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TW200817517A - Protease screening methods and proteases identified thereby - Google Patents

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TW200817517A
TW200817517A TW096124475A TW96124475A TW200817517A TW 200817517 A TW200817517 A TW 200817517A TW 096124475 A TW096124475 A TW 096124475A TW 96124475 A TW96124475 A TW 96124475A TW 200817517 A TW200817517 A TW 200817517A
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protease
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catalytically active
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protein
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TW096124475A
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Edwin L Madison
Original Assignee
Catalyst Biosciences Inc
Torrey Pines Inst
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Publication date
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Publication of TW200817517A publication Critical patent/TW200817517A/zh
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200817517 九、發明說明： 相關申請案 本申請案主張美國臨時申請案序號6〇/818,8〇4，申請 人愛德溫麥迪森，標題“蛋白酶篩選方法與藉其所鑑認之 蛋白酶，申请日2006年7月5日，以及美國臨時申請 •案序號6〇/818,910，申請人愛德溫麥迪森，標題“經修飾 之尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化子（U_PA)蛋白酶”，申請 曰2006年7月5日之優先權的利益。若允許，前述申請 f 案之標的係完整地以引用方式納入本文。 本申請案相關於國際PCT申請案序號（委任Dkt. N〇. 19〇49-002W01/4902PC)，申請人愛德溫麥迪森，標題“蛋 * 白酶篩選方法與藉其所鑑認之蛋白酶，，，申請日2006年7 月5曰，其主張美國臨時申請案序號6〇/818,8〇4及美國臨 時申請案序號60/8 18，9 10之優先權。 本申w案亦相關於美國臨時申請案序號1〇/677,977， 申凊曰2003年1〇月2曰，且已於2〇〇4年7月29曰公開， ί 案號為美國申請案號US-2004-0146938，標題“產至及鏔 選具有已改變專一性之蛋白酶的方法”，今雋k 、 ％务， 1坦諾斯，s瓦_魯格斯與c可來克，以及相關於對應之已 公開國際pct申請案號w〇2004/031733，公開日2〇〇4年 月15日，其主張美國臨時申請案序號6〇/415,388，申請 曰2002年10月2曰之優先權。 本申明案亦相關於美國臨時申請案序號i丨/⑺七丨1()， 月日2005年4月2日，且已於2006年1月5日公開， 5 200817517 案號為美國申請案號US-2006-0002916，標題“ 典 VEGF受體由野生型與突變型MTSP-1之裂解”，申請人J 葛岩與S瓦-魯格斯，以及相關於對應之已公開國際PCT 申請案號W02005/1 10453，公開曰2005年11月24曰， 其主張美國臨時申請案序號60/561，720，申請曰2004年4 月12日之權益。 雩 本申請案亦相關於美國臨時申請案序號11/104，111， 申請曰2005年4月12曰，且已於2006年2月2曰公開， (. 案號為美國申請案號US-2006-0024289，標題“ F五GF典 VEGF受體由野生型與突變型蛋白酶之裂解”，申請人J 葛岩與S瓦-魯格斯，以及相關於對應之已公開國際PCT . 申請案號W02005/100556，公開曰2005年10月27曰， 其主張美國臨時申請案序號60/561,671，申請曰2004年4 月1 2日之權益。 本申請案亦相關於美國臨時申請案序號60/729,817， 申請日2005年10月21日，標題“#鈐#邀活/6之廢疹 C #蛋泠鑌”，申請人愛德恩L.馬迪森。本申請案亦相關 於美國臨時申請案序號1 1/584,776，申請日2006年10月 7J) U，爆黾“抑制補體活化之經修飾蛋白酶”，今嘵 德恩L.馬迪森，傑克葛岩，桑德拉S瓦魯格斯與克里斯 托佛坦諾斯，以及相關於對應之已公開國際PCT申請案號 W02007/047995，公開日2007年4月26日，其各主張美 國臨時申請案序號60/729,817之權益。 若允許，前述申請案之標的係完整地以引用方式納入 6 200817517 本文。 【發明所屬之技術領域】 本發明提供用於鑑定具有已改變之受質專一性或其他 特性的經修錦蛋白酶之方法。該方法係藉由將候選者及經 修飾蛋白酶與當該受質裂解時可誘陷彼等之受質接觸而筛 選。 【先前技術】 背景 ( 蛋白酶為蛋白質降解酵素。因為蛋白酶可專一地與標 靶蛋白貝作用’並去活化或活化之，故彼等已被利用作為 治療劑。天然產生的蛋白酶往往並非最理想的治療劑，因 為其等不呈現令其等適合作為生物治療劑之專一性、穩定 性及/或催化活性（參見，例如費南得茲_加西歐等人（2〇〇3) π⑼心&扪21:408_414)。治療劑之特性中重要者 為，欠缺免疫原I生或具有已減低之免疫原，法；對於標靶分 子之專一性，及有限的副作用。天然產生的蛋白酶通常缺 1, 乏一或多項此等特性。 已嘗試設計具有改良特性之蛋白酶。此等方法包括u 合理性設計，其需要關於蛋白酶之結構、催化機制與分子 模型化方面的資訊；A 2) $向演化，為—種涉及產生蛋 白酶之多樣突變型所有組成成份（repertoire)，並挑選出 呈現所希望特徵之突變的程序（柏特新格等人（2〇〇5)於 Phage display in Biotech, and Drug Disc〇very 得饿斯 '， 編著），PP. 46H9D。對於前一項方法’缺少關於蛋白酶 7 200817517 之=構-功能關係之資訊，會限制為大多數蛋白酶合理地設 冲大k的可能性。定向演化方法在利用上僅獲得有限的成 功。 師璉經改良之蛋白酶活性，往往導致受質選擇性喪 失，且反之亦然。最理想治療性蛋白酶應呈現對受質之高 專性及咼催化效率。因為可用於挑選具有最適化專一性 與最適化活性之蛋白酶的方法之效能有限，故仍有需要研 發出另類蛋白酶挑選方法。於是，本發明之一目的係提供 用於挑選具有所希望受質專一性及活性之蛋白酶或突變型 蛋白酶的方法。 【發明内容】 簡述 本發明係提供用於挑選或鑑認出具有所希望或所預定 之受質專一性及活性的蛋白酶或突變型蛋白酶或其具催化 活性部分之方法。尤其，本發明係提供鑑認出對於標靶受 質具有經設計、改進或最適化，或不然已改變之受質專一 ，性的蛋白酶之篩選方法。力實施本發明所提供《方法時， 係將蛋白酶或其具催化活性部分之集合與蛋白酶誘陷多肽 (protease trap polypeptide)接觸，導致該蛋白酶誘陷多 肽與集合中之蛋白酶或其具催化活性部分形成穩定的複合 "；項貝例中，係藉由所選蛋白酶與蛋白酶誘陷多肽 之共價鍵聯而形成穩定的複合體。於本發明所提供之方法 中，係從該複合體鑑認或挑選出所選蛋白酶或其具催化活 性部分。本發明所提供之方法可進一步包括將已複合之蛋 8 200817517 白酶與集合中未複合之蛋白酶成員分離的步驟。於一項實 例中’係將蛋白酶誘陷多肽標定以供偵測或分離，而分離 係藉由捕捉含有可偵測蛋白酶誘陷多肽與蛋白酶或其具催 化活性部分之複合體而實現。蛋白酶誘陷多肽可以His標 籤標定’而分離可藉由以金屬螯合劑（例如（但不限定於） 硫酸鎳（NiS〇4)、氣化鈷（c〇cl2)、硫酸銅（CuS〇4)及氯化鋅 (ZnCl2))捕捉而實現。可將金屬螯合劑共軛至固體撐體， 例如，諸如瓊脂糖珠粒或磁珠等珠粒上。
本發明亦提供一種多路的方法，藉其蛋白酶集合與多 種不同的蛋白酶誘陷多肽（包括其經修飾形式）接觸，其 中係將各別蛋白酶誘陷多肽加以標定，使彼等能可鑑認地 被债測到。於此類方法中，係將至少兩種蛋白酶誘陷多狀 可鑑認地標定’以使能形成多於—種穩定的複合體，並可 鏗说得多於一種蛋白酶。 於本發明所提供之方法中，該方法亦包括連續數回合 ::選’以使蛋白酶挑選最適化，丨中係使蛋白酶在彼等於 第-回合本發明篩選方法中之鑑認或挑選後被擴增，藉此 產生蛋白酶或其具催化活性部分之第二集合。將該蛋白酶 第二集合與蛋白酶誘陷多肽（其與第一蛋白酶誘陷多肽相 冋或相異）接冑，而產生第二組穩定的複合體。對在該第 一組穩定複合體中之蛋白酶鑑認或挑選。 疋7本舍明所提供之方法中，蛋白酶誘陷多肽為絲胺酸 虫白酶抑制物（serpin)、阿伐巨球蛋白家族之成員、或p35 家族之成員。用於本發明所提供方法之此類多肽分子，藉 9 200817517
鍵聯而形成穩定的複合體。 酶誘陷多肽之共價
部分，以挑選具有所希望受質專一性之蛋白酶 r... 1； 合，為蛋白酶或 用於本發明所提供方法之蛋白酶的集 其具催化活性部分之任意集合，且包括至少、約、或等於 5' 10' 50、1()〇、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6 或更多不同成員。 於某些方面，蛋白酶為絲胺酸及/或半胱胺酸蛋白酶。於本 發明所提供之方法中，係將蛋白酶或其具催化活性部分之 集合展示出，以供與蛋白酶誘陷多肽接觸。於一項實例， 係將蛋白酶或其具催化活性部分展示於固體撐體上、細胞 表面、或於微生物之表面上。可將蛋白酶展示於酵母、細 菌、病毒、噬菌體、核酸、mRNA分子、或核糖體上。若 蛋白酶或其具蛋白質分解活性部分係展示於微生物上，則 該微生物包括（但不限定於）大腸桿菌、啤酒釀母菌或病 毒’例如M13、fd或T7噬菌體或桿狀病毒。於本發明所 提供之方法中，係將蛋白酶或其具催化活性部分展示於雙 菌體展示文庫上，且蛋白酶集合為蛋白酶噬菌體展示 10 200817517 庫。於某些具體態樣，蛋白酶係於集合中（例 呈全長蛋白酶之具蛋白分解活性部分提供。於某此實例， 係於均勻混合物中使蛋白酶集合與蛋白_陷多肽接觸。 f 本發明係提供-種蛋白酶挑選方法，其中係將至少兩 種不同蛋白酶誘陷多肽與集合接觸，但僅其中一種蛋白酶 誘陷多肽被可偵測地標定。經可偵測地標定之蛋白酶誘陷 多肽允許含有該可偵測蛋白酶誘陷多肽與蛋白酶或盆L催 化活性部分之穩定複合體之捕捉。於此方法之某些實例， :或多種未經可偵測地標定之蛋白酶誘陷多肽係以相較於 5亥經可偵測地標定之蛋白酶誘陷多肽為過量存在反應中。 於該方法中，標記為供偵測其之任何標記，例如螢光標記 或抗原表位標記，例如His標籤。 於本發明所提供之方法中所挑選之蛋白酶集合包括任 何蛋白酶集合。於某些實例，蛋白酶為絲胺酸或半胱胺酸 蛋白S#蛋白_之集合包括該等為絲胺酸蛋白酶之腺凝乳 蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶（substiHsin )家族的成員，或自 半胱胺酸蛋白酶之木瓜蛋白酶家族的天冬胺酸特異性半胱 胺酸蛋白酶（caspase)。蛋白酶包括任何列示於表7中之蛋 白酶，或其具催化活性之部分。於某些實例，蛋白酶或其 具催化活性之部分為尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化子0-pA) 蛋白酶、組織血纖維蛋白溶酶原活化子（t_pA)蛋白酶、或 MT-SP1蛋白酶之集合。 於一方面’用於本發明所提供方法中之蛋白酶誘陷多 肽，為絲胺酸蛋白酶抑制物、p35家族成員、阿伐巨球蛋 11 200817517 白豕無成貝、或其任何經修 乂飾之形式。用於本發明所提供 方法中之蛋白酶誘陷多狀， /、 包括（但不限定於）血纖維I 白溶酶原抑制子（PAI_1)、枋、蛋 J扣w旋血鉍（AT3)、或阿伐2_巨 蛋白、或其任何經修飾之形， ’ 心式。用於本發明所提供方法中 之蛋白酶誘陷多肽之經修飾 I饰形式，包括該等含有於該蛋 酶誘陷多肽之反應性部位中的胺基酸置換、刪除或取代 者。於某些實例，修飾為對應於標乾受質之裂解序列的一 或多個胺基酸置換。標靶#所π * y 7
知耙又貝可為任何涉及疾病或病症之 病原學的蛋白質。棵知為所 + 貝铩靶又為之實例包括（但不限定於） vEGFR、t-PA裂解序列、或補體蛋白。於某些方面，蛋白 酶誘陷多肽為絲胺酸蛋白酶抑制物’且一或多個胺基酸置 換係位於絲胺酸蛋白酶抑制物多肽反應性部位環中。反應 性部位環（reactive site loop，RSL)中之一或多處置換包^ 該等位於Ρ4-Ρ2’位置之任何一或多者。於另一項實例，蛋 白酶誘陷多肽為㈣2_巨球蛋白，及一或多個胺基酸置換 係位於該多肽之誘餌區中。 本發明所提供之方法包括該等為反覆進行者，其中係 將鑑認及/或挑選具有所希望受質專一性之蛋白酶的方法重 複或進行數次。於此類方法中，可於該方法之第一次重複 (或第一回合）鑑認出多數不同的蛋白酶。於其他實例， 係在第一次重複後基於重複的第一回合中所挑選鑑認出之 蛋白酶，產生及製備得多種蛋白酶。此外，於某此實例， 係將於重複之第一回合及/或於後續的回合中鑑認出I所挑 選蛋白酶的胺基酸序列進行比對，以鑑定出熱點。 * 12 200817517 该寺在多次回人φ广 口 口中（例如發生於至少2、3、4 種所鑑定的蛋白醢、 或更多 姆）C例如相較於野生型戎握祐 從用於該方法之你佟飴i 如或杈板蛋白酶） 座之位置。 /飾蛋㈣之集合被辨識為經修飾基因 本發明方法亦於鑑切 步製傷第二蛋白酶集合：:驟=蛋白酶後，進-酶作為模板，於該蛋白、用所鑑遇出之蛋白 進一步突變，以使第二集 所鑑認出蛋白酶之突涔盥 ’、土於含有具有該 出蛋白酶之犬變與額外突變的多肽；然後將第二隹 合與和用於分籬木 ^ 蛋白靶所之蛋白酶誘陷多肽相同或 不同的蛋白酶誘陷多肽接觸^ 付队 八Y通蛋白鰣誘陷多肽係經 修飾以被具有所希望受質衷 卜4 + π 、 又貝專一性之蛋白酶裂解；及從隼人 鑑認出於複合體中之蛋白 八— 玄白鉍次蛋白駟之具蛋白分解活性部 刀’猎其所鑑認出之蛋白酶具有較第一次所鑑 酶對希望受質之更大的活性或專一性。第二集合相較於所 鑑認板板蛋白酶或蛋白酶之具蛋白分解活性部分，可含有 隨機或定焦突變。定焦突變包括（例如）熱點位置，例如 絲胺酸蛋白酶（如U_PA)中之位置3〇、73、89與155 (基 於胰凝乳蛋白酶編號）。 於實施該方法時，可藉由控制一或多項參數，來調節 形成穩定複合體之反應。此辇夂奴 、 寺多數為任何可改變反應速率 或程度或反應效率者’例如（但不限定於）反應時間、溫 度、ΡΗ值、離子強度、文庫濃度與蛋白酶誘陷多狀濃度。 反應可於有蛋白酶誘陷多肽與蛋白酶或其具催化活性 13 200817517 部分間之反應的競爭劑存在下進行，以藉此增加所鑑認蛋 白酶或具催化活性部分之選擇性。競爭劑包括（例如）血 月或血水例如為人類血清或人類血漿，細胞或組織萃取 物、生物體液例如尿液或血液、蛋白酶誘陷物之經純化或 經部分純化野生型形式（或其他經修飾形式）。此類競爭 劑之實例& *自酶誘陷多月太之經純化或經部分純化野生型 或蛋自酶誘陷多肽之一或多種特定變體。 本發明亦提供其含有蛋白酶與/或 具具
催化活性部分集 及至少一種蛋白酶誘陷多肽之組合（c〇mbinati—。 该等組成可分別提供或呈一種混合物。蛋白酶誘陷多狀包 括絲胺酸蛋白酶抑制物、p35家族成員、阿伐巨球蛋白家 族成員、各別之經修飾形式、或其混合物。 〜蛋白酶與/或其具催化活性部分之集合，可以溶液或懸 、，或壬口相提供或不然經展示於例如固體撐體（基質 :二上’或於展示文庫例如（但不限定於）i菌體展示 其中各成員展示某-蛋白酶之至少 解活性部分。 如八蛋白刀 +努、明提供含有 套組含 )用於 有以經包農組成成公r 〜 取风刀（component )，及（視需 完成該方法之額外試劑與說明。 ' 用於修飾絲胺酸蛋白酶（例如U_PA)之 又貝專-性的方法，其係藉由修飾一或 89與叫基於胰凝乳蛋白酶編號）之殘基。、73、 本發明提供用於演化或挑選或鑑認出具有對於至少兩 14 200817517 種不同又貝之專-性/選擇性及/或活性的蛋自酶或其具蛋 白分解活性部分之重複性方法。該方法包括下列步驟㈤將 蛋白酶及/或蛋白酶之具蛋白分解活性部分的集合與第一蛋 酶誘h肽接觸’而於該蛋白酶誘陷多肽被該蛋白酶或 其具蛋白分解活性部分梦解德 H^ 丨刀波解後，形成含有該蛋白酶誘陷多 f 二口中之某—種蛋白酶或其具蛋白分解活性部分的穩 體，其中係於競爭劑存在下實現接觸；b)鑑認或挑 =八共第一蛋白酶誘陷多肽形成複合體之蛋白酶或其具蛋 之性部分；e)將與第—蛋白酶誘陷多肽形成複合體 酶或其具蛋白分解活性部分，於競爭劑存在下與第 陷多肽接觸；及d"監認或挑選出與第一蛋白 :誘：多狀形成複合體之蛋白酶或其具蛋白分解活性部 二，:監認、挑選或演化得之蛋白酶或其具蛋白分解活性 子於才示乾受質中之至少兩種不同辨識序歹，卜具有受 二=與裂解活性。該方法可進—步包括重複步驟a)與 所希望或所預離出對… 專一性鱼列疋之文貝專一性與裂解活性的蛋白酶。受質 /、衣解活性代表性地相較於模板蛋白酶已辦加。 用贫^含女、丄 作用之任DX法之競爭劑包括蛋白酶誘陷多肽可與其相互 性。μ、γ何物質，代表性地具有較標靶蛋白酶差的穩定 人類血將"广 <旦不限定於）血清、血漿、人類血清或 蛋白酶胞或組織萃取物、生物體液例如尿液或血液、 誘陷多μ $乡月大之經純化或經部分纯化野生、及蛋白酶 夕 之—或多種特定變體。 15 200817517 本土明亦提供包括下列步驟之蛋白酶挑選方法：勾將 蛋白酶或其具蛋白分解活性部分之集合，與第一蛋白酶誘 陷多肽接觸，而於該蛋白酶誘陷多狀裂解後，形成該蛋白 酶誘陷多肽與集合中之任一種蛋白酶或其具催化活性部分 的共價複合體；bH字已複合之蛋白酶與未複合之蛋白 陷多肽分開；c)分離或挑選或鐘認出已複合之蛋白酶；句 以所挑選得之蛋白酶為基礎，產生第二蛋白酶或其具蛋白 刀解活性口P刀集合，及e)藉由將該第二蛋白酶或其具蛋 (白分解活性部分集合與和第一蛋白酶誘陷多狀不同的第二 蛋白酶誘陷多肽接觸形成複合體；分離該複合體；及將已 複合之蛋白酶分離、挑選或鑑認出，而重複步驟昀_ e)。 第y與第二蛋白酶誘陷多肽可經修飾，以含有兩種不同標 乾又貝辨識序列，藉此鐘認或挑選出對至少兩種辨識序列 具有專一性及高裂解活性的蛋白酶。可重複此等方法數 次。於&等方&，可將蛋白酶或其具蛋白分解活性部分之 集合，於競爭齊j (參見前述）#在下與第一及/或第二蛋白 ( 酶誘陷多肽接接觸。 本發明亦提供藉由本發明方法所鏗認得之經修飾蛋白 酶。於此類蛋白酶中為胰凝乳蛋白酶家族中之經修飾絲胺 酸蛋白酶，例如含有一或多個於選自位置3〇、73、89與 (基於胰凝乳蛋白酶編號）之熱點位置的突變的尿型血纖 維蛋白溶酶原活化子（U-PA)多肽或其具催化活性部分，藉 此改變受質專一性。 9 本發明亦提供裂解t-PA受質之經修飾絲胺酸蛋白酶或 16 200817517 其具催化活性部分。尤其，於此類蛋白酶中為經修飾之尿 型血纖維蛋白溶酶原活化子（u-P A)多肽，其中u-P A多肽或 其具催化活性部分，含有一或多個於選自位置2卜24、30、 39、61(A)、80、82、84、89、92、156 > 158、159 及 187 (基於胰凝乳蛋白酶編號）之修飾。本發明亦提供含有一 或多個選自 F21V、I24L、F30V、F30L、T39A、Y61(A)H、 E80G、E82E、E84K、I89V、K92E、K156T、T158A、V159A、 與K187E,之突變的此類經修飾u-PA多肽或其具催化活性 f 部分。本發明亦提供其中u-PA多肽或其具催化活性部分 \ 含有二或多個選自 F30V/Y61(a)H ； F30V/K82E ； F30V/K156T ； F30V/K82E/V159A ； F30V/K82E/T39A/V159 A ； F3 0V/K82E/T158A/V159A ； F30V/Y61 (a)H/K92E ； F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187E;與 F30V/K82E/V159 A/E80G/E84K/I89V\K187E之突變的此等經修飾 u-PA多 肽。 本發明亦提供裂解VEGFR，特別是VEGFR-2之經修 ( 飾絲胺酸蛋白酶或其具催化活性部分。尤其，係提供經修 飾之尿型血纖維蛋白溶酶原活化子（u-PA)多肽及其具催化 活性部分，其中該u-PA多肽或其具催化活性部分含有一 或多個於選自位置 38、72、73、75、132、133、137、138、 1 5 5、1 60及2 1 7 (基於胰凝乳蛋白酶編號）的位置之修飾， 藉此改變對於VEGFR-2 (或其序列）之受質專一性。亦提 供其含有一或多個選自V38D、R72G、L73A、L73P、S75P、 F13 2L、G133D、E13 7G、I13 8T、L15 5P、L15 5V、L15 5M、 17 200817517 V160A、與R217C之突變的此類多肽。此等多肽可進一步 包括位於位置30及/或位置89之修飾，例如選自F30I、 F30T、F30L、F30V、F30G、F30M、與 I89V 之修飾。亦 提供其含有一或多個（而於某些實例為二或多個）選自 L73A/I89V ； L73P ； R217C ； L155P ； S75P/I89V/1138T ； E137G； R72G/L15 5P； G13 3D； V160A； V38D； F132L/V160A ； L73A/I89V/F30T ； L73A/I89V/F30L ； L73A/I89V/F30V ； L73A/I89V/F30G ； L73A/I89V/L 1 55V ； L73A/I89V/F30M ； L73A/I89V/L155M; L73A/I89V/F30L/L155M;與 L73A/I89V /F30G/L155M之突變的u-PA多肽或其具催化活性部分。 本發明亦提供經修飾之ιι·ΡΑ多肽，其中該u-PA多肽 或其具催化活性部分含有一或多個選自F30I、F30T、F30G 及F30M之突變。 本發明亦提供含有經修飾蛋白酶（包括經修飾之絲胺 酸蛋白酶，例如經修飾之u-P A多肽）之醫藥組成物。醫 藥組成物含有醫藥上可接受之賦形劑，且可經調配用於任 何適宜之投藥途徑，包括（但不限定於）全身、口服、鼻 部、肺部、區域性及局部投藥。亦提供含有任一該等醫藥 組成物、供投藥組成物之裝置及（視需要地）關於投藥之 說明的套組。 本發明提供編碼經修飾蛋白酶（包括u-PA蛋白酶或 其具催化活性部分）之核酸分子。本發明亦提供含有該核 酸分子的載體以及含有該核酸分子或載體之細胞。 本發明提供藉由投藥含有經修飾u-PA蛋白酶或其具 18 200817517 蛋白質分解活性部分或繞α 刀次編碼性核酸分子或細胞之醫藥组 物，治療罹患疾病或病汉r ,、々 况（例如（但不限定於）選自動脈 血检形成、靜脈血检形而ώ 成^血栓栓塞、缺血性中風、 性凝血病症、彌散性血營 &内减血、細菌性感染與牙周炎、 及神經學病況（其係藉由於艫 ^ 、 杈樂t-pA治療）之疾病或病況）
的個體之方法。該方法孫I 忐係糟由將核酸分子、細胞或 成物投藥予該個體而實現。 西梁、、且 本發明亦提供治療權电+ 张人、曾 、心患* VEGF (，特別是veGFR_2)
斤"‘之疾病或病況的個士、L ,y 個體之方法。此類疾病與病況包括 (但不限定於）癌症、血營 匕括 生成疾病、眼部疾病（例如黃 斑交性）、發炎性疾病盥 、 一搪尿病，特別疋從其引發之併發 症，例如糖尿病性視網 _ J膜病。該方法係藉由投筚含右 對"EGm現（尤其是相較於舞已增 = 專:性的經㈣“A蛋白酶之核酸二：: 疾二：成⑯A方去視需要地包括投藥另-種用於治療該 況之劑，例如投藥-種抗-腫瘤劑（若該疾病為癌 【實施方式】 詳知敘述 綱要 A.定義 B ·篩選蛋白酶之方法 C ·蛋白酶誘陷多肽 功能及表現 1 ·絲胺酸蛋白酶抑制物··構造、 19 200817517 2.蛋白酶催化’絲胺酸蛋白酶抑制物 及酸基酵素中間物之形成 L例舉性絲胺酸蛋白酶抑制物 i.PAI-1 H·抗凝血酶（AT3) 3·其他蛋白酶誘陷多肽 a.p35 b·阿伐巨球蛋白（aM)
4·蛋白酶誘陷多肽競爭劑 5.變異型蛋白酶誘陷多肽 D.蛋白酶 1.候選蛋白酶 a.蛋白酶之分類 i. 絲胺酸蛋白酶 (a) 尿激酶型血纖維蛋白、、女,π 娜芦貧臼，合酶原活化子（u-PA)
之抑制機制 (b) 組織血纖維蛋白溶酶原活化子（卜ρΑ) (c) MT-SP1 ii. 半脱胺酸蛋白酶 E.經修飾之蛋白酶與供筛選之集合 1.變異型蛋白酶之產生 a.隨機誘變 b ·定焦誘變 2·變異型蛋白酶之嵌合形式 3·組合文庫與其他文庫 20 200817517 a·噬菌體展示文庫 b ·細胞表面展示文庫 c•其他展示文庫 F ·接觸、分離及鐘認所挑選蛋白酶之方法 1 ·重複性篩選 2.例舉性所挑選之蛋白酶 G. 分析蛋白酶活性與專一性之方法 H. 製造編碼蛋白酶誘陷多肽（亦即絲胺酸蛋白酶抑制 物）或其變體或蛋白酶/經修飾蛋白酶之核酸的方法 1 ·載體與細胞 2·表現 a·原核細胞 b. 酵母細胞 c. 昆蟲細胞 d·哺乳動物細胞 e.植物 3.純化技術 4·融合蛋白質 5 _核苷酸序列 I. 所篩選蛋白酶多肽之製備、調配及投藥 1 ·組成物與遞送 2.所篩選蛋白酶之活體内表現及基因療法 a·核酸之遞送 i載體-游離型與整合性 21 200817517 ii.人造染色體及其他非-病毒載體遞送方法 iii·脂質體與其他膠囊包封开彡t ^ ^ 表匕町艰式及含有核酸之細胞 的遞送 b.試管内及活體外遞送 C·全身性、區域與局部性遞送 2. 組合療法 3. 製品與套組 J·使用所挑選蛋白酶多肽之治療之例舉性方法 1·對於裂解tPA標靶物之所挑選uPA多肽的治療之 例舉性方法 > a.血栓性疾病與病況 i ·動脈血栓形成 11·靜脈血栓形成與血栓栓塞 (a) 局部缺血性中風 ni·後天性凝血病症 〇)彌散性血管内凝血（DIC) (b) 細菌性感染與牙周炎 b·其他tPA標靶物_關連之病況 c •珍斷方法 2·對於裂解VEGF《VEGFR標㈣之所挑選蛋 多肽的治療之例舉性方法 - • &生成、癌症與其他細胞週期依賴性疾病 況 、内虱病 b·使用裂解VEGF或VEGFR之所挑選蛋白酶之級人 22 200817517 療法 κ ·貫施例 Α·定義 除非另行定義，本文中所使用之技術與科學術語，具 有與習於本發明所屬技蓺 矣^ *之人士所一般了解者相同的定 我明完整揭示中所引用之全部專利案、專利申請案、 已公開申請案與文獻、基 Γ 早斤夕J貝枓庫、網站與其他 :公開資料，（除非另行註明）皆完整地以引用方式納入 =1其中對於本文中術語有多種定義之事件，係以本 :洛Ρ者為優先。若參考URL或其他此類鑑別者或網 二應了解可改變此類鐘別者可改變，且在網際網路上之 可能有增減，但是可藉由搜尋網際網路而發現相 料。其所引用之資料證明此類資訊之可利用性及公 共傳播性。 肽”：：於本文’ “蛋白酶誘陷物，，或“蛋白酶誘陷多 狀 思指一種受質，JL ^ -p , ^ i 貝，、在某一種蛋白酶裂解後，且 =)與該蛋白酶形成穩定複合體，以藉此在該蛋白酶經 告1=過度態而形成酵素複合物時誘陷該蛋白酶，藉而抑 ::亥蛋白酶活性並捕捉其。因此，蛋白酶誘陷物為蛋白酶 4制子:蛋白酶誘陷物為多肽，或其包括胺基酸殘基之 二子1其被蛋白酶裂解而使能在裂解後形成穩定的複合 P物Z合體係足_定’以允許複合物可與未反應之誘 2或與該蛋白酶具有較不穩定相互作用之誘陷物分離。 …誘陷物包括任何分子’為合成型、經修飾或天然產 23 200817517 生的，其被蛋白酶裂解，且 複合體，以允許已反應酶^解後）與該蛋白酶形成 陷物分離。此類蛋白酶誘陷物:;戈可與未反應之誘 物、經修飾之絲胺酸蛋白酶抑::例為呈=蛋白酶抑制 抑制物相似之機制的分子 見一4胺酸蛋白酶 J刀于c例如p35)， 白酶裂解並將該蛋白酶誘陷呈穩定複合體之八早、他被蛋 伐2巨球蛋白。蛋白酶誘陷物亦包括:子，例如阿 白分解活性部分）裂^， （或其具蛋 刀」淚解，且（於裂解後）盥 具蛋白分解活性部分形成#定、t A ，、〜蛋白S#或其 刀小成％疋複合體之合成型多肽。 如用於本文，絲胺酸蛋白酶抑㈣意指_ 關的蛋白質，並等在被I6k上相 在被蛋白酶裂解其反應性部位後，導致 形成穩定之醯基-醏夸Φ P弓从 ^ 夺双 — 酵素中間物’並將蛋白酶誘陷於穩定的丘 價複合體中，而抑制蛋白酶。 、、糸私®文蛋白8#抑制物包括等 位基因與物種變體及其他變體，只要該絲胺酸蛋白酶抑制 物分子可藉由形成穩定的共價複合體而抑制蛋白酶。絲胺 酸蛋白酶抑制物亦包括全長絲胺酸蛋白酶抑制物多肽的經 截短或鄰接胺基酸片段’其最小地包括至少一個足以幫助 蛋白酶抑制作用，及與該蛋白酶形成穩定共價複合體之反 應性部位裱（RSL)的部分。例舉性絲胺酸蛋白酶抑制物列 不於表2，且/或具有列示於SEQ m N〇s: ^8中任一者、 其等位基因變體、或經截短部分之胺基酸序列。 如用於本文，“突變型”或“變異型，，絲胺酸蛋白酶 抑制物意指其含有胺基酸修飾，特別是位於絲胺酸蛋白酶 抑制物之反應性部位環中的胺基酸修飾之絲胺酸蛋白酶抑 24 200817517 制物。修飾可為一或多個對應於Ρη_Ρΐ5_Ρΐ4_Ρΐ3 位置之胺基酸的置換、刪除或取代。代 表性地，該絲胺酸蛋白酶抑制物相較於野生型絲胺酸蛋白 酶抑制物含有位於反應性部位環中1、2、3、4、5、6、7、 8、9、1〇或更多個胺基酸位置之胺基酸置換。最通常地， 置換係發生於一或多個對應於位置ρ4_Ρ2，之胺基酸。例如， 對於列示於SEQ ID ΝΟ:11之例舉性ΡΑΙ-1絲胺酸蛋白酶 抑制物’可修飾對應於SEqidn〇:ii中胺基酸位置366_37〇 之P4-P1’位置（VSARM)。實施例1描述將vSArm胺基酸 殘基修飾為RRVRM或PFGRS。 如用於本文’“易切斷鍵結”意指多肽中被蛋白酶裂 解之鍵結，且以位於受質之裂解序列中ρι_ρι，位置間所形 成的鍵結表示。 如用於本文，反應性部位意指標靶受質序列之被蛋白 酶裂解的部分。代表性地，反應性部位包括Ρ1-ΡΓ易切 斷鍵結序列。 如用於本文，反應性部位環（RSL ;亦稱作反應性中 心壤’ reactive center l〇op，RCL)意指絲胺酸蛋白酶抑制 物刀子中作為蛋白酶辨識部位，且一般含有蛋白酶專一性 之唯一或主要決定部位的胺基酸序列（代表性地1 7至22 ^接胺基酸）。RSL序列之裂解及其構型上的改變，係蛋 白酶由絲胺酸蛋白酶抑制物分子誘陷於穩定共價複合體中 之原因。對於本發明之目的，可將一或多個位於絲胺酸蛋 白酶抑制物之RSL環中的胺基酸進行修飾，以符合所希望 25 200817517 標乾蛋白質中之裂解序列。此類經修飾之絲胺酸蛋白酶抑 制物，或其含有變異型RSL序列之部分，可用於挑選具有 已改變受質專一性之蛋白酶。 如用於本文，分配意指藉其使絲胺酸蛋白酶抑制物部 分’於穩定絲胺酸蛋白酶抑制物·蛋白酶複合物與已裂解之 絲胺酸蛋白酶抑制物間進行分配的過程。對於在絲胺酸蛋 白酶抑制物進行分配之原因，係屬於抑制途徑的天然本 質’其導因於已裂解反應性部位環橫越絲胺酸蛋白酶抑制 (物表面之大易位。右蛋白酶在採取受抑制位置之前，有時 間解離（亦即使酵素 '絲胺酸蛋白酶抑制物脫酿基），則分 酉lx生於疋所給疋絲胺酸蛋白酶抑制物_蛋白酶相互作 用之、。果取决於抑制（〇與受質（灸5)途徑間之分配比例（例 如圖1所描述），其係由抑制之化學劑量法表示（si =工+ ):好的抑制子且古与ρ Μ & , & /、有該值為1，因為大部分絲胺酸蛋 白酶抑制物分子分配至複合體形成，而W趨近於0。然 m A RSL ;衣不夠快速插入蛋白酶中，則分配發生且反應 ^ 直接趨向已裂解產物進行。 士用於本文催化效率或kcat/km為蛋白酶裂解受質 之效率測里值’且如習於該項技藝人士已熟知係於穩定態 條件下測量得。 “ 女用於本文，抑制之二級速率常數意指關於蛋白酶盘 抑制子之相互作料速率常數。—般，蛋白酶與抑制子（例 如蛋白酶誘陷物，如絲胺酸蛋白酶抑制物）之相互作用’ 種’、各反應物、抑制子與蛋白酶濃度之乘積成正比之 26 200817517 二級反應。纟自酶受緊密結合性或不可逆抑制子或蛋白酶 t陷物之抑制的二級速率常數為m，其當乘以酵素 =度與抑制子濃度時，產生酵素被特定抑制子去活化之速 率對於各別蛋白扭誘陷物與酵素配對之速率常數，獨特 地反映出彼等的相互作用。作為二級反應，二級速率常數 增加意指經修飾之所挑選蛋白酶與抑制子間的相互作用較 j經修飾蛋白酶與該抑制子間之作用快。因此，二級速率 苇數之改堯反映出反應之各組成（蛋白酶及/或抑制子）間 、的相互作用改鲶。當進行蛋白酶篩選時二級速率常數增 加，可表示於該蛋白酶中存在所希望之所挑選修飾。曰 如用於本文，醯基酵素中間物意指於催化之第一步驟 期間’受質與絲胺酸蛋白酶之催化中心中的必要絲胺酸（代 表性地為Sefl95，基於胰凝乳蛋白酶編號）間所形成之共 價性中間物。該反應過程如下：絲胺酸_〇H攻擊位於受質 P1位置之叛基碳’組胺酸之氮接受來自絲胺酸_〇H之氯， 而一對來自幾基氧之雙鍵的電子移向該氧。此導致產生帶 t貞電荷之四面體中間物。此時連結該受質之肽鍵中的氮與 碳之鍵結被打斷。產生此鍵結之共價電子移動而攻擊組胺 酸之氫，而藉此打斷該連結。先前從幾基氧雙鍵移出之電 子，再從負電氧移回而再生成導致共價性醯基酵素中間物 形成之鍵結。該醯基酵素中間物被水解，產生脫酿基作用 及形成經裂解之受質與游離態酵素。 如用於本文，蛋白酶之集合意指含有至少1〇種不同 蛋白酶及/或其具蛋白分解活性部分，且一般含有至少5〇、 27 200817517
100' 500、1000、1〇4、1〇5或更多成員之集合。該集合代 表性地含有與欲篩選其受質專一性之蛋白酶（或其具蛋白 分解活性部分）。於集合中包括天然產生的蛋白酶（或其 具蛋白分解活性部分）及/或經修飾之蛋白酶（或其具蛋白 分解活性部分）。修飾包括沿著蛋白酶長度進行之隨機突 變，及/或於所靶定或挑選之區域内進行的修飾（亦即定焦 突，）。修飾可為組合型且可包括所有排列，藉由取代位 方、知疋基因座或位於所有基因座或其次組之全部胺基酸。 該集合可包括全長或較短（僅包括蛋白酶功能域）的蛋白 酶。蛋白酶可包括任何蛋白酶，例如絲胺酸蛋白酶及半耽 胺酸蛋白酶。該集合及特定集合之大小係由使用者決定。 如用於本文，“組合型集合”或“組合型文庫，，音指 -種蛋白酶多肽集合，其相對於起始模板蛋白酶多狀^ 列於其序列中具有不同且多樣的胺基酸序列突變。於集合 中所表現之突變可橫跨該多肽之序列，或可位於該多肽； 列之某（些）肖定區域中。突變可隨機進行，或可為經實 驗或基於、構或功能資料合理地設計之乾定突變。 °於本文，“模板蛋白酶，，意指具有用於其誘變之 =基酸序列的蛋自酶。模板蛋自酶可為野生 :::::性部分)之序列，或者其可為對其進行額:: 、去中所鑑涊知之突變型蛋白酶，可用作Α 供欲用於後蟢妞、眩人 』用1卞為 、，挑4回合之進一步誘變的起始模板。 如用於本文，隨機突變意指在橫跨多肽之序列導入一 28 200817517 或多個胺基酸改變，而不考慮或偏好突變發生於何處。隨 機誘變可受助於各種習於該項技藝人士已知之技術，包括 (例如）UV照射、化學方法及PCR方法（例如’易錯PCR)。 如用於本文，定焦突變意指於多肽之某（些）特定區 域，或某（些）特定位詈φ Μ I， 置中的一或多個胺基酸改變。例如， :進行位於蛋白酶之專一性結合口袋中胺基酸的把定突 ::例如’可藉由定點誘變或多位置-定點誘變，使用該項 技術已知之標準重組技術完成定焦誘變。 :用二本文，蛋白酶誘陷物與蛋白酶或 =分間之穩定複合體意指，一種足夠穩定以與未和蛋 白鉍誘陷物形成複合體之蛋 酶）分開的複合體。此類複！，未經複合之蛋白 用（包括共價性、離子性錢欠^由任何穩定之相互作 直於“ 及驗水性相互作用）形成，但是 :"复人二夠安定，以保持複合形式達足以分離出 邊稷合體之時間。代矣祕 山 戈表隱地，此類相互作用 ί Κ 胺酸蛋白酶抑制物與經裂解蛋白酶之間）為共價鍵。 選所得：：:二熱點’’意指-位置，其於由蛋白酶挑 &所侍對於所希望新爭暂 ^ ^ 性的多數變體中發生突變的活性及’或之選擇 或多處“熱點”。因此，此等位置為對於談24—出一 性及/或選擇性決定位， 酶之專一 蛋⑽㈣(例如絲胺 之多於-個成員的相對…豕知成特疋蛋白酶家族） 酶編號)發生呈廣效專一例如基 性及/或選擇性決定位。 29 200817517 如用於本文，關於受質專一性之所希望專一性音指對 於所預定或預選或不然所無定受質之裂解專一性。 d 了於本文’挑選，’或其文法上之變化意指，挑出 或透出與蛋白酶誘陷多 禝合之蛋白酶。因此，對於本發 月之目的，挑選意指基於蛋白酶於與 定複合體中之締合而將其筛出。一般，挑選 選可，助於脾疋#望，可將蛋白酶分離出。例如，挑 他可偵測部分標定，以;二；之標記物、標藏或其 而鑑認出該蛋白酶。9 ▲ '穩定複合體中之締合 如用於本文，“鋏句” 認知存在穩定複合體：；二：上之變化意指辨識或 法中，係藉由其在d:。代表性地’於本發明之方 合而鑑認出該蛋白酶:多狀之穩定複合體中之締 體中之已結合蛋白酶^ 例如）藉由擴增存在該複合 隨後進行DNA定序而（亦即’生長於適當宿主細胞中）’ 心斤而完成。 如用於本文，經辦a 如蛋白酶誘陷多肽二離意指將該分子(例 或與例如用於純化或 七…物（例如螢光團）締合， 經可偵測地標定意指：八 心耘戴或其他部分締合。 標定以供偵測或分離日將刀子（例如蛋白酶誘陷多肽）進行 如用於本文，關於蛋白 部分的擴增，意指增加— 次蛋白酶之具蛋白分解活性 量，例如足夠進行A 4蛋白酶或具蛋白分解活性部分之 仃刀離及選殖與表現，或者若蛋白酶或具 30 200817517 蛋白分解活性部分係展示於微生物上，則將微生物導入適 當宿主並生長或培養，以使能製造更多被展示之蛋白酶或 具蛋白分解活性部分。 如用於本文，關於反應混合物之均勻意指，反應物係 呈如混合物之液相，包括呈溶液或懸浮液。 如用於本文，引述蛋白酶或蛋白酶之具蛋白分解活性 部分的集合係“基於”某特定蛋白酶意指該集合係衍生自 ί
。亥蛋白I#，例如藉由隨機或定點誘變，或合理設計或其他 修飾流程或方法，而產生集合。 如詩本文，藉由投藥t_PA進行治療之疾病或病況， 係指對其習於該項技藝人士會投藥t_PA之疾病或病況。此 類病況包肖（但不限定於）血纖維蛋白溶解性病況，例如 動脈血栓形成、靜脈▲栓形成與也栓栓塞、缺血性中風、 後天$凝血病症、彌散性血管内凝血、及其前驅病況，例 如細菌或病毒性感染、牙周炎及神經學病況。 如用於本文，由VEGFR-2介導之疾病或病況係涉及 病料或病㈣。此類病況包括（但不限定於）發炎性與 血管生成性錢’例如癌症，糖尿病性視網膜病，及眼部 病症包括黃斑變性。 如用於本文 可互相替換使用 命名包括酶原形 為求清楚，關於 絲胺酸蛋白酶、 ，而意指催化共價肽鍵水解之酵素。此等 式，及其經活化之單-、二-與乡-鏈形式’。 蛋白酶係指所有形式。蛋白酶包括（例如） 半胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、蘇胺 31 200817517 酸蛋白酶及金屬蛋白酶， 與裂 視其活性部位之催化活性 解標輕受質之肽鍵的機制而定。 士用於本文’酶原意指因蛋白分解性裂解（包括成孰 裂解，例如活化裂解）及/或與置 …、 成複合體，而被活化之蛋白^ 貝 5 、因子形 一 <蛋白駟。酶原為蛋白分解酵素之不 ( 活化前驅物。此類前驅物_般較大，雖然非必要大於具活 性形式。關於絲胺酸蛋白酶’酶原係藉由專一性裂解(、包 括催化性及自體催化性裂解）或藉由與活化輔因子（其產 生具活性之酵素）肖合而轉化成具活性酵素。因此，酶原 為在酵素作用上不具活性之蛋白質’其藉由活化子之作用 而轉變成蛋白分解性酵素。可自體催化性地實現裂解。一 般二酶原不具活性且可藉由從酶原催化性及自體催化性裂 解珂區（proregion)，而轉化為成熟具活性之多肽。 / 识如用於本文，“前區，，、“前肽，，或“前序列，，意指 妓解而產生成熟蛋白質之區域或片段。此可包括其功能 為藉由遮蔽催化性結構，而因此防止形成催化性中間體（亦 即，藉由空間上封閉受質結合部位），來壓制酵素活性的 區段。前區為一段位於成熟具生物活性多肽之胺基末端的 月女基酸序列，且可小至如數個胺基酸，或可為一種多功能 域結構。 如用於本文，活化序列意指一段位於酶原中，為形成 具活性蛋白酶之活化裂解或成熟裂解所需的部位之胺基酸 序列。可自體催化性地或藉由活化性夥伴，來催化活化序 列之裂解。 32 200817517 活化裂解為一類1 裂解。此為（例如）、對於Γ 之構型改變發生的成熟 …… 胺酸蛋白酶之典型活化途徑， 其中裂解產生可與具有 已轉換區域作用，而讀路“舞（例如催化性殘基）之 活化可&導勒& 誘表活性所需之構型改變的新N-端。 法化可此導致產生多 形式之蛋白/式之蛋白酶。於某些實例，單鏈 式蛋白…現如單鏈之蛋白分解活性。 如用於本文，4 At »J5 r 同，且可被鑑認的=及或功能上與該分子之其他部分不 如用於本文，|f丄Μ 分。關於蛋白醢 _ ^此域為蛋白酶之具催化活性部 口 蛋白酶功能域包括任-此等蛋白質之單 一、二-及多·鏈形式。蛋白 予贫臼貝之早 ^ ^ ,, 吳之蛋白酶功能域含有J：蛋白分 •活性所需之所有該蛋 有/、蛋白刀 心。 要性質，例如其催化中 具蛋白分解 酶活性之任 早鍵形式之 分（代表性 酶之具催化 白酶功能域 序列之鄰接 酶功能域所 如用於本文，蛋白酶 、工^ 啤炙具催化活性部分或 /部分意指蛋白酶功能域，或其仍保有蛋白 何片段或部分。值得注意地，至少於試管内， 蛋白酶及其催化功能域或复 ^ 、 飞/、具蛋白分解活性部 為地C-端截短）呈現蛋白酶活性。
如用於本文，“編《笟A A 届碼蛋白酶功能域或蛋白 活性部分的核酸”意指僅 扣僅編碼所引述之單鏈蛋 或其具活性部分，而非該蛋 震曰崃之其他呈連續 4分的核酸。 、 如用於本文，描述某多 呆夕肽實質上係由蛋白 33 200817517 組成，意指該多肽之唯一部分為蛋白酶功能域或其具催化 活性部分。該多肽可視需要地（且一般將會）包括額外的 非-蛋白酶-衍生之胺基酸序列。 如用於本文，“S1-S4”意指形成供受質之ρι_ρ4殘基 的結合部位之胺基酸殘基（參見，例如，薛特與貝格Ο%?) Biochem Biophys Res Commun 27 :l 57 _l 62 )。各 si S4 人 有一、二或多個可能非-鄰接之殘基。此等部位依序從辨= 部位N-端至蛋白分解部位（稱作易切斷鍵結）進行編號。
如用於本文，術語“P1-P4”及“ Ρ1··Ρ4，”意指受質肽 中分別與S1_S4殘基及S1，_S4，殘基專一性作用且被該蛋白 酶裂解之殘基。P1-P4意指位於裂解部位…端之殘基部分； P1’-P4i意指位於裂解部位C_端之殘基部分。胺基酸殘基係 從多肽文質之N至C端進行標記（pj，…，p3, p2, 卩1, P3'，…，Pj )。各別結合次-位點被標記（Si，...，S3, S2, si，si, S21，S3，···，Sj)。於PI與pi’之間催化裂解。 如用於本文，“結合口袋，，意指與受質上之特定胺基 酸作用之殘基。“專一性口袋，，為提供較其他區段更多能 量之結合口袋（最重要或最主要的結合口袋）。代表性地， 該結合步驟處在為發生催化過程所必需之過度態形成之 前。S1-S4及Sl’-S4’胺基酸構成受質序列結合口袋，並藉 由分別與肽、多肽或蛋白受質之p1-P4及ρι，_ρ4，胺基酸作 用，而協助受質辨識。任一蛋白酶是否與受質作用為位於 S1-S4及SI -S4位置内之胺基酸的函數。若位於、 S3、S4、SI 、S2、S3’及84’次_位點中的任一或多者之胺 34 200817517 基酸可與受質之P1、P2、P3、P4、P1， 及 P4 位 點中之任一或多者之胺基酸相互作用或辨識之，則該蛋白 酶可裂解該受質。結合口袋將標靶胺基酸與蛋白酶定位於 適當位置，以使能達成肽鍵結之催化及受質之裂解。例如， 絲胺酸蛋白酶代表性地辨識受質中之P4-P2,位點；其他蛋 白酶可能具有P4-P2,外之延伸辨認。 用於本文，“授與延伸受質專一性，，之胺基酸意指該 等位於除了專一性口袋外之活性部位裂口中的殘基。此等 胺基酸包括蛋白酶中之S1-S4、Sl，-S4,殘基。 用於本文，相互作用之次級部位係位於活性部位裂口 之外。此等可助於受質辨識及催化作用。此等胺基酸包括 可助於與受質之第二及第三層級相互作用的胺基酸。例 如’蛋白酶結構中圍繞S1-S4。Sl，-S4,胺基酸之環，在使 受質中之P1-P4、ΡΓ-Ρ4,胺基酸位於適當位置，藉此定位 出蛋白酶活性部位中之易切斷鍵結上扮演重要角色。 用於本文，蛋白酶之活性部位意指受質結合部位，於 其中發生受質催化反應。活性部位之結構與化學特性使能 進行受質之辨識與結合，及後續受質中易切斷鍵結的水解 舆裂解。蛋白酶之活性部位含有造成肽裂解之催化機制的 胺基酸’以及促成受質序列辨識之胺基酸，例如授與延伸 父貝結合專一性之胺基酸。 用於本文，絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶之“催化性三聯 體 或“活性部位殘基，，意指其位於絲胺酸或半胱胺酸蛋 白酶之活性部位中，並造成肽裂解之催化機制的胺基酸（代 35 200817517 表性地為三個胺基酸）之組合。一般，催化性三聯體係存 在於絲胺酸蛋白酶中，並提供具活性親核劑及酸/鹼催化。 4胺3文蛋白酶之催化性三聯體含有三個胺基酸，其於胰凝 礼蛋白酶係Aspi〇2、His57與Serl95。此等殘基對於絲胺酸 蛋白酶之催化效率而言很重要。
用於本文，“受質辨識部位，，或“裂解序列，，意指其 由蛋白酶之活性部位辨認，而被蛋白酶裂解之序列。代表 I*生地（例如對絲胺酸蛋白酶而言），裂解序列係由受質中 之P1-P4與ρι’_ρ4’胺基酸組成，其中係於ρι位置後發生 裂解。代表性地，絲胺酸蛋白酶之裂解序列為，配合許多 之延伸受質專一性的長度六個胺基酸，但視蛋白酶而 疋可旎較長或較短。例如，MT_spi的自體催化所需之受 質辨識部位或裂解序列為RQARVV，其中R係位於…位 置，Q係位於P3位置，A係位於p2位置而R係位於ρι 4置MT_SP1中之裂解發生於其後連接VVG(}之位置R 用於本文，標紙受質意指在其受質辨識處被蛋白酶專 I*生衣解之X質。以最小而言，標乾受質包括組成裂解序 列之胺基要地，標㈣質包括含有裂解序列與任 何其他胺基酸之肽。含有由某蛋白酶所辨識之裂解序列的 t長蛋白f、其等位基因變體、同功型、或任何部分，即 受質之二： 標乾受質包括含有不影響 受質可：；解的頟外部分之肽或蛋白f。例如，標靶 、匕括以化學方式鍵聯至螢光產生部分之四個胺基酸 36 200817517 肽或全長蛋白質。 用於本文’裂解意指肽鍵藉由蛋 之裂解部位基序包含，N A r 精蛋白％ 未指定端至易切斷鍵結（分別為 禾扣疋鳊及指定端，1由 q P2-Pl-Pl,_p2,.P3, 二⑴ 丨疋我与··· P3- ··· ’ 4解發生於P1與ΡΓ殘基之間） 解\: ，受質之裂解為活化性裂解或抑制性穿 二活=解意指將多肽從不具活性形式裂解成： 形式。此包括（例如）將醢眉列 f 子鉍原衣解成活性酵素，及/或將前 生長因子裂解成具活性生导因 肱^、 長因子。例如，MT-SP1可藉由 將仏靶受質於RQAR之PKP4皮 一 序列處進行裂解而自體活 化。活化性裂解亦為一種蛋白皙 種蛋白貝糟其被裂解成一或多種j： 本身具有活性之蛋白質的裂解。例如，活化性裂解發生ς ，體糸統，其為-種不可逆之蛋白分解裂解事件級聯，其 取後結果導致形成多種直接刺激發炎、協助抗原細胞吞噬 及溶解某些細胞之效應分子。 如用於本文，抑制性裂解為將蛋白質裂解成一或多種 不具功能之分解產物。抑制性裂解造成蛋白質活性消除或 減低。代表性地’蛋白質活性減低會使該蛋白質所涉及之 途徑或過程變弱。舉-例而言，為抑制性裂解之對任一或 多種標乾蛋白質（例如VEGFR)的裂解，導致該標乾受質 之一或多項功能或活性伴隨減低或受抑制。例如，關於 VEGFR之裂解’可能受抑制之活性包括（但不限定於）受 體結合、激酶活性或血管生成活性’例如活體内或試管$ 血管生成活性。若裂解使活性相較於該蛋白質之天然妒气 37 200817517 ^ ^ !〇〇/〇 , 2〇% ^ 3〇0/〇 . 4〇% ^ 5〇% ^ 6〇% ^ 7〇% ^ 8〇% ^ 所：之二、Jr或以上，則為抑制性。作為抑制性裂解 蛋白質裂解百分比，係隨蛋白質而有所變化，但可 猎由为析該蛋白質之活性而測定得。 述之^Γ^’、蛋白酶多狀為具有相當於任一種本文所 、、白酶或其變異型蛋白酶之胺基酸序列的多肽。 :用於本文，'經修餘蛋白酶，，或“突變型蛋白酶，， 處·^ 1又於野^型或模板蛋白酶在一級序列中具有一或多 Li/蛋白酶多肽（蛋白質）。一或多處突變可為-或 “ *C取代）、插入、刪除及其任意組合。經 -飾之蛋白酶多肽包括該等具有 =、n、12、13、14、15、16、17，、19、m 二ι修飾位置者。經修飾之蛋白酶可為全長蛋白酶，或 之2修飾全長蛋白酶之具催化活性部分，只要該經修飾 型切：：！蛋白分解活性。一般，此等突變會改變野生 」拉板蛋白_以訪任—或多種所希望或所預定標乾 二之專-性與活性。除了在改變蛋白酶受質專一性之區 ^ 3有修飾外，經修飾之蛋白酶亦可容忍於對蛋白酶受 性而言非必須之區域中的其他修飾。因此，經修飾 冑代表後地與野生型或骨架蛋白酶之相對應胺基酸 有 /〇 70/〇、8〇 %、85%、90%、91〇/。、92%、93%、 0、95%、96%、97%、QS〇/ 〇〇〇/ 斗、 經修 0 98 /。、99/。或以上的序列同一性。 之全長蛋白酶或經修飾蛋白酶之具催化活性部分， 匕括其為融合蛋白之蛋白酶，只要該融合物本身並未改 38 200817517 變蛋白酶之受質專一性。 如用於本文，胰凝乳蛋白酶編號意指SEQ ID n〇:39i 之成熟胰凝乳蛋白酶多肽的胺基酸編號。可將胰凝乳蛋白 酶家族之蛋白酶（亦即，u-PA、t-PA、MT-SP1及其他）， 包括蛋白酶功能域，與胰凝乳蛋白酶進行排列比對。於此 類實例，對應於熟胰凝乳蛋白酶胺基酸的該蛋白酶胺基 酸，被給予胰凝乳蛋白酶胺基酸之編號。可藉由此類排比， 由習於該項技藝人士使用人為排比，或藉由使用許多可用 f、 之程式（例如，BLASTP )，而決定相對應位置。相對應 位置亦可以例如藉由使用蛋白質結構之電腦模擬排比進行 的結構排比為基礎。某多肽的胺基酸相應於所揭示序列中 之胺基酸的詳述，意指在使用標準排比演算法（例如GAP 演算法）排比該多肽與所揭示序列以使同一性或同源性達 隶大（其中係排比保守性胺基酸）後鑑認得之胺基酸。例 如’於將u-PA與成熟胰凝乳蛋白酶多肽進行排比後，列 示於SEQ ID NO:191之u-PA的前驅物序列中的胺基酸Cl68 ϋ 與成熟胰凝乳蛋白酶多肽之胺基酸Cl並列。因此，基於 胰凝乳蛋白酶編號，U-PA中之胺基酸C168亦為C1。使用 此類胰凝乳蛋白酶編號標準，列示於SEQ ID NO·· 191之前 驅物ιι-ΡΑ序列中的胺基酸L244，基於胰凝乳蛋白酶編號 係與L 7 3相同’而胺基酸12 6 0基於胰凝乳蛋白酶編號係與 189相同。於另一項實例，在將MT-SP1之絲胺酸蛋白酶功 能域（相當於SEQ ID NO:253中之胺基酸615至855 )與 成熟胰凝乳蛋白酶多肽進行排比後，位於MT_SP 1中位置 39 200817517 615之V被給予胰凝乳蛋白酶編號V16。後續之胺基酸據 此進行編號。因此，位於全長MT-SP1 (SEQ ID NO:253)之 胺基酸位置708的F，基於胰凝乳蛋白酶編號係對應於 F99。若有殘基存在某蛋白酶，但不存在胰凝乳蛋白酶中， 則將該胺基酸殘基加字母註記。例如，於胰凝乳蛋白酶中 為％ —部份、基於胰凝乳蛋白酶編號為胺基酸6〇、但相較 於胰凝乳蛋白酶係插入MT_SP1序列中之殘基，稱作例如 Asp60b 或 Arg60c 〇
如用於本文，對於某一標乾受質之專一性意指對標乾 受質相較於另一受質（稱作非_標靶受質）藉由某蛋白酶的 裂解之偏m係於二級速率常數或專-性常數 反映，其為蛋白酶對其受質之親 效率之測量值。 /π糸 π π %、不又 ^為米氏⑽如^㈣常數⑼^: u Vma胸，❿Ετ為：之⑻）且 濃度倒數對受質裂解速率倒素/辰度。可猎由犧質 方程…速率仰nr，並擬合成賴威弗-布克
