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MX2008013555A - Compuestos de dialquilfenilo con actividad agonista del receptor b2 adrenergico y antagonista del receptor muscarinico. - Google Patents

Compuestos de dialquilfenilo con actividad agonista del receptor b2 adrenergico y antagonista del receptor muscarinico.

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Publication number
MX2008013555A
MX2008013555A MX2008013555A MX2008013555A MX2008013555A MX 2008013555 A MX2008013555 A MX 2008013555A MX 2008013555 A MX2008013555 A MX 2008013555A MX 2008013555 A MX2008013555 A MX 2008013555A MX 2008013555 A MX2008013555 A MX 2008013555A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
compound
formula
ethyl
methyl
compounds
Prior art date
Application number
MX2008013555A
Other languages
English (en)
Inventor
Adam Hughes
Craig Husfeld
Mathai Mammen
Miroslav Rapta
Pierre-Jean Colson
Original Assignee
Theravance Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Theravance Inc filed Critical Theravance Inc
Publication of MX2008013555A publication Critical patent/MX2008013555A/es

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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/36—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos de fórmula I (ver fórmula I) donde R1 y R2 son según se definió en la memoria descriptiva, o una sal o solvato o esteroisómero del mismo aceptables para uso farmacéutico. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y combinaciones que comprenden dichos compuestos, procesos e intermediarios para preparar dichos compuestos, y métodos para usar dicho compuesto, por ejemplo, para tratar trastornos pulmonares, como por ejemplo enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma.

Description

COMPUESTOS DE DIALQUILFENILO CON ACTIVIDAD AGONISTA DEL RECEPTOR B2 ADRENERGICO Y ANTAGONISTA DEL RECEPTOR MUSCARÍNICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención se refiere a novedosos compuestos de dialquilfenilo con actividad agonista del receptor ß2 adrenérgico y antagonista del receptor muscarinico . Esta invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos, con procesos y con intermediarios para preparar dichos compuestos y con métodos para usar dichos compuestos, por ejemplo, para tratar afecciones pulmonares. Estado de la técnica Los trastornos pulmonares, como por ejemplo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , se tratan comúnmente con broncodilatadores . Un tipo de broncodilatador que se utiliza para tratar trastornos pulmonares consiste en los agonistas del receptor ß2 adrenérgico (adrenoceptor) , como por ejemplo albuterol, formoterol y salmeterol . Dichos compuestos en general se administran por inhalación. Otro tipo de broncodilatadores consiste en los antagonistas del receptor muscarinico (compuestos anticolinérgicos) , como por ejemplo ipratropio y tiotropio. Dichos compuestos típicamente también se administran por inhalación. El uso de composiciones farmacéuticas que contienen una combinación de un agonista del receptor ß2 adrenérgico y un antagonista del receptor muscarínico es conocido en el arte en el tratamiento de trastornos pulmonares. Por ejemplo, la Patente de los EE.UU. No. 6.433.027, otorgada el 13 de Agosto de 2002, revela composiciones de medicamentos que contienen un antagonista del receptor muscarínico, como por ejemplo bromuro de tiotropio, y un agonista del receptor ß2 adrenérgico, como por ejemplo fumarato de formoterol . Además, los compuestos con actividad tanto agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico son conocidos en el arte. Por ejemplo, la Patente de los EE.UU. No. 7.141.671, otorgada el 28 de Noviembre de 2006, revela compuestos de bifenilo con actividad tanto agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico. Los compuestos que poseen tanto actividad agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico son muy deseables porque dichos compuestos proveen broncodilatación a través de dos modos de acción independientes a la vez que tienen una farmacocinética molecular única.
Cuando se tratan trastornos pulmonares, es particularmente útil suministrar agentes terapéuticos que tengan una prolongada duración de acción, es decir, una duración de por lo menos aproximadamente 24 horas, cuando se administran por inhalación, de tal manera que los pacientes solo necesiten administrar el agente terapéutico una vez al día o menos. No todos los compuestos de doble acción revelados anteriormente en el arte poseen esta propiedad deseable . Por lo tanto, existe la necesidad de tener novedosos compuestos con actividad tanto agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico que posean una prolongada duración de acción cuando se administran a un paciente por inhalación. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona novedosos compuestos de dialquilfenilo con actividad tanto agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico. Se ha descubierto que, entre otras propiedades, un compuesto de la presente invención posee una prolongada duración de acción, es decir, una duración de por lo menos aproximadamente 24 horas, cuando se administra a un mamífero por inhalación. Por lo tanto, se espera que los compuestos de la presente invención sean útiles y ventajosos como agentes terapéuticos para tratar trastornos pulmonares. Por lo tanto, en uno de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I donde Rl es metilo o etilo; R2 es metilo o etilo; o una sal o solvato o estereoisómero del mismo aceptable para uso farmacéutico . En un aspecto en particular de la presente invención, el compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula II: donde Rl y R2 son según se definió aquí (incluyendo cualquier forma de realización específica o preferida) ; o una sal o solvato del mismo aceptable para uso farmacéutico . En otro de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo aceptable para uso farmacéutico y un compuesto de fórmula I. Si se desea, los compuestos de la presente invención se pueden administrar en combinación con otros agentes terapéuticos, como por ejemplo un agente antiinflamatorio esteroide. Por lo tanto, en otro de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende (a) un compuesto de fórmula I; y (b) un segundo agente terapéutico. En aún otro de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende (a) un compuesto de fórmula I; (b) un segundo agente terapéutico; y (c) un vehículo aceptable para uso farmacéutico. En aún otro de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a una combinación de agentes terapéuticos, donde dicha combinación comprende (a) un compuesto de fórmula I; y (b) un segundo agente terapéutico. En otro de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a una combinación de composiciones farmacéuticas, donde dicha combinación comprende (a) una primera composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I y un primer vehículo aceptable para uso farmacéutico; y (b) una segunda composición farmacéutica que comprende un segundo agente terapéutico y un segundo vehículo aceptable para uso farmacéutico. La presente invención también se refiere a un conjunto de elementos que contienen dichas composiciones farmacéuticas . Los compuestos de la presente invención poseen tanto actividad agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico. Por lo tanto, se espera que los compuestos de fórmula I sean útiles como agentes terapéuticos para tratar trastornos pulmonares, como por ejemplo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Por lo tanto, en uno de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un método para tratar un trastorno pulmonar, donde dicho método comprende administrar a un paciente que necesita tratamiento una cantidad efectiva para uso terapéutico de un compuesto de fórmula I. La presente invención también se refiere a un método para tratar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, donde dicho método comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva para uso terapéutico de un compuesto de fórmula I. Además, en otro de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un método para producir broncodilatación en un mamífero, donde dicho método comprende administrar a un mamífero una cantidad que produce broncodilatación de un compuesto de fórmula I. La presente invención también se refiere a un método para causar un efecto antagonista sobre un receptor muscarínico y causar un efecto agonista sobre un receptor ß2 adrenérgico en un mamífero, donde dicho método comprende administrar al mamífero un compuesto de fórmula I . Como los compuestos de la presente invención poseen tanto actividad agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico, dichos compuestos también son útiles como herramientas de investigación. Por lo tanto, en aún otro de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un método para usar un compuesto de fórmula I como una herramienta para la investigación, donde dicho método comprende realizar un ensayo biológico usando un compuesto de fórmula I . Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar para evaluar nuevos compuestos químicos. Por lo tanto, en otro de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un método para evaluar un compuesto de prueba en un ensayo biológico, donde dicho método comprende: (a) realizar un ensayo biológico con un compuesto de prueba para dar un primer valor del ensayo; (b) realizar el ensayo biológico con un compuesto de fórmula I para dar un segundo valor del ensayo; donde paso (a) se lleva a cabo ya sea antes, después o en forma concurrente con el paso (b) ; y (c) comparar el primer valor del ensayo que se obtuvo en el paso (a) con el segundo valor del ensayo que se obtuvo en el paso (b) . La presente invención también se refiere a procesos e intermediarios novedosos útiles para preparar compuestos de fórmula I. Por lo tanto, en otro de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un proceso para preparar un compuesto de fórmula I, donde dicho proceso comprende desproteger un compuesto de fórmula 6 (según se definió aquí) para dar un compuesto de fórmula I. En otro de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un proceso para preparar un compuesto de fórmula I, donde dicho proceso comprende: (a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula 4 con un compuesto de fórmula 5 en presencia de un agente reductor para dar un compuesto de fórmula 6; y (b) desproteger el compuesto de fórmula 6 para dar un compuesto de fórmula I; donde los compuestos 4, 5 y 6 son según se definió aquí.
En una forma de realización en particular de la presente invención, los compuestos de fórmula I se preparan desprotegiendo un compuesto de fórmula 6, donde el grupo protector de hidroxilo es un grupo sililo. Por lo tanto, en aún otro de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un proceso para preparar un compuesto de fórmula I, donde dicho proceso comprende desproteger un compuesto de fórmula 6a: donde Ra, Rb y Re se seleccionan independientemente entre Alquilo Cl-4, fenilo, -alquil Cl -4 - ( fenilo) , o un de Ría, Rlb y Rlc es -O- (alquilo Cl-4); para dar un compuesto de fórmula I . En otras formas de realización, los procesos que se describen aquí además comprenden el paso de formar una sal de un compuesto de fórmula I aceptable para uso farmacéutico. En otras formas de realización, la presente invención se refiere a los otros procesos que se describen aquí; y al producto que se prepara mediante cualquiera de los procesos que se describen aquí . En una forma de realización en particular, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula III: o una sal o estereoisómero de los mismos, donde Yl se selecciona entre -CHO, -CN, -CH20H, -CH (OR3a) OR3b, -C(0)OH, -C(0)OR3c, bromo y yodo, donde R3a y R3b se seleccionan independientemente entre alquilo Cl-6, o R3a y R3b están unidos para formar un alquileno C2-6, R3c se selecciona entre alquilo Cl-6; y Rl y R2 son según se definió aquí (incluyendo cualquier forma de realización específica o preferida) , donde dichos compuestos son útiles como intermediarios para preparar compuestos de fórmula I. En una forma de realización en particular de la fórmula III, Rl y R2 son metilo. En otra forma de realización en particular de la fórmula III, Yl es -CHO. En aún otra forma de realización en particular de la fórmula III, Rl y R2 son metilo y Yl es -CHO.
La presente invención también se refiere al uso de un compuesto de fórmula I para terapia. Además, la invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno pulmonar; y al uso de un compuesto de fórmula I como herramienta para la investigación. Aquí se revelan otros aspectos y formas de realización de la presente invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En uno de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a novedosos compuestos de fórmula I. Los compuestos de fórmula I contienen uno o más centros quirales y por lo tanto, a no ser que se indique otra cosa, la presente invención se refiere a mezclas racémicas; estereoisómeros puros (es decir, enantiómeros o diasterómeros) ; mezclas enriquecidas con estereoisómeros, etcétera. Aquellos entrenados en la técnica comprenderán que ccuando en la presente documentación se representa o nombra un estereoisómero en particular, a menos que se indique lo contrario, en las composiciones de esta invención pueden haber cantidades menores de otros estereoisómeros, teniendo en cuenta que la utilidad de la composición como un todo no se vea alterada por la presencia de dichos otros isómeros.
En particular, los compuestos de fórmula I contienen un centro quiral en el átomo de carbono indicado por el símbolo * en la siguiente fórmula parcial: En una forma de realización en particular de la presente invención, el átomo de carbono identificado por el símbolo * tiene la configuración (R) . En esta forma de realización, los compuestos de fórmula I tienen la configuración (R) en el átomo de carbono identificado por el símbolo * o están enriquecidos en una forma estereoisomérica con la configuración (R) en dicho átomo de carbono . Los compuestos de fórmula I también contienen varios grupos básicos (por ejemplo, grupos amino) , y por consiguiente, los compuestos de fórmula I pueden existir como bases libres o en varias formas de sal. Todas estas formas están incluidas dentro del alcance de esta invención. Además, se incluyen solvatos de los compuestos de fórmula I, o sales de éstos, en el alcance de esta invención .
Por lo tanto, aquellos con experiencia en el arte reconocerán que aquí, a no ser que se indique otra cosa, la referencia a un compuesto, por ejemplo, la referencia a un compuesto de fórmula I o compuesto 6, incluye referencia a las sales y estereoisomeros y solvatos de dicho compuesto.
Además, según se usa aquí, las formas en singular "un" "una", "la" y "el" incluyen las correspondientes formas en plural a no ser que el contexto del uso indique claramente otra cosa. La nomenclatura que se utiliza aquí para nombrar los compuestos de la presente invención y sus intermediarios se ha derivado en general usando el software AutoNom que se puede obtener comercialmente (MDL, San Leandro, California) . Típicamente, los compuestos de fórmula I se han nombrado como derivados éster piperidin-4 - ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico . Realizaciones representativas Los siguientes sustituyentes y valores proporcionan ejemplos representativos de varios aspectos y realizaciones de esta invención. Estos valores representativos definen e ilustran adicionalmente dichos y realizaciones, y no pretenden excluir otras realizaciones o limitar el alcance de esta invención. Respecto de esto, se prefiere la representación de un valor o sustituyente particular que no excluya de modo alguno otros valores o sustituyentes de esta invención, a menos que se lo indique en forma específica . En una forma de realización, Rl es metilo y R2 es metilo . En otra forma de realización, Rl es etilo y R2 es etilo . En otra forma de realización, Rl es metilo y R2 es etilo . En otra forma de realización, Rl es etilo y R2 es metilo . Por lo tanto, en uno de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a compuestos de fórmula I que se seleccionan entre: éster 1- [2- (4- { [ (R) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico (compuesto lia); éster 1- [2- (4- { [ (R) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil}-2,5-dietilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto Ilb) ; éster l-[2-(4-{[(R)-2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil}-2-metil-5-etilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lie) ; éster l-[2-(4-{[(R)-2-(3- formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil} -2-etil-5-metilfenilcarbamoil) etil] iperidin-4 -ilico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico (compuesto lid); o una sal de los mismos aceptable para uso farmacéutico . Definiciones Cuando se describen los compuestos, las composiciones, los métodos y los procesos de esta invención, los siguientes términos tienen los significados que se indican a continuación, a menos que se indique lo contrario. El término "alquilo" hace referencia a un grupo hidrocarburo monovalente saturado que puede ser lineal o ramificado. Salvo que se defina lo contrario, dichos grupos alquilo contienen típicamente entre 1 y 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo representativos incluyen, a modo de ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, ter-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo y similares . Cuando se menciona una cantidad específica de átomos de carbono para un término particular en la presente documentación, se indica la cantidad de átomos de carbono antes del término. Por ejemplo, el término "alquilo Cl-3" significa un grupo alquilo con entre 1 y 3 átomos de carbono donde los átomos de carbono están en cualquier configuración aceptable desde el punto de vista químico. El término "alquileno" hace referencia a un grupo hidrocarburo divalente saturado que puede ser lineal o ramificado. A menos que se los defina de otro modo, dichos grupos alquileno típicamente contienen entre 1 y 10 átomos de carbono. Los grupos alquileno representativos incluyen, a modo de ejemplo, metileno, etan- 1 , 2 -diilo ("etileno") , propan-1 , 2-diilo, propan- 1 , 3 -diilo , butan- 1 , 4 -diilo , pentan- 1 , 5 -diilo y similares. El término "grupo protector de amino" hace referencia a un grupo protector adecuado para evitar reacciones indeseadas en un grupo amino. Los grupos protectores de amino representativos incluyen, sin limitaciones, ter-butoxicarbonilo (BOC) , tritilo (Tr) , benciloxicarbonilo (Cbz) , 9 - f luorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , bencilo, formilo, trimetilsililo (TMS) , ter-butildimetilsililo (TBS) y similares . El término "grupo protector de carboxilo" hace referencia a un grupo protector adecuado para evitar reacciones indeseadas en un grupo carboxilo. Los grupos protectores de carboxilo representativos incluyen, sin limitaciones, ésteres, tales como metilo, etilo, ter-butilo, bencilo (Bn) , p-metoxibencilo (PMB) , 9-f luroenilmetilo (Fm) , trimetilsililo (TMS) , ter-butildimetilsililo (TBS) , difenilmetilo (benzhidrilo , DPM) y similares. A no ser que se indique otra cosa, el término "compuesto de la invención" o "compuesto de fórmula I" o "compuesto de fórmula II" según se usa aquí significa el (los) compuesto (s) especificado (s) o una sal o solvato o estereoisómero de los mismos que son aceptables para uso farmacéutico . El término "halo" hace referencia a fluoro, cloro, bromo e yodo . El término "grupo protector de hidroxilo" hace referencia a un grupo protector apropiado para prevenir reacciones indeseables en un grupo hidroxilo. Los grupos protectores de hidroxilo representativos incluyen, sin limitaciones, grupos sililo, incluyendo grupos tri (Cl-6) alquil) sililo, como por ejemplo trimetilsililo (TMS) , trietilsililo (TES) , ter-butildimetilsililo (TBS) y semejantes; ésteres (grupos acilo) incluyendo grupos Cl-6alcanoilo, tales como formilo, acetilo y semejantes; grupos arilmetilo, tales como bencilo (Bn) , p-metoxibencilo (PMB) , 9-fluorenilmetilo (Fm) , difenilmetilo (benzhidrilo, DPM) y similares. Además, pueden protegerse también dos grupos hidroxilo como un grupo alquilideno, como por ejemplo prop-2-ilidina, formado, por ejemplo, a través de una reacción con una cetona, como por ejemplo acetona.
