至3升燒 瓶中，並添加甲苯（1升）與_氫氧化鈉水溶液（丨升）。將所 形成之混合物攪拌i小時，然後分離液層。將有機層以稀鹽 水（500毫升）洗滌，並藉迴轉式蒸發移除溶劑，以提供二苄 基-(44基-2,5-二甲基苯基）胺⑽克），為半固體濃稠油（或 者，於此步驟中可使用二氯甲烷取代甲苯）。1hnmr (3⑻ MHz，DMS〇-d6) 5 2·05 (3H，s)，2·19 (3H，s)，3.90 (4H，s)5 6.91 (1¾ s) 7.05-7.20 (10H，m)，7·42 (1H，s) ; MS [M+H+]實測值 428 步驟B - 4-二爷基胺基_2,5_二甲基苯甲醛鹽酸鹽 於裝有架空攪拌器、溫度控制及添液漏斗之丨升3頸圓底 燒瓶中，添加二苄基-(4嘁基_2>二甲基苯基）胺（15克，”毫 莫耳）。添加甲苯（300宅升），並將所形成之混合物攪拌約u 分鐘。將反應燒瓶以乾燥氮滌氣，並冷卻至約·2〇c>c，且麫 120149 >56- 200811105 由添液漏斗逐滴添加己烧中之1·6Μ正-丁基鐘（33毫升，53 毫莫耳）。在添加期間，反應混合物之内部溫度係被保持低 於-l〇°C。當添加完成時，將所形成之混合物在約下搜 拌15分鐘。然後逐滴添加n，N-二曱基甲酿胺（1〇毫升，丨29毫 莫耳），同時保持内部反應溫度低於〇°C。接著，將所形成 之混合物在-20°C至0°C下授拌約1小時。然後添加iM鹽酸水 溶液（200毫升），歷經5分鐘期間，且將所形成之混合物搜 拌15分知。接著分離液層，及以稀鹽水（1⑻毫升）洗滌有機 層。然後’使有機層以無水硫酸納脫水乾燥，過濾，及在 減壓下移除溶劑，以提供4_二芊基胺基二曱基苯甲醛鹽 酸鹽（11.5克，90%產率，95%純度），為濃稠油，其係於靜 置時固化。產物含有約3至5%脫碘基副產物。1 η nmR (3⑻ MHz? CDC13) 5 2.42 (3H? s)5 2.50 (3H? s)5 4.25 (4¾ s)? 6.82 (1¾ s)3 7·10-7·30 (10H，m)，7·62 (1H，s)5 10_15 (1H，s) ; MS [M+H+]實測值 330.3. 步驟C - 4-[l，3]二氧伍圜|基-2,5_二甲基苯胺 於500耄升圓底燒瓶中，添加‘二芊基胺基_2,5_二甲基苯 甲搭鹽酸鹽（11.5克，3!·4毫莫耳）與甲苯（15〇毫升），並將所 形成之混合物攪拌，直到鹽完全溶解為止。然後，將反應 k瓶以乾“氮條氣5分鐘。添加乙二醇（5.25毫升，94.2毫莫 耳）人對甲笨；酸（76〇毫克，6 2毫莫耳），並將所形成之混 合物在6CTC至8(TC下加熱約2〇小時。接著在4〇。〇下，於迴轉 式洛發為上t艾慢移除溶劑（歷經約4〇分鐘）。將曱苯（1〇〇毫 升）添加至殘留物中，並在4〇°C下，於迴轉式蒸發器上再一 120149 -57- 200811105 次慢慢地移除溶劑。使用另一液份之甲苯（100毫升）重複此 程序’並使混合物蒸發至乾涸。將醋酸乙酯（150毫升）與飽 和碳酸氮納水溶液（100毫升）添加至殘留物中，且分離液 層。將有機層以鹽水（50毫升）洗滌，然後以無水硫酸鈉脫 水乾燥’過濾，及在減壓下濃縮，以提供粗製二芊基-(4-[1，3] 二氧伍圜-2-基-2,5-二曱基-苯基）胺（11·4克）。 使粗製二爷基-(4^3]二氧伍圜-2-基-2,5-二甲基-苯基）胺溶 於乙知與水之2 : 1混合物（總計15〇毫升）中，並將所形成之 心合物以乾燥氮滌氣5分鐘。添加鈀/碳（2.3克，10重量％， 含有約50%水）與固態碳酸氫鈉（1〇克），並使所形成之混合 物在約1大氣壓之氫氣及25它至3〇它下氫化約8小時。然後， 使混合物經過矽藻土過濾，並於迴轉式蒸發器上濃縮濾液， 以提供粗製4-[1，3]二氧伍圜基-2,5·二曱基苯胺（5·6克，92% 產率），為濃稠油。i H NMR (300 MHz, DMS〇-d6) 5 2·05 (3Η，s)， 2.22 (3Η，s)，3.7-3.9 (4Η，m)5 3.95 (4Η，s)5 5.59 (1Η，s)，6.72 (1¾ s)5 7.0-7.25 (11H5 m). 步驟D - NMWj]二氧伍圜1基二甲基苯基）丙烯醯胺 於500毫升圓底燒瓶中，添加粗製‘[以]二氧伍圜冬基_2,5_ 二〒基苯胺（5.6克，29毫莫耳）、二氯〒烷（1〇〇毫升）及二異 丙基乙胺（7.6毫升，43·5毫莫耳）。將所形成之混合物於室溫 下稅拌直到成伤，谷解為止，然後，使混合物冷卻至〇。〇。 接著逐滴添加氯化丙烯醯（2·35毫升，29毫莫耳），歷經5分 鐘期間。將反應混合物在(TC至下搜拌i小日夺，接著添加 水（50毫升），並持續攪拌約30分鐘，此時微細固體已形成。 120149 〇8- 200811105 過:慮混合物，卩收集固體。然後分離遽液層，並使有機層 在減塵下〉農縮至乾酒。將二氣甲炫⑼毫升）添加至殘留物 中，且將此混合物㈣，直到自由流動性漿液已發展為止。 過濾漿液（使用收集上文微細固體之相同漏斗），並以二氯 甲烧（1〇毫升）洗務濾'餅，及乾燥’以提供N-(4-[l，3]二氧伍圜 -2-基-2,5-二甲基苯基）丙烯醯胺卩丨克’ 97%純度），為白色至 灰白色固體。 然後，使得自上文之濾液蒸發至乾涸，並將甲醇（iq毫升） 添加至殘留物中。將此混合物攪拌15分鐘，接著藉過濾收 集》儿渴又物，以甲醇P毫升）洗滌，並乾燥，獲得第二份收取 產物之N-(4-[l，3]二氧伍圜基-2,5-二曱基苯基）丙烯醯胺（〇·8 克，95% 純度）。1 H NMR (3〇〇 MHz，Cd3 〇D) $ 2 1〇 (3H，s)，2 23 (3Ή， s)，3.85-4.10 (4Η，m)，5.60-6.40 (3Η，m)，5.59 (1Η，s)，7·18 (1Η，s)5 7·23 (1H，s)· 步驟E -聯苯-2-基胺曱基酸l-[2-(4-曱醯基-2,5_二甲基苯胺曱 醯基）乙基]六氫吡啶冰基酯鹽酸鹽 於5〇毫升圓底燒瓶中，添加聯苯-2-基胺曱基酸六氫吡啶 -4-基酯（1.2克，4.04毫莫耳）與N-(4-[l，3]二氧伍圜-2-基-2,5-二曱 基苯基）丙烯酿胺（1.0克，4.04毫莫耳）。添加乙醇（1〇毫升） 與二氯甲烷（10毫升），以形成漿液。將反應混合物在45°C至 5〇°C下加熱約18小時，然後冷卻至室溫。添加1M鹽酸水溶 液（10毫升），並將所形成之混合物激烈攪拌約3小時。添加 二氣曱烷（10毫升），且將所形成之混合物攪拌約5分鐘。接 著分離液層，並使有機層以無水硫酸鈉脫水乾燥，過濾， 120149 -59- 200811105 及於迴轉式蒸發器上濃縮，以提供粗製聯苯-2-基胺曱基酸 甲醯基-2,5-二曱基苯胺曱醯基）乙基]六氫吡啶-4-基酯 鹽酸鹽（1.9 克）。4 NMR (300 MHz, DMSO-d6) (5 1.2-1.4 (2H，m)， 1.58-1.75 (2H? 2.0-2.17 (2H? m)5 2.19 (3H? s)? 2.38 (3H? s)? 2.41-2.50 (4H，m)，2.5-2.75 (2H，m)，4.31-4.42 (1H，m)，7.10-7.35 (9H，m)，7·55 (1H， s)，7·75 (1H，s)5 8.59 (1H，s)，9·82 (1¾ s)5 9·98 (1H，s) ; MS [M+H+]實 測值500.2. 步驟F -聯苯-2-基胺曱基酸i-[2-(4-{[⑻-2-(第三-丁基二甲基矽 烷基氧基）-2-(3-曱醯胺基冰羥苯基）乙胺基】曱基}-2,5-二甲基 苯基-胺甲醯基）乙基]六氫p比咬冬基酉旨 於2升三頸圓底燒瓶中，添加聯笨_2_基胺曱基酸μ[2_(4_曱 酸基-2,5-二甲基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶斗基酯鹽酸鹽 (38克’ 70毫莫耳）與N-{5-[(R)-2-胺基+(第三-丁基二曱基矽烷 基氧基）乙基]-2-羥苯基}曱醯胺醋酸鹽（33 6克，91毫莫耳）。 添加二氯甲烷（5〇〇毫升）與甲醇（5〇〇毫升），並將所形成之混 合物於室溫及乾燥氮下攪拌約3小時。然後，使反應混合物 冷部至0 C至5 C，並分次添加固體三乙醯氧基硼氫化鈉 (44.5克，381毫莫耳），歷經1〇分鐘期間。使反應混合物自〇 C慢慢溫熱至室溫，歷經約2小時期間，然後冷卻至此。 〜加飽和妷酸氫鈉水溶液（5〇〇毫升）與二氯曱烷（5〇〇毫升）。 將此混合物充分攪拌，接著分離液層。以鹽水⑻毫升）洗 條有機層，以無水硫酸納脫水乾燥’過濾，及在減壓下濃 、♦伯，獍侍粗製聯苯、2-基胺甲基酸[⑻第三—丁基二 甲基矽烷基氧基）：(3砰醯胺基斗羥苯基）乙胺基]甲基}_2,5一 120149 -60- 200811105 一甲基苯胺曱酿基）-乙基]六氫吡啶冰基酯（55克，86〇/〇純 度），為黃色固體。 使粗產物（30克）溶於含有2〇/〇曱醇之二氯甲烷（總計15〇毫 升）中，並I載至矽膠管柱（3〇〇克）上，該管柱已經以含有2% 甲醇與0.5〇/〇氫氧化銨之二氯曱、院裝填及達成平衡。使產物 自官柱溶離，使用含有2%曱醇與〇5%氫氧化銨之二氯曱烷 (1升）·’含有4%曱醇與〇·5%氫氧化銨之二氯曱烷（1升），及含 有5 /〇甲g子與〇·5〇/0氫氧化銨之二氯曱烷（約3升）。收集溶離 伤（200笔升），並合併此等具有純度大於州％之溶離份，及 在減壓下辰縮，以提供聯苯基胺甲基酸(第三 丁基一甲基石夕烧基氧基）-2-(3-甲醯胺基冰經苯基）乙胺基]甲 基} 2,5 —甲基苯胺甲醯基）_乙基]六氫呲啶_4_基酯（2ι·6克， 96·5/。純度），為帶黃色固體。MS [μ+η+]實測值794·6· 步驟G聯笨-2-基胺甲基酸甲醯胺基冰經苯 基>2-羥乙基胺基】甲基}_2>二甲基苯基_胺甲醯基）乙基]六 氫吡啶_4-基酯氟化氫鹽 於1升圓底燒瓶中，添加聯苯-2_基胺甲基酸Η2_(4_{[(κ)_2_ (第一丁基一曱基矽烷基氧基）_2_(3_甲醯胺基I羥苯基）乙胺 土] f基} 2,5 一 $基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶4基酯⑺·5 克’ 27.1毫莫耳）與二氣甲烧_毫升）。將所形成之混合物 於室溫下搜拌，直到成份溶解為纟，然後添加三乙胺三氣 化氫’毫升，54.2毫莫耳），並將所形成之混合物於洗 下攪拌約48小時。於迴轉式蒸發器上移除溶劑，以提供濃 稠糊劑。將二氯甲烧（100毫升）與醋酸乙酯（2〇〇毫升）添加至 120149 -61 - 200811105 糊劑中，並將所形成之混合物攪拌3〇分鐘。於乾燥氮下慢 慢過濾所形成之漿液，且以二氯〒烷與醋酸乙酯之1: 2混 合物（總計100毫升）洗滌濾餅，在氮氣下乾燥2小時，接著 於真空下乾综過仪，以提供聯苯：基胺甲基酸 (3-甲醯胺基斗羥苯基）：經乙基胺基]甲基卜2,5-二甲基苯胺 甲酿基）乙基]六氮说咬-4-基g旨，為氟化氫鹽（25克，96.9%純 度），其為硬質黏土狀固體。MS [M+H+]實測值680·8· %步驟Η —聯苯各基胺甲基酸H2-(4][(R)士(3_甲醯胺基冰羥苯 基羥乙基胺基】甲基二甲基苯胺甲醯基）_乙基]六兔 峨淀-4-基酯 使聯苯-2-基胺甲基酸H2_(4_{[(R)_2_(3_曱醯胺基斗羥苯 基>2-經乙基胺基]甲基}-2,5-二曱基苯胺曱醯基）乙基]六氫咐 啶-4-基S旨I化氫鹽（25克）於6英吋逆相管柱（Micr〇s〇rb固相） 上，以三等份批次純化，使用乙腈在水中之1〇%至5〇%混合 物3有1 /〇 一氣醋酸，作為流動相。合併具有大於娜純 )度之溶離份，然後以一份體積之水稀釋。使所形成之混合 物冷卻至ot:，並添加固態碳酸氫鋼，直到混合物之pH值約 至8.0為止在約5分鐘内，發展成白色聚液。將此聚液 攪拌〇刀釦然後過濾。以水（5〇〇毫升）洗蘇遽餅，風乾約 4小時，接著在真空中乾燥過夜，以提供聯苯絲胺曱基酸 H2-(4-{[(R)_2-(3_甲酿胺基冰經苯基）么經乙基胺基]〒基卜 二甲基苯基-胺甲醯基）乙基]六氫吡啶-4-基酉旨(12克，99+%純 度）’為半結晶性自由態鹼。 120149 -62- 200811105 實例6 聯苯-2-基胺曱基酸^[2廿{[(R)-2_(3-甲醯胺基冬羥苯基）_2_經 乙基胺基]甲基卜2,5-二甲基苯胺甲醯基）乙基】六氫吡啶4基酯 步驟A -聯苯-2-基胺曱基酸二氧伍圜_2_基'&二甲 基苯胺甲醯基）乙基】六氫吡啶_4_基酯 於500毫升圓底燒瓶中，添加聯苯_2_基胺甲基酸六氫吡啶 冰基醋（17.0克，58毫莫耳）與二氧伍圜么基_2,5•二曱 基笨基）丙烯fc胺（13.1克，52.9毫莫耳）。添加乙醇（150毫升） 與二氣曱烷（150毫升），以形成漿液。將反應混合物在5〇。〇 至55 C下加熱約24小時，然後冷卻至室溫。於迴轉式蒸發 态上移除大部份溶劑，而造成濃稠漿液。添加乙醇（試藥 級）’以形成總體積為約2〇〇毫升，並將所形成之混合物加 熱至80°C，然後慢慢冷卻至室溫。過濾所形成之濃稠白色 漿液，以乙醇（20毫升）洗滌，及在真空中乾燥，以提供聯 苯-2-基胺曱基酸1-〇(4-[1，3]二氧伍圜冬基_2,5_二曱基苯胺曱 醯基）乙基]六氫吡啶|基酯（23.8克，約98%純度），為白色固 步驟B -聯苯-2-基胺甲基酸曱醯基-2,5-二曱基苯基_胺 曱酿基）乙基】六氫p比咬-4-基酉旨 於500耄升圓底燒瓶中，添加聯苯基胺曱基酸^[^(^[ι，〕] 二氧伍圜-2-基-2,5-二曱基笨胺曱醯基）乙基]六氫吡啶斗基酯 (15克，27.6毫莫耳）與乙腈（15〇毫升），以形成漿液。添加21^ 鹽酸水溶液（75毫升），並將所形成之混合物於3〇它下搜拌工 小時。然後，使混合物冷卻至室溫，並添加醋酸乙酯（15〇 120149 -63 - 200811105 毫升）。添加2M氫氧化鈉水溶液（75毫升），確認pH值，接 著添加另外之2M氫氧化鈉，直到溶液之pH值係在9至1〇之 範圍内為止。分離液層，且以稀鹽水（75毫升；1 ·· 1鹽水/ 水）洗滌有機層，以無水硫酸鈉脫水乾燥，及在迴轉式蒸發 器上移除溶劑，獲得聯苯基胺甲基酸μ[2-(4-甲醯基_2,5-二 甲基苯基-胺甲醯基）乙基]六氫吡啶_4_基酯（12.5克，約98%純 度）。若需要，則此中間物之純度可藉由以乙醇（3份體積之 乙醇）形成漿液’將漿液加熱至8〇°C，接著慢慢冷卻至室 溫，及藉過濾單離而增加。 步驟C -聯苯-2-基胺甲基酸(第三_丁基二甲基矽 烧基氧基）-2-(3-甲醯胺基冰羥苯基）乙基亞胺基]甲基二 曱基-苯胺曱酼基）乙基]六氫吡啶_4_基酯 於250毫升圓底燒瓶中，添加聯苯-2-基胺曱基酸1-[2-(4-甲 酿基二甲基苯胺曱醯基）乙基]六氫吡啶-4-基酯（7.1克， 14.2笔莫耳）與n_{5-[(R)-2-胺基小(第三-丁基二甲基矽烷基氧 基）乙基]-2’笨基}甲醯胺醋酸鹽（5·8克，15·6毫莫耳）。添加

