CN111088242A

CN111088242A - Ctss蛋白及编码其的基因的用途

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Publication number: CN111088242A
Application number: CN201811239261.3A
Authority: CN
Inventors: 徐平; 谢琦; 杨靖; 王银; 武军驻; 左涛; 常蕾; 高慧英
Original assignee: Beijing Bofengyuan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Bofengyuan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2020-05-01
Also published as: WO2020083314A1

Abstract

本发明通过揭示CTSS蛋白与肝硬化或肝纤维化之间的紧密联系，提出利用CTSS蛋白肝硬化/肝纤维化的诊断以及治疗上的用途，提供一种诊断试剂和试剂盒，也提供CTSS蛋白或其编码基因的治疗用途。

Description

CTSS蛋白及编码其的基因的用途

技术领域

本发明涉及分子诊断和治疗领域，具体涉及肝硬化的早期检测诊断试剂以及对肝硬化的治疗。

背景技术

肝硬化是一种常见的、发病率较高的疾病，其早期病理表现为肝纤维化。肝硬化患者通常伴随多种严重的并发症，如静脉曲张出血、肝腹水、肾衰竭等。并且，患者一旦确诊为肝硬化，发展成肝癌的几率也将大大增加(Schuppan D,Afdhal NH.Livercirrhosis.Lancet.2008；371:838–851.)。

在早期肝纤维化阶段，患者临床症状不明显，又缺乏有效的临床诊断方法，患者一旦确诊往往已经发展到肝硬化阶段。目前已有的肝硬化诊断方法，比如影像学和血清学指标(肝纤四项：血清III型前胶原氨基端肽，血清层粘连蛋白，透明质酸，血清Ⅳ型胶原)在不同肝纤维化和肝硬化患者中变异较大，并不能提供快速准确的诊断结果；通过肝穿刺进行的组织病理学检测是肝硬化确诊的“金标准”。然而穿刺对患者造成的风险较大(DesmetVJ,Gerber M,Hoofnagle JH,Manns M,Scheuer PJ.Classification of chronichepatitis:Diagnosis,grading and staging.Hepatology.1994；19:1513–1520；Rosenberg WMC,Voelker M,Thiel R,Becka M,Burt A,Schuppan D,et al.Serum markersdetect the presence of liver fibrosis:A cohort study.Gastroenterology.2004；127:1704–1713.)。目前，临床缺乏快速准确又无创的肝纤维化/肝硬化诊断方法。

肝硬化的治疗同样面临挑战。临床肝硬化治疗策略主要是针对病因的治疗。比如病毒诱发的纤维化通过干扰素、核苷(酸)类似物等进行抗病毒治疗(Mallet V,Gilgenkrantz H,Serpaggi J,Verkarre V,Vallet-Pichard A,Fontaine H,et al.Briefcommunication:The relationship of regression of cirrhosis to outcome inchronic hepatitis C.Ann.Intern.Med.2008；149:399–403.)，在早期纤维化阶段可得到较好的治疗效果。然而，在肝硬化阶段，临床上主要通过抑制并发症进行治疗，并不能达到治疗肝硬化的目的(Tsochatzis EA,Bosch J,Burroughs AK.Liver cirrhosis.In:TheLancet.2014.p.1749–1761.)。

因此，病理机制不明是造成肝硬化诊断和治疗困难的主要原因。已有研究表明，细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)重塑失调导致的细胞外基质在肝组织表面大量沉积是肝硬化的重要病理机制(Iredale JP,Thompson A,Henderson NC.Extracellularmatrix degradation in liver fibrosis:Biochemistry andregulation.Biochim.Biophys.Acta-Mol.Basis Dis.2013；1832:876–883.)。如弹性蛋白等ECM家族蛋白，被认为具有影响ECM重塑过程的重要酶类，而组织蛋白酶家族的CTSS蛋白由331个氨基酸组成，能酶切胶原(Wilkinson RDA,Williams R,Scott CJ,BurdenRE.Cathepsin S:Therapeutic,diagnostic,and prognosticpotential.Biol.Chem.2015；396:867–882.)，和肝硬化发生发展密切相关。

发明内容

本发明的一个目的是提供CTSS蛋白和/或其编码基因在诊断肝硬化或肝纤维化疾病中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种肝硬化或肝纤维化疾病早期诊断试剂和包含该试剂的试剂盒。

本发明的再一个目的是提供CTSS蛋白或其编码基因在药物筛选中的用途。

本发明还提供CTSS蛋白或其编码基因中制备治疗肝硬化或肝纤维化的药物中的用途。

根据本发明的一个方面，通过定量蛋白质组学技术和免疫组化实验发现CTSS在肝硬化组织中上调表达；通过将CTSS抗体和荧光探针偶联注射到CCl₄诱导的肝硬化小鼠模型中，在CCl₄诱导产生的肝硬化小鼠的肝脏观测到显著荧光亮度；用CCl₄诱导处理野生型(WT)和CTSS^-/-型小鼠，发现CTSS敲除组肝硬化小鼠模型肝硬化程度显著缓解。因此，CTSS蛋白与肝硬化之间存在密切的关联，可将CTSS蛋白和其编码基因用于肝硬化或肝纤维化的无创早期诊断，所述CTSS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