Vmax=[ET]k ) ，士十曾心/』⑻）+ ;其中 ，计异得參數K叫、κ 以於各種不同漠為併 m Cat/Km。任何用 率的方法，可用二：，測定裂解隨時間增加之速 產生部分連接，該部分於被將受質與螢光 不阿酵素濃度下之裂解速率， 時釋出。藉由測定
Kcat。專一性 、疋出對於特定蛋白醢之 &吊數可用於使用該技藝 疋蛋白酶之 <如準方法（例如位 200817517 置=合文庫(PS_SCL))挪定位於 S1-S4區段中的胺基酸對於受 扭之卩或夕個 點專一偏好。此外，專—性常數a PMM胺基酸之位 於一標乾受質相較於另一受質之偏好了用於剩定出蛋白酶對 可用於比：本t又貝專一性比為專-性常數之比值，且 J用於比較二或多種蛋白醢 ^ 五 受質之。 種蛋白酶對於二或多種 酶對於某—^ ^’如’蛋白酶對於競爭受f，或競爭蛋白 比乾、:；X貝之受質專一性’可藉由比較。Km而進行 , 如，對於標乾受質具有專-性常數為2X106M- 二非標μ質為蛋白酶， 對質而言較具專—性。使用得自前述之專一性常 數，該蛋白酶具有對於標㈣白酶之受質專―性比為⑽。 如用於本文，對於標靶受質之偏好可以受質專一性比 表現。反映出偏好挑選之特定比值，為所討論受質鱼蛋白 酶之函數。值大於i之受質專一性比，表示對於標靶受質 之偏好，而受質專一性比小於i，表示對於非-標靶受質之 偏好 & ’至少為或約1之比值反映對於欲被認為候選 治療劑之蛋白酶之顯著差異。 如用於本文，經改變之專一性意指相較於起始野生型 或模板蛋白酶經修飾或所挑選蛋白酶於受質專一性的改 變。一般，專一性改變反應經修飾蛋白酶對於標靶受質相 較於模板蛋白酶之野生型受質（於本文稱作非標靶受質） 之偏好的改變。代表性地，本發明所提供之經修飾或所挑 選蛋白酶，相較於模板蛋白酶之受質專一性，對於標靶蛋 200817517 白質之任-或多段預定或所希望 質專-性。例如，對於標乾受質對非 ^現增加的受 -性比為100之經修飾或所 二“具有戈質專 受質專一性比為〗0之 、酶，呈現相較於具有 於另一杏仞日士 月木蛋白酶為10-倍增加 於另，例，具有受質專_ ⑼寻性。 較於為0.1之比值〜之經修飾蛋白酶，相 較於模板蛋白酶之專專—性以倍增加。為呈現相 ♦多種所預鳴受質具大有 蛋白…於任- r爪倍，·倍、脈倍、3眼倍、_^、5·倍、1〇_倍、 的受質專一性。 4、5〇〇-倍或以上 如用於本文，“選擇性”杏A立 爭受質之、、曰入私+ + 田/、心私蛋白酶選擇並從競 了又貝之此合物之中裂解一 ~性互換使用。钛靶又貝之能力時，可與專 俠便用。蛋白酶對於標靶 多種標乾受質之增加的挑選性，可，何其他一或 標靶受質被蛋白酶裂解之專 糟由比較該等 蛋白_斟认π 性$數而测定。例如，若一 =對嶋受質具有專—性常數為2Χ 而對於任何其他—或多種受質為2Χ…M.ls 疋 白酶對於前者標乾受質較具選擇性。 ㈣’則該蛋 質關文’活性意指多肽或其與全長（競爭）蛋白 邛为的一或多種功能活性。 限定於）生物活性、催化或酵辛活性、^性包括（但不 之結合的能力）、免 -性結合的能力。 …亥夕狀之受體或配體專 42 200817517 如用於本^w y 、 催化活性或裂解活性意指竿 測所選受質之蛋白八缺“ “曰系蛋白if如偵 之活性。裂解活性 鮮刀析中刀析 得。 了糟由〃刀析某蛋白酶之裂解效率而測量 疋白=於t文，對於標乾受質之活性意指其反映出，一 虫鰣對於軚靶雙質之活性的裂解 其他測量值。f解、…^ 性或力能活性，或 量得。對於本發明之目的，4 ’鮮欢旱而測 的’右蛋白酶呈現出相較於盔該蛋 白酶存在時較大的辨^、☆併π "、、為蛋 、不革又貝蛋白分解或裂解，且/或調節（亦 即活化或抑制）標靶受質 貝贫白之功月匕活性，則活性增加。 如用於本文’絲胺酸蛋白酶或絲胺酸内肽酶意指一類 其特徵在於在該酵素之活性中心存在有絲胺酸殘基之肽 酶^絲胺酸蛋白酶參與許多體内功能，包括血液凝結、發 炎，以及原核與真核細胞之消化性酵素。由“絲胺酸蛋白 酶裂解之機带】’係基於所無定肽鍵被絲胺酸親核性攻 擊。與天冬胺酸或金屬缔合之半胱胺酸、蘇胺酸或水分子， 亦可扣項此角色。絲胺酸、組胺酸與天冬胺酸之排列的側 鏈，形成大多數絲胺酸蛋白酶共有之催化性三聯體。絲胺 酸蛋白酶之活性部位形狀呈多肽受質結合致其之裂口。 如用於本文，人類蛋白質為由存在於人類基因組，包 括所有等位基因變體及其保守變異中之核酸分子（例如 DNA )所編碼者。若修飾係基於人類蛋白之野生型或優勢 序列’則蛋白質之變體或修飾為人類蛋白質。 如用於本文，天然產生的α_胺基酸之殘基為該等存在 43 200817517 然，藉由f電荷tRNA分子以其 個α-胺基酸之殘 如用於本文’非天然胺基酸意指非由基 ^ 人類中之關連mRNA密 馬子之專一性辨識，而併入蛋白質的2〇 基。 酸 因編碼之胺基 如用於本文，核酸包括dna、rn 括肽核酸（PNA)及1混人物 /、；、員似物，包 …丄/合物。核酸可為單股或雙股。當指 才木針或引子時，其視愛i 八视而要經標定（例如）可 例如勞光團或放射性標記，預期為單股分子^ ==係使其標-物在統計上為獨-或具有低副本: (代表性地少於5，一妒筏w、认，、 —文康… &係少於3)以用於探測或引發某 文庫。一般，探針或引子 興趣基因互補或相同之序列的鄰接：16或30個與所 為10、2〇、3〇、50、100共多個核酸長。 了 如用於本文，肽音指1在 肽。 2 i 40個胺基酸之多 如用於本文，存在於本發明所提供 之胺基酸，係根據其已知…字母咖序列中 ^ ^ ^ 一予母或早-字母縮寫（表1) 疋。存在於各種核酸片段中之核苷酸， 項技藝之標準單-字母命名表示。 ’、貝吊於該 機化=於,本文，“胺基酸”為含有胺基與幾酸基團之有 胺基酸包括二對於本發明之目的， 似物（亦即，天^基酸、非天然胺基酸與胺基酸類 /、中α-碳具有側鏈之胺基酸）。 44 200817517 如用於本文’ “胺基酸殘基，，意指在多肽於其肽鍵聯 部位化學分解（水解）後形成的胺基酸。本文所述之胺基 酸殘基被推定為係呈“L”異構形式。呈“D”異構形式（經如 此命名）之殘基，可取代任一 L_胺基酸殘基，只要該多肽 仍保有所希望之功能特性。NH2意指位於多肽胺基末端之 自由L胺基。COOH意指位於多肽羧基末端之自由態羧基。 在維持以於乂扪c/zem，243: 3552_3559 〇969)所述，及 Γ 採用37 C.F.R j§ 1821_1 822之標準多肽命名，對 基酸之縮寫係列示於表1: 、各知 表1 -對照表 ^^~丽 ----- L字母 3-字母 鞍基酸 Tyr 酪胺酸 Gly 甘胺酸 Phe 苯丙胺酸 Met 甲硫胺酸 Ala 丙胺酸 Ser 絲胺酸 〜I lie 異亮胺酸 Leu 亮胺酸 __JT Thr 蘚^胺酸 Val 纈胺酸 sP Pro 脯胺酸 Lys 賴胺酸 His j且胺酸 Gin 爸胺醯胺 45 200817517 符號 1-字母 3-字母 胺基酸 E Glu 谷胺酸 Z Glx Glu 及/或 Gin W Trp 色胺酸 R Arg 精胺酸 D Asp 天冬胺酸 N Asn 天冬醯胺 B Asx Asn 及/或 Asp C Cys 半胱胺酸 X Xaa 未知或其他 應注意，所有於本文中以分子式代表之胺基酸殘基序 列，具有以習知胺基末端至羧基末端之方向的左至右位 向。此外，語詞“胺基酸殘基”廣義定義為包括對照表（表 1 )中所列之胺基酸，及經修飾與不平常之胺基酸，例如 該等參照於37 C.F.R· §§ 1.821-1.822所列者，且以引用方 式納入本文。再者，應注意位於胺基酸殘基序列之起始或 末端的破折號，表示與一或多個胺基酸殘基之另一序列、 與胺基末端基團例如NH2、或與羧基末端基團例如c〇〇h 連接之肽鍵。 如用於本文，“天然產生的胺基酸，，意指存在多肽中 之20種L-胺基酸。 如用於本文，“非天然胺基酸，，意指具有與天然胺基 酸相似之結構，但在結構上已經修飾以模擬天然胺基酸之 結構與反應性的有機化合物。因此，非天然胺基酸包括（例 46 200817517 °除20種天然產生的胺基酸以外之胺基酸或胺基酸類 似物’且包括（但不限定於）胺基酸之D_立體異構物。例 舉性非天然胺基酸於本文敘述，且為習於該項技藝人士已 知者。 "" 汝用於本文，等動力學混合物為其中已將胺基酸之莫 耳比例基於其所報導之反應速率進行調整者（參見，例如， 歐斯瑞奇等人’（1994)生物聚合物34:1681 )。 如用於本文，DNA構體為其含有以非天然方式組合及 並排之DNA節段的單或雙股、線形或環狀DNA分子。βΝΑ 構體以人為操作之結果存在，且包括經操作分子之選殖株 及其他副本。 如用於本文，DNA節段為較大DNA分子中具有特定 屬性之部分。例如，編碼特定多肽之DNA節段為較長dna 刀子（例如質體或質體片段）中，其當從5，至3，方向解讀 日守’編碼特定多肽之胺基酸序列的部分。 如用於本文，術語直向同源物（〇rth〇l〇g)意指得自一物 種的夕肽或蛋白質，其為得自不同物種之多肽或蛋白質之 功旎對應物。直向同源物間之序列差異為種形成結果。 如用於本文’聚核苷酸意指去氧核糖核苷酸或核糠核 苷酸鹼基從5’至3’端讀取之單·或雙股聚合物。聚核苷酸包 括RNA與DNA，且可自天然來源分離得，於試管内合成 得，或從天然與合成分子之組合製備得。聚核苷酸分子之 長度於本文係根據核苷酸（縮寫成“nt”）或鹼基對（縮寫 成“bp”）表示。當前後文許可時，術語核苷酸係用於單_及 47 200817517 雙股分子。當該術語應用於雙股分子時，其係用於表示總 長度，且應了解與術語鹼基對相等。習於該項技藝人士會 瞭解，雙股聚核苷酸之兩股可能在長度上稍有差異，且其 末端可能交錯·，因此雙股聚核苷酸分子内之所有核苷酸可 未配對。一般，此未配對之末端長度將不超過2〇個核苷 酸。 如用於本文’兩蛋白質或核酸間之“相似性，，意指， 蛋白質之胺基酸序列或核酸之核苷酸序列間的關係。相似 性可基於殘基序列及其中所含有之殘基的同一性及/或同源 性私度。评估蛋白質或核酸間之相似性程度的方法，為習 於4項技藝人士已知。例如，於一項評估序列相似性之方 法中’係將兩胺基酸或核苷酸序列以產生序列間最大同一 性耘度之方式進行排比。“同一性”意指胺基酸或核苷酸 序列無差異之程度。胺基酸序列（且某程度而言指核苷酸 序列）之排比，亦可考量胺基酸（或核苷酸）中之保守性 差異及/或經常性取代。保守性差異為該等仍保留所涉及殘 基之物理-化學特性者。排比可為整體性（以序列全長且包 括全部殘基排列比對所比較序列），或局部性（排列比對 僅包括最相似區域之序列的一部份）。 “同一性”本身具有該技藝已認知之定義，且可使用 已公開技術計算（參見，例如：斤覃分子左參學 (Computational Molecular Biology)，雷斯先，Α Μ·,編著， 年聋欠學钇版，紐約，\9W ·，生物電算：資訊學與基因組計畫 (Biocomputing: Informatics and Genome Projects),史密 48 200817517 斯，D.W·，編著，學院出版，紐約，1993 ;序办袅濛之雹廢分灰 (Compwier少Dak )，第 I 部，格力芬，α·μ· 與格力务，Η · G ·，編著，胡馬那出版，紐澤西，1 9 9 4 ;分子j教 學之序列分析 Q Sequence Analysis in Molecular Biology), 凡海耶，G·，學院出版，1987;及序列分析引子（心 义⑽/州），葛利布斯科夫，Μ•與迪弗流克斯，j·，編著， Μ史托克頓出版，紐約，1991 )。雖然同時存在有許多用於 計异兩聚核苷酸或多肽間之同一性的方法，術語“同一 性為習於該項技藝人士已熟知者（卡利羅，Η.與利普頓， D·，«7 她^後 ι〇73(1988))。 如用於本文，同源（就核酸與/或胺基酸序列而論）意 指約大於或等於25%序列同源性，代表性地，大於或等: 25%、40%、5G%、6G%、鳩、嶋、抓、咖或㈣序 列同源性；若需要可指定確切的百分比。對於本發明之目 的，術語“同源性”與“同一性，，常相互使用，除非另行 指示。H於同源性或同—性百分比之敎，係將序 列進行排比，以使能獲得最高程度之吻合（參見，例如. ㈣分Η乾雷斯克，A.M.，編著，牛津大學 ΊΒ生物電算:資訊學與基 '、、二 者，Γ ，約，1993;相㈣之諸统第J部格 力分，A.M.與格力芬，H G，編 ，α 1 "4 ;分子㈣學之席疗麵，凡海耶’：：：版▲澤西， 及序列分析引子，葛利布斯科夫’弗子心版，1987 ; Μ史托克頓出版，紐約，1991.，迪弗流克斯，J.，編著， ，卡利羅等人（1988) ^ 49 200817517 α:1073 )。藉由序列同源性，保守胺基酸數 目可藉由標準排比演算程式測定，且可用以由各供應者建 立之預設空隙罰則（gaP Penalty )。實質上同源之核酸分 子，會代表性地於適中嚴苛度或高嚴苛度下，沿著所興趣 核酸之長度進行雜交。亦預期含有取代雜交核酸分子中之 密碼子的簡併性密碼子之核酸分子。 可使用已知之電腦演算法例如”FASTA”程式，使用例 如於皮爾森等人（1988) Pn AW. 5W· [/a S5:2444 中所述=預設參數（其他程式包括GCG程式套裝（迪弗流 免，Jf，3·專人，Nucleic Research 】2⑴ jgy (η名4))、 BLASTP、BLASTN、FASTA (亞舒爾，S-F·等人 ^偏％ 价0/ 275:403 (1990));巨大電腦指南（Guide to Huge Computers)， 馬’丁 J•畢修普，編著，學院出版，聖地牙哥，1994，與卡利羅 等人（198 8) S/dA/ J她心料：1〇73 )，測定任二種 刀子疋否具有至少6〇0/〇，7〇%, 8〇%，85%，⑽％，95%，％%， 97%’ 98% or 99% “同一性”或“同源性”。例如，國家 生物技術資料庫中心之BLAST㊣數可用於測定同一性。 ^他商業或公開可取得之程式包括DNAShr ”MegAlign，，程 式（ > 迪遜，wi)與威斯康辛大學遺傳學電腦組群（UWG) 空隙（Gap)，，程式（麥迪遜，WI)。蛋白及/或核酸分 :,百分比同源性或同一性，可（例如）藉由使用⑽電 月自权式（例如’尼多曼等人（197〇) 乂剔仙厂48:443，由 史山4舁瓦特叉修訂（（1981) 乂办却〆从如办2:482 )比 較序列資訊而測定。簡言之，GAP程式定義相似性為所排 50 200817517 比之符號（亦即核苷酸或胺基酸）中相似者的數目除以兩 序列之較短者中的符號總數。gap程式之預設參數可包 括·（1)單一比對矩陣（含有同一性之值為1及非-同一性 之值為〇)與葛利柏斯托夫等人（1986)
14:6745之加權比對矩陣，如許瓦茲與戴赫夫編著，蛋泠# 序列與結構之圖表集q ATLAS 〇F pR〇TEIN seqUENCE AND ⑽附咖），國家生物醫學研究基金會，ΡΡ· 353-358 (1979) 所述，（2)對於各空隙為3 〇之罰則，且對各空隙中之個別 ( 符號之額外0·10罰則；及（3)對末端空隙無罰則。 因此，如用於本文，“同一性，，或“同源性，，代表測 试14 >考夕狀或聚核苷酸間之比對。如用於本文，術語至 少90%相同於’’意指相對於參考核酸或多肽之胺基酸序 列，同一性百分比為9〇至99·99。同一性達9〇%或以上表 示事實上，舉例而言假設比對長度為1〇〇胺基酸之測試與 麥考多肽。測試多肽中不大於1〇0/。（亦即，100個中有10 , 個）胺基酸與苓考多肽中者不同。於測試與參考聚核苷酸 I，之間，可進行類似的比對。此類差異可呈隨機分布於整個 夕肽長度或彼等可叢聚達最大可允許值（例如10/100胺基 I差異（大約90%同一性））之不同長度的一或多個區域 中之定點冑變表現。i異係定義為核酸或胺基酸取代、插 入或刪除。於大於約85-90%之程度的同源性或同一性，結 果應與程式及空隙參數組無關；如此高度的同一性可輕易 地5平估，往往係藉由人為排比而不仰賴軟體。 如用於本文，所排比之序列意指使用同源性（相似性 51 200817517 及/或同-性）來排比核普酸或胺基酸中之相對應位置。代 表性地’係排比二或多料5〇%或以上相關之序列。一組 所排比序列意指2或多種於相對應位置進行排比之序列， 且可包㈣生自RNA (例如EST及其他①财）與基因組 DNA序列排比之排比序列。 如用於本文，“引子，，意指核酸分子，其可於適當條 件（例如，於四種不同核普酸三碟酸與聚合劑，例如dna 聚合酶、RNA聚合酶或反轉錄酶存在下）於適#緩衝液中 Γ 及於適合溫度下作用為模板-指揮性DNA合成的起始點。 應認知某些核酸分子可作為“探針，，及作為“引子，，。然 而，引子具有用於延伸之3，_羥基。引子可用於各種不同= 法，包括（例如）聚合酶鏈反應（PCR)、反轉錄酶（RT)_pcR、 RNA PCR、LCR、多重 PCR、鍋柄式 pCR( panhandie pcR)、 捕捉PCR、表現PCR、3,與5, RACE、原位pCR、接合作 用-介導之PCR及其他擴增方法。 如用於本文，引子對”意指一組包括與欲擴增（例 ( 如藉由PCR)序列之5,端雜交之5,（上游）引子及與欲擴 增序列之3,端互補序列雜交之3,（下游）引子的引子組。 如用於本文，“專一地雜交，，意指核酸分子（例如寡 核苷酸）與標靶核酸分子藉由互補之鹼基配對之黏合。習 於該項技藝人士熟知可影響專一性雜交之試管内與活體内 參數，例如特定分子之長度與組成。與試管内雜交特別相 關之參數進一步包括黏合與漂洗溫度、缓衝液組成及鹽類 》辰度。用於將非-專一性結合之核酸分子去除之例舉性漂洗 52 200817517 於阿嚴苛度為 Ο·1 X SSPE、0.1% SDS、65°c，而於 中嚴可度為〇·2 χ SSPE、〇1% SDS、5〇〇c。相等之嚴苛度 1 =為β項技藝中已知。f於該項技藝人士可容易地調整 此等芩數，以靶定適於特別應用之核酸分子。 如用於本文’ I質上與產物相同意指其足夠相似以使 所興趣特性充分未被改變，以致實質上相同的產物能用於 取代該產物。
似，，異。 用於本文，亦應了解術語“實質上相同，，或‘‘相 會隨前後文如習於相關技藝人士所了解者而有所差 用於本文，等位基因變體或等位基因變異異指佔據 相同染色體座之基因的任意二或多種另類形式。等位基因 變異自然地由突變發生’且可能導致族群中的表現型多樣 性。基因突變可能為緘默（於所編碼之多肽無改變），或 I能編碼具有已改變胺基酸序列之多m‘等位基因 又體於本文亦用以表不由某基因之等位基因變體所編碼 之蛋白質。代表性地，基因之參考形式編碼得自某一族群 或某物種之單一參考成員的多肽之野生型及/或優勢形式。 代表性地，等位基因變體（包括種間與種内之變體）與得 相同物種之野生型及/或優勢形式具有至少、列％或 以上胺基酸同-性；同-程度取決^該基因，及比對是於 種内或種間進行。-般’種内等位基因變體與野生型及/或 優勢形式具有至少、約8〇%、85%、9()%或㈣同一性或以 上，包括與多肽之野生型及/或優勢形式之96%、97%、98%、 53 200817517 99%或以上的同一性。
^ 口用於本文，“等位基因，，（於本文可與“等位基因 、交體交替使用）意指基因或其部份之擇其一形式。等位 基因佔據同源染色體上之相同基因座或位置。當個體具有 某基因之兩相同等位基因時，則該個體被認為對於該基因 或等位基因係同型合子性。當個體具有某基因之兩不同等 位基因時，則該個體被認為對於該基因係異型合子性。特 定基因之等位|因可能彼此差*單一核芽酸或數個核普 酸’且可包括核普酸之取代、刪除與插人。某基因之等位 基因亦可為含有突變之基因形式。 如用於本文，剪接變體意指經由導致一類以上 的基因、组DNA之一級轉錄物之差異性加工所產生之變體。 如用於本文，修飾係關於多肽之胺基酸序列或核酸分 子中的核錢序列之修飾，分別包括胺基酸與核苦酸之 刪除、插人及置換。修飾多肽之方法為習於該項技藝人士 之例常工作，例如藉由使用重組DNA方法。 如用於本文，肽模擬物為一種化合物，其模擬特定肽 之生物活性形式的構型與某些立體化學性質。一般，肽模 擬物係經設計以模擬某化合物之某些所希望特性而非不希 望之性質’例如導致喪失具生物活性構型與鍵結斷裂之柔 勃性。肽模擬物可從具生物活性化合物，#由將某些造成 不希望性質之基團或鍵結以生物電等排物體⑻仏⑽⑽）置 換。生物電等排物體為習於該項技藝人士已知者。例如伸 甲基生物電等排物冑CH2S 6被用作為腦啡肽類似物中之 54 200817517 醯胺替代物（參見，例如史帕托拉（1983) pp. 267-357於胺 基酸、肽及蛋白質之化學與剩物化學（Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins)，韋 恩斯坦編者，卷7，馬歇爾迪克，紐約）。嗎啡（可經由 口服投藥）為胜肽内啡肽之肽模擬物的化合物。為本發明 之目的’環狀肽包括於肽模擬物内，而其中一或多個肽鍵 被模擬物置換之多肽亦如此。 如用於本文，包含於參考多肽中提出之胺基酸的特定 百分比之多肽意指多肽與參考多肽間所共有的連續相同胺 基酸的比例。例如，包含70%於具有於SEQ ID NO:XX (列 舉147個胺基酸）提出之胺基酸的序列的參考多肽中之胺 基酸的同功型，意指該參考多肽含有至少1 〇3個於Seq ID NO:XX胺基酸序列中提出之鄰連胺基酸。 如用於本文’術語啟動子意指基因中含有提供rNA 聚合酶結合，及引發轉錄作用之DNA序列的部份。啟動 子序列一般（但非總是）係存在於基因之5，非_編碼區域中。 如用於本文，經單離或純化之多肽或蛋白質或其具生 物活性部分，係實質上不含有細胞物質或其他來自該蛋白 質從其衍生得之細胞或組織的污染蛋白質，或者當以化學 方式合成時實質上不含化學前驅物或其他化學品。若製劑 當以由習於該項技藝人士所用之評估其純度之標準分析方 法（例如薄層層析術（TLC)、凝膠電泳術與高效能液體層 析術（HPLC))測定時，似乎不含可容易偵測之雜質，則 彼等可經測定為實質上純的，或者為充分純的以使經進^ 55 200817517 步純化不會可偵測地改變該物質之物理及化學性質，例如 酵素及生物活性。該等化合物用於產生實質上化學上純的 :匕合物之純化方法，為習於該項技藝人士已知。然而，實 質上化學上純的化合物可為一種立體異構物之混合物。於 此類實例：’進一步純化可能增加該化合物之比活性。 ;術語實質上不含有細胞物質包括其中蛋白質係自細胞 (該蛋白質自其單離或經重組方式製得）#細胞組成分離 :蛋白製劑。於一項具體㈣，術語實質上不含有細胞物 質包括具有少於約30% (以乾重計）非蛋白酶蛋白質（於 ^文亦稱作污染蛋白f)，—般少於約鳩非蛋白酶蛋白 貝或10%非蛋白酶蛋白f，或少於約5%非蛋白酶蛋白質 蛋白酶蛋白貝製劑。當蛋白酶蛋白質或其具活性部分係 經重組方式製得時’其亦實質上不含有培養基，亦即，培 、於、’勺或為β亥蛋白酶蛋白質製劑體積之Μ%、1 或5%。 ;如用於本文，術語實質上不含有化學前驅物或其他化 子口口 υ括其中蛋白質係自涉及該蛋白質合成之化學前驅物 或其他化學品分離的蛋白酶蛋白質製劑。該術語包括具有 夕於約3〇/° (以乾重計）、20%、1〇%、5%或更少之化學 月(J驅物或非蛋白酶化學品或組成的蛋白酶蛋白質製劑。 如用於本文，合成型（關於，例如，合成型核酸分子 或^成里基因或合成型肽類）意指藉由重組方法及/或藉由 化學合成方法製得之核酸分子或多肽分子。 如用於本文，藉由使用重組DNA方法之重組方式製 56 200817517 造意指使用已熟知之分早&铷與
<刀千生物學方法表現由所選殖DNA 編碼的蛋白質。 質體）意指用於將外源性核酸 中的分開元件。載體代表性地 以實現將基因或其部分整合入 如用於本文，載體（或 導入供其表現或複製之細胞 保持為游離型，但可經設古十 基因組染色體中。亦預期載體為人造染色體，例如酵母人 造染色體與哺乳動物人造染色體。此類載體之挑選及使用 為習於該項技藝人士已熟知者。
如用於本文，表現載體包括能夠表現經操作性與能影 曰此類DNA片段表現之調節性序列（例如啟動子區域） 連接的DNA之載體。此類額外節段可包括啟動子與終結 子序列，且視需要地可包括一或多個複製起點、一或多個 可選擇標記、#強子、聚腺苦化訊號、等。表現載體-般 係何生自質體或病毒DNA，或可含有該二元件。因此，表 現載體意指重組DNA或RNA構體，例如質體、噬菌體、 重組病毒或其他，其（在導入適當宿主細胞中後）導致所 選殖DNA表現。適當表現載體為習於該項技藝人士所熟 知’且包括該等可於真核細胞及/或原核細胞中複製者，及 。亥等保持為游離型，或其整合入宿主細胞基因組内者 如用於本文，載體亦包括“病毒載體，，或“病毒性載 體。病毒載體為經操作性連接至外源性基因，以使該外 源性基因轉移至細胞中之經設計病毒（作為載體或穿梭載 體)〇 〆 如用於本文，腺病毒意指任一群會造成人類結膜炎與 57 200817517 上呼吸道感染之含_ηχΓΔ 主 Α病母。如用於本文，裸露DNA竟 指可用於疫苗鱼其、志、+ ^ ^ "" 療法之無組蛋白DNA。裸露DNA為 在稱作轉型之基因轉蒋 褥移過私期間，從細胞傳至另一細胞之 遺傳物質。於轉型作 乍用中，經純化或裸露DNA係由接受 細胞攝取，其將給予接受細胞新的特徵或外表型。 ±如用於本文’可操作或操作性連接當關於DNA節段 時，意指該等節段係經排列以使其等依所欲之目的偕同發 揮功月色’例如轉錄作爾仏士人
、 （始於啟動子，並通過編碼序列進 行直到終結子。 如用於纟文，|白結合序列意指其能夠專__結合至1 他蛋白質錢序列（通常是結合至—組蛋白質或肽序歹卜、 或結合至-種特定蛋白質或肽序列）之蛋白質或肽序列。 如用於本文’表位標籤意指一段短的展開的胺基酸殘 基’其相當於有助經附加表位標籤之蛋白質或肽進行後續 生化及免疫子刀析之抗原表位。附加表位標籤係藉由將表 位標籤序列加至存在適當表現載體中之蛋白f 編碼序列。 經附加抗原表位標籤之蛋白f可使料對對抗該標鐵之高 度專一性抗體親和性純化。 β 如用於本文，金屬結合序列意指能夠專一結合至金屬 離子（通常是結合至一組金屬離子或結合至一種特定金屬 離子）之蛋白質或肽序列。 如用於本文，術語評估欲包括以獲得樣本中存在之某 蛋白酶或其功能域之活性絕對值，以及獲得該活性程度之 指數、比例、百分比值、目測或其他值指標的靈敏度為目 58 200817517 的之定量與定性測定。 > u 疋汗估可為直接或間接，且實際上欲 被偵測之化學物鍤τ — 予物種不一疋必然是蛋白分解產物本身，而可 例如為其衍生物或宜 次某二八他物貝。例如，補體蛋白之裂解 產物的偵測’例如蕪由q 精由SDS_PAGE及以考馬斯藍染色蛋白 質。 用於本文，生物活性意指某化合物之活體内活性， 或於活體内技藥某化合物、組成物或其他混合物後產生的 生理反應。因此，生物活性包含此類化合物、組成物及混 合物之治療功效與醫藥活性。生物活性可於經設計用於測 :式或利用此類活性之試管μ統中觀察。因此，對於本發 明之目的，蛋白酶之生物活性為其於其中使某多肽被水解 的催化活性。 如用於本文，同等物（當關於兩核酸序列時）意指所 討論之兩序列編碼相同胺基酸序列或相等之蛋白質。當同 等物用於關於兩蛋白質或肽類時，其意指該二蛋白質或狀 類具有實質上相同的胺基酸序列，而僅具有不實質上改變 / 该蛋白質或肽類之活性或功能的胺基酸取代。當同等物係 關於某性質時，該性質不必須呈現相同程度（例如，二肽 類~Τ此呈現同類型酵素活性之不同速率），但該等活性通 常實質上是相同的。互補（當關於兩核苷酸序列時）意指， 该二核苷酸兩序列能夠雜交，代表性地於相對核苷酸之間 具有少於25%、15%或5%錯配。若需要，會特別限定互補 百分比。代表性地係選擇使彼等可於高嚴苛度條件下進行 雜交之兩分子。 59 200817517 如用於本文，調制蛋白質活性或基因或核酸表現之藥 劑’會減低或增加或不然改變該蛋白質之活性，或（以某 種方式）向上-或向下調節或不然改變該核酸於 夕、 表現。 < 士用於本文’醫藥功效或治療功效意指，於投藥欲用 以治療疾病或病症錢解其徵狀之㈣後㈣到的功效。 如用於本文，“調制，，與“調節，，或“改變”意指分 子（例如蛋白貝）之活性的改變。例舉之活性包括（但不 定於）生物活J± ’例如訊號傳遞。調節可包括增加活性 (亦即向上’節或促動劑活性）、減低活性（亦即向下_ 調節或抑制）㈣於活性之任何其他改變（例如週期性、 頻數、持續時間、動力學哎i 予4头他翏數之改變）。調制作用 可為背景相關性，且調制作用 J利tF用代表性地可比擬所指定之狀 態，例如野生型蛋白皙、σ &丄、， I贪白貝、王組成型狀態之蛋白質或被表現 於所指定細胞類型或條件中之蛋白質。 用於本文扣ρ制及抑制作用意指相對於未受抑制活 性活性之減低。 如用於本文，組成铷咅 μ才日任思混合物。其可為溶液、 懸浮液、液體、粉末、膏為|、 水性、非水性或其任意組合。 如用於本文，組合咅扣一 口 ％、耘一或多項目間之任意締合。組 合可為一或多種分開的項曰广点丨丄 ^ ^ , 項目（例如二種組成物或二集合 物），可為其混合物（例如-々夕= 、例如一或多項目之單一混合物）， 或其任何變異形式。組合 ^ 口之70件通常在功能上關連或相 關。套組為其視需要地包 匕枯4、、且合或其兀件之使用說明的 60 200817517 包裝組合。 如用於本文’治療意指任何其中使病況、病症或疾病 之徵狀緩解，或不然有益地改變的方法。 如用於本文，治療功效意指因改變（代表性地改善或 緩解疾病或病況之徵狀）或治癒疾病或病況之個體的治療 而產生的功效。治療上有效量意指在投藥予個體後，可導 致治療功效之組成物、分子或化合物的量。 ( 如用於本文，術語“個體，，意指動物，包括哺乳動物， 例如人類。 如用於本文，患者意指人類個體。 如用於本文’有效量意指治療劑用於預防、治癒、緩 解、遏止或部分遏止某疾病或病症況之徵狀所需要的量。 一如用於本文，單位劑量形式意指適用於人類與動物個 體，且如該項技藝已知經個別包裝之物理上分開的單位。 如用於本文，單一劑量調配物意指一種用於直接投藥 之調配物。
X 、如用於本文，“製品，，為所製得並供販售之產品。如 於本申請案全文，該術語欲包含於包裝物品中所含有之 經修飾蛋白酶多肽及核酸。 _用於本文，液體意指任何可流動之組成物。因此， 夜體包含壬半-固體、膏劑、溶液、水性混合物、凝膠、洗 液、乳霜形式之組成物及其他此類組成物。 今夕用於本文，套組意指本發明所提供之經修飾蛋 白_多肽或核酸分子、與其他供包括（但不限定於）投藥、 61 200817517 診斷與評估生物活性或特性之目的之另 組視需要地包括使用說明書。 一項目的組合 套 ^用於本文，細料取物或料產物意指從已溶解或 被破壞之細胞所製得的製備物或流份。 如用於本文’動物包括任何動物，例如（但不限定於） 靈長類’包括人類、猿與猴子；屬齒類，例如小鼠盥大鼠； 禽類，例如雞；反㈣例如山羊、牛、鹿、料；似羊的， 例如豬與其他動物。非-人類動物將人類自為所預期之動物 排除。本發明所提供之蛋白酶係源自任何來源、動物、植 物、原核生物及真菌。a多數蛋白酶係動物來源，包括哺 乳動物來源。 如用於本文，對照組意指實質上與測試樣本相同之樣 本，惟其不以測試參數進行測試，或者若其為一種樣本血 漿樣本，則其可來自未罹患所興趣病況之正常自願者。對 照組亦可為内部對照組。 如用於本文，單數形式“一，，與“該，，包括複數之指 不對象，除非内文另行清楚地指示。因此，例如，關於化 合物，包含“ 一胞外功能域，，係包括具有一或多個胞外功 能域之化合物。 如用於本文，範圍與量可表示呈“約，，某一特定值或 範圍。約亦包括正確量值。因此“約5驗基”意為“約5 鹼基”及“ 5鹼基”。 如用於本文，“視需要的”或“視需要地，，意指之後 所描述之事件或狀況確實或並未發生，且該敘述包括其中 62 200817517 該事件或狀況發生之實例，以及其並未發生之實例。例如， 視品要經取代之基團意指該基團為未經取代或經取代。 如用於本文，對於任意保護基、胺基酸及其他化合物 之縮語係（除非另行指示）根據彼等之一般用法、所認知 之縮語或生物化學命名IUPAC-IUB委員會（參見，（1972)
Biochem. 11 〇 Β·篩選蛋白酶之方法 本發明提供用於篩選具有經改變性質（尤其是受質專 一性與選擇性）之蛋白酶的方法。該方法亦提供此類經修 改蛋白gf，其呈現貫質上未改變或具有足夠活性以用於治 療性用途。本發明所提供之方法可使用任何用於蛋白酶修 飾及設計經修飾蛋白酶之方法。此類方法包括用於製造文 庫之隨機方法、使用現存之文庫、以及定向演化方法。 已使用各種用於鑑定具有經改變受質專一性/選擇性之 蛋白酶的挑選流程，但各具有其限制。本發明所提供之方 法可克服此等限制。一般，篩選流程包括該等其丨）針對蛋 白酶結合挑選或2)針對蛋白酶催化挑選者。採用蛋白酶結 合之策略的實例包括（例如）使用過渡態類似物（transiti⑽ state analogue，TSA)及該等利用小分子自滅受質者。TSA 為杈擬蛋白酶：受質反應之過渡態之電子與結構性質的穩 疋化合物。蛋白酶與受質間之最強作用代表性地發生於反 應之過渡態。TSA係用作為挑選具有高結合親合性之蛋白 酶的模式受質。TSA並非真正過渡態之完全模擬物，且其 合成非常困難（柏新格等人（2〇〇5)於以山·〜 63 200817517 价〇化c/z·㈣d D — (Sidhu S，ed)，ρρ· 461-491 )。 此類策略具有含經改變受質專一性之所鑑定蛋白酶變體， 但是因為對於蛋白酶催化之需要並非該挑選流程的一部 分’故此等蛋白酶一般呈現減低的活性。 於一項另供挑選之策略，已經使用小分子自滅受質（亦
稱作基於機制之抑制子）以基於結合挑選蛋白酶。此類自 滅受質代表性地為與酵素之活性部位共價結合的小分子抑 制子。此類自滅受質含有可與酵素親核劑反應而形成共價 鍵的具反應性親電子基。對於此反應並不需要天然肽鍵被 蛋白酶裂解。代表性地，此類抑制子僅在與正確酵素結合 並進订正常催化步驟時產生具反應性親核劑（參見，例如 柏新格等人（2005)於心印/町k⑽j仏叹 (Sidhu S，ed)，沖 461_491)。於許多個案受 貝抑制子模擬涉及催化之第一過渡態的構型，但不允許完 成催化週期。結果，此類抑制子之使用有效地挑選出強結 口而非催化，並導致具有受減弱之受質分離之不活性酵素 之挑選（得洛吉等人（2006) ChemBi〇Chem，7:149_157)。 又，由於其大小及缺乏對於受質裂解之需要，彼等並不再 現蛋白酶與天然蛋白受質之相互作用。 亦已曰"式種針對催化而非結合挑選之蛋白酶挑選策 ( >見例如海尼斯等人（2001)，/Voiez.n心gZ·⑽erhg，14: 1〇43]〇52)。針對催化分析之—項主要限制為反應產物在 反應完成後便很快擴散開，使其難以分離出具催化活性之 ，、、、、cr果針對催化挑選之策略仰賴將受質與酵素錯定 64 200817517 至噬菌體，以使彼等能相當靠近。例如，蛋白質鈣調蛋白 (calmodulin )已被用作為一種固定化劑（迪馬提斯（丨999);
Mol· Bi〇1.，286:617_633 )。反應受質係使用鈣調蛋白-結 a肽衍生物，非-共彳貝地錯定於加約調蛋白標籤之嗟菌體酵 素上。於催化後，使用抗-產物親合性試劑，將展示反應產 物之噬菌體從非-催化活性噬菌體分離出。然而，因為受質 被接附至噬菌體粒子上，故可能妨礙催化反應。因此，此
等與其他用於蛋白酶挑選之方法受到限制且無法鑑定出具 有經改變受質專-性與實質上未改變其供治療應用之足夠 活性的蛋白酶。本發明所提供之方法可免於此等限制。 本發明所提供係用於鑑認具有經改變、最適化或增進 之叉貝專一性的蛋白酶與/或蛋白酶變體之蛋白酶挑選方 法。此類蛋白酶係被鐘認出以最適化，及使用作為能裂解 與去活化（或活化）所希望蛋白質標靶物（例如涉及疾病 或病症之病原學的蛋白質標乾物）之治療性蛋白酶。於本 發明所提供篩選蛋白酶之方法中’係將候選蛋白酶捕捉而 ^蛋白酶酵素反應的安定中間複合體，然後再鑑認之。安 疋中間複合體代表性地為允許其自與未經複合之分子分離 的共W合體或其他複合體。此類中間物包括（例如）允 許進行捕捉及最終鐘認出具有所挑選或預定受質專一性之 ::酶的醯基酵素中間物。“酶之捕捉（誘陷）係藉由 人二白酶集合與被該蛋白酶裂解並於裂解後形成穩定的複 ^之蛋白酶誘陷多肽接觸而實現。此類蛋白酶誘陷多肽 只例為絲胺酸蛋白酶抑制物、阿伐2巨球蛋白及其他此 65 200817517 天然產生且/或可經修飾用 類分子。蛋白酶誘陷多馱b 、 於挑選特定標靶受質。可為 於實施該等方法時， 或突變型蛋白酶）集八 \于资白酶（代表性地為經修飾 酶反應之蛋白酶誘陷多 或正吊，蛋白酶集合，與和該蛋白 誘陷中間物的複合體。★=觸，於受質裂解後形成含有受 質專一性/選擇性之蛋白t等方法可用於鑑認具有所希望受 /選擇性之蛋白酶，可=為達成具有所希望受質專-性 /或位於反應性部位周圍 序歹J及 之序列，於& & ^ β 列，例如反應性環序列或類似 <斤歹i於蛋白駟誘陷多肽ψ攸从 欣中修飾以模擬所希望標靶受皙 之受質裂解序列。 冲主知粑又貝 筛&反應係藉由將蛋白酶集合與蛋白酶誘陷多肽於藉 八可形成穩定複合體（代表性地為共價複合體）之條件^ 接觸而完成。複合體具有足夠穩定性，以允許彼等可與其 他車乂不安疋之複合物及未反應之蛋白酶誘陷多肽分開。 可將蛋白酶誘陷多肽加以可鑑認之標記或附加親和性 標籤以助於複合體之鑑定。例如，蛋白酶誘陷多肽之標定 (例如藉由螢光部分、親和性標籤或其他此類標定/加標 籤試劑）有助於蛋白酶-抑制子複合體之分離，及所挑選蛋 白酶之鑑認。可分析所挑選蛋白酶之活性，以評估蛋白分 解效率及受質專一性。亦可例如藉由定序或其他鑑定程序 (包括質譜分析方法）’鑑定所鐘認或挑選出之蛋白酶， 或藉由其他標定方法鑑定存在複合體中之所挑選得蛋白 酶。 66 200817517 本發明所提供之方法亦包括視需要之反覆篩選少驊， 以使該方法可一次完成，或可針對具有所希望或所預定之 專一性/選擇性及/或裂解活性的蛋白酶進行多次回合。例 如，蛋白酶挑選可包括隨機或實驗性或系統性地（於粑定 區域及/或沿著全長）修飾所篩選得之蛋白酶，並重複將蛋 白酶集合與一或多種蛋白酶誘陷多肽接觸之方法（一、二、 三、四或多次回合）。 本發明所提供之方法可例如藉由，包括二或多種 同標定或不同可鑑認之蛋白酶誘陷多肽而為多路的 於本發明所提供之方法，蛋白酶誘陷多肽於複合反應 中’不需要呈€ 100%或甚至非常高的效率，只要具有至 少可请測百分比（代表性地至少' i %、2 %、5 %】㈣、2 〇 %、 3㈣、娜、观、60%、鳩、8〇%、9q%或更高）可㈣ 不安定之複合物及未反應之蛋白酶誘陷多肽分離或 1 4::出的知、疋稷合體。因此，蛋白酶可於其中分配係於 %被蛋白酶誘陷多肽抑制（例如蛋白酶所催化 之反應受1%、5%、聰、鳩、鳩、4〇%、5()%、60%、 :二_ 9。％、95%、99%或更高抑制）的反應中發生者 挑k出。於本發明所提供之方法， 間、、、w声 R ,.她i j如糟由控制反應時 間/皿度、pH值、離子強度及/或 整挑選之嚴苛度及其他參數。亦可於拙心又貝/辰度’而調 爭者（例如含有不希望受質裂解；^間藉由包括競 π主又貝#解序列之特異經 類競爭者（例如人類血漿））而調節專一性限制。”廣 本發明所提供之方法亦可藉由將蛋白酶集合與—種蛋 67 200817517 白酶誘陷多肽或不同蛋白酶誘陷多肽之混合物接觸（例如 藉由多路）而完成。若使用多數不同蛋白酶誘陷多狀，則 可將各蛋白酶誘陷多肽個別且不同地加以標定，使彼等能 可鑑認地被债測到。此類方法使於單-反應中從蛋白酶集 合分離及鑑認出多數蛋白酶成為可能。 本發明所提供之方法♦ % u — 允4 一次師選蛋白酶集合，以鑑認 出該等具有所希望或所預定之受質專―性者。蛋白酶集合包 括任何蛋白酶集合，包括各種野生型蛋白酶、經修飾蛋白酶、 ί混t物及其具蛋白分解活性之部分的集合。可使用任意集 &且集合亦可由被作成-組突變型蛋白酶，或其含有該突變 =蛋白分解活性部分。此類集合包括其中該集合成員含有 化革w !术〇犬變可沿著蛋白酶（或其具催 化活性之部分）全長隨機發生， 、惟 例如^ 次了靶疋於特別部分或區域， 例如蛋白_之專一性結合口袋。 並發現先前未被認為係專—性仏供之方法可鐘認 ::㈣。因此，本發明所提供之蛋白酶挑選技術方法， σ於產生具有完全新穎專一性與活性之蛋 適化現存蛋白酶先導之專一性或活性。 · ， /或最 c·蛋白蘇诱陷多肽 本發明所提供方法中所使用之 種含有反應性部位之多肽（或多肽部分)=夕肽，為- 之受質，於裂解後導致穩定的蛋白酶_ /、作為蛋白酶 成。-般，此類蛋白酶誘陷多肽為需要：二合體形 斷鍵結㈣η以產生受誘陷受質=解易切 双口體者。穩定 68 200817517 的稷合體代表性地為透過蛋白酶與蛋白酶誘陷多肽間之緊 密作用（例如由於共價、離子性、厭水性或其他緊密連接） 所=成的不可逆複合體。由於此類複合體一般可穩定達數 小時、數天、數週或以上，故藉此允許分離出該複合體。 於項焉例，穩定的中間複合體可為於絲胺酸或半胱胺酸 蛋白酶與蛋白酶誘陷多肽反應後形成之醯基酵素中間體。 取通常地，於蛋白酶誘陷多肽裂解後，在複合體中之快速 構型改變會破壞蛋白酶，而防止該醯基酵素複合體進行去 醯基化。目此，淘選具有蛋白酶誘陷多肽之蛋白酶允許對 催化之速率限制步驟（亦即，ρι_ρι，鍵結之裂解及酵素醯 化作=)$行挑選，同時形成可容易從集合混合物分離出 之非常緊密（亦即共價性）複合體。 ^代表性地，此類蛋白酶誘陷多肽係大型（多於100個 月女基馱），含有由蛋白酶辨識之反應性部位序列的單一功 此域蛋白f。_般’反應性部位裂解序列為柔性、暴露出 且長度足以使纟為標㈣質之較大反應性環的冑分（歐特 流斯基等人（2005) 77^五細〇丄24: 13〇3131〇)，然而， 只要蛋白酶誘陷物含有能夠被蛋白酶裂解’藉此模擬'受質 裂解之反應性部位序列，即可用於本發明所提供方法。因 此，任一含有被蛋白酶裂解之易切斷鍵結， 陷：長期、穩定之複合體中的大型多狀或經合成方式；： 之夕肽，可用於本發明所接供太 — 知5所杈仏方法。此類蛋白酶誘陷多肽 之貫例為絲胺酸蛋白酶抑制物，如本文所述。其他蛋白 誘陷多肽亦可用於本發明所提供方法，例如任何其作用機 69 200817517 制類似於絲胺酸蛋白酶抑制物分子者。此等包括（例如） 合成型或經重組方式產生之類_絲胺酸蛋白酶抑制物分子， 或含有絲胺酸蛋白酶抑制物分子之鄰連片段或序列的多 肽，其包括絲胺酸蛋白酶抑制物分子反應性部位環的足夠 部分。此外，可使用其抑制機制類似於絲胺酸蛋白酶抑制 物之其他蛋白酶抑，例如抑制天冬㈣特異性半耽胺 酸蛋白酶之桿狀病毒ph蛋白（許等人（2〇〇1) f 410:494-497 ;歐特流斯基等人（2 0 0 5 ) 77^五細0义24: ί 1303_1310)。其他蛋白酶誘陷多肽包括任何蛋白酶誘陷於 能夠被容易分離出之穩定複合體中者，包括（但不限定於） 阿伐2巨球蛋白。 1·絲胺酸蛋白酶抑制物：構造、功艇及表現 絲胺酸蛋白酶抑制物（Serpin)為（相較於其他正常約少 於60個胺基酸之絲胺酸蛋白酶抑制子）大型蛋白分子（約 330-500個胺基酸）之蛋白酶抑制劑。絲胺酸蛋白酶抑制 物超家族為最大且分布最廣之蛋白酶抑制劑。目前已於各 -種不同動物、牛痘病毒、植物、細菌及古菌中鑑定得超過 ι，5〇〇種絲胺酸蛋白酶抑制物家族成員（羅等人（2卯6) ^卿細/咖7:216)，其中有超過三十種不同人類絲 胺奴蛋白酶抑制物已被研究。大多數人類絲胺酸蛋白酶抑 制物經發現存在血液，而於其中彼等作用於廣範圍調節性 角色’包括（例如）發炎、補體、凝血及血纖維蛋白溶解 級聯。絲胺酸蛋白酶抑制物亦於細胞内作用於執行細胞保 k角色例如_節細胞毒性蛋白酶之不當釋出。雖然大多 70 200817517 =酸蛋白酶抑制物對於蛋白酶活性具有抑制作用， tr蛋白酶抑制物卻執行其他非抑制性作用，例如一 :!了=於）激素傳送、皮質類固醇結合球蛋白及血壓 :即（席弗曼等人⑽υ观，276:33293_33296卜於非 抑制性絲胺酸蛋白酶抑制物中包括類固醇結合球蛋白與印 白蛋白。代表性地’絲胺酸蛋白酶抑制物會抑制絲胺酸蛋
C
㈣鑑定出數種其為類_木瓜酵素半耽胺酸 蛋白酶或天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋自酶之抑制子的絲胺 酸蛋白酶抑制物（惠斯托克等人(2005) febs 】。_】，272: 4868_4873)。 絲胺酸蛋白酶抑制物家族成員間之序列同一性很薄 弱：然而，彼等之結構具有高度保守#。例如，絲胺酸蛋 白酶抑制物家族成員與絲胺酸蛋白酶抑制物阿伐卜抗胰蛋 白酶共有約30%胺基酸序列同源性，且具有保守的三級結 構。在構造上，絲胺酸蛋白酶抑制物係由三個p折疊（A、 B與C)及8-9個α_螺旋（A_n組成，其構成在上方之β_ 圓筒功能域及在下方之螺旋功能域。該二功能域藉由五股 B-折璺A橋連，其為絲胺酸蛋白酶抑制物之主要結構特徵 (胡、;丁 頓等人（2003)，J· 77^〇以如b ㈣1: 1 53 5-1 5 49 )。絲胺酸蛋白酶抑制物為亞穩定態蛋白質，使 其荨在呈彼等之活性形式時僅部分安定；彼等需要蛋白酶 來採取完全安定的構型。環（稱作反應性部位環（RSL)) 負責絲胺酸蛋白酶抑制物分子之經改變構型。RSL為一段 具有約17胺基酸殘基，於該分子頂端位於a與C β_折疊 71 200817517 間之區域突出之暴露伸展。RSL作為蛋白酶辨識部位，且 -般含有蛋白酶專_性之獨特決定元。絲胺酸蛋白酶抑制 物結構之最安定形式為RSL_經裂解形式。隨著蛋白酶裂解 後，之胺基末端部分插入卜折疊A中央，而變成六股 β-折疊之第四股。此構型改變稱作“廢迫，，至“鬆弛”（或 S至R)轉換。此轉變特徵在於由於五股Μ斤疊a重新組 、我成/、月又反平行形式，而增加該分子之熱穩定性（羅偷斯 等人（2000)，/5/〇/· c/2 ㈣，275: 5839_5844 )。換言之，絲 胺酸蛋白酶抑制物之天然結構等於潛伏性中間體，其僅在 蛋白酶裂解後被轉變成更穩定的結構（勞等人（2006) Genome Biology9 7：216) 〇 代表性地，絲胺酸蛋白酶抑制物靶定絲胺酸蛋白酶， 雖然有些絲胺酸蛋白酶抑制物使用類似機制抑制半胱胺酸 蛋白酶。RSL環因其可提供對於標靶蛋白酶之偽_受質，故 決定何種蛋白酶被靶定用於抑制作用。事實上，特定絲胺 酸蛋白酶抑制物之抑制專一性係由RSL序列（為各絲胺酸 J 蛋白酶抑制物間最可變之區域）所介導（特拉維斯等人（1990) 仏〇/· C/zem.丑&371: 3-11 )。RSL 模擬蛋白酶之 叉質辨識序列，而藉此含有經編號為…Ρη·Ρ3_Ρ2_ρ^Ρι，_ρ2,_ Ρ3 Ρ η…之反應性部位，其中反應性部位係介於Ρ 1與ρ 1， 間之易切斷鍵結。對於成熟型（XI-抗胰蛋白酶，位於Ρι_Ρι， 鐽結之裂解發生於Met358 -Ser359鍵結（相當於SEQ ID ΝΟ:1 中所列示胺基酸序列之胺基酸Met·與Ser3 89 )。對位於 蛋白酶上之殘基的相對應結合部位為〜811-83-82-81_81，，82，， 72 200817517
Sn’、_··.。於本發明所提供之方法，係進行RSL序列之 修飾，以從展示文庫挑選出展現經改變受質專一性之 酶’其詳細論述如下文。 2·蛋白酶催化，絲胺酸蛋白酶抑制物之抑制钱制，及 醢基-酵素中間物之形成 心本發明所提供之蛋白酶挑選方法利用多肽誘陷蛋白酶 之此力（例如以絲胺酸蛋白酶抑制物為 ^機變受質專-性之蛋白酶。蛋白酶催化之機；= ‘蛋白分解酵素：絲胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸或 至屬-蛋白酶間稍有差異。例如，絲胺酸肽酶具有包含於活 f生中〜内之絲胺酸殘基，天冬胺酸類具有兩個位於催化中 心之天冬胺酸，半胱胺酸_類型肽酶具有一個半胱胺酸殘 基蘇胺酸-類型肽酶具有一個蘇胺酸殘基，而金屬_肽酶 於催化機制中使用一個金屬離子。一般，該等形成共價中 間體之蛋白酶家族，為本發明所提供蛋白酶挑選方法之標 靶物。此等包括（例如）絲胺酸與半胱胺酸蛋白酶家族之 成員。舉例而言，對於絲胺酸蛋白酶，催化作用之第一步 驟係於叉質與存在蛋白酶催化中心之絲胺酸之間形成醯基_ 酵素中間物。此共價中間物之形成係透過帶負電荷四面體 過渡您中間物進行，然後將受質之p i _p丨，肽鍵裂解。於第 二步驟或去醯基期間，醯基-酵素中間物被水分子水解，而 釋出該肽並使酵素之Ser-羥基復原。去醯基（其亦涉及四 面體過渡態中間物之形成）係透過醯化之逆反應途徑進 行。對於去醯基，水分子為取代Ser殘基之攻擊性親核劑。 73 200817517 位於絲胺酸蛋白酶催化中心< His殘基提供一般驗基並接 叉反應性Ser之〇H基。 絲胺酸蛋白酶抑制物使用如前所述之S至R轉換，抑 制絲胺酸及半胱胺酸標靶蛋白酶兩者。彼等之作用機制在 蛋白酶抑制劑中為獨特，因為其於去醯基化前先破壞蛋白 酶之活性部位，藉此於醯基_酵素中間物形成後不可逆地阻 礙蛋白分解（歐特流斯基等人（2005) 2七 1 303 )。絲胺酸蛋白酶抑制物與蛋白酶之反應的動力學模 式，與受質之蛋白分解的模式相同（參見，例如圖1 ;周 等人（2001) /· 5沁/· CTzem·，276: 27541-27547)。待與標乾 蛋白S#作用後，絲胺酸蛋白酶抑制物首先透過位於p 1 _p ^， 易切斷鍵結兩侧翼之RSL中的殘基之相互作用，形成非共 價性類·米氏（Michaelis-like)複合體（席弗曼等人（2〇〇1)，乂 厶zo/· 276: 3 3293-33296 )。位於蛋白酶活性部位中 之絲胺酸殘基（對絲胺酸蛋白酶而言）攻擊p 1-P1，鍵結， 其有助於肽鍵裂解及在絲胺酸殘基與P1殘基之骨架羰基 間形成共價酯鍵聯。待RSL被裂解後，RSL便插入絲胺酸 蛋白酶抑制物分子之β-折疊A中。所插入之第一個殘基為 P14 (亦即成熟型α1·抗胰蛋白酶中之胺基酸345，相當於 SEQ ID Ν0:1所列示胺基酸序列中之胺基酸位置Τ369 )， 且其後為1^1^之柔性鉸鏈區（？15彳9)(布克等人（2005)从〇/. 如〇/·五ν〇/·，22: 1627-1634 ) 。RSL之插入使與其共價鍵結 之蛋白酶移位，造成該蛋白酶以其活性部位被破壞為特徵 之構型變化（參見圖1 )，以及絲胺酸蛋白酶抑制物轉變 74 200817517 成“鬆弛”態。蛋白酶之該構型變化改變活性部位之催化 性三聯體’致使pi側鏈能從S1 口袋移出。構型重新排列 之淨結果為陷住醯基酵素中間物（席弗曼等人（2〇〇ι), 乂 厶Z.o/· 276: 33293-33296 )。 醯基酵素之形成對於絲胺酸蛋白酶抑制物相互作用很 重要，而因此絲胺酸蛋白酶抑制物代表性地對某些類於催 化作用中具有醯基酵素中間物之蛋白酶具專一性y於此等 類型蛋白酶中，佔多數者為絲胺酸蛋白酶家族之成員，包 括該等存在胰凝乳蛋白酶超家族，及該等存在蛋白酶之枯 草桿菌蛋白酶家族的成員，其更詳細描述於下文。此外， 絲胺酸蛋白酶抑制物亦對半胱胺酸蛋白酶，包括（例如） 該等屬絲胺酸蛋白酶之木瓜蛋白酶家族及天冬胺酸特異性 半胱胺酸蛋白酶家族者具有反應性。代表性地，絲胺酸蛋 白酶抑制物不會抑制金屬_、蘇胺酸或天冬胺酸性家族之蛋 白酶。例如，絲胺酸蛋白酶抑制物與金屬蛋白酶之相互作 用不產生共價性受誘陷之中間物，而是金屬蛋白酶會裂解 該抑制子而不形成任何複合體（李等人（2004) Cwar hr 64: 8657-8665)。 因此，雖然大部分絲胺酸蛋白酶抑制物會抑制胰凝乳 蛋白酶家族之絲胺酸蛋白酶，但的確存在可抑制半胱胺酸 蛋白酶之交叉-類抑制子。在交又-類抑制子中包括皆抑制 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶丨之病毒絲胺酸蛋白酶抑 制物CrmA與P19 (SEPRINB9)，及抑制類_木瓜蛋白酶半 胱胺酸蛋白酶，包括組織蛋白酶L、K與s之SCCA1 75 200817517 絲胺酸蛋白酶之絲胺酸蛋白酶抑制物-所介 ’似乎對於半胱胺酸蛋白酶亦可行。然而， 其差異在於經動恶誘陷之中間物為硫醇酯，而非如絲胺酸 蛋白酶個案中之氧基g旨（席弗曼等人（2〇〇1)，j ^所·， 276· 33293-33296)。穩、定、共價性硫醇0旨類型連接之存 在係由偵測到於SCCA1與組織蛋白酶s間存在著SDS_安 定性複合體而獲得支持（席弗曼等人（200 i )，/·射以亂，
276: 33293-33296 ； ^^#A(1998) Biochemistry^ 37:5258-5266 ) 〇 絲胺酸蛋白酶抑制物·蛋白酶配對可高度穩定存在達數 週至數年，視該絲胺酸蛋白酶抑制物_蛋白酶配對而定，缺 而，最終會發生分解而產生正常蛋白分解之產物（亦即， 、嶋之絲胺酸蛋白酶抑制物與具活性之蛋白酶；參見例 wi^(2001yKCW，276:2754i_27547)q 者，若RSL環無法夠快速插入蛋白酶中，反應直接進行至