甲醇（100宅升），以形成漿液，並將此混合物在45°C至50°C 及氮氣下攪拌1小時。然後，使混合物冷卻至室溫，並添加 甲苯（50宅升），且在溫度範圍從35它至45ι下，於迴轉式蒸 發器上移除溶劑。將曱苯（50毫升）添加至殘留物中，並移 除溶劑’以提供聯苯么基胺曱基酸么(第三-丁基 二甲基碎烧基氧基）_2_(3-甲醯胺基冬羥苯基）乙基亞胺基]甲 基}-2>二甲基苯胺曱醯基）乙基]六氫吡啶-4-基酯（12克），為 黃橘色固體。 120149 -64 - 200811105 步驟D -聯苯-2-基胺曱基酸i-[2-(4-{[(R)-2-(第三-丁基二曱基矽 烷基氧基）-2-(3-甲醯胺基-4-羥苯基）乙胺基j曱基}-2,5-二甲基 苯基-胺曱醯基）乙基]六氫吡啶_4-基酯 於氫化作用燒瓶中，添加聯苯-2_基胺曱基酸 (弟二"丁基一曱基石夕烧基氧基）-2-(3-曱酸胺基-4-經苯基）乙基 亞月女基]曱基}-2,5-一甲基苯胺曱酿基）乙基]六氫p比咬基酯 (4.6克）與2-曱基四氫呋喃（50毫升）。將所形成之混合物攪 拌，直到固體溶解（約5分鐘）為止，然後，將混合物以氮條 氣。添加始/碳（920毫克，5重量％，經承載活性碳），並使 混合物在50 psi (帕爾振盪器）下氫化6小時。接著，使混合 物經過矽藻土過濾，並以2-曱基四氫呋喃（10毫升）洗滌矽藻 土。於濾液中，添加硫丙基改質之矽膠（溶液重量之2〇%， Silicyde)，並將此混合物於25〇c至3(rc下攪拌3小時。然後， 使混合物經過矽藻土過濾，及濃縮，以移除溶劑。使殘留 物溶於甲醇（每克殘留物5毫升）中，接著，將所形成之溶液 慢添加至飽和碳酸氫納水溶液與水之經激烈攪拌1。】予 合物（每克殘留物40毫升）中，將所形成之灰白色漿液攪$ 20分鐘，然後過濾。以水（20份體積）洗滌濾餅，風乾3小時’ 接著在真空中’於室溫下乾燥過夜’以提供聯苯冬基胺甲 基酸H2-(4-{[(R)-2-(第三-丁基二曱基矽烷基氧基）_2_(3_甲醯胺 基_4_羥苯基）乙胺基]甲基}-2,5-二甲基苯胺甲醯基）乙基]六氫 口比。定-4-基自旨（80%回收，約96%純度）。 步驟E _聯苯-2-基胺甲基酸1-丨2-(4-{职)_2_(3_甲醯胺基斗羥笨 基）-2-羥乙基胺基]甲基}-2,5-二甲基苯基_胺甲醯基）乙基】六 120149 -65 - 200811105 氫吡啶-4-基酯L-酒石酸鹽 於200耄升圓底燒瓶中，添加聯笨冬基胺曱基酸 H2例[⑻j(第三-丁基二曱基錢基氧基甲酿胺基斗 經苯基）乙胺基]-甲基}办二甲基苯胺甲驢基）乙基]六氮吨 °疋-4-基酯（3.8克，4·8宅莫耳）與2-甲基四氫呋喃㈣毫升）。將 所形成之混合物於室溫下攪拌，直到成份溶解（約15分鐘） 為止，然後添加二乙胺三氟化氫（0.94毫升，5.76毫莫耳）， 並將所形成之混合物於25。(：下攪拌約24小時。於此混合物 中，添加飽和碳酸氫鈉水溶液與水之1 : 1混合物（4()毫升） 及2-甲基四氫呋喃，且將所形成之混合物攪拌，直到固體 溶解為止（溶液pH約8)。分離液層，並將有機層以鹽水（3〇 耄升）洗滌，以無水硫酸鈉脫水乾燥，過濾，及於迴轉式蒸 發器上濃縮。使殘留物溶於2_甲基四氫呋喃（5〇毫升）中，並 添加固體L-酒石酸（650毫克）。將所形成之混合物於25艺至3〇 C下攪拌18小時，然後經過濾紙過濾。以2-甲基四氫呋喃（1〇 愛升）、異丙醇（10毫升）洗滌濾餅，且立即放置在真空下， 以提供聯苯-2-基胺甲基酸i_[2-(4-{[(R)-2-(3-曱醯胺基I羥苯 基）-2-經乙基胺基]甲基卜2>二甲基苯基-胺甲醯基）乙基]六 氫咐啶-4-基酯L-酒石酸鹽（3.7克，>97%純度）。 步驟F -聯苯_2_基胺曱基酸^2-(4-(((11)-2-(3-曱醯胺基j羥苯 基羥乙基胺基]曱基卜2,5-二甲基苯胺甲醯基）_乙基]六氫 吡啶冰基酯 於250毫升圓底燒觀中，添加聯苯_2_基胺甲基酸 H2-(4-{[(R)-2-(3-曱醯胺基-4-羥苯基）-2_羥乙基胺基]T基}-2,5- 120149 -66- 200811105 二甲基苯胺曱酿基）乙基]六氫吡啶-4-基酯L-酒石酸鹽（3 5 克）與曱醇（35毫升）’並將所形成之混合物授拌Μ分鐘。添 加飽和碳酸氫鈉水溶液與水之1 : 1混合物（7〇毫升），歷㉛5 分鐘期間，並持續攪拌2小時。過濾所形成之灰白色漿液， 且以水（20毫升）洗滌濾餅，風乾2小時，接著在真空中乾燥 過夜，以提供聯苯-2-基胺曱基酸H2_(4_{[⑻·2_(3_甲醯胺基斗 經苯基）-2-經乙基胺基]曱基}_2,5_二甲基苯胺甲醯基）_乙基] 六氫吡啶I基酯（2.3克），為半結晶性自由態鹼。 1 Η與13 C NMR光譜係關於聯苯_2·基胺曱基酸 M3-曱醯胺基冬羥苯基）-2-羥乙基胺基]曱基卜2,5-二曱基笨胺 曱酿基）-乙基]六氫吡啶-4-基酯之試樣（22.2毫克，在約〇·75毫 升DMSO-d6中），在環境溫度下，使用JE〇L ECX-4〇〇 NMR光譜 儀獲得： 1 H NMR (400 MHz，DMS〇-d6 )，主要異構物占 9 64 ⑽ 1H)，9 54 (br s，1H)，9.43 (s，1H)，8·67 (s，1H)，8.26 (s，1H)，8.03 (d，J = 1.9，1H)， 7.25- 7.45 (m，9H)，〜7.3 (nd5 1H)，7·07 (s5 1H)，6.88 (dd，J = 8.2, 1·9, 1H)， 6.79 (d，J = 8.2, 1H)，5.15 (bi*，1H)，4.53 (dd，J = 7.3, 4·7, 1H)，4.47 (m， 1H)，〜3.65 與〜3.60 (AB 對，2H)，2.68 (br m，2H)，〜2.59(nd，4H)，2.44(br t，J = 6.5, 2H)，2.20 (s，3H)，〜2.17 (br m，2H)，2.14 (s5 3H)5 1.73 (br5 2H)， 1.44 (br q，J =〜9.0, 2H)· 1 H NMR (400 MHz，DMS〇-d6 )5 較少異構物 ^ 9 64 (br，1H)，9 43 (s，1H)，9.26 (br d，J =〜7.0, 1H)，8.67 (s5 1H)，8.50 (br d，J =〜7.0, 1H)， 7.25- 7.45 (m，9H)，〜7.3 (nd，1H)，7.07 (s，1H)，〜7.07 (nd，1HX 6.95 (dd，J = 8.3, 1.8, 1H)，6.83 (cU = 8.3, 1H)，5.15 (br，1H)，4.47 ㈣ m)，〜3·65 與 120149 -67- 200811105 〜3·60 (AB 對，2H)，2.68 (br m5 2H)，〜2.59 (nd5 2H)，2.44 (br t5 J = 6.5, 2H)，2.20 (s，3H)，〜2.17 (br m5 2H)，2.14 (s5 3H)，1.73 (br，2H)，1.44 (br q， J =〜9·0,2Η)· 13C NMR (100 MHz，DMS〇-d6)，主要異構物 5 170.0，159·9, * 153.9, 145.5, 139.3, 137.6, 135·2, 135.0, 134.8, 133.4, 133.4, 130.2, 130.2, . 128.6, 128.2, 127.8, 127.4, 127.2, 127.0, 126.1，125.7, 125.6, 121.7, 118.6, 114.5, 71.4, 70.0, 57·4, 53·9, 50.3, 50.1，33.7, 30·7, 18.2, 17.5. 13C NMR (100 ΜΗζ，DMSO-d6)，較少異構物们70.0，163.4, 153.9, 147.8, 139.3, 137,6, 135.7, 135.2, 135.0, 134.8, 133.4, 133.4, 130.2, 130.2, 128.6, 128·23 127.8, 127.4, 127.2, 127.0, 126.1，125.7, 123.0, 119.6, 115.6, 71.0, 70.0, 57.3，53.9, 50.3, 50.1，33·7, 30·7，18.2, 17·5· 1 Η與13 C NMR光譜係顯示主要異構物（約82莫耳百分比） 與較少異構物（約18莫耳百分比）之存在，咸認係為由於環 繞-NH-C(0)H鍵之位阻旋轉所造成之旋轉異構物。咸認在主 要異構物中苯基對羰基氧係為同側，而在較少異構物令為 ^ 對側。 實例7 聯苯1基胺甲基酸142_(4_{[(1^2_(3- f醯胺基冰羥苯基-羥 乙基胺基】甲基卜2,5-二f基苯胺甲醯基）乙基】六氫吡啶冬基 酯之形式Π之種晶 使半結晶性聯苯基胺曱基酸H2_(4_{[(R)_2_(3_甲醯胺基+ 羥苯基>2·經乙基胺基]甲基}_2>二甲基苯基_胺甲醯基）乙 基]六氫吡啶-4-基酯（500毫克）溶於甲醇（5〇毫升）中，並添加 水’直到達成濁點為止。將所形成之混合物在坑下授掉3 120149 -68- 200811105 小B守’並藉過滤單離所形成之結晶性物質，以提供結晶性 聯苯冬基胺曱基酸H2_(4__{KR)冬(3-甲醯胺基斗羥苯基經 乙基胺基]曱基}-2,5-二曱基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶冬基 酉曰（420笔克）。此結晶性自由態驗係被測定為具有示差掃描 卡計法（DSC)執跡顯示吸熱流中之吸收峰在約142它至約15〇 °C下；且粉末X-射線繞射（PXRD)圖樣在其他吸收峰中具有顯 著繞射吸收峰，在20值為約20.7±0.3521.6±〇3522.5±〇.3及23.2± 〇·3下。此結晶性自由態鹼形式係稱為形式π。關於此化合 物之形式II及其他結晶性自由態鹼形式之其他資訊係揭示 於與本案同一曰期提出申請之共同歸屬美國專利申請案編 號-（律師案件目錄編號P-222-US1)，及2〇〇6年4月25曰 提出申請之美國臨時申請案號60/794,709中；其揭示内容係 以其全文併於本文供參考。 實例8 聯苯-2-基胺甲基酸印分丨[⑻丨(3_甲醯胺基_4_羥苯基）_2_羥 乙基胺基】甲基卜2,5-二曱基苯胺曱醯基）乙基]六氫吡啶4基 酯之形式II之結晶化作用 於衣有木二授拌窃、溫度控制及添液漏斗之3升三頸圓 底燒瓶中’添加半結晶性聯苯I基胺曱基酸一 曱醯胺基冰經苯基）-2_羥乙基胺基]曱基卜2,5_二曱基苯胺甲 酷基）乙基]六氫吡啶-4-基酯（14克）與曱醇（I.4升）。以一份添 加水（500毫升），然後慢慢添加另外之水（2〇〇毫升），直到達 成濁點為止。添加聯苯冬基胺曱基酸以3_曱醯胺 基-4-經苯基）-2-經乙基胺基]曱基卜2,5_二甲基苯基_胺曱醯基） 120149 -69- 200811105 乙基]六氫吡啶斗基酯之形式Π之種晶（50毫克），並將所形 成之混合物在25。(：下搜拌3小時，此時已發展成自由流動性 聚液。添加水⑽毫升），歷經15分鐘期間，並將所形成之 混合物於25°C下搜拌過夜。然後過濾混合物，i以水（1〇〇 毫升)洗滌濾餅，風乾約2小時，接著在真空及室溫下乾燥 仙小日寸，以提供結晶性聯苯j基胺曱基酸i_[2_(4_{[(r)冬(3•曱 s!胺基销$基）_2名乙基胺基]甲二曱基苯胺甲酸 基）乙基]六氫吡啶斗基酯（12·5克，99·6%純度）。此結晶性鹽 係被測定為形式II。 實例9 聯苯-2-基胺甲基酸甲醯基_2,5_二甲基苯胺曱醯基）乙 基】-六氫p比咬-4-基酉旨 步驟A - 4-碘基-2,5-二曱基苯胺 於2,5-二甲苯胺（2〇克，ι65毫莫耳）在二氣甲烷與曱醇之 1 · 1混合物（4〇〇毫升）中之溶液内，添加碳酸氫鈉（2〇·8克， 250笔莫耳）與二氯碘酸⑴四曱基銨（44·7克，165毫莫耳）。將 所形成之混合物於室溫下攪拌丨小時，然後添加水（5⑻毫 升）。移除有機層，並以5%硫代硫酸鈉水溶液（5〇〇毫升）及 鹽水（500毫升）洗滌。接著，使有機層以無水硫酸鎂脫水乾 無’過濾，及在真空下濃縮，以提供4_碘基_2,5_二甲基苯胺 (39.6克’ 98%產率）。使用此產物無需進一步純化。 步驟Β - 碘基-2,5-二曱基苯基）丙烯醯胺 於4-蛾基-2,5-二曱基苯胺（37.2克，151毫莫耳）在二氣曱烷 (5〇〇宅升）中之溶液内，添加碳酸氫納（25·4克，302毫莫耳）。 120149 -70- 200811105 使所形成之：合物冷卻至叱，並慢慢添加氣化丙烯醯(⑴ 毫升’ 15丨毫莫耳），歷經25分鐘期間。將所形成之混合物 於室溫下料過夜，’然後過濾。使濾液之體積降至約⑽毫 升’且沉殿物形成。過渡沉殿物，乾燥，以水㈣）洗務， 接著再-次乾燥’而得叫碘基办二甲基苯基)丙烯醯胺 (42·98克，95%純度，9G% i率）。使用此產物無需進-步純 化0 步驟C -聯苯_2_基胺甲基酸H2•㈣基_2,5_二甲基苯胺甲酿 基）-乙基】六氫咐咬-4-基酉旨 於N-(4-碘基-2,5-二甲基苯基）丙烯醯胺（32·2克，1〇7亳莫耳） 在膠二曱基曱酿胺與異丙醇之6 :丨ν/ν混合物亳升）中 之溶液内，添加聯苯丨基胺甲基酸六氫吡啶+基酯（36·3克， 123宅莫耳）。將所形成之混合物於5〇艺下加熱％小時，接 著在80°C下24小時。然後，使反應混合物冷卻至室溫，及 在真空下濃縮。使殘留物溶於二氯甲烷（1升）中，並將此溶 液以1N鹽酸水溶液（500毫升）、水（5〇〇毫升）、鹽水（5〇〇毫升） 及飽和碳酸氫鈉水溶液（5〇〇毫升）洗滌。接著，使有機層以 無水硫酸鎂脫水乾燥，及過濾。添加乙醇（4〇〇毫升），並使 所形成之混合物在真空下濃縮成體積為約4〇〇毫升，此時沉 源又物已形成。過;慮 >儿;殿物’及乾燥，而得聯苯_2_基胺曱基 酸1-[2-(4-碘基-2,5-二曱基笨胺曱醯基）乙基]六氫吡啶斗基酯 (59.6 克，84% 純度，79% 產率）。m/z : [M+H+]對 之計算值598.49 ;實測值598.5. 步驟D - 4-{3-[4-(聯苯-2-基胺曱醯基氧基）六氫吡啶小基】丙醯 120149 200811105 基胺基卜2,5-二曱基苯曱酸曱酯 於聯苯-2-基胺曱基酸H2-(4_碘基 卜 p 一甲基本胺曱醯基） 乙基]六氫吡啶斗基酯（56克，94毫莫耳） 、寸；隹M，N-一甲基甲醯胺 與曱醇之5 : 1 v/v混合物（600毫升）中 7 τ < /合液内，添加二異丙 基乙胺（49毫升，281毫莫耳）、工3•雙 /、 又（一本基膦基）丙院（3.9 克，9.4毫莫耳）及醋酸鈀（11) (21克 · 、 凡义4笔莫耳）。將所形成 之此&物以氧化故務氣，然後在70°C至8〇°C及一氧化碳大 氣（氣瓶壓力）下㈣過夜。在真空下濃縮反應混合物反並 使殘留物溶於二氯甲烷（500毫升）中。將此混合物以別鹽酸 水溶液（500毫升）、水（500毫升），接著以鹽水（5〇〇毫升）洗 滌。然後，使有機層以無水硫酸鎂脫水乾燥，過濾，接著 在真空下濃縮。將殘留物與乙醇混合（約5:丨v/w乙醇對殘 留物），且將混合物加熱，直到所有固體物質溶解為止。使 此令液k杈冷部至室溫，並藉過濾單離所形成之沉澱物，