SEQ ID NO1：

MKRLVCVLLVCSSAVAQLHKDPTLDHHWHLWKKTYGKQYKEKNEEAVRRLIWEKNLKFVMLHNLEHSMGMHSYDLGMNHLGDMTSEEVMSLMSSLRVPSQWQRNITYKSNPNRILPDSVDWREKGCVTEVKYQGSCGACWAFSAVGALEAQLKLKTGKLVSLSAQNLVDCSTEKYGNKGCNGGFMTTAFQYIIDNKGIDSDASYPYKAMDQKCQYDSKYRAATCSKYTELPYGREDVLKEAVANKGPVSVGVDARHPSFFLYRSGVYYEPSCTQNVNHGVLVVGYGDLNGKEYWLVKNSWGHNFGEEGYIRMARNKGNHCGIASFPSYPEI

SEQ ID NO2：

ctaaagatgaaacggctggtttgtgtgctcttggtgtgctcctctgcagtggcacagttgcataaagatcctaccctggatcaccactggcatctctggaagaaaacctatggcaaacaatacaaggaaaagaatgaagaagcagtacgacgtctcatctgggaaaagaatctaaagtttgtgatgcttcacaacctggagcattcaatgggaatgcactcatacgatctgggcatgaaccacctgggagacatgaccagtgaagaagtgatgtctttgacgagttccctgagagttcccagccagtggcagagaaatatcacatataagtcaaaccctaatcggatattgcctgattctgtggactggagagagaaagggtgtgttactgaagtgaaatatcaaggttcttgtggtgcttgctgggctttcagtgctgtgggggccctggaagcacagctgaagctgaaaacaggaaagctggtgactctcagtgcccagaacctggtggattgctcaactgaaaaatatggaaacaaaggctgcaatggtggcttcatgacaacggctttccagtacatcattgataacaagggcatcgactcagacgcttcctatccctacaaagccatggatcagaaatgtcaatatgactcaaaatatcgtgctgccacatgttcaaagtacactgaacttccttatgggagagaagatgtcctgaaagaagctgtggccaataaaggcccagtgtctgttggtgtagatgcgcgtcatccttctttcttcctctacagaagtggtgtctactatgaaccatcctgtactcagaatgtgaatcatggtgtacttgtggttggctatggtgatcttaatgggaaagaatactggcttgtgaaaaacagctggggccacaactttggtgaagaaggatatattcggatggcaagaaataaaggaaatcattgtgggattgctagctttccctcttacccagaaatctagaggatctctcctttttataacaaatcaagaaatatgaagcactttctcttaacttaatttttcctgctgtatccagaagaaataattgtgtcatgattaatgtgtatttactgtactaatagaaaatatagtttgaggccgggcactgtctggctcacgcctgtaatcccagtacttgggaggccaaggaggcatatcaacttgaggccaggagttaaagagcagcctggctaactgtgaaaccctctctact

本发明提供一种肝硬化或肝纤维化疾病的早期诊断试剂，所述诊断试剂可以是下述类型的试剂：

抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(基因芯片)、蛋白质芯片或上述的组合。

因此该试剂可以包含识别CTSS蛋白抗原表位的抗体，也可以包含与CTSS抗体偶联荧光探针形成的复合物，还可以包含从待测样品中扩增CTSS基因的引物。

在上述诊断试剂的基础上，本发明也提供检测试剂盒，试剂盒容器内装有用以检测CTSS蛋白或基因的试剂，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。在优选的实施方案中，所述试剂盒含有一种或多种选自下述的试剂：

(1)用于扩增CTSS基因的特异性引物；

(2)用于检测CTSS基因的特异性探针；

(3)用于检测CTSS蛋白或其编码基因的芯片；

(4)用于检测CTSS蛋白的特异性抗体；

根据本发明的另一方面，提供CTSS蛋白或其编码基因在制备治疗肝硬化或肝纤维化疾病的药物中的用途，可以制备识别CTSS抗原表位的抗体或用于识别CTSS编码基因的反义核酸，通过封阻或抑制CTSS蛋白的表达治疗抑制肝硬化或肝纤维化疾病。

此外，本发明还提供CTSS蛋白或其编码基因在体外筛选肝硬化或肝纤维化药物的药靶的应用，将CTSS蛋白作为治疗肝硬化或肝纤维化药物的靶点，评价待筛选药物是否抑制CTSS蛋白或其编码基因的表达，确定待筛选药物是否可以作为治疗肝硬化或肝纤维化的候选药物。

本发明所述的识别CTSS抗原表位的抗体，是指通过任何已有技术获得的CTSS抗体，也包括任何通过本领域技术人员已知的各种技术进行制备而得到的抗体。CTSS抗体可用于免疫组织化学技术中，检测待测样本中的CTSS蛋白，还可以作为用于预防肝纤维化或肝硬化的特异性治疗剂。抗体可以通过ELISA、IHC、Western印迹分析，或者与荧光检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪、荧光探针等影像学的方法来检测。本发明所述的CTSS的反义核苷酸可采用各种常规的制备方法制备。

