MX2008016221A

MX2008016221A - Métodos de selección de proteasa y proteasas identificadas por este medio.

Info

Publication number: MX2008016221A
Application number: MX2008016221A
Authority: MX
Inventors: Edwin L Madison
Original assignee: Catalyst Biosciences Inc
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2009-02-23
Also published as: KR20170014023A; EP2046951A2; US20090123452A1; US8663633B2; IL217488A; EP3034607A1; EP2402438A3; JP2009542218A; SG175602A1; SG10201503055TA; IL217489A; TW201139677A; TW200817517A; US20120308551A1; HK1126521A1; US20120301945A1; KR20150033726A; AU2007307260A1; CN103289980A; HK1226098B

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para identificar proteasas con especificidad de sustrato modificada u otras propiedades. Los métodos seleccionan proteasas candidatas y modificadas contactándolas con un sustrato, tal como una serpina, alfa-macroglobulinas o una proteína de la familia p35 o serpinas modificadas y miembros modificados de la familia p35 o alfa-macroglobulinas modificadas que, después del desdoblamiento del sustrato, atrapan la proteasa formando un complejo estable. También se proporcionan proteasas modificadas.

Description

MÉTODOS DE SELECCIÓN DE PROTEASA Y PROTEASAS IDENTIFICADAS POR ESTE MEDIO CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos para identificar proteasas modificadas, con especificidad de sustrato modificada u otras propiedades. Los métodos seleccionan proteasas candidatas y modificadas contactándolas con un sustrato que las atrapa después del desdoblamiento del sustrato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteasas son enzimas que degradan proteínas. Debido a que las proteasas pueden interactuar específicamente con e inactivar o activar una proteína objetivo, han sido empleadas como terapéuticos. Las proteasas que se originan naturalmente, a menudo no son terapéuticos óptimos puesto que no exhiben la especificidad, estabilidad y/o actividad catalítica que las proporciona adecuadas como bioterapéuticos (véase por ejemplo, Fernandez-Gacio et al. (2003) Trends in Biotech. 21: 408-414). Entre las propiedades de terapéuticos que son importantes, están la carencia de inmunogenicidad o inmunogenicidad reducida; especificidad para una molécula objetivo, y efectos secundarios limitados. Proteasas que se originan naturalmente en general, son deficientes en una o más de estas propiedades. Se han hecho intentos por diseñar proteasas con propiedades mejoradas. Entre estos procedimientos incluyen 1) diseño racional, el cual requiere información acerca de la estructura, mecanismos catalíticos y modelación molecular de una proteasa; y 2) evolución dirigida, la cual es una proteasa que involucra la generación de un repertorio mutante diverso para una proteasa, y selección de aquellos mutantes que exhiben una característica deseada (Bertschinger et al. (2005) en Phage display in Biotech, and Drug Discovery (Sidhus, ed) , pp . 461-491). Para el procedimiento anterior, una carencia de información con respecto a la relación de estructura-función de proteasas, limita la capacidad para racionalmente diseñar mutaciones para la mayoría de las proteasas. Las metodologías de evolución dirigidas han sido empleadas con éxitos limitados . La selección para actividad de proteasa mejorad a menudo, conduce a una pérdida de selectividad de sustrato y viceversa. Una proteasa terapéutica óptima debe exhibir una alta especificidad para un sustrato objetivo, y una alta eficiencia catalítica. Debido a la efectividad limitada de métodos disponibles para seleccionar proteasas con especificidad optimizada y actividad optimizada, permanece una necesidad de desarrollar métodos alternos de selección de proteasa. Por consiguiente, está entre los objetivos de la presente, proporcionar métodos para selección de proteasas o proteasas mutantes, con especificidades y actividades de sustrato deseadas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos para la selección o identificación de proteasas o proteasas mutantes o porciones catalíticamente activas de las mismas, con especificidades y actividades de sustrato deseadas o predeterminadas. En particular, proporcionados en la presente, están métodos de selección de proteasas que identifican proteasas que tienen una especificidad y/o actividad alterada, mejorada u optimizada, o alterada de otro modo, de sustrato para un sustrato o sustratos objetivos. Los métodos pueden ser usados por ejemplo, para seleccionar proteasas que tienen una especificidad y/o actividad de sustrato alterada para un sustrato objetivo involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. En virtud de la especificidad y/o actividad alterada, típicamente incrementada para un sustrato objetivo, las proteasas identificadas o seleccionadas en los métodos proporcionados en la presente, son candidatas para uso como reactivos o terapéuticos en el tratamiento de enfermedades o condiciones por las cuales el sustrato objetivo está involucrado. En la práctica de los métodos proporcionados en 1 presente, una colección de proteasas o porción de la misma catalíticamente activa, es contactada con un polipéptido que atrapa proteasas resultando en la formación de complejos estables de polipéptido que atrapa proteasas con proteasas o porción de la misma catalíticamente activa en la colección. En algunos ejemplos, el polipéptido que atrapa proteasa es modificado para ser desdoblado por una proteasa que tiene una especificidad y/o actividad de sustrato predeterminada para un sustrato objetivo, por ejemplo, un sustrato objetivo involucrado en una enfermedad o trastorno. El método puede además, comprender seleccionar los complejos para especificidad de sustrato para la secuencia desdoblada del sustrato objetivo. En tales ejemplos, la proteasa identificada o seleccionada, tiene una actividad y/o especificidad alterada hacia el sustrato objetivo. En un ejemplo, el complejo estable es formado por enlace covalente de una proteasa seleccionada con un polipéptido que atrapa proteasa. Las proteasas seleccionadas o porción de la misma catalíticamente activas, son identificada o seleccionadas a partir del complejo en los métodos proporcionados en la presente. Los métodos proporcionados en la presente, pueden además, incluir la etapa de atrapar las proteasas formadas en complejos a partir de los miembros de proteasa no formados en complejos de la colección. En un ejemplo, el polipéptido que atrapa proteasa, es etiquetado para detección o separación y la separación es efectuada por la captura de complejos que contienen el polipéptido que atrapa proteasa detectable y la proteasa o porción de la misma catalíticamente activa. La captura puede ser efectuada en suspensión, solución o en un soporte sólido. En casos en donde la captura es por un soporte sólido, el polipéptido que atrapa proteasa está unido al soporte sólido, lo cual puede ser efectuado antes, durante o subsecuente al contacto del polipéptido que atrapa proteasa con la colección de proteasas o porciones catalíticamente activas de los mismos. El soporte sólido puede incluir, por ejemplo, una cavidad de una placa de 96 cavidades. En algunos ejemplos, el polipéptido que atrapa proteasa es etiquetado con biotina. En otros ejemplos, el polipéptido que atrapa proteasa puede ser etiquetado con un marca His y la separación puede ser efectuada por captura con un agente quelante de metal, tal como pero no limitado a, sulfato de níquel (NiS04) , cloruro de cobalto (CoCl2) , sulfato de cobre (CuS04), y cloruro de zinc (ZnCl2) . El agente quelante de metal, puede ser conjugado a un soporte sólido, tal como por ejemplo, en perlillas tales como perlillas de sefarosa o perlillas magnéticas. En los métodos proporcionados en la presente, el método puede además, incluir una etapa de amplificar la proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en los complejos separados. En algunos ejemplos, la proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en el complejo separado, es exhibida en el fago, y la amplificación se efectúa infectando una célula hospedera con el fago. Las células hospederas pueden incluir una bacteria, por ejemplo, E. coli. La proteasa amplificada, ya sea de medio de célula bacteriana, periplasmo bacteriano, sobrenadante de fago o proteína purificada, pueden ser seleccionadas para especificidad y/o actividad hacia un sustrato objetivo. Típicamente, el sustrato objetivo es un polipéptido o una secuencia desdoblada en un polipéptido involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. También proporcionado en la presente, está un método multiplexado por medio del cual, la colección de proteasas es contactada con una pluralidad de diferentes polipéptidos que atrapan proteasas, que incluyen formas modificadas de la misma, en donde cada uno de los polipéptidos que atrapan proteasas son etiquetados de manera que pueden ser identificablemente detectados. En tales métodos, al menos dos polipéptidos que atrapan proteasas son identificables etiquetados, de manera que más de un complejo estable puede formarse y más de una proteasa es identificada.

En los métodos proporcionados en la presente, los métodos también incluyen rondas sucesivas de selección para optimizar la selección de proteasa, en donde las proteasas son amplificadas después de su identificación o selección en una primera ronda de los métodos de selección de la presente, para con ello, producir una segunda colección de proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas. La segunda colección de proteasas son contactadas con un polipéptido que atrapa proteasas, esto es, el mismo o diferente que el primer polipéptido que atrapa proteasas, para producir una segunda serie de complejos estables. Las proteasas en la segunda serie de complejos estables, son identificadas o seleccionadas. En los métodos proporcionados en la presente, el polipéptido que atrapa proteasa es una serpina, un miembro de la familia alfa macroglobulina , o un miembro de la familia p35. Tal molécula de polipéptido usada en los métodos proporcionados en la presente, forma un complejo estable por enlace covalente de una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa con el polipéptido que atrapa proteasas. En un aspecto del método proporcionado en la presente, son identificadas proteasa que tienen una especificidad de sustrato deseada contactando una colección de proteasas y/o porciones proteolíticamente activas de proteasas con un polipéptido que atrapa proteasas para formar complejos estables del polipéptido que atrapa proteasas con una proteasa después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasas. El polipéptido que atrapa proteasas, o formas modificadas de las mismas, se selecciona para uso en los métodos para propósitos de ser desdoblado por una proteasa que tiene la especificidad de sustrato deseada. En los métodos, la proteasa o porción de la misma proteoliticamente activa, es identificada para seleccionar una proteasa que tiene una especificidad de sustrato deseada. La colección de proteasas usadas en los métodos proporcionados en la presente, son cualquier colección de proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas e incluyen miembros con al menos, aproximadamente, o igual a 5, 10, 50, 100, 103, 104, 105, 106 o más de diferentes elementos. En algunos aspectos, las proteasas son proteasas serina y/o cisteína. En los métodos proporcionados en la presente, la colección de proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas, son exhibidas para contacto con un polipéptido que atrapa proteasa. En un ejemplo, la proteasa o porción de la misma proteoliticamente activa, son exhibidos en un soporte sólido, superficie celular, o en una superficie de un microorganismo. La proteasa puede ser exhibida en levadura, bacteria, un virus, un fago, un ácido nucleico, una molécula de ARNm, o sobre ribosomas. En donde la proteasa o porción de la misma proteoliticamente activa es exhibida en un microorganismo, los microorganismos incluyen pero no se limitan a, E. coli, S. cerevisiae, o un virus tal como un M13, fd, o fago T7, o un baculovirus. En los métodos proporcionados en la presente, las proteasas o porciones de las mismas proteoliticamente activas, son exhibidas en una biblioteca de exhibición de fago y la colección de proteasa es una biblioteca de exhibición de fago. En algunas modalidades, las proteasas son proporcionadas en las colecciones, tal como por exhibición, como porciones proteoliticamente activas de una proteasa de longitud completa. En algunos ejemplos, el contacto de una colección de proteasa con un polipéptido que atrapa proteasa, está en una mezcla homogénea. Proporcionado en la presente, está un método de selección de proteasa, en donde al menos, dos diferentes polipéptidos que atrapan proteasas son contactados con la colección, pero en donde solamente uno de los polipéptidos que atrapan proteasas es detectablemente etiquetado. El polipéptido que atrapa proteasas que es detectablemente etiquetado, permite la captura de complejos estables que contienen el polipéptido que atrapa proteasas detectable, y una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa. En algunos ejemplos de este método, uno o más polipéptidos que atrapan proteasas que no son detectablemente etiquetados, están presentes en exceso en la reacción, comparado con el polipéptido que atrapa proteasas detectablemente etiquetado. En los métodos, la etiqueta es cualquier etiqueta para detección del mismo, tal como una etiqueta fluorescente o una etiqueta de epitope, tal como una marca His. En otros ejemplos, la etiqueta detectable es biotina . La colección de proteasas para la cual se hace la selección en los métodos proporcionados en la presente, incluye cualquier colección de proteasa. En algunos ejemplos, las proteasas son serina o cisteina proteasas. La colección de proteasas incluye aquellas que son miembros de la familia quimiotripsina y subtilisina de serina proteasa o de las caspasas de la familia papaina de cisteina proteasas. Las proteasas incluyen cualquier proteasas, o porción de las mismas catalíticamente activas, expuestas en la Tabla 7. En algunos ejemplos, la proteasa o porción de la misma catalíticamente activa, son colecciones de proteasas del activador del plasminógeno urocinasa (u-PA) , proteasas del activador del plasminógeno de tejido (t-PA) , o proteasas T-SP1. En un aspecto, los polipéptidos que atrapan proteasas usados en los métodos proporcionados en la presente son, serpinas, miembros de la familia p35, miembros de la familia alfa-macroglobulina , o cualquiera de las formas modificadas de los mismos. Un polipéptido que atrapa proteasa usado en los métodos proporcionados en la presente incluye, pero no se limita a, inhibidor-1 del plasminógeno (PAI-1), antitrombina (AT3), o alfa 2-macroglobulina, o formas modificadas de los mismos. Las formas modificadas de un polipéptido que atrapa proteasa usadas en los métodos proporcionados en la presente, incluyen aquellas que contienen reemplazo, supresiones o sustituciones de aminoácido en el sitio reactivo del polipéptido que atrapa proteasa. En algunos ejemplos, la modificación es cualquiera o más de los reemplazos de aminoácido que corresponden a una secuencia desdoblada de un sustrato objetivo. El sustrato objetivo puede ser cualquier proteina involucrada en una etiología de una enfermedad o trastorno. Ejemplos de sustratos objetivos incluyen, pero no se limitan a, VEGFR, una secuencia t-PA desdoblada, o una proteína complemento. Por ejemplo, sustratos objetivos incluyen, pero no se limitan a, VEGFR2 o una proteína complemento C2. La secuencia desdoblada de un sustrato objetivo incluye, pero no se limita a, cualquiera expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 389, 479 y 498. En algunos aspectos, el polipéptido que atrapa proteasa es una serpina y uno o más reemplazos de aminoácido son/están en el bucle de sitio reactivo del polipéptido serpina. Uno o más reemplazos en el bucle de sitio reactivo (RSL) , incluye aquellos en cualquiera o más de las posiciones P4-P2. Ejemplares de tales serpinas usadas en los métodos involucrados en la presente, son cualquiera expuesto en cualquiera de las SEC ID NOS: 497, 499, 610 y 611. En otro ejemplo, el polipéptido que atrapa proteasa está en una alfa 2-macroglobulina y uno o más reemplazos de aminoácidos están en la región de cebo del polipéptido. Las proteasas identificadas o seleccionadas en los métodos en la presente contra un polipéptido que atrapa proteasas modificadas, pueden ser seleccionadas o filtradas para especificidad de sustrato alterados para el sustrato objetivo, comparado con un sustrato no objetivo. En tales ejemplos, el sustrato no objetivo incluye, un sustrato de la proteasa plantilla correspondiente. Típicamente, la especificidad de sustrato de la proteasa identificada o seleccionada, se incrementa por 1.5-veces, 2-veces., 5-veces, 10-veces, 50-veces, 100-veces, 200, veces, 300-veces, 400-veces, 500-veces o más. Los métodos proporcionados en la presente, incluyen aquellos que son iterativos en donde el método para identificar y/o seleccionar proteasas con una especificidad de sustrato deseado es repetida o realizada una pluralidad de veces. En tales métodos, una pluralidad de diferentes proteasas pueden ser identificadas en la primera iteración, o la primea ronda del método. En otros ejemplos, una pluralidad de proteasas es generada y preparadas después de la primera iteración, basadas en las proteasas identificadas seleccionadas en la primera ronda de iteración. Adicionalmente, en algunos ejemplos, las secuencias de aminoácido de proteasas seleccionadas identificadas en la primera ronda o iteración y/o en rondas sucesivas, son comparadas a identificar puntos calientes. Los puntos calientes son aquellas posiciones que son reconocidas como un lugar modificado en rondas múltiples, tal como ocurre en al menos 2, 3, 4, 5 o más proteasas identificadas, tal como se compara con una proteasa de plantilla o tipo nativo, a partir de una colección de proteasas modificadas usadas en el método. También proporcionado en el método de la presente, está una etapa adicional de, después de identificar una proteasa o proteasas, preparando una segunda colección de proteasas, en donde una proteasa identificada es usada en una plantilla, para hacer mutaciones adicionales en la secuencia de proteasa o porción catalíticamente activa de la misma, de manera tal que miembros de la segunda colección (están basados en) , contienen polipéptidos que tienen mutaciones de las proteasas identificadas y mutaciones adicionales; después de contactar la segunda colección con un polipéptido que atrapa proteasa, que es ya sea idéntico o diferente de la trampa de proteasa usada para aislar la primera proteasa o proteasas, en donde la trampa de proteasa es modificada para ser desdoblada por una proteasa que tiene la especificidad de sustrato deseada; e identificación de una (s) proteasa (s) o porción (es) proteoliticamente activa (s) de una proteasa a partir de la colección en un complejo, por medio del cual, la(s) proteasa (s) identificada (s) tienen mayor actividad o especificidad hacia el sustrato deseado que la primera proteasa identificada. La segunda colección puede contener mutaciones aleatorias o enfocadas, comparada con las secuencias de aminoácidos de la(s) proteasa (s) de plantilla identificadas o porción proteoliticamente activa de una proteasa. Las mutaciones enfocadas, incluyen, por ejemplo, posiciones de puntos calientes, tales como posiciones 30, 73, 89 y 155, basados en la numeración de quimiotripsina, en una serina proteasa, tal como u-PA. En la práctica de los métodos, la reacción para formar complejos estables puede ser modulada controlando uno o más parámetros. Tales parámetros son cualquiera que altera la relación o extensión de reacción o eficiencia de la reacción, tal como, pero no limitado a, tiempo de reacción, temperatura, pH, intensidad iónica, concentración de biblioteca y concentración de polipéptido atrapador de proteasa . Las reacciones pueden ser realizadas en la presencia de un competidor de la reacción entre un polipéptido que atrapa proteasa y una proteasa o porción de la misma proteoliticamente activa para con ello, mejorar la selectividad de la(s) proteasa (s) identificadas o porción (es) proteoliticamente activa (s). Los competidores incluyen, por ejemplo, suero o plasma. Tal suero humano o plasma humano, o célula o extracto de tejido, un fluido biológico, tal como orina o sangre, una forma tipo nativa purificada o parcialmente purificada (u otra forma modificada) de la trampa de proteasa. Ejemplares de tales competidores son una forma de tipo nativa purificada o parcialmente purificada de un polipéptido que atrapa proteasa, o una o más variantes especificas de un polipéptido que atrapa proteasa. Se proporcionan métodos iterativos para desarrollar o seleccionar o identificar una proteasa o porción de la misma proteoliticamente activa con especificidad/selectividad y/o actividad para al menos dos secuencias desdobladas. Los métodos incluyen las etapas de: a) contactar una colección de proteasas y/o porciones proteoliticamente4 activas de proteasas con un primer polipéptido que atrapa proteasas para formar, después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasa por la proteasa o porción de la misma proteoliticamente activa, complejos estables que contienen el polipéptido que atrapa proteasa con una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa, en la colección, en donde el contacto es efectuado en la presencia de un competidor; b) identificar o seleccionar proteasas o porciones de la misma proteoliticamente activas que forman complejos con el primer polipéptido que atrapa proteasa; c) contactar proteasas o porciones de las mismas proteoliticamente activas, que forman complejos con el primer polipéptido que atrapa proteasas con un segundo polipéptido que atrapa proteasas, en la presencia de un competidor; y d) identificar o seleccionar proteasas o porciones de las mismas proteoliticamente activas, que forman complejos con el primer polipéptido que atrapa proteasas. Las dos secuencias desdobladas pueden estar en un sustrato objetivo, o pueden estar en dos sustratos objetivos diferentes. Las proteasas identificadas, seleccionadas o desarrolladas o porción de la misma proteoliticamente activa, tiene especificidad de sustrato y/o actividad de desdoblamiento por al menos dos secuencias desdobladas diferentes en uno o más sustratos objetivo diferente. El primero y segundo polipéptido que atrapa proteasas, puede ser el mismo o diferente. Típicamente, el primero y segundo polipéptido que atrapa proteasas usados en el método, son diferentes y cada uno son modificados para ser desdoblados por una proteasa que tiene la especificidad de sustrato predeterminada para diferentes sustratos objetivo diferentes. El método puede además, incluir repetir las etapas a) y b) o a)-d) al menos, una vez hasta que una proteasa con una especificidad de sustrato deseada o predeterminada y actividad de desdoblamiento en al menos dos secuencias de reconocimiento, es aislada. La especificidad de sustrato y actividad de desdoblamiento, típicamente son incrementadas comparadas con una proteasa plantilla . Los competidores para uso en los métodos incluyen cualquiera, con los cuales el polipéptido que atrapa proteasa puede interactuar, típicamente con menor estabilidad que con una proteasa objetivo. Los competidores incluyen, pero no se limitan a, suero, plasma, suero humano o plasma humana, una célula o extracto de tejido, un fluido biológico tal como orina o sangre, una forma de tipo nativa purificad o parcialmente purificada de la trampa de proteasa, y una o más variantes específicas de un polipéptido atrapador de proteasa. También se proporcionan métodos para selección de proteasa que incluyen las etapas de: a) contactar una colección de proteasas o porciones de la misma proteolíticamente activa, con un primer polipéptido que atrapa proteasas para formar, después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasas, complejos covalentes del polipéptido que atrapa proteasas, con cualquier proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en la colección; b) atrapar las proteasa formadas en complejo, a partir de polipéptido ( s ) atrapadores de proteasas no formados en complejo; c) aislar o seleccionar o identificar las proteasas formadas en complejos; d) generar una segunda colección de proteasas o porciones proteolíticamente activas de proteasas, basados en las proteasas seleccionadas; y e) repetir las etapas a) - c) , contactando la segunda colección de proteasas o porciones de las mismas proteolíticamente activas, con un segundo polipéptido que atrapa proteasas, que son diferentes del primer polipéptido que atrapa proteasas para formar complejos; atrapar los complejos; y aislar, seleccionar o identificar proteasas formadas en complejos. El primero y segundo polipéptidos que atrapan proteasas, pueden ser modificados para contener dos diferentes secuencias de reconocimiento de sustrato objetivo, con ello, la proteasa seleccionada o identificada, tiene especificidad y alta actividad de desdoblamiento con al menos, dos secuencias de reconocimiento. Estos métodos pueden ser repetidos una pluralidad de veces. En estos métodos, la colección de proteasas o porciones de las mismas proteolíticamente activas, pueden ser contactadas con el primero y/o segundo polipéptido que atrapa proteasas en la presencia de un competidor (véase anteriormente) . En cualquiera .de los métodos de selección de proteasas proporcionados en la presente, las colecciones pueden contener proteasas modificadas. Las modificaciones en las proteasas pueden ser aleatorias o enfocadas en una región objetivo del polipéptido. También se proporcionan combinaciones que contienen una colección de proteasas y/o porciones de la misma proteoliticamente activas; y al menos, un polipéptido que atrapa proteasa. Los componentes pueden ser proporcionados separadamente o como una mezcla. El polipéptido que atrapa proteasa incluye, entre serpinas, miembros de la familia p35, miembros de la familia alfa-macroglobulina , formas modificadas de cada uno, y mezclas de los mismos. La colección de proteasas y/o porciones de la misma catalíticamente activas, pueden ser proporcionadas en solución o suspensión o en una fase sólida o exhibida de otro modo, tal como en un soporte sólido (material de matriz) o en una biblioteca de exhibición, tal como, pero no limitado a, biblioteca de exhibición de fago, en donde los miembros exhiben al menos, una porción proteoliticamente activa de una proteasa.

Se proporcionan kits que contienen las combinaciones. Típicamente, los kits contienen los componentes empaquetados y, opcionalmente, reactivos e instrucciones adicionales para realizar los métodos. También se proporcionan métodos para modificar la especificidad del sustrato de una serina proteasa, tal como u-PA, modificando uno o más de los residuos seleccionados a partir de 30, 73, 89 y 155, basados en la numeración de quimiotripsina . También se proporcionan proteasas modificadas identificadas por los métodos de la presente. Las proteasas modificadas proporcionadas en la presente, exhiben especificidad y/o actividad de sustrato alterado, en virtud de la modificación identificada. Cualquiera de las modificaciones proporcionadas en la presente, identificadas usando el método de selección, se pueden hacer en una proteasa de tipo nativa, cualquier variante alélica o especies de las mismas, o en cualquier otra variante de la proteasa. Además, también se proporcionan en la presente, proteasas modificadas que contienen 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de' secuencia a una proteasa de tipo nativa, o especies variantes o alélicas de los mismos, tan pronto como la modificación identificada en los métodos aquí, esté presente.

Entre muchas proteasas, están proteasas modificadas que incluyen, serinas proteasas modificadas en la familia quimiotripsina, tal como polipéptidos activadores del plasminógeno urinario (u-PA) , o fragmentos de los mismos catalíticamente activos, que contienen una o más mutaciones en posiciones de puntos calientes seleccionadas entre las posiciones 30, 73, 89 y 155, basados en la numeración de quimiotripsina, con ello, se altera la especificidad del sustrato. Proporcionada en la presente, también se incluyen proteasas activadoras del plasminógeno urinario (u-PA) , identificadas en el método aquí, que exhiben especificidad y/o actividad incrementada hacia un sustrato objetivo involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. Tales sustratos objetivos incluyen, pero no se limitan a, VEGFR o un sustrato activador del plasminógeno de tejido (t-PA) . Por lo tanto, también se proporcionan serinas proteasas modificadas o porciones de las mismas catalíticamente activas, que desdoblan un sustrato t-PA. En particular, entre tales proteasas, están polipéptidos activadores del plasminógeno urinario modificados (u-PA) , en los cuales, el polipéptido u-PA o porción de la misma catalíticamente activa, contiene una o más modificaciones en las posiciones seleccionadas de entre las posiciones 21, 24, 30, 39, 61(A), 80, 82, 84, 89, 92, 156, 158, 159 y 187, con base en la numeración de quimiotripsina . También se proporcionan tales polipéptidos u-PA modificados o porciones de los mismos catalíticamente activos que contienen una o más mutaciones seleccionadas de entre F21V, I24L, F30V, F30L, T39A, Y61(A)H, E80G, K82E, E84K, I89V, K92E, K156T, T158A, V159A, y K187E. También proporcionadas, están estos polipéptidos u-PA modificados, en donde el polipéptido u-PA o porciones de los mismos catalíticamente activas, contienen dos o más mutaciones seleccionadas de entre F30V/Y61 (a) H; F30V/K82E; F30V/K156T; F30V/K82E/V159A; F30V/K82E/T39A/V159A; F30V/K82E/T158A/V159A; F30V/Y61 (a) H/K92E; F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187E; y F30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V\K187E. También proporcionadas, están serinas proteasas modificadas o porciones catalíticamente activas de las mismas, que desdoblan VEGFR, particularmente VEGFR-2. En particular, están proporcionados polipéptidos activadores del plasminógeno urinario modificado (u-PA) y porciones de los mismos catalíticamente activos, en donde el polipéptido u-PA o porción del mismo catalíticamente activa, contiene una o más modificaciones en las posiciones seleccionadas de entre las posiciones 38, 72, 73, 75, 132, 133, 137, 138, 155, 160, y 217, con base en la numeración de quimiotripsina, con ello, se altera la especificidad del sustrato a un VEGFR-2, o secuencia del mismo. También se proporcionan tales polipéptidos que contienen una o más mutaciones seleccionadas de entre V38D, R72G, L73A, L73P, S75P, F132L, G133D, E137G, I138T, L155P, L155V, L155M, V160A, y R217C. Estos polipéptidos pueden además, incluir una modificación en la posición 30 y/o posición 89, con base en la numeración de quimiotripsina, tal como modificaciones seleccionadas de entre F30I, F30T, F30L, F30V, F30G, F30M, e I89V. También proporcionados están estos polipéptidos u-PA o porciones de los mismos catalíticamente activas, que contienen una o más mutaciones, y en algunos casos, dos o más mutaciones seleccionadas de entre L73A/I89V; L73P; R217C; L155P; S75P/I89V/I138T; E137G; R72G/L155P; G133D; V160A; V38D; F132L/V160A; L73A/I89V/F30T; L73A/I89V/F30L; L73A/I89V/F30V; L73A/I89V/F30G; L73A/I89V/L155V; L73A/I89V/F30M; L73A/I89V/L155M; L73A/I89V/F30L/L155M; y L73A/I89V/F30G/L155M. También proporcionado está el polipéptido u-PA modificado, en donde el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo, contiene una o más mutaciones seleccionadas de entre F30I, F30T, F30G, y F30M. También proporcionados en la presente, están polipéptidos MT-SP1 modificados, identificados por los métodos de la presente. Tales polipéptidos modificados incluyen, cualquiera que tenga una o más modificaciones de aminoácido seleccionadas de entre D23E, I41F, I41T, L52M, Y60(g)s, T56K, H71R, F93L, N95K, F97Y, F97L, T98P, F99L, A126T, V129D, P131S, I136T, I136V, H143R, T144I, I154V, N164D, T166A, L171F, P173S, F184(a)L, Q192H, S201I, Q209L, Q221(a)L, R230W, F234L, y V244G, con base en la numeración de quimiotripsina, en un polipéptido MT-SPl expuesto en la SEC ID NO: 53. En algunos ejemplos, las modificaciones están en una porción catalíticamente activa de un MP-SP1 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 505. En otros ejemplos, las modificaciones están en un polipéptido MT-SPl, que además comprende una modificación que corresponde a la modificación de C122S en un polipéptido MT-SPl expuesto en la SEC ID NO: 253, con base en la numeración de quimiotripsina, por ejemplo, un MT-SPl expuesto en la SEC ID NO: 507 o 517. En particular, de modificaciones proporcionadas en la presente, son cualquiera seleccionada de entre 14IF, F97Y, L171F y V244G. Los polipéptidos MT-SPl modificados proporcionados en la presente, pueden además, incluir una o más modificaciones que corresponden a Q175R o D217V en un polipéptido MT-SPl, expuesto en la SEC ID NO: 253. Tales modificaciones incluyen cualquiera seleccionado de entre I136T/N164D/T166A/F184 (A)L/D217V; I41F; I41F/A126T/V.244G; D23E/I41F/T98P/T144I; I41F/L171F/V244G; H143R/Q175R; I41F/L171F; R230W; I41F/I154V/V244G; I141F/L52M/V129D/Q221 (A)L; F99L; F97Y/I136V/Q192H/S201I ; H71R/P131S/D217V; D217V; T65K/F93L/F97Y/D217V; I41T/P173S/Q209L; F97L/ F234L; Q175R; N95K; y Y60(G)S. Cualquiera de los polipéptidos MT-SP1 modificados, exhibe modificaciones que incrementan uno o ambos de una especificidad para una proteina complemento C2 o actividad hacia la proteina complemento C2. También se proporcionan, composiciones farmacéuticas que contienen las proteasas modificadas, que incluyen serinas proteasas, tales como los polipéptidos u-PA modificados o polipéptidos T-SP1 modificados. Las composiciones farmacéuticas contienen excipientes farmacéuticamente aceptables, y pueden ser formulados por cualquier ruta adecuada de administración, que incluye pero no se limita a, administración sistémica, oral, nasal, pulmonar, local y tópica. También se proporcionan kits que contienen cualquiera de las composiciones farmacéuticas, un dispositivo para administración de la composición y, opcionalmente, instrucciones para administración. Se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las proteasas modificadas, que incluyen las proteasas u-PA y proteasas MT-SP1, y porciones de las mismas catalíticamente activas. También se proporcionan vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico y células que contienen las moléculas o vectores de ácido nucleico . Los métodos de tratamiento de sujetos que tienen una enfermedad o condición, tal como, pero no limitado a, una enfermedad o condición seleccionada de entre trombosis arterial, trombosis venosa y trombo embolismo, apoplejía isquémica, trastornos de coagulación adquiridos, coagulación extravascular diseminada, infección bacteriana y periodontitis , y condiciones neurológicas, que son tratadas por administración de t-PA, administrando las composiciones farmacéuticas que contienen las proteasas u-PA modificadas o porciones de las mismas proteolíticamente activas, o que codifican moléculas de ácido nucleico o las células, se proporcionan. Los métodos son efectuados administrando una molécula de ácido nucleico, una célula o una composición farmacéutica al sujeto. También se proporcionan métodos para tratar un sujeto que tiene una enfermedad o condición que es mediada por un VEGFR, particularmente un VEGFR-2. Tales enfermedades o condiciones incluyen, pero no se limitan a, cáncer, enfermedades angiogénicas, enfermedades oftálmicas, tales como degeneración macular, enfermedades inflamatorias y diabetes, particularmente complicaciones a partir de estas, tales como retinopatías diabéticas. Los métodos son efectuados administrando una molécula de ácido nucleico o célula o composición que contiene o codifica las proteasas u-PA modificadas que exhiben especificidad de sustrato, particularmente incrementada comparada con la forma no modificada, para VEGFR-2. Los métodos, opcionalmente incluyen administrar otro agente para el tratamiento de la enfermedad o condición, tal como administrar un agente anti-tumoral , en donde la enfermedad es cáncer. También se proporcionan métodos para tratar un sujeto que tiene una enfermedad o condición que es mediada por una proteina complemento, particularmente C2. Tales enfermedades y condiciones incluyen, pero no se limitan a, sepsias, Artritis reumatoide (RA) , glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN) , Esclerosis Múltiple ( S) , Miastenia- gravis (MG) , asma, enfermedad del intestino inflamatorio, lesión de tejido inflamatorio agudo mediada por el complejo inmune (IC), enfermedad de Alzheimer (AD) ; lesión por reperfusión-isquemia, y síndrome Guillan-Barre . En algunos ejemplos, la lesión por reperfusión-isquemia, es causada por un evento o tratamiento, tal como, pero no limitado a, infarto miocardial (MI), apoplejía, angioplastia, injerto por derivación de arteria coronaria, derivación cardiopulmonar (CPB) y hemodiálisis . Los métodos son efectuados administrando una molécula de ácido nucleico o célula o composición, que contiene o codifica las proteasas MT-SP1 modificadas, que exhiben especificidad de sustrato, particularmente incrementada comparada con la forma no modificada por C2. En otros ejemplos, las enfermedades o condiciones resultan del tratamiento de un sujeto. Por ejemplo, el tratamiento puede resultar en lesión por reperfusión-isquemia mediada-complemento. Tales tratamientos incluyen, pero no se limitan a, angioplastia o injerto de derivación de arteria coronaria. En tales ejemplos, una proteasa MT-SP1 modificada es administrada antes del tratamiento de un sujeto. Los polipéptidos MT-SP1 modificados, pueden ser administrados contactando un fluido corporal o muestra de tejido in vitro, ex vivo o in vivo. También proporcionadas aquí, están polipéptidos serpina modificados usados en los métodos proporcionados en la presente. Tales polipéptidos serpina modificados son modificados en su bucle de sitio reactivo en posiciones que corresponden a las posiciones P4-P2, con una secuencia desdoblada por un sustrato objetivo. Típicamente, el sustrato objetivo está involucrado en la etiología de una enfermedad, o trastorno. Tales sustratos objetivos incluyen, pero no se limitan a, un VEGFR, una proteína complemento o sustratos t-PA. Por ejemplo, sustratos objetivo incluyen VEGFR2 y proteína complemento C2. Ejemplares de serpinas modificadas proporcionadas en la presente, están inhibidor-1 activador del plasminógeno modificado (PAI-1) , y antitrombina-3 (AT3) . Serpinas modificadas ejemplares, son expuestas en cualquiera de las SEC ID NOS: 497, 499, 610 y 611.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa el mecanismo de inhibición de una proteasa por una serpina y la generación de un complejo inhibido estable. Después del contacto, una serpina (I) y proteasa (E) , inicialmente forman un complejo similar a ichaelis no covalente (El). Esto es seguido por el desdoblamiento del enlace escindible Pl-Pl' y ataque nucleofilico por la serina catalítica de una proteasa un carbonilo de bucle de sitio reactivo (RSL) de una serpina y la formación de un intermediario de enzima acilo covalente (EI#) . El producto inhibidor covalente cinéticamente atrapado (EI+) , es el resultado de la inserción de RSL, translocación de proteasa, distorsión de sitio activo de proteasa, y deformación de la estructura proteasa total. La trayectoria no inhibidora menor libera producto desdoblado normal, serpina (I*) , y la proteasa reactiva (E) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Reseña A. Definiciones B. Método para Seleccionar Proteasas C. Polipéptidos que atrapan proteasas 1. Serpinas: Estructura, Función y Expresión 2. Catálisis de Proteasa, Mecanismo Inhibidor de Serpinas, y Formación de Intermediario de Enzima Acilo a. Serpinas ejemplares i. PAI-1 ii. Antitrombina (AT3) 3. Otros polipéptidos que atrapan proteasas a . p35 b. Alfa-macroglobulinas (aM) 4. Competidores de Polipéptidos que atrapan proteasas 5. Polipéptidos que atrapan proteasas Variantes Proteasas 1. Proteasas candidatas a. Clases de Proteasas i. Serina proteasa (a) Activador del plasminógeno de tipo urocinasa (u-PA) (b) Activador de plasminógeno de tejido (t-PA) (c) MT-SP1 ii. Cisteina proteasas Proteasas modificadas y colecciones para selección 1. Generación de proteasas variantes a . Mutagénesis aleatoria b . Mutagénesis enfocada 2. Formas quiméricas de proteasas variantes 3. Bibliotecas combinatoriales y otras bibliotecas a . Bibliotecas de exhibición de fago b . Bibliotecas de exhibición de superficie celular c. Otras bibliotecas de exhibición Métodos para contactar, aislar e identificar proteasas seleccionadas 1. Selección iterativa 2. Proteasas seleccionadas ejemplares Métodos para valorar la actividad y especificidad de proteasas Métodos para producir ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que atrapan proteasas (es decir, serpinas) o variantes de los mismos o proteasas/proteasas modificadas 1. Vectores y células 2. Expresión a. Células procarióticas b. Células de levadura c. Células de insecto d. Células de mamífero e . plantas 3. técnicas de purificación 4. Proteínas de fusión 5. Secuencias de nucleótido Preparación, formulación y administración de polipéptidos de proteasa seleccionada 1. Composiciones y suministro 2. Expresión in vivo de proteasas seleccionadas y terapia de gen a. Suministro de ácidos nucleicos i. Vectores - episomal e integración ii. Cromosomas artificiales y otros métodos de suministro de vectores no virales iii. Liposomas y otras formas encapsuladas y administración de células que contienen ácidos nucleicos b. Suministro in vitro y ex vivo c. Suministro sistémico, local y tópico 2. Terapias de combinación 3. Artículos de Manufactura y kits Métodos Ejemplares de tratamiento con polipéptidos de proteasa seleccionada Métodos ejemplares de tratamiento para polipéptidos uPA seleccionados que desdoblan objetivos tPA a . Enfermedades y condiciones trombóticas i. Trombosis arterial ii. Trombosis venosa y tromboembolismo (a) Apoplejía isquémica iii. Trastornos de coagulación adquiridos (a) Coagulación intravascular diseminada (DIC) (b) Infección bacteriana y periodontitis b. Otras condiciones asociadas con el objetivo tPA c. Métodos de diagnóstico Métodos ejemplares de tratamiento para polipéptidos de proteasa seleccionados que desdoblan objetivos VEGF o VEGFR a . Angiogénesis , cáncer y otras enfermedades o condiciones dependientes del ciclo celular b. Terapias de combinación con proteasas seleccionadas que desdoblan VEGF o VEGFR 3. Métodos ejemplares de tratamiento para polipéptidos MT-SP1 seleccionados que desdoblan objetivos de proteina complemento a . Enfermedades inflamatorias mediadas inmunes b. Enfermedades neurodegenerativas c . Enfermedades cardiovasculares K. Ejemplos A. DEFINICIONES A menos que se defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente, tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece (n) la(s) invención (es ) . Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias en Genbank, bases de datos, sitios de red y otros materiales publicados referidos a través de la descripción completa en la presente, a menos que se note de otro modo, están incorporadas por referencia en su totalidad. En el caso de que exista una pluralidad de definiciones para términos aquí, aquellos en esta sección, prevalecerán. Cuando se hace referencia a un URL u otro de tal identificador o dirección, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y la información particular en la internet puede venir e ir, pero la información equivalente se puede encontrar por la búsqueda de internet. La referencia a esta, evidencia la disponibilidad y diseminación pública de tal información. Como se usa en la presente, una "trampa de proteasa" o "polipéptido que atrapa proteasa", se refiere a un sustrato que es desdoblado por una proteasa y que, después del desdoblamiento, forma un complejo estable con la proteasa para con ello, atrapar las proteasas ya que las proteasas van a través de un estado de transición actual para formar un complejo de enzima, con ello, inhibiendo la actividad de las proteasas y capturándolas. De este modo, las proteasas atrapadas son inhibidores de proteasas. Las proteasas atrapadas son polipéptidos o moléculas que incluyen residuos de aminoácido que son desdoblados por una proteasa, de manera tal que después del desdoblamiento, se forma un complejo estable. El complejo es suficientemente estable para permitir la separación de complejos de atrapamiento sin reaccionar o de trampas que tienen interacciones menos estables con las proteasas. Las proteasas atrapadas incluyen cualquier molécula, sintética, modificada o que se origina naturalmente, que es desdoblada por la proteasa y, después del desdoblamiento, forma un complejo con la proteasa, para permitir la separación de la proteasa que reacciona o complejo a partir de una separación sin reaccionar. Ejemplar de tales proteasas atrapadas son serpinas, serpinas modificadas, moléculas que exhiben un mecanismo similar a serpinas, tales como por ejemplo, p35, y cualquier otra molécula que es desdoblada por una proteasa y atrapa la proteasa como un complejo estable, tal como por ejemplo, alfa 2-macroglobulina . También incluida como proteasas atrapadas, están polipéptidos sintéticos que son desdoblados por una proteasa (o porción proteoliticamente activa de los mismos) y, después del desdoblamiento, forman un complejo estable con la proteasa o porción de la misma proteoliticamente activa . Como se usa en la presente, serpinas se refiere a un grupo de proteínas estructuralmente relacionadas que inhiben las proteasas después del desdoblamiento de su sitio reactivo por una proteasa que resulta en la formación de un intermediario de enzima acilo estable y la separación de la proteasa en un complejo covalente estable. Las serpinas incluyen variantes de especies y alélicas y otras variantes, tan pronto como la molécula serpina inhiba una proteasa formando un complejo covalente estable. Las serpinas también incluyen fragmentos contiguos o truncados de aminoácidos de un polipéptido serpina de longitud completa, que mínimamente incluye al menos, una porción suficiente del bucle de sitio reactivo (RSL) , para facilitar la inhibición de proteasa y la formación de un complejo covalente estable con la proteasa. Las serpinas ejemplares son expuestas en la Tabla 2 y/o tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 1-38, variantes alélicas o porciones truncadas de las mismas. Como se usa en la presente, una serpina "mutante" o "variante", se refiere a una serpina que contiene modificaciones de aminoácido, particularmente, modificaciones en el bucle de sitio reactivo de la serpina. Las modificaciones pueden ser reemplazo, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos que corresponden a las posiciones Pn-Pi5-Pi4-Pi3 P4-P3-P2-Pi-Pi ' -P2 ' -P3 ' · · · Pn ' - . Típicamente, la serpina contiene reemplazos de aminoácidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácido en el bucle de sitio reactivo, comparado con una serpina de tipo nativa. Más usualmente, los reemplazos son en uno o más aminoácidos que corresponden a las posiciones P4-P2' . Por ejemplo, para la serpina PAI-1 ejemplar expuesta en la SEC ID NO: 11, las posiciones P4-P1 (VSARM) , que corresponden a las posiciones de aminoácido 366-370 en la SEC ID NO: 11, pueden ser modificadas. El Ejemplo 1, describe modificación de los residuos de aminoácido VSARM a RRVRM o PFGRS.

Como se usa en la presente, un "enlace desdoblable", se refiere al enlace en un polipéptido desdoblado por una proteasa y se denota por el enlace formado entre la posición Pl-Pl' en la secuencia desdoblada de un sustrato. Como se usa en la presente, sitio reactivo se refiere a la porción de la secuencia de un sustrato objetivo que es desdoblado por una proteasa. Típicamente, un sitio reactivo incluye la secuencia de enlace desdoblable Pl-Pl' . Como se usa en la presente, bucle de sitio reactivo (RSL; también llamado bucle de centro reactivo, RCL) , se refiere a una secuencia de aminoácidos en una molécula serpina (típicamente 17 a 22 aminoácidos contiguos), que sirven como el sitio de reconocimiento de proteasa y en general, contiene la única o principal determinante de especificidad de proteasa. El desdoblamiento de la secuencia RSL y cambios conformacionales de los mismos, son responsables de la separación de la proteasa por la molécula serpina en un complejo covalente estable. Para propósitos en la presente, cualquiera o más aminoácidos en el bucle RSL de una serpina, puede ser modificada para corresponder a secuencias de desdoblamiento en una proteína objetivo deseada. Tales serpinas modificadas, o porciones de las mismas que contienen la secuencia variante RLS, pueden ser usadas para seleccionar proteasas con especificidad de sustrato alterad. Como se usa en la presente, división se refiere al proceso por el cual las serpinas se dividen entre un complejo de proteasa-serpina estable contra las serpinas desdobladas. La razón de la división en serpinas, pertenece a la naturaleza de la trayectoria inhibidora, lo cual resulta de una gran translocación del bucle de sitio reactivo desdoblado a través de la superficie de serpina. Si la proteasa tiene tiempo para disociarse (es decir, desacilar el complejo de enzima-serpina) , antes de adoptar la ubicación inhibida, entonces ocurre la división. El resultado de una interacción de serpina-proteasa dada, por lo tanto, depende de la relación de división entre las trayectorias inhibidoras {k4) y sustrato (k5) (tal como se representa en la Figura 1), la cual está representada por la estequiometria de inhibición (SI = l/k5/k4) ; buenos inhibidores tienen el valor de 1 debido a que la mayoría de las moléculas de serpina se dividen en la formación del complejo y k5/k4 es cercano a 0. Si el bucle RSL, sin embargo, no es insertado lo suficientemente rápido en la proteasa, ocurre la división y la reacción procede directamente al producto desdoblado. Como se usa en la presente, la eficiencia catalítica o kcat/km, es una medida de la eficiencia con la cual una proteasa desdobla un sustrato y es medida bajo condiciones de estado listo como es bien conocido por aquellos en la técnica. Como se usa en la presente, la constante de relación de segundo orden de inhibición, se refiere a la constante de relación para la interacción de una proteasa con un inhibidor. En general, la interacción de una proteasa con un inhibidor, tal como una trampa de proteasa, tal como una serpina, es una reacción de segundo orden, proporcional al producto de la concentración de cada reactivo, el inhibidor y la proteasa. La constante de relación de segundo orden para inhibición de una proteasa por un enlace hermético o inhibidor irreversible o una trampa de proteasa, es una constante, la cual cuando se multiplica por la concentración de enzima y la concentración inhibidora, proporciona la relación de inactivación enzimática por un inhibidor particular. La contante de relación para cada trampa de proteasa y par enzimático diferentemente refleja su interacción. Como una reacción de segundo orden, un incremento en la constante de relación de segundo orden, significa que la interacción entre una proteasa seleccionada modificada e inhibidor, es más rápida comparada con la interacción de una proteasa no modificada y el inhibidor. De este modo, un cambio en la constante de relación de segundo orden, refleja un cambio en la interacción entre los componentes, la proteasa y/o inhibidor de la reacción. Una constante de relación de segundo orden incrementada, cuando es seleccionada para proteasas, puede reflejar una modificación seleccionada deseada en la proteasa. Como se usa en la presente, intermediario de enzima acilo se refiere al intermediario covalente formado durante la primera etapa en el catalizador, entre un sustrato y una serina esencial en el centro catalítico de una serina proteasa (típicamente Serl95, con base en la numeración de quimiotripsina) . La reacción procede, como sigue: la serina-OH ataque el carbono carbonilo en la posición Pl del sustrato, el nitrógeno de la histidina acepta el hidrógeno del -OH de la serina, y un par de electrones del doble enlace del oxígeno carbonilo mueve al oxígeno. Esto resulta en la generación de un intermediario tetraédrico negativamente cargado. El enlace que une el nitrógeno y el carbón en el enlace peptídico del sustrato ahora se rompe. Los electrones covalentes que crean este enlace mueven el ataque del hidrógeno de la histidina, con ello, rompiendo la conexión. Los electrones que previamente se mueven del doble enlace de oxígeno de carbonilo, se mueven nuevamente del oxígeno negativo para recrear el enlace que resulta en la formación de un intermediario de enzima acilo covalente. El intermediario de enzima acilo es hidrolizado por agua, resultando en la desacilación y la formación de un sustrato desdoblado y libre de enzima. Como se usa en la presente, una colección de proteasas se refiere a una colección que contiene al menos, 10 diferentes proteasas y/o porciones de las mismas proteoliticamente activas, y en general que contienen al menos 50, 100, 500, 1000, 104, 105 o más elementos. Las colecciones típicamente contienen proteasas (o porciones de la misma proteoliticamente activas), son seleccionadas para especificidad de sustrato. Incluidas en las colecciones están proteasas que se originan naturalmente (o porciones de las mismas proteoliticamente activas) y/o proteasas modificadas (o porciones de las mismas proteoliticamente activas) . Las modificaciones incluyen, mutaciones aleatorias a lo largo de la longitud de las proteasas y/o modificaciones en las regiones objetivo o seleccionadas (es decir, mutaciones enfocadas) . Las modificaciones pueden ser combinatoriales y pueden incluir todas las permutaciones, por sustitución de todos los aminoácidos en un lugar particular o en todo el sitio o subseries de los mismos. Las colecciones pueden incluir proteasas de longitud completa o más cortas, que incluyen solamente el dominio proteasa. Las proteasas pueden incluir cualquier proteasa, tales como serinas proteasas y cisteínas proteasas. El tamaño de la colección y colección particular, es determinado por el usuario. En otras modalidades, la colección puede contener tan poco como 2 proteasas. Como se usa en la presente, "colecciones combinatoriales" o "bibliotecas combinatoriales", se refieren a una colección de polipéptidos de proteasa que tienen distintas y diversas mutaciones de aminoácidos en su secuencia, con respecto a la secuencia de una secuencia de polipéptido de proteasa de plantilla iniciadora. Las mutaciones representadas en la colección pueden ser a través de la secuencia del polipéptido, o pueden ser en una región o regiones especificadas de la secuencia de polipéptido. Las mutaciones se pueden hacer aleatoriamente o pueden ser mutaciones dirigidas diseñadas empíricamente o racionalmente, con base en la información estructural o funcional . Como se usa en la presente, una "proteasa plantilla", se refiere a una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos que se usa para la mutagénesis de la misma. Una proteasa plantilla puede ser la secuencia de una proteasa de tipo nativa, o una porción de la misma catalíticamente activa, o puede ser la secuencia de una proteasa variante, o una porción de la misma catalíticamente activa, por la cual se hacen mutaciones adicionales. Por ejemplo, una proteasa mutante identificada en los métodos de selección de la presente, puede ser usada como una plantilla iniciadora para mutagénesis adicional para ser usada en rondas subsecuentes de selección. Como se usa en la presente, mutación aleatoria se refiere a la introducción de uno o más cambios de aminoácido a través de la secuencia de un polipéptido, sin considerar o desviarse en cuanto a la mutación. La mutagénesis aleatoria puede ser facilitada por una variedad de técnicas conocidas por uno de habilidad en la técnica que incluyen, por ejemplo, irradiación UV, métodos químicos, y métodos de PCR (por ejemplo, PCR propenso a erro) . Como se usa en la presente, una mutación enfocada se refiere a uno o más cambios de aminoácido en una región especificada (o regiones) , o una posición especificad (o posiciones) de un polipéptido. Por ejemplo, se puede hacer una mutación dirigida de los aminoácidos en el paquete de enlace de especificidad de una proteasa. Puede ser realizada mutagénesis enfocada, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis dirigida a sitios múltiples usando técnicas recombinantes estándares conocidas en el arte. Como se usa en la presente, un complejo estable entre una trampa de proteasa y una proteasa o una porción de la misma proteolíticamente activa, se refiere a un complejo que es suficientemente estable para ser separado de las proteasas que no forman complejos con la trampa de proteasa (es decir, proteasas no formadas en complejos) . Tales complejos pueden ser formados via cualquier interacción estable, que incluyen interacciones covalentes, iónicas e hidrofóbicas , pero son suficientemente estables bajo las condiciones de reacción para permaneces formadas en complejo por tiempo suficiente para atrapar complejos para asilamiento. Típicamente, tales interacciones, tal como entre serpinas y proteasas desdobladas, son enlaces covalentes . Como se usa en la presente, un "punto caliente", se refiere a una posición que es mutada en variantes múltiples, que resultan de la selección de proteasas que exhiben actividad mejorada y/o selectividad para la nueva secuencia de sustrato deseada. Uno o más "puntos calientes", pueden ser identificados durante la selección de proteasa. Por lo tanto, tales posiciones son determinantes de especificidad y/o selectividad para la proteasa, y con ello, contribuyen a la especificidad de sustrato, y también pueden ocurrir como determinantes de especificidad y/o selectividad amplias a través del lugar correspondiente en más de un miembro de la familia proteasa, tal como una familia de serina proteasa o una familia de proteasa particular, tal como basada en numeración de quimiotripsina . Como se usa en la presente, especificidad deseada con referencia a especificidad de sustrato, se refiere a especificidad de desdoblamiento por un sustrato predeterminado o pre-seleccionado o de otro modo dirigido. Como se usa en la presente, "seleccionar" o variaciones gramaticales de las mismas, se refieren a escoger o elegir una proteasa que está en complejo con un polipéptido de trampa de proteasa. Por lo tanto, para propósitos de la presente, seleccionar se refiere a sacar o elegir una proteasa que está en complejo con un polipéptido de trampa de proteasa. En general, la selección puede ser facilitada por captura de los complejos covalentes, y si se desea, la proteasa puede ser aislada. Por ejemplo, la selección puede ser facilitada por el etiquetado del polipéptido que atrapa proteasas, por ejemplo, con un marcador predeterminado, etiqueta u otra porción detectable, para con ello, identificar la proteasa basado en su asociación en el complejo estable. Como se usa en la presente, "identificar" y variaciones gramaticales de la misma, se refiere al reconocimiento de o conocimiento de una proteasa en un complejo estable. Típicamente, en los métodos de la presente, la proteasa es identificada por su asociación en un complejo estable, con un polipéptido que atrapa proteasa, el cual puede ser realizado, por ejemplo, por amplificación (es decir, crecimiento en una célula hospedera apropiada) de las proteasas unidas en el complejo, seguido por secuenciamiento de ADN. Como se usa en la presente, etiquetado para detección o separación, significa que la molécula, tal como un polipéptido que atrapa proteasa, está asociada con una etiqueta detectable, tal como un fluoróforo, o está asociada con una etiqueta u otra porción, tal como por purificación o aislamiento o separación. Etiquetado detectablemente, se refiere a una molécula, tal como un polipéptido que atrapa proteasa, que es etiquetado para detección o separación. Como se usa en la presente, referencia a amplificación de una proteasa o porción proteoliticamente activa de una proteasa, significa que la cantidad de la proteasa o porción proteoliticamente activa se incrementa, tal como a través de aislamiento y clonación y expresión, o, en donde la proteasa o porción proteoliticamente activa, es exhibida en un microorganismo, el microorganismo es introducido en un hospedero apropiado y crece o cultiva de manera que se produce más proteasa exhibida o porción proteoliticamente activa. Como se usa en la presente, homogéneo con referencia a una mezcla de reacción, significa que los reactivos están en la fase liquida como una mezcla, que incluye una solución o suspensión. Como se usa en la presente, la recitación que una colección de proteasas o porciones proteoliticamente activas de proteasas, "basad en" una proteasa particular, significa que la colección se deriva de la proteasa particular, tal como por mutagénesis aleatoria o dirigida o diseño racional u otro esquema o protocolo de modificación, para producir una colección. Como se usa en la presente, una enfermedad o condición que es tratada por administración de t-PA, se refiere a una enfermedad o condición por la cual un experto en la técnica podría administrar t-PA. Tales condiciones incluyen, pero no se limitan a, condiciones fibrinolíticas , tales como trombosis arterial, trombosis venosa y tromboembolismo, apoplejía isquémica, trastornos de coagulación adquiridos, coagulación intravascular diseminada y precursores de estos, tales como infecciones bacterianas o virales, periodontitis , y condiciones neurológicas . Como se usa en la presente, una enfermedad o condición que es mediada por VEGFR-2 está involucrada en la patología o etiología. Tales condiciones incluyen, pero no se limitan a, condiciones inflamatorias y angiogénicas, tales como cánceres, retinopatías diabéticas y trastornos oftálmicos, que incluyen degeneración macular. Como se usa en la presente, "proteasas", "proteinasas" y "peptidasas" , son intercambiablemente usadas para referirse a enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptidicos covalentes. Estas designaciones incluyen, formas de zimógeno y formas de cadena única, doble y múltiple, activadas de la misma. Por claridad, la referencia a proteasa se refiere a todas las formas. Las proteasas incluyen, por ejemplo, serina proteasas, cisteina proteasas, proteasas aspárticas, treonina o metalo-proteasas que dependen de la actividad catalítica de su sitio activo y mecanismo de desdoblamiento de enlaces peptidicos de un sustrato objetivo. Como se usa en la presente, un zimógeno se refiere a una proteasa que es activada por desdoblamiento proteolítico, que incluyen desdoblamiento de mutación, tal como desdoblamiento de activación y/o formación de complejo con otra(s) proteína (s) y/o co-factor (es ) . Un zimógeno es un precursor inactivo de una enzima proteolítica . Tales precursores son en general, más grandes, aunque no necesariamente más grandes que la forma activa. Con referencia a serina proteasa, los zimógenos son convertidos a enzimas activas por desdoblamiento específico, que incluye desdoblamiento catalítico y autocatalítico, o por enlace de un co-factor de activación, los cuales generan una enzima activa. Un zimógeno de este modo, es una proteina enzimáticamente activa que es convertida a una enzima proteolitica por la acción de un activador. El desdoblamiento puede ser efectuado autocataliticamente . Los zimógenos en general, son inactivos y pueden ser convertidos a polipéptidos activos maduros por desdoblamiento catalítico o autocatalítico de la pro-región del zimógeno. Como se usa en la presente, "proregión", "propéptido" o "prosecuencia", se refieren a una región o un segmento que es desdoblado para producir una proteína madura. Esto puede incluir segmentos que funcionan para suprimir la actividad enzimática, por enmascaramiento de la maquinaria catalítica y de este modo, previniendo la formación del intermediario catalítico (es decir, ocluyendo estéricamente el sitio de enlace al sustrato) . Una proregión es una secuencia de aminoácidos posicionados en el término amino de un polipéptido biológicamente activo maduro, y pueden ser tan pocos como algunos aminoácidos o pueden ser una estructura de dominios múltiples. Como se usa en la presente, una secuencia de activación se refiere a una secuencia de aminoácidos en un zimógeno que son el sitio requerido para desdoblamiento de activación o desdoblamiento de maduración para formar una proteasa activa. El desdoblamiento de una secuencia de activación puede ser catalizado autocataliticamente o por patrones de activación. El desdoblamiento de activación es un tipo de desdoblamiento de maduración en el cual, ocurre un cambio conformacional requerido para actividad. Esta es una trayectoria de activación clásica, por ejemplo, para proteasas serina en las cuales, un desdoblamiento genera un nuevo N-término, el cual interactúa con las regiones conservadas de la maquinaria catalítica, tal como residuos catalíticos, para inducir cambios conformacionales requeridos para actividad. La activación puede resultar en la producción de formas de canal múltiple de las proteasas. En algunos casos, formas de cadena única de la proteasa, pueden exhibir actividad proteolítica como una cadena única. Como se usa en la presente, dominio se refiere a una porción de una molécula, tal como proteínas o los ácidos nucleicos codificantes, que son estructuralmente y/o funcionalmente distintos de otras porciones de la molécula y son identificables . Como se usa en la presente, un dominio proteasa es la porción catalíticamente activa de una proteasa. La referencia a un dominio proteasa de una proteasa, incluye las formas de cadenas únicas, dobles y múltiples, de cualquiera de estas proteínas. Un dominio proteasa de una proteína, contiene todas las propiedades requisito de tal proteína requerida por su actividad proteolítica, tal como por ejemplo, su centro catalítico. Como se usa en la presente, una porción catalíticamente activa o proteolíticamente activa de una proteasa, se refiere al dominio proteasa, o cualquier fragmento o porción de la misma, que retiene la actividad de la proteasa. De manera significante, al menos in vitro, las formas de cadena única de las proteasas y dominios catalíticos o porciones de las mismas proteolíticamente activas (típicamente truncaciones C-terminales ) , exhiben actividad de proteasa. Como se usa en la presente, un "ácido nucleico que codifica un dominio proteasa o porción catalíticamente · activa de una proteasa", se refiere a un ácido nucleico que codifica solamente el dominio de proteasa de cadena única mencionada o porción activa de la misma, y no las otras porciones contiguas de la proteasa como una secuencia continua . Como se usa en la presente, la recitación de que un polipéptido consiste esencialmente del dominio proteasa, significa que la única porción del polipéptido es un dominio proteasa o una porción de la misma catalíticamente activa. El polipéptido puede opcionalmente, y en general, incluir secuencias derivadas no proteasas adicionales de aminoácidos . Como se usa en la presente "S1-S4", se refiere a residuos de aminoácido que forman los sitios de enlace para residuos P1-P4 de un sustrato (véase por ejemplo, Schecter and Berger (1967) Biochem Biophys Res Commun 27:157-162). Cada uno de S1-S4, contiene uno, dos o más residuos, los cuales pueden ser no contiguos. Estos sitios son numerados secuencialmente a partir del sitio de reconocimiento N-terminal al sitio de proteólisis, referido como el sitio desdoblable. Como se usa en la presente, los términos "P1-P4" y "P1-P4", se refieren a los residuos en un sustrato peptidico que específicamente interactúa con los residuos S1-S4 y residuos S1-S4, respectivamente, y son desdoblados por la proteasa. P1-P4, se refiere a las posiciones del residuo en el lado N-terminal del sitio de desdoblamiento; P1-P4', se refiere a las posiciones de residuo al lado C-terminal del sitio de desdoblamiento. Los residuos de aminoácidos son etiquetados a partir del N a C-término de un sustrato de polipéptido (Pi, P3, P2, Pl, ??', P2 ' , P3' , .·., Pj ) . Los sub-sitios de enlace respectivo son etiquetados (Si,..., S3, S2, SI, SI', S2 ' , S3',..., Sj ) . El desdoblamiento es catalizado entre Pl y Pl' . Como se usa en la presente, un "paquete de enlace, se refiere al residuo o residuos que interactúan con un aminoácido o aminoácidos específicos en un sustrato. Un "paquete específico", es un paquete de enlace que contribuye más energía que los otros (el paquete de enlace más importante o dominante) . Típicamente, la etapa de enlace precede la formación del estado de transición que es necesario para que el proceso catalítico ocurra. Aminoácidos S1-S4 y Sl'-S4, conforman el paquete de enlace de secuencia de sustrato y facilitan el reconocimiento del sustrato por interacción con aminoácidos P1-P4 y Pl'-P4', de un péptido, polipéptido o sustrato de proteína, respectivamente. Si una proteasa interactúa con un sustrato, es una función de los aminoácidos en las posiciones S1-S4 y Sl'-S4'. Si los aminoácidos en cualquiera o más de los subsitios SI, S2, S3, S4, SI', S2' , S3' y S4, interactúan con o reconocen cualquiera o más de los aminoácidos en Pl, P2, P3, P4, Pl' , ?2', P3' y P4' en un sustrato, después, la proteasa puede desdoblar el sustrato. Un paquete de enlace posiciona un aminoácido objetivo con una proteasa, de manera que se logra la catálisis de un enlace peptídico y desdoblamiento de un sustrato. Por ejemplo, las serinas proteasas típicamente reconocen sitios P4-P2' en un sustrato; otras proteasas pueden tener reconocimiento extendido más allá de P4-P2' . Como se usa en la presente, aminoácidos que "contribuyen a la especificidad de sustrato extendida", se refiere a aquellos residuos en la fisura del sitio activo además del paquete de especificidad. Estos aminoácidos incluyen los residuos S1-S4, Sl'-S4' en una proteasa. Como se usa en la presente, los sitios secundarios de interacción, están fuera de la fisura del sitio activo. Estos pueden contribuir a reconocimiento y catálisis de sustrato. Estos aminoácidos incluyen aminoácidos que pueden contribuir a segundas y terceras interacciones con un sustrato. Por ejemplo, los bucles en la estructura de una proteasa que circunda el S1-S . Los aminoácidos Sl'-S4', juegan un papel en el posicionamiento de P1-P4, los aminoácidos Pl'-P4' en el sustrato, con ello registran el enlace desdoblable en el sitio activo de una proteasa . Como se usa en la presente, sitio activo de una proteasa, se refiere al sitio de enlace de sustrato en donde ocurre la catálisis del sustrato. La estructura y propiedades químicas del sitio activo, permiten el reconocimiento y enlace del sustrato y subsecuente hidrólisis y el desdoblamiento del enlace escindible en el sustrato. El sitio activo de una proteasa, contiene aminoácidos que contribuyen al mecanismo catalítico de desdoblamiento peptídico, así como también a aminoácidos que contribuyen al reconocimiento de secuencia de sustrato, tal como aminoácidos que contribuyen a la especificidad de enlace de sustrato extendida. Como se usa en la presente, "una triada catalítica" o "residuos de sitio activo" de una serina o cisteína proteasa, se refiere a una combinación de aminoácidos, típicamente tres aminoácidos, que están en el sitio activo de una serina o cisteína proteasa, y contribuyen al mecanismo catalítico del desdoblamiento peptídico. En general, una triada catalítica se encuentra en serinas proteasas y proporciona un nucleófilo activo y catálisis de ácido/base. La triada catalítica de serinas proteasas contiene tres aminoácidos, los cuales en la quimiotripsina, son Asp102, His57, y Ser195. Estos residuos son críticos para la eficiencia catalítica de una serina proteasa . Como se usa en la presente, el "sitio de reconocimiento de sustrato" o "secuencia desdoblable" , se refiere a la secuencia reconocida por el sitio activo de una proteasa que es desdoblada por una proteasa. Típicamente, por ejemplo, por una serina proteasa, una secuencia desdoblada se hace de los aminoácidos P1-P4 y Pl'-P4' en un sustrato, en donde ocurre el desdoblamiento después de la posición Pl. Típicamente, una secuencia desdoblada para una serina proteasa es de seis residuos en longitud, para igualar la especificidad de sustrato extendida de muchas proteasas, pero puede ser más larga o más corta, dependiendo de la proteasa. Por ejemplo, el sitio de reconocimiento de sustrato o secuencia de desdoblamiento de MT-SP1 requerida para autocatálisis es RQARVV, en donde R está en la posición P4, Q está en la posición P3, A está en la posición P2 y R está en la posición Pl. El desdoblamiento en MT-SP1 ocurre después de la posición R, seguido por la secuencia VVGG. Como se usa en la presente, el sustrato objetivo se refiere a' un sustrato que es específicamente desdoblado en su sitio de reconocimiento de sustrato por una proteasa. Mínimamente, un sustrato objetivo incluye los aminoácidos que conforman la secuencia de desdoblamiento. Opcionalmente, un sustrato objetivo incluye un péptido que contienen la secuencia de desdoblamiento y cualquiera de otros aminoácidos. Una proteína de longitud completa, variante alélica, isoforma, o cualquier porción de la misma, que contiene una secuencia de desdoblamiento reconocida por una proteasa, es un sustrato objetivo para tal proteasa. Adicionalmente, un sustrato objetivo incluye un péptido o proteína que contiene una porción adicional que no afecta el desdoblamiento del sustrato por una proteasa. Por ejemplo, un sustrato objetivo puede incluir un péptido de cuatro aminoácidos o una proteína de longitud completa químicamente unida a una porción fluorogénica . Como se usa en la presente, desdoblamiento se refiere al rompimiento de enlaces peptidicos por una proteasa. La porción de sitio desdoblado para una proteasa, involucra residuos N y C-terminal al enlace desdoblable (los lados cebados y no cebados, respectivamente, con el sitio desdoblado para una proteasa definida como ..P3-P2-Pl-Pl ' -P2 ' -P3' ... y el desdoblamiento ocurre entre los residuos Pl y Pl' ) . Típicamente, el desdoblamiento de un sustrato es un desdoblamiento de activación o un desdoblamiento inhibidor. Un desdoblamiento de activación se refiere al desdoblamiento de un polipéptido de una forma inactiva a una forma activa. Esto incluye, por ejemplo, desdoblamiento de un zimógeno a una enzima activa, y/o desdoblamiento de un factor pro-crecimiento en un factor de crecimiento activo. Por ejemplo, MT-SP1 puede auto-activarse por desdoblamiento de un sustrato objetivo en la secuencia P1-P4 de RQAR. Una desdoblamiento de activación, también es desdoblado, por este medio, una proteína es desdoblada en una o más proteínas que ellas mismas tienen actividad. Por ejemplo, ocurre desdoblamiento de activación en el sistema complemento, el cual es una cascada irreversible de eventos de desdoblamiento proteolítico, cuya terminación resulta en la formación de moléculas efectoras múltiples que estimulan la inflamación, facilitan la fagocitosis del antígeno y lisan directamente algunas células .

