TW200815467A - Anti-DLL4 antibodies and methods using same - Google Patents

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200815467 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明一般係關於分子生物學領域。更特定而言，本發 明係關於抗-DLL4抗體及其用途。 不儉 【先前技術】 血管供應之形成為很多生理及病理過程之基要 如胚胎及腫瘤之活躍生長纽織胃 ' 贫、且螂而要足夠的血液供應。1藉 由產生促血管生成因子來滿足此需要，促血管生成因；： 由所謂血管生成之過程促進新血管形成。血管形成為一種 複雜但有序的生物事件，其包括以下全部或多個步驟：a) 内皮細胞（EC)自現存EC增殖或自祖細胞分化；b)Ec遷移 且接合而形成索樣結構；勾血管索接著經歷脈管生成而形 成具有中央内腔之脈管；d)現存索或脈管長出芽而形成二 級脈管；e)原始脈管叢經歷進一步重塑及再成形；及〇募 集周圍内皮細胞以包覆内皮管，向脈管提供維持及調節功 能；該等細胞包括小毛細血管之周細胞、較大脈管之平滑 肌細胞及心臟中之心肌細胞。Hanahan，277:48-50 (1997)，Hogan 及 Kolodziej，iVai. i^ev· 3:513_23 (2002) ; Lubarsky及 Krasnow，Ce// 112:19-28 (2003) 〇 血管生成牵涉於多種病症之致病原因中現已得到充分破 認。該等病症包括實體腫瘤及癌轉移、動脈粥樣硬化、晶 狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管 性疾病（諸如增生性視網膜病（例如糠尿病性視網膜病））、 年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼、所移植 121444.doc 200815467 之角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎 及牛皮癖。Folkman等人，5/(9厂 C/iem. 267:10931-34 (1992) ; Klagsbrun等人，d训μ. 53:217-39 (1991);及Garner Α·，"Vascular diseases，’’於：Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A·， Klintworth GK編，第 2版（Marcel Dekker，NY，1994)，第 1625-1710頁。 在腫瘤生長之情況下，血管生成‘似乎為過度增生轉變為 腫瘤形成以及為腫瘤之生長及轉移供應營養的關鍵。 Folkman等人，339:58 (1989)。與正常細胞相比， 新血管生成使腫瘤細胞獲得生長優勢及增生自主性。腫瘤 通常始於單個異常細胞，此細胞可因遠離可供利用之毛細 血管床而僅增殖為幾立方毫米之尺寸，且其會長期*休眠’ 而不進一步生長及擴散。接著有些腫瘤細胞轉變成血管生 成表型以活化内皮細胞，該等内皮細胞增殖且成熟為新毛 細血管。該等新形成之血管不僅可使原發性腫瘤繼續生 長，而且亦使轉移性腫瘤細胞擴散且再次拓殖。因此’已 觀察到腫瘤切片中微金管密度與乳癌及其他若干腫瘤之患 者存活率之間存在相關性。Weidner等人，见五叩/·丄Mei 324:1-6 (1991) ; H〇Tak等人，加以 340:1120-24 (1992); Macchiarini等人，340:145-46 (1992)。控制血管生 成轉變之確切機制尚未完全暸解，但咸信腫瘤塊中之新血 管生成係因大量血管生成刺激物與抑制物之間的淨平衡引 起（Folkman，伽· MW. 1 (1):27-31 (1995)) 〇 121444.doc 200815467 血管發育之過程受到緊密調控。迄今業已證明很多種分 子（大多為周圍細胞所產生之分泌因子）可調控EC分化、增 殖、遷移及接合成索樣結構。舉例而言，血管内皮生長因 子（VEGF)已鑑別為與刺激血管生成及誘導血管透過性相關 的關鍵因子。Ferrara等人，五18:4-25 (1997)。 即便單個VEGF等位基因之丟失亦可造成胚胎死亡的觀察 結果指出該因子在血管系統之發育及分化中所起的不可替 代之作用。此外，業已證明VEGF為與腫瘤及眼内病症相 關的新血管生成之關鍵介體。Ferrara等人，五Woer. 同 上。在所檢查之人類腫瘤中，大部分過度表現VEGF mRNA。Berkman等人，义 C/ϋ /πνα，· 91:153-59 (1993); Βτοπη 專 k，Human Pathol. 26:86-91 (1995) ; Brown 等 人，C^mcer 53:4727-35 (1993) ; Mattern等人，召r/ί. J. Cancer 73:931-34 (1996) ; Dvorak 等人，dm. J· Pathol, 146:1029_39 (1995)。 同樣，在患有糖尿病性視網膜病及其他局部缺血相關之 視網膜病之患者中，眼液中VEGF之濃度水平與血管活躍 增生之存在高度相關。Aiello等人，见五叹/. J. Mei 331:1480-87 (1994)。此外，研究已證明VEGF在受AMD侵 染之患者中定位於脈絡膜新生血管膜中。Lopez等人， Invest. Ophthalmol· Vis. Sci· 3Ί° 抗- VEGF中和抗體抑制多種人類腫瘤細胞株在裸小鼠中 之生長（Kim 等人，iVaiwre 362:841-44 (1993) ; Warren 等 人，J. CVz·;?· /πναί. 95:1789-97 (1995) ; Borgstrdm等人， 121444.doc 200815467

Cancer Res. 56:4032-39 (1996) i Melnyk^ A 5 Cancer Res· 56:921-24 (1996))且亦抑制局部缺血性視網膜病症模型中 之眼内血管生成（Adamis 等人，jrc/i. 114:66- 71 (1996))。因此，抗-VEGF單株抗體或VEGF作用之其他 抑制劑為治療腫瘤及各種眼内新生血管性病症之有前途之 候選物。該等抗體例如描述於1998年1月14日公開之EP 817,648以及均於1998年10月15日公開之WO 98/45331及 WO 98/45332中。FDA已批准一種抗-VEGF抗體貝伐單抗 (bevacizumab)，其可與化學治療方案組合使用以治療特定 癌症，且FDA已批准一種抗-VEGF抗體片段蘭尼單抗 (ranibizumab)用於治療年齡相關之（濕性）黃斑變性。兩種 藥物均正處於臨床試驗研究中。 顯然，仍繼續對具有臨床屬性、最適宜作為治療劑開發 的藥劑存在需要。本文中所述之本發明滿足此需要且可提 供其他益處。 本文中所引用之全部參考文獻，包括專利申請案及公開 案，均以引用之方式全文併入本文中。 【發明内容】 本發明部分基於多種DLL4結合劑（諸如免疫接合物、抗 體及其片段)之鑑別。DLL4係作為一種重要且有利的治療 標靶呈現，且本發明提供基於結合DLL4的組合物及方 法。如本文中所述之本發明之DLL4結合劑提供用於靶向 與DLL4-Notch受體途徑之表現及/或活性相關的病理性病 狀的重要治療劑及診斷劑。因此，本發明提供與DLL4結 121444.doc 200815467 合相關之方法、組合物、套組及製品。 本發明提供結合（諸如特異性結合）DLL4的抗體。 在一態樣中，本發明提供一種經分離之抗-DLL4抗體， 其中全長IgG形式之抗體以約1 nM或約1 nM以上或約500 pM或500 pM以上之結合親和力特異性結合人類DLL4。如 此項技術中所公認，配體與其受體之結合親和力可使用多 種檢定中之任何檢定加以測定且可利用多種數值來表示。 因此，在一實施例中，結合親和力可表示為Kd值且反映固 • 有結合親和力（例如，最小親合性作用）。無論在無細胞環 境或與細胞相關之環境中，結合親和力通常且較佳在活體 外量測。可利用此項技術中已知之多種檢定法中之任何檢 定，包括本文中所述之彼等檢定，包括例如Biacore®、放 射免疫檢定法（RIA)及ELISA，以獲得結合親和.力量測值。 在一些實施例中，經分離之抗-DLL4抗體以類似親和力結 合人類及小鼠DLL4，亦即，對人類DLL4之結合親和力比 對小鼠DLL4之結合親和力大或小不超過100倍。在一些實 施例中，對人類DLL4之結合親和力比對小鼠DLL4之結合 親和力大或小不超過10倍。在一些實施例中，該抗體以約 1 nM或1 nM以上或約500 pM或500 pM以上之結合親和力 特異性結合小鼠DLL4。 在一態樣中，本發明提供一種經分離之抗-DLL4抗體， 其中全長IgG形式之抗體以約2x105或2x105以上或約lx 105 或ΙχΙΟ5以上之^寺異性結合人類DLL4。如此項技術中所 公認，配體與其受體結合之kon可使用多種檢定法中之任何 121444.doc -10· 200815467 檢定加以測定且可利用多種數值來表示。 在一態樣中，本發明提供一種結合DLL4之配體結合區 的分離抗體。在一些實施例中，分離抗體結合包含、由或 大體上由DLL4胞外域組成之多肽。在一些實施例中，分 離抗體結合包含、由或大體上由人類DLL4中之胺基酸252-282、1-252、1-286、1-324及 / 或 219-286組成之多肽。 在一態樣中，本發明提供一種與Notch受體競爭結合 DLL4的經分離之抗-DLL4抗體。 • 在一態樣中，本發明提供一種抑制、還原及/或阻斷 DLL4生物活性的經分離之抗-DLL4抗體。 在一態樣中，本發明之抗-DLL4抗體包含： (a)至少一、二、三、四、五或六個高變區（HVR)序列， 其係選自由以下序列組成之群： ⑴包含序列A1-A11之HVR-L1 ， 其中A1-A11為 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:10)； (Π)包含序列B1-B7之HVR-L2 ， 其中B1-B7為 • SASFLYS(SEQ ID N0:11)； (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 QQSYNGPST(SEQ ID N0:15)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1 ，其中D1-D10為 GFTFTDNWIS(SEQ ID ΝΟ:1)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2 ， 其中E1-E18為 GVINPNSGATEYADSVKG(SEQ ID NO:5)及 (vi) 包含序列F1-F15之HVR-H3 ，其中F1-F15為 121444.doc •11- 200815467 VYYCARDNFGGYFDY(SEQ ID NO:9);及 (b)至少一種變異體HVR，其中該變異體HVR序列包含 SEQ ID NO: 1-18中所示序列中至少一個殘基之修飾。 在一態樣中，本發明之抗-DLL4抗體包含： (a) 至少一、二、三、四或五個高變區（HVR)序列，其係 選自由以下序列組成之群： ⑴包含序列A1-A11之HVR-L1 ，其中A1-A11為 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:10)； ® (ii)包含序列B1-B7之HVR-L2 ，其中B1_B7為 SASFLYS(SEQ ID ΝΟ:11)； (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 QQSVNGPAT(SEQ ID NO:14)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1 ，其中D1_D10為 GFSFRDNWIS(SEQ ID NO:2)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GVINPNSGSTDYADSVKG(SEQ ID NO:3)； ^ (vi)包含序列F1-F15之HVR-H3 ’其中F1-F15為 VYYCARDNFGGYFDY(SEQ ID NO:9);及 (b) 至少一種變異體HVR，其中該變異體HVR序列包含 SEQ ID NO: 1-18中所示序列中至少一個殘基之修飾。 在一態樣中，本發明之抗-DLL4抗體包含： (a)至少一、二、三、四或五個高變區（HVR)序列，其係 選自由以下序列組成之群： ⑴包含序列A1-A11之HVR-L1 ，其中A1-A11為 121444.doc -12- 200815467 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:10)； (ii) 包含序列旧47之！^1^2 ，其中B1-B7為 SASFLYS(SEQ ID NO:ll)； (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中ChC9為 QQSYTGTVT(SEQ ID NO:18)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1 ，其中D1-D10為 GFTFTDNWIS(SEQ ID N0:1)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2 ，其中EhE18為 GYISPNSGFTYYADSVKG(SEQ ID N0:8)及 (vi) 包含序列F1-F15之HVR-H3 ，其中FLF15為 VYYCARDNFGGYFDY(SEQ ID N0:9);及 (b)至少一種變異體HVR，其中該變異體HVR序列包含 SEQ ID NO: 1-18中所示序列中至少一個殘基之修飾。 在一態樣中，本發明提供一種包含一、二、三、四、五 或六個HVR的抗體，其中各HVR包含、由或大體上由選自 由SEQ ID ΝΟ:；1·18組成之群之序列組成，且其中SEQ ID ΝΟ··10 對應於 HVR-L1，SEQ ID ΝΟ:11 對應於 HVR-L2， SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17 或 18 對應於11¥11-L3，SEQ ID ΝΟ:1 或 2對應於HVR-H1，SEQ ID NO:3、4、 5、6、7或 8對應於 HVR_H2，且 SEQ ID NO:9對應於HVR-H3。在一實施例中，本發明之抗體包含11¥11-1^、11¥11-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3，其中各序列 依次包含 SEQ ID ΝΟ··10、11、12、1、3、9。在一實施例 中，本發明之抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、 121444.doc -13 - 200815467 HVR-Hl、HVR-H2及HVR-H3，其中各序列依次包含SEQ ID NO: 10、11、13、1、4、9。在一實施例中，本發明之 抗體包含 HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中各序列依次包含SEQ ID NO:10、11、 14、2、3、9。在一實施例中，本發明之抗體包含11¥11-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及 HVR-H3， 其中各序列依次包含SEQ ID NO:10、11、15、1、5、9。 在一實施例中，本發明之抗體包含HVR-L1、HVR-L2、 HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及 HVR-H3，其中各序列依次 包含 SEQ ID NChlO、11、16、1、6、9。在一實施例中， 本發明之抗體包含 HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl、HVR-H2及HVR-H3，其中各序列依次包含SEQ ID NO: 10、11、17、1、7、9。在一實施例中，本發明之抗體 包含 HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3，其中各序列依次包含SEQ ID NO:10、11、18、 1、8、9 〇 本發明抗體中之變異體HVR在HVR内可具有一或多個 (諸如二、三、四、五或五個以上）殘基之修飾。 在一實施例中，HVR-L3變異體在以下位置之任何組合 中包含 1-6(1、2、3、4、5或 6)處取代：91(S 或 W)、92(Y 或 F)、93(Τ、Ν 或 S)、94(Τ 或 G)、95(P、Q、Α 或 Τ)及 / 或 96(P、S、A 或 V)。 在一實施例中，HVR-H2變異體在以下位置之任何組合 中包含1-4(1、2、3或4)處取代：50(V、L或Y)、52(N或 121444.doc -14- 200815467 S)、52a(P或 S)或 53(N、Q、T或 I)。 各位置後之括號中的字母指示說明性取代（亦即，置換） 胺基酸，如對於熟習此項技術者顯而易見，可利用此項技 術中已知及/或本文中所述之技術常規性評估在本文中所 述之上下文中用作取代胺基酸的其他胺基酸的適用性。 在一恶樣中，本發明提供一種包含包括SEq iD ^^^或二 之序列之HVR-H1區的抗體。在一態樣中，本發明提供一 種包含包括SEQ ID ΝΟ··3、4、5、6、7或8之序列之hVR_ H2區的抗體。在一態樣中，本發明提供一種包含包括seq ID NO:9之序列之HVR-H3區的抗體。在一實施例中，本發 明提供一種包含包括SEQ ID NO:10之序列之hvr_l1區的 抗體。在一實施例中，本發明提供一種包含包括SEQ m ΝΟ:11之序列之HVR-L2區的抗體。在一實施例中，本發明 提供一種包含包括 SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、17或 18之序列之HVR-L3區的抗體。 在一態樣中，本發明提供一種包含以下序列中之至少一 個、至少兩個或全部三個序列的抗體： ⑴包含SEQIDN0:1之序列之HVR-H1序列； (ii) 包含 SEQ ID NO:5之序列之HVR-H2 ; (iii) 包含SEQ ID N〇:9之序列之HVR-H3序列。 在一態樣中，本發明提供一種包含以下序列中之至少一 個、至少兩個或全部三個序列的抗體： ⑴包含SEQIDNO.10之序列之HVR-L1序列； (ii)包含SEQ ID ΝΟ:11之序列之HVR-L2序列； 121444.doc -15- 200815467 (iii)包含SEQ ID NO:15之序列之HVRL3序列。 在一態樣中，本發明提供一種包含以下序列中之至少一 個、至少兩個或全部三個序列的抗體： (i) 包含SEQIDNO:l之序列之HVR-H1序列； (ii) 包含SEQIDNO:8之序列之HVR-H2序列； (iii) 包含SEQ ID ΝΟ··9之序列之HVR-H3序列。 在一態樣中，本發明提供一種包含以下序列中之至少一 個、至少兩個或全部三個序列的抗體： • ⑴包含SEQ ID ΝΟ:10之序列之HVR-L1序列； (ii) 包含SEQ ID ]^0:11之序列之《^11-[2序列； (iii) 包含SEQIDNO:18之序列之HVR-L3序列。 如圖la及lb中所示，相對於個別HVR(亦即，HI、H2或 H3)將SEQ ID ΝΟ:1-18之胺基酸序列編號，此編號與如下 所述之Kabat編號系統一致。 在一態樣中，本發明提供包含如圖la及lb中所示之重鏈 HVR序列的抗體。 ^ 在一態樣中，本發明提供包含如圖la及lb中所示之輕鏈 HVR序列的抗體。 本發明抗體之某些實施例包含如以下SEQ ID NO:52中所 示之人源化 4D5 抗體（lmMAb4D5-8)(HERCEPTIN®， Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(亦在美國 專利第 6,407,213 號及 Lee等人，义 Mo/· (2004)，340 (5):1073_93中提及）之輕鏈可變域。 1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 121444.doc -16· 200815467

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin

Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107(SEQ ID NO:52)(HVR殘基加有下劃線）。

在一實施例中，huMAb4D5-8輕鍵可變域序列在位置 30、66及91中之一或多處（上文分別以粗體/斜體所示之 Asn、Arg及His)經修飾。在一實施例中，經修飾之 huMAb4D5-8序列包含位置30中之Ser、位置66中之Gly及/ 或位置91中之Ser。因此，在一實施例中，本發明之抗體 包含包括以下SEQ ID ΝΟ··53中所示之序列的輕鏈可變域： 1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin

Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107(SEQ ID NO:53)(HVR殘基加有下劃線）。 相對於huMAb4D5-8經取代之殘基在上文中以粗體/斜體 121444.doc -17- 200815467 指示。 若與DLL4之結合活性得以大體上保持，則本發明之抗 體可包含任何適當的框架可變域序列。舉例而言，在一些 實施例中，本發明之抗體包含人類第III子群重鏈框架一致 序列。在該等抗體之一實施例中，框架一致序列包含位置 71、73及/或78處之取代。在該等抗體之一些實施例中， 位置71為A，73為T且/或78為A。在一實施例中，該等抗 體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN®，Genentech，Inc·，South • San Francisco, CA，USA)(亦在美國專利第 6,407,213號及第 5,821,337 號，及 Lee 等人，J. Mol. Biol· (2004)，340 (5)··1073-93中提及）之重鏈可變域框架序列。在一實施例 中，該等抗體進一步包含人類κΐ輕鏈框架一致序列。在一 實施例中，該等抗體包含如美國專利第6,407,213號及第 5,821，337號中所述之huMAb4D5-8之輕鏈HVR序列。在一 實施例中，該等抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN®， Genentech，Inc·，South San Francisco，CA，USA)(亦在美國 專利第6,407,213號及第5,821，337號，及Lee等人，J. Mol· Biol. (2004)，340 (5):1073-93中提及）之輕鏈可變域序列。 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中框 架序列包含 SEQ ID N0:19、20、21、22、23、24、25、 26 、 27 、 28 、 29 、 30 、 31 、 32 、 33 、 34 、 35 、 36及/或37 之序歹丨j，且HVR HI、H2及H3序列分別為SEQ ID ΝΟ:1、5 及/或9。在一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域， 其中框架序列包含SEQ ID NO:38、39、40及/或41之序 121444.doc 18· 200815467 列’且HVR Ll、L2及L3序列分別為SEQ ID ΝΟ··10、11及/ 或15。 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中框 架序列包含 SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36及 /或 37 之序列，且HVR HI、H2及H3序列分別為SEQ ID NO:2、3 及/或9。在一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域， 其中框架序列包含SEQ ID NO:38、39、40及/或41之序 列’且HVR Ll、L2及L3序列分別為SEQ ID NO:10、11及/ 或14 〇 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中框 架序列包含 SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36及/或 37 之序列，且HVR HI、H2及H3序列分別為SEQ ID ΝΟ:1、8 及/或9。在一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域， 其中框架序列包含SEQ ID ΝΟ··38、39、40及/或41之序 列，且HVR Ll、L2及L3序列分別為SEQ ID ΝΟ:10、11及/ 或18 〇 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中框 架序列包含SEQ ID ΝΟ:46、47、48及/或49之序列，且 HVR HI、Η2及Η3序列分別為SEQ ID ΝΟ:1、5及/或9。在 一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中框架序 列包含SEQ ID ΝΟ:42、43、44及/或45之序列，且HVR Ll、L2及L3序列分別為SEQ ID ΝΟ:10、11及/或15。 121444.doc -19- 200815467 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中框 架序列包含SEQ ID NO:46、47、48及/或49之序列，且 HVR HI、H2及H3序列分別為SEQ ID NO:2、3及/或9。在 一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中框架序 列包含SEQ ID NO:42、43、44及/或45之序列，且HVR LI、L2及L3序列分別為SEQ ID NO:10、11及/或14。 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中框 架序列包含SEQ ID NO:46、47、48及/或49之序列，且 HVR HI、H2及H3序列分別為SEQ ID ΝΟ:1、8及/或9。在 一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中框架序 列包含SEQ ID NO:42、43、44及/或45之序列，且HVR LI、L2及L3序列分別為SEQ ID NO:10、11及/或18。 在一實施例中，本發明之抗體經親和力成熟以獲得所要 之標靶結合親和力。在一實例中，本發明之親和力成熟抗 體包含胺基酸位置H28、H30、H31、H32、H33、L91、 L92、L93、L94、L95及/或L96中一或多處之取代。在一 實例中，本發明之親和力成熟抗體包含以下取代中之一或 多者：（a)在重鏈中，V50L、V50Y、N52S、P52aS、 N53Q、N53T、N53I、S56A、S56F、T57S、D58E、 D58I、D58A、D58Y ;或（b)在輕鏈中，S91W、Y92F、 T93N、T93S、T94G、P95Q、P95A、P95T、P96S、 P96A、P96V。 在一實施例中，本發明之抗體包含包括SEQ ID NO:54之 序列的重鏈可變域。在一實施例中，本發明之抗體包含包 121444.doc •20- 200815467 括SEQIDNO:55之序列的輕鏈可

發明之抗體包含包括SEq ID nq: 發明之抗體包含包括SEQ ID Ν(> 受域。在一實施例中，本 :56之序列的重鏈可變域及 包括SEQIDNO:57之序列的輕鏈可變域。 在貝鉍例中，本發明之抗體包含包括SEq ID N〇:58之 序列的重鏈可變域。在一實施例中， 括SEQ ID NO:59之序列的輕鏈可變域 本發明之抗體包含包 。在一實施例中，本 赉明之抗體包含包括SEQ ID NO:58之序列的重鏈可變域及 包括SEQ IDNO:59之序列的輕鏈可變域。 在一態樣中，本發明提供一種與上述任何抗體競爭結合 DLL4的抗體。在一態樣中，本發明提供一種如上述任何 抗體般結合DLL4上同一抗原決定基的抗體。 如此項技術中所已知，且如下文中更詳細描述，界定抗 體高變區之胺基酸位置/邊界可視本上下文及此項技術中 已知之各種定義而改變（如下所述）。可變域内部的一些位 置可視為混合高變位置，原因在於該等位置按一類標準可 認為處於高變區内，而按另一不同類標準可認為處於高變 區之外。該等位置中之一或多者亦可見於擴展之高變區中 (如下文進一步定義）。 在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中， 121444.doc -21- 200815467 抗體為多株抗體。在-些實施例中，抗體係選自由後合抗 體、親和力成热抗體、人源化抗體及人類抗體組成之群。 在一些實施例中，抗體為抗體片段。在一些實施例中，抗 體為 Fab、Fab，、Fab’-SH、F(ab，)^ scFv。 在一實施例中，抗體為嵌合抗體，例如，一種包含來自 非人類供體、與異源非人類、人類或人源化序列（例如， 框架序列及/或恆定域序列）接合之抗原結合序列的抗體。 在一貝施例中，抗原結合序列為合成序列，例如，藉由突 攀 》誘發（例如，嗤菌體呈現篩檢等）所獲得之序列。在一實 %例中，本發明之嵌合抗體具有鼠v區及人類c區。在一 κ施例中，鼠輕鏈V區係與人類鏈融合。在一實施例 中’鼠重鏈V區係與人類igGi C區融合。 本發明之人源化抗體包括在FR中具有胺基酸取代的彼等 抗體及在接枝CDR中具有變化之親和力成熟變異體。cDR 或FR中經取代之胺基酸不限於供體或受體抗體中所存在的 籲彼等胺基酸。在其他實施例中，本發明之抗體進—步包含 以區中胺基酸殘基之改變，其可使得效應功能改良，包括 CDC及/或aDCC功能增強及B細胞致死。本發明之其他抗 體包括具有可改良穩定性之特定改變的彼等抗體。在其他 只施例中，本發明之抗體包含Fe區中胺基酸殘基之改變， 其可使得效應功能降低，例如，CDC及/或ADCC功能降低 及/或B細胞致死降低。在一些實施例中，本發明之抗體的 特徵在於與自然殺手（NK)細胞上人類補體因子clq及/或人 類Fc叉體之結合降低（諸如不存在結合）。在一些實施例 121444.doc -22 * 200815467 中，本發明之抗體的特徵在於與人類FcyRI、FcyRIIA及/ 或FcyRIIIA之結合降低（諸如不存在結合）。在一些實施例 中，本發明之抗體屬於IgG類別（例如，IgGl或IgG4)且包 含至少一個 E233、L234、G236、D265、D270、N297、 E318、K320、K322、A327、A330、P331 及/或 P329(根據 EU索引編號）中之突變。在一些實施例中，抗體包含突變 L234A/L235A或 D265A/N297A。 在一態樣中，本發明提供包含本文中所提供之任何抗原 結合序列的抗-DLL4多肽，其中該等抗-DLL4多肽特異性 結合DLL4。 本發明之抗體結合（諸如特異性結合）DLL4，且在一些實 施例中可調節DLL4相關效應之一或多個態樣，其包括但 不限於以下態樣中之任一或多者：減弱或阻斷Notch受體 活化、減弱或阻斷Notch受體下游分子信號轉導、破壞或 阻斷Notch受體與DLL4之結合，及/或促進内皮細胞增殖， 及/或抑制内皮細胞分化，及/或抑制動脈分化，及/或抑制 腫瘤血管灌注，及/或治療及/或預防腫瘤、細胞增殖性病 症或癌症；及/或治療或預防與DLL4表現及/或活性相關之 病症及/或治療或預防與Notch受體表現及/或活性相關之病 症。在一些實施例中，本發明之抗體特異性結合DLL4。 在一些實施例中，該抗體特異性結合DLL4胞外域（ECD)。 在一些實施例中，該抗體特異性結合由或大體上由DLL4 胞外域組成之多肽。在一些實施例中，該抗體以約1 nM或 1 nM以上或約500 pM或500 pM以上之KD特異性結合 121444.doc -23- 200815467 DLL4。在一些實施例中，該抗體以約2x1 〇5或2χ l〇5以上或 1 〇或1X1 〇以上之kQn特異性結合人類。在一些 A知例中’本發明之抗體可活體内及/或活體外減弱、抑 制及/或阻斷DLL4活性。在一些實施例中，該抗體與 LL4配體競爭結合（減弱及/或阻斷受體與dll4之結 合）。 在一態樣中，本發明提供包含本發明之一或多種抗體及 載诏之、、且台物。在一實施例中，該載劑為醫藥學上可接受 之載劑。 在1、樣中，本發明提供編碼本發明之抗—DLL4抗體之 核酸。 ’本發明提供包含本發明之核酸之載體。 ，本發明提供包含本發明之一或多種核酸及 。在一實施例中，該載劑為醫藥學上可接受 在一態樣中 在一態樣中 載劑之組合物 之载劑。 在悲樣中，本發明提供包含本發明之核酸或載體之宿 主細胞。載體可屬於任何類型，例如，重組載體，諸如表 現載體。可使用多種宿主細胞中之任一種。在一實施例 中，佰主細胞為原核細胞，例如，大腸桿菌（ε·。在 -實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如，哺乳動物細 胞’諸如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞。 在一態樣中，本發明提供製備本發明之抗體的方法。舉 例而言，本發明提供製備抗_DLL4抗體（如本文中定義，其 包括全長抗體及其片段）或免疫接合物的方法，該方法/包 121444.doc -24- 200815467 含：在適當的宿主細胞中表現編碼該抗體（或其片段）之本 發明之重組載體，以及回收該抗體。

在一態樣中，本發明提供一種包含一容器及容納於該容 益内之組合物之製品，其中該組合物包含本發明之一或多 種抗-DLL4抗體。在一實施例中，組合物進一步包含抗血 管生成劑。在一實施例中，抗血管生成劑為抗_¥£仍抗 體’例如’貝伐單抗。在—實施例中，組合物包含本發明 之核酸。在一實施例中，包含抗體之組合物進一步包含載 劑，在一些實施例中該載劑為醫藥學上可接受之載劑。在 -實施例中’容器内含有第二組合物，其中該第二組合物 包含抗血管生成劑。在一實施例中，抗血管生成劑為抗_ VEGF抗Μ，例如，貝伐單抗。在一實施例中，本發明之 製品進一步包含將組合物（例如抗體）投與個體的說明書（諸 如本文中所述之任何方法的說明書）。 在一態樣中，本發明提供一種包含一第一容器及一第二 今裔的套組，該第一容器包含包括本發明之一或多種抗_ DLL4抗體之組合物且該第二容器包含緩衝劑。在一實施 例中，緩衝劑為醫藥學上可接受之緩衝劑。在—實施例 中，包含抗體之組合物進一步包含載劑，在一些實施例中 該載劑為醫藥學上可接受之載劑。在—實施例中，套組進 一步包含將組合物（例如，抗體）投與個體之說明書。 在恶樣中，本發明提供本發明之抗_DLL4抗體在製備 用；/口療f生及/或預防性治療諸如癌症、腫瘤及，或細胞增 殖性病症之病症之藥物中的用诠。 121444.doc -25 - 200815467 為與血管生成相關之病理性病狀。 在悲樣中，本發明提供本發明之核酸在製備用於治療 性及/或預防性治療諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症 之病症之藥物中的用途。在一些實施例中，病症為與血管 生成相關之病理性病狀。 在一悲樣中，本發明提供本發明之表現載體在製備用於 /口療性及/或預防性治療諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖性 μ之病症之藥物中的用途。在―些實施例中，病症為與 灰^生成相關之病理性病狀。 在心樣中’本發明提供本發明之宿主細胞在製備用於 /Π療性及/或預防性治療諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖性 病症之病症之藥物中的用途。在一些實施例中，病症為與 血^生成相關之病理性病狀。 在一態樣中，本發明提供本發明之製品在製備用於治療 卜及/或預防性治療諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症 Φ 之病症之藥物中的用途。在一些實施例中，病症為與血管 生成相關之病理性病狀。 在一悲樣中，本發明提供本發明之套組在製備用於治療 I4生及/或預防性治療諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖性病症 之病症之藥物中的用途。在一些實施例中，病症為與血管 生成相關之病理性病狀。 本發明提供適用於調節與DLL4之表現及/或活性相關之 疾病狀態（諸如表現及/或活性增加或減弱或不當表現及/或 活性)的方法及組合物。 121444.doc -26- 200815467 在悲樣中，本發明提供治療或預防與DLL4之表現及/ 或活性增強相關之腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症的方 法，該等方法包含將有效量之抗-DLL4抗體投與需要該洽 療之個體。 〜樣中本發明^供減弱、抑制、阻斷或防止腫瘤 或癌症生長的方法，該等方法包含將有效量之抗抗 體投與需要該治療之個體。 在一態樣中，本發明提供治療腫瘤、癌症及/或細胞增 瘦I·生病症的方法’ #包含將有&量之抗_dll4抗體投與需 要該治療之個體。 在樣中本叙明&供抑制企管生成的方法，其包含 將有效量之抗-DLL4抗體投與需要該治療之個體。 在I、樣中，本發明提供治療與血管生成相關之病理性 病狀的方法，其包含將有效量之抗_〇]^4抗體投與需要該 治療之個體。在一些實施例中，與血管生成相關之病理性 病狀為腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。在一些實施例 中，與血管生成相關之病理性病狀為眼内新生血管疾病。 本舍明之方法可用於影響任何適當的病理狀態。例示性 病症描述於本文中，且包括選自由以下癌症組成之群之癌 症：小細胞肺癌、神經母細胞瘤、黑素瘤、乳癌、胃癌、 結腸直腸癌（CRC)及肝細胞癌，包括彼等癌症之轉移形 本發明之方法可進-步包含其他治療步驟。舉例而言， 在-實施例中，方法進-步包含將所乾向之細胞及/或組 121444.doc -27· 200815467 織（例如，癌細胞）暴露於輻射 生成劑的步驟。 治療或化學治療劑或抗金管 在另一恶樣中，本發明握 ' ,A A 知乃徒供偵測DLL4之方法，該等方 法包含偵測樣本中之4 ^ ^ ,^ ^ _DLL4抗體複合物。如本文 T所使用之術語丨，偵測π句 士 — 括參考或不參考對照物之定性及/ 或疋量偵測（量測含量）。