本发明通过揭示CTSS蛋白与肝硬化或肝纤维化之间的紧密联系，提出利用CTSS蛋白肝硬化/肝纤维化的诊断以及治疗上的用途。

附图说明

图1：CTSS在肝硬化组织中上调表达。CTS家族蛋白在肝硬化组织中整体上调，CTSS上调幅度最高，“CL”为肝硬化组织，“NL”为正常组织。

图2：CTSS的MS₂质谱谱图。

图3：CTSS在肝硬化组织中出现阳性染色，“CL”为肝硬化组织，“NL”为正常组织。

图4：通过H-E染色和Masson染色检测肝硬化造模程度，“WT-CCl₄”为CCl₄诱导野生型小鼠6周建立模型，“WT-Oil”为橄榄油诱导6周的对照组小鼠。

图5：CCl₄诱导野生型小鼠6周，将荧光染料吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)注射到各组小鼠体内，检测ICG在小鼠肝脏中的代谢速率；“WT-CCl₄”为CCl₄诱导野生型小鼠6周建立模型，“WT-Oil”为橄榄油诱导6周的对照组小鼠。

图6：CTSS抗体和IgG抗体分别与荧光染料ICG偶联形成复合物CTSS-ICG和IgG-ICG，再分别注射到各组小鼠体内进行活体成像图。“WT-CCl₄ICG-CTSS”CCl₄诱导6周形成的肝硬化小鼠模型中注射ICG偶联CTSS抗体复合物；“WT-CCl₄ICG-IgG”为CCl₄诱导6周形成的肝硬化小鼠模型注射ICG偶联IgG抗体复合物；“WT-Oil ICG-CTSS”为橄榄油诱导6周的对照组小鼠体内注射ICG偶联CTSS抗体复合物。

图7：注射抗体荧光染料后48h的离体成像图；“WT-CCl₄ICG-IgG”为CCl₄诱导6周形成的肝硬化小鼠模型注射ICG偶联IgG抗体复合物；“WT-Oil ICG-CTSS”为橄榄油诱导6周的对照组小鼠体内注射ICG偶联CTSS抗体复合物。

图8：CCl₄诱导野生型和CTSS KO型小鼠6周，对各组小鼠进行H-E染色图。“WT-CCl₄”为CCl₄诱导6周形成肝硬化小鼠模型；“WT-Oil”为橄榄油诱导6周形成的对照组小鼠；“CTSSKO-CCl₄”为CCl4诱导CTSS^-/-小鼠6周模型；“CTSS KO-Oil”为橄榄油诱导CTSS^-/-小鼠6周模型。

图9：CCl₄诱导野生型和CTSS KO型小鼠6周，对各组小鼠进行Masson染色图。“WT-CCl₄”为CCl₄诱导6周形成肝硬化小鼠模型；“WT-Oil”为橄榄油诱导6周形成的对照组小鼠；“CTSS KO-CCl₄”为CCl4诱导CTSS^-/-小鼠6周模型；“CTSS KO-Oil”为橄榄油诱导CTSS^-/-小鼠6周模型。

图10：通过试剂盒检测实验组和对照组小鼠肝脏中的羟脯胺酸含量的图。“WT-CCl₄”为CCl₄诱导6周形成肝硬化小鼠模型；“WT-Oil”为橄榄油诱导6周形成的对照组小鼠；“CTSS KO-CCl₄”为CCl4诱导CTSS^-/-小鼠6周模型；“CTSS KO-Oil”为橄榄油诱导CTSS^-/-小鼠6周模型。

图11：胶原片段Endostatin和Canstatin在肝硬化组织中上调表达；(A)质谱数据显示在18型胶原(COL18A1)和4型胶原(COL4A2)的C端鉴定到较多的肽段(长线代表胶原的氨基酸序列长度，短线代表鉴定肽段的氨基酸序列长度，方框区域为可从COL18A1和COL4A2的C端降解的血管抑制素蛋白Endostatin和Canstatin的区域，提示在肝硬化组织中鉴定到了Endostatin和Canstatin，“CL”为肝硬化肝组织，“NL”为正常肝组织；(B图)通过Westernblot验证Endostatin和Canstatin在肝硬化组织中表达，C7-C12为HBV诱发的肝硬化组织，C13-C14为酒精诱发肝硬化，C15-C16为丙肝病毒诱发肝硬化，C17-C18为胆汁淤积诱发肝硬化，N5-N9为正常肝组织；

图12：CTSS可能降解胶原产生Endostatin；(A图)CTSS敲除后影响Endostatin表达；(B图)CTSS抑制后显著抑制Endostatin和Canstatin表达，“siCTSS”为转染CTSS的siRNA组，“Scramble”为转染negative control组。

图13：Endostatin促进肝窦内皮细胞血管化；(A)通过扫描电镜观察模型鼠的肝脏组织中肝窦内皮细胞窗孔变化，橄榄油诱导的野生型小鼠的肝脏组织中(WT-Oil)，肝窦内皮细胞较多且处于开放状态，CCl₄诱导的野生型小鼠(WT-CCl₄)的肝窦内皮细胞窗孔显著降低，而在CCl₄诱导的CTSS KO(CTSS KO-CCl₄)鼠中肝窦内皮细胞窗孔较WT-CCl₄组有较多窗孔保持开放，porosity为窗孔开放的肝窦内皮细胞面积所占肝窦内皮细胞总面积的比例；“WT-CCl₄”为CCl₄诱导6周形成肝硬化小鼠模型；(B)用不同浓度的