Como se usa en la presente, un desdoblamiento inhibidor es desdoblado de una proteina en uno o más productos de degradación que no son funcionales. El desdoblamiento inhibidor resulta en la disminución o reducción de una actividad de una proteina. Típicamente, una reducción de una actividad de una proteína, reduce la trayectoria o proceso para el cual está involucrada la proteína. En un ejemplo, el desdoblamiento de cualquiera o más proteínas objetivo, tal como por ejemplo, una VEGFR, que es un desdoblamiento inhibidor, resulta en la reducción o inhibición concomitante de cualquiera o más funciones o actividades del sustrato objetivo. Por ejemplo, para desdoblamiento de un VEGFR, actividades que pueden ser inhibidas incluyen, pero no se limitan a, enlace de ligando, actividad de cinasa, o actividad angiogénica, tal como actividad angiogénica in vivo o in vitro. Para ser inhibidor, el desdoblamiento reduce la actividad por al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99.9% o más, comparado con una forma nativa de la proteína. El porcentaje de desdoblamiento de una proteína que es requerido para que el desdoblamiento sea inhibidor, varía entre proteínas, pero puede ser determinado por ensayo para una actividad de la proteína. Como se usa en la presente, un polipéptido de proteasa, es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a cualquiera de las proteasas candidatas, o proteasas variantes de las mismas, como se describe en la presente. Como se usa en la presente, una "proteasa modificad" o "proteasa muteina", se refiere a un polipéptido de proteasa (proteina) que tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria, comparada con una proteasa plantilla o de tipo nativo. Una o más mutaciones pueden ser uno o más reemplazos (sustituciones) , inserciones, supresiones de aminoácidos, y cualquiera de las combinaciones de los mismos. Un polipéptido de proteasa modificada incluye aquellas con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más posiciones modificadas. Una proteasa modificada puede ser una proteasa de longitud completa, o puede ser una porción de la misma catalíticamente activa de una proteasa de longitud completa modificada, tan pronto como la proteasa modificada sea proteolíticamente activa. En general, estas mutaciones cambian la especificidad y actividad de las proteasa plantilla o tipo nativa para el desdoblamiento de cualquiera o más sustratos objetivo deseados o predeterminados. Además de contener modificaciones en regiones que alteran la especificad del sustrato de una proteasa, una proteasa modificada puede también tolerar otras modificaciones en regiones que no son esenciales a la especificidad del sustrato de una proteasa. Por lo tanto, una proteasa modificada típicamente tiene 60%, 70%, 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a una secuencia correspondiente de aminoácidos de una proteasa de andamiaje o de tipo nativo. Una proteasa de longitud completa modificada o una porción de la misma catalíticamente activa de una proteasa modificada, puede incluir proteasas que son proteínas de fusión tan pronto como la fusión misma no altere la especificidad de sustrato de una proteasa. Como se usa en la presente, la numeración de quimiotripsina, se refiere a la numeración de aminoácido de un polipéptido de quimiotripsina maduro de la SEC ID NO: 391. El alineamiento de una proteasa de la familia quimiotripsina (es decir, u-PA, t-PA, T-SP1, y otros), que incluyen el dominio proteasa, puede hacerse con quimiotripsina. En tal caso, los aminoácidos de la proteasa que corresponden a los aminoácidos de quimiotripsina, están dando la numeración de los aminoácidos de quimiotripsina. Las posiciones correspondientes pueden ser determinadas por tal lineamiento, por uno de habilidad en la técnica usando alineaciones manuales o usando los numerosos programas de alineación disponibles (por ejemplo, BLASTP) . Las posiciones correspondientes también se pueden basar en alineaciones estructurales, por ejemplo, usando alineaciones simuladas por computadora de la estructura de proteina. La recitación de que los aminoácidos de un polipéptido corresponden a aminoácidos en una secuencia descrita, se refiere a aminoácidos identificados sobre la alineación del polipéptido con la secuencia descrita para maximizar la identidad u homología (en donde los aminoácidos conservados están alineados), usando un algoritmo de alineación estándar, tal como el algoritmo GAP. Por ejemplo, después del alineamiento de u-PA con el aminoácido de polipéptido de quimiotripsina maduro C168 en la secuencia precursora de u-PA expuesta en la SEC ID NO: 191, se alinea con el aminoácido Cl del polipéptido de quimiotripsina maduro. De este modo, el aminoácido C168 en u-PA, también es Cl basado en la numeración de quimiotripsina. Usando tal numeración de quimiotripsina estándar, el aminoácido L244 en la secuencia precursora u-PA expuesta en la SEC ID NO: 191, es la misma como L73 basada en la numeración de quimiotripsina y el aminoácido e 11260 es el mismo como 189, con base en la numeración de quimiotripsina. En otro ejemplo, después del alineamiento del dominio de serina proteasa de T-SP1 (que corresponde a los aminoácidos 615 a 855 en la SEC ID NO:253), con quimiotripsina madura, V en la posición 615 en T-SP1, está dando la numeración de quimiotripsina de V16. Los aminoácidos subsecuentes son numerados por consiguiente. De este modo, un F en la posición de aminoácido 708 de MT-SP1 de longitud completa (SEC ID NO:253), corresponde a F99 basado en la numeración de quimiotripsina. En donde existe un residuo en una proteasa, pero no está presente en la quimiotripsina, el residuo de aminoácido está dando una rotación de letra. Por ejemplo, los residuos en quimiotripsina que son parte de un bucle con 60 aminoácidos basados en la numeración de quimiotripsina, pero están insertados en la secuencia MT-SP1 comprada con quimiotripsina, son referidos a por ejemplo, Asp60b o Arg60c. Como se usa en la presente, especificidad para un sustrato objetivo, se refiere a una preferencia para desdoblar un sustrato objetivo por una proteasa, comparado con otro sustrato, referido como un sustrato no objetivo. La especificidad se refleja en la constante de relación de segundo orden o constante de especificidad (kcat/Km), la cual es una medida de la afinidad de una proteasa para su sustrato y la eficiencia de la enzima. Como se usa en la presente, una constante de especificidad para el desdoblamiento es (kcat/Km), en donde Km es la constante Michaelis- enton ( [S] a una mitad de max) y Kcat es el Vmax/[Er], en donde ?? es la concentración de enzima final. Los parámetros kcat, Km y kcat/Km, pueden ser calculados graficando el inverso de la concentración del sustrato contra el inverso de la relación del sustrato desdoblado, y ajustarlo a la ecuación Lineweaver-Burk (1/relación = (Km/Vmax) ( 1/ [S] ) +1/Vmax; en donde Vmax [Eyj kcat) - Cualquier método para determinar la relación de incremento de desdoblamiento con tiempo en la presencia de varias concentraciones de sustrato, puede ser usado para calcular la constante de especificidad. Por ejemplo, un sustrato está ligado a una porción fluorogénica , la cuales liberada después del desdoblamiento por una proteasa. Determinando la relación de desdoblamiento a diferentes concentraciones de enzima, kcat puede ser determinada para una proteasa particular. La constante de especificidad puede ser usada para determinar el sitio de preferencias especificas de un aminoácido en cualquiera o más de los paquetes S1-S4 de una proteasa para un aminoácido P1-P4 concomitante en un sustrato, usando métodos estándares en la técnica, tales como una biblioteca combinatorial de exploración posicional (PS-SCL) . Adicionalmente, la constante de especificidad también puede ser usada para determinar la preferencia de una proteasa para un sustrato objetivo sobre otro sustrato. Como se usa en la presente, una relación de especificidad de sustrato, es la relación de constantes de especificidad y puede ser usada para comparar especificidades de dos o más proteasas o una proteasa para dos o más sustratos. Por ejemplo, la especificidad de sustrato de una proteasa para competencia de sustratos o de proteasas competentes para un sustrato, puede ser comparada comparando el kcat/Km. Por ejemplo, una proteasa que tiene una constante de especificidad de 2 x 106 _1seg~1 para un sustrato objetivo y para 2 x 104 ^seg-1 para un sustrato no objetivo, es más especifica para el sustrato objetivo. Usando las constantes de especificidad del anterior, la proteasa tiene una relación de especificidad de sustrato de 100 para la proteasa objetivo. Como se usa en la presente, la preferencia para un sustrato objetivo puede ser expresada como una relación de especificidad de sustrato. El valor particular de la relación que refleja una. preferencia, es una función de los sustratos y las proteasas en la emisión. Una relación de especificidad de sustrato que es mayor que 1, significa una preferencia para un sustrato objetivo y una especificidad de sustrato menor de 1, significa una preferencia para un sustrato no objetivo. En general, una relación de al menos o aproximadamente 1, refleja una diferencia suficiente para que una proteasa sea considerada un terapéutico candidato. Como se usa en la presente, especificidad alterada, se refiere a un cambio en la especificidad del sustrato de una proteasa modificada o seleccionada comparada con una proteasa plantilla o de tipo nativa iniciadora. En general, el cambio en la especificidad, es una reflexión del cambio en la preferencia de una proteasa modificada para un sustrato objetivo, comparado con un sustrato de tipo nativo de la proteasa plantilla (aquí referida como un sustrato no objetivo) . Típicamente, las proteasas modificadas o proteasas seleccionadas proporcionadas en la presente, exhiben especificidad de sustrato incrementada para cualquiera o más de las secuencias desdobladas deseadas o predeterminadas de una proteína objetivo, comparada con la especificidad del sustrato de una proteasa plantilla. Por ejemplo, una proteasa modificada o proteasa seleccionad que tiene una relación de especificidad de sustrato de 100 para un sustrato objetivo, contra un sustrato no objetivo, exhibe una especificidad incrementada 10 veces, comparada con una proteasa andamiaje con una relación de especificidad de sustrato de 10. En otro ejemplo, una proteasa modificada que tiene una relación de especificidad de sustrato de 1, comparada con una relación de 0.1, exhibe un incremento de 10 veces en la especificidad de sustrato. Para exhibir la especificidad incrementada, comparada con una proteasa plantilla, una proteasa modificada tiene una especificidad 1.5 veces, 2 veces, 5-veces, 10-veces, 50-veces, 100-veces, 200-veces, 300-veces, 400-veces, 500-veces o más, mayor que la especificidad de sustrato para cualquiera o más de los sustratos objetivo predeterminados. Como se usa en la presente, "selectividad", puede ser usad intercambiablemente con la especificidad cuando se refiere a la habilidad de una proteasa para elegir y desdoblar un sustrato objetivo de entre una mezcla de sustratos competentes. La selectividad incrementada de una proteasa para un sustrato objetivo, comparada con cualquier otro o más sustratos objetivo, puede ser determinada, por ejemplo, comparando las constantes de especificidad de desdoblamiento de los sustratos objetivo por una proteasa. Por ejemplo, si una proteasa tiene una constante de especificidad de desdoblamiento de 2 x 106 "1seg"1 para un sustrato objetivo y 2 x 104 M~1seg"1 para cualquier otro de uno o más sustratos, la proteasa es más selectiva para el sustrato objetivo anterior. Como se usa en la presente, actividad se refiere a una actividad funcional o actividades de un polipéptido o porción del mismo, asociada con una proteina de longitud total (completa) . Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad para enlazar o competir con un polipéptido para enlace a un anticuerpo anti-polipéptido ) , inmunogenicidad, capacidad para formar multímeros, y la capacidad para enlazarse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido . Como se usa en la presente, actividad catalítica o actividad de desdoblamiento, se refiere a la actividad de una proteasa como se valora en ensayos proteolíticos in vitro, que detectan proteólisis de un sustrato seleccionado. La actividad de desdoblamiento puede ser medida valorando la eficiencia catalítica de una proteasa. Como se usa en la presente, la actividad hacia un sustrato objetivo, se refiere a la actividad de desdoblamiento y/o actividad funcional, u otra medición que refleja la actividad de una proteasa en, o hacia un sustrato objetivo. La actividad de desdoblamiento puede ser medida valorando la eficiencia catalítica de una proteasa. Para propósitos de la presente, una actividad se incrementa si una proteasa exhibe mayor proteólisis o desdoblamiento de un sustrato objetivo y/o modula (es decir, activa o inhibe) una actividad funcional de una proteína de sustrato objetivo comparad con la ausencia de la proteasa. Como se usa en la presente, la serina proteasa o serina endopeptidasa, se refiere a una clase de peptidasas, las cuales son caracterizadas por la presencia de un residuo serina en el centro activo de la enzima. Las serinas proteasas participan en un amplio intervalo de funciones en el cuerpo, que incluyen coagulación de la sangre, inflamación, así como también enzimas digestivas en los procariotas y eucariotas. El mecanismo de desdoblamiento por "serinas proteasas", se basa en el ataque nucleofilico de un enlace peptidico objetivo por una serina. La cisteina, treonina o moléculas de agua asociadas con aspartato o metales, también pueden jugar este papel. Cadenas laterales alineadas de serina, histidina y aspartato, forman una triada catalítica común a la mayoría de las serina proteasas. El sitio activo de serina proteasas es formado como una hendidura en donde el sustrato de polipéptido se enlaza. Serinas proteasas ejemplares incluyen, activador del plasminógeno urinario (u-PA) , expuesto en la SEC ID NO: 433 y MT-SP1, expuesto en la SEC ID NO: 253, y porciones de los mismos catalíticamente activas, por ejemplo, el dominio proteasa MT-SP1 (también llamado la cadena B) , expuesta en la SEC ID NO: 505. Como se usa en la presente, una proteína humana es una codificada por una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, presente en el genoma de un humano, que incluyen todas las variantes alélicas y variaciones conservativas de las mismas. Una variante o modificación de una proteína, es una proteína humana si la modificación se basa en el tipo nativo o secuencia prominente de una proteína humana. Como se usa en la presente, los residuos de cc-aminoácidos que se originan naturalmente, son los residuos de aquellos 20 a-aminoácidos encontrados en la naturaleza, los cuales son incorporados en la proteina por reconocimiento especifico de la molécula de tARN cargada con su codón ARNm cognato en humanos. Como se usa en la presente, aminoácidos que no se originan naturalmente, se refieren a aminoácidos que no son genéticamente codificados. Como se usa en la presente, ácidos nucleicos incluyen AD, ARN y análogos de los mismos, que incluyen ácidos nucleicos peptidicos (PNA) y mezclas de los mismos. Ácidos nucleicos pueden ser de hebra única o doble. Cuando se refiere a sonda o cebadores, los cuales son opcionalmente etiquetados, tal como con una etiqueta detectable, tal como una radioetiqueta o fluorescente, moléculas de hebra única están contempladas. Tales moléculas son típicamente de una longitud de manera que su objetivo es estadísticamente único o de bajo número de copia (típicamente menos de 5, en general, menos de 3) para la sonda o cebación de una biblioteca. En general, una sonda o un cebador contiene al menos, 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria a, o idéntica a un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden ser 10, 20, 30, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Como se usa en la presente, un péptido se refiere a un polipéptido que es desde 2 hasta 40 aminoácidos de longitud.

Como se usa en la presente, los aminoácidos los cuales ocurren en las varias secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente, son identificados de conformidad con su abreviatura de una letra o tres letras, conocida (Tabla 1) . Los nucleótidos los cuales ocurren en los varios fragmentos de ácido nucleico, son designados con las designaciones de una letra estándares usadas rutinariamente en la técnica. Como se usa en la presente, un "aminoácido", es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxilico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para propósitos de la presente, aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos que se originan naturalmente, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácido (es decir, aminoácidos en donde el a-carbono tiene una cadena lateral). Como se usa en la presente, "residuo de aminoácido", se refiere a un aminoácido formado después de la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácido descritos en la presente, son asumidos por estar en la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D", los cuales son así designados, pueden ser sustituidos por cualquier residuo de L-aminoácido, tan pronto como la propiedad funcional deseada es retenida por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un polipéptido. En armonía con la nomenclatura de polipéptido estándar descrita en J. Biol. Chem. , 243: 3552-3559 (1969), y adoptado por el 37 C.F.R, §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para residuos de aminoácido se muestran en la Tabla 1: Tabla 1 - Tabla de Correspondencia Se debe notar que todas las secuencias de residuos de aminoácido representadas en la presente por las fórmulas, tienen una orientación izquierda a derecha en la dirección convencional de término amino a término carboxilo. Además, la frase "residuo de aminoácido", es ampliamente definida para incluir los aminoácidos listados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificado e inusuales, tales como aquellos referidos en el 37 C.F.R §§ 1.821-1.822, e incorporados en la presente por referencia. Además, se debe notar que una cantidad pequeña al comienzo o al final de una secuencia de residuo de aminoácido, indica un enlace peptidico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido, a un grupo amino-terminal , tal como NH2 o a un grupo carboxilo-terminal, tal como COOH. Como se usa en la presente, "aminoácidos que se originan naturalmente", se refiere a los 20 aminoácidos-L que ocurren en polipéptidos . Como se usa en la presente, "aminoácido no natural", se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural, pero ha sido modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Aminoácidos que no se originan naturalmente de este modo, incluyen por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos que se originan naturalmente e incluyen, pero no se limitan a, los D-isoestereómeros de aminoácidos.

Aminoácidos ejemplares no naturales, son descritos en la presente y se conocen por aquellos de habilidad en la técnica . Como se usa en la presente, una mezcla isocinética es una en la cual, las relaciones molares de aminoácidos se han ajustado con base en sus relaciones de reacción reportadas (véase por ejemplo, Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34:1681). Como se usa en la presente, un constructo de ADN es una molécula de ADN de hebra única o doble, lineal o circular, que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtacolocados en una manera no encontrada en la naturaleza. Existen constructos de ADN como un resultado de manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas. Como se usa en la presente, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado, es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, el cual, cuando se lee a partir de la dirección 5' a 3' , codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado. Como se usa en la presente, el término ortólogo significa un polipéptido o proteina obtenida de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteína a partir de especies diferentes. Diferencias de secuencia entre los ortólogos, son el resultado de la especiación . Como se usa en la presente, el término polinucleótido, significa un polímero de hebra única o doble de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, leídas del extremo 5' al 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in vítro, o preparados a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se da en la presente en términos de nucleótidos (abreviado "nt") o pares base (abreviado "bp") . El término nucleótidos, es usado para moléculas de hebra única y doble, en donde el contexto lo permite. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se usa para denotar la longitud completa y se entiende por ser equivalente al término pares base. Se reconocerá bien por aquellos expertos en la técnica, que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra, puede diferir ligeramente en longitud y que los extremos del mismo pueden ser escalonados; de este modo, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra no pueden ser apareados. Tales extremos no apareados en general, no excederán 20 nucleótidos de longitud. Como se usa en la presente, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos referidos en la relevancia entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o la secuencia de nucleótido de los ácidos nucleicos. La similitud se puede basar en el grado de identidad y/o homología de las secuencias de residuos y los residuos contenidos ahí. Los métodos para valorar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos, son conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Por ejemplo, en un método para valoración de la similitud de secuencia, dos aminoácidos o secuencias de nucleótido son alineados en una manera que proporciona un nivel máximo de identidad entre las secuencias. "Identidad", se refiere a la extensión en la cual el aminoácido o secuencias de nucleótido son invariantes. La alineación de secuencias de aminoácido, y en alguna extensión secuencias de nucleótido, también puede tomar en cuenta diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son aquellas que preservan las propiedades físico-químicas de los residuos involucrados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas sobre la longitud completa de las secuencias y que incluyen todos los residuos) , o local (alineamiento de una porción de las secuencias que incluye solamente la región o regiones más similares) . "Identidad", per se, tiene un significado reconocido en la técnica, y puede ser calculado usando técnicas publicadas. (Véase por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Seguetee Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, . and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Mientras existe un número de métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad", es bien conocido por aquellos expertos en la técnica (Carillo, H. & Lipton, D. , SIAM J Applied Math 45:1073 (1988)). Como se usa en la presente, homólogos (con respecto a secuencias de ácido nucleico y/o aminoácido) , significa aproximadamente mayor que o igual a 25% de homología de secuencia, típicamente mayor que o igual a 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de homología de secuencia; el porcentaje preciso puede ser especificado, si es necesario. Para propósitos en la presente, los términos "homología" e "identidad", son a menudo usados de manera intercambiable, a menos que se indique de otro modo. En general, para determinación del porcentaje de homología o identidad, las secuencias son alineadas de manera que se obtiene el orden de apareamiento más alto (véase por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. ., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Seguetee Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Seguence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIA J Applied Math 45:1073). Por homología de secuencia, el número de aminoácidos conservados se determina por programas de algoritmos de alineamiento estándar, y puede ser usado con penalizaciones de apertura por omisión establecido por cada proveedor. Moléculas de ácido nucleico sustancialmente homologas, podrían hibridizar típicamente a rigurosidad moderada, o a alta rigurosidad junto con la longitud del ácido nucleico de interés. También están contempladas moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico hibridizante . Si cualquiera de dos moléculas tienen secuencias de nucleótido o secuencias de aminoácido que son al menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas" u "homologas", pueden ser determinadas usando algoritmos de computadora tales como el programa "FASTA", usando por ejemplo, los parámetros por omisión como en Pearson et al. (1988; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 55:2444 (otros programas incluyen el paquete del programa GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al, J Molec Biol 275:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo et al (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para Información de Biotecnología, puede ser usada para determinar la identidad. Otros programas comercialmente o públicamente disponibles incluyen, programa DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) y el programa "Gap" del Grupo de Computadora de Genética de la University of Wisconsin (UWG) (Madison WI). El porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico, puede ser determinado por ejemplo, comparando información de secuencia usando un programa de ordenador GAP (por ejemplo, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, como se revisa por Smith and Waterman ((1981) Adv. Appl . Math. 2:482). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, los nucleótidos o aminoácidos), los cuales son similares, divididos por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por omisión para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación uñaría (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación pesada de Gribskov et al. (1986) Nucí. Acids Res. 14:6745, como se describe por Schwartz and Dayhoff, eds . , ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3.0 para cada apertura y una penalidad adicional de 0.10 para cada símbolo en cada apertura; y (3) sin penalidades para aperturas finales. Por lo tanto, como se usa en la presente, el término "identidad" u "homología", representan una comparación entre una prueba y un polipéptido o polinucleótido de referencia. Como se usa en la presente, el término al menos "90% idéntico", se refiere a porcentajes de identidades desde 90 hasta 99.9 con relación al ácido nucleico de referencia o secuencia de aminoácido del polipéptido. Identidad a un nivel de 90% o más, es indicativo del hecho que, asumiendo por propósitos de ej emplificación, son comparadas una prueba y longitud de polipéptido de referencia de 100 aminoácidos. No más de 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba, difieren de aquellos del polipéptido de referencia. Comparaciones similares pueden hacerse entre los polinucleótidos de referencia y prueba. Tales diferencias pueden ser representadas como mutaciones de punto aleatoriamente distribuidas sobre la longitud completa de un polipéptido, o pueden ser agrupadas en una o más ubicaciones de longitud variante hasta el máximo permisible, por ejemplo, 10/1.00 aminoácidos de diferencia (aproximadamente 90% de identidad) . Las diferencias son definidas como sustituciones, inserciones o supresiones, de ácido nucleico o aminoácido. Al nivel de homologías o identidades arriba de aproximadamente 85-90%, el resultado debe ser independiente del programa y la serie de parámetros de apertura; tales niveles de identidad altos, pueden ser valorados fácilmente, a menudo por alineamiento manual sin confiar en el software. Como se usa en la presente, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) , para alinear las posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, dos o más secuencias que están relacionadas por 50% o más identidad, son alineadas. Una serie alineada de secuencias, se refiere a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y pueden incluir alineamiento de secuencias derivadas de ARNs, tales como EST y otros ADNc, alineados con la secuencia de ADN genómico. Como se usa en la presente, "cebador", se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como un punto de inicio de síntesis de ADN dirigida por plantilla bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, en la presencia de cuatro diferentes trifosfatos de nucleósidos y un agente de polimerización, tal como polimerasa de ADN, polimerasa de ARN o transcriptasa inversa) , en un amortiguador apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que ciertas moléculas de ácido nucleico pueden servir como una "sonda" y como un "cebador". Un cebador, sin embargo, tiene un grupo 3' -hidroxilo para extensión. Un cebador puede ser usado en una variedad de métodos, que incluyen por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa inversa (RT)-PCR, RNA, PCR, LCR, PCR múltiple, PCR manejado por charola, PCR por captura, PCR de expresión, 3' y 5' RACE, PCR in situ, PCR mediado por ligación y otros protocolos de amplificación. Como se usa en la presente, "par cebador", se refiere a una serie de cebadores que incluyen un cebador al 5' (corriente arriba) , que hibridiza con el extremo 5' de una secuencia a ser amplificada (por ejemplo, por PCR) y un cebador al 3' (corriente abajo), que hibridiza con el complemento del extremo 3' de la secuencia a ser amplificada . Como se usa en la presente, "específicamente hibridiza", se refiere a templado, por apareamiento de base complementaria, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) , a una molécula de ácido nucleico objetivo. Aquellos de habilidad en la técnica, son familiares con parámetros in vitro e in vivo, que afectan la hibridizacion específica, tales como longitud y composición de la molécula particular. Los parámetros particularmente relevantes a la hibridizacion in vitro, incluyen templado y temperatura de lavado, composición amortiguadora y concentración de sal. Condiciones de lavado ejemplares para remover moléculas de ácido nucleico no unidas específicamente a alta rigurosidad, son 0.1 x SSPE, 0.1% de SDS, 65°C y a rigurosidad media son 0.2 x SSPE, 0.1% de SDS, 50°C. Las condiciones de rigurosidad equivalentes, son conocidas en la técnica. La persona experta puede fácilmente, ajusfar estos parámetros para lograr la hibridizacion específica de una molécula de ácido nucleico a una molécula de ácido nucleico objetivo apropiada para una aplicación particular. Como se usa en la presente, sustancialmente idéntico a un producto, significa suficientemente similar ya que la propiedad de interés está suficientemente sin cambio, de manera que el producto sustancialmente idéntico, puede ser usado en lugar del producto. Como se usa en la presente, también se entiende que los términos "sustancialmente idéntico" o "similar", varia con el contexto como se entiende por aquellos de habilidad en la técnica relevante. Como se usa en la presente, una variación alélica o variante alélica, hace referencia a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo lugar cromosomal. La variación alélica se origina naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en polimorfismo fenotipico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de gen pueden ser silentes (sin cambio en el polipéptido codificado) , o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencia de aminoácido alterada. El término "variante alélica", también se usa en la presente para denotar una proteina codificada por una forma de tipo nativo y/o forma predominante de un polipéptido a partir de una población o número de referencia único de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, las cuales incluyen variantes entre y a través de las especies, típicamente tienen al menos, 80%, 90% o mayor identidad de aminoácido con una forma predominante y/o de tipo nativo a partir de estas mismas especies; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es interespecies o intraespecies . En general, las variantes alélicas intraespecies tienen al menos, aproximadamente 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad o mayor, con una forma predominante y/o de tipo nativo, que incluye 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad con una forma de tipo nativa y/o predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en la presente, en general se refiere a variaciones en proteínas entre miembros de las mismas especies . Como se usa en la presente, "alelo", el cual es usado intercambiablemente en la presente con "variante alélica", se refiere a formas alternativas de un gen o porciones de los mismos. Los alelos que ocupan el mismo lugar o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, el sujeto se dice, es homocigoto para tal gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, el sujeto se dice, es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen específico, pueden diferir de entre sí en un nucleótido único o varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, supresiones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación. Como se usa en la presente, variantes de especies, se refiere a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, que incluyen diferentes especies de mamíferos, tales como ratón y humano. Como se usa en la presente, una variante de empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcripto primario de un ADN genómico que resulta en más de un tipo de ARNm. Como se usa en la presente, modificación es en referencia a modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye, supresiones, inserciones y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Los métodos para modificar un polipéptido, son rutina para aquellos de habilidad en la técnica, tal como usando metodologías de ADN recombinante. Como se usa en la presente, un peptidomimético es un compuesto que imita la conformación y ciertas características estereoquímicas de la forma biológicamente activa de un péptido particular. En general, los peptidomiméticos son designados para imitar ciertas propiedades deseables de un compuesto, pero no las propiedades deseables, tales como flexibilidad, que conducen a una pérdida de una conformación biológicamente activa y rompimiento de enlaces. Los peptidomiméticos pueden ser preparados de compuestos biológicamente activos, reemplazando ciertos grupos o enlaces que contribuyen a propiedades indeseables con bioisosteres . Los bioisosteres son conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Por ejemplo, el bioisostere de metileno CH2S, ha sido usado como un reemplazo de amida en análogos de encefalina (véase por ejemplo, Spatola (1983) pp. 267-357 in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weinstein, Ed. volume 7, Marcel Dekker, New York) . La morfina, la cual puede ser administrada oralmente, es un compuesto que es un peptidomimético de la endorfina peptidica. Para propósitos de la presente, péptidos cíclicos están incluidos entre los peptidomiméticos como son polipéptidos en los cuales uno o más enlaces peptidicos son/están reemplazados por un imitador. Como se usa en la presente, un polipéptido que comprende un porcentaje especificad de aminoácidos expuestos en un polipéptido de referencia, se refiere a la proporción de aminoácidos contiguos idénticos portados entre un polipéptido y un polipéptido de referencia. Por ejemplo, una isoforma que comprende 70% de los aminoácidos expuesto en un polipéptido de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: XX, la cual menciona 147 aminoácidos, significa que el polipéptido de referencia contiene al menos, 103 aminoácidos contiguos expuestos en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:XX. Como se usa en la presente, el término promotor significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de la polimerasa de ARN e inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en la región no codificante al 5' de los genes. Como se usa en la presente, polipéptido o proteína aislada o purificada o porción de la misma biológicamente activa, está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes a partir de la célula o tejido del cual se derivan las proteínas, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando son químicamente sintetizados. Las preparaciones pueden ser determinadas por estar sustancialmente libres. si parecen estar libres de impurezas fácilmente detectables, como se determina por métodos estándares de análisis, tal como cromatografía de capa delgada (TLC) , electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , usadas por aquellos de habilidad en la técnica para valorar tal pureza, o suficientemente puros de manera tal que la purificación adicional no podría detectablemente alterar las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas de la sustancia. Los métodos para purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros, son conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Un compuesto sustancialmente químicamente puro, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros . En tales casos, además, la purificación podría incrementar la actividad específica del compuesto. El término sustancialmente libre de material celular, incluye preparaciones de proteínas en las cuales, la proteína es atrapada de los componentes celulares de las' células a partir de las cuales se aislan o producen recombinantemente . En una modalidad, el término sustancialmente libre de material celular, incluye preparaciones de proteínas proteasas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no proteasas (también referidas en la presente como una proteína contaminante) , en general, menos de aproximadamente 20% de proteínas no proteasa o 10 de proteínas no proteasa o menos de aproximadamente 5% de proteínas no proteasa. Cuando la proteína proteasa o porción activa de la misma es recombinantemente producida, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente o a 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína proteasa. Como se usa en la presente, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos, incluye las preparaciones de proteínas proteasas en las cuales la proteína se atrapa de precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas proteasa que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5% o menos de precursores químicos o químicos o componentes no proteasa. Como se usa en la presente, sintética con referencia a por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético, se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que es producida por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química. . Como se usa en la presente, producción por medios recombinantes usando métodos de ADN recombinante, significa el uso de métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por el ADN clonado. Como se usa en la presente, vector (o plásmido) , se refiere a elementos discretos que son usados para introducir un ácido nucleico heterólogo en células para ya sea expresión o replicación del mismo. Los vectores típicamente permanecen episomal, pero pueden ser designados para efectuar la integración de un gen o porción del mismo en un cromosoma del genoma. También contemplados están vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamíferos. La selección y uso de tales vehículos es bien conocida por aquellos de habilidad en la técnica.

Como se usa en la presente, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está operativamente ligado con secuencias regulatorias , tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente, pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionadles , un intensificador , una señal de poliadenilación, y similares. Vectores de expresión son en general, derivados de ADN viral o plásmido, o pueden contener elementos de ambos. De este modo, un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, después de la introducción en una célula hospedera apropiada, resulta en la expresión del ADN clonado. Vectores de expresión apropiados son bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica, e incluyen aquellos que son replicables en células eucarióticas y/o células procarióticas y aquellos que permanecen episomales o aquellos los cuales se integran en el genoma de la célula hospedera. Como se usa en la presente, vectores también incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Los vectores virales son virus diseñados por ingeniería que están operativamente ligados a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas), los genes exógenos en células. Como se usa en la presente, un adenovirus se refiere a cualquiera de un grupo de virus que contienen ADN que causan conjuntivitis e infecciones del tracto respiratorio superior en humanos. Como se usa en la presente, el ADN puro se refiere a un ADN libre de histona que puede ser usado para vacunas y terapia de gen. ADN puro es el material genético que se pasa de célula a célula durante una transformación llamada proceso de transferencia de gen. En la transformación, el ADN purificado o puro, es tomado del recipiente celular el cual dará al recipiente celular una nueva característica o fenotipo. Como se usa en la presente, operablemente u operativamente ligado, cuando se refiere a segmentos de ADN, significa que los segmentos son arreglados de manera que funcionan en conjunto para sus propósitos propuestos, por ejemplo, la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento codificante al terminador. Como se usa en la presente, secuencia de enlace a la proteína, se refiere a una proteína o secuencia peptídica que es capaz de enlazarse específicamente a otras secuencias peptídicas o proteínas en general, a una serie de secuencias peptídicas o proteínas o a una secuencia peptidica o proteína particular. Como se usa en la presente, una marca de epítope se refiere a un estiramiento corto de residuos de aminoácido que corresponden a un epítope para facilitar el análisis bioquímico e inmunológico subsecuente de la proteína o péptido marcado con epítope. El marcado de epítope se logra agregando la secuencia de la marca del epítope a una secuencia que codifica la proteína en un vector de expresión apropiado. Las proteínas etiquetadas con epítope, pueden ser purificadas por afinidad usando anticuerpos altamente específicos originados contra las marcas . Como se usa en la presente, la secuencia de enlace metálica, se refiere a una secuencia peptidica o proteína, que es capaz de enlazarse específicamente a iones metálicos en general, a una serie de iones metálicos o a un ión metálico particular. Como se usa en la presente, el término valoración está propuesto para incluir determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteasa, o un dominio del mismo, presente en la muestra, y también para obtener un índice, relación, porcentaje, valor visual u otro indicativo del nivel de actividad. La valoración puede ser directa o indirecta y las especies químicas actualmente detectadas, no necesitan por supuesto, ser el producto de proteólisis mismos, sino por ejemplo, ser un derivado del mismo o alguna sustancia adicional. Por ejemplo, la detección de un producto desdoblado de una proteina complemento, tal como por SDS-PAGE y teñido de proteina con azul Coomasie. Como se usa en la presente, actividad biológica se refiere a las actividades ín vivo de un compuesto o respuestas fisiológicas que resultan de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. Actividad biológica, de este modo, abarca efectos terapéuticos y actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones y mezclas. Actividades biológicas pueden ser observadas en sistemas in vitro diseñados para probar o usar tales actividades. De este modo, para propósitos en la presente, una actividad biológica de una proteasa es su actividad catalítica en la cual, un polipéptido es hidrolizado . Como se usa en la presente, equivalente cuando se refiere a dos secuencias de ácidos nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestión, codifican la misma secuencia de aminoácidos o proteínas equivalentes. Cuando se usa equivalente con referencia a dos proteínas o péptidos, significa que las dos proteínas o péptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácido con solamente sustituciones de aminoácido que no alterna sustancialmente la actividad o función de la proteina o péptido. Cuando equivalente se refiere a una propiedad, la propiedad no necesita estar presente en la misma magnitud (por ejemplo, dos péptidos pueden exhibir diferentes relaciones del mismo tipo de actividad enzimática) , pero las actividades son usualmente sustancialmente las mismas. Complementariamente, cuando se hace referencia a dos secuencias de nucleótido, significa que las dos secuencias de nucleótido son capaces de hibridizar, típicamente con menos de 25%, 15% o 5% desapareamientos entre nucleótidos opuestos. Si es necesario, el porcentaje de complementariedad se especificará. Típicamente, las dos moléculas son seleccionadas de manera que hibridizarán bajo condiciones de alta rigurosidad. Como se usa en la presente, un agente que modula la actividad de una proteína o expresión de un gen o ácido nucleico, ya sea reduce o incrementa o de otro modo, altera la actividad de la proteína o, en alguna manera, regula ascendentemente o descendentemente o de otro modo, altera la expresión del ácido nucleico en una célula. Como se usa en la presente, un efecto farmacéutico o efecto terapéutico, se refiere a un efecto observado después de la administración de un agente propuesto para el tratamiento de una enfermedad o trastorno o para aliviar los síntomas del mismo.

Como se usa en la presente, "modular" y "modulación", o "alterar", se refiere a un cambio de una actividad de una molécula, tal como una proteina. Actividades ejemplares incluyen, pero no se limitan a, actividades biológicas tales como transduccion de señal. La modulación puede incluir un incremento en la actividad (es decir, regulación ascendente o actividad agonista) , un decremento en la actividad (es decir, regulación descendente o inhibición) , o cualquier otra alteración en una actividad (tal como un cambio en la periodicidad, frecuencia, duración, cinética u otros parámetros) . La modulación puede ser dependiente del contexto y típicamente, la modulación es comparada con un estado designado, por ejemplo, la proteína de tipo nativa, la proteína en un estado constitutivo, o la proteína como se expresa en un tipo de célula designada o condición. Como se usa en la presente, inhibir e inhibición, se refieren a una reducción en la actividad con relación a la actividad no inhibida. Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuosa, no acuosa, o cualquier combinación de los mismos. Como se usa en la presente, una combinación se refiere a cualquier asociación entre o a través de dos o más elementos. La combinación puede ser de dos o más elementos, o cualquier variación de los mismos. Los elementos de una combinación son en general, funcionalmente asociados o relacionados. Un kit es una combinación empaquetada que opcionalmente incluye instrucciones para uso de la combinación o elementos de los mismos. Como se usa en la presente, "enfermedad o trastorno", se refiere a una condición patológica en un organismo que resulta de causa o condición que incluye, pero no se limita a, infecciones, condiciones adquiridas, condiciones genéticas y caracterizadas por síntomas identificables . Las enfermedades y trastornos de interés en la presente, son aquellas que involucran activación del complemento, que incluyen aquellas mediadas por activación de complemento y aquellas en las cuales la activación del complemento juega un papel en la etiología o patología. Las enfermedades y trastornos también incluyen aquellas que son causadas por la ausencia de una proteína tal como una deficiencia inmune, y de interés en la presente, son aquellos trastornos en donde la activación del complemento no ocurre debido a una deficiencia en una proteína de complemento . Como se usa en la presente, "tratar", a un sujeto con una enfermedad o condición, significa que los síntomas del sujeto son parcialmente o totalmente aliviados, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o una prevención de empeoramiento de síntomas o progreso de una enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de una interferona modificada y composiciones proporcionadas en la presente. Como se usa en la presente, un agente terapéutico, régimen terapéutico, radioprotector o quimioterapéutico, significan fármacos convencionales y terapias de fármacos, que incluyen vacunas, las cuales son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Agentes radioterapéuticos son bien conocidos en la técnica. Como se discute en la presente, tratamiento significa cualquier manera en la cual los síntomas de una condición, trastorno o enfermedad u otra indicación, son aliviados o de otro modo benéficamente alterados. Como se usa en la presente, efecto terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento de un sujeto que altera, típicamente mejora o alivia los síntomas de una enfermedad o condición o que cura una enfermedad o condición. Una cantidad terapéuticamente activa, se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto, el cual resulta en un efecto terapéutico después de la administración a un sujeto.

Como se usa en la presente, el término "sujeto", se refiere a un animal, que incluye un mamífero, tal como un ser humano. Como se usa en la presente, un paciente se refiere a un sujeto humano. Como se usa en la presente, alivio de los síntomas de una enfermedad particular o trastorno por un tratamiento, tal como por administración de una composición farmacéutica u otro terapéutico, se refiere a cualquier disminución, sea permanente o temporal, duradera o temporal de los síntomas que pueden ser atribuidos a, o asociados con la administración de la composición o terapéutico. Como se usa en la presente, prevención o profilaxis se refiere a métodos en los cuales, el riesgo de desarrollar una enfermedad o condición se reduce. Como se usa en la presente, una cantidad efectiva es la cantidad de un agente terapéutico necesario para prevenir, curar, aliviar, detener o parcialmente detener un síntoma de una enfermedad o trastorno. Como se usa en la presente, administración de una proteasa, tal como una proteasa modificada, se refiere a cualquier método en el cual la proteasa es contactada con su sustrato. La administración puede ser efectuada in vivo o ex vivo o in vitro. Por ejemplo, para administración ex vivo, un fluido corporal, tal como sangre, es removido de un sujeto y contactado fuera del cuerpo con la proteasa no complemento modificad. Para administración in vivo, la proteasa modificada puede ser introducida en el cuerpo, tal como por introducción local, tópica, sistémica y/o otra ruta. La administración in vitro abarca métodos, tales como métodos de cultivo celular. Como se usa en la presente, forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y empaquetadas individualmente como se conoce en la técnica. Como se usa en la presente, una formulación de dosificación individual se refiere a una formulación para administración directa. Como se usa en la presente, un "artículo de manufactura", es un producto que es elaborado y vendido. Como se usa a través de esta solicitud, el término está propuesto para abarcar polipéptidos de proteasas modificadas y ácidos nucleicos contenidos en los artículos de empaquetado. Como se usa en la presente, fluido se refiere a cualquier composición que puede fluir. Los fluidos de este modo abarcan composiciones que están en la forma de semi-sólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras de tales composiciones. Como se usa en la presente, un "kit", se refiere a una combinación de un polipéptido de proteasa modificado o molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente y otro elemento para un propósito que incluye, pero no se limita a, administración, diagnóstico y valoración de una actividad o propiedad biológica. Los kits opcionalmente incluyen las instrucciones de uso. Como se usa en la presente, un extracto o lisado celular, se refiere a una preparación o fracción biológica, la cual es elaborada de una célula interrumpida o lisada. Como se usa en la presente, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no se limita a primates que incluyen, humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ovinos, tales como cerdos y otros animales. Animales no humanos, excluyen humanos como el animal contemplado. Las proteasas proporcionadas en la presente, son de cualquier fuente, animal, planta, procariótica y fúngica. La mayoría de las proteasas son de origen animal, que incluyen origen de mamífero. Como se usa en la presente, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no es tratada con un parámetro de prueba, o, si es una muestra de plasma de muestra, puede ser de voluntarios normales no afectados con la condición de interés. Un control también puede ser un control interno . Como se usa en la presente, las formas singulares, "un", "uno" y "el", incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo. De este modo, por ejemplo, la referencia a compuesto, que comprende "un dominio extracelular" , incluye compuestos con una o una pluralidad de dominios extracelulares . Como se usa en la presente, intervalos y cantidades pueden ser expresados como "aproximada" a un valor o intervalo particular. Aproximado también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente 5 bases", significa "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases". Como se usa en la presente, "opcional" u "opcionalmente" , significa que el evento subsecuentemente descrito o las circunstancias, ocurren o no ocurren, y que la descripción incluye casos en donde dicho evento o circunstancia ocurre y casos en donde no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo es sustituido o insustituido . Como se usa en la presente, las abreviaturas para cualquiera de los grupos protectores, aminoácidos y otros compuestos, son, a menos que se indique de otro modo, de conformidad con su empleo común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión en Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11:1726) .

B . MÉTODO PARA SELECCIONAR PROTEASAS Se proporcionan métodos para seleccionar proteasas con propiedades alteradas, particularmente especificidad y selectividad de sustrato. Los métodos también proporcionan tales proteasas alteradas que exhiben actividad sustancialmente sin cambio o con suficiente para un uso terapéutico. Los métodos proporcionados en la presente, pueden ser empleados con cualquier método para modificación de proteasa y diseño de proteasas modificadas. Tales métodos incluyen métodos aleatorios para producir bibliotecas, uso de bibliotecas existentes, y también métodos de evolución directas. Una variedad de esquemas de selección para identificar proteasas que tienen especificidad/selectividad de sustrato alterada, han sido empleados, pero cada una tiene limitaciones. Los métodos proporcionados en 1 presente, superan tales limitaciones. En general, los esquemas de selección incluyen aquellos que 1) seleccionan el enlace a la proteasa o 2) seleccionar catálisis de proteasa. Ejemplos de estrategias que toman ventaja de enlace de proteasa incluyen, por ejemplo, el uso de análogos de estado de transición (TSAs) y aquellos que emplean sustratos suicidas de molécula pequeña. Un TSA es un compuesto estable que imita las características electrónicas y estructurales del estado de transición de una proteasa: reacción de sustrato. La interacción más fuerte entre una proteasa y el sustrato, ocurre típicamente en el estado de transición de una reacción. Un TSA es empleado como un sustrato modelo para seleccionar proteasas con alta afinidad de enlace. Un TSA nunca es un imitador perfecto de un estado de transición verdadero y sus síntesis son difíciles (Bertschinger et al., (2005) en Phage display in Biotech and Drug Discovery (Sidhu S, ed) , pp. 461-491). Tal estrategia ha identificado variantes de proteasas con especificidad de sustrato alterada, pero tales proteasas en general, exhiben actividad reducida debido a que un requerimiento para la catálisis de proteasa no es parte del esquema de selección. En una estrategia alterna, sustratos suicidas de molécula pequeña (también llamado inhibidores a base de mecanismo) , han sido usados para seleccionar proteasas basadas en el enlace. Tales sustratos suicidas típicamente son inhibidores de molécula pequeña que se enlazan covalentemente al sitio activo de una enzima. Estos sustratos suicidas contienen un electrófilo reactivo que reacciona con un nucleófilo de enzimas para formar un enlace covalente. El desdoblamiento de un enlace peptídico normal por la proteasa, no es requerido para esta reacción. Típicamente, tales inhibidores producen un nucleófilo reactivo solamente después del enlace a la enzima correcta y se someten a etapas catalíticas normales (véase por ejemplo, Bertschinger et al. (2005) en Phage display in Biotech, and Drug Discovery (Sidhu S, ed) , pp. 461-491) . En muchos casos, el inhibidor de sustrato imita la conformación del primer estado de transición involucrado en la catálisis, pero no permite la terminación del ciclo catalítico. Como un resultado, el uso de inhibidores efectivamente selecciona el enlace fuerte en lugar de los catalizadores y resulta en la selección de enzimas inactivas con disociación deteriorada del sustrato (Droge et al. (2006) ChemBioChem, 7:149-157). También, debido a su tamaño y la carencia de requerimiento para el desdoblamiento del sustrato, no recapitulan la interacción de una proteasa con un sustrato de proteína natural. Una estrategia de selección de proteasa que selecciona la catálisis en lugar del enlace, también ha sido intentada (véase por ejemplo, Heinis et al. (2001), Protein Engineering, 14: 1043-1052). Una de las limitaciones principales en el ensayo para la catálisis, es que los productos de reacción se difunden lejos rápidamente después que la reacción de completa, haciendo difícil aislar la enzima catalíticamente activa. Consecuentemente, las estrategias que seleccionan para la catálisis, confian en el anclaje del sustrato y la enzima al fago, de manera tal que están en proximidad cercana. Por ejemplo, la proteina calmodulina ha sido usada como un agente de inmovilización (Demartis (1999) J Mol. Biol., 286:617-633). Los sustratos de reacción son no covalentemente anclados en las enzimas de fago marcado con calmodulina, usando derivados de péptidos enlazantes a calmodulina. Después de la catálisis, los fagos que exhiben el producto de reacción, son aislados de fago no catalíticamente activo usando reactivos de afinidad anti-producto . Puesto que el sustrato es unido a la partícula del fago, sin embargo, la reacción de catálisis puede ser obstaculizada. Por lo tanto, estos y otros métodos para selección de proteasa, sufren limitaciones y no identifican proteasas con especificidad alterada y sustancialmente no cambian con suficiente actividad para aplicaciones terapéuticas. Los métodos proporcionados en la presente, dirigen estas limitaciones . Proporcionados en la presente, están métodos de selección de proteasas para identificar proteasas y/o variantes de proteasas con especificidad de sustrato alterada, optimizada o mejorada. Tales proteasas son identificadas para optimización y uso como proteasas terapéuticas que pueden desdoblar e inactivar (o activar) los objetivos de proteína deseados, tales como por ejemplo, objetivos de proteína involucrados en la etiología de una enfermedad o trastorno. En los métodos para seleccionar proteasas proporcionados en la presente, las proteasas candidato son separadas como complejos intermediarios estables de la reacción enzimática de la proteasa y después identificados. Los complejos intermediarios estables, típicamente son complejos covalentes u otros complejos que permiten la separación de los mismos a partir de moléculas no formadas en complejos. Tales intermediarios, incluyen por ejemplo, un intermediario de enzima acilo que permite la captura y finalmente la identificación de las proteasas que tienen una especificidad de sustrato seleccionada o predeterminada. La captura (atrapamiento) de la proteasa, es efectuado contactando una colección de proteasas con un polipéptido que atrapa proteasa que es desdoblado por la proteasa y, después del desdoblamiento, forma el complejo estable. Ejemplares de tales polipéptidos que atrapan proteasas son serpinas, alfa 2-macroglobulinas , y otras de tales moléculas. El polipéptido que atrapa proteasas puede originarse naturalmente y/o puede ser modificado para seleccionar un sustrato objetivo particular. En la práctica de los métodos, colecciones de proteasas, típicamente modificadas o proteasas mutantes y/o colecciones de proteasas naturales, son contactadas con un polipéptido que atrapa proteasas, que reacciona con la proteasa después del sustrato desdoblado para formar el complejo que contiene el intermediario atrapado. Estos métodos pueden ser usados para identificar proteasas que tienen una especificidad/selectividad de sustrato deseada. Para lograr la identificación de proteasas que tienen una especificidad/selectividad de sustrato deseada, la secuencia de aminoácido del enlace desdoblable, y/o secuencias circundantes en el sitio reactivo, tal como la secuencia de bucle reactivo o secuencia de análogo, puede ser modificada en el polipéptido que atrapa proteasas para imitar la secuencia que desdobla sustrato del sustrato objetivo deseado. La reacción de selección se realiza contactando una colección de proteasas con el polipéptido que atrapa proteasa bajo condiciones por este medio, formando complejos estables, típicamente forman complejos covalentes. Los complejos son de estabilidad suficiente para permitir su separación de otros complejos menos estables y polipéptidos que atrapan proteasas sin reaccionar . Los polipéptidos que atrapan proteasas pueden ser etiquetados identificables o marcados de afinidad para facilitar la identificación de complejos. Por ejemplo, el etiquetado de los polipéptidos que atrapan proteasas, tales como por una porción fluorescente, marca de afinidad u otros de agentes de etiquetado/de marca facilitan el aislamiento del complejo proteasa-inhibidor e identificación de la proteasa seleccionada. Las proteasas seleccionadas pueden ser analizadas por actividad para valorar la eficiencia proteolitica y especificidad de sustrato. Las proteasas identificadas o seleccionadas también pueden ser identificadas, tales como por secuenciamiento u otro protocolo de identificación, que incluyen métodos espectrométricos, o por otros métodos de etiquetación, para identificar proteasas seleccionadas en los complejos. Los métodos proporcionados en la presente, también incluyen etapas de selección iterativa opcionales, de manera que el método puede ser realizado una vez, o puede ser realizado en rondas múltiples afiladas en una proteasa de una especificidad/selectividad deseada o predeterminada y/o actividad de desdoblamiento. Por ejemplo, la selección de proteasa puede incluir aleatoriamente o empíricamente o sistémicamente modificar la proteasa seleccionada (en regiones dirigidas y/o a lo largo de la longitud), y repetir (en una, dos, tres, cuatro o más rondas) el método de contactar la colección de proteasas con uno o más polipéptidos que atrapan proteasas. Los métodos proporcionados en la presente, pueden ser multiplexados , tal como incluyendo dos o más polipéptidos que atrapan proteasas diferencialmente etiquetado o diferencialmente identificables . En los métodos proporcionados en la presente, no es necesario que el polipéptido que atrapa proteasa exhiba 100% o aún muy alta eficiencia en la reacción complexada tan pronto como al menos un porcentaje detectable, típicamente al menos 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 o más, pueda formar un complejo estable que puede ser separado o de otro modo identificado de entre complejos menos estables o polipéptidos que atrapan proteasas sin reaccionar. De este modo, las proteasas pueden ser seleccionadas en donde ocurre la división en la reacción en la cual, existe más de 100% de inhibición por el polipéptido que atrapa proteasa, a tal como por ejemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o más inhibición de la reacción catalizada por proteasa. En los métodos proporcionados en la presente, la rigurosidad de la selección y otros parámetros, puede ser modulada, tal como controlando el tiempo de reacción, temperatura, pH, intensidad iónica, y/o concentraciones de sustrato y biblioteca. Las restricciones de especificidad también pueden ser moduladas durante la selección, incluyendo competidores tales como por ejemplo, competidores específicos que contienen una secuencia desdoblada de sustrato indeseada o clases más amplias de competidores, tales como por ejemplo, plasma humano. El método proporcionado en la presente, también puede ser realizado contactando una colección de proteasas con un polipéptido que atrapa proteasas o mezclas de diferentes polipéptidos que atrapan proteasas tales como por multiplexado . En donde se usa una pluralidad de diferentes proteasas que atrapan proteasas, cada polipéptido que atrapa proteasa puede ser individualmente e indistintamente etiquetada, de manera que puede ser detectado identificablemente . Tal método permite el aislamiento e identificación de proteasas múltiples de una colección de proteasas en una reacción única. Los métodos proporcionados en la presente, permiten colecciones de proteasas ser seleccionadas una vez para identificar aquellas que tienen una especificidad de sustrato deseada o predeterminada. Las colecciones de proteasas incluyen, cualquier colección de proteasas, que incluyen colecciones de varias proteasas de tipo nativa, proteasas modificadas, mezclas de las mismas, y también porciones de las mismas proteoliticamente activas. Cualquier colección puede ser empleada. Las colecciones también pueden ser elaboradas como una serie de proteasas mutantes, o porciones de las mismas proteoliticamente activas que contienen la mutación. Tales colecciones incluyen, colecciones combinatoriales en las cuales, miembros en la colección contienen mutaciones diversas. La mutación puede ser aleatoria a lo largo de la longitud de una proteasa (o porción de la misma catalíticamente activa) , o puede ser dirigida a una posición o región particular, tal como por ejemplo, el paquete de especificidad de enlace de la proteasa. Los métodos proporcionados en la presente, pueden identificar y descubrir residuos sin contacto no previamente apreciados por estar involucrados como determinantes de especificidad (es decir, residuos enterrados). Por lo tanto, el método de tecnología de selección de proteasa proporcionado en la presente, puede ser usado para crear proteasas con especificidades completamente nuevos y/o optimizar la especificidad o actividad de una carga de proteasa existente .

C. POLIPEPTIDOS QUE ATRAPAN PROTEASAS Un polipéptido que atrapa proteasa usado en los métodos proporcionados en la presente, es un polipéptido, o una porción de polipéptido que contiene un sitio reactivo, que sirve como un sustrato para una proteasa que, después del desdoblamiento, resulta en la formación de un complejo intermediario de proteasa-sustrato, que es estable. En general, tal polipéptido que atrapa proteasa es uno que requiere el desdoblamiento de un enlace desdoblable (PIPI' ) por la proteasa para proporcionar la generación de un complejo de sustrato-proteasa atrapado. El complejo estable es típicamente un complejo irreversible formado a través de las interacciones herméticas entre la proteasa y el polipéptido que atrapa proteasa, tal como debido a los enlaces covalentes, iónicos, hidrofóbicos u otros herméticos. Como tal, el complejo es en general, estable por horas, días, semanas o más, con ello permitiendo el aislamiento del complejo. En un ejemplo, el complejo intermediario estable puede ser un intermediario de enzima acilo que se forma después de la reacción de una serina o cisteína proteasa con un polipéptido que atrapa proteasa. Más usualmente, después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasa, un cambio conformacional rápido en el complejo, distorsiona la proteasa y previene la desacilación del complejo de enzima acilo. De este modo, las proteasas ampliadas con polipéptidos que atrapan proteasas, permiten la selección de la etapa que limita la relación de catálisis (es decir, desdoblamiento del enlace Pl-Pl' y acilación de la enzima), mientras al mismo tiempo forman complejos muye herméticos (es decir, covalentes) , que son fácilmente aislados de las mezclas de colección. Típicamente, tales polipéptidos que atrapan proteasas son grandes (más de 100 aminoácidos) , proteínas de dominio único que contienen una secuencia de sitio reactivo reconocida por una proteasa. En general, la secuencia de desdoblamiento de sitio reactivo es parte de un bucle reactivo más grande que es flexible, expuesto y largo, para hacerlo un sustrato objetivo (Otlewski et al., (2005) The EMBO J. 24:1303-1310), sin embargo, tan pronto como la trampa de proteasa contiene una secuencia de sitio reactivo que puede ser desdoblada por una proteasa, con ello, imitando el desdoblamiento de sustrato, puede ser usada en los métodos proporcionados en la presente. De este modo, cualquier polipéptido grande o polipéptido sintéticamente producido que contiene un enlace desdoblable desdoblado por una proteasa que resulta en el atrapamiento de una proteasa en un complejo estable, duradero, puede ser usado en los métodos proporcionados en la presente. Ejemplares de tales polipéptidos que atrapan proteasas son serpinas, tales como cualquiera de los descritos en la presente. Otros polipéptidos que atrapan proteasas, también pueden ser usados en los métodos proporcionados aquí, tal como cualquiera de aquellos mecanismos de acción que son similares a aquellos de las moléculas serpinas. Estos incluyen, por ejemplo, moléculas similares a serpinas sintéticas o recombinantemente generadas, o polipéptidos que contienen fragmentos o secuencias contiguas de una molécula serpina que incluyen, una porción suficiente de un bucle de sitio reactivo de una molécula serpina. Además, otros inhibidores de proteasa cuyo mecanismo de inhibición es similar a aquellos de las serpinas, pueden ser usados, tal como por ejemplo, la proteina de baculovirus p35 que inhibe la caspasa (Xu et al. (2001) Nature, 410:494-497; Otlewski et al (2005) The EMBO J. 24: 1303-1310). Otros polipéptidos que atrapan proteasas incluyen cualquiera que atrapa una proteasa en un complejo estable que puede ser fácilmente aislado, tal como pero no limitado a, alfa 2-macroglobulina . 1. SERPINAS: Estructura, Función y Expresión de Serpinas Las serpinas (inhibidores de serina proteasa) , son inhibidores de proteasa que son moléculas de proteina grandes (aproximadamente 350-500 aminoácidos), comparadas con otros inhibidores de serina proteasa que son normalmente de aproximadamente menos de 60 aminoácidos. La superfamilia serpina es la más grande y más ampliamente distribuida de inhibidores de proteasa. Más de 1,500 miembros de la familia de serpinas han sido identificados a la fecha en una variedad de animales diferentes, poxvirus, plantas, bacterias y arcaes (Law et al. (2006) Genome Biology, 7:216), con más de treinta diferentes serpinas humanas estudiadas hasta ahora. La mayoría de serpinas humanas se encuentran en la sangre, en donde funcionan en un amplio intervalo de papeles regulatorios que incluyen, por ejemplo, cascada inflamatoria, complemento, coagulación y fibrinoliticas . Las serpinas también funcionan intracelularmente para realizar papeles citoprotectores, tales como por ejemplo, regulando la liberación inapropiada de proteasas citotóxicas. Aunque la mayoría de las serpinas tienen un papel inhibidor en la actividad de la proteasa, algunas serpinas realizan otros papeles no inhibidores tales como, pero no limitado a, transporte de hormona, globulina de enlace corticoesteroide, y regulación de la presión sanguínea (Silverman et al (2001) JBC, 276: 33293-33296) . Entre las serpinas no inhibidoras están globulinas de enlace esferoide y ovoalbúmina. Típicamente, las serpinas inhiben la acción de serina proteasas, aunque varias serpinas han sido identificadas que son inhibidores de proteasas o caspasas de cisteína similares a papaína ( hisstock et al (2005) FEBS Journal, 272: 4868-4873). La identidad de secuencia entre los miembros de la familia serpina es débil, sin embargo, sus estructuras son altamente conservadas. Por ejemplo, miembros de la familia serpina portan aproximadamente 30% de homología de secuencia de aminoácido con la serpina alfa 1-antitripsina y tienen una estructura terciaria conservada. Estructuralmente, las serpinas son elaboradas de hasta tres láminas ß (A, B y C) y 8-9 a-hélices (A-I), las cuales son organizadas en un dominio de barril-ß superior y un dominio helicoidal inferior. Los dos dominios son puenteados por las cinco láminas A de hebra B, las cuales son característica estructural principal de serpinas (Huntington et al (2003) , J. Thrombosis and Haemostasis, 1:1535-1549). Las serpinas son proteínas metaestables de manera que son solamente parcialmente estables en su forma activa; requieren que las proteasas adopten una conformación completamente estable. Un bucle, llamado el bucle de sitio reactivo (RSL) , es responsable de la conformación alterada de la molécula serpina. El RSL es un estiramiento expuesto de aproximadamente 17 residuos de aminoácidos que sobresalen de la parte superior de la molécula en una región entre las láminas-ß A y C. El RSL sirve como el sitio de reconocimiento de proteasa, y en general, contiene las únicas determinantes de especificidad de proteasa. La forma más estable de la estructura serpina es la forma desdoblada RSL. Después del desdoblamiento de proteasa, la porción amino terminal del RSL se inserta en el centro de la lámina-ß A para llegar a ser la hebra cuatro de las láminas ß de seis hebras. Este cambio conformacional es llamado la transición "estresada" o "relajada" (o S a R) . Esta transformación es caracterizada por un incremento en la estabilidad térmica de la molécula debido a la reorganización de la lámina-ß A de cinco hebras a una forma anti-paralela de seis hebras (Lawrence et al (2000), J Biol. Chem., 275: 5839-5844). En otras palabras, la estructura nativa de las serpinas es equivalente a un intermediario latente, el cual es solamente convertido a una estructura más estable después del desdoblamiento de la proteasa (Lawet al (2006) Genome Biology, 7:216). Típicamente, las serinas proteasas dirigen serpinas, aunque algunas serpinas inhiben las cisteínas proteasas usando un mecanismo similar. El bucle RSL determina cuales proteasas son dirigidas para inhibición, cómo se proporciona un pseudo-sustratb" para la proteasa objetivo. En efecto, la especificidad inhibidora de una serpina particular es mediada por la secuencia RSL, la cual es la región más variable entre las serpinas (Travis et al (1990) Biol. Chem. Hoppe Seyler, 371:3-11). El RSL imíta la secuencia de ¦ reconocimiento de sustrato de una proteasa y con ello, . contiene un sitio reactivo numerado como Pn-P-¡-p2-??-??' -Pi' -?z' -P3' -P' n..., en donde el sitio reactivo es el enlace' desdoblable entre Px y Px' . Para al-antritripsinas maduras, el desdoblamiento en el enlace Pl-Plf,- ocurr en el enlace Met358-Ser359 ' (que corresponde a los aminoácidos Met382 y Ser389 de la secuencia de aminoácidos- -expuestas en la SEC ID NO:l). El sitio de enlace correspondiente para ios residuos en las proteasas son: Sn-S3~S2-Sr-Si ' ,' ¿'2 ' SÍ', SN'-... En el método proporcionado en la presente, la modificación de la secuencia RSL se hace para seleccionar proteasas de una biblioteca de exhibición que exhibe especificidad de sustrato alterada, como se discute en detalle abajo. 2. Catálisis de Proteasa, Mecanismo Inhibidor de Serpinas, y Formación de Intermediario de Enzima Acilo El método de selección de proteasa proporcionado en la presente, explota la capacidad de los polipéptidos para atrapar proteasas, tal como se ejemplifica por serpinas, para identificar proteasas con especificidad de sustrato alterada. .Los mecanismos de catálisis de proteasa difieren ligeramente entre clases de enzimas proteoliticas : serina, cisteina, aspártico, treonina o metalo-proteasas . Por ejemplo, las serpina peptidasas tienen un residuo serina involucrado en el centro activo, el aspártico tiene dos ácidos aspárticos en el centro catalítico, las peptidasas tipo cisteina, tienen un residuo de cisteina, las peptidasas de tipo treonina tienen un residuo treonina, y las metalo-peptidasas usan un ión metálico en el mecanismo catalítico. En general, aquellas familias de proteasas que forman intermediarios covalentes son el objetivo del método de selección de proteasa proporcionado en la presente. Estas incluyen por ejemplo, miembros de la familia de serina y cisteina proteasa. Como un ejemplo de serinas proteasas, la primera etapa en la catálisis es la formación de un intermediario de enzima acilo entre el sustrato y la serina en el centro catalítico de la proteasa. La formación de este intermediario covalente procede a través de un intermediario de estado de transición tetrahédrico negativamente cargado y después, el enlace peptídico Pl-Pl' del sustrato es desdoblado. Durante la segunda etapa o desacilacion, el intermediario de enzima acilo es hidrolizado por una molécula de agua para liberar el péptido y restaurar el Ser-hidroxilo de la enzima. La desacilacion, la cual también involucra la formación de un intermediario de estado de transición tetrahédrico, procede a través de la trayectoria de reacción inversa de acilación. Por desacilacion, una molécula de agua es el nucleófilo de ataque en lugar del residuo Ser. El residuo His en el centro catalítico de una serina proteasa, proporciona una base general y acepta el grupo OH del Ser reactivo . Las serpinas inhiben la reacción de catálisis de tanto proteasas serina como cisteina objetivo, usando la transición S a R como se menciona anteriormente. Su mecanismo de acción es único entre los inhibidores de proteasa destruyendo el sitio activo de la proteasa antes de los procesos de desacilacion, con ello, impidiendo irreversiblemente la proteólisis después de la formación 3 del intermediario de enzima acilo (Otlewski et al (2005) The EMBO Journal, 24: 1303). El modelo cinético de la reacción de una serpina con una proteasa, es idéntico a aquel de la proteólisis de un sustrato (véase por ejemplo, Figura 1; Zhou et al. (2001) J. Biol . Chem. , 276: 27541- 27547). Después de la interacción con una proteasa objetivo, la serpina inicialmente forma un complejo similar a Michaelis no covalente a través de las interacciones de residuos en el RSL que flanquea el enlace desdoblable PI¬ PI' (Silverman et al. (2001), J. Biol. Chem., 276: 33293- 33296) . El residuo serina (para serinas proteasas) , en el sitio activo de la proteasa, ataca el enlace Pl-Pl' , facilitando el desdoblamiento del enlace peptidico y formación de un enlace éster covalente entre el residuo serina y la estructura carbonilo del residuo Pl. Después que el RSL es desdoblado, el RSL se inserta en la ß-lámina A de la molécula serpina. El primer residuo para insertar es P14 (es decir, aminoácido 345 en la al-antitripsina madura, el cual corresponde a la posición de aminoácido T369 en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:l), y es seguido por la región de articulación flexible (P15-P9) del RSL (Buck et al. (2005) Mol. Biol. Evol., 22: 1627-1634). La inserción del RSL transporta la proteasa covalentemente unida con ésta, resultando en un cambio conforraacional de la proteasa, caracterizado por un sitio activo distorsionado (véase Figura 1), asi como también una transición de la serpina en un estado "relajado". El cambio conformacional de la proteasa altera la triada catalítica del sitio activo, de manera que la cadena lateral Pl es removida del paquete SI. El resultado neto de los reacomodos conformacionales es el atrapamiento del intermediario de enzima acilo (Silverman et al. (2001), J. Biol. Chem. , 276: 33293-33296). La formación de cualquier encima acilo es importante a la interacción de serpina, y por lo tanto, las serpinas son típicamente específicas para clases de proteasas que tienen intermediarios de enzima acilo en la catálisis. Entre estas clases de proteasas están miembros predominantes de la familia de serina proteasa que incluyen, aquellos en la superfamilia de quimiotripsina y aquellos en la superfamilia subtilisina de proteasas, los cuales son descritos en más detalle abajo. Adicionalmente, las serpinas también son reactivas contra cisteínas proteasas que incluyen, por ejemplo, aquellas en la familia papaína y la familia caspasas de serina proteasa. Típicamente, las serpinas no inhiben las proteasas de metalo-treonina, o familias aspárticas. Por ejemplo, las interacciones de serpinas con metaloproteasas no resultan en un intermediario atrapado covalente, sino en su lugar, la metaloproteasa desdobla el inhibidor sin la formación de cualquier complejo (Li et al (2004) Cáncer Res. 64: 8657-8665) . De este modo, aunque la mayoría de las serpinas inhibe las serpina proteasas de la familia de quimiotripsinas, los inhibidores de clase cruzada existen que inhiben la cisteína proteasa. Entre los inhibidores de clase cruzada están la serpina viral CrmA y PI9 (SEPRINB9) , que inhibe tanto caspasas 1, como SCCAl (SERPINB3) , que inhiben las cisteínas proteasas como papaína que incluyen, catepsinas L, K y S. El mecanismo de inhibición mediado por serpina de serinas proteasas, parece ser adaptado a cisteínas proteasas también. La diferencia sin embargo, es que el intermediario cinéticamente atrapado es un tioéster en lugar de un oxi éster como es el caso de serina proteasas (Silverman et al (2001) J. Biol. Chem. , 276:33293-33296). La existencia de un enlace de tipo tiol éster covalente, estable, es soportada por la detección de un complejo estable SDS entre SCCAl y catepsina S (Silverman et al (2001) J. Biol. Chem., 276:33293-33296; Schick et al. (1998) Biochemistry, 37:5258-5266). El par serpina-proteasa es altamente estable por semanas hasta años, dependiendo del par de serina-proteasa , sin embargo, la disociación eventualmente ocurrirá para proporcionar los productos de proteolisis normal (es decir, serpina desdoblada y la proteasa activa; véase por ejemplo, Zhou et al. (2001) J. Biol. Chem. , 276: 27541-27547). Además, si el bucle RSL no es insertado lo suficientemente rápido en la proteasa, la reacción procede directamente al producto desdoblado. Este fenómeno es llamado división y refleja la existencia de una trayectoria ramificada que puede ocurrir que conduce a ya sea un complejo inhibidor estable o cambio de la serpina en un sustrato, tal como se representa en la Figura 1, como la formación de un complejo inhibido contra la trayectoria no inhibidora (Lawrence et al., (2000), J. Biol. Chem., 275: 5839-5844). La división-de una serpina puede ser modulada cambiando residuos en el bucle RSL, particularmente en la región de articulación del RSL, el cual inicia la inserción del bucle (es decir, P14), o alternado la proteasa por la cual la serpina interactúa óptimamente. Por ejemplo, la actividad inhibidora del inhibidor-1 del activador del plasminogeno de serpina (PAI-1) , difiere entre las proteasas uPA, tPA y trombina, con una preferencia dirigida para uPA y tPA. Además, la variación del bucle RSL a, por ejemplo, la posición P14 de la región articulada, altera la preferencia dirigida de PAI-1: mutación a aminoácidos cargados (es decir Arg, Lys, Asp, Glu) , reduce la actividad inhibidora de PAI-1 a cada uno de uPA, tPA y trombina; mutación a aminoácidos neutrales (es decir, His, Tyr, Gln, Asn) o a Gly, el cual carece de una cadena secundaria que resulta en una actividad inhibidora reducida 10-100 veces de PAI-1 a tPA y trombina, comparada con uPA; y la mutación a aminoácidos hidrofóbicos no cambia la actividad inhibidora de PAI-1, comparada con el PAI-1 de tipo nativo (Lawrence et al. (2000), J. Biol. Chem., 275: 5839- 5844). Un factor importante en el éxito de la inhibición mediada por serpina de catálisis de proteasa, es la longitud del bucle RSL, el cual debe ser una longitud precisa para asegurar que la serpina y proteasa interactúan en una forma que proporcionan una palanca entre el cuerpo de la serpina y la proteasa para permitir el desplazamiento de la serina catalítica a partir del sitio reactivo, y la deformación de la proteasa (Zhou et al. (2001) J. Biol. Chem., 276: 27541-27547; Huntington et al. (2000) Nature, 407:923-926). En efecto, la proteasa es aplastada contra el cuerpo de la serpina. La mayoría de las serpinas tienen un RSL que es de 17 residuos de longitud, mientras solamente algunos han sido identificados con bucles de 16 residuos (es decir, ot2-antiplasmina, inhibidor Cl y CrmA) . Una serpina variante a2-antiplasmina, que tiene un bucle de 18 residuos, también ha sido identificada de un paciente con un trastorno por sangrado, aunque esta variante no es una serpina inhibidora funcional (Zhou et al. (2001) J. Biol. Chem., 276: 27541-27547). De este modo, el mecanismo inhibidor de serpina puede acomodar un acortamiento, pero no estiramiento, del RSL (Zhou et al. (2001) J. Biol. Chem. , 276: 27541-27547). Además de una conservación de longitud de bucle entre los miembros de la familia serpina, el RSL de las serpinas también retiene en general, una composición de región articulada conservada (P15-P9), y no contiene típicamente, residuos P voluminosos o cargados. a. Serpinas Ejemplares Las serpinas usadas en el método proporcionado en la presente, pueden ser cualquier polipéptido de serpina, que incluye pero no se limita a, polipéptidos recombinantemente producidos, polipéptidos sintéticamente producidos y serpinas extraídas a partir de células, tejidos y sangre. Las serpinas también incluyen variantes alélicas y polipéptidos de diferentes especies que incluyen, pero no se limitan a, animales de origen humano y no humano, poxivurs, plantas, bacterias y arcaes. Típicamente, una variante de especies o alélicas de una serpina, difiere de una serpina de tipo natural o nativa, por aproximadamente o al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. Las serpinas humanas incluyen cualquier serpina proporcionada en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 abajo) , isoformas variantes alélicas, moléculas sintéticas de ácidos nucleicos, proteínas aisladas de tejidos humanos, células o sangre, y formas modificadas de cualquier polipéptido de serpina humana. Las serpinas también incluyen fragmentos de polipéptido truncados, tan pronto como una porción suficiente del bucle RSL está presente para mediar la interacción con una proteasa y formación de un intermediario de enzima acilo covalente. coagulación de sangre, fíbrinólisis y la generación de quininas ; inhibidor de esterasa C 1 SERPINA A5 inhibidor de serina IPSP, inhibe la P05154 20-406 8 proteasa de plasma, PAI-3 proteína C inhibidor de activada y proteína C activadores del plasminógeno SERPINA A4 calistatina AIN inhibe las P29622 21-427 9 , PI4 actividades amidoliticas y quinogenasa de calicreína de tejido humano SERPINA ? Neuroserpina NEUS Formación o Q99574 17-410 10 , PII2 reorganización de conexiones sinópticas y plasticidad sináptica; inhibidor de tPA, uPA, y plasmina SERPBMA I inhibidor-1 PAI1 Regulación de P05121 24-402 1 1 activador del fíbrinólisis; plasminógeno inhibidor de trombina, uPA, tPA y plasmina SERPI A 12 inhibidor de serina PII4 inhibición de 075830 19-405 12 proteinasa metástasis de derivada de cáncer mioepitelio SE PI A 10 inhibidor de ZP1 inhibe el factor Z Q9UK.55 22-444 13 pioteasa y XI dependiente de la proteína Z SERPINA 2 pioteasa ne ina I, PI7, inhibición de P07093 20-398 14 precursor nexina GDN, uPA y tPA derivado de la glía PN-1 Serpinas SERPINA Bl inhibidor de ILEU inhibición de P30740 1 -379 15 inhibidoras elastasa de pioteasa del intra- leucocito, inhibidor neutrófilo celulares de elastasa del neutrófilo de monocitos SERPINA B2 inhibidor-2 PAI2 activador del P05120 1-415 16 activador del plasminógeno plasminógeno tipo tejido, señalización inrracelular; inhibición de uPA SERPINA B6 Placental PTI6 Inhibe P35237 1-376 17 inhibidor de rrombina rrombina SERPINA Bomapina SB10, hematopoyesis, P48595 1-397 18 B10 P1 10 inhibición de rrombina y tripsina SER PIN A epipina SB1 1 Q96P15 1 -392 19 BU SERPI A Yukopina SB 12 inhibe tripsina y Q96P63 1-405 20 B12 pías mina SERPINA Headpina SB13, proliferación o Q9UIV8 1 -391 21 B13 Pl 13 diferenciación de queratinocitos, inhibición de catepsinas L y K SERPINA B3 antígeno I de SCC1 modula la respuesta P29508 1 -390 22 carcinoma de inmune hacia células escamosas tumores, inhibición de catepsinas L, K, S y V, y papaina SERPINA B4 antígeno 2 de SCC2 modula la P48594 1-390 23 carcinoma de respuesta inmune células hacia tumores, escamosas inhibición de catepsina G y quimasa SERPINA B7 Megsina SPB7 maduración de 075635 1 -390 24 megacariocitos SERPINA B8 antiproteinasa 8 SPB8, inhibición de P50452 1-374 25 citoplásinica PI8 furina SERPINA B9 antiproteinasa 9 SPB9, inhibidor de P50453 1 -376 26 citoplásmica PI9 Granzima B SERPINA B6 inhibidor-6 de PI6, inhibición de P35237 1 -376 27 proteinasa, PTI catepsina G, inhibidor de inhibe la rrombina rrombina placenta! serpinas no SERPINA A8 angiotensinógeno ANG regulación de la P01019 34-485 28 inhibidoras T presión sanguínea, precursor de la hormona SERPINA A6 globulina de enlace CBG portador hormonal P08185 23-405 29 corticoesteroide (glucocorticoides y progestinas), enlace a cortisol SERPINA Hl proteína de golpe HS47 chaperona P29043 18-417 30 de calor 47 kDa molecular para colágeno SERPINA Fl factor derivado del PEDF induce P36955 20-418 31 epitelio del diferenciación pigmento neuronal en células de retinoblastoma; inhibidor de angiogénesis SERPI A B5 Maspina MAS supresor de P36952 1-375 32 P tumor, previene la metástasis SERPINA H2 proteína 2 de SIH2 chaperona P50454 19-418 33 enlace a colágeno molecular para colágeno SERPINA A7 proteína de enlace THB transporte de la P05543 21 -415 34 a tíroxina G hormona tiorides, enlace a tiroxina SERPI A A9 célula B central GCET mantenimiento de Q86WD7 24-417 35 germinal expresada 1 células B nai've en la proteina del transcripto- 1 SERPINA A12 Vas pina adipocitocina Q8IW75 21-414 36 sensibilizante a la insulina SERPINA A1I Q86U 17 20-422 37 SERPI A A13 Q6UXR4 22-307 38 Típicamente, una serpina usada en el método proporcionado en la presente, es una serpina inhibidora o fragmento de la misma, capaz de formar un intermediario de enzima acilo covalente intermediario entre la serpina y proteasa. En general, tal serpina es usada para seleccionar proteasas normalmente dirigidas por la serpina, en donde ocurre el cierre a la inhibición completa de la proteasa, y la división se minimiza entre el complejo inhibidor y el sustrato de serpina desdoblado. La Tabla 3 representa ejemplos de serinas proteasas y sus inhibidores serpina cognatos . Tales pares de serpina/proteasa, se espera tengan una constante de asociación alta o contante de relación de segundo orden de inhibición y baja o ninguna división en un complejo no inhibidor. Por ejemplo, el inhibidor fisiológico principal de t-PA es la serpina PAI-1, una glicoproteina de aproximadamente 50 kD (Pannekoek et al. (1986) EMBO J, 5:2539-2544; Ginsberg et al, (1980) J. Clin. Invest., 78:1673-1680; and Carrell et al. In: Proteinase Inhibitors, Ed. Barrett, A.J. et al., Elsevier, Amsterdam, páginas 403-420 (1986) . Otros pares de serpina/proteasa, también pueden ser usados en los métodos proporcionados en la presente, sin embargo, aún en donde las constantes de asociación son inferiores y la división es superior. Por ejemplo, aunque las constantes de asociación de otras serpinas, tales como inhibidor de esterasa Cl y alfa-2-antiplasmina con tpA son órdenes de magnitud inferior que aquellos de PAI-1 (Ranby et al. (1982) Throm. Res., 27:175-183; Hekman et al. (1988) Arch. Biochem. Biophys . , 262:199-210) , estas serpinas sin embargo, inhiben el tPA (véase por ejemplo, Lucore et al. (1988) Circ. 77:660-669).