〜樣中，本發明提供診斷與DLL4表現及/或活性 相關之病症的方法，該等方法包含侧取自患有或疑似患 病症之心者之生物樣本中的dll4_抗抗體複合 物。在-些實施例中，DLL4表現為增強的表現或異常的 表現。在一些實施例中，病症為腫瘤、癌症及/或細胞增 殖性病症。 1在另一態樣中，本發明提供本文中所述之任何抗_dll4 抗體’其中該抗_DLL4抗體包含可偵測標記。 在另一態樣中，本發明提供本文中所述之任何抗_dll4 抗體與DLL4之複合物。在—些實施例中，複合物為活體 内或活體外複合物。在一些實施例中，複合物包含癌細 胞。在一些實施例中，抗-DLL4抗體係經可偵測性標記。 【實施方式】 本發明在本文中提供抗-DLL4抗體，其適用於例如治療 或預防與DLL4之表現及/或活性相關之疾病狀態，諸如表 現及/或活性增強或不當表現及/或活性。在一些實施例 中’使用本發明之抗體治療腫瘤、癌症及/或細胞增殖性 病症。在一些實施例中，使用本發明之抗體治療與血管生 121444.doc -28- 200815467 成相關之病理性病狀。 在另一態樣中，本發明之抗-DLL4抗體適用作偵測及/或 分離DLL4(諸如偵測各種組織及細胞類型中之DLL4)之試 劑。 本發明進一步提供製備抗-DLL4抗體及編碼抗-DLL4抗 體之聚核苷酸的方法。 通用技術 本文中所述或所參考之技術及程序通常充分瞭解且通常 可使用熟習此項技術者習知之方法應用，諸如以下文獻中 廣泛使用之方法：Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第 3 版（2001) Cold Spring Harbor

Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel等 人編，（2003)) ; METHODS IN ENZYMOLOGY 叢刊 (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson，B. D. Hames及 G. R. Taylor編（1995))， Harlow 及 Lane 編（1988) ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，及 ANIMAL CELL CULTURE(R. I· Freshney編 (1987)) 〇 定義 ”分離n抗體為已經鑑別且與其天然環境之組分分離及/或 自其回收的抗體。其天然環境之污染組分為干擾抗體之診 斷性或治療性使用的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白 質溶質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，將抗體（1)如藉 121444.doc -29- 200815467 由Lowry方法所測定，純化為大於95重量％之抗體，且最 佳大於99重量％ ; (2)純化至足以經由使用旋杯式測序儀獲 得N-末端或内部胺基酸序列中之至少15個殘基的程度；或 (3)使用Coomassie™藍或較佳銀染劑，在還原條件或非還 原條件下，藉由SDS-PAGE純化至同質。由於抗體天然環 境之至少一種組分不存在，因此分離抗體包括原位存在於 重組細胞内之抗體。類似地，分離抗體包括重組細胞周圍 培養基中之抗體。然而，分離抗體通常藉由至少一個純化 步驟製備。 "分離’’核酸分子為一種經鑑別且與至少一種污染核酸分 子分離的核酸分子，該核酸分子與該至少一種污染核酸分 子在抗體核酸之天然來源中通常結合。分離核酸分子不同 於其天然產生之形式或環境。因此分離核酸分子不同於存 在於天然細胞中時之核酸分子。然而，分離核酸分子包括 包含於通常表現抗體之細胞中的核酸分子，在該等細胞 中，例如該核酸分子處於與天然細胞不同的染色體位置 中〇 術語’’如Kabat中之可變域殘基編號’’或’’如Kabat中之胺基 酸位置編號”及其變化形式係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991)中用於編譯抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號 系統。利用此編號系統，實際的線性胺基酸序列可在可變 域之FR或CDR中含有較少或額外胺基酸，相當於縮減或插 121444.doc -30- 200815467 入。舉例而言，重鏈可變域可包括H2之殘基52後面的單胺 基酸插入（殘基52a，根據Kabat)及重鏈FR殘基82後面的插 入殘基（例如，殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於 給定抗體，殘基之Kabat編號可藉由將該抗體序列之同源 區與"標準’’Kabat編號序列對準來確定。 如本文中所使用，短語”大體上類似”或"大體上相同”表 示兩個數值之間足夠高的相似程度（一般而言，一數值與 本發明之抗體相關而另一數值與參考/比較抗體相關），以 致热習此項技術者認為兩值之間的差異在該等值（例如Kd 值）所量測之生物學特徵之範圍内幾乎不具有或不具有生 物學及/或統計學重要性。該等兩值之間的差異相對於參 考/比較抗體之值較佳小於約5〇%、較佳小於約4〇%、較佳 小於約30%、較佳小於約2〇%、較佳小於約1〇%。 結合親和力”通常指分子（例如抗體）之單個結合位點與 其結合搭配物（例如抗原）之間非共價相互作用的總和的強 度。除非另有說明，否則如本文中所使用，”結合親和力·， 係指反映結合對成員（例如抗體與抗原）之間丨：丨相互作用的 固有結合親和力。分子X與其搭配物γ之親和力通常可由 解離常數（Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用 方法（包括本文所述之彼等方法）量測。低親和力抗體通常 與抗原緩慢結合且傾向於快速解離，而高親和力抗體通常 與抗原結合較快且傾向於保持長期結合。多種量測結合親 和力之方法係為此項技術中所已知，可使用該等方法中之 任一種達成本發明之目的。具體說明性實施例描述於下文 121444.doc 31 200815467 中〇 在一實施例中，本發明之”Kd’1或” Kd值”係藉由用所關注 之抗體之Fab型式及其抗原執行之放射性標記抗原結合檢 定（RIA)量測，正如以下量測溶液中Fab與抗原之結合親和 力之檢定所述：藉由在滴定系列之非標記抗原存在下用最 低濃度之（1251)-標記抗原平衡Fab，接著用塗有抗-Fab抗體 之滴定板捕獲結合之抗原（Chen等人，（1999) Μο/扪〇/ 293:865-881)。為確定檢定條件，將微量滴定板（Dynex)用 春 於50 mM碳酸鈉（pH 9.6)中之5 pg/ml捕獲抗-Fab抗體 (Cappel Labs)塗覆隔夜，且隨後在室溫下（約23°C)用於PBS 中之2°/〇(w/v)牛血清白蛋白阻斷兩至五小時。在非吸附板 (Nunc #269620)中，將 100 pM或 26 pM [1251]-抗原與連續稀 釋之所關注之Fab(例如與Presta等人，(1997) 57:4593-4599中抗-VEGF抗體Fab-12之評估一致）混合。接 著將所關注之Fab培育隔夜；然而此培育可持續較長的時 期（例如65個小時）以確保達成平衡。其後，將混合物轉移 ® 至捕獲板中以便在室溫下培育（例如一小時）。接著將溶液 移除且將滴定板用於PBS中之0.1% Tween⑧20洗滌八次。 當滴定板已乾燥時，添加150微升/孔閃爍體（MicroScint™-20 ； Packard)，且將孔板經由TopCount伽瑪計數器 (Packard)計數十分鐘。選擇產生小於或等於最大結合之 20%之各Fab的濃度用於競爭性結合檢定。根據另一實施 例，在25°C，使用 BIAcore™-2000或BIAcoreTM_3000 (BIAcore， Inc.，Piscataway，NJ)，使用表面電漿共振檢定法，用約10 121444.doc -32- 200815467 個反應單元（RU)之固定抗原CM5晶片量測Kd或Kd值。簡 言之，根據供應商說明書，將羧甲基化葡聚糖生物感應器 晶片（CM5，BIAcore Inc.)用N-乙基二曱基胺基丙 基）-碳化二醯亞胺鹽酸鹽（EDC)及N-羥基丁二醯亞胺（NHS) 活化。將抗原用10 mM乙酸鈉（pH 4·8)稀釋成5 pg/ml(約0.2 μΜ)，再以5微升/分鐘之流速注入，以獲得約1〇個反應單 元（RU)之偶合蛋白質。注入抗原之後，注入1 Μ乙醇胺以 阻斷未反應之基團。若進行動力學量測，則將Fab於具有 ® 0.05% Tween®20之PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋液（〇·78 nM至500 nM)在25°C下以約25 μΐ/min流速注入。結合速率 d)及解離速率（kQff)係使用簡單的一比一朗繆爾 (Langmuir)結合模型（BIAcore Evaluation Software 3.2版）， 藉由同時擬合結合及解離感應圖來計算。平衡解離常數 (Kd)計算為比率kc^/k^。參見，例如，Chen，Y·等人， (1999) 乂 Mo/价〇/ 293:865-881。若結合速率藉由上述表面 電漿共振檢定法超過106 3VT1 S — 1，則結合速率可藉由使用 ^ 螢光淬滅技術測定，該技術係在25°C、在如光譜儀（諸如 具有攪拌式紅色比色管之止流裝備型光譜儀（Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 光譜儀（ThermoSpectronic)) 中所量測之濃度增大之抗原存在下量測於PBS (pH 7 ·2)中之 20 nM抗-抗原抗體（Fab形式）之螢光發射強度（激發=295 nm;發射=340 nm，16nm帶通）之增大或減小。 根據本發明，”結合速率’’或”k〇n"亦可在25 °C，使用 BIAcore™-2000 或 BIAcore'3000(BIAcore，Inc·，Piscataway， 121444.doc •33- 200815467 NJ)，用約10個反應單元（RU)之固定抗原CM5晶片，利用 上述同樣的表面電漿共振技術測定。簡言之，根據供應商 說明書，將羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片（CM5, BIAcore Inc·)用N-乙基二甲基胺基丙基）_碳化二醯 亞胺鹽酸鹽（EDC)及N-羥基丁二醯亞胺（NHS)活化。將抗 原以10 mM乙酸鈉（pH 4.8)稀釋成5 Kg/ml(約0.2 μΜ)，再以 5微升/分鐘之流速注入，以獲得約10個反應單元（RU)之偶 合蛋白質。注入抗原之後，注入1 Μ乙醇胺以阻斷未反應 之基團。若進行動力學量測’則將Fab於具有0.05% TweentO之PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋液（0.78 nM至500 ηΜ)在25°C下以約25 μΐ/min之流速注入。結合速率（U及 解離速率（koff)係使用簡單的一比一朗繆爾（Langmuir)結合. 模型（BIAcore Evaluation Software 3.2版），藉由同時擬合 結合及解離感應圖來計算。平衡解離常數（Kd)計算為比率 koff/kon。參見，例如，Chen，Y·等人，（1999) 乂 Mo/ 293:865-881。若結合速率藉由上述表面電漿共振檢定超過 106 M·1 S·1，則結合速率藉由使用螢光淬滅技術測定較 佳，該技術係在25°C、在如光譜儀'(諸如具有攪拌式比色 管之止流裝備型光譜儀（Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco光譜儀（ThermoSpectronic))中所量測之濃度增大之 抗原存在下量測PBS(pH 7.2)中之20 nM抗·抗原抗體（Fab形 式）之螢光發射強度（激發=295 nm;發射=340 nm，16 nm 帶通）之增大或減小。 如本文中所使用，術語π載體"意欲指能夠轉運已與其連 121444.doc -34· 200815467 接之另一核酸的核酸分子。一類型之載體為"質體"，其係 指其他DNA片段可連接至其中之環狀雙股〇\八環。另一類 型之载體為噬菌體載體。另一類型之载體為病毒載體，其 中其他DN A片段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在 其所引入之宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起點 之細菌載體及游離型哺乳動物載體）。其他載體（例如非游 離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞 之基因組中，且從而隨同宿主基因組一起複製。此外，某 些載體能夠指導與其操作性連接之基因的表現。該等載體 在本文中稱為，，重組表現載體"（或簡稱"重組載體"）。一般 而a，用於重組DNA技術中之表現載體通常為質體形式。 由於貝體為載體之最常用形式，因此在本說明書中，，，質 體’’及’’載體’’有時可互換使用。 如本文中可互換使用之"聚梭苦酸"或"核酸，，係指任何長 度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫 籲 氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基， 及/或其類似物，或任何可由DNA或RNA聚合酶或藉由合 成反應併入聚合物中之受質。聚核苷酸可包含經修飾之核 苷馱，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在對核苷酸結 構之修_，則該修飾可在組裝聚合物之前或之後賦予。核 序列了由非核皆酸組分中斷。聚核普酸可在合成之後 進步加以修飾，諸如與標記接合。其他類型之修飾例如 包括：”帽孕” 天然產生核苷酸中之一或多者經類似物取 弋核苷S文間修飾’諸如具有不帶電荷之鍵（例如膦酸甲 121444.doc -35- 200815467 酉曰碟酸三酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等）之彼等修飾及 八有▼電荷之鍵（例如硫代鱗酸酯、二硫代填酸酯等）之彼 等修飾、含有懸垂部分（諸如蛋白質（例如核酸酶、毒素、 抗體、信號肽、聚L-離胺酸等））之彼等修飾、具有嵌入分 子（例如吖啶（acridine)、補骨脂素（pS〇ralen#)之彼等修 飾、含有螯合劑（例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金 屬等）之彼等修飾、含有烷化劑之彼等修飾、具有經修飾 之鍵（例如α變旋異構核酸等）之彼等修飾以及聚核苷酸之 未修飾形式。此外，通常存在於糖中之任何羥基可例如由 膦酸酯基、磷酸基置換，經標準保護基保護，或經活化以 製備與其他核皆酸之其他鍵聯，或可與固體或半固體載體 接合。5’端及3’端ΟΗ可麟酸化或經胺或經具有i至2〇個碳 原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生化為標 準保濩基。聚核苷酸亦可含有此項技術中通常已知之核糖 或脫氧核糖之類似形式，其包括例如2，_〇_甲基-核糖、2,_ 〇-烯丙基核糖、2’-氟-核糖或2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似 物、α-變旋異構糖、差向異構糖（諸如阿拉伯糖、木糖或 來蘇糖（lyxoses)、吼喝糖、。夫喃糖、景天庚酮糖 (sedoheptuloses))、非環類似物及鹼性核苷類似物，諸如 曱基核糠核苷。一或多個磷酸二酯鍵可經替代鍵聯基團置 換。該等替代鍵聯基團包括（但不限於）其中磷酸酯基經 P(0)S("硫代酸酯"）、p(s)s(”二硫代酸酯"）、（〇)nr2("醯胺 化物”）、P(〇)R、P(0)OR，、C0或CH2(”甲縮醛，，）置換之實 施例，其中各R或R/獨立地為Η或經取代或未經取代之烷基 121444.doc -36- 200815467 (1-20個C)(視需要含有醚鍵（-〇-))、芳基、稀基、产产某 環烯基或芳烧基。聚核苷酸中並非所有的鍵聯必需相同。 以上說明適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括rna 及 DN A。 如本文中所使用，”寡核苷酸”通常係指長度通常（但不一 定）小於約200個核苷酸之短的、通常為單股、通常為入成 的聚核苷酸。術語11寡核苷酸”與”聚核苷酸"相互間並不排 斥。以上對於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於募核發 酸。 關於肽或多肽序列之”胺基酸序列一致性百分率（％)"係 定義為：在對準序列且引入間隙（若需要）後（以獲得最大序 列一致性百分率且不將任何保守性取代視作序列一致性之 部分）’候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基 一致之胺基酸殘基的百分率。用於測定胺基酸序列一致性 百分率之目的的對準可以此項技術之技能範圍内之多種方 式實現，例如，使用可公開獲得之.電腦軟體，諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)軟體。 熟習此項技術者可確定用於量測對準的適當參數，包括為 獲得與所比較之全長序列之最大對準所需要的任何演算 法。然而，為本文之目的起見，胺基酸序列一致性％值係 使用序列比對電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比對 電腦程式由Genentech，Inc.創作，且源代碼已隨使用者文 件一起備案於美國版權辦公室（U.s· Copyright Office， Washington D.C.，20559)，其中其係以美國版權註冊號第 121444.doc -37- 200815467 TXU510087號註冊。ALIGN-2程式可經由 Genentech, Inc.，

South San Francisco，California 公開獲得。所編譯之 ALIGN_2程式應在UNIX操作系統上使用，較佳數位UNIX V4.0D。所有序列比對參數由ALIGN-2程式設定且不更 改。 在使用ALIGN-2用於胺基酸序列比對之情況下，給定胺 基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致％(其或 者可表示為具有或包含與給定胺基酸序列B之特定胺基酸 ® 序列一致性％的給定胺基酸序列A)計算如下： 100乘以分數（X/Y) 其中X為在A與B之彼程式對準中，由序列對準程式 ALIGN-2記為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B 中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度與 胺基酸序列B之長度不相等，則A與B之胺基酸序列一致性 %將不等於B與A之胺基酸序列一致性％。 除非另有具體說明，否則本文中所使用之全部胺基酸序 列一致性％值可使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述獲 得。 除非另有特定說明或上下文說明，否則如本文中所使用 之術語"DLL4”（可互換地稱”δ樣4Π)係指任何天然或變異（無 論為天然或合成）DLL4多肽。術語’’天然序列π特定言之涵 蓋天然產生之截短形式或分泌形式（例如胞外域序列）、天 然產生之變異體形式（例如，交替剪接形式）及天然產生之 等位基因變異體。術語”野生型DLL4”通常係指包含天然產 12l444.doc -38 - 200815467 生之DLL4蛋白之胺基酸序列的多肽。術語"野生型DLL4序 列11通常係指存在於天然產生之DLL4中的胺基酸序列。 除非另有具體說明或上下文說明，否則如本文中所使用 之術語"Notch受體”（可互換地稱為"N〇tch”）係指任何天然 或變異（無論為天然或合成）Notch受體多肽。人類具有四種

Notch 受體（Notchl、Notch2、Notch3 及 Notch4)。如本文中 所使用，術語Notch受體包括四種人類]^“^受體中之任一 種或全部。術語”天然序列”特定言之涵蓋天然產生之截短 形式或分泌形式（例如胞外域序列）、天然產生之變異體形 式（例如，交替剪接形式）及天然產生之等位基因變異體。 術語”野生型Notch受體，，通常係指包含天然產生之^^^仏受 體蛋白之胺基酸序列的多肽。術語,，野生型N〇tch受體序 列通#係指存在於天然產生之N〇tch受體中的胺基酸序 列。 術語"抗體’’與”免疫球蛋白，，可以最廣泛意義上互換使用 且包括單株抗體（例如全長或完整單株抗體）、多株抗體、 夕1貝抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體，只要其 展現所要生物活性）且亦可包括某些抗體片段（如本文中之 更詳細描述）。抗體可為人類抗體、人源化抗體及/或親和 力成熟抗體。 術語"可變’’係指抗體間可變域之某些部分在序列上廣泛 不同且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然 而，可變性並非在抗體之整個可變域中均勻分布。其集中 於輕鏈及重鏈可變域中三個稱為互補性決定區（CDR)或高 121444.doc •39- 200815467 變區（HVR)的片段。可變域之更高度保守部分稱為框架 (FR)區。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個主要採用 β-折疊片構型、由三個CDR連接的FR區，其形成連接且在 一些情況下形成β-折疊片結構之部分的環。各鏈中之CDR 由FR區緊鄰地固持在一起，且與其他鏈中之cdr共同促進 抗體之抗原結合位點之形成（參見Kabat等人，v Proiez·似 〇/ ，第五版，贝如⑽“

Institute of Health, Bethesda，MD (1991))。恆定域不直接 _ 參與抗體與抗原之結合，但展現多種效應功能，諸如抗體 參與抗體依賴性細胞毒性。 木瓜蛋白酶消化抗體可產生兩個相同的抗原結合片段， 稱nFabn片段（各具有單一抗原結合位點）及殘餘"Fe，，片段， 其名稱反映其易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個 抗原結合位點且仍能夠交聯抗原的F(ab，）2片段。 nFv"為含有完整抗原識別位點及完整抗原結合位點的最 φ 小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區係由一重鏈可變域與 一輕鏈可變域以非共價方式緊密結合之二聚體組成。在單 鍵Fv種類中’一重鏈可變域與一輕鏈可變域可由撓性肽連 接子共價連接，以使得輕鏈與重鏈可以與雙鏈&種類中之 彼結構類似之”二聚”結構結合。在此構型中各可變域之三 個CDR相互作用以界定vh-Vl二聚體表面上的抗原結合位 點。總而言之，該等六個CDR賦予抗體以抗原結合特異 性。然而’甚至單個可變域（或僅包含三個抗原特異性 CDR之Fv之一半）亦具有識別及結合抗原之能力，儘管親 121444.doc 200815467 和力比完整結合位點之親和力低。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。FaV片段因在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半 胱胺酸的重鏈CH1域之羧基末端添加幾個殘基而與Fab片 段不同。Fab^SH為本文中恆定域之半胱胺酸殘基帶有自 由硫醇基之Fab，之名稱。F(aiy)2抗體片段最初係作為Fab， 片段對（其間具有鉸鏈半胱胺酸）產生。抗體片段之其他化 學偶合亦為已知的。 來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之·”輕鏈I，基 於其恆定域之胺基酸序列可歸類到兩種明顯不同類型（稱 作K及λ)中之一種中。 免疫球蛋白視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，可歸 類為不同類別。存在五種主要免疫球蛋白類別·· IgA、 IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干類可進一步分為亞類 (同型），例如IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAAIgA2。對應 於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ 及μ °不同類別之免疫球蛋白之亞單位結構及三維構型已 為吾人所熟知。 "抗體片段"僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳 保留與彼部分當存在於完整抗體中時通常相關之功能中之 至少一種功能，較佳大部分或全部功能。抗體片段之實例 包括Fab、Fab，、F(ab)2&Fv片段；雙功能抗體；線性抗 體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。 在一實施例中’抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且 121444.doc -41 - 200815467 從而保留結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段 (例如包含Fc區之抗體片段）保留與該以區當存在於完整抗 體中時通常相關之生物功能中之至少一種功能，諸如FcRn 結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及互補結合。在一實 施例中’抗體片段為具有大體上與完整抗體類似之活體内 半衰期的單價抗體。舉例而言，該抗體片段可包含與能夠 賦予該片段活體内穩定性之Fc序列連接之抗原結合臂。 術語"高變區》，、”HVR"或，，HV"當用於本文中時係指抗體 可變域中具有序列高可變性且/或在結構上形成確定之環 的區域。通常，抗體包含六個高變區；三個在VH中（H1、 H2、H3)，且三個在VL中（LI、L2、L3)。本文中使用且涵 蓋多種高變區描述。Kabat互補判定區（CDR)係基於序列可 變性且為最常用的（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。而 Chothia指出結構環之位置（Chothia及 Lesk J· Mol. Biol· 196:901-917 (1987))。AbM 高變區表示 Kabat CDR 與

Chothia結構環之間的折衷且被Oxford Molecular’s AbM抗 體建模軟體使用。”接觸"高變區係基於對可用複合晶體結 構之分析。該等各高變區中之殘基附註如下。

Loop Kabat AbM

Chothia Contact LI L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 I2I444.doc -42- 200815467 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Η1 Η31-Η35Β Η26-Η35Β H26-H32 H30-H35B (Kabat編號） Η1 Η31-Η35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號） Η2 Η50-Η65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 Η3 Η95-Η102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 高變區可包含如下”擴展高變區” ：VL中之24-3 6或24-34(L1)、46-56 或 50-56(L2)及 89-97(L3)以及 VH 中之26-35(H1)、50-65 或 49·65(Η2)及 93-102、94-102 或 95-102(113)。可變域殘基係根據Kabat等人（同上文）之該等各 定義加以編號。 ’’框架π或"FR”殘基為除如本文中所定義之高變區殘基外 之彼等可變域殘基。 如本文中所使用之術語•’單株抗體"係指大體上同源之抗 體的群中之抗體，亦即，構成此群體之個別抗體相同且/ 或結合相同抗原決定基，除在單株抗體產生過程中可能出 現之可能變異體外（該等變異體通常少量存在）。該單株抗 體通常包括一種包含結合標拓之多肽序列的抗體，其中標 靶結合多肽序列可經由包括自複數個多肽序列中選擇單標 靶結合多肽序列的方法而獲得。舉例而言，選擇方法可為 自複數個純系（諸如雜交瘤純系池、嗟菌體純系池或重組 DNA純系池）中選擇唯一純系。應瞭解，選定的標靶結合 121444.doc _43· 200815467 序列可進一步改造例如以提高對標靶的親和力、使標輕结 合序列人源化、提高其在細胞培養物中之產量、降低其在 活體内之免疫原性、形成多特異性抗體等，且包含經改造 之標把結合序列的抗體亦為本發明之單株抗體。與通常包 括針對不同決定子（抗原決定基)的不同抗體的多株抗體製 劑相比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上的單 個決定子。除其特異性之外，單株抗體製劑的優點在於其 通常未被其他免疫球蛋白污染。修飾語”單株”指示抗體係 獲自大體上同源之抗體群的特徵且不應理解為需要藉由任 何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株 抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括：例如，雜交瘤 方法（例如，Kohler等人，iVaiwre，256:495 (1975) ; Harlow 等人，Antibodies: A Laboratory Manual，（Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版.1988) ; Hammerling 等 人，於：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier，N.Y·，1981)中）；重組DNA方法（參見， 例如，美國專利第4,816,567號）；噬菌體呈現技術（參見， 例如，Clackson等人，iVaii/re，352:624-628 (1991) ; Marks 等人，乂 Mol Biol·，222:581-597 (1991) ; Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004) ； Lee^ Λ ^ J. Mol Biol. 340(5): 1073-1093 (2004) ； Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004);及 Lee 等人 J.

Mei/zo心284(1-2):119-132 (2004))，及在具有部分或全部 人類免疫球蛋白基因座或編碼人類免疫球蛋白序列之基因 121444.doc -44- 200815467

的動物中產生人類或人類樣抗體的技術（參見，例如，wo 1998/24893 ； WO 1996/34096 ； WO 1996/33735 ； WO 1991/10741 ; Jakobovits等人，Proc· Jead·心，·· ί/5^4， 90:2551 (1993) ; Jakobovits 等人，iVaiwe，362:255-258

(1993) ； Bruggemann^ A 5 Year in Immuno^ 7:33 (1993)； 美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,591，669號 (均為 GenPharm);第 5,545,807號；WO 1997/17852 ;美國 專利第 5,545,807號；第 5,545,806號；第 5,569,825 號；第 5,625，126號；第 5,633,425號；及第 5,661，016 號；Marks 等 人，10: 779-783 (1992) ; Lonberg等人， Nature, 368: 856-859 (1994) ； Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994) ; Fishwild等人，14: 845-85 1 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996) I Lonberg^ Huszar, Intern. Rev. Immunol. y 13: 65-93 (1995)) 〇 非人類（例如，鼠類）抗體之”人源化"形式為含有源自非 人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。人源化抗體之大 部分為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體高變區 之殘基係經來自具有所要特異性、親和力及容量的非人類 物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動 物）之高變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋 白之框架區（FR)殘基係經相應非人類殘基置換。此外，人 源化抗體可包含受體抗體或供體抗體中不存在之殘基。可 作出該等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人源化 121444.doc -45- 200815467 抗體包含至少一個且通常兩個可變域之大體上所有序列， 其中所有或大體上所有高變環係對應於非人類免疫球蛋白 之彼等序列，且所有或大體上所有FR為人類免疫球蛋白序 列之彼等序列。人源化抗體視需要亦包含免疫球蛋白恆定 區（Fc)之至少一部分，通常包含人類免疫球蛋白之彼部 分。欲知進一步之詳情，請參見Jones等人，321: 522-525 (1986) ; Riechmann 等人，332:323-329 (1988);及 Presta，Cwrr· 价〇/· 2:593-596 (1992)。亦參見以下回顧文章及其中所引用之參考文獻： Vaswani 及 Hamilton， j·· Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998) ； Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035.1038 (1995) ; Hurle 及 Gross，Cwrr. (9/?· 5:428-433 (1994) 〇 n喪合n抗體（免疫球蛋白）具有與源自特定物種或屬於特 定抗體類別或子類之抗體中之對應序列相同或同源之重鏈 及/或輕鏈的部分，而鏈之剩餘部分與源自另一物種或屬 於另一抗體類別或子類之抗體中之對應序列以及該等抗體 之片段（只要其展現所要生物活性）相同或同源（美國專利第

4,816,567號；及 Morrison等人，iVoc· iVW/· W· USA 81:6851-6855 (1984))。如本文中所使用之人源化抗體為嵌 合抗體之子集。 11單鏈Fv11或"scFv”抗體片段包含抗體之vh域及VL域， 其中該等域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽在VH 與VL域之間進一步包含能使seFv形成所要抗原結合結構的 121444.doc -46- 200815467 多肽連接子。關於scFv之回顧，請參見Pluckthun，77^ Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第 113 卷， Rosenburg及 Moore編，Springer-Verlag，New York，第 269-315頁（1994)。 "抗原"為抗體可與其選擇性結合的預定抗原。目標抗原 可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然 產生之化合物或合成化合物。目標抗原較佳為多肽。 術語”雙功能抗體”係指具有兩個抗原結合位點之小抗體 片段，該等片段包含與同一多肽鏈（VH-VL)中之輕鏈可變 域（VL)連接的重鏈可變域（VH)。藉由利用過短而使同一鏈 上之兩個域無法配對的連接子，該等域被迫與另一鏈中之 互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分 描述於例如·· EP 404,097 ; WO 93/11161 ;及 Hollinger 等 人，夕以·· 90:6444-6448 (1993)中。 π人類抗體”為具有相應於人類所產生之抗體之胺基酸序 列之胺基酸序列的抗體，且/或已利用如本文中所揭示之 任一種製備人類抗體之技術製得。人類抗體之該定義特別 排除包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。 ”親和力成熟”抗體為，與不具有彼等改造之親本抗體相 比，在其一或多個CDR中具有一或多處使得抗體對抗原之 親和力提高之改造的抗體。較佳親和力成熟抗體對於目標 抗原具有奈莫耳（nanomolar)或甚至皮莫耳（picomolar)之親 和力。親和力成熟抗體可藉由此項技術中已知之程序製 備。Marks等人，Bio/Technology 10:779-783 (1992)描述藉 121444.doc -47- 200815467 由VH與VL域改組之親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨 機誘變描述於·· Barbas等人iVoc iVai· 乂⑽汰Sci· 91:3809-3813 (1994) ; Schier 等人 Ge彻 169:147-155 (1995) ； Yelton等人 J· 1 55:1994-2004 (1995);