处理肝窦内皮细胞后，扫描电镜观察细胞窗孔开放情况，在用30ng/μL和90ng/μL的浓度处理后，肝窦内皮细胞的窗孔显著减少。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但不限制本发明权利要求范围。本发明所用试剂均为市售。

【实施例1】：通过蛋白质组技术鉴定CTSS在肝硬化组织中上调表达

人肝硬化和正常肝样本来自肝硬化手术治疗的患者，由外科医生取材，并进一步由病理科医生通过组织的病理学分析。取50mg新鲜肝组织放入预冷研钵中，加液氮研磨，收集粉末到1.5mL Eppendorf管中，加入300μL细胞裂解液，超声细胞破碎仪裂解5-8min至溶液澄清透明，得到细胞裂解液(Total cell lysate，TCL)，4℃离心机最大转速离心5min，分装。利用SDS-PAGE短胶通过计算灰度值对TCL进行蛋白定量。为减少个体差异对定量蛋白质组数据的影响，分别取3例肝硬化患者的全蛋白进行混匀为“CL1”，另外取3例肝硬化患者的全蛋白进行混匀为“CL2”。5例正常肝组织全蛋白(NL)也分别取等量蛋白进行混匀。SDS-PAGE短胶分离，“CL1”、“CL2”和“NL”共3组样品分别取100μg全蛋白进行SDS-PAGE短胶分离；SDS-PAGE胶染色，脱色；3组样品分别切成胶粒，脱色，脱水；胰蛋白酶37℃消化14小时；抽提液(5％甲酸，50％乙腈)将消化后肽段从胶粒中抽提出来，蒸干备用。

用iTRAQ-4plex试剂盒(AB Sciex，美国)按照说明书对CL1、CL2、NL、NL分别进行114、115、116和117标记，其中116和117为技术重复。为了检测标记效率，从4组样品中各取出1uL混合，用实验室自制的StageTip柱脱盐后进行质谱鉴定。确认标记效率后等量混合样品，离线液相分离以降低样品复杂度，共分成17个fraction，蒸干，备用。

对分离肽段进行液相色谱-质谱联用(LC-MS)(LTQ-Orbitrap Velos质谱仪，Thermo Fisher Scientific，美国)分析：取约1μg样品，用3μm C₁₈自主填充的反相分离柱(75μm i.d.×15cm)100min液相梯度分析。液相色谱分离条件是乙腈浓度从0-35％。质谱分析条件：最高电离电压2.0kV，扫描范围400–1800m/z，自动增益控制(automatic gaincontrol，AGC)1×10⁶，最大离子注入时间150ms，一级扫描在400m/z的分辨率为30000。二级谱扫描模式为高能碰撞诱导解离(Higher Energy Collision Induced Dissociation，HCD)，40％碰撞能量，自动增益控制30000，动态排除35s。

将获得质谱原始raw文件通过MaxQuant(v1.5.8.3)软件进行正反库搜库，搜库参数设置为：母离子误差范围为20ppm，最大漏切位点为2，氨基酸长度最小为7，假阳性率(false discovery rate，FDR)小于1.0％。蛋白定量的依据为unique肽段的报告离子(reporter ion)的丰度。

我们将差异蛋白差值标准设为肝硬化肝(CL)/正常肝(NL)(ratio CL/NL)比例大于1.5倍或者小于-1.5倍且p value<0.05，共鉴定到201个上调差异蛋白和85个下调表达蛋白。

在上调的差异蛋白中鉴定到组织蛋白酶(CTS)家族蛋白在肝硬化组织中整体上调，其中CTSS上调超过1.5倍(图1)，并且CTSS的二级谱匹配较好，提示CTSS鉴定正确(图2)。

【实施例2】：检测CTSS在肝硬化和正常肝组织中的表达

使用CTSS抗体(Abcamab，134157)通过免疫组化检测肝硬化和正常肝中CTSS的表达量。肝硬化和正常肝组织的石蜡切片在60℃烘箱中烤2h；二甲苯脱蜡，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min；随后用梯度酒精水化，无水乙醇Ⅰ10min，无水乙醇Ⅱ10min，95％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，自来水漂洗2次，每次5min；过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，准备含3％H₂O₂的甲醇溶液，将切片泡到在溶液中，室温避光孵育30min；蒸馏水洗5min，2次；抗原修复，准备抗原修复液(10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液)，将切片没入到抗原修复液中，用微波炉加热，选择高档，15分钟；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗5min，2次；山羊血清(康为世纪，CW0130)37℃孵育40min；滴加第一抗体，用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2h；PBS缓冲液洗5min，2次；滴加二抗，37℃，40min；PBS缓冲液洗5min，2次；DAB显色，镜下观察，适时终止；自来水冲洗；苏木素复染30s，自来水冲洗；自来水冲洗返蓝15min；梯度酒精脱水，80％乙醇2min，95％乙醇2min，无水乙醇2次，5min每次；二甲苯Ⅰ和Ⅱ各5min；中性树胶封片；显微镜(Olympus，BX53)观察CTSS染色(图3)。结果表明，CTSS在肝硬化组织中出现阳性染色，“CL”为肝硬化组织，“NL”为正常组织。