(SERPINB3) 〇 導抑制之機制 :裂解產物。此現象稱作分配，且反映出存在著可能發生 i新產生4Ό制複合體或使絲胺酸蛋白酶抑制物轉變成 ::之分歧途徑，如圖1所描述之形成受抑制複合體對非· =㈣徑（羅倫斯等人（2_)，心/cw，275:5839_ 插:）。可猎由改變规環中之殘基（特別是存在引發環 入之RSL鉸鏈时的殘基（亦即pi4))，或藉 絲胺酸蛋白酶抑制物與其最適作 ^ 欠 酸蛋白酶抑制物之分配。例如="，而調節絲胺 維蛋白溶酶原活化子…= )之抑制活性，在蛋白酶 76 200817517 #、tPA與凝血酶之間有所差異，其中對於心愈心 具有所乾定之偏好。再者，RSL環於（例如）鉸鏈/之川 ==異，改變PAI]所輕定之偏好：突變成帶電荷胺 土 即—、_、ASP、Glu )減低 PAi- i 對各別 uPA、 tPA與凝金酶之抑制活性；突變成中性胺基酸（亦即His、 Tyr、Gln、Asn)或成缺乏側鏈之吻，導致Μ」對心 與凝企酶之抑制活性相較於uPA g低1(M⑽倍；而突變 成厭水性胺基酸，相較於野生型PAM並不改變MM之 抑制活性（羅儉斯等人（2〇〇〇w㈣〜讲.，⑺ 5844) 〇 · 於蛋白酶催化之絲胺酸蛋白酶抑制物所介導之抑制的 成功中-項重要因素為RSL環之長度’其必須為確保絲胺 酸蛋白酶抑制物與蛋白酶描 ”、 _ ^知:供在、、、糸胺酸蛋白酶抑制物本 體與蛋白酶間之槓桿之方式相互作用以允許催化性絲胺酸 從活性部位易位並使蛋白酶變形的確切長度（周等人（2001) y/. CW，276: 27541-27547;胡、;了頓等人（2咖）細㈣， 407.923-926 )。事實上，蛋白酶係對絲胺酸蛋白酶抑制物 之本體擠壓。大多數絲胺酸蛋白酶抑制物具有其長度為17 個殘基之RSL，而僅少數經鑑定具有16個殘基二‘(亦 即，α2_抗纖溶酶、Cl_抑制子與CrmA)。亦已從羅患出 血失调症之心者鑑定得具有丨8殘基環之α2_抗纖溶酶變異 型絲胺酸蛋白酶抑制物，雖然此變異型並非具功能性之抑 制性絲胺酸蛋白酶抑制物（料人（20(H) 乂咖· C“.，276: 27541 27547)因此，絲胺酸蛋白酶抑制物抑制機制可容 77 200817517 許RSL之縮短，而非增長（周等人（2〇〇1) ^仏o/ c心所，276: 2 7 541 27547 )。除了於絲胺酸蛋白酶抑制物家族成員間環 長度之保守外，絲胺酸蛋白酶抑制物之RSL 一般亦保有保 守性鉸鏈區（P15-P9)組成，且代表性地不含有帶電荷或巨 大的P殘基。 a·例舉性絲胲酸蛋白酶抑制物 用於本發明所提供方法之絲胺酸蛋白酶抑制物，可為 任何絲胺酸蛋白酶抑制物多肽，包括（但不限定於）以重 組方式製得之多月太，以合成方式製得之多月大，及從細胞、 組織與血液萃取得之絲胺酸蛋白酶抑制物。絲胺酸蛋白酶 抑制物亦包括等位基因變體，及得自不同物種（包括（但 不，定於）人類與非人類來源之動物、牛痘病毒、植物、 =囷及古菌）之多肽。代表性地，絲胺酸蛋白酶抑制物之 等位基因或物種變體與天然或野生型絲胺酸蛋白酶抑制物 差異約或至少 40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、 92/。、93% ' 94%、95%、96%、97%、98%或 99%。人類絲 月女酸蛋白酶抑制物包括任一於本文所提供（例如，列示於 下表2)之絲胺酸蛋白酶抑制物、等位基因變體同工型、 知自核酸之合成型分子、從人類組織、細胞或血液分離得 之蛋白質、及任何人類絲胺酸蛋白酶抑制物多肽之經修飾 $式。絲胺酸蛋白酶抑制物亦包括經截短之多肽片段，只 要所存在足夠之RSL環部分以介導與蛋白酶之作用與共價 驢基酵素中間物之形成。 78 200817517 表2:例舉性絲胺酸蚤白醃抑制物 錄胺酸蛋白 酶抑制物 蛋白質名稱 暱稱 功嫵 Acc. # 成熟型 多肽 (aa) SEQ ID NO 胞外抑制 性絲胺酸 蛋白酶抑 制物 SERPINA1 阿伐-1· 抗胰蛋白酶 AIAT 抑制彈性蛋白 酶 P01009 25-418 1 SERPINA2 阿伐-1- 抗胰蛋白酶·相 關蛋白質 A1AU 可能是偽基因 P20848 22-420 2 SERPINF2 阿伐-2-抗血纖 維蛋白溶酶 A2AP 抑制血纖維蛋 白溶酶與胰蛋 白酶 P08697 40-491 3 SERPINA3 阿伐-1-抗胰凝 乳蛋白酶 AACT 抑制嗜中性組 織蛋白酶G 與肥大細胞凝 乳蛋白酶 P01011 24-423 4 SERPINC1 抗凝血酶-III ANT3 調節凝血級 聯；凝血酶與 因子Xa抑制 子 P01008 33-464 5 SERPIND1 肝素輔因子II HEP2 調節凝血級 聯；凝血酶抑 制子 P05546 20-499 6 SERPING1 血漿蛋白酶C1 抑制子 IC1 調節補體活 化，凝血，血纖 維蛋白溶解與 產生細胞分裂 素;C1酯酶抑 制子 P05155 23-500 7 SERPINA5 血漿絲胺酸蛋白 酶抑制子，蛋白 質C抑制子 IPSP, PAI-3 抑制受活化之 蛋白質C與 血纖維蛋白溶 酶原活化子 P05154 20-406 8 SERPINA4 抑激肽釋放酶 (Kallistatin) ΚΑΙΝ, ΡΙ4 抑制人類組織 激狀釋放酶之 醯胺分解與激 肽原酶活性 P29622 21-427 9 SERPINII 神經絲胺酸蛋白 酶抑制物 (neuroserpin ) NEUS, ΡΙΙ2 形成或重新組 織突觸連結與 突觸可塑性； tPA，uPA 與血 纖維蛋白溶酶 之抑制子 Q99574 17-410 10 SERPINE1 血纖維蛋白溶酶 原活化子抑制子 -1 ΡΑΙ1 調節血纖維蛋 白溶解；抑制 凝血酶，uPA， tPA與血纖維 蛋白溶酶 P05121 '24-402 11 SERPIN12 肌上皮細胞-衍 生之絲胺酸蛋白 酶抑制子 ΡΙΙ4 抑制癌症轉移 075830 19-405 12 SERPINA10 蛋白質Z-依賴 ΖΡ1 抑制因子Z與 Q9UK55 22-444 13 79 200817517 性蛋白酶抑制早 Ια ' SERPINE2 蛋白酶nexin I， 神經膠質-衍生’ 之nexin前驅物 PI7, GDN, PN-1 抑制uPA與 tPA P07093 20-398 14 胞内抑制 性絲坡酸 蛋白酶抑 制物 SERPINB1 白血球兔性蛋白 酶抑制子，單核 細胞嗜中性彈性 蛋白酶抑制子 ILEU 抑制嗜中性蛋 白酶 P30740 1-379 15 SERPINB2 血纖維蛋白溶酶 原活化子抑制子 -2 PAI2 組織型血纖維 蛋白溶酶原活 化子抑制子， 胞内傳訊；抑 制uPA P05120 1-415 16 SERPINB6 月α盤/旋血酶抑制 子 PTI6 抑制凝血酶 P35237 1:376 17 SERPINB10 蟾蜍蛋白酶抑制 子(Bomapin) SB 10， P110 造血作用，抑 制凝血酶與胰 蛋白酶 P48595 1-397 18 SERPINB11 epipin SB11 Q96P15 1-392 19 SERPINB12 Yukopin SB 12 抑制胰蛋白酶 與血纖維蛋白 溶酶 Q96P63 1-405 20 SERPINB13 Headpin SB13， P113 角質形成細胞 之增殖或分 化，抑制組織 蛋白酶L與K Q9UIV8 1-391 21 SERPINB3 鱗狀細胞癌抗原 1 SCC1 調制對腫瘤之 免疫反應，抑 制組織蛋白酶 L，K，S 與 V 及木瓜蛋白酶 P29508 1-390 22 SERPINB4 鱗狀細胞癌抗原 2 SCC2 調制對腫瘤之 免疫反應，抑 制組織蛋白酶 G與凝乳蛋白 酶 P48594 1-390 23 SERPINB7 Megsin SPB7 巨核細胞之成 熟 075635 1-390 24 SERPINB8 細胞質抗蛋白酶 8 SPB8， PI8 抑制成對鹼性 胺基酸蛋白酶 (Furin) P50452 1-374 25 ---------- SERPINB9 胞質抗蛋白酶9 SPB9, PI9 粒酶B抑制 子 P50453 1-376 26 SERPINB6 蛋白酶抑制子-6,胎盤凝血酶 抑制子 PI6, PTI 抑制組織蛋白 酶Q抑制凝 j6l酶 P35237 1-376 27 非抑制性 絲《酸蛋 白酶抑制 SERPINA8 血管收縮素原 ANGT 血壓調節，激 素前驅物 P01019 34-485 28 SERPINA6 皮質類固醇-結 合性球蛋白 CBG 激素載體(糖 皮質類固醇與 孕酮)，皮質醇 結合 P08185 23-405 29 80 200817517 SERPINH1 47kDa熱休克 蛋白 HS47 膠原蛋白之分 子侣伴蛋白 P29043 18-417 30 SERPINF1 色素上皮細胞-衍生之因子 PEDF 誘導成視網膜 細胞瘤細胞之 神經細胞分 化；血管生成 之抑制子 P36955 20-418 31 SERPINB5 Maspin MASP 腫瘤阻抑劑， 防止轉移 P36952 1-375 32 SERPINH2 膠原蛋白·結合 性蛋白質2 SIH2 膠原蛋白之分 子侣伴蛋白 P50454 19-418 33 SERPINA7 甲狀腺素·結合 性蛋白 THBG 甲狀腺激素運 送，甲狀腺素 結合 P05543 21-415 34 SERPINA9 生發中心B-細 胞表現之轉錄產 物1蛋白質 GCET1 原初B細胞 之維持 Q86WD7 24-417 35 SERPINA12 SERPINA11 Vaspin 匕 脂肪細胎.闵子 Q8IW75 21-414 36 SERPINA13 Q86U17 Q6UXR4 20-422 22-307 37 38 代表性地，用於本發明所提供方法之絲胺酸蛋白酶抑 制物為一種抑制性絲胺酸蛋白酶抑制物（或其片段），其 能夠於絲胺酸蛋白酶抑制物與蛋白酶間形成共價醯基_酵素 中間物。一般，此類絲胺酸蛋白酶抑制物係用於挑選正常 由絲胺酸蛋白6#抑制物輕定之蛋白酶，其中幾乎發生蛋白 c酶的完 全抑制且抑制性複合體與經裂解絲胺酸蛋白酶抑制 物受質間之分配被減至最小。表3描述絲胺酸蛋白酶及其 同源絲胺酸蛋白酶抑制物抑制子之實例。此等絲胺酸蛋白 酶抑制物/蛋白酶配對預期具有高締合常數或二級抑制速率 常數’及低或無分配成為非-抑制性複合體。例如，卜p A 之主要生理學抑制子為絲胺酸蛋白酶抑制物pAI_丨，其為 一種具有大約50kD之糖蛋白（潘尼寇克等人（1986)五_0 丄，5:2539-2544 ;金斯柏格等人（198〇) ^ c/& 78:1673-1680;及卡瑞爾等人於··蛋冷鑌矽鈔齋（尸 81 200817517 ，Ed·巴瑞特，A.J.等人，Elsevier，阿姆斯特丹，第 403-420頁（1986))。然而，其他絲胺酸蛋白酶抑制物/蛋 白酶配對亦可用於本發明所提供之方法，甚在其締合常數 較低且分配較高的情況下。例如，雖然其他絲胺酸蛋白酶 抑制物（例如C 1酯酶抑制子及阿伐-2-抗纖溶酶）與tPA 之締合常數較PAI-1的低數個數量級（藍比等人（1982) Throm. Res ·，2Ί ·Λ7 5-\名3 ·，海先 I 專尺（\9名名）Arch· Biochem. 262:199-210 )，但是此等絲胺酸蛋白酶抑制物仍 f 然會與tPA結合（參見，例如盧柯爾等人（1988) Ckc. 77:660-669 ) ° 表3: 絲胺酸蛋白酶 同源絲胺酸蛋白梅抑制物抑制子 經活化之蛋白質C 蛋白質C抑制子 PAI-1 C1酯酶 C1酯酶抑制子 組織蛋白酶G 阿伐-1-抗胰蛋白酶 阿伐-1-抗胰凝乳蛋白酶 凝乳蛋白酶 阿伐-1-抗胰凝乳蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 阿伐-1-抗胰凝乳蛋白酶 阿伐-2-抗纖溶酶 Contrapsin 凝血因子（Vila，Xa，XIa，Xlla) 抗凝血·酶III Cl酯酶抑制子 彈性蛋白酶 阿伐-1-抗胰蛋白酶 Kallikrein C1 ϊ旨酶抑制子 阿伐-1-抗胰蛋白酶 纖溶酶 阿伐-2-抗纖溶酶 凝血酶 抗凝血酶III 肝素辅因子II tPA PAI-1，PAI-2, PAI-3 胰蛋白酶 阿伐-1-抗胰蛋白酶 受生長激素調節之蛋白 類胰蛋白酶蛋白酶 蛋白酶nexin I u-PA PAI-1，PAI-2, PAI-3 82 200817517 因此，用於在本發明所提供方法中的蛋白酶之挑選之 絲胺酸蛋白酶抑制物，-般產生其中有80%、90%、93%、 Γ:、95:’二、96%、97%、98%、99%或1〇〇%之反應產物係 ㈣性複合體之形成的反應產物。然而，於有些個案，可 此於本發明所提供之方法中發生絲胺酸蛋白酶抑制物盥蛋 白酶間的分配增加’例如若用於本發明所提供方法之絲胺 酸蛋白酶抑制物並未最適地減該蛋白酶。因&，本發明
所提i、之方法提供一種絲胺酸蛋白酶抑制物，其可用於挑 5〇。/。、60%、7G%、75%或以上穩定抑制性複合體，而其餘 產物為經歷裂解之絲胺酸蛋白酶抑制物受f。可能被改變 以最適化用於其中發生分配之蛋白酶挑選的因素包括（例 如）增加絲胺酸蛋白酶抑制物濃度及增長反應時間。於某 些案例’其他非抑制性絲胺酸蛋白酶抑制或其如下所 :述：突變型）可用於本發明所提供之方法，只要用於挑 遥之枯乾蛋白酶月b與g亥絲胺酸蛋白酶抑制物受質相互作 用，而產生可被捕獲之共價抑制性複合體。 1.PAI-1 選蛋白酶，其中所產生之反應導致為或約20%、30%、4〇%、 用於蛋白酶挑選方法之絲胺酸蛋白酶抑制物的實例為 血纖維蛋白溶酶原活化子抑制子-1 (PAI-1)，或其變體#。 PAW為組織血纖維蛋白溶酶原活化子（t_pA)與尿激酶或尿 型血纖維蛋白溶酶原活化子(u_pA)(其等為涉及導因於血 纖維蛋白溶酶原之活化的血纖維蛋白溶解之蛋白酶）之主 要抑制子。PAI]對於t_PA* U.PA具有二級速率常數為 83 200817517 約2Χ 107Μ、-ι。PAM涉及腫瘤侵入、血纖維蛋白溶解、 細胞遷移、組織再塑、組織内捲、排印、發炎、 八 /兹香層侵 入及惡性轉型（沙隆恩等人（1988) j，264. 6339-6343 )。卩八1-1主要由内皮細胞製造，但是亦由其他 類組織，例如脂肪組織分泌。其他相關之血纖維蛋白溶酶 原活化子抑制子包括PAI_2與PAI-3。pAI_2 (例如）亦為 u-PA及t-PA之抑制子，但其係由胎盤分泌且代表性地於 妊娠期間僅以高量存在。 PAI-1為具有列示於SEQ ID ΝΟ:11之前驅物序列（包 括23個胺基酸訊號序列，當其被裂解時產生379個胺基 酸成熟序列）的單鏈糖蛋白。類似於其他絲胺酸蛋白酶抑 制物’ PAI-1在經蛋白酶於其位於Arg346-Met347 (亦即， 相當於列示於SEQIDNO:ll之前驅物序列的胺基酸Arg369
Met )之P1_P1’活性部位裂解後，會從潛在形式過渡 成活性形式，藉此導致穩定共價複合體的形成及所結合之 蛋白酶的不活化。然而，不似其他絲胺酸蛋白酶抑制物， PAI-1採取一種自發地產生不活性、高度穩定但是共價完 正的形式之潛伏轉變，藉此RSL之殘基pi5至P4插入β_ 折® Α形成折疊之第四股（亦即s4A)，而殘基ρ3至ρι〇, $成位於該分子表面之突出環（迪泰耶等人（2003) J 5ζ·ο/·
278: 23899-23905 )。因此，具活性 Pam 於 37°C 下相對上轎不安定，在自發轉變成潛伏構型之前，呈現僅 2 5 士 •小時之半衰期。然而，此潛伏構型可藉由變性再活化， 例如藉由以月桂基硫酸鈉、氣化胍與尿素（迪克雷等人（1992) 84 200817517 j.万沁/.(：心所.，267:1 1693·1 1696)及熱（片桐等人（ι988)Εμ J. Biochem·，176: 81·87)變性。pm之活性形式亦藉由 與玻連蛋白（vitronectin )相互作用而安定化。已鑑定得 無法進行轉變成潛伏構型而因此於升溫及較高邱值下更 穩定達較久時間之突變& PAW (參見，例如柏肯帕斯等 人（1995) 77ze j，14:2969_2977 )。 已對絲胺酸蛋白酶（亦即t_PA & u_PA)及/或抑制性 絲胺酸蛋白酶抑㈣（亦即PM])進行修飾，來調制或 改變抑制作用之二級速率常數’以使蛋白酶對藉由彼等之 同源絲胺酸蛋白酶抑制子（或其變體）之抑制作用具抗性， 例如可用於其中希望野生型蛋白酶活性之治療用途（夫 見’例如美國專利序號冰⑽：⑽…：⑽加； 5,486602 ; 5,304,482 ) 〇 2. 抗凝血酶（AT3) 另種用於本發明方法之例舉性絲胺酸蛋白酶抑制物 (或其變體）為抗凝血酶(AT3)。AT3亦為絲胺酸蛋 抑制物家族之成員，且去活化許多酵素，包括（例如）該 等得自凝血系統者，例如（但不限定於）因子χ、因子以 因子Π(凝血酶）、因子VII、因子幻及因子如。代表 性地，抗凝血酶主要存在血液中，於_(例…由 阻功能而防止或抑制凝血。AT3之活性編 -=種輔因子（代表性地為肝素）之存在而增加 肝素相互作用時，AT3推r ^ ^ 、 仃一種涉及使環從絲胺酸蛋白酶 抑制物結構排出且暴露…構型重排，導致具有暴露 85 200817517 出之蛋白酶-易接近構型的AT3結構。此外，肝素可與蛋 白酶及抑制子兩者結合，藉此加速該抑制機制（勞等人（2〇〇6) Genome Biology, 7(216): 1-11)。
AT3之基因序列編碼一種跨越七外顯子之dna，其編 碼列示於SEQIDNO:5之前驅物蛋白。相當於SEQIDn〇:5 所列示序列之胺基酸1 -32的訊號序列之裂解，產生具有分 子量為約58,000道耳頓之432胺基酸的成熟蛋白質。胺基 酸中有六個為半胱胺酸，其導致三個分子内雙硫鍵之形 成。AT3之RSL中的P4_P2,位置含有胺基酸殘基iagrsl (SEQ ID NO:478)，其相當於SEQ ID Ν〇··5所列示序列中 之胺基酸422-427,其中位於反應性部位ρι_ρι，之裂解發 生於胺基酸Arg425-Ser426之間。 又 3·其他蛋白酶誘陷多肽 方法。此類蛋自_陷多肽之實例為P35。此外，任何直 他被蛋白酶裂解’促使蛋白酶誘陷於長期、穩定之複合體 中的分子，可用於本發明所提供之方法。 a. p35 其他蛋白酶誘陷多肽為該項技藝已知，或可經鑑定呈 現與絲胺酸蛋白酶抑制物類似之抑制機制（例如，藉由產 生穩定中間體及於該蛋白酶之構型變化之蛋白酶裂解標靶 受質）。此類蛋白酶誘陷多肽被預期用於本發明所提供之 例如，桿狀病毒P35蛋白 譜天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋 制天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋 CSEQ ID NO: 473)(其為廣 白酶抑制子）可以此方式抑 白 _ ( έ午專人（2001) 86 200817517 410:494-497，·許等人（2〇〇3) 乂 CTz^.278(7):5455- 5461) 。P35之P1_pr鍵結（位於天冬胺酸特異性半胱胺 酸蛋白酶裂解部位DQMD87)由天冬胺酸特異性半胱胺酸 蛋白酶之裂解，於p35環之胺基節段（Asp87)與天冬胺酸特 異性半胱胺酸蛋白酶催化性三聯體之半胱胺酸殘基（於天 冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶-8為Cys350 )之間，產生共 貝；IL @曰中間體。在形成硫g旨連結後，蛋白酶進行可令經裂 解環之胺基節段埋入天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶之構 型改k，同時於位置2含有Cys殘基之P35的N-末端插入 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶活性部位中，因此阻斷天 冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶_8 +仙317殘基之溶劑可 接近II。水解性水分子之無法接近性於是防止硫醋鍵之後 續水解作用。 除P35外之類似病毒性天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白 酶抑制子包括（但不限定於）p49(seqidn〇:49i)及絲胺 酸蛋白酶抑制物CnnA牛痘基因（Seq m紙492)。州抑 制子呈現肖P35類似之天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶抑 皮機制#中在P49天冬胺酸特異性半脱胺酸蛋白酶辨識 序列TV㈣裂解後，與天冬㈣特異性半胱胺酸蛋白酶 之活性部位形成穩定的硫酯連接。 用於使用本發明所接供> 士 4 岍扠供之方法進行篩選的標靶受質， 可包括病毒性天冬胺酸转里w 、 、一丨半胱胺酸蛋白酶抑制子多 月太’例如p35、P49或CrmA吝日士丄 肽。本發明所提供絲胺酸蛋 白_抑制物之RSL環的修飭太i I飾方法，可容易地應用於病毒性 87 200817517 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶抑制子多肽之修飾。例 如，可將用於P35 RSL中之裂解的標乾部位進行修飾，以 便挑選對標靶受質具有經改變反應性或專_性之蛋白酶。 於野生型P35,天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶辨識係於 胺基酸位置84_87 (DQMD87)發現。因此，病毒性天冬胺酸 特異性半胱胺酸蛋白酶抑制子多肽之修飾可包括改變裂解 序列及/或周圍胺基酸殘基之修飾。例如，此類經修飾之天 冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶抑制子多肽，例如p35、— 或多肽，可經設計成模擬所希望標乾受質（例如涉 ^疾病或病症之病原學者）之裂解序列。可於本發明所提 =方法中進行任何於病毒性天冬胺酸特異性半耽胺酸蛋 白酶抑制子多肽之RSL環的修飾。 用於本發明所提供方法中之病毒性天冬胺 酸蛋白酶抑制子多狀’例如〜或C— 為任何病毒性天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶抑制子多 =括（但不限定於）以重組方式製得之多狀，以合成 Ρ49Γ多狀’及藉由桿狀病毒純化方法製得之p35或 2。病毒性天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白 ;::體包括多狀之等位基因變體，例如—一 b.阿伐巨球蛋白（aM) 酶抑阿伐巨球蛋白(Μ家族包括諸如例舉性蛋白 抑= 咐蛋白酶 7預期用於本發明所提供方法中作為蛋白酶誘 88 200817517
陷物。aM分子抑制全部種類的蛋白酶。aM蛋白酶誘陷物 特徵在於具有包含抑制子之誘餌區被蛋白酶裂解的類似抑 制機制。誘餌區為容易進行蛋白分解性裂解之節段，且其 (於裂解後）引發aM分子中的構型變化導致該蛋白酶周 圍之結構瓦解。對於SEQ ID NO:49〇所列示之例舉性a2M 序列’誘餌區相當於胺基酸690-728。於所成之aM_蛋白 酶安定複合體中，蛋白酶之活性部位在空間上被遮蔽，藉 此減少正常蛋白酶受質之可接近性。代表性地，受困陷之 蛋白酶對小的肽受質仍保有活性，但喪失其與大蛋白受質 或抑制子作用之相互能力。此外，aM分子之特徵為存在 有反應性硫醇酯，其藉由該硫醇酯與胺類之反應，而使抑 制能力不活化。再者，於誘餌區裂解後發生之構型改變， 暴露出保守性COOH-末端受體結合功能域Mnding main，rbd)。RBD序列之暴露有助於將aM_蛋白酶複合 體從循環中移出。 4·蛋白酶誘陷物競爭齋j 於本發明所提供之方法中可使用競爭劑，來調節所選 蛋白酶對於標靶受質之專一性及選擇性限制。可於任何時 :(例如在蛋白酶與所希望蛋白酶誘陷多肽接觸之前或之 二’將競爭劑與蛋白肖（或其集合）接觸，或者可將競 =所希望蛋白酶誘陷多肽同時與蛋白酶接觸。競爭劑 為專一性競爭劑或廣效性競爭劑。 專—性競爭劑係'經設計為模擬所預定之非標歡受質， 而精此作用為所預定之可能不合·標乾物（。ff_target)。代 89 200817517 表性地，此類競爭劑未經標定，以使复 ^ 文八所形成之穩定蛋白 柄複合體不會被挑選出。此外，此類競爭 丁⑷1乐u大量超過 用於挑選流程之經設計蛋白酶誘陷多肽的 莫耳過量）加入，以使競爭劑能結合隼人中 代表丨生地 _ '、口 Y之不希望蛋白 扭。於—項專一性競爭之實例，係將兩種不 多肽（各別經設計成模擬不同受質辨識） s r 觸，而僅其中-種蛋白酶誘陷多肽係經可偵測標定。例如， 競筆劑可包括經設計以使其反應性部位模擬非_以 裂解序列的多肽蛋白酶誘陷物。因此， 灶^ 、 蛑脸_疋人^ J將观f劑（例如 、、糸月邊蛋㈣抑制物）設計錢d4_pi, rsl殘 定之非-標靶受質的裂解序列置換。競 ς 夕肽（例如另一種絲胺酸蛋白酶抑制物多狀， 列已經修飾以在P4_P1I位置含有 /、 受質之裂Μ “ 、戳所希望或所預定標靶 二之衣解序列，且經標Μ用於其分離之胺基酸） 、方法中。因此，二種蛋白酶誘陷多肽 或非·標靶受f呈 、1於標靶 乾受質專： 蛋㈣，但只有呈現所希望標 又貝專一性且經可偵測標定之穩 應被分離屮^ ^ ^. 疋貧白鰣稷合體能從反 反刀離出。專一性競爭劑之其 蛋白醢讀於夕 貝1夕J a祜（例如）天然 5 U夕肽’其反應性部位已於本發明所提供之方法 、、里修飾。實施例6例舉此類策略 、/ 絲胺酸|4 W ，、〒血水、1純化AT3 夂蛋白酶抑制物係用作為對經修 物AT3SLGR-KI +拉◊ Μ 〆m S夂蛋白酶抑制 ^观f劑〇 制所挑選蛋6,捉仏之万法中，以限 蛋白轉之專-性及選擇性。廣效性競爭劑之實例 90 200817517 包括（例如）含有各種天然蛋白酶抑制之人類血裝或人類 :清二或者，可產生其中各P2、P3或以位置變為不同之 虫白酶誘陷多肽的廣效性小分子文 ™aphine 文庫。 例如 Acxxx~ 5·變異型蛋白酶誘陷多肽 >已於其反隸部位、經修飾❿具有㈣變裂解序列之蛋 白酶誘陷多肽，可用於本發明所提供之方法中，以挑選具 有所希望或所預定標乾受質之蛋白酶。因此，蛋白酶=陷 物係於其作為蛋白酶所辨識裂解部位之序列區域中修飾， 以挑選對於標靶受質具有經改變反應性或專—性=蛋白 酶。例如，絲胺酸蛋白酶抑制物可經修飾而在或於rsl環 中之易切斷鍵結周圍具有經改變之裂解序列。於另一項實 例，a2M可於其誘餌區中修飾而具有經改變之裂解序列。 此等經修飾之蛋白酶誘陷物可經設計成模擬所希望標靶受 貝（例如，涉及疾病或病症之病原學的標靶受質）之裂解 序歹！J。 可於本發明所提供之方法中’產生任何於絲胺酸蛋白 酶抑制物分子之RSL環序列中的修飾。例舉性野生型絲胺 酸蛋白酶抑制物之RSL序列的排比係列示於下表於下 表中，標明P15至P5,位置之編號係有關於成熟型a—〗·抗 胰蛋白酶分子（相當於SEQ ID N〇:1中所列示胺基酸序列 之胺基酸367· 387 )。RSL環序列之同—性為習於該項技 藝人士已知，且/或可由例如經由比對而測定，例如經由與 如下表4所列示之絲胺酸蛋白酶抑制物比對。 91 200817517 表4: RSL環序列排比* 絲胺酸蛋制物 RSL環序列 SEQ ID NO 343 ^15 PlO 卩4 PlP]/ 363 煙旱大蛾(Manduca EGAEAAAANAFGIVPKSLILY 397 絲胺酸蛋白酶抑制物IB 煙草煙草絲胺酸蛋白酶抑制物1K EGAEAAAANAFKITTYSFHFV 398 αΐ-抗胰凝乳蛋白酶 EGTEASAATAVKITLLSALVE 399 抗凝血酶-III EGSEAAASTAVVIAGRSLNPN 400 ΡΑΙ-ΙΙ EGTEAAAGTGGVMTGRTGHGG 401 αΐ胃抗胰蛋白酶 KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPE 402 ΡΑΙ-Ι SGTVASSSTAVIVSARMAPEE 403 ΡΑΙ-ΙΙΙ S GTRAAAATGT 工 FT FRSARLN 404 卵白蛋白 AGREVVGSAEAGVDAASVSEE 405 改寫自葉等人（2001) Nature Structural Biology 8: 979 因此，可修飾絲胺酸蛋白酶抑制物之RSL環中相當於 絲胺酸蛋白酶抑制物活性部位中任一或多個胺基酸（亦 即，相當於例如上表4中所列P15至P5,位置之胺基酸） 的胺基酸序列。代表性地，為RSL環序列之鉸鏈區部份的 胺基酸（亦即相當於P15-P9位置之胺基酸）不被修飾。於 一項實例，係修飾一或多個位於P1與/或ΡΓ位置之胺基 酸，相當於該等位於易切斷鍵結側翼之胺基酸。於另一項 實例，係修飾任一或多個相當於活性部位位置P4-P2’之胺 基酸。例如，PAI-1 之 Ρ4-ΡΓ為 VSARM (SEQ ID NO:378)， 其中裂解發生於R (P1)與M (PI，）胺基酸之間。可進行 VSARM序列之任一或多個胺基酸之修飾，以修飾PAI-1 之裂解序列，以挑選具有經改變專一性之蛋白酶。實施例 1例舉PAI-1之修飾，其中係將反應性部位環中之VSARM 序列修飾成RRARM (SEQ ID NO:379)。於另一項實例，可 將反應性部位環VSARM序列修飾成已知的有效肽受質 92 200817517 、 PFGRS (SEQ ID NO:389)。或者（且若需要地），可於任 一或多個胺基酸位置P 4 - P 2 ’作一次一個、一次兩個、一次 三個修飾，且所成之經修飾絲胺酸蛋白酶抑制物可分開於 連續挑選回合中測試，以最適化在各別經修飾位置呈現受 質專一性及/或選擇性之蛋白酶。 於大多數個案，置換位於野生型絲胺酸蛋白酶抑制物 反應性部位環中，或於另一種蛋白酶誘陷物之類似序列之 胺基酸殘基的胺基酸殘基，係基於在所希望標靶受質中之 ί 裂解序列選擇。標靶受質蛋白為其正常下涉及病症者，其 中於所給定受質序列裂解標靶蛋白質可作為對該病症之治 療（參見，例如美國專利申請案號US 2004/0146938、 US2006/0024289、US2006/0002916 及臨時申請案序號 60/729,817 )。例如，標靶蛋白質可為涉及類風溼性關節 炎者（亦即TNFR)、敗血病者（亦即蛋白質C )、腫瘤 發生者（亦即生長因子受體，例如VEGFR)或發炎（亦即 補體蛋白）者。標靶受質亦可為病毒蛋白，以使於該病毒 C 蛋白裂解後該病毒將無能力感染細胞。 表5:例舉性標靶受質 標靶 適應症 分子分類 IL-5/IL-5R 氣喘 細胞因子 IL-1/IL-1R 氣喘、發炎、風溼病 細胞因子 IL-13/IL-13R 氣喘 細胞因子 IL-12/IL-12R 免疫學病症 細胞因子 IL-4/IL-4R 氣口而 細胞因子 TNF/TNFR 氣喘、Crohn氏病、HIV感染、 發炎、牛皮癬、類風溼性關節 炎、發炎性腸病 細胞因子 CCR5/CXCR4 HIV感染 GPCR gpl20/gp41 HIV感染 融合蛋白 93 200817517 CD4 HIV感染 免疫受體 血凝素 (Hemaglutinin ) 流感病毒感染 融合蛋白 RSV融合蛋白 RSV感染 融合蛋白 B7/CD28 移植-v-宿主病症、類風溼性關 節炎、移植排斥、糖尿病 免疫受體 IgE/IgER 移植-V-宿主病症、移植排斥 抗體受體 CD2, CD3, CD4， CD40 移植-V-宿主病症、移植排斥、 牛皮癣 免疫受體 IL-2/ IL-2R 自體免疫疾病、移植-V-宿主病 症、類風溼性關節炎 細胞因子 VEGF，FGF，EGF， TGF 癌症 生長因子 HER2/Neu 癌症（亦即乳癌） 生長因子受體 CCR1 多發性硬化 GPCR CXCR3 多發性硬化、類風溼性關節炎 GPCR CCR2 動脈粥樣硬化、類風溼性關節 炎 GPCR Src 癌症、骨質疏鬆 激酶 Akt 癌症 激酶 Bcl-2 癌症 蛋白質-蛋白質 BCR-Abl 癌症 激酶 GSK-3 糖尿病 激酶 Cdk_2/cdk-4 癌症 激酶 EGFR 肺、乳、膀胱、前列腺、結腸 直腸、腎、頭與頸癌 VEGFR-1， VEGFR-2 頸癌 生長因子受體 補體 發炎性疾病 免疫分子 標靶蛋白質内之裂解部位為已知，或可容易第被鑑認 出。標靶蛋白質内之裂解部位係藉由下列準則進行鑑認： 1)彼等係位於蛋白質之暴露表面上；2)彼等係位於缺乏 二級結構之區域中（亦即，非位於螺旋之P薄片中），當 以結構預欲測驗算法之原子構造測定時（此等區域傾向為 位於蛋白質表面上之環或位於細胞表面受體上之柄）；3)彼 等係位於適合使蛋白質不活化（或活化）之部位，基於其 已知之功能。裂解序列例如長度為四個殘基（亦即P1-P4 94 200817517 r 位置），以配合蛋白酶之延伸受質專一性，但是可能更長 或更短。可藉由該項技藝已知之任何方法，鑑定得標革巴受 質中之裂解序列（參見，例如已公開之美國專利申請案號 US 2004/0146938 )。於一項實例，係藉由將標靶受質與任 何已知可裂解該受質之蛋白酶進行培育，而測定出標靶受 質之裂解。於與蛋白酶進行培育後，可藉由SDS-PAGE將 標靶蛋白質分離，並可藉由以蛋白質染料例如考馬斯亮藍 染色，而鑑認分解產物。可將蛋白分解片段定序，以測定 i P1-P4裂解序列殘基之身分。表6鑑認出例舉標靶受質之 相當於位置P1-P4的裂解序列。 表6:例舉標靶受質(P1-P4殘基)的裂解序列 標靶 裂解序列 TNF-a AEAK (406) TNF-R1 ENVK (407); GTED (408) TNF-R2 SPTR (409); VSTR (410); STSF (411) HER-2 KFPD (412);AEQR(413) EGFR KYAD (414); NGPK(415) VEGFR-1 SSAY(416); GTSD (417) VEGFR-2 AQEK (418); RIDY (419); VLKD (480); LVED (481); WFKD (482); RIYD (483); KVGR (484); RVRK (485); RKTK (486); KTKK (487); TKKR (488); RRVR (489) C3 REFK (420); GLAR (421); RLGR (422); AEGK (423); QHAR (424); LPSR (425); SLLR (426); LGLA (427); LSVV (428) C4 HRGR (429) C2 GATR (430); SLGR (431); VFAK (432) 因此，絲胺酸蛋白酶抑制物之RS1，或其他蛋白酶誘 陷物中之類似序列的修飾，可經修飾成某標靶受質之任何 所希望或所預定的裂解序列。於一項實例，所挑選之裂解 95 200817517 序列可為t-PA之特別有效裂解序列。此 如）PGFRSA (SEQ ID ΝΟ··389，·來見例如、 列為（例 >見例如，丁格等人（1995) 户諸，92:7627-763”。於是，例如 ^ Λ ^ T ^具有用以複製 t-PA受質專一性之經改變受質專一 兮Γ生挑選蛋白酶。因為卜 PA為治療血纖維蛋白溶解性病症之常用治療劑，故此 «之蛋白酶可經最適化，而為另供挑選的“^治療劑， 同時使常與tPA療法關連之不希望副作 、心 ，主田j作用（亦即過量出血） 減至最少。 於另-項實例，可定對於補體蛋白之裂解序列，作 為供使用本發明所提供方法挑選《白酶之所預定或所希望 裂解序列。所挑選對任一或多種補體蛋白具有增加受質專 一性之蛋白酶，將是用於治療與發炎相關連之病症或疾病 (例如（但不限定於）自體免疫疾病，如類風溼性關節炎 與狼瘡、心臟疾病、及其他炎性病症，如敗血症與缺血_ 灌流損傷）的治療候選物（參見，例如臨時申請案序號 6〇/729,817)。實施例6例舉MT_spi蛋白酶針對藉由以以 補體蛋白之裂解序列（亦即SLGRKI，SEQ m N〇:479)置 換其天然P4-P2,殘基IAGRSL (SEQ ID n〇:478)而修倚的 ΑΝΤ3絲胺酸蛋白酶抑制物分子之篩選。胺基酸殘基由 SLGRKI裂解序列，或其如下所述中間物進行之修飾或置 換，可於任何供挑選任意所希望候選蛋白酶之蛋白酶誘陷 多肽，例如絲胺酸蛋白酶抑制物多肽中製作。 於一項另外的實例，可於VEGFR (例如於vegfr之 柄部區域）中挑選裂解序列，以使VEGFR可於被對該裂 96 200817517 解序列具有專—性之蛋白酶裂解後去活化。彻⑼中 知序列貫例係於本文描述，且列示於相關已公開之美國專 利申請案序號US20_()24289與US2__2916中。例如， 絲^酸蛋白酶抑制物之RSL，或於其他蛋白酶誘陷物之類 :序列：例如阿伐_2巨球蛋白之“誘尔，區，可經修飾而 使任一或多個胺基酸位置P4_P2，以VEGFR之裂解序列置 換。於-項實例’天然絲胺酸蛋白酶抑制物中之胺基酸殘 基可經修飾而含有相當於RRVR (剛ι〇 ν〇·彻）裂解序 狀Ρ4 Ρ1位置。對此類絲胺酸蛋白酶抑制物所挑選得之 蛋白酶將是用於治療VEGFR_所介導之病症（例如血管生 成性失調症）的候選物。 於有些個案，於本發明所提供之方法中，於絲胺酸蛋 白酶抑制物RSL之一或多個ρ4·ρ2，位置，或於其他蛋白酶 誘陷物之類似序列的修飾’可於連續的回合中製作以最適 化用於挑選具有所希望或所預定受質專一性之蛋白酶。例 如，u-PA及t-PA蛋白酶兩者皆於？2位置偏好小胺基酸， 而於P3及P4位置喜好非常不同的胺基酸。因此，可產生 為最終標乾裂解序列之中間物的經修飾之絲胺酸蛋白酶抑 制物，其中弟一中間物係藉由僅修飾P3及P4位置而產生， 以用於挑選呈現位於P3及p4位置之專—性的蛋白酶。秋 後所挑選得之蛋白酶可用作為供產生對於經修飾而額外具 有P2位置改變之新絲胺酸蛋白酶抑制物分子的新組合文 庫之模板。 θ 因此，於（例如）其對於VEGFR裂解序列rrvr呈 97 200817517 現增加之受皙直_ & 中，挑選的冑 ·ΡΑ蛋白酶（或其變體）之挑選 肽’例如絲胺酸蛋白酶抑制物（其 ： 等位置，僅…位置被改變）進行=然：列之該 蛋白酶抑制物pam<rsl;s中的丁 Μ如’在絲胺酸 ，可: 列而製得經修飾中間型PAI_1，以產生於！M_P1，位置八^ ⑽A驗之中間型絲胺酸蛋白酶抑制物分子。^有 位置額外經修飾…絲胺酸蛋白酶抑制物:進行後續 的蛋白酶挑選回合。 、 蛋白酶誘陷物（包括絲胺酸蛋白酶抑制物），可使用 該項技藝中已知用於修錦蛋白質之任何方法進行修飾。此 等方法包括定位誘變，包括單或多-定位誘變。分析（例如 對於絲胺酸蛋白酶抑制物分子或其他蛋白酶誘陷物之生物 學功能進行的分析）為該項技藝中已知且可用於評估评 飾蛋白酶誘陷物於本發明所提供方法中作為抑制子之活 性。此類分析仰賴用於本發明方法之經修飾蛋白酶誘陷 物。此類用於PAW《分析的實例包括（例如）對於標準 騰蛋白酶之活性部位滴定或如實施例1中所例舉之標準騰 蛋白酶滴定。可設計類似的分析’或其為習於該項技藝人 士已知，視蛋白酶誘陷物（或其變體）正常與其相互作用 之同源蛋白酶而定。而且，預期（且常為實際情況）經修 飾蛋白酶之誘陷物在正常蛋白酶誘陷物活性或功能分析中 相較於野生型蛋白酶誘陷物會具有減低之活性。 98 200817517 D·蛋白酶 於本發明所提供之方法中， 所預定或所希望受質）R ，（代表性地針對於 w主又貝J呈現經改變受暂 蛋白酶。將蛋白酶、突變型蛋白…專一性者挑選候選 木a舁蛋白酶誘陷多肽（ P刀之 可於本發明所提供者，勹 括（例如）絲胺酸蛋白酶抑制物或瘦 I、者包 抑制物）接觸，而針對呈11 /飾之、、、糸胺酸蛋白酶 針對具有經改變受質專-性挑選恭以 史白酶集合可提供於固體撐 、蛋白酶。 於溶液或懸浮液）中。所筛選得勻混合物(例如 蛋白酶誘陷多肽所成之穩定複人縣可經分離呈與該 得之蛋白酶對於所希望切 可被㈣。所篩選 化功效及反應性，而因此為用作 ^貝展現增加之催 貝所涉及之任何疾病或病症）之候選者。 不靶又 1·候選蛋白酶 於本發明所提供之方法， 症之所希望受質具有經改變受質專—十對對於涉及疾病或病
酶。一般，蛋白酶為水解棹H #之候選而挑選蛋白 运亩 心勒^質而使其他保持完 A 度專一性蛋白質。對於天然受質之裂觫“ 之尚 選擇性以使能偏好受質裂解而不傾向非度 等人（1996) J.仏〇/·以⑽，271: ' <解（比布斯 希望標靶受質具有經改變專 467)。針對對於所 又欠專一性與選擇性 選，將使該蛋㈣作為選擇心化或去活 ·的篩 低、緩解或預防疾病或病症 / 白質以減 人丄 ，口療劑之用途成為可台匕 於本發明所提供蛋白酶誘陷筛 ：-。用 T之私靶蛋白酶可為 99 200817517 任何類已知能夠肽鍵水解蛋白酶誘陷相互作用者之蛋白 酶。代表性地，對絲胺酸蛋白酶抑制物而言，此類蛋白酶 -般為絲胺酸蛋白酶抑制物可與其反應而形成共價中間複 合體之絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶。絲胺酸及半耽胺酸蛋白 酶之實例為任何列示於下表7中之蛋白酶。代表性地，於 本發明所提供之方法係使用經修飾蛋白酶文庫以筛選出對 於標㈣白酶誘陷物（或其變體）（例如絲胺酸蛋白酶抑 制物（或其變體））展現增加的專—性或選擇性之蛋白酶。 已經描述可用於（及/或經修飾而用於）本發明所提供 挑選方法之例舉性蛋白酶，且包括包括具催化活性部分之 經截短多肽。例舉性候選蛋白酶列示於表7,且於本文令 加以描述（參見例如，ac。於該 表中記㈣於各例舉性候選蛋白酶之核皆酸序列及所編碼 之^酸則驅物序列的序列鑑別號（seq m NO)。對應於 訊號肽或原肽序列以產+ & 1疋 J屋生成沾蛋白質的所編碼胺基酸亦於 録中註明。此外，亦加註指示蛋白酶功能域（亦即狀酶 早位）之胺基酸，而構成（例如）代表性蛋白酶之 三聯體的活性部位殘基亦如此。因為相互作用為動態的， 所註明之胺基酸位置僅為參考及例舉說明。所註明 反映出其差異為2、3、4、5或更多個胺基酸之基因座範 圍。於等位基因變體及物種變體之間亦存在變異。習㈣ 項技藝人士可藉由目視比對或其他包括可容易取得之演算 法與軟體之比對鑑認出相對應之序列。 用於挑選之候選蛋白酶代表性地為野生型或野生型候 100 200817517 選蛋白酶之經修飾或變異形式，或其具催化活性部分，包 括任一蛋白質之等位基因變體及同功型。候選蛋白酶可藉 由該項技藝中任何已知之方法製造或分離得，包括從天然 來源分離、於細胞、組織與生物體以重組方式製得之蛋白 質的分離、及藉由重組方法與藉由包括電腦執行步驟之方 法、合成方法及習於該項技藝人士已知之任何方法。用於 挑選之候選蛋白酶的修飾可藉由習於該項技藝人士已知之 任何方法（例如本文下述之任何方法）達成。 表7:例舉性候選蛋白酶 蛋白酶 Merops 碼 名稱 Nt. ACC. Nt. A.A. A.A.S 訊％/原肽 肽單位 類型 NO: SEQ ACC. EQ 序列 (活性部位殘基） ID NO: ID NO: NO: 絲胺酸 S01.010 粒酶B， M17016 P10144 40 1-18/19-20 21-247 蛋白鱗： 人類-型 39 (64,108,203) 凝乳-胰 S01.011 睪蛋白酶 NM 006799 41 NP_006790 42 1-19/20-41 42-288 蛋白酶 (Testisin) (vl) NM 144956 43 NP_659205 44 (82, 137, 238) 家族 (v2) NM 144957 45 NP_659206 46 (v3) S01.015 類胰蛋白酶 NM—003294 47 NP_003285 48 1-18/19-30 31-274 貝他1(人 類 Kill) (74, 121,224) S01.017 激肽釋放酶 NM—012427 49 NP_036559 50 1-22/ 67-292 hk5 (108, 153, 245 ) S01.019 Corin NM_006587 51 NP一006578 52 802-1037 (843, 892, 985) S01.020 激肽釋放酶 NM一019598 53 NP一062544 54 1-17/ 22-248 12 Tvl) (843, 892,985) NM 145894 55 NP_665901 56 (v2) NM 145895 57 NP_665902 58 (v3) S01.021 DESC1 AF064819 59 AAF04328 60 191-422 oritease (231,276,372) SO 1.028 類胰蛋白酶 NM_012467 61 NP_036599 62 1-19/ 38-272 加瑪1 (78, 125,222) SOI.029 激肽釋放酶 NM—022046 63 Q9P0G3 64 1-18/19-24 25-249 hK14 (67,111,204) 101 200817517 f
蛋白酶 Merops 瑪 名稱 Nt. ACC. Nt. A.A. A.A.S 訊我/原肽 肽單位 類型 NO: SEQ ACC. EQ 序列 (活性部位殘基） ID NO: ID NO: NO: S01.033 透明質結合 NM一004132 65 NP_004123 66 1-23/ 314-557 性絲胺酸蛋 白酶（HGF 活化子-類 蛋白質） (362, 411，509) SO 1.034 跨膜蛋白 NM 019894 67 NP 063947 68 205-436 酶，絲胺酸 4 NM_183247 69 NP—899070 70 (245,290,387) SO 1.054 類胰蛋白酶 NM_012217 71 Q9BZJ3 72 1-18/19-30 31-235 德他1 (人 類） (74, 121,224) S01.074 Marapsin NM_031948 73 NP一114154 74 1-22/23-34 35-279 (75, 124,229) S01.075 類胰蛋白酶 BC036846 75 AAN04055 76 37-281 同源物2 (人 類） (77, 126,231) S01.076 類胰蛋白酶 僅推定的 77 78 67-304 同源物3 (人 AC005570 (裝配型質粒 (107,213,259) 類） 407D8) S01.079 跨膜蛋白 酶，絲胺酸 NM_024022 79 NP—076927 80 217-451 (vA) (257, 304,401) NM 032401 81 NP_115777 82 3 m NM 032404 83 NP_115780 84 (vC) NM 032405 85 NP_115781 86 (vD) S01.081 激肽釋放酶 NM_023006 87 NP_075382 88 1-16/17-21 22-256 hK15(人類） Tvl) NM 138563 89 NP—612630 90 (62, 106,209) 7v2) NM_138564 91 NP_612631 92 (v3) NM 017509 93 NP_059979 94 (v4) S01.085 Memame- BC035384 95 AAH35384 96 1-241 AA031 肽酶（由 MEROPS (56, 101,195) 自EST推 論得） S01.087 膜-型嵌合 AB048796 97 BAB39741 98 321-556 絲胺酸蛋白 酶 (361,409,506) S01.088 Memame- 僅推定的 CAC12709 99 10-142 AA038 AL136097 (50,101) 肽酶 (RP11-62C3 clone) S01.098 Memame- 僅推定的 100 AAH41609 101 33-202 AA128肽酶 ( 由 MEROPS 自EST推 論得） BC041609 (50,152) 102 200817517 (
蛋白蘇 類型 Merops 碼 名稱 Nt. ACC. NO: Nt. SEQ ID NO: A.A. ACC. NO: A.A.S EQ ID NO: 訊號/原肽 序列 肽單位 (活性部位殘基） S01.127 陽離子性胰 蛋白酶（人 類-1型）（陽 離子性） NM一002769 102 NP_002760 103 1-15/16-23 24-246 (63, 107, 200) SOI.131 親核性 彈性蛋白酶 NM—001972 104 NP_001963 105 1-27/28-29 30-249 (70, 117, 202) SOI.132 甘露聚糖-結合性凝集 素-相關之 絲胺酸蛋白 酶-3 AF284421 106 AAK84071 107 1-19/ 449-710 (497, 553, 664) SOI.133 組織蛋白酶 G NM—001911 108 NP_001902 109 1-18/19-20 21-245 (64,108,201) SOI.134 成髓細胞 蛋白酶 (蛋白酶3) NM_002777 110 NP_002768 111 1-25/26-27 28-250 (71, 118, 203) SOI.135 粒酶A (CTLA3) NM一006144 112 NP—006135 113 1-26/27-28 29-261 (69,114,212) SOI.139 粒酶Μ NM—005317 114 NP_005308 115 1-23/24-25 26-256 (66,111,207) SOI.140 胰凝乳蛋白 酶（人類型） NM—001836 116 NP_001827 117 1-19/21-21 22-247 (66,110,203) SOI.143 類胰蛋白酶 阿伐(1) NM—003294 118 NP_003285 119 1-18/19-30 31-274 (74, 121, 224) SOI.146 粒酶Κ NM—002104 120 NP_002095 121 1-24/26-26 27-261 (67, 116,214) SOI.147 粒酶Η (CTLA1) NM_033423 122 NP_219491 123 1-18/19-20 21-246 (64, 108,202) SOI.152 凝乳蛋白酶 Β M24400 124 P17538 125 1-18 34-263 (75, 120,213) SOI.153 胰彈力蛋白 酶 NM_001971 126 NP—001962 127 1-8/9-18 19-256 (63, 111,206) SOI.154 胰内切肽酶 Ε(Α) NM_005747 128 NP_005738 129 1-15/16-28 29-270 (73, 123,217) SOI.155 胰彈力蛋白 酶 II (ΙΙΑ) M16652 130 AAA52380 131 1-16/7-28 29-269 (73, 121,216) SOI.156 腸肽酶 NM_002772 132 NP_002763 133 785-1019 (825, 876, 971) SOI.157 胰凝乳蛋白 酶C NM_007272 134 NP_009203 135 1-16/17-29 30-268 (74, 121,216) SOI.159 前列腺蛋白 酶 (prostasin ) NM 一002773 136 NP—002764 137 1-29/30-32 45-288 (85,134,238) SOI.160 激肽釋放酶 1 NM_002257 138 NP_002248 139 1-18/19-24 25-261 (65,120, 214) SOI.161 激肽釋放酶 hK2 (人類） NM—005551 7vl) NM 001002 231 (v2) NM 001002 232 (v3) 140 142 144 NP一005542 NP 0010022 31 NP 0010022 32 141 143 145 1-18/19-24 25-260 (65, 120,213) 103 200817517