Jackson 等人，《/· Jmmi/⑽/· 154(7):3310-9 (1995);及

Hawkins等人，J. Mo/· 226:889-896 (1992)中。 抗體”效應功能”係指可歸因於抗體中之Fc區（天然序列Fc 區或胺基酸序列變異Fc區）的彼等生物活性，且隨抗體同 型而改變。抗體效應功能之實例包括·· Clq結合及互補依 賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞 毒性（ADCC);吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體） 之下調；及B細胞活化。 π抗體依賴性細胞介導之細胞毒性’’或n ADCC"係指細胞 毒性之一種形式，其中結合於存在於某些細胞毒性細胞 (例如自然殺手（ΝΚ)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）上之 Fc受體（FcR)上之分泌型Ig使該等細胞毒性效應細胞能夠特 異性結合攜有抗原之靶細胞且隨後用細胞毒素殺死靶細 胞。抗體”武裝"細胞毒性細胞且為該殺傷所絕對必需。介 導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表 現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。FcR在造血細胞上之表現概述 於 Ravetch及 Kinet，J⑽w. iJev· Jmmwno/ 9:457-92 (1991)之 第464頁上之表3中。為評估所關注之分子的ADCC活性， 可執行活體外ADCC檢定’諸如美國專利第5,500,362號或 第5,821，337號或Presta美國專利第6,737,〇56號中所述之彼 121444.doc •48- 200815467 檢定。適用於該等檢定的效應細胞包括周圍血液單核細胞 (PBMC)及自然殺手（NK)細胞。或者或此外，可在例如動 物模型（諸如 Clynes 等人，ΛΓβί/· 5^·· ί/以 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型）中活體内評估所關 注之分子之ADCC活性。 "人類效應細胞”為表現一或多種FcR且執行效應功能的 白血球。較佳地，該等細胞至少表現FcyRIII並執行ADCC 效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括周圍血液~ 單核細胞（PBMC)、自然殺手（NK)細胞、單核細胞、細胞 毒性T細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞較佳。 效應細胞可自天然來源（例如，血液)中分離而得。 ’’Fc受體’’或” FcR”描述與抗體之Fc區結合的受體。較佳 FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體 (γ受體）之FcR且包括FcyRI、FcyRII及FcyRIII亞類之受體 (包括該等受體之等位基因變異體及交替剪接形式）。 FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體υ)及FcyRIIB("抑制受 體”)，兩者具有類似胺基酸序列，不同之處主要在於其細 胞質域。活化受體FcyRIIA在其細胞質域中含有基於免疫 受體酪胺酸之活化基元（ITAM)。抑制受體？(^111比在其細 胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元（ITIM)。（參 見 M.於Dagron，i^v· /mm·。/· 15:203-234 (1997)中之 回顧）〇 FcR 回顧於 Ravetch 及 Kinet，Rev· Immunol 9:457-92 (1991) ; Capel 等人 ’ Immunomethods 4:25-34 (1994);及 de Haas 等人，ΖαΖ?· C7z’m. Med· 126:330-41 121444.doc • 49- 200815467 (1995)中。其他FcR(包括將在將來鑑別出之彼等FcR)均涵 蓋於本文中之術語”FcR"中。該術語亦包括新生兒受體 FcRn，其負責將母親之IgG傳遞至胎兒（Guyer等人，/· Immunol. 1 17:587 (1976)及 Kim等人，丄 Immunol, 24:249 (1994))且調控免疫球蛋白之體内平衡。WOOO/ 42072(Pi*esta)描述與FcR之結合提高或減弱的抗體變異 體。彼專利公開案之内容特別以引用之方式併入本文中。 亦參見 Shields等人/·ϋ/. Ckm· 9(2): 6591-6604 (2001)。 量測與FcRn結合之方法為已知的（參見，例如，Ghetie 1997，Hinton 2004)。活體内與人類FcRn結合及人類FcRn 高親和力結合多肽之血清半衰期例如可在轉殖基因小鼠或 表現人類FcRn之轉染人類細胞株中或在投與Fc變異體多肽 之靈長類動物中檢定。 ”互補依賴性細胞毒性’’或"CDC"係指靶細胞在補體存在 下之溶解。典型補體途徑之活化係由補體系統之第一組分 (Clq)與結合其同源抗原之（適當亞類之）抗體的結合啟始。 為評估補體活化，可執行例如於Gazzano-Santoro等人， 202:163 (1996)中戶斤述之 CDC檢定0 具有經改造之Fc區胺基酸序列及增加或降低之C lq結合 能力的多肽變異體描述於美國專利第6，194,55 1B1號及 W099/51642中。彼等專利公開案之内容特別以引用之方 式併入本文中。亦參見Idusogie等人J. /mmw⑽/. (2000) 。 術語”包含Fc區之多肽”係指諸如抗體或免疫黏附素（參見 121444.doc -50- 200815467 下文定義）之包含Fc區的多肽。Fc區之C末端離胺酸（殘基 447，根據EU編號系統）例如可在多肽純化期間或藉由重組 工程化設計編碼多肽之核酸來移除。因此，根據本發明包 含具有Fc區之多肽的組合物可包含具有K447之多肽、所有 K447被移除之多肽，或具有K447殘基與無K447殘基之多 肽之混合物。 ”阻斷”抗體或”拮抗"抗體為抑制或減弱其所結合之抗原 之生物活性的抗體。較佳阻斷抗體或拮抗抗體大體上或完 全抑制抗原之生物活性。 如本文中所使用之”促效抗體”為模擬所關注之多肽之至 少一種功能活性的抗體。 為本文目的之，，受體人類框架”為包含源自人免疫球蛋白 框架或源自人類一致框架之VL或VH框架之胺基酸序列的 框架。”源自”人免疫球蛋白框架或人類一致框架之受體人 類框架可包含其相同胺基酸序列或可含有先前已存在之胺 基駄序列變化。若存在先前已存在之胺基酸變化，則較佳 存在不超過5處且較佳4處或少於4處或3處或少於3處的先 别已存在之胺基酸變化。若先前已存在之胺基酸變化存在 於VH中，則彼等變化較佳僅在位置、73只及78只中之 一處、兩處或一處；例如彼等位置處之胺基酸殘基可為 71A 73T及/或78A。在一實施例中，vl受體人類框架序 歹J在序列上與VL人免疫球蛋白框架序列或人類一致框架 序列相同。 人類致框架"為在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列 121444.doc -51 · 200815467 之選擇中代表最普遍存在之胺基酸殘基的框架。通常，人 免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之子群。通 常，該序列子群為如Kabat等人所述之子群。在一實施例 中，VL之子群為如Kabat等人所述之子群κΐ。在一實施例 中，VH之子群為如Kabat等人所述之第III子群。 nVH第III子群一致框架"包含獲自Kabat等人之可變域重 鏈第III子群之胺基酸序列的一致序列。在一實施例中， VH第III子群一致框架胺基酸序列包含以下各序列中之至 少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID N0:42)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO: 44)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:45)。 ，’VL第I子群一致框架”包含獲自Kabat等人之可變域輕鏈 κ第I子群之胺基酸序列的一致序列。在一實施例中，VH第 I子群一致框架胺基酸序列包含以下各序列之至少一部分 或全部： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID N0:46)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:47>L2- GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:48)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:49) 0 ”病症”或”疾病”為可因用本發明之物質/分子或方法治療 而獲益的任何病狀。其包括慢性及急性病症或疾病，包括 使哺乳動物易感染所述病症的彼等病理學病狀。本文中欲 治療之病症之非限制實例包括惡性及良性腫瘤、癌、胚細 胞瘤及肉瘤。 術語"細胞增殖性病症’’及”增殖性病症’’係指與某種程度 12H44.doc •52- 200815467 ，細胞增殖性 之異常細胞增殖相關的病症。在一實施例中 病症為癌症。 如本文中所使用之"腫瘤"係指所有贅生性細胞生長及增 殖（無論惡性或良性）’以及所有癌變前及癌變細胞及組 織。術語"癌症""癌變"、"細胞增殖性病症"、"增殖性病 症"及”腫瘤"如本文中所指並不互相排斥。

術語"癌症"及"癌變"係指或描述哺乳動物中以細胞生長/ 增殖失調為典型特徵之生理性病狀。癌症實例包括（但不 限於）：癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白企病。該等癌 症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞 肺癌、肺部之腺癌、肺部之鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、 胃腸癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、印巢癌、 肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、 子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺 癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、胃癌、黑素瘤及各種類型 之頭頸癌。血管生成之失調會引起多種病症，該等病症可 由本發明之組合物及方法治療。該等病症包括非贅生性病 狀與贅生性病狀》贅生性,病包括（但不限於）上述彼等病 症。非贅生性病症包括(但不限於)不當或異常之肥大、關 節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癖、牛皮癬斑、類肉瘤 病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑、糖尿病性及其他增 殖性視網膜病（包括早熟性視網膜病）、晶狀體後纖維組^ 增生、新生血管青光眼、年齡相關性黃斑變性、糖尿病性 黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜 121444.doc -53- 200815467 :Γ=斥、視網膜/脈絡膜新金管生成、眼角新血管生成 (虹膜紅變）、日P^ @王取 (avm, ^ 血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形 (AVM)、腦脊膜瘤、血 峰f勹 & M血I義維瘤、甲狀腺過度增 匕火、^氏疾病）、角膜及其他組織移植、慢性炎症、 肺口P火症、急性肺損傷 w RDS㉟血症、原發性肺動脈高 ::?積液、腦水廬(例如，與急性中風/封閉式頭部 Ύ “目關之腦水腫）、滑液炎症、ra中之血管醫形 化丨生肌火、肥厚性骨形成、骨關節炎（〇A)、難治性 ，水、多囊性即巢疾病、子宮内膜異位、體液第三空間轉 ;留、主早產、饭性炎症（諸如1BD(克隆氏病(Crohn丨s disease) 及/貝瘍性結腸炎））、腎同種異體移植排斥、炎性腸病、腎 病f候群、不當或異常組織大量生長（非癌症）、血友病性 關節病、肥厚性瘢痕、毛髮生長抑制、Osier-Weber症候 群、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生、硬皮病、沙 B黏著’滑膜炎、皮炎、子癇前期、腹水、心包腔 積液（諸如’與心包炎相關之心包腔積液）及胸膜腔積液。 如本文中所使用，”治療"係指臨床介入以求改變所治療 之個體或細胞之自然病程，且可為預防而執行或在臨床病 理過私期間執行。所要治療效果包括預防疾病發生或復 無、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預 防轉移、降低疾病進行速率、改善或緩和疾病狀態、及緩 解或改善預後。在-些實施例中，使用本發明之抗體延缓 疾病或病症之發展。 121444.doc -54- 200815467 個體"為脊椎動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。哺 乳動物包括（但不限於）··農畜（諸如牛）、運動動物、寵物 (諸如猶、犬及馬）、靈長類動物、小鼠及大鼠。 對治療之目的而言，”哺乳動物"係指歸類為哺乳動物的 任何動物，包括人類、家畜及農畜，以及動物園動物、運 動動物或玩賞動物，諸如犬、馬、貓、牛等。哺乳動物較 佳為人類。 "有效量”係指以必要劑量及時期可有效獲得所要治療或 預防結果的量。 本發明之物質/分子、促效劑或拮抗劑之"治療有效量，，可 根據以下因素而改變··諸如個體之疾病狀態、年齡、性別 及體重，以及該物質/分子、促效劑或拮抗劑在個體中引 發所要反應的能力。治療有效量亦為可使治療有益效應超 過該物質/分子、促效劑或拮抗劑之任何毒性或有害效應 的量。"預防有效量”係指以必要劑量及時期可有效獲得所 要預防結果的量。由於預防劑量係在患病之前或在患病早 期用於個體，因此預防有效量通常（但不一定）小於治療有 效量。 如本文中所使用之術語"細胞毒性劑”係指抑制或防止細 胞功能及/或使細胞破壞的物質。該術語意欲包括放射活 性同位素（例如，At211、I131、I125、γ9〇、Re186、Rel88、

Sm153、Bi212、P32及Liz之放射活性同位素）；化學治療劑， 例如甲胺喋呤（methotrexate)、阿黴素（adriamicin)、長春 生物鹼（vinca alkaloids)(長春新鹼（Vincristine)、長春花驗 121444.doc -55- 200815467 (vinblastine)、依託泊苷（etoposide))、羥道諸紅黴素 (doxorubicin)、美法侖（melphalan)、絲裂黴素 C(mitomycin C)、苯丁 酸氮芥（chlorambucil)、道諾黴素（4&1111〇1*11131(^11)， 或其他插入劑，酶及其片段，諸如核溶解酶，抗生素，及 毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或 酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體，以及下文所揭 示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑在下文中描 述。殺腫瘤劑可使得腫瘤細胞破壞。

π化學治療劑"為適用於治療癌症的化合物。化學治療劑 之實例包括：烷化劑，諸如硫替派（thiotepa)及CYTOXAN® 環填醯胺；烧基續酸酯，諸如白消安（busulfan)、英丙舒 凡（improsulfan)及旅泊舒凡（piposulfan);氮丙唆，諸如苯 唆多巴（benzodopa)、卡巴酉昆（carboquone)、米特多巴 (meturedopa)及尤利多巴（uredopa);伸乙基亞胺及曱基密 胺，包括六甲蜜胺（altretamine)、三伸乙基密胺 (triethylenemel amine) 、 三伸 乙基填 酿胺 (trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代填醯胺 (triethiylenethiophosphor amide) 及三 甲密胺 (trimethylolomelamine);多聚乙醯類（acetogenins)(尤其布 拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacinone)) ; Δ-9-四 氫大麻盼（delta_9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻盼 (dronabinol，MARINOL®)) ; β·拉帕酮（beta_lapachone); 拉帕醇（lapachol);秋水仙驗（colchicine)；樺木酸 (betulinic acid);喜樹驗（camptothecin)(包括合成類似物拓 121444.doc -56- 200815467

朴替康（topotecan)(HYCAMTIN⑧）、CPT-11(伊諾替康 (irinotecan) ， CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹驗 (acetylcamptothecin)、斯考普萊叮（scopolectin)及 9-胺基喜 樹驗）；苔蘚蟲素（bryostatin);卡利斯塔叮（callystatin); CC-1065(包括其阿多來新（adozelesin)、卡折來新 (carzelesin)及卡折來新合成類似物）；足葉草毒素 (podophyllotoxin);足葉草酸（podophyllinic acid);替尼泊 甙（teniposide);念珠藻環肽（cryptophycin)(尤其念珠藻環 肽1及念珠藻環肽8);海兔毒素（dolastatin);多卡米辛 (duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189 及 CB1-TM1); 艾榴素（eleutherobin);盤克斯塔叮（pancratistatin);沙考 的汀（sarcodictyin);海綿素（spongistatin);氮芥，諸如苯 丁酸氮芥、萘氮芥（chlornaphazine)、環麟醢胺、雌氮芥 (estramustine)、異環填醯胺、二氣甲基二乙胺 (mechlorethamine)、鹽酸二氣曱基二乙胺氧化物 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法命、新氮芥 (novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥（phenesterine)、松龍苯 芥（prednimustine)、氯乙環填醯胺（trofosfamide)、尿嘧。定 氮芥（uracil mustard);硝基脲，諸如亞硝脲氮芥 (carmustine)、氯脲黴素（chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、環己亞硝脲（lomustine)、嘴°定亞硝脲 (nimustine)及拉甯司汀（ranimnustine);抗生素，諸如烯二 炔抗生素（例如，卡奇黴素（calicheamicin)，尤其卡奇黴素 γΐ及卡奇黴素ωΐ(參見，例如，Agnew，Chem Inti. Ed. 121444.doc -57- 200815467

Engl·，33: 183-186 (1994));達内黴素（dynemicin) ’ 包括達 内黴素A ;埃斯培拉黴素（esperamicin);以及新製癌菌素 (neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色 團）、阿克拉希黴素（aclacin〇mysin)、放線菌素 (actinomycin)、奥拉黴素（&价111：&111；/(^11)、重氮絲胺酸 (azaserine)、博萊黴素（bleomycin)、 放線菌素 C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅被素 (carminomycin)、嗜癌黴素（carzinophilin)、色 Μ 素 (chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾锨素、 地托比星（detombicin)、6-重氮基-5-側氧基正白胺酸、 ADRI AM YCIN®羥道諾紅黴素（包括嗎啉基-羥道諾紅黴素 (morpholino-doxorubicin)、氰基嗎琳基-經道語紅黴素 (cyanomorpholino-doxorubicin)、2-口比 口各淋基-羥道謹紅徽 素及去氧羥道諸紅黴素（deoxydoxorubicin)、表柔比星 (epirubicin)、依索比星（68〇1*111)1(^11)、伊達比星 (idarubicin)、麻西羅黴素（marcellomycin)、絲裂黴素 (mitomycins)(諸如絲裂黴素 C)、黴盼酸（mycophenolic acid)、諾加黴素（nogalamycin)、橄禮黴素（olivomycins)、 培洛黴素（peplomycin)、潑非黴素（potfiromycin)、嘌呤黴 素（puromycin)、奎那黴素（quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、鏈黑菌素（streptonigrin)、鏈脲黴素 (streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、佐柔比星（2〇1*111^(^11); 抗代謝物，諸如曱胺蝶吟及5-敗尿癌咬（5-fluorouracil)(5- 121444.doc -58 - 200815467

FU);葉酸類似物，諸如傣諾特呤（denopterin)、甲胺喋 呤、嗓羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);嗓呤類 似物，諸如氟達拉濱（fludarabine)、6-魏基嗓呤（6_ mercaptopurine)、售咪嗓吟（thiamiprine)、硫鳥 °票呤 (thioguanine)；嘴唆類似物，諸如環胞苦（ancitabine)、阿 紮胞普（azacitidine)、氮尿苦（6-azauridine)、卡莫 I (carmofur)、阿糖胞普（cytarabine)、雙脫氧尿普 (dideoxyuridine)、去氧 尿苦（doxifluridine)、依諾他濱 (enocitabine)、氣尿核 ^(noxuridine);雄性激素，諸如二 甲睾酮（calusterone)、丙酸屈他雄顔I (dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧 (mepitiostane)、睾内酉旨（testolactone);抗腎上腺藥，諸如 胺基苯乙旅咬酮（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、 曲洛司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid); 醋葡内酯（aceglatone); 駿填醯胺葡糠戒 (aldophosphamide glycoside)；胺基乙醢丙酸 (aminolevulinic acid);伊利盧拉（eniluracil);胺苯 ϋ丫咬 (amsacrine);倍思塔布（bestrabucil);比生群（bisantrene); 艾達曲克（edatraxate);得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺 (demecolcine)；地 口丫 酉昆(diaziquone)；艾弗利散 (elfornithine);依利酷銨（elliptinium acetate);埃坡黴素 (epothilone)；乙環氧唆（etoglucid);石肖酸鎵（gallium nitrate);經基脲（hydroxyurea);香蒜糖（lentinan);羅尼達 寧（lonidainine);類美登素（maytansinoids)，諸如美登素 121444.doc -59- 200815467

(maytansine)及胺沙托辛（ansamitocins);丙脉腙 (mitoguazone);米托蒽釅（mitoxantrone);莫比達摩 (mopidanmol)；瑞拉維林（nitraerine)；喷司他丁 (pentostatin);凡那明（phenamet)；比柔比星 (pirarubicin);洛索蒽酉昆（losoxantrone) ; 2-乙基醯肼（2-ethylhydrazide);普魯苄肼（procarbazine) ; PSK® 多醣複合 物（JHS Natural Products， Eugene， OR);丙亞胺 (razoxane);根黴菌素（rhizoxin);西佐糖（sizofiran);螺鍺 (spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid);三 亞胺S昆（triaziquone) ; 2,2^2"-三氣三乙基胺；單端孢黴烯 族毒素（trichothecenes)(尤其T-2毒素、弗納庫林 A(verracurin A)、桿孢菌素 A(roridin A)及胺癸叮 (anguidine));烏拉坦（urethan); 去乙醯長春醯胺 (vindesine)(ELDISINE® ， FILDESIN®);氮烯唑胺 (dacarbazine);甘露醇氮芥（mannomustine);二漠甘露醇 (mitobronitol);二漠衛矛醇（mitolactol);雙漠丙基旅嗓 (pipobroman)；甲托辛（gacytosine);阿糠胞苦 (arabinoside)("Ara-C”）；硫替派（thiotepa);紫杉醇 (taxoids)，例如 TAXOL® 太平洋紫杉醇（Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton, N.J.) ； ABRAXANE™

Cremophor-free太平祥紫杉醇之經白蛋白工程化設計之奈 米微粒調配物（American Pharmaceutical Partners， Schaumberg，Illinois)及 TAXOTERE® 多西他赛（doxetaxel) (Rhone-Poulenc Rorer，Antony, France);克羅南布 121444.doc -60- 200815467

(chloranbucil);吉西他濱（gemcitabineKGEMZAR®) ; 6-硫 鳥 11 票呤（6-thioguanine);魏基嗓呤（mercaptopurine);甲胺 嗓呤；翻類似物，諸如順顧（cisplatin)及卡顧 (0阻1*1)0卩1&1^11);長春花驗（¥1111>1&81^116)(\^1^人]^(1));翻；依 託泊普（VP-16);異環填醯胺；米托蒽鲲(mitoxantrone); 長春新鹼（vincristineKONCOVIN®)； 奥沙利鉑 (oxaliplatin);盧考弗文（leucovovin);長春瑞賓 (vinorelbineXNAVELBINE®) •，諾凡特龍（novantrone);依 達曲沙（edatrexate);道諾黴素；胺基喋呤；伊班膦酸鹽 (ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟曱基鳥 胺酸（difluorometlhylornithine)(DMFO);類視色素，諸如 視黃酸（retinoic acid);卡培他濱（capecitabine) (XELODA®);以上任一種治療劑之醫藥學上可接受之鹽、 酸或衍生物；以及以上兩種或兩種以上治療劑之組合，諸 如CHOP(環磷醯胺、羥道諾紅黴素、長春新鹼與潑尼松龍 (prednisolone)之組合療法之縮寫）及FOLFOX(奥沙利鉑 (oxaliplatin)(ELOXATIN™)與5-FU及盧考弗文組合治療方 案之縮寫）。 此定義亦包括用於調控、減弱、阻斷或抑制可促進癌症 生長之激素之效應的抗激素劑，且通常為系統性或全身性 治療之形式。其可為激素本身。實例包括抗雌激素及選擇 性雌激素受體調節劑（SERM)，例如包括它莫西芬 (tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧它莫西芬）、EVISTA®雷洛西 芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、4-羥基它莫西芬 121444.doc -61- 200815467

(4-hydT〇xytamoxifen)、曲沃昔芬（trioxifene)、雷洛昔芬鹽 酸鹽（keoxifene)、LY117018、歐納氏酮（onapristone)及 FARESTON^瑞米芬（toremifene);抗黃體酮；雌激素受 體減量調節劑（ERD);具有抑制或阻止卵巢之功能的藥 劑，例如黃體素釋放激素（LHRH)促效劑，諸如LUPRON® 及ELIGARD®乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)、乙酸戈舍 瑞林（goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林〇\1861^1111&〇6{&16) 及曲特瑞林（tripterelin);其他抗雄性激素，諸如氟他胺 (flutamide)、 尼魯米特（nilutamide)及必卡他胺 (bicalutamide);以及抑制芳香酶的芳香酶抑制劑（芳香酶 可調節腎上腺中之雌激素產生），諸如4(5)-咪唑、胺基苯 乙派咬酮（aminoglutethimide)、MEGASE®乙酸曱地孕酮 (megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦（exemestane)、 弗米斯坦（formestanie)、法倔唾（fadrozole)、RIVISOR®伏 氯 °坐(vorozole) 、 FEMARA® 來曲嗤（letrozole)及 ARIMIDEX®瑞寧德（anastrozole)。此外，該化學治療劑定 義包括：雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽（clodronate)(例如， BONEFOS® 或 OSTAC⑧)、DIDROCAL® 依替膦酸鹽 (etidronate)、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸/唑來膦酸鹽 (zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX® 阿命膦酸鹽 (alendronate)、AREDIA® 帕米膦酸鹽（pamidronate)、 SKELID®替魯膦酸鹽（tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸鹽 (risedronate);以及曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環 核苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其抑制牵涉於異 121444.doc -62- 200815467 常細胞增殖之信號轉導途徑中之基因表現的彼等反義募核 苷酸，該等基因諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子 受體（EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE⑧疫苗及基因療法 疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及 VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑； ABARELIX® rmRH ;對曱苯石黃酸拉帕替尼（lapatinib ditosylate)(ErbB-2與EGFR二元路胺酸激酶小分子抑制劑， 亦稱為GW572016);及以上任一治療劑之醫藥學上可接受 之鹽、酸或衍生物。 π生長抑制劑"當用於本文中時係指在活體外或活體内抑 制細胞（諸如表現DLL4之細胞）生長的化合物或組合物。因 此，生長抑制劑可為使S期細胞（諸如表現DLL4之細胞）百 分率顯著降低的藥劑。生長抑制劑之實例包括（在S期外之 處）阻斷細胞週期進行的藥劑，諸如誘導G1停滞及Μ期停 滯的藥劑。典型的Μ期阻斷劑包括長春花（長春新鹼及長春 花鹼）、紫杉烷及拓撲異構酶II抑制劑，諸如羥道諾紅黴 素、表阿黴素（epirubicin)、道諾黴素、依託泊苷及博萊黴 素。阻滯G1的彼等藥劑亦可阻滯S期，例如DNA烷化劑， 諸如它莫西芬、潑尼松、達卡巴嗪、二氯甲基二乙胺、順 麵、甲胺嗓吟、5_氟尿癌咬及ara-C。其他資訊可見於The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn 及 Israel 編，第 1 章，標題為"Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakami 等人（WB Saunders: Philadelphia，1995)，尤其第13頁。紫杉烷（太平洋紫杉醇 121444.doc -63- 200815467 ^多西匕他賽（docetaxel))均$源自紫杉樹的抗癌藥物。源自 歐洲紫杉（EUropean yew)的多西他賽（tax〇tere⑧，

Rh〇ne_P:ulene R〇rer)為太平洋紫杉醇之半合成類似物 (TAXOL ’ Bristol-Myers Squibb)。太平洋紫杉醇及多西 他，促進微官蛋白二聚體組I成微管且藉由防止解聚來穩 定微管，從而抑制細胞中之有絲分裂。 $ I工道諾紅彳放素為恩環黴素抗生素。羥道諾紅黴素之化 學全名為（8S-順H〇-[(3-胺基_2,3,6_三去氧_a_L_來蘇-六吡 南糖基）氧基]-7,8,9，10-四氫_6,8，11β三羥基_8_(羥基乙醯 基）-1_甲氧基·5，12-并四苯二酮。 術語”抗贅生性組合物"係指包含至少一種活性治療劑（例 如抗癌劑）適用於治療癌症的組合物。治療劑（抗癌劑， 本文中亦稱為，，抗贅生劑”）之實例包括（但不限於）：例如， 化予/σ療蜊、生長抑制劑、細胞毒性劑、用於放射治療之 藥劑、抗血管生成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑、毒素 及其他/a療癌症之藥劑，例如抗VEGF中和抗體、vegf拮 抗d、抗-HER-2、抗-CD20、表皮生長因子受體（EGFR_ 抗劑（例如，酪胺酸激酶抑制劑）、HER1/EGFR抑制劑、埃 羅替尼（erlotinib)、c〇x_2抑制劑（例如，塞來考昔 (CeleC〇Xlb))、干擾素、細胞激素、與 ErbB2、ErbB3、 ErbB4或VEGF受體中之一或多者結合之拮抗劑（例如中和 抗體）、血小板衍生長因子（pDGF)及/或幹細胞因子（SCF) 之文體路胺酸激酶之抑制劑（例如，曱磺酸伊馬替尼 (imatinib mesylate)(Gleevec⑧ Novartis))、TRAIL/Apo2 及 121444.doc -64- 200815467 其他生物活性藥劑及有機化學藥劑等。 义如本申請案中所使用之術語”前藥"係指s藥活性物質之 月驅物或衍生物形式’與親本藥物相比，其對腫瘤細胞之 細胞毒性較弱且能夠經酶促活化或轉化成具有較高活性之 親本形式。參見，例如，Wilman，”Prodrugs in Cancer

Chem〇therapy”Bioehemical s〇ciety 丁❹如扣如如，i4，第 375 382頁，第615屆貝爾法斯特會議（Meeting Belfast) • (1986)^ Stella# A ^ ^Prodrugs: A Chemical Approach to

Targeted Drug Delivery/Oirected Drug Delivery, Borchardt 等人，（編）’第 247-267頁，Humana Press (1985)。本發明 之幻蕖包括（但不限於）.含有構酸酯基之前藥、含有硫代 麟酸酯基之前藥、含有硫酸酯基之前藥、含有肽之前藥、 經D-胺基酸修飾之前藥、糖基化前藥、含有卜内醯胺之前 藥、含有視需要經取代之苯氧基乙醯胺之前藥或含有視需 要經取代之苯乙醯胺之前藥、可轉化成具有較高活性之細 φ 胞毒性游離藥物之弘氟胞嘧啶及其他5-氟尿核苷前藥。可 衍生為用於本發明中之前藥形式之細胞毒性藥物的實例包 括（但不限於）上述彼等化學治療劑。 抗血官生成劑”或”血管生成抑制劑”係指直接或間接抑 制血管生成、脈管生成或不當血管透過性的小分子量物 質、聚核苷酸（包括例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多 肽、分離蛋白質、重組蛋白、抗體或其接合物或融合蛋 白。舉例而言，抗血管生成劑為如上文所定義之抗體或其 他針對管生成劑之拮抗劑，例如針對VEGF之抗體、針 121444.doc -65- 200815467 對VEGF受體之抗體、可溶性VEGF受體片段或阻斷VEGF 受體信號轉導之小分子（例如PTK787/ZK2284、SU6668、 SUTENT®/SU11248(蘋果酸舒尼替尼（sunitinib malate))、 AMG706或描述於例如國際專利申請案WO 2004/113304中 之彼等物質）。抗血管生成劑亦包括天然金管生成抑制 劑，例如，血管抑制素、内皮抑制素等。參見，例如， Klagsbrun 及 D’Amore，j53:217-39 (1991) ; Streit 及 Detmar，似，22:3172-3179 (2003) (例如，列舉惡性黑素瘤中抗血管生成療法之表3) ; Ferrara 及 Alitalo，Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)；