TABLA 3: Serina proteasa Inhibidor de serpina cognato Proteína C activada Inhibidor de proteína C PAI-1 Esterasa Cl Inhibidor de esterasa Cl Catepsina G Alfa-l-antitripsina Quimasa Alfa-l-antiquimiotripsina Quimiotripsina Alfa-l-antiquimiotripsina Alfa-2-antiplasmina contrapsina Factores de coagulación Antitrombina III (Vlla, Xa, Xla, Xlla) Inhibidor de esterasa Cl Elastasa Alfa-l-antitripsina Calicreína Inhibidor de esterasa Cl Alfa-l-antitripsina Plasmina Alfa-2-antiplasmina Trombina Antitrombina III Cofactor de heparina II uPA PAI-1, PAI-2, PAI-3, Tripsina Alfa-l-antitripsina Proteína regulada por la hormona de crecimiento Proteasa similar a Proteasa nexina I tripsina u-PA PAI-1, PAI-2, PAI-3 De este modo, en general, una serpina usada para selección de una proteasa en los métodos proporcionados en la presente,' proporciona un producto de reacción en donde 80%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% del producto de reacción, es la formación del complejo inhibidor. En algunos casos, sin embargo, la división incrementada entre una serpina y proteasa puede ocurrir en los métodos proporcionados en la presente, de manera que si la serpina usada en el método no dirige óptimamente la proteasa. De este modo, en el método proporcionado en la presente, una serpina puede ser usada para seleccionar una proteasa en donde la reacción resultante conduce a, o a aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, o más de un complejo inhibidor estable y el producto restante es un sustrato de serpina desdoblado. Los factores que pueden ser alterados para optimizar la selección de proteasa en donde ocurre la división incluyen, por ejemplo, concentración incrementada de serpina y tiempo de reacción incrementado. En algunos casos, otras serpinas no inhibidoras, o mutantes de las mismas como se discute abajo, pueden ser usadas en los métodos proporcionados en la presente, tan pronto como la proteasa objetivo para selección, sea capaz de interactuar con el sustrato serpina para proporcionar el complejo inhibidor covalente que puede ser capturado. i. PAI-1 Ejemplares de serpinas usadas en los métodos de selección de proteasas están el inhibidor-1 activador del plasminogeno (PAI-1), o variantes de los mismos. El PAI-1 es el inhibidor principal del activador del plasminogeno de tejido (t-PA) y activador de plasminogeno urinario o urocinasa (u-PA) , los cuales son proteasas involucradas en la fibrinólisis debido a la activación del plasminogeno. El PAI-1 tiene una constante de relación de segundo orden para t-PA y u-PA de aproximadamente 2 X 107 M"1s"1. El PAI-1 está involucrado en la invasión del tumor, fibrinólisis, migración celular, remodelación de tejido, involución del tejido, ovulación, inflamación, invasión de trofoblasto y transformación maligna (Salonen et al. (1988) J Biol. Chem., 264: 6339-6343). El PAI-1 es principalmente producido por el endotelio, pero también es secretado por otros tipos de tejidos, tales como por ejemplo, el tejido adiposo. Otros inhibidores activadores del plasminógeno relacionados incluyen, PAI-2 y PAI-3. El PAI-2, por ejemplo, también es un inhibidor de u-PA y t-PA, pero es secretado por la placenta y típicamente está solamente presente en altas cantidades durante el embarazo. El PAI-1 es una glicoproteína de cadena única que tiene una secuencia precursora expuesta en la SEC ID NO: 11, que incluye una secuencia señal de 23 aminoácidos, los cuales cuando se desdoblan, resultan en una secuencia madura de 379 aminoácidos. Como otras serpinas, PAI-1 transita de una forma latente en una forma activa después del desdoblamiento por una proteasa en su sitio reactivo Pl-Pl' localizado en Arg346-Met347 (es decir, que corresponden a los aminoácidos Arg369 y Met370 de una secuencia precursora expuesta en la SEC ID NO: 11), con ello, resultando en la formación de un complejo covalente estable y la activación de la proteasa unida. Distinto de otras serpinas, sin embargo, PAI-1 adopta una transición latente espontáneamente que resulta en una forma inactiva, altamente estable pero covalentemente intacta con ello, los residuos P15 a P4 del inserto RSL en la ß-lámina A, forma cuatro hebras de la lámina-ß (es decir, s4A) , y los residuos P3 a PIO' , forman un bucle extendido en la superficie de la molécula (De Taeye et al. (2003) J Biol. Chem., 278: 23899-23905). De este modo, el PAI-1 activo es relativamente inestable a 37°C, exhibiendo una vida media de solamente 2.5 horas antes de la conversión espontánea a una conformación latente. Esta forma latente, sin embargo, puede ser re-activada por desnaturalización, tal como por desnaturalización con dodecil sulfato de sodio, cloruro de guanidinio y urea (Declerek et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 11693-11696), y calor (Katagiri et al. (1988) Eur J. Biochem. , 176:81-87). La forma active de PAM también es estabilizada por interacción con vitronectina . El PAI-1 mutante ha sido identificado que es inestable para someterse a conversión a una conformación latente y son por lo tanto, más estables a temperatura y pH elevado por periodos de tiempo prolongados (véase por ejemplo, ' Berkenpas et al. (1995) The EMBO J. , 14:2969-2977). Las modificaciones de serina proteasas (es decir, t-PA o u-PA) y/o la serpina inhibidora (es decir, PAI-1), han sido elaboradas para modular o alterar las constantes de relación secundarias de inhibición, para asi hacer proteasas resistentes a la inhibición por su inhibidor serpina cognato, o variante de la misma, tal como para uso en aplicaciones terapéuticas, en donde la actividad de la proteasa de tipo nativa se desea (véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Series Nos. 5,866,413; 5,728,564; 5,550,042; 5,486602; 5,304,482). ii . Antitrombina (AT3) Otra serpina ejemplar, o variante de la misma para uso en los métodos descritos en la presente, es la antitrombina (AT3) . La AT3 también es un miembro de la familia serpina e inactiva un número de enzimas, que incluyen por ejemplo, aquellas del sistema de coagulación tal como, pero no limitado a, Factor X, Factor IX, Factor II (trombina), Factor VII, Factor XI, y Factor XII. Típicamente, la antitrombina es predominantemente encontrada en la sangre, en donde por ejemplo, previene o inhibe la coagulación bloqueando la función de la trombina. La actividad de AT3 es incrementada por la presencia de uno o más cofactores, típicamente heparina. Después de la interacción con heparina, AT3 se somete a reacomodo conformacional involucrando explosión de bucle lejos de la estructura de serpina y exposición de Pl que resulta en una estructura AT3 que tiene una conformación accesible a la proteasa expuesta. Además, la heparina puede enlazarse a tanto la proteasa como el inhibidor con ello, acelerando el mecanismo inhibidor (Law et al. (2006) Genome Biology, 7 (216) : 1-11) . La secuencia de gen para AT3 codifica para un sexto exón que recorre el ADN, codificando una proteína precursora expuesta en la SEC ID NO: 5. El desdoblamiento de la secuencia señal que corresponde a los aminoácidos 1-32 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 5, resulta en una proteína madura de 432 aminoácidos, que tiene un peso molecular de aproximadamente 58,000 daltons. Seis de los aminoácidos son cistinas, los cuales resultan en la formación de tres enlaces disulfuro intramoleculares. Las posiciones P4-P2' en el RSL de AT3, contienen los residuos de aminoácido IAGRSL (SEC ID NO:478), los cuales corresponden a los aminoácidos 422-427 en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 5, en donde el desdoblamiento al sitio reactivo Pl-Pl' , ocurre entre los aminoácidos Arg425-Ser426. 3. Otros polipéptidos que atrapan proteasas Los polipéptidos que atrapan proteasas adicionales, son conocidos en la técnica, o pueden ser identificados que exhiben un mecanismo de inhibición similar a serpinas (por ejemplo, desdoblamiento del sustrato objetivo por una proteasa que produce un intermediario estable y un cambio conformacional en la estructura de la proteasa) . Tales polipéptidos que atrapan proteasas están contemplados para uso en los métodos proporcionados en la presente. Ejemplares de tales polipéptidos que atrapan proteasas son p35. Además, cualquier otra molécula que es desdoblada por una proteasa que resulta en el atrapamiento de una proteasa en un complejo estable, duradero, puede ser usada en los métodos proporcionados en la presente. a . p35 Por ejemplo, la proteina p35 del baculovirus (SEC ID NO: 473), la cual es un inhibidor de caspasa de amplio espectro, puede inhibir las caspasas en esta manera (Xu et al (2001) Nature 410:494-497; Xu et al (2003) J. Biol. Chem. 278 (7) : 5455-5461) . El desdoblamiento del enlace ??-Pi' de p35 (en el sitio de desdoblamiento de caspasa DQMD87) por caspasas, produce un intermediario de tioéster covalente entre el segmento amino del bucle p35 (Asp87) y el residuo de cisteina de la triada catalítica de caspasa (Cys350 en caspasa-8) . Después de la formación del enlace tioéster, la proteasa se somete a un cambio conformacional permitiendo al segmento amino del bucle desdoblado, enterrarse en la caspasa, mientras el N-término de p35 que contiene un residuo Cys en la posición 2 se inserta en el sitio activo de la caspasa, de este modo bloqueando la accesibilidad del solvente del residuo His 317 en la caspasa-8. La inaccesibilidad a la molécula de agua hidrolitica, de este modo previene la hidrólisis subsecuente del enlace tioéster. Inhibidores de caspasa viral similares, además de p35, incluyen pero no se limitan a, p49 (SEC ID NO:491) y el gen de viruela vacuna CrmA de serpina (SEC ID NO: 492). El inhibidor p49, exhibe un mecanismo de inhibición a caspasa similar a aquel de p35 en que un enlace tioéster estable se forma con el sitio activo de la caspasa, después del desdoblamiento de la secuencia de reconocimiento de caspasa p49 TVTD94. Los sustratos objetivo para la selección usando los métodos proporcionados en la presente, pueden incluir un polipéptido inhibidor de la caspasa viral, tal como un polipéptido p35, p49 o CrmA. Los métodos para modificación del bucle RSL de serpinas proporcionados en la presente, pueden ser fácilmente adaptados para modificación de los polipéptidos inhibidores de la caspasa viral. Por ejemplo, el sitio objetivo para desdoblamiento en el RSL p35, puede ser modificado para seleccionar proteasas que tienen una reactividad o especificidad alterada para un sustrato objetivo. En p35 de tipo nativo, el reconocimiento de caspasa se encuentra en las posiciones de aminoácido 84-87 (DQMD87) . Las modificaciones a polipéptidos inhibidores de caspasa viral pueden de este modo, incluir modificaciones que alteran la secuencia de desdoblamiento y/o circundan los residuos de aminoácido. Por ejemplo, tales polipéptidos inhibidores de caspasa modificada, tales como por ejemplo un polipéptido p35, p49 o CrmA, pueden ser designados para imitar la secuencia desdoblada de un sustrato objetivo deseado, tal como por ejemplo, un sustrato objetivo involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. Cualquier modificación en la secuencia bucle de RSL de un polipéptido inhibidor de caspasa viral, puede hacerse en los métodos proporcionados en la presente. Los polipéptidos inhibidores de caspasa viral tales como un polipéptido p35, p49 o CrmA, usados en los métodos proporcionados en la presente, pueden ser cualquier polipéptido inhibidor de caspasa viral, que incluye pero no se limita a, polipéptidos producidos recombinantemente, polipéptidos producidos sintéticamente y polipéptido p35 o p49 producido por métodos de purificación de baculovirus. Los polipéptidos inhibidores de caspasa viral también incluyen variantes alélicas de polipéptidos, tales como variantes de polipéptido p35, p49 o CrmA. b. Alfa Macroglobulinas (aM) La familia alfa macroglobulina (aM) de proteasas incluye inhibidores de proteasas tales como el inhibidor alfa-2-macroglobulina de proteasa ejemplar (a2M; SEC ID NO: 90), y están contemplados para uso como trampas de proteasa en los métodos proporcionados en la presente. Moléculas aM inhiben todos los casos de proteasas. Las trampas de proteasa aM son caracterizadas por un mecanismo de inhibición similar que involucra desdoblamiento de una región de cebo del inhibidor por una proteasa. La región de cebo es un segmento que es susceptible a desdoblamiento proteolitico, y el cual, después del desdoblamiento, inicia un cambio conformacional en la molécula aM que resulta en el colapso de la estructura alrededor de la proteasa. Para la secuencia a2M ejemplar expuesta en la SEC ID NO: 90, la región de cebo corresponde a los aminoácidos 690-728. En el complejo estable de proteasa aM resultante, el sitio activo de la proteasa es estéricamente protegido, con ello, reduciendo el acceso a sustratos de proteasa normal. Típicamente, la trampa de proteasa permanece activa contra los sustratos peptídicos pequeños, pero pierde su capacidad para interactuar con sustratos de proteína grande o inhibidores. Además, moléculas aM son caracterizadas por la presencia de un tioléster reactivo, el cual inactiva la capacidad inhibidora por reacción del tioléster con aminas. Además, el cambio conformacional que ocurre después del desdoblamiento de la región cebo expone un dominio de enlace al receptor terminal COOH conservado (RBD) . La exposición de la secuencia RBD facilita la remoción del complejo de aM-proteasa de la circulación. 4. Competidores que atrapan proteasas Los competidores pueden ser usados en lo métodos proporcionados en la presente, para modular las restricciones de especificidad y selectividad de una proteasa seleccionada para un sustrato objetivo. Los competidores pueden ser contactados con la proteasa, o colecciones de las mismas, en cualquier tiempo, tal como antes o después del contacto de la proteasa con el polipéptido que atrapa proteasa deseado o el competidor y el polipéptido que atrapa proteasa puede ser contactado con la proteasa simultáneamente. Los competidores pueden ser competidores específicos o competidores amplios. Los competidores específicos son designados que imitan un sustrato no objetivo predeterminado y con ello, actúan como objetivos potenciales predeterminados. Típicamente, tales competidores no son etiquetados, de manera que los complejos de proteasa estable que forman no son seleccionados. Además, tales competidores son agregados en grandes cantidades, típicamente exceso molar, sobre el polipéptido que atrapa proteasa designado usado en el esquema de selección, de manera que los competidores se enlazan a las proteasas indeseadas en la colección. En un ejemplo de competición especifica, dos diferentes polipéptidos que atrapan proteasas, cada uno designado para imitar reconocimiento de sustrato diferente, son contactados con una colección de proteasas en donde solamente uno de los polipéptidos que atrapa proteasas es detectablemente etiquetado. Por ejemplo, un competidor puede incluir una trampa de proteasa de polipéptido que es designada para tener su sitio reactivo que imita la secuencia desdoblada de un sustrato no objetivo. De este modo, un competidor tal como una serpina, puede ser diseñado para tener sus residuos P4-P1' RLS recolocados por la secuencia de desdoblamiento de un sustrato no objetivo predeterminado. El competidor puede ser usado en los métodos en combinación con un polipéptido que atrapa proteasa, tal como por ejemplo, otro polipéptido de serpina, cuya secuencia RSL ha sido modificada para contener aminoácidos en las posiciones P4-P1' que imitan la secuencia de desdoblamiento de un sustrato objetivo predeterminado o deseado, y que es etiquetado para aislamiento del mismo. De este modo, ambos polipéptidos que atrapan proteasas se seleccionan de proteasas que exhiben selectividad para la secuencia desdoblada objetivo o no objetivo, pero solamente aquellos complejos de proteasa estable que exhiben la especificidad de sustrato objetivo deseado y que son detectablemente etiquetados, pueden ser aislados de la reacción. Otros ejemplos de competidores específicos incluyen, por ejemplo, el polipéptido que atrapa proteasas nativo para el cual el sitio reactivo ha sido modificado en los métodos proporcionados en la presente. El ejemplo 6 ejemplifica tal estrategia en donde una serpina AT3 purificada de plasma es usada como un competidor contra la serpina modificada AT3SLGR-Kl. Los competidores amplios también pueden ser usados en los métodos proporcionados en la presente, para restringir la selectividad y especificidad de proteasas seleccionadas. Ejemplos de competidores amplios incluyen, por ejemplo, plasma humano o suero humano, el cual contiene una variedad de inhibidores de proteasa naturales. Alternativamente, puede ser generada una biblioteca de molécula pequeña amplia de polipéptidos que atrapan proteasas, en donde cada posición de P2, P3 o P4 se hace para ser diferente, tal como por ejemplo, una biblioteca Acxxx-Tiafina . 5. Polipéptidos que atrapan proteasas variantes Los polipéptidos que atrapan proteasas que han sido modificados en su sitio reactivo para tener una secuencia desdoblada alterada, pueden ser usados en los métodos proporcionados en la presente, para seleccionar proteasas con un sustrato objetivo deseado o predeterminado. De este modo, las trampas de proteasa son modificadas en la región de su secuencia que sirve como el sitio de desdoblamiento reconocido de una proteasa, para seleccionar proteasas que tienen una reactividad o especificidad alterada para un sustrato objetivo. Por ejemplo, las serpinas pueden ser modificadas para tener una secuencia desdoblada alterada en, o que circunda el enlace desdoblable en el bucle RSL. En otro ejemplo, a2 puede ser modificado en su región de cebo para tener una secuencia desdoblada alterada. Tales trampas de proteasa modificada pueden ser designadas para imitar la secuencia desdoblada de un sustrato objetivo deseado, tal como por ejemplo, un sustrato objetivo involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. Cualquier modificación en la secuencia de bucle RSL de una molécula serpina, puede hacerse en los métodos proporcionados en la presente. Los alineamientos de las secuencias RSL de serpinas de tipo nativo ejemplares, son expuestos en la Tabla 4 abajo. En la Tabla 4 abajo, los números que designan las posiciones P15 a P5' , son con respecto a la molécula a?-antitripsina madura (que corresponde a los aminoácidos 367-387 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:l). La identidad de las secuencias de bucle RSL es conocida por aquellos de habilidad en la técnica y/o puede ser determinada por alineaciones tales como por alineamiento con serpinas como se expone en la Tabla 4 abajo. ? adaptada de Ye et al. (2001) Nature Structural Biology 8: 979 De este modo, secuencias de aminoácido con el bucle RSL de una serpina que corresponde a cualquiera o más de los aminoácidos en su sitio reactivo de una serpina (es decir, cualquiera o más de aminoácidos que corresponden a posiciones P15 a P5' como se expone por ejemplo, en la Tabla 4 anterior), pueden ser modificados. Típicamente, los aminoácidos que son parte de la región articulada de la secuencia del bucle RSL, no son modificados (es decir, los aminoácidos que corresponde a las posiciones P15-P9) . En un ejemplo, uno o más aminoácidos en la posición Pl y/o Pl' , son modificados correspondientes a aquellos aminoácidos que flanquean el enlace desdoblable. En otro ejemplo, cualquiera o más aminoácidos que corresponden a las posiciones de sitio reactivo P4-P2' , son modificados. Por ejemplo, el P4-P1' de PAI-1 es VSARM (SEC ID NO: 378), en donde ocurre el desdoblamiento entre los aminoácidos R(P1) y ?(?1')· La modificación de cualquiera o más de los aminoácidos de la secuencia VSARM, puede hacerse para modificar la secuencia desdoblada de PAI-1, para seleccionar proteasas con especificidad alterada. El Ejemplo 1, ejemplifica la modificación de PAI-1, en donde la secuencia de VSARM en el bucle de sitio reactivo se modifica para ser RRARM (SEC ID NO: 379). En otro ejemplo, el bucle de sitio reactivo de la secuencia VSARM, puede ser modificado al bucle de sitio reactivo eficiente conocido PFGRS (SEC ID NO: 389). Ejemplar de tal PAI-1 mutante, se expone en las SEC ID NOS: 610 y 611. En otro ejemplo, las modificaciones pueden hacerse en el RSL de antitrombina III (AT3) . Por ejemplo, el P4-P1' de AT3 es IAGRSL (SEC ID NO: 478), en donde ocurre el desdoblamiento entre los aminoácidos R(P1) y S (??'). La modificación de cualquiera o más aminoácidos de la secuencia IAGRSL puede hacerse para modificar la secuencia desdoblada de AT3 para seleccionar proteasas con especificidad alterada. Los ejemplos 6 y 7 ejemplifican la modificación de AT3, en donde la secuencia IAGRSL en el bucle de sitio reactivo es modificada para ser RRVRKE (SEC ID NO:498). En otro ejemplo, la secuencia de aminoácido IAGRSL en el bucle de sitio reactivo, puede ser modificada a SLGRKI (SEC ID NO. 479) . Otros polipéptidos AT3 modificados se hacen conteniendo el reemplazo de la secuencia de aminoácido IAGRSL con la secuencia de aminoácido SKGRSL (SEC ID NO: 501), o la secuencia de aminoácido PRFKII (SEC ID NO: 503). Ejemplares de tales moléculas mutantes AT3 se exponen en cualquiera de las SEC ID NOS:497, 499, 500 y 502. Alternativamente, y si es necesario, la modificación en cualquiera o más de las posiciones de aminoácido P4-P2', puede hacerse en una vez, dos en una vez, tres a la vez, etc., y la serpina resultante modificada puede ser separadamente probada en rondas sucesivas de selección, para optimizar las proteasas que exhiben especificidad de sustrato y/o selectividad en cada una de las posiciones modificadas. En muchos casos, los residuos de aminoácido que reemplazan residuos de aminoácido en el bucle de sitio reactivo de una serpina de tipo nativo, o secuencia análoga en otra trampa de proteasa, son elegidos con base en las secuencias desdobladas en un sustrato objetivo deseado. Una proteina de sustrato objetivo es una que está normalmente involucrada en una patología, en donde el desdoblamiento de la proteína objetivo en una secuencia de sustrato dado, sirve como un tratamiento para la patología (véase por ejemplo, Publicación de Patente Estadounidense No. US 2004/0146938, US2006/0024289, US2006/0002916, y solicitud provisional serie No. 60/729,817). Por ejemplo, la proteina objetivo puede ser una involucrada en artritis reumatoide (es decir, TNFR) , sepsis (es decir, proteina C) , tumorigenicidad (es decir, un receptor del factor de crecimiento, tal como VEGFR) , o inflamación (es decir, una proteina complemento) . Un sustrato objetivo también puede ser una proteina viral de manera que después del desdoblamiento de la proteina viral, los virus podrían ser incapaces de infectar células. La Tabla 5 abajo, expone sustratos objetivos ejemplares.

TABLA 5: Sustratos Objetivos Ejemplares Objetivo Indicación Clase de molécula IL-5/IL-5R Asma Citocina IL-1/IL-1R Asma, inflamación, Citocina trastornos reumáticos IL-13/IL-13R Asma Citocina IL-12/IL-12R Trastornos Citocina inmunológicos IL-4/IL-4R Asma Citocina TNF/TNFR Asma, enfermedad de Citocina cron, infección por VIH, inflamación, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio CCR5/CXCR4 Infección por VIH GPCR Gpl20/gp41 Infección por VIH Proteína de fusión CD4 Infección por VIH Receptor inmune Hemaglutinina Infección de influenza Proteina de fusión Proteina de Infección por RSV Proteina de fusión RSV fusión B.7/CD28 Trastorno de injerto- Receptor inmune contra-hospedero, artritis reumatoide, rechazo a trasplante, diabetes mellitus IgE/IgER Trastorno de injerto- Receptor de contra-hospedero, anticuerpo rechazo al transplante CD2 , CD3, CD4 , Trastorno de injerto- Receptor · inmune CD40 contra-hospedero, rechazo al transplante, psoriasis IL-2/IL-2R Enfermedades Citocina autoinmunes, trastornos de injerto contra hospedero, artritis reumatoide VEGF, FGF, EGF, cáncer Factor de TGF crecimiento HER2 /Neu Cáncer (es decir, Receptor del cáncer de mama) factor de crecimiento CCR1 Esclerosis múltiple GPCR CXCR3 Esclerosis múltiple, GPCR artritis reumatoide CCR2 Aterosclerosis, GPCR artritis reumatoide, Ser Cáncer, osteoporosis Cinasa Akt Cáncer Cinasa Bcl-2 Cáncer Proteina-cinasa BCR-Abl cáncer Cinasa GSK-3 Diabetes Cinasa Cdk-2/cdk-4 Cáncer Cinasa EGFR Cáncer de pulmón, mama, vejiga, próstata, colorectal, riñon, cabeza y cuello VEGFR-1 Cáncer de cuello Receptor del VEGFR-2 factor de crecimiento Complemento Enfermedades Moléculas inmunes inflamatorias Los sitios de desdoblamiento dentro de la roteinas objetivo son conocidos o pueden ser fácilment identificados. Los sitios de desdoblamiento dentro de las proteínas objetivo son identificados por el siguiente criterio: 1) están localizados en la superficie expuesta de la proteína; 2) están localizados en regiones que están desprovistas de estructura secundaria (es decir, no en •láminas P de hélices), como se determina por la estructura atómica de los algoritmos de predicción de estructura (estas regiones tienden a ser bucles en la superficie de las proteínas o trocales en los receptores de la superficie celular); 3) están localizados en sitios que son probablemente inactivos (o activan) la proteína, basados en su función conocida. Las secuencias desdobladas son por ejemplo, de cuatro residuos en longitud (es decir, posiciones P1-P4) para igualar la especificidad de sustrato extendida de las proteasas, pero pueden ser más largas o más cortas. Por ejemplo, los residuos de aminoácido P4-P1 para una secuencia desdoblada en el factor de complemento C2, son SLGR (SEC ID NO: 431), pero también pueden ser representadas como la secuencia P4-P2' de SLGRK1 (SEC ID NO: 479), en donde ocurre el desdoblamiento entre la posición Pl y Pl' (es decir, entre R/K) . Por lo tanto, cualquiera o más de los residuos dentro de una secuencia desdoblada, que incluye cualquiera o más de los residuos P4-P2', que incluyen P4-P1, pueden ser introducidos en un polipéptido que atrapa proteasa, tal como en el RSL de una serpina para generar un polipéptido que atrapa proteasa mutante . Las secuencias desdobladas pueden ser identificadas en un sustrato objetivo por cualquier método conocido en la técnica (véase por ejemplo, Solicitud Estadounidense Publicada No. US 2004/0146938) . En un ejemplo, el desdoblamiento de un sustrato objetivo es determinado incubando el sustrato objetivo con cualquier proteasa conocida por desdoblar el sustrato. Después de la incubación con la proteasa, la proteina objetivo puede ser separada por SDS-PAGE y los productos degradativos pueden ser identificados por teñido con un tinte de proteina, tal como Azul Brillante de Coomassie. Los fragmentos proteoliticos pueden ser secuenciados para determinar la identidad de las secuencias desdobladas, por ejemplo, la secuencia de desdoblamiento P4-P2' del aminoácido 6, y en particular, los residuos de secuencia de desdoblamiento P4-Pl de cuatro aminoácidos. La Tabla 6 identifica secuencias desdobladas que corresponden a las posiciones P4-P1, para sustratos objetivo ejemplares.

TABLA 6: SECUENCIA DESDOBLABLE PARA SUSTRATOS OBJETIVO EJEMPLARES (Residuos P4-P1) Objetivo Secuencia desdoblada TNF-a AEAK (406) T F-R1 ENVK (407); GTED (408) TNF-R2 SPTR (409); VSTR (410); STSF (41 1) HER-2 KFPD (412); AEQR (413) EGFR YAD (414); NGPK (415) VEGFR-1 SSAY (416); GTSD (417) VEGFR-2 AQEK (418); RIDY (419); VLKD (480); LVED (481); WFKD (482); RIYD (483); KVGR (484); RVRK (485); RKTK (486); KTKK (487); TKKR (488); RRVR (489) C3 REFK (420); GLAR (421); RLGR (422); AEGK (423); QHAR (424); LPSR (425); SLLR (426); LGLA (427); LSVV (428) C4 HRGR (429) C2 GATR (430); SLGR.(431); VFAK (432) Por ejemplo, la modificación de una RSL de una serpina, o secuencia análoga en otras trampas de proteasa, puede ser modificad a cualquier secuencia desdoblada deseada o predeterminada de un sustrato objetivo. En un ejemplo, la secuencia desdoblada seleccionada puede ser una que es una secuencia desdoblada particularmente eficiente de t-PA. Tal secuencia desdoblada es, por ejemplo, PFGRS (Ding et al. (1995) PNAS, 92:7627-7631). De este modo, por ejemplo, una proteasa puede ser seleccionada para tener una especificidad de sustrato alterada que se hace para replicar la especificidad de sustrato de t-PA. Puesto que el t-PA es a menudo un terapéutico usado para el tratamiento de trastornos fibrinoliticos, tal proteasa seleccionada puede ser optimizada para ser un terapéutico t-PA alternativo, mientras se minimizan los efectos secundarios indeseables a menudo asociados con terapias t-PA (es decir, sangrado excesivo) . En otro ejemplo, una secuencia desdoblada para una proteina complemento, puede ser dirigida como una secuencia desdoblada predeterminada o deseada para selección de una proteasa usando los métodos proporcionados en la presente. Una proteasa seleccionada por tener especificidad de sustrato incrementada contra cualquiera o más proteínas complemento, podría ser un candidato terapéutico para el tratamiento de trastornos y enfermedades asociadas con la inflamación, tales como pero no limitados a, enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide y lupus, trastornos cardiacos y otros trastornos inflamatorios tales como sepsis y lesión por reperfusión isquémica (véase por ejemplo, solicitud provisional serie No. 60/729,817). El Ejemplo 6 a Ejemplos 15, ejemplifican la selección de una proteasa MT-SPl contra una molécula serpina AT3 modificada por reemplazos de sus residuos P4-P20 nativos IAGRSL (SEC ID NO:478), con una secuencia desdoblada de las proteínas complemento C2 (es decir, SLGRKI, SEC ID NO:479). La modificación o reemplazo de residuos de aminoácido por la secuencia desdoblada SLGRKI, o intermediarios de los mismos, tales como se describe abajo, puede hacerse en cualquier polipéptido que atrapa proteasa, tal como cualquier polipéptido de serpina, para selección de cualquier proteasa candidato asi deseada. En un ejemplo adicional, una secuencia desdoblada puede ser seleccionada en un VEGFR, tal como en la región troncal de un VEGFR, de manera que el VEGFR es inactivado después del desdoblamiento por una proteasa que tiene especificidad para la secuencia desdoblada. Ejemplos de secuencias desdobladas en un VEGFR son descritas en la presente y se exponen en la solicitudes Estadounidenses publicadas relatadas series Nos. US20060024289 y US20060002916. Por ejemplo, el RSL de una serpina, o una secuencia análoga en otras trampas de proteasa tal como la región "cebo" en la alfa-2-macroglobulina, puede ser modificado para tener una o más posiciones de aminoácidos P4-P2' relacionados con la secuencia desdoblada de un VEGFR. En un ejemplo, los residuos de aminoácido en una serpina nativa pueden ser modificados para contener las posiciones P4-P1 correspondientes a la secuencia desdoblada RRVR (SEC ID NO:489), o la secuencia P4-P2' completa RRVRKE (SEC ID NO:498). Una proteasa seleccionada contra tal serpina modificada, podría ser un candidato para tratar trastornos mediados por VEGFR, tales como por ejemplo, trastornos angiogénicos .

En algunos casos en los métodos proporcionados en la presente, las modificaciones en cualquiera o más de las posiciones P4-P2' de un RSL de serpina, o secuencia análoga en otras trampas de proteasa, se puede hacer en rondas sucesivas para optimizar la selección de proteasas con una especificidad de sustrato desead o predeterminada. Por ejemplo, proteasas tanto u-PA como t-PA, prefieren aminoácidos pequeños en la posición P2 y aminoácidos muy diferentes en las posiciones P3 y P4. De este modo, las serpinas modificadas pueden ser generadas que son intermediarias para la secuencia desdoblada objetivo final, en donde un primer intermediario es generado por modificación de solamente las posiciones P3 y P4 para seleccionar proteasas que exhiben especificidad en las posiciones P3 y P . La proteasa o proteasas seleccionadas, pueden entonces ser usadas como una plantilla para la generación de una nueva biblioteca combinatorial contra una nueva molécula de serpina modificada para tener adicionalmente, la posición P2 cambiada . De este modo en la selección, por ejemplo, de una proteasa u-PA, o variante de la misma que exhibe especificidad de sustrato incrementada para la secuencia desdoblada VEGFR RRVR, la primera ronda de selección puede hacerse contra un polipéptido que separa proteasas modificado intermediario, tal como una serpina, en donde solamente las posiciones P3 y P4 son cambiadas comparadas con la secuencia nativa en estas posiciones. Por ejemplo, en donde los aminoácidos nativos P4-P1' en el bucle RSL de serpina PAI-1 son VSAR , un intermediario modificado PAI-1 puede hacerse por reemplazo de solamente la secuencia desdoblada P4 y P3 de VEGFR, para proporcionar la molécula de serpina intermediaria que contiene RRARM (SEC ID NO: 379) en las posiciones P4-P1' . Las rondas subsecuentes de selección de proteasa se pueden hacer contra una serpina PAI-1 que adicionalmente ha sido modificada en la posición P2. Las trampas de proteasa, que incluyen serpinas, pueden ser modificadas usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para purificación de proteínas. Tales métodos incluyen, mutagénesis dirigida al sitio, que incluyen mutagénesis dirigida a sitio único o a sitios múltiples. Del mismo modo, la expresión y purificación de polipéptidos que atrapan proteasas, que incluyen variantes que atrapan proteasas, puede ser realizada usando métodos estándares en la técnica para expresión y purificación de polipéptidos. Cualquier sistema hospedero celular puede ser usado para expresión, que incluye pero no se limita a, células de mamífero, células bacterianas o células de insecto. Además, los polipéptidos que atrapan proteasas pueden ser modificados además, para incluir secuencias adicionales que ayudan en la identificación y purificación del polipéptido que atrapa proteasas. Por ejemplo, marcas de epítopes, tal como, pero no limitado a, marcas His o marcas Flag, pueden ser agregadas para ayudar en la purificación de afinidad del polipéptido. En algunos ejemplos, los polipéptidos que atrapan proteasas son directamente biotinilados para ayudar en la captura y/o purificación. Un método ejemplar para biotinilar un polipéptido que atrapa proteasa se describe en el Ejemplo 16. Ensayos, tales como ensayos para la función biológica de una molécula serpina u otras trampas de proteasas, son conocidos en la técnica y pueden ser usados para valorar la actividad de una trampa de proteasa modificada como un inhibidor en los métodos proporcionados en la presente. Tales ensayos son dependientes del polipéptido que atrapa la proteasa modificado para uso en los métodos de la presente. Ejemplares de tales ensayos para PAI-1 incluyen, por ejemplo, titulación de sitio activo contra tripsina estándar o titulación de tripsina estándar tal como se ejemplifica en el Ejemplo 1. También ejemplares de tales ensayos, están ensayos de inhibición de proteasa, los cuales son conocidos en la técnica, por medio del cual, la capacidad de la trampa de proteasa para inhibir el desdoblamiento de un sustrato fluorogénico por una proteasa activa, es usada como una lectura para la actividad de atrapamiento de proteasa. Ejemplar de un ensayo de inhibición de proteasa es un ensayo de inhibición de matriptasa- ( T-SP1) . En un ejemplo de tal ensayo, la trampa de proteasa es una serpina. En un ejemplo específico, la serpina es AT3 o una proteína AT3 variante elaborada de conformidad con los métodos proporcionados en la presente, el sustrato fluorogénico es RQAR-ACC. El desdoblamiento del sustrato es medido, por ejemplo, como se ejemplifica en el Ejemplo 14A. Los ensayos de inhibición de trombina, también pueden ser usados para valorar la actividad de AT3, o AT3 modificado. Los ensayos similares pueden ser diseñados o son conocidos por uno de habilidad en la técnica, dependiendo de la proteasa cognada para la cual un polipéptido que atrapa proteasa, o variante del mismo, actúa normalmente. Además, se espera y a menudo es el caso, que un polipéptido que atrapa proteasa modificada, tendrá actividad reducida comparada con un polipéptido que atrapa proteasa de tipo nativo en ensayos normales de actividad o función de trampa de proteasa.

D. PROTEASAS En los métodos proporcionados en la presente, las proteasas candidato son seleccionadas para que exhiban una especificidad de sustrato alterada, típicamente para un sustrato predeterminado o deseado. Las colecciones de proteasas, proteasa mutante o porciones catalíticamente activas de las mismas, son contactadas con un polipéptido que atrapa proteasas, tal como cualquiera proporcionado en la presente, que incluye por ejemplo, serpinas o serpinas modificadas, para seleccionar proteasas con especificidad de sustrato alterada. Las colecciones de proteasa pueden ser proporcionadas en un soporte sólido o en una mezcla homogénea tal como en solución o suspensión. Las proteasas seleccionadas pueden ser aisladas como complejos estables con el polipéptido que atrapa proteasa, y pueden ser identificadas. Las proteasas seleccionadas exhiben eficiencia catalítica incrementada y reactividad contra el sustrato objetivo deseado o predeterminado, y son por este medio, candidatos para uso como terapéuticos, tal como en cualquier enfermedad o trastorno para el cual el sustrato objetivo está involucrado. 1. Proteasas Candidatas En el método proporcionado en la presente, las proteasas son seleccionadas por tener una especificidad alterada y/o incrementada para un sustrato deseado que está involucrado en una enfermedad o trastorno. En general, las proteasas son proteínas altamente específicas que hidrolizan sustratos objetivo mientras dejan otros intactos. Para el desdoblamiento de sustratos naturales, las proteasas exhiben un alto grado de selectividad tal como aquella que el desdoblamiento de sustrato es favorecido, mientras el desdoblamiento sin sustrato es desfavorecido (Coombs et al. (1996) J. Biol. Chem., 271:4461-4467). La selección de proteasas con especificidad y selectividad deseada para un sustrato objetivo deseado podría permitir el uso de proteasas como terapéuticos para activar selectivamente o inactivar proteínas para reducir, aliviar, o prevenir una enfermedad o trastorno. Las proteasas objetivo usadas en el método de selección de trampa de proteasa proporcionadas en la presente, pueden ser cualquier clase conocida de proteasas capaces de hidrólisis de enlace peptídico para el cual la trampa de proteasa interactúa. Típicamente, para serpinas, tales proteasas son en general serina o cisteína proteasas para las cuales las serpinas reaccionan con, o forman un complejo intermediario covalente. Ejemplar de proteasas serina y cisteína son proteasas expuestas en la Tabla 7 abajo. Típicamente, una biblioteca de proteasas modificadas son usadas en los métodos proporcionados en la presente, para seleccionar una variante de proteasa que exhibe una especificidad o selectividad incrementada para una trampa de proteasa objetivo, o variante de la misma, tal como una serpina, o una variante de la misma. Proteasas ejemplares que pueden ser usadas y/o modificadas para ser usadas, en el método de selección proporcionado en la presente, son descritas e incluyen polipéptidos truncados de los mismos, que incluyen una porción catalíticamente activa. Proteasas candidatas ejemplares son listadas en la Tabla 7 y descritas en la presente (véase por ejemplo, www .merops . sanger .ac.uk) . Los identificadores de secuencia (SEC ID NO) para la secuencia de nucleótido y secuencia precursora de aminoácido codificada para cada una de las proteasas candidatas ejemplares, se representan en la tabla. Los aminoácidos codificados que corresponden al péptido señal o secuencia de polipéptido para proporcionar una proteina madura, también están notados en la Tabla. Además, los aminoácidos que designan el dominio de proteasa (es decir, la unidad peptidasa) , también son notados, como son los residuos de sitio activo que conforman, por ejemplo, la triada catalítica de la proteasa respectiva. Puesto que las interacciones son dinámicas, las posiciones de aminoácido notadas son para referencia y ej emplificación . Las posiciones notadas, reflejan un intervalo de lugares que varían por 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos. Las variaciones también existen entre variantes alélicas y variantes de especies. Aquellos expertos en la técnica, pueden identificar secuencias correspondientes por comparación visual u otras comparaciones que incluyen algoritmos fácilmente disponibles y software. Las proteasas candidato para selección, típicamente son de tipos nativas o modificadas o formas variantes de una proteasa candidata de tipo nativo, o porciones de la misma catalíticamente activa, que incluyen variantes alélicas e isoformas de cualquier proteína. Una proteasa candidata puede ser producida o aislada por cualquier método conocido en la técnica que incluye, aislamiento de fuentes naturales, aislamiento de proteínas recombinantemente producidas en las células, tejidos y organismos, o por métodos recombinantes y por métodos que incluyen etapas en silicio, métodos sintéticos y cualquiera de los métodos conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. La modificación de una proteasa candidata para selección, puede ser cualquier método conocido por uno de habilidad en la técnica, tal como cualquier método descrito en la presente abajo.

Tabla 7 : Proteasas Candidatas Ejemplares Tipo de Código Nombre Nt. ACC. Nt. A.A. A.A. secuencia de Unidad Proteasa Merops propéptido/ peptidasa NO: SEC ACC. SEC (residuos de señal sitio activo) ID NO: ID NO: NO: proteasa apoptótica Mdi-2) CI4.006 precursor de D28492 344 P29594 343 / 1-169 170-432 caspasa -2 (277, 320) (proteasa ICH- I , pioteüia NEDD2) C 14.007 preausor de Z48810 346 P49662 345 / 1-80 93-377 caspnsa-4 (210, 258) (proteasa ICH-2, proteasa TX) C14.008 preausor de U280I5 348 P5 I878 347 / 1-120. 134-418 caspasa-5 (251, 299) (proteasa ICH-3, proteasa TY, ICE(rel)-m) C 14.009 precursor de X98172 350 QI4790 349 / 1-216 193-479 caspasa-8 (ICE (317, 360) similar a FADD, proteasa apoptótica 5 siiuilar a ICE C I4.010 preausor de U56390 352 P5521 1 351 1 17-416 caspasa-9 (237, 287) (ICE-LAP6, proteasa apoptótica Mcu-6 C I4.0I I precursor de U6051 354 Q92851 353 / 1-219 243-514 caspasa 10 (358, 401) C I4.0 I2 caspasa-11 U59463 356 P70343 355 / 1-80 89-373 (preausor de (206, 254) caspas -4) CI4.0 I 3 precursor de Y 13090 358 008736 357 133-419 caspasa 12 (250, 298) CI4.015 precursor de Y12261 360 001382 359 / 1-28 (169, 21 1) caspasa (insecto) (drICE) C14.016 preausor de AF001464 362 O02002 361 / 1-33 (154, 196) caspasa 1 (insecto) CI4.017 precursor de AF078533 364 075601 363 (210, 258) caspasa-13 CI4.0I 8 precursor de AF097874 366 P3 I 44 365 1-242 caspasa- 14 (89, 132) CI4.019 precursor de AF 104357 368 Q9XYF4 367 /M34 (271 , 318) caspasa Nc (caspasa DRONC similar a NEDD2) C 14.026 paiacaspasa de AFI 30356 370 Q9UDY8 369 337-523 proteüia 1 de (415, 464) tr nslocación de lúifouia MALT (paracaspasa) C14.971 U85059 372 015519 371 260-433 (315, 363) a. Clases de Proteasas Las proteasas, (también referidas como proteinasas o peptidasas) , son enzimas que degradan la proteina, que reconocen secuencias de aminoácidos o un sustrato de polipéptido dentro de una proteina objetivo. Después del reconocimiento de la secuencia sustrato de aminoácidos, las proteasas catalizan la hidrólisis o desdoblamiento de un enlace peptídico dentro de una proteina objetivo. Tal hidrólisis de una proteina objetivo, dependiendo de la ubicación del enlace peptídico dentro del contexto de la secuencia de longitud completa de la secuencia objetivo, puede inactivar, o en algunos casos activar, un objetivo. Las proteasas son clasificadas con base en la forma en que atacan la proteína, ya sea exo o endo-proteasa . Las proteinasas o endopeptidasas atacan dentro de la proteína para producir péptidos grandes. Las peptidasas o exopeptidasas atacan extremos o fragmentos de proteína para producir péptidos pequeños y aminoácidos. Las peptidasas son clasificadas en su patrón de acción: la aminopeptidasa desdobla aminoácidos a partir del extremo amino: la carboxipeptidasa desdobla aminoácidos a partir del extremo carboxilo, las dipeptidil peptidasas desdoblan dos aminoácidos; las dipeptidasas dividen un dipéptido, y las tripeptidasas desdoblan un aminoácido de un tripéptido. La mayoría de las proteasas son pequeñas, desde 21,000 hasta 45,000 Daltons. Muchas proteasas son sintetizadas y secretadas como formas inactivas llamadas zimógenos y subsecuentemente activadas por proteólisis. Esto cambia la arquitectura del sitio activo de la enzima. Varios tipos distintos de mecanismos catalíticos son usados por las proteasas (Barret et al. (1994) Meth. Enzymol. 244:18-61; Barret et al. (1994) Meth. Enzymol 244:461- 486; Barret et al. (1994) Meth. Enzymol. 248:105-120; Barret et al. (1994) Meth. Enzymol. 248: 183-228). Basados en su mecanismo catalítico, las carboxipeptidasas son subdivididas en carboxipeptidasas tipo serina, metalo y cisteína y las endopeptidasas son la serina, cisteína, aspártico, treonina y metaloendopeptidasas . Las serina peptidasas tienen un residuo serina involucrado en el centro activo, el aspártico tiene dos ácidos aspárticos en el centro catalítico, las peptidasas tipo cisteína tienen un residuo cisteína, las peptidasas tipo treonina tienen un residuo treonina y las metalopeptidasas usan un ión metálico en el mecanismo catalítico. En general, las proteasas pueden ser divididas en clases basadas en su actividad catalítica, de manera tal que las clases de proteasas pueden incluir serina, cisteína, aspártico, treonina o metalo-proteasas . La actividad catalítica de las proteasas se requiere para desdoblar un sustrato objetivo. Por lo tanto, la modificación de una proteasa para alterar la actividad catalítica de una proteasa puede afectar (es decir, modificar la especificidad/selectividad) , la capacidad de una proteasa para desdoblar un sustrato particular. Cada proteasa tiene una serie de aminoácidos que alinea el paquete de sitio activo y hace contacto directo con el sustrato. Las estructuras cristalográficas de peptidasas, muestran que el sitio activo está comúnmente localizado en una ranura en la superficie de la molécula entre los dominios estructurales adyacentes, y la especificidad del sustrato es dictada por las propiedades de sitios de enlace arreglados a lo largo de la ranura en uno o ambos lados del sitio catalítico que es responsable de la hidrólisis del enlace desdoblable. Por consiguiente, la especificidad de una peptidasa es descrita por la capacidad de cada subsitio para acomodar una cadena lateral de un residuo de aminoácido único. Los sitios son numerados a partir del sitio catalítico, SI, S2...Sn, hacia el N-término del sustrato, y SI', S2'...Sn' hacia el C-término. Los residuos que acomodan son numerados Pl, P2...Pn y Pl' , P2'..Pn', respectivamente. El desdoblamiento de una proteína objetivo es catalizado entre Pl y Pl' , en donde los residuos de aminoácido del N al C-término del sustrato de polipéptido son etiquetados (Pi,...P3, P2, Pl, Pl' , P2' , P3'...Pj), y sus paquetes de reconocimiento de enlace correspondiente en la proteasa son etiquetados (Si,..., S3, S2, SI, SI', S2 ' , S3',..., Sj ) (Schecter and Berger (1967) Biochem Biophys Res Commun 27:157-162). De este modo, P2 interactúa con S2, Pl con SI, Pl' con SI', etc. Consecuentemente, la especificidad de sustrato de una proteasa viene a partir de las posiciones S1-S4 en el sitio active, en donde la proteasa está en contacto con los residuos P1-P4 de las secuencias del sustrato peptidico. En algunos casos, existen pocas interacciones (si las hay) , entre los paquetes S1-S4 del sitio activo, de manera que cada paquete parece reconocer y enlazarse al residuo correspondiente en la secuencia de sustrato peptidico independiente de los otros paquetes. De este modo, las determinantes de especificidad pueden ser cambiadas en un paquete sin afectar la especificidad del otro paquete. Basados en numerosas estructuras y modelación de los miembros de la familia, los residuos de superficie que contribuyen a la especificidad de sustrato extendida y otras interacciones secundarias con un sustrato, han sido definidas por muchas proteasas que incluyen proteasas de la familia serina, cisteina, aspártico, metalo y treonina (véase por ejemplo, Wang et al., (2001) Biochemistry 40(34): 10038-46; Hopfner et al., (1999) Structure Fold Des. 7 (8) : 989-96; Friedrich et al. (2002) J Biol Chem. 277 (3) : 2160-8; Waugh et al., (2000) Nat Struct Biol. 7(9):762-5; Cameron et al, (1993) J Biol Chem. 268:11711; Cameron et al, (1994) J Biol Chem. 269: 11170). i . Serinas Proteasas Las serinas proteasas (SPs) , las cuales incluyen enzimas secretadas y enzimas secuestradas en organelos de almacenamiento de organelo citoplásmico, tienen una variedad de papeles fisiológicos, que incluyen coagulación sanguínea, cicatrización de heridas, digestión, respuesta inmune e invasión y metástasis de tumor. Por ejemplo, quimiotripsina, tripsina, y función de elastasa en el tracto digestivo; el Factor 10, Factor 11, trombina y plasmina, están involucrados en la coagulación y cicatrización de heridas; y convertasas CIr, CIs y C3, juegan un papel en la activación del complemento. Una clase de proteínas de la superficie celular designadas serina proteasa de la transmembrana tipo II, son proteasas las cuales son proteínas ancladas a la membrana con dominios extracelulares . Como proteínas de superficie celular, juegan un papel en la transducción de la señal intracelular y en la mediación de los eventos proteolíticos de la superficie celular. Otras serinas proteasas están unidas a la membrana y funcionan en una manera similar. Otras son secretadas. Muchas serinas proteasas ejercen su actividad después del enlace a los receptores de la superficie celular y, por lo tanto, actúan en las superficies celulares. La proteólisis de la superficie celular es un mecanismo para la generación de proteínas biológicamente activas que median una variedad de funciones celulares. Las serinas proteasas, que incluyen serinas proteasas de la membrana y secretadas, están involucradas en procesos que incluyen desarrollo y progreso neoplásico. Mientras el papel preciso de estas proteasas no ha sido completamente elaborado, las serinas proteasas e inhibidores de las mismas, están involucradas en el control de muchas proteasas fisiológicas intra y extracelulares, que incluyen acciones degradativas en la invasión de células de cáncer y distribución metastásica, y la neurovascularización de tumores que están involucrados en el progreso del tumor. Las proteasas están involucradas en la degradación y remodelación de la matriz extracelular (ECM) y contribuyen a la remodelación del tejido, y son necesarias para la invasión y metástasis de cáncer. La actividad y/o expresión de algunas proteasas ha sido mostrad por correlacionarse con el progreso y desarrollo del tumor. Más de 20 familias (denotadas S1-S27) de serinas proteasas han sido identificadas, estas están agrupadas en 6 clanes (SA, SB, SC, SE, SF y SG) con base en la similitud estructural y otra evidencia funcional (Rawlings ND et al. (1994) Meth. Enzymol. 244: 19-61). Existen similitudes en los mecanismos de reacción de varias serinas peptidasas. Clanes de quimiotripsina, subtilisina y carboxipeptidasa C, tienen una triada catalítica de serina, aspartato e histidina en común: la serina actúa como un nucleófilo, aspartato como un electrófilo, e histidina como una base. Las orientaciones geométricas del residuo catalítico son similares entre familias, debido a los diferentes pliegues de proteína. Los arreglos lineales de los residuos catalíticos comúnmente reflejan relaciones del clan. Por ejemplo, la triada catalítica en el clan de quimiotripsina (SA) es HDS ordenada, pero es DHS ordenada en el clan subtilisina (SB) y SDH en el clan carboxipeptidasa (SC) . Ejemplos de serinas proteasas de la superfamilia quimiotripsina incluyen activador del plasminogeno de tipo tejido (tPA) , tripsina, proteasa similar a tripsina, quimiotripsina, plasmina, elastasa, urocinasa (o activador del plasminogeno tipo urinario, u-PA) , acrosina, proteína C activada, esterasa Cl, catepsina G, quimasa, y proteasas de la cascad de coagulación sanguínea que incluyen calicreína, trombina, y Factores VIla, IXa, Xa, Xla, y Xlla (Barret, A.J., In: Proteinase Inhibitors, Ed. Barrett, A.J., Et al., Elsevier, Amsterdam, Páginas 3-22 (1986) ; Strassburger, . et al, (1983) FEBS Lett., 157 :219- 223; Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol 5, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, Md. (1972); y Rosenberg, R.D. et al. (1986) Hosp. Prac, 21:131-137). La actividad de las proteasas en la familia de serina proteasa es dependiente de una serie de residuos de aminoácido que forman su sitio activo. Uno de los residuos es siempre una serina; por lo tanto su designación como serinas proteasas. Por ejemplo, quimiotripsina, tripsina y elastano portan una estructura similar y su residuo serina activo están en la misma posición (Ser-195) en los tres. Debido a sus similitudes, tienen diferentes especificidades de sustrato; desdoblan enlaces peptidicos diferentes durante la digestión de la proteina. Por ejemplo, la quimiotripsina prefiere una cadena lateral aromática en el residuo cuyo carbono carbonilo es parte del enlace peptidico a ser desdoblado. La tripsina prefiere un residuo Lys o Arg positivamente cargado en esta posición. Las serinas proteasas difieren marcadamente en sus propiedades de reconocimiento de sustrato: algunas son altamente especificas (es decir, las proteasas involucradas en la coagulación de la sangre y el sistema de complemento inmune) ; algunas son solamente parcialmente especificas (es decir, las proteasas digestivas de mamífero tripsina y quimiotripsina) ; y otras, como subtilisina, una proteasa bacteriana, son completamente no específicas. Debido a estas diferencias en especificidad, el mecanismo catalítico de las serinas proteasas está bien conservado . El mecanismo de desdoblamiento de una proteína objetivo por una serina proteasa, se basa en el ataque nucleofílico del enlace peptidico dirigido por una serina. La cisteina, treonina o moléculas de agua asociadas con aspartato o metales, también pueden jugar este papel. En muchos casos, la propiedad nucleofilica del grupo es mejorada por la presencia de una histidina, mantenida en un "estado aceptor de protón" por un aspartato. Las cadenas secundarias alineadas de serina, histidina y aspartato, acumulan la triada catalítica común a la mayoría de las serinas proteasas. Por ejemplo, los residuos de sitio activo de quimiotripsinas, y serinas proteasas que son miembros de la misma familia como quimiotripsina, tales como por ejemplo MTSP-I, son Aspl02, His57, y Serl95. Los dominios catalíticos de todas las serinas proteasas de la superfamilia quimiotripsina, tienen tanto homología de secuencia como homología estructural. La homología de secuencia incluye la conservación de: 1) los residuos de sitio activo característicos (por ejemplo, Serl95, His57, y Aspl02 en el caso de tripsina); 2) el agujero de oxianión (por ejemplo, Glyl93, Aspl94 en el caso de tripsina) ; y 3) los residuos cisteína que forman puentes disulfuro en la estructura (Hartley, B.S., (1974) Symp. Soc. Gen. Microbiol . , 24: 152-182). La homología estructural incluye 1) un pliegue común caracterizado por dos estructuras clave Griegas (Richardson, J. (1981) Adv. Prot. Chem. , 34:167-339); 2) una deposición común de residuos catalíticos; y 3) preservación detallada de la estructura dentro del núcleo de la molécula (Stroud, R.M. (1974) Sci. Am. , 231:24-88) . A través de la familia quimiotripsina de serinas proteasa, la interacción de estructura entre el sustrato y enzima es completamente conservada, pero las interacciones de cadena laterales varían considerablemente. La identidad de los aminoácidos que contienen los paquetes S1-S4 del sitio activo, determina la especificidad del sustrato de tal paquete particular. Injertando los aminoácidos de una serina proteasa a otros del mismo pliegue, modifican la especificidad de uno a otro. Típicamente, los aminoácidos de la proteasa que contienen los paquetes S1-S4, son aquellos que tienen cadenas laterales dentro de 4 a 5 angstroms del sustrato. Las interacciones que estos aminoácidos tienen con el sustrato de proteasa, son en general llamadas interacciones de "primer armazón" debido a que contactan directamente el sustrato. Ahí, sin embargo, pueden ser interacciones de "segunda armazón" y "tercera armazón", que finalmente posicionan aminoácidos de primera armazón. Los efectos de enlace de sustrato de primera armazón y segunda armazón, son determinados principalmente por bucles entre los dominios de barril beta. Debido a que estos bucles no son elementos nucleares de la proteína, la integridad del pliegue se mantiene mientras las variantes de bucle con nuevas especificidades de sustrato, pueden ser seleccionadas durante el curso de la evolución para cubrir completamente los nidos reguladores o metabólicos necesarios al nivel molecular. Típicamente para serinas proteasas, los siguientes aminoácidos en la secuencia primaria, son determinantes de especificidad: 195, 102, 57 (la triada catalítica); 189, 190, 191, 192, y 226 (SI); 57, el bucle entre 58 y 64, y 99 (S2) ; 192, 217, 218 (S3) ; el bucle entre Cysl68 y Cysl80, 215, y 97 a 100 (S4) ; y 41 y 151 (S21), basados en la numeración de quimiotripsina, en donde un aminoácido en una posición SI afecta la especificidad Pl, un aminoácido en una posición S2 afecta la especificidad P2, un aminoácido en la posición S3 afecta la especificidad P3, y un aminoácido en la posición S4 afecta la especificidad P4. La posición 189 en una serina proteasa es un residuo enterrado en el fondo del paquete que determina la especificidad SI. Las determinantes estructurales para varias serinas proteasas son listadas en la Tabla 8, con numeración basada en la numeración de quimiotripsina madura, con dominios proteasa para cada una de las proteasas designadas alineadas con aquellas del dominio proteasa de la quimiotripsina. El número por detrás de los encabezados de columna del bucle Cysl68-Cysl82 y 60, indican el número de aminoácidos en el bucle entre los dos aminoácidos y en el bucle. La designación sí/no bajo los encabezados de columna Cysl91-Cys220, indican si el puente disulfuro está presente en la proteasa. Estas regiones son variables dentro de la familia de serinas proteasas como quimiotripsina y representan determinantes estructurales en si mismos. La modificación de una proteasa para alterar cualquiera o más de los aminoácidos en el paquete S1-S4, afecta la especificidad o selectividad de una proteasa para un sustrato objetivo.

TABLA 8: Las determinantes estructurales para varias serinas proteasas (a) Activador del Plasminógeno tipo Urocinasa (u- PA) El activador del plasminógeno tipo urocinasa (u-PA, también llamado activador del plasminógeno urinario) , es una proteasa ejemplar usada como un candidato para la selección en los métodos de la presente. El u-PA es expuesto en la SEC ID NO: 190 y codifica una secuencia de aminoácido precursora expuesta en la SEC ID NO: 191. El u-PA se encuentra en la orina, sangre, fluidos seminales, y en muchos tejidos cancerosos. Está involucrado en una variedad de procesos biológicos, los cuales están ligados su conversión de plasminógeno a plasmina, la cual la misma es una serina proteasa. La plasmina tiene papeles en una variedad de procesos normales y patológicos que incluyen, por ejemplo, migración celular y destrucción de tejido a través de su desdoblamiento de una variedad de moléculas que incluyen fibrina, fibronectina , proteoglicanos y laminina. El u-PA está involucrado en la remodelación del tejido durante la cicatrización de heridas, migración de células inflamatorias, neovascularización e invasión de células tumorales. El u-PA también desdobla y activa otros sustratos, que incluyen pero no se limitan a, factor de crecimiento/factor de diseminación del hepatocito (HGF/SF) , la forma latente de metaloproteasas de matriz de tipo 1 de membrana (MT-SPl) , y otros.

La forma madura de u-PA es una proteina de residuo 411 (que corresponde a residuos de aminoácido 21 hasta 431 en la secuencia de aminoácido mostrado en la SEC ID NO: 191, la cual es la forma precursora que contiene un péptido de señal de aminoácido 20) . La u-PA contiene tres dominios: el dominio serina proteasa, el dominio Kringle y el dominio del factor de crecimiento. En la forma madura de u-PA humano, los aminoácidos 1-158 representan la cadena A n-terminal que incluye un dominio de factor de crecimiento (aminoácidos 1-49), un dominio Kringle (aminoácidos 50-131) y una región enlazadora interdominio (aminoácidos 132-158). Los aminoácidos 159-411 representan el dominio serina proteasa C-terminal o cadena B. La u-PA es sintetizada y secretada como una molécula zimógena de cadena única, la cual se convierte en un U-PA de dos cadenas activas por una variedad de proteasa que incluye, por ejemplo, plasmina, calicreina, catepsina B, y factor gama de crecimiento del nervio. El desdoblamiento en la forma de dos cadenas ocurre entre los residuos 158 y 159 en una secuencia u-PA madura (que corresponde a residuos de aminoácido 178 y 179 en la SEC ID NO: 191) . Las dos cadenas resultantes se mantienen juntas por un enlace de disulfuro, con ello forman la forma de dos cadenas de u-PA. La u-PA es regulada por el enlace a un receptor de superficie celular de alta afinidad, uPAR. El enlace de u-PA a uPAR incrementa la relación de activación de plasminógeno y mejora la degradación de matriz extracelular e invasión celular. El complejo binario formado entre uPAR y u-PA interactúa con el plasminógeno asociado con la membrana para formar complejos de activación de orden más altos que reducen el Km (es decir, constante de relación cinética de la afinidad aproximada para un sustrato) para activación de plasminógeno (Bass et al. (2002) Biochem. Soc, Trans., 30: 189-194). Además, en enlace de u-PA a uPAR protege la proteasa a partir de la inhibición por el inhibidor cognado, es decir, PAI-1. Esto es debido a que la u-PA de cadena única normalmente presente en plasma no es susceptible a inhibición por PAI-1, y cualquier u-PA activo en el plasma será inhibido por PAI-1. La u-PA activo que es unión del receptor está completamente disponible para inhibición por PAI-1, sin embargo, PAI-1 es incapaz para acceder a la molécula activa enlazada (Bass et al. (2002) Biochem. Soc, Trans., 30: 189-194). Como un resultado, u-PA principalmente funciona en la superficie celular y sus funciones son correlacionadas con la activación de proteólisis pericelular dependiente del plásmido. La especificidad del sustrato extendido de u-PA y t-PA (discutido abajo) son similares, debido al hecho que ambos son responsables para desdoblar plasminógeno en plásmido activo. Tanto u-PA como t-PA tienen alta especificidad para desdoblar después de Pl Arg, y similarmente muestran una presencia para aminoácidos pequeños en la posición P2. Ambas de las posiciones P3 y P4 son específicamente determinantes para sustratos de u-PA y t-PA, con un papel prominentemente particular de la posición P3 (Ke et al. (1997) J. Biol . Chem. , 272: 16603-16609) . La preferencia para aminoácidos en la posición P3 es distinta, y es el principal determinante para la discriminación de sustrato alterado entre las dos proteasas. La t-PA tiene una preferencia para aminoácidos aromáticos (Phe y Tyr) en la posición P3, mientras u-PA tiene una .preferencia para aminoácidos polares pequeños (Thr y Ser) (véase por ejemplo, Ke et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 16603-16609; Harris et al. (2000) PNAS, 97: 7754-7759) . (b) Activador de Plasminogeno del Tejido (t-PA) Una proteasa candidato para selección de nuevamente una separación de proteasa en los métodos de este documento, también incluyen el activador de plasminogeno de tejido de serina proteasa ejemplar (t-PA) y variantes de los mismos. La t-PA es una serina proteasa que convierte plasminogeno a plasminina, la cual se involucra en fibrinólisis o la formación de coágulos sanguíneos. La t-PA recombinante se usa como un terapéutico en enfermedades caracterizadas por coágulos sanguíneos, tal como por ejemplo, apoplejía. El empalme alternativo del gen t-PA produce tres trascriptos. El transcripto predominante se muestra en la SEC ID NO: 192 y codifica una proteína precursora mostrada en la SEC ID NO: 193 que contiene una secuencia de señal de aminoácido 20-23 y una pro-secuencia de aminoácido 12-15. Los otros transcriptos se muestran en la SEC ID NO: 194 y 196, que codifica proteínas precursoras que tienen una secuencia de aminoácidos mostrados en las SEC ID NOS: 195 y 197, respectivamente. La secuencia madura de t-PA, que carece de la secuencia señal y secuencia de propéptido es aminoácidos 527. La t-PA es secretada por el endotelio de los vasos sanguíneos y circulantes en la sangre como una forma de cadena única. A diferencia de muchos otras proteasas serina, la forma de cadena única o "proenzima" de t-PA tiene una eficiencia catalítica alta. La actividad de t-PA es incrementada en la presencia de fibrina. En la ausencia de fibrina, la t-PA de cadena única es aproximadamente 8% como activa comparada a la t-PA de dos cadenas, sin embargo en la presencia de fibrina las formas de cadena única o de dos cadenas de t-PA exhiben actividad similar. (Strandberg et al. (1995) J. Biol. Chem. , 270: 23444-23449). De esta forma, la activación de t-PA de cadena única puede ser lograda por desdoblamiento de activación (es decir, desdoblamiento del zimógeno) , resultando en una forma de dos cadenas, o por enlace a la fibrina de co-factor. El desdoblamiento de activación ocurre después del desdoblamiento del plásmido, calicreina de tejido y Factor X activado en posición de aminoácidos Arg275-Ile276 (que corresponde a Arg310-Ile311 en la secuencia de aminoácidos fijados en la SEC ID NO: 193) resultando en la generación de la forma de dos cadenas activa de t-PA. El polipéptido de dos cadenas contiene una cadena A y B que están conectadas por un enlace de disulfuro intercadena. La t-PA madura contiene 16 puentes de disulfuro y se organiza en cinco distintos dominios (Gething et al. (1988). La EMBO J. , 7: 2731-2740). Los residuos 4-50 de la proteina madura forman un dominio indicador, los residuos 51-87 forman un dominio similar a EGF, los residuos 88-175 y 176-263 forman dos dominios Kringle que contienen tres enlaces de disulfuro de interdominios cada uno, y los residuos 277-527 de la molécula madura (que corresponde a residuos de aminoácido 311-562 de la secuencia precursora mostrada en la SEC ID NO: 193) configurando el dominio de serina proteasa. En contraste a u-PA, la cual actúa como un activador de enlace al receptor celular, la t-PA funciona como una enzima de activación circulatoria dependiente de fibrina. También, tanto la forma de cadena única como la forma de dos cadenas de t-A son susceptibles a inhibición por sus inhibidores cognados, por ejemplo, PAI-1, aunque la t-PA de dos cadenas es inhibida por PAI-1 aproximadamente 1.4 veces más rápidamente que la t-PA de cadena única (Tachis et al. (1997) J Biol. Chem. , 272: 14580-5). La t-PA puede llegar a ser protegida a partir de la inhibición enlazando a su sitio de enlace celular Anexina-II en células endoteliales . De esta forma, aunque tanto t-PA como u-PA desdoblan y activan plasminógeno, la acción de t-PA en la sangre, soporta a t-PA como el activador fibrinolitico primario del plasminógeno, mientras u-PA es el activador celular primario de plasminógeno. (c) MT-SP1 La MT-SP1 de serina proteasa tipo membrana (también llamada matriptasa, TADG-15, supresor de tumorigenicidad 14, ST14) es una proteasa ejemplar para selección en los métodos proporcionados en este documento para seleccionar variantes con una- especificidad de sustrato alterado contra una secuencia desdoblada de sustrato deseado o predeterminado. La secuencia de MT-SP1 se muestra en la SEC ID NO: 252 y codifica un polipéptido de aminoácido 855 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrados en la SEC ID NO: 253. Es una proteinasa multidominio con un dominio de proteinasa serina C-terminal (Friedrich et al. (2002) J Biol Chem 277 (3):2160). Una variante de aminoácido 683 de la proteasa se ha aislado, pero esta proteina parece ser una forma truncada o una forma ectodominio. La MT-SP1 es altamente expresada o activa en cánceres de próstata, mama y colorectal y puede jugar un papel en la metástasis de cáncer de próstata y mama. La MT-SP1 también es expresada en una variedad de tejidos epiteliales con altos niveles de actividad y/o expresión en el tracto gastrointestinal y la próstata del humano. Se conocen otras especies de MT-SP1. Por ejemplo, un homólogo de ratón de MT-SP1 se ha identificado y llamado epitina. La MT-SP1 contiene un dominio de transmembrana, dos dominios CUB, cuatro repeticiones LDLR y un dominio de serina proteasa (o dominio SI de peptidasa; también llamado la cadena B) entre aminoácidos 615-854 (o 615-855 dependiendo en las variaciones en la literatura) en la secuencia mostrada en 1 SEC ID NO: 253. La secuencia de aminoácido del dominio de proteasa se muestra en la SEC ID NO: 505 y se codifica por una secuencia de ácidos nucleicos mostrados en la SEC ID NO: 504. La MT-SP1 se sintetiza como un zimógeno, y activa para formar una cadena doble por desdoblamiento. Además, el dominio proteolitico de cadena única solo es catalíticamente activado y funcional. Una variante de MT-SP1, llamado CB468, que tiene una mutación de C122S que corresponde a la secuencia de tipo nativo de MT-SP1 mostrada en ya sea SEC ID NO: 253 ó 505; en base a numeración de quimiotripsina, exhibe visualización mejorada en los vectores de fagémido. Tal variante MT-SP1 se muestra en la SEC ID NO: 515 (MT-SP1 de longitud completa) ó SEC ID NO: 507 (dominio de proteasa) y se puede usar en los métodos descritos en este documento posteriormente . La T-SP1 pertenece a la familia SI de peptidasa de proteasa de serina (también referida como la familia de quimiotripsina) , la cual también incluye quimiotripsina y tripsina. Generalmente, los elementos de la familia quimiotripsina divide la homología de secuencia y estructural con quimiotripsina. La MT-SP1 es numerada en este documento de conformidad con la numeración de quimiotripsina madura, con su dominio de proteasa alineado con el dominio de proteasa de quimiotripsina y sus residuos numerados en consecuencia. En base a la numeración de quimiotripsina, los residuos del sitio activo son Aspl02, His57 y Serl95 (que corresponde a Asp711, His656, y Ser805 en la SEC ID NO: 253). La secuencia de aminoácido lineal puede ser alineada con la quimiotripsina y numerada de conformidad con las láminas ß de quimiotripsina. Las inserciones y supresiones ocurren en los bucles entre las láminas beta, pero en toda la familia estructural, las láminas del centro son conservadas. La serina proteasa interactúa con un sustrato en una manera de lámina beta conservada. Hasta 6 enlaces de hidrógeno conservado pueden ocurrir entre el sustrato y la enzima. Todas las serinas proteasas de la familia quimiotripsina tienen una región conservada a sus N-términos del dominio de proteasa que es necesario para actividad catalítica (es decir, IIGG, VVGG o IVGG, en donde el primer aminoácido en este cuarteto es numerado de conformidad con le numeración de quimiotripsina y proporciona la designación Ilel6. Esta numeración no refleja la longitud de la secuencia precursora) . La especificidad del sustrato de MT-SP1 en el dominio de proteasa ha sido mapeado usando una biblioteca combinatoria sintética de exploración y exhibición de fago del sustrato (Takeuchi et al. (2000) J Biol Chem 275: 26333). Los residuos desdoblados en los sustratos reconocidos por MT-SP1 contienen Arg/Lys a P4 y los residuos básicos o Gln a P3, pequeños residuos a P2, Arg o Lys a Pl, y Ala a Pl' , Los sustratos efectivos contienen Lys-Arg-Ser-Arg en los sitios P4 hasta Pl, respectivamente. Generalmente, la especificidad del sustrato por MT-SP1 revela una tendencia por lo cual si P3 es básico, entonces P4 tiende a ser no básico; y si P4 es básico, entonces P3 tiende a ser no básico. Sustratos conocidos para MT-SP1, que incluye, por ejemplo, receptor 2 activado por proteinasa (PAR-2) , uPA de cadena única (sc-uPA) , la proforma de MT-SPl, y el factor de crecimiento de hepatocito (HGF) , conforma a la secuencia desdoblada para sustratos específicos de MT-SPl. La MT-SPl puede desdoblar sustratos sintéticos seleccionados tan eficientemente como tripsina, pero exhibe una especificidad más restringida para sustratos de tripsina. El dominio catalítico de MT-SPl tiene el pliegue estructural completo de una serina proteasa similar a (quimio) tripsina, pero exhibe propiedades únicas tal como un sub-sitio S2/S4 hidrofóbico/acídico y un bucle 60 expuesto. Similarmente, la MT-SPl no desdobla indiscriminadamente sustratos del péptido en residuos Lys o Arg accesibles, pero requiere reconocimiento de residuos adicionales que rodean el enlace del péptido desdoblado. Este requerimiento para una secuencia primaria extendida refleja la especificidad de MT-SPl para sus sustratos. Por ejemplo, a pesar que MT-SPl desdobla el receptor 2 activado por proteinasa (PAR-2) (que exhibe una secuencia objetivo P4 hasta Pl) de Ser-Lys-Gly-Arg) , la enzima no activa proteínas estrechamente relacionado a este sustrato tal como PAR-1, PAR-3 y PAR-4 que no exhiben secuencias objetivo combinando la especificidad de MT-SPl extendida cerca del enlace desdoblado (véase Friedrich et al. (2002) J Biol Chem 277: 2160).