而得4-{3-[4-(聯苯冬基胺甲醯基氧基）六氫吡啶+基]丙醯基 胺基}-2,5-二曱基苯甲酸甲酯（47·3克，97〇/〇純度，％%產率）。 m/z · [Μ+Η+]對 C3 丨 Η3 5Ν3 〇5 之計算值 530.63 ;實測值 530.4. 步驟Ε -聯笨-2-基胺曱基酸 1-[2-(4-經曱基_2,5_二甲基_苯胺甲醯基）乙基】六氫吡啶冰基酉旨 使4-{3-[4-(聯苯i基胺曱醯基氧基）六氫吡唆小基]丙醯基 月女基}-2,5-一甲基苯曱酸曱醋（49.8克，93.9毫莫耳）在四氫吱 喃（2⑻愛1升）中之溶液冷卻至〇°C，並分次添加氫化鐘銘（10.7 克’ 28L7 莫耳）（1〇 χ 1〇7克）。將所形成之混合物搜拌3小 時，然後添加水（10.7毫升），接著為1N氫氧化鈉水溶液（1〇 7 120149 -72 - 200811105 笔升）與另外之水（32·1耄升）。將此混合物攪拌過夜，接著 過濾。於真空下濃縮有機層，並將殘留物與醋酸乙酯混合 (約5: IWw醋酸乙酯對殘留物）。將此混合物加熱，直到所 有固體物質溶解為止，然後，使溶液冷卻至室溫。過濾所 ，形成之沉澱物，及乾燥，而得聯苯_2_基胺甲基酸μ[2_(4-羥甲 基-2,5-一甲基苯胺曱醯基）乙基]六氫？比σ定_4_基酯（24·6克，％% 純度，47.5%產率）。使用此物質而無需進一步純化。m/z ·· [M+H ]對 C3 QH3 5N3 04 之計算值 502.62 ;實測值 502.5. 步驟F -聯苯-2-基胺甲基酸 1-[2-(4-甲醢基-2,5-二甲基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶4基酉旨 於聯苯-2-基胺甲基酸^[2-(4-羥甲基-2,5-二甲基苯胺甲醯 基）乙基]六氫吡啶-4-基酯（5.0克，10毫莫耳）在二氯曱烷（2〇〇 毫升）中之溶液内，添加二異丙基乙胺（8·7亳升，5〇毫莫耳） 與二甲亞颯（5·6亳升’ 100毫莫耳）。使所形成之混合物冷卻 至〇°C ’並添加三氧化硫吡啶複合物（8 0克，5〇毫莫耳）。將 、/ 反應混合物在〇°C下攪拌1小時，然後添加水（300毫升）。移 除有機層，並以1N鹽酸水溶液（300毫升）及鹽水（3〇〇毫升） 洗條。接著，使有機層以無水硫酸鎂脫水乾燥，及過濾。 使用所形成之含有聯笨_2_基胺甲基酸1-[2-(4-曱醯基-2,5-二甲 基苯胺甲酿基）乙基;]六氫吡啶I基酯之溶液，無需進一步純 化。m/z : [M+H+]對 c3 Q h3 3 % 〇4 之計算值 500.60 ;實測值 son 實例10 得自表現人類M2, M3AM4毒蕈鹼受體之細胞之細胞培 養物與細胞膜製劑 120149 -73 - 200811105 使安定地表現無性繁殖人類hMi，hM2，hM3及hM4毒蕈鹼受 體亞型之CHO細胞系，個別地在經補充10% FBS與250微克/ 毫升基因素之Hams F-12培養基中生長至幾乎匯合。使細胞 在5% C〇2，37°C培養器中生長，並以在dPBS中之2 mM EDTA 除去。將細胞藉由5分鐘離心分離，在650 X克下收集，並 將細胞丸粒無論是於-80°C下冷凍儲存，或立即製備細胞膜 供使用。關於細胞膜製劑，係使細胞丸粒再懸浮於溶胞緩 衝劑中，並以Polytron PT-2100組織瓦解器（Kinematica AG ; 20秒 X 2次爆裂）均化。於4°C下，使粗製細胞膜在40,000 X克下離 心15分鐘。然後，使細胞膜丸粒以再懸浮緩衝劑再懸浮， 並以Polytron組織瓦解器再一次均化。細胞膜懸浮液之蛋白 質濃度係藉由Lowry等人，1951，兰翁必學游办，793, 265中所 述之方法測得。將全部細胞膜以數液份冷凍儲存於-80°C 下，或立即使用。所製成hM5受體細胞膜之液份係直接購自 PericinElmei·公司（Wellesley，MA)，並儲存於-80°C下直到使用為 止。 實例11 對毒蕈鹼受體之放射配位體結合檢測 對無性繁殖毒蕈鹼受體之放射配位體結合檢測係在96-井 微滴定板中，於總檢測體積為1〇〇微升中進行。將安定地表 現無論是hMi，hM2，hM3，hM4或hM5毒蕈鹼亞型之CHO細胞 膜，在檢測緩衝液中稀釋至下列專一標的蛋白質濃度（微克 /井）：對hMi為10微克，對hM2為10-15微克，對hM3為10-20 微克，對hM4為10-20微克，及對hM5為10-12微克，以獲得類 120149 -74- 200811105 似訊息（cpm)。在檢測板添加之前，將細胞膜短暫地使用 Polytron組織瓦解器均化（10秒）。用於測定放射配位體之kd 值之飽和結合研究，係使用L-[N-曱基-3 Η]莨菪胺氣化甲烷 ([3H]-NMS) (TRK666，84.0 Ci/ 毫莫耳，Amersham Pharmacia Biotech， Buckinghamshire，England)，在 0.001 nM 至 20 nM 範圍之濃度下進 行。用於測定待測化合物Ki值之置換檢測，係使用[3h]-nms ，在1 nM及十一種不同待測化合物濃度下進行。首先使待 測化合物在稀釋緩衝液中溶解至400 /iM濃度，然後以稀釋 缓衝液連續性地稀釋5x至最後濃度範圍從10 PM至100 //M。 對檢測板之添加順序與體積如下：25微升放射配位體、25 微升經稀釋之待測化合物及50微升細胞膜。將檢測板在37 °C下培養60分鐘。藉由在已於1% BSA中預處理過之GF/B玻 璃纖維濾板（PerkinElmer公司）上快速過濾，使結合反應終止。 將濾板以洗滌緩衝劑（10 mM HEPES)沖洗三次，以移除未結 合之放射活性。接著，使板風乾，並將50微升Microscint-20 液態閃爍流體（PerkinElmer*公司）添加至各井中。然後，將板 在PerkinElmer TopCount液體閃爍計數器（PerkinElmer公司）上計 數。結合數據係藉由非線性回歸分析，使用GraphPad Prism 包裝軟體（GraphPad軟體公司，San Diego, CA)，利用單一位置 競爭模式進行分析。待測化合物之Ki值係使用Cheng-Prusoff 方程式（Cheng Y ; Pmsoff WH· (1973)兰允 # 理學，22 (23): 3099-108)，計算自放射配位體所發現之IC5Q值與1<^值。使Kj 值轉化成P&值，以測定幾何平均與95%可信度間隔。然後， 將此等摘要統計學轉化回復至Kj值，以供數據報告。 120149 -75 · 200811105 在此項檢測中，較低&值表示待測化合物對所測試之受 體具有較高結合親和力。發現聯苯冬基胺曱基酸 l-[2-(4-{[(R)-2-(3-曱酸胺基-4-經苯基峰羧乙基胺基]曱基卜2,5-一曱基苯胺曱醯基）乙基]六氫吡啶-4-基酯（化合物na)，對 Μ〗，M2，Mg，M4及M5毒蕈鹼受體亞型具有&值低於1〇 。 實例12 得自表現人類历、爲或啟腎上腺素能受體之細胞之細胞培 養物與細胞膜製劑 女疋地表現無性繁殖人類怂與怂腎上腺素能受體之人類 胚胎腎臟（HEK-293)細胞系或安定地表現無性繁殖人類啟腎 上腺素能受體之中國大頰鼠卵巢（CH〇)細胞系，係在具有 10% FBS之DMEM或Hams F-12培養基中，於500微克/毫升基 因；r、存在下’生長至幾乎匯合。將細胞單層以在中2 mM EDTA去除。使細胞在l5〇〇〇 φπι下，藉由離心分離形成粒狀， 並將細胞丸粒無論是於-8(rc下冷凍儲存，或立即製備細胞 膜供使用。關於表現細胞膜之负與怂受體之製備，係使細 胞丸粒再％序於溶胞緩衝劑⑽ιώΜ HEpES/HC1，1〇碰ε〇丁A， pH 7.4，於4°C下）中，並使用緊密安裝之D〇unce玻璃均化器 (30 -人衝私），在冰上均化。關於表現細胞膜之較具蛋白酶 敏感〖生A又妝，係使細胞丸粒在溶胞緩衝劑（10 丁咖 pH 7.4)中均化，每5〇毫升緩衝劑補充一個片劑之，，完全蛋白 酶抑制劑混合藥片劑與2 mM EDTA，，（R〇che分子生物化學品，