Tonini等人，22:6549-6556 (2003)(例如’列舉 抗血管生成因子之表2);及Sato hi. «/. C/M· (9加〇/·，8:2〇〇-206 (2003)(例如，表1列舉臨床試驗中所用之抗血管生成 劑）。 本發明之組合物及其製備方法 本發明涵蓋包含抗-DLL4抗體及包含編碼抗-DLL4抗體 之序列之聚核苷酸的組合物，包括醫藥組合物。如本文中 所使用，組合物包含一或多種與DLL4結合的抗體及/或一 或多種包含編碼一或多種與DLL4結合之抗體之序列的聚 核苷酸。該等組合物可進一步包含此項技術中熟知之適當 載劑，諸如醫藥學上可接受之賦形劑（包括缓衝劑）° 本發明亦涵蓋分離抗體及聚核苷酸實施例。本發明亦涵 蓋大體上純的抗體及聚核苷酸實施例。 本發明之抗-DLL4抗體較佳為單株抗體。本發明之範疇 121444.doc -66· 200815467 亦涵蓋本文中所提供之抗-DLL4抗體的Fab、Fab，、Fab1-SH及F(aV)2片段。該等抗體片段可藉由慣常方式（諸如酶 促消化）形成，或藉由重組技術產生。該等抗體片段可為 嵌合抗體片段或人源化抗體片段。該等片段適用於以下所 述之診斷性及治療性目的。 單株抗體係獲自大體上同源的抗體之群，亦即構成該群 之個別抗體相同，除可能少量存在之可能的天然產生之突 變之外。因此，修飾語”單株”表明抗體不為離散抗體之混 合物的特徵。 本發明之抗-DLL4單株抗體可使用最先描述於Kohler等 人，心加6，256:495 (I975)中之雜交瘤方法製備，或可藉 由重組DNA方法（美國專利第4,816,567號）製備。 在雜交瘤方法中，使小鼠或其他適當宿主動物（諸如倉 鼠）免疫以誘發產生或能夠產生與用於免疫之蛋白質特異 性結合之抗體的淋巴細胞。針對DLL4之抗體通常藉由多 次皮下（sc)或腹膜内（ip)注射DLL4及佐劑而在動物體内產 生。DLL4可使用此項技術中熟知之方法製備，其中一些 方法在本文中進一步描述。舉例而言，下文描述DLL4之 重組製備。在一實施例中，用DLL4之衍生物使動物免 疫，該DLL4衍生物含有與免疫球蛋白重鏈之Fc部分融合 的DLL4之胞外域（ECD)。在一較佳實施例中，用DLL4· IgGl融合蛋白使動物免疫。通常用DLL4與單磷醯基脂質A (MPL)/ 海 '藻糖二黴菌酸酉旨（trehalose dicrynomycolate) (TDM)(Ribi Immunochem. Research，Inc·，Hamilton，MT)之 121444.doc -67- 200815467 免疫原性接合物或衍生物使動物免疫，且在多個部位皮内 注射溶液。兩週後對該等動物強化。7至14天後，抽取動 物血液且檢定血清的抗-DLL4效價。強化動物直至效價穩 定。 或者，可活體外使淋巴細胞免疫。接著使用適當的融合 劑（諸如聚乙二醇）使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成 雜交瘤細胞（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and iVacizce，第 59-103 頁（Academic Press，1986))。 將由此所製備之雜交瘤細胞接種且培養於適當的培養基 中，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤 細胞生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺 少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT或HPRT)，則 用於雜交瘤之培養基通常應包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸 苷（HAT培養基），該等物質可防止HGPRT缺陷型細胞生 長。 較佳骨髓瘤細胞為有效融合、支持所選抗體產生細胞穩 定高含量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的彼 等細胞。其中，較佳骨髓瘤細胞株為鼠骨髓瘤細胞株，諸 如源自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之彼等細胞株（可獲自 Salk Institute Cell Distribution Center， San Diego, California USA)及SP-2或X63-Ag8-653細胞（可獲自美國典 型培養物保存中心（American Type Culture Collection， Rockville，Maryland USA))。人類骨髓瘤及小鼠-人類雜合 骨髓瘤細胞株亦已描述用於人類單株抗體之製備（Kozbor， 121444.doc -68 - 200815467 J. Immunol” 133:3001(1984) ； Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)) 〇 檢定雜交瘤細胞生長所在之培養基中針對DLL4之單株 抗體之產生。較佳地，由雜交瘤細胞所產生之單株抗體之 結合特異性係由免疫沈澱法或活體外結合檢定法（諸如放 射免疫檢定法（RIA)或酶聯免疫吸附檢定法（ELISA))測 定。 ® 單株抗體之結合親和力例如可由Munson等人， 107:220 (1980)之 Scatchard分析來測定。 鑑別出產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體 之雜交瘤細胞之後，可將純系藉由限制稀釋程序次選殖且 由標準方法培養（Goding， Monoclonal Antibodies: Pr/wcz.p/a ，第 59-103 頁（Academic Press， 1986))。適用於此目的之培養基例如包括D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，可使雜交瘤細胞在動物體内活體内生 ^ 長成腹水腫瘤。 次純系所分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程 序，諸如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳 法、透析法或親和層析法自培養基、腹水液或血清適當分 離。 本發明之抗-DLL4抗體可藉由使用組合文庫篩檢具有所 要活性之合成抗體純系來製備。原則上，合成抗體純系係 藉由篩檢含有呈現與噬菌體外殼蛋白融合之抗體可變區 121444.doc -69- 200815467 (Fv)之各種片段之噬菌體的噬菌體文庫來選擇。該等噬菌 體文庫係藉由親和層析法針對所要抗原來全面篩選。表現 能夠結合所要抗原之Fv片段的純系被吸附至該抗原，且從 而與文庫中之非結合純系分離。結合純系接著與抗原溶離 且可藉由其他抗原吸附/溶離循環進一步富集。本發明之 任何抗-DLL4抗體可如下獲得··設計適當的抗原篩檢程序 以選擇所關注之噬菌體純系，接著使用所關注之噬菌體純 系之 Fv 序列及 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)，第1_3卷中所述之適當恆定區（Fc)序 列建構全長抗-DLL4抗體純系。 抗體之抗原結合域係由兩個約110個胺基酸之可變（V)區 形成，兩個區各來自均存在三個高變環或互補判定區 (CDR)的輕鏈（VL)與重鏈（VH)。可變域可作為單鏈 FV(scFv)片段（其中VH與VL·經由一短的撓性肽共價連接）或 作為Fab片段（其中VH與VL各自與恆定域融合且非共價相 互作用）在噬菌體上功能性呈現，如Winter等人，乂⑽. 7m 12: 433 - 455(1994)中戶斤述0如本文中戶斤使用，編 碼噬菌體純系之scFv以及編碼噬菌體純系之Fab統稱為nFv 噬菌體純系”或"Fv純系”。 VH與VL基因之文庫可藉由聚合酶鏈反應（PCR)單獨選 殖，且在噬菌體文庫中隨機重組，接著可在該噬菌體文庫 中搜尋抗原結合純系，如Winter等人，i?ev· /mm㈣〇/·， 12: 433-455(1994)中所述。來自經免疫之來源之文庫提供 121444.doc -70- 200815467 針對免疫原之高親和力抗體，而無需建構雜交瘤。或者， 可選殖單純文庫以提供針對無任何免疫作用之廣泛非自體 抗原及自體抗原之人類抗體的單一來源，如Griffiths等 人，EMBO J，12: 725_734 (1993)所述。最後，單純文庫亦 可如下合成製備：藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段 且使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高變CDR3區且實 現活體外重排，如 Hoogenboom 及 Winter，J. Μο/· 5ζ·ο/.， 227:3 81-3 88 (1992)中所述。 使用絲狀噬菌體藉由與少量外殼蛋白ρΙΙΙ融合呈現抗體 片段。抗體片段可作為單鏈Fv片段（其中VH與VL域由撓性 夕肽間隔基連接於同一多肽鏈上，例如，如Marks等人， 汄抓/·价〇/，，222: 581-597(1991)中所述），或作為Fab片段 (其中例如一鏈與ρΠΙ融合而另一鏈分泌進入細菌宿主細胞 周質内，在周質内藉由置換一些野生型外殼蛋白而組裝呈 現於喔菌體表面上的Fab_外殼蛋白結構，如H〇〇genb〇〇m等 人’汉⑽/· jc以·，19: 4133-4137(1991)中所述）呈現。 一般而言’編碼抗體基因片段之核酸係獲自由人類或動 物收集之免疫細胞。若需要偏重於抗-DLL4純系的文庫， 則用DLL4使個體免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/ 或循環B細胞及其他周圍血液淋巴細胞（pBL)用於文庫建 構。在一較佳實施例中，偏重於抗_〇1^4純系之人類抗體 基因片段文庫係如下獲得··在攜有功能性人類免疫球蛋白 基因陣列（且缺乏功能性内源抗體產生系統）之轉殖基因小 鼠中產生抗-DLL4抗體反應，以使得DLL4免疫形成產生針 121444.doc -71- 200815467 對DLL4之人類抗體的B細胞。產生人類抗體之轉殖基因小 鼠的產生在下文中描述。 抗-DLL4反應性細胞群之進一步富集可如下獲得：使用 適當篩檢程序分離表現DLL4特異性膜結合抗體之B細胞， 例如，藉由以DLL4親和層析法分離細胞或使細胞吸附至 經螢光染料標記之DLL4上，繼而進行流式活化細胞分選 (FACS)。 或者，使用來自未經免疫之供體之脾細胞及/或B細胞或 其他PBL提供可能抗體文庫之較佳代表，且亦容許使用其 中DLL4不具抗原性之任何動物（人類或非人類）物種建構抗 體文庫。對於建構活體外併有抗體基因之文庫，自個體收 集幹細胞以提供編碼未重排抗體基因區段之核酸。所關注 之免疫細胞可獲自多種動物物種，諸如人類、小鼠、大 鼠、兔、狼、犬、貓，、豬、牛、馬及鳥物種等。 編碼抗體可變基因區段（包括VH及VL區段）之核酸係自 所關注之細胞回收且擴增。在已重排之VH與VL基因文庫 之情況下，所要DNA可如下獲得：自淋巴細胞中分離基因 組DNA或mRNA，繼而用與重排VH與VL基因之5’端及3’端 匹配之引子進行聚合酶鏈反應（PCR)，如Orlandi等人於 Proc· Natl· Acad. Sci· (USA), 86: 3833-3837 (1989)中所 述，從而製得用於表現之不同V基因文庫。可如Orlandi等 人（1989)及 Ward 等人，iVaiwre，341: 544-546(1989)中所述 用位於編碼成熟V-域之外顯子之51端的後置引子及位於J-區段内部的前置引子自cDNA及基因組DNA擴增V基因。然 121444.doc -72- 200815467 而，若由cDNA擴增，則後置引子亦可如Jones等人， 9: 88-89 (1991)中所述位於前導外顯子中，且 前置引子可如Sastry等人，Proc. Scz·· 「[/以入 86: 5728-5732 (1989)中所述位於恆定區内部。為使互補性 最大化，可在引子中併入簡便性，如Orlandi等人（1989)或 Sastry等人（1989)所述。較佳地，文庫多樣性係藉由使用 靶向各V-基因家族之PCR引子來最大化，以便擴增存在於 免疫細胞核酸樣本中之所有可用VH及VL排列，例如，如 Marks等人，义 Mo/. 5b/·, 222: 581-597(1991)之方法中所 述，或如 Orum 等人，iVwc/eic 及以·，21: 4491- 4498( 1993)之方法中所述。對於將所擴增之DNA選殖入表 現載體内，可如Orlandi等人（1989)所述在PCR引子内之一 端處引入稀有限制性位點作為標記；或如Clackson等人， TVaiwre，352: 624-628 (1991)中所述用經標記之引子進一步 PCR擴增。 經合成重排之V基因之文庫可由V基因區段活體外獲 得。大部分人類VH-基因區段已經選殖及測序（報導於 Tomlinson等人，*/· Μο/· 5ζ·σ/·，227: 776-798(1992)中），且 繪出圖譜（報導於 Matsuda等人，iVaiwre Genei·，3: 88-94 (1993)中）；可使用該等經選殖之區段（包括HI及H2環之所 有主要構型）與編碼不同序列及長度之H3環之PCR引子產 生不同VH基因文庫，如Hoogenboom及Winter，*/. Mo/. 5沁/·，227: 381-388 (1992)中所述。亦可製備其中所有序列 多樣性集中於單一長度之長H3環中的VH文庫，如Barbas 121444.doc -73- 200815467 專尺 ’ Proc· Natl· A^ccid· Sci· 89: 4457-4461(1992)中 所述。人類Vk及νλ區段已經選殖及測序（報導於wiiiiams 及 Winter，jEwr· J./mm抓〇/.，23: 1456-146ί (1993)中）且可用 於製備合成輕鏈文庫。基於VH及VL折疊之範圍及L3AH3 長度，合成V基因文庫編碼具有大量結構多樣性的抗體。 繼擴增編碼V-基因之DNA後，可根據H〇〇genb〇〇m及

Winter，J· Mo/· 5b/.，227: 381_388 (1992)之方法活體外重 排生殖系V-基因區段。 鲁 抗體片段之文庫可藉由以若干方式組合VH與VL基因文 庫來建構。各文庫可在不同載體中產生，且該等載體可活 體外重組，例如，如Hogrefe等人，仏似，128: 119-126 (1993)中所述，或藉由組合感染活體内重組，例如， Waterhouse等人，及以·，21: 2265-2266 (1993)中 所述之ΙοχΡ系統。活體内重組方法係利用Fab片段之雙鏈 性貝來克服大腸桿菌轉化效率對文庫大小所施加的限制。 φ 單純VH及VL文庫係單獨選殖，一種選殖入噬質體内且另 一種選殖入嗟菌體载體内。接著將兩個文庫藉由噬菌體感 柒έ有巫貝體之細菌來組合以便各細胞含有不同的組合， 且文庫大小僅受所存在之細胞數目限制（約1〇12個純系）。 兩種載體均含有活體内重組信號，以便VH與VL基因重組 到單f製子上且共同包裝入噬菌體病毒粒子内。該等龐 大文庫提供大1具有良好親和力（約1〇·8 Μ之κ,不同抗 體。 或者’該等文庫例如可依序選殖入同一載體内，例如， 121444.doc -74- 200815467 如 Barbas等人，/Voc· #如/· ^crz·· USA, 88: 7978-7982 (1991)中所述；或藉由PCR組裝至一起且接著選殖，例 如，如 Clackson 等人，ATaiwre，352: 624-628 (1991)中所 述。PCR組裝亦可用於將VH及VL DNA與編碼撓性肽間隔 基之DNA連接以形成單鏈Fv(scFv)文庫。在又一技術中， "細胞内PCR組裝"係用於在淋巴細胞内藉由PCR組合VH與 VL基因且接著選殖連鎖基因之文庫，如Emb let on等人， Nucl· Acids Res·，20: 3831-3837(1992)中所述。 由单純文庫所產生之抗體（天然或合成）可具有中度親和 力（約106至ΙΟ7 M·1之Kef1)，但亦可如Winter等人（1994)(同 上）所述藉由建構及自二級文庫再選擇來活體外模擬親和 力成熟。舉例而言，突變可藉由使用易出錯聚合酶（報導 於 Leung等人，rec/mzjwe，1: 11-15 (1989)中）以 Hawkins等 人，J. Mol· Biol.，226: 889-896 (1992)之方法或以Gram等 人，/Voc· iVa"· Scz· [/5^4，89: 3576-3580 (1992)之方 法於活體外隨機引入。此外，親和力成熟可藉由例如使用 PCR用帶有跨越所關注之CDR之隨機序列的引子在選定的 個別Fv純系中使一或多個CDR隨機突變且篩選較高親和力 純系來進行。WO 9607754(1996年3月14日公開）描述在免 疫球蛋白輕鏈之互補判定區内誘發突變形成以產生輕鏈基 因文庫的方法。另一種有效方法係如Marks等人， Biotechnol.，10: 779-783 (1992)中所述，使藉由嚆菌體呈 現所選擇之VH或VL域與獲自未經免疫之供體之天然產生 的V域變異體之文庫重組且以數輪鏈改級針對較高親和力 121444.doc -75- 200815467 加以篩檢。此技術允許製備親和力在1 〇-9 Μ範圍内的抗體 及抗體片段。 DLL4核酸及胺基酸序列在此項技術中已知。編碼DLL4 之核酸序列可使用DLL4之所要區之胺基酸序列設計。或 者，使用GenBank寄存編號第ΝΜ_019074號之cDNA序列 (或其片段）。DLL4為跨膜蛋白質。胞外區含有8個EGF樣 重複以及DSL域，DSL域在所有Notch配體間為保守的且為 受體結合所必需。預測蛋白質亦含有跨膜區及缺少任何催 化基元之細胞質尾部。人類DLL4蛋白為685個胺基酸之蛋 白質且含有以下區··信號肽（胺基酸1-25) ; MNNL(胺基酸 26-92) ; DSL(胺基酸 155-217) ; EGF_ 樣（胺基酸 221-251); EGF-樣（胺基酸 252-282) ; EGF-樣（胺基酸 284-322) ; EGF-樣（胺基酸324-360) ; EGF-樣（胺基酸366-400) ; EGF-樣（胺 基酸402-438) ; EGF-樣（胺基酸440-476) ; EGF-樣（胺基酸 480-5 18);跨膜（胺基酸529-55 1);細胞質域（胺基酸552-685)。人類DLL4之寄存編號為ΝΜ__019074，且小鼠DLL4 之寄存編號為ΝΜ_019454。 編碼DLL4之DNA可由多種此項技術中已知之方法來製 備。該等方法包括（但不限於）Engels等人，Chem. hi.五汰28: 716-734 (1989)中所述之任何化學合成 方法，諸如三酯、亞磷酸酯、胺基磷酸酯及H-膦酸酯方 法。在一實施例中，在設計編碼DLL4的DNA中使用表現 宿主細胞青睞之密碼子。或者，可自基因組或cDNA文庫 中分離編碼DLL4之DNA。 I21444.doc -76- 200815467 繼建構編碼DLL4之DNA分子後，使dna分子與表現载 體（諸如質體）内之表現控制序列操作性連接，其中控制序 列係由經载體轉化之宿主細胞識別。一般而言，質體載體 含有源自與宿主細胞相容之物種的複製序列及控制序列。 載體通常攜有複製位點以及編碼能夠在轉化細胞中提供表 型選擇之蛋白質的序列。適用於在原核宿主細胞及真核宿 主細胞中表現的載體在此項技術中已知，且一些載體於本 文中進一步描述。可使用諸如酵母之真核生物或來源於多 細胞有機體（諸如哺乳動物）的細胞。 視需要，使編碼DLL4之DNA與促分泌前導序列操作性 連接，從而使宿主細胞將表現產物分泌入培養基内。促分 泌前導序列之實例包括st„、歐克淨（ec〇tin)、lamB、疱疹 GD lPP、驗性磷酸Sf、轉化酶及α因子。亦適用於本文中 的為蛋白Α之36個胺基酸之前導序列（Abrahmsen等人， EMBO J·，4: 3901 (1985))。 宿主細胞可用本發明之上述表現載體或選殖載體轉染且 杈佳轉化，且在適當時經改良以誘導啟動子、選擇轉化體 或擴增編碼所要序列之基因的習知營養培養基中培養。 轉染係指表現載體被宿主細胞吸收，無論任何編碼序列 實際上是否表現。多種轉染方法，例如CaP04沈澱法及電 穿孔法，已為普通熟習技工所已知。當宿主細胞内出現此 載體工作之任何跡象時，通常公認轉染成功。轉染方法為 此項技術中所熟知，且一些方法在本文中進一步描述。 轉化意謂將DNA引入有機體内以便〇!^八可作為染色體外 121444.doc -77- 200815467 成分或染色體之部分複製。視所用宿主細胞而定，轉化係 使用適於該等細胞之標準技術進行。轉化方法為此項技術 中所熟知，且一些方法在本文中進一步描述。 用於產生DLL4之原核宿主細胞可如Sambr〇〇k等人（同上） 中之一般性描述加以培養。 用於產生DLL4之哺乳動物宿主細胞可培養於多種培養 基中，此為此項技術中所熟知且其中一些在本文中加以描 述。 本揭示案中所提及之宿主細胞涵蓋活體外培養之細胞以 及宿主動物體内之細胞。 DLL4之純化可使用業内公認之方法實現，其中一些在 本文中加以描述。 經純化之DLL4可附著於適當基質，諸如瓊脂糖珠粒、 丙稀醯胺珠粒、玻璃珠粒、纖維素、各種丙烯酸系共聚 物、羥基甲基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸系 鲁 共聚物、财綸（nWon)、中性及離子性載劑及其類似物，以 用於噬菌體呈現純系之親和層析分離。DLL4蛋白附著於 基質可藉由h 第44卷（1976)中所述 之方法實現。使蛋白質配體附著於多醣基質（例如璦脂 糖、葡聚糖或纖維素）的常用技術包括用鹵化氰活化載劑 及隨後使肽配體之第一脂族胺或芳族胺與活化基質偶合。 或者，可使用DLL4塗覆吸附板之孔，使DLL4表現於固 定於吸附板之宿主細胞上或用於細胞分選，或與生物素接 合以用塗有抗生蛋白鏈菌素之珠粒捕獲，或用於此項技術 121444.doc •78- 200815467 已知的其他任何方法以全面選擇噬菌體呈現文庫。 使噬菌體文庫樣本與固定之DLL4在適於噬菌體顆粒之 至 >、邛为與吸附劑結合之條件下接觸。通常，選擇包括 pH、·離子濃度、溫度及類似條件在内之條件以模擬生理條 件。洗滌與固相結合之噬菌體且接著由酸溶離，例如，如 Barbas 等人，/V0C· 以^，88:7978_7982 (1991)中所述；或例如由鹼溶離，例如，如等人，乂 Mo/· &〇/·，222·· 581-597 (1991)中所述；或藉 *DLL4 抗原 矶爭來溶離，例如，類似KClackson等人，7V〜，352: 624-628 (1991)之抗原競爭方法之程序。噬菌體可在單輪 選擇中畜集2〇-1，〇〇〇倍。此外，可使富集之噬菌體在細菌 培養物中生長且經受更多輪之選擇。 選擇效率視多種因素而定，該等因素包括洗滌期間之解 離動力學以及單噬菌體上之多個抗體片段是否可與抗原同 時結合。具有快速解離動力學（及弱結合親和力）之抗體可 藉由利用短時間洗滌、多價噬菌體呈現及固相中高塗覆密 度之抗原來保持。高密度不但可經由多價相互作用穩定噬 菌體，而且有利於使已解離之噬菌體再結合。具有慢速解 離動力學（及良好結合親和力）之抗體之選擇可藉由利用長 時間洗務及單價嗟菌體呈現（如Bass等人，8: 309-314 (1990)及WO 92/09690中所述）及低塗覆密度之抗 原（如 Marks等人，1〇: 779-783 (1992)中所述） 來促成。 可能在對DLL4具有不同親和力之嗤菌體抗體之間、甚 121444.doc -79- 200815467 至在具有稍微不同之親和力之噬菌體抗體之間選擇。然 而，所選抗體之隨機突變（例如，當以上述某些親和力成 熟技術執行時)可能會產生大部分與抗原結合且少數具有 較高親和力的多種突變體。經由限制DLL4，可淘汰稀少 的高親和力噬菌體。為保留所有較高親和力突變體，可將 噬菌體與過量之生物素化DLL4 —起培育，但生物素化 DLL4之莫耳濃度比DLL4之目標莫耳親和常數低。接著可 由塗有抗生蛋白鏈菌素之順磁珠粒捕獲高親和力結合噬菌 體。此"平衡捕獲"使得可根據抗體之結合親和力來選擇抗 體，其靈敏性容許自顯著過量之具有較低親和力之噬菌體 中分離出親和力僅高出兩倍之突變純系。亦可基於解離動 力學操縱洗滌與固相結合之噬菌體所用的條件來辨別。 抗-DLL4純系可基於活性選擇。在一實施例中，本發明 提供可阻斷Notch受體（諸如Notchl、Notch2、Notch3及/或 Notch4)與DLL4之間的結合，但不阻斷Notch受體與第二蛋 白質之間的結合的抗-DLL4抗體。對應於該等抗-DLL4抗 體的Fv純系可如下選擇：（1)如上所述自噬菌體文庫中分 離出抗-DLL4純系，且視需要擴增所分離之噬菌體純系群 (藉由使該群體在適當細菌宿主中生長）；(2)選擇DLL4及 分別需要針對其之阻斷活性及非阻斷活性的第二蛋白質； (3)使抗-DLL4噬菌體純系吸附至固定之DLL4上；（4)使用 過量的第二蛋白質溶離任何識別與第二蛋白質之結合決定 子重疊或共有之DLL4結合決定子的非所要純系；及（5)溶 離步驟（4)完成後仍保持吸附的純系。視需要，具有所要阻 121444.doc -80 - 200815467 斷/非阻斷性質之純系可藉由將本文中所述之選擇程序重 複一或多次來進一步富集。 編碼源自雜交瘤之單株抗體或本發明之噬菌體呈現以純 系的DNA易於使用習知程序（例如，使用經設計以自雜交 瘤或嗤I)體DNA模板特異性擴增所關注之重鏈編碼區及輕 鏈編碼區的募核苷酸引子）分離及測序。分離後，即可將 DNA置於表現載體内，接著將該表現載體轉染入諸如大腸 桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢（CH⑺細胞或骨髓 瘤細胞之宿主細胞内（否則就不產生免疫球蛋白蛋白質）， 以在重組宿主細胞中獲得所要單株抗體之合成。關於在細 ί中重組表現編碼抗體之DNA的回顧文章包括skerra等 人，Cwrr· Μ 5·· 256 (1993)及 Pluckthmi， 130: 151 (1992)。 可將編碼本發明之Fv純糸的DNA與編碼重鍵恒定區及/ 或輕鏈恆定區之已知DNA序列（例如，適當的〇ΝΑ序列可 獲自Kabat等人，同上文）組合以形成編碼全長或部分長度 之重鏈及/或輕鏈的純系。應瞭解，任何同型之怪定區（包 括IgG恆定區、IgM恆定區、IgA恆定區、igD恆定區& IgE 恆定區）可用於此目的，且該等恆定區可獲自任何人類或 動物物種。如本文中所使用之"嵌合，，抗體及，，雜交"抗體之 定義包括自一動物（諸如人類）物種之可變域DNA衍生且接 著與另一動物物種之彳互定區DN A融合以形成”雜交"的全長 重鏈及/或輕鏈之編碼序列的F v純系。在一較佳實施例 中，使源自人類可變DNA之Fv純系與人類恆定區DNA融合 121444.doc -81 - 200815467 以形成所有人類、全長或部分長度之重鏈及/或輕鏈的編 碼序列。 編碼本發明之源自雜交瘤之抗-DLL4抗體的DNA亦可加 以修飾，例如，藉由用人類重鏈恆定域及輕鏈恆定域之編 碼序列取代源自雜交瘤純系之同源鼠序列（例如，如

Mornson等人，以仍」，81: 6851-6855 (1984) 之方法）。編碼雜交瘤或Fv純系來源之抗體或片段的 DNA可藉由使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽之 全部或部分編碼序列共價連接來進一步加以修飾。以此方 式’可製備具有本發明之Fv純系或雜交瘤純系來源之抗體 之結合特異性的”嵌合”抗體或”雜交"抗體。 抗體片段 本發明涵蓋抗體片段。在某些情形下，使用抗體片段比 使用元整抗體具有優勢。較小尺寸之片段容許快速清除， 且可改良對實體腫瘤之接近。 已開發出多種製備抗體片段之技術。通常，該等片段係 經由蛋白水解消化完整抗體而獲得（參見，例如Morimoto 專人 ’ Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及 Brennan 等人，Science，229:81 (1985) )。然而，該等片段現可由重組宿主細胞直接產生。 Fab、Fv及ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表現且均可由 大腸桿菌分泌，從而可容易地製備大量該等片段。抗體片 段可自上述抗體噬菌體文庫中分離。或者，Fab，-SH片段 可自大腸桿菌中直接回收且經化學偶合以形成F(ab*)2片段 121444.doc -82 - 200815467 (Carter等人，B/o/Tec/mo/ogj； 10:163-167 (1992))。根據另 一方法，F(aV)2片段可直接自重組宿主細胞培養物中分 離。活體内半衰期增加且包含補救受體結合抗原決定基殘 基的Fab及F(ab’）2片段描述於美國專利第5,869,046號中。 其他用於製備抗體片段的技術對於熟習此項技術者而言顯 而易見。在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv片段 (scFv)。參見WO 93/16185 ;美國專利第5,571，894號及第 5,587,458號。Fv及sFv為具有完整結合位點、缺乏恆定區 ® 的唯一種類，因此，其適合在活體内使用期間減少非特異 性結合。可建構sFv融合蛋白以產生效應蛋白質與sFv之胺 基末端或羧基末端之融合。參見Antibody Engineering， Borrebaeck編，同上文。抗體片段亦可為，，線性抗體”，例 如，如美國專利第5,641，870中所述。該等線性抗體片段可 為單特異性或雙特異性抗體片段。 人源化抗體 本發明涵蓋人源化抗體。人源化非人類抗體的各種方法 為此項技術中所已知。舉例而言，人源化抗體可具有一或 多個自非人類來源引入其中的胺基酸殘基。該等非人類胺 基酸殘基通常稱為”引進"殘基，其通常取自”引進”可變 域。人源化大體上可按照Winter及其合作者之方法（jones 等人（1986) Λ^ίζ/re 321:522-525 ; Riechmann 等人（1988) Nature 332··323-327 ; Verhoeyen 等人（1988) Science 239:1534-1536)，藉由用高變區序列取代人類抗體之相應 序列來進行。因此，該等"人源化"抗體為嵌合抗體（美國專 121444.doc -83 - 200815467 利第4,81 6,5 67號），其中近乎完整的人類可變域已經來自 非人類物種的相應序列取代。實際上，人源化抗體通常為 其中一些高變區殘基及可能一些FR殘基已經鼠抗體中之類 似位點處之殘基取代的人類抗體。 選擇用於製備人源化抗體的人類可變域（輕鏈與重鏈）對 於降低抗原性極為重要。根據所謂的，，最佳擬合"方法，針 對已知人類可變域序列的完整文庫篩檢齧齒動物抗體之可 變域序列。接著將最接近齧齒動物序列之人類序列當作人 源化抗體之人類框架（Sims等人（1993) 加卿⑽/ 151:2296; Chothia等人（1987) J·尬/·細/· 196:901)。另 一種方法係使用源自輕鏈或重鏈之特定子群中所有人類抗 體之一致序列的特定框架。幾種不同的人源化抗體可使用 同一框架（Carter 等人（1992) iV〇c· ΛΓαί/. 以以， 89:4285 ; Presta等人（1993) j ^所抓〇/，151:2623)。 I4生貝更為重要。為實現此目標， 序列及人源化序列之三維模型、 使抗體人源化且保持對抗原之高親和力及其他有利生物 ，根據一種方法，使用親本

121444.doc -84- 200815467 特欲，諸如對目標抗原之親和力增強。一般而言，高變區 殘基直接且最主要牽涉於影響抗原結合。 人類抗體 #本發明之人類抗视L4抗體可#由將選自人類來源之嗟 菌體呈現文庫之卜純系可變域序列與已知人類恆定域序列 如上所述進打組合建構。或者，本發明之人類單株抗_ L4抗體可由雜父瘤方法製備。用於製備人類單株抗體 鲁 之人類骨髓瘤細胞株及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株例如 已描述於 Kozbor 乂 /mm ⑽ 〇/·，133: 3001(1984) ; Brodeur 等 尺，M〇n〇cl〇nal Antibody Pr〇ducti〇n 仏❿吻咖 and 却，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc·，New Y〇rk， 1987);及 Boerner等人，义 147:86 (1991)中。 現可能產生能夠在免疫後在不產生内源性免疫球蛋白之 情況下產生人類抗體之完整文庫的轉殖基因動物（例如小 鼠）。舉例而言，已描述，嵌合及生殖系突變小鼠中抗體 _ 重鏈接合區（JH)基因之純合子缺失使得内源性抗體產生被 完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列在該等生殖系 突變小鼠中之轉移使得人類抗體在抗原激發後產生。參 見，例如，Jakobovits等人，iVoc· iVai/· dca忒 Scz· C/M，90: 2551 (1993) ; Jakobovits等人，362: 255 (1993); ^ruggermann^ A j Year in Immunol., 7: 33 (1993) ° 亦可利用基因改組由非人類（例如，齧齒動物）抗體獲得 人類抗體，其中人類抗體具有與起始非人類抗體類似的親 和力及特異性。根據此方法（其亦稱"抗原決定基印記法"）， 121444.doc -85- 200815467 使如上所述藉由噬菌體呈現技術獲得之非人類抗體片段之 重鏈或輕鏈可變區經人類v域基因之文庫置換，從而產生 非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體之群。用抗原選擇使得 非人類鍵/人類鍵嵌合分離，其中在移除初始嗤 菌體呈現純系中之對應非人類鏈後，人類鏈恢復經破壞之 抗原結合位點，亦即抗原決定基支配（印記）人類鏈搭配物 之選擇。當為了置換剩餘非人類鏈而重複該過程時，便獲 得人類抗體（參見1993年4月1日公開之PCT WO 93/06213)。與藉由CDr接枝將非人類抗體人源化之傳統方 式不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的 完全人類抗體。 雙特異性抗體 雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的 單株抗體，較佳為人類或人源化抗體。在此情況下，其中 一種結合特異性係針對DLL4且另一種結合特異性係針對 其他任何抗原。例示性雙特異性抗體可與DLL4蛋白之兩 個不同抗原決定基結合。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒 性劑定位於表現DLL4之細胞。該等抗體具有DLL4結合臂 及結合細胞毒性劑（例如，沙泊寧（saporin) ·、抗干擾素-α、 長春t生物驗、蓖麻素Α鏈、甲胺蝶吟或放射性同位素半 抗原）之臂。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段 (例如，F(ab’)2雙特異性抗體 製備雙特異性抗體之方法為此項技術中所已知。通常， 又特異性抗體之重組製備係基於兩個免疫球蛋白重鏈_輕 12I444.doc -86 - 200815467 鏈對之共同表現，其中該兩個重鏈具有不同特異性 (Milstein 及 Cuello，ΑΓα 仏 re，305:537 (1983))。該等雜交瘤 (四源雜交瘤）因免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配而產生 10種不同抗體分子之可能混合物，其中僅一種具有正確雙 特異性結構。正確分子之純化（通常藉由親和層析步驟進 行）相當繁瑣，且產物產量低。類似程序揭示於1993年5月 13 日公開之WO 93/08829 及 Traimecker等人，J·，1〇: 3655 (1991)中 。 根據不同而更佳之方法，使具有所要結合特異性（抗體 抗原結合位點）之抗體可變域與免疫球蛋白怪定域序列融 合。與包含鉸鏈區、CH2區及CH3區中之至少一部分的免 疫球蛋白重鏈恆定域融合較佳。較佳至少一個融合體中存 在含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區（CH1)。 將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及（若需要）免疫球蛋白輕鏈 的DNA插入單獨表現載體中且共同轉染入適當宿主有機體 中。當在建構中所用之不同比率之三種多肽鏈提供最佳產 量時，其為調整實施例中三種多肽片段之相互比例提供了 很大靈活性。然ίό，當至少兩種等比率之多肽鏈的表現導 致高產量時或當該等比率沒有特定意義時，可能在一個表 現載體中插入兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列。 在此方法之-較佳實施例中，雙特異性抗體係由一臂中 具有第-結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈與另—臂中之 雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對（提供第二結合特異性）組成。 據發現，由於免疫球蛋白輕鏈僅佔雙特異性分子之二分之 121444.doc -87- 200815467 -為分離提供胃行m因此該非對稱結财利於所要雙 特異性化合物與非所需免疫球蛋白鏈接合物分離。此方法 揭示於觸94/G469时。關於形成雙特異性抗體的詳情， 請參見，例如，Suresh等人，心㈣咖㈣， 121:210 (1986)。