蛋白酶 Merops 爲 名稱 Nt. ACC. Nt. A.A. A.A.S 訊號/原肽 肽單位 類型 NO: SEQ ACC. EQ 序列 (活性部位殘基） ID NO: ID NO: NO: SOI.162 激肽釋放酶 NM 001648 146 NP 001639 147 1-17/18-24 25-260 Tvl) '(vl) (65, 120,213) J NM 001030 148 NP 0010252 149 047 (v3) Γ8 (v3) NM 001030 150 NP 0010252 151 048 (v4) Γ9 (v4) NM 001030 152 NP 0010252 153 049 (v5) 20 (v5) NM 001030 154 NP 0010252 155 050 (v6) 21 (v6) SOI.174 間胰蛋白酶 NM_002771 156 NP_002762 157 1-24/ 24-246 (mesotrypsi η) (63,107,200) SO 1.205 胰内切肽酶 NM_007352 158 NP一031378 159 1-15/16-28 29-270 Ε形式Β(Β) (73, 123,217) SO 1.206 胰彈性蛋白 NM一015849 160 NP_056933 161 1-16/17-28 29-269 酶II型式Β (人類）（ΙΙΒ) (73,121,216) S01.211 凝血因子 NM_000505 162 NP_000496 163 1-19/ 373-615 Xlla (412,461,563) S01.212 血漿激肽釋 NM_000892 164 NP_000883 165 1-19/ 391-628 放酶 (KLK3) (434,483, 578) S01.213 凝血因子 NM_000128 166 NP_000119 167 1-18/ 388-625 XIa Tvl) (vl) (431,480,575) NM 019559 168 NP 062505 169 (HAF) (v2) (v2) S01.214 凝血因子 NM_000133 170 NP_000124 171 1-28/29-46 227-461 IXa (267, 315,411) S01.215 凝血因子 NM 000131 172 NP_000122 173 1-20/21-60 213-454 Vila (vl) (vl) (253,302,404) NM 019616 174 NP 062562 175 (v2) (v2) S01.216 凝血因子 NM_000504 176 NP_000495 177 1-31/32-40 235-469 Xa (276,322,419) S01.217 凝血酶 NM—000506 178 NP—000497 179 1-24/25-43 364-620 (406,462, 568) S01.218 蛋白質C NM_000312 180 NP_000303 181 1-32/33-42 212-452 (經活化） (253,299,402) SO 1.223 頂體蛋白酶 NM_001097 182 NP—001088 183 1-19 43-292 (88, 142, 240) SO 1.224 Hepsin NM_182983 184 NP_892028 185 163-407 (vl) (203,257,353) NM 002151 186 NP_002142 187 (v2) S01.228 肝細胞生長 NM_001528 188 NP_001519 189 1-35/36- 408-648 因子活化子 (HGFA) 372 (447, 497, 598) SO 1.231 U-iL纖維蛋 NM_002658 190 NP_002649 191 1-20/ 179-426 白溶酶原活 化子(uPA) (224,275,376) SO 1.232 t- jk纖維蛋 NM—000930 192 NP一000921 193 1-23/24-32 311-562 白溶酶原活 (vl) NM一000931 194 (vl) NP 000922 195 and 33-35 (357, 406,513) 化子（tPA) (v2) (v2) NM 033011 196 NP 127509 197 (v3) (v3) SO 1.233 血纖維蛋白 NM 000301 198 NP 000292 199 1-19/20-97 581-810 溶酶 (622, 665, 760) 104 200817517
蛋白酶 Merops 碼 名稱 Nt. ACC. Nt. A.A. A.A.S 訊號/原肽 肽單位 類型 NO: SEQ ACC. EQ 序列 (活性部位殘基） ID NO: ID NO: NO: SO 1.236 Neurosin NM 002774 200 NP一002765 201 1-16/17-21 22-244 (yA) (62,106, 197) NM 001012 202 NP 0010129 203 964 (vB) —82 NM 001012 204 NP 0010129 205 965 (vC) 83 NM 001012 206 NP 0010129 207 966 (vD) —84 S01.237 神經胰蛋白 NM一003619 208 NP_003610 209 1-20/ 631-875 酶 (676, 726, 825) (neurotrypsi η) SO 1.242 類胰蛋白酶 貝他2 (人 類)(1) NM_024164 210 NP—077078 211 1-30/ 31-268 SO 1.244 Neuropsin NM—007196 212 NP—009127 213 1-28/29-32 33-258 (vl) (vl) (73, 120,212) NM 144505 214 NP 653088 215 (v2) (v2) NM 144506 216 NP一653089 217 ⑽ (v3) NM 144507 218 NP 653090 219 (v4) (v4) SO 1.246 激肽釋放酶 NM一002776 220 NP—002767 221 1-30/ 35-276 hK10 (人類） (vl) NM 145888 222 NP_665895 223 (86,137,229) (v2) SO 1.247 上皮絲胺酸 NM_005656 224 NP_005647 225 256-491 蛋白酶 (296, 345, 441) (Epitheliasin ) S01.251 前列腺酶 NM—004917 226 NP一004908 227 1-26/27-30 31-254 (prostase) (71,116,207) S01.252 腦絲胺酸蛋 NM_022119 228 NP_071402 229 1-32 50-292 白酶2 (90, 141, 242) S01.256 Chymopasin NM_001907 230 NP—001898 231 1-18/19-33 34-264 (75, 121,214) S01.257 激肽釋放酶 NM一006853 232 NP_006844 233 22-250 11 (vl) (vl) (62, 110, 203) NM 144947 234 NP 659196 235 1-50/51-53 (v2) (v2) S01.258 陰離子性胰 NM一002770 236 NP_002761 237 1-15/16-23 24-246 蛋白酶（人 m) (Π) (TRY2， TRY8， TRYP2) (63, 107, 200) S01.291 LOC144757 推定的 238 AAH48112 239 78-319 肽酶（人類） BC048112 (122, 171,268) SO 1.292 Memame- BN000133 240 CAD67985 241 1-19 175-406 AA169肽酶 (215, 260,356) SO 1.294 Memame- 推定的 242 AA171肽酶 無DNA SO 1.298 Memame- 推定的 AAC80208 243 24-246 AA174肽酶 (TRY6) 無 DNA seq (63, 107,200) SO 1.299 Memame- NM一198464 244 NP一940866 245 68-302 AA175肽酶 (108, 156, 250) 105 200817517 蛋白酶 類型 Merops 爲 名稱 Nt. ACC. NO: Nt. SEQ ID NO: A.A. ACC. NO: A.A.S EQ ID NO: 訊號/原肽 序列 肽單位 (活性部位殘基） S01.300 角質層胰凝 乳蛋白酶性 酵素(SCCE) NM一005046 (vl) NM 139277 (v2) 246 248 NP—005037 NP_644806 247 249 1-22/23-29 30-250 (70, 112,205) S01.301 類胰蛋白酶 酵素，呼吸 道（跨膜蛋 白酶，絲胺 酸 11D) NM_004262 250 NP_004253 251 187-471 (227,272,368) S01.302 Matripase (MTSP1) AF118224 252 AAD42765 253 615-855 (656,711,805) S01.306 激肽釋放酶 hK13 NM_015596 254 NP_056411 255 1-16/ 36-263 (76, 124,218) S01.307 激肽釋放酶 hK9 (人類 編號） NM_012315 256 NP_036447 257 1-15/ 23-250 (63,111,204) S01.308 Memame-AA035肽酶 NM_153609 258 NP_705837 259 49-283 (89, 140, 234) S01.309 臍靜脈蛋白 酶 NM_007173 260 NP—009104 261 1-23/ 95-383 (175,246,316) S01.311 LCLP蛋白 酶(LCLP (N-端)） 胜肽片段 無DNA P34168 262 1-26 ⑼ S01.313 Spinesin NM_030770 263 NP_110397 264 218-455 (258, 308,405) S01.318 Memame-AA178肽酶 NM_183062 265 NP_898885 266 1-33/ 53-288 (93, 143,238) SO 1.320 Memame-AA180肽酶 BN000120 267 CAD66452 268 1-23/ 52-301 (92, 142,240) SO 1.322 Memame-AA182肽酶 BN000128 269 CAD67579 270 1-17/ 8-298 (87, 139,237) S01.414 Memame-AA122肽酶 ( 由 MEROPS 自EST推 論得） 推定的 AK075142 271 BAC11431 272 1-177 (12, 64, 168) 半胱胺 酸蛋白 蘇：木 瓜蛋白 酶家族 C01.032 組織蛋白酶 L X12451 273 P07711 274 1-17/18- 113 113-333 (132, 138, 276, 300) C01.009 組織蛋白酶 V U13665 275 060911 276 1-17/18- 113 114-334 (132, 138, 277,301) C01.036 組織蛋白酶 K S93414 277 P43235 278 1-15/16- 114 115-329 (133,139,276,296) CO 1.034 組織蛋白酶 S AJ007331 279 P25774 280 1-16/17- 114 115-331 (133,139, 278, 298) C01.018 組織蛋白酶 F M14221 281 Q9UBX1 282 1-19/20- 270 271-484 (289, 295,431,451) C01.060 組織蛋白酶 B M15203 283 P07858 284 1-17/18-79 80-331 (102, 108,278, 298) C01.001 木瓜蛋白酶 M84342 285 106 P00784 286 1-18/19- 133 135-342 (158, 292,308) 200817517 蛋白酶 類型 Merops 碼 名稱 Nt. ACC. NO: Nt. SEQ ID NO: A.A. ACC. NO: A.A.S EQ ID NO: 訊ft/原肽 序列 肽單位 (活性部位殘基） C01.075 克魯扎因 (Cruzain)(克 魯斯蛋白酶 (Cruzapain)) Y14734 287 P25779 288 123-467/ 124-334 (147,284, 304, 絲胺酸 蛋白峰： 枯草桿 菌蛋白 鷗家族 S08.001 枯草桿菌蛋 白 酶 Carlsberg 前 驅物 X03341 290 P00780 289 1-29/30- 105 111-370 (137, 168, 325) S08.002 枯草桿菌蛋 白酶（鹼性 mesentericopep tidase) P07518 291 6-266 (32, 64,221) S08.003 枯草桿菌蛋 白 酶 Savinase (鹼性蛋白 酶） P29600 292 6-260 (32, 62,215) S08.007 熱 酶 (thermitase) P04072 293 13-264 (38,71,225) S08.009 嗜熱性絲胺 酸蛋白酶前 驅物 (Ak.l蛋白 酶） L29506 295 Q45670 294 1-24/25- 121 134-391 (160, 193, 347) S08.020 C5a肽酶前 驅物 J05229 297 PI 5926 296 1-31/ 120-339, 458-560 (130,193,512) S08.021 閃爍桿菌 蛋白酶 (fervidolysin ) AY035311 299 AAK61552 298 164-457 S08.035 枯草桿菌蛋 白酶J前驅 物 M64743 301 P29142 300 1-29/30- 106 112-372 (138,170, 327) S08.036 枯草桿菌蛋 白酶E前驅 物 KOI988 303 P04189 302 1-23/24- 106 112-372 (138, 170,327) S08.037 枯草桿菌蛋 白酶DY P00781 304 6-257 (32, 63,220) S08.054 蛋白酶K 前驅物（内 切肽酶K) X14689 306 P06873 305 1-15/16- 105 134-373 (144, 174,329) S08.050 鹼性絲胺酸 外切蛋白酶 A前驅物 M25499 308 P16588 307 1-21/22- 141 155-412 (180,213,363) 107 200817517 r % i 蛋白酶 類型 Merops 瑪 名稱 Nt. ACC. NO: Nt. SEQ ID NO: A.A. ACC. NO: A.A.S EQ ID NO: 訊號/原肽 序列 肽單位 (活性部位殘基） S08.060 表皮素引導 肽 (epidermin)-加工性前導 胜肽絲胺酸 蛋白酶epiP 前驅物 X62386 310 P30199 309 1-23 / 24 -? 123-451 (149, 194, 402) S08.063 膜-結合轉 錄因子部位 1蛋白酶前 驅物(部位-1 蛋白酶，枯 草桿菌蛋白 酶/凱新蛋 白 酶 (kexin)-同 功酶1， SKI-1) AF078105 312 Q9Z2A8 311 1-14/18- 186 179-473 (218,249, 338,414) S08.066 鹼性蛋白酶 前驅物 (ALP) M87516 314 Q03420 313 1-20/21- 120 121-409 (161, 192,353) S08.094 胞外絲胺酸 蛋白酶前驅 物 M13469 316 P09489 315 1-27/ 50-389 (76,112, 341) S08.090 三狀基-狀 酶 II (TPP-II) AF035251 318 Q9V6K1 317 5-509 (131，359, 549) S08.114 次要胞外蛋 白酶vpr前 驅物 M76590 320 P29141 319 1-28/29- 160 163-365, 487-586 (189,233, 534) S08.116 PIII-型蛋白 酶前驅物 (乳桿菌蛋 白 酶 (Lactocepin) ) J04962 322 PI 5292 321 1-33/34- 187 190-379, 584-628 (217, 281,620) S08.048 類成對鹼性 胺基酸蛋白 酶蛋白酶1， 同功型1-CRR 前驅物 M81431 324 P30430 323 1-? /7-309 376-646 (372,413,587) S08.070 凱新蛋白酶 前驅物 (KEX2 蛋 白酶） CKex2-類内 切蛋白酶1， dKLIP-1) M22870 326 P13134 325 1-19/20-109 and 110-113 149-445 (175,213,385) 108 200817517 蛋白酶 類型 Merops 碼 名稱 Nt. ACC. NO: Nt. SEQ ID NO: A.A. ACC. NO: A.A.S EQ ID NO: 訊號/原肽 序列 肽單位 (活性部位残基） S08.071 成對鹼性胺 基酸蛋白酶 前驅物 (PACE) XI7094 328 P09958 327 1-24/25- 107 131-421 (153, 194, 295, 368) S08.075 類枯草桿菌 蛋白酶/凱 新蛋白酶蛋 白酶PACE4 (原蛋白質 轉化酶枯草 桿菌蛋白酶 /凱新蛋白 酶6型前驅 物） M80482 330 P29122 329 1-63 / 64-149 182-473 (205, 246, 347, 420) S08.079 鈣依賴性蛋 白酶前驅物 (胰蛋白酶） X56955 332 P23916 331 254-521 (233,270,466) 半胱胺 酸蛋白 酶：天 冬胺酸 特異性 半胱胺 酸蛋白 酶家族 C14.001 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-1 前驅物（間 白素-1貝他 轉化酶，IL-1BC) U14647 334 P43527 333 /1-118 120-404 (236, 284) C 14.002 細胞死亡蛋 白3前驅物 L29052 336 P42573 335 235-495 (315, 358) C 14.003 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-3 前驅物 (Apopain， 半胱胺酸蛋 白酶） U13737 338 P42574 337 /1-9 10-277 (121, 163) C14.004 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-7 前驅物（類 ICE細胞〉周 亡性蛋白酶 3，細胞凋 亡性蛋白酶 Mch-3) U39613 340 P55210 339 /1-23 29-303 (144, 186) C14.005 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-6 前驅物（細 胞凋亡性蛋 白酶Mch-2) U20536 342 P55212 341 /1-23 24-292 (121, 163) 109 200817517 蛋白酶 類型 Merops 瑪 名稱 Nt. ACC. NO: Nt. SEQ ID NO: A.A. ACC. NO: A.A.S EQ ID NO: 訊號/原肽 序列 肽單位 (活性部位殘基） C14.006 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-2 前驅物 (ICH-1蛋白 酶，NEDD2 蛋白） D28492 344 P29594 343 /1-169 170-432 (277, 320) C14.007 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-4 前驅物 (ICH-2蛋白 酶，TX蛋白 酶） Z48810 346 P49662 345 /1-80 93-377 (210, 258) C14.008 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-5 前驅物 (ICH-3蛋白 酶，TY蛋白 酶，ICE (rel)-III) U28015 348 P51878 347 / 1-120 134-418 (251, 299) C14.009 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-8 前驅物（類 FADD ICE, 類ICE細胞 凋亡性蛋白 酶5) X98172 350 Q14790 349 /1-216 193-479 (317, 360) C14.010 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-9 前驅物 (ICE-LAP6, 凋亡性蛋白 酶 Mch-6 U56390 352 P55211 351 117-416 (237, 287) C14.011 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-10前驅物 U60519 354 Q92851 353 /1-219 243-514 (358, 401) C14.012 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-11 (天冬胺 酸特異性半 胱胺酸蛋白 酶-4前驅 物） U59463 356 P70343 355 /1-80 89-373 (206,254) 110 200817517 蛋白酶 類型 Merops 碼 名稱 Nt. ACC. NO: Nt. SEQ ID NO: A.A. ACC. NO: A.A.S EQ ID NO: 訊原肽 序列 肽單位 (活性部位殘基） C14.013 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-12前驅物 Y13090 358 008736 357 133-419 (250,298) C14.015 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶前 驅物（昆蟲） (drICE) Y12261 360 001382 359 /1-28 (169,211) C14.016 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-1 前驅物（昆 蟲） AF001464 362 002002 361 /1-33 (154,196) C14.017 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-13前驅物 AF078533 364 075601 363 (210, 258) C14.018 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶-14前驅物 AF097874 366 P31944 365 1-242 (89, 132) C14.019 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶 Nc前驅物 (類 NEDD2 天冬胺酸特 異性半胱胺 酸蛋白酶 DRONC) AF104357 368 Q9XYF4 367 /1-134 (271,318) C14.026 MALT淋巴 瘤轉位蛋白 1副天冬胺 酸特異性半 胱胺酸蛋白 酶（副天冬 胺酸特異性 半胱胺酸蛋 白 酶 (paracaspase )) AF130356 370 Q9UDY8 369 337-523 (415,464) C 14.971 CASP8 與 類FADD凋 亡調節子前 驅物 （C-FLIP) U85059 372 015519 371 260-433 (315, 363) 111 200817517 a.蛋白酶之分類 蛋白酶（亦稱作蛋白酵素或肽酶）為辨識標
中之胺基酸序列或肽受質之蛋白質-分解性酵素。於胺J 的受質序列之辨識後，蛋白酶催介押心T 土夂 惟化軚靶蛋白中肽鍵之水解 或裂解。標乾蛋白之此類水解作用「 鮮1乍用（視關於標靶序列之 長序列的前後文内的肽鍵位置而宏）^丄 j可去活化（或於有此 案例可活化）標靶物。 蛋白酶係基於彼等攻擊該蛋白質
I曰買之方式，分類為外切 -或内切_蛋白酶。蛋白酶或内狀酿 肮輙攻擊蛋白質之内部而產 生大型肽類。肽酶或外切肽酶攻墼 姆文辜蛋白質之末端或片段而 產生小型肽類與胺基酸。肽酶传r甘 啤係以其作用形式分類··胺基 而三肽酶從三肽類裂解胺基酸。大多數蛋白酶為小型從 卿至45，_道耳頓。許多蛋白酶係被合成及分泌呈稱 為酶原之不活性形式且後續藉由蛋白分解活化。此改變該 酵素活性部位之結構。 肽酶從胺基末端裂解胺基酸；幾基肽酶從缓基末端裂解胺 基酸，二肽醯基肽酶裂解兩個胺基酸；二肽酶㈣二狀類， 有數種不同類型催化機制為蛋白酶所利用（巴瑞特等 人（1994)編心㈣卿/· 244:18_61 ;巴瑞特等人（Η%)偷& ^^_/ 244:461·486;巴瑞特等人（1994) 細少卿/· •105 120，巴瑞特等人（199句从⑽五㈣漏/· )。基於彼等之催化機制，羧基肽酶次分成絲胺酸-、 & 半胱胺自文—型幾基肽酶而内肽酶為絲胺酸·、半胱胺 天冬胺酸-、蘇胺酸_與金屬内肽酶。絲胺酸肽酶具有 112 200817517 包含於活性中心之一個絲胺酸殘基，天冬胺酸型具有位於 催化中〜之兩個A冬胺酸，半胱胺酸-類型月太酶具有一個半 胱胺馱殘基，蘇胺酸_類型肽酶具有一個蘇胺酸殘基，而金 屬-肽酶於催化機制令使用一個金屬離子。一般，蛋白酶可 土於，、催化/¾•性分成數類，以致蛋白酶之分類可包括絲胺 酸、半胱胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸或金屬蛋白_。蛋白酶 之催化活性為裂解標靶受質所需，，改變蛋白酶催化
活性之蛋白酶修飾可影響蛋白酶裂解特定受質之能力（亦 即，修飾專一性/選擇性）。 ^各種蛋白酶具有一系列排列於活性部位口袋且直接與 叉負接觸之胺基酸。肽酶之晶體學結構顯示活性部位通常 位於該分子表面上介於相鄰結構功能域間之溝槽中，且受 貝專-性係受沿著位於負責易切斷鍵結的水解之催化部位 7一或兩側上的溝槽排列之結合部位的性質之支配。於 疋肽酶之專一性係由各次位容納單一胺基酸殘基之側鏈 的能力來描述。該等部位係從催化部位編號，S1，S2...Sn 朝向受質之N_端，而S1，，S2，〜Sn，朝向c令彼等所容納 之殘基分別編號為Ρ1，Ρ2···Ρη及 貝之裂解係於ρ 1與ρ!，間被催化 Ρ1’，Ρ2’···ρη·。標把蛋白 ’於該處從多肽受質之Ν 至C端之胺基酸殘基被標記（Pi，…，Ρ3, Ρ2, ρι，ρι·，ρ2,， =，.·..，Pj)並標記其等位於蛋白酶上之相對應結合辨識口 (，·.’ S3, S2, Sl，Sl'，S2'，S3’，...，Sj)(薛特與柏格（1967) 細咖m別叩細Co_ww 27:157_162)。因此，p2與 S2相互作用’ ρι與S1 ’ ρι，與si，等依此類推。結果，蛋 113 200817517 白酶之文質專一性係來自活性部位中之S 1-S4位置，於該 處蛋白酶係與肽受質序列之P1-P4殘基接觸。於有些個案， 在活性部位之s丨_S4 口袋間有少的（若有的話）交互作用， 使每個口袋顯得可獨立於其他口袋辨識且結合位於肽受質 序列上之相對應殘基。因此，專一性決定基序可在在一 個口袋被改變而不影響其他口袋之專一性。基於許多家族 成員之結構與模型化，已為許多蛋白酶（包括絲胺酸、半 胱胺酸、天冬胺酸、金屬與蘇胺酸家族之蛋白酶）界定對 延展受質活性及其他與受質之次級作用有貢獻的表面殘基 貝芬奈等人（1999) Structure Fold Des· 7(8):989-96 ;弗來力 奇等人（2002) J Bi〇l Chem. 277(3):2160-8 ;瓦烏等人（2〇〇〇) Nat Struct Biol. 7(9):762_5 ;卡麥隆等人（1993) 268:1 171 1 ;卡麥隆（1994) / 仏0/ CTz㈣· 269: 1 1 170 )。 i·絲胲酸蛋白酶 絲胺酸蛋白酶（SP)包括分泌型酵素及隱沒於胞質儲藏 胞器中之酵素，具有各種種種生理學角色，包括血液凝結、 傷部癒合、消化、免疫反應及腫瘤侵入與轉移。例如，騰 凝乳蛋白酶、胰蛋白酶與彈性蛋白酶於消化道執行其功 能·，因子1〇、因子η、溶血酶、及&纖維蛋白溶㈣及 凝血與傷部癒合；而Clr、Cls與C3轉化酶在補體活化作 用中扮演要角。 -類名為第η型跨膜絲胺酸蛋白酶之細胞表面蛋白質 為其具有胞外功能域之膜-錨定性蛋白質的| ^ 贫曰崎。作為細 114 200817517 =面蛋白f ’彼等在胞内訊號傳遞及於介導細胞表面蛋 *白刀解事件上扮演要角。其他絲胺酸蛋白酶為膜結合且以 類似方式執行功能。其他為分泌型。許多絲胺酸蛋白酶在 …田胞表面文體結合後展現其等活性，而因此於細胞表面 上作用。細胞表面蛋白分解作用為用於介導各種細胞功能 之具生物活性蛋白質之產生的機制。
絲胺酸蛋白酶（包括分泌型與跨膜絲胺酸蛋白酶）涉 及包括腫瘤發展與進展之程序。雖然此等蛋白酶之嫁切角 色尚未被完全闡明，絲胺酸蛋白酶及其抑制子涉及調控許 多胞内與胞外生理過程，包括癌細胞侵入與轉移擴散中之 分解作用，以及涉及腫瘤進展之新血管生成。蛋白酶涉及 胞外基質（ECM)之分解與改建並造成組織改建，且為癌症 入k與轉移所必需。有些蛋白酶之活性及/或表現已被顯示 與腫瘤進展及發展相關連。 已鑑定出超過20種絲胺酸蛋白酶家族（稱為S1_S27)， 此等係基於結構相似性及其他功能上之證據區分成6組 (SA、SB、SC、SE、SF 與 SG)(羅林斯葡等人（1994) Mw/z. —zymo/· 244: 19-61 )。數種絲胺酸肽酶之反應機制間有 相似性。胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶及羧基肽酶c家 方矢共同具有絲胺酸、天冬胺酸與組胺酸之催化性三聯體： 絲胺酸作用為親核劑’天冬胺酸作用為親電子劑，而組胺 酸作為驗。催化性殘基之幾何定向於各家族間相似，儘管 蛋白質折疊不同。催化性殘基之線性排列一般反映出組的 關係。例如，催化性三聯體於胰凝乳蛋白酶組中排列 115 200817517 成HDS❻疋於枯草桿菌蛋白酶組（SB)中排列成DHS，而 於羧基肽酶組（sc)中排列成SDH。
騰减礼蛋白酶超家族之絲胺酸蛋白酶的實例包括組織 fL血纖、准蛋白/合酶原活化子⑴pA)、膜蛋白酶、類-騰蛋白 酶蛋白酶 '胰4乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶、彈性蛋白酶、 尿激酶（或尿型血纖維蛋白溶酶原活化子，u_pA)、頂體 蛋白酶、、、工活化之蛋白質c、c i酉旨酶、組織蛋白酶G、類 糜蛋白酶及血液凝集級聯之蛋白酶，包括激肽釋放酶、凝 血酶、與因子Vila、IXa、Xa、χΐα及XHa (巴瑞特，Α·j·， 於：蛋白酶抑制劑（斤0化//?3“//7/?/以紿以），Ed•巴瑞特， A.J·等人，艾斯維爾，阿姆斯特丹，3_22頁（1986);史塔斯 柏格，W·等人，（1983) 心仏，157:219 223 ;戴贺夫， Μ·0·，蛋白質序列與構造圖集（Atlas 〇f pr〇tein and Structure )，Vol 5，國家生物醫學研究機構，，SiWer Spring，Md· (1972);及羅森柏格，R D·等人（1986) iVac.，21: 131-137)。 絲fe S文蛋白酶豕族中之蛋白酶的活性係取決於一組形 成其等活性部位之胺基酸。其中一殘基總係絲胺酸，因此 彼等被命名為絲胺酸蛋白酶。例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋 白酶、與彈性蛋白酶共有類似之結構，且在該三者中彼等 之活性絲胺酸殘基係位於相同位置（Ser-丨95)。不論其等之 相似性，彼等具有不同的受質專一性；彼等在蛋白質消化 期間裂解不同的肽鍵。例如，胰凝乳蛋白酶偏好位在其幾 基碳為欲被裂解之肽鍵的一部份之殘基上的芳族側鏈。騰 116 200817517 Τ白柄偏好位於此位置之帶正電荷⑼或_殘基。絲胺 酉:蛋白辑在其等的受質辨識特性上明顯不同：有些為高度 專-性（亦即’涉及血液凝集與免疫補體系統之蛋白酶）； 有些僅為部分專i (亦即，喷乳動物消化性蛋白酶胰蛋 白酶與胰凝乳蛋白酶）；而其他（例如枯草桿菌蛋白酶） 為完全非專-性的。不論此等在專—性上之差異，絲胺酸 蛋白酶之催化機制相當保守。 Γ
標把蛋白質被絲胺酸蛋白酶裂解之機制係基於所歡定 肽鍵受絲胺酸之親核性攻擊。與天冬胺酸或金屬締合之半 胱胺酸、蘇胺酸或水分子亦扮演此角色。於許多個案，係 藉由組胺酸之存在增進基團之親核十生，該組胺酸藉由天冬 胺i維持在質子受體狀態，’。絲胺酸、組胺酸與天冬胺 酸所排列之側鏈建構出大多數絲胺酸蛋白酶共有之催化性 三聯體。例如，胰凝乳蛋白酶及，其為與胰凝乳蛋白酶屬 同一豕族之成員的絲胺酸蛋白酶（例如MTSP-1 )之活性 部位殘基為 Asp 102、His5 7 及 Seri 95。 騰凝乳蛋白酶超家族之所有絲胺酸蛋白酶的催化性功 能域具有序列同源性及結構同源性兩者。序列同源性包括 以下者之保守：特徵活性部位殘基（例如，於胰蛋白酶 之實例為Seri 95、His57與Asp 102) ; 2)氧陰離子洞（例 如，於胰蛋白酶之實例為Glyl93, AsP194);及3)於結 構中形成雙硫橋連之半胱胺酸殘基（哈特力，B.S·，（1974) 办仍户· 5W· Gei Mz’croZn·。/·，24: 152-182 )。結構同源性包 括1)以兩個希臘鑰匙構造（Greek key structure)為特徵 117 200817517 之共有折疊（查理森，J·(魔）Adv_ Prot. Chem.，34:167_ 339 2)催化性殘基之共同配置；及3)分子核心内結 構之詳細保存（史勞得，R.M. (1974) Sci· Am.，231: 24_88)。 在整個絲胺酸蛋白酶之胰凝乳蛋白酶家族中，受質與 酵素間之骨架相互作用被完全保留，但是側鏈相互作用相 當具有差異。含有活性部位之si_s4 口袋的胺基酸之特性 决疋只特別口為之文質專一性。將一種絲胺酸蛋白酶之胺
激#夕植至另-種具有相同折疊者會使其中—種之專一性 改k:成另一種。代表性地，含右 ,,^ 3有S1_S4 口袋之蛋白酶的胺 絲為_有側鏈在受質之…埃以内者。此等胺基 酸與蛋=受質之相互作用因為其直接與受質接觸而一般 稱作第一層作用。然而，可有最線將第躁 g力取、、、肘弟一層胺基酸置 於適‘位置之“第二層，，及“第三層，，相互作用。第一層 與弟二層受質結合作用主i孫 乍用主要係由貝他-圓筒功能域間之環來 決定。因為此等環並非咎白哲+ > y —· 非蛋“之核心件，故能保持折疊 70正性，同時具有新穎受質專一性 、…、i於八工U ^ '生之％變體可在演化期間 k擇义於刀子層二人上達成所需要代謝或調節生境。代表性 地對於絲胺酸蛋白酶，下列一級序列中之胺基酸為專一性 之決定基序：心⑽、…備化性三聯體）；⑻ 、 19卜192與226(S1);57、介於58與64之環及 Μ、217、21，);介於—與一之環丄)及 97至：(S4)，及4〗與15I (S2’)(基於姨凝乳蛋白酶編 位於S!位置中之胺基酸影響ρι專—性 S2位置中之胺基酸影響P2專—性，位於Μ 美 118 200817517 酸影響P3專一性，而位於S4位置中之胺基酸影響P4專 一性。絲胺酸蛋白酶中之位置1 89係隱埋於決定S 1專一 性之口袋底部之殘基。對於各種絲胺酸蛋白酶之結構決定 基係列示於表8，其等係基於成熟型胰凝乳蛋白酶編號， 其中係將各所指名者的蛋白酶功能域與胰凝乳蛋白酶之功 能域排列。於Cysl68-Cysl82與60’s環攔位標題下之數字 表示介於該二胺基酸間之環中及於該環中的胺基酸數目。 於Cysl91-Cys220攔位標題下之是/否表示於該蛋白酶中是 否存在有雙硫橋連。此等區域在類-胰凝乳蛋白酶絲胺酸蛋 白酶家族中為可變，且其本身及代表結構決定基。某蛋白 酶用以改變其位於S1-S4 口袋中之任一或多個胺基酸的修 飾會影響蛋白酶對於標靶受質之專一性或選擇性。 表8:對於各種絲胺酸蛋白酶之結構決定基 決定專一性之殘基 S4 S3 S2 SI 171 174 180 215 Cysl68 Cysl82 192 218 99 57 60，s 環 189 190 226 Cysl91C ys220 粒酶B Leu Tyr Glu Tyr 14 Arg Asn He His 6 Gly Ser Arg 否 粒酶A Asn Val Met Phe 17 Asn Leu Ai^ His 7 Asp Ser Gly 是 粒酶Μ Arg Ser Met Phe 15 Lys Ai^ Leu His 8 Ala Pro Pro 是 組織蛋 白酶G Phe Ser Gin Tyr 13 Lys Ser He His 6 Ala Ala Glu 否 MT-SP1 Leu Gin Met Tip 13 Gin Asp Phe His 16 Asp Ser Gly 是 親核性 彈性蛋 白酶 Tyr 5 Phe Gly Leu His 10 Gly Val Asp 是 類糜蛋 白酶 Phe Arg Gin Tyr 12 Lys Ser Phe His 6 Ser Ala Ala 否 阿伐-類 胰蛋白 酶 Tyr lie Met Tip 22 Lys Glu He His 9 Asp Ser Gly 是 貝他-類 膜蛋白 酶(I) Tyr lie Met Trp 22 Gin Glu Val His 9 Asp Ser Gly 是 貝他-類 Tyr lie Met Tip 22 Lys Glu Thr His 9 Asp Ser Gly 是 119 200817517 胰蛋白 酶（II) 胰凝乳 蛋白酶 Tip Arg Met Tip 13 Met Ser Val His 7 Ser Ser Gly 是 Easter Tyr Ser Gin Phe 16 Arg Thr Gin His 14 Asp Ser Gly 是 膠原蛋 白酶 Tyr lie " Phe 12 Asn Ala He His 8 Gly Thr Asp 是 因子Xa Ser Phe Met Trp 13 Gin Glu Tyr His 8 Asp Ala Gly 是 蛋白質C Met asn Met Tip 13 Glu Glu Thr His 8 Asp Ala Gly 是 血装激 肽釋放 酶 Tyr Gin Met Tyr 13 Ai^ Pro Phe His 11 Asp Ala Ala 是 血纖維 蛋白溶 酶 Glu Arg Glu Trp 15 Gin Leu Thr His 11 Asp Ser Gly 是 胰蛋白酶 Tyr Lys Met Trp 13 Gin Tyr Leu His 6 Asp Ser Gly 是 凝血酶 Thr lie Met Trp 13 Glu Glu Leu His 16 Asp Ala Gly 是 tPA Leu Thr Met Trp 15 Gin Leu Tyr His 11 Asp Ala Gly 是 uPA His Ser Met Trp 15 Gin Ai^ His His 11 Asp Ser Gly 是 (a)尿激酶型也纖維蛋白溶酶原活化子（ii-PA) 尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化子（u-PA，亦稱作尿 型血纖維蛋白溶酶原活化子）為使用作為供於本發明方法 挑選之候選者的實例。u-PA列示於SEQ ID NChl90且編碼 如SEQ ID NOH91所列示之前驅物胺基酸序列。u-PA於尿 液、血液、精液及許多癌症組織中發現。其涉及各種生物 學過程，該過程與其將血纖維蛋白溶酶原轉化成血纖維蛋 白溶酶（本身為一種絲胺酸蛋白酶）相關。血纖維蛋白溶 酶在各種正常及致病過程具有重要性，該等過程包括（例 如）透過其裂解各種包括血纖維蛋白、纖連蛋白、蛋白聚 糖、及層黏連蛋白等分子的細胞移位及組織破壞。u-PA涉 及於傷部癒合、炎性細胞移位、新血管生成及腫瘤侵入期 間之組織改建。U-PA亦裂解並活化其他受質，包括（但不 限定於）肝細胞生長因子/散播因子（HGF/SF)、膜第1型基 120 200817517 ’ 質金屬蛋白酶（MT-SP1)之潛伏形式、及其他。 u-P A之成熟形式為411殘基之蛋白質（相當於在SEQ ID NO: 191中所列示胺基酸序列中的胺基酸殘基21至431， 其為含有20胺基酸訊號肽之前驅物形式1 ) 。u-PA含有 三個功能域：絲胺酸蛋白酶功能域、kringle功能域及生長 因子功能域。於人類u-PA之成熟形式中，胺基酸1 _丨5 8代 表N-端A鏈，其包括生長因子功能域（胺基酸丨-的卜匕丨吨卜 ( 功能域（胺基酸50-13 1 )、與功能域間連接區域（胺基酸 132-158 )。胺基酸159-411代表c-端絲胺酸蛋白酶功能 域或B鏈。U-PA係經合成及分泌呈單鏈酶原分子，其由各 種蛋白酶（包括（例如）血纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、 組織蛋白酶B、與神經生長因子_加瑪）轉化成活性二_鏈 u-PA。成為二鏈形式之裂解發生於成熟型u_pA序列之殘 ^ 158與159 (相當於seqidn〇 ΐ9ι中的胺基酸殘基 ” 1 79 )之間。兩所成之鏈係藉由雙硫鍵維持在一起，藉 ( 此形成u-PA之二鏈形式。 ^ P A係藉由結合至高親和性細胞表面受體（uPAR ) 化=周即。υ·ΡA與uPAR之結合增加血纖維蛋白溶酶原活
尸速率並增進胞外基質分解與細胞侵入。u_pA與uPAR / $之雙聯複合體與膜締合性血纖維蛋白；容酶原相互
形成減低對於血纖維蛋白溶酶活化之 即，對受曾> A 化、〃八、近似親和性的動力速率常數）的較高級數活 體（貝斯等人（2002) 7>am，30: 189- 1 9 4 )。此休 ’ u-PA與upAR之結合保護蛋白酶不受藉由 121 200817517 同源抑制子（亦即PAW) 中任-種活性…受PA心二 …全可受PAI_i抑制，然而，pAi=結合之活性 1 之活性Λ子（貝斯等人（2〇〇2)^-知1級，3〇: 处Μ、 3 口果’ 主要於細胞表面執行功能且其功 能與血纖維蛋白溶酶-依|目％ 、 依賴性細胞周圍蛋白分解之活化相 關。 U-PA與心之延展受質專一性（論述於下）類似， 因為该二者皆負責將血纖維蛋白溶酶原裂解成具活性血纖 維蛋白溶酶。U-PA盥t-PA -本m 士人+ ^ ，、t PA 一者對於在pi Arg後之裂解皆 具有同專性，且彼等同樣顯示偏好位於P2位置之小胺 基酸。P3與P4位置兩者對於u_pA及卜pA受質皆為專一 性決定基，其中P3位置具有特別顯著的角色（凱等人（1997) L Biol· Chem·，272: 16603_16609)。對於 P3 位置胺基酸 之偏好很明顯，且為兩蛋白酶間經改變受質區別力的主要 决疋基t-PA對於位於P3位置之芳香性胺基酸（phe與 Tyr)具有偏好，而U_PA對於小極性胺基酸（Thr與Ser) 具有偏好（參見例如，凱等人（1997) j. Bi〇i. chem.，272: 16603-16609 ;哈里斯等人（2〇〇〇)户见97: 7754 7759)。 (b)组織血鐵维蛋白溶酶原活化子（卜pA) 用於本發明方法中供針對蛋白酶誘陷物挑選之候選蛋 白酶亦包括例舉性絲胺酸蛋白酶組織血纖維蛋白溶酶原活 化子（t-PA)，及其變體。t-PA為將血纖維蛋白溶酶原轉化 122 200817517 成血纖維蛋白溶酶（其涉及血纖維蛋白溶解或血塊生成） 之絲胺酸蛋白酶。重組型t-PA於以血液凝塊為特徵之疾病 (例如中風）中用作為治療劑。t-ΡΑ基因之可變剪接產生 三種轉錄產物。佔多數之轉錄產物係列示於SEq ID ν〇·192 且編碼於SEQ ID ΝΟ··193所列示含有20-23胺基酸訊號序 列及1 2- 1 5胺基酸前-序列之前驅物蛋白質。其他轉錄產物 係列示於SEQIDNO:194與196,其等編碼具有分別於SEQ IDN〇:195與197所列示胺基酸序列之前驅物蛋白質。t_pA 之成沾序列（缺少訊號序列與前肽序列）為5 2 7胺基酸。 t-PA係由血管内皮細胞分泌並且以單鏈形式於血液中 循環。不似蜂多其他絲胺酸蛋白酶，t_PA之單鏈或“原酶” 形式具有鬲催化功效。t_pA之活性在血纖維蛋白存在下會 立曰加。無血纖維蛋白存在下，單鏈t_pA相較於二_鏈t-PA 具有約8%活性，然而於血纖維蛋白存在下，單鏈_與二鏈_ t-PA呈現相似的活性。（史坦柏格等人（1995) y， 270: 23444_23449 )。因此，單鏈t_pA之活化可藉由導致 二鏈形式之活化裂解（亦即酶原裂解），或藉由與辅因子 血纖維蛋白結合而完成。活化裂解於經血纖維蛋白溶酶、 組織激肽釋放酶、與經活化因子X於位於Arg275_neη6之 胺基酸（相當於SEQ ID N〇:193所列示胺基酸序列中之 Arg31G-Ile3")之裂解後發生，導致產生卜pA之具活性二
鏈形式。二鏈多肽含有藉由一個鏈間雙硫鍵連接之A與B 鏈。 成熟t-PA含有16個雙硫橋連並經組織成五個不同功 123 200817517 能域（蓋新等人（1988), Γ/ze五脱丄，7: 2731-2740)。成 熟蛋白之殘基4-50形成指狀功能域，殘基5卜87形成類-EGF 功能域，殘基88-175及176-263形成兩個含有三個功能域 間雙硫鍵結之kringle功能域，而成熟分子之殘基277-527 (相當於SEQ ID NO: 193所列示前驅物序列的胺基酸殘基 3 1 1-562 )組成絲胺酸蛋白酶功能域。 相對於u-PA (其作用為細胞受體·結合活化子），t_PA 發揮血纖維蛋白-依賴性循環性活化酵素之功能。同樣，t_ PA之單鏈-與二鏈形式容易受其等同源抑制子（例如PAI-1)抑制’雖然二鏈t-ΡΑ受PAU之抑制較單鏈t_PA快大 約1.4倍（塔奇亞斯等人（1997)夕如〇/以㈣·，272: 1458〇_ 5 ) 。t-PA可藉由與其位於内皮細胞上之細胞結合部位
Annexin-Π結合而變為受保護免於抑制。因此，雖然t_pA 及U PA白裂解並活化血纖維蛋白溶酶原，t_pA於血液中 之作用支持t-P A作為血纖維蛋白溶酶原之主要血纖維蛋白 溶解活化子，而u-PA為血纖維蛋白溶酶原的主要細胞活 化子。 (c) MT-SP1
MT-SP1 (亦稱作基質蛋白酶， 於 SEQ ID
8 5 5胺基酸多肽。 膜-類型絲胺酸蛋白酶 TADG-15， 方法中之挑 經改變受質 胺基酸序列之 白_。MT-SP1之序列列示 於SEQ ID NO·· 253所列示 3其為具有C _端絲胺酸蛋白 124 200817517 酶功能域之多功能域蛋白酶（佛來瑞奇等人（2〇〇2) jw CTzem 277(3):2160 )。已分離得該蛋白酶之683胺基酸變 體’但此蛋白質似乎為經截短形式或外功能域形式。 MT-SP1於前列腺癌、乳癌及結直腸癌中係高度表現 或具活性且其可能在乳癌與前列腺癌之轉移扮演重要角 色。MT-SP1於人類胃腸道及前列腺中亦以高活性且/或表 現水平表現於各種上皮組織。已知有其他物種之MT—spi。 ， 例如，已鑑定得MT-SP1之小鼠同源物並稱之為上皮蛋白 、 (epithin) 〇 MT-SP1含有一個跨膜功能域、兩個cub功能域、四 1又LDLR重複、及一個絲胺酸蛋白酶功能域（或肽酶s丄 功此域）介於SEQ ID NO:253所列示序列之胺基酸615-854 (或615-855，視文獻中的差異而定）之間。MT-SP1經合 成為酶原’並藉由裂解而被活化成雙鏈。此外，單鏈蛋白 分解性功能域單獨即具催化活性及功能。 MT-SP1屬於絲胺酸蛋白酶之si家族（亦稱作胰凝乳 蛋白酶家族），其亦包括胰凝乳蛋白酶與胰蛋白酶。一般， 胰凝乳蛋白酶家族成員與胰凝乳蛋白酶共有序列及結構同 源性。MT-SP 1於本文係根據成熟胰凝乳蛋白酶之編號進 行編號’其中其蛋白酶功能域與胰凝乳蛋白酶之蛋白酶功 能域排列且其殘基亦依此進行編號。基於胰凝乳蛋白酶編 號，活性部位殘基為Asp102、His57及Serl95(相當於SEQ ID NO:253 之 Asp711、His656 及 Ser805 )。可將線性胺基 酸序列與胰凝乳蛋白酶的進行排列並根據胰凝乳蛋白酶之 125 200817517 0折$編號。插入與刪除發生於貝他折疊間之環中，但是 在整個該結構家族中，核心折疊皆為保守。於受質與酵素 之間可此發生至多6個保守氫鍵。胰凝乳蛋白酶家族之所 有絲胺酸蛋白酶於其對於催化活性為必需之蛋白酶功能域 N-立而皆具有保守的區域（亦即，iigg、VVGG或IVGG， 其中於此四聯體之第一個胺基酸係根據胰凝乳蛋白酶之編 唬進行編號，且命名為Ilel6。此編號並未反映前驅物序列 之長度）。 { 一 已經使用位置掃描合成性組合文庫及受質噬菌體展 示，衣作蛋白I#功能域中MT-SP1之受質專一性圖譜（竹 内等人（2000) J 5b/ c/zem 275:26333)。由 MT-SP1 所辨 識受質中之裂解殘基含有位於P4之Arg/Lys與位於p3之 鹼性殘基或Gin，位於P2之小殘基，位於ρι之Arg或Lys， 及位於ΡΓ之Ala。有效受質含有分別位於ρι至p4部位之 Lys-Arg-Ser-Arg。一般，對於MT_spi之受質專一性顯示 ( 一趨勢，藉此若P3為鹼性則P4傾向為非鹼性；及若p4 ^ 為鹼性則P3傾向為非鹼性。已知之MT-SP1之受質包括（例 如）蛋白酶活化之受體-2 (PAR-2)、單鏈uPA (sc_upA)、 MT-SP1原形、及肝細胞生長因子（HGF)，遵照MT_spi專 一性受質之裂解序列。 MT-SP1可與胰蛋白酶同樣有效地裂解所挑選之合成 受質，但是對於受質呈現較胰蛋白酶更受限之專一性。 MT-SP1之催化性功能域具有，類_胰（凝乳）蛋白酶絲胺 酸蛋白酶之整體結構折疊，但是呈現獨特性質例如厭水性/ 126 200817517
酸性S2/S4次-部位及暴露出的6〇環。同樣，MT_spi不會 無差異地於可接近之LyS或Arg殘基裂解肽受質，而需要 易切斷肽鍵周圍之額外殘基的辨識。此延 列之需要強調MT-SP1對其受質之專一性。、二= MT-SP1裂解經蛋白酶活化之受體(pAR_2)(展示
LyS-Gly-Arg之P4至P1標靶序列），該酵素不活化與此 受質密切相關之蛋白質，例如PAR_1、PAR_3及pAR_4,
彼等並不展示吻合靠近易切斷鍵結之延伸MT_spi專一性 的標靶序列（參見佛來瑞奇等人（2〇〇2) jW以⑽ 277(3):2160 )。 MT-SP1之蛋白酶功能域係由前區與催化性功能域組 成。該多肽之具催化活性部分開始於位在成熟蛋白質之胺 基fee 乂基ό 11的自我活化部位以後（參見例如，seq id no. 253位於RQAR其後接殘基VVGG) 。MT-SP1及騰蛋白酶 之S1 口袋，於對於Lys以及Arg P1殘基有良好互補性方 面係類似的，藉此導致與胰蛋白酶在受質裂解方面有某此 相似性。Pl-Lys殘基之順應係由Seri9〇介導，其側鍵提供 用以穩定被隱埋之α -銨基的額外氫鍵受體（佛來瑞奇等人 (2002) / 价〇/ 277(3):2160 ) 。S2 口袋經塑形以順應 P2胺基酸之小到中尺寸的厭水性側鏈且一般接受位於p2 位置之廣泛胺基酸。於受質結合後，由Phe99笨甲基之旋 轉證明S2次部位並不堅硬。位於位置P3 (對於Gln或驗 性殘基）及P4 (對於Arg或Lys殘基）之受質胺基酸似乎 係由在S3與S4 口袋内，與Asp-217及/或ASp_96之酸性 127 200817517 ，側鏈之靜電相互作用所介導，其可能較佳地於彼等接近酵 素活性部裂口時預先定位專一的鹼性受質。？3殘基之側鏈 亦能與Gin192之胺甲醯胺基形成氫鍵，或者p3側鏈可延 伸入S4次部位而與Phe97形成氫鍵，藉此減弱與Gly210之 内-主鏈氫鍵。於任一構型，鹼性p3側鏈能夠較佳地與 MT-SP1 S4 口袋之負潛勢相互作用。來自相$ S4部位之 相互電荷補償與排放解釋在良好MT_Spi受質中位於與 P4之Arg/Lys殘基之同時發生的低可能性。一般，MT_spi ( 造成對於受質結合之延伸專一性的胺基酸位置（基於胰凝 乳蛋白酶編號）包括：46與151 (S1，）； 189、190、19卜192、 216、226 (S1) ; 57、58、59、60、61、62、63、64、99 (S2); 192、217、218、146 (S3) ; 96、97、98、99、1〇〇、168、 169、170、170A、171、172、173、174、175、176、178、 179 、 180 、 215 、 217 、 224 (S4)。 ii.半胱胺酸蛋白酶 ( 半胱胺酸蛋白酶具有涉及半胱胺酸硫氫基之催化機 制。半胱胺酸硫氫基由鄰近組胺酸殘基之去質子作用後接 著該半胱胺酸對肽羰基碳進行親核性攻擊。使新幾基一端 與半胱胺酸硫醇連接之硫酯為該反應之中間物（可比擬絲 胺酸蛋白酶之醯基-酵素中間物）。半胱胺酸蛋白酶包括木 瓜蛋白酶、組織蛋白酶、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶、 與需转蛋白酶（calpain )。 類-木瓜蛋白酶半胱胺酸蛋白酶為以對木瓜蛋白酶之結 構相似性相關的硫醇依賴性内切肽酶。彼等以稱為r與l 128 200817517 (右與左）之功能域形成二功能域蛋白質，而來自二功能 域之環形成受質辨識缺口。彼等具有由胺基酸cys25、 H1S159與Asnl75組成之催化性三聯體。不似基於受質之 貝他-折®構型來辨識並蛋白分解標輕肽之絲胺酸蛋白酶， 此蛋白酶家族不具有供受質辨識之相當確定的口袋。主要 的又貝辨識發生於P2胺基酸（相較於絲胺酸蛋白酶之p工 殘基）。 f 已使用完全多樣位置掃描合成型組合文庫（ps_SCL)測 定一些半胱胺酸蛋白酶（人類组織蛋白酶L、v、k、s、F、 B、木瓜蛋白酶及克魯扎因）之受質專一性。完整的文庫 含有PI、P2、P3與P4四肽受質，其中一位置保持固定而 其他三位置以20種可能胺基酸之等莫耳混合物隨機化， 產生總多樣性為〜1 6 〇，〇 〇 〇四狀序列。 整體而言，P1專一性在組織蛋白酶間幾乎相同，其強 烈偏好Arg與Lys，同時可忍受小的脂族胺基酸。大部分 專-性經發現A P2位置’於該處人類組織蛋白酶對於厭 水性胺基酸具有嚴格選擇性。有意思地，對於厭水性殘基 之P2專-性區在芳香族胺基酸（例如、、丁”與μ (组 織蛋白酶L、V))，及大型脂族胺基酸（例如W盥^ (組織蛋白酶K、s、F))間分開。相較於p2位置，於p3 位置之選擇性明顯較不嚴格。然而有數種蛋白酶對於捕胺 酸（組織蛋㈣V、S與木瓜蛋白酶）、亮胺酸（組織蛋 白酶B)或精胺酸（組織蛋白酶S、“札因）具有不同 偏好。蛋白酶⑨P4位置顯示廣專一性，因為無一種胺基 129 200817517 ' 酸被挑選超越其他。 S2 口袋係蛋白酶受質辨識部位中最具選擇性且特徵被 描述最完全者。其係由位於下列空間位置（木瓜蛋白酶編 號）之胺基酸界定·· 66、67、68、133、157、160 及 205。 位置205扮演與絲胺酸蛋白酶之位置189類似的角色一為 隱埋於決定專一性之口袋底部的殘基。其他專一性決定基 包括下列胺基酸（根據木瓜蛋白酶編號）：61與66 (S3); 19、20及158 (S1)。對於各種半胱胺酸蛋白酶之結構決定 ^ 基係列示於表9。代表性地，半胱胺酸蛋白酶（例如木瓜 蛋白酶）用以改變任一或多個位於延伸專一性結合口袋或 相互作用之其他次級部位的胺基酸之修飾，會影響蛋白酶 對於某標靶受質（包括補體蛋白標靶受質）的專一性或選 擇性。 表9:對於各種半胱胲酸蛋白酶之結構決定基 決定專一性之殘基 活性部位殘基 S3 | S2 S1 25 159 175 61 66 66 133 157 160 205 19 20 158 組織蛋 白酶L Cys His Asn Glu Gly Gly Ala Met Gly Ala Gin Gly Asp 組織蛋 白酶V Cys His Asn Gin Gly Gly Ala Leu Gly Ala Gin Lys Asp 組織蛋 白酶K Cys His Asn Asp Gly Gly Ala Leu Ala Leu Gin Gly Asn 組織蛋 白酶S Cys His Asn Lys Gly Gly Gly Val Gly Phe Gin Gly Asn 組織蛋 白酶F Cys His Asn Lys Gly Gly Ala lie Ala Met Gin Gly Asp 組織蛋 白酶B Cys His Asn Asp Gly Gly Ala Gly Ala Glu Gin Gly Gly 木瓜蛋 白酶 Cys His Asn Tyr Gly Gly Val Val Ala Ser Gin Gly Asp 克魯扎因 Cys His Asn Ser Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gin Gly Asp 130 200817517 Ε·經修飾之蛋白酶舆供筹選之集合 蛋白酶或其變體可用於本發明之方 望受質專-性（最常係改變、增進或最適化之受質專=希