IndianaP〇l1S，ίΝ)。使勻漿在2〇,〇〇〇 X克下離心，並將所形成之 丸粒按上述藉由再懸浮與離心分離，以溶胞緩衝劑洗條一 120149 -76- 200811105 次。然後，使最後丸粒再懸浮於冰冷結合檢測緩衝劑（75 mM Tris/HCl，pH 7.4, 12.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA)中。細胞膜懸浮液 之蛋白質濃度係藉由Lowry等人，1951，兰# /fc #游办，793, 265 ;及Bradford，分#兰#必學，1976, 72, 248-54中所述之方法 測得。將全部細胞膜以數液份冷凍儲存於-80°C下，或立即 使用。 實例13 對人類A，/¾及庑腎上腺素能受體之放射配位體結合檢測 結合檢測係在96-井微滴定板中，於總檢測體積為100微升 中，使用含有人類A，岛或啟腎上腺素能受體之HU微克 膜蛋白質，在檢測緩衝液（75 mM Tris/HCl，pH 7.4，於25°C下， 12.5 mM MgCl2，1 mM EDTA，0_2% BSA)中進行。用於測定放射 配位體之Kd值之飽和結合研究，係使用[3 Η]-二氫烯丙心安 (dihydroalprenolol)(NET-720，100 Ci/毫莫耳，PerkinElmei•生命科學 公司，Boston，MA)對A與/¾受體，及[1251]-(+碘基氰基品多羅 (cyanopindolol)(NEX-189，220 Ci/ 毫莫耳，PerkinElmer 生命科學公 司，Boston，MA)，在10或11種範圍從0.01 nM至20 nM之不同濃 度下進行。用於測定待測化合物&值之置換檢測，係使用 [3 H]-二氫烯丙心安（dihydroalprenolol)在 1 nM 下，及[丨 2 51]-㈠-破 基氰基品多羅（cyanopindolol)在0.5 nM下，對待測化合物之10 或11種不同濃度範圍從10 pM至10 //M下進行。非專一性結 合係於10 //M丙°若羅（propranolol)存在下測得。檢測係在37°C 下培養1小時，然後藉由在已於0.3%聚乙烯亞胺中預浸泡過 之對A與床受體為GF/B或對成受體為GF/C玻璃纖維濾板 120149 -77- 200811105 (Packard生物科技公司，Meriden，CT)上快速過濾，使結合反應 終止。將濾板以過濾緩衝劑（75 mM Tris/HCl，pH 7.4，於4°C下， 12.5 mM MgCl2，1 mM EDTA)洗滌三次，以移除未結合放射活 性。接著，使板乾燥，並添加50微升Microscint-20液態閃爍 流體（Packard生物科技公司，Meriden，CT)，且將板在Packard TopCount液體閃爍計數器（Packard生物科技公司，Meriden, CT) 上計數。結合數據係藉由非線性回歸分析，使用GraphPad Prism包裝軟體（GraphPad軟體公司5 San Diego, CA)，利用單一 位置競爭之3-參數模式進行分析。曲線最低值係被固定為 非專一性結合之數值，當於10 //M丙喏羅（propranolol)存在下 測定時。待測化合物之Kj值係使用Cheng-Prusoff方程式（Cheng Y 與 Prusoff WH·，兰允秦逻學，1973, 22, 23, 3099-108)，計算自放 射配位體所發現之IC5G值與Kd值。 在此項檢測中，較低Ki值表示待測化合物對所測試之受 體具有較高結合親和力。發現聯苯-2-基胺甲基酸 l-[2-(4-{[(R)-2-(3-曱 胺基-4-¾ 本基）-2-經乙基胺基]曱基}-255~ 二甲基苯胺曱醯基）乙基]六氫吡啶-4-基酯（化合物Ila)對爲 腎上腺素能受體具有&值低於10 nM，而對啟與战腎上腺素 能受體具有&值大於1〇〇〇 nM。 實例14 對毒蕈鹼受體亞型之拮抗作用之功能性檢測 檢測A - cAMP蓄積之激動劑所媒介抑制之阻抑 在此項檢測中，待測化合物作為hM2受體拮抗劑之功能性 功效係藉由度量待測化合物在表現hM2受體之CHO-K1細胞 120149 -78- 200811105 中阻斷弗斯科林（forskolin)所媒介cAMP蓄積之氧震顫素抑制 之能力而測得。cAMP檢測係在使用具有125Ι^ΑΜΡ (NEN SMP004B，PerkinElmer生命科學公司，Boston，ΜΑ)之閃光板腺苷 基環化酶活化作用檢測系統之放射免疫檢測格式中，根據 製造者之說明書進行。將細胞以dPBS沖洗一次，並以胰蛋 白酶-EDTA溶液（0·05°/〇胰蛋白酶/0.53 mM EDTA)去除，按上文 細胞培養物與細胞膜製劑段落中所述。將已脫離之細胞藉 由在650 X克下離心五分鐘，於50毫升dPBS中洗條兩次。然 後，使細胞丸粒再懸浮於10毫升dPBS中，並將細胞以Coulter Z1雙粒子計數器（Beckman Coulter，Fullerton，CA)計數。使細胞再 一次於650 X克下離心五分鐘，並再懸浮於刺激緩衝劑中， 至檢測濃度為1.6 X 106至2.8 X 106個細胞/毫升。 首先使待測化合物在稀釋緩衝液（經補充1毫克/毫升BSA (0.1%)之dPBS)溶解至400 //M濃度，然後連續性地以稀釋缓衝 液稀釋至最後莫耳濃度範圍為100 //M至〇·1 nM。氧震顫素係 以類似方式稀釋。 為度量腺苷基環化酶活性之氧震顫素抑制，將25微升弗 斯科林（forskolin)(25 最後濃度，於dPBS中稀釋）、25微升 經稀釋之氧震顫素及50微升細胞添加至激動劑檢測井中。 為度量待測化合物阻斷氧震顫素抑制之腺苷基環化酶活性 之能力，將25微升弗斯科林（forskolin)與氧震顫素（個別為25 //M與5 //M最後濃度，在dPBS中稀釋）、25微升經稀釋之待 測化合物及50微升細胞添加至其餘檢測井中。 將反應物在37°C下培養1〇分鐘，並藉由添加1〇〇微升冰冷 120149 -79- 200811105 偵測緩衝劑使其停止。將板密封，在室溫下培養過夜，並 於隔天早上，在PerldnElmer T〇pC〇unt液體閃爍計數哭 (PerkmElmer公司，Wellesley，MA)上計數。所產生之cAMp量（微 微莫耳/井）係以關於試樣所發現之計數及如製造者之使用 者手冊t所述之cAMP標準為基準計算而得。數據係藉由非 線性回歸分析，以GraphPad Prism包裝軟體（Graphpad軟體公司