根據另-種方法，抗體分子對之間的界面可經工程化設 計以使自重組細胞培養物中所回收之雜二聚體之百分率最 大化。較佳界面包含抗體恆定域之Ch3域之至少一部分。 在此方法中，將第一抗體分子之界面中之一或多個小：基 酸側鏈置換為較大側鏈（例如，酪胺酸或色胺酸）。藉由用 杈小胺基酸側鏈（例如，丙胺酸或蘇胺酸）置換大胺基酸側 鏈，可在第二抗體分子之界面上形成尺寸與大側鏈相同或 類似的補償”腔”。此舉提供使雜二聚體產量增加超過其他 非所需終產物（諸如同二聚體）的機制。 雙特異性抗體包括交聯抗體或”雜接合”抗體。舉例而 言，雜接合物中抗體中之一者可與抗生物素蛋白偶合，另 抗體可與生物素偶合。舉例而言，已提出該等抗體使免 疫系統細胞靶向非所需細胞（美國專利第4,676,98〇號）且用

於治療 HIV 感染（WO 91/00360、W〇 92/00373 及 EP 0 3 0 8 9 )。雜接合抗體可使用任何適宜交聯方法製備。適當 交聯劑以及多種交聯技術已為此項技術中所熟知，且揭示 於美國專利第4,676,980號中。 由抗體片段產生雙特異性抗體的技術亦描述於文獻中。 舉例而言，雙特異性抗體可使用化學鍵聯製備。Brennan 121444.doc -88- 200815467 等人，Science，229: 81 (1985)描述其中使完整抗體經蛋白 水解裂解產生F(ab，)2片段之程序。該等片段在二硫醇錯合 劑亞砷酸鈉存在下還原以使鄰近二硫醇穩定且防止分子間 二硫化物形成。接著使所產生之Fab，片段轉化為硫硝基苯 甲酸（TNB)衍生物。接著衍生物中之一者藉由 用疏基乙胺還原再轉化為Fab，_硫醇且與等莫耳量之另一種 Fab’-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特 異性抗體可用作使酶選擇性固定的藥劑。 近期之進展促進自大腸桿菌中直接回收Fab,_SH片段， 將其化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J. Exp. Med·，175: 217-225 (1992)描述充分人源化之雙特異性抗體 F(aV)2分子之製備。各Fab，片段單獨自大腸桿菌分泌且在 活體外經受直接化學偶合以形成雙特異性抗體。由此所形 成之雙特異性抗體能夠結合過度表現HER2受體的細胞及 正常人類T細胞，且引發人類細胞毒性淋巴細胞針對人類 乳房腫瘤標靶的溶解活性。 亦已描述由重組細胞培養物直接製備及分離雙特異性抗 體片段的各種技術。舉例而言，雙特異性抗體已使用白胺 酉夂拉鍵製備。Kostelny等人，/· /所所以仙/.，148(5):1547- 15 53 (1992)。將來自F〇s及jun蛋白之白胺酸拉鏈肽藉由基 因融合與兩種不同抗體的Fab，部分連接。使抗體同二聚體 在鉸鏈區還原以形成單體且接著再氧化以形成抗體雜二聚 體。此方法亦可用於製備抗體同二聚體。Hollinger等人， Proe· 90:6444-6448 (1993)所述的"雙 121444.doc -89- 200815467 功能抗體π技術為製備雙特異性抗體片段提供一種替代機 制。5亥專片段包含經由連接子與輕鏈可變域（vl)連接的重 鏈可變域（VH)，該連接子太短以致不容許同一鏈上的兩個 域之間配對。因此，迫使一片段之VH域及VL域與另一片 段之互補VL域及VH域配對，從而形成兩個抗原結合位 點。藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製備雙特異性抗體片段的 另一種策略亦已報導。參見Gruber等人，j 152: 5368 (1994) 〇 _ 本發明涵蓋具有兩價以上的抗體。舉例而言，可製備三 特異性抗體。Tutt等人J. /所_加/ 147: 60 (1991) 〇 多價抗體 多價抗體可比二價抗體更快地由表現該等抗體所結合之 抗原之細胞内在化（及/或分解代謝）。本發明之抗體可為具 有二個或二個以上抗原結合位點（例如，四價抗體）的多價 抗體（除IgM類之外），其可易於藉由重組表現編碼抗體之 φ 多肽鏈的核酸製備。多價抗體可包含二聚化域及三個或三 個以上的抗原結合位點。較佳二聚化域包含Fe區或鉸鏈區 (或由Fc區或鉸鏈區組成）。在此情況下，抗體包含Fc區及 二個或二個以上位於^區之胺基末端的抗原結合位點。本 文中之較佳多價抗體包含三個至約八個、但較佳四個抗原 結合位點（或由三個至約八個、但較佳四個抗原結合位點 組成）。多價抗體包含至少一條多肽鏈（且較佳包含兩條多 狀鍵）’其中多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而 s，多肽鏈可包含 VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1 為 121444.doc -90- 200815467 第可k域，VD2為第二可變域，〜為Fc區的一條多狀 鏈，XI及X2表示胺基酸或多肽，且_ w。舉例而言， 夕肽鏈可包合· VH-CH1_撓性連接子-vh_chi如區鍵；或 VH-CHl-VH.CHl-Fe區鏈。本文中之多價抗體較佳進一步 包合至少兩個（且較佳四個）輕鏈可變域多肽。本文中之多 知抗體例如可包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文 所/函盍之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視需要進一步 包含CL域。 ®抗體變異體 在一些實施例中，涵蓋本文中所述抗體之胺基酸序列修 飾舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其 他生物性質。抗體之胺基酸序列變異體係藉由將適當核苷 酸變化引入抗體核酸中或藉由肽合成法來製備。該等修飾 例如包括在抗體之胺基酸序列内缺失及/或插入及/或取代 殘基。為獲得最終構築體，可進行缺失、插入及取代之任 φ 何組合’其限制條件為最終構築體具有所要特徵。胺基酸 改造可在序列形成時引入主題抗體胺基酸序列中。 適用於4監別抗體中為較佳誘變位置之某些殘基或區的方 法稱作丙胺酸掃描誘變n，如Cunningham及Wells (1989) 244:1081-1085所述。本文中，鑑別殘基或目標殘 基之基團（例如’帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu) 且使其經中性或帶負電之胺基酸（最佳丙胺酸或聚丙胺酸） 置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位 點處或適於取代之位點處引入另外或其他變異體，改進證 121444.doc -91- 200815467 明在功能上對取代敏感的彼等胺基酸位置。因此，儘管預 先確定用於引入胺基酸序列變異之位點，但突變性質本身 無需預先確定。舉例而言，為分析突變在給定位點處之效 能，可在目標密碼子或目標區進行ala掃描或隨機誘變，且 針對所要活性篩檢所表現之免疫球蛋白。 胺基酸序列插入包括長度範圍為一個殘基至含有一百個 或一百個以上殘基之多肽的胺基末端融合及/或羧基末端 融合，以及單或多胺基酸殘基的序列内插入。末端插入之 實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗體或與細胞毒性 多肽融合之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括抗體 之N-末端或C-末端與增加抗體血请半衰期之酶（例如， ADEPT)或多肽的融合體。 糖基化多肽通常為N-連接或〇-連接的。N-連接係指碳水 化合物部分與天冬醯胺酸殘基之側鏈之連接。三肽序列天 冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸_χ_蘇胺酸（其中X為除脯 胺酸外的任何胺基酸）為使碳水化合物部分與天冬醯胺酸 側鏈酶促連接的識別序列。因此，多肽中存在該等三肽序 列中之任一者均產生潛在的糖基化位點。連接糖基化係 才日糖Ν-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一與經基胺基酸 (彔通常為絲胺酸或蘇胺酸）之連接，儘管亦可使用5 _經基 脯胺酸或5-經基離胺酸。 向抗體添加糖基化位點可方便地藉由改造胺基酸序列以 使得其含有上述三肽序列中之一或多者來實現（對於义連 接糖基化位點）。亦可藉由使一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘 121444.doc -92- 200815467 基添加至或取代原始抗體之序列進行改造（對於〇-連接糖 基化位點）。 若抗體包含Fc區，則可改造與其連接之碳水化合物。舉 例而言，具有缺少與抗體Fc區連接之海藻糖之成熟碳水化 合物結構的抗體描述於美國專利申請案US 2003/0157108(Presta，L·)中。亦參見 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co·，Ltd) 〇在與抗體Fc區連接之碳水 化合物中具有對分N-乙醯葡糖胺（GlcNAc)之抗體係在WO 2003/011 878(Jean-Mairet 等人）及美國專利第 6,602,684 號 (Umana等人）中提及。在與抗體Fc區連接之寡醣中具有至 少一個半乳糖殘基的抗體報導於WO 1997/30087(Patel等 人）中。關於具有與抗體Fc區連接之經改造之碳水化合物 的抗體，亦參見 WO 1998/58964(Raju，S.)及 WO 1999/ 22764(Raju，S·)。關於糖基化經修飾之抗原結合分子，亦 參見 US 2005/0123546(Umana等人）。 本文中之較佳糖基化變異體包含Fc區，其中與Fc區連接 之碳水化合物結構無海藻糠。該等變異體具有經改良之 ADCC功能。視需要，Fc區中進一步包含一或多個可進一 步改良ADCC的胺基酸取代，例如Fc區中位置298、333及/ 或334處之取代（殘基之Eu編號）。與"去海藻糖化 (defucosylated)"*”缺乏海藻糖”抗體有關之公開案的實例 包括：US 2003/0157108 ; WO 2000/61739 ; WO 2001/ 29246 ； US 2003/0115614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/ 0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/ 121444.doc -93- 200815467 0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085119 ； WO 2003/ 084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO 2005/053742 ; Okazaki等人，《/· Mo/· Biol· 336:1239-1249 (2004) ; Yamane-Ohnuki 等人，87:614 (2004)。產生去海藻糖化抗體之細胞株之實例包括蛋白質 海藻糖基化缺陷型Lecl3 CHO細胞（Ripka等人， 249:533-545 (1986);美國專利申請案第 US 2003/0157108 Α1 號，Presta，L ;及 WO 2004/056312 Al，Adams等人，尤其實例11)，及基因敲除細胞株，諸如 α-1，6-海藻糖基轉移酶基因FUT8經敲除之CHO細胞 (Yamane-Ohnuki等人，召zoied 87:614 (2004))。 另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。該等變異體在 抗體分子中具有至少一個經不同殘基置換之胺基酸殘基。 用於取代誘變的最關注之位點包括高變區，但亦涵蓋FR改 造。保守取代以標題"較佳取代"展示於表1中。若該等取 代導致生物活性改變，則可引入更多實質性改變（表1中命 名為’’例示性取代"，或下文參考胺基酸類別進一步描述）， 且篩檢產物。 表1 原始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala (A) Val ; Leu ; lie Val Arg(R) Lys ； Gin ； Asn Lys Asn(N) Gin ； His ； Asp, Lys ； Arg Gin Asp (D) Glu ； Asn Glu Cys (C) Ser ； Ala Ser Gln(Q) Asn ； Glu Asn Glu(E) Asp ； Gin Asp 121444.doc -94- 200815467

Gly (G) Ala Ala His (Η) Asn ； Gin ； Lys ； Arg Arg lie φ Leu ； Val ； Met ； Ala ； Phe ;正白胺酸 Leu Leu (L) 正白胺酸；lie ; Val ; Met ； Ala ； Phe He Lys(K) Arg ； Gin ； Asn Arg Met (M) Leu ； Phe ； lie Leu Phe (F) Trp ； Leu ； Val ； He ； Ala ； Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val ； Ser Ser Trp (W) Tyr ； Phe Tyr Tyr⑺ Trp ； Phe ； Thr ； Ser Phe Val (V) lie ; Leu ; Met ; Phe ; 1 Ala ;正白胺酸 Leu

對抗體之生物性質之實質性修飾可如下實現：選擇對維 持（a)取代區域内多肽主鏈之結構，例如，折疊片或螺旋狀 構型，（b)分子在目標位點處之電荷或疏水性，或（c)側鏈 之體積在其效應上顯著不同的取代。天然產生之殘基可基 於共同側鏈性質分成如下群組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、 lie ; 鲁 （2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 驗性：His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈取向的殘基：Gly、Pro ;及 (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe 〇 非保守性取代需要將該等類別中之一類的成員與另一類 的成員交換。 一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體（例如，人源 121444.doc -95- 200815467 化抗體或人類抗體）中之一或多個高變區殘基。通常，選 擇用於進一步開發之所得變異體相對於產生其之親本抗= 具有經改良之生物性質。產生該等取代變異體的適當方法 包括利用噬菌體呈現法之親和力成熟。簡言之，使若干高 變區位點（例如，6-7個位點）突變以在各位點產生所有可能 的胺基酸取代。由此所產生之抗體作為與包裝於各粒子内 部之M13之基因ΠΙ產物之融合體由絲狀噬菌體粒子呈現。 接著如本文中所揭示，就其生物活性（例如結合親和力）篩 檢噬菌體呈現之變異體。為鑑別用於修飾之候選高變區位 點，可執行丙胺酸掃描誘變以鑑別顯著有助於抗原結合的 高變區殘基。或者或此外，分析抗原-抗體複合物之晶體 結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點可為有利的。根據本 文中詳述之技術，該等接觸殘基及相鄰殘基為取代之候選 殘基。一旦產生該等變異體，則使一組變異體如本文中所 述經受篩檢，且在一或多種相關檢定中選擇具有優良特性 之抗體用於進一步開發。 編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子係由此項技術 中已知的多種方法製備。該等方法包括（但不限於）：自天 然來源中分離（在天然產生之胺基酸序列變異體之情況下） 或藉由寡核苷酸介導（或定點）誘變、PCR誘變及序列盒誘 變抗體之早期製備變異體或非變異體型式來製備。 可能需要將一或多個胺基酸修飾引入本發明之免疫球蛋 白多肽之Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包 含在一或多個胺基酸位置處（包括鉸鏈半胱胺酸之位置）包 121444.doc -96- 200815467 含胺基酸修飾（例如取代）的人類Fc區序列（例如，人類 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc區）。 根據此說明及此項技術之教示，在一些實施例中涵蓋本 發明之方法中所用之抗體與野生型對應抗體相比例如可在 Fc區中包含一或多處改造。但該等抗體與野生型對應物相 比大體上仍保持治療效用所需之相同特徵。舉例而言，吾 人認為，某些改造可在Fc區中進行，從而產生改變（亦 即，提高或減弱）之Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如，如W099/51642中所述。關於Fc區變異體之 其他實例，亦請參見 Duncan及 Winter Nature 322:738-40 (1988);美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821 號；及 W094/29351。WO00/42072(Presta)及 W02004/ 05 63 12(Lowman)描述與FcR之結合提高或減弱之抗體變異 體。該等專利公開案之内容特別以引用之方式併入本文 中。亦請參見Shields等人，1/.价〇/.07/^所.9 (2):6591-6604 (2001)。US2005/0014934A1 (Hinton等人）中描述半衰 期增加且與新生兒Fc受體（FcRn)之結合提高的抗體，該 FcRn負責將母親之IgG傳遞至胎兒（Guyer等人，J.

Immunol. 117:587 (1976)及 Kim等人，J. Immunol. 24:249 (1994))。該等抗體包含其中具有一或多個取代的Fc區，該 等取代提高Fc區與FcRn之結合。具有經改造之Fc區胺基酸 序列及增加或降低之Clq結合能力的多肽變異體描述於美 國專利第6，194,551B1號、W099/51642中。彼等專利公開 案之内容特別以引用之方式併入本文中。亦參見Idusogie 121444.doc -97- 200815467 等人，乂 164: 4178-4184 (2000) 〇 抗體衍生物 可進一步修飾本發明之抗體以含有此項技術已知且易於 獲知的其他非蛋白質部分。適於抗體衍生化之部分較佳為 水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制實例包括（但不限 於）：聚乙二醇（PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖 維素、葡聚糖、聚乙稀醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-I、二氧 ^ 戊裱、聚-1，3,6_三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺 基酸（均聚物或無規共聚物）及葡聚糖或聚（正乙烯基σ比咯啶 酮）聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共 聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如，甘油）、聚乙烯醇及其混 合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而具有製造中 之優勢。$合物彳具有任何分子量，1可為分枝或未分枝 聚合物。與抗體連接之聚合物的數量可改變，且若連接一 種以上的聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言， • 用於何生化之聚合物的數量及/或類型可基於以下考慮因 素確定：包括(但不限於），欲改良之抗體之特定性質或功 能；抗體衍生物是否用於限定條件下之療法等。 筛檢具有所要性質之抗艘 本發明之抗體可由此項技術中已知之各種檢定法表徵其 μ/μμ及生物功能。在一些實施例中，對抗體之 以下任-或多個方面加以表徵：與dll4結合；及/或減弱 或阻斷N〇tCh受體活化；及/或減弱或阻斷Notch受體下游分 子信號轉導；及/或破壞或阻斷N〇teh受體舆說4之結合； 121444.doc -98- 200815467 及/或促進内皮細胞增殖；及/或抑制内皮細胞分化；及/或 抑制動脈分化；及/或抑制腫瘤血管灌注；及/或治療及/或 預防腫瘤、細胞增殖性病症或癌症；及/或治療或預防與 DLL4表現及/或活性相關之病症；及/或治療或預防與 Notch受體表現及/或活性相關之病症。 經純化之抗體可由一系列檢定進一步表徵，該等檢定包 括（但不限於）：N-末端測序、胺基酸分析、非變性尺寸排 除高壓液相層析（HPLC)、質譜法、離子交換層析及木瓜蛋 白酶消化。 在本發明之某些實施例中，分析本文中所製備之抗體之 生物活[生在一些實施例中，測試本發明之抗體之抗原結 合活性。此項技術中已知且本文中可使用的抗原結合檢定 包括（但不限於）使用諸如以下技術之任何直接或競爭結合 檢定··西方墨點法（western M〇t)、放射免疫檢定、 ELISA(酶聯免疫吸附檢定）、，，夾心”免疫檢定、免疫沈澱 檢定、螢光免疫檢定及蛋白A免疫檢定。說明性抗原結合 檢定提供於下文之實例部分中。 在又一實施例中，本發明提供與266、26.14、26 2〇、 26.34及/或26.82抗體競爭結合DLL4的抗舰L4單株抗體。 該等競爭抗體包括識別與由抗體26·6、26.14、26 2〇、 26.34及/或26.82所識別之DLL4抗原決定基相同或重疊之 DLL4抗原決定基的抗體。該等競爭抗體可藉由篩檢與經 ^,己之26.6 26.14、26.20、26.34及/或 26.82抗體競爭結 合固定之DLL4的抗-DLL4雜交瘤上清液來獲得。與在含有 121444.doc -99- 200815467 無關（或無）抗體之對照結合混合物中所偵測到之結合標記 抗體之量相比，含有競爭抗體之雜交瘤上清液使在該競爭 結合混合物中所偵測到之結合標記抗體之量降低。本文中 所述之任何競爭結合檢定適用於上述程序。 在另一態樣中，本發明提供包含一或多（諸如2、3、4、 5 及/或 6)個 26.6、26.14、26.20、26.34及 / 或 26.82 抗體 HVR 的抗-DLL4單株抗體。包含一或多個26.6、26.14、26.20、 26.34及/或26·82抗體HVR的抗-DLL4單株抗體可如下建 構：將一或多個 26.6、26.14、26.20、26.34及 /或 26.82抗 體HVR接枝於模板抗體序列（例如與親本抗體之對應鼠序 列最接近的人類抗體序列，或親本抗體輕鏈或重鏈之特定 子群中所有人類抗體的一致序列）上，以及如本文中所述 在重組宿主細胞中表現具有或不具有隨附恆定區序列之所 得嵌合輕鏈及/或重鏈可變區序列。 具有本文中所述之獨特性質之本發明之抗-DLL4抗體可 藉由以任何適當方法針對所要特性篩檢抗-DLL4雜交瘤純 系來獲得。舉例而言，若需要阻斷或不阻斷Notch與DLL4 之結合的抗-DLL4單株抗體，則候選抗體可以諸如競爭結 合ELIS A之結合競爭檢定測試，其中板孔塗有DLL4，且使 抗體於所關注之過量Notch受體中之溶液層鋪於所塗孔板 上，且以酶偵測所結合之抗體，例如，使結合抗體與HRP 接合抗-Ig抗體或生物素化抗-Ig抗體接觸且使HRP顏色反 應顯色，例如，藉由用抗生蛋白鏈菌素-HRP及/或過氧化 氫使板顯色，且用ELISA板讀取器在490 nm下藉由分光光 121444.doc -100- 200815467 度法偵測HRP顏色反應。 在一實施例中，本發明涵蓋具有一些但非全部效應功能 之經改造之抗體，使得其成為多種應用（其中活體内抗體 半衰期為重要的，但某些效應功能（諸如補體及ADCC)為 不必要的或有害的）之所要候選抗體。在某些實施例中， 所產生之免疫球蛋白之Fc活性係經量測以確保僅維持所要 性質。可執行活體外及/或活體内細胞毒性檢定以確認 CDC及/或ADCC活性之降低/缺失。舉例而言，可執行Fc受 m W 體（FcR)結合檢定，以確保抗體缺乏FcyR結合能力（從而可 能缺乏ADCC活性），但保持FcRn結合能力。介導ADCC之 初級細胞NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、 FcyRII及FcyRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及 Kinet，/ ㈣ w. /mm ㈣ 〇/ 9:457-92 (1991)之第 464 頁上之 表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外檢定之實例 描述於美國專利第5,500,362號或第5,821，337號中。適用於 該等檢定的效應細胞包括周圍血液單核細胞（PBMC)及自 然殺手（NK)細胞。或者或此外，所關注分子之ADCC活性 例如可在動物模型（諸如Clynes等人，Proc. Natl· Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示之彼動物模型）中活體 内評估。亦可進行Clq結合檢定以確認抗體不能結合Clq 且從而缺乏CDC活性。為評估補體活化，可執行例如如 Gazzano-Santoro 等人，J· Mei/zo心 202:163 (1996)中所述之CDC檢定。亦可使用此項技術中已知之方 法，例如實例部分所述的彼等方法，執行FcRn結合測定及 121444.doc -101 - 200815467 活體内清除/半衰期測定。 載體、宿主細胞及重組方法

為重組製備本發明之抗體，可將編碼其之核酸分離且插 入可複製載體中以便進—步選殖（擴增而人）或表現。編碼 該抗體的DNA易於使用習知程序（例如，使用能夠特異性 結合編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因的募核苷酸探針）分 離及測序。有多種載體可供利用。載體之選擇部分視欲使 帛之宿主細胞而定。通常，較佳宿主細胞係為原核生物或 真核生物（通常哺乳動物）來源之細胞。應瞭解，任何同型 之恆定區（包括IgG恆定區、IgM恆定區、IgA恆定區、IgD 恆定區及IgE恆定區）可用於此目的，且該等恆定區可獲自 任何人類或動物物種。 a ·使用原核宿主細胞產生抗體： i·載體建構 編碼本發明抗體之多肽組分的聚核苷酸序列可使用標準 φ 重組技術獲得。所要聚核苷酸序列可自產生抗體之細胞 (諸如雜交瘤細胞）分離且測序。或者，聚核苷酸可使用核 苷酸合成儀或PCR技術合成。獲得後，將編碼多肽之序列 插入能夠在原核宿主中複製且表現異源聚核苷酸的重組載 體中。可供利用且此項技術中已知之多種載體可用於本發 明之目的。適當載體之選擇主要視欲插入載體中之核酸之 大小及欲用該載體轉化之特定宿主細胞而定。·各載體含有 多種組分，此視其功能（擴增或表現異源聚核苷酸，或擴 增且表現異源聚核苷酸）及其與其所存在之特定宿主細胞 121444.doc -102· 200815467 之相容性而定。載體組分通常包括（但不限於）··複製起 點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點（RBS)、信 號序列、異源核酸插入及轉錄終止序列。 一般而言，配合該等宿主使用含有源自與宿主細胞相容 之物種之複製子及控制序列的質體載體。載體通常攜有複 製位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標記序 列。舉例而言，大腸桿菌通常使用pBR322(源自大腸桿菌 物種之質體）轉化。PBR322含有編碼安比西林（ampieillin ; Amp)及四環素（tetracycline ; Tet)耐藥性的基因，且因此提 供用於鑑別轉化細胞的易用方式。pBR322、其衍生物或 其他微生物質體或嗤菌體亦可含有或經修飾以含有可由微 生物有機體用於表巧内源性蛋白質的啟動子。用於表現特 定抗體之PBR322衍生物之實例詳述於Carter等人之美國專 利第5,648,237號中。 此外，可配合該等宿主使用含有與宿主微生物相容之複 製子及控制序列的噬菌體載體作為轉化載體。舉例而言， 在製備可用於轉化諸如大腸桿菌LE392之易感性宿主細胞 的重組載體中可利用諸如IGEM'll之噬菌體。 本發明之表現載體可包含兩個或兩個以上編碼各多肽組 分的啟動子-順反子對。啟動子為位於調節其表現之順反 子上游（5’）的非轉譯調控序列。原核生物啟動子通常分成 兩類：誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其控制下回應 土口養條件變化（例如，存在或不存在營養物或溫度變化）啟 始增加之順反子轉錄量的啟動子。 121444.doc 200815467 已熟知大量由多種潛在宿主細胞識別之啟動子。所選啟 動子可藉由經由限制酶消化將啟動子自來源DNA中移除且 將所分離之啟動子序列插入本發明載體中來操作性連接至 編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。天然啟動子序列與多種異 源啟動子均可用於直接擴增及/或表現目標基因。在一些 實施例中，可利用異源啟動子，因為與天然目標多肽啟動 才比其通$谷許所表現之目標基因之較高轉錄及較高 產量。 °

適用於原核宿主之啟動子包括PhoA啟動子、卜半乳糖酶 及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子 (諸如tae或tre啟動子）。然而，可在細菌中起作用的其他啟 動子（諸如其他已知細菌啟動子或噬菌體啟動子）亦適用。 其核苷酸序列已公開’由此能夠讓熟習工作者使用連接子 或轉接子（adapter)將其操作性連接至編碼目標輕鏈及重鍵 的順反子（si—等人（義）Cell 2〇:269)上以提供任何 所需限制性位點。 在本發明之-態樣中’重組载體内之各順反子包含引導 所表現之多肽遷移跨越膜的分泌信號序列組分…般而 言’信號序列可為载體之組分，或其可為插人載體中:目 標多肽DNA的-部分。選擇用於本發明目的之信號序_ 為可由宿主細胞識別及加卫（亦即由信號肽酶裂解）的传穿 序列。若原核宿主細胞不識別及處理異源多狀之天缺= 序列，則使該信號序列經選自例如由以下各物組成：群； 原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、ipp或熱穩 121444.doc -104- 200815467 定腸毒素 II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA 及MBP。在本發明之一實施例中，在表現系統之兩個順反 子中使用的信號序列均為STII信號序列或其變異體。 在另一態樣中，本發明之免疫球蛋白之產生可在宿主細 胞之細胞質中發生，且因此不需要在各順反子内存在分泌 信號序列。因此，免疫球蛋白輕鏈及重鏈經表現、折疊且 組裝以在細胞質内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株 (例如大腸桿菌trxB-菌株）提供有利於二硫鍵形成的細胞質 環境，從而容許所表現之蛋白質亞單位之適當折疊及組 裝。Proba及 Pluckthun Ge⑽，159:203 (1995)。 適於表現本發明抗體之原核宿主細胞包括古細菌 (Archaebacteria)及真細菌（Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性 (Gram-negative)或革蘭氏陽性（Gram-positive)有機體。適 用細菌之實例包括埃希氏桿菌（Escherichia)(例如大腸桿 菌）、桿菌（Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌（凡、腸細 菌（Enterobacteria)、假單胞菌（Pseudomonas)物種（例如銅 綠假單胞菌（A aerwghwa))、鼠傷寒沙門氏桿菌 (Salmonella typhimurium)、黏質沙雷菌（Serratia marcescans)、克雷伯氏菌（Klebsiella)、變形桿菌 (Proteus)、志贺桿菌（Shigella)、根瘤菌（Rhizobia)、透明 顫菌（Vitreoscilla)或副球菌（Paracoccus)。在一實施例中， 使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例中，使用大腸桿菌細胞 作為本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株 W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第 2卷 121444.doc -105- 200815467 (Washington, D.C.： American Society for Microbiology, 1987)，第1190-1219頁；ATCC寄存號第27,325號）及其衍 生物’包括具有基因型 W3 110 AfhuA (Δΐ:οηΑ) ptr3 lac Iq lacL8 ΔοηιρΤΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR之菌株 33D3(美國 專利第5,639,635號）。其他菌株及其衍生物（諸如大腸桿菌 294(ATCC 31，446)、大腸桿菌 B、大腸桿菌 λ1776(ΑΤ0Χ 31，53 7)及大腸桿菌1^308(八丁(^31，608))亦為適用的。該 等實例為說明性的而非限制性的。具有確定基因型之上述 任何細菌之衍生物的建構方法為此項技術中所已知且描述 於例如，Bass等人，户⑺如·似，8:309-314 (1990)中。通常需 要考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適當的細 菌。舉例而言，當使用諸如pBR322、pBR325、pACYCl77 或pKN410之熟知質體提供複製子時，可適當地使用大腸 桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌物種作為宿主。宿主細胞通常 應分泌最低量之蛋白水解酶，且可能需要在細胞培養物中 併入其他蛋白酶抑制劑。 Π.抗體製備 將宿主細胞用上述表現載體轉化，且培養於適當時經改 良以誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要序列之基因 的習知營養培養基中。 轉化意謂將DNA引入原核宿主中以便]〇：^八可作為染色體 外成分或染色體之部分複製。視所用宿主細胞而定，轉化 係使用適於該等細胞之標準技術來執行。使用氯化鈣之鈣 處理通常用於含有實質性細胞壁障壁的細菌細胞。另一種 121444.doc • 106 - 200815467 轉化方法使用聚乙二醇/DMSO。又一種所用技術為電穿孔 法。 用於產生本發明之多肽的原核細胞係培養於此項技術已 知且適於培養所選擇之宿主細胞的培養基中。適當培養基 之只例包括盧氏肉湯（luria br〇th)(LB)加上必需的營養補充 物在一些實施例中，培養基亦含有基於建構表現載體所 選之選擇劑，以選擇性地容許含有表現載體之原核細胞生 長。舉例而言，將安比西林添加至培養基中以使表現安比 西林耐藥性基因之細胞生長。 除碳、氮及無機磷酸鹽源外，亦可包括以適當濃度單獨 引入或作為與其他補充物或培養基（諸如複合氮源）之混合 物引入的任何必要補充物。培養基視需要可含有一或多種 選自由麵胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、硫乙醇酸鹽、二硫赤 藻糖醇及二硫蘇糖醇組成之群的還原劑。 原核宿主細胞係在適當溫度下培養。舉例而言，對於大 腸桿菌培養，較佳溫度的範圍為約2〇〇C至約39〇c、更佳約 25C至約37°C、甚至更佳為約3(TC。培養基之pH值可為約 5至約9範圍内的任何pH值，此主要視宿主有機體而定。對 於大腸桿菌，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7 〇。 若在本發明之表現載體中使用可誘導啟動子，則蛋白質 表現係在適於活化該啟動子的條件下誘導。在本發明之一 恶樣中，使用Pho A啟動子控制多肽之轉錄。因此，將所轉 化之宿主細胞培養於磷酸鹽限制培養基中以便誘導。磷酸 鹽限制培養基較佳為C.R.A.P培養基（參見，例如， 121444.doc •107- 200815467