El término "grupo saliente" hace referencia a un grupo funcional o un átomo que puede ser desplazado por otro grupo funcional o átomo en una reacción de sustitución, como por ejemplo una reacción de sustitución nucleofílica . A modo de ejemplo, los grupos salientes representativos incluyen, pero sin limitarse un grupos cloro, bromo e yode-grupos del éster sulfónico, tales como mesilato, tosilato, brosilato, nosilato y semejantes; y grupos aciloxilo, tales como acetoxilo, trifluoroacetoxilo y similares. Cuando el término "diámetro de la media de masa" o "MMD" se utiliza con referencia a partículas significa un diámetro tal que la mitad de la masa de las partículas está contenida en partículas de mayor diámetro y la mitad está contenida en partículas de menor diámetro. El término "micronizada" o "en forma micronizada" significa partículas en las cuales por lo menos aproximadamente un 90 por ciento de las partículas tiene un diámetro menor de aproximadamente 10 m a no ser que se indique otra cosa. El término "o una sal, un solvato o un estereoisómero del mismo aceptable para el uso f rmacéutico" , como por ejemplo se lo utiliza en la presente, incluye todas las permutaciones de sales, solvatos y estereoisómeros , como por ejemplo un solvato de una sal aceptable para el uso farmacéutico de un estereoisómero de un compuesto de fórmula I . El término "sal aceptable para el uso farmacéutico" hace referencia a una sal que es aceptable para administrar a un paciente, como por ejemplo un mamífero (por ejemplo, sales que presentan una seguridad aceptable en un régimen de dosificación para mamíferos) . Las sales representativas aceptables para el uso farmacéutico incluyen sales de ácido acético, ascórbico, bencensulfónico, benzoico, alcanforsulfónico, cítrico, etansulfínico, edisílico, fumárico, gentísico, glucónico, glucurónico, glutámico, hipúrico, bromhídrico , clorhídrico, isetiónico, láctico, lactobiónico , maleico, málico, mandélico, metansulfónico , múcico, naftalensulfónico , naftalen- 1 , 5 -disulfónico , naftalen-2 , 6-disulfónico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluensulfónico, xinafoico y similares. El término "derivados protegidos de los mismos" significa un derivado del compuesto que se especifica donde uno o más grupos funcionales del compuesto están protegidos o bloqueados para impedir que sufran reacciones no deseadas con un grupo protector o bloqueante. Los grupos funcionales que pueden protegerse incluyen, a modo de ejemplo, grupos carboxi, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos tiol, grupos carbonilo y similares. Aquellos con una experiencia normal en el arte conocen bien los grupos protectores apropiados para dichos grupos funcionales, según se puede ver por ejemplo en las descripciones en T . W. Greene y G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Síntesis, tercera edición, Wiley, New York, 1999, y las referencias que se citan allí. El término "sal del mismo" hace referencia a un compuesto formado cuando se reemplaza el hidrógeno de un ácido por un catión, como por ejemplo un catión metálico o un catión orgánico, y similares. En la presente invención, el catión típicamente comprende una forma protonada de un compuesto de fórmula I, es decir donde uno o más grupos amino han sido protonados por un ácido. Preferiblemente, la sal es una sal aceptable para el uso farmacéutico, aunque no se requiere esto para las sales de los compuestos intermediarios que no están dirigidos a la administración a pacientes . El término "solvato" hace referencia a un complejo o un agregado formado por una o más moléculas de un soluto, es decir, un compuesto de fórmula I o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico, y una o más moléculas de un solvente. Dichos solvatos son típicamente sólidos cristalinos con una relación molar de soluto y solvente sustancialmente fija. Algunos solventes representativos son, a modo de ejemplo, agua, metanol, etanol, isopropanol, ácido acético y similares. Cuando el solvente es agua, el solvato formado es un hidrato. El término "cantidad eficaz para terapia" significa una cantidad suficiente para efectuar un tratamiento cuando se administra a un paciente que necesite tratamiento. El término "tratar" o "tratamiento" , como se lo usa en la presente documentación, hace referencia a tratar o al tratamiento de una enfermedad o una condición médica (como por ejemplo la COPD o asma) en un paciente, como por ejemplo un mamífero (particularmente un humano), que incluye : (a) prevenir la ocurrencia de la enfermedad o la condición médica, es decir, el tratamiento profiláctico de un paciente; (b) mejorar la enfermedad o la condición médica, es decir, eliminar o causar la regresión de la enfermedad o la condición médica en un paciente; (c) suprimir la enfermedad o la condición médica, es decir, hacer más lento o detener el desarrollo de la enfermedad o la condición médica en un paciente; o (d) aliviar los síntomas de la enfermedad o la condición médica en un paciente. Todos los otros términos que se utilizan aquí se dan con la intención de que tengan sus significados normales según lo entienden aquellos con una experiencia normal en el arte que les concierne. Procedimientos Generales de Síntesis Los compuestos de la presente invención se pueden preparar a partir de materias primas que se pueden obtener fácilmente usando los siguientes métodos y procedimientos generales o usando otra información que aquellos con una experiencia normal en el arte pueden obtener fácilmente o conocen. Aunque los siguientes procedimientos pueden ilustrar una forma de realización o aspecto en particular de la presente invención, aquellos con experiencia en el arte reconocerán que se pueden preparar otras formas de realización o aspectos de la presente invención usando el mismo método o métodos similares o usando otros métodos, reactivos y materias primas que conocen aquellos con experiencia en el arte. También se apreciará que se dan donde condiciones de proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, proporciones molares de reactivos, solventes, presiones, etc.), a no ser que se especifique otra cosa también se pueden utilizar otras condiciones de proceso. Aunque las condiciones de reacción óptimas típicamente variarán dependiendo de diversos parámetros de reacción como por ejemplo los reactivos, solventes y cantidades que se usen, aquellos con una experiencia normal en el arte pueden determinar fácilmente las condiciones de reacción apropiadas usando procedimientos rutinarios de optimización. Además, como será evidente para aquellos entrenados en la técnica, pueden ser necesarios grupos protectores convencionales para evitar que determinados grupos funcionales sufran reacciones indeseadas . La selección de un grupo protector apropiado para un grupo funcional en particular así como las condiciones y reactivos apropiados para la protección y desprotección de dichos grupos funcionales son bien conocidos en el arte. Si se desea, se pueden utilizar grupos protectores diferentes de aquellos que se ilustran en los procedimientos que se describen aquí . En una forma de realización, los compuestos de fórmula I se sintetizan según se ilustra en el Esquema I: Esquema I donde Pl es un grupo protector de hidroxilo; y R3a y R3b se seleccionan independientemente entre alquilo Cl-6, o R3a y R3b están unidos para formar un alquileno C2-6. Según se muestra en el Esquema I, el compuesto 1 se puede hacer reaccionar con entre aproximadamente 0,95 y aproximadamente 1,05 equivalentes molares del compuesto 2 para dar el compuesto 3. Esta reacción de Michael se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 75 °C, típicamente entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 45 °C, durante entre aproximadamente 8 y aproximadamente 24 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo diclorometano o mezclas de diclorometano y metanol o etanol, etcétera. Al completar la reacción, el producto típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Como alternativa, la mezcla de reacción que contiene el compuesto 3 se puede utilizar directamente en el próximo paso de la síntesis. Luego, el compuesto 3 se hace reaccionar con ácido acuoso para hidrolizar el grupo acetal y dar el compuesto aldehido 4. En esta reacción se puede emplear cualquier ácido apropiado incluyendo, a modo de ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido metansulfónico , ácido p-toluensulfónico, etcétera. La reacción de hidrólisis se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 30 °C, típicamente entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 25 °C, durante entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo metanol, etanol, isopropanol, diclorometano/etanol , acetonitrilo , etcétera. Al completar la reacción, el producto típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Luego se hace reaccionar el compuesto 4 con entre aproximadamente 0,95 y aproximadamente 1,5 equivalentes molares del compuesto 5 en presencia de un agente reductor para dar el compuesto 6. En esta reacción se puede utilizar cualquier apropiada agente reductor incluyendo, como ilustración, un reactivo hidruro de metal, como por ejemplo borohidruro de sodio, triacetoxiborohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, etcétera, o hidrógeno y un metal catalizador, como por ejemplo paladio sobre carbono, etcétera. Esta reacción de alquilación reductiva se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente -20 °C y aproximadamente 30 °C, típicamente entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 5°C, durante entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado y un solvente prótico, como por ejemplo dicloroetano y metanol, etcétera. Al completar la reacción, el producto típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Luego se desprotege el compuesto 6 para dar un compuesto de fórmula I. Las condiciones en particular que se utilizan para desproteger el compuesto 6 dependerán del grupo protector que se emplee. Por ejemplo, cuando Pl es un grupo protector sililo (es decir, un compuesto de fórmula 6a según se definió aquí), como por ejemplo ter-butildimetilsililo , ter-butildifenilsililo , difenilmetilsililo , di-ter-butilmetilsililo, ter-butoxidifenilsililo , etcétera, esta reacción de desprotección se lleva a cabo típicamente poniendo en contacto el compuesto 6a con una fuente de ion fluoruro. En una forma de realización en particular, la fuente de ion fluoruro es trifluorhidrato de trietilamina . Otras fuentes apropiadas de ion fluoruro incluyen fluoruro de tetrabutilamonio , fluoruro de potasio con 18-corona-6, fluoruro de hidrógeno, fluorhidrato de piridina, etcétera. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 50 °C, típicamente entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 25°C, durante entre aproximadamente 24 y aproximadamente 72 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo dicloroetano, etcétera. Al completar la reacción, el producto típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. El compuesto 1 es conocido en el arte o se puede preparar a partir de materias primas y reactivos que se pueden obtener comercialmente usando procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE.UU. Publicación No. U.S. 2004/0167167 Al y R. Naito et al., Chem. Pharm. Bull., 46(8) 1286-1294 (1998). A modo de ejemplo, el compuesto 1 se puede preparar según se ilustra en el Esquema II: Esquema II Según se muestra en el Esquema II, se hace reaccionar bifenil-2-isocianato (7) con una 4 -hidroxipiperidina con el N protegido 8, donde P2 es un grupo protector de amino como por ejemplo un bencilo, para dar el intermediario carbamato 9. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 100°C, típicamente entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 80 °C, durante entre aproximadamente 6 y aproximadamente 24 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. Si se desea, esta reacción se puede realizar en un diluyente apropiado, como por ejemplo diclorometano, tolueno, etcétera. Como alternativa, esta reacción se puede realizar en ausencia de un diluyente. Al completar la reacción, el producto 9 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Como alternativa, la mezcla de reacción que contiene el compuesto 9 se utiliza directamente en el próximo paso de la síntesis. Luego se elimina el grupo protector de amino, P2 , del compuesto 9 usando procedimientos convencionales para dar el compuesto 1. Por ejemplo, cuando P2 es un grupo bencilo, el compuesto 9 se puede desproteger usando hidrógeno o formiato de amonio, en presencia de un catalizador, como por ejemplo un catalizador de paladio. Los catalizadores que sirven como ejemplo incluyen, como ilustración, paladio sobre carbono, hidróxido de paladio sobre carbono, etcétera. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 50°C, típicamente aproximadamente 40 °C, durante entre aproximadamente 6 y aproximadamente 24 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo metanol, etanol, isopropanol, etcétera. Al completar la reacción, el compuesto 1 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Los compuestos de fórmula 2 son conocidas en el arte o se pueden preparar a partir de materias primas y reactivos que se pueden obtener comercialmente usando procedimientos conocidos. Como ilustración, los compuestos de fórmula 2 se pueden preparar según se muestra en el Esquema III: Esquema III Según se muestra en el Esquema III, primero, un compuesto anilina de fórmula 10, donde XI es bromo o yodo, se protege en el grupo amino para dar un compuesto de fórmula 11, donde P3a es un grupo protector de amino y P3b es hidrógeno o un grupo protector de amino. Se puede utilizar cualquier grupo protector de amino apropiado, como por ejemplo bencilo, 4 -metoxibencilo , trifluoroacetilo, etcétera. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar un compuesto de fórmula 10 con aproximadamente 2 o más equivalentes molares, preferiblemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3,0 equivalentes molares, de un halogenuro de bencilo, como por ejemplo cloruro, bromuro o yoduro de bencilo, para dar el compuesto 11 donde P3a y P3b son ambos bencilo. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 50°C, típicamente aproximadamente 30 °C, durante entre aproximadamente 18 y aproximadamente 24 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo metanol, etanol, isopropanol, etcétera. Típicamente, esta reacción también se lleva a cabo en presencia de una base apropiada, como por ejemplo carbonato de potasio, carbonato de sodio, etcétera. Al completar la reacción, el compuesto 11 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera.
Los compuestos representativos de fórmula 10 que se pueden emplear en esta reacción incluyen 2 , 5-dimetil-4-yodoanilina, 2 , 5-dietil-4-yodoanilina, 2 -etil-4 -yodo- 5 -metilanilina, 5-etil-4 -yodo- 2 -metilanilina , 4-bromo-2,5-dimetilanilina, 4 -bromo-2 , 5-dietilanilina, 4-bromo-2-etil-5 -metilanilina, 4-bromo-5-etil-2-metilanilina, etcétera. Dichos compuestos se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Spectra Group Limited, Inc., Millbury, OH) o se pueden preparar a partir de materias primas y reactivos que se pueden obtener comercialmente usando procedimientos convencionales . Luego, el compuesto 11 se pone en contacto con entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 equivalentes molares de un reactivo de alquil litio, como por ejemplo n-butil-litio o ter-butil-litio, para formar el correspondiente anión donde se ha intercambiado el grupo XI por litio. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente -70 °C y aproximadamente 0°C, típicamente aproximadamente -20 °C, durante entre aproximadamente 0,25 y aproximadamente 1 hora o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo tolueno, xileno, tetrahidrofurano , etcétera .
El anión de litio que se obtiene como resultado no se aisla, sino que se hace reaccionar in situ con un exceso molar de N, N-dimetilformamida para dar el compuesto 12. En general, se utilizan entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4 equivalentes molares de N,N-dimetilformamida . Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente -70°C y aproximadamente 0°C, típicamente entre aproximadamente -20°C y aproximadamente 0°C, durante entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. Al completar la reacción, el compuesto 12 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Luego se protege el grupo aldehido del compuesto 12 como un acetal haciendo reaccionar el compuesto 12 con un alcohol o un diol en presencia de un catalizador ácido. En esta reacción se puede utilizar cualquier alcohol o diol apropiado. Por ejemplo, los alcoholes y dioles que sirven como ejemplo incluyen metanol, etanol, n-propanol, etilenglicol , propilenglicol , etcétera. En general, en esta reacción se emplean un exceso molar del alcohol o diol, preferiblemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4 equivalentes molares .
En esta reacción se puede utilizar cualquier catalizador ácido apropiado para facilitar la formación del acetal . Los catalizadores ácidos que sirven como ejemplo incluyen, a modo de ejemplo, ácido p-toluensulfónico, ácido bencensulfónico, ácido clorhídrico, etcétera. La reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 50°C y aproximadamente 100°C, típicamente entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 80 °C, durante entre aproximadamente 12 y aproximadamente 24 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo tolueno, xileno, etcétera. Típicamente, la reacción se lleva a cabo de una manera que permite extraer el agua que se produce, como por ejemplo por destilación azeotrópica o mediante el uso de tamices moleculares . Al completar la reacción, el compuesto 13 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Como alternativa, la mezcla de reacción que contiene el compuesto 13 se puede utilizar directamente en el próximo paso de la síntesis. Después de la formación del acetal, el grupo amino del compuesto 13 se desprotege usando reactivos y condiciones estándar para formar el compuesto 14. Por ejemplo, si P3a y P3b son grupos bencilo, el compuesto 13 se puede desproteger usando hidrógeno y un catalizador, como por ejemplo un catalizador de paladio. Los catalizadores que sirven como ejemplo incluyen, a modo de ejemplo, paladio sobre carbono, hidróxido de paladio sobre carbono, etcétera. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 50 °C, típicamente entre aproximadamente 25 °C y aproximadamente 30 °C, durante entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo metanol, etanol, mezclas etanol/acetato de etilo, etcétera. Al completar la reacción, el compuesto 14 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Luego se hace reaccionar el compuesto 14 con un halogenuro de acriloílo 15, donde X2 es cloro, bromo o yodo, para formar el compuesto 2. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente -20 °C y aproximadamente 25 °C, típicamente entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 5°C, durante entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 6 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo diclorometano, etcétera, en presencia de una base apropiada, como por ejemplo diisopropiletilamina, trietilamina, etcétera. En general, en esta reacción se utilizan entre aproximadamente 1 y 1,2 equivalentes molares del halogenuro de acrilo lo y entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 equivalentes molares de la base. Al completar la reacción, el compuesto 2 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, recristalización, cromatografía, etcétera. Los compuestos de fórmula 5 son conocidas en el arte o se pueden preparar a partir de materias primas y reactivos que se pueden obtener comercialmente usando procedimientos conocidos. Como ilustración, los compuestos de fórmula 5 se pueden preparar según se muestra en el Esquema IV: Esquema IV 18 Según se ilustra en el Esquema IV, los compuestos de fórmula 5 se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula 16, donde P4 es un grupo protector de hidroxilo, como por ejemplo bencilo, y X3 es un grupo saliente, como por ejemplo cloro, bromo o yodo. Los compuestos de fórmula 16 son conocidas en el arte. Por ejemplo, la Patente de los EE.UU. No. 6.268.533 Bl, otorgada el 31 de Julio de 2001; y R. Hett et al., Organic Process Research & Development 1998, 2, 96-99; describen la preparación de N- [2 -benciloxi-5- ( (R) -2-bromo-l-hidroxietil) fenil] formamida (es decir, el enantiómero (R) del compuesto 16, donde P4 es bencilo y X3 es bromo) a partir de 2 -bromo-4 ' -benciloxi-3 ' -nitroacetofenona, cuya síntesis se describe en K. Murase et al., Chem. Pharm. Bull., 25(6) 1368-1377 (1977). Si se desea, la forma racémica del compuesto 16 se puede preparar usando un agente reductor no quiral, como por ejemplo complejo dimetilsulfuro-borano , para reducir la 2-bromo-4'-benciloxi-3 ' -nitroacetofenona . El grupo hidroxilo del compuesto 16 se protege usando procedimientos y reactivos convencionales para dar el compuesto 17, donde Pl es un grupo protector de hidroxilo. En una forma de realización en particular, el grupo protector de hidroxilo es un grupo protector sililo, como por ejemplo dimetilisopropilsililo , dietilisopropilsililo, dimetilhexilsililo, ter-butildimetilsililo, ter-butildifenilsililo, difenilmetilsililo, etcétera. Por ejemplo, el compuesto 16 se puede hacer reaccionar con entre aproximadamente 0,95 y aproximadamente 1,2 equivalentes molares de cloruro de ter-butildimetilsililo en presencia de entre aproximadamente 1,1 y aproximadamente 1,3 equivalentes molares de imidazol para dar el compuesto 17 donde Pl es ter-butildimetilsililo. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 50 °C, típicamente a temperatura ambiente, durante entre aproximadamente 24 y aproximadamente 48 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo N, -dimetilformamida, etcétera. Al completar la reacción, el compuesto 17 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, cromatografía, etcétera. A modo de ilustración adicional, la síntesis de N- { 2 -benciloxi - 5 - [ (R) -2 -bromo- 1- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) etil] fenil } formamida se describe en el Ejemplo 2 de la Patente de los EE.UU. Publicación No. US 2004/0248985 Al, publicada el 9 de Diciembre de 2004. Luego se hace reaccionar el compuesto 17 con una bencil amina (es decir, Bnl-NH2) para dar el compuesto 18, donde Bnl es un grupo bencilo no sustituido o un grupo bencilo sustituido con entre 1 y 3 sustituyentes sobre el anillo fenílico del grupo bencilo que se seleccionan independientemente entre alquilo Cl-4 o alcoxi Cl-4. Las bencil aminas que sirven como ejemplo incluyen, bencilamina, 3 , 4 -dimetoxibencilamina, 4 -metoxibencilamina , 4-metilbencilamina, etcétera. Esta reacción se lleva a cabo típicamente poniendo en contacto el compuesto 17 con entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4 equivalentes molares de la bencil amina a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 100°C, típicamente entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 90 °C, durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 24 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo N-metil - 2 -pirrolidona ( MP) , etcétera. Al completar la reacción, el compuesto 18 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, cromatografía, recristalización, etcétera. La eliminación del grupo bencilo, Bnl , y P4 usando procedimientos y reactivos convencionales da luego el compuesto 5. En una forma de realización, tanto Bnl como P4 son grupos bencilo que se eliminan en la misma mezcla de reacción. Típicamente, esta reacción se lleva a cabo poniendo en contacto el compuesto 5 con hidrógeno en presencia de un catalizador, como por ejemplo un catalizador de paladio. Los catalizadores que sirven como ejemplo incluyen hidróxido de paladio sobre carbono, paladio sobre carbono, etcétera. En general, esta reacción de desbencilación se lleva a cabo en presencia de un ácido, como por ejemplo ácido acético, ácido fórmico, etcétera. Esta reacción se lleva a cabo típicamente a una temperatura que varía dentro del rango entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 50°C, típicamente a temperatura ambiente, durante entre aproximadamente 6 y aproximadamente 24 horas o hasta completar sustancialmente la reacción. En general, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente apropiado, como por ejemplo metanol, etanol, etcétera. Al completar la reacción, el compuesto 5 típicamente se aisla usando procedimientos convencionales, como por ejemplo extracción, cromatografía, etcétera. En una forma de realización en particular, el compuesto 5 se aisla como la sal con ácido acético . Aquellos con una experiencia normal en el arte reconocerán que los compuestos de fórmula I también se pueden preparar mediante otros procedimientos de síntesis. Por ejemplo, se puede cambiar el orden en particular en que se realizan los pasos de síntesis o se pueden emplear intermediarios diferentes. Como ilustración, los compuestos de fórmula III: donde Yl es -CN, -C(0)OH o -C(0)0R3c se pueden reducir usando procedimientos y reactivos convencionales para dar el aldehido 4 (es decir, donde Yl es -CHO) . Además, dichos compuestos se pueden reducir al alcohol, es decir, donde Yl es -CH20H, y el alcohol se puede oxidar luego usando procedimientos y reactivos estándar para dar el aldehido 4 (es decir, donde Yl es -CHO) . Si se desea, se pueden preparar sales aceptables para uso farmacéutico de los compuestos de fórmula I poniendo en contacto la forma de base libre de un compuesto de fórmula I con un ácido aceptable para uso farmacéutico. Detalles adicionales con respecto a condiciones de reacción específicas y otros procedimientos para preparar compuestos representativos de esta invención o intermediarios de los mismos se describen en los Ejemplos que se presentan más adelante. Composiciones, combinaciones y formulaciones farmacéuticas Los compuestos de esta invención se administran típicamente a un paciente bajo la forma de una composición o formulación farmacéutica. Dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al paciente por cualquier ruta de administración aceptable, incluyendo, sin limitaciones, los modos de administración por inhalación, oral, nasal, tópico (que incluye transdérmico) y parenteral . Se comprenderá que podrá usarse cualquier forma de un compuesto de esta invención, (es decir, base libre, sal aceptable para el uso farmacéutico, solvato, etcétera) que sea apropiada para un modo de administración particular, en las composiciones farmacéuticas, según se describe en la presente documentación. Por lo tanto, en uno de sus aspectos como composición, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo o excipiente aceptable para uso farmacéutico y un compuesto de fórmula I. Opcionalmente , si se desea, dichas composiciones farmacéuticas pueden contener otros agentes terapéuticos y/o de formulación. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención típicamente contienen una cantidad efectiva para uso terapéutico de un compuesto de fórmula I. Sin embargo, aquellos con experiencia en el arte reconocerán que una composición farmacéutica puede contener más de una cantidad efectiva para uso terapéutico, es decir, composiciones globales, o menos de una cantidad efectiva para uso terapéutico, es decir, unidades de dosificación individuales diseñadas para administración múltiple para conseguir una cantidad efectiva para uso terapéutico. Típicamente, la composición farmacéutica contendrá entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 95 por ciento en peso del agente terapéutico; incluyendo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 30 por ciento en peso; como por ejemplo entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 por ciento en peso del agente terapéutico . Puede usarse cualquier vehículo o excipiente convencional en las composiciones farmacéuticas de esta invención. La selección de un vehículo o excipiente particular, o de combinaciones de vehículos o excipientes, dependerá del modo de administración usado para tratar un paciente, o del tipo de trastorno médico o estado de enfermedad particular. Respecto de esto, la preparación de una composición farmacéutica adecuada para un modo de administración particular está dentro del alcance de los especialistas en la técnica farmacéutica. Los vehículos o excipientes usados en las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden adquirir en el comercio. Por ejemplo, dichos materiales se pueden adquirir en Sigma (St. Louis, MO) . A modo de ilustración adicional, aquellos con una experiencia normal en el arte conocen bien las técnicas de formulación convencionales según se puede ver por ejemplo en las descripciones de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); y H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999) . Los ejemplos representativos de materiales que pueden servir como vehículos aceptables para el uso farmacéutico incluyen, sin limitaciones, los siguientes: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetil celulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol ; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol ; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones amortiguadoras de fosfato; (21) gases propelentes comprimidos, tales como clorofluorocarburos y fluorohidrocarburos ; y (22) otras sustancias no tóxicas compatibles empleadas en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas de esta invención se preparan típicamente mezclando o combinando de forma exhaustiva e íntima un compuesto de la invención con un vehículo aceptable para el uso farmacéutico y cualquier ingrediente opcional. Si resulta necesario o se lo desea, luego puede moldearse la mezcla uniformemente combinada resultante, o puede cargársela en tabletas, cápsulas, pildoras, recipientes, cartuchos, dosificadores y semejantes, usando procedimientos y equipos convencionales.