San Diego, CA)，使用非線性回歸單一位置競爭方程式進行分 析。Cheng-pms0ff方程式係用以計算心。，使用氧震顫素: 度-回應曲線之EC^，與氧震顫素檢測濃度，個別作為心 與[L]。 d 在此項檢測中，較低心^值表示待測化合物對所測試之 受體具有較高功能性活性。發現聯苯冬基胺甲基酸 l-[2-(4-{[(R)-2-(3-甲醯胺基_4_羥苯基>2_羥乙基胺基]甲基卜2,5_ 二甲基苯胺甲醯基）乙基]六氫吡啶斗基酯（化合物^叫在表 現hi%受體之CHO_K丨細胞中阻抑弗斯科林所媒介cAMp蓄積 之氧震顫素抑制，係具有心“值低於約1〇nM。 檢測B -激動劑所媒介pss】GTPrS結合之阻抑 在此功能性檢測中，待測化合物作為刚2受體拮抗劑之功 能性功效係藉由度量待測化合物在表現受體之ch〇_ki 細胞中阻斷氧震顫素刺激之[35s]GTPtS結合之能力而測得。 :使用π心'使已冷凍之細胞膜解凍，然後在檢測緩衝 液t稀釋，具有最後靶組織濃度為每井5至1〇微克蛋白質。 將細胞膜使用PolytronPT_2100組織瓦解器短暫地均化，然後 添加至檢測板。 120149 -80- 200811105 關於5 S]GTP tS結合作用被激動劑氧震顫素刺激之ECm 值（提供90%最大回應之有效濃度）係於各實驗中測定。 為測疋待測化合物抑制氧震顫素刺激之[3 5 S]GTp作結合 作用之能力，將下列添加至96井板之各井中：具有[35S]GTP 7S (0.4 nM)之25微升檢測緩衝液’ 25微升氧震顫素（EC9〇)與 GDP (3 uM)，25微升經稀釋之待測化合物，及表現受體 之25微升CHO細胞膜。然後，將檢測板在37艺下培養6〇分 鐘。將檢測板於WBSA-預處理過之GF/B濾器上過濾’使用 PerkinElmer 96-井採集器。將板以冰冷洗滌緩衝劑沖洗3 X 3 心，然後經空氣或真空乾燥。將Micr〇scint_2〇閃爍液體（5〇微 升）添加至各井，並將各板密封’及在T〇pC_t (perkinEl_ ) 上計數放射活性。數據係藉由非線性回歸分析，以Graphpad Prism包裝軟體（GraphPad軟體公司，3如Dieg〇, ca)，使用非線 性回歸單—位置競爭方程式進行分析。⑽咖破方程式 係用以計算KGbs，使用待測化合物之濃度—回應曲線之