Simmons 專人，义 (2〇〇2)，263:133- 147)。如此項技術中所已知，可根據所使用之载體構築 體，使用多種其他誘導物。 在一實施例中，所表現之本發明多肽分泌進入宿主細胞 之周質内且自其回收。蛋白質回收通常包括通常藉由諸如 滲透壓衝擊、超音波處理或溶解之方式破壞微生物。細胞 一旦破壞，則可藉由離心或過濾移除細胞碎片或完整細 胞。蛋白質可例如藉由親和樹脂層析法進一步純化。或 者，蛋白質可轉運至培養基中且於其中分離。細胞可自培 養基中移除且培養基上清液可經過濾且濃縮以便進一步純 化所產生之蛋白質。所表現之多肽可使用通常已知之方法 (諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE)及西方墨點檢定法）進一 步分離及鑑別。 在本發明之一態樣中，抗體製備係藉由醱酵方法大量進 行。各種大規模分批饋入醱酵程序可用於製備重組蛋白 質。大規模醱酵具有至少1000公升之容量、較佳約 至100,000公升之容量。該等醱酵器使用攪拌器葉輪分配 氧及營養物，尤其葡萄糖（較佳之碳/能量來源）。小規模醱 酵通常係指體積容量不超過約1〇〇公升且可在約升至約 100公升範圍内之醱酵器中的醱酵。 在一醱酵方法中，通常使細胞在適當條件下生長至所要 密度（例如約180-220之OD550)之後開始誘導蛋白質表現， 在該階段，細胞處於早期靜止期。如此項技術中已知及以 上所述可根據所使用之載體構築體使用多種誘導物。誘 121444.doc •108- 200815467 導前可使細胞生長較短時期^儘管可使用較長或較短之誘 導時間，但細胞通常誘導約12_5〇個小時。 為提高本發明之多肽之生產產量及品質，可改變各種醱 酵條件。舉例而言，為改良所分泌之抗體多肽之正確組裝 及折疊，可使用過度表現伴隨蛋白（諸如Dsb蛋白（DsbA、

DsbB ' DsbC ' DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨蛋白活 性的肽基脯胺醯基順反-異構酶）的其他載體共同轉化宿主 原核細胞。已證明伴隨蛋白有利於細菌宿主細胞中所產生 之異源蛋白質之正確折疊及溶解性。Chen等人（1999) y 扪〇 274··19601_19605 ·，Ge〇rgi〇u等人，美國專利第 6,〇83,715 號；Georgicm等人，美國專利第 6,〇27,888 號； Bothmann and Pluckthun (2000) /. Biol Chem. 275:17100-17105 ； Ramm and Pluckthun (2000) J. BioL Chem, 275:17106-17113 ; Arie等人（2001) Mo/· Mz·㈣6紿/· 39:199-210 〇 為使所表現之異源蛋白質（尤其對蛋白質水解敏感的彼 等蛋白質）之蛋白水解作用最小，本發明可使用某些缺乏 蛋白水解酶的宿主菌株。舉例而言，宿主細胞菌株經修飾 以實現在編碼已知細菌蛋白酶（諸如蛋白酶ΙΠ、〇mpT、

DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶v、蛋白酶vi及 其組合）之基因中的基因突變。一些缺乏大腸桿菌蛋白酶 之菌株可獲得且描述於例如，j〇ly等人（1998)，同上； Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Georgi〇u等人， 美國專利第5,5〇8，192號；Hara等人，z>r叹 121444.doc -109- 200815467 2:63-72 (1996)中。 在一實施例中，使用缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或 多種伴隨蛋白之質體轉化的大腸桿菌菌株作為本發明之表 現系統中之宿主細胞。 iii.抗體純化 可使用此項技術中已知的標準蛋白質純化方法。以下程 序為適當純化程序之例示性程序：免疫親和柱或離子交換 柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子 交換樹脂（諸如DEAE)層析、層析聚焦、SDS_pAGE、硫酸 銨沈澱及使用例如Sephadex G_75之凝膠過濾。 在-態樣中，使用固定於固相上之蛋白A免疫親和純化 本發明之全長抗體產物。蛋白A為獲自金黃色葡萄球菌 (义叩办/〇⑶匀的41kD細胞壁蛋白質，其可以高 親和力與抗體之pc區結合。Lindmark等人（I%)) j /所卿如Λ 62:1_13。蛋白A固定於其上之固相較佳為 包含玻璃或二氧化矽表面之柱，更佳為可控多孔破璃柱或 矽酸柱。在一些應用中，該柱已塗有諸如甘油之試劑，以 求防止污染物之非特異性黏著。 作為純化之第一步，可將如上所述獲自細胞培養物之製 劑塗施於固定蛋白A之@相上以容許所關注之抗體與蛋白 A特異性結合。接著洗滌固相以移除與固相非特異性結合 的污木物。最後，藉由溶離自固相中回收所關注之抗體。 b•使用真核宿主細胞產生抗體： 載體組分通常包括（但不限於）以下各物中之一或多者： 121444.doc -110- 200815467 k號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、 啟動子及轉錄終止序列。 ⑴信號序列組分 用於真核宿主細胞中的載體亦可含有信號序列或其他在 所關注之成熟蛋白質或多肽•末端具有特異性裂解位點 的多狀。所選異源信號序列較佳為由宿主細胞識別及加工 (亦即，由信號肽酶裂解）的序列。在哺乳動物細胞表現 時，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例 • 如，單純疮療gD信號。 該前導區之DNA與編碼抗體之DNA連接於同一閱讀框架 内0 (ii) 複製起點 哺乳動物表現載體通常不需要複製組分起點。舉例而 言，通常使用SV40起點，僅因為其含有早期啟動子。 (iii) 選擇基因組分 φ 表現載體及選殖載體可含有亦稱為可選擇標記的選擇基 因典型的選擇基因編碼（a)賦予針對抗生素或其他毒素 (例如’安比西林、新黴素（ne〇myein)、甲胺嗓呤或四環 素）之财藥性；（b)補充營養缺陷型缺陷（若相關）；或（c)供 應複合培養基無法提供之關鍵營養物的蛋白質。 選擇流程之一實例利用藥物阻滯宿主細胞之生長。經異 源基因成功轉化的彼等細胞產生賦予耐藥性的蛋白質且因 此倖存於選擇方案。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素、 黴紛酸及潮黴素（hygromycin)。 121444.doc •111- 200815467 適用於哺乳動物細胞之可選擇標記之另一實例為使得能 夠鑑別有能力容納抗體核酸之細胞的彼等標記，諸如 DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-Π(較佳為 靈長類動物金屬硫蛋白基因）、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧 酶等。 舉例而言，藉由將所有轉化體培養於含有甲胺喋呤 (Mtx)(—種DHFR之競爭性拮抗劑）的培養基中首先鑑別經 DHFR選擇基因轉化之細胞。當使用野生型DHFR時，適當 ® 的宿主細胞為缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢（CHO)細胞 株（例如，ATCC CRL-9096)。 或者，可藉由使細胞生長於含有用於可選擇標記之選擇 劑（諸如胺基糖苷抗生素，例如，卡那黴素（kanamycin)、 新黴素或G418)的培養基中來選擇經編碼抗體、野生型 DHFR蛋白及另一種可選擇標記（諸如胺基糖苷3，-磷酸轉移 酶（ΑΡΗ))之DNA序列轉化或共同轉化的宿主細胞（尤其含 有内源DHFR的野生型宿主）。參見美國專利第4,965，199 修 號。 (iv)啟動子组分 表現載體及選殖載體通常含有由宿主有機體識別且與抗 體多肽核酸操作性連接的啟動子。用於真核細胞的啟動子 序列為已知的。幾乎所有真核基因具有位於轉錄啟始之位 點上游約25至30個鹼基處的AT富集區。另一存在於距多種 基因之轉錄起點上游70至80個鹼基處的序列為CNCAAT 區，其中N可為任何核苷酸（SEQ ID NO:60)。在大部分真 121444.doc -112- 200815467 核基因之3末端處為A ATAAA序列，該序列可為將多聚腺 苦酸尾巴添加至編碼序列之3,末端之信號（seq m NO:61)。所有該等序列可適當地插入真核表現載體中。 抗體多肽在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄可由例如獲 自病毒（諸如多形瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒（諸如腺病毒 2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄 病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒4〇(Sv4〇))基因組之啟動 子、異源哺乳動物之啟動子（例如肌動蛋白啟動子或免疫 球蛋白啟動子）、熱休克啟動子控制，其限制條件為該等 啟動子與宿主細胞系統相容。 SV40病毒之早期啟動子及晚期啟動子方便以一個亦含 有SV40病毒複製起點的8又4〇限制片斷獲得。人類巨細胞 病母之極早期（imme(Jiate “^丫）啟動子可方便地以 E限制片斷獲得。使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體在哺乳動 物佰主中表現DNA的系統揭示於美國專利第4，U9,446號 中。該系統之修飾描述於美國專利第4,6〇1，978號中。或 者可使用羅氏（ROUS)肉瘤病毒長末端重複片斷作為啟動 子。 (V)增強子元件組分 編碼本發明抗體多肽之DNA由較高級真核細胞的轉錄通 :藉由將-個增強子序列插入載體内來增強。ί見已知多種 曰強子序列來自哺乳動物基因（球蛋白、彈性蛋白酶、白 蛋白主蛋白及胰島素）。然而，典型使用來自真核細 胞病毋的増強子。實例包括複製起點近側（late side)的 121444.doc -113- 200815467 SV40增強子（bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強 子、複製起點近側的多形瘤增強子、及腺病毒增強子。關 於用於活化真核啟動子的增強元件，亦請參見Yaniv， Λ^ίι/re 297: 17-18 (1982)。增強子可接合於載體内抗體多 狀編碼序列之5f或31位置，但較佳位於啟動子之51位點。 (vi) 轉錄終止組分 用於真核宿主細胞中之表現載體通常亦含有終止轉錄及 穩定mRNA所需的序列。該等序列通常可獲自真核生物或 病毒DNAs或cDNAs之5’及偶爾3’的非轉譯區。該等區含有 核皆酸區段可轉錄為編碼抗體之mRNA之非轉譯部分中之 聚腺苷酸化片段。一種適用的轉錄終止組分為牛生長激素 聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載 (vii) 宿主細胞之選擇及轉化 本文中適用於選殖或表現載體之DNA的宿主細胞包括本 文中所述之較高級真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊 椎動物細胞在培養物（組織培養物）中之繁殖已成為常規程 序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉化之猴 腎CV1細胞株（COS-7，ATCC CRL 1651);人類胚腎細胞株 (293或293細胞，經次選殖生長於懸浮培養物中，Graham 等人，J. Ge" Firo/. 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞（BHK， ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub 等人，尸roc. iVai/· 乂cad· Sd· 77:4216 (1980));小鼠足 (sertoli)細胞（TM4，Mather，Βζ·〇/· 23:243-251 121444.doc -114- 200815467 (1980));猴腎細胞（CVl，ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細 胞（VERO-76，ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞 (HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類 肺細胞（W13 8，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人，Annals Ν·Υ· Acad· Sci· 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝瘤細胞株（Hep G2)。 將宿主細胞用上述表現載體或選殖載體轉化以用於抗體 製備且在適當時經改良以便誘導啟動子、選擇轉化體或擴 增編碼所要序列之基因的習知營養培養基中培養。 (viii)培養宿主細胞 用於產生本發明之抗體的宿主細胞可在多種培養基中培 養。諸如Ham’s FlO(Sigma)、最低必需培養基（MEM) (Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜氏改良依格培養基 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)(Sigma)之市 售培養基適於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Meth. Εηζ· 58:44 (1979) ; Barnes 等人，j似/· 102:255 (1980);美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 5，122,469 號；WO 90/03430 ; WO 87/00195或美國專利Re. 30,985中所述之任 何培養基可用作宿主細胞之培養基。必要時該等培養基中 之任一種中可補充激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、 121444.doc -115- 200815467 轉鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸如氯化納'約鹽、鎮鹽 及磷酸鹽）、緩衝液（諸如HEPES)、核苷酸（諸如腺苦及= 苷）、抗生素（諸如GENTAMYCINtm藥物）、痕量元素（定義 為通常以微莫耳範圍内之最終濃度存在之無機化合物）及 匍萄糖或等效能量來源。亦可包括為熟習此項技術者所已 知之適當濃度的任何其他必要補充物。培養條件（諸如溫 度、pH值及類似條件）為先前用於經選擇用於表現之宿主 細胞的彼等條件，且對普通熟習之技工顯而易見。 (ix)抗體純化 當使用重組技術時，抗體可在細胞内產生或直接分泌進 入培養基中。若抗體在細胞内產生，則作為第一步，將微 粒碎片（伯主細胞或溶解片段）例如藉由離心或超濾移除。 若抗體分泌進入培養基，則通常首先使用市售蛋白質濃縮 過濾器（例如Amicon或Millip0re peincon®超濾單元）濃縮 來自該等表現系統的上清液。以上任何步驟中可包括諸如 PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白質水解，且可包括抗生 素以防止外來污染物生長。

由細胞製備的抗體組合物可使用例如羥基磷灰石層析 法、凝膠電泳法、透析法及親和層析法純化，其中親和層 析法為較佳純化;技術。蛋白A作為親和配體的適用性視存 在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型而定。蛋 白A可用於純化基於人類γ1、72或^4重鏈的抗體 等人，/· Jmmwno/. Mei/z· 62··1-13 (1983))。對於所有小鼠 同型及人類γ3推薦使用蛋白g(Guss等人，ΕΜΒΟ J 121444.doc -116- 200815467 5:15671575 (1986))。親和配體所附著之基質最通常為瓊脂 糖，然而其他基質亦可用。機械性上穩定的基質，諸如可 控多孔玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基）苯，與瓊脂糖相比可使 流速更快及處理時間更短。若抗體包含CH3域，則 Bakerbond ABXTM樹脂（J. T· Baker，Phillipsburg，NJ)適用於 純化。視欲回收之抗體而定，亦可使用其他蛋白質純化技 術，諸如離子交換柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、 二氧化矽層析、肝素SEPHAROSEtm層析、陰離子或陽離 子交換樹脂（諸如聚天冬胺酸柱）層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。 繼任何初步純化步驟之後，可使用溶離緩衝液在2.5-4.5 之間的pH值下使包含所關注之抗體及污染物的混合物經受 低pH值疏水相互作用層析，層析較佳在低鹽濃度下（例如 約0-0.25 Μ鹽）執行。 免疫接合物 本發明亦提供免疫接合物（可互換地稱作”抗體-藥物接合 物"或”ADC")，其包含與細胞毒性劑（諸如化學治療劑、藥 物、生長抑制劑、毒素（例如細菌、真菌、植物或動物來 源之酶活性毒素，或其片段））或放射性同位素（亦即放射性 接合物）接合之本文中所述之任何抗-DLL4抗體。 使用抗體-藥物接合物局部傳遞細胞毒性劑或細胞抑制 劑（亦即在癌症治療中殺死或抑制腫瘤細胞的藥物）（Syrigos 及 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614 ； Niculescu-Duvaz 及 Springer (1997) dt/v· De/·及ev. 121444.doc •117- 200815467 26:151-172 ;美國專利第4,975,278號）可使藥物部分靶向傳 遞至腫瘤，且細胞内累積於其中，其中全身性投與該等非 接合型藥劑會對正常細胞以及欲求除去之腫瘤細胞產生不 可接受程度之毒性（Baldwin等人，（1986) L⑽(1986年3 月 15 曰）：第 603-05 頁；Thorpe，（1985V’Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review，，* Monoclonal Antibodies *84: Biological And Clinical Applications，A· Pinchera等人（編），第 475-506頁）。因此設 法使毒性最小而功效最大。已報導，多株抗體與單株抗體 均適用於該等策略（Rowland等人，（1986)0^加以/所肌1^〇/. Immunother·，21:183·87)。該等方法中使用的藥物包括道 諾黴素、羥道諾紅黴素、曱胺喋呤及長春地辛（Rowland等 人，（1986)同上文）。抗體-毒素接合物中使用的毒素包括 細菌毒素（諸如白喉毒素）、植物毒素（諸如篦麻毒素）、小 分子毒素（諸如格爾德黴素（geldanamycin)(Mandler等人 (2000) Jowr· 〇/ iVai· Career 92 (19):1573-1581 ;

Mandler 等人（2000) Med. Chem. Letters 10:1025_1028 ; Mandler 等人（2002)81〇。〇11』11§&16€!]^111· 13:786-791))、類美登素（EP 1391213 ; Liu 等人，（1996) Prcx. Scz·· 93:8618-8623)及卡奇黴素（Lode 等人（1998) Cawcw 义 58:2928 ; Hinman 等人（1993) C㈣cer及5 3:3336-3342)。該等毒素可藉由包括微管蛋 白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制在内之機制來實現其 細胞毒性及細胞抑制效應。一些細胞毒性藥物當與大的抗 121444.doc -118- 200815467 體或蛋白質受體配體結合時往往無活性或具有較低活性。 ZEVALIN®(替伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan)， Biogen/Idec)為由針對CD20抗原（存在於正常B淋巴細胞及 惡性B淋巴細胞之表面上）之鼠IgGl κ單株抗體與nlIn或9GY 放射性同位素由硫脲連接子-螯合劑結合而構成的抗體-放 射性同位素接合物（Wiseman等人（2000)五wr· Jaz/r. iVwc/. Med· 27(7):766-77 ; Wiseman 等人（2002) Blood 99 (12) :4336-42 ; Witzig等人（2002) X C/M. Oncol, 20 (10): 2453-63 ； Witzig^ A(2002) J. Clin. Oncol 20 (15) : 3262-69)。儘管ZEVALIN具有針對B細胞非霍奇金氏淋巴瘤⑺-cell non-Hodgkin’s Lymphoma)(NHL)的活性，但投藥會使 大部分患者產生嚴重且長期的血細胞減少症。 MYLOTARGTM(吉妥珠單抗奥唑米星（gemtuzumab ozogamicin) 5 Wyeth Pharmaceuticals) 5 一種由 hu CD33抗 體與卡奇黴素連接而構成的抗體藥物接合物，於2000年獲 准用於注射治療急性骨聽性白血病（Drugs of the Future (2000) 25 (7):686 ;美國專利第 4970198 號、第 5079233 號、第 5585089 號、第 5606040 號、第 5693762 號、第 5739116號、第5767285號、第5773001號）。康圖單抗美坦 辛(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc·)，一種由 huC242抗體與類美登素藥物部分DM 1經由二硫化物連接子 SPP連接而構成的抗體藥物接合物，正處於治療表現 CanAg之癌症（諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他癌症）之II 期試驗中。MLN-2704(Millennium Pharm·，BZL Biologies， 121444.doc -119- 200815467

Immunogen Inc·)，一種由抗前列腺特異性膜抗原（PSMA) 單株抗體與類美登素藥物部分DM1連接而構成的抗體藥物 接合物，正在開發以用於潛在治療前列腺腫瘤。奥利斯垣 叮（auristatin)肽、奥利斯坦叮E(audstatin E，AE)及單甲基 奥利斯坦叮（monomethylauristatin，MMAE)(海兔毒素 (dolastatin)之合成類似物），係與嵌合單株抗體cBR96(對 Lewis Y癌具有特異性）及cACIO(對CD30惡性血液病具有特 異性）接合（Doronina 等人（2003) Λ^ίζ/re 21 (7):778·784)且正處於治療開發中。 適用於產生免疫接合物的化學治療劑描述於本文中（例 如上文）。可使用之酶活性毒素及其片段包括：白喉Α鏈、 白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（源自綠膿假單胞 菌aerwgz·似μ))、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素 A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-帚麴菌素（alpha-sarcin)、油桐 (Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸（Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜（momordica eharantia)抑制劑、麻瘋樹毒素（curcin)、巴豆毒素 (crotin)、肥皂草（sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋 白（gelonin)、有絲分裂素（mitogellin)、侷限麴菌素 (restrictocin)、酚黴素、伊諾黴素（enomycin)及黴菌毒素 (tdcothecene)。參見，例如，1993年10月28日公開之WO 93/21232。多種放射性核可用於製備放射性接合抗體。實 例包括212Bi、131I、131In、9GY及186Re。抗體與細胞毒性劑 之接合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備，該等偶合 121444.doc -120- 200815467 別諸如N- 丁二醯亞胺基_3彳2_吡啶基二硫醇）丙酸酯 (SPDP)、亞胺硫埭（IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物（諸如己 二醯亞胺二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如二丁二醯亞胺基辛 二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊 氮基苯甲醯基）己二胺）、雙重氮鹽衍生物（諸如雙（對重氮 鹽苯甲喊乙二胺）、二異氰酸酉旨（諸如甲苯2,6_二異氛酸 酯）及雙活性氟化合物（諸如二氟_2,4_二硝基苯）。舉例 _ 而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Seience， 238.1098 (1987)中所述製備。碳_14標記之異硫氰酸基节 基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸（MX-DTpA)為用於使放射性 核苷酸與抗體接合之例示性螯合劑。參見w〇94/ii〇26。 本文中亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素（諸如卡奇黴 素、類美登素、海兔毒素、奥利斯坦叮、黴菌毒素及 CC1065，及具有毒素活性之該等毒素之衍生物）的接合 物0 • i·美登素及類美登素 在一些實施例中，免疫接合物包含與一或多種類美登素 分子接合之包含本發明之抗體（全長或片段）。 類美登素為有絲分裂抑制劑，其藉由抑制微管蛋白聚合 而起作用。美登素首先係自東非灌木齒葉美登木 (Maytenus serrata)中分離而得（美國專利第3,896，iu號）。 隨後，發現某些微生物亦產生類美登素（諸如美登醇 (maytansinol)及C_3美登醇酯）（美國專利第4，i5i，〇42號）。 合成美登醇及其衍生物及類似物例如揭示於美國專利第 121444.doc • 121 - 200815467 4，137,230 號、第 4,248,870 號、第 4,256,746 號、第 4,260,608 號、第 4,265,814 號、第 4,294,757 號、第 4,307,016 號、第 4,308,268 號、第 4,308,269 號、第 4,309,428 號、第 4,313,946 號、第 4,315,929 號、第 4,317,821 號、第 4,322,348 號、第 4,331，598 號、第 4,361，650 號、第 4,364,866 號、第 4,424,219 號、第 4,450,254號、第 4,362,663號及第 4,371，533號中。

顯美登素藥物部为為抗體樂物接合物中之吸引人的藥物 部分，原因在於其··⑴相對易於藉由醱酵或醱酵產物之化 學修飾、衍生化製備；（ii)易於用適於經由非二硫化物連 接子與抗體接合之官能基衍生化；（iii)在血漿中穩定；且 (iv)有效對抗多種腫瘤細胞株。 含有類美登素之免疫接合物、其製備方法及其治療用途 例如揭示於美國專利第I·，，號、第5,416,〇64號及歐洲 專利EP 0 425 235 B1中’其揭示内容明確以引用之方式併 入本文中。Liu等人，勤"^㈣93:8618_ ’（1996)描述包含與針對人類結腸直腸癌之單株抗體 連接的類美登素（命名為DM1)的免疫接合物。發現該 接合物對所培養之結腸癌細胞具有高度細胞毒性，且在活 體内腫瘤生長檢定中展示抗腫瘤活性。c⑽等人， R_ 52:127_131 (1992)描述其中類美登素經由二硫化 物連接子與結合人類結腸癌細胞株上之抗原之鼠抗體㈣ 與結合HER_2/neu致癌基因之另一鼠單株抗體μ」接合的 、文接Q物，¾•體外對每細胞表現3⑽5個取r_2表面抗原 121444.doc -122- 200815467 之人類乳癌細胞株SK_BR_3測試TA1_類美登素接合物之細 胞毒性。該藥物接合物實現一定程度與游離類美登素藥物 類似的細胞毒性，其隨每抗體分子類美登素分子數的增加 而增加。A7-類美登素接合物在小鼠中展示低的全身性細 胞毒性。 抗體-類美登素接合物係藉由將抗體與類美登素分子化 學連接來製備，而不會顯著降低抗體或類美登素分子之生 物活性。參見，例如，美國專利第5,208,020號（其揭示内 罾㈣以引用之方式併入本文中)。每抗體分子平均接合% 4個類美且素为子已展示增強靶細胞之細胞毒性而對抗體 之功能或溶解性無不利影響的功效，儘管預期與使用裸抗 一才匕17使個毋素/抗體分子亦增強細胞毒性。類美 登素為此項技術中所熟知，且可由已知技術合成或自天然 來源中分離。適當的類美登素例如揭示於美國專利第 ’ 〇M2(h虎及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較 修纟類吳登素為美登醇及在美登醇分子之芳族環或其他位置 處經修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。 存在多種此項技術中已知用於製備抗體-類美登素接合 物的連接基團’其包括例如美國專利第$，別號或Μ專 ^J〇 425 235 Bl ； Chari ^ Λ ^ Cancer Research 52:127-131(1992)^ ^ ^ If t ^ 10/960,602(2004^ 10^ 8 a 申請)中所揭示的彼等連接基團，該等揭示内容明確以引 用之方式併入本文中。包含連接子組分smcc的抗體-類美 且素接合物可如美國專财請案第ig/96q，⑹2(2剛年则 121444.doc -123- 200815467 8曰申請）中所揭示製備。如上述專利中所揭示，連接基團 包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定 基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團，二硫基及硫醚 基較佳。其他連接基團係在本文中描述及例示。 抗體與類美登素之接合物可使用多種雙官能蛋白質偶合 劑製備’該等偶合劑諸如丁二酿亞胺基比唆基二 硫基）丙酸酯（SPDP)、丁二醯亞胺基_4-(Ν-順丁烯二醯亞胺 基甲基）環己烷-1-甲酸酯（SMCC)、亞胺硫竦（ΙΤ)、亞胺基 酯之雙官能衍生物（諸如己二醯亞胺二曱酯鹽酸鹽）、活性 酯（諸如二丁二醯亞胺基辛二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、雙 疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙重 氮鹽衍生物（諸如雙（對重氮鹽苯曱醯基）_乙二胺）、二異氰 酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如 1，5-二氟-2,4-二硝基苯）。尤其較佳之偶合劑包括Ν_丁二醯 亞胺基·3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（spDp)(Carlss〇n等人，

Biochem· J· 173:723-737 (1978))及 N-丁二醯亞胺基·4_(2_ 吡啶基硫基）戊酸酯（SPP)以提供二硫鍵。 視連接類型而定，連接子可與類美登素分子之各種位置 連接。舉例而言，酯鍵可使用習知偶合技術藉由與羥基反 應而形成。該反應可在具有羥基之C-3位置處、經經甲基 修飾之C-14位置處、經羥基修飾之(^15位置處及具有羥基 之C-20位置處發生。在一較佳實施例中，鍵聯係在美登醇 或美登醇類似物之C-3位置處形成。 ii.奥利斯坦叮及海兔毒素 121444.doc -124- 200815467 在一些實施例中，免疫接合物包含與海兔毒素或海兔毒 素肽類似物及衍生物奥利斯坦叮（美國專利第5635483號、 第57805 88號）接合之本發明之抗體。已證明海兔毒素及奥 利斯坦叮干擾微管體動力學、GTP水解及核分裂及細胞分 K (Woyke ^ A (200 1) Agents and Chemother. 45 (12):3580-35 84)且具有抗癌活性（US 5663 149)及抗真菌活 性（Pettit 等人（1998) Antimicrob. Agents Chemother, 42:2961-2965)。海兔毒素或奥利斯坦叮藥物部分可經由肽 藥物部分之N(胺基）末端或C(羧基）末端與抗體連接（WO 02/088172)。 例示性奥利斯坦叮實施例包括’’Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"，美國第 10/983,340號（2004年11月5日申請，其揭示内容明確以引 用之方式全文併入本文中）中所揭示的N-末端連接之單曱 基奥利斯坦叮藥物部分DE及DF。 基於肽之藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸 及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。該等肽鍵例如可根據 肽化學領域中熟知之液相合成方法（參見E. Schr5der及K.