的蛋白_。欲用於本發明所提供方法之經修 J 由將蛋白酶之任一戋多個少 酶可藉 、“…“戍夕個胺基酸使用該項技藝所公知之方 法致犬k而產生（亦參見， 方 2004/0146938 )。用於佟#月士义☆開U.S•申請案號 用於修飾及本發明所提 包括（例如）全長野生型蛋白 酶 或對於催化活性（例如㈣㈣心 分解）係足夠的蛋白酶 片^又 此矢員、丄心飾蛋白酶可個另丨丨斜挪甘 如絲胺酸蛋白酶抑㈣七 ㈣靶蛋白酶誘陷物（例 二 =扭抑制物或經修飾之絲胺酸蛋白酶抑制物） 二:或^可例如藉由使用展示文庫（包括其中蛋白酶 之展不係藉由（例如）嗟菌 " « _ ^巫痛體展不、細胞表面展示、珠粒 展不、核糖體展示、戋豆 篩選。一 之組合文庫）而呈集合形式 師k 對蛋白_誘陷物 i ^ ^ ^ ^ ^ 次a β二修飾形式呈現專一性及/或選 X γ _ 、釔疋之共饧抑制性複合體的形 成），可精由習於該項技蓺人本ρ Λ ^ .. 、技食人士已知之任何偵測流程（包 括（但不限定於）親 析、基於螢光之八拆。 或純化、ELISA、顯色分 翌从、 刀析（例如，螢光猝滅或FRET )、以及 其他）而變為容易。 I變異型蛋白酶之產生 用於突變蛋白_ & ^ ^ 以μ_序列之方法的實例包括在遍及完整序 列上¥致隨機誘變 ^ At , 心石去或造成蛋白酶序列上所選區域或 2之疋焦犬變發生的方法。於-項實例，對蛋白酶所 131 200817517 ll仃之大變數為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 介钱4 15、16、17、18、19或20。於一項較佳實例， 夂賦予i日加的X質專_性。於有些實例，蛋白酶變體之 係車又野生型蛋白酶的活性增加至少1 (M咅、1 〇(M咅或 隱倍。於相關方面，於活性之增加係於受質專一性。 a·随機誘變
Ik機誘k方法包括（例如）使用大腸桿菌XLli^d、uv
了射例如藉由去胺、烷基化、或鹼基類似物誘變劑之化 學修倚、或PCR方法例如DNA改組（dna ―仙叫）、 卡匣誘變、定點隨機誘變或易錯pCR (參見例如，美國申 明案唬2006-01 15874 )。此類實例包括（但不限定於）藉 由經基胺之化學修飾（盧安，Η·等人（1997) 188:35一 39 )使用dNTP類似物（查柯羅，M等人（1996)义 255:589-603 )、或使用市售可得之隨機誘變套組，例如 GeneMorph基於PCR之隨機誘變套組（史塔金 (stratagene )或多樣化隨機誘變套組（克隆技術 (Clontech))。多樣化隨機誘變套組允許藉由變化反應混合 物中錳（Mn2+)與dGTP之量而對於所給定DNA序列之所希 望突變率（從2至8突變/1000鹼基對）挑選。提升錳濃 度首先增加突變率，再藉由增加dGTp濃度而使突變率進 一步增加。甚至可藉由執行額外之PCR回合而達到更高的 突變率。 b.定焦誘變 定焦誘變可藉由在某基因序列之預定區域（例如在介 132 200817517 • 導催化活性之蛋白酶功能域的區域）中造成一或多處突變 而達成。於一項實例，係將蛋白酶之任一或多個胺基酸使 用任何軚準單或多定點誘變套組（例如QuikChange (史塔 金））突變。於另一項實例，係將蛋白酶之任一或多個胺 基酸藉由飽和誘變（曾等人（2〇〇4) 1， 32：115)，例如活化部位殘基之誘變突變。於此實例，係 將形成蛋白酶S1_S4 口袋（於該處該蛋白酶係與肽受質之 P1-P4殘基接觸）及/或已顯示為專一性之重要決定基的殘 v 基突變成每一種可能之胺基酸，單獨或組合地。於有些個 案，在活性部位之S1-S4 口袋間有少的（若有的話）相互 作用，使得各口袋顯示能獨立於其他狗代辨識且結合位於 肽受質序列上之相對應殘基。因此，在一個口袋中之專一 性決定基序通常可被改變而不影響其他口袋之專一性。於 一個例舉性具體態樣中，係使用飽和誘變技術，其中將排 列出口袋之殘基突變成各別20種可能胺基酸（參見例如， 【 Kimkle方法，現今分子生物學之提案（current Pr〇t〇c〇ls in Molecular Biology)，約翰威利父子股份有限公司，Media Pa·)。於此類技術，可合成簡併誘變性寡核苷酸引子，其 位於編碼所選胺基酸之所希望密碼子具有寡核苷酸之隨機 化。例舉性隨機化流程包括NNS_或 NNK_隨機化，其中n 代表任意核苷酸，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶而κ代表鳥嘌呤 或胸腺嘧啶。將簡併誘變性引子黏合至單股DNA模板並 將DNA聚合酶加入以合成該模板之互補股。經接合作用 後，將雙股DNA模板轉型至大腸桿菌中進行擴增。 133 200817517 於本文中描述形成例舉性蛋白酶之延伸受質結合口袋 的胺基酸。一般，可例如藉由基於蛋白酶與受質之複合體 的三維結構之分子模型化而之知蛋白酶之受質專一性（參 見例如，王專人（2001) 少4〇(34): 1〇〇38;賀芬 奈等人，Fo/d 1)以· 1999 7(8):989 ;弗來力奇等人 (2002) J 扪〇/ Chm 277(3):2160 ;瓦烏等人（2〇〇〇) &rwci 扔〇/· 7(9):762 )。例如，MT_spi之定焦突變可位於造成 受質專一性之任一或多個殘基（基於胰凝乳蛋白酶編號）， 其包括95、102、157 (催化性三聯體）；189、19〇、191、 192、216 與 226 (S1) ; 57、58、59、60、61、62、63、64、 99 (S2)，146、1 92、21 7、21 8 (S3) ; 96、97、98、99、1 00、 168、169、170、170A、171、172、173、174、175、176、 178、179、180、215、217、224 (S4)。於另一項實例，於 木瓜蛋白I#豕族蛋白酶之胺基酸殘基突變可於像塑P2專 一性之任一或多個殘基（標準木瓜蛋白酶編號），包括 L 66_68、133、157、160及/或215。此外，不直接與蛋白酶 受質接觸，但影響接觸殘基（例如該等於前述所列示者） 之位置與/或構型的殘基，亦可被突變以改變蛋白酶骨架之 專一性。 於另一項實例，所誘變之定焦胺基酸可藉由與具有相 似文質專一性之同源蛋白酶的比對挑選出。共有胺基酸殘 基可藉由同源蛋白質之胺基酸序列的排比（例如涉及受質 結合之蛋白酶的區域之排比）而鑑定。代表性地，具有相 似受質專一性之蛋白酶共有共同之胺基酸，例如，位於受 134 200817517 質結合口袋之胺基酸在所比對蛋白酶 似。又，可比料目 此相同或相 J比對具有不同受質專一性之蛋白 列以鑑認出可台t、牛 -的胺基酸序 J月b涉及文質辨認之胺基酸。 如三-維模型化蓉太 法可與例 於又合，以於鑑定供誘變之標乾殘基。 初步回合中祜松〜 白轉師選之 隨機誘變之組合 在蛋白駟從經 又犀之師選後’代表性地一 中觀察並篩選到齡徊“勒机” y ;師選方法
巾k到數個熱點位置。最常，因A ^^ μ 廣泛地突蠻茸 夕— 马Ik機誘變 大夂某一多肽序列但是在各部位僅有一此 使用定焦誘變作為箆一插笛政、；* 二大交’故 之熱點位置。相對於"夕十 ⑨d —步誘變 二相對於在某一多肽序列之隨機誘變後所挤斗 的較淺薄的誘變，埶點 x生 置產m 變允許於特殊特定位
突…：深入之突變發生。例如，飽和誘變可用於 又·'、、點，例如藉由於此等位置使用含有NN NNt/c的寡聚物。於—項實例，使用本發明所提供之方法: 3已於U-PA中鑑定出下列造成受質活性增加之熱點：73、80、 30及155(基於胰凝乳蛋白酶編號）。此等位置之突變可 十1】如）#由於一或多個此等位置使用野生型或模板蛋： 酶序歹j之飽和誘變而達成，以產生欲被使用於後續筛 蛋白酶突變型集合。 2·變異型蛋白酶之丧合形式 Μ本發明所提供之變異型蛋白酶可包括嵌合型或融合蛋 白質。於一項實例，蛋白酶融合蛋白可包含蛋白酶蛋白之 至少一個具催化活性部分。於另一項實例，蛋白酶融合蛋 135 200817517 蛋白酶之至少二或多個具催化活性部分。於融合蛋 =中’非蛋白酶多肽可融合至蛋白酶多肽端或c_端。 =具體態樣，融合蛋白可包括柔性連接狀或間隔物， ::二白酶與非-蛋白酶多肽分開。於另一項具體態樣，融 :可包括標戴或可偵測多肽。例舉性標籤及可偵測蛋 白為該項技藝已知，且包括例 限疋於）組胺酸標 ，旋木素標籤、亭標籤或螢光蛋白。於又另一項且 體態樣，融合蛋白為GST-蛋白酶融合蛋白，其中蛋白酶； 列係融合1 GST (麩胱甘月太S-轉移酶）序列之N-端。此 類融合蛋白可助於重組蛋白酶多狀之純化。於另一項呈體 Μ ’融合蛋白為Fc融合蛋白，其中蛋白酶序列係融合 至知自免疫球蛋白G之Fc功能域的N•端。此類融合蛋白 可具有較佳之活體内藥物動力學性質。於另一項具體態 樣融合蛋白為於其N-端含有異源性訊號序列之蛋白酶蛋 白。於某些宿主細胞（例如哺乳動物宿主細胞），可透過 使用異源性訊號序列增加蛋白酶之表現及/或分泌。^ ，蛋白酶嵌合型或融合蛋白質可藉由標準重組Dna技 術製付。例如，將編碼不同多肽序列之DNA片段根據習 知技術以符合框架之方式接合在一起，該技術為例如藉由 使用供黏接之鈍端或交錯端，提供適當末端之限制酵^分 解，若適當之黏性末端補平，避免不希望接合之鹼性磷酸 酶處理，及酵素性接合。於另一項具體態樣，融合基因可 精由習知技術（包括自動化DNA合成儀）合成。或者， 可使用於二連貫的基因片段間產生互補突出（其後續可經 136 200817517 .黏合及再擴增而產生嵌合型基因序列）之錯定引子，來完 成基因片段之PCR擴增（參見，例如奥司貝爾等人（eds) 現今分子生物學之提案，約輪威利父子，1992 )。而且， 市售可得許多已編碼融合部分（例如GST多狀）之表現載 體。蛋自酶-編碼性核酸可被選殖至此類表現載體中，以使 該融合部分以符合框架之方式連接至蛋白酶蛋白。 3·组合文庫舆其他文庠 供篩選分析之化合物來源，可為諸如文庫之集合，而 f 文庫包括（但不限定於）組合文庫。用於合成組合文庫之 方法及此類組合文庫之特徵為該項技藝已知（一般，參見 故合艾亀：合成、篩選及應用潛能、c〇mbinat〇rial UbrarUs 夂*Scram 叹⑽d 却科提斯別） 瓦特迪格魯特，Inc·，1995 ;提徹與李柏，cwr 0pz>2. 万ζ·ο/。2(3):363_71 (1998);藍，^ , 12(3):145-67 (1997);布藍尼與馬丁，Cwrr 仏〇/ , 1(1).54-9 (1997)，及舒茲與舒茲，方化加办⑽/ ， 12(6):729-43 (1996))。 已使用分子生物學方法與/或同時化學合成方法，發展 出用於產生多樣文庫（包括蛋白酶或酵素文庫，包括位置 掃描合成組合文庫（PSSCL))之方法及策略（參見例如， 喬治歐寺人（1997) jVd 5/oiec/zeo/· 15:29-34;金姆等人 (2000) 66: 788 793 ;麥可]；匕斯 G p 等人（1998) 279:1958-1961 ;舒米里恩，p L 等人 (1994) dpp/· 5ic^/2em· 5沁iec/mo/· 47:175-189 ;王，c j 等 137 200817517 尺（1996). Methods Enzymol. 267:52-68 ; U.S.專利 6,867,010> 65 1 685919^U.S.#^ ^ If t No. 2006-0024289) 〇 所成之組α文庫可旎含有數百萬化合物，其可經篩選而鑑 S忍出呈現所挑選活性之化合物。 於一項實例，可將蛋白酶集合或文庫之組成展示於遺 傳包裝’丨包括（但不限定於）任何能展示多肽部分之可 複製載體’例如噬菌體、病毒或細菌。多數經展示多肽係 由遺傳包裝以允許多肽（例如蛋白酶或其具催化活性部 分）與標多肽結合及/或相互作用之方式展示出。例舉性 遺傳包裝包括（但不限定於）嗤菌體（參見例如，克拉森 等人（1991)使用嗟菌體展示文庫製造抗體片段，勤_， 352:624-628 ;葛雷瑟等人（1992)藉由密碼子為底之誘變於 絲狀噬菌體載體系統進行之抗體設計，乂 f 903則；胡根布等人〇991)絲狀嗟菌冑*面之多次， 單位蛋白：用於展示抗體（Fate)重與3G輕鏈之方法，勤以❿ 19:4133_4137〇)、桿狀病毒（參見例如 克等人（ 1 995)真核病毒展示：以銀紋夜蛾核多角體病毒 UCNPV)之主要表面糖蛋白設計用於在病毒表面展現外來 蛋白質，扪13:1〇79-1〇84 )、細 、 於展示蛋白質（例如喔菌體_所展示蛋白酶）之載 所興趣之噬菌體實例包括（但不限定於）T4 一 — 巫囷體、Μ1 7 噬&體與m *菌體。視需要地，將遺傳包裝例 宿主中進行擴增。任一此等遺傳包裝以及任何其他習於： 項技藝人士已知者，係用於本發明所提供方法中，、w 以展示 138 200817517 蛋白酶或其具催化活性部分。 a·嗔茜Λ展示文庠 用於篩選之變異型蛋白酶或其具催化活性部分的文 庫’可經表現於表面噬菌體例如（但不限定於）Μ1 3、fd、 fl、T7及λ嗟菌體上（筝見例如，桑提尼（1998) 乂 282:125-135 ;羅森柏格等人（1 996) /心似 6:1·6 ;豪 許叉得等人（1999) ha/ 268:363-370 ;贊格希等人 (2005) 7?以· 33(18)el60:l-8)。變異型蛋白酶可 1 以共饧、非共價或非肽鍵融合至嗟菌體外套蛋白（參見例 如，U.S· Pat. No. 5,223,409，克拉梅利等人（1993) Gew 137:69及WO 01/05950 )。可將編碼變異型蛋白酶之核酸 與編碼外套蛋白之核酸融合以產生蛋白酶_外套蛋白融合蛋 白質’其中變異型蛋白質係表現於噬菌體之表面上。此外， 融合蛋白質可包括柔性連接肽或間隔物、標籤或可偵測多 肽、蛋白酶部位、或用以增進融合蛋白表現及/或利用之額 〃外胺基酸修飾。例如，添加蛋白酶部位可允許在挑選程序 後有效回收所希望的噬菌體。例舉性標籤與可偵測蛋白為 4項技藝已知，且包括例如（但不限定於）組胺酸標籤、 血凝集素標籤、myc標籤或螢光蛋白。 σ巫菌體展示經描述（例如）於拉得納等人，U S· pat. N〇. ’ 23,409’ 維迪專人（2002) Cwrr. (9ρζ·/7· C/zem. 5ζ·ο/· 6:92_ 96 ’ 史密斯（1985) 228:13 15-1317 ; WO 92/18619 ; WO 91/17271 ； WO 92/20791 ； WO 92/15 679 ； WO 93/01288 ； WO 92/01047 ; w〇 92/〇969() ; w〇 9〇/〇28〇9 ;迪哈得等人 139 200817517 • (1999) 5ζ·ο/· C/zem 274:18218-30 ;胡根布等人（1998)
Immunotechnology 4:1-20 ;胡根布等人（2000) Immunol
Today 2:371 _8 ;富克斯等人（1991) AWrec/mo/og；； 9:1370-1372 ;海等人（1992) i/wm 3:81-85 ;胡 斯等人（1989) Sc/mm 246:1275-1281 ;格里菲斯等人（1993) 五M50 J 12:725-734 ;霍金斯等人（1992) J Μο/ 5ζ·ο/ 226:889-896;克拉森等人（1991) TVaiwre 352:624-628;格 拉姆等人（1992) P见89:3576-3580加勒德等人（1991) Γ 9:1373-1377 ;雷巴爾等人（1996) ―叮mo/· 267:129-49 ;胡根布等人（1991) Λ/W AM 及以 19:4133-4137 ;及巴貝斯等人（1991) PAMS 88:7978-7982。 適用於噬菌體展示（例如噬菌體載體）之核酸為該項 技藝已知（參見例如，安得里斯-威赫夫等人（2〇〇〇) j Immunol Methods, 28: 159_81 ;阿姆斯壯（Armstrong )等 人（1996)學院出版（Academic Press)，凱（Kay)等人 Ed. pp.35-53，柯瑞等人（1993) Gwe 128(1):129-34 ;奎爾拉等 (^ ' I 人（1990) /Voc TVa" dcW [/M 87(16):6378-82 ;福克斯 等人（1992)万ζ·ο加/mzjwa 13(3):422-8 ;胡根布等人（1991) AM 19(15):4133-7 ;麥卡弗帝等人（199〇) TVWz/m 348(6301):552-4 ;麥康奈爾等人（1994) Gwe 151(1-2):115- 8，史考特與史密斯（1990) 249(4967):386_90)。 編碼蛋白酶-外套蛋白融合蛋白之核酸文庫可併入噬菌 體基因組’或者插入嗟菌粒（phagemid )載體中。於嗟菌 粒糸統中’係將編碼展示蛋白質之核酸提供於嗟菌粒載體 140 200817517 曹 上’代表性地長度少於6000核苷酸。噬菌粒载體包括嗟 菌體複製起點，令質體能在攜帶質體之細菌細胞被輔助噬 菌體（例如M13K01或M13VCS)感染時併入噬菌體顆粒 中。然而，噬菌粒缺乏可於感染後製造穩定噬菌體顆粒之 足夠噬菌體基因組合。此等噬菌體基因可由辅助噬菌體提 供。代表性地，輔助噬菌體提供基因ΙΠ外套蛋白之完整 副本及其他供噬菌體複製及組裝所需的噬菌體基因。因為 辅助噬菌體具有缺陷型複製起點，故輔助噬菌體相較於具 有野生型起點之質體無法有效併入噬菌體顆粒中。參見例 如，U.s· Pat· No· 5,821，047。噬菌粒基因組含有可挑選標 記基因，例如Amp.sup.R或Kan sup R (分別代表胺苄青 霉素或肯納霉素抗性）以用於挑選出已受文庫成員感染i 細胞。 於另一噬菌體展示實例，可使用帶有編碼—組足以在 表現時製造感染性噬菌體顆粒之噬菌體基因的核酸、噬菌 體包裝訊號、及自我複製序列之載體。例如，載體可為已 經修飾而包括編碼展示蛋白之序列的噬菌體基因組。噬菌 體展示載體可進-步包括可插入外來核酸序列之位點，例 如含有限制酵素消化部位之多重選殖部位。外來核酸序列 (例如，編碼噬菌體載體中之展示蛋白質者）可被連結至 核糖體結合位點、訊號序列（例如M13訊號 ： 錄終結子序列。 ）及轉 載體可藉由標準選殖技術構築得以含有編石馬包括 酶與嗟菌體外套蛋白的部分之多肽的序列，且其可操作地 141 200817517 連接至可調節啟動子。 ^ ;有~貝例，噬菌體展示载體包括 兩&編碼噬菌體外套蛋 匕括 #雜勺& , 蛋白之相同區域的核酸序列。例如， 載體包括-個編碼位於可操作性 序列的位置的如此區域之序…扁馬該展不蛋白之 ^序列，與另一個編碼位於編碼外 套蛋白之功能性噬菌體基 α (例如，野生型噬菌體基因） 的丽後文之如此區域之序 J 野生型及融合外套蛋白二者 之表現可助於藉由降低签咩共 一 辛低母巫讀體顆粒所製得之融合蛋白量 來製造成熟嗟菌體。此類方、么 此頦方法尤其可用於其中該融合蛋白 較不受噬菌體容忍之情況。 嗤菌體展示系統代表性地利用絲狀㈣體，例如m i 3、 fd與fl。於有些使用絲狀嗤菌體之實例，係將展示蛋白融 合至外套蛋白銷定功能域。融合蛋白可與另一種具有相同 錨定功能域之多肽（例如野生型外套蛋白或其内源性副 本）共表現。可用於蛋白質展示之噬菌體外套蛋白包括G) 絲狀噬菌體之次要外套蛋白，例如基因ΠΙ蛋白質化川…， 及（ii)絲狀噬菌體之主要外套蛋白，例如基因νιπ蛋白質 (gvnip)。亦可使用與其他噬菌體外套蛋白 ν 蛋白質、基因vn蛋白質、或基_蛋白質)二合基體因(： 見例如，WO 00/71694 )。 亦可使用此等蛋白質之部分（例如，功能域或片段）。 可用之部分包括穩定併入噬菌體顆粒中，（例如）以使融 合蛋白能在挑選程序全程保留於該顆粒中之功能域。於_ 項實例，係使用glllp之錨定功能域（參見例如，U s.pat Ν〇. 5,658,727及下述實施例）。於另一項實例，係使用gVnIp 142 200817517 (參見例如，U.S. Pat. No· 5,223,409 )，其可為天然、全 長gVIIIp經融合至展示蛋白質。絲狀噬菌體展示系統代表 性地使用蛋白酶融合蛋白，以將異源性胺基酸序列接附至 噬菌體外套蛋白或錨定功能域。例如，噬菌體可包括編碼 訊號序列、異源性胺基酸序列、與錨定功能域（例如，glllp 錫定功能域）之基因。 可藉由選擇噬菌體外套蛋 之價數。例如’ glllp蛋白代表性地係以每病毒顆粒三至五 副本併入噬菌體外套中。因此，Glllp與變異型蛋白酶之 融合產生低價數。比較上，gVIIIp蛋白代表性地係以每病 毒顆粒2700副本併入噬菌體外套中（馬文（1998) 办以 汾⑼以.仏〇/. 8:150·158)。由於gVIIIp之高價數，超過十 個殘基之肽通常無法為噬菌體所忍受。噬菌粒系統可用於 增加噬菌體對較大型肽類之耐受性，其係藉由提供外套蛋 =之野生型副本以減少融合蛋白之價數。此外’可使用經 最適化用於較大型肽類的表現之gVIIlp變體。於—個此類 實例’係於針對具有經改善表面展示龍 篩選獲得變異型gVIIp。 P㈣炎 亦可使用可調節啟動子來押舍 ,卞木徑制展不蛋白之價數。受調 即表現可用於製造具有低價數展/ 士闲π，Μ , 其㈡心巫囷體。許多可
凋即（例如可誘導及/或可阻 了夕J 序列包括)文動子序列為已知。此類 斤幻匕括其活性可經由使用者 (例如㈤厣、—π 丨入（例如藉由環境參數 C例如飢度）之操縱，或藉由刺激 数 分子之移除）而被+之添加或阻抑子 Μ即的可調節啟動子。例如，可 143 200817517 加入外源性化學化合物 啟動子可含有對於—或多：：某些啟動子之轉錄。可調節 合部位。可構筚得复：紅#錄活化子或阻抑子蛋白之結 子，且其亦可二二轉錄因子結合部位之合成型啟動 子包括對環境參數(例如= = 可調節啟動 抗生素、或化學藥劑）且 ，代謝物 之可調節啟動子包括含有He啟動子。適心大腸桿菌
縱序列（或操縱子）之轉錄 2冲、〜與 磷酸酶啟動子㈣、阿：：“位的啟動子、驗性 子、鼠李糖啟動子、啟動子：：動子，例…AD啟動 動子本身、或其具功能性片段（參 ::如’艾爾文等人(199〇) 一:123·ΐ26 :塔柏與杳理 林0998)户⑽.缝心从1〇74_1〇78 ;張等人 (6) 44. 121-125 ;盧兹與布雅得（1997)心/ ^油 版 25: 12〇3-12H);D. V 喬得爾等人〇979)pr Wi 知U」.，76:106-1 10; j. D·溫道斯等人（1982)細ϋ ^ ’ 1〇:6639-57 ; R•克勞爾等人（1985) G⑽，38:31-38 ;布 羅斯（1984)(^27:161_172;安曼納與布羅斯（1985)^ 4〇: 183-190 ;古茲曼等人（1992) ^ 心以⑺·〇/，174: 7716_ 7728 ’ 哈迪曼等人（1998) / ，18〇: ι277 ΐ286)。 例如’ he啟動子可被乳糖或結構上相關之分子（例 如異丙基-貝他-D-硫代半乳糖苷（IPTG))誘導而受到葡萄 糖阻抑。有些可誘導啟動子係由去阻抑（例如阻抑蛋白分 子之去活化）所誘導。 可調節啟動子序列亦可經間接調節。可經設計用於間 144 200817517 接調節之啟動子實例包括 SP6及Τ5啟動早孤。PR PL、"ii菌體Τ7、 該調節序列係由其表現（例如、 數調節之因子阻抑或活化。此類啟動子之藉 例…動子。〜聚合酶之表現可受；^實 啟動子（例…動子)調節.例如，細:;=應- f包括編…Μ聚合酶之序列與受環境參IS —種 郎序列（例如/啟 ^ 。即之调 之活性亦^ 異源性核酸。T7RNA聚合酶 ㈠又RNA聚合酶之天然抑制子 之存在調節。 1 /心囷酶） 藍答以被設計以受環境參數調節。例 序列二IT包括編碼藍答阻抑子之溫度敏感性變體的核酸 田胞升高至非-許可溫度會從阻抑釋出匕啟動子。 子或轉錄調節序列之調節特性可容易地 =子或序列可操作性連接至編碼報導蛋白（或任何可偵 蛋白）之序列而進行測試。將此啟動子_報導子融合、導 ^㈣胞’心性地在質體或載體中’並於各種環境條 -::估1'導蛋白之豐富度。可用之啟動子或序列為於特 疋ir、件下被選擇性活化或阻抑者。 於有些具體態樣，係使用非·可調節啟動子。例如 挑選於有關條件下產生適當量轉錄之啟動子。非·可調節啟 動子之一種實例為gin啟動子。 p b·細胞表面展示文庫 用於篩選之變異型蛋白酶文庫 平』、、工衣現於細胞（例 如’原核或真核細胞）表面上。用於 上用於細胞表面表現之例舉 145 200817517 鲁 性細胞包括（但不限定於）細菌、酵母、昆蟲細胞、鳥類 細胞、植物細胞、及哺乳動物細胞（陳與喬治歐（2〇〇2) 79: 49卜5〇3)。於一項實例，用於表現 之細菌細胞為大腸桿菌。 變異型蛋白酶可經表現呈具有表現於細胞表面之蛋白 質（例如膜蛋白或表面-締合蛋白）的融合蛋白質。例如， 變異型蛋白酶可於大腸桿菌中經表現呈具有大腸桿菌外膜 蛋白（例如OmpA)、主要大腸桿菌脂蛋白（Lpp)與外膜蛋 白〇mpA之遺傳上經設計雜合分子、或表面-締合蛋白（例 如線毛及鞭毛次單位）的融合蛋白質。一般，當細菌外膜 蛋白用於異源性肽類或蛋白質之展示時，其係透過基因插 入載體蛋白之許可部位而達成。異源性肽類或蛋白質之表 現係取決於所插入蛋白功能域之結構特性，因為肽類或蛋 白貝在插入终可部位時相較於在蛋白質N _或c -端融合更 受限制。可對融合蛋白進行修飾以增進該融合蛋白之表 現，例如柔性連接肽或間隔物之插入、細菌蛋白質之修飾 1 (例如藉由於胺基酸序列的突變、插入或刪除）。酵素， 例如β-内醯胺酶與肥料纖維單胞菌⑽㈣似 之Cex外葡聚糖酶，已成功於大腸桿菌表面表現呈 〇mPA融合蛋白質（法藍斯可J A.與喬治歐G· y㈣r 745:372 - 382 (1994)及喬治歐 G·等人 五叹. 9·239-247 (1996))。其他具有15·514胺基酸之肽類已展 不於OmpA表面之第二、第三與第四外環中（山謬爾森等 人汄价〇化以⑽/· 96·· 129-154 (2002))。因此，外膜蛋白能 146 200817517 攜帶異源性基因產物並展示於細菌之外表面上。 於另一項實例，變異型蛋白酶可經融合至諸如淋病奈 瑟氏球菌（TV· ) IgAl蛋白酶、黏質沙雷氏菌 (iSerraik marcacew )絲胺酸蛋白酶、弗氏志贺氏菌 (57n_ge//a //exwr/ ) VirG蛋白及大腸桿菌黏附素AIDA-I 等蛋白質之自我運轉蛋白功能域（克拉瑟等人j.
1991 —1999 (1990);志方 S 等人 /5/(^/2^.1 14:723-731 (1993);鈐木丁等人/价〇/(7/2請.270:30874-30880 (1995); 及穆瑞爾J等人J 179:794-804 (1997))。其他 自我運轉蛋白包括該等存在於革蘭氏陰性菌種（例如，大 腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌（心/w_//a ser_r )與弗氏志賀氏菌）者。酵素（例如β内醯 胺酶）已成功使用此系統表現於大腸桿菌表面上（拉特曼 CT 等人 J 182(13): 3 726—3733 (2000))。 細菌可經重組設計而表現融合蛋白質，例如膜融合蛋 白質。可將編碼變異型蛋白酶之核酸與編碼細胞表面蛋白 質（例如，但不限定於細菌0mpA蛋白）之核酸融合。可 將編碼變異型蛋白酶之核酸插入膜蛋白之許可部位，例如 膜蛋白之胞外環中。此外，可將編竭變異型蛋白酶之核酸 融合至編碼標籤或可㈣蛋白之核酸。標籤及可偵測蛋白 為該項技藝已知，且包括例如（但不限m组胺酸標鐵、 血凝集素標籤、myc標籤或螢光蛋白。可將編碼融 =Γ作性連接至供於細菌中表現之啟動子。例如可 將核^插入可攜帶用於融合蛋白的表現之啟動子及視需要 147 200817517 也么挑選（例如對抗生素抗性）之額外基因的載體或質體 中可以此類質體轉型（例如藉由電穿孔或化學轉型轉型） 細菌。此類技術為習於該項技藝人士已知。 一位於外膜或周質間隙之蛋白質通常係呈不成熟蛋白質 -成；、、、田i貝中，其於訊號序列處裂解而產生被送至細胞 質外面之成熟蛋白質。用於大腸桿菌之重組蛋白之分泌性 襄ie之例舉性汛號序列為已知。當所興趣基因正確融合至 訊號序列時，可於以訊號肽酶裂解後獲得不含延伸之 N-端胺基酸序列。因此，可於未改變所興趣蛋白質之胺基 酸序列下製得成熟蛋白（邱與李义仲/ 64: 625-635 (2004))。 其他細胞表面展示系統為該項技藝已知且包括（但不 限定於）基於冰成核蛋白（Inp)之細菌表面展示系統（李比 特 J Μ (1998) 16: 576 80 )、酵母展示（例 如與酵母Aga2p胞壁蛋白融合；參見u s. pat. 6,423,538 )、昆蟲細胞展示（例如桿狀病毒展示；參見耳 斯特等人（1998) Nucleic Acids Research，Vol 26，Issue 7 1718-1723 )、哺乳動物細胞展示、及其他真核細胞展示系 統（參見例如，5,789,208 與 WO 03/029456 )。 e·其他展示文庫 亦可能使用其他用於篩選變異型蛋白酶文庫之展示形 式’例如其變異係如本文所述設計之文庫。例舉性其他展 不形式包括核酸-蛋白質融合物、核酶展示（參見例如漢斯 與普拉克斯（1997) iVd/· hd· &/· t/U. 13:4937_ 200817517 4942 )、珠粒展示（拉姆，κ· s.等人#(1991) 354, 82-84 ;霍頓，R· α·等人（1991) iVaiwre，3 5 4, 84-86 ;弗卡，Α· 等人（1991) /此J.户〜化〜及以37, 487-493;拉姆，Κ· S·等人（1997) Chm· hv·，97，41 1-448 ; U.S·已公開專利 申请案2004-0235054 )及蛋白質列陣（參見例如卡席爾（2001) J. Immunol. Meth. 250:81-91 ^ WO 01/40803 ? WO 99/51773 及 US2002-0192673-A1)。
於特別其他個案，作為替代的，將蛋白酶、變異型蛋 白酶、或具催化活性部份或噬菌體文庫或細胞表現之變異 型蛋白酶接附至固體撐體上係有利地。例如，於有些實例， 細胞表現之變異型蛋白酶可自然地吸附於珠粒上，以使珠 粒族群之每一株粒含有單一細胞（弗利曼等人Βί〇α^η〇ι· Bioeng. (2004) 86:196-200 )。經固定至玻璃撐體後，可使 楗集洛生長並以顯色或螢光生成受質篩選。於另一實例， 可將臭異型蛋白酶或嗟菌體文庫或細胞表現之變異型蛋白 酶排列至滴定平盤中並固定之。 F•接觸、分離及鐘認所挑選蛋白酶之方法 ^待已選擇並製備得多數展示蛋白酶或其具催化活性部 份之集合或文料，將料文庫詩使標&蛋白酶誘陷多 :與蛋白酶組成接觸。將標靶受f(包括例如蛋白酶誘陷 々纟於其RSL %中經突變以具有所希望裂解序列之絲 女酸蛋白酶抑制物）與用於挑選具有經改變受質專一性之 :白酶的所展示蛋白酶文庫接觸。蛋白酶與蛋白酶誘陷多 了於懸洋液、溶液中、或經由固體撐體接觸。組成係接 149 200817517 觸對於結合發生以及對於後續裂解反應及所筛選蛋白酶與 蛋白酶誘陷多肽之穩定中間複合體之形成的足夠時間、溫 度或浪度。可藉由改變一或多種選自反應溫度、蛋白酶誘 陷多肽抑制子濃度、競爭劑（若有包括）濃度、混合物中 蛋白酶集合之濃度、及培育時間長度之參數而調節藉其維 持反應之嚴可度。 捕捉並分離出所篩選得與蛋白酶誘陷多 肌艰成共價複
合體之蛋白酶。為有助於捕捉，用於對其篩選之蛋白酶誘 陷多肽（若適於該項分析方法）可提供於溶液、於懸浮液 中或接附至固體撐體上。例如，可將蛋白酶誘陷多肽接附 至固體撐體，例如一或多種珠粒或粒子、微球體、導管戋 平盤表面、濾膜、及其他該項技藝已知之固體撐體上。例 舉性固體撐體系統包括（但不限定於）由（例如）玻璃、 二氧化⑨、金屬、尼龍、纖維素、塑膠或複合材料構成之 平坦表面，包括多孔平盤或膜；或可呈珠粒例如矽膠、控 制孔玻璃、磁性（Dynabead)或纖維素珠粒之形式。此類 方法可改造以用於懸浮液或呈管柱之形式。可將標靶蛋白 酶誘陷多肽直接或間接附著於固體撐體，例如聚丙烯醯胺 朱粒上，、偵或非共價方法可用於接附。接附標靶化合物 之共價方法包括化學交聯方法。反應性試劑可於位於標靶 勿子與樓體上之官能基間產生共價鍵。可被化學地反應之 官能基實例為胺基、硫醇、及幾基。N_乙基順丁稀二酿亞 胺〃乙駄胺、氫琥珀醯亞胺、及戍二醛為與官能基反 應之u的貫例。於其他實例，可將標靶受質藉由例如（但 150 200817517 不限定於）免疫親和性或配體_受體相互作用（例如，生物 素-鏈Μ抗生物素或麩麩胱甘肽s_轉移酶_麵麵胱甘肽）之 方法間接接附至固體撐體上。蛋白酶誘陷多肽至固體撐體 之接附可於S f與變異型蛋白酶或嗤菌體文庫或細胞表現 之變異型蛋白酶的接觸之前、期間或之後完成。例如，可
將私靶文貝在與變異型蛋白酶培育之前，預先吸附至固體 撐體，例如層析術管柱上。於其他實例，固體撐體之接附 可於標靶受質被結合至變異型蛋白酶之後完成。 於此類實例，含有已複合受質-蛋白酶對之固體撐體可 被/月洗以去除任何未結合之蛋白酶。可藉由習於該項技藝 人士已知之任何方法（例如藉由以稀酸處理，隨後再中和 (福等人（1997) J 272:25678-25684 )，或以三 乙胺處理（奇斯威爾等人（1992) Trends Bi〇techn〇i ι〇抓 84))❿將複合體從固體撐體回收。&步驟可被最適化以 確保展示來源從固體受f之可再現與定量回收。例如，可 獨立地使用習於該項技藝人士已熟知之Μ (例如藉由使 用對抗該噬菌體，例如對抗Μη噬菌體之抗體（例如 England Bialabs，ΜΑ)及標準EUSA)監測展示來源與接 附至固體撐體之標靶受質的結合（參見例如奥司貝爾等人 (1987)現今分子生物學之提案，約輪威利父子， 。 另一種捕捉及分離受質_蛋白酶複合體之方法係從溶 液代表I*生地於此類方法，係將蛋白酶誘陷多狀或其變 體與蛋白酶集合於（例如、體積之適當結合緩衝液（亦 即，20 、 30 、 40 、 50 、 6〇 、 7〇 、 8〇 、 9〇 、 1〇〇 、 2〇〇 、 3⑽、 151 200817517 400、500或更多微升）中挺 接觸，其中各蛋白酶誘陷多肽係 與預定之標記物、標籤、或其他用於其鐘認及分離之可债 測部分缔合。可_部分以任何有助於受f蛋白酶複合 體的傾測及/刀離之部分。例如，該部分可為對其存在有對 於該標籤具專-性之抗體的表位標籤（亦即標鐵、 His-標叙、或其他）0於
紙兄八他）抗體可結合至固體揮體（例如珠粒） 上以助於該穩定的複合體之捕捉。可使用其他類似策略且 包括（例如）以生物素標記標無受質，並使用經接附至諸 如磁性珠粒或微量滴定平盤等固體撐體之鏈黴抗生物素捕 捉或者以聚組胺酸（例# His 6_標籤）標定並使用金屬餐 合劑（例如（但不限定於）硫酸鎳（Nis〇4)、氯化鈷（c〇ci2)、 硫酸銅（CuS〇4)或氯化辞（ZnCl2))捕捉。可將捕捉劑與大 型珠粒（例如瓊脂糖珠粒）偶合，藉此可容易地藉由離心 來達成經結合珠粒之分離。或者，可將捕捉劑與較小型珠 粒（例如磁性珠粒（亦即Miltenyi Bi〇tec)，其可容易地 使用磁性管柱分離）偶合。此外，該部分可為螢光性部分。 例如，於有些展示系統（例如細胞表面展示系統），螢光 標記可助於藉由螢光活化細胞分選（FACS ;參見例如，雷 文專人（2006) Molecular BioSystems，2: 49-57)而分離出所 挑選得之複合體。 於有些案例，係將一或多種不同蛋白酶誘陷多肽係與 蛋白酶集合接觸，其中各蛋白酶誘陷多肽係與不同偵測部 分締合，以使能個別分離出一或多於一種蛋白酶誘陷多肽 〜蛋白酶複合體。能夠於單一反應中包括1、2、3、4、 152 200817517 6 7 8 9、10或更夕種不同蛋白酶誘陷多肽（盆各具有 不同之所希望RSL裂解序列）之能力允許同時㈣及㈣ 出成千上百種共價性複合體。 可將攸蛋白酶集口挑選得之經結合蛋白酶擴增以助於 鑑認所挑選蛋白酶。待除去任何未結合至蛋白酶誘陷多狀 „結合組成後’將蛋白酶所展示至之物質的來源（亦 增及表現。一般，在盘宿主y t適“、、、田胞中進行擴 ί /、主、、、田胞培育以允許噬菌體吸附後， ' 將小體積營養液體培養基加入，並#勤换、 體探針DNA於增殖宿主中見7 W幫助嗤菌 基以抗生素及製。經此培以，將培養 f " 充。耗體蛋㈣基因組亦可含 有、，扁碼對抗生素抗性之基因以允許選擇性生長 囷體蛋白酶DNA之細菌細胞。 ’、巫 之垆 展不末源（例如細菌宿主） 如Γ二中方式最適化。例如，添加至分析材料(例 h克里孔中）之細菌量，可 耗體來源，藉此確保嗟菌體二：°步驟回收得之 、 、ee 木巫囷體基因組之定量性鑪道 ^ - 廷噬菌體時，可視需要地測。· 展示來源之其< 政羊。擴增步驟擴增 所締合之指名如w體基因組）’允許過度表現 心名夕肽並（例如藉由簡A定序）鐘定之。 可使用淘選方法，藉此快速 如蛋白酶誘陷多肽或其㈣變體結合之蛋;=質，例 活性部份。淪、登及，， < 蛋白輕或其具催化 體-展示蛋白酶藉由將嗟菌體句肽（例如嗟菌 將未結合之嗟菌體洗除，並溶^白貝心 丨®寻性結合之噬菌 153 200817517 =行並然後將已溶析之喔菌體擴增（例如經由感染宿 γ進仃額外的淘選與擴增循環以連續富增對標靶多 肽具二最高親和性之噬菌體匯集。經數回合後，例如藉由 财疋序鐘定各別選瘦株，並可例如藉由下文段落G中所 列示之方法测量其活性。 旦鑑疋出所挑選得之蛋白酶後，可將其從展示來 、、屯化亚測式其活性。此類方法包括一般重组dna技術且 對於習於該項技藝人士係例常所進行的。可將來自展示來 :之載體（含有蛋白酶DNA)分離以能夠純化得所篩選之 蛋白質。例如，在大腸桿菌宿主以如上所列述之所挑選噬 ^體感染後，可挑出各別純株並增量生長，以供使用習於 '亥項技藝人士已知之任何方法進行質體純化，且若需要可 (例如）使用中量質體純化套組（奎爾金卿））大量製 備。經純化之質體可用於_定序以鑑定變異型蛋白酶 之序列，或可用於轉染至任何供表現之細&，例如（但不 限疋於）哺乳動物表現系統。若需要’可完成一或二-步驟 咖以擴增所挑選之序列，其可被次選殖入所選表現載體 中。PCR引子可經設計以有助於次選殖，例如藉由包括增 添限制酵素切位。實施合“例舉用於完成全長“A美因 之擴增與純化的二步驟PCR程序，其中㈣選之蛋白㈣ 菌體僅含有…因之蛋白酶功能域。待轉感染入用於 表現之適當細豸（例如詳述於下文者）後，含有蛋白酶多 肽’或其具催化活性部份之條件培養基可於活性分析中測 試，或可用於進一步純化。此外，若需要，可相應地將蛋 154 200817517 白麵力口 Z…叫呵干硬形式 二鏈形式。此項操作為習於該項技蓺 又π人士已知。例如，可 使單鏈U-PA活化而裂解血纖維蛋 ^，丄 m乍赏白，合酶，例如本 1.重複性薛選
於本發明所提供方法，係利用重複性筛選以最適化蛋 白酶之修飾。因此，於重複性篩選方法中，蛋白酶可藉由 於各種參數下（例如藉由使用不同蛋白酶誘陷多肽或料 劑）進打多次；匈選反應而演化。於此類重複性篩選方法中， 可將蛋白酶集合於連續篩選回合t保持值^。或者，可產 生僅含有於先前回合中鑑定得之所挑選蛋白酶的新蛋白酶 集合’及/或藉由產生相較於在第—回合鑑定得之模板蛋白 酶已進一步經突變的新突變型蛋白酶集合。 於項貝例，蛋白酶文庫之第一回合筛選可鑑定出含 有。或夕種改變蛋白酶專一性之突變的變異型蛋白酶。然 後可完成第二回合文庫合成，其中將—種突變之胺基酸: 置保^疋’而於蛋白質之其餘位置或所希望區域或殘基 進仃定焦或隨機誘變。經額外筛選回合後，可將所挑選得 ^白酶進行另外回合的文庫合成與筛選。例如，可完成 ^ 5或更夕回合之文庫合成與篩選。於有些實例， 义異型蛋白酶對經改變受質之專一性係以各篩選回合進一 步最適化。 ^ ' 種重複性師選方法中，蛋白酶集合之第一回合 帛kI係針對中間蛋白酶誘陷多肽，以鑑認出含有一或多 種改變蛋白酶對該中間受質之專一性的突變之變異型蛋白 155 200817517 酶。可將所薛選之I白醮、台 主細胞中擴增，且用作：：合體分離、生長、並於適當宿 列的蛋白酶誘陷多肽^ 含有標把多狀之完整裂解序 如，此類方法可用於挑選合筛選中的蛋白酶集合。例 —性之蛋㈣，Ί vEGFR賴序列具有受質專 裂解序列，而接=或夕沟選回合係針對舰腹中間 列咖R之蛋選回合係針對含有VEGFR2裂解序 您蛋白St誘陷多肽進行。 多種二多選實例，係將二或多種含有對二或 狀，於另類淘選回二用序列的蛋白酶誘陷多 選經最適化以斟6 :法中。此類方法係有用於挑 選之變體代表性二：=質具有選擇性之蛋白酶。所挑 -性，但有高活性：二=受質辨識序列，具有窄的專 多月太（其已經修^7第—種蛋白酶誘陷 白酶）之第一人種預定受質專-性之蛋 回5蛋白酶集合篩選，可梦切出人右... 種改變蛋白酶專-性的突變之變里型蛋：：有一或多 之蛋白酶分離、生長 2坦蛋白喊。可將所挑選 針對第_種#自A x w ;、备佰主細胞中擴增，且用於 ::種蛋白_陷多肽（其已 種預定”專—性之蛋白酶 - 酶集合。於今笼士、、+卜 « 口師選中作為蛋白 相同或相異二各之第一與第二種蛋白酶誘陷多肽可能 同標乾受質之^辨 活性部位不同地修飾以模擬不 例，可能於灶=位（亦即裂解序列）。於有些實 J月b於双甲劑（例如本文所述心 下，增強篩選嚴苛度。 S观爭劑）存在 156 200817517 2·例舉性所挑選之蛋白酶 於本文提供者為於本發明所提供方法中所鑑認得之變 異型U-PA多肽，其具有經改變及/或經改善之受質專一性。 此類k異H u-PA多肽被鑑定為對於標靶蛋 或料望裂解序列具有增加的活性。例如，本發
異型u.PA多肽係被挑選以對於藉由以所希望或所挑 選標靶蛋白質的反應性部位胺基酸置換天然ρ4_ρι，反應性 部位胺基酸而於其RSL序列中經修飾之突變型絲胺酸:白 酶抑制物多狀具有增加的活性。於一項實例，係對經修飾 ΡΑί-l多肽鑑定得變異型u_pA多肽。用於本發明所提供& PA挑選方法之經修飾多肽分子，包括（例如）於其 天然P4-P1，殘基VSARM (SEQ ID N〇:378)以對於中間 VEGFR-2裂解序列RRARM (SEQ m n〇:379)之胺基酸殘 基，其中於P4-P1位置之所希望裂解序列為VEGFR_2裂解 序列RRVR (SEQ ID NO:489)，或以對於最適t_PA裂解序 列PFGRS (SEQ ID ΝΟ··3 89)之胺基酸殘基修飾的PAM。 使用本發明所提供之方法，鑑定得下列助長u_PA多 狀之受質專一性的位置：21、24、30、38、39、61 (A)、72 133、137、138、155、 73、75、80、82、84、89、92、132、 156、158、159、160、187、與217 (基於胰凝乳蛋白酶編 號）。一個或多個胺基酸置換可位於一或多個對應下列u_ PA多肽（例如列示於SEQ ID NO:433的胺基酸序列之U-PA 多肽或其具催化活性部位）的位置：F21、124、F30、V38、 T39、Y61(A)、R72、L73、S75、E80、K82、E84、189、K92、 157 200817517 * F132、G133、E137、I138、L155、K156、T158、V159、V160、 ΚΙ 87、與R217 (基於胰凝乳蛋白酶編號）之位置。本發 明所提供呈現增加受質專一性之經修飾u-PA多肽可含有 一或多個相當於u-PA多肽（例如列示於SEQ ID N0:433 的胺基酸序列之u-PA多肽或其具催化活性部位）的F21V、 I24L、F30I、F30V、F30L、F30T、F30G、F30M、V38D、 T39A、Y61(A)H、R72G、L73A、L73P、S75P、E80G、K82E、 E84K、I89V、K92E、F132L、G133D、E13 7G、I13 8T、L15 5P、 C L155V、L15 5M、K15 6Y、T15 8A、V15 9A、V160A、K187E、 與R2 1 7C之任何一或多個修飾之胺基酸修飾（基於胰凝乳 蛋白酶編號）。 於一項實例，本發明所提供之具有增加對於VEGFR-2 裂解序列之受質專一性的經修飾u-PA多肽，含有一或多 個相當於 V38D、F30I、F30T、F30L、F30V、F30G、F30M、 R72G、L73A、L73P、S75P、I89V、F13 2L、G133D、E13 7G、 I138T、L155P、L155V、L155M、V160A、與 R217C 之任 I 何一或多個修飾之胺基酸修飾（基於胰凝乳蛋白酶編號）。 此類多肽之實例為該等含有一或多個相當於在u-PA多肽 (例如具有於SEQ ID NO:433所列示胺基酸之u-PA多肽 或其具催化活性片段）中的任一 F30I ; L73 A/I89V ; L73P ; R217C ； L155P ； S75P/I89V/113 8T ； E137G ； R72G/L155P ； G133D ； V160A ； V38D ； F132L/V160A ； L73A/I89V/F30T ； L73A/I89V/F30L ； L73A/I89V/F30V ； L73A/I89V/F30G ； L73A/I89V/L155V ； L73A/I89V/F30M ； L73A/I89V/L1 55M ； 158 200817517 * L73A/I89V/F30L/L155M ;與 L73A/I89V/F30G/L155M 之胺 基酸修飾的u-PA多肽。此類序列之實例為該等列示於SEQ ID NOS: 434-459中任一者，或其含有突變且具有催化活 性之連續胺基酸之片段。尤其，係提供具有下列胺基酸修 飾之經修飾 u-PA 多肽：L73A/I89V ; L155P ; R72G/L155P ; F132L/V160A ； L73 A/I89 V/F3 0T ； L73 A/I89 V/L1 5 5 V ； L73A/I89V/L155M ;與 L73A/I89V/F30L/L155M (基於胰凝 乳蛋白酶編號）。
(、 於另一項實例，本發明所提供之具有增加對於受t-PA 辨識之裂解序列之專一性的經修飾u-PA多肽含有一或多 個相當於 F21V、I24L、F30V、F30L、T39A、Y61(A)H、E80G、 K82E、E84K、I89V、K92E、K156T、T158A、V159A、與 K187E之任何一或多個修飾之胺基酸修飾（基於胰凝乳蛋 白酶編號）。此類多肽之實例為該等含有一或多個相當於 在u-PA多肽（例如具有列示於SEQ ID N0433之胺基酸 序列的u-PA多肽或其具催化活性部位）中的F21V; I24L ; I， F30V ； F30L ； F30V/Y61(A)H ； F30V/K82E ； F30V/K156T ； F30V/K82E/V159A ； F30V/K82E/T39A/V1 59A ； F30V/K82E/ T158A/V159A ； F30V/Y6 1 (A)H/K92E ； F30V/K82E/V1 59A /E80G/I89V/K187E;與 F30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V /K187E中任一者之胺基酸修飾的u-PA多肽。此類序列之 實例為該等列示於SEQ ID NOS: 460-472中任一者，或其 含有突變且具有催化活性之連接胺基酸片段。
本發明亦提供者為相較於本發明所提供之變異型ιι-Ρ A 159 200817517
多肽具有相對應突變的胰凝乳蛋白酶家族之變異型蛋白酶 (基於胰凝乳蛋白酶編號）。例如，基於膜凝乳蛋白酶編 號，u-PA中位置F30之修飾相當於t_pA中位置Q30，胰 蛋白酶中Q30，及胰凝乳蛋白酶中Q30之修飾（波帝等人 結構生物學之現今觀點、Current Opinion in Structural BioJogy)，7··从5-名72)。翌於該頊技藝又士 可決定於其他胰凝乳蛋白酶家族成員中之相對應突變，包 括（但不限定於）表7中所列示且具有列示於任一 SEQ ID NOS: 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、 64 、 66 、 68 、 70 、 72 、 74 、 76 、 78 、 80 、 82 、 84 、 86 、 88 、 90、92、94、96、98、99、101、i〇3、105、107、109、111、 113 、 115 、 117 、 119 、 121 、 123 、 125 、 127 、 129 、 131 、 133 、 135 、 137 、 139 、 141 、 143 、 145 、 147 、 149 、 151 、 153 、 155 、 157 、 159 、 161 、 163 、 165 、 167 、 169 、 171 、 173 、 175 、 177 、 179 、 181 、 183 、 185 、 187 、 189 、 193 、 195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、 215 、 217 、 219 、 221 、 223 、 225 、 227 、 229 、 231 、 233 、 235 、 237 、 239 、 241 、 242 、 243 、 245 、 247 、 249 、 251 、 253 、 255 、 257 、 259 、 261 、 262 、 264 、 266 、 268 、 270 、 272之胺基酸序列的任一蛋白酶或其具催化活性片段之修 飾。 G•分析蛋白酶活性舆專一性之方法 可對於本發明所提供方法中挑選得之蛋白酶測試測決 定該等蛋白酶（於筛選後）冑否保持催化功效及呈現所希 160 200817517
望之受質專一性。可M 個案中之血纖維蛋白已：受質_ 而挑選之所希基於蛋白酶係針對其 質，分析受質聲解不而 裂解序列所設計的榮光狀受 挑選… 估催化功效及/或受質專-性。所 —之天然雙質裂解的動力學分析，可被比較以分 π標…之裂解以評估挑所選蛋白酶對於標“ i專一性。此外，可評估㈣作用之二級速率常 監測所挑選蛋白酶對於受質（例如用於挑選方法中之蛋白 Γ陷多肽或其變體）的功效及反應性。實施例5例= 種用於評估於本發明方法所鑑定得變異型U_PA 化功效與反應性的分析方法。 催