值’與氧震顫素在檢測中之濃度，個別作為MM配位體 濃度。 ◊在此項檢測中，較低K。b s值表示待測化合物對所測試之 受體具有較高功能性活性。發現聯苯_2_基胺甲基酸 1-[2-(4-__2_(3_甲醯胺基领苯基）_2_經乙基胺基]甲基卜 二甲基苯胺曱酸基）乙基]六氫峨咬_4_基§旨（化合物叫在表 現hM2受體之CH〇_K】細胞中對阻抑氧震顫素刺激之"⑽ rS結合具有尺。匕值低於約10nM。 檢測C -經由FLIPR檢測之激動劑所媒介鈣釋出之阻抑 120149 -81 - 200811105 在此功能性檢測中，待測化合物作為，hM3及cM5受體 之拮抗劑之功能性功效，係藉由度量待測化合物抑制激動 劑所媒介胞内飼上增加之能力而測得。 將安定地表現此等受體之CHO細胞，在進行檢測之前一 晚’接種至96-井FLIPR板中。經接種之細胞係以FLIPII缓衝 劑（10 mM HEPES，pH 7.4, 2 mM 氣化鈣，2·5 mM 羧苯磺胺 (probenecid) ’在未具有詞與鎮之也业氏缓衝鹽溶液（耶ss) 中），使用CdlWash (MTX Labsystems公司）洗滌兩次，以移除生 長培養基。於洗滌後，各井含有50微升FLIPR緩衝劑。然後， 將細胞以50微升/井之4處FLU〇_4AM (製成2χ溶液卜在^ °C，5%二氧化碳下培養4〇分鐘。在染料培養期之後，將細 胞以ELIPR緩衝劑洗務兩二欠’留下5〇微升之最後體積於各井 中 0 V. / 測定關於氧震顫素之胞内Ca2+釋出之劑量依賴性刺激， 以致待測化合物可針對氧震顫素刺激，在EC9G濃度下度量。 :先將、’、田胞以化合物稀緩衝液培養2〇分鐘，然後添加氧 震顏素。^震顫素之^值餘據詳述於下文《FLIPR度量 與數據還原段落中夕古、土 、，、 之方法，亚格配公式ECF= ((F/100-F)A 1/H)* EC50而產生。3 χ %之氧震顫素濃度係在刺激板中製備， 以致係將氧震顫幸之Fr 、曲#、☆丄 /丁、之EC%沒度添加至試驗檢測板中之各 井0 強度0.5瓦特， 。基線係在添 歷經10秒而測 用於FLIPR之参數為：曝光長度〇 4秒，雷射 激發波長柳毫微米，及發射波長550毫微米 加氧震顫素之前，#由度量螢光上之改變， 120149 -82- 200811105 :::氧震顫素刺激之後，flipr係連續地度量螢光之改變， 母姑1心’歷經L5分鐘’以捕獲最大螢光變化。 螢光之改變係砉+垚料々β 表不為對各井之最大螢光減去基線螢光。 原始數據係藉由非綠把 、一 、”回知，以 GraP^ad (GraphPad 軟體 " 心〇, CA)，使用S形劑量回應之内建模式，對著 . 對數進仃分析。拮抗劑“值係藉由 辦、曲Ώ使用乳展SM素EC5G值作為KD，與氧震顫素對於配位 妝/辰度之EG 〇，根據Cheng孑rus〇ff方程式吻哪& p聊民a 測得。 /在此項檢測中，較低^值表示待測化合物對所測試之 受體具有較高功能性活性。發現聯苯4基胺f基酸 l-[2-(4-{[(R)-2-(3-甲线冰㈣基财乙基胺基]甲基卜2,5_ 一曱基苯月女曱醯基）乙基]六氫吡啶斗基酯㈠匕合物玎勾在安 疋地表現h%，hM3及cM5受體之ch〇細胞中對阻抑激動劑所 媒介之鈣釋出具有心^值低於約1〇nM。 實例15 在異種地表現人類爲、爲或爲腎上腺素能受體之 與CHO細胞系中之全細胞cAMp閃光板檢測 cAMP仏測係在使用具有[⑵扣八礎（NEN smp〇〇4, PerkinElmer生命科學公司，B〇st〇n，MA)之閃光板腺苷基環化 酶活化作用檢測系統之放射免疫檢測格式中，根據製造者 說明書進行。為測定怂與爲受體激動劑功效，係使 安定地表現無性繁殖人類爲與怂受體之HEK_293細胞系，在 經補充10% FBS與基因素（500微克/毫升）之DMEM中生長至 120149 -83 - 200811105 幾乎匯合。為測定啟受體激動劑功效（ec5〇)，係使安定地 表現無性繁殖人類或/53腎上腺素能受體之CHO-K1細胞系 在經補充10% FBS與基因素（250微克/毫升）之Hams F-12培養 基中生長至幾乎匯合。將細胞以PBS沖洗，並在含有2 mM EDTA或胰蛋白酶-EDTA溶液（〇·〇5%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA) 之dPBS (Dulbecco氏磷酸鹽緩衝之鹽水，未具有CaCl2與MgCl2) 中脫離。在Coulter細胞計數器中計數細胞後，使細胞在1，〇〇〇 rpm下’藉由離心分離形成粒狀，並再懸浮於含有ffiMX (PerkinElmer套件）而經預溫熱至室溫之刺激緩衝劑中，至1.6 X 106至2·8 X 106個細胞/毫升之濃度。於此項檢測中，每井使 用約40,000至80,000個細胞。將待測化合物（10 mM在DMSO 中）稀釋至 PBS 中，其含有 0.1% BSA 在 Beckman Biomek-2000 中，並在100 //Μ至1 pM範圍之11種不同濃度中測試。使反 應物在37°C下培養10分鐘，並藉由添加含有125I-cAMP (NEN SMPOO4，PerkinElmer 生命科學公司，Boston，Μ·Α·)之 100 微升冷 偵測緩衝劑使其停止。所產生cAMP之量（微微莫耳/井）係 以關於試樣所發現之計數與如製造者之使用者手冊中所述 之cAMP標準作為基準計算而得。數據係籍由非線性回歸分 析，以 GraphPad Prism 包裝軟體（GraphPad 軟體公司，San Diego, CA)，使用S形方程式進行分析。Cheng-Prusoff方程式（Cheng Y 與 Prusoff WH。立允# 理#，1973, 22, 23, 3099-108)係用以計算 EC50 值。 在此項檢測中，較低EC5〇值表示待測化合物對所測試之 受體具有較高功能性活性。發現聯苯-2-基胺甲基酸 120149 -84 - 200811105 Η2-(4-{Ρ〇-2-(3-曱醯胺基-4-羥苯基羥乙基胺基]曱基卜2,5-一曱基本基·胺曱酿基）乙基]六氫p比。定-4-基i旨（化合物Ila)對 /¾腎上腺素能受體具有EC5Q值低於約1〇 nM ;對成腎上腺素 能受體之EC5Q值約30 nM ;而對/¾腎上腺素能受體之EC50值 大於700 nM。 實例16 使用以内源方式表現人類A腎上腺素能受體之肺臟上皮細 胞系之全細胞cAMP閃光板檢測 在此項檢測中，待測化合物之激動劑功效與内在活性係 使用表現冼腎上腺素能受體内源含量之細胞系測得。使得 自人類肺臟上皮細胞系之細胞（BEAS-2B) (ATCCC RL-9609，美 國培養物類型收集處，Manassas, VA) (January B等人，矣鐵# 逻學妨开，1998，723, 4, 701-11)在完全、不含血清之培養基 (LHC-9培養基，含有腎上腺素與視黃酸，Biosource國際， Camarillo，CA)中生長至75-90%匯合。於檢測前一天，將培養 基轉換成LHC-8 (無腎上腺素或視黃酸，Biosource國際， Camarillo, CA)。cAMP檢測係在使用具有I；1 2 51]-cAMP之閃光板 腺答基環化酶活化作用檢測系統（NEN SMP004，PerkinElmer生 命科學公司，Boston，MA)之放射免疫檢測格式中，根據製造 者說明書進行。 於檢測當天，將細胞以PBS沖洗，經由以PBS中之5 mM EDTA磨擦而去除，及計數。使細胞在1，〇〇〇 rpm下，藉由離 心分離形成粒狀，並再懸浮於經預熱至37°C之刺激緩衝劑 中，於最後濃度為600,000個細胞/毫升下。於此項檢測中， 120149 -85- 200811105 細胞係在最後濃度為100,000至120,000個細胞/井下使用。將 待測化合物連續性地稀釋至檢測緩衝液（75 mM Tris/HCl pH 7·4，於 25°C 下，12.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA，0.2% BSA)中，在 Beckman Biomek-2000中。待測化合物係在檢測中，於範圍為 10 //M至10 PM之11種不同濃度下測試。使反應物在37°C下 培養10分鐘，並藉由添加100微升冰冷偵測緩衝劑停止。將 板密封，於4°C下培養過夜，並於隔天早上，在TopCount閃 爍計數器（Packard生物科技公司，Meriden，CT)上計數。每毫升 反應物所產生之cAMP量係以關於試樣所發現之計數及如 製造者之使用者手冊中所述之cAMP標準為基準計算而得。 數據係藉由非線性回歸分析，以GraphPad Prism包裝軟體 (GraphPad軟體公司，San Diego, CA)，使用關於S形劑量-回應 之4-參數模式進行分析。 在此項檢測中，較低EC5G值表示待測化合物對受體測試 具有較高功能性活性。發現聯苯-2-基胺曱基酸l-[2-(4-{[(R)-2-(3-甲醯胺基冬羥苯基羥乙基胺基]甲基}-2,5-二甲基苯基-胺曱醯基）乙基]六氫吡啶斗基酯（化合物Ila)具有EC5〇值低 於10 nM，且内在活性值大於0.3，與完全戾激動劑異丙基 腎上腺素（1.0)作比較。 實例17 用於測定枝氣管保護性功效與延續時間之Einthoven檢測 在此項檢測中，係使用天竺鼠測定待測化合物之枝氣管 保護性功效與延續時間。此項檢測係衍生自Einthoven (1892) /yagers Zrc/z· 57 : 367-445 ;與 Mohammed 等人（2000) /½½ P/wrmaco/ 120149 -86- 200811105 77^rj3⑹：287-92中所述之程序。在此項檢測中，於換氣壓 力上之改變係充作氣道阻力之替代度量方式。在以待測化 合物預處理之後，毒蕈驗拮抗劑功效係於丙喏羅（propranolol) 存在下，使用對靜脈内乙醯甲膽鹼之枝氣管收縮劑劑量-回應曲線測定。同樣地，/¾激動劑枝氣管保護性功效係使 用組織胺測定。合併之枝氣管保護性功效係於丙喏羅不存 在下，使用乙醯甲膽鹼測定。 檢測係使用體重在250與400克間之雄性Duncan-Hartley天 竺鼠（Harlan，Indianapolis，IN)進行。待測化合物或媒劑（意即無 菌水）係在全身曝露服藥室（R+S模具，San Carios，CA)中，使 用5毫升服藥溶液，藉吸入（IH)服藥，歷經10分鐘時期。使 動物曝露至氣溶膠，其係自LC星型霧化罐套組（22F51型， PARI呼吸設備公司，Midlothian，VA)產生，在22 psi之壓力下， 藉由Bioblend (5% C〇2 ; 21%〇2 ;及74% N2之混合物）逐出。肺 功能係在吸入服藥後，於不同時點下評估。 在檢測開始之前七十五分鐘，以肌内（IM)注射氯胺酮（43.7 毫克/公斤/曱苯噻嗜（3.5毫克/公斤）/乙醯普馬畊（1.05毫克/ 公斤）之混合物，使天竺鼠麻醉。