【实施例3】：建立CCl₄诱导的肝硬化小鼠模型及肝硬化程度检测

选取C57BL/6j雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重18-22g。按CCl₄(国药试剂)与橄榄油(高温灭菌)的比例为1:7配制肝硬化诱导试剂，分装，4℃冰箱保存。实验组小鼠每只小鼠注射200μL肝硬化诱导试剂；对照组小鼠每只小鼠注射200μL橄榄油，每周注射3次，持续注射6周。实验组和对照组各用6只鼠。6周后，将小鼠拉颈处死，解剖，取出肝组织，PBS漂洗两次，一部分肝组织浸泡在4％的甲醛溶液中用于石蜡切片制作，另一部分液氮速冻，然后冻存于-80℃冰箱保存。

将制作好的石蜡切片进行H-E染色和Masson染色。H-E染色操作步骤根据HE染色试剂盒(碧云天，C0105)提供说明书进行操作。参照“实施例2”进行石蜡切片的烤片、脱蜡、水化，苏木素染色，苏木素染液染色5min，自来水冲洗10min；95％乙醇5s；伊红染色，伊红染液染色1min，自来水冲洗一遍；自来水浸泡5min；脱水，透明，封片。

Masson染色操作步骤根据Masson染色试剂盒(索莱宝，G1403)提供说明书进行操作。石蜡切片的烤片、脱蜡、水化参照上述步骤；用配制好的Weigert铁苏木素染色液染色5-10min；酸性乙醇分化液分化10s，自来水洗；Masson蓝化液返蓝5min，自来水洗，蒸馏水洗1min；丽春红品红染色液染色7min；用弱酸工作液(蒸馏水：弱酸溶液＝2:1)洗1min；磷钼酸溶液洗2min，弱酸工作液洗1min；苯胺蓝染色液中染色2min，弱酸工作液洗1min；95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次10s，二甲苯透明3次，每次2min；中性树胶封片。

在图4中，H-E染色显示WT-Oil组小鼠肝脏细胞排列规则，无胶原沉积，肝小叶清晰，与此对应，Masson染色的WT-Oil组小鼠无胶原纤维形成，肝细胞形态规则完整；而WT-CCl₄组小鼠H-E染色显示肝脏细胞不规则排列，纤维间隔增加，肝小叶破坏严重，表明炎症和纤维化明显；Masson染色显示进一步证明WT-CCl₄组小鼠胶原纤维显著增加，肝小叶被严重破坏。这些结果表明成功建立了肝纤维化和硬化模型(图4)。

【实施例4】：通过CTSS抗体偶联荧光染料进行肝硬化小鼠模型活体成像

参照“实施例3”建立肝硬化小鼠模型。将ICG荧光染料分别尾静脉注射到实验组和对照组小鼠体内，每只小鼠通过尾静脉注射10μg ICG(上海准视生物科技有限公司)，检测不同时间点小鼠肝脏成像，计算ICG从肝脏的排出率。ICG的排出越快肝功能越好，反之，肝功能较差。拍照条件，用带有808nm激光器的SWIR近红外相机(天盈光电SW640)进行活体拍照，高增益，50ms，CLIP5(图5)。

将CTSS抗体和IgG抗体分别与荧光染料ICG按照摩尔比1:25在pH7.2-7.4的PBS中避光室温反应4h，用NAP5柱子(GE Healthcare，17-0853-02)进行纯化得到CTSS偶联ICG的复合物(CTSS-ICG)和IgG抗体偶联ICG的复合物(IgG-ICG)，按照每只小鼠尾静脉注射含20μg抗体的剂量对WT-CCl₄小鼠注射CTSS-ICG复合物(4只鼠)(WT-CCl₄CTSS-ICG)，IgG-CTSS作为阴性对照(4只鼠)(WT-CCl₄IgG-ICG)，用带有808nm激光器的SWIR近红外相机进行活体拍照，高增益，50ms，CLIP5。注射抗体荧光染料复合物后，随着时间的推移，小鼠体内的荧光亮度不断增加，在12小时亮度达到最强；比较第12小时3组小鼠的荧光亮度，WT-CCl₄CTSS-ICG组小鼠荧光亮度显著高于Oil-CCl₄CTSS-ICG组，阴性对照WT-CCl₄IgG-ICG组荧光亮度显著偏于WT-CCl₄CTSS-ICG组(图6)。在注射抗体荧光染料复合物后48h，对小鼠进行解剖，得到的肝组织PBS漂洗2次后进行离体成像，拍照条件低增益，100ms，CLIP5(图7)。离体成像与上述活体成像结果一致：WT-CCl₄CTSS-ICG组小鼠肝脏荧光亮度显著高于Oil-CCl₄CTSS-ICG组和阴性对照WT-CCl₄IgG-ICG组(图7)。以上结果提示：CCl₄诱导的小鼠肝硬化模型中CTSS的表达量显著增加，并且通过荧光探针结合CTSS抗体的方法可用于检测小鼠肝硬化程度。