Ltibke，nThe Peptides"，第 1 卷，第 76-136 頁，1965,

Academic Press)製備。奥利斯坦叮/海兔毒素藥物部分可根 據以下文獻中之方法製備：US 5635483 ; US 5780588 ; Pettit 等人（1989) 乂 dm· C/zem· *SW· iii:5463-5465 ; Pettit 等人（1998) jwi-Cancer Drwg Des/ge 13:243-277 ; Pettit， G.R·等人办1996，719-725;及 Pettit等人（1996) x 121444.doc -125- 200815467 C/zem. PerA：//? 7>α似· 1 5:859-863 〇 亦參見Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784 ； ,f Monomethyl valine Compounds Capable of Conjugation to Ligands"，美國第 10/983，340號（2004年11月5日申請），其以引用之方式全文 併入本文中（例如，揭示連接子及製備與連接子接合之單 甲基纈胺酸化合物（諸如MMAE及MMAF)的方法）。 iii. 卡奇黴素 在其他實施例中，免疫接合物包含與一或多個卡奇黴素 分子結合之本發明之抗體。抗生素之卡奇黴素家族能夠以 亞皮莫耳（sub-picomolar)濃度產i雙股DNA斷裂。關於卡 奇黴素家族之接合物之製備，參見美國專利第5,712,374 號、第 5,714,586號、第 5,739，116號、第 5,767,285 號、第 5,770,701 號、第 5,770,710 號、第 5,773,001 號、第 5,877,296 號（全部頒予 American Cyanamid Company)。可 使用之卡奇黴素之結構類似物包括（但不限於）：Ύι1、α/、 (Χ31、Ν-乙醯基-γ/、PSAG 及 eSCHinman 等人，Cancer

Research 53:3336-3342 (1993) ; Lode 等人，Cancer

Research 58:2925-2928 (1998)及 American Cyanamid之上述 美國專利）。另一種可接合抗體的抗腫瘤藥物為QFA，其為 抗葉酸劑。卡奇黴素與QFA均具有細胞内作用位點且不易 跨越質膜。因此，細胞經由抗體介導之内化作用吸收該等 藥劑大大增強其細胞毒性效應。 iv. 其他細胞毒性劑 其他可與本發明抗體接合之抗腫瘤劑包括BCNU ;斯曲 121444.doc -126- 200815467 普托辛（streptozoicin);長春新鹼及5_氟尿嘧啶；美國專利 5,053,394、5,770,710中所述統稱為LL_E33288複合物之藥 劑家族；以及埃斯培拉黴素（美國專利5,877,296)。 可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉錢、白喉毒素 之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿假單胞菌）、篦 麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒蛋白a鏈、心帚麴 菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白（ρΑρι、 ΡΑΡΙΪ及PAP_S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒素、 肥皂草抑制劑、天堂果蛋白、有絲分裂素、侷限麴菌素、 酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參見，例如，1993年1〇月 28 日公開之 W0 93/21232。 本發明進一步涵蓋抗體與具有核酸分解活性之化合物 (例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如脫氧核糖核 酸酶；DNase)之間所形成的免疫接合物。 純選擇性破壞腫冑，則抗體可包含高度放射性原子。 φ 夕種放射性同位素可用於製備放射性接合抗體。實例包括

At=、1131、1125、Y9。、R，、R，、Sm…、Bim、p32、

Pb 12及Lu之放射性同位素。當接合物用於偵測時，其可包 含閃爍造影研究用之放射性原子，例如“化或im ;或核 磁共振（NMR)成像（亦稱為磁共振成像，㈣用之自旋標 記，又諸如碘_123、碘_131、銦-⑴、氟-19、碳_13、氮· 15、氧-17、釓、錳或鐵。 放射性標記或其他標記可以已知方式併入接合物中。舉 例而言，肽可經生物合成，或可使用包括例如氣_19而非 121444.doc -127- 200815467 氫的適當胺基酸前驅物藉由胺基酸化學合成法來合成。諸 如tc99n^I123、Re!“、Rei8^Inm之標記可經由肽中之半 胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。可使用 IODOGEN 方法（Fraker 專人（1978) 灭以·

Comw親 80: 49_57)併入碘-123。'.Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal，CRC Press 1989)詳細描述 其他方法。 抗體與細胞毒性劑之接合物可使用多種雙官能蛋白質偶 合劑製備’該等偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基_3_(2_吡啶基 二硫基）丙酸酯（SPDP)、丁二醯亞胺基(冰順丁烯二醯亞 胺甲基）環己烷-1-曱酸酯（SMCC)、亞胺硫煉（it)、亞胺基 酯之雙官能衍生物（諸如己二醯亞胺二曱酯鹽酸鹽）、活性 酯（諸如二丁二醯亞胺基辛二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、雙 疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙重 氮鹽衍生物（諸如雙（對重氮鹽苯甲醯基> 乙二胺）、二異氰 酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如 1，5-一氟-2,4-二硝基苯）。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可 如Vnetta等人，心化以^，238:1〇98 (1987)中所述製備。碳- 14標記之1-異硫氰基苄基+甲基二伸乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)為用於使放射性核㈣與抗體接合的例示性整 合劑。參見簡⑽屬。連接子可為有利於細胞毒性藥 物在細胞中釋放的"可裂解連接子"。舉例而t，可使用酸 不穩定連接子、肽酶㈣性連接子、光不穩定連接子、二 甲基連接子或含二硫化物連接子等A， 121444.doc -128- 200815467 及以⑽π/ζ 52:127-131 (1992);美國專利第 5,208,020號)。 本發明之化合物明確涵蓋（但不限於）用以下交聯試劑所 製備之 ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、 SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、 磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB以及 SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基颯）苯甲酸酯），其均可在市 面上購得（例如，購自 Pierce Biotechnology，Inc·，Rockford， • IL.，U.S. A)。參見 2003-2004 Applications Handbook and Catalog 第 467:498 頁。 v.製備抗體藥物接合物 在本發明之抗體藥物接合物（ADC)中，抗體（Ab)經由連 接子（L)與一或多個藥物部分（D)(例如每抗體約1至約20個 藥物部分）接合。式I之ADC可經由若干途徑使用熟習此項 技術者已知之有機化學反應、條件及試劑製備，包括：（1) $ 使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形 成Ab-L，繼而與藥物部分D反應；及P)使藥物部分之親核 基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，繼而 與抗體之親核基團反應。製備ADC的其他方法描述於本文 中〇

Ab-(L-D)p I 連接子可包含一或多個連接子組分。例示性連接子組分 包括6-順丁烯二醯亞胺己醯基（，，MCn)、順丁烯二醯亞胺丙 醯基（ΠΜΡ")、纈胺酸-瓜胺酸（"val-cit”）、丙胺酸-苯丙胺酸 121444.doc -129- 200815467 (”ala-phe”）、對胺基苄氧羰基（"PAB”）、N-丁二酸亞胺基4_ (2·吼咬基硫基）戊酸酯（"SPP”）、N-丁二醯亞胺基4_(N_順丁 烯二醯亞胺甲基）環己烷-1-甲酸酯（"SMCC")及N-丁二酸亞 胺基（4-破基-乙醯基）胺基苯甲酸酯（"siab")。其他連接子 組分為此項技術中所已知且一些描述於本文中。亦表見 ifMonomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to

Ligands”，US Ser. No.10/983,340，2004年 11 月 5 日申請， 5亥文獻内谷以引用之方式全文併入本文中。 在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺 基酸連接子組分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二 肽包括：顯胺酸-瓜胺酸（vc或val_cit)、，丙胺酸_苯丙胺酸 (af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸·瓜胺酸 (gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸β甘胺酸（gly_gly_gly)。包含 胺基酸連接子組分的胺基酸殘基包括天然產生之彼等胺基 酸’以及次要胺基酸及非天然產生之胺基酸類似物，諸如 鲁 瓜胺酸。胺基酸連接子組分可在其對藉由特定酶（例如腫 瘤相關之蛋白酶、組織蛋白酶B、（3及D或纖溶酶蛋白酶） 酶促裂解之選擇性方面經設計及優化。 抗體上之親核基團包括（但不限於）··（i)N_末端胺基；（H) 側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺 酸；及（iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺基、硫 醇基及·基為親核性基團且能夠與包括以下物質之連接子 部分及連接子試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵：⑴ 活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯基鹵；（ii) 121444.doc 200815467 烧基鹵及苄基鹵，諸如鹵乙醯胺；（Hi)酸、酮、羧基及順 丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原之鏈間二硫化 物，亦即半胱胺酸橋。抗體可藉由用還原劑（諸如DTT(二 硫蘇糖醇））處理獲得與連接子試劑接合的反應性。因此各 半胱胺酸橋理論上形成兩個反應性硫醇親核試劑。其他親 核基團可經由離胺酸與2_亞胺硫煉（Traut試劑）之反應引入 抗體中’從而使胺轉化成硫醇。反應性硫醇基團可藉由引 入一、二、三、四或四個以上的半胱胺酸殘基而引入抗體 (或其片段）中（例如製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基 酸殘基的突變抗體）。 本發明之抗體藥物接合物亦可藉由修飾抗體以引入親電 子部分（其可與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應）而 製備。糖基化抗體中之糖可用例如過碘酸鹽氧化試劑氧 化’以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛基 或酮基。所得亞胺希夫鹼（imine Schiff base)基團可形成穩 定鍵聯’或例如由硼氫化物試劑還原以形成穩定的胺鍵。 在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧 化酶或偏過碘酸鈉之反應可在能與藥物上之適當基團反應 之蛋白質中產生幾基（駿及酮）（Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N_末端絲胺酸或蘇胺 酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛而非第 一 fe 基酸（Geoghegan及 Stroh，（1992)价C/^em· 3:138_146 ; US 5362852)。該醛可與藥物部分或連接子親 核試劑反應。 121444.doc -131· 200815467 同樣某物部分上之親核基團包括（但不限於）能夠與包 括·（0活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯基 鹵，(π)烷基鹵及苄基鹵，諸如鹵乙醯胺；（iii)醛、酮、羧 基及順丁烯二醯亞胺基團的連接子部分及連接子試劑上之 親電子基團反應以形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、 肟肼、硫半卡（thiosemicarbazone)、肼甲酸酯基及笑其 醯肼基團。 4 土 或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白例如可藉由重 組技術或肽合成法製備。DNA長度可包含編碼接合物中彼 此相鄰或由編碼連接子肽（其不破壞接合物之所要性質）之 區域分開的兩部分之各別區。 在另一實施例中，抗體可與用於腫瘤預先靶向之"受體 如抗生蛋白鏈菌素）接合，其中將抗體_受體接合物投 ^患者’ Μ而使用清除劑將未結合之接合物自循環系統中 矛夕除，且接著投與與細胞毒性劑（例如，放射性核苷酸）接 合的”配體’’（例如，抗生物素蛋白）。 醫藥調配物 包含本發明抗體之治療調配物係藉由將具有所要純度之 抗體與可選之生理學±可接受之載劑、賦形劑或穩定劑 (Remington ： The Science and Practice of Pharmacy % 20)^ (、〇〇))此〇製備成水溶液、凍乾或其他乾燥型調配物之形 式=便儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量 及/辰度下對接党者無毒，且包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、 擰檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸·，抗氧化劑，包括抗壞金 121444.doc -132- 200815467 酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨、 氯化六烴季銨、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、笨酚、丁 醇或苯甲醇、對經苯甲酸烧酉旨（諸如對經苯甲酸甲醋或對 經苯甲酸丙酉旨）、兒茶紛、間苯二紛、環己醇' 3-戊醇及間 甲紛）；低分子量（約10個殘基以下）多肽；蛋白質，諸如血 清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙 烯比各疋酮，胺基酸，諸如甘胺酸、麵醯胺酸、天冬醯胺 鲁豸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單_、二醣及其他碳水化 α物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA ;糖，諸如蔗糖 ' 甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成 鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物（例如，Ζη蛋白質錯合 物）’及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM、 PLUR0NICSTM或聚乙二醇（PEG)。 本文中之凋配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應 症所而的活性化合物，較佳具有彼此無不利影響之補充活 φ 丨生的彼等化合物。該等分子適當地以有效實現預定目標之 量組合存在。 活性成分亦可包裹於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合 所製備的微囊（例如，分別為羥甲基纖維素或明膠微囊及 聚（甲基丙烯酸甲酯）微囊）中，膠體藥物傳遞系統（例如， 曰貝體白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊） 或巨乳液中。該等技術揭不於及 0/户/mr而叮第 20版（2000)中。 用於活體内投藥的調配物必須為無菌的。此易於藉由經 121444.doc -133- 200815467 由無菌過濾膜過濾來實現。 可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適當實例包 括含有本發明之免疫球蛋白之固體疏水性聚合物的半透過 性基質，該等基質呈例如膜或微囊的成形物品之形式。持 續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚（2_經基 乙基-曱基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸交酯（美國專利 第3,773,919號）、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、 不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚 物（諸如LUPRON DEPOT，由乳酸乙醇酸共聚物與乙酸亮 丙瑞林組成之可注射微球體））及聚羥基丁酸。雖 然諸如乙浠-乙酸乙浠自旨及乳酸-乙醇酸之聚合物能使分子 釋放逾100天，但某些水凝膠釋放蛋白質持續的時斯較 短。當囊封之免疫球蛋白在身體中長期保留時，其可能因 在3 7 C下暴露於水分中而變性或聚集，從而導致生物活性 喪失及可能的免疫原性變化。可根據所涉及之機制設計合 理的穩定策略。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基· 二硫化物互換而形成分子間S_S鍵，則穩定可藉由修飾氫 硫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添 加劑及形成特定的聚合物基質組合物來實現。 用途 本發明之抗體例如可用於活體外、離體及活體内治療方 法中。 在^"樣中，本發明提供治療或預防與DLL4之表現及/ 或活性增強相關之腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症的方 121444.doc -134- 200815467 法，該等方法包含將有效量之抗_DLL4抗體投與需要該治 療之個體。 在一態樣中，本發明提供降低、抑制、阻斷或防止腫瘤 或癌症生長的方法，該等方法包含將有效量之抗 體投與需要該治療之個體。 在一態樣中，本發明提供治療腫瘤、癌症及/或細胞增 殖性病症的方法，其包含將有效量之抗_DLL4抗體投與需 要該治療之個體。 在一態樣中，本發明提供抑制血管生成的方法，其包含 將有效量之抗-DLL4抗體投與需要該治療之個體。 在一悲樣中，本發明提供治療與金管生成相關之病理性 病狀的方法，其包含將有效量之抗-DLL4抗體投與需要該 治療之個體。在一些實施例中，與血管生成相關之病理性 病狀為腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。在一些實施例 中’與血管生成相關之病理性病狀為眼内新生血管疾病。 此外’本發明之抗體中之至少一部分可結合來自其他物 種之抗原。因此，本發明之抗體可用於例如在含有抗原之 細胞培養物中、在具有可與本發明之抗體交叉反應之抗原 的人類個體或在其他哺乳動物個體（例如黑猩猩、狒狒、 狨猴、食蟹狼及恆河猴、豬或小鼠）中結合特異性抗原活 I*生。在一實施例中，藉由使本發明之抗體與抗原接觸以使 侍抗原活性被抑制而使用本發明之抗體抑制抗原活性。抗 原較佳為人類蛋白質分子。 在一實施例中，本發明之抗體可用於在患有與抗原表現 121444.doc -135- 200815467 及戈/舌丨生增強相關之病症之個體中結合抗原的方法，該 方法包含將本發明之抗體投與個體以使得個體中之抗原被 & 較佳地，抗原為人類蛋白質分子且個體為人類個 體或者’個體可為表現與本發明之抗體結合之抗原的哺 乳動物其他個體可為抗原已引入其中（例如藉由投與抗 原或藉由表現抗原轉殖基因）之哺乳動物。可將本發明之 抗體投^4人類個體用於治療目的。此外，可將本發明之抗 體投與表現可與免疫球蛋白交叉反應之抗原的非人類哺乳 動物（例如鼓長類動物、豬或小鼠）用於獸醫學目的或用作 人類疾病之動物模型。關於後者，該等動物模型可適用於 u平估本^明之抗體之治療功效（例如，測試劑量及投藥時 間進程）。 可使用本發明之抗體治療、抑制與一或多種抗原分子之 表現及/或活性相關之疾病、病症或病狀，延緩其進行、 防止/延緩其復發，改善或預防該等疾病、病症或病狀。 例示性病症包括癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病 或淋巴惡性疾病。該等癌症之更特定實例包括：鱗狀細胞 癌（例如上皮鱗狀細胞癌）、肺癌（包括小細胞肺癌、非小細 胞肺癌、肺部之腺癌及肺部之鱗狀癌）、腹膜癌、肝細胞 癌、胃癌（包括胃腸癌）、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮 頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝細胞瘤、乳 癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌或子宮 癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝 癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋 121444.doc -136- 200815467 巴瘤、腦癌，以及頭頸癌，及相關癌轉移。在一些實施例 中’癌症係選自由以下各病組成之群：小細胞肺癌、神經 母細胞瘤、黑素瘤、乳癌、胃癌、結腸直腸癌（CRC)及肝 細胞癌。在一些實施例中，癌症選自由以下各病組成之 群：非小細胞肺癌、結腸直腸癌及乳癌，包括彼等癌症之 轉移形式。 在某些K施例中’將包含與一或多種細胞毒性劑接合之 抗體的免疫接合物投與患者。在一些實施例中，免疫接合 _ 物及/或其所結合之抗原係由細胞内在化，從而使得免疫 接合物殺死其所結合之靶細胞的治療功效增強。在一實施 例中，細胞毒性劑靶向或干擾靶細胞中之核酸。在一實施 例中，細胞毒性劑靶向或干擾微管聚合。該等細胞毒性劑 之貝例包括本文中所述之任何化學治療劑（諸如類美登 素、奥利斯坦叮、海兔毒素或卡奇黴素）、放射性同位素 或核糖核酸扭或DNA核酸内切酶。 • 本發明之抗體在治療中可單獨或者與其他組合物組合使 用。舉例而言，可將本發明之抗體與另一種抗體、化學治 療劑（包括化學治療劑之混合物）、其他細胞毒性劑、抗也 官生成劑、細胞激素及/或生長抑制劑共同投與。若本發 明之抗體抑制腫瘤生長，則可能尤其需要將其與一或多種 其他亦抑制腫瘤生長之治療劑(例如抗-VEGF劑，包括抗 VEGF抗體）組合4者或此外，患者可接受組合放射治療 (例如，外光束照射，或利用經放射性標記之藥劑(諸如抗 體）之療法）。上述該等組合療法包括組合投藥（其中將兩種 121444.doc •137- 200815467 一調配物或單獨之調配物中） 本發明之抗體可在投與辅助療 或兩種以上的藥劑包括於同 及單獨投藥，在該情況下， 法之前及/或之後投與。 組合療法 、、斤扣出，本發明提供其中將抗_dlL4抗體與另一 :療法-起投與的組合療法。舉例而言，抗孤*抗體可 :抗癌治療劑或抗新血管生成治療劑組合使用以治療各種 ^生性或非贅线病狀。在—實施例中，該贅生性或非費 生性病狀之特徵為與異常或不以管生成相關的病理性病 症抗-DLL4抗體可與另一種有效用於彼等目的之藥劑在 相同組合物中或作為單獨組合物依序或組合投與。或者或 此外，可投與多種DLL4之抑制劑。 抗舰L4抗體之投藥例如可以單—組合物或以兩種或兩 種以上不同組合物形式利用相同或不同的投藥途徑同時進 ❼或者或此外’投藥可以任何順序依序進行。在某些實 施例中’介於兩種或兩種以上組合物投藥之間可存在數分 鐘至數天至數週至數月範圍内的間隔。舉例而言，可首先 投與抗癌齊卜繼而投與DLL4抑制劑。然而，亦涵蓋同時 投藥或首先投與抗-DLL4抗體。 與抗-DLLO^m合投與之治療劑之有*量係由醫師或 獸醫判斷。進行劑量管理及調整以實現賴治療之病狀之 最大控制。此外，劑量視諸如所欲使用之治療劑之類型及 所治療之特定患者之因素而定。抗癌劑之適當劑量為目前 所使用之彼等劑量，且可因抗癌劑與抗_DLL4抗體之組合 121444.doc -138- 200815467 作用（協同作用）而降低。在某些實施例中，抑制劑之組合 加強單一抑制劑之功效。術語”加強”係指治療劑在其常用 劑量或認可劑量下之功效提高。亦參見本文中題為醫藥組 合物的部分。 通常，抗-DLL4抗體及抗癌劑適用於相同或類似疾病以 阻斷或減緩諸如腫瘤生長或癌細胞生長之病理性病症。在 一實施例中，抗癌劑為抗血管生成劑。 與癌症相關之抗企管生成療法可為旨在抑制提供營養以 支持腫瘤生長所需之腫瘤血管發展的癌症治療策略。由於 血管生成牽涉於原發性腫瘤生長與轉移，因此本發明所提 供之抗血管生成治療能夠抑制原發部位腫瘤之贅生性生長 以及防止第二部位腫瘤之轉移，從而允許其他治療劑攻擊 腫瘤。 多種、抗血管生成劑已鑑別且為此項技術中所已知，包括 本文中所列舉之彼等藥劑，例如在定義項下所列舉的彼等 藥劑，以及例如 Carmeliet 及 Jain, Nature 407:249-257 (2000) ; Ferrara 等人，iVaiwre 3:391-400 (2004);及 Sato Int. J. Clin. Oncol·，8:200-206 (2003)所列舉的彼等藥劑。亦參見美國專利申請案 US20030055006。在一實施例中，抗-DLL4抗體係與以下 藥劑組合使用：抗-VEGF中和抗體（或片段）及/或另一 VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑，包括（但不限於），例如 可溶性 VEGF 受體（例如 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、 神經纖毛蛋白（例如，NRP1、NRP2))片段、能夠阻斷 121444.doc -139- 200815467 VEGF或VEGFR之適體、中和抗-vegfj^體、VEGFR酿胺 酸激酶（RTK)之低分子量抑制劑、VEGF之反義策略、針對 VEGF或VEGF受體之核糖酶、VEGF之拮抗劑變異體；及 其任何組合。或者或此外，除VEGf拮抗劑及其他藥劑 外’可視需要將兩種或兩種以上血管生成抑制劑共同投與 患者。在某些實施例中，可將一或多種其他治療劑（例如 抗癌劑）與抗-DLL4抗體、VEGF拮抗劑及抗血管生成劑組 合投與。 在本發明之某些態樣中，適用於與抗_DLL4抗體組合治 療腫瘤的治療劑包括其他癌症療法（例如，手術、放射性 治療(例如，包括照射或投與放射性物質））、化學療法、用 本文中所列舉及此項技術中已知之抗癌劑治療或其組 合）。或者或此外，可將兩種或兩種以上如本文中所揭示 之結合相同或兩種或兩種以上不同抗原的抗體共同投與患 者。有時將一或多種細胞激素投與患者可能亦為有益的。 化學治療劑 在某些態樣中，本發明提供藉由將有效量之DLL4拮抗 劑及/或血管生成抑制劑及一或多種化學治療劑投與易患 癌症或經診斷患有癌症的患者來阻斷或減緩腫瘤生長或癌 細胞生長的方法。多種化學治療劑可用於本發明之組合治 療方法。所涵蓋之化學治療劑之例示性及非限制性清單提 供於本文中之”定義"項下。 如一般技術者所瞭解，化學治療劑之適當劑量通常與已 用於臨床療法中之彼等劑量相當，其中化學治療劑係單獨 121444.doc -140- 200815467 或與其他化學治療劑組合投與。視所治療之病狀而定，可 月b存在劑1變化。掌管洽療之醫師應能夠確定用於於個別 個體之適當劑量。 本發明亦提供用於抑制或防止復發性腫瘤生長或復發性 癌、、、田胞生長的方法及組合物。復發性腫瘤生長或復發性癌 、、、田胞生長係用於描述一種病⑼，其中對於正經歷-或多種 現打療法（例如，癌症療法，諸如化學療法、放射療法、 手術激素療法及/或生物學療法/免疫療法、抗_vEGF抗 體療去，尤其針對特定癌症的標準治療方案）或已經一或 多種現行療法治療之患者，臨床上已無法勝任對該等患者 之治療，或該等患者不再自治療獲得任何有益效應，以致 於孩等患者需要其他有效療法。如本文中所使用，該短語 亦可指”無反應性/難治性，，患者之病狀，例如，其描述對療 法有反應卻遭受副作用困擾、產生耐藥性、對療法無反 應、對療法之反應不令人滿意等的患者。在各種實施例 中，癌症為復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長，其中癌 細胞數目尚未顯著降低，或已增加，或腫瘤尺寸尚未顯著 降低，或已增大，或癌細胞之尺寸或數目未進一步降低。 在本上下文中利用”復發性"或"難治性”或"非反應性"之業 内公認之含義，藉由此項技術巾已知用於檢定對癌細胞之 治療功效的任何方法，可活體内或活體外確定癌細胞是否 為復發性腫瘤生長或為復發性癌細胞生長。對抗_vegf、、台 療具有抗性之腫瘤為復發性腫瘤生長之實例。 本發明提供藉由投與-或多種阻斷或減緩個體中復發性 121444.doc -141- 200815467 腫瘤生長或復發性癌細胞生長之抗_DLL4抗體來阻斷或減 缓個體中復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長的方法。在 某些實施例中，拮抗劑可在癌症治療劑之後投與。在某些 實施例中，將抗-DLL4抗體與癌症治療劑同時投與。或者 或此外，將抗-DLL4抗體療法與另一種癌症療法交替，其 可以任何順序執行。本發明亦涵蓋投與一或多種抑制性抗 體以防止易患癌症之患者癌症發作或復發的方法。通常， 使個體同時經歷癌症療法。在一實施例中，癌症療法為用 抗血管生成劑（例如，VEGF拮抗劑）治療。抗血管生成劑包 括此項技術中已知之彼等藥劑及本文中定義項下所提供之 彼等藥劑。在一實施例中，抗血管生成劑為抗-VEGF中和 抗體或片段（例如，AVASTIN®(Genentech，South San Francisco, CA)或 LUCENTIS⑧（Genentech， South San Francisco，CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3 等）。參見， 例如美國專利 6,582,959、6,884,879、6,703,020 ; W098/45332 ； WO 96/30046 ； W094/10202 ； EP 0666868B1 ； 美國專利申請案 20030206899、20030190317、20030203409 及 20050112126 ; Popkov 等人，〇/

Methods 288:149-164 (2004);及 W02005012359。其他藥 劑可與VEGF拮抗劑及抗-DLL4抗體組合投與，以便阻斷或 減缓復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長，例如，參見本 文中題為組合療法之部分。 本發明之抗體（及輔助治療劑）係藉由任何適當方式（包括 非經腸、皮下、腹膜内、肺内及鼻内）投與，且若需要用 121444.doc -142- 200815467 於局部治療’則病灶内或玻螭體内投藥 肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下^腸輸液包括 體適當地藉由脈衝輸液投與，尤其 :、。此外’抗 給藥可藉由任何適當途徑(例如藉由注;里:::抗體。 :或皮下注射)進行’此部分視投藥是否二=

本發明之抗體組合物以符合良好醫學規範之方 給藥及投與。本文中考慮之因素包括所治療之特^症、、 所治療之特定哺乳動物、單個患者之臨床病狀、病症 因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時程及執業醫師已知 的其他因素。抗體不必但視需要用一或多種目前用於預防 或治療所述病症之藥劑調配。該等其他藥劑之有效量視本 發明之抗體存在㈣配物中的量、病症或治療之類型及上 述其他因素岐。該等藥劑通常以相同劑量及如上文中所 使用之投藥途徑或此前所用劑量之約i %至99%使用。 對於預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量（當單獨 或與諸如化學治療劑之其他藥劑組合使用時）視以下因素 而定··欲治療之疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度 及病程、是否為預防性或治療性目的投與抗體、先前之療 法、患者臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。適 當地將抗體一次或經一系列治療投與患者。無論例如藉由 一或多次單獨投藥或藉由連續輸液，視疾病類型及嚴重程 度而定’投與患者的初始候選劑量為約1 Kg/kg至15 mg/kg(例如，（M mg/kg_1〇叫/]^之抗體。一種典型每曰 121444.doc • 143 - 200815467 劑量可在約1 Pg/kg至100 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍 内*此視上述因素而定。對於在數日或較長時間内的重複 投藥’視病狀而定，可持續治療直至疾病症狀出現所要抑 制時為止。抗體之—例示性劑量在約〇 mg/kg至約】〇 mg/kg範圍内。因&，可向患者投與一或多次約μ S 2·0 mg/kg、4.0 mg/kg或 1〇 mg/kg(或其任何組合） 之劑量。該等劑量可例如每週或每三週間斷投與（例如， 以使仵患者接受約二至約二十(例如約六)次劑量的抗體)。 初期投與較高劑量負荷，繼而投與一或多次較低劑量。例 丁 I’》藥方案包合初期投與約4 mg/kg之劑量負荷，繼而 每週維持約2 mg/kg抗體之劑量。然而，其他給藥方案可 為適用的。此療法之進程易&習知技術及檢定監控。 本發明之抗-DLL4抗體適用於偵測特定細胞或組織中 肌4表現之檢定（諸如診斷性檢定或預後性檢定），其中該 等抗體係如下所述經標記且/或固定於不溶性基質上。 在另一態樣中，本發明提供偵測DLL4之方法，該等方 法包含彳貞測樣本中之01^4_抗_〇“4抗體複合物。如本文 中所使用之術語"债測"包括參考或不參考對照之定性及/或 定量偵測（量測含量）。 在另一態樣中，本發明提供診斷與DLL4表現及/或活性 相關之病症的方法’該等方法包含偵測來自患有或疑似患 有該病症之患者之生物樣本中的祖4_抗_組4抗體複合 物。在-些實㈣巾，DLL4表現為㈣之表現或異常（不 當）之表現。在-些實施例中，肖病症為腫冑、癌症及/或 121444.doc -144 - 200815467 細胞增殖性病症。 在另一態樣中，本發明提供本文中所述之任何抗-DLL4 抗體，其中該抗-DLL4抗體包含可偵測標記。 在另一態樣中，本發明提供本文中所述之任何抗-DLL4 抗體與DLL4之複合物。在一些實施例中，複合物為活體 内或活體外複合物。在一些實施例中，複合物包含癌細 胞。在一些實施例中，抗-DLL4抗體係經可偵測標記。 抗-DLL4抗體可用於以多種熟知之偵測檢定法中之任一 零 種偵測DLL4。舉例而言，可如下檢定生物樣本中之 DLL4 :自所要來源獲取樣本，將樣本與抗-DLL4抗體混合 以使抗體與該混合物中所存在之任何DLL4形成抗體/DLL4 複合物，及偵測存在於混合物中之任何抗體/DLL4複合 物。用於檢定的生物樣本可由此項技術中已知適於特定樣 本之方法製備。使樣本與抗體混合之方法及偵測抗體 /DLL4複合物之方法係根據所用檢定類型選擇。該等檢定 $ 包括免疫組織化學、競爭性及夾心檢定及空間抑制檢定。 DLL4之分析方法均使用以下試劑中之一或多種：經標 記之DLL4類似物、經固定之DLL4類似物、經標記之抗-DLL4抗體、經固定之抗-DLL4抗體及空間接合物。經標記 之試劑亦稱為π示蹤劑”。 所用標記為不干擾DLL4與抗-DLL4抗體結合的任何可偵 測官能基。用於免疫檢定中的多種標記為已知的，實例包 括可直接偵測的部分，諸如螢光染料、化學發光標記及放 射性標記；以及必須經反應或衍生化才可偵測的部分，諸 121444.doc -145- 200815467 如酶。該等標記之實例包括： 所用標記為不干擾DLL4與抗-DLL4抗體結合的任何可傭 測官能基。用於免疫檢定中的多種標記為已知的，實例包 括可直接偵測的部分，諸如螢光染料、化學發光標記及放 射性標記；以及必須經反應或衍生化才可偵測的部分，諸 如酶。該等標記之實例包括：放射性同位素32p、uc、

125ι、3H及1311 ;螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素 (fluorescein)及其衍生物；若丹明（rh〇damine)及其衍生 物·’丹磺醯（dansyl);繳酮（umbellifer〇ne);螢光素酶，例 如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶（美國專利第 4,737,456號）；榮光素（lueifeHn) ; 2,3_二氫酞嘹二綱；辣 根過氧化物酶（HRP);鹼性磷酸酶；卜半乳糖苷酶，·葡糖 澱粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳 糖氧化酶及葡萄糖i磷酸脫氫酶；與使用過氧化氫氧化染 料前驅物之酶(諸如HRP)偶合的雜環氧化酶，諸如尿酸酶 及黃嘌呤氧化酶；乳過氧化酶，或微過氧化酶；生物素/ 抗生物素蛋白；自旋標記；嚨菌體標記；穩定自由基，及 其類似物。 可利用習知方法使該等標記與蛋白 質或多肽共價結合。 舉例而言，可使用諸如 醯亞胺、雙醯亞胺酯、 劑將抗體用上述螢光標 記。參見，例如，美國 第 3,645,090 號（酶）； 二駿、碳化二醯亞胺 '二順丁烯二 又重氮化聯苯胺及其類似物之偶合 C、化學發光標記及酶標記加以標 專利第3,940,475號（螢光測定法）及

Hunter 專人，#144: 945 I21444.doc -146 - 200815467 (1962) ; David等人，13: 1014-1021 (1974); Pain等人，/· /mmzz⑽厂 办，40: 219_230 (1981);及