En una realización, las composiciones farmacéuticas de esta invención son apropiadas para una administración por inhalación. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administrar por inhalación típicamente tomarán la forma de un aerosol o un polvo. Dichas composiciones se administran generalmente usando dispositivos de administración bien conocidos, tales como un nebulizador de inhalación, un inhalador de dosis medidas (MDI) , un inhalador de polvo seco (DPI) o un dispositivo de administración similar. En una realización específica de esta invención, la composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico se administra por inhalación usando un nebulizador de inhalación. Dichos dispositivos nebulizadores producen típicamente una corriente de aire a alta velocidad que hace que la composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico se vaporice como una niebla que se lleva dentro del tracto respiratorio del paciente. Por lo tanto, cuando se fórmula para utilizar en un inhalador nebulizador, el agente terapéutico se disuelve típicamente en un vehículo apropiado para formar una solución. Como alternativa, el agente terapéutico se puede micronizar y combinar con un vehículo apropiado para formar una suspensión de partículas micronizadas . Los dispositivos nebulizadores apropiados para administrar agentes terapéuticos por inhalación son bien conocidas por aquellos con una experiencia normal en el arte o dichos dispositivos se pueden obtener comercialmente . Por ejemplo, los dispositivos o productos nebulizadores que sirven como ejemplo incluyen el Inhalador Respimat Softmist (Boehringer Ingelheim) ; el Sistema de Administración Pulmonar AERx (Aradigm Corp.); el Nebulizador Reutilizable PARI LC Plus (Pari GmbH); etcétera.
Una composición farmacéutica para utilizar en un inhalador nebulizador que sirve como ejemplo comprende una solución acuosa isotónica que comprende entre aproximadamente 0,05 g/ml y aproximadamente 10mg/ml de un compuesto de fórmula I. En una forma de realización, una solución con dichas características tiene un pH de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6. En otra realización específica de esta invención, la composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico se administra por inhalación usando un inhalador de polvo seco. Dichos inhaladores de polvo seco típicamente administran el agente terapéutico como un polvo de flujo libre que se dispersa en la corriente de aire que inspira el paciente. Para conseguir un polvo que fluye libremente, típicamente el agente terapéutico se fórmula con un excipiente apropiado como por ejemplo lactosa, almidón, manitol, dextrosa, ácido poliláctico (PLA) , co-glucólido de polilactida (PLGA) o combinaciones de los mismos. Típicamente, el agente terapéutico se microniza y combina con un vehículo apropiado para formar una mezcla apropiada para inhalación. Por lo tanto, en una forma de realización de la invención, el compuesto de fórmula I está en forma micronizada. Una composición farmacéutica para utilizar en un inhalador de polvo seco que sirve como ejemplo comprende lactosa molida seca y partículas micronizadas de un compuesto de fórmula I. Dicha formulación de polvo seco puede prepararse, por ejemplo, combinando la lactosa con el agente terapéutico, y luego mezclando los componentes en seco. Como alternativa, si se lo desea, puede formularse el agente terapéutico sin un excipiente. Luego se carga típicamente la composición farmacéutica en un dispositivo de administración de polvos secos, o en recipientes o cápsulas de inhalación para usar con un dispositivo de administración de polvos secos. Los dispositivos inhaladores para administración de polvo seco que son apropiados para administrar agentes terapéuticos por inhalación son bien conocidos por aquellos con una experiencia normal en el arte o dichos dispositivos se pueden obtener comercialmente . Por ejemplo, los dispositivos o productos inhaladores para administración de polvo seco que sirven como ejemplo incluyen Aeolizer ( ovartis ) ; Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed) ; Diskhaler (GlaxoSmithKline ) ; Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline) ; Easyhaler (Orion Pharma) ; Eclipse (Aventis) ; FlowCaps (Hovione) ; Handihaler (Boehringer Ingelheim) ; Pulvinal (Chiesi) ; Rotahaler (GlaxoSmithKline) ; SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma) ; Twisthaler (Schering-Plough) ; Turbuhaler (AstraZeneca) ; Ultrahaler (Aventis) ; etcétera.
En aún otra realización especifica de esta invención, la composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico se administra por inhalación usando un inhalador de dosis medidas. Dichos inhaladores de dosis medida típicamente descarga una cantidad medida del agente terapéutico usando un gas propelente comprimido. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas administradas usando un inhalador de dosis medidas típicamente comprenden una solución o suspensión de agente terapéutico en un propelente licuado. Puede emplearse cualquier propelente licuado apropiado, incluyendo clorofluorocarburos , tales como CC13F, y fluorohidroalcanos (HFA) , tales como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) y 1 , 1 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 -heptafluoro-n-propano, (HFA 227) . Debido a los peligros que representan los clorofluorocarburos sobre la capa de ozono, en general se prefieren las formulaciones que contienen HFA. Los componentes adicionales de las formulaciones de HFA incluyen co- solventes , tales como etanol o pentano, y agentes tensioactivos , tales como trioleato de sorbitan, ácido oleico, lecitina y glicerina. Una composición farmacéutica representativa para utilizar en un inhalador de dosis medida comprende entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 5% en peso de un compuesto de la fórmula I; entre aproximadamente 0% y aproximadamente 20% en peso de etanol; y entre aproximadamente 0% y aproximadamente 5% en peso de tensioactivo ; donde el resto es un propelente de HFA. Dichas composiciones típicamente se preparan agregando un fluorohidroalcano enfriado o presurizado a un recipiente apropiado que contiene el agente terapéutico, etanol (si está presente) y agente tensioactivo (si está presente) . Para preparar una suspensión, el agente terapéutico se microniza y luego se combina con el propelente. Luego se carga la formulación en un recipiente metálico de aerosol, que forma una porción de un dispositivo inhalador de dosis medida . Los dispositivos inhaladores de dosis medida que son apropiados para administrar agentes terapéuticos por inhalación son bien conocidas por aquellos con una experiencia normal en el arte o dichos dispositivos se pueden obtener comercialmente . Por ejemplo, los dispositivos o productos inhaladores de dosis medida que sirven como ejemplo incluyen: Sistema Inhalador AeroBid (Forest Pharmaceuticals) ; Aerosol para Inhalación Atrovent (Boehringer Ingelheim) ; Flovent (GlaxoSmithKline) ; Inhalador Maxair (3M) ; Inhalador Proventil (Schering) ; Aerosol para Inhalación Serevent (GlaxoSmithKline) ; etcétera . En otra realización, las composiciones farmacéuticas de esta invención son adecuadas para administración oral.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas para administración oral pueden tomar la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, pastillas, sachets, grageas, polvos, gránulos; o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como emulsiones líquidas de aceite en agua o agua en aceite; o como elíxires o jarabes; y semejantes; donde cada uno contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como ingrediente activo. Cuando se desee una administración oral en una forma de dosificación sólida (es decir, como cápsulas, tabletas, pildoras y semejantes) , las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenderán típicamente un compuesto de la presente invención, como ingrediente activo, y uno o más vehículos aceptables para el uso farmacéutico, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio. Opcionalmente o como alternativa, dichas formas de dosificación sólidas pueden comprender también: (1) rellenos o extensores, tales como almidonas, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes desintegradores, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos, y/o carbonato de sodio; (5) agentes que demoran la solubilización, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como alcohol cetílico y/o monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y/o arcilla bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio y/o mezclas de los mismos; (10) agentes colorantes; y (11) agentes amortiguadores. También puede haber agentes de liberación, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes saborizantes y aromas, conservantes y antioxidantes presentes en las composiciones farmacéuticas de esta invención. Los ejemplos de antioxidantes aceptables para el uso farmacéutico incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y semejantes; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa- tocoferol y semejantes; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y semejantes. Los agentes de recubrimiento para tabletas, cápsulas, pildoras y semejantes incluyen aquellos usados para recubrimientos entéricos, tales como ftalato de acetato de celulosa (CAP) , ftalato de acetato de polivinilo (PVAP) , ftalato de hidroxipropil metilcelulosa , copolímeros del éster de ácido metacrílico, trimelitato de acetato de celulosa (CAT) , carboximetiletilcelulosa (CMEC) , succinato de acetato de hidroxipropil metil celulosa (HPMCAS) , y semejantes. Si se lo desea, las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden formularse para obtener la liberación lenta o controlada del ingrediente activo usando, a modo de ejemplo, hidroxipropil metil celulosa en proporciones variables; u otras matrices de polímeros, liposomas y/o microesferas . Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener opcionalmente agentes opacantes y pueden formularse de modo que liberen el ingrediente activo solamente, o con preferencia, en una determinada porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente de una manera demorada. Los ejemplos de composiciones de embebido que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede estar en una forma micro-encapsulada, si resulta apropiado, con uno o más de los excipientes descriptos previamente. Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen, a modo de ilustración, emulsiones, microemulsiones , soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires aceptables para el uso farmacéutico. Dichas formas de dosificación líquidas comprenden típicamente el ingrediente activo y un diluyente inerte, tal como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico , carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1 , 3 -butilenglicol , aceites (especialmente aceite de semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, castor y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Las suspensiones, además del ingrediente activo, pueden contener agentes de suspensión, tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílieos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos. Cuando se desea una administración oral, las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden envasar en una forma de dosificación unitaria. El término "forma de dosificación unitaria" hace referencia a una unidad física discreta adecuada para dosificar a un paciente, es decir, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de agente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, ya sea solo o en combinación con una o más unidades adicionales. Por ejemplo, dichas formas de dosificación unitaria pueden ser cápsulas, comprimidos, pildoras y similares. Los compuestos de esta invención también pueden administrarse por vía transdérmica , usando sistemas de administración transdérmica y excipientes conocidos. Por ejemplo, puede mezclarse un compuesto de esta invención con potenciadores de la permeabilidad, tales como propilenglicol , monolaurato de polietilenglicol , azacicloalcan- 2 -onas y semejantes, e incorporarse en un parche o un sistema de administración similar. Pueden usarse excipientes adicionales, incluyendo agentes gelatinizantes , emulsionantes y amortiguadores, en dichas composiciones transdérmicas , si se lo desea. Además, los compuestos de esta invención se pueden administrar por vía parenteral, es decir, endovenosa, subcutánea o intramuscular. Para administración parenteral, un compuesto de fórmula I típicamente se disuelve en un vehículo aceptable para administración parenteral, como por ejemplo agua estéril, solución salina, aceite vegetal, etcétera. A modo ilustrativo, una composición endovenosa típicamente comprende una solución acuosa estéril de un compuesto de fórmula I, en el cual la solución tiene un pH dentro del rango entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7. Si se desea, los compuestos de la presente invención se pueden se pueden administrar en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes. En esta forma de realización, un compuesto de la presente invención ya sea se mezcla físicamente con el otro agente terapéutico para formar una composición que contiene ambos agentes; o bien cada agente está presente en composiciones separadas y distintas que se administran al paciente simultáneamente o en forma consecutiva. Por ejemplo, se puede combinar un compuesto de fórmula I con un segundo agente terapéutico usando procedimientos y equipo convencionales para formar una composición que comprende un compuesto de fórmula I y un segundo agente terapéutico. Además, los agentes terapéuticos se pueden combinar con un vehículo aceptable para uso farmacéutico para formar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I, un segundo agente terapéutico y un vehículo aceptable para uso farmacéutico. En esta forma de realización, los componentes de la composición típicamente se mezclan para crear una mezcla física. Luego, la mezcla física se administra en una cantidad efectiva para uso terapéutico usando cualquiera de las rutas descritas aquí .
Como alternativa, los agentes terapéuticos pueden permanecer por separado y como sustancias distintas antes de administrarlos al paciente. En esta forma de realización, los agentes terapéuticos no se mezclan físicamente entre sí antes de la administración pero se administran simultáneamente o en forma consecutiva como composiciones por separado. Por ejemplo, un compuesto de fórmula I se puede administrar por inhalación simultáneamente o en forma consecutiva con otro agente terapéutico usando un dispositivo de administración por inhalación que emplea compartimientos separados (por ejemplo envases de tipo blister) para cada agente terapéutico. Como alternativa, la combinación se puede administrar usando dispositivos de administración separados, es decir, un dispositivo de administración para cada agente terapéutico. Además, los agentes terapéuticos se pueden suministrar por diferentes rutas de administración, es decir, uno por inhalación y el otro por administración oral. En combinación con dichos compuestos se puede utilizar cualquier agente terapéutico compatible con los compuestos de la presente invención. En una forma de realización en particular, the segundo agente terapéutico es uno que se puede administrar efectivamente por inhalación. Como ilustración, los tipos de agentes terapéuticos que se pueden utilizar con los compuestos de la presente invención que sirven como ejemplo incluyen, pero no como limitación, agentes antiinflamatorios, como por ejemplo agentes antiinflamatorios esteroides (incluyendo corticoesteroides y glucocorticoides) , agentes antiinflamatorios no esteroides (NSAIDs) , e inhibidores de PDE4 ; broncodilatadores , como por ejemplo inhibidores de PDE3 , moduladores de adenosina 2b y agonistas del receptor ß2 adrenérgico; agentes antiinfecciosos, como por ejemplo antibióticos para Gram-positivas , antibióticos para Gram-negativas, y agentes antivirales; antihistamínicos ; inhibidores de proteasa; bloqueantes aferentes, como por ejemplo D2 agonistas y moduladores de neuroquinina; y antagonistas del receptor muscarinico (agentes anticolinérgicos ) . Hay numerosos ejemplos de dichos agentes terapéuticos que son bien conocidos en el arte. Las dosis apropiadas para los otros agentes terapéuticos que se administran en combinación con un compuesto de la invención están típicamente dentro del rango entre aproximadamente 0,05 pg/día y aproximadamente 500mg/día. En una forma de realización en particular de la presente invención, un compuesto de fórmula I se administra en combinación con un agente antiinflamatorio esteroide . Los ejemplos representativos de agentes antiinflamatorios esteroides que se pueden utilizar en combinación con los compuestos de la presente invención incluyen, pero no como limitación, dipropionato de beclometasona; budesonide; butixocort como propionato; 20R- 16a, 17a- [butilidenobis (oxi) ] -6a, 9a-difluoro- 11 ß -hidroxi - 17 ß - (metiltio) androsta-4 -en- 3 -ona (RPR-106541) ; ciclesonide ; dexametasona ; éster S-fluorometílico del ácido 6a, 9a-difluoro- 17a- [ ( 2 - furanilcarbonil ) oxi] -li -hidroxi-16a-metil-3-oxoandrosta-l,4-dieno-17B-carbotioico; éster S-fluorometílico del ácido 6a, 9a-difluoro- ??ß-hidroxi- 16a-metil-17a-[(4-metil-l, 3 -tiazol- 5 -carbonil ) oxi] - 3 -oxoandrosta- 1 , 4-dieno-17ß-carbotioico; éster (S)-(2-oxotetrahidrofuran-3S- ílico) del ácido 6a, 9a-difluoro- 11 ß -hidroxi- 16a-metil- 3 -oxo- 17a-propioniloxiandrosta-l , 4 -dieno-17ß-carbotioico; flunisolide; propionato de fluticasona; metil prednisolona ; furoato de mometasona; prednisolona; prednisona; rofleponide ; ST-126; triamcinolona acetonida; etcétera, o sales de los mismos aceptables para uso farmacéutico. Dichos agentes antiinflamatorios esteroides se pueden obtener comercialmente o se pueden preparar usando procedimientos y reactivos convencionales. Por ejemplo, la preparación y uso de agentes antiinflamatorios esteroides se describe en la Patente de los EE.UU. No. 6.750.210 B2, otorgada el 15 de Junio de 2004; Patente de los EE.UU. No. 6.759.398 B2 , otorgada el 6 de Julio de 2004; Patente de los EE.UU. No. 6.537.983, otorgada el 25 de Marzo de 2003; la Solicitud de Patente de los EE.UU. Publicación No. US 2002/0019378 Al, publicado el 14 de Febrero de 2002; y las referencias que se citan allí. Cuando se emplea, el agente antiinflamatorio esteroide se administra típicamente en una cantidad que produce un efecto terapéutico benéfico cuando se administra en conjunto con un compuesto de la invención. Típicamente, el agente antiinflamatorio esteroide se administrará en una cantidad suficiente para obtener entre aproximadamente 0,05 yg y aproximadamente 500 yg por dosis. Los siguientes ejemplos ilustran composiciones farmacéuticas representativas de la presente invención: Ejemplo A Composición de polvo seco Un compuesto micronizado de la invención (lOOmg) con lactosa molida (25 g) (por ejemplo, lactosa donde no más de aproximadamente 85% de las partículas tienen una MMD de entre aproximadamente 60 pm y aproximadamente 90 µta y no menos del 15% de las partículas tienen una MMD menor de 15 µp?) . Luego se carga esta mezcla en blisters individuales de un paquete de tipo blister pelable en una cantidad suficiente como para proveer entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 500 pg del compuesto de la invención por dosis. Los contenidos de los blisters se administran usando un inhalador de polvo seco.
Ejemplo B Composición de polvo seco Se mezcla un compuesto micronizado de la invención (1 g) con lactosa molida (200 g) para formar una composición suelta con una proporción en peso de forma de base libre cristalina a lactosa molida de 1:200. La composición mezclada se envasa dentro de un dispositivo para inhalación de polvo seco capaz de suministrar entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 500 g del compuesto de la invención por dosis. Ejemplo C Composición de polvo seco Se mezclan un compuesto micronizado de la invención (lOOmg) y un agente antiinflamatorio esteroide micronizado (500mg) con lactosa molida (30 g) . Luego se carga esta mezcla dentro de blisters individuales de un paquete de tipo blister pelable en una cantidad suficiente como para proveer entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 500 pg del compuesto de la invención por dosis. Los contenidos de los blisters se administran usando un inhalador de polvo seco . Ejemplo D Composición para inhalador de dosis medida Se dispersa un compuesto micronizado de la invención (10 g) en una solución que se prepara disolviendo lecitina (0,2 g) en agua desmineralizada (200 mi) . La suspensión que se obtiene como resultado se seca por aspersión y luego se microniza para formar una composición micronizada que comprende partículas con una medios del diámetro menor de aproximadamente l,5pm. Luego se carga la composición micronizada dentro de cartuchos para inhalador de dosis medida que contienen 1 , 1, 1, 2-tetrafluoroetano presurizado en una cantidad suficiente como para proveer entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 500 pg del compuesto de la invención por dosis cuando se administra mediante el inhalador de dosis medida. Ejemplo E Composición para nebulizador Se disuelve un compuesto de la invención (25mg) en solución salina isotónica de pH amortiguado al citrato (pH 5) (125 mi) . La mezcla se agita y sónica hasta que el compuesto se disuelve. El pH de la solución se controla y ajusta, de ser necesario, a pH 5 agregando lentamente hidróxido de sodio acuoso 1N. La solución se administra usando un dispositivo nebulizador que suministra entre aproximadamente 10 xg y aproximadamente 500 pg del compuesto de la invención por dosis. Ejemplo F Cápsulas de gelatina dura Se mezclan íntimamente un compuesto de la invención (50 g) , lactosa secada por aspersión (440 g) y estearato de magnesio (10 g) . La composición que se obtiene como resultado se carga en una cápsula de gelatina dura (500mg de composición por cápsula) que se administra en forma oral . Ejemplo G Suspensión oral Los siguientes ingredientes se mezclan íntimamente para formar una suspensión para administración oral: Ingredientes Cantidad Compuesto de la invención 1,0 g Ácido fumárico 0,5 g Cloruro de sodio 2,0 g Metil parabeno 0,15 g Propil parabeno 0,05 g Azúcar granulado 25,5 g Sorbitol (solución al 70%) 12,8 g VEEGU ® K (silicato de magnesio y aluminio) 1,0 g Sabor 0, 035 mi Colorante 0 , 5mg Agua destilada c.s.p. 100 mi La suspensión que se obtiene como resultado contiene lOOmg de ingrediente activo por 10 mi de suspensión. La suspensión se administra en forma oral.
Ejemplo H Composición inyectable Se mezcla un compuesto de la invención (0,2 g) con solución amortiguadora de pH al acetato de sodio 0,4 M (2,0 mi) . El pH de la solución que se obtiene como resultado se ajusta a pH 4 usando ácido clorhídrico acuoso 0,5 N o hidróxido de sodio acuoso 0,5 N, según sea necesario, y luego se agrega suficiente agua para inyección como para dar un volumen total de 20 mi. Luego se filtra la mezcla a través de un filtro estéril (0,22 micrón) para dar una solución estéril apropiada para administrar por inyección.