於-項實例’被挑選以配合經突變蛋白酶誘陷多肽之 所希望專-性特性的所挑選蛋白酶（例如所挑選W =-sP1蛋白酶），可使用個別對應於所希望裂解序列之 赏光產生肽文質進行分析。例如，對於可裂解標無受質之 任-或多種所希望序列的經修飾蛋白酶之分析之方法包 括:⑷將肽螢光產生樣本（含有所希望標乾裂解序列）， 以藉此使螢光產生部分在蛋白酶作用後能從肽受質序列釋 :的方式與蛋白酶接觸；及⑻觀察樣本是否進行可價测之 螢光變化’該可偵測之變化係樣本中存在有酵素活性蛋白 酶之指標。於此類實例中，係藉由該項技藝已知之方法， 將蛋白酶針對其挑選之所希望裂解序㈣成螢光產生狀。 於一項具體態樣’可將個別肽裂解序列接附至加營光產生 標籤之受質，例如ACC或AMC螢光產生脫離基，且營光 161 200817517 產生部分之釋出可經測定為蛋白酶對於肽裂解序列之專一 性的測量值。標靶裂解序列中螢光之增加速率可例如藉由 使用螢光分光光度計測量得。可隨時間測量螢光之增加速 率。可藉由標準動力學方法測定得米氏（Miehaeiis_MentQn) 動力常數。可藉由賴受質濃度倒㈣受質㈣速率倒數
之圖，並擬合賴威弗_布纟方程式（1/速率=(Km/v_)(i_ + i/vmax;其中 Vmax=[ET]kcat)，計算得動力 、 ^cat =^Keat/K„。二級速率常數或專一性常數（keat/Kj為受質被 特定蛋白酶切割之情形的測量值。例如，可製得ACC_4 AMC-四肽如 Ac_RRAR-AMC 或 •bLOR-AMC，並與於本 發明所提供方法所挑選之蛋白酶進行培育，且可藉由分析 螢光產生部分之釋出而評估該蛋白酶活性。
分析溶液樣本中之蛋白酶僅僅需要將一個量的蛋白酶 儲備溶液加至螢光產生蛋白酶指示劑肽中並測量後續於吸 收光二中之螢光增加或激發條帶減少。亦可將溶液與榮光 產生指示劑組合，並於最適化蛋白酶活性之“分解緩衝 f中分析。適於分析蛋白酶活性之緩衝液為習於該項技 农 .、’、去 叙，係挑選具有相當於特定蛋白酶之最 適ρΗ^的ρΗ值之緩衝液。例如，特別適合用於分析彈性 蛋白酶活性之緩衝液含有5〇祕鱗酸納、hMEDTA於仲 量最容μ榮光計量器中完成，其為一種提供對於 激發’，光源然後測量後續於料波長所發散之 ’益。與缺乏該蛋白酶之控制指示溶的比較提供蛋白 酶活性的測量。可藉由產生對於蛋白酶/指示劑組合物之標 162 200817517 準曲線（其中係測定由具有已知活性之蛋白酶溶液所產生 的榮光變化速率）來精確定量活性程度。 雖然可使用螢光計完成螢光產生化合物之偵測，亦可 藉由έ於该項技藝人士已熟知之各種其他方法完成偵測。 因此’例如，當螢光團於可見光波長發射時，可簡單地藉 由對由光源激發反應之螢光目測檢驗進行偵測。亦可藉由 利用接至數位化之攝影機的影像分析系統或其他影像擷取 〆 系統進行债測。亦可藉由透過濾鏡顯像偵測，如於螢光顯 U鏡下。顯微鏡可提供僅由操作者顯像之訊號。或者，可 ;、相底片上或使用錄影分析系統記錄訊號。亦可使用影 像分析系統或光度計簡單地即時定量訊號。 因此，例如，樣本蛋白酶活性之基本分析包含將樣本 懸汁或溶解於緩衝液（於欲受分析之特定蛋白酶的最適pH 值下）’將螢光產生蛋白酶肽指示劑加至該緩衝液，並使 光螢光。十L測所成的螢光變化，如於例如哈里斯等人 L (二8) Q㈣273:27364所示。分光螢光計係設定為 使螢光團於該螢光團之激發波長下激發。螢光產生蛋白酶 指不劑為由於蛋白酶裂解該指示劑而改變螢光之蛋白酶的 受質序列。 亦可分析所挑選蛋白酶以確定彼等當以全長蛋白質之 ，隻文存在日寸會裂解所希望序列。於一項實例，可將所純 Τ付之標乾蛋白f (亦即VEGFR2 )於有或無所挑選蛋白 鰣^在下進行培育，並可藉由SDS-PAGE隨後以考馬西亮 監染色蛋白質來監測裂解事件，及使用光密度計分析裂解 163 200817517
產物。全長I 使用光密度計、= 之專一性裂解常數可藉由 在下隨^，、，㈣估全長㈣受質條帶於蛋白酶存 在之光密度計量變化 熟知用於分柄所蚤珍# 力J便用δ亥技#已 白之活性m =蛋白質活性的方法，分析標乾蛋 m月八功能已被該裂解事件破壞。
於特別具體態樣，所M 蛋白酶)之專-性的…： 表性地為經修飾 較可用於測定所挑選蛋白酶是否（相 ΠΤ模板蛋白酶)呈現經改變(例如，增加): 定：;=對於標_之專-性可藉由觀察於： 少不同痒^白啤相較於野生型或模板蛋白酶裂解多 ^ 5 P 1得。若經修飾蛋 酶少種㈣受質，則經修飾蛋白酶對該二H白 野生型蛋白肖更大 专知乾又貝具有較 可從俨鈀☆新士 十。蛋白酶對標靶受質之專一性 払靶文貝相較於非標靶受質（亦即蛋白酶 型受質）之專—性裂解常數測定： 對於標減質相對於非標 ^二修飾蛋白辦 模板蛋白酶間之;=:Γ。經修飾蛋白梅與野生㈣ -受質之專-性=2例：比較’可用於評诂對於標 义 ^相較於野生也】$總i 酶對於標乾受質相對於非標乾受 '專 為至少2-倍、至少4_件 f專一性可 2〇〇 、 300 、 400 、 500 、 6〇〇 、 6〇 、 70 、 80 、 9〇 、 1〇〇 、 多。 、700、_、900、1〇〇〇 倍或更 164 200817517 Η·製造編碼蛋白酶誘陷 物）或其變體或蛋白酶/細 ’、即絲胺酸蛋白酶抑制 士七私石丨- 、、 > 都蛋白酶之核酸的方法 本文所列不之多肽，包 a 肽或其具催化活性部分，〜蛋白扭誘陷多肽或蛋白酶多 該項技藝已熟知用於蛋白：：經修飾υ·ΡΑ多肽，可藉由 獲得。可使用任何習於該:=及重組蛋白質表現之方法 希望基因之核酸的方法。 、姐疋 '扁碼所 任何該項技藝中可利用> t /' \
可用於獲得編碼所希望蛋 / ， 丄a 蛋白轉誘陷多肽或蛋白酶蛋白（例 如自細胞或組織來源）之 ( ΦΡΙΧΤΑ ^ ^ r-i , 长（亦即，包含完整編碼區域） cDNA或基因組DNA純 ^匕Λ ； 、、生修飾多肽（例如變異型蛋白 酶誘陷多肽或所挑選變里 文…i蛋白 ，、型蛋白酶），可如本發明所述從 夕肽改造得，例如藉由定點誘變。 可使用該項技藝中已知用於選殖及分離核酸分子之可 利用方法選殖或分離得多肽。 狀 此類方法包括核酸之PCR擴 增及文庫筛選，包括核酸 、 夂雜又師選、基於抗體之篩選與基 於活性之篩選。 用於核酸擴增之方法可用於分離編碼所希望多肽之核 酸分子’包括例如聚合酶鏈反應（PCR)方法。含有核酸之 材料可用#為《其可分離得所希望多肽.編碼核冑分子之起 °貝例如 DNA與mRNA製劑、細胞萃取物、組織 萃取物”夜體樣本（例如血液、血清、唾液）、得自健康 舁/或疾病個體之樣本，可用於擴增方法。亦可使用核酸 文庫作為起始物質來源。可設計用於擴增所希望多肽之引 子。例如，可基於從其產生所希望多肽之經表現序列來設 165 200817517 β 計引子。可基於多肽胺基酸序列之反-轉譯設計得引子。可 將經由擴增產生之核酸分子定序，並確認係編碼希望之多 肽。 可將額外核苷酸序列與多肽—編碼性核酸分子連接， 包括含有用於使合成基因選殖入載體（例如蛋白質表現載 體或經設計用以擴增核心蛋白編碼性DNA序列之載體） 之目的之限制内切核酸酶切位的連接子序列。而且，指定 功此性DNA元件之額外核苷酸序列可經操作性連接至多 月太-編碼性核酸分子。此類序列之實例包括（但不限定於） 經设計有助於胞内蛋白質表現的啟動子序列，及經設計有 助於蛋白質分泌之分泌序列。亦可將額外之核苷酸殘基序 列（例如指定蛋白質結合區域之鹼基序列）連接至蛋白酶 -編碼性核酸分子。此類區域包括（但不限定於）協助或 編碼有助於蛋白酶攝取入特定標靶細胞中之蛋白質，或不 然改變合成基因產物之藥物動力學的殘基序列。 然後可將經鑑定及分離之核酸插入適當選殖載體中。 可使用許多該項技藝已知之載體_宿主系統。可能之載體包 括（但不限疋於）質體或經修飾病毒，但是載體系統必須 人所使用之宿主細胞相容。此類載體包括（但不限定於） 巫菌體’例如藍答衍生物、或質體例如pCMV4、pBR322 或pUC質體衍生物、或BluescHpt載體（史塔金，La J〇Ua， cA)。插入選殖載體可（例如）藉由將dna片段接合至具 有互補性黏性末端之選殖載體中而完成。可使用τ〇ρ〇選 殖載體（因維托金（Invitr〇gen)，Carlsbad，CA)實現插入。 166 200817517 若用於切斷> 之互補限制位點不存在選殖載體中， 可使用酵素方、、表狄从 謀… 分子末端。或者’可藉由將核 甘酸序列（速ϋΛ 、硯接子）接合至DNA末端，而產生所希
位點；此等妙技人a、土 t J 二 、二口之連接子可含有編碼限制内切核酸酶辨
a、序j之特別經化學合成之寡核苷酸。於另類方法，可藉 ㈣兀聚合尾部修飾經裂解載體與蛋白質基因。可將重組 刀：、工由（例如型、轉感染、i染、1穿孔及音波震 動牙孔導入佰主細胞，始能產生許多該基因序列之副本。 :特別/、體悲樣，宿主細胞使用會併入經分離蛋白質 2因、CDNA或合成型DNA序列的重組DNA分子之轉型，、 旎夠產生該基因之多數副本。因A，可藉由生長轉型株， 從轉型株分離重組DNA分子，及（若需要）從經分離之 重組DNA取回插入的基因，而大量獲得該基因。 1·載Λ舆細胞 、為重組表現一或多種所希望蛋白質（例如任何本文所 述者），可將含有全部或部分編碼該蛋白質之核苷酸序列 的核酸插人適當表現載體’亦即其含有用於轉錄及轉譯該 所插入蛋白質編碼序列之所需元件的載體。亦可由蛋白酶 基因之天然啟動子，及/或其側翼區域提供必f的轉錄及轉 澤訊號。 亦提供者為含有編碼蛋白酶或經修飾蛋白酶之核酸的 載體。亦提供含有該等載體之細胞。細胞包括真核與原核 細胞’而載體為任何適於其中使用者。 提供含有載體之真核與原核細胞，包括内皮細胞。此 167 200817517 類細胞包括細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古菌、植物 細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。細胞係用於藉由將前述 細胞生長於藉此使所編碼蛋白質由該細胞表現之條件下而 製造其蛋白質，並回收所表現之蛋白質。為本發明之目的， 例如，可將蛋白酶分泌至培養基中。 於一項具體態樣，係提供含有編碼具有蛋白酶活性（例 如編碼本發明所提供之任一 u_Pa變體多肽）且含有所有或 部分蛋白酶功能域之多肽的核苷酸序列或其多數副本之載 體。亦長:供者為含有編碼蛋白酶功能域與多達且包括全長 蛋白酶蛋白質之額外蛋白酶蛋白質部分的核苷酸序列以及 其多數副本之載體。載體可針對於細胞中經修飾蛋白酶蛋 白質或其蛋白酶功能域之表現或能使蛋白酶蛋白質經表現 呈分泌蛋白質而挑選。當蛋白酶功能域被表現時，係將核 酉欠連接至編碼分泌訊號（例如啤酒釀母菌交配因子訊號序 列或其部分）或天然訊號序列的核酸。 可使用各種宿主-載體系統，來表現蛋白質編碼序列。 此等包括但不限定於，以病毒（例如牛痘病毒、腺病毒及 其他病毒）感染之哺乳動物細胞系統；以病毒（例如桿狀 病毋）感柒之昆蟲細胞系統；微生物，例如含有酵母載體 酵母菌，或經嗟菌體、DNA、質體DNA或黏粒轉 型之細菌。載體之表現元件依其強度與專一性而有所差 異。取決於所使用之宿主_載體系統，可使用許多適宜之 錄與轉譯元件中任一種。 可使用任種習於该項技藝人士已知，用於將 200817517 片段插入載體中之方法來構築含有一種含有適當轉錄/轉譯 調控訊號與蛋白質編碼序列之嵌合型基因的表現載體。此 等方法可包括試管内重組DNA與合成技術，及活體内重 組（基因重組）。編碼蛋白質（或其功能域、衍生物、片 段或同源物）之核酸序列的表現，可由第二核酸序列調節， 以使該基因或其片段能於經該重組DNA分子轉型之宿主 中表現。例如，可藉由該項技藝中已知之任何啟動子/增強 子，控制該等蛋白質之表現。於一項特別具體態樣，啟動 子對於所希望蛋白質之基因並非天然。可使用之啟動子包 括（但不限定於）SV40早期啟動子（貝諾斯特與錢波， 290:304-310 (1981))包含於Rous肉瘤病毒之3，長末端重 複區的啟動子（山本等人Ce// 22:787_797 〇98〇))、疱疹 胸普激酶啟動子（瓦袼等人，户清制ϋ以⑽ 1441-1445 (1981))、金屬硫蛋白基因之調節序列（布 林斯特等人，編㈣携:39_42 (1982));原核表現載體， 例如石_内醯胺酶啟動子（杰等人（1981) &· ί/Μ 7&5543 )或⑽啟動子（迪波爾等人，户n
Ad仏·.⑽級21-25 (1983));亦參見“得自重組細菌 之有用蛋白質，，：於科學美國人（Scientific American) 2^2:79-94 (1980));含有胭脂胺鹼合成酶啟動子之植物表 現載體（赫拉爾·伊斯雷拉等人，3W:2〇9_213 (1984))或花椰菜鑲嵌病毒35S rna啟動子（家德等人， 9:2871 (1981))，及光合作用酵素核酮 糖二磷酸羧基酶啟動子（赫拉爾-伊斯雷拉等人， 169 200817517 得自酵母與其他真菌之啟動子元件， 例如Gal4啟動子、酒精脫氫酶啟動子、磷甘油激酶啟動子、 驗性鱗酸酶啟動子、及下列呈現組織專一性且已用於轉殖 基因動物之動物轉錄控制區··彈性蛋白酶I基因控制區， 其於胰臟癌細胞中具活性（史威特等人，cw/ M:639_646 (I 外 4) ·，歐尼茲等尺，Cold Spring Harbor Symp· Quant· Biol· 50:3 99-409 (1986);麥當勞，如0/0幻；7:425 515 (1987)); 胰島素基因控制區，其於胰臟貝他細胞中具活性（哈拿漢 等人，375:115-122 (1985))、免疫球蛋白基因控制 區，其於淋巴細胞中具活性（葛羅司德等人，Ce// M:647_658 (1984) ;亞當斯等人，37&·533-538 (1985);亞力山 寺人，Mo/· CW/ 5/(9/· 7:1436 -1444 (1987))、小氣乳腺腫 瘤病毒控制區，其於睪丸、乳房、淋巴與肥大細胞中具活 性（雷德等人，CW/ 45:485-495 (1986))、白蛋白基因控制 區，其於肝臟中具活性（賓特等人，⑽j Dev乂 7:268-276 (1987))、阿伐-胎蛋白基因控制區，其於肝臟 中具活性（克魯勞夫等人，Mo/· Ce//· 5沁/. 5:1639_1648 (1985) ;哈莫等人，235:53-5 8 1987 ))、阿伐-1 抗 胰蛋白酶基因控制區，其於肝臟中具活性（凱斯等人， ⑽dDeve/· 7:161-171 (1987))、貝他球蛋白基因控制區， 其於骨髓細胞中具活性（莫格拉姆等人，^ 375:338_34〇 (1985);村里亞斯等人，Ce// 46:89-94 (1986))、髓鞘驗性 蛋白基因控制區，其於腦之寡突神經膠質細胞中具活性（里 德黑德等人，CW/ 4S:703-712 (1987)) '肌球蛋白輕鏈_2 170 200817517 控制i ’其於㈣肌中具活性（桑尼，細心仙283_ 2% (1985))、及促性腺激素釋放激素基因控制區，其於 下視丘之促性腺激素分泌細胞中具活性（馬森等人 ⑼:1372-1378 (1986))。 於一項特別具體態樣，係使用含有將可操作連接至編 碼所希望蛋白質（或其功能域、衍生物、片段或同源物） 之核酸、-或多個複製起點、及（視需要地）_或多個可 广挑選標記物（例如抗生素抗性基因）的載體。例如用於表 ' =蛋白酶蛋白之蛋白酶功能域的載體與系統包括已熟知之 畢赤酵母菌屬（Pz·—)載體（可例如購自因維托金，聖地 牙哥，C A )，特別是該等經設計用於分泌所編碼蛋白質者。 用於轉型大腸桿菌細胞之例舉性質體載體包括（例如） 表現載體（可構自奎爾金，泛倫西亞，CA;參見由垄爾金公 開之描述該系統之文獻）。PQE㈣具有嗟菌體T5啟動 子（由大腸桿菌RNA聚合酶辨識）以及雙重lac操縱子阻 ( 抑模、且以於大腸桿菌提供重組蛋白質之緊密調節的、高 水平表現、供有效轉譯之合成型核糖體結合部位H)、 6Xh1S標籤編碼序列、％與T1轉錄終結子、c〇iEi複製起 點、及供賦予胺苄青霉素抗性之貝他_内醯胺酶基因。pQE :體能使6XHis標籤放置於重組蛋白之斗或c·端。此類 =體包括pQE 32、pQE 30、及pQE 31，其提供對於所有 一視框之多重選殖位點，並提供N_端加標籤蛋白質 之表現其他用於轉型大腸桿菌細胞之例舉性質體載體， 包括（例如）pET表現載體（參見，美國專利4,952,496; 171 200817517 可購自諾瓦金（NOVAGEN)，麥迪遜，WI;亦參見由諾瓦 金公開之描述該系統之文獻）。此等質體包括ρΕΤ π a， 其含有T71ac啟動子、T7終結子、可誘導性大腸桿菌iac 操縱子、與lac阻抑蛋白基因；ρΕτ I2a-c，其含有T7啟 動子、T7終結子、與大腸桿菌〇mpT分泌訊號；及pET i5b 與PET19b(諾瓦金，麥迪遜，WI)，其含有用於以阳8管 柱純化之His-TagTM引導肽序列及允許在通過管柱純化後 裂解之凝血酶裂解位點、T7-lac啟動子區與T7終結子。 2.表現 蛋白質（例如任何列示於本文包括任一種蛋白酶誘陷 多肽或其變體’或所挑選之蛋白酶或其具催化活性部分） 可藉由習於該項技藝人士已知之任何方法（包括活體内及 試管内方法）製得。可將所希望蛋白質表現於任何適於製 造所需要量及形式（例如供投藥及治療需要）之蛋白質的 生物體中表現。表現宿主包括原核與真核生物，例如大腸 才干囟酵母、植物、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，包括人類 細胞系與轉殖基因動物。表現宿主差異可在於其蛋白質製 造罝以及呈現於所表現蛋白質上之轉譯後修飾類型。表現 宿主之選擇可基於此等及其他因素，例如調節與安全性考 量、製造成本與純化之需求及方法。 有許多表現載體對於習於該項技藝人士為可利用且已 知且可用於蛋白質表現。表現載體之選擇將受所選宿主表 現系統影響。一般，表現載體可包括轉錄啟動子與視需要 地增強子、轉譯訊號、及轉錄與轉譯終結訊號。用於穩定 172 200817517 轉型之表現載體代表性地具有可選擇及維持經轉型細胞之 可挑選標記物。於有些個案，可使用複製起點擴增載體之 副本數。 蛋白質（例如本文所提供之任何變異型蛋白酶或任一 種蛋白酶誘陷多肽或其變體）亦可呈蛋白質融合物形式被 利用或表現。例如，可產生蛋白酶融合物以將額外功能性 加至蛋白酶。蛋白酶融合蛋白之實例包括（但不限定於） 訊號序列、例如供定位之標籤（如his6標籤或㈣標幻、 或供純化之標籤（例如GST融合）及用於指揮蛋白質分泌 與/或膜締合之序列的融合。 於一項具體態樣，蛋白酶可經表現呈活性形式。於另 -項具體態樣’蛋白酶係表現呈不活性、酶原形式。 a·原核麵胞 原核生物（特別是大腸桿菌）提供—種用於製造大量 蛋白質之系統。大腸桿菌之轉型為習於該項技蓺人士已笮 知的簡單且快速之技術。用於大腸桿菌之表現載體可含二 可誘導性㈣子’此類㈣何詩料^平蛋 現及用於表現對宿主細胞呈現某種毒性之蛋白質。誘導性 啟動子包括lac啟動子、trp啟動子、雜合…啟動 與SP6 RNA啟動子及受溫度調節之⑸乙啟動子。 蛋白質（例如本文所提供者）可經表現於大腸桿菌之 細胞質環境中。細胞質為一種還原性環境，且對於竿此分 二:Γ::二致形成不可溶性包涵體。諸如二硫蘇糖醇與 βι基乙料還原劑，及諸如胍·HC1與尿素等變性劑，可 173 200817517 用於將蛋白質再溶解。 。一種替代的方法係將蛋白質表現於
將導引序列融合至欲經表現之蛋白質， ^造。代表性地，係 ’其指揮該蛋白質至 周貝後藉由位於周質内之訊號肽酶，將導引序列去除。 周質-較導引序列之實例包括得自果膠酸鹽解離酶基因之 pelB導引序列及衍生自驗性碟酸酶基因之導引序列。於有 些個案，肖質之表現允許所表現蛋白f渗漏至培養基中。 蛋白質之分泌允許從培養物上清液快速且簡單的純化。不 彳刀泌之蛋白貝可藉由滲透溶解而自周質獲得。類似於細 胞質表現，於有些個案，蛋白質可能變為不可溶而可使用 又丨生劑與還原劑以助於溶解及再折疊。誘導及生長之溫度 亦可&善表現水平及溶解度，代表性地係使用介於25。。至 37 C之溫度。代表性地，細菌製造出未經糖苷化之蛋白質。 因此，若蛋白質需要糖苷化以執行功能，則可於從宿主細 胞純化後試管内糖苷化。 *>·酵母細胞 酵母（例如啤酒釀母菌（)、
此類 如任何於本文所述者）之已熟知酵母表現宿主。酵母可以 游離型複製載體或藉由經同源重組之穩定染色體整合轉 型。代表性地，係使用可誘導啟動子調節基因表現。 174 200817517 啟動子之實例包括GAL1、GAL7與GAL5及金屬硫蛋白啟 動子，例如CUP1、AOX1或其他畢赤酵母或其他酵母啟動 子表現載體往往包括可挑選標記物，例如用於挑選及維 持所轉型DNA之LEU2、TRP1、HIS3與URA3。於酵母中 斤表見之蛋白質常為可溶性。與侣伴蛋白例如Bip及二硫 化物異構酶共表現可增進表現水平與溶解度。此外，於酵 母中所表現之蛋白質可使用分泌訊號肽融合物（例如得自 『。皁酒釀母菌之酵母交配型阿伐—因子分泌訊號）以及與酵 、母細胞表面蛋白（例如Aga2p交配附著受體或心 ❼7s葡糖澱粉酶）之融合物指揮進行分泌。蛋白 酶裂解位點（例如對於Kex-2蛋白酶者）可經設計而將融 合序列當其退出分泌路徑時從經表現之多肽去除。酵母亦 月匕夠於Asn-X-Ser/Thr基序糖苦化。 c·昆森麵胞 昆蟲細胞（尤其使用桿狀病毒表現者）可用於表現多 肽，例如經修飾之蛋白酶，或經修飾之蛋白酶誘陷多肽。 昆蟲細胞表現高水平蛋白質且能夠進行大多數由高等真核 細胞利用之轉譯後修飾。桿狀病毒具有限定之宿主範圍， 其改善安全性並減低真核表現之調節掛念。具代表性之表 現載體使用供高水平表現之啟動子，例如桿狀病毒之多角 體蛋白啟動子。一般所使用之桿狀病毒系統包括桿狀病 毒，例如苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒 cW/br⑴‘ nuclear· polyhedrosis virus，AcNpv)與家蠶核多 角體病毒⑽咖助W nuclear p〇lyhedr〇sis Wrus， 175 200817517 之桿狀病毒，及昆蟲細胞系，例如衍生自草地黏蟲 (Spodoptera frugiperda)之 Sf9、一 I黎氬 Q pseudaletia (A7S)與大樺斑蝶（乃“似似 ) (DpNl) 〇 為達高水平表現，遂將欲表現分子之核苷酸序列緊接著融 合於病毒多角體蛋白起始密碼子的下游。哺乳動物分泌訊 號於昆蟲細胞中正確地加工且可用於將所表現蛋白質分泌 至培養基中。此外’細胞系一星黏蟲（A7S)與大桿斑蝶（DpN 1) 產生具有與哺乳動物細胞系統類似之糖苷化形式的蛋白 質。 昆蟲細胞中之替代的表現系統係使用經穩定轉型 < 細 胞。諸如許尼得2 (Schnieder 2，S2)與Kc細胞（黑腹果繩 (Drosophila me lano gas ter ))反 C7 細胞（白故伊故（乂 ))等細胞系可用於表現。果蠅金屬硫蛋白啟動 子可用於在以鎘或銅之重金屬誘導作用存在下誘導高水平 表現。表現載體代表性地係藉由使用可挑選標記物，例如 新霉素與潮霉素維持。 d·哺乳動物細胞 哺乳動物表現系統可用於表現包括經修飾之蛋白酶< 其具催化活性部份、或蛋白酶誘陷多肽或其變體之蛋白 質。可藉由病毒感染（例如腺病毒）或藉由直接DNA轉 移（例如脂質體、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖）及藉由物理方 式（諸如電穿孔與顯微注射）將表現構體轉移至喷乳動物 細胞。用於哺乳動物細胞之表現載體代表性地包括 帽部位、TATA框、轉譯起始序列（Kozak共有序列）與 176 200817517 聚腺苷化元件。此類載體往往包括供高水平表現之轉錄啟 =子-增強子’例如SV4G啟動子_增強子、人類細胞巨大病 毋（CMV)啟動子及R〇us肉瘤病毒（Rsv)之長末端重複。此 等啟動子-增強子於許多類型細胞中具活性。組織及細胞類 型啟動子與增強子區域亦可用於表現。例舉性啟動子/增 強子區域包括（但不限定於）該等得自諸如彈性蛋白酶工、 胰島素、免疫球蛋白、小鼠乳腺腫瘤病毒、白蛋白、阿伐 胎蛋白、阿伐-1抗胰蛋白酶、貝他球蛋白、髓鞘鹼性蛋白、 肌球蛋白輕鏈-2、及促性腺素釋放激素基因控制等基因者。 可使用可挑選標記物挑選及維持具有表現構體之細胞。可 挑選標記物基因之實例包括（但不限定於）潮霉素B磷酸 轉移酶、腺苷脫胺酶、黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶、 胺基糖苷磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶與胸苷激酶。與細 胞表面傳訊分子例如TCR-ζ及FceRIi之融合可指揮蛋白 質以活性狀態表現於細胞表面上。 許多細胞系可用於哺乳動物表現，包括小鼠、大鼠、 人類、猴子、雞與倉鼠細胞。例舉性細胞系包括（但不限 疋於）CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠 NS0 (非分泌 性）及其他骨髓瘤細胞系、融合瘤與雜合瘤細胞系、淋巴 細胞、成纖維細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、 2B8及HKB細胞。細胞系亦可用於適應無血清培養基，其 有助於將所分泌蛋白質從細胞培養基純化。一種此類實例 為無血清EBNA-1細胞糸（法姆等人（2〇〇3)
Bioeng. 84:332-42 )。 177 200817517 e.植物 轉瘦基因植物細胞與植物可用於表現諸如本文所述任 一種之蛋白質。代表性地使用直接DNA轉移（例如微粒 轟擊與PEG-介導之轉移）入原生質體，及以農桿菌-介導 之轉型’將表現構體轉移至植物。表現載體可包括啟動子 與增強子序列、轉錄終結元件與轉譯控制元件。表現載體 及轉型技術通常於雙子葉宿主（例如阿拉伯芥 (心叩A)與煙草）及單子葉宿主（例如玉米與稻米） 間不同。用於表現之植物啟動子實例包括花椰菜鑲嵌病毒 啟動子、胭脂鹼合成酶啟動子、核糖二磷酸羧基酶啟動子 及泛素與UBQ3啟動子。可挑選標記物（例如潮霉素、磷 酉文甘露糖異構酶及新霉素碟酸轉移酶）常被用於協助挑選 及維持經轉型之細胞。經轉型之植物細胞可呈細胞、聚集 物（癒合組織）維持於培養基中或再生成完整植株。轉殖 基因植物細胞亦可包括經設計用於製造蛋白酶或經修飾蛋 白酶之藻類（參見例如，梅菲德等人（2003) 7(?0:43心 442 )。因為植物具有與哺乳動物不同之糖基化形式，此 可能影響於此等宿主製造之蛋白質選擇。 3.纯化技術 用於從宿主細胞純化多肽（包括蛋白酶多肽或其他蛋 白質）之方法將視所選擇之宿主細胞與表現系統而定。對 於分泌型分子，一般係於去除細胞後從培養基純化得蛋白 質。對於細胞内表現，可將細胞溶胞並從萃取物純化得蛋 白質。當使用轉殖基因生物例如植物與動物進行表現時， 178 200817517 可使用組織或器官作為製造溶解細胞萃取物之 、 此外，轉殖基因動物製造可包括於奶或蛋中的:材料】 造’可將其收集，且若需要，可使用該項技藝之：：：製 將蛋白質萃取及進一步純化出。 ’法
於-項冑例’蛋白酶可經表現及純化成為失活 原形式）或者替代地所表現之蛋白酶W 式，例如二鏈形式，此係藉由自我催化而去除原區。 $地’自我活化發生於純化過程中，例如藉由於室溫下培 育24-72小時。活化速率與程度係取決於蛋白質濃度與斗: 別之經修飾蛋白酶，以致彳1 、 下培育-段更長的時間。可藉由SDS_PAGE (例如3千道 ，移）及藉由酵素活性（勞光產生物質之裂解）監測 代表杜地，蛋白質於純化之前係允許達到>75%活化。 蛋白質（例如蛋白酶）可使用該項技藝已知之標準蛋 白質純化技術（包括（但不限定於）sds_page、大小級 分與大小排除層析術、硫酸銨沈殿、及離子交換層析術， 例如陰離子交換）純化得。亦可利用親和性純化技術，增 =副之功效與純度。例如，抗體、受體及其他與蛋白酶 口之为子可用於親和性純化。亦可將表現構體設計，以 、見#丨生&籤加至蛋白質，例如myc表位、GST融合或 Ττ · 6並分別及以myc抗體、麩胱甘肽樹脂及Ni-樹脂親 盥=純化。可藉由該項技藝已知之方法（包括凝膠電泳術 "、木色及分光光度技術）評估純度。 4· «合蛋白質 179 200817517 亦提供含有本發明所提供之變異型蛋白酶與一或多種 其他多肽的融合蛋白質。提供含有此類經調配用於以適宜 迷咎技藥之嘁合蛋白質的醫藥組成物。融合蛋白質係藉由 將經修飾蛋白酶與另一種多肽（例如抗體或其片段、生長 因子、配體及其他為用於有助於蛋白酶之純化、藉由將蛋 白酶導向標靶細胞或組織而改變蛋白酶之藥物動力學性 質、及/或增加蛋白酶表現或分泌㈣之藥劑）卩任意順序 連接而形成。於蛋白酶融合蛋白質中，蛋⑽多肽可相當 於蛋白酶蛋白質全部或其具催化活性部份。於有些具體態 樣，蛋白酶或其具催化活性部份為經修飾之蛋白酶。本發 明所提供之融合蛋白質實質上仍保留其對於任一或多種所 希望標乾受質之全部專-性與/或選擇性…般，蛋白酶融 合多肽相較於非-融合蛋白酶保有至少約3〇%、4〇%、5〇%、 /〇 7〇/〇、8〇/〇、85〇/〇、90% 或 95%受質專一性與/或選 擇性，包括96%、97%、98%、99%或以上受質專一性，相 車父於非-融合蛋白酶。 蛋白酶多狀與另一多肽之連接可係直接地或間接地經 由連接物貫現。於-項實例，連接可為藉由化學連接，例 7經由異元雙官能劑或硫醇連接或其他此類連接。蛋白酶 與另一多肽之融合可為至蛋白酶多肽之N-或C-端。可與 本^明所提供的用於蛋白酶用於融合蛋白質之多肽的非限 制H只例包括（例如）GST (麵胱甘肽S-轉移酶）多狀、 〜自免疫球蛋白之Fc X力能域、或異源性訊號序列。融合 蛋白貝可含有頭外組成，例如助於蛋白質被細胞攝入之大 180 200817517 腸桿菌麥芽糖4士八 擒、、口合蛋白（MBP)(參見， WO 01/3271 1 )。 国際PCT申峋案號 蛋白％融合蛋白質藉 可將編碼不同多月…‘卓重組技術製得。例如， 个u夕肽序列之DNA片段以 根據習知技術Γ#丄 付口 C木之方式， (例如猎由使用供黏接 供適當末端之限制酵鈍W又錯4、提 適當之黏性末端補平、避 ::希望接合之驗性磷酸酶處理、及酵素性接合）而接合 r \
技白：：另—項具體態樣，融合基因可藉由習知技術（包 括自動化DNA合忐徭、人# π 上 成儀）a成侍。或者，可使用於二接續 基因片段（其後續可你邦人月娘祕& * 伐貝 欠只』、、工黏合及擴增而產生嵌合型基因 列）間產生互補突屮夕办f — 7 .
预大出之4田疋引子，來完成基因片段之pcR 擴增（參見例如’奥司貝爾等人（eds)現今分子生物學之提 案’約翰威利父子 1QQ9、 工。 _ 于，1992 )。而且，市售可得許多已編碼 融合部分（❹GST多肽）之表現載體。蛋㈣編碼性 核酸可被選殖至此類表現載體中，以使該融合部分能以符 合框架之方式連接至蛋白酶蛋白。 5 ·核普酸序列 本發明提供編碼經修飾蛋白酶之核酸分子。核酸分子 包括任一所編碼蛋白酶或其具催化活性部份之等位基因變 體或剪接變體。於一項具體態樣，本發明所提供之核酸分 子具有至少 50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、 93、94、95或99%序列同一性，或於適中嚴苛度或高嚴苛 度下沿著任一所編碼野生型蛋白酶（或其具催化活性部 份）之全長核酸的至少70%雜交。於另一項具體態樣，核 181 200817517 酸分子可包含該等具有任一蛋 姆A其具催化活性部份 (例如本發明所提供者）之簡併性密碼子序列者。 ^供經可操作性連接至啟動子（例如供於哺乳動物 細胞中表現之可誘導性啟動子）的核酸分子（或含有核酸 分子之具催化活性部份的融合蛋白質）。此類啟動子包括 (但不限定於）CMV與SV40啟動子；腺病毒啟動子，例 如E2基因啟動子，其對Hpv以致癌蛋白具反應；pv啟
動子，例如對PVE2蛋白具反應之pBVp89啟動子；及其 他文HI V或PV或致癌基因活化之啟動子。 本發明提供之經修飾蛋白酶’亦可於基因轉移載體中 遞送至細胞。轉㈣體亦可編碼料其㈣於治療欲投藥 蛋白酶之疾病或病症（例如凝血病症或癌症）的治療劑。 編碼蛋白酶之載體可全身性地使用，其藉由將核酸投要至 個體。例如’轉移載體可為病毒載體，例如腺病毒載體。 編碼蛋白酶之«亦可併人幹細胞巾且此等幹細胞係例如 藉由將幹細胞移植或植入治療部位而被投藥予個體。例 如，可將間質幹細胞（MSC)設計而表現蛋白酶，併將此類 MSC移植於供治療之腫瘤部位。 I·所挑選蛋白酶多肽之製備、調配及投藥 1·组成物舆遞送 所挑選蛋白酶（例如所挑選突變型U_PA多肽）之組 成物，可經調配用於藉由習於該項技藝人士已知之途徑（包 括肌肉内、靜脈内、真皮内、腹膜内注射、皮下、硬膜外、 畀。卩、口服、直％、局部、吸入、口部（例如舌下）、與 182 200817517 ^皮投藥或任何途幻之投藥。所挑選蛋白酶可 §知途# (例如藉由灌流或快速注射（bQlus i \壬何 糟由透過表皮或黏膜與皮膚裡襯（例如，口 與小腸黏膜等）吸收）投藥，且可μ μ、、直腸 序地、間歇性或存在同一組合物中投藥、。投举='=’依 局部的或全身性，視治療區域而定。局部性為局錢、 灌！二域可例如（但不限定於）手術期間之局部性 :=、㈣料（例如與手術後傷部之包紫結合）、二生 成由導管方式、藉由栓劑方式、或藉由植切 成。技樂亦可包括受控釋放系統，其包括受控釋放，2 ==方式控制釋放之裝置。於任何所給予個案中 ^數=且途徑取決於各種因素，例如疾病本質、疾病 進展、疾病嚴重度與所使用的特別組成物。 心t種遞送系統為已知且可用於投藥所挑選之蛋白酶， 表艮定於）包封於脂質體、微粒、微膠囊、能夠 -“物之重組細胞、受體介導之細胞吞噬作 、、扁碼所挑選蛋自_ $ # & a 送系統。 -杉文刀子的遞送，例如反轉錄病毒遞 口可製備含有所挑選蛋白酶之醫藥組成物。一般，醫藥 =接受之組成物係考慮到管理機關或其他機關之核准:、 ':般用於動物及人類之已知藥典製備得。醫藥組成物 =載劑’例如稀释劑、佐劑、賦形劑或同功型與其投 勺體。此類醫藥载劑可為滅菌液體，例如水與油類， 匕括該等石油、動物'植物或合成來源者，例如花生油、 200817517 it \ s物油及芝麻油。當醫藥組成物係經靜脈内投 樂日^水為代表性的载劑。食鹽水溶液及右旋糖水溶液與 二由溶液亦可用作為液體載劑，尤其是用於可注射溶液。 =成物除活性成份外可含有：稀釋_如乳糖、餘、碟 酉文一約、或叛甲基纖維素：潤滑劑例如硬脂酸鎮、硬脂酸 :::’及黏著劑例如澱粉、天然膠（如阿拉伯膠）、 葡萄糖、糖密、$ r & ^ ♦乙烯基吡咯啶、纖維素及其衍生物、聚 、、酮（P〜done)、交聯聚維嗣（εΓ〇8ρ〇νί“）及其他習 二X員技晏人士已知之此類黏著劑。適宜之醫藥賦形劑包 括殿粉、葡萄糖、乳糖、蔑糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、 白堊石夕膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘％ _ 脫脂奶粉、m/ 仏、滑石、氣化納、 , 及乙醇。若希望，組成物 =广欠要量之澄潤劑或乳化劑，“Η緩衝劑，例如 U夂鹽、檸檬_、環糊精衍生物、去水山㈣單月桂酸 乙酵胺醋酸鈉、三乙醇胺油酸酿、及其他此類試劑。 Ϊ寺^物可採用溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠 、及持續釋出調配物之形式。組成物可經調配成 U、、使用傳統黏著劑及載劑例如三酸甘油醋。口服調 配=包括標準載劑，例如醫藥級甘露糖醇、乳糖、殿粉、 :月曰馱鎂冑精鈉、纖維素、碳酸鎂、及其他此類試劑。 Τ宜醫藥載劑之實例係描述&“雷明頓製 (R_ng_，sPhamaeeutiealSeienees)”，ε 1馬 物將含有治療上有效量之化合物（一般呈經純化 以可提供該形式用於適當投藥予患者之適量載體。 184 200817517 調配物應適合投藥型式。 調配物係提供用於以單位劑量形式（例如錠劑、膠囊、 丸劑、粉末、顆粒、滅菌非經腸道溶液或懸浮液、與口服 溶液或懸浮液'及含有適宜量化合物或其醫藥上可接受衍 生物之油水乳液）投藥至人類與動物。醫藥上治療上活性 化合物及其衍生物’代表性地以單位劑量型式或多劑量型 式職，投藥。各單位劑量含有足以產生所希望治療功效 Γ =療上活性化合物，與所需要醫藥載體、載劑或 個/、/ °早位劑量形式之實例包括安瓶與注射器及經 :別包裝之錠劑或膠囊。翠位劑量形式可逐 樂。多劑量形式為多數個相同單位劑量形式包裝於，欲以 =!位劑量進行投藥單-容器中。多劑量形式之實例 =tr、片劑或膠囊瓶或品脫或加命瓶。因此，多劑 里形式為多數個未經分隔包裝之單位劑量形式。 可製備含有範圍介於〇〇() 毒性載劑達平衡的劑量形式或組成物 藥組成物可採用f4、Μ 、服技梁’ w 方法使用醫= = ^ 經明穋化之殿粉、聚乙烯/比/例如黏著劑（例如預先 素），填充劑（例如乳糖、微 纖維 滑劑（例如硬脂酸鎂、滑石或石夕石广满 薯澱粉或澱粉乙醇酸鈉）、戈 ，朋解劑（例如馬鈴 製備得。錠劑可以該項技藝桂f硫酸納）） 醫藥調配物亦可呈液體开方法加以包覆。 體形式，例如溶液、糖襞或懸浮 185 200817517 Γ或可呈現用以於使用Sii以水或其他適宜載體重建之藥 物產σσ。此類液體製劑可藉由習知方法使用醫藥上可接受 之添加劑（例如懸浮劑（例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍^ 物或氫化食用脂質）；乳化劑（例如卵磷脂或阿拉伯膠；； 非水|±載體（例如杏仁油、油性酯類、或分級植物油）； 及防腐d (例如甲基或丙基—對—羥基本甲酸酯或山 製備得。 求U ) f 卜適用於直腸投藥之調配物可呈單位劑量拴劑提供。 等可猎由將活性化人物盘一 -U ^ 注化口物與或多種習知固體載劑（例如可 可脂）混合，然後再將所成之混合物成形而製備得。 適用於局部塗敷於皮膚或眼部之調配物包括軟膏 霜、洗液、藥膏、凝膠、噴霧液、氣溶膠與油劑。例舉： 載劑包括凡士林、羊毛月旨、聚乙二醇、醇類、與其二或多 種之組合。局部調配物亦可含有GG5至15 ϋ重: 百分比之增稠劑’其選自經丙基甲基纖維素、甲基纖維素里 聚乙浠基料咬酮、聚乙稀醇、聚（伸烧基二醇）、 羥基烧基、（甲）丙稀酸醋或聚（甲）丙稀酿胺。局 配物常係藉由滴下敷用或呈進人結膜囊中之軟膏。其亦4 用於刺激或潤滑眼部、臉凹部、及外耳道。其亦可注射入 前眼腔與其他部位中。呈液體狀態之局部調配物亦可存在 於呈條狀或n形眼鏡之親水性三維聚合物基質巾，從 釋放出活性組成。 〃 ?於糟：吸入之投藥，用於本發明之化合物可以從加 塵包裝或喷霧器伴隨使用適宜的推進劑（例如二氯二款甲 186 200817517 :、三氯氟甲&、二氣四氟乙烧、…碳或其他適合氣 W呈輪料霧外觀之形式遞送。於加壓氣轉之個案， 可藉由提供用於遞送經計量之量之氣^決定單位劑量。 可、調配含有化合物與適宜粉末基f (例如乳糖或丨殿粉）之 粉末混合的用於吸入器或吹筚 藥筒。 7人樂為的（例如）日月膠的膠囊與
適用於口部（舌下）投藥之調配物包括（例如）含有 存在經調味基|(通常是蔗糖與阿拉伯膠或黃耆膠）中之 :性化合物的蔓齡及含有存在惰性基底（例如，明膠 舁甘油或蔗糖與阿拉伯膠）中之活性化合物的香錠。 所挑璲蛋白酶之醫藥組成物可被調配以用於經由注射 、（例如經由快速注射或連續灌流）之非經腸道投藥。用於 庄射之調配物可呈現例如存在於安瓿或多劑量容器（有添 加防腐劑）中之單位劑量形式。組成物可為存在油性或水 2:體中之懸浮液、溶液或乳液，或可含有諸如懸浮劑、 女定劑與/或分散劑之調配劑。或者，活性成份可呈用於在 使用4以適宜載體（例如滅菌無熱原水或其他溶劑）重建 的粉末形式。 、日提供適用於經皮投藥之調配物。彼等可呈任何適宜形 /、例如適於與接受者表皮持續接觸一段長時間的分 開貼布此類貼布含有活性化合物存在於視需要經緩衝之 水’合液中，例如活性化合物濃度為〇·1至0.2M。適用於經 皮投藥之調酉己物亦可㈣電離子導入（iontophoresis)(參見 例如，農y廣 禾所九(Pharmaceutical Research ) 3(6), 318 187 200817517 (1986))及代表性地採用活性化合物之視需要經緩衝水溶 液。 醫藥組成物亦可藉由受控釋放調配物及/或遞送裝置進 行投藥（參見例如，U_s.專利案號3,536,809 ; 3,598，123 ; 3,630,200 ; 3,845,770 ; 3,847,770 ; 3,916,899 ; 4,008,719 ; 4,687,610 ; 4,769,027 ; 5,〇59,595 ; 5,073,543 ; 5，120,548 ; 5,354,566; 5,591，767; 5,639,476; 5,674,533 及 5,733,566 )。 於某些具體態樣，亦可使用脂質體與/或奈米粒子於所 挑選蛋白酶投藥。脂質體係由分散於水性介質之磷脂類形 成，且自發地形成多層同中心之雙層囊泡（亦稱為多層泡 囊（multilamellar vesicle，MLV) ) 。MLV — 般具有直徑為
25疆至4 nmMLV之超音波震盪導致小的單層囊泡（smaU unilamellar vesicle，SUV)之形成，而SUv具有直徑範圍2〇〇 至5 0 0埃’於核心含有水溶液。 磷脂類當分散於水中時可形成各種除了脂質體以外的 結構，視脂質對水的比例而定。於低比例下，形成脂質體。 脂質體之物理特徵取決於pH值、離子強度與二價陽離子 之存在。脂質體對離子與極性物質呈現低通透性，但是在 升溫下會進行顯著改變其通透性之相轉變。相轉變涉及從 緊在衣填、有次序之結構（稱為凝膠狀態）轉變成鬆散裝 填、較無次序之結構（稱為流體狀態）。此發生於獨特的~ 相-轉變溫度’並導致對離子、糖類與藥物之通透性增加。 脂質體經由不同機制與細胞作用：由網狀内皮系統之 吞噬細胞（例如噬菌體與嗜中性細胞）之胞呑；藉由非專 200817517 厭水性或靜電力：或藉由與細胞表面組成之特別相 所膜而二附至細胞表面糟由將脂質體的脂質雙層插入胞 貝_細胞質膜融合，同時將脂質體内含物釋放至胞質 中’及猎由將至質體的脂質轉移至細胞或次細胞膜（或相 反地）而無脂質體内含物之缔合。改變脂質體調配物可能 改變操作的機制，雖然可同時操作多於一種機制。奈米膠 囊一般可以穩定且可曹；^^ 疋』亶稷之方式包埋化合物。為避免由於 胞内聚合物過載所產生之副作用，應使用能夠於活體内分 解之聚合物來設計此類超細粒子（粒徑大約q i _)。符 合此等需求之生物可分解性聚燒基4基丙賴酯奈米粒子 被預期用於本發明，且此類粒子容易製得。 投藥方法可用於減低所挑選蛋白酶暴露至分解性程序 (例如蛋白分解性降解）及經由抗原與免疫原性反應之免 疫學介入。此類方法之實例包括於治療部位進行局部性投 藥。治療劑之PEG化已經報導可增加對蛋白溶解作用具抗 陡牦加血漿半衰期、及減低抗原性與免疫原性。PEG化 方法為該項技藝已知（參見例如，路與菲力克斯，/^. J. 户卬"A Prokk及以，127_138，1994 ;路與菲力克斯， Peptide Res，，6: U2_6, 1993 •，菲力先斯等人㈤』pe^ide Μ : 253-64, 1995 ;班哈爾等人乂价〇/. C7zd，2伙 13 398 404，1994，布倫紐等人 j /所饥⑽以，Μ#: 3〇88-95, 1995 ;亦參見，卡里西提等人（2〇〇3)以v仏叹及〜 55(7 0).1261-77 及莫理紐斯（2〇〇3)/>/2(2/^(3(：<9，/2以(3/7少23「(§/>, 々：3S-8S ) 。PEG化亦可用於活體内遞送核酸分子。例如 200817517 .:病毒之PEG化可增加穩定度與基因轉殖（參見例如，程 專人（2003) 户/mr所及以⑻：1444-51 ) 〇 可藉由連續灌流活性劑來維持可希望之血液水平，其 、水水平確疋。應注意，主治醫師應知道如何及何時時 終止、中斷或調整治療，以由於毒性或骨髓、肝臟或腎臟 功能障礙而降低劑量。反之，若臨床反應不充分時（預先 排除毒性副作用），主治醫師亦應知道如何及何時調整治 療至較高水平。 ° 醫樂組成物可（例如）藉由口服、肺部、非經腸道（肌 肉内、腹膜内、靜脈内（IV)或皮下注射）、吸人（經由細 =調配物）、經皮、鼻部、陰道、直腸、或舌下之投藥 投藥，且可經調配成適於各別投藥途徑之單位劑量形式（參 見例如國際PCT申請案號w〇 93/25221與WO 94/1 7784 ; 及歐洲專利申請案613,683 )。 所挑選蛋白酶係以足以呈現治療上有用功效而對受治 療患者無不希望副作用之量，包含於醫藥上可接受之載劑 中。治療上有效之濃度可藉由於已知試管内及活體内系統 測試化合物而以實驗方式測定得（例如本文所提供之分 析）。 所挑選蛋白酶於組成物中之濃度取決於該複合體之吸 收、不活化與排除速率、複合體之物理化學特徵、劑量施 用時間表、與所施用藥量以及習於該項技藝人士已知之其 他因素。所挑選蛋白酶欲用於投要以治療疾病或病況（例 如癌症《血管生成症治療）之量可藉由#準臨床技術測定 190 200817517 得。此外， 劑量範圍。確切= 析ΐ動物模式來幫助鑑定最適 途徑及疾病嚴重;:定以貫驗方式測定得)可視投藥 所挑選蛋白酶可一次投单，赤叮 間投荜f h ”或可为成許多用於間隔時 间仅未 < 季父小劑量。 了 段治療時間（例“奴^蛋白扭可以一或多次劑量經- 於有此個宰了# 時、數天、數週、或數月行投藥。 門續投藥。應了解，確切劑量與治療時 由從活體内或試管内測物=已知之測试方法或藉 ^ 立 巧j °式數據之外插法以實驗方式測定 、、“'辰度與劑1值亦可隨欲減輕病況之嚴重度而 二—v 了解，對於任何特定個體應根據各別需要及 投=或管控組成物投藥之人員的專業判斷隨時間調整特別 劑1攝生法，以及本文所列示之濃度範圍僅為例舉性且無 意限制組成物及含有彼等之組合的範圍與用途。組成物可 每小時、每天、每週、每月、每年或—次投藥。含有該等 多肽之組成物以及含有用於基因療法之核酸之組成物的投 藥型式，包括（但不限定於）損傷内、腹膜内、肌肉内及 靜脈内投藥。亦包括者為灌流、氣管内、皮下、脂質體所 "V、儲藏所介導之投藥。亦包括鼻部、眼部、口服、局 部、區域性及耳部遞送。劑量可以實驗方式测定得且取決 於適應症、投藥模式與個體。例舉性劑量包括〇.丨、1、丨〇、 1 00、200及更多mg/天/kg個體體重。 2·所挑選蛋白醃之活艟内表現及基因療法 所挑述蛋白齡可精由表現核酸分子而遞送至細胞與組 191 200817517 織。所挑選蛋白酶可呈編碼所挑選蛋白酶之核酸分子投 藥，包括活體外技術及直接活體内表現。 a·核酸之遞送 核酸可藉由習於該項技藝人士已 細胞或組織。 i·載《-游離型舆整合性 用於藉由編碼核酸分子之表現而投藥所挑選蛋白酶之 f 方法包括重組載體之投藥。載體可經設計以保持游離型， 例如藉由包括複製起點或可經設計以整合至細胞染色體 中。重組型載體可包括病毒載體與非_病毒載體。非限制性 病毒載體包括（例如）腺病毒載體、疱疹病毒載體、反轉 錄病毒載體、及習於該項技藝人士已知之任何其他病毒載 體。非限制性非·病毒載體包括人造染色體或脂質體或其他 主病毒載體。所挑選蛋㈣亦可詩制病㈣體與非_ 活體外基因表現療法。例如，細胞可經設計而 表現所挑遠蛋白酶，例如葬， 鼓人^其kw 9由將所挑選蛋白酶編碼性-核酸 整合入基因組位置中， 1 p A 、、了知作性連接至調節序列或使苴 可刼作性連接至位於基因組位置 一'、 此類細胞局部或全身性於越4 調即序列。然後可將 者。 U王身^樂予個體，例如有需要治療之患 表現。適用於美m、’萬要治療之個體的病毒 腺體-相關病毒t二之：毒载體包括（例如）腺病毒、 腺病毒表現技術:::::技 員技藝人士已熟知，且腺病毒製 192 200817517 造與投藥方法亦已熟知。腺病毒血清型係（可 吴國菌種保存中心（ΑΤΓΓ 、欠* 财㈣田 洛克谷，MD)。腺病毒可於活 月且 ，例如自需要治療之患者分離出細胞，並以表現 所挑選蛋白酶之腺病毒载體轉導。經適宜培養時期後，將 經轉導細胞投藥予個體（局部且/或全身性地）。或者，將 表現所挑遠蛋白酶之腺病毒顆粒分離出並於醫藥上可接受 之載劑中調配1供遞送心預防、料或緩解個體疾病 或病況的治療有效量。代表性地，腺病毒顆粒係以範圍從 1顆粒至urn顆粒每公斤患者體重，一般介於1〇6或ι〇8 顆粒至1012顆粒每公斤患者體重之劑量遞送。於有些狀 况提么、具有耙定細胞之劑（例如對細胞表面膜蛋白或標 靶細胞，或位於標靶細胞上之受體的配體）之核酸來源係 所欲的。 11·人造染色嬗及其他非病毒載饉遞送方法 可將核酸分子併入人造染色體與其他非_病毒載體中。 ( 人造染色體（參見例如，U.S.專利No· 6,077,697及PCT國 際PCT申請案No· W0 〇2/〇97〇59)可經設計以編碼及表現 同功型。 m·脂質Λ舆其他縢囊包封形式及含有核酸之細胞的遞 送 可將核酸包封於載體（例如脂質體）中，或導入細胞 (例如細菌細胞，特別是經減毒之細菌）或導入病毒載體 中。例如，當使用脂質體時，可使用與和胞飲作用相關之 細胞表面膜蛋白結合的蛋白質以供靶定及/或助於攝入，例 193 200817517 如對於特定類型細胞之病 環中進行内化之蛋白質的 内半衰期之蛋白質。 毒殼體蛋白或其片段、 抗體、及挺定胞内定位 對於在循 與增進胞 D,
試管内及活體外遞送 對於活體外及試管内方法，係將編碼所挑選蛋白酶之 核酸分子“至得自適合供者或欲受治療健之細胞中之 可為治療目的將核酸導入其中之細胞包括（例如） 用於欲受治療之疾病或病況的所希望、可利用細胞_， 包括（但不限定於）：上皮細胞、内皮細胞、角質細胞、 成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞；血液細_ τ淋巴細 胞、B淋巴細胞、單核球、巨嗟細胞、嗜中性白細胞、邊 伊紅白細胞、巨核細胞、粒細胞；各種幹或祖細胞，特二 是造血性幹或祖細胞，例如得自骨髓、料血、周邊血液、 胎肝、及其其他來源之幹細胞。
對於活體外治療，係取出得自與欲受治療個體相容之 ，者的細&，或得自欲受治療個體之細胞，將核酸導入此 等經單離細胞並將經修飾細胞投予該個體。治療包括直接 投藥，例如包封於欲植人患者之多孔膜中（參見例如，W N〇S·4,892,538與5,283，187)。適用於試管内將核酸 轉殖入哺乳動物之技術包括脂質體與陽離子 如，DOTMA，DOPE 與 DC-Chol)之使用、雷* ,、 ' 便用、電牙孔、顯微 注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、及磷酸舞沈澱方法。DNA 遞送方法可用於活體内表現所挑選蛋白酶。此類方法包括 核酸之脂質體遞送及裸S囊遞送’包括局部與全二生 194 200817517 遞送’例如使用電穿孔、超音波與麟酸鈣遞送。其他技術 包括顯微注射、細胞融合、染色體-介導之基因轉殖、微細 胞-介導之基因轉殖及原生質球融合。 所挑選蛋白酶之活體内表現可與額外分子之表現結 ^ 例如’可將所挑選蛋白酶之活體内表現與細胞毒性產 物（例如於經設計病毒中）之表現結合或表現於細胞毒性 病毋中。此類病毒可被靶定至其為治療功效之標靶物的特 疋類型細胞。經表現之所挑選蛋白酶可用於增進該病毒之 細胞毒性。 所挑選蛋白酶之活體内表現可包括將所挑選蛋白酶編 碼核酸分子操作性連接至特別調節序列，例如細胞_專一性 或、、且Λ -專一性啟動子。所挑選蛋白酶亦可從專一性感染及 /或複製於標乾細胞與/或組織類型中 之載體表現得。可使 用可誘導啟動子以選擇性調節所挑選蛋白酶表現。 c全身性、區域舆局部性遞送 核馱刀子（呈裸露核酸或存在載體、人造染色體、脂
用於所挑選蛋白酶的表 胞。此類細胞可 現之核酸，然後 195 200817517 例如藉由注射或移植投藥予患者。 2·組合療法 任一本文所述之所挑選蛋白 白酶多肽之核酸分子，可組合、— ，及編碼所挑選蛋 接續於其他治療劍或方法 、間歇地與、或 劑、小分子化合物、及手X:二定於)其他生物 治療為可得之疾病或病況（包括戶藥劑與 可將用於此類疾病或病況之所挑選蛋白’L歹丨牛者）， 例如，本發明所提供之…？蛋白酶多狀與其組合， 之所挑選蛋白酶多a ’ m在/錢（例如癌症者） 拉綠 在其之前、間歇地與、或 、—他抗癌治療劑（例如化學治療劑、放射性核素、 方射療法、細胞因？、生長因子、光敏化劑、毒素、抗- 代謝物、傳訊調制劑、始、皮> &主 子U门市』d抗癌抗生素、抗癌抗體、血管生成 #制子、或其組合）投藥。於一項特別實例，本發明所提 供之用於治療血栓性疾病之所挑選蛋白酶多月太，可組合、 在其之别、間歇地與、或接續於其他抗凝血劑（包括（但 不限定於）血小板抑制子、血管舒張劑、纖維溶解性活化 子、或其他抗凝血劑）投藥。例舉性抗凝血劑包括肝素、 曰豆素水虫至素、阿司匹林、萘普生（naproxen )、甲氣 刀那酉夂（meclofenamic acid )、布洛芬（ibuprofen ) 、σ引 木美辛（indomethacin )、二苯丁唾（phenylbutazare )、 I 氣匹疋（ticlopidine )、鏈激酶（streptokinase )、尿激 酶、與組織血纖維蛋白溶酶原活化子。 3·製品舆套组 196 200817517 所挑選蛋白酶多肽、或編碼所挑選蛋白酶多肽之核 酸、或其衍生物或具生物活性部分的醫藥組成物，可經包 裝呈含有包裝材料，有效用於治療疾病或病症之醫藥組成 物、及指示該所挑選蛋白酶多肽或核酸分子係用於治療該 疾病或病症之標籤的製品。 本發明所提供之製品含有包裝材料。用於包裝醫藥產 品之包裝材料為習於該項技藝人士所熟知。參見例如，u s.