【实施例5】：通过CCl₄诱导小鼠产生肝硬化模型，CTSS敲除鼠中肝硬化程度得到显著缓解

C57BL/6j的CTSS^-/-小鼠来自浙江大学第二附属医院，由哈佛医学院施国平教授惠赠。CTSS^-/-小鼠的制备方法如下：在小鼠胚胎干细胞ES129细胞中通过同源重组的方法将CTSS外显子5区域包含CTSS活性区域的半胱氨酸部分除去，然后将ES129细胞导入到C57BL/6j雌鼠的子宫内产生下一代，通过South blot技术检测新生鼠体内CTSS是否已经敲除(ShiGP,Villadangos J a,Dranoff G,Small C,Gu L,Haley KJ,et al.Cathepsin S requiredfor normal MHC class II peptide loading and germinal centerdevelopment.Immunity.1999；10,197–206.)。使用Primer 5软件设计CTSS基因的特异性引物：上游引物序列为：5’-GAA TAA AGG CTG TGG AGG CG-3’；下游引物序列为：5’-CGT GGCTTT GTA GGG ATA GG-3’。将CTSS^-/-小鼠彼此交配繁殖10代以后取其后代用于研究实验(Sukhova GK,Zhang Y,Pan JH,Wada Y,Yamamoto T,Naito M,et al.Deficiency ofcathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficientmice.J.Clin.Invest.2003；111:897-906.)。参照“实施例3”中实验步骤建立肝硬化小鼠模型，实验组和对照组各4只鼠。在CCl₄诱导6周后取小鼠肝组织，PBS漂洗2次，一部分肝组织浸泡于4％甲醛溶液中用于石蜡切片制作，另一部分肝组织液氮速冻后于-80℃冰箱保存。

石蜡切片根据“实施例3”中实验步骤进行H-E染色和Masson染色的实验，根据染色结果，WT-Oil组和CTSS KO-Oil组小鼠肝脏肝小叶明显，没有胶原沉积和纤维间隔出现，WT-CCl₄组出现大量的胶原沉积和较严重的纤维间隔，而CTSS KO-CCl₄组胶原沉积显著降低和纤维间隔的宽度显著变细(图8和图9)。

参照羟脯胺酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，A030-2)说明书检测羟脯胺酸含量：调节pH甲液、调节pH乙液、羟脯氨酸标准品；精确称取肝组织湿重30-100mg放入试管中，准确加水解液1mL。95℃水解10min，枪头吹吸混匀，95℃继续水解10min；调pH值至6.0-6.8左右；加入去离子水至10mL，混匀；取3mL稀释的水解液加适量活性炭20-30mg，以离心后上清液澄清无色为准，混匀，3500rpm离心10min，小心取上清1mL检测；检测方法，空白对照加入1mL去离子水，标准管加1mL标准品(5μg/mL)，测定管每管加入1mL样品，各管均加入“试剂一”0.5mL，混匀后静置10min，每管加入“试剂二”0.5mL，混匀后静置5min，每管加入“试剂三”0.5mL，混匀后65℃水浴15min，3500rpm离心10min，取上清550nm检测OD值；依据说明书公式计算羟脯氨酸含量。羟脯胺酸在WT-Oil组和CTSS KO-Oil组的含量接近，WT-CCl₄组羟脯胺酸的含量显著升高，并且显著高于CTSS KO-CCl₄组(图10)。图8-10结果提示，CTSSKO后，小鼠肝硬化程度得到显著缓解。

【实施例6】：CTSS影响肝硬化的机制研究

分析在肝硬化组织中上调的差异表达蛋白，鉴定到一群在肝硬化组织中上调表达的血管抑制素蛋白Endostatin和Canstatin。这些蛋白是从胶原的C端降解得到的产物(图10)。取6例在HBV诱发肝硬化患者(HBV CL)和6例酒精、丙肝病毒等因素诱发的其他肝硬化患者，以及5例正常肝患者(NL)通过Western blot进一步验证Endostatin和Canstatin在肝硬化组织中的上调表达：参照“实施例1”中的TCL提取方法从肝硬化和正常肝组织中提取全蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，随后用Endostatin抗体(Abcam，ab64569，1:1000稀释)和Canstatin抗体(LifeSpan，LS-C312679，1:1000稀释)室温孵育2h，洗膜液(0.88％NaCl，20mM Tri-HCl pH 8.0，0.1％Tween-20)洗2次，每次15min，二抗(康为世纪，CW0156S和CW0153S)按1:5000稀释后室温孵育1h，洗膜后利用化学发光显色液(Thermo Fisher Scientific，34080)进行显色(图11)。

如图11所示，(A)质谱数据显示在18型胶原(COL18A1)和4型胶原(COL4A2)的C端鉴定到较多的肽段(短线)，方框区域为可从COL18A1和COL4A2的C端降解的血管抑制素蛋白Endostatin和Canstatin的区域，提示在肝硬化组织中鉴定到了Endostatin和Canstatin，“CL”为肝硬化肝组织，“NL”为正常肝组织；(B图)通过Western blot验证Endostatin和Canstatin在肝硬化组织中表达，C7-C12为HBV诱发的肝硬化组织，C13-C14为酒精诱发肝硬化，C15-C16为丙肝病毒诱发肝硬化，C17-C18为胆汁淤积诱发肝硬化，N5-N9为正常肝组织