按需要投予此混合物之補 充劑量（首次劑量之50%)。單離頸靜脈與頸動脈’並以充填 鹽水之聚乙烯導管（個別為微瑞那散（renathane)與PE-50， Beckton Dickinson，Sparks，MD)進行插管。將頸動脈連接至壓力 傳感器，以允許度量血壓，而頸靜脈套管係用於IV注射無 論是乙醯l曱膽驗或組織胺。然後，將氣管分割開來，並以 14克針頭（#NE-014，小零件，Miami Lakes，FL)插管。一旦完成 120149 -87 - 200811105 套：插入法，私天竺鼠使用呼吸器（6幻型，Η卿㈣裝置公司 ΜΑ)進行換氣，設定在每搏量丨毫升Μ⑽克體重下，但不超 過2.5笔升體積，及在每分鐘1〇〇搏之速率下。換氣壓力（νρ) 係在氣官套管中，使用經連接至Biopac (TSD 137C)預放大器 之Bmpac傳感器度量。體溫係使用加熱墊被保持在37艺下。 在起始數據收集之前，以腹膜腔内方式投予戊巴比妥 (25笔克/公斤），以壓抑自然呼吸，及獲得安定基線。於评 上之改變係被記錄在Biopac Wind〇ws數據收集界面上。收集 基線值歷經至少5分鐘，於此段時間後，以非累積方式， 使用2-倍增量之枝氣管收縮劑（乙醯甲膽鹼或組織胺）劑量， 以IV激叙天竺鼠。當使用乙醯甲膽鹼作為枝氣管收縮劑時， 將動物以丙喏羅（5毫克/公斤，IV)預處理，以隔離待測化合 物之抗毒蕈鹼作用。丙喏羅係在建構對乙醯曱膽鹼或組織 胺之劑量回應曲線之前30分鐘投予。 於VP上之改變係使用承認數據收集軟體（Santa Barbara，CA) έ己錄。在研究完成後，使動物安樂死。 於VP上之改變係以水之公分數度量。於νρ上之改變（公 分Η2〇）=尖峰壓力（於枝氣管收縮劑激發後）-尖峰基線壓 力。將對乙曱膽驗或組織胺之劑量回應曲線吻合至四參 數計异術方程式’使用 GraphPad Prism Windows 3.00 版（GraphPad 庫人體，San Diego’ California)。使用下列方程式： Y = Min + (Max-Min)/(1 + l〇((1〇sID5〇-x)*Hiii斜率）） 其中X為劑量之對數，γ為回應。γ係在Min下開始，且漸 120149 -88 - 200811105 近地趨近至Max，具有s形之形狀。 對乙醯曱膽鹼或組織胺之次最高劑量之枝氣管收縮劑回 應之抑制百分比，係在待測化合物之各劑量下，使用下列 方程式計算：回應之抑制％=100_((尖峰壓力(於枝氣管收縮 劑激發後，經處理）尖峰基線麼力（經處理）m〇〇%/(尖峰 壓力(於枝氣管收縮劑激發後’水）_尖峰基線壓力(水）χ :)。抑制作用曲線係使用四參數計算術方程式G-胸軟 兩° ΙΕ>5 〇 (為產生枝氣官收縮劑回應之5〇%抑制作用所 需要之劑量mEmax(最高抑制)亦在適當情況下估計。 於待測化合物吸入後’在不同時間點下之枝氣管保護程 度’係用以估計藥力半生期下 ^ 千生期（PD 丁山）。PD Τ1/2係使用非線 ^生回知吻合，使用單相指數衰減方程式㈣咖d阳，樓 版）測定：Y =跨距*exp(_K*x) +平坦區；於跨距+平挺區下開 始，並以速率常敍衰減至平坦區,τ1/2=0·鑛。平坦 區係被強制為〇。 在服藥後L5小時，發現聯苯-2-基胺甲基酸Η2-(4-_-2-(3- 胺基_4·經苯基）m基胺基]甲基卜2,5_二ρ基苯胺^ -土）乙基]/、氫吨。疋_4_基醋（IIa),對乙酸曱膽驗所引致之技 氣管縮小及組織胺所引致之枝氣管縮小兩者，具有心低 於約50微克/毫升。 此外，當以單—次最高劑量⑽微克/毫升）投藥時，此化 合物會產生顯著枝氣管保護，歷經至高約72小時。在此項 檢測中，沙美特醇（saImeter〇1)(3微克/毫升）（爲腎上腺素能受 體激動劑)顯示顯著枝氣管保護’歷經6至14小時；及提歐 120149 -89- 200811105 多平（tiotropium) (10微克/毫升）（毒蕈驗受體拮抗劑）顯示顯 著枝氣管保護，歷經大於72小時。 實例18 用於測定枝氣管保護性功效與延續時間之體積描記器天竺 鼠檢測 在此項檢測中，待測化合物之枝氣管保護性功效與延續 時間係使用天竺鼠檢測測定。 體重在250與350克間之每組6隻雄性天竺鼠（Duncan-Hartley (HsdPoc: DH) Harlan，Madison，WI)係個別地藉由籠子卡片鑒別。 在整個此研究中，係允許動物無限制地獲取食物與水。待 測化合物係在全身曝露服藥室（R&S模具，San Carlos，CA)中， 經由吸入投藥，歷經10分鐘。服藥室係經安排，以致使氣 溶膠從中央歧管同時被傳輸至6個各別室。使天竺鼠曝露至 待測化合物或媒劑（WFI)之氣溶膠。氣溶膠係使用LC星型霧 化罐套組（22F51型，PARI呼吸設備公司，Midlothian，VA)，自水 溶液產生，在22 psi之壓力下，藉由氣體（C02= 5%，02= 21%， 及N2= 74%)之混合物逐出。在此操作壓力下，經過霧化罐 之氣流係為每分鐘大約3升。所產生之氣溶膠係藉由正壓力 驅動至室中。在經氣溶膠化之溶液傳輸期間，未使用稀釋 空氣。在10分鐘霧化作用期間，大約1.8毫升溶液被霧化。 此數值係以重量分析方式度量，其方式是將經填充霧化罐 之霧化作用前與後之重量作比較。 經由吸入投予之待測化合物之枝氣管保護作用，係在服 藥後1.5、24、48及72小時，使用全身體積描記法評估。在 120149 -90- 200811105 肺評估開始之前四十五分鐘，以肌内注射氯胺酮（43.75毫克 /公斤）、曱苯噻畊（3.50毫克/公斤）及乙醯普馬畊（1.05毫克/ 公斤），使各天竺鼠麻醉。將手術位置刮毛，並以70%醇清 理，及施行頸部腹面之2至3公分中線切開術。單離頸靜脈， 並以充填鹽水之聚乙烯導管（PE-50，Becton Dickinson，Sparks， MD)插管，以允許靜脈内灌注鹽水中之乙醯膽鹼或組織胺。 然後，將氣管分割開來，並以14G鐵弗龍管件（#NE-014，小 零件，Miami Lakes，FL)插管。若需要則藉由另外肌内注射麻 醉混合物，保持麻醉。監測麻醉之深度，而若動物會回應 其足掌之夾縮或若呼吸速率每分鐘大於1〇〇次呼吸，則進行 調整。 一旦完成套管插入法，即將動物放置在體積描記器 (#PLY3114, Buxco電子公司Jharon，CT)中，並插入食管壓力套 管（PE-160，Becton Dickinson, Sparks，MD)以度量肺驅動壓力。將 鐵弗龍氣管管件連接至體積描記器之開孔，以允許天竺鼠 呼吸來自室外部之屋内空氣。然後，將室密封。使用加熱 燈以保持體溫，並以4毫升空氣，使用10毫升校準注射器 (#5520 系列，Hans Rudolph，Kansas City, MO)使天竺鼠之肺臟膨 大三倍，以確保下氣道未曾陷縮，且動物不會遭遇到換氣 過度。 在測定出基線值對順應性為在每公分H2〇0.3至0.9毫升 之範圍内，及對阻力為在每毫升每秒〇·1至0.199公分H2〇之 範圍内後，起始肺評估。Buxco肺度量電腦程式係用於肺數 值之收集與衍生。開始此程式係起始實驗擬案與數據收集。 120149 91 200811105 於體積上隨著時間之改變，其係隨著每次呼吸發生在體積 描記器内，係經由Buxco壓力傳感器度量。#由將此信號隨 著時間積分，對每次呼吸計算流量之度量值。使用 壓力傳感器(TRD41〇0)收集之此信號與肺驅動壓力變化，俜 經由Buxco (MAX 227〇)前置放大器連接至數據收集界面 (SFT34Q0與SFT3813)。所有其他肺參數騎生自此兩種輸入。 收集基線值歷經5分鐘，於此段時間後，以無論是乙柄 膽驗或組織胺激發天竺氣。當評估待測化合物之毒輩驗枯 抗劑作用時，丙灯隹(propan〇1〇1) (5毫克/公斤，叫⑸脚&韻冰 St· Louis，M0)係在以乙酿膽驗激發之前】5分鐘投予。乙酿膽 鹼（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO) (0.1 毫克 / 毫升）係自注射泵 (S_W，世界精密度儀器公司，s_〇ta，fl)，在下列劑量及 自實驗開始之開立時間了 ’以靜脈内方式灌注i分鐘里Μ 微克/分鐘，在5分鐘下，3.8微克/分鐘，在1〇分鐘下，w 微克/分鐘，在15分鐘下，15〇微克/分鐘，在2〇分鐘下，邓 微克7分鐘，在25分鐘下，及6〇微克/分鐘，在30分鐘下。 或者，待測化合物之枝氣管保護作用係在未以丙喏羅預虑 理之乙g进膽驗激發模式中評估。 當評估待測化合物之A腎上腺素能受體激動劑作用時， 組織月女（25微克/宅升）⑻gma_Aldrich，St L〇uis，M〇）係自注射7 在下列劑量及自貫驗開始之開立時間下，以靜脈内方式^ 注1分知· 〇·5微克/分鐘，在5分鐘下，〇·9微克/分鐘，^ & ,-ν. , 在 10 刀，，里下，1.9微克/分鐘，在15分鐘下，3·8微克/分鐘， .ν .. 在 20 刀、’里下，7.5微克/分鐘，在25分鐘下，及15微克/分鐘，才 120149 -92 - 200811105 =鐘下4阻力或順應性在各乙酿膽驗或組織胺劑量… 分鐘未返回基線值，則以4毫升空氣，自1〇毫升校準注射 器’使天竺鼠之肺臟膨大3倍。所記錄之肺參數包括呼吸領 率（每分鐘之呼吸數）、順應性（每公分H2〇之毫升數）及肺 阻力（每毫升每秒之公分邮）。—旦在此擬案之料鐘下完 成肺功能度量’即將天竺鼠移離體積描記器，並藉由二氧 化碳窒息使其安樂死。 數據係以兩種方式之一評估： ⑷肺阻力（rl)(每毫升每秒之公分H2〇）係計算自壓力上 改變對流量上改變之比例。對媒劑與待測化合物計算對乙 醯膽鹼（60微克/分鐘，IH)tRL回應。於媒劑處理動:中之 平均乙醯膽鹼回應，在各預處理時間下，係經計算且用以 计异乙醯膽鹼回應，在其相應之預處理時間下，在各試驗 化合物劑量下之抑制百分比。關於”Rl”之抑制劑量—回應曲 線’係以四參數計算術方程式吻合，使用Graphpad pri· Wmd〇Ws 3·00 版（GraphPad.軟體，San Diego, California)，以估計枝 氣管保護性©5〇(抑制乙醯膽鹼（60微克/分鐘）枝氣管縮小 回應達50%所需要之劑量）。使用下列方程式： Y = Min + (Max-Min)/(1 + 10 ((logID50“x)*H⑴斜率）) 其中X為劑量之對數，Y為回應（乙醯膽鹼所引致RL上增加 之抑制百分比）。Y係在Min下開始，且漸近地趨近至Max， 具有S形之形狀。 (b) 數量’其係被定義為造成基線肺阻力加倍所必 120149 -93 - 200811105 須之乙醯膽鹼或組織胺之量，其係使用衍生自流量與壓力 之肺阻力值計算，歷經一範圍之乙醯膽鹼或組織胺激發’ 使用下列方程式（錢衍生自用以計算〜值之方程式:經 ϋ