El dominio de proteasa de MT-SP1 está compuesto de una pro-región y un dominio catalítico. La porción catalíticamente activa del polipéptido inicia después del sitio de autoactivación en residuo 611 de aminoácido de la proteína madura (véase, por ejemplo SEC ID NO: 253 en RQAR seguido por los residuos VVGG) . El paquete SI de MT-SP1 y tripsina es similar con buena complementariedad para Lys, así como también para residuos Arg Pl, con ello continuando para algunas similitudes en desdoblamiento de sustrato con tripsina. La adaptación de los residuos Lys Pl es mediada por Ser cuya cadena lateral proporciona un receptor de enlace de hidrógeno adicional para estabilizar el grupo a-amonio metido (véase Friedrich et al. (2002) J Biol Chem 277: 2160). El paquete S2 está formado por cadenas laterales hidrofóbicas de tamaño medio a pequeño acomodados de aminoácidos P2 y generalmente aceptan un intervalo amplio de aminoácidos en la posición P2. En el enlace de sustrato, el sub-sitio S2 no es rígido como se evidencia por la rotación del grupo bencilo Phe". Los aminoácidos del sustrato en las posiciones P3 (para ya sea Gln o residuos básicos) y P4 (para residuos Arg o Lys) parecen ser mediados por interacciones electroestáticas en los paquetes S3 y S4 con las cadenas laterales acídicas de Asp-217 y/o Asp-96 las cuales pueden favorablemente pre-orientar sustratos de péptido básico específico cuando se acerca a la hendidura del sitio activo de la enzima. La cadena lateral de un residuo P3 también es capaz unir hidrógeno al grupo carboxamida de Gln192 o alternativamente, la cadena lateral P3 puede extenderse en el sub-sitio S4 para formar un enlace de hidrógeno con Phe97, con ello debilitar los enlaces de hidrógeno de cadena interprincipal con Gly216. En cualquier conformación, una cadena lateral P3 básica es capaz para interactuar favorablemente con el potencial negativo del paquete S4 MT-SP1. La compensación y exclusión de carga mutua a partir del mismo sitio S4 explica la baja probabilidad de la ocurrencia simultánea de residuos Arg/Lys a P3 y P4 en sustratos buenos MT-SPl. Generalmente, las posiciones de aminoácido de MT-SPl (en base a numeración de quimiotripsina) que contribuye a extender la especificidad para enlace de sustrato que incluye: 146 y 151 (SI'); 189, 190, 191, 192, 216, (SI); 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 99 (S2); 192, 217, 218, 146 (S3) ; 96, 97, 98, 99, 100, 168, 169, 170, 170A, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 178, 179, 180, 215, 217, 224 (S4) . ii . Proteasas de Cisteina Proteasas de cisteina tienen un mecanismo catalítico que involucra un grupo de sulfhídrilo de cisteina. La desprotonacion del sufhídrilo de cisteina por un residuo histidina adyacente es seguido por ataque nucleofilico de la cisteina en el carbono péptido carbonilo. Un tioéster enlazado a nuevo término carboxi al tiol cisteina es un intermediario de la reacción (comparable al intermediario acril-enzima de una serina proteasa) . Las proteasas de cisteina incluyen papaina, catepsina, caspasas y calpainas. Las proteasas de cisteina similar a papaina son una familia de endo-peptidasas dependientes de tiol relacionadas por similitud estructural a papaina. Forman una proteina de dos dominios con los dominios R y L etiquetados (para derecho e izquierdo) y bucles a partir de ambos dominios forman una hendidura de reconocimiento del sustrato. Pueden tener un triada catalítica hecha de los aminoácidos Cys25, Hisl59 y Asnl75. A diferencia de proteasas de serina las cuales reconocen y proteolizan un péptido objetivo a base de una conformación de lámina beta del sustrato, esta familia de proteasa no tiene paquetes bien definidos para reconocimiento de sustrato. El reconocimiento de sustrato principal ocurre en al aminoácido P2 (comparado al residuo Pl en proteasas de serina) . La especificidad del sustrato de un número de proteasas de cisteina (catepsina humana L. V, K, S, F, B, papaina y cruzaína) ha sido determinada usando una biblioteca de combinación sintética de exploración de posición diversa completa (PS-SCL) . La biblioteca completa contiene sustratos de tetrapéptido Pl, P2, P3 y P4 en los cuales una posición sujeta fija mientras las otras tres posiciones son aleatorizadas con mezclas molares iguales de los 20 aminoácidos posibles, dando una diversidad total de -160,000 secuencias de tetrapéptido. En general, la especificidad Pl es al menos idéntica entre las catepsinas, con Arg y Lys siendo fuertemente favorecida mientras los aminoácidos alifáticos pequeños son tolerados. Mucha de la selectividad es encontrada en la posición P2, en donde las catepsinas humanas son estrictamente selectivas para aminoácidos hidrofóbicos . Interesantemente, la especificidad P2 para residuos hidrofóbicos se dividen entre aminoácidos aromáticos tales como Phe, Tyr y Trp (catepsina L, V) y aminoácidos alifáticos voluminosos tal como Val o Leu (catepsina K, S, F) . Comparado a la posición P2, la selectividad en la posición P3 es significantemente menos severa. Varias de las proteasas, sin embargo, tienen una preferencia distinta para prolina (catepsina V, S y papaina) , leucina (catepsina B) , o arginina (catepsina S, cruzaina) . Las proteasas muestra amplia especificidad en la posición P4, como un aminoácido no es seleccionado sobre otros.

El paquete P2 es el más selectivo y mejor caracterizado de los sitios de reconocimiento del sustrato de proteasa. Es definido por los aminoácidos en las siguientes posiciones espaciales (numeración de papaina) : 66, 67, 68, 133, 157, 160 y 205. La posición 205 juega un papel similar a la posición 189 en las proteasas serina, un residuo entra al fondo del paquete que determina la especificidad. Los otros determinantes de especificidad incluyen los siguientes aminoácidos (numeración de conformidad con papaina): 61 y 66 (S3) ; 19, 20 y 158 (SI). El determinante estructural para varias proteasas cisteina se lista en la Tabla 9. Típicamente, las modificaciones de una proteasa cisteina, tal como por ejemplo una proteasa papaina, para alterar cualquiera de uno o más de los aminoácidos en la especificidad extendida que enlace el paquete a otros sitios secundarios de interacción que afecta la especificidad o selectividad de una proteasa para un sustrato objetivo que incluye un sustrato objetivo de proteína del complemento.

Tabla 9. Los determinantes estructurales para varias proteasas cisteina E. PROTEASAS MODIFICADAS Y COLECCIONES PARA SELECCIÓN Las proteasas o variantes de las mismas se puede usar en los métodos en este documento para identificar proteasas con una especificidad de sustrato deseado, más a menudo una especificidad de sustrato que es alterada, mejorada u optimizada. Las proteasas modificadas a ser usadas en el método proporcionado en este documento pueden ser generadas mutando cualquiera de uno o más residuos de aminoácido de una proteasa usando cualquier método comúnmente conocido en la técnica (véase también Solicitud Estadounidense No. 2004/0146938 publicada). Las proteasas para modificación y los métodos proporcionados en este documento, incluyen, por ejemplo, proteasas de tipo nativo de longitud completa, formas variantes conocidas de proteasas, o fragmentos de proteasas que son suficientes para actividad catalítica, por ejemplo, proteólisis de un sustrato. Tales proteasas modificadas puede ser seleccionadas individualmente contra una proteasa separada objetivo, tal como una serpina o serpina modificada, o pueden ser seleccionadas como una colección, tal como por ejemplo usando una biblioteca de exhibición, que incluye una biblioteca de combinación dónde la exhibición de la proteasa es por, por ejemplo, exhibición de fago, exhibición de superficie celular, exhibición de perlillas, exhibición de ribosoma, u otros. La selección de una proteasa que exhibe especificidad y/o selectividad para una proteasa separada o una forma modificada de la misma, debido a la formación de un complejo inhibitorio covalente estable, puede ser facilitada por cualquier esquema de detección conocido por uno de los expertos en la técnica que incluye, pero no se limita a, etiquetación y /o purificación de afinidad, ELISA, ensayos cromogénicos , ensayos a base de fluorescencia (por ejemplo apagado fluorescente o FRET) , entre otros. 1. Generación de Proteasas Variantes Ejemplos de métodos para secuencias de proteasa mutada incluyen métodos que resultan en mutagénesis aleatoria a través de la secuencia completa o métodos que resultan en mutagénesis enfocadas de una región o dominio seleccionado de la secuencia de proteasa. En un ejemplo, el número de mutaciones hechas por la proteasa es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20. En una modalidad preferida, las mutaciones confieren especificidad de sustrato incrementada. En algunos ejemplos, la actividad del variante de proteasa es incrementada por al menos 10 veces, 100 veces o 1000 veces sobre la actividad de la proteasa de tipo nativo. En aspectos relacionados, el incremento en actividad es una especificidad de sustrato. a. Mutagenesis al Azar Los métodos de mutagénesis al azar incluyen, por ejemplo, el uso de E. coli HL1 rojo, irradiación UV, modificaciones químicas tales como desaminación, alquilación o mutágenos análogos de base o métodos PCR tal como lanzadera de ADN, mutagénesis de cásete, mutagénesis al azar dirigida al sitio o PCR propenso al error (véase, por ejemplo Solicitud Estadounidense No.: 2006-00115874). Tales complejos incluyen; pero no se limitan a, modificaciones químicas por hidroxilamina (Rúan, H. et al. (1997) Gene 188:35-39), el uso de análogos dNTP (Zaceólo, . et al. (1996) J. Mol. Biol . 255-603), o el uso de kits de mutagénesis al azar disponibles tal como, por ejemplo, kits de mutagénesis al azar a base de PCR GeneMorph (Stratagene) o kits de mutagénesis al azar Diversify (Clontech) . El kit de mutagénesis a lazar Diversify permite la selección de una proporción de mutación deseada para una secuencia de ADN proporcionada (de 2 hasta 8 mutaciones/1000 pares bases) variando la cantidad de manganeso (Mn2+) y dGTP en la mezcla de reacción. Elevando los niveles de manganeso inicialmente incrementa la proporción de mutación, con un incremento en proporción de mutación adicional proporcionado por concentración incrementada de dGTP. Aún proporciones mayores de mutación pueden ser logradas desarrollando rondas adicionales de PCR. b. Mutagénesis Enfocada La mutación enfocada puede ser lograda elaborando una o más mutaciones en una región predeterminada de una secuencia de gen, por ejemplo, en regiones del dominio de proteasa que media la actividad catalítica. En un ejemplo, cualquiera de uno o más aminoácidos de una proteasa mutada usando cualquier kit de mutagénesis dirigida al sitio única o múltiple estándar tal como por ejemplo QuikChange (Stratagene) . En otro ejemplo, cualquiera de uno o más aminoácidos de una proteasa son mutadas por mutagénesis de saturación (Zheng et al. (2004) Nucí. Acids . Res., 32:115), tal como por ejemplo, mutagénesis de residuos del sitio activo. En este ejemplo, los residuos que forman el paquete S1-S4 de una proteasa (en donde la proteasa está en contacto con los residuos P1-P4 del sustrato del péptido ( y/o que han sido mostrados por ser determinantes importantes de especificidad son mutadas para cada aminoácido posible, ya sea solo o en combinación. En algunos casos, existe poca interacción (si ninguna) entre los paquetes S1-S4 del sitio activo, de forma tal que cada paquete parece reconocido y enlazado al residuo correspondiente en la secuencia del sustrato del péptido independiente de los otros paquetes. De esta forma, los determinantes de especificidad generalmente pueden ser cambiados en un paquete sin afectar la especificidad de los otros paquetes. En una modalidad ejemplar, una técnica de mutagénesis de saturación se usa, en la cual los residuos que revisten el paquete son mutados a cada uno de los 20 aminoácidos posibles (véase por ejemplo, el método Kunkle, de Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media Pa . ) . En tal técnica, un cebador de oligonucleótido mutagénico degenerado puede ser sintetizado el cual contiene al azar nucleótidos en los codones deseados que codifican los aminoácidos seleccionados. Esquemas aleatorizados ejemplares incluyen aleatorización NNS- o NNK-, en donde N representa cualquier nucleótido, S representa guanina o citocina y K representa guanina o timina. El cebador mutagénico degenerado es endurecido a la plantilla de ADN de hebra única y se agrega polimerasa de ADN para sintetizar la hebra complementaria de la plantilla. Después de la ligación, la plantilla de ADN de hebra doble es transformada en E. coli para amplificación. Los aminoácidos que forma el paquete enlazado al sustrato extendido de proteasas ejemplares se describen en este documento. Generalmente, la especificidad del sustrato de una proteasa es conocida tal como por ejemplo, por modelado molecular en base e estructuras tridimensionales del complejo de una proteasa y sustrato (véase por ejemplo, Wang et al. (2001) Biochemistry 40 ( 3 ) : 10038 ; Hopfner et al. Structure Fold Des. 1999 7(8): 989; Friedrich et al. (2002) J Biol Chem 277 (3) : 2160; augh et al. (2000) Nat Struct Biol. 7(9): 762). Por ejemplo, mutaciones enfocadas de MT-SP1 puede estar en cualquiera de uno o más residuos (en base a numeración de quimiotripsina ) que contribuye a la especificidad del sustrato que incluye 195, 102, 157 (la triada catalítica); 189, 190, 191, 192, 216 y 226 (SI); 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 99 (S2); 146, 192, 217, 218 (S3); 96, 97, 98, 99, 100, 168, 169, 170, 170A, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 178, 179, 180, 215, 217, 224 (S) . En otro ejemplo, la mutación de residuos de aminoácido en la proteasa de familia de papaína puede estar en cualquiera' de uno o más residuos que afecta la especificidad P2 (numeración de papaina estándar) que incluye 66-68, 133, 157, 160 y/o 215. Además, los residuos que no están directamente en contacto con el sustrato de proteasa, pero afecta la posición y/o conformación de residuos de contacto (tal como por ejemplo, aquellos listados anteriormente) también pueden ser mutados para alterar la especificidad de un andamiaje de proteasa. En otro ejemplo, los aminoácidos enfocados para mutagénesis pueden ser seleccionados por comparación de secuencia de proteasa homologa con especificidades de sustrato similar. Los residuos de aminoácido consenso pueden ser identificados por alineación de las secuencias amino de las proteínas homologas, por ejemplo, alienación de las regiones de la proteasa que están involucradas en enlace del sustrato. Típicamente, las proteasas con aminoácidos consenso distribuyen especificidades del sustrato similares, por ejemplo, aminoácidos en el paquete de enlace del sustrato, pueden ser idénticos o similares entre los proteasas comparadas. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos de proteasas con especificidades de sustrato diferentes pueden ser comparadas para identificar aminoácidos que pueden ser involucrados en reconocimiento del sustrato. Estos métodos pueden ser combinados con métodos, tal como modelado tri-dimensional , para identificar residuos objetivos para mutagénesis.

En un ejemplo adicional, la mutagénesis enfocada puede ser restringida para aminoácidos que son identificados como manchas calientes en las rondas iniciales de selección de proteasa. Por ejemplo, siguiendo la selección de proteasas a partir de bibliotecas combinatorias mutagenizadas al azar, varias posiciones de "mancha caliente" son típicamente observadas y seleccionadas sobre y sobre nuevamente en los métodos de selección. Más a menudo, ya que la mutagénesis al azar ampliamente muta una secuencia de polipéptido, pero con únicamente pocas mutaciones en cada sitio, se usa la mutagénesis enfocada como una segunda estrategia para específicamente posiciones de mancha caliente objetivo para mutagénesis adicional. La mutagénesis enfocada de posiciones de mancha caliente permite una más diversa y profunda mutagénesis en posiciones específicas particulares, opuestas a la mutagénesis más pocos profundas que ocurre después de la mutagénesis al azar de una secuencia de polipéptido. Por ejemplo, la mutagénesis de saturación puede ser usada para mutar "manchas calientes" tal como usando oligos que contienen NNt/g o NNt/c en esta posiciones. En un ejemplo, usando los métodos proporcionados en este documento, las siguientes manchas calientes se han identificado en u-PA por contribuir a incrementar la especificidad del sustrato: 73, 80, 30 y 155, en base a la numeración de quimiotripsina . La mutación de estas posiciones puede ser lograda, tal como por ejemplo, usando mutagénesis de saturación de una secuencia de proteasa de plantilla o tipo nativo en uno o más sitios para crear colecciones de mutantes de proteasa para ser usados en selección subsecuente. 2. Formas Quiméricas de Proteasas Variantes Las proteasas variantes proporcionadas en este documento pueden incluir proteínas quiméricas o fusiones. En un ejemplo, una proteína de fusión de proteasa comprende al menos una porción catalíticamente activa de una proteína de proteasa. En otro ejemplo, una proteína de fusión de proteasa comprende al menos dos o más porciones catalíticamente activas de una proteasa. Dentro de la proteína de fusión, el polipéptido no de proteasa puede ser fusionado al N-términos o C-términos del polipéptido de proteasa. En una modalidad, la proteína de fusión puede incluir un enlazador o espaciador de péptido flexible, que separa la proteasa de un polipéptido no de proteasa. En una modalidad, la proteína de fusión puede incluir un polipéptido detectable o marca. Se conoce marcas y proteínas detectables ejemplares en la técnica e incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, una marca de histidina, una marca de hemaglutinina, una marca myc o una proteína fluorescente. En aún otra modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión de proteasa GST en la cual, las secuencias de proteasa están fusionadas al N-término de la secuencia GST ( S-transferasa de glutationa) . Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de polipéptidos de proteasa recombinante . En otra modalidad, la proteína de fusión es una fusión Fe en la cual las secuencias de proteasa son fusionadas el N-término del dominio Fe a partir de inmunoglobulina G. Tales proteínas de fusión pueden tener mejores propiedades farmacodinámicas in vivo. En otra modalidad, la proteína de fusión es una proteína de proteasa que contiene una secuencia de señal heteróloga en su N-término. En ciertas células hospederas (por ejemplo, células hospederas de mamífero) , la expresión y/o secreción de proteasa puede ser incrementada a través del uso de una secuencia señal heteróloga. Una proteína de fusión o quimérica de proteasa puede ser producida por técnicas de ADN recombinantes estándar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifica las diferentes secuencias de polipéptido están ligadas juntas en estructura de conformidad con las técnicas convencionales, por ejemplo, empleando términos de extremo romo o extremo escalonado para ligación, digestión de enzima de restricción para proporcionar términos apropiados, presentado en extremos cohesivos como apropiado, el tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizadas. Alternativamente, la amplificación PCR de los fragmentos del gen se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que proporcionan aumento a lanzamientos complementarios entre dos fragmentos del gen consecutivos que pueden subsecuentemente ser endurecidos y amplificados para generar una secuencia del gen quimérico (véase, por ejemplo, Ausuble et al. (eds) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John iley & Sons, 1992). Sin embargo, muchos vectores de expresión son comercialmente disponibles que ya codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica proteasa puede ser clonado en tal vector de expresión tal que la porción de fusión está enlazado en la estructura a la proteina de proteasa. 3. Bibliotecas de Combinación y Otras Bibliotecas La fuente de compuestos para los ensayos de selección, pueden ser colecciones tal como bibliotecas, que incluyen, pero no se limita a, bibliotecas de combinación. Se conocen en la técnica métodos para sintetizar bibliotecas de combinación y características de tales bibliotecas de combinación (Véase generalmente, Combinatorial Librarles : Synthesis , Screening and Application Potential (Córtese Ed. ) Walter de Gruyter, Inc., 1995; Tietze and Lieb, Curr. Opin. Chem. Biol . , 2(3):363-71 (1998); Lam, Anticancer Drug Des. , 12(3):145-67 (1997) ; Blaney and Martin, Curr. Opin. Chem. Biol., l(l):54-9 (1997); and Schultz and Schultz, Biotechnol . Prog., 12(6):729-43 (1996)). Se ha desarrollado métodos y estrategias para generar diversas bibliotecas, que incluyen proteasa o bibliotecas de enzima, que incluyen bibliotecas de combinación sintética de exploración de posición (PSSCL) usando métodos de biológica molecular y/o metodologías de síntesis química simultánea (véase por ejemplo, Georgius, et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:29-34; Kim et al. (2000) Appl Environ Microbiol. 66: 788 793; MacBeath, G.P. et al. (1998) Science 279:1958-1961; Soumillion, P.L. et al. (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. 47:175-189, Wang, C.I. et al. (1996). Methods Enzymol. 267:52-68, Patentes Estadounidenses 6,867,010, 6,168,919, Solicitud de Patente Estadounidense No. 2006-0024289) . Las bibliotecas de combinación resultantes potencialmente contienen millones de compuestos que pueden ser seleccionados para identificar compuestos que exhiben una actividad seleccionada. En un ejemplo, los compuestos de la colección o biblioteca de proteasas pueden ser exhibidos en un paquete genético, que incluye, pero no se limita a cualquier vector replicable, tal como fago, virus o bacteria, que puede exhibir una porción de polipéptido. La pluralidad de polipéptidos exhibidos se exhibe por un paquete genérico en tal manera para admitir el polipéptido, tal como una proteasa o porción del mismo catalíticamente activa, para enlazar y/o interactuar con un polipéptido objetivo. Paquetes genéticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos (véase, por ejemplo, Clackson et 25 a/. (1991) Making Antibody Fragments Using Phage Display Librarles, Nature, 352:624-628; Glaser et al. (1992) antibody Engineering by Condon-Based Mutagenesis in a Filamentous Phage Vector System, J. Immunol., 149:3903 3913; Hoogenboom et al. (1991) Multi-Subunit Proteins on the Surface of Filamentous Phage: Methodologies for Displaying Antibody (Fate) Heavy and 30 Light Chains, Nucleic Acids Res., 19:4133-41370), baculovirus (véase, por ejemplo, Boublik et al./ (1995) Eucaryotic Virus Display: Engineering the Major Surface Glycoproteins of the Autographa California Nuclear Polyhedrosis Virus (ACNPV) for the Presentation of Foregoing Proteins on the Virus Surface, Bio/Technology, 13:1079-1084), la bacteria y otros vectores adecuados para exhibir una proteína, tal como una proteasa que exhibe fago. Por ejemplo bacteriófagos de interés incluyen, pero no se limitan a, fago T4, fago M13 y fago HI. Los paquetes genéticos son opcionalmente amplificados tal como en un hospedero bacteriano. Cualquiera de estos paquetes genéticos, asi como cualquiera de otros conocidos por aquellos expertos en la técnica, se usan en los métodos proporcionados en este documento para exhibir una proteasa o porción del mismo catalíticamente activo . a. Bibliotecas que Exhiben Fago Las bibliotecas de proteasas variante, o porciones del mismo catalíticamente activos, por selección pueden ser expresados en los bacteriófagos de superficie, tal como, pero no se limitan a fagos M13, fd, fl, T7 y ? (véase por ejemplo, Santini (1998) J. Mol. Biol. 282:125-135; Rosenberg et al. (1996) Innovations 6:1-6; Houshmand et al. (1999) Anal Biochem 268:363-370, Zanghi et al. (2005) Nuc. Acids Res. 33 ( 18 ) el60 : 1-8 ) . Las proteasas variantes pueden ser fusionadas a una proteína que recubre el bacteriófago con enlaces covalentes, no covalentes o no peptídicos. (Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,223,409, Crameri et al. (1993) Gene 137:69 y WO 01/05950). Los ácidos nucleicos que codifican la proteasa variante pueden ser fusionados a ácidos nucleicos que codifican la proteína de recubrimiento para producir una proteína de fusión de proteina que recubre la proteasa, en donde la proteína variante es expresada en la superficie del bacteriófago. Por ejemplo, ácido nucleico que codifica la proteasa variante puede ser fusionado a ácidos nucleicos que codifican el dominio C-terminal del Gen III M13 de fase filamentosa (glllp; SEC ID NO: 512) . En algunos ejemplos, se usan una proteasa mutante que exhibe visualización mejorada en el fago como una plantilla para generar bibliotecas que exhiben el fago mutante como se describe en este documento. Por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 8, una MT-SP1 mutante que tiene la mutación de serina a cisteína en la posición que corresponde a la posición 122 de MT-SP1 de tipo nativo, en base a numeración de quimiotripsina que exhibe visualización del fago mejorada. Por lo tanto, tal mutante puede ser usado como las plantillas a partir de las cuales se genera diversidad en la biblioteca. Adicionalmente , la proteína de fusión puede incluir un enlazador o espaciador de péptido flexible, una marca o polipéptido detectable, un sitio de proteasa o modificaciones de aminoácido adicional para mejorar la expresión y/o utilidad de la proteína de fusión. Por ejemplo, además de un sitio de proteasa puede permitir para recuperación eficiente de bacteriófagos deseados siguiendo un procedimiento de selección. Se conocen en la técnica marcas y proteínas detectables ejemplares e incluyen por ejemplo, pero no se limita a, una marca de histidina, una marca de hemaglutinina, una marca myc o una proteína fluorescente. En otro ejemplo, el ácido nucleico que codifica la fusión de proteína que recubre la proteasa puede ser fusionado a una secuencia líder para mejorar la expresión del polipéptido. Ejemplos de secuencias líder incluyen, pero no se limitan a, STII o OmpA. La exhibición del fago se describe, por ejemplo, en Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5,223,409; Rodi et al. (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6:92-96; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; O 91/17271; WO 92/20791; O 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clakson et al. (1991) Nature 352 : 624-628M Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133- 137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

Se conocen en la técnica ácidos nucleicos adecuados para exhibición del fago, por ejemplo, vectores del fago, (véase por ejemplo, Andris-Widhopf et al. (2000) J Immunol Methods, 28: 159-81; Armstrong et al. (1996) Academic Press, Kay et al. Ed. Pp 35-53; Corey et al. (1993) Gene 128 (1) : 129-34; Cwirla et al. (1990) Proc Nati Acad Sci USA 87 ( 16) ; 6378-82 ; Fowlkes et al. (1992) Biotechniques 13(3):422-8; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19 (15) : 4133-7; McCafferty et al. (1990) Nature 348 (6301) : 552-4; McCdonnel et al. (1994) Gene 151 ( 1-2 ): 115-8; Scott and Smith (1990) Science 249 (4967) : 386-90) . Una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de proteínas que recubren la proteasa, típicamente variantes de proteasa generadas como se describe anteriormente, pueden ser incorporadas en el genoma del bacteriófago, o alternativamente insertadas en un vector fagémido. En un sistema fagémido, el ácido nucleico que codifica la proteína exhibida se proporciona en un vector fagémido, típicamente de longitud de menos de 6000 nucleótidos. El vector fagémido incluye un origen de fago de replicacion de forma que el plásmido es incorporado en partículas de bacteriófago cuando las células bacterianas que portan el plásmido son infectadas con fago auxiliador, por ejemplo, M13K01 o M13VCS. Los fagémidos, sin embargo, carecen de una serie suficiente de genes del fago para producir partículas de fago estables después de la infección. Estos genes del fago pueden ser proporcionados por un fago auxiliador. Típicamente, el fago auxiliador proporciona una copia intacta de la proteína de recubrimiento del gen III y otros genes del fago requeridos para replicación del fago y montaje. Debido a que el fago auxiliador tiene un origen defectivo de replicación, el genoma del fago auxiliador no es eficientemente incorporado en partículas del fago en relación al plásmido que tiene un origen de tipo nativo. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,821,047. El genoma fagémido contiene un gen marcador seleccionable, por ejemplo, Amp.sup.R o Kan.sup.R (para resistencia a ampicilina o canamicina, respectivamente) para la selección de células que son infectadas por un elemento de la biblioteca. En otro ejemplo de exhibición del fago, los vectores que pueden ser usados portan ácidos nucleicos que codifican una serie de genes del fago suficientes para producir una partícula del fago infecciosa cuando se expresa, una señal de empaquetado del fago, y una secuencia de replicación autónoma. Por ejemplo, el vector puede ser un genoma del fago que se ha modificado para incluir una secuencia que codifica la proteína exhibida. Los vectores que exhiben el fago pueden además incluir un sitio en el cual una secuencia de ácido nucleico extraño puede ser insertada, tal como un sitio de clonación múltiple que contiene sitios de digestión de enzima de restricción. Las secuencias de ácido nucleico extrañas, por ejemplo, que codifica proteínas exhibidas en vectores del fago, pueden ser enlazadas a un sitio de enlace ribosomal, una secuencia de señal (por ejemplo, una secuencia de señal M13) , y una secuencia terminadora transcripcional . Los vectores pueden ser construidos por técnicas de clonación estándar para contener secuencias que codifican un polipéptido que incluye una proteasa y una porción de una proteína que reviste el fago, y la cual está operablemente enlazada a un promotor regulable. En algunos ejemplos, un vector que exhibe fago incluye dos secuencias de ácido nucleico que codifica la misma región de una proteína que recubre el fago. Por ejemplo, el vector incluye una secuencia que codifica tal región en una posición operablemente enlazada a la secuencia que codifica la proteína exhibida, y otra secuencia la cual codifica tal región en el contexto del gen de fago funcional (por ejemplo, un gen del fago de tipo nativo) que codifica la proteína de recubrimiento. La expresión tanto de proteínas de tipo nativo como de recubrimiento de fusión pueden ayudar en la producción de fago maduro disminuyendo la cantidad de proteína de fusión hecha por partícula del fago. Tales métodos son particularmente útiles en situaciones en donde la proteina de fusión es menos tolerada por el fago. Los sistemas que exhiben el fago típicamente utilizan el fago filamentoso, tal como 13, fd, y fl. En algunos ejemplos usando fago filamentoso, la proteína exhibida se fusiona a un dominio de anclaje de proteína que recubre el fago. La proteína de fusión puede ser coexpresada con otro polipéptido que tiene el mismo dominio de anclaje, por ejemplo, una copia de tipo nativo o endógeno de la proteína de recubrimiento. Las proteínas que recubren el fago que pueden ser usadas para exhibir proteína incluyen (i) proteínas de recubrimiento secundarias, tal como proteína del gen III (glllp) , y (ii) proteínas de recubrimiento principales del fago filamentoso tal como proteína del gen VIII (gVIIIp) . También se pueden usar fusiones a otras proteínas que recubren el fago tal como proteína del gen VI, proteína del gen VII o proteína del gen IX (véase, por ejemplo, WO 00/71694). También se pueden usar porciones de estas proteínas (por ejemplo, dominios o fragmentos) . Porciones útiles incluyen dominios que están establemente incorporadas en la partícula del fago, por ejemplo, de forma que la proteína de fusión permanece en la partícula durante todo un procedimiento de selección. En un ejemplo, se usa el dominio de anclaje de glllp (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,658,727 y Ejemplos posteriores) . En otro ejemplo, se usa gVIIIp (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,223,409), la cual puede ser una gVIIIp de longitud completa, madura fusionada a la proteína exhibida. Los sistemas que exhibe el fago filamentoso típicamente usan fusiones de proteína para unir la secuencia de aminoácido heteróloga a una proteína que recubre el fago o dominio de anclaje. Por ejemplo, el fago puede incluir un gen que codifica una secuencia de señal, la secuencia de aminoácido heterólogo, y el dominio de anclaje, por ejemplo, un dominio de anclaje glllp. La valencia de la proteína de fusión expresada puede ser controlada por elección de la proteína que recubre el fago. Por ejemplo, las proteínas glllp típicamente están incorporadas en el recubrimiento del fago en tres a cinco copias por virión. La fusión de glllp a proteasas variantes, de esta forma produce una valencia menor. En comparación, las proteínas gVIII típicamente se incorporan en el recubrimiento del fago a 2700 copias por virión (Marvin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8:150-158). Debido a la valencia mayor de gVIIIp, los péptidos mayores que diez residuos no son generalmente bien tolerados por el fago. Los sistemas fagémidos se puede usar para incrementar la tolerancia del fago a péptidos más grandes, proporcionando copias de tipo nativo de las proteínas de recubrimiento para disminuir la valencia de la proteina de fusión. Adicionalmente, se pueden usar mutantes de gVIIIp los cuales son optimizados para expresión de péptidos más grandes. En un ejemplo, un gVIIp mutante se obtiene en una selección de mutagénesis para gVIIIp con propiedades de exhibición de superficie mejoradas (Sidhu et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:487-495). También se pueden usar promotores regulables para controlar la valencia de la proteina exhibida. La expresión regulada puede ser usada para producir el fago que tiene una valencia baja de la proteina exhibida. Se conocen muchas secuencias del promotor regulables (por ejemplo, inducibles y/o reprimibles) . Tales secuencias incluyen promotores regulables cuya actividad puede ser alterada o regulada por la intervención del usuario, por ejemplo, por manipulación de un parámetro ambiental, tal como, por ejemplo, temperatura o por adición de moléculas estimulantes o remoción de una molécula represora. Por ejemplo, puede ser agregado un compuesto químico exógeno para regular la transcripción de algunos promotores. Los promotores regulables pueden contener sitios de enlace para uno o más activadores de transcripción o proteína represora. Pueden ser construidos promotores sintéticos que incluyen sitios de enlace del factor de transcripción y también pueden ser usados como promotores regulables.

Promotores regulables ejemplares incluyen promotores responsables para un parámetro ambiental, por ejemplo, cambios térmicos, hormonas, metales, metabolitos, antibióticos o agentes químicos. Promotores regulables apropiados para uso en E. coli, incluyen promotores los cuales contienen sitios del factor de transcripción a partir de secuencias operadoras lac, tac, trp, trc, y tet, u operones, el promotor de fosfatasa alcalina (pho) , un promotor de arabinosa tal como un promotor araBAD, el promotor de ramnosa, los mismos promotores, o fragmentos de los mismos funcionales (véase, por ejemplo, Elvin et al. (1990) Gene 37:123-126; Tabor and Richardson, (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1074-1078; Chang et al. (1986) Gene 44:121-125; Lutz and Bujard, (1997) Nucí. Acids. Res. 25: 1203-1210; D. V Goeddel et al. (1979) Proc. Nat . Acad. Sci. USA. , 76:106-110; J. D. indass et al. (1982) Nucí. Acids. Res., 10:6639-57; R. Crowl et al. (1985) Gene, 38:31-38; Brosius (1984) Gene 27: 161-172; Amanna and Brosius, (1985) Gene 40: 183-190; Guzman et al. (1992) J. Bacteriol., 174: 7716-7728; Haldimann et al. (1998) J. Bacteriol., 180: 1277-1286) . El promotor lac, por ejemplo, puede ser inducido por lactosa o moléculas estructuralmente relacionadas tal como isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) y es representada por glucosa. Algunos promotores inducibles son inducidos por un proceso de desrepresión, por ejemplo, inactivación de una molécula represora. Una secuencia del promotor regulable también puede ser indirectamente regulada. Ejemplos de promotores que puede ser diseñados por ingeniería para regulación indirecta incluyen: el fago lambda PR, PL, fago T7, SP6 y promotores T5. Por ejemplo, la secuencia reguladora es representada o activada por un factor cuya expresión es regulada, por ejemplo, por un parámetro ambiental. Un ejemplo de tal promotor es un promotor T7. La expresión de la polimerasa ARN T7 puede ser regulada por un promotor ambientalmente responsable tal como el promotor lac. Por ejemplo, la célula puede incluir un ácido nucleico heterólogo que incluye una secuencia que codifica la polimerasa ARN T7 y una secuencia reguladora (por ejemplo, el promotor lac) que es regulada por un parámetro ambiental. La actividad de la polimerasa ARN T7 puede también ser regulada por la presencia de un inhibidor natural de polimerasa ARN, tal como lisozima T7. En otra configuración, el PL lambda puede ser diseñado por ingeniería para ser regulado por un parámetro ambiental. Por ejemplo, la célula puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante sensible a la temperatura del represor lambda. Las células aumentadas a la temperatura no permisible aligeran el promotor PL de la represión. Las propiedades reguladoras de un promotor o secuencia reguladora transcripcional pueden ser fácilmente probadas enlazando operablemente el promotor o secuencia o una secuencia que codifica una proteina reportera (o cualquier proteina detectable) . Esta secuencia de fusión promotora-reportera se introduce en una célula bacteriana, típicamente en un plásmido o vector, y la abundancia de la proteína reportera es evaluada bajo una variedad de condiciones ambientales. Un promotor o secuencia útil es una que es selectivamente activada o reprimida en ciertas condiciones . En algunas modalidades, se usan promotores no regulables. Por ejemplo, un promotor puede ser seleccionado para producir una cantidad apropiada de transcripción bajo las condiciones relevantes. Un ejemplo de un promotor no regulable es el promotor gilí. b. Bibliotecas que Exhiben la Superficie Celular Las bibliotecas de proteasas variantes para selección pueden ser expresadas en las superficies de células, por ejemplo, células procarióticas o eucarióticas. Células ejemplares para expresión de superficie celular incluyen, pero no se limitan a, bacterias, levadura, células de insecto, células de ave, células de planta y células de mamífero (Chen and Georgious (2002) Biotechnol Bioeng 79:496-503). En un ejemplo, las células bacterianas para expresión son Escherichia coli. Proteasas variantes pueden ser expresadas como una proteína de fusión con una proteína que es expresada en la superficie de la célula, tal como una proteína de membrana o proteína asociada a la superficie celular. Por ejemplo, una proteasa variante puede ser expresada en E. coli como una proteína de fusión con una proteína de membrana externa de E. coli (por ejemplo, OmpA) , una molécula híbrida genéticamente diseñada por ingeniería de la lipoproteína de E. coli principal (Lpp) y la proteína de membrana externa OmpA o una proteína asociada a la superficie celular (por ejemplo, subunidades pili y flagelar) . Generalmente, cuando se usa proteínas de membrana externa bacteriana para exhibir los péptidos o proteínas heterólogos, se logra a través de inserciones genéticas en sitios permisivos de las proteínas portadoras. La expresión de un péptido o proteína heterólogos depende de las propiedades estructurales del dominio de proteína insertada, ya que el péptido o proteína es más restringida cuando se inserta en un sitio permisivo comparado a la fusión en el N-término o C-término de una proteína. Se pueden hacer modificaciones a la proteína de fusión para mejorar la expresión de la proteína de fusión, tal como la inserción de secuencias espadadoras o enlazadoras del péptido flexible o modificación de la proteina bacteriana (por ejemplo, por mutación, inserción o supresión, en la secuencia de aminoácido) . Las enzimas, tales como ß-lactamasa y la exoglucanasa Cex de Cellulomonas fimi, han sido exitosamente expresadas como proteínas de fusión Lpp-OmpA en la superficie de E. coli (Francisco J.A. and Georgiou G. Ann N Y Acad Sci, 745:372-382 (1994) y Georgiou G et al. Protein Eng. 9:239-247 (1996)). Se han exhibido otros péptidos de aminoácidos 15-514 en el segundo, tercero y cuarto bucles externo en la superficie de OmpA (Samuelson et al. J. Biotechnol. 96:129-154 (2002)). De esta forma, las proteínas de membrana externa pueden portar y exhibir productos del gen heterólogo en la superficie externa de la bacteria. En otro ejemplo, proteasas variantes pueden ser fusionadas a dominios autotransportadores de proteínas tal como proteasa IgAl de N. gonorrhoeae, proteasa de serina Serratia marcescens, la proteína VirG de Shigella flexneri , y la AIDA-I adesina de E. coli (Klauser et al. EMBO J. 1991-1999 (1990); Shikata S, et al. J Biochem. 114:723-731 (1993); Suzuki T et al. J Biol Chem. 270:30874-30880 (1995); y Naurer J et al. J Bacteriol. 179:794-804 (1997)). Otras proteínas autotransportadoras incluyen aquellas presente en especies gram negativas (por ejemplo, E. coli, Salmonella serovar Typhimurium y S. flexneri) . Las enzimas, tales como ß-lactamasa, han sido exitosamente expresadas en la superficie de E. coli usando este sistema (Lattemann CT et al. J Bacteriol. 182(13): 3726-3733 (2000)). La bacteria puede ser recombinantemente diseñada por ingeniería para expresar una proteína de fusión, tal como una proteína de fusión de membrana. Ácidos nucleicos que codifican las proteasas variantes pueden ser fusionados a ácidos nucleicos que codifican una proteína de superficie celular, tal como, pero no se limitan a, una proteína OmpA bacteriana. Los ácidos nucleicos que codifican las proteasas variantes pueden ser insertados en un sitio permisible en la proteína de membrana, tal como un bucle extracelular de la proteína de membrana. Adicionalmente, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede ser fusionado a un ácido nucleico que codifica una marca o proteína detectable. Tales marcas y proteínas detectables se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, una marca de histidina, una marca de hemaglutinina , una marca myc o una proteína fluorescente. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión pueden estar operablemente enlazados a un promotor para expresión en la bacteria. Por ejemplo un ácido nucleico que puede ser insertado en un vector o plásmido, el cual puede portar un promotor para expresión de la proteína de fusión y opcionalmente, genes adicionales para selección, tal como para resistencia a antibióticos. La bacteria puede ser transformada con tales plásmidos, tal como por electroporacion o transformación química. Tales técnicas se conocen por un experto ordinario en la técnica. Son usualmente sintetizadas proteínas en la membrana externa o espacio periplásmico en el citoplasma como proteínas premaduras, las cuales se desdoblan en una secuencia señal para producir la proteína madura que es exportada fuera del citoplasma. Se conocen secuencias señales ejemplares usadas para producción secretoria de proteínas recombinantes para E. coli. La secuencia de aminoácido N-terminal, sin la extensión Met, puede ser obtenida después del desdoblamiento por la peptidasa señal cuando un gen de interés es correctamente fusionado a una secuencia señal. De esta forma, puede ser producida una proteína madura sin cambiar la secuencia de aminoácido de la proteína de interés (Choi and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:625-635 (2004). Se conocen otros sistemas que exhiben la superficie celular en la técnica e incluyen, pero no se limitan a sistema que exhibe la superficie bacteriana a base de proteína de nucleación en hielo (lnp) (Lebeault J M (1998) Nat Biotechnol. 16:576 80), que exhibe levadura (por ejemplo, fusiones con la proteína de pared celular Aga2p de levadura; véase Patente Estadounidense No. 6,423,538), que exhibe célula de insecto (por ejemplo, que exhibe baculovirus ; véase Ernst et al. (1998) Nucleic Acids Research, Vol 26, número 7 1718-1723) , que exhibe célula de mamífero y otros sistemas que exhiben eucarióticos (véase por ejemplo, 5,789,208 y WO 03/029456). c. Otras Bibliotecas de Exhibición También es posible usar otros formatos de exhibición para proyectar bibliotecas de proteasas variantes, por ejemplo, bibliotecas, cuyas variaciones se designan como se describen en este documento. Ejemplarmente otros formatos de exhibición incluyen fusiones ácido nucleico-proteína, que exhibe ribosoma (véase, por ejemplo, Hanes and Pluckthun (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 13:4937-4942), que exhibe perlillas (Lam, K. S. et al. Nature (1991) 354, 82-84; K. S. et al. (1991) Nature, 354, 82-84; Houghten, R. A. et al. (1991) Nature, 354, 84-86; Furka, A. et al. (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37, 487-493; Lam, K. S., et al. (1997) Chem. Rev. , 97, 411-448; Solicitud de Patente Estadounidense Publicada 2004-0235054) y series de proteína (véase por ejemplo, Cahill (2001) J. Immunol. Meth. 250:81-91, WO 01/40803, WO 99/51773 y US2002-0192673-A1) . En otros casos específicos, puede ser ventajoso en vez de unir las proteasas, proteasas variantes o porciones catalíticamente activas o bibliotecas del fago o células que expresan proteasas variantes a un soporte sólido. Por ejemplo, en algunos ejemplos, las células que expresan proteasas variantes pueden ser naturalmente adsorbidas a una perlilla, de forma tal que una población de perlillas contiene una perlilla por célula única (Freeman et al. Biotechnol. Bioeng. (2004) 86:196-200). Después de la inmovilización a un soporte de vidrio, las microcolonias se pueden hacer crecer y seleccionar con un sustrato cromogénico o fluorogénico . En otro ejemplo, se pueden ordenar proteasa variante o bibliotecas del fago o células que expresan proteasas variantes en placas tituladoras e inmovilizadas.

F. MÉTODO PARA PONER EN CONTACTO, AISLAR E IDENTIFICAR PROTEASAS SELECCIONADAS Después que han sido elegidas y preparadas una pluralidad de colecciones o bibliotecas que exhiben proteasas o porciones de la misma catalíticamente activa, las bibliotecas se usan para poner en contacto un polipéptido que atrapa proteasa objetivo con los componentes de proteasa. Los sustratos objetivo, que incluyen, por ejemplo, un polipéptido que atrapa proteasa tal como una serpina mutada en su bucle RSL por tener una secuencia de desdoblamiento deseada, están en contacto con las bibliotecas de proteasa exhibida para selección de una proteasa con especificidad de sustrato alterado. La proteasa y el polipéptido que atrapa proteasa pueden estar en contacto en suspensión, solución o vía un soporte sólido. Los componentes están en contacto por un tiempo, temperatura o concentración suficiente para interacción para ocurrir y para la subsecuente reacción de desdoblamiento y formación de un complejo intermedio estable de la proteasa seleccionada y polipéptido que atrapa proteasa. La severidad por la cual la reacción es mantenida, puede ser modulada cambiando uno o más parámetros de entre la temperatura de reacción, concentración del inhibidor de polipéptido que atrapa proteasa, concentración de un competidor (si es incluido), concentración de la colección de proteasas en la mezcla, y duración de tiempo de la incubación. Las proteasas seleccionadas que forman complejos covalentes con el polipéptido que atrapa proteasa son capturadas e aisladas. Para facilitar la captura, los polipéptidos que atrapan proteasa para selección nuevamente, pueden ser proporcionados en solución, en suspensión o unidos a un soporte sólido, apropiados para el método de ensayo. Por ejemplo, el polipéptido que atrapa proteasa puede estar unido a un soporte sólido, tal como por ejemplo, una o más perlillas o partículas, microesferas , una superficie de un tubo o placa, una membrana de filtro y otros soportes sólidos conocidos en la técnica. Sistemas de soporte sólidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una superficie plana construida, por ejemplo, de vidrio, silicón, metal, nylon, celulosa, plástico o una compuesta, que incluye placas o membranas de pared múltiple; o pueden estar en la forma de una perlilla tal como un gel de sílice, un vidrio de poro controlado, una perlilla magnética (Dynabead) o celulosa. Tal método puede ser adaptado para uso en suspensión o en la forma de una columna. Los polipéptidos que atrapan proteasa objetivos pueden estar unidos directamente o indirectamente a un soporte sólido, tal como una perlilla de poliacrilamida . Se pueden usar métodos covalentes o no covalentes para unión. Métodos covalentes para unión de compuestos objetivo incluyen métodos de reticulación química. Los reactivos que pueden reaccionar pueden crear enlaces covalentes entre grupos funcionales en la molécula objetivo y el soporte. Ejemplos de grupos funcionales que se pueden hacer reaccionar químicamente son amino, tiol y grupos carboxilo. Son ejemplos N-etilmaleimida , yodoacetamida, N-hidrosuccinimida y glutaraldehído de reactivos que reaccionan con grupos funcionales. En otros ejemplos, los sustratos objetivos pueden estar indirectamente unidos a un soporte sólido por métodos tales como, pero no se limitan a, inmunoafinidad o interacciones ligando-receptor (por ejemplo, biotina-estreptavidina o glutationa S-transferasa-glutationa) . Por ejemplo, un polipéptido que atrapa proteasa puede ser recubierto en una placa ELISA, u otro arreglo direccionable similar. En u ejemplo, las cavidades de la placa pueden ser recubiertos con un agente de captura de afinidad, el cual se enlaza a y captura el polipéptido que atrapa proteasa. El ejemplo 9, ejemplifica un método por el cual el anticuerpo anti-His biotinilado es recubierto en una placa que contiene estreptavidina para facilitar la captura de un polipéptido que atrapa proteasa que contiene una marca His. La unión del polipéptido que atrapa proteasa a un soporte sólido puede ser realizada ya sea antes, durante o subsecuente a su contacto con proteasas variantes o bibliotecas del fago o células que expresan proteasas variantes. Por ejemplo, los sustratos objetivos pueden ser pre-absorbidos a un soporte sólido, tal como una columna de cromatografía, antes de la incubación con la proteasa variante. En otros ejemplos, la unión de un soporte sólido se realiza después que el sustrato objetivo es enlazado a la proteasa variante. En tal ejemplo, el soporte sólido que contiene la pareja sustrato-proteasa formada en complejo puede ser lavado para remover cualquier proteasa no enlazada. El complejo puede ser recuperado a partir del soporte sólido por cualquier método conocido por un experto en la técnica, tal como por ejemplo, por tratamiento con ácido diluido, seguido por neutralización (Fu et al. (1997) J Biol. Chem. 272:25678-25684) o con trietilamina (Chiswell et al. (1992) Trends Biotechnol. 10:80-84). Esta etapa puede ser optimizada para asegurar la recuperación reproducible y cuantitativa de la fuente de exhibición a partir del sustrato sólido. Por ejemplo, el enlace de la fuente de exhibición al sustrato objetivo unido al soporte sólido puede ser monitoreado independientemente usando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, como tal usando un anticuerpo dirigido contra el fago, tal como contra el fago i3 (por ejemplo, New England Biolabs, MA) y un ELISA estándar (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, New York) . Otro método para captura y aislar un complejo sustrato-proteasa es de solución. Típicamente, en tal método, un polipéptido que atrapa proteasa o variantes del mismo está en contacto con una colección de proteasa tal como, por ejemplo, en un volumen pequeño de un amortiguador en enlace apropiado (es decir, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o más microlitros) en donde cada polipéptido que atrapa proteasa está asociado con un marcador predeterminado, marca u otra porción detectable para identificación y aislamiento del mismo. La porción detectable puede ser cualquier porción que facilita la detección y aislamiento del complejo sustrato-proteasa. Por ejemplo, la porción puede ser una marca epitope para la cual un anticuerpo especifico para la marca existente (es decir, marca myc, marca His u otros) . El anticuerpo puede estar enlazado a un soporte sólido, tal como una perlilla, para facilitar la captura del complejo estable. Otras estrategias similares se pueden usar e incluir, por ejemplo, etiquetación del sustrato objetivo con biotina y captura usando estreptavidina unida a un soporte sólido tal como perlillas magnéticas o una placa microtituladora o etiquetación con polihistidina (por ejemplo, marca His-6) y captura usando un agente de quelación de metal tal como, pero no se limita a, sulfato de níquel (NiS04) , cloruro de cobalto (CoCl2) , sulfato de cobre (CuS04) o cloruro de zinc (ZnCl2) . Los agentes de captura pueden estar acoplados a perlillas grandes, tal como por ejemplo, perlillas de sefarosa, con ello el aislamiento de las perlillas unidas pueden ser fácilmente logradas por centrifugación. Alternativamente, los agentes de captura pueden ser acoplados a perlillas pequeñas, tal como por ejemplo, perlillas magnéticas (es decir, Miltenyi Biotec) , que pueden ser fácilmente aislado usando una columna magnética. Además, la porción puede ser una porción fluorescente. Por ejemplo, en algunos sistemas de exhibición, tal como por ejemplo, sistemas de exhibición de la superficie celular, una etiqueta fluorescente que facilita el aislamiento del complejo seleccionado por clasificación de célula activada fluorescente (FACS; véase por ejemplo, Levin et al. (2006) Molecular BioSystems, 2: 49-57). En algunos ejemplos, uno o más polipéptidos que atrapan proteasa distintos están en contacto con una colección de proteasas, en donde cada una de los polipéptidos que atrapan proteasa están asociados con diferentes porciones de detección, asi como individualmente aisladas una o más de un complejo polipéptido que atrapa proteasa-proteasa . La capacidad para incluir en una reacción única 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más polipéptidos que atrapan proteasa distintos, cada uno con una secuencia de desdoblamiento RSL deseada diferente, permite la detección e aislamiento de decenas de cientos o miles de complejos covalentes simultáneamente. Las proteasas seleccionadas, capturadas como complejos covalentes con el polipéptido que atrapa proteasa, pueden ser separado de proteasas no en complejos de la colección de proteasas. Las proteasas seleccionadas pueden entonces ser amplificadas para facilitar la identificación de la proteasa seleccionada. Después de remover cualquier proteasa no en complejo al polipéptido que atrapa proteasa, la fuente de material a la cual la proteasa es exhibida (es decir, fago, células, perlillas, etc.) es amplificada y expresada en una célula hospedera apropiada. Por ejemplo, en donde la proteasa es exhibida en fago, generalmente el proteasa-fago en complejo con un polipéptido que atrapa proteasa es incubado con una célula hospedera para permitir adsorción del fago, seguido por adición de un volumen pequeño de caldo nutriente y agitación del cultivo para facilitar la replicación de ADN por sonda del fago en el hospedero multiplicado. En algunos ejemplos, esto se hace en la presencia del fago auxiliador para asegurar que las células hospederas están infectadas por el fago. Después de esta incubación, el medio es suplementado con un antibiótico y/o un inductor. El genoma de proteasa del fago también puede contener un gen que codifica la resistencia al antibiótico para permitir el crecimiento selectivo de aquellas células bacterianas que mantienen el ADN del proteasa del fago. Típicamente, para amplificación del fago como una fuente de sobrenadante del fago que contiene proteasas seleccionadas, es requerido el rescate del fago por el uso de fago auxiliador. En algunos ejemplos, es posible someter a ensayo la presencia de una proteasa seleccionada son una etapa de rescate. Por ejemplo, después de la incubación del complejo capturado que contiene la proteasa seleccionada o identificada con una célula hospedera, por ejemplo, bacteria, y crecimiento en la presencia de un agente selectivo, el periplasma o medio de cultivo celular puede ser directamente muestreado como una fuente de proteasa seleccionada, por ejemplo, para medir la actividad de proteasa. Tal procedimiento se describe en el Ejemplo 17. Adicionalmente, la amplificación de la fuente de exhibición, tal como en un hospedero bacteriano, puede ser optimizada en una variedad de rutas. Por ejemplo, la cantidad de bacteria agregada al material de ensayo, tal como en microcavidades, puede estar en exceso abrumador de la fuente del fago recuperado a partir de la etapa de enlace con ello asegurando la transduccion cuantitativa del genoma del fago. La eficiencia de la transduccion opcionalmente puede ser medida cuando se selecciona el fago. La etapa de amplificación, amplifica el genoma de la fuente de exhibición, tal como genomas del fago, que permite sobre-expresión del polipéptido de rasgo distintivo asociado e identificación del mismo, tal como por secuenciamiento de AD . Se puede usar un procedimiento de lavado en charola por el cual las proteasas o porciones catalíticamente activas del mismo que interactúa con una proteina objetivo, tal como un polipéptido que atrapa proteasa o variante RSL del mismo, son rápidamente seleccionados. El lavado en charola se lleva a cabo, por ejemplo, incubando una biblioteca de polipéptidos que exhibe el fago, tal como proteasas que exhiben el fago, con una proteina objetivo soluble o que se enlaza a la superficie, lavando lejos en fago no enlazado, y eluyendo el fago específicamente y covalentemente enlazado. El fago eluido después se amplifica, tal como por vía de infección de un hospedero, y tomando a través de ciclos adicionales de lavado en charola y amplificación para enriquecer sucesivamente la combinación del fago por aquellos con las altas afinidades para el polipéptido objetivo. Después de varias rondas, se identifican clones individuales, tal como por secuenciamiento de ADN, y puede ser medida su actividad, tal como por cualquier método mostrado en la Sección G posterior. Una vez que la proteasa seleccionada es identificada, puede ser purificada a partir de la fuente de exhibición y probada para actividad. Generalmente, tales métodos incluyen técnicas de ADN bioquímicas y recombinantes generales y son de rutina para aquellos expertos en la técnica. En un método, se puede usar la precipitación de polietilen glicol (PEG) para remover la actividad de proteasa potencialmente contaminante en los sobrenadantes del fago seleccionado purificado. En tal ejemplo, después del rescate del fago en la presencia del fago auxiliador, el sobrenadante del fago que contiene la proteasa seleccionada puede ser precipitado en la presencia de PEG. Un experto en la técnica es capaz para determinar el porcentaje de PEG requerido para la aplicación de precipitación particular. Generalmente, para precipitación de sobrenadantes de proteasa, se usa PEG al 20%. En algunos ejemplos, el sobrenadante, ya sea del sobrenadante del fago rescatado, o a partir del periplasma celular bacteriano o medio celular (sin rescate del fago) puede ser sometido a ensayo para actividad de proteasa como se describe en este documento. Alternativamente o adicionalmente, la proteasa seleccionada puede ser purificada a partir del sobrenadante u otra fuente. Por ejemplo, el ADN que codifica el dominio de proteasa seleccionada puede ser aislado a partir de la fuente de exhibición para permitir la purificación de la proteina seleccionada. Por ejemplo, después de la infección de células hospederas de E. coli con el fago seleccionado mostrado anteriormente, los clones individuales pueden ser depurados y se hacen crecer para purificación del plásmido usando cualquier método conocido por un experto en la técnica, y si es necesario puede ser preparado en cantidades grandes, tal como por ejemplo, usando el Kit de Purificación del Plásmido Mido (Qiagen) . El plásmido purificado puede ser usado para secuenciamiento de ADN para identificar la secuencia de la proteasa variante, o puede ser usado para transfectar en cualquier célula para expresión, tal como pero no se limita a, un sistema de expresión de mamífero. Si es necesario, se pueden realizar una o dos etapas de PCR para amplificar la secuencia seleccionada, la cual puede ser subclonada en un vector de expresión de elección. Los cebadores PCR pueden ser diseñados para facilitar la subclonación, tal como incluyendo la adición de sitios de enzima de restricción. El ejemplo 4, ejemplifica un procedimiento PCR de dos etapas para lograr la amplificación y purificación del gen u-PA de longitud completa, en donde el fago de proteasa seleccionada contiene únicamente el dominio de proteasa del gen u-PA. Después de la transfección en las células apropiadas para expresión tal como se describe en detalle posteriormente, se puede probar el medio acondicionado que contiene el polipéptido de proteasa, o porción del mismo catalíticamente activo en ensayos de actividad o se puede usar para purificación adicional. Además, si es necesario, la proteasa puede ser procesada por lo tanto para proporcionar una proteasa activa, tal como por desdoblamiento de una forma de cadena única, en una forma de dos cadenas. Tales manipulaciones se conocen por un experto en la técnica. Por ejemplo, el u-PA de cadena única se puede hacer activando el desdoblamiento del plásmido tal como se describe en este documento. 1. Selección Iterativa En los métodos proporcionados en este documento, la selección iterativa es empleada para optimizar la modificación de las proteasas. De esta forma, en métodos se selección iterativa, una proteasa puede ser desarrollada realizando las reacciones de lavado en charola una pluralidad de veces bajo varios parámetros, tal como por ejemplo, usando diferentes polipéptidos que atrapan proteasa o competidores. En tales métodos de selección iterativa, la colección de proteasa mantenida constante en rondas de selección sucesivas. Alternativamente, se puede generar una nueva colección de proteasa que contiene únicamente las proteasas seleccionadas identificadas en las rondas precedentes y/o creando una nueva colección de proteasas mutantes que han sido mutadas adicionalmente comparadas a una proteasa de platilla identificada en la primera rinda. En un ejemplo, una primera ronda de selección de la biblioteca de proteasa puede identificar proteasas variantes que contienen una o más mutaciones, las cuales alteran la especificidad de la proteasa. Después se puede realizar una segunda ronda de síntesis de biblioteca en la cual las posiciones de aminoácido de una o mutaciones son mantenidas constantes, y se puede llevar a cabo mutagénesis enfocada o al azar en el resto de la proteína o, región o residuo deseado. Después de una ronda adicional de selección, la proteasa seleccionada puede ser ajustada a rondas adicionales de síntesis y selección de biblioteca. Por ejemplo, se pueden realizar 2, 3, 4, 5, o más rondas de síntesis y selección de biblioteca. En algunos ejemplos, la especificidad de la proteasa variante hacia el sustrato alterado es además optimizada con cada ronda de selección. En otro método de selección iterativa, una primera ronda de selección de una colección de proteasa puede estar en contra de un polipéptido que atrapa proteasa intermediaria para identificar proteasas variantes que contienen uno o más mutaciones, las cuales alteran la especificidad de la proteasa al sustrato intermediario. Los complejos de proteasa seleccionados pueden ser aislados, haciéndolos crecer, y amplificados en las células hospederas apropiadas y usadas como la colección de proteasa en una segunda ronda de selección contra un polipéptido que atrapa proteasa que contiene la secuencia desdoblada completa de un polipéptido objetivo. Por ejemplo, tal procedimiento puede ser usado para seleccionar las proteasas que tienen especificidad de sustrato para una secuencia de desdoblamiento VEGFR, en donde una o más rondas de lavado en charola son contra una secuencia desdoblada inmediata RRARM, y se realizan rondas subsecuentes de lavado en charola contra un polipéptido que atrapa proteasa que contiene la secuencia RRVR que desdobla VEGFR2. En un ejemplo adicional de selección iterativa, se usan dos o más polipéptidos que atrapan proteasa que contienen diferente reconocimiento de sustrato o secuencias desdobladas para dos o más diferentes polipéptidos en los métodos en rondas alternativas de lavado en charola. Tal método es útil para seleccionar las proteasas que son optimizadas por tener selectividad para dos diferentes sustratos. Las variantes seleccionadas típicamente tienen especificidad reducida, pero alta actividad hacia dos o más secuencias de reconocimiento del sustrato. En tales métodos, una primera ronda de selección de una colección de proteasa contra un primer polipéptido que atrapa proteasa, que ha sido modificado para seleccionar una proteasa con una primera especificidad de sustrato predeterminado, puede identificar proteasas variantes que contienen una o más mutaciones las cuales alteran la especificidad de la proteasa. Las proteasas seleccionadas pueden ser aisladas, se hacen crecer y se amplifican en las células hospederas apropiadas usadas como la colección de proteasa en una segunda ronda de selección contra un segundo polipéptido que atrapa proteasa que se ha modificado para seleccionar una proteasa con una segunda especificidad de sustrato predeterminado. El primero y segundo polipéptido que atrapa proteasa usado en los métodos puede ser el mismo o diferente, pero cada uno es diferentemente modificado en su sitio reactivo para imitar un sitio de reconocimiento del sustrato (es decir, secuencia desdoblada) de diferentes sustratos objetivo. En algunos ejemplos, la severidad en la selección puede ser mejorada en la presencia de competidores, tal como por ejemplo, competidores reducidos o amplios como se describe en este documento. 2. Proteasas Seleccionadas Ejemplares Proporcionados en este documento, son polipéptidos u-PA y MT-SP1 variantes identificados en los métodos proporcionados en este documento por tener una especificidad de sustrato alterado y/o mejorado. Tales polipéptidos u-PA y MT-SP1 variantes se identifican por tener una especificidad incrementada para una secuencia desdoblada seleccionada o deseada de una proteina objetivo. Ejemplos de tales proteínas objetivo incluyen, pero no se limitan a, una secuencia desdoblada en un VEGFR o una proteína complemento, por ejemplo, proteína complemento C2. Se puede usar cualquier serpina modificada en los métodos de selección en este documento para identificar proteasas variantes. Ejemplos de tales serpinas modificadas son PAI-1 o AT3 modificadas en su RSL por contener secuencias de desdoblamiento para una proteina objetivo, por ejemplo, un VEGFR o C2, como se describe en este documento anteriormente. Las proteasas modificadas seleccionadas resultantes exhiben especificidad de sustrato alterada, típicamente mejorada para la secuencia desdoblada en la proteína objetivo comparado a la proteasa de plantilla o de partida, la cual no contiene las modificaciones seleccionadas. Como se describe posteriormente, la especificidad es típicamente incrementada y es generalmente al menos 2 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 veces o más cuando se compara a la especificidad de una proteasa de plantilla o de tipo nativo para el sustrato objetivo seleccionado contra un sustrato no obj etivo . a. Polipéptidos u-PA Variantes Por ejemplo, se seleccionan polipéptidos u-PA variantes proporcionados en este documento por tener una actividad incrementada para un polipéptido de serpina mutante modificado en su secuencia RSL reemplazando los aminoácidos de sitio reactivo P4-P1' nativo con aquellos de una proteina objetivo deseada o seleccionada. En un ejemplo, los polipéptidos u-PA variantes se identifican contra la selección de un polipéptido PAI-1 modificado. Ejemplos de moléculas de polipéptido PAI-1 modificadas usadas en los métodos de selección de u-PA proporcionados en este documento incluyen, por ejemplo, PAI-1 modificada en sus residuos P4-P1' nativos de VSARM (SEC ID NO: 378) con residuos de aminoácido para una secuencia desdoblada VEGFR-2 intermedia de RRARM (SEC ID NO: 379), en donde la secuencia desdoblada deseada en las posiciones P4-P1 es la secuencia desdoblada VEGFR-2 de RRVR (SEC ID NO: 489) o con residuos de aminoácido para la secuencia desdoblada t-PA de PFGRS (SEC ID NO: 389) . Usando los métodos proporcionados en este documento, se identifican las siguientes posiciones contribuyendo a especificidad del sustrato de un polipéptido u-PA: 21, 24, 30, 38, 39, 61(A), 72, 73, 75, 80, 82, 84, 89, 92, 132, 133, 137, 138, 155, 156, 158, 159, 160, 187 y 217, en base a numeración de quimiotripsina . Reemplazos o reemplazo de aminoácidos pueden ser en una o más posiciones que corresponden a cualquiera de las siguientes posiciones F21, 124, F30, V38, T39, Y61 (A) , R72, L73, S75, E80, K82, E84, 189, K92, F132, G133, E137, 1138, L155, K156, T158, V159, V160, K187 y R217 de un polipéptido u-PA, tal como un polipéptido u-PA mostrado en la SEC ID NO: 433 o porción del mismo catalíticamente activo, en base a numeración de quimiotripsina . Un polipéptido u-PA modificado proporcionado en este documento que exhibe especificidad de sustrato incrementada puede contener una o más modificaciones de aminoácido que corresponden a cualquiera de una o más modificaciones de F21V, I24L, F30I, F30V, F30L, F30T, F30G, F30M, V38D, T39A, Y61(A)H, R72G, L73A, L73P, S75P, E80G, K82E, E84K, I89V, K92E, F132L, G133D, E137G, I138T, L155P, L155V, L155M, K156Y, T158A, V159A, V160A, K187E y R217C de un polipéptido u-PA, tal como un polipéptido u-PA mostrado en la SEC ID NO: 433 o porción del mismo catalíticamente activo, en base a numeración de quimiotripsina. En un ejemplo, un polipéptido u-PA modificado proporcionado en este documento que tiene especificidad de sustrato incrementada para una secuencia desdoblada VEGFR-2 contiene una o más modificaciones de aminoácido que corresponde a cualquiera de una o más modificaciones de V38D, F30I, F30T, F30L, F30V, F30G, F30M, R72G, L73A, L73P, S75P, I89V, F132L, G133D, E137G, I138T, L155P, L155V, L155M, V160A y R217C, en base a numeración de quimiotripsina. Ejemplos de tales polipéptidos son aquellos polipéptidos u-PA que contienen una o más modificaciones de aminoácido que corresponde a cualquiera de F30I; L73A/I89V; L73P; R217C; L155P; S75P/I89V/I138T; E137G; R72G/L155P; G133D; V160A; V38D; F132L/V160A; . L73A/I89V/F30T; L73A/I89V/F30L; L73A/I89V/F30V; L73A/I89V/F30G; L73A/189V/L155V; L73A/I89V/F30M; L73A/I89V/L155M; L73A/I89V/F30L/L155M; y L73A/I89V/F30G/L155M en un polipéptido u-PA, tal como un polipéptido u-PA que tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 433 o un fragmento del mismo catalíticamente activo. Ejemplos de tales secuencias son aquellas mostradas en cualquiera de las SEC ID NOS: 434-459, o fragmentos del mismo de aminoácidos contiguos que contienen la mutación y que tienen actividad catalítica. En particular, se proporcionan los polipéptidos u-PA modificados que tienen las siguientes modificaciones de aminoácido: L73A/I89V; L155P; R72G/L155P; F132L/V160A; L73A/I89V/F30T; L73A/I89V/L155V; L73A/I89V/L155M; y L73A/I89V/F30L/L155M, en base a la numeración de quimiotripsina . En otro ejemplo, un polipéptido u-PA modificado proporcionado en este documento, que tiene especificidad incrementada para una secuencia desdoblada reconocida por t-PA que contiene una o más modificaciones de aminoácido que corresponde a cualquiera de una o más modificaciones de F21V, I24L, F30V, F30L, T39A, Y61(A)H, E80G, K82E, E84K, I89V, K92E, K156T, T158A, V159A, y K187E, en base a la numeración de quimiotripsina. Ejemplos de tales polipéptidos son aquellos polipéptidos u-PA que contienen una o más modificaciones de aminoácido que corresponde a cualquiera de F21V; I24L; F30V; F30L; F30V/Y61 (A) H; F30V/K82E; F30V/K156T; F30V/K82E/V159A; F30V/K82E/T39A/V159A; F30V/K82E/T158A/V159A; F30V/Y61 (A) H/K92E; F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187E; y F30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V/K187E, en un polipéptido u-PA, tal como un polipéptido u-PA que tienen una secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 433 o un fragmento del mismo catalíticamente activo. Ejemplos de tales secuencias son aquellas mostradas en cualquiera de las SEC ID NOS: 460-472, o fragmentos del mismo de aminoácidos contiguos que contienen la mutación y que tienen la actividad catalítica. También proporcionados en este documento, son proteasas variantes de la familia de quimiotripsina que tiene la mutación correspondiente comparada a los polipéptidos u-PA variantes proporcionados en este documento, en base a numeración de quimiotripsina. Por ejemplo, en base a numeración de quimiotripsina, modificación de la posición F30 en u-PA que corresponde a modificación de la posición Q30 en t-PA, Q30 en tripsina y Q30 en quimiotripsina (Bode et al. (1997) Current Opinión in Structural Biology, 7: 865-872). Un experto en la técnica puede determinar mutaciones correspondientes en cualquiera de otros elementos de la familia quimiotripsina, que incluyen pero no se limitan a modificación de cualquier proteasa mostrada en la Tabla 7 y que tiene una secuencia de aminoácidos mostrado en cualquiera de las SEC ID NOS: 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99, 101, 103, 105, 107; 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145,147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 242, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 264, 266, 268, 270, 272, fragmentos del mismo catalíticamente activo. b. Polipéptidos MT-SP1 Variantes En otro ejemplo, polipéptidos MT-SP1 variantes proporcionados en este documento, se seleccionan por tener una reactividad incrementada para un polipéptido de serpina mutante modificado en su secuencia RSL reemplazando los aminoácidos de sitio reactivo P4-P2' nativo con aquellos de una proteína objetivo deseada o seleccionada. En un ejemplo, los polipéptidos MT-SP1 variante se identifican contra selección de un polipéptido AT3 modificado. Ejemplos de moléculas de polipéptido AT3 modificada se usan en los métodos de selección MT-SPl proporcionados en este documento incluye, por ejemplo, AT3 modificado en su residuos P4-P2' nativos de IAGRSL (SEC ID NO: 478) con residuos de aminoácido para una secuencia de desdoblamiento C2 de proteina complemento de SLGRKI (SEC ID NO: 479) . Usando los métodos proporcionados en este documento, se identifican las siguientes posiciones contribuyendo a especificidad del sustrato de un polipéptido MT-SPl: 23, 41, 52, 60(g), 65, 71, 93, 95, 97, 98, 99, 126, 129, 131, 136, 143, 144, 154, 164, 166, 171, 173, 175, 184(a), 192, 201, 209, 217, 221(a), 230, 234, y 244, en base a la numeración de quimiotripsina . Reemplazo o reemplazos de aminoácido se pueden hacer en cualquiera de una o más posiciones correspondientes para cualquiera de las siguientes posiciones D23, 141, L52, Y60 (g) , T65, H71, F93, N95, F97, 198, F99, A126, V129, P131, 1136, H143, T144, 1154, N164, T166, L171, P173, Q175, F184 (a) , Q192, S201, Q209, D217, Q221(a), R230, F234, y V244 de un polipéptido MT-SPl, tal como polipéptido MT-SPl de longitud completa mostrada en la SEC ID NO: 253 ó 515 o porción del mismo catalíticamente activo mostrado en la SEC ID NO: 505 ó 507, en base a numeración de quimiotripsina. Un polipéptido MT-SPl modificado, proporcionado en este documento que exhibe especificidad de sustrato incrementada puede contener una o más modificaciones de aminoácido que corresponde a cualquiera de una o más modificaciones de D23E, I41F, I41T, L52M, Y60(g)s, T65K, H71R, F93L, N95K, F97Y, F97L, T98P, F99L, A126T, V129D, P131S, I136T, I136V, H143R, T1441, I154V, N164D, T166A, L171F, P173S, Q175R, F184(a)L, Q192H, S201I, Q209L, D217V, Q221(a)L, R230 , F234L, y V244G de un polipéptido MT-SPl, tal polipéptido MT-SPl de longitud completa mostrado en la SEC ID NO: 253 ó 515 o porción del mismo catalíticamente activo mostrado en la SEC ID NO: 505 ó 507, en base a numeración de quimiotripsina . En particular, un polipéptido MT-sPl modificado contiene una o más modificaciones de aminoácido que corresponde a cualquiera de una o más modificaciones de I41F, F97Y, L171F, Q175R, D217V y V244G, por ejemplo, cualquiera de una o más de I41F, F97Y, L171F y V244G. Típicamente, tal polipéptido MT-SPl modificado exhibe especificidad del sustrato aumentada para proteína del complemento C2. Ejemplos de tales polipéptidos son aquellos polipéptidos que contienen MT-SPl que contienen una o más modificaciones de aminoácido que corresponden a cualquiera de I136T/N164D/T166A/F184 (A) L/D217V; I41F; I41F/A126T/V244G; D23E/I41F/T98P/T144I ; I41F/LI7IF/V244G; H143R/Q175R; I41F/L17IF; R230W; I41F/I154V/V244G; I41F/L52M/V129D/Q221 (A)L; F99L; F97Y/I136V/Q192H/S201I ; H7IR/P131S/D217V; D217V; T65K/F93L/F97Y/D217V; I41T/P173S/Q209L; F97L/F234L; Q175R; N95K; y Y60(G)S en un polipéptido MT-SP1, tal como un polipéptido MT-SP1 que tiene una secuencia de aminoácido mostrado en la SEC ID NO: 253 o un fragmento del mismo catalíticamente activo mostrado en la SEC ID NO: 505. Ejemplos de tales secuencias son aquellas mostradas en cualquiera de las SECID NOS: 589-609, o fragmentos del mismo de aminoácidos contiguos que contienen la mutación y que tienen actividad catalítica tal como, por ejemplo, cualquiera mostrada en la SEC ID NOS: 568-588. En algunos ejemplos, los polipéptidos T-SP1 variante proporcionados en este documento, adicionalmente contiene una modificación correspondiente a C122S en un polipéptido MT-SP1, tal como un polipéptido MT-SP1 que tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 253 o un fragmento del mismo catalíticamente activo mostrado en la SEC ID NO: 505. Ejemplos de tales polipéptidos MT-SP1 variantes se muestra en cualquiera de la SEC ID NOS: 537-557, o fragmentos del mismo de aminoácidos contiguos que contienen la mutación y que tienen actividad catalítica tal como, por ejemplo, cualquiera mostrado en cualquiera de las SEC ID NOS: 516-536. En particular, se proporcionan polipéptidos u-PA modificados que tienen las siguientes modificaciones de aminoácidos: L73A/I89V; L155P; R72G/L155P; F132L/V160A; L73A/I89V/F30T; L73A/I89V/L155V; L73A/I89V/L155 ; y L73A/I89V/F30L/L155M, en base a la numeración de quimiotripsina .