将“实施例5”中通过CCl₄诱导野生型和CTSS^-/-鼠建立的肝硬化小鼠模型的肝组织按照上述步骤进行Western blot分析，检测Endostatin在模型鼠中的表达情况(图12)。Endostatin抗体(Abcam，ab3453)按照1:1000的比例进行稀释。同时设计CTSS的siRNA，序列为：“AGAAUCAGGCAAUAUCCGAUUAGGG”。将siRNA在转染试剂Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent(Invitrogen，11668-019)的作用下转染到可产生胶原的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中，48h后，收集细胞，提取全蛋白，参照上述步骤通过Western blot检测Endostatin和Canstatin表达(图12)。图12显示，CTSS可能降解胶原产生Endostatin；(A图)CTSS敲除后影响Endostatin表达；(B图)CTSS抑制后显著抑制Endostatin和Canstatin表达，“siCTSS”为转染CTSS的siRNA组，“Scramble”为转染negative control组。

Endostatin为血管抑制素蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：3)，进一步验证Endostatin对肝窦内皮细胞的影响。取“实施例5”中通过CCl₄诱导野生型和CTSS-/-鼠建立的肝硬化小鼠模型的新鲜的肝组织，通过2.5％的戊二醛进行肝灌注，切成薄片在4℃固定过夜，梯度酒精脱水，干燥，喷金制作成电镜样品进行扫描电镜(ZEISS，EVOLS10)观察(图13)。

进一步取野生型健康C57BL/6j小鼠的新鲜肝脏，PBS漂洗2次，切成5mm左右的碎块后放入到盛有胶原酶(Miltenyi Biotec，130-090-312)的gentle MACS25C Tubes(Miltenyi Biotec，130-093-237)中，在全自动温和组织处理器(Miltenyi Biotec，130-093-235)上通过程序“37C_m_LIDK_1”进行自动解离；重悬样品；用DMEM将100μm滤膜(BDBiosciences，352360)浸润，再将解离悬液加入到滤膜中，过滤除去未解离杂质；细胞悬液300g离心10min，弃上清，得细胞沉淀；用200μL PEB buffer(含0.5％BSA的PBS溶液)重悬细胞，计数；然后按每只鼠肝脏加20μL CD146MicroBeads(Miltenyi Biotec，130-092-007)的量加入beads，并于4℃孵育15min；再用放入磁场中的Mini column(Miltenyi Biotec，130-042-201)分选结合CD146MicroBeads的细胞；细胞计数，一部分细胞用CD146抗体(Sciencell，134711)冰上孵育30min后通过流式细胞仪(BD Biosciences，LSRFortessaSORP)检测肝窦内皮细胞纯度为89.6％；另一部分细胞用原代细胞培养基(Sciencell，1001)重悬，培养18h后加入不同浓度的重组人血管内皮抑制素注射液恩度(Endostar)(先声药业)处理12h；2.5％戊二醛将细胞注射4℃固定过夜，梯度酒精脱水，干燥，喷金，扫描电镜观察(图13)。

由图13可见：(A)通过扫描电镜观察模型鼠的肝脏组织中肝窦内皮细胞窗孔变化，橄榄油诱导的野生型小鼠的肝脏组织中(WT-Oil)，肝窦内皮细胞较多且处于开放状态，CCl₄诱导的野生型小鼠(WT-CCl₄)的肝窦内皮细胞窗孔显著降低，而在CCl₄诱导的CTSS KO(CTSS KO-CCl₄)鼠中肝窦内皮细胞窗孔较WT-CCl₄组有较多窗孔保持开放，porosity为窗孔开放的肝窦内皮细胞面积所占肝窦内皮细胞总面积的比例；“WT-CCl₄”为CCl₄诱导6周形成肝硬化小鼠模型；(B)用不同浓度的Endostar处理肝窦内皮细胞后，扫描电镜观察细胞窗孔开放情况，在用30ng/μL和90ng/μL的浓度处理后，肝窦内皮细胞的窗孔显著减少。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京谱峰源生物科技有限公司

<120> CTSS蛋白及编码其的基因的用途

<130> BJ1936-18P122121

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Lys Arg Leu Val Cys Val Leu Leu Val Cys Ser Ser Ala Val Ala

1 5 10 15

Gln Leu His Lys Asp Pro Thr Leu Asp His His Trp His Leu Trp Lys

20 25 30

Lys Thr Tyr Gly Lys Gln Tyr Lys Glu Lys Asn Glu Glu Ala Val Arg

35 40 45

Arg Leu Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Phe Val Met Leu His Asn Leu

50 55 60

Glu His Ser Met Gly Met His Ser Tyr Asp Leu Gly Met Asn His Leu

65 70 75 80

Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Val Met Ser Leu Met Ser Ser Leu Arg

85 90 95

Val Pro Ser Gln Trp Gln Arg Asn Ile Thr Tyr Lys Ser Asn Pro Asn

100 105 110

Arg Ile Leu Pro Asp Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Cys Val Thr

115 120 125

Glu Val Lys Tyr Gln Gly Ser Cys Gly Ala Cys Trp Ala Phe Ser Ala

130 135 140

Val Gly Ala Leu Glu Ala Gln Leu Lys Leu Lys Thr Gly Lys Leu Val

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ala Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Thr Glu Lys Tyr Gly