Utilidad Los compuestos de la presente invención poseen tanto actividad agonista del receptor ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico y por lo tanto, se espera que dichos compuestos sean útiles como agentes terapéuticos para tratar condiciones médicas mediadas por receptores ß2 adrenérgicos o receptores muscarínicos , es decir, condiciones médicas que mejoran por tratamiento con un agonista del receptor ß2 adrenérgico o un antagonista del receptor muscarínico. Aquellos con una experiencia normal en el arte conocen bien dichas condiciones médicas según se puede ver por ejemplo en las descripciones de Eglen et al., Muscarinic Receptor Subtypes : Pharmacology and Therapeutic Potential, DN&P 10(8), 462-469 (1997); Emilien et al., Current Therapeutic Uses and Potential of beta-Adrenoceptor Agonists and Antagonists, European J. Clinical Pharm., 53(6), 389-404 (1998); y las referencias que se citan allí. Dichas condiciones médicas incluyen, a modo de ejemplo, trastornos pulmonares o enfermedades asociadas con obstrucción reversible de las vías respiratorias, como por ejemplo enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica y sibilante y enfisema) , asma, fibrosis pulmonar, etcétera. Otras condiciones incluyen el parto prematuro, la depresión, la deficiencia cardiaca congestiva, las enfermedades de la piel (por ejemplo, enfermedades inflamatorias, alérgicas, psoriásicas y proliferativas , condiciones en las cuales es deseable disminuir la acidez péptica (por ejemplo, úlcera peptídica y gástrica) y enfermedad de desgaste muscular. Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención se refiere a un método para tratar un trastorno pulmonar, donde dicho método comprende administrar a un paciente que necesita tratamiento una cantidad efectiva para uso terapéutico de un compuesto de fórmula I. Cuando se utilizan para tratar un trastorno pulmonar, los compuestos de la presente invención típicamente se administrarán por inhalación en varias dosis por día, en una única dosis por día o una única dosis por semana. En general, la dosis para tratar una afección pulmonar variará entre aproximadamente 10 pg/día y aproximadamente 500 yg/día . En uno de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un método para tratar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, donde dicho método comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva para uso terapéutico de un compuesto de fórmula I. En general, la dosis para tratar COPD o asma variará dentro del rango entre aproximadamente 10 pg/día y aproximadamente 500 pg/día. Aquellos con una experiencia normal en el arte entienden que el término "COPD" incluye una variedad de condiciones respiratorias, que incluyen bronquitis obstructiva crónica y enfisema, según se puede ver por ejemplo en las descripciones de Barnes, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, N. Engl . J. Med. , 2000: 343:269-78, y las referencias que se citan allí. Cuando se los administra por inhalación, los compuestos de esta invención típicamente tienen el efecto de producir broncodilatación . Por lo tanto, en otro de sus aspectos como método, la presente invención se refiere a un método para producir broncodilatación en un mamífero, donde dicho método comprende administrar a un mamífero una cantidad que produce broncodilatación de un compuesto de fórmula I. En general, la dosis para producir broncodilatación variará dentro del rango entre aproximadamente 10 pg/día y aproximadamente 500 pg/día. Cuando se utilizan como agentes terapéuticos, los compuestos de la presente invención se administran opcionalmente en combinación con otro agente o agentes terapéuticos. En particular, mediante la administración de los compuestos de la presente invención con un agente antiinflamatorio esteroide, se puede conseguir una terapia triple, es decir, actividad agonista del receptor ß2 adrenérgico, actividad antagonista del receptor muscarínico y actividad antiinflamatorio, usando solo dos agentes terapéuticos. Como las composiciones farmacéuticas (y sus combinaciones) que contienen dos agentes terapéuticos son típicamente más fáciles de formular y/o administrar en comparación con las composiciones que contienen tres agentes terapéuticos, dichas composiciones de dos componente proveen una ventaja significativa con respecto a las composiciones que contienen tres agentes terapéuticos. Por lo tanto, en una forma de realización en particular, las composiciones farmacéuticas, combinaciones y métodos de la presente invención además comprenden un agente antiinflamatorio esteroide. Como los compuestos de la presente invención poseen tanto actividad de agonista ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico, dichos compuestos también son útiles como herramientas de investigación para investigar o estudiar sistemas biológicos o muestras con receptores ß2 adrenérgicos o receptores muscarínicos . Además, dichos compuestos son útiles en ensayos de clasificación para descubrir, por ejemplo, nuevos compuestos tanto con actividad de agonista ß2 adrenérgico como actividad antagonista del receptor muscarínico. Dichos sistemas biológicos o muestras pueden comprender receptores ß2 adrenérgicos y/o receptores muscarínicos. En dichos estudios, que se pueden llevar a cabo ya sea in vitro o in vivo, se puede emplear cualquier sistema biológico o muestra apropiados con receptores ß2 adrenérgicos y/o muscarínicos. Los sistemas o las muestras biológicas representativas apropiadas para dichos estudios incluyen, sin limitaciones, células, extractos celulares, membranas plasmáticas, muestras de tejido, mamíferos (tales como ratones, ratas, cerdos de guinea, conejos, perros, cerdos, etcétera) y semejantes. Cuando se utiliza como herramienta para la investigación, un sistema biológico o muestra que comprende un receptor ß2 adrenérgico y/o un receptor muscarínico que típicamente se pone en contacto con una cantidad de un compuesto de la presente invención que causa un efecto agonista sobre un receptor ß2 adrenérgico o una cantidad de un compuesto de la presente invención que causa un efecto antagonista sobre un receptor muscarínico . Luego se determinan o miden los efectos sobre el sistema biológico o muestra que causa el compuesto usando procedimientos convencionales y equipo, como por ejemplo midiendo la unión en un ensayo de unión a un radioligando o cambios mediados por un ligando en un ensayo funcional o determinando la magnitud de la broncoprotección provista por el compuesto en un ensayo de broncoprotección en un mamífero. Los cambios mediados por un ligando en un ensayo funcional que sirven como ejemplo incluyen cambios mediados por un ligando en el adenosina monofosfato cíclico (AMPc) intracelular; cambios mediados por un ligando en la actividad de la enzima adenilato ciclasa (que sintetiza el AMPc) ; cambios mediados por un ligando en la incorporación de guanosina 51 -0- ( tio) trifosfato ([35S]GTP S) en membranas aisladas a través del intercambio catalizado por receptores del [35S]GTP S por GDP; cambios mediados por un ligando en los iones calcio intracelulares libres (medidas, por ejemplo, con un lector de imágenes ligadas a la fluorescencia en placas o FLIPR® de Molecular Devices, Inc.); etcétera. Se espera que los compuestos de la presente invención causen un efecto agonista o causen la activación de un receptor ß2 adrenérgico y antagonicen o disminuyan la activación de receptores muscarínicos en los ensayos funcionales de la lista que se da aquí o en ensayos de una naturaleza similar. Los compuestos de la presente invención se utilizarán típicamente en dichos estudios en una concentración que varía dentro del rango entre aproximadamente 0,1 nanomolar y aproximadamente 100 nanomolar. Además, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar como herramientas de investigación para evaluar otros compuestos químicos. En este aspecto de la invención, un compuesto de fórmula I se utiliza como estándar en un ensayo para permitir la comparación de los resultados que se obtienen con un compuesto de prueba y el compuesto de fórmula I. Por ejemplo, los datos de unión del receptor ß2 adrenérgico y/o receptor muscarínico (según se determinan, por ejemplo, mediante ensayos in vitro de desplazamiento de radioligando) para un compuesto de prueba o un grupo del compuestos de prueba se comparan con los datos de unión del receptor ß2 adrenérgico y/o receptor muscarínico para un compuesto de fórmula I para identificar aquellos compuestos de prueba que tienen un efecto ligante deseable, es decir compuestos de prueba con un efecto ligante aproximadamente igual o superior al de un compuesto de fórmula I, si es que tienen alguno. Como alternativa, por ejemplo, se pueden determinar los efectos broncoprotectores para los compuestos de prueba y un compuesto de fórmula I en un ensayo de broncoprotección en un mamífero y estos datos se pueden comparar para identificar compuestos de prueba que proporcionen efectos broncoprotectores aproximadamente iguales o superiores . Dicho aspecto de la invención incluye, como formas de realización separadas, tanto (i) la generación de datos de comparación (usando los ensayos apropiados) y (ii) el análisis de los datos de prueba para identificar compuestos de prueba de interés . Las propiedades y la utilidad de los compuestos de la presente invención se pueden demostrar usando diversos ensayos in vitro e in vivo bien conocidos por aquellos con una experiencia normal en el arte. Por ejemplo, en los siguientes Ejemplos se describen con mayor detalle ensayos que sirven como ejemplo. EJEMPLOS Las siguientes Preparaciones y Ejemplos se proveen para ilustrar realizaciones y aspectos específicos de esta invención. Sin embargo, la ilustración de formas de realización y aspectos específicos, no se da para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera a no ser que se indique específicamente. Todos los reactivos, materias primas y solventes que se utilizan en los siguientes ejemplos se adquirieron de proveedores comerciales (como por ejemplo Aldrich, Fluka, Sigma, etcétera) y, a no ser que se indique otra cosa, se utilizaron sin más purificación. En los siguientes ejemplos, el análisis por HPLC se llevó a cabo típicamente usando un instrumento Agilent (Palo Alto, CA) Serie 1100 con columnas Zorbax Bonus RP 2,1 x 50 mm, provisto por Agilent, (una columna C14), con un tamaño de partícula de 3,5 micrones . La detección se realizó por absorbancia UV a 214 nm. La fase móvil "A" consistía en acetonitrilo al 2 %, 97,9 % de agua, y 0,1% de ácido trifluoroacético (v/v/v) ; y la fase móvil "B" consistía en 89,9 % de acetonitrilo, 10 % de agua, y 0,1 % de ácido trifluoroacético (v/v/v) . Los datos de HPLC (10-70) se obtuvieron con una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto de gradiente de 10% a 70% de fase móvil B durante un período de 6 minutos. Los datos de HPLC (5-35) se obtuvieron con una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto de gradiente de 5% a 35% de fase móvil B durante un período de 5 minutos; y Los datos de HPLC (10-90) se obtuvieron con una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto de gradiente de 10% a 90% de fase móvil B durante un período de 5 minutos. Los datos de cromatografía líquida con espectrometría de masas (LCMS) se obtuvieron típicamente con un instrumento Applied Biosystems (Foster City, CA) Modelo API-150EX. Los datos de LCMS 10-90 se obtuvieron con un gradiente de 10% a 90% de fase móvil B durante un periodo de 5 minutos . Las purificaciones a pequeña escala típicamente se llevaron a cabo usando un sistema API 150EX Prep Workstation de Applied Biosystems. La fase móvil "A" consistía en agua que contenía 0,05% de ácido trifluoroacético (v/v) ; y la fase móvil "B" consistía en acetonitrilo que contenía 0,05% de ácido trifluoroacético (v/v) . Para pequeñas muestras (tamaño de muestra recuperada de entre aproximadamente 3 y 50mg) , típicamente se utilizaron las siguientes condiciones: velocidad de flujo 20 ml/min; gradientes de 15 min y una columna 20 mm x 50 mm Prism RP con partículas de 5 micrones (Termo Hypersil-Keystone, Bellefonte, PA, EEUU). Para muestras más grandes (es decir, muestra sin tratar mayor de aproximadamente lOOmg) , típicamente se utilizaron las siguientes condiciones: velocidad de flujo 60 ml/min; gradientes de 30 min y una columna 41,4 mm x 250 mm Microsorb BDS con partículas de 10 micrones (Varían, Palo Alto, CA, EEUU) . Ejemplo 1 Ester piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico Se calentaron juntos bifenil-2-isocianato (97,5 g, 521 mmol) y 4-hidroxi-l-bencilpiperidina (105 g, 549 mmol) (ambos se pueden obtener comercialmente de Aldrich, Milwaukee, WI) a 70°C durante 12 h, durante cuyo tiempo se monitoreó la formación de éster l-bencilpiperidin-4-ílico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico por LCMS . Luego se enfrió la mezcla de reacción a 50°C y se agregó etanol (1 L), y luego se agregó ácido clorhídrico 6M (191 mi) lentamente. Luego se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se agregó formiato de amonio (98,5 g, 1,56 mol) y se burbujeó gas nitrógeno a través de la solución vigorosamente durante 20 min. Luego se agregó paladio (10 % peso en peso (seco) sobre carbón activado) (20 g) . La mezcla de reacción se calentó hasta 40°C durante 12 h y luego se filtró a través de un lecho de Celite. Luego se eliminó el solvente bajo presión reducida y se agregó ácido clorhídrico 1M (40 mi) al residuo sin tratar. Luego se agregó hidróxido de sodio (ION) para ajustar el pH a 12. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 mi) y se secó (sulfato de magnesio) , y luego se eliminó el solvente bajo presión reducida para dar el éster piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (155 g, 100%) . HPLC (10-70) Rt = 2,52; MS m/z: [M + H+] calculado para C18H20N2O2 297,15; encontrado 297,3. Ejemplo 2 Ácido 3- [4- (bifenil - 2 - ilcarbamoiloxi ) piperidin-1-il] propiónico A una solución de éster piperidin-4 -ilico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (50 g, 67,6 mmol) en diclorometano (500 mi) se le agregó ácido acrilico (15,05 mi, 100 mmol) . La mezcla resultante se calentó hasta 50°C bajo reflujo durante 18 horas y luego se eliminó el solvente. Se agregó metanol (600 mi) y esta mezcla se calentó hasta 75°C durante 2 horas y luego se enfrió a la temperatura ambiente para formar una suspensión espesa. El sólido se recolectó por filtración, se lavó con metanol (50 mi) y se secó al aire para dar ácido 3 - [4 - (bifenil- 2 -ilcarbamoiloxi) piperidin-l-il] propiónico (61g, 96% de pureza) como un polvo blanco. Ejemplo 3 Sal con ácido acético de la N- { 5- [ (R) -2-Amino-l- (ter-butildimetilsilaniloxi) etil] -2-hidroxifenil } formamida Paso A - N-{5-[(R)-2 -Bencilamino- 1- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) etil] -2 -benciloxifenil } formamida A un matraz de fondo redondo con tres bocas de 500 mi se agregó N- {2-benciloxi-5- [ (R) -2-bromo-l- (ter-butildimetilsilaniloxi ) etil] fenil } formamida (100 g, 215 mmol) y N-metil-2 -pirrolidona (300 mi) . Se agregó bencilamina (69,4 mi, 648 mol) y la mezcla de reacción se desgaseó con nitrógeno. Luego se calentó la mezcla de reacción hasta 90 °C y se agitó durante aproximadamente 8 horas . Luego se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se agregaron agua (1,5 L) y acetato de etilo (1,5 L) . Se separaron las capas y la fase orgánica se lavó con agua (500 mi), una mezcla 1:1 de agua y salmuera saturada (500 mi en total) , y luego nuevamente con agua (500 mi) . Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y concentró bajo presión reducida para dar N- { 5 -[ (R) -2 -bencilamino- 1- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) etil] -2 -benciloxifenil } formamida en bruto (100 g, 90% de rendimiento, 75-80% de pureza) como un aceite espeso anaranjado-marrón. Paso B - Sal con ácido acético de la N- { 5- [ (R) -2-Amino-1- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) etil] -2-hidroxifenil } formamida Se disolvió N- { 5 - [ (R) -2 -bencilamino- 1- ( ter-butildimetilsilaniloxi) etil] -2 -benciloxifenil } formamida en bruto (100 g, 194 mmol) en metanol (1 L) y ácido acético (25 mi, 291 mmol) . La mezcla resultante se purgó con nitrógeno seco y luego se agregó hidróxido de paladio sobre carbono (20 g, 20 % peso en peso, aproximadamente 50% de agua) . Se burbujeó hidrógeno a través de la mezcla de reacción agitando a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 horas. Luego se purgó la mezcla con nitrógeno seco y la mezcla se filtró a través de Celite. El filtrado se concentró en un evaporador rotatorio y se agregó acetato de etilo (600 mi) al residuo. Esta mezcla se agitó durante aproximadamente 2 horas, después de cuyo tiempo se desarrolló una suspensión amarilla espesa. La suspensión se filtró y el precipitado se secó al aire para dar la sal con ácido acético de la N- { 5- [ (R) -2-Amino-l- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) etil] - 2 -hidroxifenil } formamida (48 g, 98% de pureza) como un sólido amarillo-blancuzco. LCMS (10-70) Rt = 3,62; [M + H+] encontrado 311,3. Ejemplo 4 Ester 1- [2- (4- { [ (R) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico Paso A - 2 , 5-dimetil-4 -nitrobenzoato de metilo A una solución agitada de ácido 2 , 5-dimetil-4 -nitrobenzoico (480mg, 2,4 mmol) en metanol seco (8,2 mi) a 0°C bajo nitrógeno seco se le agregó cloruro de tionilo (0,538 mi, 7,38 mmol) . La mezcla resultante se dejó entibiar hasta la temperatura ambiente y se agitó durante aproximadamente 7 horas. Se agregó más cloruro de tionilo (0,300 mi) y se siguió agitando a temperatura ambiente durante toda la noche. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró bajo presión reducida para dar 2 , 5-dimetil-4-nitrobenzoato de metilo (578 mg) como un sólido amarillo pálido. HPLC (10-70) Rt = 4,61; 1H RMN (300 MHz, CDC13) d 2,57 (s, 3H) , 2,61 (s, 3H) , 3,94 (s, 3H) , 7,82 (s, 1H) , 7,87 (s, 1H) . Paso B - 4 -amino- 2 , 5 -dimetilbenzoato de metilo A una solución agitada de 2 , 5-dimetil-4 -nitrobenzoato de metilo (523 mg, 2,5 mmol) en una mezcla 9:1 de metanol y agua (25 mi en total) a 0°C se le agregó cloruro de amonio (401 mg, 7,5 mmol) . Se agregó cinc (1,63 g, 25 mmol) en porciones y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción luego se filtró a través de Celite y el lecho de Celite se lavó con metanol. El filtrado se concentró bajo presión reducida y el residuo que se obtuvo como resultado se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró bajo presión reducida para dar 4-amino- 2 , 5 -dimetilbenzoato de metilo (450mg) como un aceite amarillo. 1H RMN (300 MHz, CDC13) d 2,14 (s, 3H) , 2,53 (s, 3H) , 3,83 (s, 3H) , 3,85 (br s, 2H) , 6,48 (s, 1H) , 7,72 (s, 1H) . Paso C - 4 - { 3 - [4 - (Bifenil-2 - ilcarbamoiloxi ) piperidin-1- il] propionilamino} -2 , 5 -dimetilbenzoato de metilo A una solución agitada de ácido 3- [4- (bifenil-2-ilcarbamoiloxi) piperidin-l-il] propiónico (670mg, 1,82 mmol) y 4 -amino- 2 , 5 -dimetilbenzoato de metilo (390mg, 2,18 mmol) en diclorometano (3,6 mi) y diisopropiletilamina (0,413 mi) se le agregó hexafluorofosfato de 0- (7-azabenzotriazol-l-il) -1, 1, 3 , 3-tetrametiluronio (HATU) (829 mg, 2,18 mmol) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Luego se lavó la mezcla con bicarbonato de sodio acuoso saturado, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con diclorometano que contenía entre 3% y 5% de metanol para dar 4 - { 3 - [4 - (Bifenil-2 -ilcarbamoiloxi) piperidin- 1 - il] propionilamino} -2,5-dimetilbenzoato de metilo (568 mg, 59% de rendimiento) . LCMS (10-70) Rt = 4,55; [M + H+] encontrado 530,4. Paso D - Ester 1- [2- (4-Hidroximetil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico A una solución agitada de hidruro de aluminio y litio 1M en THF (1,52 mi, 1,52 mmol) a 0°C se le agregó 4-{3-[4- (Bifenil-2-ilcarbamoiloxi) piperidin-l-il] propionilamino} -2 , 5 -dimetilbenzoato de metilo (400mg, 0,76 mmol) . La mezcla resultante se agitó a 0°C durante 30 minutos y luego se agregó una mezcla 1:1 de hidróxido de sodio acuoso 1M (5 mi) y agua (5 mi) y se siguió agitando durante 2 horas. Se agregó diclorometano y se separó la fase orgánica, se secó sobre sulfato de sodio y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con diclorometano que contenía 5% de metanol para dar el éster 1 - [2 - (4 -Hidroximetil-2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico. LCMS (10-70) Rt = 3 , 94 ; [M + H+] encontrado 502,5. Paso E - éster 1- [2- (4 -Fortnil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico A una solución de éster 1- [2- (4-hidroximetil-2, 5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (151 mg, 0,3 mmol) en diclorometano (3 mi) a 0°C se le agregó dimetil sulfóxido (128 pL, 1,8 mmol) y diisopropiletilamina (157 L, 0,9 mmol). Después de 15 minutos, se agregó complejo de trióxido de azufre y piridina (143 mg, 0,9 mmol) y se continuó agitando a 0°C durante 1 hora. Se agregó agua para detener la reacción y se separaron las capas . La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y el solvente se eliminó bajo presión reducida para dar el éster l-[2-(4-formil-2, 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (150mg, 100% de rendimiento), que se utilizó sin más purificación. [M + H+] encontrado 500,4.