G. MÉTODOS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD DE PROTEASA Las proteasas seleccionadas en los métodos proporcionados en este documento pueden ser probadas para determinar si, después de la selección, las proteasas retienen la eficacia catalítica y exhiben la especificidad de sustrato deseado. La evaluación de actividad se puede realizar usando sobrenadantes a partir de la fuente de exhibición amplificada o de proteína purificada. Por ejemplo, como se discutió anteriormente, el sobrenadante del fago puede ser sometido a ensayo después del rescate del fago con el fago auxiliador y amplificación del fago. Alternativamente, la actividad de proteasa puede ser sometida a ensayo directamente a partir del medio celular o periplasma de bacteria infectada. También puede ser determinada la actividad de proteasa de la proteasa seleccionada purificada. Se puede evaluar la eficiencia catalítica y/o especificidad del sustrato sometiendo a ensayo el desdoblamiento del sustrato usando sustratos conocidos de la proteasa. Por ejemplo, el desdoblamiento del plasminógeno puede ser evaluado en el caso en donde t-PA o u-Pa se usa en el método de selección de este documento. En otro ejemplo, puede ser usado un sustrato del péptido reconocido por la proteasa. Por ejemplo, RQAR (SEC ID NO: 513), la cual es el sitio de auto-activación de MT-SP1, puede ser usado para evaluar la actividad de proteasas MT-SP1 seleccionadas. En una modalidad, se puede usar un tetrapéptido fluorogénicamente marcado del sustrato del péptido, por ejemplo, un tetrapéptido ACC o A C. Además, unos sustratos de péptido fluorogénico diseñado a base de la secuencia desdoblada de un sustrato objetivo deseado para el cual la proteasa es seleccionada en contra para que pueda ser usada para evaluar la actividad. En algunos ejemplos, la proteasa seleccionada puede ser evaluada por su actividad en contra de un sustrato de péptido conocido en la presencia o ausencia del polipéptido que atrapa proteasa variante usando en el método de selección. Típicamente, tal valoración de actividad se realiza para seleccionar adicionalmente aquellas proteasas que son inhibidas en la presencia de polipéptido que atrapa proteasa que contiene la secuencia de desdoblamiento deseado del sustrato objetivo, y con ello optimizar las proteasas seleccionadas que tienen selectividad mejorada para el sustrato objetivo. Las comparaciones de inhibición se puede hacer en contra de la proteasa de platina o tipo nativo y/o con todas las otras proteasas identificadas en el método de selección. Los análisis de cinética del desdoblamiento de sustratos nativos de una proteasa seleccionada pueden ser comparados al análisis de desdoblamiento de sustratos objetivo deseados para evaluar la especificidad de la proteasa seleccionada para la secuencia objetivo. Además, las constantes de proporción de segundo orden de inhibición (ki) pueden ser evaluadas para monitorear la eficiencia y reactividad de una proteasa seleccionada para un sustrato, tal como por ejemplo, el polipéptido que atrapa proteasa, o variante del mismo, usado en el método de selección. El ejemplo 5 ejemplifica varios ensayos usados para evaluar la eficiencia y reactividad catalítica de polipéptidos u-PA mutantes identificados en los métodos proporcionados en este documento. El ejemplo 10 y el Ejemplo 12 ejemplifican varios ensayos usados para evaluar la eficiencia catalítica de sobrenadantes del fago MT-SP1 seleccionado. El ejemplo 14 ejemplifica varios ensayos usados para evaluar la eficiencia y reactividad catalítica de proteasas MT-SP1 variantes purificadas seleccionadas. En un ejemplo, las proteasas seleccionadas, tal como por ejemplo proteasas u-PA o MT-SP1 seleccionadas, que se seleccionan para igualar el perfil de especificidad deseada del polipéptido que atrapa proteasa mutado, pueden ser sometidos a ensayo usando sustratos del péptido fluorogénico individual que corresponde a la secuencia de desdoblamiento deseado. Por ejemplo, un método para someter a ensayo una proteasa modificada que puede desdoblar cualquiera de una o más de las secuencias desdobladas deseadas de un sustrato objetivo: (a) poner en contacto una muestra fluorogénica del péptido (que contiene una secuencia de desdoblamiento objetivo deseada) con una proteasa, de tal manera por lo tanto una porción fluorogénica se libera de una secuencia de sustrato del péptido en acción de la proteasa, con ello producir una porción fluorescente; y (b) observar si la muestra sufre un cambio detectable en fluorescencia, el cambio detectable es una indicación de la presencia de proteasa enzimáticamente activa en la muestra. En tal ejemplo, la secuencia de desdoblamiento deseada para la cual la proteasa se selecciona, se hace en contra en un péptido fluorogénico por métodos conocidos en la técnica. En una modalidad, las secuencias de desdoblamiento del péptido individual pueden estar unidas a un sustrato fluorogénicamente marcado, tal como por ejemplo un grupo saliente fluorogénico AMC o ACC, y la liberación de la porción fluorogénica puede ser determinada como una medición de especificidad de una proteasa para una secuencia de desdoblamiento del péptido. La proporción de incremento en fluorescencia de la secuencia de desdoblamiento objetivo puede ser medida tal como usando un espectrómetro de fluorescencia. La proporción de incremento en fluorescencia puede ser medida durante un tiempo. Las constantes de cinética Michaelis-Menton pueden ser determinadas por los métodos de cinética estándar. Las constantes de cinética kcat, Km y kcat/ m pueden ser calculadas graficando el inverso de la concentración del sustrato contra el inverso de la velocidad de desdoblamiento del sustrato, y ajustarse a la ecuación de Lineweaver-Burk ( l/velocidad= (Km/Vmax) ( 1/ [S] ) + 1/Vmax; en donde Vmax= [ET] kcat) . La constante de proporción de segundo orden o constante de especificidad (kcat/Km) es una medición de como un sustrato es bien cortado por una proteasa particular. Por ejemplo, un tetrapéptido ACC- o AMC-, tal como Ac-RRAR-A C, Ac-SLGR-AMC, Ac-SLGR-ACC, Ac-RQAR-ACC, se puede hacer e incubar con una proteasa seleccionada en los métodos proporcionados en este documento y se puede evaluar la actividad de la proteasa sometiendo a ensayo para liberar la porción fluorogénica . La elección del tetrapéptido depende de la secuencia de desdoblamiento deseada para ser sometida a ensayo y puede ser empíricamente determinado. Sometiendo a ensayo una proteasa en una solución simplemente requiere agregar una cantidad de la solución base a una proteasa para un péptido indicador de proteasa fluorogénica y midiendo el incremento subsecuente en fluorescencia o disminución en banda de excitación en el espectro de absorción. La solución y el indicador fluorogénico también puede ser combinada y sometida a ensayo en un "amortiguador de digestión" que optimiza la actividad de la proteasa. Amortiguadores adecuados para someter a ensayo la actividad de proteasa son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En general, un amortiguador es seleccionado con un PH el cual corresponde al PH óptimo de la proteasa particular. Por ejemplo, un amortiguador particularmente estable para someter a ensayo la actividad de elastasa contiene 50 mM de fosfato de sodio, 1 mM de EDTA a pH 8.9. La medición es hace más fácil en un fluorómetro, un instrumento que proporciona una fuente de luz de "excitación" para el fluoróforo y después las mediciones de luz subsecuentemente emitidas a una longitud de onda particular. En comparación con una carencia de solución indicadora de control, la proteasa proporciona una medición de la actividad de proteasa. El nivel de actividad puede ser precisamente cuantificada generando una curva estándar para la combinación proteasa/indicador en la cual se determina la proporción de cambio en fluorescencia producida por soluciones de proteasa de actividad conocida. Mientras la detección de compuestos fluorogénicos puede ser lograda usando un fluorómetro, la detección puede ser lograda por una variedad de otros métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. De esta forma, por ejemplo, cuando la emisión de fluoróforos en las longitudes de ondas visibles, la detección puede ser simple por inspección visual de fluorescencia en respuesta a excitación por una fuente de luz. La detección también puede ser por medios de un sistema de análisis de imagen utilizando una cámara de video en interfaz a un digitalizador u otro sistema de adquisición de imagen. La detección también puede ser por visualización a través de un filtro, como bajo un microscopio fluorescente. El microscopio puede proporcionar una señal que es simplemente visualizada por el operador. Alternativamente, la señal puede ser registrada en película fotográfica o usando un sistema de análisis en video. La señal también puede simplemente ser cuantificada en tiempo real usando ya sea un sistema de análisis de imagen o un promotor. De esta forma, por ejemplo, un ensayo básico para actividad de proteasa de una muestra involucra suspender o disolver la muestra en un amortiguador (al pH óptimo de la proteasa particular a ser ensayado) agregar al amortiguador un indicador de péptido de proteasa fluorogénica, y monitorear el cambio resultante en fluorescencia usando un espectrofluorómetro como se muestra en por ejemplo, Harris et al., (1998) J Biol Chem 273:27364. El espectrofluorómetro se fija para excitar el fluoróforo en la excitación de longitud de onda del fluoróforo. El indicador de proteasa fluorogénica es una secuencia de sustrato de una proteasa que cambia en fluorescencia debido a una proteasa que desdobla el indicador. Las proteasas seleccionadas también son sometidas a ensayo para determinar que desdoblan la secuencia deseada, cuando están presentes en el contexto de la proteina de longitud completa. En un ejemplo, una proteina objetivo purificada, es decir VEGFR2 o proteina complemento C2, puede ser incubada en la presencia o ausencia de una proteasa seleccionada y el acontecimiento de desdoblamiento puede ser monitoreado por SDSPAGE seguido por teñido con Azul Brillante Coomassie para proteina y análisis de productos de desdoblamiento usando densitometria . La constante de especificidad del desdoblamiento de una proteina de longitud completa por una proteasa puede ser determinada usando densitometria en gel para evaluar cambios en densitometria durante un tiempo de una banda del sustrato objetivo de longitud completa incubada en la presencia de una proteasa. Además, la actividad de la proteina objetivo también puede ser sometida a ensayo usando métodos bien conocidos en la técnica para someter a ensayo la actividad de una proteina objetivo deseada, para verificar que su función ha sido destruida por el evento de desdoblamiento . En modalidades especificas, la comparación de las especificidades de una proteasa seleccionada, típicamente una proteasa modificada, puede ser usada para determinar si la proteasa seleccionada exhibe alteración, por ejemplo, especificidad incrementada comparada a la proteasa de tipo nativo o de plantilla. La especificidad de una proteasa para un sustrato objetivo puede ser medida observando como muchas secuencias de disparo modifican una proteasa desdoblada a una actividad dada comparado con una proteasa de tipo nativo o de plantilla. Si la proteasa modificada desdobla menos los sustratos objetivo que la proteasa de tipo nativo, la proteasa modificada tiene mayor especificidad que la proteasa de tipo nativo para aquellos sustratos objetivo. La especificidad de una proteasa para un sustrato objetivo puede ser determinada a partir de la constante de especificidad de desdoblamiento de un sustrato objetivo comparado a un sustrato no objetivo (es decir, secuencia de sustrato de tipo nativo de una proteasa) . Una proporción de las constantes de especificidad de una proteasa modificada para un sustrato objetivo contra un sustrato no objetivo puede ser hecha para determinar una proporción de la eficiencia de desdoblamiento de la proteasa. Se puede usar la comparación de proporción de eficiencia del desdoblamiento entre una proteasa modificada y una proteasa de tipo nativo o de plantilla para evaluar el cambio de veces en especificidad para un sustrato objetivo. La especificidad puede ser al menos 2 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 veces o más cuando se compara a la especificidad de una proteasa de tipo nativo o de plantilla para un sustrato objetivo contra un sustrato no objetivo.

H. MÉTODOS PARA PRODUCIR ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS QUE ATRAPAN PROTEASA (es decir, SERPINAS) O VARIANTES DE LOS MISMOS O PROTEASAS/PROTEASAS MODIFICADAS Los polipéptidos mostrados en este documento, incluyen polipéptidos que atrapan proteasa o polipéptidos de proteasa o porciones del mismo catalíticamente activo, que incluye polipéptidos u-PA modificados o polipéptidos MT-SP1 modificados, pueden ser obtenidos por métodos bien conocidos en la técnica para purificación de proteína y expresión de proteína recombinante . Se puede usar cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica para identificación de ácidos nucleicos que codifican genes deseados. Se puede usar cualquier método disponible en la técnica para obtener un clon de ADN genómico o ADNc de longitud completa (es decir, abarcando la región de codificación completa) que codifica un polipéptido que atrapa proteasa o -proteína de proteasa, tal como a partir de una fuente de celular o tejido. Folipéptidos modificados, tal como polipéptidos que atrapan proteasa variantes o proteasas variantes seleccionadas, pueden ser diseñadas por ingeniería como se describe en este documento a partir de un polipéptido de tipo nativo, tal como por mutagénesis dirigida al sitio. Los polipéptidos pueden ser clonados o aislados usando cualquiera de ios métodos disponibles' conocidos en la técnica para clonación y aislamiento de moléculas de ácido nucleico. Tales métodos incluyen amplificación P-CR óe ácidos nucleicos y selección de bibliotecas, que incluyen selección por- hibridación de ácido nucleico, selección a base de anticuerpo. y selección a base de actividad. Los métodos ' para amplificación de ácidos nucleicos pueden ser usados para aislar moléculas- de ácido nucleico que codifican un polipéptido deseado, que incluye por ejemplo,' métodos dé reacción de cadena de la polimerasa ¦(PCR) . ¦· 'Se. puede · usar un material- que- contiene' ácido nucleico como un material de partida a partir del cu¿'.l puede ser aislada una molécula de ácido' nucleico · que codifica ei polipéptido deseado. Por ejemplo/ se pueden usar preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares', extractos de tejido, muestras de fluido (por ejemplo, sangre, . suero, saliva), muestras de sujetos saludables y/o enfermos en métodos de amplificación. También se pueden usar bibliotecas de ácido nucleico como una fuente de material de partida. Los cebadores pueden ser diseñados para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores pueden ser diseñados en base a secuencias expresadas a partir de las cuales se genera un polipéptido deseado. Los cebadores pueden ser diseñados en base a posterior traducción de una secuencia de aminoácido del polipéptido. Las moléculas de ácido nucleico generados por amplificación pueden ser secuenciados y confirmados para codificar un polipéptido deseado. Las secuencias de nucleótido adicional pueden ser unidas a una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, que incluye secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción para los propósitos de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteina o un vector diseñado para la amplificación de la proteina del núcleo que codifica secuencias de ADN . Además, secuencias de nucleótido adicional, específicamente elementos de ADN funcional pueden estar operativamente enlazados a molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido. Ejemplos de tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteina intracelular , y secuencias de secreción diseñadas para facilitar la secreción de proteina. Secuencias de residuos del nucleótido adicional tal como secuencias de base específicamente, regiones que enlazan la proteína también pueden ser unidas a moléculas de ácido nucleico que codifica la proteasa. Tales regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias de residuos que facilitan o codifican proteínas que facilitan la recuperación de una proteasa en células objetivo específicas, o de otra forma alterar las farmacocinéticas de un producto de un gen sintético. Además, se pueden agregar marcas y otras porciones, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación de afinidad del polipéptido. Por ejemplo, las secuencias de residuos de nucleótido adicional tal como secuencias de base, específicamente una marca de epítope u otro marcador detectable también pueden estar unido a moléculas de ácido nucleico que codifica proteasa a una molécula de ácido nucleico que codifica serpina, o variantes del mismo. Ejemplos de tales secuencias y secuencias de ácido nucleico que codifican una marca His (por ejemplo, 6xHIs, HHHHH; SEC ID NO: 496) o marca Flag (DYKDDDDK; SSEC ID NO: 495) . La identificación y aislamiento de ácidos nucleicos pueden ser insertados en un vector de clonación apropiado. Se pueden usar un número mayor de sistemas vector-hospedero conocidos en la técnica. Vectores posibles incluyen, pero no se limita a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector puede ser compatible con la célula hospedera usada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tal como derivados lambda, o plásmidos tal como derivados de plásmido pC V4, pBR322 o pU, o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . La inserción en un vector de clonación puede, por ejemplo, ser lograda por ligación del fragmento de ADN en un vector de clonación, el cual tiene términos cohesivos complementarios. La inserción puede efectuarse usando vectores de clonación TOPO (INVITROGEN, Carlsbad, CA) . Si los sitios de restricción complementaria usados para fragmento, el ADN no está presente en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden ser enzimáticamente modificados. Alternativamente, cualquier sitio deseado puede ser producido por secuencias de nucleótido de ligación (enlazadores ) en los términos de ADN; estos enlazadores ligados pueden contener oligonucleótidos químicamente sintetizados específicos que codifican secuencias de endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector desdoblado y gen de proteína puede ser modificado por cola de homopolímeros . Las moléculas recombinantes pueden ser introducidas en células hospederas vía, por ejemplo, transformaciones, transfecciones , infecciones, electroporación y sonoporación, de forma que muchas copias de la secuencia son generadas. En modalidades específicas, la transformación de células hospederas con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de proteína aislado, ADNc, o secuencias de ADN sintetizadas capaces de generación de copias múltiples del gen. De esta forma, el gen puede ser obtenido en grandes cantidades haciendo crecer los transformantes, aislar las moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes y, cuando es necesario, recuperar el gen deseado a partir del ADN recombinante aislado. 1. Vectores y Células Para expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, tal como cualquiera descrita en este documento, el ácido nucleico que contiene todo o una porción de la secuencia de nucleótido que codifica la proteína puede ser insertado en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesario para la transcripción y traducción de la proteína insertada que codifica la secuencia. Las señales transcripciones y de traducción necesarias también pueden ser proporcionadas por el promotor nativo de genes de proteasa, y/o sus regiones de flanqueo. También proporcionados son vectores que contienen un ácido nucleico que codifica la proteasa o proteasa modificada. También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucarióticas y procarióticas , y los vectores son cualquiera adecuado para uso en este documento. Se proporcionan células procarióticas y eucarióticas, que incluyen células endoteliales, que contienen los vectores. Tales células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células de planta, células de insecto y células de animal. Las células se usan para producir una proteina de la misma, haciendo crecer las células descritas anteriormente bajo condiciones con las cuales la proteina codificada es expresada por la célula, y recuperando la proteina expresada. Para propósitos de este documento, por ejemplo, la proteasa puede ser secretada en el medio. En una modalidad, se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa, tal como que codifica cualquiera del polipéptido variante u-PA proporcionado en este documento, y contiene todo o una porción del dominio de proteasa, o copias múltiples del mismo. También proporcionados son vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifican el dominio de proteasa y porciones adicionales de una proteina de proteasa hacia arriba e incluye una proteina de proteasa de longitud completa, asi como también copias múltiples del mismo. Los vectores pueden ser seleccionados por expresión de la proteina de proteasa modificada o dominio de proteasa del mismo en la célula o tal que la proteina de proteasa es expresado como una proteina secretada. Cuando el dominio de proteasa es expresado, el ácido nucleico es enlazado a un ácido nucleico que codifica una señal de secreción, tal como la secuencia de señal del factor de apareamiento Saccharomyces cerevisiae o una porción del mismo, o la secuencia de señal nativa. Una variedad de sistemas hospedero-vector pueden ser usados para expresar la secuencia que codifica la proteina. Estos incluyen pero no se limitan a, sistemas de célula de mamífero infectados con virus (por ejemplo, virus viccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de célula de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus ) ; microorganismos tal como vectores de levadura que contienen levadura; o bacterias transformadas con bacteriófago, ADN, ADN plásmido o ADN cósmido. Los elementos de expresión de vectores, varía en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema hospedero-vector usando, se pueden hacer cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados. Cualquiera de los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector puede ser usado para vectores de expresión del constructo que contienen un gen quimérico que contiene señales de control transcripcional/traduccional apropiado y secuencias que codifican la proteina. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética) . Expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican proteina, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos del mismo, puede ser regulada por una segunda secuencia de ácido nucleico de forma que los genes o fragmentos del mismo son expresados en un hospedero transformado con las moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede ser controlada por cualquiera del promotor/mejorador conocido en la técnica. En una modalidad específica, el promotor no es nativo a los genes para una proteína deseada. Los promotores los cuales pueden ser usados, incluyen pero no se limita al promotor temprano SV40 (Bernoist and Chambón, Nature 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal 3'log del virus de sarcoma Rous (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), el promotor timidina cinasa del herpes (Wagner et al. Proc. Nati. Acad. Sci . USAB 78:1441-1445 (1981)), la secuencia reguladora del gen metalotioneina (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procariótica tal como el promotor ß-lactamasa (Jay et al. (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983) ) ; véase también "Useful Proteins from Recombinant Bacteria"; en Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresión de la planta que contienen el promotor nopalina sintasa (Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) o el promotor de ARN 35S del virus de mosaico de coliflor (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética de ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos tales como el promotor GaI4, el promotor alcohol deshidrogenasa, el promotor fosfoglicerol cinasa, el promotor fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional de animal que exhiben tejidos específicos y han sido usados en animales transgénicos ; región de control del gen elastasa I la cual es activa en células acinares pancreáticas (Swiff et al., Cell 38:639-646 (1984); Omitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); región de control del gen de insulina la cual es activa en células pancreáticas beta (Hanahan et al.

Nature 315:115-122 (1985)), región control del gen de inmunoglobulina la cual es activa en células linfoides (Grosschedl et al. Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), región control del virus de tumor mamario de ratón la cual es activa en células testiculares , mama, linfoide y mástil (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), región de control del gen albúmina la cual es activa en hígado .(Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)), región control del gen alfa-fetoproteina la cual es activa en hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), región control del gen antitripsina alfa-1 la cual es activa en hígado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), región control del gen globulina beta la cual es activa en células mieloides (Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), región control del gen de proteína básica mielina la cual es activa en células oligodendrocitas del cerebro (Readhead et al., 48:703-712 (1987)), región control del gen de 2 cadenas ligeras miosina la cual es activa en el músculo esqueleto (Sani, Nature 314:283-286 (1985)), y región control del gen de la hormona que libera gonadotrófico la cual es activa en gonadotrófos del hipotálamo (Masón et al., Science 234:1372-1378 (1996)).

En una modalidad especifica, un vector se usa el cual contiene un promotor operablemente enlazado a ácidos nucleicos que codifican una proteina deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo del mismo, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibiótico) . Por ejemplo, los vectores y sistemas de expresión de los dominios de proteasa de las proteínas de proteasa incluyen los vectores Pichia bien conocidos (disponibles, por ejemplo de Invitrogen, San Diego, CA) , particularmente aquellos diseñados para secreción de las proteínas codificadas. Vectores de plásmido ejemplares para la transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también literatura publicada por Qiagen que describe el sistema) . Los vectores pQE tienen un promotor T5 del fago (reconocido por polimerasa ARN de E. coli) y doble módulo de represión del operador lac para proporcionar expresión de alto nivel, fuertemente regulada de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de enlace ribosomal sintético (RBS II) para traducción eficiente, una secuencia que codifica la marca 6XHis, terminadores transcripcionales t0 y TI, origen ColEl de replicación y un gen beta-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Los vectores pQE que permiten la colocación de una marca 6xHis en cualquiera de N- o C-término de la proteina recombinante . Tales plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30 y pQE 31 los cuales proporcionan múltiples sitios de clonación para todas las tres estructuras lectoras y proporciona para la expresión de proteínas N-terminalmente marcadas 6xHis. Otros vectores de plásmido ejemplares para transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, vectores de expresión pET (véase, Patente Estadounidense 4,952,496; disponible de NOVAGEN, adison, WI; véase, también literatura publicada por Novagen que describe el sistema) . Tales plásmidos incluyen pET lia, los cuales contienen el promotor T71ac, terminador T7, el operador lac de E. coli inducible, y el gen represor lac; pET 12a-c, el cual contiene el promotor 17, terminador T7 y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (NOVAGEN, Madison, WI), el cual contiene una secuencia líder His-Tag™ para uso en purificación con una columna His y un sitio de desdoblamiento de trombina que permite desdoblamiento después de la purificación sobre la columna, la región promotora T7-lac y el terminador T7. 2. Expresión Las proteínas, tales como cualquiera mostrada en este documento incluyen cualquiera de los polipéptidos que atrapan proteasa o variantes de los mismos, o proteasas seleccionadas o porciones de los mismos catalíticamente activos, pueden ser producidos por cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica que incluyen métodos in vivo o in vitro. Las proteínas deseadas pueden ser expresadas en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades requeridas y formas de las proteínas, tal como por ejemplo, necesarias para administración y tratamiento. Los hospederos de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tal como E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, que incluyen línea celulares humanas y animales transgénicos . Los hospederos de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteína, así como también los tipos de modificaciones post-traduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección de hospederos de expresión se puede hacer en base a estos y otros factores, tal como consideraciones de regulación y seguridad, costos de producción y, la necesidad y métodos para purificación. Muchos vectores de expresión están disponibles y se conocen por aquellos -expertos en la técnica y se pueden usar para expresión de proteínas. La elección del vector de expresión puede ser influenciada por la elección de sistemas de expresión del hospedero. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y mejoradores opcionales, señales de traducción y señales de terminación transcripcional o traduccional . Vectores de expresión que son usados para transformación estable, típicamente tienen un marcador seleccionable el cual permite selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, un origen de replicación puede ser usado para amplificar el número de copia del vector. Las proteínas, tales como por ejemplo cualquier proteasa variante proporcionada en este documento o cualquier polipéptido que atrapa proteasa o variante del mismo, también puede ser utilizada o expresada como fusiones de proteína. Por ejemplo, una fusión de proteasa puede ser generada para agregar funcionalidad agregada a una proteasa. Ejemplos de proteínas de fusión de proteasa incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia señal, una marca tal como para localización, por ejemplo, una marca his6 o una marca tag, o una marca para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para secreción de proteína dirigida y/o asociación de membrana . En una modalidad, una proteasa puede ser expresada en una forma activa. En otra modalidad, una proteasa es expresada en una forma de zimógeno inactivo. a. Células Procarióticas Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es una técnica simple y rápida bien conocida por aquellos expertos en la técnica. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles, tales promotores son útiles para inducir grandes niveles de expresión de proteína y para expresar proteínas que exhiben alguna toxicidad a las células hospederas. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6, y el promotor APL que regula la temperatura. Las proteínas, tales como cualquiera proporcionada en este documento, pueden ser expresadas en el ambiente citoplásmico de E. coli. El citoplasma es una ambiente de reducción y para algunas moléculas, esto puede resultar en la formación de anticuerpos de inclusión insoluble. Los agentes de reducción tal como dimetiltreotol y ß-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tal como guanidina-HC1 y urea pueden ser usados para resolubilizar las proteínas. Un procedimiento alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de la bacteria, el cual proporciona un ambiente oxidante y similar a caperonina e isomerasas de disulfuro, y puede conducir a la producción de proteina soluble. Típicamente, la secuencia líder se fusiona a la proteína a ser expresada, lo cual dirige la proteína al periplasma. La líder es después removida por peptidasa de señal dentro del periplasma. Ejemplos de secuencias líder objetivos periplásmicas incluyen la líder pelB a partir del gen pectato liasa y la líder derivada del gen fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la fuga de la proteína expresada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas permite purificación rápida y simple a partir del sobrenadante del cultivo. Las proteínas que no son secretadas pueden ser obtenidas a partir del periplasma por lisis osmótica. Expresión similar a citoplásmica, en algunos casos las proteínas pueden llegar a ser insolubles y desnaturalizantes, y se pueden usar agentes de reducción para facilitar la solubilización y replegado. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influencias los niveles de expresión y solubilidad, típicamente se usan temperatura entre 25°C y 37°C. Típicamente, la bacteria produce proteínas glicosiladas . De esta forma, si las proteínas requieren glicosilación para funcionar, se puede agregar glicosilación in vitro después de la purificación a partir de las células hospederas . b . Células de Levadura Las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pome, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son hospederos de expresión de levadura bien conocidos que pueden ser usadas para producción de proteínas, tal como cualquiera descrita en este documento. La levadura puede ser transformada con vectores de replicación episomal o por integración cromosomal estable por recombinación homologa. Típicamente, se usan promotores inducibles para regular la expresión del gen. Ejemplos de tales promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotionenina, tal como CUP1, A0X1 u otro de Pichia u otro promotor de levadura. Los vectores de expresión a menudo incluyen un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en levaduras son a menudo solubles. La co-expresión con caperininas tal como Bip e isomerasa de disulfuro en proteína pueden proporcionar niveles de expresión y solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levadura pueden ser dirigidas por secreción usando fusiones de péptido de señal de secreción tal como la señal de secreción del factor alfa tipo apareamiento de levadura a partir de Saccharomyces cerevisae y fusiones con proteínas con superficie celular de levadura tal como el receptor de adhesión apareado Aga2p o la glucoamilasa Arxula adeninivorans . Un sitio de desdoblamiento de proteasa tal como la proteasa Kex-2, puede ser diseñado por ingeniería para remover las secuencias fusionadas a partir de los polipéptidos expresados como se retiran de la trayectoria de secreción. La levadura también es capaz de glicosilación en porciones Asn-X-Ser/Thr . c. Células de insecto Las células de insecto, particularmente usando expresión de baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos tal como proteasas modificadas o polipéptidos que atrapan proteasa modificada. Las células de insecto expresan altos niveles de proteína y son capaces de la mayoría de las modificaciones post-traduccional usadas por eucariota mayores. Los baculovirus tienen un intervalo de hospedero restrictivo lo cual mejora la seguridad y reduce los asuntos reguladores de la expresión eucariótica. Vectores de expresión típica usando para promover expresión de alto nivel tal como promotor polihedrina de baculovirus. Sistemas de baculovirus comúnmente usados incluyen los baculovirus tal como virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) , y el virus de polihedrosis nuclear bombyx morí (BmNPV) y líneas celulares de insecto tal como Sf9 derivado de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpNl) . Para altos niveles de expresión, la secuencia del nucleótido de la molécula a ser expresada es fusionada inmediatamente corriente arriba del codón de iniciación polihedrina del virus. Las señales de secreción del mamífero son con exactitud procesadas en las células de insecto y puede ser usadas para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpNl) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a sistemas de célula de mamífero . Un sistema de expresión alternativo en células de insecto es el uso de células establemente transformadas. Las líneas celulares tal como las células Schnieder 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus) pueden ser usadas para expresión. El promotor metalotoneína de Drosophila puede ser usado para inducir altos niveles de expresión en la presencia de inducción de metal pesado con cadmio o cobre. Los vectores de expresión son típicamente mantenidos por el uso de marcadores seleccionables tal como neomicina e higromicina. d. Células de Mamífero Se pueden usar sistemas de expresión de mamífero para expresar proteínas que incluyen proteasas modificadas o porciones de las mismas catalíticamente activas, o polipéptidos que atrapan proteasa o variantes de los mismos. Los constructos de expresión pueden ser transferidos a células de mamífero por infección viral tal como adenovirus o por transferencia de ADN directo tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tal como electroporación y microinyección . Los vectores de expresión para células de mamífero típicamente incluyen sitio tapado ARNm, una caja TATA, una secuencia de iniciación traduccional (secuencia consenso Kozak) y elementos de poliadenilación . Tales vectores a menudo incluyen promotor-mej oradores transcripcionales para altos niveles de expresión, por ejemplo el promotor-mejorador SV40, el promotor citomegalovirus humano (CMV) y la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous (RSV) . Estos promotores-mej oradores son activos en muchos tipos de células. También se pueden usar promotores de tejido y tipo celular y regiones mejoradas para expresión. Regiones de promotor/mejorado ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellas de genes como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus del tumor mamario en ratón, albúmina, fetoproteína alfa, antitripsina alfa 1, globina beta, proteína básica de mielina, miosina de cadena ligera 2 y control del gen de la hormona que libera gonadotrópico . Se pueden usar marcadores seleccionables para seleccionar y mantener células con el constructo de expresión. Ejemplos de genes marcadores selecciónateles incluyen, pero no se limitan a, fosfotransferasa de higromicina B, adenosina desaminasa, transferasa de fosforibosil xantina-guanina, fosfotransferasa de aminoglicósido, reductasa de dihidrofolato y timidina cinasa. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular tal como TCR-? y FCeRI-y puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular. Muchas líneas celulares están disponibles para expresión de mamífero que incluyen células de ratón, rata, humano, mono, pollo y hámster. Líneas celulares ejemplares incluyen pero no se limita a, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NSO de ratón (no secretada) y otras líneas celulares de mieloma, hibridoma y líneas celulares de heterohibridoma , linfocitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 y células HKB. Las líneas celulares también están disponibles adaptadas a medio libre de suero, lo cual facilita la purificación de proteínas secretadas a partir del medio de cultivo celular. Un ejemplo es la línea celular EBNA-1 libre de suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42). e . Plantas Las células de planta transgénica y plantas pueden ser usadas para expresar proteínas tal como cualquiera descrita en este documento. Los constructos de expresión son típicamente transferidos a plantas usando transferencia de ADN directa tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG en protoplastos, y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y mejoradoras, elementos de terminación transcripcional y elementos de control traduccional . Los vectores de expresión y técnicas de transformación son usualmente divididas entre hospederos de dicotiledóneas, tal como Arabidopsis y tabaco, y hospederos de monocotiledóneas, tal como maíz y arroz. Ejemplos de promotores de plantas usados para expresión incluyen el promotor de virus del mosaico de coliflor, el promotor nopalina sintasa, el promotor ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Marcadores seleccionables tal como higromicina, isomerasa de fosfamanosa y fosfotransferasa de neomicina son a menudo usados para facilitar la selección y mantenimiento de células transformadas. Las células de plantas transformadas pueden ser mantenidas en cultivo como células, agregados (tejido celular) o regeneradas en plantas completas. Las células de planta transgénicas también incluyen algas diseñadas por ingeniería para producir proteasas o proteasas modificadas (véase por ejemplo, Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442). Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación que las células de mamífero, esto puede influenciar la elección de proteína producida en estos hospederos. 3. Técnicas de Purificación El método de purificación de polipéptidos , que incluyen polipéptidos de proteasa u otras proteínas, a partir de células hospederas dependerá de las células hospederas elegidas y sistemas de expresión. Para moléculas secretadas, las proteínas son generalmente purificadas a partir del medio de cultivo después de remover las células. Para expresión intracelular, las células pueden ser lisadas y las proteínas purificadas a partir del extracto. Cuando los organismos transgénicos tal como plantas y animales transgénicos se usan para expresión, los tejidos u órganos pueden ser usados como material de partida para elaborar un extracto celular lisado. Adicionalmente, la producción del animal transgénico puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, los cuales pueden ser colectados, y si es necesario, las proteínas pueden ser extraídas purificadas adicionalmente usando métodos estándar en la técnica. En un ejemplo, las proteasas pueden ser expresadas y purificadas por estar en una forma inactiva (forma de zimógeno) o alternativamente la proteasa expresada puede ser purificada en una forma activa, tal como una forma de dos cadenas, por autocatálisis para remover la proregión. Típicamente, la autoactivación ocurre durante el proceso de purificación, tal como por incubación a temperatura ambiente por 24-72 horas. La proporción y grado de activación es dependiente de la concentración de proteína y la proteasa modificada específica, de forma tal que para el ejemplo, una muestra más diluida puede necesitar ser incubada a temperatura ambiente por largo periodo de tiempo. La activación puede ser monitoreada por SDS-PAGE (por ejemplo, un cambio de 3 kilodalton) y por actividad enzimática (desdoblamiento de un sustrato fluorogénico) . Típicamente, una proteasa se deja que llegue a >75% de activación antes de la purificación. Las proteínas, tales como proteasas o polipéptidos que atrapan proteasa, pueden ser purificadas usando técnicas estándar de purificación de proteína conocidas en la técnica, que incluye pero no se limita a, SDS-PAGE, cromatografía de fracción de tamaño y exclusión de tamaño, precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico, tal como intercambio aniónico. También se pueden utilizar técnicas de purificación por afinidad para mejorar la eficiencia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos, receptores y otras moléculas que enlazan proteasas o polipéptidos que atrapan proteasa en purificación por afinidad. Los constructos de expresión también pueden ser diseñados por ingeniería para agregar una marca de afinidad a una proteína tal como un epítope myc, fusión GST o His6 y purificada por afinidad con anticuerpo myc, resina de glutationa y resina de Ni, respectivamente. La pureza se puede evaluar por cualquier método conocido en la técnica, que incluye electroforesis eh gel, y técnicas de teñido y espectrométrico . 4. Proteínas de Fusión También se proporcionan proteínas de fusión que contienen una proteasa variante proporcionada en este documento y uno o más de otros polipéptidos. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas de fusión formuladas para administración por una ruta adecuada. Las proteínas de fusión se forman por unión en cualquier orden a la proteasa modificada y otro polipéptido, tal como anticuerpo o fragmento del mismo, factor de crecimiento, receptor, ligando y otro agente para los propósitos de facilitar la purificación de una proteasa, que altera las propiedades farmacodinámicas de una proteasa dirigiendo la proteasa a una célula o tejido objetivo, y/o incrementando la expresión o secreción de una proteasa. Dentro de una proteína de fusión de proteasa, el polipéptido de proteasa puede corresponder a todas o una porción del mismo catalíticamente activa de una proteína de proteasa. En algunas modalidades, la proteasa o porción de la misma catalíticamente activo es una proteasa modificada. Las proteínas de fusión proporcionadas en este documento retienen sustancialmente toda su especificidad y/o selectividad para cualquiera de uno o más de los sustratos objetivo deseados. Generalmente, los polipéptidos de fusión de proteasa retienen al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60&, 70%, 80%, 85%, 90% ó 95% especificidad y/o selectividad de sustrato comparado con una proteasa de no fusión, que incluye 96%, 97%, 98%, 99% o más especificidad de sustrato comparado con una proteasa de no fusión . El enlace de un polipéptido de proteasa y otro polipéptido se puede efectuar directamente o indirectamente vía un enlazador. En un ejemplo, el enlace puede ser enlace químico, tal como por vía de agentes heterobifuncionales o enlaces tiol y otros enlaces. La fusión de una proteasa a otro polipéptido puede ser a los N- o C-términos del polipéptido de proteasa. Ejemplos no limitantes de polipéptidos que pueden ser usados en proteínas de fusión con una proteasa proporcionada en este documento incluyen, por ejemplo, un polipéptido GST (glutationa S-transferasa) , dominio Fe a partir de una inmunoglobulina o una secuencia señal heteróloga. Las proteínas de fusión pueden contener componentes adicionales, tal como proteína de enlace maltosa de E. coli (MBP) que ayuda a la recuperación de la proteína por células (véase, Solicitud PCT Internacional No. WO01/32711) . Una proteína de fusión de proteasa puede ser producida por técnicas recombiantes estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptido pueden ser ligadas juntas en estructura de conformidad con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando términos de extremo romo o extremo escalonado por ligación, digestión de enzima de restricción para proporcionar términos apropiados, llenado de extremos cohesivos como sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación PCR de fragmentos del gen puede ser llevada a cabo usando cebadores de anclaje que proporcionan aumento a sobresalientes complementarios entre dos fragmentos del gen consecutivos que pueden subsecuentemente ser endurecidos y reamplificados para generar una secuencia quimérica del gen (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Sin embargo, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles listas para codificar una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica una proteasa puede ser clonado en tal vector de expresión de forma que la porción de fusión está enlazada en estructura a la proteina de proteasa . 5. Secuencias de Nucleótido Se proporcionan en este documento moléculas de ácido nucleico que codifican proteasas modificadas. Las moléculas de ácido nucleico incluyen variantes alélicas o variantes de empalme de cualquier proteasa codificada, o porción de la misma catalíticamente activa. En una modalidad, se proporcionan en este documento moléculas de ácido nucleico que tienen al menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ó 99% de identidad de secuencia o hibridizada bajo condiciones de severidad media o alta en al menos 70% de una longitud completa de cualquier ácido nucleico que codifica proteasa de tipo nativo, o porción de la misma catalíticamente activa. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico puede incluir aquellos con secuencias de codón degeneradas de cualquiera de las proteasas o porciones de la misma catalíticamente activas tal como aquellas proporcionadas en este documento. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico, o proteínas de fusión que contienen una porción catalíticamente activa de una molécula de ácido nucleico, operablemente enlazado a un promotor, tal como un promotor inducible para expresión en células de mamífero. Tales promotores incluyen, pero no se limita a, promotores CMV y SV40; promotores de adenovirus, tal como el promotor del gen E2, el cual es responsable de la oncoproteína E7 de HPV; un promotor PV, tal como el promotor p89 de PBV que es responsable de la proteína E2 de PV; y otros promotores que son activados por HIV o PV u oncógenos. Proteasas modificadas proporcionadas en este documento, también pueden ser suministradas a las células en vectores de transferencia del gen. Los vectores de transferencia también pueden codificar adicionalmente otros agentes terapéuticos para tratamiento de la enfermedad o trastorno, tal como trastornos de coagulación o cáncer, para los cuales se administra la proteasa. Los vectores de transferencia que codifican una proteasa pueden ser usados sistémicamente, administrando el ácido nucleico a un sujeto. Por ejemplo, el vector de transferencia puede ser un vector viral, tal como un vector de adenovirus. Los vectores que codifican una proteasa también pueden ser incorporados en células troncales y tales células troncales administradas a un sujeto, tal como por transplante o injerto de las células troncales en los sitios para terapia. Por ejemplo, las células troncales mesenquimales (MSCs) pueden ser diseñadas por ingeniería para expresar una proteasa y tales MSCs injertadas en un sitio de tumor para terapia.

I. PREPARACIÓN, FORMULACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE POLIPEPTIDOS DE PROTEASA SELECCIONADOS 1. Composiciones y Suministro Las composiciones de proteasas seleccionadas, tal como por ejemplo polipéptidos u-PA mutantes seleccionados, pueden ser formuladas por administración mediante cualquier ruta conocida por aquellos expertos en la técnica, que incluye administración intramuscular, intravenosa, intradérmica, inyección intraperitoneal , subcutánea, epidural, nasal, oral, rectal, tópica, inhalación, bucal (por ejemplo, sublingual) y transdérmica o cualquier otra ruta. Las proteasas seleccionadas pueden ser administradas por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de revestimientos epitelial o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden ser administradas con otros agentes biológicamente activos, ya sea secuencialmente, intermitentemente o en la misma composición. La administración puede ser local, tópica o sistémica dependiendo del lugar de tratamiento. La administración local a un área en necesidad del tratamiento puede se lleva a cabo por, por ejemplo, pero no se limita a, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para herida después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante. La administración también puede incluir sistemas de liberación controlada que incluye formulaciones de liberación controlada y dispositivo de liberación controlada, tal como por medio de una bomba. La ruta más adecuada en cualquier caso dado depende de una variedad de factores, tal como la naturaleza de la enfermedad, el progreso de la enfermedad, la séveridad de la enfermedad, la composición particular la cual se usa. Se conocen varios sistemas de suministro y pueden ser usados para administrar proteasas seleccionadas, tal como pero no se limitan a, encapsulación en liposomas, micropartículas , microcápsulas , células recombiantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por el receptor y suministro de moléculas de ácido nucleico que codifican proteasas seleccionadas tal como sistemas de suministro de retrovirus.

Se pueden preparar composiciones farmacéuticas que contienen proteasas seleccionadas. Generalmente, se preparan las composiciones farmacéuticamente aceptables en vista de aprobación por una agencia reguladora u otra agencia, preparada de conformidad con farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y en humanos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores tales como un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual una isoforma es administrada. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite cacahuate, aceite de soya, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un portador típico, cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. También se pueden emplear soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones puede contener junto con un ingrediente activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tal como goma de acacia, gelatina, glucosa, melazas, polivinilpirrolidina, celulosa y derivados de los mismos, povidona, crospovidona y otros aglutinantes conocidos por aquellos expertos en la técnica. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilen glicol, agua y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes y emulsificantes , o agentes amortiguadores de pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato de trietanolamina y sodio, oleato de trietanolamina y otros agentes. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Una composición puede ser formulada como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tal como triglicéridos . La formulación oral puede incluir portadores estándar tal como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y otros agentes. Ejemplos de portadores farmacéuticos se describen en "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tales composiciones pueden contener una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portadores para proporcionar la forma para administración apropiada al paciente. La formulación debe ser adecuada a la forma de administración. Se proporcionan formulaciones para administración a humanos y animales en formas de dosificación unitarias, tal como tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, y soluciones o suspensiones orales, y emulsiones aceite-agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados de los mismos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos farmacéuticamente terapéuticamente activos y derivados de los mismos son típicamente formulados y administrados en formas de dosificación unitarias o formas de dosificación múltiples. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas, y tabletas o cápsulas individualmente empaquetadas. Se pueden administrar formas de dosificación unitarias, en fracciones o múltiples de los mismos. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias empaquetadas en un contenedor único para ser administrado en forma de dosis única segregado. Ejemplos de formas de dosis múltiple incluyen viales, botellas de tabletas o cápsulas o botellas de pintas o galones. Por lo tanto, forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no están segregadas en empaquetado. Se pueden preparar formas o composiciones de dosificación que contienen ingrediente activo en el intervalo de 0.005% hasta 100% con el balance hecho a partir de un portador no tóxico. Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tal como agentes de enlace (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinil pirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa) ; rellenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato hidrógeno de calcio) ; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa glicolato almidón de sodio) ; o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio) . Las tabletas pueden ser recubiertas por métodos bien conocidos en la técnica. La preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o puede estar presente como un producto del fármaco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Las preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes de emulsión (por ejemplo, lecitina o acacia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos o aceites vegetales fraccionados) ; y preservativos (por ejemplo, metil- o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Formulaciones adecuadas para administración rectal pueden ser proporcionadas como supositorios de dosis unitarias. Estos pueden ser preparados mezclando el compuesto activo con uno o más portadores sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y después moldear la mezcla resultante. Formulaciones adecuadas para aplicación tópica a la piel o al ojo, incluyen ungüentos, cremas, lociones, pastas, geles, atomizadores, aerosoles y aceites. Portadores ejemplares incluyen vaselina, lanolina, polietilen glicoles, alcoholes y combinaciones de dos o más de los mismos. Las formulaciones tópicas también pueden contener 0.05 hasta 15, 20, 25 por ciento en peso de espesantes seleccionados de entre hidroxi propil metil celulosa, metil celulosa, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, poli (alquilen glicoles), poli/hidroxialquilo, (met ) acrilatos o poli (met ) acrilamidas . Una formulación tópica es a menudo aplicada por instilación o como un ungüento en el saco conjuntival. También puede ser usada para irrigación o lubricación del ojo, cavidades faciales, y conducto auditivo externo. También puede ser inyectada en el interior de la cámara acular y otros lugares. Una formulación tópica en el estado liquido también puede estar presente en una matriz hidrofilica de polímero tridimensional en la forma de una tira o lentes de contacto, a partir del cual los componentes activos son liberados. Para administración por inhalación, los compuestos para uso en este documento pueden ser suministrados en la forma de una presentación de atomización de aerosol en envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un impulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para uso en un inhalador o insuflador pueden ser formulados conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Las formulaciones adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen, por ejemplo, grageas que contienen el compuesto activo en una base con sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; y pastillas que contienen el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia. Las composiciones farmacéuticas de proteasas seleccionadas pueden ser formuladas para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones por inyección pueden estar presentes en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en contenedores de dosis múltiples, con un preservativo agregado. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículo aceitoso o acuoso, y pueden contener agentes de formulación tal como agentes de suspensión, de estabilización y/o de dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril u otros solventes, antes del uso. Se proporcionan formulaciones adecuadas para administración transdérmica . Pueden ser proporcionadas en cualquier formato adecuado, tal como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor por un periodo de tiempo prolongado. Tales parches contienen el compuesto activo en solución acuosa opcionalmente amortiguada de, por ejemplo, 0.1 hasta 0.2M en concentración con respecto al compuesto activo. También se pueden suministrar formulaciones adecuadas para administración transdérmica por iontoforesis (véase, por ejemplo, Pharmaceutical Research 3(6), 318 (1986) y típicamente toman la forma de una solución acuosa opcionalmente amortiguada del compuesto activo. También se pueden administrar composiciones farmacéuticas por formulaciones de liberación controlada y/o dispositivos de suministro (véase, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 y 5,733,566). En ciertas modalidades, también se pueden emplear liposomas y/o nanopartículas con administración de proteasa seleccionada. Los liposomas son formados a partir de fosfoíípidos que están dispersados en un medio acuoso y espontáneamente forman vesículas bicapas concéntricas multilaminar (también llamadas vesículas multilaminares (MLVs) ) . Las MLVs generalmente tienen diámetros de 25 nm hasta 4 µp\. La sonicación de MLVs resulta en la formación de vesículas unilaminares pequeñas (SUVs) con diámetros en el intervalo de 200 hasta 500 angstroms que contienen una solución acuosa en el núcleo. Los fosfoíípidos pueden formar una variedad de estructuras diferentes a liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar del lipido a agua. A proporciones bajas, la forma liposomas. Las características físicas de liposomas dependen de pH, intensidad iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas pueden sufrir una fase de transición la cual marcadamente alteran su permeabilidad. La fase de transición involucra un cambio de una estructura ordenada, estrechamente empaquetada, conocida como el estado en gel, para una estructura ordenada, holgadamente empaquetado, conocido como el estado de fluido. Esto ocurre a una temperatura de fase de transición característica y resulta en un incremento en permeabilidad a iones, azúcares y fármacos. Los liposomas interactúan con células vía diferentes mecanismos; endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tal como macrófagos y neutrófilos ; adsorción a la superficie celular, ya sea por fuerzas hidrofóbicas o electroestáticas débiles no específicas, o por interacciones específicas con componentes de superficie celular; fusiones con la membrana celular del plasma por inserción del lípido bicapa del liposoma en la membrana del plasma, con liberación simultánea de contenido liposomal en el citoplasma; y por transferencia de lipidos liposomales a membranas celular o subcelular, o vice versa, sin cualquier asociación de los contenidos de liposoma. Variando la formulación de liposoma puede alterar dicho mecanismo operativo, aunque más de uno puede operar al mismo tiempo. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos en una forma estable y reproducible . Para evitar efectos colaterales debido sobrecarga polimérica intracelular , tales partículas ultrafinas (de tamaño alrededor de 0..1 µp) deben ser diseñadas usando polímeros capaces de ser degradados in vivo. Se contemplan nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cubren estos requerimientos para uso en este documento, y tales partículas pueden fácilmente elaborarse. Se pueden emplear métodos de administración para disminuir le exposición de proteasa seleccionada a procesos degradantes, tal como degradación proteolítica e intervención inmunológica vía respuestas antigénicas e inmunogénicas . Ejemplos de tales métodos incluyen administración local en los sitios de tratamiento. Se ha reportado pegilación de terapéuticos por incrementar la resistencia a proteólisis, incrementa la vida media del plasma, y disminuye la antigenicidad e inmunogenicidad . Se conocen en la técnica ejemplos de metodologías de pegilación (véase por ejemplo, Lu and Félix, Int. J.

Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Félix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Félix et al., Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 1995; Benhar et al., J Biol. Chem. , 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995; véase también Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (10) : 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). También se puede usar pegilación en el suministro moléculas de ácido nucleico in vivo. Por ejemplo, la pegilación de adenovirus puede incrementar la estabilidad y transferencia del gen (véase, por ejemplo, Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51). Se pueden mantener niveles deseables de sangre por una infusión continua del agente activo como se determina por niveles de plasma. Se debe notar que el médico tratante debe conocer cómo y cuando terminar, interrumpir o ajustar la terapia para disminuir la dosificación debido a toxicidad, o disfunciones de la médula ósea, hígado o riñon. Contrariamente, el médico tratante pueden también conocer cómo y cuando ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no es adecuada (que impiden efectos secundarios tóxicos). Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas, por ejemplo, por ruta de administración, oral, pulmonar, parenteral (intramuscular, intraperitoneal , intravenosa (IV) o inyección subcutánea), inhalación (vía una formulación en polvo fino) , transdérmica, nasal, vaginal, rectal, o subglingual y pueden ser formuladas en formas de dosificación apropiadas para cada ruta de administración (véase, por ejemplo, Solicitudes PCT Internacionales Nos. WO 93/25221 y WO 94/177184; y Solicitud de Patente Europea 613,683). Una . proteasa seleccionada es incluida en el portador farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en la ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. Se pueden determinar empíricamente la concentración terapéuticamente efectiva, probando los compuestos en sistemas in vítro o in vivo conocidos, tal como los ensayos proporcionados en este documento. La concentración de una proteasa seleccionada en la composición depende de proporciones de absorción, inactivación y excreción del complejo, las características fisicoquímicas del complejo, el esquema de dosificación y cantidad administrada, así como también otros factores conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se puede determinar la cantidad de una proteasa seleccionada a ser administrada para el tratamiento de una enfermedad o condición, por ejemplo tratamiento contra cáncer o angiogénesis por técnicas clínicas estándar. Además, se pueden emplear los ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptima. La dosificación precisa, la cual puede ser determinada empíricamente, puede depender en la ruta de administración y la seriedad de la enfermedad. Se puede administrar una proteasa seleccionada a la vez, o puede ser dividida en un número de dosis pequeña para ser administradas en intervalos de tiempo. Se pueden administrar proteasas seleccionadas en una o más dosis durante el curso de un tiempo de tratamiento, por ejemplo durante varias horas, días, semanas o meses. En algunos casos, es útil la administración continua. Se entenderá que la dosificación y duración precisa del tratamiento está en función de la enfermedad a ser tratada y puede ser administrada empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o por extrapolación de datos de prueba in vivo o in vitro. Se debe notar que los valores de concentraciones y dosificación pueden variar con la severidad de la condición a ser aliviada. Además se debe entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específica se deben ajustar durante un tiempo, de conformidad con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración mostrados en este documento son únicamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o uso de las composiciones y combinaciones que los contienen. Las composiciones pueden ser administradas, cada hora, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente o una vez. La forma de administración de la composición que contiene los polipéptidos, asi como composiciones que contienen ácidos nucleicos para terapia de gen, incluyen, pero no se limitan a, administración intralesional, intraperitoneal , intramuscular e intravenosa. También incluidos son administración por infusión, intratecal, subcutánea, mediada por liposoma y mediada por depósito. También incluidos, son suministro nasal, ocular, oral, tópico, local y óptico. Las dosificaciones pueden ser determinadas empíricamente y dependen de la indicación, forma de administración y el sujeto. Dosificaciones ejemplares incluyen de 0.1, 1, 10, 100, 200, y más mg/día/kg en peso del sujeto. 2. Expresión in vivo de Proteasas Seleccionadas y Terapia de Gen . Pueden ser suministradas proteasas seleccionadas a células y tejidos por expresión de moléculas de ácido nucleico. Las proteasas seleccionadas se puede administrar como moléculas de ácido nucleico que codifican una proteasa seleccionada, que incluyen técnicas ex vivo y expresión in vivo directas. a. Suministro de Ácidos Nucleicos Se pueden suministrar ácidos nucleicos a las células y tejidos por cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica. i . Vectores Episomales e Integración Métodos para administrar proteasas seleccionadas por expresión de moléculas de ácido nucleico codificadas incluyen administración de vectores recombinantes . El vector puede ser diseñado para permanecer episomal, tal como por inclusión de un origen de replicación o puede ser diseñado para integrarse en un microsoma en la célula. Vectores recombinantes pueden incluir vectores virales y vectores no virales. Vectores virales no limitantes incluyen, por ejemplo, vector adenoviral, vectores del virus de herpes, vectores retrovirales y cualquier otro vector viral conocido por un experto en la técnica. Vectores virales no limitantes incluyen cromosomas artificiales o liposomas u otro vector no viral. También se puedes usar las proteasas seleccionadas en terapia de expresión del gen ex vivo usando vectores virales y no virales. Por ejemplo, las células pueden ser diseñadas por ingeniería para expresar una proteasa seleccionada, tal como integrando un ácido nucleico que codifica una proteasa seleccionada en una localización genómica, ya sea operativamente enlazada a secuencias reguladoras o de forma tal que se coloca operablemente enlazado a secuencias reguladoras en una localización genómica. Tales células pueden después ser localmente o sistémicamente administradas a un sujeto, tal como un paciente en necesidad del tratamiento. Una proteasa seleccionada puede ser expresada por un virus, el cual es administrado a un sujeto en necesidad del mismo por tratamiento. Vectores de virus adecuados para terapia de gen incluyen adenovirus, virus asociado a adeno, retrovirus, lentivirus y otros anotados anteriormente. Por ejemplo, la tecnología de expresión de adenovirus es bien conocida en la técnica, y también son bien conocidos la producción de adenovirus y métodos de administración. Los serotipos de adenovirus están disponibles, por ejemplo, a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rocville, MD) . Se pueden usar adenovirus ex vivo, por ejemplo, las células son aisladas a partir de un paciente en necesidad del tratamiento, y transducidas con un vector de adenovirus que expresan proteasa seleccionada. Después de un periodo de cultivo adecuado, las células transducidas se administran a un sujeto, localmente y/o sistémicamente. Alternativamente, se aislan partículas de adenovirus que expresan proteasa y se formula en un portador farmacéuticamente aceptable para suministrar una cantidad terapéuticamente efectiva para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad o condición de un sujeto. Típicamente, las partículas de adenovirus son suministradas a una dosis que varía de 1 partícula a 1014 partículas por kilogramo del peso del sujeto, generalmente entre 106 ó 108 partículas hasta 1012 partículas por kilogramo del peso del sujeto. En algunas situaciones es deseable proporcionar una fuente de ácido nucleico con un agente de células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o una célula objetivo, o un ligando para un receptor en una célula objetivo. ii . Cromosomas artificiales y Otros Métodos de suministro del Vector no viral Las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en cromosomas artificiales y otros vectores no virales. Los cromosomas artificiales (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,077,697 y Solicitud PCT Internacional No. WO 02/097059) pueden ser diseñados por ingeniería para codificar y expresar la isoforma. iii . Liposomas y Otras formas Encapsuladas y Administración de Células que contiene Ácidos nucleicos Se pueden encapsular los ácidos nucleicos en un vehículo, tal como un liposoma, o inducidos en células, tal como célula bacteriana, particularmente una bacteria atenuada o introducida en un vector viral. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas, se pueden usar las proteínas • que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis para el objetivo y/o para facilitar la recuperación, por ejemplo proteínas de cápsido o fragmentos de las mismas, trópica para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas los cuales sufren internalización en ciclo, y proteínas de localización intracelular objetivo y aumentan la vida media intracelular . b. Suministro in vítro y ex vivo Para métodos ex vivo e in vivo, se introducen moléculas de ácido nucleico que codifican la proteasa seleccionada en las células que son de un donador adecuado o del sujeto a ser tratado. Las células en las cuales un ácido nucleico puede ser introducido para propósitos de terapia incluyen, por ejemplo, cualquier tipo celular disponible, deseado apropiado para la enfermedad o condición a ser tratada, que incluye pero no se limita a, células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos , fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacarinocitos , granulocitos ; células troncales y progenitores variadas, en particular células troncales o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, tales como células troncales obtenidas a partir de médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal y otras fuentes de las mismas. Para tratamiento ex vivo, se remueven células a partir de un donador compatible con el sujeto a ser tratado, o células a partir del sujeto a ser tratado, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y se administran las células modificadas al sujeto. El tratamiento incluye administración directa, tal como o, por ejemplo, encapsulado dentro de membranas porosas, las cuales se implanta en el paciente (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas y electroporación de lípidos catiónicos (por ejemplo, DOT A, DOPE y DC-Chol), microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano y métodos de precipitación de fosfato de calcio. Se pueden usar métodos de suministro de ADN para expresar proteasas seleccionadas in vivo. Tales métodos incluyen suministro de liposoma de ácidos nucleicos y suministro de ADN puro, que incluye suministro local y sistémico tal como usar electroporación, ultrasonido y suministro de fosfato de calcio. Otras técnicas incluyen microinyección, fusión celular, transferencia del gen mediada por microsoma, transferencia del gen mediada por microcélula y fusión de esferoplasto. Expresión in vivo de una proteasa seleccionada puede estar enlazada a la expresión de moléculas adicionales. Por ejemplo, la expresión de una proteasa seleccionada puede estar enlazada con la expresión de un producto citotóxico tal como un virus diseñado por ingeniería o expresado en un virus citotóxico. Tales virus pueden ser objetivos a un tipo celular particular que es un objetivo para un efecto terapéutico. La proteasa seleccionada expresada puede ser usada para mejorar la citotoxicidad del virus. La expresión in vivo de una proteasa seleccionada puede operablemente enlazar una molécula de ácido nucleico que codifica la proteasa seleccionada a secuencias reguladoras específicas tal como un promotor específico de la célula o específico del tejido. Las proteasas seleccionadas también pueden ser expresadas a partir de vectores que específicamente infectan y/o replican en tipos celulares objetivos y/o tejidos. Se pueden usar promotores inducibles para selectivamente regular la expresión de proteasa seleccionada. c. Suministro Sistémico, Local y Tópico Se pueden administrar moléculas de ácido nucleico, como ácidos nucleicos puros o en vectores, cromosomas artificiales, liposomas y otros vehículos al sujeto por administración sistémica, tópica, local y otras rutas de administración. Cuando es sistémica e in vivo, la molécula de ácido nucleico o vehículo que contiene la molécula de ácido nucleico puede ser objetivo a una célula. La administración también puede ser directa, tal como por administración de un vector o células que célula o tejido típicamente objetivos. Por ejemplo, células de tumor y células proliferativas pueden ser células objetivo para expresión in vivo de proteasa seleccionada. Las células usadas para expresión in vivo de una isoforma también incluyen células autólogas al paciente. Tales células pueden ser removidas de un paciente, ácidos nucleicos para expresión de una proteasa seleccionada introducida, y después administrarla al paciente como tal por inyección o inj erto . 2. Terapias de Combinación Cualquiera de estos polipéptidos de proteasa seleccionadas, y moléculas de ácido nucleico que codifican codifican polipéptidos de proteasa seleccionada descritos en este documento, pueden ser administrados en combinación con, antes de, intermitentemente con, o subsecuentemente a, otros agentes o procedimientos terapéuticos, que incluyen pero no se limitan a, otros compuestos biológicos, de molécula pequeña y cirugía. Para cualquier enfermedad o condición, que incluyen aquellos ejemplificados anteriormente, para los cuales están disponibles otros agentes y tratamientos, se pueden usar polipéptidos de proteasa seleccionada para tales enfermedades y condiciones en combinación con esos. Por ejemplo, polipéptidos de proteasa seleccionada proporcionados en este documento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, por ejemplo, cáncer, puede ser administrado en combinación con, antes de, intermitentemente con o subsecuentemente a, otros agentes terapéuticos anti-cáncer, por ejemplo agentes quimioterapéuticos , radionúclidos , terapia por radiación, citocinas, factores de crecimiento, agentes fotosensibilizadores , toxinas, anti-metabolitos , moduladores de señalización, antibióticos anti-cáncer, anticuerpos anti-cáncer, inhibidores de angiogénesis o una combinación de los mismos. En un ejemplo específico, los polipéptidos de proteasa seleccionada proporcionados en este documento para el tratamiento de enfermedades trombóticas puede ser administrados en combinación con, antes de, intermitentemente con o subsecuentemente a, otros agentes anticoagulantes que incluyen, pero no se limita a, inhibidores de plaquetas, vasodilatadores, activadores fibroliticos y otros anticoagulantes. Anticoagulantes ejemplares incluyen heparina, cumarina, hirudina, aspirina, naproxeno, ácido meclofenámico, ibuprofeno, indometacina, fenilbutazara, ticlopidina, estreptocinasa, urocinasa y activador plasminógenico del tejido. 3. Artículos de Manufactura y Kits Los compuestos farmacéuticos de polipéptidos de proteasa seleccionada para polipéptidos de proteasa seleccionada que codifican ácido nucleico, o un derivado o una porción biológicamente activa del mismo puede ser empaquetadas como artículos de manufactura que contiene material empaquetado, una composición farmacéutica la cual es efectiva para tratar la enfermedad o trastorno, y una etiqueta que indica que el polipéptido de proteasa seleccionada o molécula de ácido nucleico se usa para tratar la enfermedad o trastorno. Los artículos de manufactura proporcionados en este documento contienen materiales empaquetados. Los materiales empaquetados para uso en productos farmacéuticos empaquetados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,323,907, 5,052,558 y 5,033,252, cada una de las cuales se incorpora en este documento en su totalidad. Ejemplos de materiales empaquetados farmacéuticos incluyen, pero no se limita a, empaques de ampolla, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, contenedores, jeringas, botellas y cualquier otro material de empaquetado adecuado para una formulación seleccionada y forma planeada de administración y tratamiento. Una amplia serie de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionadas en este documento se contemplan como una variedad de tratamientos para cualquier enfermedad o trastorno mediado por el objetivo. También se puede proporcionar como kits los polipéptidos de proteasa seleccionada y moléculas de ácido nucleico. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en este documento y un articulo para administración. Por ejemplo, una proteasa seleccionada puede ser suministrada con un dispositivo para administración, tal como una jeringa, un inhalador, una copa de dosificación, un gotero o un aplicador. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para aplicación que incluye dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para formas de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en este documento y un artículo para diagnóstico. Por ejemplo, tales kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o actividad de la proteasa seleccionada en un sujeto.

J. MÉTODOS EJEMPLARES DE ETRATAMIENTO CON POLIPÉPTIDOS DE PROTEASA SELECCIONADA Los polipéptidos de proteasa seleccionada en este documento que desdoblan objetivos particulares y moléculas de ácido nucleico que codifican la proteasa seleccionada proporcionada en este documento pueden ser usados para tratamiento de cualquier enfermedad o condición asociada con una proteina que contiene la secuencia objetivo o para la cual se emplea una proteasa que desdobla la secuencia objetivo. Por ejemplo, se pueden usar polipéptidos uPA seleccionado diseñado por ingeniería para desdoblar sustratos objetivo tPA, tal como plasminógeno para tratamiento de cualquier enfermedad o condición asociada con el sustrato objetivo tPA o para el cual se emplean polipéptidos tPA. Enfermedades ejemplares asociadas con un sustrato objetivo tPA incluyen enfermedades trombóticas en donde el tratamiento con una proteasa seleccionada proporcionada en este documento puede promover el desdoblamiento de plasminógeno a su proteasa activa forma plasmina, e induce disolución de un coagulo sanguíneo. Los polipéptidos de proteasa seleccionada que tiene actividad terapéutica solos o en combinación con otros agentes. Los polipéptidos de proteasa seleccionada proporcionados en este documento se diseñan para exhibir propiedades mejoradas sobre proteínas de enlace rivalizadas. Tales propiedades, por ejemplo, pueden mejorar la efectividad terapéutica de los polipéptidos . Esta sección proporciona usos ejemplares de y métodos de administración. Estas terapias descritas son ejemplares y no limitan las aplicaciones de polipéptidos de proteasa seleccionada . Los polipéptidos de proteasa seleccionada proporcionados en este documento pueden ser usados en varios terapéuticos, así como también métodos de diagnóstico que están asociados con una proteína que contiene la secuencia objetivo. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, métodos de tratamiento de condiciones fisiológicas y médicas descritas y listadas posteriormente. Los polipéptidos de proteasa seleccionada proporcionados en este documento pueden exhibir mejoramiento de actividades in vivo y efectos terapéuticos comparados a proteínas de enlace rivalizadas o una proteasa que desdobla el objetivo particular, que incluye dosificaciones inferiores para lograr el mismo efecto, un efecto terapéutico más sostenido y otras mejoramientos en administración y tratamiento. Ejemplos de mejoramientos terapéuticos usando polipéptidos de proteasa seleccionada incluyen, pero no se limita a, mejor penetración al tejido objetivo (por ejemplo, penetración al tumor) , mayor efectividad, dosificaciones bajas, pocas administraciones y/o menos frecuentes, efectos laterales disminuidos y efectos terapéuticos incrementados. Notablemente, debido a las proteasas seleccionadas pueden desdoblar e inactivar números elevados de sustrato objetivo, las proteasas seleccionadas ofrecen amplificación terapéutica sustancial. En particular, los polipéptidos de proteasa seleccionada, son planeados para uso en métodos terapéuticos en los cuales una proteasa que desdobla el objetivo particular se ha usado para tratamiento. Tales métodos incluyen, pero no se limita a, métodos de tratamiento de enfermedades, tales como, pero no se limitan a, trastornos de coagulación sanguínea, que incluyen trastornos trombóticos y coagulación intravascular diseminada, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurológicos , enfermedades proliferativas, tal como cáncer, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infección viral, infección bacteriana, enfermedades respiratorias, trastornos gastrointestinales y enfermedades metabólicas . El tratamiento de enfermedades y condiciones con los polipéptidos de proteasa seleccionada puede ser efectuado por cualquier ruta adecuada de administración, usando formulaciones adecuadas como se describe en este documento, que incluye, pero no se limita a, administración intramuscular, intravenosa, intradérmica, inyección intraperitoneal , subcutánea, epidural, nasal, oral, rectal, tópica, inhalación, bucal (por ejemplo, sublingual) y transdérmica . Si es necesario, una dosificación y duración particular, y protocolo de tratamiento pueden ser empíricamente determinados o extrapolados. Por ejemplo, se pueden usar dosis ejemplares de polipéptidos de proteasa de tipo nativo que desdoblan secuencias similares como un punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, se puede usar una dosificación de un polipéptido tPA recombinante como una guía para determinación de dosificaciones de polipéptidos uPA seleccionado que desdobla tPA objetivos. Se pueden determinar niveles y regímenes de dosificación en base a dosificaciones y regímenes conocidos, y si es necesario pueden ser extrapoladas en base a los cambios en propiedades de los polipéptidos de proteasa seleccionada y/o se pueden determinar empíricamente en base a una variedad de factores. Se pueden usar factores tales como el nivel de actividad y vida media de los polipéptidos de proteasa seleccionada en comparación a otras proteasas similares para elaborar tales determinaciones. Las dosificaciones y regímenes particulares pueden ser empíricamente determinados. Otros factores incluyen, peso corporal del individuo, salud general, edad, la actividad del compuesto específico empleado, seco, dieta, tiempo de administración, proporción de excreción, combinación de fármaco, la severidad y curso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el juicio del médico tratante. Típicamente se combinan el ingrediente activo, el polipéptido de proteasa seleccionado con un portador farmacéuticamente efectivo. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinado con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única o forma de dosificación múltiple puede variar dependiendo del hospedero tratado y la forma particular de administración. El efecto de los polipéptidos de proteasa seleccionada en el tratamiento de una enfermedad o mejora de los síntomas de una enfermedad puede ser monitoreado usando una prueba de diagnóstico conocida en la técnica para la enfermedad particular a ser tratada. En el mejoramiento de una condición del paciente, se puede administrar una dosis de mantenimiento de un compuesto o composición, si es necesario; y la dosificación, la forma de dosificación o frecuencia de administración, o una combinación de los mismos pueden ser modificados. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente en una base de acción prolongada en cualquier reincidencia de síntomas de la enfermedad o en base al esquema de dosificaciones. En otros casos, se pueden requerir administraciones adicionales en respuesta a eventos agudos tal como hemorragia, trauma o procedimientos quirúrgicos. En algunas muestras, se emplean variantes de las proteínas de proteasa seleccionada que funcionan como cualquiera de agonistas de proteasa (es decir, miméticos) o como antagonistas de proteasa. Se pueden generar variantes del polipéptido de proteasa seleccionada por mutagénesis (por ejemplo, mutación o truncamiento del punto discreto de la proteína de proteasa) . Un agonista del polipéptido de proteasa seleccionado puede retener sustancialmente el mismo, o una subserie de, las actividades biológicas de una forma que se origina naturalmente del polipéptido de proteasa seleccionada. Un antagonista del polipéptido de proteasa seleccionada puede inhibir una o más de las actividades de la forma que se origina naturalmente del polipéptido de proteasa seleccionada por, por ejemplo, desdoblando la misma proteína objetivo como el polipéptido de proteasa seleccionada. De esta forma, los efectos biológicos específicos pueden ser producidos por tratamiento con una variante de la función limitada. En una modalidad, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene una subserie de las actividades biológicas de la forma que se origina naturalmente del polipéptido de proteasa seleccionada tiene pocos efectos secundarios en un sujeto en relación al tratamiento con la forma que se origina naturalmente del polipéptido de proteasa seleccionada. Las siguientes son algunas enfermedades o condiciones ejemplares para las cuales las proteasas seleccionadas pueden ser usadas como un agente de tratamiento solo o en combinación con otros agentes. Objetivos ejemplares para selección de proteasa son para propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de objetivos posibles para uso en los métodos proporcionados en este, documento. 1. Métodos E emplares de Tratamiento para Polipéptidos uPA Seleccionado que Desdoblan Objetivos tPA Los polipéptidos que uPA seleccionados que desdoblan secuencias objetivo tPA son útiles en aplicaciones terapéuticos para uso en mejora de trastornos trombóticos que incluyen condiciones tanto agudas como crónicas. Las condiciones agudas incluyen entre otras tanto ataque al corazón como apoplejía, mientras las situaciones crónicas incluyen aquellas de trombosis y restenosis arterial y de vena profunda. Los polipéptidos uPA seleccionados pueden ser usados como agente terapéuticos trombóticos para mejorar los síntomas de tales condiciones. Las composiciones terapéuticas incluyen los polipéptidos, moléculas de ADNc solas o parte de un sistema de suministro del vector viral y otros sistemas de suministro de expresión del gen a base de vector, presentados en un sistema de suministro de liposoma y similares. Una composición para uso como un agente terapéutico trombolítico es una cantidad fisiológicamente efectiva de los polipéptidos uPA seleccionados en un excipiente farmacéutico adecuado. Dependiendo de la forma de administración y la condición a ser tratada, los agentes terapéuticos trombolíticos se administran en una dosis única o múltiple. Un experto en la técnica apreciará que las variaciones en dosificación dependen de la condición a ser tratada. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en este documento que inhiben o antagonizan la coagulación sanguínea pueden ser usados en métodos anticoagulantes de tratamiento para trastornos isquémicos, tal como trastorno vascular periférico, un émbolo pulmonar, una trombosis venosa, trombosis de vena profunda (DVT), tromboflebitis superficial (SVT) , trombosis arterial, un infarto al miocardio, un ataque isquémico temporal, angina inestable, un déficit neurológico isquémico reversible, una actividad trombolitica adjunta, condiciones coagulantes excesivas, lesión de perfusión, anemia falciforme o trastorno de apoplejía. En pacientes con un riesgo incrementado de coagulación excesiva, tal como DVT o SVT, durante cirugía, polipéptidos uPA de proteasa seleccionada proporcionados en este documento, pueden ser administrados para prevenir coagulación excesiva en cirugías, tal como, pero no se limitan a cirugía cardiaca, angioplastía, cirugía de pulmón, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía del cerebro, cirugía vascular o cirugía de transplante de órgano, que incluye transplante de corazón, pulmón, páncreas, o hígado. El algunos casos, se realiza en tratamiento solo con polipéptidos uPA seleccionados. En algunos casos, se administran polipéptidos uPA seleccionados junto con factores anticoagulación adicional requeridos por la condición o enfermedad a ser tratada. El tPA es la única terapia para apoplejía tromboembolítica aguda, la cual es aprobada por la Administración de Alimento y Fármaco (FDA) . El tPA y variantes de los mismos están comercialmente disponibles y se han aprobado para administración a humanos por una variedad de condiciones. Por ejemplo, alteplasa (Activase®, Genentech, South San Francisco, Calif.) es tPA recombinante humano. La reteplasa (Retavase®, Rapilysin®; Boehringer Mannheim, Roche Centoror) es una forma no glicosilada recombinante de tPA humano en el cual la molécula ha sido genéticamente diseñada por ingeniería por contener 355 de los 527 aminoácidos de la proteína original. La tenecteplasa (TNKase®, Genetech) es un derivado de glicoproteína de 527 aminoácidos de tPA humano que difiere de tPA humano que se origina naturalmente por tener tres sustituciones de aminoácido. Estas sustituciones disminuyen la separación del plasma, incrementan el enlace de fibrina (y por lo tanto incrementan la especificidad de fibrina) e incrementan la resistencia al inhibidor-1 activador de plasminógeno (PAI-1). La anistreplasa (Eminase®, SmithKline Beecham) es aún otro tPA humano comercialmente disponible. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en este documento con especificidad hacia objetivos tPA pueden ser similarmente modificados y preescritos por cualquier terapia que es tratable con tPA. a. Enfermedades y Condiciones Trombóticas Las enfermedades se caracterizan por hipercoagulación, o la desregulación de hemostasis en favor del desarrollo de coágulos sanguíneos. Enfermedades y condiciones trombóticas ejemplares incluyen trombosis arterial, trombosis venosa, tromboembolismo venoso, embolismo pulmonar, trombosis de la vena profunda, apoplejía, apoplejía isquémica, infarto al miocardio, angina inestable, fibrilación atrial, lesión renal, angioplastía coronaria transluminal percutánea, coagulación intravascular diseminada, sepsis, órganos artificiales, derivación o prótesis, y otras enfermedades trombóticas adquiridas, como se discute posteriormente. Terapias típicas para enfermedades trombóticas involucran terapias anticoagulantes, que incluyen inhibición de la cascada de coagulación. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en este documento y los polipéptidos uPA seleccionados que codifican ácidos nucleicos proporcionados en este documento, pueden ser usados en terapias anticoagulantes para enfermedades y condiciones trombóticas, que incluyen tratamiento de condiciones que involucran coagulación intravascular. Se pueden usar los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en este documento que pueden inhibir la coagulación sanguínea, por ejemplo, para control, disolver, o prevenir la formación de trombosis. En una modalidad particular, los polipéptidos uPA seleccionados en este documento, y polipéptidos uPA seleccionados que codifican ácidos nucleicos pueden ser usados para tratamiento de un trastorno trombótico arterial. En otra modalidad, los polipéptidos uPA seleccionados en este documento, y polipéptidos uPA seleccionados modificados que codifican ácidos nucleicos pueden ser usados para tratamiento de un trastorno trombótico venoso, tal como trombosis de la vena profunda. En una modalidad particular, los polipéptidos uPA seleccionados, y polipéptidos uPA seleccionados que codifican ácidos nucleicos pueden ser usados para tratamiento de un trastorno isquémico, tal como apoplejía. Ejemplos de mejoramientos terapéuticos que usan polipéptidos uPA seleccionados incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, dosificaciones inferiores, poca administración y/o menos frecuente, efectos secundarios disminuidos y efectos terapéuticos incrementados. Los polipéptidos uPA seleccionados pueden ser probados para efectividad terapéutica, por ejemplo, usando modelos animales. Por ejemplo, modelos de ratón de apoplejía isquémica, o cualquier otro modelo de enfermedad conocida para una enfermedad o condición trombótica, se pueden tratar con polipéptidos uPA seleccionados (Dodds, Ann NY Acad Sci 516:631-635 (1987)) . El progreso de los síntomas y fenotipos de la enfermedad es monitoreado para evaluar los efectos de los polipéptidos uPA seleccionados. Los polipéptidos uPA seleccionados también pueden ser administrados a modelos animales, asi como también a sujetos como en ensayos clínicos para evaluar la efectividad in vivo en comparación a controles placebo. i . Trombosis Arterial Las formas de trombosis arterial son un resultado de una ruptura en la pared de vasos arteriales. Más a menudo la ruptura ocurre en paciente con enfermedad vascular, tal como ateroesclerosis . Las trombosis arteriales usualmente se forman en regiones de flujo sanguíneo interrumpido y en sitios de ruptura debido a una placa ateroesclerótica, la cual expone el subendotelio trombogénico a plaquetas y proteínas de coagulación, lo cual en su momento activa la cascada de coagulación. La ruptura de la placa también puede producir reducción adicional de los vasos sanguíneos debido a hemorragia en la placa. Las trombosis no oclusivas pueden llegar a estar incorporadas en la pared celular y pueden acelerar el crecimiento de placas ateroescleróticas . La formación de trombosis arteriales puede resultar en isquemia ya sea obstruyendo el flujo o por embolismo en la microcirculación distal. Anticoagulantes y fármacos que suprimen la función de las plaquetas y la cascada de coagulación pueden ser efectivos en la prevención y tratamiento de trombosis arterial. Tales clases de fármacos son efectivos en el tratamiento de trombosis arterial. La trombosis arterial puede conducir a condiciones de angina inestable e infarto al miocardio agudo. Se pueden usar polipéptidos uPA seleccionados, proporcionados en este documento que inhiben la coagulación en el tratamiento y/o prevención de trombosis arterial y condiciones, tal como angina inestable e infarto al miocardio agudo. ii . Trombosis Venosa y Tromboembolismo La trombosis venosa es una condición en la cual un coagulo sanguíneo se forma en una vena debido a desequilibrio en las señales para la formación del coagulo contra la disolución del coagulo, especialmente en casos de flujo sanguíneo que fluye a través del sistema venoso. Los resultados de la formación de trombos pueden incluir lesión a la vena y válvulas de la vena, aunque la pared celular típicamente permanece intacta. Loa coágulos pueden a menudo embolizar, o romper y viajar a través de la corriente sanguínea en donde se pueden alojar en áreas de órganos tal como pulmones (embolismo pulmonar), cerebro (apoplejía isquémica, ataque isquémico temporal) , corazón (ataque cardiaco/infarto al miocardio, angina inestable), piel (púrpura fulminante) y glándula adrenal. En algunos casos el bloqueo del flujo sanguíneo puede conducir a la muerte.