專利 Nos. 5,323,907、5,052,558 及 5,033,252，其各以全文 以引用方式納入本文。醫藥包裝材料之實例包括（但不限 疋於）發泡包裝、瓶子、導管、吸入器、幫浦、袋子、小 "瓦谷的/主射為、藥瓶、及任何適用於所挑選調配物 及所欲投藥與治療模式之包裝材料。本發明所提供化合物 與組成物之廣泛調配物被預期為用於任何標靶物—介導疾 病或病症之各種治療。 所挑選蛋白酶多肽與核酸分子亦可以套組形式提供。 套組可包括本文所述之醫藥組成物及用於投藥之項目。例 如所挑選蛋白酶可以用於投藥之襄置提供，例如注射器、 吸入器、劑量杯、滴管、或 飞敦樂為。套組可（視需要地） 匕括對於施用（包括劑量、 _ 剑里、、口樂攝生法）之說明與與投藥 拉式之說明。套組亦可包括太 匕括本文所述之醫藥組成物及用於 ^ 、、、了匕括用於測量所挑選蛋白 ㈣個體中之濃度、含量或活性的項目。 w於所挑遘蛋白酶多肽之治 本發明所提供之可裂解特 、疋^乾物的所挑選蛋白酶多 197 200817517 狀及編碼本發明所提供之所挑選蛋白酶多肽的核酸分子， 可用於/台療任何與含有標靶序列之蛋白質相關或對其係使 用可衣解私靶序列之蛋白酶的疾病或病況。例如，經設計 用以衣解tP Α標乾雙質（例如血纖維蛋白溶酶原）之所挑 k uPA夕月太可用於治療任何與tpA標把受質相_或對其係 使用tPA多月太之、左、r- + 疾病或病況。與tPA標靶受質相關之例舉 性疾病包括其中以本發明所提供之所挑選蛋白酶治療能促 ί
進血纖維蛋自溶解成其活性蛋自酶形式，並誘導血 塊溶解的血栓溶解之疾病。 、 遥蛋白酶夕肽單獨或與其他藥劑組合會具有治療 心 斤提么、之所挑選蛋白酶多肽係經設計以展現超越競 =結合蛋白的改良特性。此等特性（例如）可增進多肽 «療功效。本段落提供舉性用途與投藥方法。此等所描 处之療法為例舉性而非限定所挑選蛋白酶多肽之應用。 靶序^發明所提供所挑選蛋白酶多肽可用於各種與含有標 伯之蛋白質相關的治療性以及診斷方法。此等方法包 枯（但不限定於） 口。下文所描述與列示之生理及醫學 明所提供所挑選蛋白酶多肽相較於競爭性結合 治療功效，包括= 呈現改進活體内活性與 功效及其他：：功效之較低劑量、更持久的治療 多肽之治療上方面之改良。使用所挑選蛋白酶 (例如腫瘤穿：更=定於)較佳標乾組織穿透 較不常投筚、較低劑置、更少及/或 /咸）副作用及增加治療功效。顯著地，因為 198 200817517 所挑選蛋白酶能裂解並失活高量標乾受質，故所挑選 酶提供實質上的治療性擴大。 尤其’所挑選蛋白酶多肽係欲用於其中已使用裂 定標㈣之蛋㈣進行治療的治療方法。此類方法包括… 不限定於）以下疾病或病症例如（但不限定於）的治療; 法：凝血疾病，包括血栓溶解病症與彌散性血管内凝塊、 =官疾病、神經學病症、增生性疾病（例如癌症）、於
二疾：、自體免疫疾病、病毒感染、細菌感染L 疾病、月腸疾病、與代謝性疾病。 =所《蛋白酶多肽進行之疾病與錢治療可藉由任 何使用如本文所述之適合調配物㈣宜投_ 不限定於)肌肉内、靜脈内、真皮内、腹膜内注射、皮二： 鼻！ :/，、直腸、局部、吸…部（例如舌 差法樂）貫現。若需要’可以實驗方式測定或外 法求仔特別劑量與期間及治療方法。例如，可 t 相似序列之野生型蛋白酶多肽之例舉性劑… 劑量之起始點。例如，重 -、疋適虽 p m tPA ,ffi . 4 、、 夕肽之劑量可用作為決定 衣解心軚靶物之所挑選UPA多肽劑量的指南。 劑量水平與攝生法可基於已知劑量與攝生法來 且若需要，可基於所挑選蛋白酶 及/或可基於各種不同因素以訾化而外插得 ^ 種+ π因素以貫驗方式測定得。可使 半、jrr白酶多肤相較於其他類似蛋白酶之活性水平與 量^攝= 實驗方式測定得特別劑 ”攝生法。其他此類因素包括個體之體重、—般健康、 199 200817517 年齡、所使用特別化合物之活性、性別、飲食、投藥時間、 排除速率、藥物組合、疾病之嚴重度與時程、及患者對疾 病之意向以及治療醫師之判斷。代表性地將活性成份（所 挑選蛋白酶多肽）肖醫藥上有效之載劑組合。可與載劑物 質組合以產生單一劑量形式或多劑量形式之活性成份量可 隨受治療宿主及特別投藥模式而變化。 所挑4蛋白酶夕狀對於疾病之治療或疾病之症狀之緩 解之功效，可使用該項技藝已知用於特別欲受治療疾病之 ^斷測忒[測。於患者病況之改善後，若需要，可投藥維 持片1里之化口物或組成物；且可變更劑量、劑量形式、或 投藥頻數，或其組合。於有些個案，個體於任何疾病症狀 之復發後或基於預定劑量，可能需要基於長期基礎之間歇 性治療。於其他個幸，太料么 〃 在對心性事件（例如出血、創傷或 手術過程）反應時，可能需要額外投藥。 ^ ;有一 Μ例係使用其發揮作為蛋白酶激動劑（亦即 核擬物）或作為蛋白酶拮抗劑之功能之所挑選蛋白酶蛋白 的變體。可藉由誘t (例如，蛋白酶蛋白的分別定點突變 或截短）i生所挑選蛋白酶多肽H所㈣i白❹ 肽之激動劑可保有實質上與所挑選蛋白酶蛋白多肽之天然 產生以相同（或其次組）#生物活性。所挑選蛋白酶多 一 ^可藉由（例如）裂解與所挑選蛋白酶多肽相 同^躲蛋白，而抑制所挑選蛋白酶多肽之天然形式的一 或夕種生物活性。因士 μ 理而產生特定的生物功攻了以具有限定功效之變體處 物功效。於一項具體態樣，個體以具有 200 200817517 、 所挑選蛋白酶多肽之天然產生形式的一次組生物活性之變 體之冶療相對於以所挑選蛋白酶多肽之天然產生形式的治 療，於個體具有較少副作用。 以下為一些對其可使用所挑選蛋白酶單獨或與其他藥 劑組合作為治療劑之例舉性疾病或病況。用於蛋白酶之挑 延之例舉性標靶物係以說明為目的，而非意於限制用於本 發明所提供方法之可能標靶物的範圍。 ^ 1·用於裂解tPA標靶物之所挑選uPA多肽之治療的例 ^ 舉性方法 裂解tPA標靶序列之所挑選uPA多肽可用於供減輕血 才王病症（包括急性與慢性病況）的治療應用。急性病況包 括心臟病與中風以及其他者，而慢性病況包括該等動脈與 深層靜脈血栓形成與再狹窄者。所篩選uPA多肽可用作為 供減輕此類病況症狀之血栓溶解治療劑。治療組成物包括 多肽、單獨cDNA分子、或病毒載體遞送系統或其他基於 载體之基因表現遞送系統的一部分，存在脂質體遞送系統 、 以及類似者之中。用於作為血栓溶解治療劑之組成物一般 為生理上有效量之所挑選uPA多肽，存在醫藥上適宜之賦 形劑中。視投藥模式及欲受治療病況而定，血栓溶解治療 劑係以單一或多劑量進行投藥。習於該項技藝人士應瞭解 劑量變化取決於欲受治療病況。 本發明所提供之抑制或拮抗血液凝結之所挑選多 肽可用於以下用於局部缺血性病症之治療之抗凝血方法： 例如周邊血管病症、肺栓塞、靜脈血栓形成、深層靜脈血 201 200817517 心化成（DVT)、表層血栓性靜脈炎（svt)、動脈血检形 心肌梗塞、暫時性絕血發作、㈣定讀痛、可逆缺 血!·生神㈣缺乏、附加血栓溶解活性、過量凝塊病況、再 灌流損傷、鐮形血球貧血或中風病症。於具有增加過 塊（例如DVT或SVT)危險之患者，於手術期間，可^ 藥本發明所提供之所挑選uPA多肽以防止於手術（例如 不限定於）心、臟手術、血管修復術、肺部手術、腹腔手術、 脊椎手術、腦部手術、血管手術或器官移植手術，包括心 臟、肺、胰臟或肝臟之移植）中之過量結塊。於有些個案， 係單獨以所挑選uPA多肽進行H於有些個案，所挑選 uPA多肽係依所欲治療病況或疾病之需要與其他抗凝血因 子結合。
tPA為急性血栓性中風之唯一療法，其已獲得食品與 藥物管理局（FDA)核准。tPA與其變體於市售可得且已獲准 用於投藥予人類治療各種病況。例如阿替普酶（， Activase®，Genentech，南舊金山，Calif·)為重組人類 tpA。 瑞替普酶（reteplase，Retavase®，Rapilysin®;百靈加英格 曼漢（Boehringer Mannheim)，R0Che Cent〇ror)為人類 tpA 之重組未經糖苷化形式，其中該分子已經基因設計而含有 原始蛋白527個胺基酸中之355個。替尼普酶 (tenecteplase，TNKase®，基因技術）為人類 tpA 之 527 個胺基酸糖蛋白衍生物，其與天然產生的人類tp A差異在 於具有三個胺基酸取代。此等取代減低血漿清除率、增加 血纖維蛋白結合（並藉此增加血纖維蛋白專一性）、並增 202 200817517 加對血纖維蛋白溶酶原活化子抑制子（ΡΑ^)之抗性。阿尼 普酶（anostreplase，Eminase®，史密斯克林貝契姆 (SrmthKline Beecham))為另一種市售可得之人類tPA。本 發明所提供對tPA標靶物具有專一性之所挑選uPA多肽可 經類似修飾及開藥用於任何以tp A治療之療法。 a·血检性疾病舆病況 血心性疾病特徵在於過度凝血，或傾向血塊之發展之 止血失調。例舉性血拴性疾病與病況包括動脈血栓形成、 靜脈血栓形成、靜脈血栓栓塞、肺栓塞、深層靜脈血栓形 成、中風、局部缺血性中風、心肌梗塞、不穩定心絞痛、 心房纖維性顫動、腎損傷、經皮穿腔冠狀血管修復術、彌 散性血管内凝血、敗血病、人造器官、錯開（或義 體（prosthesis)、及其他後天性血栓疾病，如下所述。用 於血栓性疾病之代表性療法涉及抗凝血劑療法，包括凝血 級聯之抑制。 本發明所提供之所挑選uPA多肽及編碼本發明所提供 =所挑選uPA多肽的核酸可用於用在血栓性疾病與病況之 抗凝血劑療法，包括涉及血管内凝血之病況之治療。可使 用本發明所提供之能抑制血液凝集的所挑選upA多肽來（例 )抆制，合解、或防止血栓形成。於一項特別具體態樣， 本發明所提供之所挑選uPA多肽，及編碼本發明所提供之 所挑選uPA多肽的核酸，可用於動脈血栓性病症之治療。 於另一項具體態樣，本發明所提供之所挑選upA多肽，及 編碼本發明所提供之所挑選uPA多肽的核酸可用於靜脈血 203 200817517 栓性病症（例如深層靜脈血栓形成）t治療。於一項特別 具體態樣，本發明所提供之所挑選uPA多肽，及編碼 :所k供之所挑選uPA多肽的核酸可用於治療局部缺血性 病症，例如中風。❹所挑選uPA多肽之治療上改盖 =括=(但不限定於）車交低劑量、更少及/錄不常 又梁、減少副作用、及增加治療功效。可例如藉由 f
物模式’測試所挑選UPA多肽之治療有效性。例如，局部 、血it中風之小氣模式，或任何其他已知之對於血检性疾 :或病況之疾病模式，可以所挑選upA多肽進行治療（多 ㈣★ w細 w 516: 631_635 (1987))。監測疾病症 表形之進展以評估所挑選WA多肽之功效。亦可將所 挑UPA多肽投藥予動物模式以及例如於臨床實驗之個 體以"平估相較於安慰劑控制組之活體内有效性。 i·動脈血栓形成 動脈血栓形成為動脈血管壁破裂之結果。破裂最常發 生於罹患血管疾病（例如粥樣動脈硬化）之患者。動脈血 栓通常形成於擾亂域之區域，及於由於粥樣動脈硬化斑 =所造成破裂的位置，其使血栓生成次内皮暴露至血小板 "" 蛋白，其接著活化凝血級聯。斑塊破裂亦可能由於 出T ’敬入斑塊中，而產生血管之進一步窄化。非閉合性血 才王可能轉變為併入血管壁而可加速粥樣動脈硬化斑塊生 長。動脈血栓之形成可能因阻斷流動或因栓塞進入末梢微 循％而導致局部缺血。抗凝血劑與壓制血小板功能及凝血 、、及聯之藥物可有效於動脈血栓形成的預防及治療。此類藥 204 200817517 物有效用於動脈血栓形成之治療。動脈血栓形成可能導致 不穩定心絞痛與急性心肌梗塞之病況。本發明所提供抑制 凝血之所挑選uPA多肽可用於動脈血栓形成及諸如不穩定 心絞痛與急性心肌梗塞等病況的治療及/或預防。 ii·靜腺血栓形成舆血栓栓塞 靜脈血栓形成一種為其中由於血塊形成對血塊溶解之 訊號不平衡（特別是在低血液流過靜脈系統之情況）而使 血塊形成於靜脈中的病況。血栓形成之結果可包括對靜脈 及靜脈辦膜之損傷，雖然血管壁代表性地仍保持完整。金 塊常會栓塞化或裂開而通過μ運行，其巾彼等可能滞留 在器官區，例如肺部（肺栓塞）、腦（局部缺血性中風、 暫時性局部缺ώ性發作）、心臟（心臟病/心肌梗塞、不 穩定心絞痛）、皮膚（暴發性紫癜（purpurafuimi臟…、 及腎上腺。於有些案例，血流之阻斷可導致死亡。具有復 發靜脈血栓栓塞之傾向的患者之特徵為具有血检好發症 (thr〇mb〇philia)。發展血栓性疾病之危險因子包括創傷、 不動〜I·生疾病、心臟衰竭、肥胖、高水平雌激素、腿部 痲療:心肌梗塞、靜脈瘤曲張、癌症、脫水、吸煙、口服 避手藥、及’fe孕。具有血栓好發症家族之遺傳學研究已顯 不可遺傳之高水平凝A因子，包括FVIII、FIX與㈣（拉 維格等人 Γ/ζΓ〇_·^_· 1:2134-2130 (2003))。 深層靜脈血拾形成（DVT)係指於深層腿部靜脈中之靜 脈血塊形成。造成 爾脈甲之静 之一種主要口素為對靜脈内襯之損 ^血液結塊之傾向增加及血流之減緩。總體而言，此等 205 200817517 因素稱作弗丘氏三聯體（Virchow，s triad)。靜脈在創傷或手 術期間’或因疾病病況（例如Buerger氏病或dic )或另 一結塊而可能變得受損。其他造成DVT發展之因素與前述 所討論的較常見血栓栓塞性疾病之成因類似。於DVT個案 中形成之血塊僅造成次要發炎，因此，令其打散至血流中' 會較為容易。血栓往往可因腿部肌肉之次要收縮而被打 碎。血栓一旦轉變成栓塞後，其可能滯留於肺部血管中， * 而於該處而導致肺部梗塞。血流中具有高水平活性FIX之 患者係處於發展成深層靜脈血栓形成之增高的危險（威特 叉等人 J. Thromb. Haemost· 1(1): 16-18 (2003)) 〇 血栓栓塞性疾病可能遺傳，其中該疾病係因遺傳性凝 血因子異常所造成，因此導致止血失衡。數種先天性缺陷 包括抗凝血酶ΠΙ、蛋白質C、蛋白質s、或血纖維蛋白溶 酶原。其他因子包括對經活化蛋白質c之抗性（亦稱作APC 抗性或因子V閒置效應，其中於於因子V中之突變使其對 由蛋白質C之分解具抗性）、前凝血酶突變、異常血纖維 1 蛋白原血症（造成對纖維溶解具抗性之突變）、及高血高 半胱胺酸症。血栓栓塞性疾病於年輕患者之發展最常係因 為上述之先天性缺陷，且稱之為青少年血拴好發症。 對於靜脈血栓栓塞性疾病與DVT之治療代表性地包括 抗凝血劑療法，其中係投藥口服劑量之肝素與華法林 (warfadn)。肝素通常係灌流至患者以控制急性事件， 接著為使料法林之較長期口服抗凝血齊卜療法來控制未來 的事件。其他療法包括直接凝血酶抑制子、血小板功能抑 206 200817517 制子，例如阿司匹林與葡聚糖、及抵銷靜脈停滯之療法， 包括壓迫彈性襪與肺壓迫裝置。本發明所提供抑制凝血之 所挑選uP A多肽可用於用在血栓栓塞性疾及/或DVT之抗 凝血劑治療。於一些具體實例中，本發明所提供抑制凝血
之所挑選uP A多肽可在呈現對於企栓栓塞性疾病及/或〇VT 之危險因子之患者中用於預防治療血栓栓塞性疾病與/或 DVT 〇 (a)局部缺血性中風 f 絕血性中風發生於流至腦部之血流受中斷時，其中至 腦部區域之循環的突然失去導致相神經學功能之對應喪 失。與出血性中風（其特徵在於腦内出血）相反，局部缺 血性中風通常係因血栓形成或栓塞造成。局部缺血性中風 佔所有中風之大約80%。除了前述關於發展血栓栓塞之成 因與危險因子外，造成腦動脈之分離（dissecti〇n)之過程 (例如創傷' 胸主動脈分離、動脈炎）可能引起栓塞性中 “ 風。其他成因包括狹窄或閉塞動脈末梢之過低灌流，或介 於2腦動脈區域間之脆弱分界區的過低灌流。對於局部缺 血性中風之治療包括用於該病況之預防及治療之抗凝血劑 ^法。本發明所提供抑制凝血之所挑選upA多肽可用於局 邛缺血性中風的治療及/或預防或危險之減少。 iii·後天性凝血病症 後天性凝血病症為以下者病況或疾病之結果：例如維 生素κ缺乏、肝病、彌散性血管内凝血（di 凝血劑發展。血液凝隼之缺指.±广— ^ 八 、知為由病況或疾病所造成凝血 207 200817517 因子之次級缺乏的結果。例如，來自肝臟之凝血因子的製 造常在肝臟處於疾病狀態時缺損。伴隨凝血因子之合成減 少’纖維 >谷解變得增加及血小板缺少症（缺少血小板）增 加。藉由肝臟之凝血因子的製造減少可能導因於爆發性肝 炎或懷孕期之急性脂肪肝。此類病況促進血管内凝塊，其 消耗可利用之凝血因子。本發明所提供抑制凝血之所挑選 uPA多狀可用於治療後天性凝也病症以減輕血液凝結因子 缺乏。
(a)彌散性血管内凝血（DIC) 彌政性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC)為以廣泛且進行中之凝血活化作用為特 欲的病症於DIC，在凝血之凝血酶活化與血塊之血纖維 蛋白溶酶降解之間喪失平衡。所產生之血管與微血管血纖 維蛋白沈積會危及至各種器官之血液供應，其可造成器官 器官衰竭。於次急性或慢性DIC，患者呈現高凝血表型， 具有因過量凝血酶形成而導致之血栓形成，且可能出現各 種血栓形成之症狀與病徵。與急性DIC相反，次急性或慢 性DIC係以減緩高血栓形成之方法治療，包括肝素、抗凝 血酶Π!及經活化蛋白f c治療。本發明所提供之所挑選 uPA多肽及編碼本發明所提供之所㈣心多肽的核酸分 子可用於治療次急性或慢性DIC。於一項具體態樣，本文 之次急性或慢性DIC多肽，及編碼所挑選upA多狀的核酸 =可用於與其他抗凝血療法組合。可例如藉由使用動物 桓式，测試所挑選UPA多肽之#底古^ ^ 夕肽之/口療有效性。監測疾病症狀 208 200817517 及表型之進展，以評估所挑選uPA多肽之功效。亦可將所 挑遥uP A夕肽投藥予動物模式以及例如於臨床實驗中之個 月且以#估相較於安慰劑控制組之活體内有效性。 (b)麵鏑性威染舆牙周炎 叉微生物（例如細菌）之全身性感染常與DIC關連。 减血途徑之向上調節，可能有部份受引起導致細胞因子之 /辰度升咼之發炎反應的微生物細胞膜組成（脂多糖或内毒 素）或細菌外毒素（例如葡萄球菌阿伐毒素）介導。接著， 細胞因子可影響凝血作用之誘導。 細菌性病原體（例如，牙齦卟啉菌（ 0叹/να/ζ、））已沾知為成人牙周炎之成因。牙齦卟琳菌製 造其發揮毒力因子之功能之精胺酸_專一性半胱胺酸蛋白酶 (格瑞尼等人 J· C7k·施6b/· 25:738-740 (1987)，史莫 利專人（9ra/ A/VerM/o/· /所沉“⑽/· 4:178-181 (1989)，馬許 等人 M/crM/o/· 59:181-185 (1989)及波提帕等人 I 5zg/· 273: 21648-21657 (1998))。牙齦卟啉菌產生 兩種稱作50 kDa與95 kDa牙銀蛋白酶（gingipains) r (分 別是RgpB與HRgpA )之蛋白酶。蛋白酶可蛋白分解性裂 解並因此活化凝血因子。於細菌感染期間，牙齦蛋白酶r 往血流中之釋放可因此導致無法控制之凝血級聯活化，造 成凝血酶之過量製造及增加引起彌散性血管内凝血（DIC)的 可能性。於凝血酶濃度之大量增加可能進而對藉由位於牙 周炎部位之破骨細胞之牙槽骨質再吸收有貢獻。 本發明所提供抑制凝血之所挑選uPA多肽，及編碼所 209 200817517 挑選uPA多肽的核酸分子可用於治療牙周炎。可於牙周广 模式中，測試所挑選up A多肽對於通風孔反應之治療有戈 性。此類模式於諸如非人靈長類、狗、小鼠、大鼠、倉鼠、 及天竺鼠之動物中係可得的（韋恩柏格與布拉爾7吖 26(6)，335_34〇)。亦可將所挑選 upA 夕 夕狀
投藥予動物模式以及例如於臨床實驗中之個體以評估相較 於安慰劑控制組之活體内有效性。 X b·其他tPA標靶物-關連之病況 本發明所提供之所挑選uPA多肽亦可用於治療對其已 被指出涉及之的神經學病況。tPA被認為由於tpA水解胞 外基貝蛋白與其他受質之能力，而調節包括組織重塑與可 塑性的生理過程（格拉瓦尼斯與席斯卡（·4)咖49:177_ m)。f罹患例如中風或損傷（例如由於意外或手術） 之事件之患者往往會受可以本發明所提供之所挑選心多 狀治療之神經學損害所苦。所提供之所挑選UPA多肽可用 ;療為各種神經學疾病與病況（包括（但不限定於）神 經退化性疾病’例如多發性硬化、肌萎縮性侧索硬化、次 急性硬化性全腦炎、巴金森氏症、亨丁頓氏病、肌肉營養 由s養缺乏或毒素（例如神經毒素、濫用之藥物） 二：之病況）所苦之患者。此外，所挑選UPA多肽可用於 =認知增進及/或用於治療認知衰退，例如“良性衰老健 '二年齡-相關之記憶損傷’，、“年齡_相關之認知衰 退 專（彼得生笼λ , m^unol〇gicai Meth. 257:107-1 16 (1))及阿滋海默氏症。 210 200817517 所挑選uPA多狀可使用各種用於對神經系統之損傷之 動物模式的任一種測試。可使用之模式包括（但不限定於） 用於血栓栓塞性中風之嗡齒類、兔子、貓、狗、或靈長類 模式（克魯袼與布許hvai. h心·〇/· 37:6〇〇_8 (2〇〇2) ,·古他 钱布利沒 Indian J Physiol. Pharmacol· 48:379-94 (2QQ4))、
用於脊髓損傷之模式（韋布等人〜155:225_3〇 (2004))、等等。亦可於人類測試該等方法與組成物。各 種，用於於動物及人類評估運動、感覺、行為、及/或認知 功能之恢復之不同方法（包括標準化測試與計分系統）係 可得的。可使用任何適合之方法。於—項實例，可使用美 (American Spinal Injury Association e )其已成為用於測量人類感覺功能恢復之主要工具。 關於各種計分系統與方法之實例，參見（例如）馬丁尼兹· ^力查拉，/ Μ咖4G:35_9 (2GG3)，湯馬斯與 。右加 ’ 細· Dev 4〇:25_33 (2〇〇3)，凱斯拉克與基 思泰得，J⑽/ 26:323_8 (2〇〇3)。可藉由於組 織培養系統及動物模式測試藥劑，考量到藥劑之功效及任 何所硯㈣之毒性，而建立用於人類之較佳劑量範圍。 c·診斯方法 本發明所提供之所挑選upA多肽可用於診斷方法，包 括（但不p艮定^、π、 ; 侦測血纖維蛋白與已改變活性之血纖維 =解產物的診斷方法。因此該等分析指示血栓形成病 套么八他Θ斷應用包括含有針對所挑選UPA多肽之抗體的 套組’且Μ於該項技藝人士所熟悉。 211 200817517 2.用於裂解VEGF或VEGFR橾靶物之所挑選蛋白酶 多肽之治療之例舉性方法 血管内皮細胞生長因子（VEGF)為結合並透過特定細胞 表面受體（VEGFR)傳訊來調節血管生成（為其中新血管係 從現有血管產生之過程）之細胞因子。病理性血管生成描 述與疾病相關之血管化增加，且包括諸如固體腫瘤生長（麥 克馬洪，（2000) 5 Suppl 1:3-10 )、黃斑變性及 糖尿病之事件。於癌症中，固體腫瘤需要永遠增加之血液 f 供給以用於生長與轉移。缺氧或致癌性突變會增加於腫瘤 與周圍基質細胞中之VEGF與VEGF-R mRNA水平，導致 現有血管之延伸以及新的血管網路之形成。於濕性黃斑變 性，異常之血管生長形成於黃斑下方。此等血管漏血並流 入黃斑損傷之光受器細胞中。於糖尿病中，至眼部之血液 之缺乏亦可能導致失明。眼部周圍之微血管生長之VEGF 刺激導致無法適當執行功能之雜亂血管。 已鑑定得三種 VEGF之胰蛋白酶激酶家族受體 I ( VEGF-R-1/Flt-l、VEGF-R-2/Flk-l/KDR、VEGF-R-3/Flt-4)。KDR(小鼠同源物為Flk-Ι)係一種具有Kd為400-800 pM之VEGF之高親和性受體（瓦登柏格（1994) CTzem. 269(43):26988-95 )，其專門地表現於内皮細胞上。VEGF 與KDR締合已被鑑定為病理性血管生成所需之關鍵内皮 細胞-專一性傳訊途徑（金（1993) 362 (6423):841-4 ; 密勞爾（1994) 367 (6463):576-9 ;吉島（1999) 幻;· 30(5): 1 179-86 )。受體於配體結合後之雙聚 212 200817517 ’ 化造成胞質功能域自我鱗酸化以及結合夥伴（其將％號傳 至整個細胞質及進入細胞核之以改變細胞生長程式之）之 再補充。使用可溶性VEGF-R2腫瘤之治療可抑制腫瘤生 長（林（1998) Ce// Gr㈣Μ 心· 9(1):49-58 )，且鱗酸化 之化學抑制造成腫瘤變成凋亡（沙賓（1999) c⑽ 59(21):5412-6) 〇 由血管内皮細胞生長因子（VEGF)與其受體進行之傳訊 被指出涉及病理性血管生成及於癌症之腫瘤血管快速發 1 展。阻斷此傳訊途徑之藥物會防止腫瘤血液供給之生長及 維持，並導致腫瘤之整體死亡。最近抗_VEGF抗體 AVASTINtm在罹患轉移性結腸癌患者中之成功，已確認 VEGF為用於癌症之抗-血管生成的標靶物。儘管此等令人 鼓舞之結果，腫瘤進展仍舊已無視於抗_Vegf治療發生。 抗體影響VEGF功能之機制以及抗體如何阻礙腫瘤生長仍 為未知。抑制（knock down)實驗顯示阻斷VEGF功能會阻 斷血管生成。因此，透過VEGFR-2之血管生成傳訊之抑 k 制表現非常適合具有新穎標靶之經設計蛋白酶的開發的低 開發治療領域。 專一地靶定VEGF受體與Flk_1/KDR之療法已抑制病 理性血管生成且已在多數人類與小鼠固體腫瘤之小鼠模式 中顯示腫瘤尺寸減小（皮瑞特（1999) 及以· 59(20): 209 18，豐（1999)心印/似，·“ ι(ι)·3ΐ-41· Erratum 於：（1 999) 1(2):183)，其為單獨及與細胞毒性療法組合（克 雷門特（2000) J C7M /⑽咖· 105(8):R15_24)。使用小分子 213 200817517 抑制子與抗體之研究確認了 VEGF受體家族為有效的抗-血 管生成標靶物但仍然需要更有效的治療法。 VEGFR係由七個類_免疫球蛋白（ig)功能域、一個跨膜 區、與兩個胞質絡胺酸蛋白酶功能域組成。前三個類？ 功能域已顯示會調節配體結合，而功能域4至7在抑制正 確雙聚化及無配體存在下之傳訊上具有重要性。作為由經 設計蛋白酶選擇性蛋白分解之標物，其具有下列有希望 的標革巴物特徵：容易進行蛋白分解之不安定胺基酸區域； 六員大乳與小机物種間之高序列同一性；於裂解後向下 調節傳訊；及能夠非有成果地結合配體之可溶性受體的蛋 白分解產生。VEGFR_2之數個區域可用於專一性蛋白分 解，包括跨膜區前之柄區，及類_Ig功能域間未形成結構 之環。於一項實例，本發明所提供之類_絲胺酸蛋白酶可經 。又。十以於其峥膜與細胞因子或生長因子（例如)結 合功能域之間裂解受體。功能在於將蛋白質受體拘束於細 胞表面或裱區域之柄區藉此從多肽鏈之球狀功能域脫離。 a·血管生成、癌症、舆其他細胞遇期依籟性疾病或病 況 本發明所提供之例舉性所挑選蛋白酶裂解負責血管生 成之調節之VEGF或VEGFR。在細胞表面分子為於腫瘤血 吕生成中傳訊之VEGFR之情況下，裂解可預防腫瘤擴散。 例如，自VEGFR分子之細胞表面功能域的裂解可不活化 其傳送胞外訊號（特別是細胞增殖訊號）之能力。若無血 官生成以餵養腫瘤’癌細胞往往無法增殖。於一項具體態 214 200817517 樣，本發明所提供之所挑 :曰酶於疋用於治療癌症。又， VEGFR之裂解可用於調節其 他肩症（例如黃斑病變、發炎 及糖尿病）中之血管生成。於一 項具體悲樣，裂解涉及細 胞週期進展之標靶VEGF戋VFrpp求 所 A VEGFR蛋白會不活化該蛋白 質允許細胞週期繼續進行之能 丁1月匕力。右無細胞週期之繼續， 癌細胞無法增殖。於是，本發明所提供裂解獨μ vegfr 之所挑選蛋⑽係用於治療癌症及其他細胞週期依賴性病 狀0
本為明所提供之所挑選蛋白酶亦可裂解負責致瘤性之 m生蛋白貝。裂冑VEGF多狀防止透過VEGF受體之傳 訊並減少血管生成，因此減少於其中血管生成具有重要性 之疾病，例如癌症、黃斑病變、發炎及糖尿病。再者，vegf 傳。fl於某些特定細胞類型中負責細胞週期之調節。於是， 本發明所提供裂解VEGF或VEGFR之所挑選蛋白酶可用 於癌症及其他細胞週期依賴性病狀之治療。 b·使用裂解VEGF或VEGFR之所挑選蛋白酶之组合 療法 於項具體恶樣’病症（例如癌症）之治療包含對有 而要之患者投藥予治療上有效量之專一性裂解並失活 VEGF/VEGFR_2複合體之傳訊之蛋白酶，例如與至少一種 抗癌劑組合。抗血管生成療法已被證明成功對抗固體腫瘤 與血液學惡性腫瘤兩者（參見例如，利巴提等人（2003) //㈣如☆//及以· 12(1)，11-22)。於是，本發明 所k供作為抗血管生成療法之組成物可助於血液學與固體 215 200817517 組織惡性遽瘤兩者之治療。本發明所提供之治療組成物及 方法可單獨投藥或與任何其他習於該項技藝人士已知之適 當抗癌治療組合。例如，本發明所提供之所挑選蛋白酶可 於其中AVASTIN™投藥提供治療上助益之療法中與 AVASTIN™組合或取代之而投藥。 於一項具體態樣，抗癌劑為至少一種化學治療劑。於 相關之具體態樣，蛋白酶之投藥係與至少一種放射療法& 合。組合療法之投藥將減弱血管生成訊號並產生一群減低 游離態VEGF水平之可溶性受體。於一項特別具體態樣， 本發明所提供之所挑選蛋白酶具有吻合六個胺基酸區域上 之叉體重要區域（Flk.1/KDR柄）的試管内專一性。 本發明所提供之所挑選蛋白酶可於含有多於一種治療 劍之組成物中進行投藥。治療劑可為相同或不同，且可為 (例如）&療用放射性核素、藥物、激素、激素拮 受體拮抗劑、酵素或受另一劑活化之酶原、自分泌物、細 胞因子或習於該項技藝人士已知之任何適宜抗癌劑。於一 項具體態樣，與所挑選蛋白酶多肽共同投藥之抗癌劑為 avastin™。其他 机L J為 、了用於柄明所提供方法之治療劑包括 母素、抗-DNA、抗-RNA、放射俨A々〜从什 義寡核苦酸）、抗-蛋白質Γ/ΪΓ (例如反 私h 貝一抗-染色質細胞毒性或抗微生 劑。其他治療劑為習於該項技藝人士已知 此類其他治療劑根據本發明所提供方法之使用。j… 抗腫瘤劑可為許多化學治劑其中之一，例如燒化劑、 代謝物、激素性藥劑、抗生素、抗體、抗癌生物劑、格 216 200817517 力維克（Gieevee)、秋水仙素、長春花植物驗、L·天久醯胺 姆、丙卡巴耕（pr〇cabazine)、經基脲、曼托坦（她。_)、 石肖基脲或味唾氨甲酿胺。適宜藥劍為該等促進微管蛋白去 極化或防止腫瘤細胞增生之藥齊卜所預期之化學： 括（但不限定於）列示於具有治療等價評估之已核准藥口 之橘皮書（Orange Book of Appr〇Ved〜⑽灿％油
Th⑽Peutic Equiva丨ence Evaiuati〇n’由食品與藥物管理局 及美國健康與人類服務部門編纂）之抗癌劑。除了前“ 學治療劑之外，本發明所提供之類_絲胺酸蛋白酶蛋白酶 亦可與放射療法治療一起投藥。預期該項技藝已知之額外 治療。 治療劑可為化學治療劑。化學治療劑為該項技藝已知， 且包括至少紫杉烧類、氮芥、伸乙亞胺衍生物、烧基石备酸 西旨、石肖基脲類、三肼類、葉酸類似物、㈣類似物…票呤 類似物、長春花植物鹼、抗生素、酵素、鉑配位錯合物、 經取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮脂素阻抑劑、或拮抗 劑。更具體地，化學治療劑可為一或多種選自由類固醇、 孕留酮、雌激素、抗雌激素、或雄激素組成之非限制性組 群。甚至更具體地’化學治療劑可為氮雜尿_(azaHbine)、 博來霉素（ble〇myCin)、百利德定（bryostatin-i)、白消 安（busulfan)、卡蕈司丁 γ ^ . 、 、J ’丁（，carmustine )、苯丁 酸氮芥 (chlorambucil )、川頁翻 Γ _ 丨貝4白Cclsplatln) 、cpiM1、環磷醯胺 (cyclophosphamide)、阿糖胞苷（cytarabine)、達卡巴 畊（dacarbazine)、更生霉素（dactin〇mycin)、柔紅霉 217 200817517 • 素（daunorubicin )、地塞米松（dexamethasone )、己細 雌酚（diethylstilbestrol )、艾霉素（doxorubicin )、乙炔 雌二醇（ethinyl estradiol )、伊托泊普（etoposide )、氟 尿口密口定（fluorouracil )、氟甲睾酮（fluoxymesterone )、 吉西他濱 （gemcitabine ) 、己酸經基孕嗣 (hydroxyprogesterone caproate )、經基脲（hydroxyurea )、 L-天冬醯胺酶（L-asparaginase)、亞葉酸（leucovorin)、 羅莫司汀（lomustine、氮芥（mechlorethamine )、 C medroprogesterone acetate、醋酸甲經孕酮（megestrol acetate)、甲地孕酮、苯丙胺酸氮芥（melphalan)、疏嗓 呤（mercaptopurine )、氨甲蝶呤（methotrexate )、光輝 霉素（mithramycin )、絲裂霉素（mitomycin )、曼托坦 (mitotane ) 、丁 酸苯 S旨（phenyl butyrate )、潑泥松 (prednisone )、丙卡巴肼（procarbazine )、司莫司、;丁 (semustine )、鏈唑霉素（streptozocin )、他莫昔芬 (tamoxifen)、紫杉烷類（taxanes )、紫杉醇（taxol )、 #- 、 丙酸睾 _( testosterone propionate )、沙立度胺 (thalidomide )、硫鳥嘌呤（thioguanine )、噻替哌 (thiotepa )、尿 °密 σ定氮芥（uracil mustard )、長春驗 (vinblastine )、或長春新驗（vincristine )。亦預期使用 化學治療劑之任意組合。化學治療劑之投藥可於類_絲胺酸 蛋白酶突變多肽之投藥之前、期間或之後。 其他適用於與本發明所提供之所挑選蛋白酶多肽組 合，或共同投藥的治療劑係選自由放射性同位素、硼加成 218 200817517 2、免疫調節劑、毒素、光活化子或染料、癌症化學治療 藥物、抗病毒藥物、抗真菌藥物、抗菌藥物、抗原蟲藥物 與化學敏化劑所組成之組群（參見u s. Pat. N〇s. 4,925,648 及4,932,412 )。適宜之化學治療劑係經描述於（例如）雷 明頓製藥科學，19th Ed•(馬克出版c〇 1995 )，及於古 得曼與吉爾曼之治療制之製藥學基礎（the PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，古得 哭等人，Eds·麥克米拉出版c〇•，紐約，198〇與2〇〇1版）。 ，他適且之化學治療劑（例如實驗藥物），為習於該項技 蟄人士已知。又，適宜之治療用放射性同位素係選自由X-务射體β务射體、丫-發射體、奥格（auger )電子發射體、 务射α-粒子之中子捕捉劑與藉由電子捕捉衰變之放射性同 位素所組成之組群。較佳地，放射性同位素係選自ale、 198Au、32p、131卜 1311、9〇γ、186Re、188以、67Cu、177Lu、213則、 〗0B與2"At所組成之組群。 在使用多於一種治療劑與本發明所提供之所挑選蛋白 酶、、且口之情況下，彼等可為同種類或類型或可來自不同種 頒或頰型。例如，治療劑可包含不同放射性核素，或藥物 與放射性核素。 於另一具體態樣，係使用因其個別能量發射而在不同 2離起作用的相異同位素作為與本發明所提供之蛋白酶組 口的第一及第二治療劑。此等劑可用於達成腫瘤之更有效 治 ， 口 '、且可用於如在正常臨床狀況下，呈現多數大小不同 腫瘤之患者。 219 200817517 少數可利用之同位餐可 ‘菸抑 了用於>σ療非常最小的腫瘤附著 物及單一細胞。於J：卜望处、η ^ 、 狀況，樂物或毒素可為用於與本發 明所k供之蛋白酶共同投率 此旦H门 x梁的更有用治療劑。於是，於有 一讀，同㈣係與非_同位素物種（例如藥物、毒素、
中子捕捉^)組合使用並與本發明所提供之蛋白酶共同 投藥。許多藥物與毒素為已知，其對於細胞具有細胞毒性 功效，且可與本發明所提供之蛋白酶組合使用。彼等係見 於樂物與毒素手冊’例如默克索引，古得曼與吉爾曼、以 及類似者，及於前述所引用之文獻。 干擾細胞内*白質合成之藥物,亦可與蛋白酶組合用於 本發明之治療方法中；此類藥物為習於該項技藝人士已 知，且包括嘌呤霉素、環己醯亞胺、及核酸酶。 本發明所提供之治療方法可用於癌症療法。已熟知放 射性同位素、藥物及毒素可與專—性結合至由癌細胞製造 或與其相關之標記物的抗體或抗體片段共軛，且此等抗體 共軛物可用於將放射性同位素、藥物或毒素靶定至腫瘤部 位，以增進其治療功效並使副作用減至最低。此等劑與方 法之貫例係於瓦兹查克與妥培（於癌症之細胞與分子生物 ( Introduction to the Cellular and Molecular Biology of
Cancer) ’ L. M.法藍克斯與n· M.泰奇，eds，第18章，pp. 378-410,牛津大學出版牛津，i986之序言）、於免疫共軛 物·抗體共輛物於放射顯影及癌症療法（Immunoconjugates:
Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of
Cancer ’ C. W· Vogel，ed·，3-300，Oxford University Press， 220 200817517 • Ν.Υ·，1987 )、於迪爾曼，R. Ο. ( CRC臨床回顧於致癌學/ 血液學（CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology) 1:357, CRC Press，Inc·，1984)、於巴斯坦等人（Cell 47:641， 19 86 )、於維提他等人（Science 238:1098-1 104，1987 )及 於布拉迪等人（Int. J· Rad. Oncol. Biol· Phys. 13:1535-1544, 1987 )回顧。免疫共軛物於癌症及其他治療形式之用途之 其他實例已經揭示（尤其）於U.S. Pat. Nos. 4,331，647、 4,348,376、4,361，544、4,468,457 ' 4,444,744 ' 4,460,459、 f ' 4,460,561 4,624,846、4,818,709、4,046,722、4,671，958、 4,046,784、5,332,567、5,443,953、5,541，297、5,601，825、 5,635,603、5,637,288、5,677,427、5,686,578、5,698，178、 5,789,554、5,922,302、6，187,287、以及 6,319,500。 此外’本發明所提供之治療方法包括該等其中本發明 之所挑選蛋白酶係與其他用於防止、減緩或逆轉某些細胞 毒性劑之副作用的化合物或技術組合使用。此類組合之實 ( 例包括（例如）IL_1與用於快速清除之抗體一起投藥，如 例如於U.S· Pat. No. 4,624,846所述。此類投藥可於投藥以 與抗癌劑（例如，與作為細胞毒性組成之放射性同位素、 藥物或毒素）組合之粒酶B突變蛋白或MT_spi突變蛋白 的主要治療性治療之投藥後3至72小時進行。此可用於 立曰加共軛物、藥物或毒素從循環之清除，及減緩或逆轉由 治療劑引起的骨髓或造血毒性。 ^ 於另一貫例，且如前所述，癌症療法可包含多於一種 腫瘤θ丨之級合’例如藥物與放射性同位素，或放射性同 221 200817517 位素與用於中子活化療法之蝴_10劑，或藥物與生物反應 改性劑，或融合分子共輒物與生物反應改性劑。可將細胞 因子納入此類攝生法中以極大化其各組成之功效。 同樣，某些與其為β或α-發射體之放射性同位素共軛 之抗白血病及抗淋巴瘤抗體當此等藥劑並非僅僅指向腫瘤 細胞時’可能誘發骨髓與其他造血性副作用。此尤其在腫 瘤細胞係存在循環中及血液形成器官中時被觀察到。至少 一種造血性細胞因子（例如生長因子，如群落刺激因子， 例如G-CSF與GM-CSF)之同時及/或後續投藥係較佳地以 減低或減輕造血性副作用，同時增加抗癌功效。 該項技藝中已熟知各種放射性核素療法之方法可用於 癌症與其他病理狀況之治療，如描述於哈柏特“核醫學療 法（Nuclear Medicine Therapy) ” ，紐約，提姆醫學出版 社，1087, ρρ· 1-340。熟練於此等方法之臨床醫師會容易 地能夠修改本文所述之細胞因子佐劑療法成如此方法以減 (緩任何其造血性副作用。同樣，以與蛋白酶突變蛋白共投 藥之細胞毒性藥物的療法，可用於（例如）癌症、感染性 或自體免疫疾病之治療，及用於器官排斥療法。此類療法 係由與以同位素或經放射標定抗體之放射性同位素療法類 似的原理支配，因此，一般技術之臨床醫師將能藉由在主 要抗癌療法之前、期間或之後細胞因子之投藥而修改細胞 因子用途之性質以減輕骨髓抑制及其他此類造血性副作 用0 Κ·實施例 222 200817517 - 下列實施例係僅為例舉說明之目的納入，且並非欲於 限制本發明範圍。 實施例1 突變型PAI-1抑制子 A.突變型PAI-1抑制子之表現舆純化 使用pPAIST7HS (為帶有人類PAI-1之cDNA (編碼 如SEQ ID NO:3 96所列示之含有N-端Met的成熟PAI-1) 的重組質體）作為將修飾導入PAI-1反應性中心環之胺基 ( 酸序列中的模板。質體pPAISTHS為質體pPAIST7之衍生 物，缺乏位於核苷酸對1之切位及位於核苷酸對 2106之5W/切位。質體pPAIST7係如所述產生（法藍基 等人（1990) 103 7: 16-23 )。 簡言之，將PAI-1 cDNA純株pPAI-llRB以限制核酸内切 酶JpaZ/與户/7M/裂解，並將含有對應PAI-1之殘基1之 密碼子的2 bp及對應379-殘基蛋白質之殘基2-376的全長 編碼序列之PAI-1之1127 bp片段，以凝膠電泳術純化。 I 架構合成型連接物以重新構築PAI-1 cDNA編碼序列之兩 端，並緊接於編碼成熟PAI-1之第一個殘基的三連子之前 導入ATG蛋白合成起始密碼子，產生具有SEQ ID NO:3 96 所列示胺基酸序列之成熟ΡΑΙ· 1。此外，為助於將cDNA 編碼區插入質體pBR322中，將連接物設計成分別於PAI-1 cDNA片段之5’及3’端產生五⑶及/與/i7/^///限制核酸内切 酶切位。合成型連接物如下：N-端5’AATTCTATGG-3’（SEQ ID NO:392)與 5，- TGCACCATAG-3’（SEQ ID NO:393)，； 223 200817517 C-端，5，- ATGGAACCCTGAA- 3，（SEQ ID NO:394)與5，-AGCTTCAGGGTTCCATCAC· 3’（SEQ ID NO:395)。將連接 物在使用前以聚核苷酸激酶處理。然後將合成型連接物（1 〇 bp位於5’末端而13 bp位於3’末端）與1127 bp DNA片段接合，以五coi?/與//kd///消化，並藉由凝膠電 泳術將 1146 bp五片段分離出，並選殖入經 五co/?/ 與 //zid/// 裂解之 pBR322 中（SEQ ID NO:377)。 為開始pPAIST-7表現載體之構築，遂將存在pBR322 載體中之次選殖株以五ai?/裂解，並將線形質體使用細菌 鹼性磷酸酶去磷酸化。使用得自含有trp啟動子與核糖體 結合部位之pC5A_48的360 bp五coT?/ DNA片段，在經標 準接合後產生pPAIST-7。 為產生PPAIST7HS原核表現載體（舒貝塔等人（1990) «7 Biol. Chem., 265: 1 8379· 1 8385 )，將 pPAIST7 以 //kd/// 部份消化以線形化質體、以大腸桿菌DNA聚合酶I之克里 諾片段鈍化末端並接合，以消除上游//Md///部位。PPAIST7 中位於PAI-1編碼序列下游介於ffindlll與Sa!I切位間的 序列的刪除以及切位之排除係藉由後續部份Sa//消 化、完全所W///消化、以大腸桿菌DNA聚合酶I之克里 諾片段鈍化末端、並接合而完成。 使用多位點誘變套組（史塔金）依照供應商所指定之 條件進行誘變反應。製造於野生型ΡΑΙ-1中於反應性中心 環之位置Ρ4-ΡΓ的胺基酸，對應於胺基酸VSARM (SEQ ID NO:3 78)之誘變。製得突變型PAI-l(PAI-l/RRAR)，其位於 224 200817517 - ΡΑΙ-l反應性中心環從P4至ΡΓ位置含有野生型胺基酸序 歹|J VSARM 以 RRARM (SEQ ID ΝΟ:379)序列之置換。RRARM 誘變引子之序列為：5’- CCACAGCTGTCATAAGGAGGGC CAGAATGGCCCCCGAGGAGATC-3, (SEQ ID ΝΟ:380)。製 得第二種突變型ΡΑΙ-1 (ΡΑΙ-1/69)，其位於ΡΑΙ-1反應性 中心環從Ρ4至Plf位置含有野生型型胺基酸序列VSARM 以PFGRS (SEQ ID NO:389)之置換。PFGRS誘變引子之序 歹》J 為：5’ CCACAGCTGTCATACCCTTCGGCAGAAGCGCC Γ CCCGAGGAGATC-3，（SEQ ID NO:390)。於誘變後，將從 轉型株分離出之DNA完全定序，以確認所希望之突變之 存在，而無任何額外的突變。 利用存在於PPAIST7HS載體中之N-端聚組胺酸殘基， 將突變型PAI-1/RRAR與ΡΑΙ_1/69表現呈融合蛋白質。突 變型PAI-1 (亦即PAI-1/RRAR與PAI-1/69)之表現與純 化係基於如凱等人（/ 5b/· C/zem·，272: 16603-16609 (1997))所述之方法。PAI-1之野生型與經突變變體的表現 I 係藉由將O.lpg編碼突變型PAI-1之pPAIST7HS載體的 DNA轉型至大腸桿菌株BL21[DE3]pLyss (諾瓦金）中，其 於異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖哌喃糖苷存在下合成T7 RNA 聚合酶。將細菌培養物伴隨劇烈搖晃，培養於37°C下達 到吸光值^595為’並將異丙基""I -硫代-半乳糖 哌喃糖苷加入達最終濃度為1 mM，來誘導T7 RNA聚合酶 之合成及PAI-1蛋白之製造。將培養物於37°C下再另生 長1-2 h，然後轉換至30。<：培養2-6 h。將細胞藉由於8000xg 225 200817517 於4QC下離心20min沈澱，並再懸浮於4〇ml冷凍起始緩 衝液（20mM 醋酸鈉，200mM NaCl 與 0.01% Tween 20，pH 5·6 )中。將細胞懸浮液於French壓力室（French pressure cell，Aminco)中打破，並將細胞碎片藉由於32,〇〇〇χ《下超 高速離心25 min去除。
藉由將含有PAI-1/RRAR或PAI-1/69之可溶性形式的 大腸桿菌溶解產物，注射於裝填CM_5〇 Sephadex (法瑪西 亞Pharmacia，參見例如桑可等人（1994)心r y224, 125-134 )之XK-26管柱（法瑪西亞生物科技pharmacia Biotech Inc)上，而進行可溶性、活性突變型卩八〗]之純 化。將管柱以5管柱體積之起始緩衝液（2〇mM醋酸鈉， 200mM NaCl 與 0·01〇/〇 Tween 20，PH 5.6)沖洗，並使用 0-2-1.8 M NAC1於相同緩衝液之線性梯度溶析ρΑι_ι蛋白 貝。收集咼峰流伤，匯集，並使用Centriplus %濃縮琴 (Amicon)濃縮。將經濃縮流份用於活性測量。 B.PAI-1活性測董 1 ·對標準胰蛋白酶之活性部位滴定 一 PAM/RRAR與PAI_1/69之活性漠度，係藉由如歐爾 森等人（/·价〇/·(：心所·，270: 30007 (1995))所述對標準胰 蛋白酶之活性部位滴定進行測定。簡言之，連續添加經濃 縮之抑制子（0.5 - 6.0 μΜ)至i μΜ ρ·胰蛋白酶（西格瑪 (Sigma))與10μΜρ_胺基苄脒探針（西格瑪）之溶液。 從伴隨在抑制子結合時所結合探針自酵素活性部位之置換 於军光的減弱來監測結合。在添加各經濃縮抑制子後，允 226 200817517 許1-2分鐘平衡時間，之後為於激發與發散波長分別為325 nm及345 nm之螢光變化的評估，以極大化結合與游離態 探針螢光間之差異。進行只含探針與抑制子而無胰蛋白酶 酵素存在之對照組滴定，以校正背景螢光值。將抑制子-酵 素滴定擬合線性回歸分析。 2.經標準化t-PA製劑之滴定 亦將突變型PAI-1對經標準化t-PA製劑進行滴定以評 估活性。野生型PAI-1或突變型PAI-1之抑制活性，係藉 由使用 t_PA (美國診斷學（American Diagnostics )，Inc，100 U/pg)與顯色之t-PA受質H-Z)-Ile-Pro-Arg-/7ara_石肖基苯胺 受質（S-2288，Chromogenix)的直接顯色分析來測量。將 系列稀釋之PAI-1 (0.1 - 4_0 pg)與t-PA微量平盤中，於室 溫下培育一段固定時間（代表性地，20-60分鐘），並藉 由添加顯色受質S-2288至終濃度為0.5 mM測量t-PA的殘 餘活性。於與漸增濃度之抑制子培育後，藉由測量於405 nm 下之吸光值評估t_PA的殘餘活性。 實施例2 ti-PA變«之噬菌«展示文庫的構築 A.野生型ti-PA選殖入噬箱粒中
為於噬菌體上示範u-PA之蛋白酶功能域功能性展示， 遂使用引子496與497、Pfu DNA聚合酶與含有全長u-PA 基因之 c-DNA (SEQ ID NO:474)的 pCMV4 質體（SEQ ID NO:373)作為模板進行高正確性PCR。用於PCR擴增之引 子如下：496 ， 5^ACGTGGCCCAGGCGGCCTTTCAGTGT 227 200817517 • GGCCAAAAG-3’（SEQ ID NO: 374) ; 497，5?-TCCTGGCC GGCCTGGCCGAGCAGGCCATTCTC'V (SEQ ID NO: 375)。 二引子於5’末端皆帶有5/Π酵素之限制切位（畫底線）。 經醇化及5/ΪΙ消化後，將PCR產物接合至經S/ζΊ分解之噬 菌粒載體，pComb3H (SEQ ID NO:376)(安得里斯·韋得赫 夫等人（2000) J /mmw 叩 / 28: 159-81)。將該嗤菌 粒用於野生型或突變型u-PA之單價展示（參見下述）。 此構體含有編碼fd嗤菌體glllp基因之C-端區域的序列。 Γ 利用具有兩種不同辨識序列之質體中存在的兩個5//I限制 切位，來設計前述引子。使用引子496與497擴增得之PCR 產物，使u-PA蛋白酶功能域cDNA (SEQ ID NO:475)定向 選殖入噬菌粒中成為可能（接合條件參見下述）。於最終 構體，係將含有u-PA蛋白酶功能域之序列的PCR產物選 殖於OmpA與glllp序列中間，以呈N-端glllp融合展示 野生型或突變型u-PA。 B·突變型u-PA及突變型ii-ΡΑ之噬鏑髏展示文庫之構 I 築 為構築u-PA噬菌體展示文庫，使用含有UPA基因之 cDNA的pCMV4/u-PA質體（如前所示）作為模板進行易 錯PCR擴增，其於100 μΐ反應混合物中使用由PCR多樣 性誘變套組（PCR Diversity mutagenesis Kit)(克隆技術） 所供應之試劑進行25次循環。依循適當PCR條件設定三 種不同PCR反應，以使用前述之引子496與497僅擴增uPA 基因之蛋白酶功能域（SEQ ID NO :475)，藉由改變錳（MN2 + ) 228 200817517 或dGTP里（如製造商所述），而達到〇·2、〇·5或〇·州之
大又率併入5亥cDNA中。將經擴增之pcR產物（8〇5 bp，SEQ ID NO:475)使用PCR純化套組（查爾金）純化，隨後以明工 酵素消化。#自各誘變反應之經明丨分解的pcR產物係用 於產生三種不同文庫。 對於文庫構築，係將pC〇mb3H載體（SEQ m n〇:376) 以s//i酵素消化，並將得自此反應之較大DNA片段使用“凝 膠切片套組（Gel slice kit) ”（奎爾金）凝膠純化。進行三 個開的別接合反應以使用含〇·2、〇·5及〇 9%突變率之 產物構築三種文庫。將至少丨料經凝膠純化之載體與經办Η 4化的PCR產物（1:2比例）混合，並將接合混合物於18〇c 下培月過仪。接著，將接合混合物使用奎爾金少量溶析套 組（mini elute kit)(奎爾金）純化，並將DNA最後溶析 於60 μΐ之Milli Q純水中。將經純化之DNA使用基因脈 衝儀（gene pulser) (Bio Rad)電穿孔入400 μ1大腸桿菌XL B1Uel電穿孔勝任細胞（史塔金）中。然後將細胞轉移至1Q ml之SOC培養基（因維托金），並於37°C下於搖晃機中培 育1 hr，隨後塗布於以羧苄青霉素（carbenici出n，乃^g/mL) 補充之大LB璦脂平板（245 mm X 245 mm)上。將平板於 3〇°C培育過夜後，使用細胞刮刀刮取轉型株，並將所成之 培養物於37。(：搖晃下生長於以羧苄青霉素（75 gg/mL)補 充之2X YT培養基中2小時。將培養物以辅助嗟菌體（vcs Μ13)以MOI(感染之重複數）為5感染以擴增文庫。於37〇c 搖晃下生長1小時後，將培養物以肯那霉素補充至終濃度 229 200817517 為3 pg/mL，並30°C下伴隨搖晃生長過夜。收取細胞並將 存在上清液中之噬菌體顆粒使用pEG_NaC1溶液沈澱。同 時，為計算各文庫之多樣性，將等分量之經電穿孔之細胞 塗布於以羧苄青霉素（100 Mg/mL)補充之LB瓊脂平板上， 並於37〇C下培育過夜後計數菌落。使用相同方法以產生 連續數代u-PA噬菌體展示文庫，以供進一步改進所鑑認 付針對PAI-1/RRAR抑制子之U_PA變體。將從先前文庫鑑 認得之u-PA變體的DNA被用作為用於構築次代文庫之模 板。 野生型或使用隨機誘變產生之u-PA嗤菌體文庫的催 化功效，係使用間接血纖維蛋白溶酶原活化分析分析。簡 3之，5 μΐ之u-PA兔囷體（代表性地〜5xi〇12cfu)、〇·2μΜ Lys-血纖維蛋白溶酶原（美國診斷學）及〇 62 mM Spectrozyme PL (美國診斷學）以總體積為1〇〇 μ1呈現。 於微量滴定平盤中進行分析，並於Molecular Devices
Thermomax中每30秒讀取405 nm下之光學密度達1 h。 反應於37°C下進行。亦評估ιι-ΡΑ或u-PA變體噬菌體之 抑制。簡言之，將5 μΐ之u-PA噬菌體（代表性地〜5xl〇u cfu)與 wt-PAI-1 (0·1 μΜ)或突變型 PAI-1/RRAR 抑制子 (1 ·0 μΜ)混合，並於室溫下培育30 min，隨後將0.62 mM Spectrozyme PL、0·2 μΜ Lys-血纖維蛋白溶酶原（美國診斷 學，Inc.)加入。如上述讀取分析值。 實施例3 從ii-PA噬鏑《文庫針對突變型抑制子挑選變異型 230 200817517
PA A.ii-PA噬繭髏/突變型PAI-1複合鼉之挑選 使用突變型PAI-l/RRAR抑制子或pAj-i/69作為淘選 貫驗中之誘餌受質”，以從前述實施例2中所述之大型、 組合u-PA喔囟體展示文庫分離出對突變型受質序列具有 改良反應性的經改變U_PA噬菌體，如實施例2所述。簡 吕之’將5 μΐ (〜2 X ΙΟ"至〜1 χι〇13) u_pA噬菌體（其含 有知自全部三種U-PA噬菌體文庫（〇·2、〇·5及〇·9%誘變頻 率）之同等u-PA嗟菌體表現）與5 μι誘餌受質（〇·；[至ι·〇 μΜ PAI-1/RRAR 或 ΡΑΙ-1/69)及 1〇 μ1 ΐ〇χ 間接緩衝液 ρΗ 7.4 (〇·5 M Tris，1·〇 M NaCl，10 mM EDTA，0.1% Tween 80)混 合於總體積100 μΐ (亦即，反應含有8〇 μ1 h2〇)。將反應 於室溫下培育不同時間（代表性地為1小時，然而，調整 培育時間以控制溶液之嚴苛度）。 使用經CuS〇4活化之瓊脂糖來捕捉u-PA噬菌體-PAI-1抑制子複合體。藉由以CuS〇4 (100 mM)處理，完成該螯 合瓊脂糖（200 μΐ ;法瑪西亞）之預先活化。將經CuS〇4活 化之璦月曰糖以於PBS緩衝溶液之〇·5% BSA於室溫下進行 封阻1小時。將100 μ1經bsa封阻之瓊脂糖珠粒在8〇〇 μ1 結合緩衝液（0·5 M NaCl，20 mM Tris，20 mM 咪唑，ρΗ7·4) 之存在下加至100 μ丨前述淘選混合物反應中，以捕捉加His_ 標籤之PAM抑制子_u_pA噬菌體複合體。於室溫下再持 績培育另1小時。接著，將淘選混合物於2000 rpm下離心 1 min，並將含有已結合u_pA嗤菌體_pAI_丨抑制子複合體 231 200817517 之瓊脂糖珠粒以1 ml結合緩衝液清洗而去除未結合之噬菌 體。重複清洗步驟5-1〇次，且於每次清洗後將含有已結合 複合體之珠粒轉移至新管中，以避免任何可能“夾帶，，非 專一性噬菌體。 將已結合u-PA噬菌體-PAI_1/RRAR複合體溶析於1〇〇 μΐ溶析緩衝液（0.5MEDTA)中。使用95μ1等分量所溶析噬 ，體感染i ml之H BlueA腸桿菌細胞（G6⑼），以計 算文庫之輸出（指示經挑選後所得之噬菌體數目）。將經 感染細菌塗布於含有缓节青霉素（75⑽社）之大Μ瓊脂平 板（=5 _ X 245 mm)上，以產生用於下一挑選回合之文 最後使用殘留之輸出文庫（亦即所挑選得喧菌體） ，供筛選及/或產生用於下一挑選回合之新文庫的個別 包囷體純株。用於挑選之料受質濃度及文庫與誘傅受質 =Γ，係根據所希望之嚴苛度加以調整。例如，可 延擇條件以使文康$〗 ΡΔ 犀之 1/0、2/。、5%、10%或大於 10%的 u- ㈣ραι_ι5’抑制。代表 -回合挑選，而二度之誘…1完成第 酶抑制物濃度及愈文庫，係將誘傅絲胺酸蛋白 選回合平行二=育時間減少。此外，可於各挑 對+/ 1 夕嚴可度。基於輸出之品質（例如於配 對十誘_絲胺酴1 t 出之n卢對雜 挑選（參見下述）中嗟菌體輸 ® < λ 5虎對雜訊比）， 的品質，從—赤夕_ 土於功此性分析之所得“擊中率” 回合。 3夕次此等挑選之噬菌體輸出可帶至次挑選 232 200817517 也於無誘鲜存在下使用前述用於從u-PA文庫 挑選嗟菌體之條杜 > 庫 驗之"、、、組實驗’並將得自此對照組實 : 誘餌絲胺酸蛋白酶抑制物受質存在下之文 =的輸出進行比較。得自峨存在下之文庫篩選的文 =出之咖正常下高於得自對照組挑選之輸出範圍為介於 —1〇 對照組挑選觀察到較高背景值，則使用更 了之條件（例如減少培育時間、增加反應物（文庫、誘 耳或珠粒）/辰度、及增加清洗結合至螯合瓊脂糖之所挑選 噬菌體的時間盥+者々 <、去，A ^ 1 i /、_數（達1G的因數或以上））重複淘選。 新受質序列具有增加的反應性舆俄化功效之u-P A 噬菌醴之繂選 將等分置所溶析得u-PA噬菌體（5 μΐ)與XL-lBlue大 %杯I)、、、田胞（1 〇〇 μΐ)混合以感染並於37〇c下培育1 。然 後將、纟二感“之大腸桿菌細胞塗布於以羧苄青霉素（1 〇〇 Mg/mL)補充之LB瓊脂平板上。待於37cC下培育過夜後， 挑取個別菌落供喔菌體製備。將細胞生長於以羧苄青霉素 (100 pg/mL)與四環霉素（丨〇 補充之2χ γτ培養基 中’並如叙述（山布魯克，J等人（1989)分f選產，會潑室 手冊 i Molecular Cloning，A laboratory manual、，冷 及港實^驗室）完成噬菌體製備。將鑑定得之噬菌體於下列 分析中測試以評估其活性。將個別噬菌體製備物用於間接 血纖維蛋白溶酶原活化分析以鑑定活性噬菌體，並將活性 噬菌體製備物用於抑制分析。 1 ·間接血纖維蛋白溶酶原活化分析 233 200817517 將個別菌體製備物用於間接血纖維蛋白溶酶原活化 分析’以鑑定出活性U-PA噬菌體。簡言之，5 μΐ之u_pA 噬菌體（代表性地〜5xl〇i2 cfu) 、〇·2 μΜ Lys_血纖維蛋白 /谷S#原（美國诊斷學）及0.62 mM Spectrozyme PL (美國 0 Wf學）係主總體積為丨〇〇 。於微量滴定平盤中進行分 析，並於 Molecular Devices Thermomax 中每 30 秒讀取 405 nm下之光學密度達ih。反應於37〇c下進行。 2.U-PA嗟菌體由突變型pAjj/RRAR之抑制 ( 將於間接血纖維蛋白溶酶原活化分析中鑑定為活性之 噬菌體，進一步對由突變型PAI_1/RRAR之抑制測試。簡 言之，關於抑制分析，將5 μ1活性U_PA噬菌體（代表性 地〜5xl〇i2 cfu)以二重複加至微量滴定平盤孔，隨後將固 定濃度之突變型PAM (例如1〇 _ )加至一孔，及將構酸 鹽緩衝食鹽水（PBS)加至重複之孔。於混合後，令反應於室 溫下持續進行-段固定時間（例如3Qmin)，隨後添加、.62 〔 SpeCtr〇Zyme PL、〇.2 μΜ Lys-血纖維蛋白溶酶原（美 國診斷學，Inc.)。對於對照組實驗，係將野生型u_pA噬 菌體於相同條件下進行評估。將平盤於405 nm下於分光 光又十中。貝值2 hr。挑選出相較於野生型u_pA噬菌體對 PM-1/RRAR或PAi.1/69呈現增進靈敏度之所挑選u_pA噬 菌體，以供進一步分析並進行DNA定序。 3·肽受質篩選 此外，為鑑認具有改良催化功效之變異型u_pA嗤菌 體’遂針對Ac-RRAR韻c受質筛選個別嗟菌體純株。對 234 200817517 ， 於該分析，係將固定體積之噬菌體上清液（例如35 μΐ )與 75 μΜ Ac-RRAR-AMC受質於IX間接分析緩衝液（50 mM Tris，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.01% Tween 80)混合， 總體積為100 μΐ。該項分析係於96-孔或384-孔黑色分析 平盤（康寧（Corning))中進行，並於380-450 nm下於分光光 度計（分子裝置（Molecular Device)讀取器中讀值2 hr。 為確認其等之改良，遂將於抑制子與肽受質篩選後鑑 認得之陽性u-PA嗤菌體使用前文列示之分析進行再篩選。 ( C.所挑選u-PA突變型之鐘定及所钂認突變型之最適 化 如前述，將陽性噬菌體純株與XL-lBlue大腸桿菌細 胞混合以感染，並將培養物伴隨搖晃於37°C下生長過夜。 使用質體製備套組（奎爾金）從過夜培養物純化得質體 DNA。將DNA送去使用下列引子進行客製定序：535- 5’-CAGCTATCGCGATTGCAG-3’（SEQ ID NO:381) ; 5542- 5’ GTGCGCAGCCATCCCGG-3，（SEQ ID NO:382)。於突變型 ί u-PA基因中被改變之胺基酸殘基係在分析序列資料後鑑定 出。