Paso F - éster 1- [2 - ( 4 - { [ (R) - 2 - ( ter-butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) etilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] iperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico Se agitó una solución de éster 1- [2- (4-formil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (150mg, 0,30 mmol) y N-{5-[(R)-2-amino-1- ( ter-butildimetilsilaniloxi) etil] -2-hidroxifenil } formamida (112 mg, 0,36 mmol) en una mezcla 1:1 de diclorometano y metanol (3,0 mi en total) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregó triacetoxiborohidruro de sodio (191 mg, 0,9 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se agregó ácido acético para detener la reacción y la mezcla se concentró bajo presión reducida para dar el éster 1- [2- (4- {[ (R) -2- (ter-butildimetilsilaniloxi ) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil ) etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico, que se utilizó sin más purificación. LCMS (10-70) Rt = 4,55; [M + H+] encontrado 794,6. Paso G - éster 1 - [2 - (4 - { [ (R) -2 - ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil -2 -ilcarbámico A una suspensión de éster 1- [2- (4- { [ (R) -2- (ter-butildimetilsilaniloxi) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico (238 mg, 0,30 mmol) en diclorometano (3,0 mi) se le agregó trifluorhidrato de trietilamina (147 ]i ¡, 0,90 mmol) . Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche y luego la mezcla se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por prep-RP-HPLC (gradiente: 2 a 50% de acetonitrilo en agua con 0,05% de TFA) . Se recogieron las fracciones apropiadas y se combinaron y liofilizaron para dar el éster 1- [2 - (4 - { [ (R) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil } -2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico como la sal ditrif luoroacetato (50mg, 97% de pureza) . LPLC (2-90) Rt = 2,76; [M + H+] encontrado 680,8. Ejemplo 5 Éster l- [2-(4-{ [(R)-2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2 - ilcarbámico Paso A - Dibencil- (4-yodo-2 , 5 -dimetilfenil ) amina A un matraz de fondo redondo de 2 litros equipado con un agitador superior, control de temperatura y un embudo para adiciones se le agregó 4-yodo-2 , 5 -dimetilanilina (100,0 g, 0,405 mol) (de Spectra Group Limited, Inc., Millbury, OH) . Se agregaron etanol (1 L) y carbonato de potasio sólido (160 g, 1,159 mol) y luego se agregó bromuro de bencilo puro (140 mi, 1,179 mol) en una porción. La mezcla resultante se agitó a 30 °C durante aproximadamente 18 horas, después de cuyo tiempo la HPLC mostró una conversión mayor del 98%. Luego se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente y se agregaron hexanos (1 L) . Esta mezcla se agitó durante 15 minutos y luego se filtró a través de un filtro de papel para eliminar sólidos y la torta del filtro se lavó con hexanos (200 mi) . Se redujo el volumen del filtrado usando un rotoevaporador hasta aproximadamente 500 mi y se agregó ácido clorhídrico concentrado (30 mi) . Luego se eliminó el solvente restante usando un rotoevaporador. Al residuo que se obtuvo como resultado se le agregaron hexanos (500 mi) y esta mezcla se agitó durante aproximadamente 30 minutos tras cuyo tiempo se formó una suspensión que fluía libremente. La suspensión se filtró y la torta del filtro se lavó con hexanos (200 mi) y se secó para dar clorhidrato de dibencil- (4-yodo-2 , 5-dimetilfenil ) amina (115 g, 62% de rendimiento, 97,5% de pureza) como un sólido de color verdoso.
El clorhidrato de dibencil- (4-yodo-2 , 5-dimetilfenil) amina se transfirió a un matraz de 3 L y se agregaron tolueno (1 L) e hidróxido de sodio acuoso 1 M (1 L) . La mezcla resultante se agitó durante 1 hora y luego se separaron las capas . La fase orgánica se lavó con salmuera diluida (500 mi) y el solvente se eliminó por rotoevaporación para dar dibencil- (4-yodo-2 , 5-dimetilfenil) amina (80 g) como un aceite espeso semisólido. (Como alternativa, en este paso se puede utilizar diclorometano en vez de tolueno) . 1H RMN (300 MHz , DMSO-d6) d 2,05 (s, 3H), 2,19 (s, 3H) , 3,90 (s, 4H) , 6,91 (s, 1H) , 7,05-7,20 (m, 10H) , 7,42 (s, 1H) ; MS [M + H+] encontrado 428. Paso B - clorhidrato de 4 -dibencilamino-2 , 5-dimetilbenzaldehído A un matraz de fondo redondo de 1 litro de 3 bocas equipado con un agitador superior, control de temperatura y un embudo para adiciones se le agregó dibencil- (4 -yodo- 2 , 5-dimetilfenil) amina (15 g, 35 mmol) . Se agregó tolueno (300 mi) y la mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 15 minutos. El matraz de reacción se purgó con nitrógeno seco y se enfrió hasta aproximadamente -20 °C y se agregó gota a gota n-butil-litio 1,6 M en hexanos (33 mi, 53 mmol) mediante el embudo para adiciones. Durante la adición, la temperatura interna de la mezcla de reacción se mantuvo por debajo de los -10°C. Cuando se completó la adición, la mezcla resultante se agitó a aproximadamente -15°C durante 15 minutos. Luego se agregó N, N-Dimetilformamida (10 mi, 129 mmol) gota a gota mientras se mantenía la temperatura interna de la mezcla de reacción por debajo de 0°C. Luego se agitó la mezcla resultante a entre -20°C y 0°C durante aproximadamente 1 hora. Luego se agregó ácido clorhídrico acuoso 1 M (200 mi) durante un período de 5 minutos y la mezcla resultante se agitó durante 15 minutos. Luego se separaron las capas y la fase orgánica se lavó con salmuera diluida (100 mi) . Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y el solvente se eliminó bajo presión reducida para dar clorhidrato de 4-dibencilamino-2 , 5 -dimetilbenzaldehído (11,5 g, 90% de rendimiento, 95% de pureza) como un aceite espeso que solidificó al quedar en reposo. El producto contenía entre aproximadamente 3 y 5 % del subproducto des -yodado. 1H RMN (300 MHz, CDC13) d 2 , 4 2 (s, 3H ) , 2 , 50 (s, 3H ) , 4 , 2 5 (s, 4H) , 6,82 (s, 1H) , 7,10-7,30 (10H, m) , 7,62 (1H, s), 10,15 (1H, s) ; MS [M + H+] encontrado 330,3. Paso C - 4- [1, 3] Dioxolan-2-il-2 , 5-dimetilfenilamina A un matraz de fondo redondo de 500 mi se le agregó clorhidrato de 4 -dibencilamino- 2 , 5 -dimetilbenzaldehído (11,5 g, 31,4 mmol) y tolueno (150 mi) y la mezcla resultante se agitó hasta que la sal se disolvió completamente. Luego se purgó el matraz de reacción con nitrógeno seco durante 5 minutos. Se agregaron etilenglicol (5,25 mi, 94,2 mmol) y ácido p-toluensulfónico (760mg, 6,2 mmol) y la mezcla resultante se calentó hasta 60°C entre 80°C durante aproximadamente 20 horas. Luego se eliminó el solvente lentamente (durante aproximadamente 40 minutos) a 40°C en un evaporador rotatorio. Se agregó tolueno (100 mi) al residuo y se volvió a eliminar lentamente el solvente a 40 °C en un evaporador rotatorio. Este proceso se repitió usando otra alícuota de tolueno (100 mi) y la mezcla se evaporó a sequedad. Se agregaron acetato de etilo (150 mi) y bicarbonato de sodio acuoso saturado (100 mi) al residuo y se separaron las capas . La fase orgánica se lavó con salmuera (50 mi) y luego se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida para dar dibencil- (4 - [1 , 3 ] dioxolan- 2 - il -2 , 5 -dimetilfenil) amina en bruto (11,4 g) . La dibencil- (4- [1, 3] dioxolan-2-il-2 , 5-dimetilfenil ) amina en bruto se disolvió en una mezcla 2:1 de etanol y agua (150 mi en total) y la mezcla resultante se purgó con nitrógeno seco durante 5 minutos. Se agregaron paladio sobre carbono (2,3 g, 10 % peso en peso que contenía aproximadamente 50% de agua) y bicarbonato de sodio sólido (1,0 g) y la mezcla resultante se hidrogenó a aproximadamente 1 atm de hidrógeno a entre 25°C y 30 °C durante aproximadamente 8 horas. Luego se filtró la mezcla a través de Celite y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio para dar 4 - [1 , 3 ] dioxolan-2 - il - 2 , 5 -dimetilfenilamina en bruto (5,6 g, 92% de rendimiento) como un aceite espeso. 1H RMN (300 MHz , DMSO-d6) d 2,05 (s, 3H) , 2,22 (s, 3H) , 3,7-3,9 (m, 4H) , 3,95 (s, 4H) , 5,59 (s, 1H) , 6,72 (s, 1H) , 7,0-7,25 (m, 11H) . Paso D - N- (4 - [1,3] Dioxolan-2 - il-2 , 5 -dimetilfenil) acrilamida A un matraz de 500 mi de fondo redondo se le agregó 4- [1, 3] dioxolan-2-il-2 , 5 -dimetilfenilamina en bruto (5,6 g, 29 mmol) , diclorometano (100 mi) y diisopropiletilamina (7,6 mi, 43,5 mmol) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente hasta que se disolvieron los ingredientes y luego la mezcla se enfrió a 0°C. Luego se agregó cloruro de acriloilo (2,35 mi, 29 mmol) gota a gota durante un período de 5 minutos . La mezcla de reacción se agitó a entre 0°C y 5°C durante 1 hora y luego se agregó agua (50 mi) y se siguió agitando durante aproximadamente 30 minutos tras cuyo tiempo se formó un sólido fino. La mezcla se filtró para recoger los sólidos. Luego se separaron las capas del filtrado y la fase orgánica se concentró bajo presión reducida a sequedad. Se agregó diclorometano (50 mi) al residuo y esta mezcla se agitó hasta que se desarrolló una suspensión que fluía libremente. La suspensión se filtró (usando el mismo embudo que se utilizó para recoger los sólidos finos que se acaban de mencionar) y la torta del filtro se lavó con diclorometano (10 mi) y se secó para dar N-(4- [1, 3] dioxolan-2-il-2 , 5 -dimetilfenil ) acrilamida (3,1 g, 97% de pureza) como un sólido blanco a blancuzco. Luego se evaporó a sequedad el filtrado anterior y se agregó metanol (10 mi) al residuo. Esta mezcla se agitó durante 15 minutos y luego el precipitado se recolectó por filtración, se lavó con metanol (5 mi) y se secó para dar una segunda cosecha de N- (4 - [1,3] dioxolan-2 - il - 2 , 5 -dimetilfenil) acrilamida (0,8 g, 95% de pureza). 1H RMN (300 MHz, CD30D) d 2,10 (s, 3H), 2,23 (s, 3H) , 3,85-4,10 (m, 4H) , 5,60-6,40 (m, 3H) , 5,59 (s, 1H) , 7,18 (s, 1H) , 7,23 (s, 1H) . Paso E - éster 1- [2 - (4 - formil- 2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como clorhidrato A un matraz de 50 mi de fondo redondo se le agregó éster piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (1,2 g, 4,04 mmol) y N- (4 - [1 , 3] dioxolan- 2 - il-2 , 5 -dimetilfenil ) acrilamida (1,0 g, 4,04 mmol). Se agregaron etanol (10 mi) y diclorometano (10 mi) para formar una suspensión. La mezcla de reacción se calentó hasta entre 45°C y 50°C durante aproximadamente 18 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó ácido clorhídrico 1M acuoso (10 mi) y la mezcla resultante se agitó vigorosamente durante aproximadamente 3 horas . Se agregó diclorometano (10 mi) y la mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 5 minutos . Luego se separaron las capas y la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró en un evaporador rotatorio para dar el áster 1- [2- (4-formil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como clorhidrato en bruto (1,9 g) . 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) d 1,2-1,4 (m, 2H) , 1,58-1,75 (m, 2H) , 2,0-2,17 (m, 2H) , 2,19 (s, 3H) , 2,38 (s, 3H) , 2,41-2,50 (m, 4H) , 2,5-2,75 (m, 2H) , 4,31-4,42 (m, 1H) , 7,10-7,35 (m, 9H) , 7,55 (s, 1H) , 7,75 (s, 1H) , 8,59 (s, 1H) , 9,82 (s, 1H) , 9,98 (s, 1H) ; MS [M + H+] encontrado 500,2. Paso F - áster 1- [2- (4- { [ (R) -2- ( ter- Butildimetilsilaniloxi) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) etilamino] metil } - 2 , 5 -dimetilfenil -carbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico A un matraz de 2 L de fondo redondo con tres bocas se agregó áster 1- [2 - ( 4 - formil-2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como clorhidrato (38 g, 70 mmol) y sal con ácido acético de la N- { 5 - [ (R) -2 -Amino- 1- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) etil] -2 -hidroxifenil } formamida (33,6 g, 91 mmol) . Se agregaron diclorometano (500 mi) y metanol (500 mi) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno seco durante aproximadamente 3 horas. Luego se enfrió la mezcla de reacción hasta entre 0°C a 5°C y se agregó triacetoxiborohidruro de sodio sólido (44,5 g, 381 mmol) en porciones durante un período de 10 minutos. La mezcla de reacción se calentó lentamente desde 0°C hasta la temperatura ambiente durante un período de aproximadamente 2 horas y luego se enfrió a 0°C. Se agregaron bicarbonato de sodio acuoso saturado (500 mi) y diclorometano (500 mi) . Esta mezcla se agitó intensamente y luego se separaron las capas . La fase orgánica se lavó con salmuera (500 mi), se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida para dar el éster 1- [2- (4-{ [ (R) -2- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) -2- (3-formilamino-4 -hidroxifenil) etilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico en bruto (55 g, 86% de pureza) como un sólido amarillo. El producto sin tratar (30 g) se disolvió en diclorometano que contenía 2% de metanol (150 mi en total) y se cargó en la parte superior de una columna de gel de sílice (300 g) previamente empacada y equilibrada con diclorometano que contenía 2% de metanol y 0,5% de hidróxido de amonio. El producto se eluyó de la columna usando diclorometano que contenía 2% de metanol y 0,5% de hidróxido de amonio (1 L) ; diclorometano que contenía 4% de metanol y 0,5% de hidróxido de amonio (1 L) y diclorometano que contenía 5% de metanol y 0,5% de hidróxido de amonio (aproximadamente 3 L) . Se recogieron fracciones (200 mi) y se combinaron aquellas fracciones con una pureza mayor que 90% y se concentraron bajo presión reducida para dar el éster 1- [2- (4- { [ (R) -2- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) etilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (21,6 g, 96,5% de pureza) como un sólido amarillento. MS [M + H+] encontrado 794,6. Paso G - Sal fluorhidrato del éster 1- [2- (4- { [ (R) -2-(3-formilamino-4-hidroxifenil) - 2 -hidroxietilamino] metil } - 2 , 5-dimetilfenil-carbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2 -ilcarbámico A un matraz de 1 L de fondo redondo se le agregó éster l-[2-(4-{[(R)-2- (ter-butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4 -hidroxifenil ) etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] iperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (21,5 g, 27,1 mmol) y diclorometano (200 mi) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente hasta que se disolvieron los ingredientes y luego se agregó trifluorhidrato de trietilamina (8,85 mi, 54,2 mraol) y la mezcla resultante se agitó a 25 °C durante aproximadamente 48 horas. El solvente se eliminó en un evaporador rotatorio para dar una pasta espesa. Se agregaron diclorometano (100 mi) y acetato de etilo (200 mi) a la pasta y la mezcla resultante se agitó durante 30 minutos. La suspensión que se obtuvo como resultado se filtró lentamente bajo nitrógeno seco y la torta del filtro se lavó con una mezcla 1:2 de diclorometano y acetato de etilo (100 mi en total) , se secó bajo nitrógeno durante 2 horas y luego se secó al vacío durante toda la noche para dar el éster 1- [2 - (4 -{[ (R) - 2 -( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil) - 2 -hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - Ilico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como una sal fluorhidrato (25 g, 96,9% de pureza) que era un sólido duro similar a una arcilla. MS [M + H+] encontrado 680,8. Paso H - éster 1- [2 - (4 -{[ (R) - 2 -( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil) -2 -hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ilico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico Se purificó la sal fluorhidrato del éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2-hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ilico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (25 g) on a de 6 pulgadas columna de fase inversa (fase sólida Microsorb) en tres lotes iguales usando una mezcla entre 10 % y 50 % de acetonitrilo en agua que contenía 1% de ácido trifluoroacético como fase móvil. Se combinaron las fracciones con más del 99% de pureza y luego se diluyeron con un volumen de agua. La mezcla resultante se enfrió a 0°C y se agregó bicarbonato de sodio sólido hasta que el pH de la mezcla fue de entre aproximadamente 7,5 y 8,0. Dentro de un tiempo de aproximadamente 5 minutos, se desarrolló una suspensión blanca. La suspensión se agitó durante 30 minutos y luego se filtró. La torta del filtro se lavó con agua (500 mi) , se secó al aire durante aproximadamente 4 horas y luego se secó al vacío durante toda la noche para dar el éster l-[2-(4- { [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil } -2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (12 g, 99+% de pureza) , como una base libre semi-cristalina . Ejemplo 6 Éster 1- [2- (4- { [ (R) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil) - 2 -hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico Paso A - éster 1- [2 - (4 - [1 , 3 ] Dioxolan- 2 - il-2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil- 2 - ilcarbámico A un matraz de 500 mi de fondo redondo se le agregaron éster piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (17,0 g, 58 mmol) y N- (4 - [1 , 3 ] dioxolan- 2 - il-2 , 5 -dimetilfenil ) acrilamida (13,1 g, 52,9 mmol). Se agregaron etanol (150 mi) y diclorometano (150 mi) para formar una suspensión. La mezcla de reacción se calentó hasta entre 50 °C y 55 °C durante aproximadamente 24 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. La mayor parte del solvente se eliminó en un evaporador rotatorio, obteniendo como resultado una suspensión espesa. Se agregó etanol (grado reactivo) para formar un volumen total de aproximadamente 200 mi y la mezcla resultante se calentó hasta 80°C y luego se enfrió lentamente a temperatura ambiente. La suspensión blanca espesa que se obtuvo como resultado se filtró, se lavó con etanol (20 mi) y se secó al vacío para dar el éster l-[2-(4-[l,3] Dioxolan- 2- il-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (23,8 g, aproximadamente 98% de pureza) como un blanco sólido. Paso B - Éster 1 - [2 - (4 - formil-2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico A un matraz de 500 mi de fondo redondo se le agregó éster 1- [2- (4- [1,3] Dioxolan-2-il-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] iperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (15 g, 27,6 mmol) y acetonitrilo (150 mi) para formar una suspensión. Se agregó ácido clorhídrico acuoso 2 M (75 mi) y la mezcla resultante se agitó a 30°C durante 1 hora. Luego se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente y se agregó acetato de etilo (150 mi) . Se agregó hidróxido de sodio acuoso 2 M (75 mi) , se controló el pH y se agregó más hidróxido de sodio 2 M hasta que el pH de la solución estuvo dentro del rango entre 9 y 10. Se separaron las capas y la fase orgánica se lavó con salmuera diluida (75 mi; salmuera/agua 1:1), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio para dar el éster 1- [2 - (4 - formil-2 , 5 -dimetilfenil-carbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (12,5 g, aproximadamente 98% de pureza) . Si se desea, se puede aumentar la pureza de este intermediario formando una suspensión con etanol (3 volúmenes de etanol), calentando la suspensión a 80°C, y luego enfriando lentamente a temperatura ambiente y aislando por filtración. Paso C - éster 1- [2- (4- { [ (R) -2- (ter- Butildimetilsilaniloxi ) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) etilimino] metil} -2, 5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico A un matraz de 250 mi de fondo redondo se le agregó éster 1- [2- (4-formil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (7,1 g, 14,2 mmol) y sal con ácido acético de la N- { 5- [ (R) -2 -Amino-1- ( ter-butildimetilsilaniloxi) etil] -2 -hidroxifenil } formamida (5, 8 g, 15,6 mmol) . Se agregó metanol (100 mi) para formar una suspensión y esta mezcla se agitó a entre 45°C y 50°C bajo nitrógeno durante 1 hora. Luego se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente y se le agregó tolueno (50 mi) y el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio a una temperatura dentro del rango entre 35°C y 45°C. Se agregó tolueno (50 mi) al residuo y se eliminó el solvente para dar el éster 1- [2- (4- {[ (R) -2- (ter-Butildimetilsilaniloxi) -2- ( 3 -formilamino-4 -hidroxifenil) etilimino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (12 g) como un sólido amarillo-anaranjado. Paso D - éster 1- [2- (4 -{[ (R) -2- (ter- Butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) etilamino] metil} -2 , 5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico A un matraz para hidrogenación se le agregó éster 1- [2-(4-{[(R)-2- (ter-Butildimetilsilaniloxi) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) etilimino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (4,6 g) y 2 -metiltetrahidrofurano (50 mi) . La mezcla resultante se agitó hasta que se disolvió el sólido (aproximadamente 5 min) y luego se purgó la mezcla con nitrógeno. Se agregó platino sobre carbono (920mg, 5 % peso en peso, sobre un soporte de carbón activado) y la mezcla se hidrogenó a 50 psi (Agitador Parr) durante 6 horas . Luego se filtró la mezcla a través de Celite y se lavó el Celite con 2 -metiltetrahidrofurano (10 mi) . Al filtrado se le agregó un gel de sílice modificado con tiopropilo (20% en peso de solución, Silicycle) y esta mezcla se agitó a entre 25°C y 30°C durante 3 horas. Luego se filtró la mezcla a través de Celite y se concentró para eliminar el solvente. El residuo se disolvió en metanol (5 mi por gramo de residuo) y luego la solución que se obtuvo como resultado se agregó lentamente a una mezcla 1:1 agitada vigorosamente de bicarbonato de sodio acuoso saturado y agua (40 mi por gramo de residuo) . La suspensión blancuzca que se obtuvo como resultado se agitó durante 20 minutos y luego se filtró. La torta del filtro se lavó con agua (20 volúmenes) , se secó al aire durante 3 horas y luego se secó al vacío a temperatura ambiente durante toda la noche para dar el éster 1- [2- (4- { [ (R) -2- (ter-butildimetilsilaniloxi) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil) etilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (recuperación del 80%, aproximadamente 96% de pureza) . Paso E - Éster 1- [2 - (4 - { [ (R) -2- (3- formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil} -2 , 5 -dimetilfenil -carbamoil) etil] piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como sal L-tartrato A un matraz de 200 mi de fondo redondo se le agregó éster l-[2-(4-{[(R)-2- ( ter-butildimetilsilaniloxi ) -2- (3-formilamino-4 -hidroxifenil ) etilamino] metil } - 2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (3,8 g, 4,8 mmol) y 2-metiltetrahidrofurano (40 mi) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente hasta que se disolvieron los ingredientes (aproximadamente 15 min) y luego se agregó trifluorhidrato de trietilamina (0,94 mi, 5,76 mmol) y la mezcla resultante se agitó a 25°C durante aproximadamente 24 horas. A esta mezcla se le agregó una mezcla 1:1 de bicarbonato de sodio acuoso saturado y agua (40 mi) y 2-metiltetrahidrofurano y la mezcla resultante se agitó hasta que se disolvió el sólido (solución pH aproximadamente 8) . Se separaron las capas y la fase orgánica se lavó con salmuera (30 mi) , se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se disolvió en 2 -metiltetrahidrofurano (50 mi) y se agregó ácido L-tartárico sólido (650mg) . La mezcla resultante se agitó a entre 25 °C y 30°C durante 18 horas y luego se filtró a través de papel de filtro. La torta del filtro se lavó con 2 -metiltetrahidrofurano (10 mi), isopropanol (10 mi) y se puso inmediatamente al vacío para dar el éster 1- [2- (4-{ [(R) -2- (3- formilamino-4 -hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil } -2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como sal del ácido L-tartárico (3,7 g, >97 % de pureza) . Paso F - éster 1- [2 - (4 - { [ (R) - 2 - ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2-hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2 -ilcarbámico A un matraz de 250 mi de fondo redondo se le agregó éster 1- [2 - (4-{ [ (R) -2- ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil ) -2-hidroxietilamino] metil }- 2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como sal del ácido L-tartárico (3,5 g) y metanol (35 mi) y la mezcla resultante se agitó durante 15 min. Se le agregó una mezcla 1:1 de bicarbonato de sodio acuoso saturado y agua (70 mi) durante el transcurso de un período de 5 min y se siguió agitando durante 2 horas. La suspensión blancuzca que se obtuvo como resultado se filtró y la torta del filtro se lavó con agua (20 mi) , se secó al aire durante 2 horas y luego se secó al vacío durante toda la noche para dar el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (2,3 g) como una base libre semi-cristalina. Se obtuvieron espectros de 1H y 13C RMN para una muestra del éster 1- [2 - (4 - { [ (R) -2 - (3 -formilamino-4 -hidroxifenil ) - 2 -hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (22,2 mg en aproximadamente 0,75 mi de DMSO-d6) a temperatura ambiente usando un espectrómetro RMN JEOL ECX-400 : 1H RMN (400 MHz , DMSO-d6), isómero mayoritario, d 9,64 (br, 1H) , 9,54 (br s, 1H) , 9,43 (s, 1H) , 8,67 (s, 1H) , 8,26 (s, 1H) , 8,03 (d, J = 1,9, 1H) , 7,25-7,45 (m, 9H) , -7,3 (nd, 1H) , 7,07 (s, 1H) , 6,88 (dd, J = 8,2, 1,9, 1H) , 6,79 (d, J = 8,2, 1H) , 5,15 (br, 1H) , 4,53 (dd, J = 7,3, 4,7, 1H) , 4,47 (m, 1H) , -3,65 y -3,60 (par AB, 2H) , 2,68 (br m, 2H) , -2,59 (nd, 4H) , 2,44 (br t, J = 6,5, 2H) , 2,20 (s, 3H) , -2,17 (br m, 2H) , 2,14 (s, 3H) , 1,73 (br, 2H) , 1,44 (br q, J = -9,0, 2H) . 1H RMN (400 MHz, D SO-d6), isómero minoritario, d 9,64 (br, 1H) , 9,43 (s 1H) , 9,26 (br d, J = -7,0, 1H) , 8,67 (s, 1H) , 8,50 (br d, J = -7,0, 1H) , 7,25-7,45 (m, 9H) , -7,3 (nd, 1H) , 7,07 (s, 1H) , -7,07 (nd, 1H) , 6,95 (dd, J = 8,3, 1,8, 1H) , 6,83 (d, J = 8,3, 1H) , 5,15 (br, 1H) , 4,47 (m, 1H) , -3,65 y -3,60 (par AB, 2H) , 2,68 (br m, 2H) , -2,59 (nd, 2H) , 2,44 (br t, J = 6,5, 2H) , 2,20 (s, 3H) , -2,17 (br m, 2H) , 2,14 (s, 3H) , 1,73 (br, 2H) , 1,44 (br q, J - -9,0, 2H) . 13C RMN (100 MHz, DMSO-d6) , isómero mayoritario, d 170,0, 159,9, 153,9, 145,5, 139,3, 137,6, 135,2, 135,0, 134,8, 133,4, 133,4, 130,2, 130,2, 128,6, 128,2, 127,8, 127,4, 127,2, 127,0, 126,1, 125,7, 125,6, 121,7, 118,6, 114.5, 71,4, 70,0, 57,4, 53,9, 50,3, 50,1, 33,7, 30,7, 18,2, 17,5. 13C RMN (100 MHz, DMSO-d6) , isómero minoritario, d 170,0, 163,4, 153,9, 147,8, 139,3, 137,6, 135,7, 135,2, 135,0, 134,8, 133,4, 133,4, 130,2, 130,2, 128,6, 128,2, 127,8, 127,4, 127,2, 127,0, 126,1, 125,7, 123,0, 119,6, 115.6, 71,0, 70,0, 57,3, 53,9, 50,3, 50,1, 33,7, 30,7, 18 , 2 , 17 , 5. Los espectros 1H y 13C RMN mostraron la presencia de un isómero mayoritario (aproximadamente 82 por ciento en moles) y un isómero minoritario (aproximadamente 18 por ciento en moles) que se cree que son isómeros rotacionales que se obtuvieron como resultado de la rotación impedida alrededor de la unión -NH-C(0)H. Se cree que el grupo fenilo está en syn con respecto al oxígeno del carbonilo en el isómero mayoritario y anti en el isómero minoritario. Ejemplo 7 Cristales de siembra de la Forma II del éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico Se disolvió éster 1- [2 - (4 -{[ (R) -2 -( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil) - 2 -hidroxietilamino] metil } -2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico semicristalino (500mg) en metanol (50 mi) y se agregó agua hasta alcanzar el punto de turbidez . La mezcla resultante se agitó a 25 °C durante 3 horas y el material cristalino que se obtuvo como resultado se aisló por filtración para dar el éster 1- [2 - (4 - { [ (R) - 2 - ( 3 -formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil}-2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico cristalino (420mg) . Se determinó que esta base libre cristalina tenía una gráfica de calorimetría diferencial de barrido (DSC) que mostró un pico en el flujo de calor endotérmico a entre aproximadamente 142 °C y aproximadamente 150 °C; y un patrón de difracción de rayos X sobre polvo (PXRD) con picos de difracción significativos, entre otros picos, en valores 2T de aproximadamente 20,7 ± 0,3, 21,6 ± 0,3, 22,5 + 0,3 y 23,2 ± 0,3. Esta forma de base libre cristalina se denominó la Forma II. Se revela información adicional sobre la Forma II y otras formas de base libre cristalina de este compuesto en la Solicitud de los EE.UU. No. , asignada en forma conjunta, presentada en cada fecha con la misma (N° de caso P-222-US1) y en la Solicitud Provisoria de los EE.UU. No. 60/794.709, presentada el 25 de Abril 2006; cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Ejemplo 8 Cristalización de la Forma II del éster 1- [2- (4 - { [ (R) -2- (3-formilamino-4 -hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil -2 - ilcarbámico A un matraz de 3 L de fondo redondo con tres bocas equipado con un agitador superior, control de temperatura y embudo para adiciones se le agregó éster 1- [2 - (4 - { [ (R) -2 -(3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico semicristalino (14 g) y metanol (1,4 L) . Se agregó agua (500 mi) en una porción y se agregó más agua (200 mi) lentamente hasta alcanzar el punto de turbidez. Se agregaron cristales de siembra de éster l-[2- (4- { [ (R) -2- (3 -formilamino-4 -hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil } -2 , 5 -dimetilfenil -carbamoil) etil] piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico de la Forma II (50mg) y la mezcla resultante se agitó a 25 °C durante 3 horas, después de cuyo tiempo se desarrolló una suspensión que fluía libremente. Se agregó agua (300 mi) durante un período de 15 minutos y la mezcla resultante se agitó a 25 °C durante toda la noche. Luego se filtró la mezcla y la torta del filtro se lavó con agua (100 mi) , se secó al aire durante aproximadamente 2 horas y luego se secó al vacío a temperatura ambiente durante 48 horas para dar el éster 1 - [2 - (4 - { [ (R) -2 - ( 3 - formilamino-4 -hidroxifenil) - 2 -hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico cristalino (12,5 g, 99,6% de pureza). Se determinó que esta sal cristalina era de la Forma II. Ejemplo 9 Éster 1- [2- (4 -Formil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2 - ilcarbámico Paso A - 4 -yodo-2 , 5-dimetilfenilamina A una solución de 2 , 5 -dimetilanilina (20g, 165 mmol) en una mezcla 1:1 de diclorometano y metanol (400 mi) se le agregó bicarbonato de sodio (20, 8g, 250 mmol) y dicloroyodato (I) de tetrametilamonio (44,7g, 165 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se agregó agua (500 mi) . La fase orgánica se eliminó y se lavó con tiosulfato de sodio acuoso al 5% (500 mi) y salmuera (500 mi) . Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y concentró al vacío para dar 4-yodo-2 , 5-dimetilfenilamina (39,6 g, 98% de rendimiento) . El producto se utilizó sin más purificación. Paso B - N- (4-yodo-2 , 5-dimetilfenil) acrilamida A una solución de 4 -yodo- 2 , 5 -dimetilfenilamina (37,2 g, 151 mmol) en diclorometano (500 mi) se le agregó bicarbonato de sodio (25,4 g, 302 mmol) . La mezcla resultante se enfrió a 0°C y se agregó lentamente cloruro de acriloílo (12,3 mi, 151 mmol) durante un período de 25 minutos . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche y luego se filtró. Se redujo el volumen del filtrado hasta aproximadamente 100 mi y se formó un precipitado. El precipitado se filtró, se secó, se lavó con agua (1 L) y luego se secó nuevamente para dar N-( -yodo- 2 , 5 -dimetilfenil ) acrilamida (42,98g, 95% de pureza, 90 % de rendimiento) . El producto se utilizó sin más purificación.
Paso C - éster 1 - [2 - (4 -yodo-2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico A una solución de N- (4 -yodo-2 , 5 -dimetilfenil) acrilamida (32,2 g, 107 mmol) en una mezcla 6:1 v/v de N, N-dimetilformamida e isopropanol (700 mi) se le agregó éster piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (36,3 g, 123 mmol). La mezcla resultante se calentó hasta 50 °C durante 24 horas y luego a 80 °C durante 24 horas. Luego se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (1 L) y esta solución se lavó con ácido clorhídrico acuoso 1N (500 mi), agua (500 mi), salmuera (500 mi) y solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (500 mi) . Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro y se filtró. Se agregó etanol (400 mi) y la mezcla resultante se concentró al vacío hasta un volumen de aproximadamente 400 mi, después de cuyo tiempo se formó un precipitado. El precipitado se filtró y se secó para dar el éster 1- [2- (4 -yodo-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] iperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (59, 6g, 84% de pureza, 79% de rendimiento). M/z: [M + H+] calculado para C29H32IN303 598,49; encontrado: 598,5.
Paso D - éster metílico del ácido 4 - { 3 - [4 - (Bifenil-2-ilcarbamoiloxi) piperidin-l-il] ropionilamino} -2,5-dimetilbenzoico A una solución de éster 1- [2- (4-yodo-2, 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (56 g, 94 mmol) en una mezcla 5:1 v/v de N, N-dimetilformamida y metanol (600 mi) se le agregaron diispropiletilamina (49 mi, 281 mmol), 1,3-bis (difenilfosfino) ropano (3,9 g, 9,4 mmol) y acetato de paladio(II) (2,1 g, 9,4 mmol). La mezcla resultante se purgó con monóxido de carbono y luego se agitó durante toda la noche a entre 70°C y 80°C bajo una atmósfera de monóxido de carbono (presión con globo) . La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se disolvió en diclorometano (500 mi) . Esta mezcla se lavó con ácido clorhídrico acuoso 1N (500 mi) , agua (500 mi) y luego salmuera (500 mi) . Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y luego se concentró al vacío. El residuo se mezcló con etanol (aproximadamente 5:1 volumen en peso etanol a residuo) y la mezcla se calentó hasta que se disolvió todo el material sólido. Esta solución se dejó enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente y el precipitado que se obtuvo como resultado se aisló por filtración para dar el éster metílico del ácido 4-{3- [4- (Bifenil-2-ilcarbamoiloxi) iperidin-1-il] ropionilamino} -2 , 5 -dimetilbenzoico (47,3 g, 97% de pureza, 92% de rendimiento). M/z: [M + H+] calculado para C31H35N305 530,63; encontrado: 530,4. Paso E - Ester 1- [2- (4 -Hidroximetil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2 -ilcarbámico Se enfrió a 0°C una solución de éster metílico del ácido 4- {3- [4- (Bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-l-il] propionilamino} -2 , 5 -dimetilbenzoico (49,8 g, 93,9 mmol) en tetrahidrofurano (200 mi) y se agregó hidruro de aluminio y litio (10,7 g, 281,7 mmol) por porciones (10 x 1,07 g) . La mezcla resultante se agitó durante 3 horas y luego se agregó agua (10,7 mi), seguida de hidróxido de sodio acuoso 1N (10,7 mi) y más agua (32,1 mi) . Esta mezcla se agitó durante toda la noche y luego se filtró. La fase orgánica se concentró al vacío y el residuo se mezcló con acetato de etilo (aproximadamente 5:1 volumen en peso de acetato de etilo a residuo) . Esta mezcla se calentó hasta que se disolvió todo el material sólido y luego se dejó enfriar la solución hasta la temperatura ambiente. El precipitado que se obtuvo como resultado se filtró y se secó para dar el éster 1- [2- (4 -hidroximetil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (24,6 g, 95% de pureza, 47,5% de rendimiento) . Este material se utilizó sin más purificación. M/z: [M + H+] calculado para C30H35N3O4 502,62; encontrado: 502,5. Paso F - éster 1- [2- (4-Formil-2, 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico A una solución de éster 1- [2- (4-hidroximetil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil - 2 - ilcarbámico (5,0 g, 10 mmol) en diclorometano (200 mi) se le agregó diisopropiletilamina (8,7 mi, 50 mmol) y dimetilsulfóxido (5,6 mi, 100 mmol) . La mezcla resultante se enfrió a 0°C y se agregaron complejo de trióxido de azufre y piridina (8,0 g, 50 mmol) . La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a 0°C y luego se agregó agua (300 mi) . La fase orgánica se eliminó y se lavó con ácido clorhídrico acuoso 1N (300 mi) y salmuera (300 mi) . Luego se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro y se filtró. La solución que se obtuvo como resultado que contenía éster 1- [2- (4-formil-2 , 5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico se utilizó sin más purificación. M/z: [M + H+] calculado para C30H33N3O4 500,60; encontrado: 500,4.
Ejemplo 10 Cultivo Celular y Preparación de Membranas a partir de Células que Expresaban receptores Muscarínicos Humanos MI, M2, M3 y M4 Se cultivaron líneas celulares CHO que expresaban respectivamente y en forma estable los subtipos hMl , hM2 , hM3 y hM4 del receptor muscarínico humano clonado, hasta casi confluencia en medio F-12 de HAM suplementado con FBS 10% y Geneticina 250 g/ml . Las células se cultivaron en una incubadora con C02 5%, a 37 °C y se levantaron con EDTA 2 mM en dPBS . Las células se recogieron mediante centrifugación a 650 x g durante 5 minutos y los pélets de células se almacenaron congelados a -80°C o bien las membranas se prepararon de inmediato para ser utilizadas. Para la preparación de las membranas, los precipitados de células se suspendieron nuevamente en solución amortiguadora de lisis y se homogenizaron con un homogenizador de tejidos Politron PT-2100 (Kinematica AG; 20 segundos x 2 pulsos) . Las membranas sin tratar se centrifugaron a 40.000 x g durante 15 minutos a 4°C. Luego se resuspendió el granulo de membrana con solución amortiguadora de pH de re-suspensión y se volvió a homogeneizar con el destructor de tejidos Politron. La concentración de proteínas de la suspensión de membrana se determinó mediante el método descrito por Lowry et al., 1951, Journal of Biochemistry, 193, 265. Todas las membranas se almacenaron congeladas en alícuotas a -80 °C o bien se usaron de inmediato. Se adquirieron alícuotas de preparado de membranas con receptor h 5 directamente de PerkinElmer, Inc. (Wellesley, MA) y se almacenaron a -80 °C hasta que se utilizaron. Ejemplo 11 Ensayo de Unión al Radioligando para receptores Muscarínicos Se realizaron ensayos de unión al radioligando para receptores muscarínicos clonados en placas para microtitulación de 96 cavidades con un volumen de ensayo total de 100 µ? . Las membranas de las células CHO que expresaban de forma estable uno de los subtipos muscarínicos hMl, hM2 , hM3 , hM4 o hM5 se diluyeron con solución amortiguadora de ensayo hasta las siguientes concentraciones de proteínas blanco específicas (pg/cavidad) : 10 µ?? pg para hMl, 10-15 pg para hM2 , 10-20 pg para hM3 , 10-20 pg para hM4 y 10-12 pg para hM5 , para obtener señales similares (cpm) . Las membranas se homogenizaron brevemente usando un homogenizador de tejidos Politron (10 segundos) antes de colocarlas en la placa de ensayo. Se realizaron estudios de unión a saturación para determinar los valores de KD del radioligando usando clorometil L- [N-metil-3H] escopolamina ( [3H] -NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire , Inglaterra), bajo concentraciones que variaban en un rango de entre 0,001 nM y 20 nM. Los ensayos de desplazamiento para determinar los valores de Ki de los compuestos de prueba se llevaron a cabo con [3H] -N S en 1 nM y una vez concentraciones del compuesto de prueba diferentes. Los compuestos de prueba se disolvieron inicialmente hasta una concentración de 400 µ? en solución amortiguadora de dilución y luego se realizaron diluciones seriadas de 5x con solución amortiguadora de dilución hasta concentraciones finales que variaban en un rango entre 10 pM y 100 µ?. El orden y los volúmenes de adición a las placas de ensayo fueron los siguientes: 25 L del radioligando, 25 L del compuesto de prueba diluido y 50 L de membranas. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a 37 °C. Las reacciones de unión se terminaron con una filtración rápida por placas filtrantes de fibra de vidrio GF/B (PerkinElmer Inc.) pretratadas en BSA 1%. Las placas filtrantes se lavaron tres veces con solución amortiguadora de lavado (HEPES 10 mM) para eliminar la radioactividad no unida. Después las placas se secaron al aire y se agregaron 50 L de fluido líquido de centelleo Microscint-20 (PerkinElmer Inc.) a cada cavidad. A continuación se contaron las placas con un contador de centelleo líquido PerkinElmer Topcount (PerkinElmer Inc.) .
Los datos de unión se analizaron con un análisis de regresión no lineal con el conjunto de software GraphPad Prism (Software GraphPad, Inc., San Diego, CA) , usando el modelo de competencia de un sitio. Los valores de Ki para los compuestos de prueba se calcularon a partir de los valores observados de IC50 y el valor de KD del radioligando usando la ecuación de Cheng- Prusoff (Cheng Y; Prusoff WH. (1973) Biochemical Pharmacology, 22(23) :3099-108) . Los valores de Ki fueron convertidos en valores de pKi para determinar la media geométrica y los intervalos de confianza del 95%. Estos valores estadísticos resumidos fueron convertidos a continuación nuevamente en valores de Ki para poder informar los datos . En este ensayo, un valor bajo de Ki indica que el compuesto de prueba tiene una mayor afinidad de unión por el receptor evaluado. Se descubrió que el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lia) tiene un valor de Ki menor de 10 nM para los subtipos MI, M2 , M3 , M4 y M5 de receptor muscarínico.