Los pacientes con una tendencia a tener tromboembolismo venoso recurrente se caracterizan por tener trombofilia . Factores de riesgo para desarrollar enfermedad tromboembólica incluyen trauma, inmovilización, enfermedades malignas, falla cardiaca, obesidad, niveles altos de estrógenos, parálisis de las piernas, infarto al miocardio, venas varicosas, cánceres, deshidratación, fumar, contraceptivos orales y embarazo. Estudios genéticos de familias con trombofilia han mostrado niveles altos de factores de coagulación hereditarios, que incluyen FVIII, FIX y FXI (Lavigne et al., J. Thromb. Haemost. 1:2134-2130 (2003) ) . La trombosis de vena profunda (DVT) , se refiere a la formación de coágulos de sangre venosa en las venas profundas de la pierna. Existen tres factores principales que contribuyen a que las DVT sean lesionadas en el revestimiento de la vena, tendencia incrementada para que la sangre coagule y reduce el flujo sanguíneo. Colectivamente, estos factores- son llamados tríada Virchow. Las venas llegan a ser lesionadas, durante la cirugía o trauma, o como un resultado de condición de enfermedad, tal como enfermedad de Buerger o DIC u otro coágulo. Otros factores que contribuyen al desarrollo de DVT son similares a aquellos de enfermedades tromboembólicas más generales como se discute anteriormente. El coágulo que se forma en DVT causa solamente inflamación menor, de este modo, permitiendo el rompimiento perdido en la corriente sanguínea más fácilmente. A menudo el trombo puede romperse como un resultado de contracción menor de los músculos de la pierna. Una vez que el trombo se vuelve un émbolo, puede llegar a alojarse en los vasos de los pulmones en donde puede causar infarto pulmonar. Los pacientes con altos niveles de FIX activo en su corriente sanguínea, están en riesgo incrementado de desarrollar trombosis de vena profunda (Weltermann et al. J. Thromb. Haemost. 1(1): 16-18 (2003)). Las enfermedades tromboembólicas pueden ser hereditarias, en donde la enfermedad es causada por anormalidades hereditarias en factores de coagulación, de este modo, conduciendo al desequilibrio en hemostasis. Varias deficiencias congénicas incluyen antitrombina III, proteína C, proteína S o plasminógeno . Otros factores incluyen resistencia a la proteína C activada (también llamada resistencia APC o efecto del Factor V de Leiden, en el cual, una mutación en el factor V lo hace resistente a la degradación por la proteína C) , mutación en protrombina, disfibrinogemia (mutaciones que confieren resistencia a fibrinólisis ) , y hiperhomocisteinemia . El desarrollo de enfermedades tromboembólicas en pacientes jóvenes es a menudo debido a los defectos congénicos descritos anteriormente y es llamado Trombofilia Juvenil.

Los tratamientos para enfermedad tromboembólica venosa y DVT típicamente involucran terapia anticoagulante, en la cual se administran dosis orales de heparina y warfarina. La heparina usualmente es infusionada en pacientes para controlar los eventos agudos, seguido por terapia anticoagulante oral de largo plazo con warfarina para controlar los episodios futuros. Otras terapias incluyen inhibidores de trombina directos, inhibidores de función de plaquetas, tales como aspirina y dextrano, y terapias para contrarrestar la estasis venosa, incluyendo dispositivos de comprensión neumáticos y almacenamientos de compresión. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente que inhiben la coagulación de la sangre se pueden usar en terapias anticoagulantes para enfermedad tromboembólica y/o DVT. En algunas modalidades, los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente que inhiben la coagulación de la sangre se pueden usar en terapias de prevención de enfermedad tromboembólica y/o DVT en pacientes que exhiben factores de riesgo para enfermedad tromboembólica y/o DVT. (a) Choque isquémico El choque isquémico ocurre cuando el flujo de sangre al cerebro es interrumpido, en donde la pérdida súbita de circulación a un área del cerebro resulta en una pérdida correspondiente de la función neurológica. En contraste con el choque hemorrágico, el cual se caracteriza por sangrado intracerebral , un choque isquémico usualmente es causado por trombosis o embolismo. Los choques isquémicos dan razón aproximadamente de 80% de todas las apoplejías. Además de las causas y factores de riesgo de desarrollar un tromboembolismo como se discutió anteriormente, los procesos que causan disección de las arterias cerebrales (por ejemplo, trauma, disección aórtica torácica, arteritis) pueden causar choque trombótico. Otras causas incluyen hipoperfusión distal a una arteria estenótica u ocluida o hipoperfusión de una región limítrofe vulnerable entre 2 territorios arteriales cerebrales. Los tratamientos para choque isquémico involucran terapia anticoagulante para la prevención y tratamiento de la condición. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente que inhiben la coagulación se pueden usar en el tratamiento y/o prevención o reducción de riesgo de choque isquémico. iii . Trastornos de Coagulación Adquiridos Los trastornos de coagulación adquiridos son el resultado de condiciones o enfermedades, tales como deficiencia de vitamina K, enfermedad del hígado, coagulación intravascular diseminada (DIC), o desarrollo de anticoagulantes de la circulación. Los defectos en la coagulación de la sangre son el resultado de deficiencias secundarias en factores de coagulación causadas por la condición o enfermedad. Por ejemplo, la producción de factores de coagulación del hígado es frecuentemente deteriorada cuando el hígado está en un estado enfermo. Conjuntamente con la síntesis disminuida de factores de coagulación, la fibrinólisis llega a ser incrementada y la trombocitopenia (deficiencia de plaquetas) es incrementada. La producción disminuida de factores de coagulación por el hígado también puede resultar de hepatitis fulminante o hígado graso agudo de embarazo. Tales condiciones promueven la coagulación intravascular la cual consume factores de coagulación disponibles. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente se pueden usar en el tratamiento de trastornos de coagulación adquiridos para aliviar las deficiencias en factores de coagulación de la sangre . (a) Coagulación Intravascular Diseminada (DIC) La coagulación intravascular diseminada (DIC) es un trastorno caracterizado por una activación de coagulación extendida y progresiva. En la DIC, existe una pérdida de equilibrio entre la activación de trombina de coagulación y degradación de plasmina de coágulos manchados. La deposición de fibrina vascular o microvascular como un resultado puede comprometer el suministro de sangre a varios órganos, los cuales pueden contribuir a la falla de órgano. En DIC sub-aguda o crónica, los pacientes presentan fenotipo hipercoagulatorio, con trombosis de formación de trombina en exceso, y se pueden presentar síntomas y signos de trombosis venosa. En contraste con la DIC aguda, la DIC sub-aguda o crónica es tratada por métodos para aliviar la hipertrombosis , incluyendo heparina, anti-trombina III y tratamiento con proteína C activada. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente y los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente se pueden usar en terapias para DIC sub-aguda o crónica. En una modalidad, los polipéptidos de DIC sub-aguda o crónica en la presente, y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos uPA seleccionados se pueden usar en combinación con otras terapias de anticoagulación. Los polipéptidos uPA seleccionados se pueden probar para efectividad terapéutica, por ejemplo, usando modelos animales. La progresión de síntomas de enfermedad y fenotipos se monitorea para valorar los efectos de los polipéptidos uPA seleccionados. Los polipéptidos uPA seleccionados también se pueden administrar a modelos animales así como sujetos tal como en ensayos clínicos para valorar la efectividad in vivo en comparación con controles de placebo. (b) Infección Bacteriana y Periodontitis La infección sistémica con microorganismos, tales como bacterias, está comúnmente asociada con DIC. La sobre-regulación de trayectorias de coagulación se puede mediar en parte por los componentes de membrana celular del microorganismo ( lipopolisacárido o endotoxina) o exotoxinas bacterianas (por ejemplo, toxina alfa estafilocócica) que causan respuestas inflamatorias que conducen a niveles elevados de citocinas. Las citocinas, a su vez, pueden influir en la inducción de coagulación. Los patógenos bacterianos, tales como Porphyrus gingivalís, son bien conocidos como agentes causantes de periodontitis en adultos. La bacteria Porphyrus gingivalís produce cisteina proteinasas especificas de arginina que funcionan como factores de virulencia (Grenier et al. J. Clin. icrobiol. 25:738-740 (1987), Smalley et al. Oral Microbiol. Immunol. 4:178-181 (1989), Marsh, et al. FEMS Microbiol. 59:181-185 (1989), y Potempa et al. J. Biol. Chem. 273:21648-21657 (1998). La Porphyrus gingivalís genera dos proteinasas que son referidas como gingipaínas de 50 kDa y 95 kDa (RgpB y HRgpA, respectivamente) . La proteasa se puede desdoblar proteolíticamente y por lo tanto activar los factores de coagulación. Durante la infección bacteriana la liberación de las gingipainas R en la corriente sanguínea puede conducir por consiguiente a la activación no controlada de la cascada de coagulación que conduce a la sobreproducción de trombina e incremento de la posibilidad de inducir coagulación intravascular diseminada (DIC) . El gran incremento de concentraciones de trombina puede contribuir además en la resorción de hueso alveolar por osteoclastos en sitios de periodontitis . Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente que inhiben la coagulación de la sangre, y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos uPA seleccionados se pueden usar en el tratamiento de periodontitis. Los polipéptidos uPA seleccionados se pueden probar para efectividad terapéutica para sensibilidad de las vías respiratorias en modelos de periodontitis. Tales modelos están disponibles en animales, tales como primates no humanos, perros, ratones, ratas, hámsters, y cobayos (Weinberg and Bral, J. of Periodontology 26(6), 335-340). Los polipéptidos uPA seleccionados también se pueden administrar a modelos animales así como sujetos tal como en ensayos clínicos para valorar la efectividad in vivo en comparación con controles de placebo. b. Otras condiciones asociadas a tPA Objetivo Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente también se pueden usar en el tratamiento de condiciones neurológicas para las cuales el tPA se ha implicado. El tPA se piensa que regula los procesos fisiológicos que incluyen la reconstrucción de tejido y plasticidad debido a la capacidad del tPA para hidrolizar las proteínas de matriz extracelulares y otros sustratos (Gravanis and Tsirska (2004) Glia 49:177-183). Los pacientes quienes han experimentado eventos tales como apoplejía o lesión (por ejemplo, debido a accidentes o cirugía) frecuentemente sufren de daño neurológico que pueden ser tratables con los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente. Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente pueden ser útiles para tratar sujetos que sufren de una variedad de enfermedades neurológicas y condiciones incluyendo, pero no limitado a, enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, panencefalitis esclerosante sub-aguda, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, distrofia muscular, y condiciones causadas por privación de nutrientes o toxinas (por ejemplo, neurotoxinas , fármacos de abuso). Adicionalmente, los polipéptidos uPA seleccionados pueden ser útiles para proporcionar mejoramiento cognitivo y/o para tratar declive cognitivo, por ejemplo, "falta de memoria senescente benigna", "deterioro de memoria asociado con la edad", "declive cognitivo asociado con la edad", etc. (Petersen et al., J Immunological Meth. 257:107-116 (2001)), y enfermedad de Alzheimer. Los polipéptidos uPA seleccionados se pueden probar usando cualquiera de una variedad de modelos animales de lesión al sistema nervioso. Los modelos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, modelos roedores, conejo, gato, perro, o primate para choque tromboembólico (Krueger and Busch, Invest. Radiol . 37:600-8 (2002); Gupta and Briyal, Indian J Physiol. Pharmacol. 48:379-94 (2004)), modelos de lesión de cordón espinal (Webb et al., Vet . Rec. 155:225-30 (2004)), etc. Los métodos y composiciones también se pueden probar en humanos. Una variedad de diferentes métodos, incluyendo pruebas estandarizadas y sistemas de registro, están disponibles para valorar la recuperación de la función motriz, sensorial, del comportamiento, y/o cognitiva en animales y humanos. Cualquier método adecuado se puede usar. En un ejemplo, el registro de la Asociación Americana de Lesión Espinal, el cual ha llegado a ser el instrumento principal para medir la recuperación de la función sensorial en humanos se puede usar. Véase, por ejemplo, artinez-Arizala, J Rehabil. Res. Dev. 40:35-9 (2003), Thomas and Noga, J Rehabil. Res. Dev. 40:25-33 (2003), Kesslak and Keirstead, J Spinal Cord ed. 26:323-8 (2003) para ejemplos de varios sistemas y métodos de registro. Los intervalos de dosis preferidos para el uso en humanos se pueden establecer probando los agentes en sistemas de cultivo de tejido y en modelos animales tomando en cuenta la eficacia de los agentes y también cualquier toxicidad observada . c. Métodos de Diagnóstico Los polipéptidos uPA seleccionados proporcionados en la presente se pueden usar en métodos de diagnóstico incluyendo, pero no limitado a, ensayos de diagnóstico para detectar fibrina y productos de degradación de fibrina que han alterado las actividades. Los ensayos son, por consiguiente, indicados en condiciones trombóticas. Otras aplicaciones de diagnóstico, incluyen kits que contienen anticuerpos contra los polipéptidos uPA seleccionados y están familiarizados con uno de experiencia ordinario en la técnica. 2. Métodos Ejemplares de Tratamiento para Polipéptidos de Proteasa Seleccionados que Desdoblan los Objetivos VEGF o VEGFR El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una citocina que se enlaza y señaliza a través de un receptor de superficie celular especifica (VEGFR) para regular la angiogénesis, el proceso en el cual nuevos vasos sanguíneos se generan de vasculatura existente. La angiogénesis patológica describe la vascularización incrementada asociada con la enfermedad e incluye eventos tales como el crecimiento de tumores sólidos (McMahon, (2000) Oncologist. 5 Suppl 1:3-10), degeneración macular y diabetes. En el cáncer, los tumores sólidos requieren un suministro de sangre cada vez incrementado para crecimiento y metástasis. La hipoxia o mutación oncogénica incrementa los niveles de VEGF y ARNm de VEGF-R en el tumor y células estromales circundantes que conducen a la extensión de vasos existentes y formación de una nueva red vascular. En la degeneración macular húmeda, se forma crecimiento anormal de vasos sanguíneos debajo de la macula. Estos vasos filtran sangre y fluido en la macula dañando las células fotorreceptoras . En la diabetes, una carencia de sangre a los ojos también puede conducir a ceguera. La estimulación de VEGF del crecimiento capilar alrededor del ojo conduce a vasos trastornados los cuales no funcionan apropiadamente . Se han identificado tres receptores de la familia tirosina cinasa de VEGF (VEGF-R-l/Flt-1 , VEGF-R-2/Flk-1/KDR, VEGF-R-3/Flt-4) . KDR (el homólogo de ratón es Flk-1) es un receptor de alta afinidad de VEGF con un Kd de 400-800 p (Waltenberger, (1994) J Biol Chem. 269 (43) : 26988-95) expresado exclusivamente en células endoteliales . La asociación de VEGF y KDR se ha identificado como una trayectoria de señalización clave especifica de célula endotelial requerida para angiogénesis patológica (Kim, (1993) Nature. 362 ( 6423 ) : 841-4 ; Millauer, (1994) Nature. 367 (6463) : 576-9; Yoshiji, (1999) Hepatology. 30(5):1179-86) . La dimerización del receptor en el enlace de ligando causa autofosforilación de los dominios citoplásmicos, y reclutamiento de socios de enlace que propagan la señalización en todo el citoplasma y en el núcleo para cambiar los programas de crecimiento celular. El tratamiento de tumores con un VEGF-R2 soluble inhibe el crecimiento de tumor (Lin, (1998) Cell Growth Differ. 9(1): 9-58), y la inhibición química de la fosforilación causa que las células de tumor lleguen a ser apoptóticas (Shaheen, (1999) Cáncer Res. 59 (21) : 5412-6) . La señalización por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus receptores es implicada en angiogénesis patológica y el desarrollo rápido de vasculatura de tumor en cáncer. Los fármacos que bloquean esta trayectoria de señalización previenen el crecimiento y mantenimiento de suministro de sangre de tumor, y conducen a la muerte sistemática del tumor. El reciente éxito del anticuerpo anti-VEGF AVASTIN™ en pacientes con cáncer de colon metastásico ha validado el VEGF como un objetivo para la terapia anti-angiogénica de cáncer. A pesar de estos resultados favorables, la progresión de tumor aún ha ocurrido a pesar del tratamiento anti-VEGF. Los mecanismos de anticuerpo que afectan la función de VEGF y cómo el anticuerpo impide el crecimiento de tumor son desconocidos. Los experimentos agénicos descendentes muestran que el bloqueo de la función de VEGF bloquea la angiogénesis . Por consiguiente, la inhibición de señalización angiogénica a través de VEGFR-2 representa un área terapéutica bajo-desarrollada ideal para el desarrollo de proteasas modificadas genéticamente con nueva determinación de objetivo . Las terapias dirigidas a los receptores VEGF y Flk-l/KDR específicamente han inhibido la angiogénesis patológica y muestran reducción de tamaño de tumor en múltiples modelos de ratón de tumores sólidos humanos y de ratón (Prewett, (1999) Cáncer Res. 59 (20) : 5209-18 ; Fong, (1999) Neoplasia 1(1):31-41. Erratum in: (1999) Neoplasia 1(2): 183) solas y en combinación con terapias citotóxicas (Klement, (2000) J Clin Invest. 105 ( 8 ) : R15-24 ) . Los estudios con inhibidores de molécula pequeña y anticuerpos validan la familia de receptor de VEGF como un potente objetivo anti-angiogénesis pero terapéuticos más efectivos aún se necesitan. El VEGFR está compuesto de una región extracelular de siete dominios tipo inmunoglobulina (Ig), una región de transmembrana, y dos dominios de tirosina cinasa citoplásmica . Se ha mostrado que los primeros tres dominios tipo Ig regulan el enlace de ligando, mientras que los dominios 4 hasta 7 tienen un papel en la inhibición de la dimerización correcta y señalización en la ausencia de ligando. Un objetivo de la proteólisis selectiva por proteasas modificadas genéticamente, tiene las siguientes características de objetivo prometedoras: una región lábil de aminoácidos accesible a proteólisis; alta identidad de secuencia entre las especies humana, rata y ratón; bajo-regulación de señalización en la escisión; y generación proteolítica de receptores solubles capaces de enlazar no productivamente el ligando. Diversas regiones de VEGF-R2 están disponibles para proteólisis específicas incluyendo la región troncal antes de la región de transmembrana y bucle no estructurado entre los dominios tipo Ig. En un ejemplo, las proteasas tipo serina proporcionadas en la presente se pueden modificar genéticamente para desdoblar receptores objetivo específico entre su transmembrana y dominios de enlace de factor de crecimiento o citocina (por ejemplo, VEGFR) . Las regiones troncales que funcionan para atar los receptores de proteína a la superficie de una célula o regiones de bucle son desconectadas de los dominios globulares en una cadena de polipéptido. a. Angiogénesis , Cáncer, y Otras Enfermedades o Condiciones Dependientes del Ciclo Celular Las proteasas seleccionadas ejemplares proporcionadas en la presente desdoblan un VEGF o VEGFR los cuales son responsables de la modulación de angiogénesis. Donde la molécula de superficie celular es una señalización de VEGFR en angiogénesis de tumor, la escisión previene la expansión de cáncer. Por ejemplo, la escisión de un dominio de superficie celular de una molécula de VEGFR puede inactivar su capacidad de transmitir señales extracelulares , específicamente las señales de proliferación celular. Sin angiogénesis para alimentar el tumor, las células de cáncer frecuentemente no pueden proliferar. En una modalidad, una proteasa seleccionada proporcionada en la presente es, por lo tanto, usada para tratar cáncer. Además, la escisión de VEGFR se puede usar para modular la angiogénesis en otras patologías, tales como generación macular, inflamación y diabetes. En una modalidad, la escisión de una proteína VEGF o VEGFR objetivo involucrada en la progresión de ciclo celular inactiva la capacidad de la proteína para permitir que el ciclo celular siga adelante. Sin la progresión del ciclo celular, las células de cáncer no pueden proliferar. Por lo tanto, las proteasas seleccionadas proporcionadas en la presente las cuales desdoblan VEGF o VEGFR se usan para tratar cáncer y otras patologías dependientes del ciclo celular . Las proteasas seleccionadas proporcionadas en la presente también pueden desdoblar proteínas solubles que son responsables de tumorigenicidad . La escisión de polipéptido de VEGF previene la señalización a través del receptor de VEGF y disminuye la angiogénesis, disminuyendo así la enfermedad en la cual la angiogénesis juega un papel, tal como cáncer, degeneración macular, inflamación y diabetes. Adicionalmente, la señalización de VEGF es responsable de la modulación del ciclo celular en ciertos tipos de células. Por lo tanto, las proteasas seleccionadas proporcionadas en la presente las cuales desdoblan VEGF son útiles en el tratamiento de cáncer y otras patologías dependientes del ciclo celular. b. Terapias de Combinación con Proteasas Seleccionadas Que Desdoblan VEGF o VEGFR En una modalidad, el tratamiento de una patología, tal como cáncer, involucra la administración a un sujeto en necesidad del mismo cantidades terapéuticamente efectivas de una proteasa que específicamente desdobla e inactiva la señalización del complejo VEGF/VEGFR-2 , tal como en combinación con al menos un agente anti-cancerígeno . La terapia antiangiogénica ha probado ser exitosa tanto contra cánceres sólidos como malignidades hematológicas . (Véase, por ejemplo, Ribatti et al. (2003) J Hematothe Stem CelTRes. 12(1), 11-22). Por lo tanto, las composiciones proporcionadas en la presente como terapia antiangiogénica pueden facilitar el tratamiento tanto de malignidades de tejido sólido como hematológicas. Las composiciones y métodos de tratamiento proporcionados en la presente se pueden administrar solas o en combinación con cualquier otro tratamiento anti-cancerígeno apropiado conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, las proteasas seleccionadas proporcionadas en la presente se pueden administrar en combinación con o en lugar de AVASTIN™ en cualquier terapia donde la administración de AVASTIN™ proporciona beneficio terapéutico. En una modalidad, el agente anti-cancerígeno es al menos un agente quimioterapéutico . En una modalidad relacionada, la administración de la proteasa está en combinación con al menos una radioterapia. La administración de la terapia de combinación atenuará la señal angiogénica y creará un grupo de receptor soluble que disminuye los niveles de VEGF libre. En una modalidad específica, una proteasa selectiva proporcionada en la presente tiene una especificidad in vitro que iguala una región critica del receptor, Flk/KDR troncal, sobre una región de seis aminoácidos. Los polipéptidos de proteasa seleccionados proporcionados en la presente se pueden administrar en una composición que contiene más de un agente terapéutico. Los agentes terapéuticos pueden ser los mismos o diferentes, y pueden ser, por ejemplo, radionúclidos terapéuticos, fármacos, hormonas, antagonistas de hormona, antagonistas de receptor, enzimas o pro-enzimas activadas por otro agente, autócrinas, citocinas o cualquier agente anticancerígeno adecuado conocido por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad, el agente anti-cancerígeno coadministrado con el polipéptido de proteasa seleccionado es AVASTIN™. Otros agentes terapéuticos útiles en los métodos proporcionados en la presente incluyen toxinas, anti-ADN, anti-ARN, oligonucleótidos radioetiquetados , tales como agentes citotóxicos o antimicrobianos oligonucleótidos anti-sentido, anti-proteína y anti-cromatina . Otros agentes terapéuticos son conocidos por aquellos expertos en la técnica, y el uso de tales otros agentes terapéuticos de conformidad con el método proporcionado en la presente es específicamente contemplado. El agente anti-tumor puede ser uno de numerosos agentes de quimioterapia tales como un agente de alquilación, un antimetabolito, un agente hormonal, un antibiótico, un anticuerpo, un anti-cancerigeno biológico, Gleevec, colquicina, un vinca alcaloide, L-asparaginasa, procarbazina, hidroxiurea, mitotano, nitrosoureas o una imidazol carboxamida. Los agentes adecuados son aquellos agentes que promueven la despolarización de tubulina o prohiben la proliferación de célula de tumor. Los agentes quimioterapéuticos contemplados incluyen, pero no se limitan a, agentes anti-cancerigenos listados en el Orange Book of Approved Drug Products With Therapeutic Equivalence Evaluations, como se compila por la Food and Drug Administration y el U.S. Department of Health and Human Services. Además de los agentes de quimioterapia anteriores, las proteasas tipo serina proteasa proporcionadas en la presente también se pueden administrar conjuntamente con tratamiento de terapia de radiación. Se contemplan los tratamientos adicionales conocidos en la técnica . El agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico . Los agentes quimioterapéuticos son conocidos en la técnica e incluyen al menos los taxanos, mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, vinca alcaloides, antibióticos, enzimas, complejos de coordinación de platino, urea sustituida, derivados de metil hidrazina, supresores adrenocorticales, o antagonistas. Más específicamente, los agentes quimioterapéuticos pueden ser uno o más agentes elegidos del grupo no limitante de esteroides, progestinas, estrógenos, antiestrógenos, o andrógenos . Aún más específicamente, los agentes de quimioterapia pueden ser azarribina, bleomicina, briostatina-1 , busulfan, carmustina, clorambucil, cisplatina, CPT-11, ciclofosfamida , citarrabina, dacarbazina, dactinomicina , daunorrubicina, dexametasona, dietilestilbestrol , doxorrubicina , etinil estradiol, etopósido, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, L-asparaginasa, leucovorin, lomustina, meclorretamina, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, melfalan, mercaptourina, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitotano, butirato de fenilo, prednisona, procarbazina, simustin estreptozocina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinblastina, o vincristina. El uso de cualquiera de las combinaciones de agentes de quimioterapia también se contempla. La administración del agente quimioterapéutico puede ser antes, durante o después de la administración del polipéptido muteína tipo serina proteasa . Otros agentes terapéuticos adecuados para el uso en combinación o para co-administración con los polipéptidos de proteasa seleccionados proporcionados en la presente se seleccionan del grupo que consiste de radioisótopo, boro adicional, inmunomodulador, toxina, agente fotoactivo o tinte, fármaco quimioterapéutico contra cáncer, fármaco antiviral, fármaco antifúngico, fármaco antibacteriano, fármaco antiprotozoario y agente quimiosensibilizador (Véase, U.S. Pat . Nos. 4,925,648 y 4,932,412). Los agentes quimioterapéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. ( ack Publishing Co . 1995), y en Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OT THERAPEUTICS (Goodman et al., Eds . Macmillan Publishing Co . , New York, ediciones 1980 y 2001). Otros agentes quimioterapéuticos adecuados, tales como fármacos experimentales, son conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. Además un radioisótopo terapéutico adecuado se selecciona del grupo que consiste de emisores ax, emisores ß, emisores ?, emisores de electrones Auger, agentes de captura de neutrones, agentes que emiten partículas a y radioisótopos que se desintegran por captura de electrones. Preferiblemente, el radioisótopo se selecciona del grupo que consiste de 225Ac, 198Au, 32P, 131I, 131I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 10B, y 211At. Donde más de un agente terapéutico se usa en combinación con las proteasas seleccionadas proporcionadas en la presente, pueden ser de la misma clase o tipo o pueden ser de diferentes clases o tipos. Por ejemplo, los agentes terapéuticos pueden comprender diferentes radionúclidos, o un fármaco y un radionúclido . En otra modalidad, diferentes isótopos que son efectivos durante diferentes distancias como un resultado de sus emisiones de energía individuales se usan como primer y segundo agentes terapéuticos en combinación con las proteasas proporcionadas en la presente. Tales agentes se pueden usar para lograr el tratamiento más efectivo de tumores, y son útiles en pacientes que presentan múltiples tumores de diferentes tamaños, como en circunstancias clínicas normales. Pocos de los isótopos disponibles son útiles para tratar los depósitos de tumor muy pequeños y células únicas. En estas situaciones, un fármaco o toxina puede ser un agente terapéutico más útil para la co-administración con una proteasa proporcionada en la presente. Por consiguiente, en algunas modalidades, los isótopos se usan en combinación con especies no isotópicas tales como fármacos, toxinas, y agentes de captura de neutrones y se co-administran con una proteasa proporcionada en la presente. Muchos fármacos y toxinas son conocidos los cuales tienen efectos citotóxicos en células, y se pueden usar en combinación con las proteasas proporcionadas en la presente. Se encuentran en compendios de fármacos y toxinas, tal como el índice Merck, Goodman y Gilman, y similares, y en las referencias citadas anteriormente. Los fármacos que interfieren con la síntesis de proteína intracelular también se pueden usar en combinación con una proteasa en los métodos terapéuticos en la presente; tales fármacos son conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen puromicina, cicloheximida, y ribonucleasa . Los métodos terapéuticos proporcionados en la presente se pueden usar para terapia de cáncer. Es bien conocido que los radioisótopos, fármacos, y toxinas se pueden conjugar a anticuerpos o fragmentos de anticuerpo los cuales enlazan específicamente a marcadores los cuales son producidos o asociados con células de cáncer, y que tales conjugados de anticuerpo se pueden usar para dirigir los radioisótopos, fármacos o toxinas a sitios de tumor para mejorar su eficacia terapéutica y minimizar los efectos secundarios. Los ejemplos de estos agentes y métodos se revisan en Wawrzynczak and Thorpe (en Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cáncer, L. M. Franks and N. M. Teich, eds, Chapter 18, pp. 378-410, Oxford University Press. Oxford, 1986), en Immunoconj ugates : Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cáncer (C. W. Vogel, ed., 3-300, Oxford University Press, N. Y., 1987), en Dillman, R. O. (CRC Critical Revie s in Oncology/Hematology 1:357, CRC Press, Inc., 1984), en Pastan et al. (Cell 47:641, 1986) en Vitetta et al. (Science 238:1098-1104, 1987) y en Brady et al. (Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys . 13:1535-1544, 1987). Otros ejemplos del uso de inmunoconjugados para cáncer y otras formas de terapia se han descrito, inter alia, en las U.S. Pat. Nos. 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,460,459, 4,460,561 4,624,846, 4,818,709, 4,046,722, 4,671,958, 4,046,784, 5,332,567, 5,443,953, 5,541,297, 5,601,825, 5,635,603, 5,637,288, 5,677,427, 5,686,578, 5,698,178, 5,789,554, 5,922,302, 6,187,287, y 6, 319, 500. Adicionalmente , los métodos de tratamiento proporcionados en la presente incluyen aquellos en los cuales una proteasa seleccionada en la presente se usa en combinación con otros compuestos o técnicas para prevenir, mitigar o invertir los efectos secundarios de ciertos agentes citotóxicos. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen, por ejemplo, la administración de IL-1 conjuntamente con un anticuerpo para rápida evacuación, como se describe en, por ejemplo, U.S. Pat. No. 4,624,846.

Tal administración se puede realizar de 3 a 72 horas después de la administración de un tratamiento terapéutico primario con una muteina granzima B o muteina MT-SP1 en combinación con un agente anti-cancerigeno (por ejemplo con un radioisótopo, fármaco o toxina como el componente citotóxico) . Esto se puede usar para mejorar la evacuación del conjugado, fármaco o toxina de la circulación y para mitigar o invertir la toxicidad mieloide y otra hematopoyética causada por el agente terapéutico. En otro ejemplo, y como se señaló anteriormente, la terapia de cáncer puede involucrar una combinación de más de un agente tumoricidal, por ejemplo, un fármaco y un radioisótopo, o un radioisótopo y un agente Boro-10 para terapia activada por neutrones, o un fármaco y un modificador de respuesta biológica, o un conjugado de molécula de fusión y un modificador de respuesta biológica. La citocina se puede integrar en tal régimen terapéutico para maximizar la eficacia de cada componente del mismo. De manera similar, ciertos anticuerpos antileucémicos y antilinfoma conjugados con radioisótopos que son emisores ß o a pueden inducir los efectos secundarios mieloides y otros hematopoyéticos cuando estos agentes no solamente son dirigidos a las células de tumor. Esto se observa particularmente cuando las células de tumor están en la circulación y en los órganos formadores de sangre. La administración concomitante y/o subsecuente de al menos una citocina hematopoyética (por ejemplo, factores de crecimiento, tales como factores estimulantes . de colonias, tales como G-CSF y G -CSF) es preferida para reducir o aliviar los efectos secundarios hematopoyéticos, mientras aumentan los efectos anti-cancerigenos . Es bien conocido en la técnica que varios métodos de terapia de radionúclidos se pueden usar para el tratamiento de cáncer y otras condiciones patológicas, como se describe, por ejemplo, en Harbert, "Nuclear Medicine Therapy", New York, Thieme Medical Publishers, 1087, pp. 1-340. Un médico clínico experimentado en estos procedimientos fácilmente será capaz de adaptar la terapia de adyuvante citocina descrita en la presente a tales procedimientos para mitigar cualquiera de los efectos secundarios hematopoyéticos de los mismos. De manera similar, la terapia con fármacos citotóxicos, coadministrada con una muteína proteasa, se puede usar, por ejemplo, para tratamiento de cáncer, ' enfermedades infecciosas o autoinmunes, y para terapia de rechazo de órgano. Tal tratamiento es gobernado por principios análogos a la terapia de radioisótopo con isótopos o anticuerpos radioetiquetados . Por consiguiente, el médico clínico de experiencia ordinaria será capaz de adaptar la descripción de uso de citocina para mitigar la supresión estrecha y otros efectos secundarios hematopoyéticos por administración de la citocina antes, durante y/o después de la terapia anti-cáncer primaria. 3. Métodos Ejemplares de Tratamiento para Polipéptidos MT-SP1 Seleccionados Que Desdoblan los Objetivos de Proteina de Complemento Los polipéptidos de proteasa y moléculas de ácido nucleico proporcionados en la presente se pueden usar para el tratamiento de cualquier condición para la cual la activación de la trayectoria de complemento está implicada, particularmente condiciones inflamatorias que incluyen condiciones inflamatorias agudas, tal como choque séptico, y condiciones inflamatorias crónicas, tal como Artritis Reumatoide (RA) . Las condiciones agudas e inflamatorias se pueden manifestar como una enfermedad inmunomediada tal como, por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria o lesión de tejido causada por inflamación mediada por complejo inmunitario. Una condición inflamatoria mediada por complemento también se puede manifestar como una enfermedad neurodegenerativa o cardiovascular que tiene componentes inflamatorios. Esta sección proporciona usos ejemplares de, y métodos de administración para, proteasas. Estas terapias son ejemplares y no limitan las aplicaciones de proteasas.

Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, métodos de tratamiento de condiciones fisiológicas y médicas descritas y listadas posteriormente. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, métodos de tratamiento de sepsis, artritis reumatoide (RA) , glomerulonefritis membranoproliferativas (MPGN) , lupus eritematoso, Esclerosis Múltiples (MS) , miastenia grave (MG) , asma, enfermedad inflamatoria de intestino, síndrome de afección respiratoria, lesión inflamatoria de tejido aguda mediada por complejo inmunitario (IC), falla de órganos múltiples, Enfermedad de Alzheimer (AD) , lesiones de reperfusión por isquemia causadas por eventos o tratamientos tal como infarto al miocardio (MI), apoplejía, desvío cardiopulmonar (CPB) o injerto de desvío de arteria coronaria, angioplastia, o hemodiálisis , o síndrome de Guillan Barre. El tratamiento de enfermedades y condiciones con proteasas se puede efectuar por cualquier ruta de administración adecuada usando formulaciones adecuadas como se describe en la presente incluyendo, pero no se limita a, inyección subcutánea, administración oral y transdérmica . Si es necesario, un protocolo de tratamiento y duración y dosificación particular se puede determinar o extrapolar empíricamente. Por ejemplo, las dosis ejemplares de polipéptidos de proteasa recombinantes y nativos se pueden usar como un punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas. Las proteasas modificadas que tienen más especificidad y/o selectividad comparadas con una proteasa tipo silvestre o de andamiaje pueden ser efectivas a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas. Los niveles de dosificación se pueden determinar con base en una variedad de factores, tal como peso corporal del individuo, salud general, edad, la actividad del compuesto especifico empleado, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármaco, la severidad y curso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el juicio del médico tratante. La cantidad del ingrediente activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única varia dependiendo del hospedero tratado y el modo de administración particular . En el mejoramiento de una condición del paciente, se puede administrar una dosis de mantenimiento de un compuesto o composiciones, si es necesario, y la dosificación, la forma de dosificación, o frecuencia de administración, o una combinación de los mismos se puede modificar. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente en una base a largo plazo en cualquier recurrencia de síntomas de enfermedad. a . Enfermedades Inflamatorias Inmunomediadas Las proteasas y proteasas modificadas seleccionadas en el método descrito en la presente, incluyendo pero no limitado a proteasas MT-SP1 variantes proporcionadas en la presente, se pueden usar para tratar enfermedades inflamatorias. Las enfermedades inflamatorias que se pueden tratar con proteasas incluyen enfermedades inflamatorias agudas y crónicas. Las enfermedades inflamatorias ejemplares incluyen enfermedades del sistema nervioso central (CNS) , enfermedades autoinmunes, condiciones de hiper-sensibilidad de vías respiratorias tales como en asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, y lesión de tejido inflamatorio aguda mediada por complejo inmunitario (IC). La encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) puede servir como un modelo para esclerosis múltiple ( S) (Piddlesden et al., (1994) J Immunol 152:5477). La EAE se puede inducir en un número de especies genéticamente susceptibles por inmunización con mielina y componentes mielina tales como proteina básica mielina, proteina proteolipida y glicoproteina de mielina oligodendrocito (MOG) . Por ejemplo, la EAE inducida por OG recapitula características esenciales de MS humana incluyendo la enfermedad clínica recurrente crónica que atraviesa la tríada patofistologica de inflamación, gliosis reactiva, y la formación de grandes placas desmielinadas confluentes. Las proteasas y proteasas modificadas se pueden valorar en modelos animales de EAE. Las proteasas se administran, tal como por inyección intraperitoneal diaria, y el transcurso y progresión de síntomas se monitorea comparado con animales de control. Los niveles de componentes de complemento inflamatorio que pueden exacerbar la enfermedad también se pueden medir sometiendo a ensayo la actividad de complemento en suero en un ensayo hemolítico y sometiendo a ensayo la deposición de componentes de complemento, tal como por ejemplo Cl, C3 y C9. La activación de complemento modula la inflamación en enfermedades tal como artritis reumatoide (RA) (Wang et al. (1995) PNAS 92:8955). Las proteasas y proteasas modificadas, incluyendo polipéptidos MT-SPl variantes proporcionados en la presente, se pueden usar para tratar RA. Por ejemplo, las proteasas se pueden inyectar localmente o sistémicamente . Las proteasas se pueden dosificar diariamente o semanalmente . Las proteasas PEGiladas se pueden usar para reducir la inmunogenicidad. En un ejemplo, la artritis inducida por colágeno tipo II (CIA) se puede inducir en ratones como un modelo de enfermedad inflamatoria de articulaciones autoinmunitaria que es histológicamente similar a la RA caracterizada por sinovitis inflamatoria, formación de pannus, y erosión de cartílago y hueso. Para inducir la CIA, colágeno tipo II bovino (B-CII) en la presencia de adyuvante de Freund completo se puede inyectar intradérmicamente en la base de la cola. Después de 21 días, los ratones se pueden volver a inmunizar usando el protocolo idéntico. Para examinar los efectos de una proteasa o proteasa modificada, incluyendo polipéptidos MT-SP1, 3 semanas después de estimulación inicial con B-CII, una proteasa o control se puede administrar intraperitonealmente dos veces semanalmente por 3 semanas. Los ratones se pueden sacrificar 7 semanas después de la inmunización inicial para análisis histológico. Para valorar el efecto terapéutico de una proteasa en enfermedad establecida, una proteasa se puede administrar oralmente por un total de 10 días después del comienzo de artritis clínica en uno o más limbos. El grado de hinchamiento en las articulaciones inicialmente afectadas se puede monitorear midiendo el espesor de pata usando calibradores. En ambos modelos, el suero se puede extraer de los ratones para ensayos hemolíticos y medición de marcadores de complemento de activación tales como, por ejemplo, C5a y C5b-9. En otro ejemplo, los modelos primates están disponibles para tratamientos de RA. La respuesta de articulaciones débiles e hinchadas se puede monitorear en sujetos tratados con polipéptidos de proteasa y controles para valorar el tratamiento con proteasa.

Las proteasas o proteasas modificadas, incluyendo pero no limitado a polipéptidos MT-SP1 variantes proporcionados en la presente, se pueden usar para tratar lesión inflamatoria de tejido aguda mediada por complejos inmunitarios (IC). La lesión mediada por IC es causada por una respuesta inflamatoria local contra la deposición de IC en un tejido. La respuesta inflamatoria resultante es caracterizada por edema, neutrófilos, hemorragia, y finalmente necrosis de tejido. La lesión de tejido mediada por IC se puede estudiar en una reacción Arthus (RPA) in vivo. Brevemente, en la reacción RPA, un exceso de anticuerpo (tal como, por ejemplo, albúmina de huevo antipollo igG de conejo) se inyecta en la piel de animales, tal como por ejemplo ratas o cobayos, que previamente se han infusionado intravenosamente con el antigeno correspondiente (es decir, albúmina de huevo de pollo) (Szalai et al., (2000) J Immunol 164:463). Inmediatamente antes del inicio en una reacción RPA, una proteasa, o un control de bolo, se puede administrar al mismo tiempo como el antigeno correspondiente por una inyección intravenosa vía la vena femoral derecha. Alternativamente, una proteasa se puede administrar durante la hora inicial de la reacción RPA, comenzando inmediatamente después de la inyección del antigeno y casi antes de la inyección dérmica del anticuerpo. Los efectos de una proteasa en la generación de lesión de tejido mediada por IC dependiente de complemento se pueden valorar a varios tiempos después del inicio de RPA colectando sangre para determinar la actividad hemolitica en suero, y recolectando el área infectada de la piel para cuantificación de tamaño de lesión. Las proteasas terapéuticas, tales como aquellas descritas en la presente incluyendo polipéptidos MT-SP1 variantes proporcionados en la presente, se pueden usar para tratar sepsis y sepsis severa que puede resultar en apoplejía letal. Un modelo de apoplejía letal mediada por complemento se puede usar para probar los efectos de una proteasa como un agente terapéutico. En tal ejemplo, las ratas se pueden cebar con una micro-cantidad de lipopolisacárido (LPS) , seguido por la administración de un anticuerpo monoclonal contra un inhibidor de membrana de complemento (anti-Crry) (Mizuno M et al., (2002) Int Arch Allergy Immunol 127:55). Una proteasa o control se puede administrar en cualquier tiempo durante el transcurso de iniciación de apoplejía letal tal como antes de cebado con LPS, después de cebado con LPS, o después de la administración anti-Crry y el rescate de ratas de apoplejía letal se puede valorar. b . Enfermedad neurodegenerativa La activación de complemento exacerba la progresión de enfermedad de Alzheimer (AD) y contribuye a la pérdida de neurita en cerebros con AD. Las proteasas y proteasas modificadas descritas en la presente, incluyendo pero no limitado a polipéptidos MT-SP1 variantes proporcionados en la presente, se pueden usar para tratar AD. Los modelos de ratón que imitan algunas de las características neuropatologicas y del comportamiento de AD se pueden usar para valorar los efectos terapéuticos de proteasas. Los ejemplos de modelos de ratón transgénicos incluyen introducir la proteína precursora que produce enfermedad (APP) o la proteína presenilina 1 (PS1) con mutaciones que producen enfermedad en ratones bajo el control de un promotor agresivo. Estos ratones desarrollan características de AD incluyendo incrementos en las placas beta-amiloides y neuritas distróficas. Los ratones transgénicos dobles para proteínas mutantes APP y PS1 desarrollan números grandes de placas beta-amiloides fibrilares y muestran factores de complemento y glía activados asociados con la placa. Las proteasas se pueden administrar, tal como por inyecciones intravenosas o intraperitoneales diarias, y el transcurso y progresión de síntomas se monitorea comparado con los animales de control. c . Enfermedad cardiovascular Las proteasas y proteasas modificadas descritas en la presente, incluyendo pero no limitado a proteasas MT-SP1 variantes proporcionadas en la presente, se pueden usar para tratar enfermedad cardiovascular. Las proteasas se pueden usar en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares incluyendo lesión por reperfusión isquémica resultante de apoplejía, infarto al miocardio, desvío cardiopulmonar, injerto de desvío de arteria coronaria, angioplastia, o hemodiálisis . Las proteasas también se pueden usar en el tratamiento de respuesta inflamatoria asociada con desvío cardiopulmonar que puede contribuir a la lesión de tejido. Generalmente, una proteasa se puede administrar previo a, concomitantemente con, o subsiguiente a un tratamiento o evento que induce una lesión por reperfusión isquémica mediada por complemento. En un ejemplo, una proteasa se puede administrar a un sujeto previo al tratamiento de un sujeto por un evento que induce la lesión isquémica mediada por complemento, tal como por ejemplo injerto de desvío de arteria coronaria de angioplastia. Los efectos de una proteasa en el tratamiento de lesión por reperfusión isquémica se pueden valorar en modelos animales de la lesión. En tal modelo, la isquemia miocardial se induce en conejos que han tenido una incisión hecha en su pericardio anterior colocando una sutura de seda 3-0 alrededor de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) 5-8 irim de su origen y ajustando la ligadura de modo que el recipiente llega a ser completamente ocluido (Buerke et al., (2001) J Immunol 167:5375). Una proteasa, tal como por ejemplo un polipéptido MT-SPl variante proporcionado en la presente, o un vehículo de control tal como solución salina, se puede dar intravenosamente en dosis incrementadas como un bolo 55 minutos después de la oclusión coronaria (es decir, 5 minutos antes de la reperfusión) . Cinco minutos más tarde (es decir, después de un total de 60 minutos de isquemia) la ligadura de LAD se puede desatar y el miocardio isquémico se puede reperfusionar por 3 horas. Al final del período de reperfusión, la ligadura alrededor de la LAD es apretada. Los efectos de una proteasa en la lesión isquémica se pueden analizar valorando los efectos en la necrosis miocardial, niveles de creatina cinasa en plasma, y marcadores de activación de neutrófilos tal como por ejemplo actividad de mieloperoxidasa y liberación de radical superóxido. En otro modelo de lesión miocardial mediada por complemento sostenida en la perfusión de corazones de ratón aislados con amortiguador de Krebs-Henseleit que contiene 6& de plasma humano, el tratamiento con proteasas o proteasas modificadas se puede usar para limitar el daño de tejido al corazón. En tal ejemplo, el amortiguador usado para perfusionar los corazones se puede suplementar con dosis variadas de proteasas, tales como pero no limitado a proteasas variantes incluyendo polipéptidos MT-SPl proporcionados en la presente. Los corazones perfusionados se pueden someter a ensayo para deposición de C3 y C5b-9 humana, presión de perfusión de arteria coronaria, presión diastólica final, y ritmo cardiaco. Las proteasas y proteasas modificadas, tales como por ejemplo polipéptidos MT-SPl variantes proporcionados en la presente, se pueden usar como terapéuticos previo a, o después del injerto de desvio de arteria coronaria o Desvio Cardiopulmonar (CPB) para inhibir la respuesta inmunitaria inflamatoria que frecuentemente sigue del desvio y que puede contribuir a la lesión de tejido. Una recirculación in vitro de sangre completa en un circuito de desvio extracorpóreo se puede usar para estimular los cambios de leucocitos y plaquetas y activación de complemento inducida por CPB (Rinder et al. (1995) J Clin. Invest. 96:1564). En tal modelo, la adición de una proteasa o proteasa modificada o amortiguador de control, en dosis variadas, se puede agregar a un paquete de transferencia que ya contiene sangre de un donador saludable y heparina porcina, casi previo a la adición de la sangre al circuito extracorpóreo.

Las muestras de sangre se pueden extraer a 5, 15, 30, 45, 60, 75, y 90 minutos después de la recirculación y se someten a ensayo para estudios de complemento tales como, por ejemplo, ensayos hemoliticos y/o ensayos de activación de complemento para medir C5a, C3a, y/o sC5b-9. Una muestra de pre-tratamiento de sangre extraída antes de su adición al circuito extracorporeo se puede usar como un control. La citometría de flujo de las muestras de sangre se puede realizar para determinar los niveles de moléculas de adhesión en poblaciones de leucocitos circulantes (es decir, neutrófilos) en la sangre tal como, por ejemplo niveles de CDllb y P-selectina.

K . EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para propósitos ilustrativos solamente y no se proponen para limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Inhibidores de PAI-1 Mu antes A. Expresión y purificación de inhibidores de PAI-1 m tantes El plásmido recombinante pPAIST7HS que porta el ADNc de PAI-1 humana (que codifica la PAI-1 madura que contiene un Met N-terminal como se describe en la SEC ID NO: 396), se utilizó como modelo para introducir modificaciones en la secuencia de aminoácido del bucle central reactivo de PAI-1. El plásmido pPAISTHS es un derivado del plásmido pPAIST7 que carece del sitio HindIII en el par de nucleótido 1 y el sitio Salí en el par de nucleótido 2106. El plásmido pPAIST7 se generó como se describe (Franke et al. (1990) Biochimic et Biophysica Acta 1037: 16-23). Brevemente, el clon de ADNc PAI-1 pPAI-HRB se desdobló con endonucleasas de restricción ApaLI y PflMI, y el fragmento 1127 bp de PAI-1 que contiene 2 bp del codón para el residuo 1 de PAI-1 y la secuencia codificante completa para residuos 2-376 de la proteina de 379 residuos se purificó por electroforesis de gel. Los enlazantes sintéticos se construyeron para reconstruir ambos extremos de la secuencia codificante de ADNc PAI-1 y para introducir un codón de iniciación de síntesis de proteína ATG inmediatamente antes del triplete que codifica el primer residuo de PAI-1 madura que genera una PAI-1 madura que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 396. Además, para facilitar la inserción de la región codificante de ADNc en plásmido pBR322, los enlazantes se diseñaron para generar los sitios de endonucleasa de restricción EcoRI y HindIII en los términos 5' y 3' , respectivamente, del fragmento de ADNc PAI-1. Los enlazantes sintéticos son como sigue: N-término, 5' AATTCTATGG-3 ' (SEC ID NO: 392) y 5 ' -TGCACCATAG-3 ' (SEC ID NO: 393); C-término, 5 ' -ATGGAACCCTGAA-3 ' (SEC ID NO: 394) y 51 -AGCTTCAGGGTTCCATCAC-3 ' (SEC ID NO:395). Los enlazantes se trataron con polinucleótido cinasa antes de uso. Los enlazantes sintéticos (10 bp en el extremo 5' y 13 bp en el extremo 3' ) luego se ligaron con el fragmento de ADN ApaLI-PflMI, digirieron con EcoRI y HindIII y el fragmento EcoRI-HindlII de 1146 bp se aisló por electroforesis de gel y se clonó en PBR322 desdoblado con EcoRI y HindIII (SEC ID NO: 377) . Para iniciar la construcción del plásmido de expresión pPAIST-7, el subclon en el vector PBR322 fue desdoblado con EcoRI y el plásmido lineal fue desfosforilado usando fosfatasa alcalina bacteriana. Usando un fragmento de ADN EcoRI de 360 bp de pC5A-48 que contiene el promotor trp y sitio de enlace de ribosoma el pPAIST-7 se generó después de la ligación estándar. Para generar el vector de expresión procariota pPAIST7HS (Shubeita et al. (1990) J Biol. Chem. , 265: 18379-18385), el pPAIST7 se digirió parcialmente con HindIII para linealizar el plásmido, de extremo romo con el fragmento Klenow de ADN polimerasa I de E. coli y se ligó para eliminar el sitio HindIII cadena arriba. La supresión de las secuencias en pPAIST7 cadena abajo de las secuencias codificantes PAI-1 entre los sitios HindIII y Salí y eliminación del sitio Salí se realizó por digestión de Salí parcial secuencial, digestión HindIII completa, de extremo romo con el fragmento Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, y ligación. La reacción de mutagénesis se realizó usando el kit de mutagénesis de sitios múltiples (Stratagene) siguiendo las condiciones especificas por el proveedor. Se hicieron las mutagénesis de aminoácidos en PAI-1 tipo silvestre en las posiciones P4-P1' en el bucle central reactivo correspondiente a aminoácidos VSARM (SEC ID NO:378). Se hizo un mutante PAI-1 (???-1/RRAR) que contiene el reemplazo de la secuencia de aminoácido tipo silvestre VSARM con secuencias RRARM (SEC ID NO: 379) en el bucle central reactivo PAI-1 de las posiciones P4 a Pl' . La secuencia del cebador mutagénico RRARM fue: 5' -CCACAGCTGTCATAAGGAGGGCCAGAATGGCCCCCGAGGAGATC-3 ' (SEC ID NO:380). Se hizo un segundo mutante PAI-1 (PAI-1/69) que contiene el reemplazo de la secuencia aminoácido tipo silvestre VSARM con secuencias PFGRS (SEC ID NO: 389) en el bucle central reactivo PAI-1 de las posiciones P4 a Pl' . La secuencia para el cebador mutagénico PFGRS fue: 5 ' CCACAGCTGTCATACCCTTCGGCAGAAGCGCCCCCGAGGAGATC-3 ' (SEC ID NO: 390) . Después de la mutagénesis, el ADN aislado de los transformantes se secuenció completamente para confirmar la presencia de mutaciones deseadas y la ausencia de cualquiera de las mutaciones adicionales. Los mutantes ???-1/RRAR y PAI-1/69 se expresaron como proteínas de fusión utilizando residuos poli histidina N-terminales presentes en el vector pPAIST7HS. La expresión y purificación de PAI-ls mutante (es decir, ???-1/RRAR y PAI-1/69) se basaron en métodos como se describe en Ke et al. (J. Biol. Chem., 272: 16603-16609 (1997)). La expresión de variantes tipo silvestre y mutadas de PAI-1 se realizó transformando 0.1 µ? de ADN de vector pPAIST7HS que codifica la PAI-1 mutante en la cepa E. coli BL21 [ DE3 ] pLys3 (Novagen) , la cual sintetiza la ARN polimerasa T7 en la presencia de isopropil-l-tio-p-D-galactopiranosido . Los cultivos bacterianos crecieron a 37 °C con sacudimiento vigoroso a una absorbancia A595 de 1.1-1.3, y se agregó isopropil-l-tio^-D-galactopiranosido a una concentración final de 1 mM para inducir la síntesis de ARN polimerasa T7 y la producción de proteínas PAI-1. Los cultivos crecieron por 1-2 h adicionales a 37 °C y luego se desplazaron a 30°C por 2-6 h. Las células se formaron en pelotillas por centrifugación a 8000 x g por 20 min a 4°C y se resuspendieron en 40 mi de amortiguador de inicio frío (acetato de sodio 20 mM, NaCl 200 mM, y 0.01% Tween 20, pH 5.6) . La suspensión celular se interrumpió en una celda de presión French (Aminco) , y la basura celular se removió por ultracentrifugación por 25 min a 32,000 x g.

La purificación de PAI-1 mutante activa soluble se realizó inyectando el lisado de E. coli que contiene forma soluble de ???-1/RRAR o PAI-1/69 sobre una columna XK-26 (Pharmacia Biotech Inc) empacada con CM-50 Sephadex (Pharmacia, véase, por ejemplo, Sancho et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224, 125-134) . La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de amortiguador de inicio (acetato de sodio 20 mM, NaCl 20 mM, y 0.01% Tween 20, pH 5.6), y las proteínas PAI-1 se eluyeron usando un gradiente lineal 0.2-1.8 M de NaCl en el mismo amortiguador. Las fracciones de pico se recolectaron, agruparon, y concentraron usando un concentrador centriplus 30 (Amicon) . Las fracciones concentradas se utilizaron para medición de actividad.

B. Mediciones de Actividad de PAI-1 1. Titulación de Sitio Activo Contra Tripsina Estándar La concentración activa de ???-1/RRAR y PAI-1/69 se determinó por titulación de sitio activo contra tripsina estándar como se describe por Olson et al. (J. Biol. Chem. , 270:30007 (1995)). Brevemente, se hicieron adiciones consecutivas de inhibidor concentrado (0.5 - 6.0 µ ) a las soluciones de ß-tripsina 1 µ? (Sigma) y sonda de p-aminobenzamidina 10 µ? (Sigma) . El enlace se monitoreó de la disminución de fluorescencia que acompaña el desplazamiento de la sonda unidad del sitio activo de enzima como la unión de inhibidor. Después de la adición de cada inhibidor concentrado un tiempo de equilibrio de 1-2 minutos se permitió antes de la valoración de cambios de fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 325 nm y 345 nm, respectivamente, para maximizar la diferencia entre la fluorescencia de sonda unida y libre. Las titulaciones de control de solo la sonda con el inhibidor en la ausencia de la enzima tripsina se realizaron para corregir la fluorescencia antecedente. Las titulaciones de inhibidor-enzima se ajustaron por análisis de regresión lineal. 2. Titulación de preparaciones de t-PA estandarizadas Las PAI-ls mutantes también se titularon contra preparaciones de t-PA estandarizadas para valorar la actividad. La actividad inhibitoria de PAI-1 tipo silvestre o PAI-1 mutante se midió por un ensayo cromo génico directo usando tPA (American Diagnostics, Inc, 100 U/ g) y el sustrato de tPA cromogénico H-D-Ile-Pro-Arg-para-nitroanilina (S-2288, Chromogenix) . Las PAI-1 diluidas en serie (0.1 - 4.0 µg) se incubaron con t-PA en una placa de microtitulación por un tiempo fijo (típicamente, 20-60 minutos) a temperatura ambiente y la actividad residual de tPA se midió por la adición del sustrato cromogénico S-2288 a una concentración final de 0.5 mM. La actividad residual de t-PA después de la incubación con concentraciones incrementadas de inhibidor se valoró midiendo la absorbancia a 405 nm.

EJEMPLO 2 Construcción de bibliotecas de visualizacion de fagos de variantes de u-PA A. Clonación de u-PA tipo silvestre en fagémido Para demostrar la visualizacion funcional del dominio u-PA proteasa en fagos, se realizó PCR de alta fidelidad usando cebadores 496 y 497, ADN polimerasa Pfu y plásmido pCMV4 (SEC ID NO: 373) que contiene ADN-c de gen u-PA de longitud completa (SEC ID NO: 74) como un modelo. Los cebadores usados en la amplificación de PCR fueron como sigue: 496, 5 ' -ACGTGGCCCAGGCGGCCTTTCAGTGTGGCCAAAAG-3 ' (SEC ID NO: 374); 497, 5 ' -TCCTGGCCGGCCTGGCCGAGCAGGCCATTCTC-3 ' (SEC ID NO: 375) . Ambos cebadores portan sitios de restricción (subrayados) para enzima Sfil en el término 5' . Después de la purificación y digestión de Sfil, el producto de PCR se ligó al vector fagémido digerido por Sfil, pComb3H (SEC ID NO: 376) (Andris-Widhopf et al. (2000) J Immunol Methods, 28: 159-81). El fagémido se utilizó para exhibición monovalente de u-PA tipo silvestre o mutante (véase posteriormente) . Este constructo contiene secuencias que codifican la región C-terminal del gen glllp de fago fd. La presencia de dos sitios de restricción de Sfil en el vector con dos diferentes secuencias de reconocimiento se aprovechó para designar los cebadores mencionados anteriormente. Los productos de PCR amplificados usando los cebadores 496 y 407 habilitaron la clonación direccional del ADNc de dominio de u-PA proteasa (SEC ID NO: 75) en el fagémido (véase posteriormente para condiciones de ligación) . En el constructo final, los productos de PCR que contienen secuencias del dominio de u-PA proteasa fueron clonados en el medio de las secuencias de OmpA y glllp para exhibir u-PA tipo silvestre o mutante como una fusión glllp N-terminal .

B. Const^cción de u-PA mutante y bibliotecas de visualización de fagos de u-PA Para construir las bibliotecas de visualización de fagos de u-PA, la amplificación de PCR propensa a error se realizó usando el plásmido pCMV4/u-PA que contiene ADNc del gen u-PA como modelo, como se describió anteriormente, por 25 ciclos en 100 µ? de mezclas de reacción usando reactivos suministrados con el Kit de mutagénesis de PCR Diversify (Clontech) . Las condiciones de PCR apropiadas se siguieron para establecer tres diferentes reacciones PCR para amplificar solamente el dominio de proteasa del gen uPA (SEC ID NO: 475) usando los cebadores 496 y 497 anteriores variando las cantidades de manganeso (MN2+) o dGTP como se describe por el fabricante, para lograr 0.2, 0.5, ó 0.9% de incorporación de velocidad de mutación en el ADNc. Los productos de PCR amplificados (805 bp, SEC ID NO: 475) se purificaron usando un kit de purificación de PCR (Qiagen) seguido por digestión de enzima Sfil. Los productos de PCR digeridos por Sfil de cada reacción de mutagénesis se utilizaron para generar tres diferentes bibliotecas . Para la construcción de bibliotecas, el vector pComb3H (SEC ID NO: 376) se digirió con enzima Sfil y el fragmento de ADN más largo de esta reacción fue purificada en gel usando un "kit de Gel sílice" (Qiagen) . Tres reacciones de ligación separadas se realizaron para construir tres bibliotecas con productos de PCR que contienen 0.2, 0.5 y 0.9% velocidades de mutación. Al menos 1 pg del vector purificado en gel se mezcló con productos de PCR digeridos por Sfil (relación de 1:2) y las mezclas de ligación se purificaron usando el kit Qiagen mini elute (Qiagen) y el ADN fue eluido finalmente en 60 µ? de agua purificada Milli Q. El ADN purificado fue electroporado en 400 µ? de células competentes de electroporación E.coli XL Bluel (Stratagene) usando impulsor de genes (Bio Rad) . Las células luego fueron transferidas a 10 mi de medio SOC (Invitrogen) y se incubaron a 37 °C en un sacudidor por 1 hr seguido por colocación en placas en placas de agar LB grandes (245 mm X 425 mm) suplementadas con carbenicilina (75 µg/ml) . Después de la incubación durante la noche de las placas a 30°C los transformantes fueron rascados usando un rascador de células y los cultivos resultantes crecieron en medio 2X YT suplementado con carbenicilina (75 g/ml) en sacudimiento a 37 °C por 2 horas. Los cultivos fueron infectados con fagos auxiliadores (VCS M13) a una MOI (multiplicidad de infección) de 5 para amplificación de las bibliotecas. Después de 1 hora de crecimiento a sacudimiento de 37 °C, los cultivos fueron suplementados con canamicina a concentraciones finales de 3 µg/ml y crecieron durante la noche a 30 °C con sacudimiento. Las células fueron recolectadas y las partículas de fagos presentes en el sobrenadante se precipitaron usando una solución de PEG-NaCl. Simultáneamente, para calcular la diversidad de cada biblioteca, una alícuota de las células electroporadas se colocó en placas en placas de agar LB suplementadas con carbenicilina (100 µg/ml) y después de la incubación durante la noche a 37 °C las colonias se contaron. Los mismos métodos se utilizaron para generar generaciones sucesivas de bibliotecas de visualización de fagos de u-PA para mejoramiento adicional de variantes de u-PA identificada contra inhibidor de ???-1/RRAR. El ADN de las variantes de u-PA identificadas de las bibliotecas previas se utilizó como modelo para la construcción de bibliotecas de siguiente generación. Las eficiencias catalíticas de bibliotecas de fagos de u-PA o tipo silvestre generadas usando mutagénesis aleatoria se analizaron usando el ensayo de activación de plasminógeno indirecto. Brevemente, 5 µ? de fagos de u-PA (típicamente ·~5?1012 cfu) , Lys-plasminógeno 0.2 µ? (American Diagnostic) y Spectrozyme PL 0.62 mM (American Diagnostica) estuvieron presentes en un volumen total de 100 µ?. Los ensayos se realizaron en placas de microtitulación, y la densidad óptica a 405 nm se leyó cada 30 segundos por 1 h en un Molecular Devices Thermomax. Las reacciones se realizaron a 37°C. La inhibición de fagos de variante de u-PA o u-PA también se valoró. Brevemente, 5 µ? de fagos de u-PA (típicamente ~5xl012 cfu) se mezclaron con wt-PAI-1 (0.1 µ?) o inhibidor de ???-1/RRAR mutante (1.0 µ?) y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente seguido por adición de Spectrozyme PL 0.62 mM, Lys-plasminógeno 0.2 µ? (American Diagnostics, Inc.). Los ensayos se leyeron como se mencionó anteriormente.

Ejemplo 3 Selección de u-PA variante de bibliotecas de fagos de u-PA contra inhibidor mutante A. Selección de complejos de fagos de u-PA/PAI-1 mutante/ El inhibidor de ???-1/RRAR mutante o PAI-1/69 se utilizaron como el "sustrato cebo" en el experimento de cribado para aislar fagos de u-PA alterados con reactividad mejorada hacia la secuencia de sustrato mutante de bibliotecas de visualización de fagos de u-PA combinatoriales , grandes descritas en el ejemplo 2 anterior. En breve, 5 µ? (-2 X 1012 a ~1 X 1013) de fagos de u-PA, que contienen una representación igual de fagos de u-PA de todas las tres bibliotecas de fagos de u-PA (0.2, 0.5 y 0.9% de frecuencia de mutagénesis) , se mezclaron con 5 µ? de sustrato de cebo (desde 0.1 a 1.0 µ? ???-1/RRAR o PAI-1/69) y 10 µ? de amortiguador indirecto 10X pH 7.4 (Tris 0.5 M, NaCl 1.0 M, EDTA 10 mM, 0.1% Tween 80) en un volumen total de 100 µ? (es decir, la reacción contuvo 80 µ? de H20) . La reacción se incubó por tiempos variados a temperatura ambiente (típicamente 1 hora, sin embargo, el tiempo de incubación se ajustó para controlar la astringencia de la solución) . Los complejos de inhibidor de PAI-l-fagos de u-PA se capturaron usando sefarosa activada con CuS04. La pre-activación de la sefarosa quelante (200 µ?; Pharmacia) se realizó por tratamiento con CuS04 (100 mM) . La sefarosa activada con CuS04 se bloqueó con 0.5% BSA en amortiguador PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Se agregaron 100 µ? de perlas de sefarosa bloqueada con BSA a 100 µ? de la reacción de mezcla de cribado anterior en la presencia de 800 µ? de amortiguador de enlace (NaCl 0.5 M, Tris 20 mM, immidozol 20 mM, pH 7.4) para capturar los complejos de fagos de u-PA- inhibidor de PAI-1 marcado con His. La incubación se continuó por otra hora a temperatura ambiente. Luego, la mezcla de cribado se centrifugó por 1 min a 2000 rpm y las perlas de sefarosa que contienen complejos de fagos de u-PA-inhibidor de PAI-1 unidos se lavaron con 1 mi de amortiguador de enlace para remover los fagos no unidos. La etapa de lavado se repitió 5-10 veces y las perlas que contienen complejos unidos se transfirieron a nuevos tubos después de cada lavado para evitar cualquier "migración" potencial de fagos no específicos. Los complejos de fagos de u-PA-PAI-l/RRAR unidos se eluyeron en 100 µ? de amortiguador de elución (EDTA 0.5 M) . Una alícuota de 95 µ? de los fagos eluidos se utilizó para infectar 1 mi de células E. coli XL-1 Blue (0.6 OD) para calcular la producción de bibliotecas (indicando el número de fagos obtenidos después de la selección) . Las bacterias infectadas se colocaron en placas en placas grandes (245 mm x 245 mm) que contienen carbenicilina (75 pg/ml) para generar una biblioteca para la siguiente ronda de selección. Finalmente, la biblioteca producida restante (es decir, fagos seleccionados) se utilizó para preparar clones de fagos individuales para seleccionar y/o generar una nueva biblioteca para la siguiente ronda de selección las concentraciones de sustrato de cebo usadas en la selección y tiempos de incubación de la biblioteca con el sustrato de cebo se ajustaron de acuerdo con el nivel de astringencia deseado. Por ejemplo, las condiciones se podrán elegir de modo que >1%, 2%, 5%, 10%, o mayor de 10% de la actividad de u-PA de la biblioteca se inhibió por el "PAI-1 de cebo" que contiene la secuencia de sustrato de cebo. Típicamente, la primera ronda de selección se realizó usando concentraciones mayores (por ejemplo, 0.5 µ?) de PAI-1 de cebo y para rondas de selección sucesivas la concentración de serpina de cebo y tiempo de incubación con las bibliotecas se redujeron. Además, se pueden usar múltiples astringencias en paralelo en cada ronda de selección. Basado en la calidad de la producción (por ejemplo, relación de señal a ruido de la producción de fagos en selecciones de serpina apareadas +/ cebo (véase descripción posteriormente) ) , y la calidad de los "aciertos" basado en el análisis funcional, la producción de fagos de una o más de estas selecciones se puede realizar hacia delante en las siguientes rondas de selección . En paralelo, los experimentos de control se realizaron usando las condiciones mencionadas anteriormente para selección de fagos de la biblioteca de u-PA sin cebo y los fagos de este experimento de control se compararon con la producción de las selecciones de biblioteca en la presencia de sustrato de serpina de cebo. La cfu de la producción de biblioteca seleccionada en la presencia de cebo fue normalmente en el intervalo de 104 a 105 mayor que la producción obtenida de la selección de control. Si se observó mayor antecedente con la selección de control, el cribado se repitió usando condiciones más astringentes tales como reduciendo los tiempos de incubación, incrementando las concentraciones de reactivos (biblioteca, cebo o perlas) e incrementando el número y tiempo de lavado de los fagos seleccionados unidos a sefarosa quelante (hasta un factor de 10 o más) .