165 170 175

Asn Lys Gly Cys Asn Gly Gly Phe Met Thr Thr Ala Phe Gln Tyr Ile

180 185 190

Ile Asp Asn Lys Gly Ile Asp Ser Asp Ala Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala

195 200 205

Met Asp Gln Lys Cys Gln Tyr Asp Ser Lys Tyr Arg Ala Ala Thr Cys

210 215 220

Ser Lys Tyr Thr Glu Leu Pro Tyr Gly Arg Glu Asp Val Leu Lys Glu

225 230 235 240

Ala Val Ala Asn Lys Gly Pro Val Ser Val Gly Val Asp Ala Arg His

245 250 255

Pro Ser Phe Phe Leu Tyr Arg Ser Gly Val Tyr Tyr Glu Pro Ser Cys

260 265 270

Thr Gln Asn Val Asn His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Asp Leu

275 280 285

Asn Gly Lys Glu Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly His Asn Phe

290 295 300

Gly Glu Glu Gly Tyr Ile Arg Met Ala Arg Asn Lys Gly Asn His Cys

305 310 315 320

Gly Ile Ala Ser Phe Pro Ser Tyr Pro Glu Ile

325 330

<210> 2

<211> 1255

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ctaaagatga aacggctggt ttgtgtgctc ttggtgtgct cctctgcagt ggcacagttg 60

cataaagatc ctaccctgga tcaccactgg catctctgga agaaaaccta tggcaaacaa 120

tacaaggaaa agaatgaaga agcagtacga cgtctcatct gggaaaagaa tctaaagttt 180

gtgatgcttc acaacctgga gcattcaatg ggaatgcact catacgatct gggcatgaac 240

cacctgggag acatgaccag tgaagaagtg atgtctttga cgagttccct gagagttccc 300

agccagtggc agagaaatat cacatataag tcaaacccta atcggatatt gcctgattct 360

gtggactgga gagagaaagg gtgtgttact gaagtgaaat atcaaggttc ttgtggtgct 420

tgctgggctt tcagtgctgt gggggccctg gaagcacagc tgaagctgaa aacaggaaag 480

ctggtgactc tcagtgccca gaacctggtg gattgctcaa ctgaaaaata tggaaacaaa 540

ggctgcaatg gtggcttcat gacaacggct ttccagtaca tcattgataa caagggcatc 600

gactcagacg cttcctatcc ctacaaagcc atggatcaga aatgtcaata tgactcaaaa 660

tatcgtgctg ccacatgttc aaagtacact gaacttcctt atgggagaga agatgtcctg 720

aaagaagctg tggccaataa aggcccagtg tctgttggtg tagatgcgcg tcatccttct 780

ttcttcctct acagaagtgg tgtctactat gaaccatcct gtactcagaa tgtgaatcat 840

ggtgtacttg tggttggcta tggtgatctt aatgggaaag aatactggct tgtgaaaaac 900

agctggggcc acaactttgg tgaagaagga tatattcgga tggcaagaaa taaaggaaat 960

cattgtggga ttgctagctt tccctcttac ccagaaatct agaggatctc tcctttttat 1020

aacaaatcaa gaaatatgaa gcactttctc ttaacttaat ttttcctgct gtatccagaa 1080

gaaataattg tgtcatgatt aatgtgtatt tactgtacta atagaaaata tagtttgagg 1140

ccgggcactg tctggctcac gcctgtaatc ccagtacttg ggaggccaag gaggcatatc 1200

aacttgaggc caggagttaa agagcagcct ggctaactgt gaaaccctct ctact 1255

Claims

1.CTSS蛋白和/或其编码基因的用途，其中所述CTSS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述用途包括：

在制备治疗肝硬化或肝纤维化疾病的药物中的应用；

作为早期诊断肝硬化或肝纤维化疾病的诊断试剂的应用。

2.权利要求1所述的用途，其中所述药物包括：

识别CTSS抗原表位的抗体；或

用于识别CTSS编码基因的反义核酸。

3.权利要求1所述的用途，其中所述诊断试剂包括：

抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片、蛋白质芯片或上述的组合。

4.权利要求3所述的用途，其中所述诊断试剂选自识别CTSS蛋白抗原表位的抗体、与CTSS抗体偶联荧光探针形成的复合物和从待测样品中扩增CTSS基因的引物。

5.权利要求1所述的用途，其中所述CTSS蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.一种用于早期诊断肝硬化或肝纤维化疾病的诊断试剂，包含：

检测待测样本中CTSS蛋白的试剂；和/或

检测待测样本中编码CTSS蛋白的基因表达的试剂。

7.权利要求6所述的诊断试剂，其特征在于所述诊断试剂选自识别CTSS蛋白抗原表位的抗体、与CTSS抗体偶联荧光探针形成的复合物和从待测样品中扩增CTSS基因的引物。

8.一种用于早期诊断肝硬化或肝纤维化疾病的试剂盒，其包含权利要求6所述的诊断试剂。

9.CTSS蛋白或其编码基因作为在体外筛选肝硬化或肝纤维化药物的药靶的应用。

10.一种体外筛选药物的方法，包括将CTSS蛋白或其编码基因的表达作为靶点，评价所述药物是否可以作为治疗肝硬化或肝纤维化的候选药物。