下表10列示自u-ΡΑ噬菌體文庫對PAI-1/RRAR突變 型抑制子挑選變異型u-PA而鑑定得之變異型u-PA。下表 1 0中所列示之突變係根據胰凝乳蛋白酶編號。括弧中之號 碼表示於噬菌體筛選方法中突變株被鑑定得之次數。基於 得自活性分析之結果，u-PA噬菌體之最佳變異型以底線強 調出。含有所指明突變之成熟u-PA前原蛋白（SEQ ID 235 200817517 ' NO:433)的胺基酸序列係於SEQ ID NOS: 434-445任一者列 示。 表10 u-PA噬鏟Λ 突變型 突變位點 級修飾胺基酸 SEQ 文庫Vs 名稱 (胰凝乳蛋白 ID PAM/RRAR 酶編ft) NO: 該溫T AR73 (2) 30 Phe - lieu 434 AR81 73, 89 Leu - Ala, lieu - Val 435 AR1 73 Leu-Pro 436 AR3 217 Arg-Cys 437 AM (3) 155 Leu-Pro 438 AR7 75, 89, 138 Ser-Pro? lieu-Val, Ileu-Thr 439 AR32 137 Glu-Gly 440 AR36 72, 155 Arg-Gly, Leu-Pro 441 II & III AR37 133 Gly-Asp 442 AR66 160 Val-Ala 443 AR24 38 Val-Asp 444 AR85 132, 160 Phe-Leu，Val-Ala 445 於分析如前述之定序數據後，鏗認出在針對PAI-1/69 抑制子之挑選後所得，在對PAI-1/69抑制子呈現增加專一 性之突變型u-PA基因中經改變的胺基酸殘基。從第一代 蛋白酶噬菌體展示文庫（I)鑑定得之突變型，係列示於下表 11。使用如前實施例2B所示之方法，使用PCR多樣性誘 變套組及引子496與497，產生後序數代蛋白酶噬菌體展 示文庫。關於Π代噬菌體展示文庫，係使用含有相當於基 於胰凝乳蛋白酶編號之F30V的u-PA突變型u-PA/Ic作為 誘變反應之模板。從第二代蛋白酶噬菌體展示文庫（II)鑑定 得之突變型係列示於下表11。關於III代噬菌體展示文庫， 係使用含有分別相當於F30V/Y61(A)H或F30V/K82E (基 於胰凝乳蛋白酶編號）之u-PA突變型u-PA-IIb或u-PA-Iib 236 200817517 ^ 突變型作為誘變反應之模板。從第三代蛋白酶嗟菌體展示 文庫（III)鑑定得之突變型係列示於下表11。關於IV代噬 菌體展示文庫，係使用含有相當於F30V/K82E/V159A (基 於胰凝乳蛋白酶編號）之u_PA突變型u-PA/IIIa作為誘變 反應之模板。從第四代蛋白酶噬菌體展示文庫（IV)鑑定得 之突變型係列示於下表1 1。括弧中之號碼表示u-P A噬菌 體因具有相同突變而被挑選得之次數。底線表示由突變株 獲得之新突變。含有所指明突變之成熟u-PA前原蛋白（SEQ Γ ID NO:433)的胺基酸序列係列示於SEQ ID NOS: 460-472 任 < 者0 表11 噬菌髏 文庫 突變型 名稱 突變位點 被修飾之胺基酸 SEQ ID NO: I u-PA/Ia 21 Phe-Val 460 u-PA/Ib 24 Ile-Leu 461 u-PA/Ic (2) 30 Phe-Val 462 u-PA/Id 30 Phe-Leu 463 II u-PA/IIa 30, 61(A) Tyr-His 464 u-PA/IIb 30, 82 Lys-Glu 465 u-PA/IIc 30. 156 Lys-Thr 466 III u-PA/IIIa (8) 30, 82, 152 Val-Ala 467 u-PA/IIIb 30, 82,22, 159 Thr-Ala, Val-Ala 468 u-PA/IIIc 30, 82, 158, 159 Thr-Ala，Val-Ala 469 u-PA/IIId (2) 30,61A，22 Lys-Glu 470 IV u-PA/IVa 30, 82, 159. 80. 89. 187 Glu-Gly, Ile-Val, Lys-Glu 471 u-PA/IVb 30, 82, 159, 80, M, 82,1S1 Glu-Gly, Glu-Lys, Ile-Val, Lys-Glu 472 1.針對PAI-1/RRAR抑制子於定焦噬菌體文庫中胺基 酸殘基30與155之最適化與重組 237 200817517 • 為富增u-PA變體對ΡΑΙ-l/RRAR抑制子之靈敏度，靶 定基於胰凝乳蛋白酶編號之胺基酸30與胺基155 (如前表 1 〇所列之第一篩選中經鑑定為熱點），用於分別使用下列 引子之隨機4匕及重組：TC30- 5， GCCCTGGNNSGCGGCC ATC- 3,（SEQ ID NO:383)，TC155· 5, GGAGCAGNNSAA AATGACTG- 3，（SEQ ID N〇:384)。 使用Quick Change多定點誘變套組（史塔金），依照 製造商所述之條件進行誘變。簡言之，於使用T4聚核苷 ( 酸激酶（新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs )，依 照製造商所述之條件將引子磷酸化後，完成三種供隨機化 殘基3〇與I55之不同反應：單獨3〇;2)單獨155 :及 30加155 —起。相較於相對應野生型u_PA蛋白酶功能域 序列f有位於殘基L73A與I89V的突變之DNA構體 (pComb3H/U-PA變體（pARF 81))，係用作為於個別地使 用引子 TC30 (SEQ ID NO:383)與 TC155 (SEQ ID NO: 384) 於另反應’此二引子係一起用於pARF 81變體DNA，以
基酸殘基L73A與 & 之誘又反應中的模板，以用於分別隨機化位置3 Q與丨5 5。 使用多定點誘變套組（史塔金），依照 特定之條件完成誘變反應。於誘變後，將反 XL_1 Blue大腸桿菌細胞，以用於文庫構築 ^ j J °使用經擴增之U-PA噬菌體文庫於 3A與3B所列示之改良u-PA變體之篩選。 % $彳足#對來自其中所有變體皆具有位於胺 ~與189V (基於胰凝乳蛋白酶編號）之背景 238 200817517 ' 突變的定焦u-PA噬菌體文庫之變異型u-PA的PAI-l/RRAR 突變型抑制子之挑選所鑑定得之u-PA變體。下表12中所 列示之突變，係根據胰凝乳蛋白酶編號。括弧中之號碼表 示於噬菌體篩選方法中突變株被挑選得之次數。基於得自 活性分析之結果，u_PA噬菌體之最佳變異型以底線強調 出。含有所指明突變之成熟u-PA前原蛋白（SEQ ID NO:433) 的胺基酸序列係列示於SEQ ID NOS·· 446-459之任一者。 表12 定焦 u-PA文庫Vs PAI-l/RRAR 突變型 名稱 30 (Phe) 155 (Leu) SEQ ID NO ARF2 Thr - 446 ARF6 Leu - 447 ARF11 Val - 448 ARF17 Gly - 449 ARF16 Leu - 450 ARF33 - Val 451 挑選I ARF35 Met - 452 &II ARF36 - Met 453 ARF37 Met - 454 ARF43 Leu - 455 ARF47 Val - 456 ARF48 Leu Met 457 ARF103 Leu - 458 ARF115 Gly Met 459 實施例4 經修飾u-PA酵素藉由COS細胞之暫時轉染之表現 對於變異型u-PA酵素於哺乳動物表現系統之表現， 係使用從嗟菌體展不結果鑑定得之陽性純株’作為供編碼 所挑選u-PA變體基因之cDNA之PCR擴增的模板（帶有 突變型u-PA蛋白酶功能域序列之pComb3H )。使用下列 引子進行重疊延展PCR(何，S等人（1989) GeM 77, 51-59 )。 239 200817517 ， 717- 5’ - TTTCAGTGTGGCCAAAAG -3’（SEQ ID NO:385); 718, 5，- CAGAGTCTTTTGGCCACA -3’（SEQ ID NO:386); 850，5’ -GrTGGTACCGCCACCATGAGAGCCCTGCTGGCGC GC -3,（SEQ ID NO:387); 851，5’ -GCTCTAGATCATCAGAG GGCCAGGCCATTCTCT -3,（SEQ ID NO:388)。弓I 子 850 與 85 1分別帶有用於火/^I及限制酵素之序列（加底線）。 如下述，以兩步驟進行PCR而完成經突變cDNA u-PA 基因之全長擴增。於第一步驟，係於100 μΐ反應中進行 PCR，以使用Pfu DNA聚合酶、引子850、718及含有全 長uPA基因（SEQ ID NO:474)之pCMV4作為模板，擴增 500 bp產物（相當於u_PA之EGF與Kringle功能域）。 同樣，使用引子851及717與適當突變型u-PA-pComb3H 作為引子，進行另一 PCR以擴增突變型u-PA蛋白酶功能 域（800 bp，亦即相當於相較於SEQ ID NO:475所列野生 型序列之突變型序列）。將此二PCR產物凝膠純化，並用 於下回合PCR擴增。於第二步驟，係使用經凝膠純化之PCR 產物（各5μ1)，作為於使用引子850與851之ΙΟΟμΙ反應混 合物中的模板。引子717與718具有可允許全長u-P A cDNA (1 ·3 kb)於第二步驟PCR中之擴增之重疊互補序列。使用 PCR純化套組（奎爾金）純化PCR產物，然後以《pM與； 限制酵素消化。待使用QIAquick管柱（奎爾金）純化後，將 全長u-PA基因與已預先經尤ρπΐ與沿αΙ消化之pcMV4哺 乳動物表現載體（SEQ ID NO:373)接合。將接合混合物電 穿孔進入大腸桿菌XL-1 Blue細胞中，並塗布於以魏节青 240 200817517 、 霉素（100 Mg/mL)補充之LB瓊脂平板上。於37°C下培育 過夜後，挑取個別菌落並生長於2 ml LB培養基中供質體 純化。將質體用於使用下列定序引子定序整個u-PA基因。 UPAF1- 5’ ATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCC-3’ (SEQ ID NO:476)及 UPAF2- 5’ GGAAAAGAGAATTCTACCG-3’（SEQ ID NO:477)。 使用Midi質體製備套組（奎爾金），大量製備具有正確 突變而無任何額外突變之突變型u-PA純株，並用於使用 ( Bio-Rad基因脈衝儀電穿孔入COS-1細胞中。將20 pg之 cDNA、100 pg 載體（carrier) DNA、與大約 107 COS-1 細 胞置入0.4-cm石英管中，並於3 20 V、960微法拉地及Ω = 〇〇 下進行電穿孔（塔奇亞斯等人（1995) J 5沁/· CT^m·，270: 183 19-18322 )。於電穿孔後，將經轉染細胞於37°C下於 含有1 0%胎牛血清與5 mM 丁酸鈉之DMEM培養基（Irvine Scientific)中培育過夜。然後將細胞以無血清培養基清洗， 並於37°C下於DMEM中培育48 h。經以無血清培養基培 ^ ' 育後，收集條件培養基並用於進一步定特徵。 實施例5 定經純化突變型u-PAs之特徵 A·酵素濃度之測置 將存在條件培養基中之突變型u_PA酵素的單鏈形式， 藉由以血纖維蛋白溶酶-瓊脂糖（Calbiochem )處理而轉變 成相對應之二鏈酵素。藉由使用預先已針對如前實施例1 所述之胰蛋白酶初級標準物滴定之標準PAI-1抑制子製劑 241 200817517 的活性部位滴疋’測里此專培養基中活性u-PA的濃度。 藉由酵素-連結免疫吸附分析，依照實驗室手冊之方法（哈 W蓴k{\99A使用抗體{ Using Antibodies)，泠t兔专驗 室）測量總體酵素濃度。此等濃度之比例產生其於各培養 基中具活性之u-PA變體之分數。 B.U-PA之直接顳色分析 u-PA活性之直接分析係利用受質碳苄氧谷胺 醯基（α-t-丁氧基）-甘胺醯基-精胺酸_p_硝基醯苯胺單醋酸鹽 (Cbo-L-(y)-Glu(a-t-PuO).Gly-Arg-pNA AcOH ； Spectrozyme® uPA，美國診斷學）（馬迪森等人（1995) j c/^所.， 270.7558-7562)。藉由測量於405 nm每單位時間所產生 之游離態（pNA)之吸光值之增加，而測定酵素活性。使用 介於6與8 nM之酵素濃度，隨時間進行動力學分析。於 二鏈u_pA分析中，Spectrazyme⑧uPA之濃度係從25至15〇 μΜ艾化，而於U-PA蛋白酶功能域之分析中，係從25至2〇〇 μΜ變化。反應係於96_孔微量滴定平盤中進行，並藉由使 用M2或Μ5平盤計讀機（分子裝置）測量每3Q 秒之405 nm下吸光值達2 h，分析反應速率。藉由繪製受 貝/辰度倒數對於ODw5之吸光值之速率的倒數之圖，並擬 合賴威弗·布克方程式（1/速率=(Km/Vmax)(1/[s]) + 其中VmaX-[ET]*kcat) ’計算得動力常數、、及n (專一性常數）。 下表13列示U-PA之突變型（經鑑定呈現對pAl_1/69 抑制子之增加專一性）於直接心pA酵素活性分析的動力 242 200817517 ' 學分析結果。結果顯示當從對Spectrozyme® uPA受質之 裂解的專一性常數（kcat/Km)的測量值測定時，所鑑定得之 各突變型u-PA相較於野生型u-PA具有減低的酵素活性。 於該表中，受測試變體為該等於表11所述，在從連續數 代（I至IV) u-P A噬菌體展示文庫之挑選後所鑑定得者。 表13: u-PA突變型 Km (mM) 灸cat (s-1) ^cat^Sn (M-l s-1) 突變型AVt u-PA u-PA/Ic (30) 0.745 22.3 2.9 xlO5 0.30 u-PA/IIb (30, 82) 0.299 11 3.6 xlO5 0.38 u-PA/IIIa (30, 82, 159) 0.239 11.6 4.8 x 105 0.50 u-PA/IIIb (30, 39, 82, 159) 0.212 9.6 4.5 x 105 0.47 u-PA/IVa (30, 80, 82, 89, 159, 187) 0.177 10 5.6 x 105 0.58 u-PA/IVb (30, 80, 82, 84, 89, 159, 187) 0.321 11 3.4 xlO5 0.35 野生型u-PA 0.174 16.6 9.5 xlO5 1.0 C·使用螢光產生受質之u-PA變髏之動力學分析 使用 Ac-RRAR-AMC受質，進行用於測量u-PA變體 對RRAR標靶受質序列之活性的直接分析。7-胺基-4_甲基 香豆素（AMC)螢光產生肽受質之使用，係用於蛋白酶專一 性之測定之例常方法（齊爾曼等人（1977) 78:47-5 1 ；哈里斯等人（2000) 97:7754-7759 )。醯苯
胺鍵之專一性裂解釋出螢光產生性AMC脫離基，提供用 於測定對於個別受質之裂解速率之有效方法。將受質從0.05 至12.0 mM系列稀釋，並於蛋白酶（9- 25 ηΜ)存在下培育 於Costar 96-孔黑色半面積分析平盤中。於螢光分光光度 計（分子裝置Gemini XPS)，於激發波長（3 80 nm)與發散 波長（450 nm)下參考AMC標準物，測量得自游離態AMC 243 200817517 脫離基之螢光。以30秒間隔獲取讀數歷時30八铲 光增加之速率。藉由緣製受質濃度倒數對受質=量營 數之圖’並擬合賴威弗布克方程式（1/速率逮率倒 + 1~咖;其中 v =[E pk ^ , . mV^)(i/[S]) max T cat)计异仵動力常數尺、κ 及Kcat/Km (專—性常數）。 at 下表14列示u-ΡΑ變體ARF2與ARF36對Ac AMC文質之動力學分析結果。結果顯示對舰 _ 所挑選…蛋白酶變體之專一性常數，相 對於 增加約或多於10+。 車又於野生型… 表14: 突變型
Km (μΜ) 突變型/Wt
D·使用間接顧色分析之血纖維蛋白溶酶原活化之動力 學分析 進行間接顯色分析以測定呈經純化蛋白製劑之野生型 與所產生突變型u-PA的活性（馬迪森等人（1989) Nature, 339. 721-724，馬迪森等人（1990) J jgh/. C/^所.，265: 21423-21426 )。於此分析中，經由藉由u-PA對血纖維蛋 白溶酶原之作用所產生的血纖維蛋白溶酶之作用使游離態 P·硝基苯胺從顯色受質Spectrozyme PL (Η-D·正亮胺醯基 六氫酪胺醯基-賴胺酸-P-硝基醯苯胺二醋酸鹽，美國診斷 244 200817517 學，Inc.)釋放出。以分光光度計於〇d4G5 nm下，測量游離 態P -硝基苯胺之釋出。
對於該分析，係將100 μΐ含有0·25-1 ng欲受測試uPA 酵素、0·62 mM Spectrozyme PL、0·2 μΜ Lys-jk 纖維蛋白 溶酶原（美國診斷學，lnc)之反應混合物，於含有5〇 mM
Tris-HCL (pH 7·5)、〇·ΐ M NaCn、1·0 mM EDTA 與 0.01% (v/v)
Tween 80之緩衝液中結合。將反應於37〇c下培育於96_孔、 平底祕置滴定平盤（Costar，Inc·)中，並於Molecular Devices
Therm〇max中每30秒讀取405 nm下之光學密度（OD405) 達1 h。如前述（馬迪森，五z (1989)339, 721_724 ) 計算得動力常數Keat、1^及Kcat/Kni(專一性常數）。 下表15列示U_PA之突變型（經鑑定呈現對pAI_1/69 抑制子之增加專一性）於間接u-PA酵素活性分析的動力 车刀析、、、σ果。結果顯示當從對Spectr〇Zyme⑧受質之裂 解專一性常數（kcat/Km)的間接測量值測定時，所鑑定得之 各突變型u-PA相較於野生型U_PA具有減低的酵素活性。 於該表中，受測試變體為該等於表u所述，在從連續數 代（I至IV) U_PA噬菌體展示文庫之挑選後所鑑定得者。
u-PA突變型
L (μΜ) <at ㈣ H (Μ.1 η)突變型~t u_pA
u-PA/Ic u-PA/IIb u-PA/Hla u-PA/IIIb u-PA/IVa u-PA/IVb 野生型u-PA 9.01 8.6 6.31 9.3 7.03 7.5 6.03 24.7 22.6 37.6 29.8 38.7 45.3 70.1 2.7 x 106 2.6 x 106 5.9 x 106 3.2 x 106 5.5 x 106 6.0 x 106 1.1 xlO7 0.24 0.23 0.53 0.29 0.50 0.54 1.0 245 200817517 Ε·突變型u-PA酵素受野生型ΡΑΙ·1及突變型PAI-l 之抑制的動力學分析
使用偽-一級（kz· <2 X 106 )或二級>2 X 1〇6 )條件， 測定突變型及野生型u-PA (陽性對照組）抑制之二級速率 常數（k/)。對於各酵素，係選擇酵素與抑制子（突變型 PAI-1)之濃度以產生數種使剩餘酵素活性介於2〇至8〇% 起始活性間變化之數據點。對於野生型及突變型u_pA與 野生型及突變型PA^之相互作用速率的動力學測量，係 於 24。(：下於含有 〇·ι mM EDTA 與 〇 1% (v/v) Tw⑽ 2〇 之
〇·1 M Tris_HCl緩衝液（PH 7.4)中進行。使用如前述部份D 所述之間接顯色分析，測定呈時間之甞數保持之剩餘酵素 活性。 對於野生型及突變型U_PA受PALi之抑制的速率常 數對於過量PAM對PM-丨而言係於偽_ 一級條件下，如前 述（參見例如，何姆斯等人（1987) 心所&”，％ 5133_ 5140，比提等人（1980) «/· 5ζ·ο/. C/zem.，255:3931-3934;馬 迪森等人（1990) P⑽，87: 353G_3533 ;馬迪森等人（19叫 咖WU—.，223:249·271)。簡言之，將經純化野生 型或突變型u-PA (3-50 fm〇i)與野生型或突變型ρΑζ」（35 ⑽fmGl)於室溫下培育Qm分鐘。於培育後，將混 ^物稀釋並於前述D所列之標準顯色分析測定酵素活性= 藉由繪製In (剩餘活性/起始活性）對時間之圖分析數據，並 測定所得直線之斜率。㈣藉由將該斜率除以反應中抑制 剤之/辰度，而衍生得偽·一級速率常數。 246 200817517 對於二級反應，係將等莫耳濃度之野生型或突變型u_ PA與野生型或突變型於微量滴定平盤中直接混合， 並於至溫下預先培育一段〇至3 〇分鐘之不同時間。預先 培育後，將混合物以過量中和性抗_PAI抗體抑制，並於間 接顯色分析中測量剩餘酵素活性。將間接顯色分析與不含 PAI 1之對照組反應或PAI於預先培育以及抗·ΡΑΐ抗體、 血纖維蛋白溶酶原與Spectrozyme PL加入反應混合物後加 入者比較。藉由繪製In (剩餘活性/起始活性）對時間之圖分 析數據，並測定所得直線之斜率。然後藉由將該斜率除以 反應中譯製劑之濃度而衍生得二級速率常數。 一下表16列示u-PA變體受pAI_1/RRAR抑制子之抑制 的一、、及速率常數。結果顯示當以相較於野生型u_pA之所 曰力的抑制作肖kz速率常數進行評估時，變體arf2盘 錢F36對於PAI_1/RRAR抑制子受質之專一性具有約1
下表17與18為野生切「矣 抑制 生1 (表丨7)或突變型PAI-1/69 J子（表18)受野生型u_pA式姐 ^ 或對ΡΑΙ· 1/69抑制子所拙 選的u-P A #髀夕如连,,„ 〜別卞尸/Γ挑 中所别+㈣w α 中数的結果。各表1 7與1 8 Υ所列之變異型u-PA，Α兮笪Ρ # 為該4攸於以上表11所述之一⑴ 247 200817517 • 至四（IV)連續回合的u-PA噬菌體展示文庫挑選所鑑定得 者。表1 7之結果顯示某些突變型u-PA (亦gp，u-PA/IIIa、 u-PA/IIIb與u-PA/IVa)相較於野生型u-PA具有稍微增加 之二級抑制速率常數，而突變型u-PA/Ic、u-PA/Iib、與u-PA/IVb相較於野生型u-PA具有減少之二級抑制速率常 數。表18之結果顯示對於各所挑選u-PA變體對於受突變 型PAI-1 /69抑制子之抑制，二級抑制速率常數顯著增加。 結果顯示，各所挑選之變體於PAI-1/69抑制子受質之專一 ί 性具有大於 13-倍增加，其中變體u-PA/IIIb、u-PA/Iva、 與u-PA/Ivb於專一性各呈現幾近或大於40-倍增加。 表17: u-PA突變型 2級速率常數(ivTV1) 靈敏度因子 (突變型AVt u-PA) u-PA/Ic 2.4xl06 0.3 u-PA/IIb 2.9xl06 0.3 u-PA/IIIa 9.7xl06 1.2 u-PA/IIIb 1.3xl07 1.6 u-PA/IVa 2.7xl07 1.6 u-PA/IVb 6.8xl06 0.8 野生型u-PA 7.5xl06 1.0 表18: u-PA突變型 2級速率常數（M'V1) 增加之靈敏度因子 (突變型AVt u-PA) u-PA/Ic 1.0x10s 13.7 u-PA/IIb 1.1x10s 15.3 u-PA/IIIa 1.8xl05 24.5 u-PA/IIIb 2.8xl05 37.5 u-PA/IVa 2.7x105 35.9 u-PA/IVb 3.2xl05 42.6 野生型u-PA 7.5xl03 1.0 248 200817517 實施例6 從MT-SP1嗷菌Λ文庫對突變型AT3抑制子挑選變異 型 MT-SP1 將含有位於野生型AT3之反應性部位環（RSL)殘基P4-P3-P2-P1-P1’-P2’中，相當於胺基酸殘基 IAGRSL (SEQ ID NO: 478)的六肽序列之突變抗凝血酶（AT3 )抑制劑（SEQ ID NO: 5)進行突變，以於此等殘基中含有取代成SLGRKI (SEQ ID NO:479)，相當於補體C2裂解序列之胺基酸殘基。將 突變型AT3SLGR-KI使用作為蛋白酶挑選實驗中之“誘餌受 質，，，以從大型、組合MT-SP1噬菌體展示文庫分離出對 突變型受質序列具有改良反應性的嗟菌體。簡言之，對於 第一代挑選之分析，係將5 μΐ具有酵素活性且之1:1〇〇 SM1 (〜3 X 1013) ’為低突變發生頻率文庫（亦即，突 變發生頻率）之1:100 SM1 (〜3 X l〇i3)MT_spi噬菌體文 庫，與等量展示5 μΐ含有較高突變發生頻率（亦即〇.9%)之 1:100 SM2 (〜3 X ΙΟ’ MT_spi噬菌體文庫結合。將噬菌 體文庫與5μ1肝素（5 ng/μΐ;得自豬小腸黏膜之儲備物）、5… 誘餌AT3slgr_ki受質（濃度範圍為〇(亦即5μ1Η2〇)、〇 〇ΐ8 μΜ、0·18 μΜ、1·8 μΜ、或 18 μΜ)混合，其係於 5 μ1 (18 _) 野生型、經血漿純化得之ΑΤ3及5 μ1 1〇χ MTSp活性緩衝 液（0.5 M Tris HC1，pH 8, 〇·3 M NaCl，〇·ΐ% Tween 30)存在 下，總體積為50 μΐ (亦即反應含有2〇 μ1 Η”）。將反應 於37°C下培育4.5小時。 使用經CnS〇4活化之瓊脂糖來捕捉Mwpd噬菌體_ 249 200817517 ‘ AT3抑制子複合體。將200 μΐ螯合瓊脂糖（法瑪西亞）以 CuS04 (1〇〇 mM)預先活化。將經CuS04活化之壤月旨糖（1〇〇 μΐ) 以2 ml溶於PBS之0.5% BSA於室溫下封阻1小時。藉由 於65 00 rpm下離心60 sec，而從封阻溶液收取珠粒，隨後 再懸浮於 45 0 μΐ 結合緩衝液（0.5 M NaCl，100 mM Tris pH 8, 10 mM咪唑，0.1% Tween 20)中。將50 μΐ前述淘選混合物 反應加至經CuS〇4活化之瓊脂糖珠粒，以捕捉加His-標籤 之AT3抑制子-MTSP-1噬菌體複合體。於室溫下再持續培 f 育另1小時。接著，將淘選混合物於2000 rpm下離心1 min， 並將含有已結合AT3嗟菌體_ MTSP-1抑制子複合體之壤 脂糖珠粒以5 00 μΐ結合緩衝液清洗而去除未結合之嗤菌 體。重複清洗步驟5次，且於每次清洗後將含有已結合複 合體之珠粒轉移至新管中以避免任何可能的非專一性嗤菌 體之“夾帶”。 將已結合之MT-SP1嗤菌體-AT3SLGR-KI複合體於1〇〇 μΐ 溶析缓衝液（0·5Μ EDTA，pH 8.0)中溶析。使用5〇 μ1等分 、 量所溶析噬菌體於37°C下感染3 ml之活性生長的TG1大 腸桿菌細胞（A600= 0.5; 0.5 OD=〜1·5 X i〇8 菌落/ml)2〇 分 鐘。將經感染之細胞塗布於含有綾苄青霉素（75 pg/mL)2 大型平板（245 mm X 245 mm)上並於3〇°C培育過夜。於次 曰早晨收取平盤。計數各平盤上之菌落數並與不含 AT3SLGR_KI抑制子之平盤的背景值比較。菌料數結果列 於表19。 250 200817517 表19:第一代挑選之結果 反應中AT3SLGR ia之濃度 得自第一回合挑選之酋落數 18 μΜ入丁3乩顚 Lawn 1.8 6088 0.18 μΜΑΒ·0 1712 0.018 μΜ AT3slgr-ki 3700 0 μΜ AT3slg腿 840 待平盤已置於冷藏室2小時使瓊脂堅硬後，將得自含 有AT3SLGR-KI之平盤的菌落刮入25 ml以羧苄青霉素（〜100 pg/ml)補充之2YT中。將20 ml含有細菌之2YT培養基 加至500 ml含有羧苄青霉素之2YT中，並測定A6Q()為0.13。 將細菌生長至OD=〜0.5，然後將〜1 X101G至2.6 X 1013 cfu/ml之輔助噬菌體（VS M13)加入（以〜150 μ1-200 μΐ)以擴 增文庫。於37°C搖晃生長1小時後，將培養物以肯那霉 素補充至終濃度為3 pg/mL，並於30°C伴隨搖晃生長過夜。 收取細胞，並將存在上清液中之噬菌體顆粒以PEG-NaCl 溶液沈澱。對於代二代MT-SP1噬菌體挑選之分析，條件 與第一代相似，惟對AT3SLGR_KI誘餌受質之反應僅為27分 鐘而非4.5小時，以增加篩選的嚴苛度。 於如前述之已結合之MT-SP1噬菌體-AT3SLGR_KI複合 體之溶析後，使用50 μΐ等量所溶析噬菌體於37°C下感染 3 ml之活性生長的TG1大腸桿菌細胞 （A600= 0.5; 0.5 OD = 〜1·5 X 108菌落/ml)20分鐘。將經感染之細胞塗布於含有 魏苄青霉素（75 μ g/mL)之大型平板（245 mm X 245 mm)上， 並於30°C培育過夜。於次日早晨收取平盤。計數各平盤 251 200817517 上之菌落數，並與不含AT3SLGR_KI抑制子之平盤的背景值 比較。菌落計數結果列於表20。 表20:索二代蟀選之結果 ~--- 反應中AT3SLGR ia之濃度 得自第二回合縴選之鏑 落數;(背景） 相較於背景之得 加比例 _____一 18 μΜ八丁3乩圓 2476 (165) 15:1 一 1.8 μΜ八丁3臟初 1750(90) 19:1 一__ 0.18 μΜ AT3SLG腿 2012(110) 18:1 __ 0.018 μΜ AT3slgr-ki 1824 (89) 21:1 挑取菌落以進一步定特徵。將細胞生長於2 ml以羧苄 青霉素（100 Mg/mL)與四環霉素（10 pg/ml)補充之2X YT培 養基中，並如敘述（山布魯克，J等人（1989)分f選產，實 ,·驗室f 冷肩漭紫潑室）完成噬菌體製備。測試所篩選 得之噬菌體對Ac-SLGR-ACC受質的酵素活性。進一步， 針對藉由野生型AT3或血漿之失活化的抗性挑選所挑選噬 菌體。 因為修飾對習於該項技藝人士會係顯而易知的，故希 望本發明僅受所附加申請專利範圍之範圍的限制。 【圖式簡單說明】 圖1描述藉由絲胺酸蛋白酶抑制物抑制蛋白酶，及產 生穩定受抑制複合體之機制。在接觸後，絲胺酸蛋白酶抑 制物（I)與蛋白酶（E)首先形成非共價性、類-米氏 (Michaelis-like)複合體（EI)。隨後為藉由在絲胺酸蛋白酶 抑制物之反應性部位環（RSL)的羰基上的蛋白酶之催化性 絲胺酸的Ρ1-ΡΓ易切斷鍵結之裂解及親核性攻擊，與共價 252 200817517 性醯基-酵素中間物（EI#)之形成。受動態誘陷之共價性抑 制產物（ΕΓ)為RSL插入、蛋白酶易位、蛋白酶活性部位扭 曲及總體蛋白酶結構變形之結果。次要非抑制性途徑釋出 正常的裂解產物（絲胺酸蛋 性蛋白酶(E)。 姆抑制物(I*)) ’與具反應 【主要元件符號說明】 (無）
253

Claims (1)

  1. 200817517 十、申請專利範困： 1 . 一種方法，其包含： a) 將蛋白酶及/或蛋白酶之具催化活性部分的集合與蛋 白酶誘陷多肽（Protease trap p〇lypeptide)接觸，以在該 蛋白酶誘陷多肽由該蛋白酶或其具催化活性部分裂解後， 形成含有該蛋白酶誘陷多肽與該集合中之蛋白酶或其具催 化活性部分的穩定複合體；及 b) 鑑認或挑選出在複合體中之蛋白酶或其具催化活性 部分。 + 2.根據申請專利範圍第丨項之方法，其進一步包含將 經複合之蛋白酶與該集合中未複合之成員分開。 3.根據申請專利範圍第i項之方法，其中該蛋白酶誘 陷多肽與複合體中之一蛋白酶係以共價鍵聯。 4·根據申請專利範圍第1項之方法，其中·· 係將蛋白酶誘陷多肽標定以供偵測或分離；且
    一分離係藉由捕捉含有可仙4蛋白_陷多肽與任何蛋 白酶或其具催化活性部分之複合體而實現。 5·根據申請專利範圍第4項之方法，其中 係將蛋白酶誘陷物以His標籤標定；且 分離係藉由以金屬螯合劑進行捕捉而實現。 6·根據申請專利範圍第5項之方 、 劑係選自硫酸鎳(NiS04)、氯化鈷(c 〃中孩金屬螯合 及氯化辞（ZnCl2)。 叫）、石泉酸銅（CuS〇4) 其為多路的 7·根據申請專利範圍第1項之方、去 254 200817517 (multiplexed )，其中： 係將多種不同的蛋白酶誘陷多肽與該集合接觸；且 至少兩種蛋白酶誘陷多肽可被可鑑認地偵測，藉此而 鑑s忍出多於一種蛋白酶。 8·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中係將複合體 中之蛋白酶或其具催化活性部分展示出，藉此使彼等可於 鑑認或挑選後被擴增，而產生第二蛋白酶及/或其具催化活 性部分之集合。 9·根據申請專利範圍第8項之方法，其進一步包含將 該第二集合與蛋白酶誘陷多肽接觸，而產生第二組穩定的 複合體。 10·根據申請專利範圍第9項之方法，其進一步包含鑑 認或挑選出於該第二組穩定複合體中之蛋白酶。 11，根據申請專利範圍第i項之方法，其中該蛋白酶誘 陷多肽係選自絲胺酸蛋白酶抑制物（serpin)、阿伐巨球 蛋白家族之成員、或p35家族之成員。 12. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該穩定複合 體包含共價鍵聯至蛋白酶或其具催化活性部分之蛋白酶誘 陷多肽。 13. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該集合含有 至少 5、10、50、100、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6 或更多種不同 成員。 14. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該蛋白酶或 其具催化活性部分為絲胺酸及/或半胱胺酸蛋白酶。 255 200817517 1 5 ·根據申請專利範圚箆 祀W弟1項之方法，其中係將蛋白 或其具催化活性部分之集合展示出。 16·根據申請專利笳圚筮 兮〜乾固弟15項之方法，其中係將蛋白 酶或其具催化活性部分展+ %间胁_ 口丨刀展不於固體撐體上、於細胞表 上、或於微生物之表面上。 1 7 _根據申請專利範圍笛； 寸〜靶kj弟16項之方法，其中係將蛋白 酶或其具催化活性部分展千#缺再 I刀展不於酵母、細菌、病毒、噬菌體、
    核酸、mRNA分子或核糖體之表面上。 1M艮據申請專利範圍第16項之方法，其中該微生物 為大腸桿菌、啤酒釀母菌或選自M13、fd、T7、或桿狀病 毒之病毒。 19. 根據申請專利範圍第1項之方法，其為均質反應。 20. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中係 酶或其具催化活性部分展示於噬菌體展示文庫。 21 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白酶係 壬蛋白酶之具催化活性部分提供。 ’、 22.根據申請專利範圍第1項之方法，其中： 係將至少兩種不同蛋白酶誘陷多肽與該集合接觸；並 將至少一種蛋白酶誘陷多肽可偵測地標定。 23 ·根據申請專利範圍第22項之方法，其中至少_種 蛋白酶誘陷多肽為可偵測，以實現含有該可偵測蛋白酶誘 陷多狀與蛋白酶或其具催化活性部分之穩定複合體的捕 捉。 24.根據申請專利範圍第22項之方法，其中： 256 200817517 係將至少兩種不同蛋白酶誘陷多肽與該集合接觸； 僅其中一種蛋白酶誘陷多肽被可偵測地標定；且 另一或其他者係各以相較於該經可偵測地標定之蛋白 酶誘陷多肽為過量地存在。 25·根據申請專利範圍第22項之方法，其中該可偵测 才承§己為螢光標記或His標籤。 26·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該蛋白酶或 ^ 其具催化活性部分係選自蛋白酶之胰凝乳蛋白酶、枯草桿 ' 菌蛋白酶、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶與木瓜蛋白酶 家族。 27·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該蛋白酶為 絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶或其具催化活性部分，且 係選自粒酶B、睾蛋白酶（Testisin)、類胰蛋白酶貝他i、 激肽釋放酶hk5、corin、激肽釋放酶12、DESC1 、 類胰蛋白酶加瑪1、激肽釋放酶hK14、透明質素結合性絲 ( 胺齩蛋白酶、類胰蛋白酶、激肽釋放酶hKl 5、胰蛋白酶、 嗜中性彈性蛋白酶、甘露聚糖-結合性凝集素_相關之絲胺 酸蛋白酶_3、組織蛋白酶G、成髓細胞蛋白酶 (myeloblastin)、粒酶 A、粒酶 M、類糜蛋白酶（chymase)、 粒酶K、粒酶η、胰凝乳蛋白酶B、胰彈性蛋白酶、胰内 切肽酶E、胰彈性蛋白酶π、腸肽酶、胰凝乳蛋白酶c、 刚列腺蛋白酶（prostasin )、激肽釋放酶丨、激肽釋放酶hK2、 激肽釋放酶3、間胰蛋白酶（mes〇trypsin)、因子χιι、血 漿激肽釋放酶KLK3、因子χι、因子Ιχ、因子VH、因子 257 200817517 Xa、凝血酶、蛋白質c、頂體蛋白酶（aero sin ) 、hep sin、 肝細胞生長因子活化子（uP A)、尿型血纖維蛋白溶酶原活化 子（uPA)、組織血纖維蛋白溶酶原活化子（tPA)、血纖維蛋 白洛 S#、neurosin、神經胰蛋白酶（neur〇trypSin )、neur〇psin、 激肽釋放酶hKl 0、上皮絲胺酸蛋白酶（epitheiiasin )、前 列腺酶（prostase)、凝乳蛋白酶（chym〇pasin)、激肽釋 放酶11、MT-SP1、spinesin、組織蛋白酶L、組織蛋白酶 V、組織蛋白酶K、組織蛋白酶s、組織蛋白酶F、組織蛋 白酶B、木瓜蛋白酶、克魯扎因（cruzain )、枯草桿菌蛋 白酶、熱酶（thermitase ) 、C5a肽酶、閃爍桿菌蛋白酶 (fervidolysin)、乳球菌蛋白酶（lect〇cepin)、成對鹼性 胺基酸蛋白酶（furin)、凱新蛋白酶（kexin)、天冬胺酸 4寸異性半胱胺酸蛋白酶-1、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白 酶-3、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶_7、天冬胺酸特異 性半胱胺酸蛋白酶-6、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶_2了 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶_4、*冬胺酸特異性半脫 胺酸蛋白酶-5、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶_8、天夂 胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶_9、天冬胺酸特異性半耽胺酸 蛋白酶以、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶_u、天久胺 酸特異性半胱㈣蛋白酶_12、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋 ^酶心天冬胺酸特異性半_酸蛋白酶…1天冬胺酸 斗寸異性半脱胺酸蛋白酶_ 14。 28.根據申請專利範圍第μ之方法，其中該蛋白酶或 ”具催化活性部分係選自尿_血纖維蛋白料原活化子 258 200817517 (uPA)、組織血纖維蛋白溶酶原活化子（tpA)及MT-Spi。 29.根據申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白酶誘 陷多肽係選自絲胺酸蛋白酶抑制物、p35㈣成員、阿伐 巨球蛋白豕族成員或其經修飾之形式。 3〇‘根據申請專利範圍第29項之方法，其中該蛋白酶 誘陷多肽係選自血纖維蛋白溶酶原活化子抑制子.戰叫 或抗凝血酶III (AT3)之絲胺酸蛋白酶抑制子。
    31. 根據申請專利範圍第29項之方法，其中該蛋白酶 誘陷多肽為阿伐2-巨球蛋白。 32. 根據申請專利範圍第29項之方法，其中該經修飾 形式含有-或多個於該蛋白酶誘陷多肽之反應性部位中的 胺基酸置換、刪除或取代。
    3 5 ·根據申請專利範圍第3 2 誘陷多肽為絲胺酸蛋白酶抑制物 係位於絲胺酸蛋白酶抑制物多肽 36·根據申請專利範圍第35項之方法，其中該 個胺基酸置換係位於P4_p2，位置之任何—或多者。 3 3 ·根據申請專利範圍第 對應於標靶受質之裂解序列的 3 4 ·根據申請專利範圍第 質係涉及疾病或病症之病原學 37·根據申請專利範圍第 誘陷多肽為阿伐2巨球蛋白 位於該多肽之誘餌區中。 32項之方法，其中該修飾為 一或多個胺基酸置換。 33項之方法，其中該標靶受 項之方法，其中該蛋白酶 ，且一或多個胺基酸置換 反應性部位環中。 32項之方法，其中該蛋白酶 ，及該一或多個胺基酸置換係 259 200817517 38. 根據中請專利範圍第丨項之方& 者，其t係將鑑認蛋白酶之方法進行數次。”為反覆進行 39. 根據_請專利範圍第38項之方1 該方法之第-重複鐘認出多種不同蛋白酶，：：：至少於 複後製備基於所鑑認出之蛋白酶之多種蛋白酶者在第-重 4〇·根據申請專利範圍第38項之方法酶 比對該等所鐘認蛋白酶之胺基酸序’，其進：步包含 中： 、疋出熱點，其 熱點為發生於至少二、三、四、五 夕 蛋白酶中之經修飾基因座；且 3更夕種所鑑認出 修飾基因座為若該集合含有經修僻蛋 解活性部分則經修飾者。 酶或〃蛋白分 41.根據申請專利範圍第i項之方法， 於鑑認出一或多種蛋白酶後， 乂包含· 其中係使用所鑑認出之蛋白酶作為: = : =合， 或其具催化活性部分中製造進一步突變，==列 成員含有具有該職㈣蛋自酶 =二集合之 肽； 大變與額外突變的多 之蛋集合與和用於分離該第--或多種蛋白酶 中节蛋=相同或不同的蛋白酶誘陷多肽接觸，其 :_誘陷多肽係經修飾以被具有所希望受質專一性 之蛋白酶裂解；及 I里又貝專性 從集合鑑認出在複合體中 分解活性邻八“ L 丨白酶或蛋白酶之具蛋白 刀，精此所鑑認出之蛋白酶具有較第一次所鑑 260 200817517 認出之蛋白酶對希望受質之更大的活性或專一性。 42·根據申請專利範圍第4 1項之方法，其中該第二集 〇相較於该所鑑認出模板蛋白酶或其具催化活性部分之胺 基酸序列含有隨機或定焦突變。 43_根據申請專利範圍第42項之方法，其中該突變係 位於熱點位置之定焦突變。 44.根據申請專利範圍第43項之方法，其中該熱點位 置係位於絲胺酸蛋白酶，且係選位置3〇、73、89與丨55 (基 € 於胰凝乳蛋白酶編號）。 45·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中穩定複合體 之形成係藉由控制一或多項選自反應時間、溫度、pH值、 子強度文庫/辰度與蛋白酶誘陷多肽濃度之參數而受調 Λ/τ 即 ° 46. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該方法進一 步包含將競爭劑加至蛋白酶誘陷多肽 (爾分間之反應中，以藉此增加所鑑認蛋二或具：化 活性部分之選擇性。 47. 根據申凊專利範圍第邨項之方法，其中該競爭劑 為人類血清或血漿。 48. 根據申凊專利範圍帛46項之方法，其中該競爭劑 為細胞或組織萃取物或生物體液例如尿液或血液。 49. 根據申凊專利範圍第46項之方法，其中該競爭劑 為蛋白酶誘陷物之經純化或經部分純化野生型形式。 5〇·根據申請專利範圍第46項之方法，其中該競爭劑 261 200817517 為蛋白酶誘陷客沾 _ 白酶誘陷多肽之\屯化或經部分純化野生型形式或蛋 或多種特定變體。 5i.根據申請專利範圍第47項之方法 為人類血漿。 八t通肌肀劑 52·根據申請專泰丨 — 為蛋白酶誘陷多肽二 項之方法，其中該競爭劑 白酶誘陷多肽之蛋^純化野生型形式或為其為經修飾蛋 狀之蛋白酶誘陷多肽。 53.根據巾請專利範圍第34項之方法， 對複合體篩選其對於 八 ^包含 加祀又貝之裂解序列之受質專一性。 二-種用於筛選蛋白酶以鐘定任 -性之蛋白酶的方法，其包含： Η又貝專 白及/或蛋⑽之具催化活性部分㈣合虚蛋 蛋白酶誘陷多肽與蛋白酶之穩定複夕=解後形成该 陷多肽係挑選或經修飾 ：-中该蛋白酶誘 酶裂解；Α “以被具有所希望受質專-性之蛋白 b)鑑認出在複合體之蛋 分，而__，有所希望受質專一:之之^ 質二5鼻種广化或挑選或鐘認出對於至少兩種不同受 =重二選擇性及/或活性之蛋白酶或其具催化活性 4刀的重稷性方法，其包含： t蛋白酶及/或蛋白酶之具催化活性部分的集合 ==陷多肽接觸，而於該蛋白酶誘陷多肽被該蛋 或其具催化活性部分裂解後，形成含有該蛋白酶誘陷 262 200817517 多肽與集合中之蛋白酶或其具催化活性部分的穩定複合 體，其中接觸係於競爭劑存在下實現； b)鑑認或挑選出與第—蛋白酶誘陷多肽形成複合體之 蛋白酶或其具催化活性部分； 〇將與第-蛋白酶誘陷多肽形成複合體之蛋白酶或其 具催化活性部於競爭劑存在下與第二蛋白酶誘陷多肽 接觸；及
    d)鑑s忍或挑選出與第 蛋白酶或其具催化活性部 二蛋白酶誘陷多肽形成複合 分， 體之 立藉此所鑑認、演化或挑選得之蛋白酶或其具催化活性 部分，對於至少兩種標乾受質對於至少兩種辨識序列 受質專一性與裂解活性。 56. 根據申請專利範圍第55項之方法，其進一步包含 重複步驟a)與13)或a)_d)至少一次，直到分離出對至少= 種辨識序列具有所希望或所狀之受質專―性與裂解活性 的所鑑認或挑選得之蛋白酶。 57. 根據申請專利範圍第55項之方法，其中該蛋白酶 集合包含位於對應於模板蛋白酶位置中之胺基酸突變。 58. 根據申請專利範圍第57項之方法，其中該裂解活 性相較於相對應模板蛋白酶係增加。 59·根據申請專利範圍第56項之方法，其中對於至+ -種辨識序狀受質專一性㈣交於相對應模板蛋白酶係二 加。 "、纭 60.根據中請專利範圍第55帛之方法，其中該競爭劍 263 200817517 係選自人類血清、人類血漿、細胞或組織萃取物、生物體 液例如尿液或血液、蛋白酶誘陷物之經純化或經部分純化 的野生型、及蛋白酶誘陷多肽之一或多種特定變體。 6 1 · —種蛋白酶挑選方法，其包含： a) 將蛋白酶或其具催化活性部分之集合，與第一蛋白 酶誘陷多肽接觸，而於該蛋白酶誘陷多肽裂解後，形成該 虫白酶誘陷多肽與該集合中之任一蛋白酶或其具催化活性 部分的共價複合體； b) 將已複合之蛋白酶與未複合之蛋白酶誘陷多肽分 開； Ο分離或挑選或鑑定該已複合之蛋白酶； d) 以所挑選得之蛋白酶為基礎產生第二蛋白酶或蛋白 酶具催化活性部分之集合；及 e) 藉由將該第二蛋白酶或其具催化活性部分之集合， 與和第一蛋白酶誘陷多肽不同的第二蛋白酶誘陷多肽接觸 ( 而形成複合體；分離該等複合體；及分離、挑選或鑑定已 複合之蛋白酶’而重複步驟a) — c)。 62. 根據申請專利範圍第61項之方法，其中係將第一 與第二蛋白酶誘陷多歸飾以含有兩種不同標㈣質辨識 序列，藉此該所鑑認或挑選得之蛋白酶對至少兩種辨識序 列具有專一性及高裂解活性。 63. 根據申請專利範圍第61項之方法，其係被重複數 次。 64. 根據中請專利範圍第61 $之方法，其中㈣蛋白 264 200817517 =或其具催化活性部分之集合於競爭劑存在下與第一及/或 苐一蛋白酶誘陷多肽接接觸。 65. 根據申請專利範圍第64項之方法，其中該競爭劑 係選自人類血清、人類血衆、細胞或組織萃取物、生物體 液例如尿液或血液、蛋白_陷物之經純化或經部分純化 野生型、及蛋白酶誘陷多肽之―或多種特定變體。 66. 根據中請專利範圍第⑷财任―項之方法，盆
    中該集合含有經修飾之蛋白酶。 / 〃 67·^巾請專利範圍第66項之方法，^__ Ik栈、定焦或位於標靶區域。 6 8. —種組合物，其包含： 蛋白酶與/或其具催化活性部分之集合；及 至少一種蛋白酶誘陷多肽。 69·根據申請專利範圍第⑼項之組合物 酶誘陷多肽係選自絲胺酸蛋白酶抑制物、p35 $ 白 阿伐巨球蛋白家族成員、或其經修飾之形式。 貝 > 70·根據申請專利範圍第68項之組^物，直卜 轉與/或其具催化活性部分之集合係於展示文庫中提/ 71.根據申請專利範圍第70項之組合物，盆_ 庫為1囷體展示文庫，且成員展示蛋 化活性部分。 *白鰣之至少-具催 68項之組 性的方法， 人72.—種套組，其包含根據申請專利範圍第 合物’其中各組成係分開包裝。 73 · —種用於修飾絲胺酸蛋白酶之受質專一 265 200817517 其包含修飾一或多個選自3〇、73、89與155 (基於胰凝乳 蛋白酶編號）之殘基。 74·根據申請專利範圍第73項之方法，其中該絲胺酸 蛋白酶為u-PA。 75·—種經修飾之尿型血纖維蛋白溶酶原活化子（u_pA) 多狀或其具催化活性部分，其含有一或多個位於選自位置 30、73、89與155 (基於胰凝乳蛋白酶編號）之熱點位置 的突變，藉此改變受質專一性。 7 6 · —種經修飾絲胺酸蛋白酶， 其中该蛋白酶或其具催化活性部分為絲胺酸蛋白酶之 胰凝乳蛋白酶家族中者；且 含有一或多個位於相當於位置30、73、89與155 (基 於胰凝乳蛋白酶編號）之突變，藉此改變受質專一性。 77·—種經修飾之尿型血纖維蛋白溶酶原活化子（u-pA) 多肽’其中該u-PA多肽或其具催化活性部分含有一或多 個位於遥自位置 21、24、30、39、61(A)、80、82、84、89、 92、156、158、159及187 (基於胰凝乳蛋白酶編號）之 位置的修飾，藉此改變對t_PA受質之受質專一性，或其序 列。 78·根據申請專利範圍第77項之經修飾u-PA多肽，其 中該u-PA多肽或其具催化活性部分含有一或多種選自 F21 V、I24L、F3 0V、F3 0L、T39A、Y61(A)H、E80G、E82E、 E84K、I89V、K92E、K156T、T158A、V159A 及 K187E 之 突變。 266 200817517 79.根據申請專利範圍第78項之經修飾u-PA多肽，其 中該u-PA多肽或其具催化活性部分含有選自F21V;I24L ; F30V ； F30L ； F30V/Y61(a)H ； F30V/K82E ； F30V/K156T ； F30V/K82E/V159A ； F30V/K82E/T39A/V1 59A ； F30V/K82E /T158A/V159A ； F30V/Y6 1 (a)H/K92E ； F30V/K82E/V1 59A /E80G/I89V/K187E;與 F30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V /K187E之突變。 80.—種經修飾之尿型血纖維蛋白溶酶原活化子（u-PA) 多肽，其中該u-PA多肽或其具催化活性部分含有一或多 個位於選自位置 38、72、73、75、132、133、137、138、 1 5 5、1 60及2 1 7 (基於胰凝乳蛋白酶編號）之位置的修飾， 藉此改變對於VEGFR-2 (或其序列）之受質專一性。 81·根據申請專利範圍第80項之經修飾u-PA多肽，其 中該u-PA多肽或其具催化活性部分含有一或多種選自 V3 8D、R72G、L73A、L73P、S75P、F132L、G133D、E137G、 I138T、L155P、L155V、L155M、V160A、與 R217C 之突 變。 82·根據申請專利範圍第80項之經修飾u-PA多肽，其 中該u-P A多肽或其具催化活性部分進一步包含位於位置3 〇 及/或位置89 (基於胰凝乳蛋白酶編號）之修飾。 83.根據申請專利範圍第82項之經修飾u-PA多肽，其 中該於u-PA多肽或其具催化活性部分之進一步修飾係選 自 F30I、F30T、F30L、F30V、F30G、F30M 及 I89V 〇 84·根據申請專利範圍第83項之經修飾u-PA多肽，其 267 200817517 中該u-PA多肽或其具催化活性部分含有選自L73 A/I89V ; L73P ； R217C ； L155P ； S75P/I89 V/113 8T ； E137G ； R72G/L155P ； G133D ； V160A ； V38D ； F132L/V160A ； L73A/I89V/F30T ； L73A/I89V/F30L ； L73A/I89V/F30V ； L73A/I89V/F30G ； L73A/I89V/L 1 55V ； L73A/I89V/F30M ； L73A/I89V/L155M; L73A/I89V/F30L/L155M;及 L73A/I89V /F30G/L155M 之突變。 85. —種經修飾之ii-PA多肽，其中該u-PA多肽或其具 ίχ 催化活性部分含有一或多種選自F30I、F30T、F30G及F30M 之突變。 86. —種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第75-79 項中任一項之經修飾u_PA多肽，用於治療藉由投藥t_PA 治療之疾病或病況。 87. 根據申請專利範圍第86項之醫藥組成物，其進一 步包含醫藥上可接受之賦形劑。 88. 根據申請專利範圍第87項之醫藥組成物，其中該 (, 醫藥組成物係經調配用於全身、口服、鼻部、肺部、區域 性或局部投藥。 89. 根據申請專利範圍第86項之醫藥組成物，其中該 疾病或病況係選自動脈血栓形成、靜脈血栓形成與血栓栓 塞、缺血性中風、後天性凝血病症、彌散性血管内凝血、 細菌性感染與牙周炎、及神經學病況。 90. —種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第80-85 項中任一項之經修飾u-PA多肽，用於治療由VEGFR-2所 268 200817517 介導之疾病或病況。 91. 根據申請專利範圍帛9〇 $之醫藥組成物，其進一 步包含醫藥上可接受之賦形劑。 92. 根據巾請專利範圍第91項之醫藥組錢，盆中續 醫藥組成物係經調配用於全身、口服、鼻部、肺部、、區域 性或局部投藥。 93. 根據申請專利範圍第9〇項之醫藥組成物，其中該 欲受治療之疾病或病況為血管生成疾病。 /4.根據申請專利範圍第％項之醫藥組成物，其中該 血管生成疾病係選自癌症、黃斑變性、發炎及糖尿病。 95.—種根據申請專利範圍第75_79項中任一項之經修 飾u-PA多肽的用途，其係用於調配用於治療藉由投藥t_pA 治療之疾病或病況之醫藥品。 96·根據申請專利範圍第95項之用途，其中該疾病或 病況係選自動脈血栓形成、靜脈血栓形成與血栓栓塞、缺 血性中風、後天性凝血病症、彌散性血管内凝血、細菌性 感染與牙周炎、及神經學病況。 97·—種根據申請專利範圍第80-85項中任一項之經修 倚u-PA多肽的用途，其係用於調配用於治療由VEGFR-2 所介導之疾病或病況之醫藥品。 98_根據申請專利範圍第95項之用途，其中該欲受治 療之疾病或病況為血管生成疾病。 99·根據申請專利範圍第98項之用途，其中該血管生 成疾病係選自癌症、黃斑變性、發炎及糠尿病。 269 200817517 100·—種套组，其包含根據申請專利範圍第86項之醫 樂組成物’供投藥組成物之裴置纟（視需要地）關於投藥 之說明。 101·—種套組’其包含根據申請專利範圍第9〇項之醫 藥組成物，供投藥組成物少壯m β a L ^ M物之裴置及（視需要地）關於投藥 之說明。 102·—種核酸分子，甘A人A 其包含編碼根據申請專利範圍第 75-85項中任項之經修都u_pA蛋白酶的核苦酸序列。 1G3· 載體’其包含根據中請專利範圍帛102項之 核酸分子。 1〇4· #細胞’其包含根據中請專利範圍帛103項之 載體。 十一、圈式： 如次頁。 270
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