B. Selección de fagos de u-PA con reactividad incrementada y eficiencia catalítica hacia nuevas secuencias de sustrato Una alícuota de fagos de u-PA eluidos (5 µ?) se mezcló con células E. coli XL-IBlue (100 µ?) para infección y se incubó a 37°C por 1 hr. Las células E. coli infectadas luego se colocaron en placas en placas de agar LB suplementadas con carbenicilina (100 g/ml). Después de la incubación durante la noche a 37°C, las colonias individuales se escogieron para preparaciones de fagos. Las células crecieron en 2 mi de 2x YT suplementado con carbenicilina (100 g/ml) y tetraciclina (10 g/ml) y la preparación de fagos se realizó como se describió (Sambrook, J et al (1989) Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold spring Harbor laboratory) . Los fagos identificados se probaron en los siguientes ensayos para valorar la actividad. Las preparaciones de fagos individuales se utilizaron en el ensayo de activación de plasminógeno indirecto para identificar los fagos activos, y las preparaciones de fagos activos se utilizaron para ensayos de inhibición . 1. Ensayo de Activación de Plasminógeno Indirecto Las preparaciones de fagos individuales se utilizaron en el ensayo de activación de plasminógeno indirecto para identificar los fagos de u-PA activos. Brevemente, 5 µ? de fagos de u-PA (típicamente ~5xl012 cfu) , Lys-plasminógeno 0.2 µ? (American Diagnostic) y Spectrozyme PL 0.62 mM (American Diagnostica) estuvieron presentes en un volumen total de 100 µ?. Los ensayos se realizaron en placas de microtitulación, y la densidad óptica a 405 nm se leyó cada 30 segundos por 1 h en un Molecular Devices Thermomax. Las reacciones se realizaron a 37°C. 2. Inhibición de fagos de u-PA por ????-1/RRAR mu an e Los fagos que fueron identificados como activos en el ensayo de actividad de plasminógeno indirecto se probaron adicionalmente para inhibición por ???-1/RRAR mutante. Brevemente, para los ensayos de inhibición, se agregaron 5 µ? de fagos de u-PA activos (típicamente ~5xl012 cfu) en cavidades duplicadas de una placa de microtitulación seguido por adición de una concentración fija de PAI-1 mutante (por ejemplo, 1.0 µ?) a una cavidad y solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a la cavidad duplicada. Después del mezclado, la reacción se dejó continuar por un tiempo fijo (por ejemplo, 30 min) a temperatura ambiente seguido por adición de Spectrozyme PL 0.62 mM, Lys-plasminógeno 0.2 µ? (American Diagnostics, Inc.). Para experimentos de control, los fagos de u-PA tipo silvestre se valoraron bajo las mismas condiciones. Las placas se leyeron a 405 nm en un espectrofotómetro por 2 horas. Los fagos de u-PA seleccionados que exhibieron sensibilidad mejorada para ???-1/RRAR o PAI-1/69 cuando se comparan con fagos de u-PA tipo silvestre se seleccionaron para análisis adicional y s 5 sometieron a secuenciado de ADN. 3. Selección de Sustrato de Péptido Además, para identificar las variantes de fagos de u-PA con eficiencia catalítica mejorada, se tamizaron clones de fagos individuales contra un sustrato de Ac-RRAR-AMC. Para el ensayo, un volumen fijo de sobrenadantes de fagos (por ejemplo, 35 µ?) se mezcló con sustrato de Ac-RRAR-AMC 75 µ? en IX amortiguador de ensayo indirecto (Tris 50 mM, NaCl 100 mN, EDTA 1 mM, 0.01% Tween 80) en un volumen total de 100 µ?. El ensayo se realizó en placas de ensayo negras de 96 cavidades o 384 cavidades (Corning) y se leyeron a 380-450 nm por 2 horas en lector de espectrofotómetro (Molecular Devices) . Para confirmar su mejoramiento, los fagos de u-PA positivos identificados después de los tamices de sustrato de péptido e inhibidor se volvieron a tamizar usando los ensayos descritos anteriormente.

C. Identificación de Mutantes de u-PA Seleccionados y Optimización de Mutantes Identificados Los clones de fagos positivos se mezclaron con células E. coli XL-IBlue para infección como se mencionó anteriormente y los cultivos crecieron durante la noche con sacudimiento a 37°C. El ADN de plásmido se purificó del cultivo durante la noche usando un kit de preparación de plásmido (Qiagen) . El ADN se purificó para secuenciado habitual usando los siguientes cebadores: 535-5'-CAGCTATCGCGATTGCAG-3 ' (SEC ID NO:381); 5542-5 ' GTGCGC AGCCATCCCGG-3 ' (SEC ID NO:382). Los residuos de aminoácido alterados en los genes de u-PA mutante se identificaron después del análisis de los datos de secuenciado. La tabla 10 posterior describe variantes de u-PA identificadas de la selección de u-PA variante de bibliotecas de fagos de u-PA contra un inhibidor de mutante ???-1/RRAR. Las mutaciones descritas en la tabla 10 posterior están con numeración de quimiotripsina . Los números entre paréntesis indican el número de veces que los mutantes fueron identificados en el método de selección de fagos. Basado en los resultados de los ensayos de activación, las mejores variantes de fagos de u-PA se realzan por subrayado. Las secuencias de aminoácido de una preproproteina u-PA madura (SEC ID NO: 433) que contiene las mutaciones designadas se describen en cualquiera de las SEC ID NOS: 434-445.

Tabla 10 Los residuos de aminoácido alterados en el gen de u-PA mutante que exhiben sensibilidad incrementada contra inhibidor de PAI-1/69 después de la selección contra el inhibidor de PAI-1/60 se identificaron después del análisis de los datos de secuenciado como se describió anteriormente. Los mutantes identificados de la primera biblioteca de visualización de fagos de proteasa de primera generación (I) se describen posteriormente en la tabla 11. Las generaciones subsiguientes de bibliotecas de visualización de fagos de proteasa se crearon usando el método como se describió anteriormente en el ejemplo 2B usando el kit de mutagénesis de Diversificación de PCR y cebadores 496 y 497. Para la biblioteca de visualización de fagos de II generación, el u-PA/IC mutante de u-PA que contiene una mutación correspondiente a F30V con base en la numeración de quimiotripsina se utilizó como un modelo para la reacción de mutagénesis. Los mutantes identificados de la biblioteca de visualización de fagos de proteasa de segunda generación (II) se describen en la tabla 11 posterior. Para la biblioteca de visualización de fagos de III generación, u-PAIIb de mutante de u-PA o mutante de u-PA-IIB que contiene mutaciones correspondientes a F30V/Y61 (A) H o F30V/K82E, respectivamente, basado en la numeración de quimiotripsina se utilizaron como modelos para la reacción de mutagénesis. Los mutantes identificados de la biblioteca de visualización de fagos de proteasa de tercera generación (III) se describen en la tabla 11 posterior. Para la biblioteca de visualización de fagos de IV generación, el u-PA/IIIa de mutante de u-PA que contiene mutaciones correspondientes a F30V/K28E/V159A basado en la numeración de quimiotripsina se utilizó como un modelo para la reacción de mutagénesis. Los mutantes identificados de la biblioteca de visualización de fagos de proteasa de cuarta generación (IV) se describen en la tabla 11 posterior. Los números entre paréntesis indican el número de veces que los fagos de u-PA se seleccionaron para que tuvieran la misma mutación. El subrayado indica las nuevas mutaciones adquiridas por el mutante. Las secuencias de aminoácido de una preproproteina u-PA madura (SEC ID NO: 433) que contiene las mutaciones designadas se describen en cualquiera de las SEC ID NOS: 460-472.

Tabla 11 1. Optimización y recombinación de residuos de aminoácido 30 y 155 en Bibliotecas de Visualización de Fagos Enfocada contra inhibidor de ???-1/RRAR Para enriquecer la sensibilidad de variantes de u-PA contra inhibidor de ???-1/RRAR, el aminoácido 30 y aminoácido 155 con base en la numeración de quimiotripsina (identificada como puntos calientes en las primeras selecciones como se describe en la tabla 10 anterior) fueron dirigidos para aleatorización y recombinación usando los siguientes cebadores, respectivamente: TC30-5'GCCCTGGNNSGCGGCCATC-3' (SEC ID NO:383) TC155-5' GGAGCAGNNSAAAATGACTG-3' (SEC ID NO: 384) La mutagénesis se realizó usando el kit de mutagénesis dirigida a sitios múltiples Quick Change (Stratagene) siguiendo las condiciones descritas por el fabricante. En breve, después de la fosforilación de los cebadores usando polinucleótido cinasa T4 (New England Biolabs) siguiendo las condiciones descritas por el fabricante, tres diferentes reacciones se realizaron para aleatorización de residuos 30 y 155: 1) 30 individualmente; 2) 155 individualmente; y 30 más 155 conjuntamente. El constructo de ADN, variante pComb3H/u-PA (pARF 81), que porta mutaciones en los residuos L73A y 189V cuando se comparan con las secuencias de dominio de u-PA proteasa de tipo silvestre correspondientes, se utilizó como un modelo en la reacción de mutagénesis usando los cebadores TC30 (SEC ID NO:383) y TC155 (SEC ID NO:384) individualmente para aleatorización de las posiciones 30 y 155 respectivamente. En otra reacción, estos dos cebadores se utilizaron para aleatorizar las posiciones 30 y 155 conjuntamente en el ADN de variante pARF 81. La reacción de mutagénesis se realizó usando el kit de mutagénesis de sitios múltiples (Stratagene) siguiendo las condiciones especificas por el proveedor. Después de la mutagénesis, los productos de reacción se transformaron en células E.coli XL-1 Blue para construcción de biblioteca (Véase ejemplo 2 anterior) . Las bibliotecas de fagos de u-PA amplificadas se utilizaron para selección de variantes mejoradas de u-PA como se describe en el ejemplo 3A y 3B anterior. La tabla 12 posterior describe variantes de u-PA identificadas de la selección contra un inhibidor de mutante ???-1/RRAR de variante u-PA de bibliotecas de fagos de u-PA enfocados donde todas las variantes tuvieron mutaciones antecedentes en residuos de aminoácidos L73A y 189V basado en la numeración de quimiotripsina . Las mutaciones descritas en la tabla 12 posterior están con numeración de quimiotripsina . Los números entre paréntesis indican el número de veces que los mutantes fueron identificados en el método de selección de fagos. Basado en los resultados de ensayos de actividad, las mejores variantes de fagos de u-PA se realzan por subrayado. Las secuencias de aminoácido de una preproproteina u-PA madura (SEC ID NO: 33) que contiene las mutaciones designadas se describen en cualquiera de las SEC ID NOS: 446-459.

Tabla 12 EJEMPLO 4 Expresión de enzimas u-PA modificadas por transfección temporal de células COS Para la expresión de enzimas u-PA variante en un sistema de expresión de mamífero, los clones positivos identificados de resultados de visualización de fagos se usaron como un modelo (pComb3H que porta secuencias de dominio de u-PA proteasa mutante) para amplificación de PCR de ADNc que codifica el gen variante de u-PA seleccionado. La superposición de PCR de extensión (Ho, S et al (1989) Gene 77, 51-59) se realizó usando los siguientes cebadores. 717-5 ' -TTTCAGTGTGGCCAAAAG-3 ' (SEC ID NO:385); 718, 5 ' -CAGAGTCTTTTGGCCACA-3 ' (SEC ID NO:386); 850, 5 ' -GGGGTACCGCCACCATGAGAGCCCTGCTGGCGCGC-3 ' (SEC ID NO: 387) ; 851, 5 ' -GCTCTAGATCATCAGAGGGCCAGGCCATTCTCT-3 ' (SEC ID NO: 388). Los cebadores 850 y 851 portan secuencias para enzimas de restricción Kpnl y Xbal (subrayadas) respectivamente . La PCR se realizó en dos etapas para realizar la amplificación de longitud completa de gen de u-PA de ADNc mutado como se describe posteriormente. En la primera etapa, la PCR se realizó en una reacción de 100 µ? para amplificar un producto de 500 bp (correspondiente a los dominios de EGF y Kringle de u-PA) usando ADN polimerasa Pfu, cebadores 850, 718 y pCMV4 que contienen el gen de u-PA de longitud completa (SEC ID NO: 74) como modelo. De manera similar, otra PCR se realizó para amplificar el dominio de u-PA proteasa mutante (800 bp, es decir correspondiente a las secuencias mutantes cuando se comparan con la secuencia tipo silvestre descrita en la SEC ID NO: 475) usando los cebadores 851 y 717 con la u-PA-pComb3H mutante apropiada como modelo. Estos dos productos de PCR fueron purificados en gel y usados en la siguiente ronda de amplificación de PCR. En la segunda etapa, los productos de PCR purificados en gel (5 µ? cada uno) se utilizaron como modelos en la mezcla de reacción de 100 µ? con cebadores 850 y 851. Los cebadores 717 y 718 tienen secuencias complementarias de superposición que permiten la amplificación del ADNc de u-PA de longitud completa (1.3 kb) en la segunda etapa de PCR. El producto de PCR se purificó usando un kit de purificación de PCR (Qiagen) y luego se digirió con enzimas de restricción Kpnl y Xbal . Después de la purificación usando columna QIAquick (Qiagen) , el gen u-PA de longitud completa se ligó con el vector de expresión de mamífero pC V4 (SEC ID NO: 373) que se ha digerido previamente con Kpnl y Xbal. La mezcla de ligación fue electroporada en células E. coli XL-IBlue y colocada en placas en placas LB suplementadas con carbenicilina (100 vq/ml) . Después de la incubación durante la noche de las placas a 37°C, las colonias individuales se escogieron y crecieron en 2 mi de medio LB para purificación de plásmido. Los plásmidos se utilizaron para secuenciado del gen u-PA completo usando los siguientes cebadores de secuenciado. UPAF1-5ATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCC-3 ' (SEC ID NO: 76) y UPAF2-5 ' GGAAAAGAGAATTCTACCG-31 (SEC ID NO: 477) . Los clones de u-PA mutantes con las mutaciones correctas, sin algunas mutaciones adicionales, se prepararon en grandes cantidades usando el kit de preparación de plásmido Midi (Qiagen) y se usaron para electroporación en células COS-1 usando un Impulsor de genes Bio-Rad. 20 µg de ADNc, 100 g de ADN portador, y aproximadamente 107 células COS-1 se colocaron en una cubeta de 0.4 cm, y la electroporacion se realizó a 320 V, 960 microfaradios, y O = 8 (Tachias et al. (1995) J Biol. Chem., 270: 18319-18322). Después de la electroporacion, las células transíectadas se incubaron durante la noche a 37°C en medio DMEM (Irvine Scientific) que contiene 10% suero bovino fetal y butirato de sodio 5 mM. Las células luego se lavaron con medio libre de suero y se incubaron en DMEM por 48 horas a 37 °C. Después de la incubación con medios libres de suero, los medios acondicionados se colectaron y usaron para caracterización adicional . EJEMPLO 5 Caracterización de u-PAs Mutantes Purificadas A. Medición de concentración de enzima La forma de cadena única de las enzimas u-PA mutantes en medios acondicionados se convirtió en la enzima de dos cadenas correspondiente por tratamiento con plasmina-sefarosa (Calbiochem) . La concentración de u-PA activa en estos medios se midió por titulación de sitio activo con una preparación de inhibidor de PAI-1 estándar que se ha titulado previamente contra un estándar primario de tripsina como se describe en el ejemplo 1 anterior. Las concentraciones de enzima totales se midieron por ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima siguiendo los protocolos de manual de laboratorio, Harlow et al (1998) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory. La relación de estas concentraciones produce la fracción de variante de u-PA que es activa en cada uno de los medios.

B. Ensayo Cromogénico Directo de u-PA Los ensayos directos de actividad de u-PA utilizaron el sustrato sal de monoacetato de carbobenzoxi-L-Y-glutamil ( -t-butoxi) -glicil-arginina-p-nitroanilida (Cbo-L- (?) -Glu (a-t-puO) -Gly-Arg-pNA AcOH; Spectrozyme® uPA, American diagnostica) (Madison et al. (1995) J Biol . Chem. , 270:7558-7562). La actividad de enzima se determinó midiendo el incremento de absorbancia de (pNA) libre generado por unidad de tiempo a una absorbancia de 405 nm. Los ensayos cinéticos se realizaron tiempo extra usando concentraciones de enzima entre 6 y 8 nM. La concentración de Spectrazyme® uPA se varió de 25 a 150 µ? en ensayos para u-pA de dos cadenas, y de 25 a 200 µ? en ensayos del dominio proteasa de u-PA. Las reacciones se realizaron en placas de microtitulación de 96 cavidades y las velocidades de reacción se valoraron por medición de absorbancia a 405 nm cada 30 segundos por hasta 2 horas usando un lector de placa Spectromax M2 o M5 (Molecular Devices) . Las constantes cinéticas kcat, Km, y kcat/Km (constante de especificidad) se calcularon graficando la inversa de la concentración de sustrato contra la inversa de la velocidad de absorbancia a OD405 , y ajustando a la ecuación de Lineweaver-Burk (l/velocidad= (Km/Vmax) (1/ [S] ) + 1/Vmax; donde Vmax= [ E ] *kcat) . La tabla 13 posterior describe los resultados de análisis cinético de mutantes de u-PA, identificados exhibiendo sensibilidad incrementada contra inhibidor de PAI-1/69, en un ensayo directo de actividad de enzima u-PA. Los resultados muestran que cada una de las u-PAs mutantes identificadas tienen una actividad de enzima disminuida cuando se compara con la u-PA tipo silvestre como se determina a partir de la medición de la constante de especificidad para escisión (kcat/Km) del sustrato Spectrozyme® uPA. En la tabla, las variantes probadas son aquellas identificadas en la tabla 11 anterior siguiendo la selección de generaciones sucesivas (I a IV) de bibliotecas de visualización de fagos de u-PA. TABLA 13: imitantes <le u-PA K.m ??_1 ¿ca ?,t, u-PA Mutante S (s-l) (mM) (M- l s-l) u-PA/Ic (30) 0.745 22.3 2.9 x 103 0.30 u-PA IIb (30, 82) 0.299 1 1 3.6 x 105 0.38 u-PA IIIa (30, 82, 159) 0.239 1 1.6 4.8 x 105 0.50 u-PA/IIIb (30, 39, 82, 159) 0.212 9.6 4.5 x 105 0.47 u-PA/IVa (30, 80, 82, 89, 159, 187) 0.177 10 5.6 x 105 0.58 u-PA/IVb (30, 80, 82, 84, 89, 159, 187) 0.321 1 1 3.4 x 105 0.35 u-PA tipo silvestre 0.174 16.6 9.5 x 105 1 .0 C. Análisis cinético de variantes de u-PA usando sustrato fluorogénico Los ensayos directos para medir la actividad de las variantes de u-PA contra la secuencia de sustrato objetivo de RRAR se realizaron utilizando un sustrato Ac-RRAR-AMC. El uso del sustrato de péptido fluorogénico 7-amino-4-metilcumarina (AMC) es un método de rutina para la determinación de especificidad de proteasa (Zimmerman et al. (1977) Anal Biochem, 78:47-51; Harris et al. (2000) PNASm 97:7754-7759). La escisión especifica del enlace anilida libera el grupo saliente AMC fluorogénico, proporcionando un medio eficiente para determinar las velocidades de escisión para sustratos individuales. Los sustratos fueron diluidos en serie de 0.05 a 12.0 mM y se incubaron en la presencia de proteasa (9-25 nM) en una placa de ensayo de media área negra de 96 cavidades Costar. La fluorescencia del grupo saliente AMC libre se midió en un espectrofotómetro de fluorescencia (Molecular Devices Gemini XPS) a una longitud de onda de excitación (380 nm) y longitud de onda de emisión (450 nm) con referencia a un estándar de AMC. La velocidad de incremento de fluorescencia se midió durante 30 minutos con lecturas tomadas a intervalos de 30 segundos. Las constantes cinéticas kcat, Km, y kcat/Km (constante de especificidad) se calcularon graficando la inversa de la concentración de sustrato contra la inversa de la velocidad de escisión de sustrato, y ajustando a la ecuación de Lineweaver-Burk (l/velocidad=(Km/Vmax) (1/ [S] ) + 1/Vmax; donde Vmax= [E] *kcat) . La tabla 14 posterior describe los resultados del análisis cinético de variantes de u-PA ARF2 y ARF36 contra el sustrato Ac-RRAR-AMC. Los resultados muestran que la constante de especificidad para el sustrato RRAR para las variantes de u-PA proteasa seleccionadas se incrementa cerca o más de 10 veces cuando se compara con u-PA tipo silvestre.

D . Análisis cinético de activación de plasminogeno usando un ensayo cromo génico indirecto Un ensayo cromo génico indirecto se realizó para determinar las actividades de la u-PA tipo silvestre y mutante producida como preparaciones de proteina purificada (Madison et al. (1989) Nature, 339:721-724; Madison et al. (1990) J Biol. Chem., 265:21423-21426). En este ensayo, la p-nitroanilina libre se liberó del sustrato cromogénico Spectrozyme PL (sal de diacetato de H-D- norleucilhexahidrotirosil-lisina-p-nitroanilida , American Diagnostics, Inc.) por la acción de plasmina generada por la acción de u-PA en el plasminógeno . La liberación de p-nitroanilina libre se midió espectrofotométricamente a OD405 nm. Para el ensayo, las mezclas de reacción de 100 yl que contienen 0.25-1 ng de las enzimas uPA a ser probadas, Spectrozyme PL 0.62 mM, Lys-plasminógeno C.2 µ? (American Diagnostics, Inc.), se combinaron en un amortiguador que contiene Tris-HCi 50 mM (pH 7.5), NaCl 0.1 M, EDTA 1.0 mM y 0.01% (v/v) de Tween 80. La reacción se incubó a 37 °C en placas de micrctitulación de fondo' plano de 96 cavidades (Costar, Inc. ) y la densidad' óptica - a 405 nm (OD405) se leyó cada 30 s por 1 h en un Molecular Devices ' Thermomax. Las constantes- cinéticas kcat l Km; y kca /Km (constante de especificidad) se calcularen corno se describió antes (Madison, E . L (1989) Nature 339, 721-724). La tabla 15 posterior describe los -resultados del análisis cinético de mutantes de u-PA, identificados exhibiendo sensibilidad incrementada contra el inhibidor de PAI-1/-69,' en un ensayo indirecto de actividad de' enzima u~ PA. Los resultados muestran que cada una de las u-PAs mutantes identificadas tienen una actividad de enzima disminuida cuando se compara con la u-PA · tipo silvestre cerno se- determina a partir de la medición indirecta -de la constante de · especificidad- para escisión (kcat/Km)- de escisión de sustrato Spectrozyme® PL. En la tabla, las variantes probadas son aquéllas identificadas en la tabla IT anterior después de la selección de ' géneraciones sucesivas (I a IV) de bibliotecas de visualizáción de fagos de u-PA.

TABLA 15: inutnntes <\t u-PA m (µ?) >-i) u-PA imitante tS u-PA/Ic 9.01 24.7 2.7 x 106 0.24 u-PATIIb 8.6 22.6 2.6 x 106 0.23 u-PA/IIIa 6.31 37.6 5.9 x 106 0.53 u-PA/IIIb 9.3 29.8 3.2 x 106 0.29 u-PA7IVa 7.03 38.7 5.5 x 106 0.50 u-PA7IVb 7.5 45.3 6.0 x 106 0.54 6.03 70.1 1.1 x 107 1 .0 E. Análisis cinético de inhibición de enzimas u-PA mutantes por PAI-1 tipo silvestre y PAI-1 mutante Las constantes de velocidad de segundo orden (ki) para la inhibición de u-PA mutante y tipo silvestre (control positivo) se determinaron usando condiciones de seudo-primer orden (ki <2 x 106) o segundo orden ( ki >2 x 106) . Para cada enzima, las concentraciones de enzima e inhibidor (PAI-1 mutante) se eligieron para producir varios puntos de datos para los cuales la actividad enzimática residual varió entre 20 y 80% de la actividad inicial. Las mediciones cinéticas en la velocidad de interacción de u-PA tipo silvestre y mutante con PAI-1 tipo silvestre y mutante se realizaron a 24°C en amortiguador Tris-HCl 0.1 M (pH 7.4) que contiene EDTA 0.1 mM y 0.1% (v/v) de Tween 20. El ensayo cromogénico indirecto como se describe en la Parte D anterior se utilizó para determinar la actividad de enzima residual que permanece como una función de tiempo. Las constantes de velocidad para la inhibición de u-PA tipo silvestre o mutante por PAI-1 fueron bajo condiciones de seudo-primer orden para un exceso de PAI-1 sobre u-PA como se describió previamente (véase, por ejemplo, Holmes et al. (1987) Biochemistry, 26:5133-5140; Beatty et al. (1980) J. Biol . Chem. , 255:3931-3934; Madison et al. (1990) PNAS, 87:3530-3533; Madison et al. (1993) Methods Enzymol., 223:249-271). Brevemente, la u-PA tipo silvestre o mutante purificada (3-50 fmol) se incubó a temperatura ambiente por 0 a 120 minutos con PAI-1 tipo silvestre o mutante (35-1330 fmol) . Después de la incubación, las mezclas se diluyeron y la actividad enzimática residual se determinó en un ensayo cromogénico estándar como se describe en D anteriormente. Los datos se analizaron graficando ln (actividad residual/actividad inicial) contra tiempo y determinando la inclinación de la linea recta resultante. Las constantes de velocidad de seudo-primer orden luego se derivaron dividiendo la inclinación por la concentración del inhibidor en la reacción . Para las reacciones de segundo orden, las concentraciones equimolares de u-PA tipo silvestre o mutante y PAI-1 tipo silvestre o mutante se mezclaron directamente en cavidades de placa de microtitulación y se pre-incubaron a temperatura ambiente por periodos de tiempo que varían de 0 a 30 min. Después de la pre-incubación, las mezclas se enfriaron con un exceso de anticuerpos anti-PAI de neutralización y la actividad enzimática residual se midió en el ensayo cromogénico indirecto. Los ensayos cromogénicos indirectos se compararon con las reacciones de control que no contienen PAI-1 o a las cuales se agregó PAI-1 después de la pre-incubación y adición de anticuerpo anti-PAI-1, plasminógeno y Spectrozyme PL a la mezcla de reacción. Los datos se analizaron graficando ln (actividad residual/actividad inicial) contra el tiempo y determinando la inclinación de la línea recta resultante. Las constantes de velocidad de segundo orden luego se derivaron dividiendo la inclinación del inhibidor en la reacción. La tabla 16 posterior describe las constantes de velocidad de segundo orden para la inhibición de variantes de u-PA por inhibidor de ???-1/RRAR. Los resultados muestran que las variantes ARF2 y ARF36 tienen aproximadamente un mejoramiento de 20 veces en la especificidad para el sustrato de inhibidor ???-1/RRAR cuando se valora por la constante de velocidad ki incrementada para inhibición cuando se compara con u-pA tipo silvestre.

Las tablas 17 y 18 posteriores son los resultados de constantes de velocidad de segundo orden de la inhibición de inhibidor PAI-1/69 tipo silvestre (tabla 17) o mutante (tabla 18) por variantes de u-PA o u-PA tipo silvestre seleccionadas contra el inhibidor PAI-1/69. Las u-PAs variantes descritas en cada una de las tabla 17 y 18 son aquellas identificadas de una (I) a cuatro (IV) rondas sucesivas de una selección de biblioteca de fagos de u-PA como se representa en la tabla 11 anterior. Los resultados en la tabla 17 muestran que algunas de las u-PAs mutantes (es decir, u-PA/IIIa, u-PA/ II Ib, y u-PA/IVa) tienen una constante de velocidad de segundo orden ligeramente incrementada para la inhibición cuando se compara con u-PA tipo silvestre y los mutantes u-PA/Ic, u-PA/IIb, y u-PA/IVb tienen una constante de velocidad de segundo orden disminuida para la inhibición cuando se compara con u-PA tipo silvestre. Los resultados en la tabla 18 muestran que la constante de velocidad de segundo orden para la inhibición es dramáticamente incrementada para cada una de las variantes de u-PA seleccionadas para inhibición por el inhibidor PAI-1/69' mutante. Los resultados muestran que cada una de las variantes seleccionadas tiene un mejoramiento mayor de 13 veces, de especificidad para el sustrato de inhibidor PAI-1/69, con variantes u-PA/IIIb, u- PA/IVa, y u-PA/IVb cada una exhibiendo cercano o más de un mejoramiento de 40 veces de especificidad.

EJEMPLO 6 Selección de MT-SPl variante de bibliotecas de fagos de MT- SPl contra inhibidor AT3 mutante Un inhibidor de antitrombina III mutante (AT3) (SEC ID NO: 5) que contiene una secuencia de hexa-péptido en los residuos de bucle de sitio reactivo (RSL) P4-P3-P2-P1- Pl'-P2' de una AT3 tipo silvestre correspondiente a los residuos aminoácidos IAGRSL (SEC ID NO: 78) fue mutado para contener una sustitución en estos residuos a SLGRKI (SEC ID NO: 79), correspondiente a los residuos aminoácidos de una secuencia de escisión C2 de complemento. El mutante AT3SLGR" I se utilizó como el "sustrato cebo" en el experimento de selección de proteasa para aislar fagos con reactividad mejorada hacia la secuencia de sustrato mutante de una biblioteca grande de visualización de fagos de MT-SP1 combinatorial . En breve, para análisis de la primera selección de generación, 5 µ? de una biblioteca de fagos de 1:100 SM1 (~3 X 1013) MT-SP1 que es una biblioteca de frecuencia mutagénica baja (es decir, 0.2-0.5% de frecuencia de mutagénesis) que tiene actividad enzimática se combinó en representación igual con 5 µ? de una biblioteca de fagos de 1:100 SM2 (~3 X 1012) T-SP1 que contiene una frecuencia de mutagénesis mayor (es decir, 0.9%) . Las bibliotecas de fagos se mezclaron con 5 µ? de heparina (5 ng/µ?; de solución madre de mucosa intestinal porcina) , 5 µ? de sustrato ¾T3slgr_ki <je cebo (variando de concentraciones desde 0 (es decir, 5 µ? de H20) , 0.018 µ?, 0.18 µ?, 1.8 µ?, ó 18 µ?) en la presencia de 5 µ? (18 µ?) de AT3 purificada de plasma, tipo silvestre y 5 µ? de amortiguador de actividad de MTSP 10X (Tris HC1 0.5 M, pH 8, NaCl 0.3 M, 0.1% Tween 30) en un volumen total de 50 µ? (es decir, la reacción contuvo 20 µ? de H20) . la reacción se incubó por 4.5 horas a 37°C.

Los complejos de fagos de MTSP-l-inhibidor de AT3 se capturaron usando sefarosa activada con CUSO4. 200 µ? de sefarosa quelante (Pharmacia) se pre-activaron con CuS04 (100 mM) . La sefarosa activada con CuS04 (100 µ?) se bloqueó con 2 mi de BSA al 0.5% en amortiguador PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se recolectaron de la solución de bloqueo por formación de pelotillas a 6500 rpm por 60 segundos seguido por resuspensión en 450 µ? de amortiguador de enlace (NaCl 0.5 M, iris 100 M pH 8, imidazol 10 mM, 0.1% Tween 20). 50 µ? de la reacción de mezcla de cribado . anterior se agregaron a las perlas de sefarosa activada con CuS04 para capturar los complejos de inhibidor de AT3-fagos de MTSP-1 marcados con His. La incubación se continuó por 1 hora a temperatura ambiente. Luego, la mezcla de cribado se centrifugó por 1 min a 2000 rpm y las perlas de sefarosa que contienen complejos de inhibidor de MTSP-l-fagos de AT3 unidos se lavaron con 500 µ? de amortiguador de enlace para remover los fagos no unidos. La etapa de lavado se repitió 5 veces y las perlas que contienen complejos unidos fueron transferidas a nuevos tubos después de cada lavado para evitar cualquier "migración" potencial de fagos no específicos. Los complejos de fagos de MT-SP1-AT3SLGR_KI fueron eluidos en 100 µ? de amortiguador de elución (EDTA 0.5 M, pH 8.0) . Una alícuota de 50 µ? de los fagos eluidos se utilizó para infectar 3 mi de células activamente crecidas E.coli TG1 (A600 = 0.5; 0.5 OD = -1.5 x 108 colonias/ml) por 20 minutos a 37°C. Las bacterias infectadas se colocaron en placas en placas grandes (245 mm x 245 mm) que contiene carbenicilina (75 µg/ml) y se incubaron a 30°C durante la noche. A la mañana siguiente las placas se recolectaron. Las colonias en cada placa se contaron y compararon con la placa antecedente que no contuvo inhibidor AT3SLGR" I. Los resultados de los conteos de colonia se describen en la tabla 19.

Las colonias de las placas que contienen ^T3 se rascaron con 25 mi de 2YT suplementado con carbenicilina (-100 g/ml) después de que las placas se han colocado en el cuarto frío por 2 horas para fortalecer el agar. 20 mi de las bacterias 2YT que contienen medio se agregaron a 500 mi de 2YT que contiene carbenicilina y el A60o se determinó que es 0.13. Las bacterias crecieron a un OD= -0.5 y luego se agregaron -1 x 1010 a 2.6 x 1013 cfu/ml de fagos auxiliadores (VS 13) (en -150 µ1-200 µ?) para amplificación de las bibliotecas. Después de 1 hora de crecimiento a sacudimiento a 37 °C, los cultivos se suplementaron con canamicina a concentraciones finales de 3 g/ml y crecieron durante la noche a 30°C con sacudimiento. Las células se recolectaron y las partículas de fagos presentes en el sobrenadante se precipitaron usando una solución PEG-NaCl. Para análisis de la segunda generación de selección de fagos de MT-SP1, las condiciones fueron similares a la primera generación, excepto que la reacción contra el sustrato de cebo TT3slgr_ki fue por solamente 27 minutos en lugar de 4.5 horas para mejorar la astringencia de la selección. Después de la elución de los complejos de fagos de MT-SP1-AT3SLGR~KI unidos como se describió anteriormente, alícuotas de 50 µ? de fagos eluidos se utilizaron para infectar 3 mi de células activamente crecientes E.coli TG1 (A600 = 0.5; 0.5 OD= -1.5 x 108 colonias/ml) por 20 minutos a 37°C. Las bacterias infectadas se colocaron en placas en placas grandes (245 mm x 245 mm) que contienen carbenicilina (75 g/ml) y se incubaron a 30°C durante la noche. A la mañana siguiente las placas se recolectaron. Las colonias en cada placa se contaron y compararon con la placa antecedente que no contuvo inhibidor AT3SLGR-K1. Los resultados de los conteos de colonia se describen en la tabla 20.

TABLA 20: Resultados de Selección de Segunda Generación Concentración de Colonias de segunda Relación de AT3SLGR-KI en ronda de selección ; Enriquecimiento reacción (antecedente) Comparada con Antecedente AT3SLGR-KI 18 ?? 2476 (165) 15: 1 AT3SLGR-KI )JM 1750 (90) 19:1 AT3SLGR-KI 0-1g µ? 2012 (110) 18 : 1 AT3SLGR-KI 0.OI8 µ? 1824 (89) 21: 1 Las colonias se escogieron para caracterización adicional. Las células crecieron en 2 mi de 2x YT suplementado con carbenicilina (100 yg/ml) y tetraciclina (10 pg/ml) y la precipitación de fagos se realizó como se describe (Sambrook, J et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold spring Harbor laboratory) . Los fagos seleccionados se probaron para actividad enzimática contra un sustrato Ac-SLGR-ACC. Adicionalmente, los fagos seleccionados se seleccionaron para resistencia a inactivación por AT3 tipo silvestre o Plasma.

EJEMPLO 7 Expresión y purificación de Inhibidores AT3 mutantes A. Generación de AT3 variante Las proteínas AT3 mutantes para uso como trampa de proteasa "sustratos cebo" se crearon introduciendo modificaciones en la secuencia de aminoácido del bucle central reactivo (RCL) de AT3 usando la región codificante de gen antitrombina III humana (AT3) (SEC ID NO: 612, comprado de Origene Technologies, Catálogo # TC110831); como un modelo. El ADNc de AT3 se amplificó por PCR usando el cebador delantero que tiene la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEC ID NO: 626: GTCACTGACTGACTGACGTGGATCCCACGGGAGCCCTGTGGACATC (la cual contiene una secuencia de relleno (mostrada en negrillas arriba), un sitio BamHl (mostrado en cursivas), y una porción que híbrida al gen AT3 (mostrado en el texto sin formato) ) , y un cebador inverso que tiene la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEC ID NO: 628: GTAGCCAACCCTTGTGTTAAGGGAGGCGGAAGCCATCACCACCATCACCACTAAGAATT C. Después de la amplificación, el ADNc se subclonó en el vector de transferencia de baculovirus pAcGP67b (BD Biosciences SEC ID NO: 94) usando sitios de restricción Bam y EcoRI . Ya sea una marca 6x-His C-terminal (SEC ID NO: 496) o marca FLAG C-terminal (DYKDDDDK; SEC ID NO: 495) se agregó durante esta etapa de subclonación de modo que los mutantes AT3 más tarde se podrán aislar por purificación de afinidad. Las secuencias de nucleótido y aminoácido de la proteína de fusión AT3 clonada, que contienen AT3 fusionada a la marca 6xHis usando un enlazante de cuatro aminoácidos GGGS (SEC ID NO: 620) se describen en las SEC ID NOs:613 y 614, respectivamente. Para hacer sustratos de cebo AT3 mutantes para aislar proteasas objetivo con varias especificidades, las reacciones de mutagénesis se realizaron usando el kit de mutagénesis de sitio dirigido Quilkchange® (Stratagene) siguiendo las condiciones especificadas por el proveedor para introducir residuos aminoácidos de secuencias de escisión objetivo en lugar de la secuencia de bucle de centro reactivo (RCL) de AT3 tipo silvestre, IAGRSL (SEC ID NO: 478) (residuos aminoácido 422-427 de la secuencia de polipéptido de AT3 precursora descrita en la SEC ID NO: 5, y residuos aminoácidos 390-395 de la secuencia de polipéptido de AT3 madura descrita en la SEC ID NO: 93) . Tal mutante, AT3 (AT3/RRVR-KE) (SEC ID NO: 497), se hizo reemplazando los residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácido de IAGRSL tipo silvestre con residuos aminoácidos RRVRKE (SEC ID NO: 498) de una secuencia de escisión de VEGFR2 de objetivo. Otro mutante, AT3 (AT3/SLGR-KI) (SEC ID NO:499), se hizo reemplazando la secuencia de aminoácido de IAGRSL tipo silvestre con residuos aminoácido SLGRKI (SEC ID NO: 479) de una secuencia de escisión de proteina C2 de complemento de obj etivo . Para la PCR Quikchange®, el cebador RCL de AT3 tipo silvestre tuvo la siguiente secuencia de ácidos nucleicos, la cual se describe en la SEC ID NO: 630: GCTGCAAGTACCGCTGTTGTGATTGCTGGCCGTTCGCTAAACCCCAACAGGGTGACTTT C. El cebador de secuencia objetivo C2 de complemento tuvo la siguiente secuencia de ácidos nucleicos, la cual se describe en la SEC ID NO.: 632: GCTGCAAGTACCGCTGTTGTGTCGTTAGGCCGTAAAATTAACCCCAACAGGGTGACTTT C. El cebador de secuencia objetivo VEGFR2 tuvo la siguiente secuencia de ácidos nucleicos, la cual se describe en la SEC ID NO.: 634: GCTGCAAGTACCGCTGTTGTGCGCCGTGTGCGCAAAGAAAACCCCAACAGGGTGACTTT C. Los vectores que contienen el ADNc de AT3 tipo silvestre y vectores que contienen el ADNc de AT3 mutante fueron transformados y amplificados en células de supercompetentes XL-l-Blue (Stratagene) . El ADN de plásmido se purificó de células usando el ki Qiagen Plasmid Maxi (Qiagen) siguiendo las condiciones especificadas por el proveedor.

B. Expresión de mutantes de AT3 Se utilizaron células de insecto Sf9 para expresar y purificar proteínas AT3 mutantes y tipo silvestre marcadas con FLAG y marcadas con His usando los vectores de transferencia pAcGP67b que contienen AT3 descritos anteriormente. Las células Sf9 se adaptaron para crecimiento en medio libre de suero SF900 II (Invitrogen) y crecieron a 85-90% de confluencia en platos de 35 mm. Las células fueron transfectadas usando el sistema de expresión de baculovirus FlashBac® (Oxford Expression Technologies) siguiendo las condiciones y protocolo especificados por el proveedor. 50 ng del vector de transferencia AT3 y 500 ng del vector de recombinación FlashBac® se pre-incubaron por 20 min con 5 µ? de reactivo de transfección Cellfectin® (Invitrogen) en 1 mi de medios libres de suero SF900 II sin antibióticos, luego se aplicó por goteo a las células. Cinco (5) horas después de la transfección, las células se centrifugaron y resuspendieron en 2 mi de medio libre de suero SF900 II con antibióticos (antibiótico/solución antimicótica ; Cellgro) y se incubaron a 28°C por 4 dias. El virus se expandió en células Sf9 a una titulación máxima de 1 x 106 pfu/ml, como se determina por ensayo de placa. Al AT3 recombinante luego se expresó usando la linea células de insecto High Five® (BTI-TN5B1-4 ) (Invitrogen) y medios libres de suero Excell™ 405 (JRH Biosciences ) . Las células fueron infectadas a una multiplicidad de infección (MOI) entre 0.1 y 1 y crecieron en 300 mi de volúmenes de cultivo en matraces Erlenmeyer de 1 L por 4-5 dias, sacudiendo a 125 RPM en una plataforma de sacudimiento orbital .

C. Purificación basada en afinidad de proteínas AT3 tipo silvestre y mutantes Para la purificación basada en afinidad de proteínas AT3 marcadas con His, los sobrenadantes de los cultivos del ejemplo 7B se limpiaron por centrifugación y filtración usando un filtro 0.45 µ? y se dializaron en un amortiguador que contiene Fosfato de Sodio 50 mM pH 7.5, NaCl 300 mM. La proteína se purificó por cromatografía de columna usando el aparato de cromatografía BioLogic Duoflow™ (Bio-Rad) y 10 mi de resina de afinidad de metal cobalto TALON® (Clontech) . La proteína marcada con His unida a resina se eluyó con un gradiente lineal de Fosfato de Sodio 50 mM pH 7.5, NaCl 300 mM y Fosfato de Sodio 50 mM pH 6.5, NaCl 300 mM, imidazol 150 mM. Las fracciones que contienen proteína se combinaron y dializaron en amortiguador de almacenamiento AT3 (Fosfato de Sodio 50 mM pH 6.5, NaCl 300 mM, 5% glicerol) . Para demostrar que la preparación de AT3 purificada contuvo proteína activa, un ensayo de inhibición de MT-SP1 (titulación de sitio activo) , como se describe en la presente, en el ejemplo 14 posterior, se realizó para medir la capacidad de la AT3 dializada para inhibir la capacidad de MT-SP1 para desdoblar un sustrato. La mezcla de reacción de este ensayo de inhibición de MT-SP1 se valoró cinéticamente para escisión de sustrato Ac-RQAT-ACC (Acetil-Arg-Gln-Ala-Arg- ACC) 0.4 mM (síntesis habitual) en un SpectraMax® (Lector de Microplacas SpectraMax® M5, Molecular Devices) (Molecular Devices, Inc.). El "ACC" en el nombre de este sustrato se refiere al grupo saliente 7-amino-4-carbamilmetilcumarina . El grupo saliente ACC se detectó a longitudes de onda de Excitación (Ex) = 380, Emisión (Em) = 450 y corte (c/o) = 435. El rendimiento total de proteína AT3 marcada con His purificada fue aproximadamente 1-3 mg/ml . La purificación basada en afinidad de proteínas AT3 marcadas FLAG, los sobrenadantes de los cultivos se limpiaron por centrifugación y filtración como se describió anteriormente. El sobrenadante limpio se dializó en Solución salina amortiguada con Tris (TBS) pH 7.4 y se agregó a un matraz Erlenmeyer de 1 L nuevo en un volumen total de 300 mi. Se agregaron 2 mi de gel de afinidad M2 anti-FLAG pre-equilibrado (Sigma) , y el volumen total se incubó en una plataforma de sacudimiento orbital a 125 RPM por 3 horas a 4°C. La proteína AT3 marcada con FLAG unida a resina se colectó por gravedad usando una columna de cromatografía de 20 mi fritada (Bio-Rad) . La resina se lavó una primera vez con 5 mi de TBS. La proteína AT3 luego se eluyó agregando 10 mi de TBS que contienen 0.2 mg/ml · de péptido FLAG (Sigma) . El eluido se concentró y dializó en amortiguador de almacenamiento AT3 (Fosfato de sodio 50 mM pH 6.5, NaCl 300 mM, 5% glicerol) y la actividad se sometió a ensayo como anteriormente, usando un ensayo de inhibición (titulación de sitio activo) de matriptasa (MT-SP1) como se describió anteriormente y en el ejemplo 14A posterior. El rendimiento total de la proteina AT3 marcada con FLAG purificada fue aproximadamente 0.5-1 mg/L . Estas proteínas AT3 marcadas con FLAG y His purificadas se utilizaron como trampas de proteasa para identificación de proteasas que reconocen las secuencias de sitio objetivo particulares, por ejemplo, en los métodos descritos en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 8 Construcción de bibliotecas de visualización de fagos de variantes de proteasa A. Clonación de dominio de proteasa MT-SP1 C122S y tipo silvestre (cadena B) en el vector de visualización de fagémido pMal-C2 El ADNc (SEC ID NO: 504) que codifica un dominio de proteasa MT-SP1 madura (MT-SP1 B-cadena) (SEC ID NO: 505), el cual contiene aminoácidos 615-854 de la proteína MT-SP1 de longitud completa descrita en SEC ID NO: 253 se clonó, usando los sitios de restricción Ndel y HindIII, en un vector pMal-C2 (SEC ID NO: 615) (New England Biolabs) , el cual contiene una secuencia guia STII (TGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAA CGCGTATGCA (SEC ID NO. : 636) para facilitar la secreción, y ácidos nucleicos que codifican un dominio C-terminal de genlll de fagos M13 filamentoso (SEC ID NO: 616). El ADNc de dominio de proteasa MT-SP1 se insertó entre la secuencia guia y el dominio Genlll de modo que el constructo final contuvo la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEC ID NO: 510, la cual codifica una proteina de fusión de Genlll N-terminal de MT-SP1. La secuencia de aminoácido codificada (SEC ID NO: 506) de esta proteina de fusión se describe posteriormente, con la secuencia guia STII (SEC ID NO: 511) en texto sin formato, el dominio MT-SPl maduro en negrillas y dominio de Genlll C-terminal (SEC ID NO: 512) en cursivas. El * indica la presencia de un codón de terminación en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina. SEC ID NO . : 506 : mkkniafllasmfvfsiatnayawggtdadegewpwqvslhalgqghicgaslispnwlvsaahcyi ddrgfrysdptqwtaflglhdqsqrsapgvqerrlkriishpffndftfdydiallelekpaeyssmvr piclpdashvfpagkaíwvtgwghtqyggtgalilqkgeirvinqttcenllpqqitprmmcvgflsg gvdscqgdsggplssveadgrifqagwswgdgcaqrnkpgvytrlplfrd ikentgvígí¾gg-f egggsegggsegggsgggsgsgdfdyekmanankgamfenadenalqsdakgkldsvatdygaaidgf igdvsglangngatgdfags qmaqvgdgdmplmnnfrqylpslpqsvecrpfofsagkpyefsidcdk mlfrgvfafllyvatfmyvfstfanilrnkes* Además de la proteína de fusión de cadena B MT-SP1 tipo silvestre, una proteína de fusión de Genll de variante (CB469) de cadena B MT-SP1 se generó usando el método descrito anteriormente. La secuencia de aminoácido de variante CB469, descrita en la SEC ID NO: 507, se generó sustituyendo una serina por la cisteína en la posición 122 (basado en la numeración de quimiotripsina) de la secuencia de dominio de proteasa MT-SP1 tipo silvestre, la cual se muestra en la secuencia anterior en cursivas y se describe en la SEC ID NO: 505. Esta secuencia de CB469 se clonó en el vector pMal-C2 como se describió anteriormente. Para lograr la visualización mejorada, el vector de fagémido que contiene ácidos nucleicos que codifican esta proteína de fusión MT-SP1 variante se utilizó para generar las bibliotecas de visualización de fagos mutantes de MT-SP1 como se describe en el ejemplo 8B posterior.

B. Mutagénesis de dominios de proteasa para la generación de bibliotecas de visualización de fagos mutantes La generación de bibliotecas de visualización de fagos que contienen dominios de proteasa mutados se hizo usando protocolos de mutagénesis de PCR propensa a error estándar que son conocidos en la técnica (Matsumura et al., ethods Mol Biol. 2002; 182:259-67; Cirino et al., Methods Mol. Biol. 2003; 231:3-9) como se ejemplifica posteriormente . 1. Mutagénesis de proteínas de fusión MT-SPl de cadena B Para la construcción de proteínas de fusión que contienen MT-SPl mutante, el ADNc de CB469 MT-SPl se amplificó del vector pMal-C2 por PCR propensa a error usando el kit de Mutagénesis Aleatoria de PCT Diversify® (BD Biosciences, Clonetech) y siguiendo las condiciones sugeridas por el proveedor para obtener cinco (5) mutaciones por kilobase. El cebador delantero MT-SPl usado en esta PCR, que tiene la secuencia de ácidos nucleicos descritos en la SEC ID NO:508): GCGCAGATATCGTACCGCATATGAAAAAGAArATCGCArrrcrr, se diseñó para hibridarse dentro de la secuencia guía STII (con los residuos mostrados en cursivas) y contuvo una secuencia de sitio de restricción Nde (mostrada en negrillas). El cebador inverso MT-SPl, que tiene la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEC ID NO: 509: GTGCATGCTGACTGACTGAGCTCCCGCrTACCCCAGTGrrcrC, se diseñó para hibridarse dentro de la porción 3 ' de la secuencia que codifica el dominio proteasa MT-SPl (con los residuos mostrados en cursivas) y contuvo una secuencia de sitio de restricción Sacl (mostrada en negrillas). 2. Purificación de productos de mutagénesis La polimerasa Taq enlaza estrechamente a ADN y por consiguiente no es completamente removida por el kit de purificación de PCR Qiagen; y su presencia puede interferir con las digestiones de restricción cadena abajo de productos de PCR (Crowe et al., Nucleic Acids Res. 1991 Enero 11, 19(1) : 184; Wybranietz et al., Biotechniques (1998) 24, 578-580) . Por consiguiente, para remover la polimerasa Taq de los productos de PCR mutantes y tipo silvestre amplificados del ejemplo 8B(1), previo a su purificación, los siguientes se agregaron a la reacción: EDTA 5 mM, 0.5% SDS, 50 ng/µ? de proteinasa K. Para eliminar la polimerasa Taq, la mezcla se incubó a 65°C por 15 minutos. Para asegurar que no existió modelo tipo silvestre remanente (el cual podría potencialmente interferir con los métodos de selección descritos posteriormente) , el producto de PCR se purificó para remover el ADN modelo. Para separar el vector del producto de PCR, las muestras se cargaron sobre un gel de agarosa al 1% en la presencia de 10X Amortiguador de Carga de Gel Anaranjado G (New England Biolabs) el cual no co-emigra con la escala o producto de PCR. El producto de PCR fue extirpado del gel usando un escalpelo. El producto extirpado se purificó usando ya sea los protocolos de Kit de Extracción de Gel QIAquick® (Qiagen) o el Kit de Extracción de Gel Zymoclean™ (Zymoclean CA, Cat# D4001) siguiendo las condiciones especificadas por el proveedor . Para el kit de Extracción de Gel Qiagen, el fragmento de gel extirpado se solubilizó en Amortiguador QG y pasó lentamente a través de una columna Qiagen QG, cada uno de los cuales tiene una capacidad de enlace de aproximadamente 5 - 10 iq, y no se retuvo más de 2 mi. Un número de columna suficiente se utilizó para acomodar el volumen completo de material de partida. Las columnas se centrifugaron en tubos colectores a 14,000 rpm para remover cualquier Amortiguador QG residual. Se agregaron 0.7 mi de Amortiguador PE a cada columna y las muestras se incubaron por 2-5 minutos. Las columnas luego se centrifugaron dos veces, por 1 minuto adicional, a 13,000 rpm para remover todo el amortiguador PE residual. Las muestras fueron transferidas en un nuevo tubo de microcentrifuga de 1.5 mi, seguido por adición de 50 µ? de H20 e incubación por dos minutos. El ADN unido se eluyó por centrifugación a 7000 rpm. En rendimiento típico estuvo entre 30%. y 60% de la cantidad de muestra de partida . Para el Kit de Extracción en Gel Zymoclean™, se utilizaron ya sea una o más columnas de Kit de Extracción en Gel Zymoclean™ del Kit Zymoclean™ DN Clean & Concentrator (cada una de las cuales tiene una capacidad de 25 pg) , dependiendo de la cantidad de material de partida. Usando este kit, el fragmento de ADN extirpado se transfirió a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mi, seguido por adición de tres (3) volúmenes de ADB Buffer™ a cada volumen de agarosa extirpada del gel. Las muestras se incubaron a 37-55°C por 5-10 minutos hasta que el gel sílice se disolvió completamente. La solución de agarosa disuelta se transfirió a una Columna Zymo-Spin I™ en un Tubo de Colección y se centrifugó a al menos 10,000 rpm por 30-60 segundos. El flujo a través de la columna se descartó. Se agregaron 200 pL de Amortiguador de Lavado a la columna y se centrifugó a al menos 10,000 rpm por 30 segundos. El flujo pasante se descartó y la etapa de lavado se repitió. Se agregaron 50 L de agua directamente a la matriz de columna. El mínimo volumen de elución fue 10 L para la columna de Extracción en Gel Zymoclean™ y 35 mi para la columna DNA Clean & Concentrator. La columna se colocó en un tubo de 1.5 mi y se centrifugó a al menos 10,000 rpm por 30-60 segundos para eluir el ADN. Después de la elución usando uno de estos dos métodos, las muestras se agruparon y la concentración de ADN se valoró midiendo la absorbancia de la muestra a 260 nm en una cubeta de UV d 70 µ?, usando un espectrofluorómetro . La concentración de ADN se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: 1A260 = 50 ng/µ? de ADN.

C. Construcción de bibliotecas de fagos mutantes proteasa usando el vector de fagémido pMal-C2. Para construcción de bibliotecas de visualización de fagos que expresan dominios de proteasa, los productos de PCR digeridos, tales como aquellos obtenidos de la mutagénesis de PCR de proteasa y purificación descrita en el ejemplo 8A y B anterior, fueron ligadas en el vector de fagémido pMal-C2 descrito anteriormente. Para este proceso, el vector fue digerido usando Ndel y Sacl, y el producto se purificó en gel y combinó en una reacción de ligación (descrita posteriormente) con los productos de PCR digeridos por restricción, purificados. El peso molecular (P ) del fagémido pSTII-g3 pMal-C2 purificado en gel, digerido por Ndel/Sacl es de 5835 pares base (bp) ; el PM del producto de PCR MT-SP1 digerido por Ndel/Sacl es 806 bp. Típicamente, para una reacción de ligación de 2 mi, 7.58 g de vector de corte fue aproximadamente 1 nM de vector y 3.14 pg de producto MT-SP1 de corte fue aproximadamente 3 nM producto de inserción. Para la ligación de los productos MT-SP1, 40 µ? (3 nM, 3.14 pg) del producto purificado digerido se mezclaron con: 40 µ? (1 nM, 7.58 pg) de vector purificado digerido; 1510 µ? de H20; 400 µ? 5X de Amortiguador de ADN Ligasa T4 (Gibco) ; y 10 µ? (10 unidades) de ADN Ligasa T4 (New England Biolabs) . La reacción de ligación se realizó durante la noche a 16°C o a temperatura ambiente por 4 horas en un volumen de 2 mi. Después de la ligación, la ADN Ligasa fue inactivada con calor incubando la mezcla de reacción de ligación a 65°C por 15 minutos seguido por adición de 4 mi de Amortiguador de Enlace de ADN ZymoResearch. Esta muestra luego se agregó, 800 µ? a la vez, a una Columna ZymoResearch con 25 µg . La columna se lavó dos veces con 600 µ? de Amortiguador de Lavado ZymoResearch y se eluyó con 50 µ? de agua, la cual se ha pre-calentado a 42°C. El porcentaje de recuperación de ADN se valoró midiendo la absorbancia de la muestra de elución diluida (3 µ? de elución en 70 µ? de H20) a 260 nm usando un espectrofluorómetro . Por ejemplo, para los 3 mi de ligación anteriores, si el A260 correspondió a 0.12 = 140 ng/µ?, entonces el rendimiento total se determinó que es aproximadamente 7 µ? (lo cual es aproximadamente 70% de recuperación de ADN de la ligación) . El producto de ligación fue electroporado en células XL-1 blue, las cuales pueden acomodar aproximadamente 500 ng/µ? por electroporación . 7.5 µ? de una ligación de 140 ng/µ? se agregaron por 200 µ? de Células XL-1 Blue (Stratagene) . Las células se agregaron a una cubeta de abertura de 0.2 cm y se electroporaron en un Gene Pulsar (Bio-Rad, CA) usando las siguientes condiciones: Voltaje (V) = 2500, Capacitancia = 25 (uF) , Resistencia = 200 ohms . Inmediatamente después de la electroporación, 1 mi de medio SOC (Invitrogen) se agregó a la cubeta. Las células luego se transfirieron a 25 mi de medio SOC y se incubaron a 37 °C por 20 minutos. Después de esta incubación cinco (5) alícuotas pequeñas (100 microlitros) diluciones de 100 veces en serie de las células se hicieron y colocaron en placas en pequeñas placas de agar 2YT Carbenicilina y se incubaron durante la noche a 37 °C para contar el número de colonias (representativo del número de clones de la biblioteca generada por electroporación) . En un método, el volumen de cultivo remanente se centrifugó para hacer pelotillas las células seguido por resuspensión en 12 mi de amortiguador SOC y se colocaron en placas sobre grandes placas de agar (245 mm X 245 mm) suplementado con Carbenicilina (75 pg/ml) y de dejó crecer durante la noche a 30°C.

Alternativamente, preparar fagos madre de la biblioteca, las células se adicionaron directamente a 500 mi de medio 2YT suplementado con Carbenicilina (75 yg/ml) con fagos auxiliadores M13K07 a lx 1010 CFU'/ml y se hicieron crecer durante la noche a 37 °C.

EJEMPLO 9 Selección de dominios de proteasa variante de bibliotecas de fago de dominio de proteasa usando trampas de proteasa A 3 mutante A. Selección de complejos MT-SPl fago/AT3 mutante y ensayo de lectura basado en, ELISA En este ejemplo, un inhibidor AT3 mutante que contiene la secuencia de escisión objetivo de complemento C2 SLGRKI, como se describió en el Ejemplo 7 anterior, se utilizó como el "sustrato de cebo" en un experimento cribado diseñado tanto para aislar como proporcionar una lectura para la presencia de fagos que llevan MT-SPl mutantes con reactividad mejorada hacia la secuencia de escisión objetivo. Los fagos se aislaron de grandes bibliotecas de exhibición de fago MT-SPl combinatorial producidas como se describe en los Ejemplos 8A, 8B y 8C anteriores, usando el siguiente procedimiento. 1. Interacción con y escisión de variantes AT3 por fagos que llevan MT-SPl mutantes Los mutantes MT-SPl enlazados al fago de bibliotecas de fago se seleccionaron primero usando AT3 mutante que tiene el sitio de escisión objetivo como sigue. Cada reacción de escisión se realizó en cavidades duplicadas de una placa de poliestireno de 96 cavidades (Nunc Maxysorp) por 60 minutos a 37°C, incubando los siguientes componentes de reacción en un volumen de 70 µ?: 35 µ? de fago de biblioteca MT-SP1 a 3.14E12 CFU/ml; 7 µ? 10X MT-SP1 Amortiguador de Actividad (0.5 M Tris-HCl, pH 7.4, 1M, NaCl, 1% Tween20); 7 µ? 10 µ? de Heparina de Bajo Peso Molecular (BD Biosciences) ; 14 µ?, H20; y 7 µ? de mutante AT3-SLGRKI marcado en His. Las reacciones de escisión individuales se realizaron con las siguientes concentraciones de AT3-SLGRKI diferentes: 100 nM, 33 nM, 11 nM, 3.3 nM, 1.1 n y 0.33 M. Cada reacción se terminó con la adición de 2 µ? 100 mg/ml del inhibidor de proteasa fluoruro de 4 - ( 2-aminoetil ) -bencensulfonilo (Pefabloc, Roche Diagnostics ) . 40 µ? de una solución de 0.275% Tween 20, 0.55% BSA, luego se adicionó y mezcló a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. 2. Captura de complejos de fago MT-SP1-AT3 usando anticuerpo anti-His Mientras tanto, las cavidades en otra placa de poliestireno de 96 cavidades (Nunc Maxysorp) se revistieron por 1 hora con sacudimiento a temperatura ambiente con 100 µ? de 5 ng/µ? de estreptavidina (Pierce) en 0.2 M de Amortiguador de Carbonato (pH 9, Pierce) . Las cavidades se lavaron entonces tres veces con 250 µ? de PBST, se bloquearon con 200 µ? de 0.2% de BSA en PBS por 2 horas a temperatura ambiente, se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente con 100 µ? de Sng/µ? de anticuerpo Anti-6HIS biotinilado para capturar mutantes AT3 marcado en His, y lavado a fondo con PBST. Cada muestra de fago MT-SP1 mutante de la reacción de escisión AT3 en el Ejemplo 9A(1) entonces se adicionó en duplicado a la placa de 96 cavidades revestidos y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entonces 14 veces con 250 µ? PBST. 3. Lectura basada en ELISA para selección de complejos de fago MT-SP1-AT3 Después del lavado, la primera de las dos hileras en la placa de microtitulación se usó para realizar un ensayo ELISA ( Inmunoensayo Enlazado a la Enzima) para obtener una lectura de captura de fago. A cada cavidad en esta hilera, 100 µ? de una dilución 1:5000 de un anticuerpo de fago anti M13 conjugado con HRP (GE Healthcare) se adicionaron y se dejaron unirse por una hora. Las cavidades en esta hilera se lavaron entonces 8 veces usando una lavadora de placa Skanwasher (Molecular Devices), seguido por adición de 100 µ? de solución de sustrato de TMB/peróxido (Pierce) y se incubaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Esta reacción se enfrió con 100 µ? de 2M H2S04 y se probó en un lector de placas SpectraMax® (Molecular Devices) por absorbencia a 450 nM. Esta lectura se utilizó como un sustituto para la presencia de complejos fagos-AT3. En este ensayo, se observó un incremento dependiente de la concentración en absorbencia (basado en concentraciones de incremento de cebo AT3-SLGRKI usado en la reacción de escisión en el Ejemplo 9A(1)). Además, cuando el proceso se realizó usando rondas sucesivas de cribado como se describió en la presente, se observó absorbencia incrementada después de cada ronda, indicando que este método de cribado podría enriquecer sucesivamente el grupo de fagos para afinidad de sitio de escisión objetivo. Estos datos sugieren que este método se puede usar para seleccionar, a partir de una biblioteca de fagos, proteínas de fusión de dominio proteasa mutante que tienen afinidad para una secuencia objetivo particular. El ensayo de ELISA proporciona un método para obtener una lectura para esta selección y enriquecimiento, usando la misma placa de 96 cavidades que se utilizó para captura basada en afinidad y elución subsecuente descrita en el Ejemplo 9A(4) posterior . 4. Elución de fagos MT-SPl seleccionados La segunda de las dos hileras de duplicado de la placa de microtitulacion del Ejemplo 9A(2) luego se usaron para eluir fagos específicamente unidos para uso en purificación y selección subsecuentes. A cada cavidad en esta hilera, se adicionó 100 µ? 100 mM HC1 y se incubaron por 5 minutos para eluir los fagos específicamente unidos. El eluido de fagos resultantes se adicionó a una cavidad separada que contiene 33 µ? de lM:Tris pH 8 para neutralización ácida previo a la infección. Los 133 µ? de mezcla de fagos neutralizados se adicionaron entonces a 1 mi de células XL-1 Blue que crecen en un OD600 de 0.5, las cuales se incubaron a continuación por 20 minutos a 37°C y se colocaron en placas sobre placas de agar 2xYT (245 mm x 245 mm) suplementado con Carbenicilina . Estas células se usaron en métodos de selección, secuenciado y purificación subsecuentes, como se describe en los Ejemplos posteriores . Este método de selección y ensayo basado en ELISA también se utilizó para seleccionar y valorar mutantes uPA de bibliotecas uPA, tales como aquellas descritas en los Ejemplos 2 y 3 anteriores.

B. Purificación de fagos que llevan el dominio de proteasa seleccionados Este Ejemplo describe un método para aislar sobrenadantes de fagos que han sido seleccionados usando inhibidores de cebo. Se determinaron los tituladores (cfu/ml) de fagos seleccionados, tales como aquellos recuperados en el Ejemplo 9A anterior. Los fagos madre se diluyeron con PBS y usaron para infectar células de E.coliXL-1 Blue, que crecen a un OD600 de 0.5 o aproximadamente 2.1 x 108 células/ml. El intervalo de inefectividad deseado fue 1000-2000 colonias por placa. Las células infectadas se colocaron en placas sobre agar 2YT complementado con 100 g/ml de Carbenicilina en portaobjetos de BioEnsayo de poliestireno de 245 mm x 245 mm cuadrados y se deja crecer por 16-20 horas o hasta que el tamaño de la colonia fue de aproximadamente 2 mm de diámetro. Usando un Recogedor de Colonia automatizado, colonias individuales se recogieron y se dispersaron en cavidades en una placa de polipropileno de 96 cavidades, cada cavidad que contiene 150-170 ul de medio 2YT complementado con 100 pg/ml de Carbenicilina y 12 µq/ l de Tetraciclina . Las cavidades de control se inocularon con células infectadas con ya sea fagos modelos (fagos que tienen un dominio de proteasa que se ha usado como el modelo para mutagénesis) o con proteínas de fusión que contienen fagos que contienen variantes de proteasa inactiva. Las placas inoculadas se sellaron con una membrana permeable al aire, colocada en una incubadora HiGro (GeneMachines ) y se agitaron a 400 rpm a 37°C por 14-20 horas. Después de la incubación, para obtener células de fase log, 100 µ? de cada cavidad se utilizaron para inocular una cavidad en una placa de cavidades de 96 cavidades profunda que contiene 1 mi de medio 2YT complementado con 100 yg/ml de Carbenicilina y 12 yg/ml de Tetraciclina . La placa de cavidades profundas se selló entonces con una membrana permeable al aire y se colocaron en el incubador HiGro® con sacudimiento a 400 rpm a 37 °C con aireación de oxigeno hasta que la densidad de las células alcanzó un OD600 de entre 0.4 y 0.6. Un periodo de incubación típico fue entre 4 y 5 horas. Después de la incubación, 100 µ? de fagos madre auxiliadores se adicionaron a cada cavidad y las placas se sellaron y se sacudieron de nuevo a 400 rpm por 5-10 minutos a 37°C. Después de los 5-10 minutos de sacudimiento, la placa se incubó a 37 °C en un estado estático sin sacudimiento por 30-45 minutos. El sacudimiento se resumió entonces a 400 rpm por 15-30 minutos a 37°C. Seguido de sacudimiento, 100 µ? de solución de canamicina (400 yg/ml) se adicionó a cada cavidad para producir una concentración final de 33.3 yg/ml de cada cavidad. La placa se reselló, y se sacudió a 400 rpm a 37°C por 12 - 16 horas. Para hacer pelotillas las células, la placa se centrifugó entonces a 3500-4500 rpm por 20 minutos a 4°C. Después de la centrifugación, sobrenadantes, los cuales contuvieron fagos aislados, se utilizaron ya sea inmediatamente para selección como se describe en los Ejemplos posteriores, o primero se almacenaron a 4°C.

C. Precipitación de polietilenglicol (PEG) de sobrenadantes de fagos de dominio proteasa Este Ejemplo describe un método para remover actividad de proteasa antecedente potencialmente contaminante (a la cual algunos ensayos de caracterización descritos en la presente posteriormente son sensibles) en sobrenadantes de fagos seleccionados purificados usando precipitación de Polietilenglicol. En este método, después del rescate los sobrenadantes de fagos que llevan MT-SP1 (tales como aquellos seleccionados y eluidos en el Ejemplo 9A) durante la noche (12-16 horas) con muestras de fagos auxiliadores se centrifugaron por 20 minutos a 4°C a 3500-4500 rpm y 1000 µ? de sobrenadante se removieron de cada cavidad y se transfirieron a una cavidad en otra placa de cavidades profundas de 96 cavidades. Para la precipitación, 250 µ? de una solución que contiene 20% PEG (por volumen) en 2.5 NaCl se adicionaron a cada cavidad. La placa se selló y mezcló por inversión vigorosa, y luego se colocó en un baño de agua con hielo y se dejó estático por 1-2 horas. La placa se centrifugó entonces por 60 minutos a 4500 rpm o por 90 minutos a 3500 rpm. La solución de sobrenadante de cada cavidad se decantó y la placa se secó suavemente y se dejó drenar por 20-30 minutos. El precipitado resultante se volvió a suspender usando PBS a un equivalente de volumen final a 20% del volumen de sobrenadante de fagos originales (200uL) para producir un concentrado de 5 veces. Este material se utilizó ya sea inmediatamente en ensayos descritos posteriormente, o almacenados a 4°C hasta que esté listo para la prueba.

EJEMPLO 10 Selección de fagos que llevan dominio de proteasa que tienen reactividad incrementada ? eficiencia catalítica hacia secuencias de sustrato objetivo Las preparaciones de fago individuales, tales como aquéllas descritas en el Ejemplo 9B y 9C, se utilizaron en varios ensayos para determinar su especificidad y/o actividad.

A. Análisis de fagos que expresan variantes de dominio de proteasa moni oreando la inhibición de hidrólisis de péptido fluorogénico por proteínas de cebo Como una aproximación para valorar clones de fagos que llevan proteasa mutante, se puede realizar un ensayo de inhibición bioquímico comparando la capacidad de un inhibidor (cebo serpina) para inhibir la actividad del dominio de proteasa de variante seleccionada con su capacidad para inhibir la actividad del dominio de proteasa modelo (es decir, la "proteasa parental") que se utilizó originalmente en construcción de biblioteca de fagémidos . Con esta aproximación, la capacidad de fagos que llevan proteasa mutante, tales como aquéllos recuperados en el Ejemplo 9 anterior, para desdoblar un sustrato fluorogénico que contiene una secuencia de sustrato objetivo se valora en la presencia y en la ausencia de una concentración dada de cebo inhibidor, y comparado con la capacidad del dominio de proteasa templado para desdoblar la misma secuencia en la presencia del mismo cebo. El uso de sustratos de péptido fluorogénico es un método de rutina para la determinación de especificidad de proteasa (zimmerman et al. (1977) Anal Biochem, 78:47-51; Harris et al. (2000) PNAS, 97:7754-7759) . Para análisis de inhibición de mutantes de cadena B de MT-SP1 comparado con la inhibición de modelo de cadena B de T-SP1 (usada para mutación en el Ejemplo 8B(1)), la variante AT3 (con una secuencia objetivo deseada) se puede usar como el inhibidor y Ac-RQAR-ACC se puede usar como el sustrato. En este sustrato, la escisión especifica del enlace de anilida libera el grupo de escisión de ACC fluorescente, que proporciona un medio eficiente para determinar las velocidades de escisión para sustratos individuales . En un ejemplo de tal ensayo, la capacidad de fagos que llevan proteasa uPA, tales como aquéllos recuperados en el Ejemplo 3 anterior, para desdoblar el sustrato fluorogénico Ac-AGR-AMC (SEC ID NO.: 617) se valoró en la presencia y en la ausencia de una concentración dada de cebo PAI . Como se describió anteriormente, el uso de un sustrato de péptido fluorogénico de 7-amino-4-metilcumarina (A C) es un método de rutina para la determinación de especificidad de proteasa. En este ejemplo, 35 µ? de sobrenadante de fagos (tales como aquéllos obtenidos como se describió en el Ejemplo 3(A)) se transfirieron a tanto una cavidad de ensayo designada y una cavidad de control designada en una placa de Polipropileno de 384 cavidades (CoStar, #3658). 35 µ? de 2x Amortiguador de Ensayo Indirecto que contiene el mismo cebo PAI usado en la selección se adicionó a las cavidades de ensayo. La concentración de cebo fue la misma que se utilizó en la selección. 35 µ? de 2x Amortiguador de Ensayo Indirecto (sin inhibidor) se adicionaron a las cavidades de control correspondientes. Las placas se incubaron a 37 °C por 60 minutos. Después del mezclado de los fagos con inhibidor o amortiguador de control, 10 µ? de un sustrato de péptido fluorogénico AGR-AMC, diluido a una concentración de ensayo final de 60 µ? en Amortiguador de Ensayo Indirecto, se agregó a las cavidades. La fluorescencia se midió usando un Lector de Placas Molecular Devices SpectraMax® con Excitación a 380 nm, Emisión ajustada a 460 nm, usando modo de lectura cinética por una hora. Los clones que muestran la inhibición mejorada del sustrato objetivo con respecto a la proteasa modelo fueron analizados adicionalmente .