Ejemplo 12 Cultivo Celular y Preparación de Membranas a partir de Células que Expresaban receptores Adrenérgicos Humanos ß?, ß2 o ß3 Se cultivaron casi hasta confluencia líneas celulares de riñon de embrión humano (HEK-293) que expresaban de manera estable receptores ß? y ß2 adrenérgicos humanos clonados o líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban de manera estable receptores ß3 adrenérgicos humanos clonados en medios DMEM o Hams F-12 con 10% de FBS en presencia de 500 pg/ml de Geneticina. La monocapa celular se levantó con EDTA 2mM en PBS . Las células se recogieron mediante centrifugación a 1000 rpm, y los pélets de células se almacenaron congelados a -80°C, o bien, las membranas se prepararon de inmediato para ser utilizadas. Para la preparación de las membranas que expresaban los receptores ß? y ß2, los pélets de células se resuspendieron en solución amortiguadora de lisis (HEPES/HC1 10 mM, EDTA lOmM, pH 7,4 a 4 °C) y se homogeneizaron con un homogeneizador de vidrio de calce ajustado Dounce (30 golpes) en hielo. Para las membranas más sensibles a proteasas que expresaban el receptor ß3, los pélets de células se homogeneizaron en solución amortiguadora de lisis (Tris/HCl lOmM, pH 7,4) suplementado con una tableta de "Tabletas de Cóctel Completo de Inhibidores de Proteasas con EDTA 2 mM" por cada 50 mi de solución amortiguadora (Roche Molecular Biochemicals , Indianapolis , IN) . El homogenato se centrifugó a 20.000 x g, y el gránulo resultante se lavó una vez con solución amortiguadora de lisis mediante resuspensión y centrifugación como se describió anteriormente. El gránulo final fue entonces resuspendido en solución amortiguadora del ensayo de unión, enfriada en hielo (Tris/HCl 75 mM pH 7,4, MgC12 12,5,5mM, EDTA 1 mM) . La concentración de proteínas de la suspensión de membranas se determinó mediante los métodos descriptos en Lowry et al., 1951, Journal of Biological Chemistry, 193, 265; y Bradford, Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-54. Todas las membranas se almacenaron congeladas en alícuotas a -80°C o bien se usaron de inmediato. Ejemplo 13 Ensayo de Unión al Radioligando con los receptores Adrenérgicos Humanos ß?, ß2 y ß3 Se realizaron ensayos de unión en placas para microtitulación de 96 cavidades con un volumen de ensayo total de 100 L con 10-15 pg de proteínas de membrana que contenían los receptores adrenérgicos humanos µ?, µ2 o ß3 en solución amortiguadora de ensayo (Tris/HCl 75 mM pH 7,4 a 25°C, MgC12 12,5 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,2%). Se realizaron estudios de unión a saturación para determinar los valores de Kd del radioligando usando [3H] -dihidroalprenolol (NET-720, 100 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) para los receptores ß? y ß2 y [125I]-(-)-yodocianopindolol (NEX-189, 220 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) en 10 u 11 concentraciones diferentes que variaban en un rango entre 0,01 nM y 20 nM. Los ensayos de desplazamiento para determinar los valores de Ki de los compuestos de prueba se llevaron a cabo con [3H] -dihidroalprenolol en 1 nM y [125I]-(-)-yodocianopindolol en 0,5 nM para 10 u 11 concentraciones diferentes del compuesto de prueba que variaban en un rango entre 10 pM y 10 µ?. La unión no especifica se determinó en presencia de propranolol 10 µ?. Los ensayos se incubaron durante 1 hora a 37 °C, y luego las reacciones de unión fueron terminadas mediante una filtración rápida por GF/B, para los receptores ß? y ß2 o para los receptores ß3 por placas filtrantes de fibra de vidrio GF/C (Packard BioScience Co . , Meriden, CT) prerremoj adas en polietilenimina 0,3%. Las placas filtrantes se lavaron tres veces con solución amortiguadora de filtrado (Tris/HCl 75 mM pH 7,4 a 4°C, MgC12 12,5 mM, EDTA 1 mM) para remover la radioactividad no unida. Después las placas se secaron y se agregaron 50 L de fluido líquido de centelleo Microscint-20 (Packard BioScience Co., Meriden, CT) y las placas se contaron con un contador de centelleo líquido Packard Topcount (Packard BioScience Co . , Meriden, CT) . Se analizaron los datos de unión empleando análisis de regresión no lineal con el conjunto de software GraphPad Prism (Software GraphPad, Inc., San Diego, CA) , usando el modelo de 3 parámetros para competición por un sitio. Se fijó el mínimo de la curva en el valor de la unión no específica, según se determinó en presencia de propranolol 10 µ?. Los valores de Ki para los compuestos de prueba se calcularon a partir de los valores observados de IC50 y el valor de Kd del radioligando , usando la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng Y y Prusoff WH . , Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108) . En este ensayo, un valor bajo de Ki indica que el compuesto de prueba tiene una mayor afinidad de unión por el receptor evaluado. Se descubrió que el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lia) tiene un valor de Ki menor de 10 nM para el receptor ß2 adrenérgico y un valor de Ki mayor de 1000 nM para los receptores ß? y ß3 adrenérgicos . Ejemplo 14 Ensayos Funcionales de Antagonismo para los Subtipos de receptores Muscarínicos Ensayo A - Bloqueo de la inhibición de la acumulación de A Pc mediada por agonistas En este ensayo, se determinó la potencia funcional de un compuesto de prueba como antagonista para el receptor hM2 midiendo la capacidad del compuesto de prueba de bloquear la inhibición por oxotremorina de la acumulación de AMPc mediada por forskolina en células CH0-K1 que expresan el receptor hM2. Los ensayos con AMPc se llevaron a cabo en un formato de radioinmunoensayo usando el sistema FlashPlate® para ensayo de activación de adenilato ciclasa con 1251-AMPc (NEN SMP004B, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron una vez con dPBS y se tomaron con una solución de Tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/EDTA 0,53 mM) , como por ejemplo se describió en la sección anterior de preparación de cultivos celulares y membranas. Las células separadas se lavaron dos veces por centrifugación a 650 x G durante 5 minutos en 50 mi de dPBS . Luego se suspendió nuevamente el precipitado en 10 mi de dPBS, y se contaron las células en un contador de partículas doble Coulter Zl (Beckman Coulter, Fullerton, CA) . Las células se centrifugaron nuevamente a 650 x G durante 5 minutos, y se las suspendió nuevamente en amortiguador de estimulación hasta una concentración de ensayo de 1,6 x 106 a 2,8 x 106 células/ml.
El compuesto de prueba se disolvió inicialmente hasta una concentración de 400 µ? en amortiguador de dilución (dPBS suplementado con 1 mg/ml de BSA (0,1%)), y luego se realizó una dilución en serie con amortiguador de dilución para obtener concentraciones molares finales que variaron entre 100 µ? y 0,1 nM . La oxotremorina se diluyó de forma similar . Para medir la inhibición por oxotremorina de actividad de adenilato ciclasa, se agregaron 25 pL de forskolina (25 µ? concentración final diluida en dPBS) , 25 pL de oxotremorina diluida, y 50 pL de células a las cavidades de ensayo con agonista. Para medir la capacidad de un compuesto de prueba de bloquear la actividad de la adenilato ciclasa inhibida por oxotremorina, se agregaron 25 pL de forskolina y oxotremorina (25 p y 5 pM concentraciones finales, respectivamente, diluida en dPBS) , 25 pL del compuesto de prueba diluido, y 50 pL de células a las restantes cavidades de ensayo. Se incubaron las reacciones durante 10 min a 37 °C y se detuvieron mediante la adición de 100 pL de solución amortiguadora de detección helada. Las placas se sellaron, se incubaron durante la noche a temperatura ambiente y se contaron a la mañana siguiente en un contador de centelleo líquido Topcount de PerkinElmer (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) . La cantidad de AMPc producido (pmol/cavidad) se calculó sobre la base de las cuentas observadas para las muestras y las referencias de AMPc, del modo en que se describe en el manual del usuario que brinda el fabricante. Los datos se analizaron con un análisis de regresión no lineal con el conjunto de software GraphPad Prism (Software GraphPad, Inc., San Diego, CA) , usando la ecuación de regresión no lineal para competencia por un sitio. Se usó la ecuación de Cheng-Prusoff para calcular la Kobs , con la curva de respuesta a la concentración de EC50 de la oxotremorina y la concentración de ensayo de oxotremorina como KD y [L] , respectivamente. En este ensayo, un valor bajo de Kobs indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor evaluado. Se descubrió que el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lia) tiene un valor de Kobs menor de aproximadamente 10 nM para el bloqueo de inhibición por oxotremorina de la acumulación de AMPc mediada por forskolina en células CHO-K1 que expresan el receptor hM2. Ensayo B - Bloqueo de la Unión de , [35S]GTPYS Mediada por agonistas En este ensayo funcional, se determinó la potencia funcional de un compuesto de prueba como un antagonista del receptor hM2 midiendo la capacidad del compuesto de prueba de bloquear la unión a [35S ] GTPYS estimulada por oxotremorina en células CH0-K1 que expresan el receptor hM2. En el momento del uso, las membranas congeladas se descongelaron y se diluyeron luego en solución amortiguadora de ensayo con una concentración final del tejido blanco de 510 g de proteínas por cavidad. Las membranas se homogenizaron brevemente usando un homogenizador de tejidos Politron PT-2100, y luego se las agregó a las placas de ensayo. Se determinó el valor de EC90 (concentración efectiva para obtener un 90% de la respuesta máxima) para la estimulación de la unión de [35S ] GTPYS por el agonista oxotremorina en cada experimento. Para determinar la capacidad de un compuesto de prueba de inhibir la unión de [35S ] GTPYS estimulada por oxotremorina, se agregó lo siguiente a cada cavidad de las placas 96 cavidades: 25 µ??, de solución amortiguadora de ensayo con [ 3 5 S ] GT PYS ( 0 , 4 nM) , 2 5 yL de oxotremorina (EC90) y GDP (3 µ?) , 25 L del compuesto de prueba diluido y 25 de membranas de células CHO que expresaban el receptor hM2. Las placas de ensayo se incubaron a continuación a 37 °C durante 60 minutos. Las placas de ensayo se filtraron sobre filtros GF/B tratados previamente con BSA 1%, usando un cosechador de 96 cavidades PerkinElmer. Las placas se lavaron con solución amortiguadora de lavado helada tres veces durante 3 segundos, y luego se secaron al aire o en vacío. Se agregó líquido de centelleo Microscint-20 (50 µ?) a cada cavidad y se selló cada placa, después de lo cual se efectuó un recuento de la radioactividad con un equipo Topcounter (Perkin Elmer) . Los datos se analizaron con un análisis de regresión no lineal con el conjunto de software GraphPad Prism (Software GraphPad, Inc., San Diego, CA) , usando la ecuación de regresión no lineal para competencia por un sitio. Se usó la ecuación de Cheng-Prusoff para calcular el valor de Kobs, usando los valores de IC50 de la curva de concentración-respuesta para el compuesto de prueba y la concentración de oxotremorina en el ensayo como valores de KD y [L] , concentración de ligando, respectivamente. En este ensayo, un valor bajo de Kobs indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor evaluado. Se descubrió que el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4 -hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil } - 2 , 5 -dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lia) tiene un valor de Kobs menor de aproximadamente 10 nM para el bloqueo de la unión a [35S]GTPYS estimulada por oxotremorina en células CHO-K1 que expresan el receptor hM2. Ensayo C - Bloqueo de la Liberación de calcio mediado por agonistas mediante ensayos FLIPR En este ensayo funcional, se determinó la potencia funcional de un compuesto de prueba como un antagonista de receptores hMl, hM3 y cM5 midiendo la capacidad del compuesto de prueba de inhibir los aumentos del calcio intracelular mediados por agonistas. Se sembraron células CHO que expresaban de manera estable los receptores en placas FLIPR de 96 cavidades la noche anterior a la realización del ensayo. Las células sembradas se lavaron dos veces con Solución amortiguadora de pH para FLIPR (HEPES 10 mM, pH 7,4, cloruro de calcio 2 mM, probenecid 2,5 mM en solución salina de Hank con pH amortiguado (HBSS) sin calcio ni magnesio) usando Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) para eliminar los medios de cultivo. Después del lavado, cada cavidad contenía 50 L de solución amortiguadora de pH para FLIPR. Las células se incubaron luego con FLU0-4AM 4 µ? (se preparó una solución 2X) a razón de 50 µ?/cavidad, durante 40 minutos a 37 °C, dióxido de carbono 5%. Después del período de incubación con el colorante, las células se lavaron dos veces con solución amortiguadora FLIPR, dejando un volumen final de 50 µ? en cada cavidad. Se determinó la estimulación dependiente de la dosis de la liberación de Ca2+ intracelular para oxotremorina de tal manera que se pudiese medir el compuesto de prueba contra la estimulación por oxotremorina a una concentración EC90. Las células se incubaron primero con solución amortiguadora de pH para dilución del compuesto durante 20 minutos y luego se agregó oxotremorina. Se generó un valor de EC90 para oxotremorina de acuerdo con el método detallado que se describe más adelante en la sección de medición de FLIPR y reducción de datos, junto con la fórmula ECF = ( (F/100-F) ?1/?) * EC50. Se preparó una concentración de oxotremorina de 3 x ECF en placas de estimulación de tal manera que se agregó una concentración EC90 de oxotremorina a cada cavidad en placas de ensayo de prueba . Los parámetros usados para el FLIPR fueron: exposición de 0,4 segundos, intensidad del láser de 0,5 watts, longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda de emisión de 550 nm. Se determinó la linea de base midiendo el cambio de la fluorescencia durante 10 segundos antes de la adición de oxotremorina. Después de la estimulación con oxotremorina, el FLIPR midió de manera continua el cambio de fluorescencia cada entre 0,5 y 1 segundo durante 1,5 minutos para capturar el máximo cambio de fluorescencia. El cambio de fluorescencia se expresó como la fluorescencia máxima menos la fluorescencia basal para cada cavidad. Los datos sin procesar se analizaron contra el logaritmo de la concentración del compuesto de prueba por regresión no lineal con GraphPad Prism (Software GraphPad, Inc., San Diego, CA) usando el modelo sigmoidal para respuesta a la dosis incluido de fábrica. Los valores de Kobs del antagonista fueron determinados por Prism usando el valor de EC50 de oxotremorina como KD y el valor de EC90 de oxotremorina para la concentración del ligando de acuerdo con la ecuación de Cheng- Prusoff (Cheng & Prusoff, 1973) . En este ensayo, un valor bajo de Kobs indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor evaluado. Se descubrió que el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenilcarbamoil) etil] piperidin-4 -ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lia) tiene un valor de Kobs menor de aproximadamente 10 nM para el bloqueo de la liberación de calcio mediada por agonista en células CHO que expresan de manera estable los receptores hMl, hM3 y cM5.
Ejemplo 15 Ensayo FlashPlate® para AMPc en células completas en líneas celulares HEK-293 y CHO que expresan de manera heteróloga a los receptores ß?, ß2 o ß3 adrenérgicos humanos Los ensayos de AMPc se realizaron en un formato de radioinmunoensayo usando el Sistema de Ensayo FlashPlate® de Activación de la Adenilato ciclasa con
[1251] -AMPc (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la determinación de la potencia como agonista de los receptores ß? y ß2 (EC50), se cultivaron líneas celulares HEK-293 que expresan de manera estable receptores ß? y ß2 clonados humanos casi hasta confluencia en DMEM suplementado con 10% de FBS y Geneticina (500 g/ml) . Para la determinación de la potencia como agonista del receptor ß3 (EC50), se cultivó la línea de células CHO-K1 que expresan de manera estable receptores ß3 adrenérgicos clonados humanos casi a confluencia en medios Hams F-12 suplementados con 10% de FBS y Geneticina (250 g/ml) . Las células se lavaron con PBS y se separaron en dPBS (solución salina de fosfatos amortiguadora de Dulbecco, sin CaC12 ni MgC12) con EDTA 2 mM o una solución de Tripsina-EDTA (tripsina 0,05%/EDTA 0,53 mM) . Después de contar las células en un contador de células Coulter, las células fueron precipitadas por centrifugación a 1.000 rpm y resuspendidas en solución amortiguadora de estimulación con IBMX (Conjunto de Elementos PerkinElmer) precalentada hasta temperatura ambiente en una concentración de entre 1,6 x 106 y 2,8 x 106 células/ml . Se usaron aproximadamente entre 40.000 y 80.000 células por cavidad en este ensayo. Los compuestos de prueba (10 mM en DMSO) se diluyeron en PBS con BSA 0,1% en Beckman Biomek-2000 y se evaluaron en 11 concentraciones diferentes que variaban dentro del rango entre 100 µ? y 1 pM . Se incubaron las reacciones durante 10 min a 37 °C y se detuvieron mediante la adición de 100 L de solución amortiguadora de detección fría que contenía
[1251] -AMPc (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences, Boston, A) . La cantidad de AMPc producida (pmol/cavidad) se calculó en base a las cuentas observadas para las muestras y los estándares de AMPc del modo en que se describe en el manual del usuario que brinda el fabricante. Los datos fueron analizados mediante el análisis de regresión no lineal con el paquete de software GraphPad Prism (Software GraphPad, Inc., San Diego, CA) usando la ecuación sigmoidea. Se usó la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng Y, y Prusoff WH., Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108) para calcular los valores de EC50. En este ensayo, un valor bajo de EC50 indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor evaluado. Se descubrió que el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil } -2 , 5 -dimetilfenil -carbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lia) tiene un valor de EC50 menor de aproximadamente 10 nM para el receptor ß2 adrenérgico; un valor de EC50 de aproximadamente 30 nM para el receptor ß? adrenérgico; y un valor de EC50 mayor que 700 nM para el receptor ß3 adrenérgico. Ejemplo 16 Ensayo FlashPlate® de AMPc de Células Enteras con una Linea Celular Epitelial de Pulmón con Expresión Endógena del Receptor Adrenérgico Humano ß2 En este ensayo, se determinaron la potencia como agonista y la actividad intrínseca de un compuesto de prueba usando una línea de células que expresan niveles endógenos del receptor ß2 adrenérgico. Se cultivaron células de una línea de células del epitelio pulmonar humano (BEAS-2B) (ATCC CRL-9609, American Type Culture Collection, Manassas, VA) (January B, et al., British Journal of Pharmacology, 1998, 123, 4, 701-11) a 75-90% de la confluencia en medio completo, libre de suero (Medio LHC-9 que contiene epinefrina y ácido retinoico, Biosource Internacional, Camarillo, CA) . El día antes del ensayo, el medio se cambió a LHC-8 (sin epinefrina ni ácido retinoico, Biosource International, Camarillo, CA) . Los ensayos con AMPc se llevaron a cabo en un formato de radioinmunoensayo usando el sistema FlashPlate® para ensayo de activación de adenilato ciclasa con
[1251] -AMPc (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Durante el día del ensayo, las células se lavaron con PBS, se levantaron por rayado con EDTA 5 mM en PBS, y se contaron. Las células fueron precipitadas por centrifugación a 1.000 rpm y resuspendidas en solución amortiguadora de estimulación precalentada a 37 °C en una concentración final de 60.000 células/ml. Las células se utilizaron en una concentración final de entre 100.000 y 120.000 células/cavidad en este ensayo. Se realizaron diluciones seriadas de los compuestos de prueba en solución amortiguadora de ensayo (Tris/HCl 75 mM pH 7,4 a 25 °C, MgC12 12,5 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,2%) en Beckman Biomek-2000. Los compuestos de prueba se evaluaron en el ensayo en 11 concentraciones diferentes que variaban dentro del rango entre 10 µ? y 10 pM. Se incubaron las reacciones durante 10 min a 37 °C y se detuvieron mediante la adición de 100 L de solución amortiguadora de detección helada. Las placas se sellaron, se incubaron durante la noche a 4°C y se contaron a la mañana siguiente en un contador de centelleo Topcount (Packard BioScience Co . , Meriden, CT) . La cantidad de AMPc producida por mi de reacción se calculó en base a las cuentas observadas para las muestras y los estándares de AMPc del modo en que se describe en el manual del usuario que brinda el fabricante. Los datos fueron analizados mediante un análisis de regresión no lineal con el paquete de software GraphPad Prism (Software GraphPad, Inc., San Diego, CA) usando el modelo de 4 parámetros para la curva de dosis-respuesta sigmoidea. En este ensayo, un valor bajo de EC50 indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor evaluado. Se descubrió que el éster l-[2-(4-{ [ (R) -2- (3-formilamino-4-hidroxifenil) -2-hidroxietilamino] metil } - 2 , 5 -dimetilfenil -carbamoil ) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (compuesto lia) tiene un valor de EC50 menor de 10 nM con actividad intrínseca valor de mayor que 0,3 en comparación con un ß2 agonista completo: isoproterenol (1,0) . Ejemplo 17 Ensayo de Einthoven para determinar la eficacia como broncoprotector y su duración En este ensayo, se determinaron la eficacia como broncoprotector del compuesto de prueba y su duración usando cobayos. Este ensayo se derivó de los procedimientos descritos en Einthoven (1892) Pfugers Arch. 51: 367 - 445; y Mohammed et al. (2000) Pulm Pharmacol Ther. 13 ( 6 ) : 287 - 92. En este ensayo, los cambios en la presión de ventilación sirven como una medida indirecta de resistencia de las vías respiratorias. Después del pre- tratamiento con un compuesto de prueba, se determinó la potencia del antagonista muscarínico usando curvas de respuesta a la dosis de broncoconstrictor para metacolina intravenosa en presencia de propranolol . De manera similar, se determinó la potencia como broncoprotector del ß2 agonista usando histamina. Se determinó la potencia combinada como broncoprotector usando metacolina en ausencia de propranolol. El ensayo se llevó a cabo usando cobayos Duncan-Hartley machos (Harían, Indianapolis , IN) , que pesaban entre 250 y 400 g. Se dosificó un compuesto de prueba o vehículo (es decir, agua estéril) por inhalación (IH) durante un período de tiempo de 10 minutos en una cámara de dosificación por exposición del cuerpo completo (R+S Molds, San Carlos, CA) usando 5 mi de solución de dosificación. Los animales se expusieron a un aerosol generado con un Conjunto Nebulizador LC Star (Modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) impulsado por Bioblend (una mezcla de 5% de C02 ; 21% de 02; y 74% de N2) a una presión de 22 psi. Se evaluó la función pulmonar a diversos puntos de tiempo después de la dosificación por inhalación.