描述於美國㈣學會巾，乙Μ膽驗與運用激發測試指引· 1999. Am J Respir Crit Care Med. 2000 ； 161 : 309.329): PD2= antilog [ log Cl+ (1〇g C” ㈣上)诹。 R丨) R2 - Ri 其中 C!==在C2前之乙驢膽驗或組織胺之濃度 C2 =造成肺阻力（RL)上至少2-倍增加之乙醯膽鹼或組織 胺之濃度 β R〇=基線心值 R2= C2後之RL值 數據之統計分析係使用二尾式Student氏t-試·驗 <0.05係被認為是有意義。 魂 Us 2004/ 蜊試。化合 在2004年8月24日公告之美國專利公報案 0167167A1中所述之化合物50，係在此項檢測中 物50之化學結構如下：

比較化合物50 120149 -94- 200811105 此化合物缺少存在於本發明化合物之苯環上之烷基。在 此項檢測中，化合物50對於劑量範圍為3微克/毫升至3〇〇 微克/毫升’在服藥後24小時，未顯示顯著枝氣管保護。對 化。物5Q在24小時下之PD2x值，係類似媒劑（水）組群。 在此員私測中，沙美特酵（salmeter〇l) (1〇〇微克/毫升）（爲腎 上f素能受體激動劑）顯示顯著枝氣管保護，歷經至少％ 小# = π提歐多平（t—ium) (1Q微克/毫升）（毒簟驗受體抬 抗劑）顯示顯著枝氣管保護，歷經至少％小時。 雖然本發明已來者直胜 /哼/、特疋方面或具體實施例加以描述， 但一般熟諳此藝者將昍日备认θ π首將明瞭的是，可施行各種改變，或等效 可在未偏離本發明之真實精神與範圍下經取代。此外， 達可應用專利法與條例所允許之程度，於本文㈣引用之 所有刊物、專利及專利申請案係據此以其全文併入供參考， 達猶如各文件已彳固^丨，、， 併入本文供參考一般之相同程度。 120149 -95 -

Claims (1)

1. 200811105 一、申請專利範圍： 1. 一種式I化合物：

   其中 R1為甲基或乙基； R2為曱基或乙基； 或其藥學上可接受之鹽或溶劑合物或立體異構物。 2.如請求項1之化合物，其具有式II :

   其中 R1為曱基或乙基； R2為曱基或乙基； 或其藥學上可接受之鹽。 3.如請求項1之化合物，其具有式Ila : 120149 200811105

   4·如請求項1之化合物，其中化合物為式Ila化合物之藥學上 可接受鹽：

   5. —種醫藥組合物，其包含藥學上可接受之載劑與如請求項 1至4中任一項之化合物。 6. —種醫藥組合物，其包含： (a) 如請求項1至4中任一項之化合物； (b) 類固醇消炎劑；及 (c) 藥學上可接受之載劑。 7. 一種治療劑之組合，其包含： (a) 如請求項1至4中任一項之化合物；與 (b) 類固醇消炎劑。 8. —種套件，其包含： (a)第一種醫藥組合物，其包含如請求項1至4中任一項 120149 200811105 之化合:勿與第-種藥學上可接受之載劑；與. 二b)上：：種醫藥組合物，其包含類固醇消炎劑與第二種 樂學上可接受之載劑； 物其中第—種與第二種醫藥組合物係為個別醫藥組合 9. 一種如請求項 中任一項之化合物於藥劑製造上之用 ㈣係用於治療慢性阻塞肺病或氣喘。 K)·-種如請求項U 二而 &今— 貞之化合物於藥劑製造上之用 u :種:亥：劑係在哺乳動物中產生枝氣管擴大作用。 丄· 種如清求1 = /1 1 ^ 、 中任一項之化合物於藥劑製造上之用 腎上腺素能受體。》物中^购體，及催動爲 12· —種使用如 之活蝴# t 、 中任一項之化合物作為研究工具 包括使用如請求項1至4中任一項 匕口物進行生物學檢測。 、 13·=生物學檢物估嫌合物之活料方法，此方 測Γ;使用待測化合物進行生物學檢測，以提供第—個檢 學用Γ請求項1至4中任一項之化合物進行該生物 '讀供弟-個檢測值；其巾步驟⑻係盔…/牛 驟（b)之前、之後或同時進行；及 ”疋在步 (c)將得自步驟夕楚 .lA 一 （）之罘一個檢測值與得自步驟（b)之第 一個檢測值作比較。 （J之弟 120149 200811105 14. 如請求項13之方法，其中生物學檢測為毒蕈鹼受體結合檢 測或/¾腎上腺素能受體結合檢測。 15. —種製備如請求項1之化合物之方法，此方法包括使式6 化合物去除保護：

   其中P1為羥基保護基，以提供式I化合物。 16. —種製備如請求項1之化合物之方法，此方法包括使式6a 化合物去除保護：

   其中Ra、Rb及Rc係獨立選自C1M烷基、苯基、-C]M烷基-(苯 基），或R]a、R1 b及R1 c之一為-0(C】_4烷基）；以提供式I化 合物。 17. —種製備如請求項1之化合物之方法，此方法包括： (a)使式4化合物： 120149 200811105

   其中P為說基保護基，於還原劑存在下反應，以提供式6 化合物：

   與 (b)使式6化合物去除保護，以提供式丨化合物。 18· —種製備如諳、卡 月孓項1之化合物之藥學上可接受鹽之方法 仕匕方〉务包括彳丰g w仗王自由態鹼形式之化合物盥藥風 受之酸接觸。 一条子上可 19· 一種用於贺供Λ 、 如請求項1至4中任一項之化合物 物，其中此中η & ^ 。物之中 甲間物為式III化合物： ]2〇]49 200811105

   其中 Y1 係選自-CH〇、CN、-CH2 OH、CH(OR3 a )〇R3 b、-C(〇)〇H、 -C(0)0R3 c、溴基及碘基，其中R3 a與R3 b係獨立選自6烷 基，或R3 a與b係接合而形成C2 _ 6次烧基，r3 c係選自Ci 6 烧基 ； R2為曱基或乙基； 或其鹽或立體異構物。 20. 如請求項19之化合物，其中”與圮為曱基。 21. 如請求項19之化合物，其中Y〗g_cH〇。 Slit項19之化合物，其中〜咖；且尺1與R2為甲基。 23.如.月求項4之化合，立 T r? rr ，、甲化合物為聯苯-2-基胺甲基酸 (〜{[(R)-2-(3-曱醯胺基冰羥苯 — 二曱AI 匕本基羥乙基胺基]甲基}-2,5- --種如請求項,至4;:之化合物其係供使用於治療上。 途’該藥劑係用於治：肺―病項之化合物於藥劑製造上之用 120149 200811105 七'指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明: 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

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