B. Análisis de actividad de proteasa variante usando sustratos de péptido fluorogénicos Para valorar directamente la actividad y especificidad de mutantes de MT-SP1, un ensayo se realizó usando los sustratos de péptido fluorogénicos Ac-RQAR-ACC (que tiene la secuencia de escisión autocatalitica nativa reconocida por MT-SP1 tipo silvestre) y Ac-SLGR-ACC (Acetil-Ser-Leu-Gly-Arg-ACC) que tiene la secuencia de escisión de sitio objetivo C2) . Como se señaló anteriormente, el ACC en los nombres de estos sustratos representa 7-amino-4-carbamoilmetilcumarina, la cual es el grupo saliente fluorescente. También como se señaló anteriormente, el uso de sustratos de péptido fluorogénico es un método de rutina para la determinación de especificidad de proteasa (Zimmerman et al. (1977) Anal Biochem, 78:47-51; Harris et al. (2000) PNAS, 97:7754-7759). En este ejemplo, la escisión especifica del enlace de anilida libera el grupo saliente ACC fluorescente, que proporciona un medio eficiente para determinar las velocidades de escisión para sustratos individuales. En este método, 35 µ? de 2x Amortiguador de Ensayo Indirecto se agregaron a todas las cavidades de prueba. 35 µ? de sobrenadante de fagos (aislado como se describe en el ejemplo 9B) o fagos precipitados por PEG re-suspendidos (aislados como se describe en el ejemplo 9C) se agregaron a cada una de las cavidades designadas. Después de la adición de los fagos, la placa se centrifugó a 2000 rpm por 1 minutos para remover las burbujas de aire. 10 µ? de cada uno de los Sustratos de Péptido (Ac-SLGR-ACC (concentración de ensayo final = 125 µ?) ) y Ac-RQAR-ACC (concentración de ensayo final = 60 µ?) ) se diluyó con IX Amortiguador de Ensayo Indirecto y luego se agregó individualmente a cavidades apropiadas. La velocidad de hidrólisis (ROH) , medida como Unidades de Fluorescencia Relativa/segundo (RFU/s) ) ; indicativa de la escisión de sustrato, se monitoreó tiempo extra usando un Lector de Microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices) , usando el modo de lectura cinética.

EJEMPLO 11 Producción, selección, valoración e identificación de mutantes de MT-SPl A. Ensayo fluorogenico de mutantes de MT-SPl de cadena B de biblioteca de fagemidos Este ejemplo describe un ensayo fluorogénico que se realizó para analizar la actividad y especificidad de fagos que portan dominios de proteasa MT-SPl producidos usando la biblioteca producida como se describe en el ejemplo 8. La biblioteca de MT-SPl se preparó como se describe en el ejemplo 8 anterior, usando la cadena B nativa de MT-SPl que tiene una serina en lugar de la cisteina en la posición 122 con base en la numeración de quimiotripsina (SEC ID NO: 507) como un modelo. La biblioteca se preparó como se describió anteriormente, usando el vector pMal-C2 y condiciones de PCR propensa a error recomendadas por el proveedor para lograr una velocidad de mutagénesis aproximada de 0.5%. El rendimiento de esta reacción de mutagénesis fue 4 x 109 recombinantes .

La selección de fagos basada en la velocidad de interacción con y escisión de la variante AT3 que contiene la secuencia de sustrato objetivo (en lugar de RCL nativo; como se describe en el ejemplo 7) se realizó como se describe en el ejemplo 9? usando un formato de 96 cavidades de polipropileno. Para esta selección, 1 x 1012 fagos recombinantes se mezclaron con A 3 variante 3.3 nM que porta una secuencia de RCL SLGRKI por 30 minutos. Después de lavado, los fagos fueron eluidos como se describe en el ejemplo 9A anterior, y se usaron para infectar células XL-1 blue como se describe en el ejemplo 9B. Las rondas sucesivas de selección se realizaron para enriquecer la rápida interacción y escisión de la secuencia de sustrato objetivo usando métodos proporcionados y descritos en la presente. Por ejemplo, los clones seleccionados en la primera ronda se sometieron a una segunda ronda de selecciones como se describe en la presente, usando AT3 3.3, 1.1, y 0.33 nM por una hora como se describe en el ejemplo 9A(3) . Después de la primera ronda de selección, el sobrenadante de fagos se preparó como en el ejemplo 9C usando la precipitación de PEG de clones seleccionados. Los clones de fagos se tamizaron usando el método del ejemplo 10(B) anterior, usando, como sustratos fluorogénicos , tanto Ac-SLGR-ACC (que contiene secuencia de sitio de escisión de objetivo C2) y Ac-RQAR-ACC (que contiene la secuencia de escisión nativa para la MT-SP1 nativa) . Para cada clon, la velocidad de fluorescencia (ROF) determinada del ensayo de Ac-SLGR-ACC se comparó con la ROF determinada del ensayo de Ac-RQAR-ACC como un medio para comparar la actividad de cada dominio de proteasa MT-SP1 mutada en la secuencia de sustrato nativo a su actividad en las secuencias de sustrato objetivo. Las ROFs en los ensayos de MT-SP1 mutante también se compararon con las ROFs en el ensayo de T-SP1 (C122S) modelo. Los resultados obtenidos con clones individuales se muestran en la tabla 21 posterior, la cual lista los números de clones, y lista la velocidad de fluorescencia como RFU/s (unidades de fluorescencia relativa por segundo) .

Tabla 21: Selección de fagos que portan dominio de proteasa MT-SP1 mutante seleccionados para velocidad de escisión de AT3-SLGRKI Niunero <le Clon Velo iílinl «l Yelooilad ile Ac-SLGR- A<-RQAR- d MT-SP1 ACC ACC imitante íRFF-.ses.) (RFF;Sf s.) Modelo 1 .85 1 5.6 CPC-0019595 7.1 33 CPC-0023085 0.8 2 CPC-0023230 1 .3 4 CPC-0023401 3.9 12 CPC-0023949 0.7 2 CPC-0024129 3.8 15 CPC-002 153 2.5 6 CPC-0024527 4.3 12 CPC-002471 5 3.2 12 CPC-0025366 1.3 1 CPC-0025387 6.8 14 CPC-0025533 6.9 23 CPC-0025582 1.7 3 CPC-0025720 2.5 5 CPC-0025866 1 .2 4 CPC-0025876 4.0 8 CPC-0025890 10.6 33 CPC-0025941 1 .0 4 CPC-0025974 9.3 41 CPC-0026100 14.8 25 CPC-0026122 6.5 3 1 CPC-0026125 1 7.4 84 CPC-0026200 7.0 21 CPC-0026219 8.0 23 CPC-0026232 7.1 15 CPC-0026597 1 1 .0 34 CPC-0026727 0.8 2 CPC-0026761 7.8 25 CPC-0027290 3.9 12 CPC-0027306 1 1 .0 50 CPC-0027309 8.3 50 CPC-0027326 9.1 54 B. Identificación de fagos mutantes MT-SPl seleccionados por secuenciado de ADN Este ejemplo describe un método usado para identificación de clones de fagos positivos que fueron preparados como se describe en los ejemplos previos y seleccionados basado en los resultados de un ensayo fluorogénico, tal como uno descrito en el ejemplo 10B anterior. Pares este método, los clones individuales se mezclaron con células E. coli XL-IBlue para infección y los cultivos crecieron durante la noche con sacudimiento a 37 °C. El ADN de plásmido se purificó del cultivo durante la noche usando un kit de preparación de plásmido (Qiagen) , y el ADN se envió para secuenciado para identificación de los mutantes .

En un ejemplo de este método, las secuencias de aminoácido de mutantes T-SP1 de cadena B seleccionados del ejemplo 11A anterior se identificaron usando las etapas resumidas anteriormente. El cebador de secuenciado que se utilizó para identificación de estos clones se describe en la SEC ID NO: 618: 5 ' GGTGTTTTCACGAGCACTTC3 ' . Los resultados obtenidos analizando los datos de secuenciado se describen en la tabla 22 posterior. Esta tabla lista solamente mutantes con residuos encontrados que son mutantes en más de un aislado. La tabla 22 lista las mutaciones/posiciones de aminoácidos para cada clon comparado con la secuencia de cadena B de MT-SP1 tipo silvestre (SEC ID NO: 505), las cuales fueron determinadas por análisis de datos de secuenciado. La numeración de aminoácido es de acuerdo con la numeración de quimiotripsina. Las SEC ID NOs también se listan tanto para la secuencia de residuos aminoácidos que codifica los dominios de proteasa MT-SP1 (cadenas B) que contienen las mutaciones de aminoácido indicadas y también para la secuencia de residuos aminoácido que codifica la proteina MT-SP1 de longitud completa que tiene las mismas mutaciones .

Tabla 22 : Mutantes MT-SPl seleccionados EXEMPLO 12 Preparación y Caracterización de grandes cantidades de proteasa MT-S1 unida a fagos seleccionada A. Preparación a gran escala de fagos de MT-SPl Este ejemplo describe la preparación de grandes cantidades de fagos que portan dominio de proteasa MT-SPl seleccionada para análisis y uso subsiguiente de dominios de proteasa seleccionada en métodos cadena abajo, tal como traducción in vitro en proteasas MT-SPl completas. Para este ejemplo, colonias que portan fagos únicas, seleccionadas como en el ejemplo 11 anterior, crecieron durante la noche en medio 2YT suplementado con Carbenicilina , a una concentración final de 50 pg/ml, y tetraciclina, a una concentración final de 12 µ?/p??, en matraces Erlenmeyer Tapados Anaranjados Corning estériles pequeños, durante la noche. Para hacer soluciones madre de glicerol, 85 µ? de glicerol al 60% se agregaron a 500 µ? de cada cultivo seguido por almacenamiento a -80 °C. El volumen remanente de cada cultivo se agregó a un matraz con deflector de boca amplia de 2L que contiene 500 mi de medio 2YT suplementado con Carbenicilina y Tetraciclina. Alternativamente, esta etapa se realizó en un matraz de 500 mi en un volumen de 50 mi. El cultivo creció hasta que se alcanzó un OD600 de 0.5. Los fagos Auxiliadores M13K07 se agregaron al cultivo para producir 1E10 CFU/ml y el cultivo se incubó por 1 hora a 37 °C. Se agregó canamicina a una concentración final de 30 µg/ml. Los cultivos con fagos auxiliadores se rescataron durante la noche por incubación a 37 °C. Después del cultivo durante la noche, las muestras se centrifugaron a 6000 rpm por 15 minutos. Se agregó un volumen de solución PEG/NaCl (20% PEG 8K/NaCl 1.5 M) por 5 volúmenes de cultivo. La muestra luego se agitó a 4°C por 20 minutos. Las muestras se centrifugaron a 10,000 rpm por 20 minutos y los sobrenadantes se removieron. Después de una segunda etapa de centrifugación a 10,000 rpm, la pelotilla fue resuspendida en 5 mi (para el volumen de 500 mi inicial) o 1 mi (para el volumen de 50 mi inicial) de PBS . Las células precipitadas que no fueron resuspendidas fueron removidas por breve centrifugación a 14,000 rpm por 2 minutos. Se agregó glicerol, a 10% en volumen, al sobrenadante que contiene las células resuspendidas. Las células se congelaron a -80°C.

B. Ensayo de fagos preparados usando sustratos ACC y QF Este ejemplo describe un ensayo fluorogénico usado para valorar la actividad y especificidad de los fagos preparados en el ejemplo 12A. Los clones de fagos que portan MT-SP1 mutante precipitados en PEG, preparados usando el cultivo de volumen de 50 mi como se describe en el ejemplo 12A, fueron normalizados a 1E13 particulas/ml . Los fagos luego se sometieron a ensayo enzimáticamente usando los sustratos ACC fluorogénico y QF (Fluorescencia Apagada) como sigue. Se agregaron 5 µ? de fagos (a 1E13 particulas /mi ) a cada cavidad en una placa de microtitulación de media cavidad de polipropileno Costar negra (Corning) conjuntamente con 5 µ? 10X amortiguador de ensayo MT-SP1, 35 µ? de H20 y 5 µ? de sustrato en un volumen total de 50 µ? . Los sustratos usados en cavidades individuales fueron: Ac-SLGR-ACC (concentración final de 120 uM) , Ac-RQAR-ACC (concent ación final de 60 uM) , o los siguientes sustratos de fluorescencia apagada: SLGR-KI y RQAR-SA (ambos usados a concentración final de 0.625 uM) .

El sustrato Ac-SLGR-ACC se utilizó para valorar la escisión, por los clones de MT-SP1 mutante, de la secuencia de escisión de objetivo (complemento C2), mientras que el sustrato Ac-RQAR-ACC se utilizó para valorar la escisión de la secuencia de escisión de objetivo nativa para MT-SPl. Igualmente, el sustrato SLGR-KI se utilizó para valorar la escisión de la secuencia de escisión de objetivo (complemento C2), mientras que el sustrato RQAR-SA se utilizó para valorar la escisión de la secuencia de escisión de objetivo nativa para MT-SPl. La relación de estas dos velocidades de escisión fue una medida cuantitativa de la especificidad de las proteasas seleccionadas para la nueva secuencia de escisión de objetivo. La comparación de estas relaciones para una variante seleccionada y la proteasa de andamiaje original correspondiente (es decir, parental) indicó si la proteasa seleccionada exhibió selectividad mejorada hacia la nueva secuencia de escisión de objetivo. Para la lectura, el lector de placas SpectraMax® se ajustó para excitación a 380 nm y para detectar la emisión a 460 nM, con un corte de 435 nM. Para la lectura de QF, el lector de placas SpectraMax® se ajustó para excitación a 490 nM, para detectar la emisión a 520 nM, con un corte de 515 nM. Los resultados de este ensayo se describen en la tabla 23 posterior. Como anteriormente, las SEC ID NOs se listan tanto para la secuencia de residuos aminoácidos que codifica los dominios de proteasa MT-SPl (cadena B) que contiene las mutaciones de aminoácido indicadas como también para la secuencia de residuos aminoácidos que codifica la proteína MT-SPl de longitud completa que tiene las mismas mutaciones, como se determina por secuenciado, como se describe en el ejemplo 11B anterior. Los números de RFU (unidades de fluorescencia relativa) corresponden a la velocidad de hidrólisis observada en una reacción de 60 minutos a 37°C para cada sustrato.

Tabla 23 : Ensayo cinético de clones de fagos que portan dominio de proteasa MT-SPl seleccionada "RÍTJ s = Uiúdade.': de fluoi e í ew in l elíiti n-.íec'ui u 't'I í idad d lmh oli5i.?'t EJEMPLO 13 Expresión de proteínas de MT-SPl mutantes seleccionadas usando traducción in vitro Este ejemplo describe la expresión de dominios de proteasa MT-SPl seleccionados y elegidos como en los ejemplos descritos anteriormente, que no son parte de una proteina de fusión de gen III.

A. Subclonación de secuencia de MT-SP1 en un vector IVEX modificado Para expresar los dominios de proteasa MT-SP1 seleccionados en fagos, como se describe en los ejemplos anteriores, no se sintetizaron como proteínas de fusión de gen III, la región codificante para el dominio de proteasa MT-SP1 que contiene la secuencia de activación N-terminal y una marca 6xHis C-terminal se clonó en el vector de traducción pIVEX.2.3d RTS in vitro (Roche; SEC ID NO: 559)) usando sitios de restricción Ndel y Xhol . La secuencia de aminoácido N-terminal completa del pIVEX .2.3d . MT-SP1 que precede el sitio de escisión RQAR se describe en la SEC ID NO: 558: MEKTRHHHHHHSGSDCGLRSFTRQAR. Los residuos que codifican las proteínas MT-SP1 de cadena B, los cuales se han seleccionado usando bibliotecas de fagémido como se describió anteriormente, se sometieron a ensayo usando métodos de selección fluorogénica como se describe en el ejemplo 10B y 11A, y se secuenciaron como se describe en el ejemplo 11B, fueron subclonados en el vector pIVEX .2.3d . MT-SP1 usando los sitios de restricción Sphl y BrsGI internos. La selección de fagémido que tiene mutaciones en la secuencia de MT-SP1 que estuvieron fuera de estos sitios internos fue creada para el uso en este método por mutagénesis de PCR.

B. Expresión de MT-SPl por traducción in vi ro La expresión de dominios de proteasa MT-SPl usando un kit de traducción in vitro, el kit de disulfuro E. coli RTS 100 (Roche Applied Science) , se realizó usando las condiciones especificadas por el proveedor con las siguientes optimizaciones: Los componentes de la solución de reacción de 50 µ? se modificaron para incluir 12 µ? de mezcla de aminoácidos, 10 µ? de mezcla de reacción, 12 µ? de lisado, conjuntamente con la adición de 5 µ? de amortiguador Hepes 1M pH 8, 2.5 µ? de Tween-20 12 nM, 2.5 µ? de Proteina Disulfuro Isomerasa (PDI), y 6 µ? del Suplemento RTS GroE caperona (Roche Applied Science) . La mezcla de alimentación de 1 mi también se modificó para incluir 168 µ? de mezcla de aminoácidos, 24 µ? de metionina, 608 µ? de mezcla de alimentación, 100 µ? de Hepes 1M pH 8, 50 µ? de Tween-20 12 nM, y 50 µ? de agua. La reacción de traducción in vitro (IVT) se incubó en un sacudidor de placa a 30°C por 18 horas.

C. Purificación de MT-SPl marcada con His Después de la reacción de traducción in vitro (IVT), la proteina insoluble se limpió por centrifugación y se transfirió a un tubo nuevo. El sobrenadante limpio (con un volumen de aproximadamente 45 µ?) se hizo llegar a un volumen final de 1 mi en Fosfato de Sodio 50 mM pH 7.5, NaCl 300 mM. La solución se aplicó a 300 µ? de resina TALON® pre-equilibrada en una columna de cromatografía fritada de 2 mi (Clontech) y se dejó fluir por gravedad. La columna se lavó con 3 mi de una solución que contiene Fosfato de Sodio 50 mM pH 7, NaCl 300 mM e Imidazol 7.5 mM, y se eluyó con 600 µ? de una solución que contiene Fosfato de Sodio 50 mM pH 6.5, NaCl 300 mM e Imidazol 75 mM. El eluido se dializó en solución salina amortiguada con fosfato con 0.1% Tween-20 (PBST) y se concentró a 20 µ?. Típicamente, el rendimiento de la proteasa purificada fue aproximadamente 70%.

EJEMPLO 14 Caracterización de dominios de proteasa MT-SPl mutada Este ejemplo describe la caracterización de los dominios de proteasa MT-SPl mutante mutada.

A. Titulación de sitio, activo de reacciones IVT Para valorar la actividad de proteasa, la titulación de sitio activo de dominios de proteasa MT-SPl mutante traducida in vitro se realizó en sobrenadante limpio con el inhibidor de MT-SPl M48R Ecotin, como se describe (Takeuchi et al, (1999) PNAS 96, 11054-11061). Para este ensayo, la proteína IVT se diluyó a una concentración final de 1:10,000 en IX amortiguador de actividad de MT-SPl y se incubó con Ecotin 15 nM en diluciones en serie 1:2.5 por 1 hora a 30°C. La reacción se valoró cinéticamente para escisión de sustrato Ac-RQAR-ACC 0.4 mM en un Lector de Microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, Inc.). El grupo saliente ACC se detectó a longitudes de onda de Excitación (Ex) = 380, Emisión (Em) = 450 y corte (c/o) = 435. Los puntos de ensayo que muestran actividad fracciona! entre 20% y 80% de actividad no inhibida se graficaron en una gráfica de actividad contra concentración de Ecotin, y una línea se gráfico entre los puntos. La intercepción x de la línea se utilizó para establecer la concentración activa de la proteasa IVT. La reacción se gráfico, con la parte lineal de la curva representando la concentración activa de la proteasa IVT. Por consiguiente, la concentración de sitio activo (descrita para varios mutantes en la tabla 24 posterior; Concentración de Sitio Activo) se determinó usando Titulación de Sitio Activo.

B. Ensayo de mutantes de dominio de proteasa MT-SPl IVT Varios seleccionantes de fagos MT-SPl producidos por IVT se valoraron para especificidad incrementada para el sitio de escisión de RCL mutante sobre el sitio de escisión de MT-SP1 de RQAQ nativo por ensayos de enzima cinéticos de fluorescencia apagada (QF) . Los sobrenadante de IVT, limpiados como se describe en el ejemplo 13C anterior, se diluyeron 1:10,000 en IX amortiguador de actividad de MT-SP1 y se incubaron con 6.25 µ? ya sea de sustrato QF RQAR-L o sustrato de escisión 2 de RCL mutante; SLGR-KI . La escisión se valoró usando un Lector de Microplacas ' Spectra ax® M5 (Molecular Devices) con longitudes de onda de Ex = 490, Em = 520 y c/o = 515. La especificidad relativa de proteasa producida por IVT para la secuencia objetivo de RCL sobre la secuencia nativa se calculó usando la relación de RFU/s (unidades fluorescentes relativas por segundo) para SLGR-KI y RQAR-SL. Los resultados se describen en la tabla 24 posterior. En la columna etiquetada SEC ID NO:, las SEC ID NOs que describen la secuencia de aminoácido de los dominios de proteasa que contienen las mutaciones aminoácido indicadas se listan primero; y las SEC ID NOs que describen la secuencia de residuos aminoácidos que codifica la MT-SP1 de longitud completa que contiene las mutaciones de aminoácidos indicadas se muestran entre paréntesis. Los números de RFU indican las unidades de fluorescencia relativa (velocidad de hidrólisis) para cada sustrato.

Tabla 24: Ensayo cinético de dominios de proteasa MT-SPl mutante EJEMPLO 15 Expresión de proteínas Mutante MT-SPl Seleccionadas como proteína purificada A. Transferencia de dominio de proteasa MT-SPl en vector PQE Un subconjunto de clones de fagos que portan dominio de proteasa MT-SPl sometidos a ensayo en los ejemplos previos se selección para transferencia de la secuencia de dominio de proteasa MT-SPl en un vector de expresión pQE30 que previamente se modificó para expresión de dominio de proteasa MT-SPl tipo silvestre. El kit de clonación de PCR de Secado por Infusión (Clonetech) se utilizó para transferir clones seleccionados en pQE30-Mt-SP1 (SEC ID NO: 624) usando condiciones especificadas por el proveedor y como se describe por Benoit et al. (2006), Protein Expressión & Purification 45:66-71. Para este proceso, una porción del ADN de clon de fagos que codifica el dominio de proteasa MT-SP1 se amplificó por reacción en cadena de polimerasa (PCR) con el cebador delantero pQE-Inserto-F2: TTCACGAGACAGGCTCGTGTTGTTGGGGGCACGGAT (SEC ID NO:560) y cebador inverso pQE-Inserto-R3 : CAGCTAATTAAGCTTATTATACCCCAGTGTTCTCTTT (SEC ID NO: 561), cada una porta colas 5' no apareadas. El plásmido pQE30-MT-SPl sin el dominio de proteasa de MT-SP1 se linealizó usando PCR con el cebador delantero: pQE-Lineal-F2 : ACGAGCCTGTCTCTGTGAATGACCGCAGCCC (SEC ID NO: 562) y cebador inverso: pQE-Lineal-Rl : TAATAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCC (SEC ID NO: 563) seguido por tratamiento tanto de productos de PCR donadores como aceptores con enzima Dpnl . Para cada secuencia de cebador de linealización descrita' anteriormente, la región de homología de 18-nt de largo, una cola de cebador 5' no apareada, se muestra en negritas. Tanto el ADN aceptor como donador se mezclaron conjuntamente luego, y la reacción de infusión se corrió en un volumen de 10 µ? usando condiciones especificadas por el proveedor. 2 µ? de la mezcla de reacción se transformador en 50 µ? de células competentes E. coli TOP10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las colonias fueron seleccionadas en placas de agar LB suplementadas con 100 ppm de Carbenicilina. El ADN de plásmido se aisló de clones seleccionados, y se secuenció usando el cebador delantero: MT-SP1-5F: GGAGAAACCGGCAGAGTAC (SEC ID NO: 564) y cebador inverso T-SP1-5R: GGTTCTCGCAGGTGGTCTG (SEC ID NO: 565) para verificar la transferencia correcta. Estos cebadores están completamente apareados.

B. Expresión, repliegue y purificación de dominios de proteasa MT-SPl mutada Los plásmidos que codifican el dominio de proteasa de variantes de MT-SPl en el vector pQE30 (Qiagen) descrito en el ejemplo 15B anterior se transformaron en células E. coli BL21-Gold ( DE3 ) (Stratagene) . Pequeños cultivos iniciadores que contienen 1 mi de LB suplementado con 100 g/ml de carbenicilina se inocularon de las colonias y se incubaron por 8 y 10 horas a 37°C. 100 µ? de este cultivo se utilizaron para inocular 50 mi de medio 2xYT suplementado con 100 pg/ml de carbenicilina y crecieron durante la noche. En tubos cónicos de 50 mi (Corning) , las células se recolectaron por centrifugación luego se sometieron a lisis. Los cuerpos de inclusión (IB) se aislaron con Reactivo NugBuster® (Novagen) usando las condiciones especificadas por el proveedor. Las pelotillas de IB se solubilizaron con 1 ral de una solución de desnaturalización que contiene Tris 10 mM pH 8, GdmHCl 6 M y DTT 20 mM. Después de la remoción de cualquier material insoluble por centrifugación en tubos de microcentrifuga (20,000 x g por 10 min) , el sobrenadante se diluyó en 40 mi de solución de repliegue, que contiene arginina 1.5 M, Tris 100 mM pH 8, NaCl 150 mM, glutationa reducida 5 mM y glutationa oxidada 50 µ??, en tubos cónicos de 50 mi (Corning) . Los tubos se colocaron horizontalmente en una plataforma Nutator (Fischer Scientific) a 4°C por 3-4 días. Las variantes de MT-SPl replegadas, aún no activadas, luego se dializaron extensamente a temperatura ambiente contra Tris 25 mM pH 8, NaCl 25 mM por 3-4 días. Después de la remoción de arginina durante la diálisis, las variantes de dominio de proteasa MT-SPl fueron capaces de activarse. Las preparaciones crudas de variantes de dominio de proteasa MT-SPl activada luego se sometieron a cromatografía en una columna HiTrap™ Q HP de 5 mi (Ge Healthcare) unida a un sistema AKTA que opera en un modo automatizado que habilita el procesamiento de hasta siete variantes por ronda. El amortiguador de proceso fue Bis-Tris 25 mM pH 6.5 y la MT-SPl purificada se eluyó dentro de un gradiente de 50 mi a NaCl 350 mM. Las fracciones activas se agruparon, luego el amortiguador se cambió por PBS + benzamidina 20 mM y se concentró a 0.5-10 mg/ml usando dispositivos Amico-Ultra 15 ( illipore ) con un M CO de 10 kDa. Finalmente, las alícuotas fueron congeladas al instante en nitrógeno liquido y se almacenaron a -80°C.

EJEMPLO 16 Preparación de cebos de inhibidor de PAI mutante biotinilado Este ejemplo describe métodos que se utilizaron para expresar y purificar proteínas inhibidoras de PAI mutantes, marcadas con biotina para captura en superficies revestidas con estreptavidina , para el uso en la selección de proteasas uPA variantes de bibliotecas de uPA. Estos inhibidores de PAI mutantes también son útiles para la selección de algunas proteasas MT-SP1 variantes de bibliotecas de MT-SP1, dependiendo de la variante MT-SP1 y la secuencia de RCL usada en el PAI .

A. Biotinilacion N-terminal de 6xHis-PAI-l Para la biotinilacion de 6xHis-PAI-l o variantes de bucle de centro reactivo de la misma, las variantes PAI-1 marcada con His tipo silvestre (SEC ID NO: 625) y PAI-1 marcada con His, como se describe en la presente en el ejemplo 1, se transformaron en la cepa hospedera (DE3)pLysS de Roseta-2 (Novagen) . La expresión se realizó esencialmente como se describe (Blouse, G.E., Perron, M.J., Thompson, J. H., Day, D. E . , Link, C. A., and Shore J. D. (2002) Biochemistry 41(40), 11997-12009), con las siguientes modificaciones. La inducción se realizó por tres horas a 30 °C en medio 2XYT suplementado con 0.2% glucosa, 100 ug/ml de carbenicilina y 10 ug/ml de cloramfenicol (Cm) . La fracción activa de 6xHis-PAI-l luego se purificó de los Usados de células como se describe (Blouse, G.E., Perron, .J., Kvassman, J. O., Yunus, S., Thompson, J. H., Betts, R. L., Lutter, L. C, and Shore J. D. (2003) Biochemistry 42(42), 12260-12272; Kvassman, J. O., and Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221) . Las variantes de 6xHis-PAI-l se biotinilaron preferentemente en el N-término usando el reactivo desdoblable de disulfuro EZ-Link NHS-SS-PE04-Biotina (PIERCE, Rockford, IL ¡121442) . Las reacciones se realizaron a pH 6.2, por 4 horas, a 4°C en hielo en un amortiguador que contiene NaPi 50 mM/NaCl 300 mM/EDTA 1 mM. La reacción se inició por la adición de un exceso molar de 5 veces de reactivo de biotinilación disuelto en DMSO. La concentración final de DMSO en la reacción se mantuvo por debajo de 1%. La reacción de biotinilación se apagó por la adición de Tris 0.5 M/NaCl 1.0/EDTA 10 mM, pH 7.4 a una concentración de Tris final de 20 mM . El exceso de reactivo de biotinilación se removió por diálisis extensa contra un amortiguador de almacenamiento que contiene NaPi 50 mM/NaCl 300 mM/EDTA 1 mM, pH 6.2. La concentración de PAI-1 en la solución resultante se confirmó usando un coeficiente de extinción de 0.93 mi mg""1 cm"1 (véase: Kvassman, J.-O., and Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221) . El grado de biotinilación se determinó usando el kit EZ-Quant HABA/Avidina (PIERCE, Rockford, IL #28005), siguiendo las condiciones especificas por el proveedor, y típicamente estuvo entre 1.0 y 1.2 moles por 1 mol de variante de PAI-1.

B. Biotinilación in vivo de PAIS: Biotinilación de BRS-TEV-OptiPAI-lestab in vivo: Este ejemplo describe un método que se utilizó para biotinilar in vivo a PAI . En este ejemplo, una secuencia de reconocimiento apropiada se incorporó en el gen que codifica la molécula cebo de modo que la marcación con biotina del cebo podrá ser realizada en células en crecimiento, en lugar de ser realizada con cebo purificado in vitro. Un gen que codifica la proteína PAI-1 estable (PAI-lestab, que tiene la secuencia de residuos aminoácidos descrita en la SEC ID NO:567), la cual tiene mutaciones N150H, K154T, Q319L y M3541 (Berkenpas, M. B., Lawrence, D. A., and Ginsburg, D. (1995) E BO J. 14(13), 2969-2977), se digirió para contener las siguientes regiones en el siguiente orden: 1) Codón de inicio, 2) Secuencia de reconocimiento de biotina (BRS) , 3) Secuencia de proteasa de virus grabado del tabaco (TEV) , 4) secuencia codificante de PAI, 5) codón de terminación; con optimización de codón de Escherichia coli. Este gen PAI-lestab sintético se clonó en el vector de expresión comercial pET21-a (Novagen, Madison, WI) (SEC ID NO: 566) usando enzimas de restricción Xbal y fíindIII que resultan en plásmido pCAT0002 (SEC ID NO: 619), el cual expresó PAI-1 optimizada (OptiPAI-1; codificada por la secuencia de aminoácido descrita en SEC ID NO: 621, en la cual la posiciones de residuo aminoácido 3-17 y 20-26 corresponden a los sitios BRS y TEV, respectivamente) usando el sistema de expresión T7. El plásmido pCAT0002 luego se co-transformó en células competentes E. coli BL21-Gold (DE3) (Stratagene, San Diego, CA) que portan el plásmido pBirA (descrito en Asai et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:20079-20078), el cual sobreexpresa la biotina ligasa E. coli, BirA. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar Luria-Bertani (LB) suplementadas con 100 ug/ml de carbenicilina y 10 yg/ml de cloramfenicol (Cm) . La expresión de BRS-TEV-OptiPAI-lestab (SEC ID NO: 621) y variantes de bucle de centro reactivo de la misma se realizó esencialmente como se describe (Blouse, G. E., Perron, M . J. , Thompson, J. H., Day, D. E., Link, C. A., and Shore, J. D. (2002) Biochemistry 41(40), 11997-12009), con las siguientes modificaciones. La inducción se inició por la adición de IPTG 0.1 mM y D-biotina 0.1 mM por tres horas a 30°C en medio 2XYT suplementado con 0.2% glucosa, 100 yg/ml de carbenicilina y 10 pg/ml de cloramfenicol (Cm) . La fracción activa de BRS-TEV-OptiPAI-lestab fue posteriormente purificada de los Usados de célula como se describe (véase: Blouse, G.E., Perron, M.J., Kvassman, J. O., Yunus, S., Thompson, J. H., Betts, R. L., Lutter, L. C, and Shore J. D. (2003) Biochemistry 42(42), 12260-12272; Kvassman, J. O., and Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221) o por selección por cromatografía en avidina monomérica (PIERCE, Rockford, IL #20227), siguiendo las condiciones especificadas por el proveedor, con las siguientes modificaciones. El amortiguador de enlace contuvo Tris 50 mM/NaCl 100 mM/EDTA 1 mM/0.01% tween-80 y tuvo un pH de 7.4; y se utilizó un amortiguador de elución competitivo que contuvo este amortiguador de enlace más D-biotina 2 mM. La biotina de la etapa de elución competitiva se removió por diálisis extensa contra un amortiguador de almacenamiento que contiene NaPi 50 mM/NaCl 300 mM/EDTA 1 mM, pH 6.2. La concentración de PAI-1 se confirmó usando un coeficiente de extinción de 0.93 mi mg"1 cm-1 como se describe (Kvassman, J.-O., and Shore, J.D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221) .

C. Biotinilación in vitro de VIC OptiPAI-lesta Este ejemplo describe método para Biotinilación N-terminal de una variante de PAI . Los métodos descritos en este ejemplo fueron realizados para incorporar un grupo reactivo apropiado en el gen que codifica la molécula cebo PAI, de modo que la marcación del cebo con biotina se podrá realizar después que la proteina se ha purificado, permitiendo el etiquetado de posición especifica del cebo. En este ejemplo, puesto que la PAI nativa no contiene algún residuo cisteina, se agrega un codón de cisteina al ADN que codifica el gen PAI para crear una PAI que contiene Cys que luego se podría hacer reaccionar con reactivos de biotinilación reactiva a Cys. La secuencia BRS-TEV N-terminal de OptiPAI-1, en plásmido pCAT002 descrita anteriormente, se suprimió con introducción simultánea de mutación VIC usando el kit de mutagénesis QuikChange-XL (Strategen, San Diego, CA) , de acuerdo con las especificaciones del proveedor, resultando en plásmido pCAT0051 (SEC ID NO: 623) que expresa la proteína VIC OptiPAI-lestab (SEC ID NO: 622) . El plásmido pCAT0051 se transformó en células competentes E. coli BL21 (DE3) pLysS (Strategen, San Diego, CA) . Los transformantes se seleccionaron en placas de agar Luria-Bertani (LB) suplementadas con 100 ug/ml de Carbenicilina y 10 ug/ml de cloramfenicol (Cm) .

La expresión de la proteína V1C OptiPAI-lestab y variantes de bucle de centro reactivo de la misma se realizó esencialmente como se describe (Blouse, G. E. Perron, M. J., Thompson, J. H., Day, D. E . , Link, C. A. , and Shore, J. D . (2002) Biochemistry 41(40), 11997-12009), con las siguientes modificaciones. La inducción se inició por la adición de IPTG 0.1 mM por tres horas a 30°C en medio 2XYT que se suplemento con 0.2% glucosa, 10 ug/ml de carbenicilina y 10 ug/ml de cloramfenicol . La fracción activa de la V1C OptiPAI-lestab o variante de la misma se purificó a partir de los Usados de célula como se describe (Blouse, G.E., Perron, M.J., Kvassman, J. O., Yunus, S., Thompson, J. H., Betts, R. L., Lutter, L. C., and Shore J. D. (2003) Biochemistry 42(42), 12260-12272; Kvassman, J. O., and Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221). Las proteínas V1C OptiPAI-1 y variantes fueron biotiniladas en el residuo cisteína N-terminal modificado genéticamente usando el reactivo de biotinilación reversible y reactiva a tiol, Biotina-HPDP de Enlace a EZ (N- (6- (Biotinamido) hexil) -3 ' - (2 ' -piridilditio) -propionamida ) (PIERCE, Rockford, IL #21341). La conjugación de biotina se realizó de acuerdo con las especificaciones del proveedor, con algunas modificaciones, como sigue. Las soluciones madre de biotina-HODO se prepararon a 5 mg/ml en DMF anhidra (9.3 mM) . A VIC OptiPAI-lestab se desaló rápidamente en columna de filtración de gel G25, de la cual se eluyó en un amortiguador de conjugación que contiene NaPi 50 mM/NaCl 150 mM/EDTA lmM/Tween-80 0.01%, pH 7.4. Las reacciones de biotinilación se iniciaron por la adición de un exceso molar de 10 veces de Biotin-HPDP madre. La concentración final de dimetilformamida (DMF) se mantuvo por debajo de 2-3%. Las reacciones se realizaron por 4 horas a 25°C y el progreso de reacción siguió usando liberación del grupo saliente piridin-2-tiona a 343 nm. El exceso de reactivo de biotinilación se removió por diálisis extensa contra un amortiguador de almacenamiento que contiene NaPi 50 mM/NaCl 300 mM/EDTA 1 mM, pH 6.2. La concentración de PAI-1 se confirmó usando un coeficiente de extinción de 0.93 mi mg"1 cm"1 como se describe (Kvassman, J.-O, and Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221). El grado de biotinilación fue típicamente 1.0-1.2 moles de biotina por mol de variante de PAI-1 usando el kit EZ-Quant HABA/Avidina y la liberación de piridin-2-tiona (PIERCE, Rockford, IL #28005) .

EJEMPLO 17 Selección de variantes de MT-SP1 de sobrenadantes de cultivo E. coli y extractos periplásmicos Este ejemplo describe dos métodos, cada uno usado como una alternativa para tamizar la actividad de variantes de MT-SP1 en fagos sometiendo a ensayo ya sea la proteina de espacio periplásmico E. coli o la proteina de medio de cultivo celular E. coli. Para ambos métodos, cultivos de 1 mi se prepararon como sigue. 1 mi de medio 2YT suplementado con 100 ug/ml de carbenicilina y 12 ug/ml de tetraciclina se distribuyó en cada cavidad de una placa de cavidades profundas de 96 cavidades, y se inoculó con 10 µ? de células XL-1 Blue que se han infectado con fagos que portan dominio de proteasa MT-SP1 durante la noche como se describe en el ejemplo 14 anterior, de una placa maestra de 96 cavidades. La placa de cavidades profundas se selló con una membrana permeable al aire y se colocó en un incubador de sacudidor HiGro con sacudimiento a 400 rpm a 37 °C con aireación de oxigeno hasta que la densidad celular alcanzó 0.4 - 0.6 OD600 (usuaimente 4-5 horas de sacudimiento). En este punto se agregó IPTG a una concentración final de 0.5 mM, y el crecimiento con sacudimiento se continuó durante la noche. Al siguiente día, la placa se centrifugó a 3600 rpm por 20 minutos para formar en pelotillas las células.

A. Selección de variantes de MT-SP1 de preparaciones periplásmicas Los métodos en este ejemplo se usaron para ensayar las proteínas de fusión MT-SPl-gen III de longitud completa, y productos de escisión enzimáticamente activos de las proteínas de fusión, que se han transportado en el espacio periplásmico E . coli. Después de la centrifugación a 3600 rpm, el sobrenadante de cultivo se desechó y la pelotilla de células se utilizó para liberar las proteínas periplásmicas usando cualquiera de las siguientes condiciones: Condición 1: Las pelotillas de células se resuspendieron en 150 µ? de solución salina amortiguada con fosfato fría (PBS); la suspensión se transfirió a una placa de PCR de 96 cavidades; seguido por una etapa de congelación-descongelación (20 min a -80°C/10 min en un baño de agua a temperatura ambiente); o Condición 2: Las pelotillas de células se resuspendieron en 150 ul de 3% Reactivo de extracción de proteína BugBuster (Novagen) ; la suspensión se transfirió a una placa de PCR de 96 cavidades; y la suspensión se incubó a temperatura ambiente por 30 min. Luego, las suspensiones de células se centrifugaron por 20 min a 3600 rpm a 4°C y los sobrenadantes que contienen proteínas periplásmicas se removieron cuidadosamente sin interrumpir la pelotilla. Además, los extractos periplásmicos se utilizaron para determinar la actividad enzimática de las variantes de MT-SP1 usando sustratos apropiados como se describe en el Ejemplo 10, Sección B.

B. Selección de variantes de MT-SP1 de preparaciones de sobrenadante Los métodos en este ejemplo se utilizaron para someter a ensayo las proteínas de fusión MT-SPl-gen III de longitud completa, y los fragmentos catalíticamente activos de la proteína de fusión, que se ha difundido del periplasma y en los medios de cultivo de célula bacteriana. En este ejemplo, después de la centrifugación en el cultivo de 1 mi, 10 µ? del sobrenadante de cultivo se removieron y sometieron a ensayo usando el ensayo de proteasa descrito en el ejemplo 10, Sección B, excepto unos 25 µ? adicionales de amortiguador de ensayo se agregaron a la reacción. Puesto que las modificaciones serán evidentes por aquellos de experiencia en esta técnica, se propone que esta invención sea limitada solamente por el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método, caracterizado porque comprende: a) contactar una colección de proteasas y/o porciones de proteasas catalíticamente activas con un polipéptido que atrapa proteasa para formar, después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasa por la proteasa o porciones de la misma catalíticamente activa, complejos estables que contienen el polipéptido que atrapa proteasa con una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en la colección; y b) identificar o seleccionar una proteasa o porción de la misma ca alíticamente activa en un complejo. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa es modificado para ser desdoblado por una proteasa que tiene una especificidad y/o actividad de sustrato predeterminada para un sustrato objetivo. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: las proteasas seleccionadas o identificadas son modificadas comparadas con una proteasa plantilla; y las proteasas seleccionadas o identificadas tienen una actividad y/o especificidad alterada hacia el sustrato objetivo comprada con la proteasa plantilla que no contiene la modificación (es ) . . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque además comprende separar las proteasas formadas en complejos a partir de elementos no formados en complejo de la colección. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa y una proteasa en el complejo están covalentemente ligados. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque: el polipéptido que atrapa proteasa es etiquetado para detección o separación; y la separación es efectuada por la captura de complejos que contienen el polipéptido que atrapa proteasa detectable con cualquier proteasa o porción de la misma catalíticamente activa. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la captura es efectuada en suspensión, solución o en un soporte sólido. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque: el polipéptido que atrapa proteasa está unido a un soporte sólido; y la unión es efectuada antes, durante o subsecuente al contacto del polipéptido que atrapa proteasa con la colección de proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el soporte sólido es una cavidad de una placa de ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) . 10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa es etiquetado con biotina. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque: la trampa de proteasa es etiquetada con una marca His; y la separación es efectuada por la captura con un agente quelante de metal. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el agente quelante de metal se selecciona de entre sulfato de níquel (NÍS04), cloruro de cobalto (CoC12), sulfato de cobre (CuS04) y cloruro de zinc (ZnC12) . 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque además comprende amplificar la proteasa o porción catalíticamente activa de la misma en los complejos separados. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la proteasa o porción catalíticamente activa de la misma en el complejo separado es exhibida en un fago, y la amplificación es efectuada infectando una célula hospedera con el fago. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la célula hospedera es una bacteria. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende seleccionar la proteasa amplificada para especificidad y/o actividad hacia un sustrato objetivo, en donde la especificidad y/o actividad es valorada en el medio de células bacterianas, pe iplasma bacteriano, sobrenadante de fago o una proteína purificada. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el sustrato objetivo es un polipéptido o una secuencia desdoblada en un polipéptido involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno . 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, que es multiplexado, caracterizado porque: una pluralidad de diferentes polipéptidos que atrapan proteasas, son contactados con la colección; y al menos dos polipéptidos que atrapan proteasas pueden ser identifloablemente detectados, por medio del cual más de una proteasa es identificada. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas en los complejos son exhibidas, por medio de lo cual pueden ser amplificadas después de la identificación o selección para producir una segunda colección de proteasas y/o porciones de las mismas catalíticamente activas. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque además comprende contactar la segunda colección con un segundo polipéptido que atrapa proteasa para producir una segunda serie de complejos estables. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el segundo polipéptido que atrapa proteasa es el mismo o diferente a partir del primer polipéptido que atrapa proteasa. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque además comprende identificar o seleccionar proteasas en la segunda serie de complejos estables. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa se selecciona de entre una serpina, un miembro de la familia alfa macroglobulina, o un miembro de la familia p35. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6-23, caracterizado porque los complejos estables comprenden un polipéptido que atrapa proteasa covalentemente ligado a una proteasa o porción catalíticamente activa de la misma. 25. Un método para seleccionar proteasas para identificar cualquier proteasa que tiene una especificidad de sustrato predeterminada, caracterizado porque comprende: a) contactar una colección de proteasas y/o porciones de proteasas catalíticamente activas con un polipéptido que atrapa proteasa para formar complejos estables del polipéptido que atrapa proteasa con una proteasa después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasa, en donde el polipéptido que atrapa proteasa es seleccionado o modificado para ser desdoblado por una proteasa que tiene la especificidad de sustrato predeterminada; y b) identificar una proteasa o una porción catalíticamente activa de una proteasa en un complejo para con ello seleccionar una proteasa que tiene especificidad de sustrato predeterminada. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque la colección contiene al menos 5, 10, 50, 100, 500, 103, 104, 105, 106 o más elementos diferentes. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque las proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas son serina y/o cisteína proteasas. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizado porque las proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas son exhibidas. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la proteasa o porciones de las mismas catalíticamente activas son exhibidas sobre un soporte sólido, en una superficie celular, o sobre la superficie de un microorganismo. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la proteasa o porción catalíticamente activa de la misma son exhibidas sobre la superficie de una levadura, bacteria, un virus, un fago, un ácido nucleico, moléculas de ARNm o ribosomas. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el microorganismo es E.coli, S. cerevisiae, o un virus seleccionado de entre M13, fd, T7, o un baculovirus. 32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizado porque es una reacción homogénea. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado porque las proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas son exhibidas en una biblioteca de exhibición de fago. 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque las proteasas son proporcionadas como porciones de las mismas catalíticamente activas de una proteasa. 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizado porque: al menos dos diferentes polipéptidos que atrapan proteasas son contactados con la colección; y al menos un de un polipéptido que atrapa proteasas es detectablemente etiquetado. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque al menos un polipéptido que atrapa proteasa es detectable para efectuar la captura de complejos estables que contienen el polipéptido que atrapa proteasa detectable con una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa. 37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque: al menos dos diferentes polipéptidos que atrapan proteasas son contactados con la colección; solamente un polipéptido que atrapa proteasa es detectablemente etiquetado; y el otro o los otros, están cada uno presentes en exceso, comparado con el polipéptido detectablemente etiquetado que atrapa proteasa. 38. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente o una marca His. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etiqueta detectable es biotina. 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizado porque las proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas son seleccionadas de entre las familias de proteasas quimiotripsina , subtilisina, caspasas y papaína. 41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-40, caracterizado porque la proteasa es una serina proteasa, cisteina proteasa, o porción catalíticamente activa de la misma y se selecciona de entre granzima B, testisina, beta triptasa 1, calicreína hk5, corina, calicreína 12, oritesasa DESC1, gamma triptasa 1, calicreína hK14, serina proteasa de enlace a hialuronano, triptasa, calicreína hK15, tripsina, elastasa de neutrófilo, serona proteasa 3 asociada con lectina de enlace a mañano, catepsina G, mieloblastina , granzima A, granzima M, quimasa, granzima K, granzima H, quimiotripsina B, elastasa pancreática, endopeptidasa pancreática E, elastasa pancreática II, enteropeptidasa , quimiotripsina C, protasina, calicreína 1, calicreína hK2, calicreína 3, mesotripsina, Factor XII, calicreína de plasma KLK3, factor XI, factor IX, factor Vül, factor Xa, trombina, proteína C, acrosina, hepsina, activador del factor de crecimiento del hepatocito (uPA) , activador del plasminógeno urinario (uPA) , activador del plasminógeno de tejido (tPA) , plasmina, neurosina, neurotripsina , neuropsina, calicreína hKIO, epiteliasina , prostasa, quimopasina, calicreína 11, MT-SP1, espinesina, catepsina L, catepsina V, catepsina K, catepsina S, catepsina F, catepsina B, papaína, cruzaína, subtilisina, termitasa, peptidasa C5a, fervidolisina, lactocepina, furina,. quexina, caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-6, caspasa-2, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10, caspasa-11, caspasa-12, caspasa-1, caspasa-13, y caspasa-14. 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41, caracterizado porque las proteasas o porción catalíticamente activas de la misma son seleccionadas de entre activador del plasminógeno de urocinasa (u-PA) , activador del plasminógeno del tejido (t-PA) y MT-SP1. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-42, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasas es seleccionado de entre serpinas, miembros de la familia p35, miembros de la familia alfa-macroglobulina o formas modificadas de los mismos . 44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-42, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa es una serpina seleccionada del inhibidor-1 activador del plasminógeno (PAI-1) o antitrombina III (AT3), o formas modificadas de los mismos. 45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa es alfa-2-macroglobulina , o una forma modificada de la misma. 46. El . método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-45, caracterizado porque la forma modificada contiene uno o más reemplazos, supresiones o sustituciones de aminoácido en el sitio reactivo del polipéptido que atrapa proteasa. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la modificación es cualquiera o más reemplazos de aminoácido que corresponden a una secuencia desdoblada de un sustrato objetivo. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el sustrato objetivo está involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. 49. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el sustrato objetivo es un VEGFR, una proteína de complemento, o un sustrato de activador del plasminógeno de tejido (tPA) . 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el VEGFR es VEGFR2. 51. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la proteína complemento es C2. 52. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque una o más modificaciones de aminoácido que corresponden a una secuencia desdoblada, tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 389, 479 y 498. 53. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa es una serpina y uno o más reemplazos de aminoácidos son/están en el bucle de sitio reactivo del polipéptido serpina. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque uno o más reemplazos de aminoácidos están en cualquiera o más de las posiciones P4-P2. 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la serpina tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NO: 497, 499, 610 y 611. 56. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el polipéptido que atrapa proteasa es alfa-2-macroglobulina, y uno o más reemplazos de aminoácido están en la región cebo del polipéptido . 57. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la proteasa identificada o seleccionada o porción catalíticamente activa de la misma' tiene especificidad de sustrato alterada para un sustrato objetivo comparado con un sustrato no objetivo . 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el sustrato no objetivo es un sustrato de la proteasa plantilla correspondiente . 59 El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la especificidad de sustrato se incrementa por 1.5-veces, 2-veces, 5-veces, 10-veces, 50-veces, 100-veces, 200-veces, 300-veces, 400-veces, 500-veces o más. 60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-59, caracterizado porque el método para identificar proteasas se realiza una pluralidad de veces, con ello, el proceso es iterativo. 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el método es realizado hasta que la proteasa exhibe especificidad y/o actividad de sustrato incrementada para una secuencia desdoblada en un sustrato objetivo, como se compara con un sustrato no objetivo de la proteasa plantilla correspondiente . 62. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque una pluralidad de diferentes proteasas están identificadas al menos, en la primera iteración del método. 63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-62, además comprende comparar las secuencias de aminoácido de las proteasas identificadas, para identificar puntos calientes, caracterizado porque: un punto cal Lente es un lugar modificado que ocurre en al menos dos, tres, cuatro, cinco o más de las proteasas identificadas y un lugar modificado es uno que es modificado si la colección contiene proteasas modificadas o porciones de las mismas catalíticamente activas. 64. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-63, caracterizado porque además comprende : después de identificar una primera proteasa o proteasas, preparar una segunda colección de proteasas, en donde una primer proteasa identificada es usada como una plantilla para hacer mutaciones adicionales en la secuencia de proteasa o porción catalíticamente activa de la misma, de manera tal que miembros de la segunda colección contienen polipéptidos que tienen mutaciones de la primera proteasa identificada y mutaciones adicionales; después contactar la segunda colección con un segundo polipéptido que atrapa proteasa que es ya sea idéntico o diferente del primer polipéptido que atrapa proteasa, usado para aislar la primera proteasa o proteasas, en donde el polipéptido que atrapa proteasa es modificado para ser desdoblado por una proteasa que tiene la · especificidad de sustrato objetivo deseada; e identificar una segunda proteasa (s) o porción (es) catalíticamente activa (s) de una proteasa a partir de la colección en un complejo, por medio del cual la segunda proteasa (s) identificad ( s ) tienen mayor actividad o especificidad hacia el sustrato objetivo que la primera proteasa identificada. 65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la segunda colección o proteasas, contienen mutaciones aleatorias o enfocadas comparadas con la secuencia de aminoácidos de la primera proteasa (s) plantilla (s) identificada ( s ) o porción catalíticamente activa de una proteasa. 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque las mutaciones son mutaciones enfocadas en posiciones de puntos calientes. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque las posiciones de puntos calientes están en una serina proteasa y son seleccionadas de entre las posiciones 30, 73, 89 y 155, basadas en la numeración de quimiotripsina . 68. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-67, caracterizado porque la formación de complejos estables es modulada controlando uno o más parámetros seleccionados de entre concentración de tiempo de reacción, temperatura, pH, intensidad iónica, concentración de biblioteca y polipéptido que atrapa proteasa . 69. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-68, caracterizado porque el método además comprende agregar un competidor a la reacción entre un polipéptido que atrapa proteasa y una proteasa o porción catalíticamente activa de la misma para con ello, mejorar la selectividad de la proteasa (s) identificada ( s ) o porción(es) catalíticamente activa (s). 70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el competidor es suero o plasma humano. 71. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el competidor es un extracto de tejido o célula o un fluido biológico tal como orina o sangre. 72. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el competidor es una forma de tipo nativa purificada o parcialmente purificada de la trampa de proteasa. 73. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el competidor es una forma de tipo nativa purificada o parcialmente purificada de un polipéptido que atrapa proteasa o una o más variantes específicas de un polipéptido que atrapa proteasa . 74. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque el competidor es plasma humana. 75. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-72, caracterizado porque el competidor es una forma de tipo nativa purificada del polipéptido que atrapa proteasa o es un polipéptido que atrapa proteasa que es un polipéptido modificado que atrapa proteasa. 76. Un método alternativo para envolver o seleccionar o identificar una proteasa o porción catalíticamente activa de la misma con especificidad/selectividad y/o actividad por al menos dos diferentes secuencias desdobladas, caracterizado porque comprende : a) contactar una colección de proteasas y/o porciones de proteasas catalíticamente activas con un primer polipéptido que atrapa proteasa para formar, después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasa por la proteasa o porciones de la misma catalíticamente activa, complejos estables que contienen el primer polipéptido que atrapa proteasa con una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en la colección, en donde el contacto es efectuado en la presencia de un competidor; b) identificar o seleccionar proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas que forman complejos con el primer polipéptido que atrapa proteasa; c) contactar proteasas o porción catalíticamente activa de la misma que forma complejos con el primer polipéptido que atrapa proteasa con un segundo polipéptido que atrapa proteasa en la presencia de un competidor; e d) identificar o seleccionar proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas que forman complejos con el segundo polipéptido que atrapa proteasa, con ello la proteasa identificada, involucrada o seleccionada o porción catalíticamente activa de la misma tiene especificidad de sustrato y/o actividad desdoblada por al menos dos secuencias desdobladas. 77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque al menos dos secuencias desdobladas están en un sustrato objetivo. 78. El mél;odo de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque al menos dos secuencias desdobladas están en dos diferentes sustratos obj etivo . 79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76-78, caracterizado porque el primero y segundo polipéptido que atrapa proteasa son diferentes y cada uno es modificado para ser desdoblado por una proteasa que tiene la especificidad de sustrato deseada para un sustrato objetivo diferente. 80. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76-79, caracterizado porque además comprende repetir las etapas a) y b) o a)-d) al menos una vez más hasta que una proteasa identificada o seleccionada con una especificidad de sustrato deseada o predeterminada y actividad de desdoblamiento con al menos dos secuencias desdobladas es aislada. 81. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la colección de proteasas comprende mutaciones de aminoácido en posiciones que corresponden a una proteasa de plantilla. 82.. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la especificidad de sustrato y/o actividad de desdoblamiento se incrementa comparada con la proteasa de plantilla correspondiente. 83. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la especificidad de sustrato para al menos una secuencia desdoblada, se incrementa comparada con la proteasa de plantilla correspondiente . 84. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el competidor se selecciona de entre suero humano, plasma humana, un extracto de célula o tejido, un fluido biológico tal como orina o sangre, una forma de tipo nativa purificada o parcialmente purificada de la trampa de proteasa, y una o más variantes especificas de un polipéptido que atrapa proteasa . 85. Un método para selección de proteasa, caracterizado porque comprende: a) contactar una colección de proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas con un primer polipéptido que atrapa proteasa para formar, después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasa, complejos covalentes del polipéptido que atrapa proteasa con cualquier proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en la colección; b) separar las proteasas formadas en complejos a partir polipéptido que atrapa proteasa (s) no formado en complej os ; c) aislar o seleccionar o identificar las proteasas formadas en complejo; d) generar una segunda colección de proteasas o porciones de proteasas catalíticamente activas basadas en las proteasas seleccionadas; y e) repetir las etapas a) - c) contactando la segunda colección de proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas con un segundo polipéptido que atrapa proteasa que es diferente del primer polipéptido que atrapa proteasa para formar complejos; separar los complejos; y aislar, seleccionar o identificar proteasas formadas en complejos. 86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el primer y segundo polipéptido que atrapa proteasas son modificados para contener dos diferentes secuencias de desdoblamiento de sustrato objetivo, con ello, las proteasas identificadas o seleccionadas tienen especificidad y actividad de desdoblamiento alta, con al menos dos secuencias de desdoblamiento . 87. El método de conformidad con la reivindicación 85 o 86, caracterizado porque es repetida una pluralidad de veces. 88. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 85-87, caracterizado porque una colección de proteasas o porciones de las mismas catalíticamente activas es contactada con el primero y/o segundo polipéptido que atrapa proteasa en la presencia de un competidor. 89. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el competidor se selecciona de entre suero humano, plasma humana, un extracto de célula o tejido, un fluido biológico tal como orina o sangre, una forma de tipo nativa purificada o parcialmente purificada del polipéptido que atrapa proteasa, y una o más variantes especificas de un polipéptido que atrapa proteasa. 90. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-89, caracterizado porque las colecciones contienen proteasas modificadas. 91. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque las modificaciones son aleatorias o modificadas o en una región objetivo. 92. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-91, caracterizado porque además comprende seleccionar los complejos para especificidad de sustrato por la secuencia desdoblada del sustrato objetivo. 93. Una combinación, caracterizada porque comprende : una colección de proteasas y/o porciones de las mismas catalíticamente activas; y al menos un polipéptido que atrapa proteasa. 94. La combinación de conformidad con la reivindicación 93, caracterizada porque el polipéptido que atrapa proteasa se selecciona de entre serpinas, miembros de la familia p35, miembros de la familia alfa-macroglobulina , o formas modificadas de los mismos. 95. La combinación de conformidad con la reivindicación 93 o reivindicación 94, caracterizada porque la colección de proteasas y/o porciones de las mismas catalíticamente activas son proporcionadas en una biblioteca exhibida. 96. La combinación de conformidad con la reivindicación 95, caracterizada porque la biblioteca exhibida es una biblioteca de exhibición de fago y los miembros exhiben al menos una porción catalíticamente activa de una proteasa. 97. Un kit, caracterizado porque comprende la combinación de cualquiera de las reivindicaciones 93-96, en donde cada componente es separadamente empaquetado. 98. Un método para modificar la especificidad de sustrato de una serina proteasa, caracterizado porque comprende modificar uno o más de los residuos seleccionados de entre 30, 73, 89 y 155 basados en la numeración de quimiotripsina . 99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la serina proteasa es uPA. 100. Una proteasa modificada, caracterizada porque la proteasa o fragmento de la misma catalíticamente activa es de la familia quimiotripsina de serinas proteasas; y contiene una o más mutaciones en cualquiera de las posiciones que corresponden a las posiciones 30, 73, 89, y 155, basadas en la numeración de quimiotripsina , con ello se altera la especificidad del sustrato. 101. La proteasa modificada de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la proteasa es un polipéptido activador del plasminógeno urinario modificado (u-PA) , o fragmento del mismo catalíticamente activo. 102. Un polipéptido activador del plasminógeno urinario modificado (u-PA) , que comprende una o más modificaciones de aminoácido que corresponde a posiciones de aminoácido en un po.l ipéptido u-PA expuesto en la SEC ID NO: 433, caracterizado porque: una o más modificaciones de aminoácido incrementan una o ambas de la especificidad para un sustrato objetivo o actividad hacia un sustrato objetivo; y el sustrato objetivo está involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. 103. El polipéptido activador del plasminógeno urinario modificado (u-PA) de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el sustrato objetivo es VEGF' o un sustrato activador del plasminógeno de tejido (t-PA) . 104. El polipéptido activador del plasminógeno urinario modificado (u-PA) de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo contiene una o más modificaciones en posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas de entre las posiciones 21, 24, 30, 39, 61(A), 80, 82, 84, 89, 92, 156, 158, 159, y 187 en un polipéptido u-PA expuesto en la SEC ID NO: 433, basado en la numeración de quimiotripsina , con ello la especificidad del sustrato a un sustrato t-PA o secuencia del mismo, es alterada . 105. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo, contiene una o más modificaciones seleccionadas de entre F21V, I24L, F30V, F30L, T39A, Y6I(A)H, E80G, K82E, E84K, I89V, K92E, K156T, T158A, V159A, y K187E. 106. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa de la misma, contiene modificaciones seleccionadas de entre F21V; I24L; F30V; F30L; F30V/Y61 (a) H; F30V/K82E; F30V/K156T; F30V/K82E/V159A; F30V/K82E/T39A/V159A; F30V/K82E/T158A/V159A; F30V/Y61 (a) H/K92E; F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187E; y F30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V/K187E. 107. El polipéptido activador del plasminógeno urinario modificado (u-PA) de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo, contiene una o más modificaciones en las posiciones que corresponden a las posiciones seleccionadas de entre las posiciones 38, 72, 73, 75, 132, 133, 137, 138, 155, 160, y 217 en un polipéptido u-PA expuesto en la SEC ID NO: 433, basado en la numeración de quimiotripsina, con ello, la especificidad de sustrato a VEGFR2, o secuencia del mismo, se altera. 108. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo contiene una o más modificaciones seleccionadas de entre V38D, R72G, L73A, L73P, S75P, F132L, G133D, E137G, I138T, L155P, L155V, L155M, V160A, y R217C. 109. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo además comprende una modificación en la posición 30 y/o position 89, basado en la numeración de quimiotripsina. 110. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con la rei indicación 109, caracterizado porque la modificación adicional en el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo, se selecciona de entre F30I, F30T, F30L, F30V, F30G, F30M, y I89V. 111. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo, contiene modificaciones seleccionadas de entre L73A/I89V; S75P/I89V/I138T; R72G/L155P; F132L/V160A; L73A/189V/F30T; L3A/I89V/F30L; L73A/I89V/F30V; L73A/I89V/F30G; L73A/I89V/L155V; L73A/I89V/F30M; L73A/I89V/L155M; L73A/I89V/F30L/L155M; y L73A/I89V/F30G/L155 . 112. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el polipéptido u-PA o porción catalíticamente activa del mismo contiene una o más modificaciones que corresponden a mutaciones seleccionadas de entre F30I, F30T, F30G, y F30M en un polipéptido u-PA expuesto en la SEC ID NO: 433, basado en la numeración de quimiotripsina , con ello la especificidad de sustrato a un VEGFR-2 o secuencia del mismo, se altera. 113. El polipéptido u-PA modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 102-112, caracterizado porque: el polipéptido tiene 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con un polipéptido u-PA tipo nativo expuesto en la SEC ID NO: 33, o variantes de especies o alélicas de los mismos; y el polipéptido incluye una o más modificaciones . 114. Un polipéptido MT-SPl modificado o porción catalíticamente activa del mismo, caracterizado porque comprende una o más modificaciones de aminoácido seleccionadas de entre D23E, I41F, 14IT, L52M, Y60(g)s, T56K, H71R, F93L, N95 , F97Y, F97L, T98P, F99L, A126T, V129D, P131S, I136T, I136V, H143R, T144I, I154V, N164D, T166A, L171F, P173S, F184(a)L, Q192H, S201I, Q209L, Q221(a)L, R230W, F234L, y V244G, basado en la numeración de quimiotripsina, en un polipéptido MT-SPl expuesto en la SEC ID NO:253. 115. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con la rei indicación 114, caracterizado porque las modificaciones están en la porción catalíticamente activa de un MT-SPl que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 505. 116. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con la reivindicación 114 o reivindicación 115, caracterizado porque las modificaciones están en un polipéptido MT-SPl, en donde además comprende una modificación que corresponde a la modificación de C122S en un polipéptido MT-SPl expuesto en la SEC ID NO: 253, basado en la numeración de quimiotripsina. 117. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque las modificaciones están en un polipéptido MT-SPl que tiene una secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 507 o 517. 118. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 114-117, caracterizado porque las modificaciones de aminoácido son seleccionadas de entre 14IF, F97Y, L171F y V244G. 119. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 114-118, caracterizado porque además comprende una o más modificaciones que corresponden a modificaciones Q175R o D217V en un polipéptido MT-SPl expuesto en la SEC ID NO:253. 120. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque las modificaciones de aminoácido son seleccionadas de entre I136T/N164D/T166A/F184 (A) L/D217V; I41F; 14 I F/A126T /V244G ; D23E/I41F/T98P/T144I; 14IF/L171F/V244G; H143R/Q175R; 14IF/L171F; R230W; 141 F/I 154V/V244G; I141F/L52M/V129D/Q221 (A)L; F99L; F97Y/I136V/Q192H/S201I ; H71R/P131S/D217V; D217V; T65K/F93L/F97Y/ D217V; 14IT/P173S/Q209L; F97L/F234L; Q175R; N95K; y Y60(G)S. 121. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 114-120, caracterizado porque las modificaciones incrementan una o ambas de la especificidad para una proteina complemento C2 o actividad hacia la proteina complemento C2. 122. El polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 114-121, caracterizado porque: el polipéptido tiene 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con un polipéptido MT-SPl tipo nativo expuesto en la SEC ID NO: 253, o a porción catalíticamente activa de la misma expuesta en la SEC ID NO: 505, o una variante de especies o alélicas de la misma; y el polipéptido incluye una o más modificaciones. 123. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido u-PA modificado de conformidad con la reivindicación 102. 124. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido u-PA modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 104-106. 125. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido u-PA modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 107-113. 126. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido MT-SPl modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 114-122. 127. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 123-126, caracterizada porque además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 128. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 127, caracterizada porque la composición farmacéutica es formulada para administración sistémica, oral, nasal, pulmonar, local o tópica. 129. Un kit, caracterizado porque comprende la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 123-126, un dispositivo para la administración de la composición y, opcionalmente, instrucciones para administración. 130. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica' cualquiera de las proteasas u-PA modificadas de conformidad con las reivindicaciones 102-113. 131. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteasas MT-SPl modificadas de conformidad con las reivindicaciones 114-122. 132. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 130 o 131. 133. Una célula, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 132. 13 . Un método de tratamiento, caracterizado porque comprende tratar un sujeto administrando una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 124, en donde el sujeto tiene una enfermedad o condición que es tratada por la administración de t-PA. 135. El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado porque la enfermedad o condición se selecciona de entre trombosis arterial, trombosis venosa y trombo embolismo, apoplejía isquémica, trastornos de coagulación adquiridos, coagulación extravascular diseminad, infección bacteriana y periodontitis , y condiciones neurologicas. 136. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque la enfermedad o condición es trombosis que obstruye un catéter. 137. Un método de tratamiento, caracterizado porque comprende tratar un sujeto administrando una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 125, en donde el sujeto tiene una enfermedad o condición que es mediada por VEGFR-2. 138. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la enfermedad o condición a ser tratada es una enfermedad angiogénica. 139. El método de conformidad con la reivindicación 138, caracterizado porque la enfermedad angiogénica se selecciona de entre cáncer, degeneración macular, inflamación y diabetes. 140. El método de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado porque además comprende administrar otro agente anti-tumoral . 141. Un método de tratamiento, caracterizado porque comprende tratar un sujeto administrando una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 126, en donde el sujeto tiene una enfermedad o condición que es mediada por la proteina de complemento C2. 142. El método de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado porque la enfermedad o condición se selecciona de entre enfermedades autoinmunes, sepsis, artritis. reumatoide (RA) , glomerulonefritis membranoproliferativa ( PGN) , esclerosis múltiple (MS) , miastenia gravis (MG) , asma, enfermedad del intestino inflamatorio, lesión de tejido inflamatorio agudo medada por el complejo inmune (IC), enfermedad de Alzheimer (AD) , lesión por reperfusión-isquemia, degeneración macular, rechazo de un órgano Lransplantado y síndrome Guillan-Barre . 143. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque la lesión por reperfusión-isquemia, es causada por un evento o tratamiento seleccionado de entre infarto miocardial (MI); apoplejía, angioplastia , injerto de derivación de arteria coronaria, derivación cardiopulraonar (CPB) y hemodiálisis . 144. El método de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado porque la enfermedad o condición resulta de un tratamiento de un sujeto. 145. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque la adminis ación de un T-SP1 modificado es efectuada antes del tratamiento a un sujeto. 146. El método de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado porque la administración de un MT-SP1 modificado es efectuada contactando un fluido corporal o muestra de Lej ido in vitro, ex vivo o in vivo, con un MT-SP1 modificado. 147. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque el tratamiento resulta en lesión por reperfusión-isquemia mediada por el complemento . 148. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el tratamiento es angioplastia o injerto por derivación de arteria coronaria. 149. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 124, para el tratamiento de una enfermedad o condición que es tratada por administración de t-PA. 150. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 124, en la preparación de un medicamento para tratamiento de una enfermedad o condición que es tratada por t-PA. 151. El uso de conformidad con la reivindicación 149 o reivindicación 150, en donde la enfermedad o condición se selecciona de entre trombosis arterial, trombosis venosa y tromboembolismo, apoplejía isquémica, trastornos de coagulación adquiridos, coagulación intravascular diseminada, infección bacteriana y periodontitis , y condiciones neurologicas. 152. El uso de conformidad con la reivindicación 149 o reivindicación 150, en donde la enfermedad o condición es trombosis que obstruye un catéter. 153. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 125, para el tratamiento de una enfermedad o condición que es mediada por VEGFR-2. 154. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 125, en la preparación de un medicamento para tratamiento de una enfermedad o condición que es mediada por VEGFR-2. 155. El uso de conformidad con la reivindicación 153 o reivindicación 154, en donde la enfermedad o condición a ser tratada es una enfermedad angiogénica. 156. El uso de conformidad con la reivindicación 155, en donde la enfermedad angiogénica se selecciona de entre cáncer, degeneración macular, inflamación y diabetes. 157. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 153-156, que además comprende administrar otro agente anti-tumoral . 158. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 126, para el tratamiento de una enfermedad o condición que es mediada por la proteina de complemento C2. 159. Uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 126, para formular un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o condición que es mediada por la proteina de complemento C2. 160. El uso de la reivindicación 158 o 159, en donde la enfermedad o condición es seleccionada de entre enfermedades autoinmunes, sepsis, artritis reumatoide (RA) , glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN) , esclerosis múltiple (MS) , miastenia gravis (MG) , asma, enfermedad del intestino inflamatorio, lesión de tejido inflamatorio agudo mediada por complejo inmune (IC), enfermedad de Alzheimer (AD) , lesión por reperfusión-isquemia, rechazo de un órgano transplantado, degeneración macular y síndrome de Guillan-Barre . 161. El uso de conformidad con la reivindicación 160, en donde la lesión por reperfusión-isquemia es causada por un evento o tratamiento seleccionado de entre infarto miocardial (MI), apoplejía, angioplastia, injerto por derivación de arteria coronaria, derivación cardiopulmonar (CPB) , y hemodiálisis . 162. Un polipéptido serpina modificado, caracterizado porque comprende modificaciones en su bucle de sitio reactive que corresponde a cualquiera o más de las posiciones P4-P2', con una secuencia desdoblada para un sustrato objetivo. 163. El polipéptido serpina modificado de conformidad con la reivindicación 162, caracterizado porque el sustrato objetivo está involucrado en la etiología de una enfermedad o trastorno. 164. El polipéptido serpina modificado de conformidad con la reivindicación 162 o 163, caracterizado porque el sustrato objetivo se selecciona de entre un VEGFR, una proteína complemento o un sustrato t-PA. 165. El polipéptido serpina modificado de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque el sustrato objetivo es un VEGFR2. 166. El polipéptido serpina modificado de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque la proteína complemento es C2. 167. El polipéptido serpina modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 162-166, caracterizado porque la serpina es un inhibidor-1 activador del plasminógeno (PAI-1) o antitrombina-3 (AT3) . 168. El polipéptido serpina modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 162-167, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 497, 499, 610 y 611. 169. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-40, caracterizado porque la proteasa es calicreina humana 8. 170. Un método, caracterizado porque comprende: a) contactar una colección de proteasas y/o porciones de proteasas- catalíticamente activas con un polipéptido que atrapa proteasa para formar, después del desdoblamiento del polipéptido que atrapa proteasa por la proteasa o porciones de la misma catalíticamente activas, complejos estables que contienen el polipéptido que atrapa proteasa con una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en la colección; y b) identificar o seleccionar una proteasa o porción de la misma catalíticamente activa en un complejo, en donde la colección contiene 2 diferentes elementos.