Setenta y cinco minutos antes de comenzar el ensayo, los cobayos se anestesiaron con una inyección intramuscular (IM) de una mezcla de ketamina (43,7 mg/kg/xilazina (3 , 5mg/kg) /acepromazina ( 1 , 05mg/kg) . Cuando fue necesario se administró una dosis suplementaria de esta mezcla (50% de la dosis inicial) . La vena yugular y la arteria carótida se aislaron y encanularon catéteres de polietileno rellenos con solución salina (micro-renathane y PE-50, respectivamente, Beckton Dickinson, Sparks, MD) . La arteria carótida se conectó a un transductor de presión para permitir la medición de la presión sanguínea y la cánula en la vena yugular se utilizó para la inyección IV ya sea de metacolina o de histamina. Luego se disecó la tráquea para dejarla libre y se encanuló con una aguja 14G (#NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL) . Cuando se terminó de encanular, los cobayos se ventilaron usando un respirador (Modelo 683, Harvard Apparatus, Inc., MA) regulado a un volumen de bombeo de lml/100 g de peso corporal pero sin exceder un volumen de 2,5 mi, y con una velocidad de 100 bombeos por minuto. La presión de ventilación (VP) se midió en la cánula traqueal usando un transductor Biopac conectado a un pre-amplificador Biopac (TSD 137C) . La temperatura corporal se mantuvo a 37 °C usando una manta calefactora. Antes de iniciar la recolección de datos, se administró pentobarbital (25mg/kg) por vía intraperitoneal (IP) para suprimir la respiración espontánea y obtener una línea de base estable. Los cambios de la VP se registraron en una interfaz para recolección de datos Biopac para Windows. Los valores de la línea de base se recogieron durante por lo menos 5 minutos, después de cuyo tiempo los cobayos se expusieron por vía IV de manera no acumulativa una dosis con incrementos al doble del broncoconstrictor (metacolina o histamina) . Cuando se utilizó metacolina como agente broncoconstrictor, los animales se pre-trataron con propranolol (5mg/kg, IV) para aislar los efectos antimuscarínicos del compuesto de prueba. El propranolol se administró 30 minutos antes de construir la curva de respuesta a la dosis para metacolina o histamina. Los cambios de la VP se registraron usando el software Acknowledge para recolección de datos (Santa Barbara, CA) . Después de completar el estudio, los animales se sometieron a eutanasia. El cambio de la VP se midió en cm de agua. El cambio de la VP (cm de H20) = pico de presión (después de la exposición al broncoconstrictor) - línea de base del pico de presión. La curva de respuesta a la dosis para metacolina o histamina se ajustó a una ecuación logística de cuatro parámetros usando GraphPad Prism, versión 3.00 para Windows (Software GraphPad, San Diego, California) . Se utilizó la siguiente ecuación: Y = Min + (Max-Min) / (1 + 10 ((log ID50-X) * Pendiente)) donde X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta. Y comienza en el Min y se acerca asintóticamente al Máx con un perfil sigmoideo. Se calculó la inhibición porcentual de la respuesta broncoconstrictora a una dosis submáxima de metacolina o histamina para cada dosis del compuesto de prueba usando la siguiente ecuación: % Inhibición de respuesta = 100- ( (pico de presión (después de la exposición al broncoconstrictor, tratado) - línea de base del pico de presión (tratado) *100% / (pico de presión (después de la exposición al broncoconstrictor, agua) - línea de base del pico de presión (agua) x 100) . Las curvas de de inhibición se ajustaron usando la ecuación logística de cuatro parámetros del software GraphPad. También se estimaron las ID50 (dosis necesaria para producir una inhibición del 50% de la respuesta broncoconstrictora) y Emax (máxima inhibición) siempre que fuese apropiado. Se utilizó la magnitud de la broncoprotección en diferentes puntos de tiempo después de inhalación del compuesto de prueba para estimar la vida media farmacodinámica (PD Tl/2) . Se determinó la PD Tl/2 mediante un ajuste por regresión no lineal usando a una ecuación con fase de decaimiento exponencial (GraphPad Prism, Versión 4.00): Y= duración * exp(-K*X) + Meseta [Y= Span * exp ( -K*X) + Plateau] ; Inicio en: duración + meseta y decaimientos hasta meseta con una proporción constante K. El PD Tl/2 = 0,69/K. La meseta se restringió a 0. Se descubrió que una hora y media después de la dosis, el éster 1- [2 - (4-{ [ (R) -2- (3- formilamino-4 -hidroxifenil ) - 2 -hidroxietilamino] metil}-2, 5 -dimetilfenilcarbamoil ) etil] piperidin- - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (Ha) tiene una ID50 menor de aproximadamente 50 pg/ml tanto para la broncoconstricción inducida por metacolina como para la broncoconstricción inducida por histamina. Además, este compuesto produjo una broncoproteccion significativa durante hasta aproximadamente 72 horas cuando se administró como una única dosis sub-máxima (100 pg/ml) . En este ensayo, el salmeterol (3 pg/ml) (un agonista del receptor ß2 adrenérgico) mostró una broncoproteccion significativa durante entre 6 y 14 horas; y el tiotropio (10 pg/ml) (un antagonista del receptor muscarínico) mostró una broncoproteccion significativa durante más de 72 horas. Ejemplo 18 Ensayo con pletismógrafo sobre cobayos para determinar la eficacia como broncoprotector y su duración En este ensayo, se determinó la eficacia como broncoprotector del compuesto de prueba y su duración usando un ensayo con cobayos .
Se identificaron individualmente grupos de 6 cobayos machos (Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harían, Madison, WI) que pesaban entre 250 y 350 g utilizando tarjetas en las jaulas. Durante todo el estudio los animales tenían libre acceso a alimentos y agua ad libitum. Se administraron los compuestos a evaluar a través de la inhalación durante 10 minutos en una exposición de cuerpo entero en una cámara de dosificación (R&S Molds, San Carlos, CA) . Las cámaras de dosificación fueron acomodadas de modo que un aerosol fuera simultáneamente entregado a 6 cámaras individuales a partir de un colector central. Los cobayos fueron expuestos a un aerosol de un compuesto a evaluar o de un vehículo (WFI) . Los aerosoles fueron generados a partir de soluciones acuosas utilizando un Conjunto de Nebulización LC Star (Modelo 22F51, PARI Respiradory Equipment, Inc. Midlothian, VA) conducido por una mezcla de gases (C02 = 5%, 02 = 21% y N2 = 74%) a una presión de 22 psi. El flujo de gas a través del nebulizador a esta presión operativa fue de aproximadamente 3 L/minuto. Los aerosoles generados fueron conducidos hacia dentro de las cámaras por presión positiva. No se utilizó ningún aire de dilución durante la entrega de las soluciones en forma de aerosol. Durante la nebulización de 10 minutos, aproximadamente 1,8 mi de solución fue nebulizada. Este valor se midió gravimétricamente por comparación del peso anterior y posterior a la nebulización del nebulizador cargado. Los efectos broncoprotectores de los compuestos a evaluar administrados a través de la inhalación fueron evaluados utilizando una pletismografia de cuerpo entero a las 1,5, 24, 48 y 72 horas luego de la dosis. Cuarenta y cinco minutos antes del comienzo de la evaluación pulmonar cada cobayo fue anestesiado con una inyección intramuscular de ketamina, (43 , 75mg/kg) , xilacina (3,50mg/kg) y acepromacina ( 1 , 05mg/kg) . El sitio quirúrgico se afeitó y se limpió con alcohol al 70% y se realizó una incisión de entre 2 a 3 cm en la línea central del aspecto ventral del cuello. Se aisló la vena yugular y se la encanuló con un catéter de polietileno que contenía solución salina (PE-50, Becton Dickinson, Sparks , MD) para poder efectuar infusiones intravenosas de acetilcolina (Ach) o histamina en solución salina. A continuación se diseccionó la tráquea para liberarla y se la encanuló con un tubo de teflón 14G (#NE-014, Small Parts, iami Lakes, FL) . Siempre que fue requerido, la anestesia se mantuvo mediante inyecciones intramusculares adicionales de la mezcla anestésica. La profundidad de la anestesia fue monitoreada y ajustada cuando el animal respondía al pellizco de su pata o cuando su tasa respiratoria era mayor que 100 respiraciones/minuto . Una vez completadas las encanulaciones , el animal fue colocado en un pletismógrafo (N° PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) y se insertó una cánula de presión esofágica (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) para medir la presión impulsora pulmonar. El tubo de teflón de la tráquea fue sujetado a la apertura del pletismograma para permitir al cobayo respirar aire de la habitación de fuera de la cámara. Entonces se selló la cámara. Se utilizó una lámpara de calentamiento para mantener la temperatura corporal y se inflaron los pulmones de los cobayos 3 veces con 4 mi de aire usando una jeringa de calibración de 10 mi (5520 Series, Hans Rudolph, Kansas City, MO) para asegurar que las vías respiratorias bajas no hubieran colapsado y que el animal no sufriera una hiperventilación . La evaluación pulmonar se inició después de determinar que los valores de la línea de base estaban dentro del rango entre 0,3 y 0 , 9 mi por cm de H20 para la compresibilidad y dentro del rango entre 0,1 y 0,199 cm de H20 por mi por segundo para la resistencia. Un programa de computación para medición pulmonar de Buxco se utilizó para recolectar y derivar los valores pulmonares. El comienzo del programa inició el protocolo experimental y la recolección de los datos. Se midieron los cambios en el volumen a través del tiempo que ocurrieron dentro del pletismograma con cada respiración a través de un transductor de presión Buxco. Se calculó una medida de flujo para cada respiración mediante la integración de esta señal en el tiempo. Esta señal y los cambios de la presión que mueve el pulmón, se recogieron usando un transductor de presión Sensym (TRD4100) , se conectaron mediante un preamplificador Buxco (MAX 2270) a una interfaz para recolección de datos (SFT3400 y SFT3813) . Los demás parámetros pulmonares se derivan a partir de estas dos entradas . Se recogieron los valores de la linea de base durante 5 minutos, después de cuyo tiempo los cobayos se expusieron ya sea con acetilcolina o histamina. Cuando se evaluaron los efectos de antagonista muscarínico de un compuesto de prueba, se administró propanolol (5mg/Kg, iv) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 15 minutos antes de la exposición a la acetilcolina. La acetilcolina (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) (0,1 mg/ml) se infundió por vía intravenosa durante 1 minuto desde una bomba de jeringa (sp210iw, World Precisión Instruments, Inc., Sarasota, FL) con las siguientes dosis y tiempos prescritos desde el comienzo del experimento: 1,9 pg/minuto a los 5 minutos, 3,8 pg/minuto a los 10 minutos, 7,5 pg/minuto a los 15 minutos, 15,0 pg/minuto a los 20 minutos, 30 pg/minuto a los 25 minutos y 60 pg/minuto a los 30 minutos. Como alternativa, se evaluaron los efectos broncoprotectores del compuesto de prueba en el modelo de exposición a la acetilcolina sin pretratamiento con propanolol . Cuando se evaluaron los efectos agonistas del receptor ß2 adrenérgico del compuesto de prueba, se infundió histamina (25 pg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por vía intravenosa durante 1 minuto desde una bomba de jeringa a las siguientes dosis y tiempos prescritos desde el comienzo del experimento: 0,5 g/minuto a los 5 minutos, 0,9 g/minuto a los 10 minutos, 1,9 g/minuto a los 15 minutos, 3,8 g/minuto a los 20 minutos, 7,5 g/minuto a los 25 minutos y 15 pg/minuto a los 30 minutos. Si la resistencia o la compresibilidad no retornaron a los valores de la línea de base a los 3 minutos siguientes a cada dosis de acetilcolina o histamina, los pulmones del cobayo se inflaron 3 veces con 4 mi de aire de una jeringa calibrada de 10 mi. Los parámetros pulmonares registrados incluyeron frecuencia respiratoria (respiraciones por minuto) , compresibilidad (mi por cm de H20) y resistencia pulmonar (cm de H20 por mi por segundo) . Una vez que las medidas de las funciones pulmonares fueron completadas en el minuto 35 de este protocolo, el cobayo fue removido del pletismograma y se le practicó la eutanasia mediante asfixia por dióxido de carbono.
Los datos fueron evaluados de una de las siguientes maneras : (a) La resistencia pulmonar (RL) (cm de H20 por mi por segundo) se calculó a partir de la proporción entre el cambio de presión y el cambio de flujo. La respuesta RL a la acetilcolina (60 g/min, IH) se calculó para el vehículo y el compuesto de prueba. Se calculó la respuesta media a la acetilcolina en los animales tratados con vehículo, para cada tiempo de pre- tratamiento, y se utilizó para calcular la inhibición porcentual de la respuesta a la acetilcolina, para el correspondiente tiempo de pre-tratamiento, para cada dosis del compuesto de prueba. Las curvas de inhibición de la respuesta a la dosis para 'RL' se ajustaron con una ecuación logística de cuatro parámetros usando GraphPad Prism, versión 3.00 para Windows (Software GraphPad, San Diego, California) para estimar la ID50 broncoprotectora (dosis necesaria para inhibir la respuesta de broncoconstricción a la acetilcolina (60 g/min) en un 50%) . Se utilizó la siguiente ecuación: Y = Min + (Max-Min) / (1 + 10 ((log ID50-X)* Pendiente)) donde X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta (inhibición porcentual del aumento de RL inducido por acetilcolina) . Y comienza en el Mín y se acerca asintóticamente al Máx con un perfil sigmoideo. (b) La cantidad PD2 , que se define como la cantidad de acetilcolina o histamina que es necesaria para duplicar el valor de la línea de base de resistencia pulmonar, se calculó usando los valores de resistencia pulmonar derivados del flujo y la presión sobre un rango de exposiciones a acetilcolina o histamina usando la siguiente ecuación (que se derivó de una ecuación que se utiliza para calcular los valores PC20 que se describe en American Thoracic Society. Guidelines for methacholine and exercise challenge testing - 1999. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161 : 309-329) : (log C2 - log C ,)(2R0 PD2 = antilog [ log C ,+ R2 - R, donde : Cl = concentración de acetilcolina o histamina anterior a C2 C2 = concentración de acetilcolina o histamina que se obtiene como resultado en por lo menos un aumento al doble de la resistencia pulmonar (RL) R0 - valor RL de la línea de base Rl = valor RL después de Cl R2 = valor RL después de C2 El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo usando una prueba t de Student de dos colas. Se consideró significativo un valor P <0,05. En este ensayo se probó el compuesto 50 descrito en la Patente de los EE.UU. Publicación No. US 2004/0167167A1, publicada el 24 de Agosto de 2004. La estructura química del compuesto 50 es la siguiente: Compuesto 50 para comparación Este compuesto carece de los grupos alquilo presentes en el anillo fenilo de los compuestos de la presente invención. En este ensayo, el compuesto 50 no mostró una broncoprotección significativa a las 24 horas después de la dosis para dosis dentro del rango entre 3 g/ml y 300 pg/ml . Los valores PD2x para el compuesto 50 a las 24 horas fueron similares a los del grupo del vehículo (agua) . En este ensayo, el salmeterol (100 pg/ml) (un agonista del receptor ß2 adrenérgico) mostró una broncoprotección significativa durante por lo menos 24 horas; y el tiotropio (10 g/ml) (un antagonista del receptor muscarínico) mostró una broncoprotección significativa durante por lo menos 24 horas . Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a aspectos específicos o realizaciones de ésta, aquellos entrenados en la técnica comprenderán que es posible efectuar diversos cambios o sustituir equivalentes sin apartarse del verdadero espíritu y alcance de la invención. Además, hasta el grado permitido por las leyes y las normas aplicables a patentes, todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan por completo a modo de referencia en la misma extensión que si cada documento se hubiera incorporado individualmente a modo de referencia en este documento.

Claims (27)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula I:
  2. CARACTERIZADO PORQUE Rl es metilo o etilo; R2 es metilo o etilo; o una sal o solvato o estereoisómero del mismo aceptable para uso farmacéutico. 2. Un compuesto de la reivindicación 1 con fórmula II:
  3. CARACTERIZADO PORQUE Rl es metilo o etilo; R2 es metilo o etilo; o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico. 3. Un compuesto de la reivindicación 1 CARACTERIZADO PORQUE tiene la fórmula lia:
  4. 4. Un compuesto de la reivindicación 1 CARACTERIZADO PORQUE el compuesto es una sal de un compuesto de fórmula I aceptable para uso farmacéutico la:
  5. 5. Una composición farmacéutica CARACTERIZADA PORQUE comprende un vehículo aceptable para uso farmacéutico y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6. Una composición farmacéutica CARACTERIZADA PORQUE comprende : (a) un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; (b) un agente antiinflamatorio esteroide; y (c) un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
  7. 7. Una combinación de agentes terapéuticos, CARACTERIZADA PORQUE comprende: (a) un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y (b) un agente antiinflamatorio esteroide.
  8. 8. un conjunto de elementos que comprende: (a) una primera composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un primer vehículo aceptable para uso farmacéutico; y (b) una segunda composición farmacéutica que comprende un agente antiinflamatorio esteroide y un segundo vehículo aceptable para uso farmacéutico; CARACTERIZADO PORQUE las primera y segunda composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas separadas .
  9. 9. Un método para tratar un trastorno pulmonar, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende administrar a un paciente que necesita tratamiento una cantidad efectiva para uso terapéutico de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  10. 10. Un método para tratar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva para uso terapéutico de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  11. 11. Un método para producir broncodilatación en un mamífero, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende administrar a un mamífero una cantidad que produce broncodilatación de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  12. 12. Un método para causar un efecto antagonista sobre un receptor muscarínico y causar un efecto agonista sobre un receptor ß2 adrenérgico en un mamífero, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende administrar al mamífero un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  13. 13. Un método para usar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como una herramienta para la investigación, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende realizar un ensayo biológico usando un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  14. 14. Un método para evaluar un compuesto de prueba en un ensayo biológico, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende : (a) realizar un ensayo biológico con un compuesto de prueba para dar un primer valor del ensayo; (b) realizar el ensayo biológico con un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para dar un segundo valor del ensayo; donde el paso (a) se lleva a cabo ya sea antes, después o en forma concurrente con el paso (b) ; y (c) comparar el primer valor del ensayo que se obtuvo en el paso (a) con el segundo valor del ensayo que se obtuvo en el paso (b) .
  15. 15. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE el ensayo biológico es un ensayo ligante de un receptor muscarínco o un ensayo ligante de un receptor ß2 adrenérgico .
  16. 16. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE el ensayo biológico es un ensayo de broncoproteccion en un mamífero.
  17. 17. Un proceso para preparar el compuesto de la reivindicación 1 CARACTERIZADO PORQUE dicho proceso comprende desproteger un compuesto de fórmula 6 : donde Pl es un grupo protector de hidroxilo, para dar un compuesto de fórmula I .
  18. 18. Un proceso para preparar el compuesto de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE el proceso que comprende desproteger un compuesto de fórmula 6a: donde Ra, Rb y Re se seleccionan independientemente entre alquilo Cl-4, fenilo, -alquil Cl-4- (fenilo) , o uno de Ría, Rlb y Rlc es -O- (alquilo Cl-4); para dar un compuesto de fórmula I .
  19. 19. Un proceso para preparar el compuesto de la reivindicación 1 CARACTERIZADO PORQUE dicho proceso comprende : hacer reaccionar un compuesto de fórmula con un compuesto de fórmula 5 : donde Pl es un grupo protector de hidroxilo, en presencia de un agente reductor para dar un compuesto de fórmula 6 : y (b) desproteger el compuesto de fórmula 6 para dar un compuesto de fórmula I.
  20. 20. Un proceso para preparar una sal aceptable para uso farmacéutico del compuesto de la reivindicación 1 CARACTERIZADO PORQUE dicho proceso comprende poner en contacto un compuesto de fórmula I en forma de base libre con un ácido aceptable para uso farmacéutico. 21. Un intermediario para preparar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO PORQUE el intermediario es un compuesto de fórmula III:
  21. III Donde Yl se selecciona entre -CHO, -CN, -CH20H, CH (OR3a) OR3b, -C(0)OH, -C(0)OR3c, bromo y yodo, donde R3a y R3b se seleccionan independientemente entre alquilo Cl-6, o R3a y R3b están unidos para formar un alquileno C2-6, R3c se selecciona entre alquilo Cl-6; Rl es metilo o etilo; R2 es metilo o etilo; o una sal o estereoisómero de los mismos.
  22. 22. El compuesto de la reivindicación 21, CARACTERIZADO PORQUE Rl y R2 son metilo.
  23. 23. El compuesto de la reivindicación 21, CARACTERIZADO PORQUE Yl es -CHO.
  24. 24. El compuesto de la reivindicación 21, CARACTERIZADO PORQUE Yl es -CHO; y Rl y R2 son metilo.
  25. 25. Un compuesto de la reivindicación 4, CARACTERIZADO PORQUE el compuesto es éster 1- [2- (4 - { [ (R) -2 - ( 3 -formilamino-4 -hidroxifenil ) -2 -hidroxietilamino] metil} -2,5-dimetilfenil-carbamoil) etil] piperidin-4 - ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico como sal del ácido L-tartárico.
  26. 26. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 CARACTERIZADO PORQUE es para utilizar en terapia.
  27. 27. Uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 CARACTERIZADO PORQUE es para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno pulmonar .
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