Nygren，J· Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)。本文中之較佳標記為酶，諸如辣根過氧化物酶及 鹼性磷酸酶。該標記（包括酶）與抗體之接合為免疫檢定技 術中一普通技能的標準操作程序。參見，例如O’Sullivan 等人，11 Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immimoassay，” Methods in 五似ymo/ogj;，J.J. Langone 及 H. Van Vunakis 編，第 73 卷 (Academic Press，New York，New York，1981)，第 147-166 試劑之固定為某些檢定方法所需。固定需要將抗-DLL4 抗體與溶液中保持游離之任何DLL4分離。此舉通常藉由 在檢定程序之前使抗-DLL4抗體或DLL4類似物不溶（例如 藉由共價偶合（例如，使用戊二醛交聯）吸附至水不溶性基 質或表面（Bennich等人，U.S· 3,720,760))，或藉由使抗-DLL4抗體或DLL4類似物不溶後再例如藉由免疫沈澱法來 實現。 樣本中蛋白質之表現可使用免疫組織化學及染色方案檢 測。將組織切片免疫組織化學染色已證明為評估或偵測樣 本中蛋白質存在之可靠方法。免疫組織化學（"IHC”）技術 通常藉由發色方法或螢光方法，利用抗體原位探測及顯現 細胞抗原。對於樣本製劑，可使用來自哺乳動物（通常人 類患者）的組織或細胞樣本。樣本之實例包括（但不限於）： 121444.doc -147- 200815467 癌細胞’諸如結腸、乳房、前列腺、印巢、肺、胃、胰 腺、淋巴瘤及白血病之癌細胞。樣本可藉由此項技術中已 知之多種程序獲得，該等程序包括(但不限於)手術切除、 抽吸或活組織檢查。該組織可為新鮮的或經冷束。在一實 施例中’樣本係經固定且包埋入石壞或其類似物中。组織 樣本可藉由習知方法固定（亦即保存）。一般技術者應瞭 解’固Μ之選擇係取決於樣本將用於組織染色或其他分 析之目的。—般技術者亦應瞭解，固定長度視組織樣本之 尺寸及所用固定劑而定。 ⑽可與其他技術（諸如形態染色及/或螢光原位雜交璋 合執行。1HCM種通时法可供利[直接檢定及間接 檢定。根據第-檢S ’抗體與目標抗原（例如DLL4)之結合 係直接測定。此直接檢定使用無需進—步抗體相互作用便 可顯現的標記試劑，諸如經營光標記或酶標記之-級抗 體。在典型的間接檢定中，未接合之一級抗體與抗原結 合：且接著經標記之二級抗體與一級抗體結合。若二級抗 體係與酶標記接合’則添加發色受質或螢光受質以提供抗 原=,4現。發生信號擴增的原因係在於若干二級抗體與一 級抗體上之不同抗原決定基反應。 ;免疫、、且織化學中的_級抗體及/或二級抗體係用可 债則4刀加以‘ €。有多種標記可供利用，其通常可歸為 以下類別： 除上述樣本製備程序外，彳能需要在mc之前、期間或 之後進纟處理組織切片。舉例而t，可執行抗原決定基 121444.doc 200815467 修補方法，諸如加熱檸檬酸鹽緩衝液中之組織樣本（參 見，例如，Leong專尺，Appl· Immunohistochem. 4 (3):201 (1996)) 〇 繼可選阻斷步驟之後，將組織切片在適當條件下暴露於 一級抗體足夠的時期，以使得一級抗體與組織樣本中之目 標蛋白質抗原結合。實現此舉的適當條件可由常規實驗確 定。抗體與樣本結合的程度可使用上述任一種可偵測標記 測定。較佳地，標記為可催化發色受質（諸如3，3’-二胺基 聯苯胺發色團）之化學改變的酶標記（例如HRPO)。較佳 地，使酶標記與特異性結合一級抗體的抗體接合（例如， 一級抗體為兔多株抗體且二級抗體為山羊抗兔抗體)。 由此所製備之標本可固定且加裝蓋玻片。接著，例如使 用顯微鏡測定載片評估值，且可使用此項技術中常用的染 色強度標準。染色強度標準可如下評估： 表2 染色圖案 記分 細胞中未觀測到染色。 0 超過10%的細胞中偵測到微弱/依稀可辨的染色。 1+ 超過10%的細胞中觀測到微弱至中度的染色。 2+ 超過10%的細胞中觀測到中度至強烈的染色。 3+ 通常，在IHC檢定中約2+或更高的染色圖案分數為診斷 性的及/或預後性的。在一些實施例中，約1 +或更高的染 色圖案分數為診斷性的及/或預後性的。在其他實施例 中，約3之更高染色圖案分數為診斷性的及/或預後性的。 應瞭解，當利用IHC檢測來自腫瘤或結腸腺瘤之細胞及/或 121444.doc -149- 200815467 組織時，通常測定或評估腫瘤細胞及/或組織中之染色（與 可能存在於樣本中之基質組織或周圍組織相反）。 其他檢定方法（稱為競爭性檢定或夾心檢定）已充分確立 且廣泛用於商業性診斷行業中。 競爭性檢定係依賴於示蹤劑DLL4類似物與測試樣本 DLL4競爭有限數目之抗-DLL4抗體抗原結合位點之能力。 在競爭之前或之後通常使抗-DLL4抗體不溶，且接著將與 抗-DLL4抗體結合之示蹤劑及DLL4與未結合之示蹤劑及 DLL4分離。此分離係藉由傾析（其中預先使結合搭配物不 溶）或離心（其中使使結合搭配物在競爭反應之後沈澱）來實 現。如由標記物質之量所量測，測試樣本DLL4之量與所 結合之示蹤劑之量成反比。用巳知量之DLL4製備劑量-反 應曲線，且與測試結果比較以定量測定測試樣本中所存在 之DLL4的量。當使用酶作為可偵測標記時，該等檢定稱 作ELISA系統。 稱作π同源”檢定之另一競爭性檢定無需相分離。此處， 製備且使用酶與DLL4之接合物以使得當抗-DLL4抗體與 DLL4結合時，抗-DLL4抗體之存在修飾酶活性。在此狀況 下，DLL4或其免疫活性片段經由雙官能有機橋與諸如過 氧化酶之酶接合。選擇用於抗_DLL4抗體的接合物以使得 抗-DLL4抗體之結合抑制或加強標記之酶活性。此方法本 身以EMIT之名稱廣泛實施。 空間接合物係用於同源檢定之空間位阻方法中。該等接 合物藉由使低分子量半抗原與小DLL4片段共價連接來合 121444.doc -150- 200815467 成，從而針對半抗原之抗體大體上不能與抗-DLL4抗體同 時結合該接合物。在此檢定程序下，存在於測試樣本中的 DLL4結合抗-DLL4抗體，由此容許抗-半抗原結合該接合 物，導致接合物半抗原之特徵改變，例如，當半抗原為螢 光團時螢光改變。 夾心檢定尤其適用於測定DLL4或抗-DLL4抗體。在依序 夾心檢定中，使用經固定之抗-DLL4抗體吸附測試樣本 DLL4，將測試樣本藉由洗滌移除，使用經結合之DLL4吸 ® 附第二標記抗-DLL4抗體，且接著將所結合之物質與殘餘 示蹤劑分離。所結合之示蹤劑之量與測試樣本DLL4成正 比。在”同時”夾心檢定中，在添加經標記之抗-DLL4之 前，不分離測試樣本。使用抗-DLL4單株抗體作為一種抗 體且使用多株抗-DLL4抗體作為另一種抗體之依序夾心檢 定適用於測試DLL4之樣本。 上文僅為針對DLL4之例示性偵測檢定。現今或將來所 開發使用抗-DLL4抗體測定DLL4的其他方法均包括於本發 ^ 明之範疇内，包括本文中所述之生物檢定。 製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防 及/或診斷上述病症之物質的製品。該製品包含一容器及 與該容器相關之標籤或内頁說明。適當容器包括例如瓶、 小瓶、注射器等。容器可由多種材料（諸如玻璃或塑料）形 成。容器容納單獨或當與另一組合物組合時有效治療、預 防及/或診斷病狀的組合物，且可具有無菌取藥孔（例如， 121444.doc -151 - 200815467 容菇可為靜脈内溶液包或具有可藉由皮下注射針頭刺透之 瓶塞的小瓶）。組合物中至少一種活性劑為本發明之抗 體。k戴或内頁§兒明書指示組合物係用於治療所選病狀， 諸如癌症。此外，製品可包含（a)内含組合物的第一容器， 其中該組合物包含本發明之抗體；及内含組合物的第二 谷器’其中該組合物包含另一治療劑，包括例如化學治療 劑或抗血管生成劑（包括例如抗-VEGF抗體（例如貝伐單 抗））。本發明之該實施例中的製品可進一步包含指示第一 _ 與第二抗體組合物可用於治療特定病狀（例如癌症）的内頁 說明書。或者或此外，該製品可進一步包含第二（或第三） 容器’該容器包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用 抑菌水（BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液（Ringer,s solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者 之觀點所需之其他物質，包括其他缓衝劑、稀釋劑、過渡 器、針頭及注射器。 鲁 以下為本發明之方法與組合物之實例。應瞭解，已知以 上所提供之一般性說明，可實施其他各種實施例。 實例 實例中所提及之市售試劑係根據製造商說明書使用，除 非另有說明。以下實例中及本說明書通篇由ATCC®寄存編 號鑑別之彼等細胞之來源為美國典型培養物保存中心 (American Type Culture Collection, Manassas，VA 20108) 〇 實例中所引用之參考文獻列舉於實例之後。本文中所引用 之全部參考文獻係以引用之方式併入本文中。 121444.doc -152- 200815467 實例1 :物質及方法 實例中使用以下物質及方法。 HUVEC纖維蛋白凝膠珠粒檢定。HUVEC纖維蛋白凝膠 珠粒檢定已有詳述（Nakatsu，Μ· N.等人，Mkrov似c及以66, 102-12 (2003))。簡言之，將Cytodex™ 3珠粒（Amersham Pharmacia Biotech)每珠粒塗上 350-400 個 HUVEC。將約 200顆塗有HUVEC之珠粒包埋於12孔組織培養板之一孔中 之纖維蛋白凝塊中。將8xl04個SF細胞塗鋪於凝塊頂端。 在第7天及第9天之間終止檢定以便免疫染色及造影。在一 些實驗中，HUVEC萌發藉由用生物素-抗-CD31(純系 WM5 9，eBioscience)及抗生蛋白鏈菌素-Cy3染色來顯現。 對於HUVEC核染色，將纖維蛋白凝膠固定於2%三聚甲醛 (PFA)中隔夜且用4’，6-二曱脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma) 染色。對於Ki67染色，將纖維蛋白凝膠用10X胰蛋白酶· EDTA處理5分鐘以移除頂層SF，用於PBS中之10% FBS中 和，且在4% PFA中固定隔夜。接著用於PBST中之10%山 羊血清將纖維蛋白凝膠阻斷4小時，與兔抗-小鼠Ki67(備 用，純系Sp6，Lab Vision) —起培育隔夜，繼而用抗-兔 IgG-Cy3(Jackson ImmunoResearch)進行二級摘測。所有隔 夜培育係在4°C下進行。 新生小鼠視網膜研究。在P1及P3時對來自同窩之新生 CD1小鼠腹膜内注射PBS或YW26.82(10 mg/kg)。P5時收集 眼，且用於PBS中之4% PFA固定隔夜。將切開之視網膜用 於PBST中之10%山羊血清阻斷3小時，接著與一級抗體一 121444.doc •153- 200815467 起培育隔夜。一級混合物包括生物素化同工凝集素B4(25 pg/ml，Bandeiraea simplicifolia ； Sigma)及以下物質中之 一者：於 PBLEC(1% Tdton X-100、0.1 mM CaCl2、0.1 mMMgCl2、0·lmMMnCl2，於PBS中，pH6·8)中具有10o/o 血清之兔抗小鼠Ki67(l:l，備用，純系Sp6，Lab Vision) 或小鼠 Cy3 接合之抗-a SMA( 1:2000，Sigma-Aldrich)。接 著將視網膜用PBST洗滌，且與Alexa Fluor® 488抗生蛋白 鏈菌素（1:200 ; Molecular Probes)與 Cy3-抗兔 IgG(l:200 ; Jackson ImmunoResearch)之二級抗體組合一起培育隔夜。 染色完成後，隨後將視網膜用於PBS中之4% PFA固定。所 有隔夜培育均在4 °C下進行。平坦固定之視網膜之影像係 經由共焦螢光顯微術獲得。 腫瘤模型。使用8週齡至10週齡米色雌性裸小鼠。為獲 得皮下腫瘤，將0.1 ml含有50%基質膠（BD Bioscience)之 細胞懸浮液注射入小鼠肋側右後部。將5χ 1〇6個人類結腸 癌HM7細胞、ΙΟχΙΟ6個人類結腸癌c〇l〇205細胞、ΙΟχΙΟ6 個人類肺癌Calu6細胞、ΙΟχΙΟ6個人類肺癌MV-522細胞、 1〇χ10ό個小鼠白血病WEHI-3細胞、ΙΟχΙΟ6個小鼠淋巴瘤 EL4細胞、ΙΟχΙΟ6個人類卵巢癌SK-OV-3 XI細胞、ΙΟχΙΟ6 個小鼠肺癌LL2細胞、l〇xl〇6個白血病/淋巴瘤EL4細胞或 1〇χ10ό個非小肺癌H1299細胞注射入各小鼠内。對於人類 黑素瘤MDA-MB_435模型，將0.1 ml含有50%基質膠之細 胞（5 X 106)懸浮液注射入小鼠乳腺脂墊内。經由腹膜内投與 抗-DLL4抗體YW26.82(10毫克/公斤體重，每週兩次）。對 121444.doc •154· 200815467 於以下腫瘤模型，使各測試小鼠接收植入在右肋側中之皮 下腫瘤塊（1 mm3) ··非小肺癌SKMES-1、人類乳癌MX-1、 人類結腸直腸癌SW620及人類腺癌LS174T。藉由測徑規量 測來量化腫瘤生長。藉由量測長度（/)及寬度…）且計算體 積（F=iw2/2)來測定腫瘤體積（mm3)。各組包括10至15隻動 物。使用雙尾學生t-測試對各治療組進行統計比較。 腫瘤血管標記及免疫組織化學。用異氟烷將小鼠麻醉。 靜脈内注射經FITC標記之番茄凝 集素（150 pg於 150 μΐ之 0.9% NaCl 中；Vector Laboratories) 且在全身性灌注之前讓其循環5分鐘。用於PBS中之1% PFA經賁門灌注脈管系統3分鐘。移除腫瘤且隨後藉由在相 同固定劑内浸沒2小時而加以固定，繼而在30%蔗糖中培 育隔夜以防凍，接著包埋入OCT中。將切片（4 μιη厚）用抗-小鼠 CD31(1:50，BD Pharmingen)染色，繼而用 Alexa 594 山羊抗-大鼠 IgG(l:800，Molecular Probes)染色。 小鼠腸之組織學及免疫組織化學。將經福馬林固定且經 石蠟包埋之小鼠小腸組織切為3 μπι厚之切片。按照製造商 (PolyScientific)建議，用阿爾新藍（Alcian blue)執行腸細胞 類型之組織化學鑑別。對於抗-Ki67染色，將切片用標靶 修補溶液（S1700，DAKO)預處理且與兔抗_Ki67(l:200，純 系 SP6，Neomarkers)— 起培育。用 Vectastain ABC Elite套 組（Vector labs)偵測 7.5 g/rnl 之二級山羊抗·兔（Vector labs)。將所有經Ki67染色之切片用Mayer之蘇木素 (hematoxylin)複染色。對於HES-1染色，相繼使用抗-大鼠 121444.doc -155 - 200815467 HES-1(純系 NMl，MBL，International)及 TSA-HRP。 RNA干涉。自Dharmacon購買把向人類DLL4之 SMARTpool小干涉RNA(siRNA)雙鏈體及81對照非靶向 siRNA #2。使用 OptiMEM-1® 及 Lipfectamine™ 2000 (Invitrogen)以 40%融合之HUVEC執行 siRNR雙鏈體（50 nM) 之轉染。siRNA轉染後48小時，進行FACS分析。4種抗-DLL4 SMART池siRNA之序列係如下： CAACTGCCCTTATGGCTTTTT(SEQ ID NO:62)(寡核苷 _ 酸1，有義）， AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT(SEQ ID NO:63)(寡核苷 酸1，反義）， CAACTGCCCTTCAATTTCATT(SEQ ID NO:64)(寡核苷 酸2，有義）， TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT(SEQ ID NO:65)(寡核苷 酸2，反義）， TGACCAAGATCTCAACTACTT(SEQ ID NO:66)(募核苷 酸3，有義）， GTAGTTGAGATCTTGGTCATT(SEQ ID NO:67)(募核苷 酸3，反義）， GGCCAACTATGCTTGTGAATT(SEQ ID NO:68)(寡核苷 酸4，有義）， TTCACAAGCATAGTTGGCCTT(SEQ ID NO:69)(寡核苷 酸4，反義）。

Notch配體：Notch阻斷ELISA。用0.5 pg/ml之重組大鼠 121444.doc -156- 200815467

Notchl_Fc(rrNotchl-Fc，R & D Systems)塗覆 96 孔微量滴 定板。檢定中使用含有DLL4-AP(與人類胎盤驗性填酸酶 融合之DLL4之胺基酸1-404)的條件培養基。為製備條件培 養基，以 Fugen6試劑（Roche Molecular Biochemicals)用表 現DLL4-AP之質體瞬間轉染293細胞。轉染後五天，收集 條件培養基，過濾且在4°C下儲存。將由0.15 pg/ml滴定為 25 pg/ml之純化抗體在室溫下與DLL4-AP條件培養基（賦予 與所塗rrNotchl-Fc最大可實現結合之50%的稀釋度）一起預 培育1小時。接著將抗體/DLL4-AP混合物在室溫下添加至 塗有rrNotchl-Fc之板中歷時1小時，其後將板於PBS中洗 滌數次。使用1步PNPP(Pierce)作為受質以及OD 405 nm吸 光率量測偵測所結合之DLL4-AP。用DLL1-AP(人類 DLL1，胺基酸1-445)執行相同檢定。用經純化之DLL4-His (C-末端經His標記之人類DLL4，胺基酸1-404)及Jagl· His(R & D system)進行類似檢定。用小鼠抗-His mAb(l |ig/ml，Roche Molecular Biochemicals)、生物素化山羊抗-小鼠（Jackson ImmunoResearch)及抗生蛋白鏈菌素-AP (Jackson ImmunoResearch)债測所結合之經His標記之配 體。 RNA提取及即時定量RT-PCR。使用RNeasy® Mini套組 (Qiagen)、根據製造商說明書自2-D培養物中之HUVEC中 提取總RNA。為自培養於纖維蛋白凝膠中之HUVEC中提 取總RNA，將纖維蛋白凝膠用10X胰蛋白酶-EDTA(Gibco) 處理5分鐘以移除頂層纖維母細胞，繼而用於PBS中之10% FBS中和。接著將凝膠塊自組織培養孔中移除且於微管中 121444.doc -157- 200815467 經受離心作用（10K歷時5分鐘）以移除過量流體。將所得凝 膠’’小球”用溶解缓衝液（RNeasy® Mini套組）溶解，且如同 於2-D培養物中之HUVEC—樣進一步處理。使用RNA 6000 奈米晶片及 Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies) 評估RNA品質。使用7500即時PCR系統（Applied Biosystems)三重複進行即時定量RT-PCR反應。使用人類 GAPDH作為正規化之參考基因。表現量係表示為相對於 對照3次獨立測定mRNA變化之平均（土SEM)倍數。 VEGFR2、TGF02及GAPDH之前置弓1子及反置引子及探針 序列係如下： TGFb2 前置引子·· GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TA(SEQ ID NO:70) 反置弓丨子：CAT CAT CAT TAT CAT CAT CAT TGT C(SEQ ID NO:71) 探針：AAT TCT TGG AAA AGT GGC AAG ACC AAA AT(SEQ ID NO:72) VEGFR2 前置引子：CTT TCC ACC AGC AGG AAG TAG(SEQ ID NO:73) 反置弓j 子：TGC AGT CCG AGG TCC TTT(SEQ ID NO:74) 探針：CGC ATT TGA TTT TCA TTT CGA CAA CAG A(SEQ ID NO:75) 121444.doc -158- 200815467

GAPDH 前置引子：GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC(SEQ ID NO:76) 反置引子：GAA GGT GAA GGT CGG AGT C(SEQ ID NO:77) 探針：CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC(SEQ ID NO:78) 實例2 :產生噬菌體抗-DLL4抗體 ® 藉由在重鏈及輕鏈之互補判定區（CDR)内引入多樣性來 基於單一框架（人源化抗-ErbB2抗體，4D5)建立合成噬菌 體抗體文庫（Lee，C. V·等人，J Mo/ 价〇/ 340，1073-93 (2004) ; Liang，W. C.等人，J C/zem 281，951-61 (2006))。用單純文庫針對固定於]^3义丨8〇印很免疫滴定板上 之經His標記之人類DLL4(胺基酸1·404)執行滴定板篩選。 四輪富集後，隨機選取純系且使用噬菌體ELIS Α鑑別特異 性結合物。將所得hDLL4結合純系用經His標記之鼠DLL4 蛋白進一步篩檢以鑑別交叉物種純系。對於各陽性噬菌體 純系，將重鏈及輕鏈之可變區次選殖入經工程化設計以表 現全長IgG鏈的pRK表現載體中。將重鏈及輕鏈構築體共 同轉染入293或CHO細胞内，且使用蛋白A親和層析柱自無 血清培養基中純化所表現之抗體。由ELISA就阻斷DLL4與 大鼠Notchl-Fc之間的相互作用，且由FACS就與表現全長 人類DLL4或鼠DLL4之穩定細胞株的結合測試純化抗體。 對於親和力成熟，可藉由溫和隨機化策略建構具有源自所 121444.doc -159- 200815467 關注之初始純系之CDR環（CDR-L3、CDR-H1及CDR-H2)之 三種不同組合的噬菌體文庫，以便使各所選位置突變為非 野生型殘基或以約50··50之頻率維持為野生型（Liang等人， 2006，同上）。接著經由四輪以逐漸增加之嚴謹性針對經 His標記之人類及鼠DLL4蛋白的溶液相篩選鑑別高親和力 純系。 實例3 ··抗-DLL4抗體之表徵 為測定抗-DLL4 Mab之結合親和力，使用則八⑶代™· 3000(BIAcore，Inc·，Piscataway，NJ)量測表面電漿共振 (SRP)。簡言之，根據供應商說明書，將羧甲基化葡聚糖 生物感應器晶片（CM5，BIAcore Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲 基胺基丙基）-碳化二醯亞胺鹽酸鹽（EDC)及N-羥基丁二醯 亞胺（NHS)活化。將抗-DLL4抗體用10 mM乙酸鈉（pH 4.8) 稀釋為5 pg/ml，再以5微升/分鐘之流速注入以獲得約500 個偶合抗體之反應單元（RU)。接著，注入1 Μ乙醇胺以阻 斷未反應基團。對於動力學量測，在25°C下以25 μΐ/min之 流速將人類或鼠DLL4_His分子之兩倍連續稀釋液（0·7 nM 至500 nM)注入具有〇·〇5〇/。Tween™ 20之PBS中。使用簡單 的一比一朗缪爾（Langmuir)結合模型（BIAcore Evaluation Software 3·2版）計算結合速率（kon)及解離速率（koff)。平 衡解離常數（Kd)計為比率koff/kon。此實驗之結果展示於 表3中。抗體YW26.81對人類DLL4與鼠DLL4展現類似的Kd 值（Kd值分別為〇丨nM及0·09 nM)，從而能夠以小鼠模型評 估0 121444.doc -160- 200815467 表3 :抗-DLL4抗體與人類DLL4及小鼠DLL4之結合親和 力及動力學參數。"NA”表示未執行量測。 純系 鼠 M(ECD5.5) 人類 M(ECD5.5) kon/105 kofflO'4 Kd(nM) kon/105 kofm〇 厂 Kd(nM) YW26 0.57 16 28 0.3 7.4 25 YW26.6 4.1 0.61 0.15 2 0.49 0.25 YW26.14 3.3 0.73 0.22 1.8 0.66 0.37 YW26.20 3.3 1 0.3 1.7 0.79 0.46 YW26.34 3.6 0.65 0.18 1.9 0.67 ^1 0.35 YW26.82 5.4 0.46 0.09 2.4 0.37 0.15 實例4 :抗-DLL4抗體之進一步表徵 抗-DLL4 Mab YW26.82之抗原決定基定位：抗-DLL4 1^&6 26.82識別存在於人類〇1^4胞外域口€〇)之第2個£0卞 樣重複（EGL2)中的結合決定子。EGL2包含人類DLL4 ECD 之胺基酸252-282。簡言之，使DLL4 ECD突變體表現為鹼 性磷酸酶融合蛋白且與所評估之抗體結合。圖11a展示一 組表現為C-末端人類胎盤鹼性磷酸酶（AP)融合蛋白之 DLL4突變體的示意圖。括號指示融合蛋白中所包括之 DLL4序列。於塗有經純化之抗-DLL4 Mab(YW26.82，0.5 pg/ml)之96孔微量滴定板上測試含有融合蛋白之293T細胞 條件培養基。使用1步PNPP(Pierce)作為受質以及OD 405 nm吸光率量測偵測所結合之DLL4.AP。Mab YW26.82結合 包含DLL4 EGL2域之構築體而不結合缺少DLL4 EGL2域之 構築體。此證明抗-DLL4 Mab YW 26.82識別人類DLL4 ECD之EGL2域中的抗原決定基。

Mab YW26.82選擇性結合小鼠DLL4及人類DLL4。將96 孔Nunc Maxisorp板用所示經純化之重組蛋白（1 pg/ml)塗 121444.doc -161 - 200815467 覆。藉由ELISA檢定量測YW26.82在所示濃度下之結合。 使用TMB作為受質及OD 450 nm吸光率量測，用抗人類抗 體HRP接合物偵測所結合之抗體。使用抗-HER2及重組 ErbB2-ECD作為檢定對照（圖lib)。此實驗之結果展示於圖 11b中。Mab YW26.82結合人類DLL4及小鼠DLL4，且不與 人類DLL1及人類JAG1可偵測結合。該等結果證明Mab YW26.82選擇性結合DLL4。 對經載體，、全長DLL4、Jagl或DLL1瞬間轉染之293細胞 的FACS分析亦證明，Mab YW26.82選擇性結合DLL4。如 圖11c中所示，僅在經DLL4轉染之細胞上偵測到YW26.82 之顯著結合（上圖）。在經DLL1或Jagl轉染之細胞上未偵測 到顯著結合。Jagl及DLL1之表現分別由重組大鼠Notchl-Fc(rrNotchl-Fc ^ 中圖）及重組.大鼠 Notch2-Fc(rrNotch2-Fc，下圖）之結合證實。以2 pg/ml之濃度使用YW26.82、 rrNotchl-Fc 或 rrNotch2-Fc(R & D system)，繼而使用山羊 抗人類 IgG-PE(l:500，Jackson ImmunoResearch) 〇 競爭實驗證明，Mab YW26.82可有效且選擇性阻斷 Notch與DLL4而非其他Notch配體之相互作用。如圖lid中 所示，抗-DLL4 Mab以約12 nM之IC50計算值阻斷DLL4-AP而非DLL1-AP與所塗rNotchl之結合（左圖）。抗-DLL4 Mab以約8 nM之IC50計算值阻斷DLL4-His而非Jagl-His與 所塗rNotchl之結合（右圖）。 抗-DLL4 Mab YW26.82在人類臍靜脈内皮細胞（HUVEC) 中特異性結合内源性表現的DLL4。對經對照或DLL4-特異 121444.doc -162- 200815467 性siRNA轉染的HUVEC進行FACS分析。以2 pg/ml之濃度 使用YW26.82，繼而使用山羊抗-人類IgG-PE(l:500 ’ Jackson ImmunoResearch)。此實驗之結果展示於圖lie 中。對未經轉染之HUVEC(對照）及經對照siRNA轉染之 HUVEC觀察結合。相比之下，在經DLL4 siRNA轉染之 HUVEC中結合顯著降低。該等實驗證明，抗-DLL4 Mab YW26.82在HUVEC中特異性結合内源性表現的DLL4。 實例5 :用抗-DLL4抗體治療增強内皮細胞活體外增殖 於纖維蛋白凝膠中在共同培養之人類皮膚纖維母細胞 (SF)存在下生長之人類臍靜脈内皮細胞（HUVEC)產生具有 明顯内腔樣結構之芽（Nakatsu，Μ· N·等人，Microvasc Res 66，102-12 (2003))。添加抗-DLL4 抗體 YW26.82 明顯增加 芽之長度及數量（圖7a)。由蛋白質複合物之γ-分泌酶活性 催化之Notch之蛋白水解加工為Notch活化期間的必需步驟 (Baron, M. Semin Cell Dev Biol 14, 113-9(2003)) 〇 ^ ^ ^ 是，γ-分泌酶抑制劑二苯并氮呼（DBZ)(van Es，J. H.等人， Nature 435，959-63 (2005) ; Milano，J·等人，SW 82, 341-5 8 (2004))對HUVEC萌發具有相同的效應。就該等 兩種處理之不同機制而言，萌發增強無疑應歸因於Notch 信號轉導之減弱。Ki67染色揭示，EC萌發增強係歸因於細 胞增殖增強（圖7b)。在初始纖維蛋白凝膠檢定中，HUVEC 萌發及隨後的内腔形成係由共同培養之SF細胞支持。用條 件培養基置換SF細胞後，抗-DLL4 Mab與DBZ仍能夠增強 HUVEC萌發（圖1c)，證明DLL4/Notch信號轉導之EC自主 121444.doc -163- 200815467 作用。在反向實驗中，用固定之DLL4蛋白使Notch活化導 致顯著的生長抑制（圖7e)。該等發現結果提示， DLL4/Notch信號轉導之活化狀態與EC增殖緊密相關。 實例6 :用抗-DLL4抗體治療增強内皮細胞活體内增殖 早期產後小鼠以明確的事件順序產生立體血管圖案 (Stone, J.^Dreher, Z. J Comp Neurol 255, 35-49 (1987)； Gerhardt，H.等人，Ce" 161，1163-77 (2003);

Fruttiger，M. invest Op/zi/za/mo/ 43，522-7 (2002))。 新生視網膜中生長中之EC中DLL4之顯性及動態表現提示 DLL4調控視網膜血管發育的可能作用（Claxton，S.及 Fruttiger，M. Gene Expr 似 5， 123-7 (2004))。 YW26.82之全身性傳遞使得視網膜脈管系統完全改變。EC 之大量積聚發生於視網膜中，從而產生具有原始血管形態 之片樣結構（圖7d)。觀察到EC中Ki67標記顯著增加，此指 示EC增殖1增強（圖7h)。因此，在新生小鼠中阻斷DLL4後 視網膜EC之過度增殖表型證實活體外觀察結果。 實例7 : DLL4/Notch在調控上皮細胞增殖中之必要作用 VEGF控制EC之若干基本方面（Ferrara，见五B，209-31 (2005) ； Coultas，L. f A Nature 438，937-45 (2005))。然 而，對於VEGF信號轉導如何併入複雜的血管過程（諸如動 靜脈（AV)分化及分級血管組織化，明顯需要其他高度協同 之信號轉導途徑的事件）卻知之甚少。在斑馬魚（zebra fish) 中進行之遺傳學研究提示，VEGF在動脈内皮分化期間作 用於Notch途徑之上游（Lawson，N· D·等人，Deve/opm⑼ί 121444.doc -164- 200815467 128，3675-83 (2001))。吾人發現，VEGF 剌激 HUVEC 使得 DLL4之表面表現增強（資料未展示），此符合近期關於 DLL4 mRNA受到VEGF剌激上調的報導（Patel，N. S.等人， 65，8690-7 (2005))。有趣的是，01^4自身在 Notch活化後上調（圖12)，其提示存在DLL4藉以有效向 Notch途徑傳遞VEGF信號之正反饋機制。簡言之，HUVEC 在DBZ(0.08 μΜ)不存在或存在之情況下由經固定之C-末端 經His標記之人類DLL4(胺基酸1-404)激發。激發後36小 時，用抗-DLL4抗體經由FACS分析檢測内源性DLL4表 現。 顯然，由阻斷Notch信號轉導引起之EC之過度增殖仍依 賴於VEGF。在3-D纖維蛋白凝膠培養物中，用抗-VEGF Mab處理消除大部分EC在DBZ存在或不存在情況下之萌發 (圖7f)，增加了過度增殖行為可部分歸因於VEGF信號轉導 增強的可能性。實際上，由YW26.82或DBZ阻斷Notch使得 VEGFR2上調（圖7g)。反之，由固定之DLL4活化Notch抑制 VEGFR2之表現（圖7g)。因此，儘管VEGF可作用於 DLL4/Notch途徑之上游，但DLL4/Notch能夠經由負調控 VEGFR2表現細調反應。 實例8 :用抗_DLL4抗艎治療阻斷内皮細胞分化且阻斷 動脈發育 除EC增殖增強外，拮抗DLL4/Notch使得纖維蛋白凝膠 中的EC芽產生顯著的形態變化。多細胞内腔樣結構大都不 存在（圖8a)，提示存在缺陷型EC分化。在經Mab YW26·82 121444.doc -165- 200815467 處理之視網膜中，放射狀交錯之動脈及靜脈之特徵圖案受 到嚴重破壞。抗-α平滑肌肌動蛋白（ASMA)染色（其與視網 膜動脈相關）完全不存在（圖8c)。此觀測結果與DLL4+/-胚 胎中缺陷型動脈發育明顯類似。該等發現結果從不同角度 強調DLL4/Notch在調控EC分化中的必要作用。 實例9 : TFGP表現與Notch之活化狀態有關 與Notch途徑相似，TGFp信號轉導為環境依賴性的且對 細胞分化、增殖及生長抑制具有不同效應且通常為相反之 效應。此外，TGF0途徑與血管過程相關（Urness，L. D·等 人，Gm以 26，328-31 (2000) ; Oshima，M.等人，Dev 5zo/ 179，297-302 (1996) ; Larsson，J·等人，20, 1663-73 (2001))。舉例而言，缺乏活化素（Activin)受體樣 激酶1(ALK1)(—種EC特異性I型TGFp受體）產生卵黃囊中 之原始EC網路及動靜脈功能失調（AVM)(—種具有缺陷型 Notch信號轉導之小鼠所共有之表型）(Urness，L. D.等人， Nat Genet 26, 328-31 (2000) ; Iso Τ·等人，drierzosc/er Thromb 23，543-53 (2003))。此引導吾人研究該 等兩條途徑之間的可能聯繫。吾人發現TGFp2之表現（圖 8b)與Notch之活化狀態緊密相關，提示TGFP途徑可作用於 Notch途徑之下游。總之，吾人之發現結果支持其中充當 ’’信號轉導路由器"之DLL4/Notch轴經由調控DLL4表現來 整合VEGF信號轉導且與TGFP途徑接合以促進EC分化的模 型。 實例10:用抗-DLL4抗體治療活體内抑制腫瘤生長 121444.doc -166- 200815467 為直接說明DLL4/Notch信號轉導在腫瘤血管生成期間的 可能作用，吾人用臨床前腫瘤模型研究阻斷DLL4對腫瘤 生長的影響（圖9a-9d)。在HM7、C〇1〇205及Calu6異種移植 腫瘤模型中（圖9a-9c)，YW26.82處理在腫瘤形成（腫瘤尺寸 之250 mm3)後開始。在所有三個模型中，對照組與治療組 之間生長速率的差異在給藥後三天變得明顯。治療組之腫 瘤體積經兩週治療保持不變。除皮下腫瘤外，抗-DLL4 Mab亦抑制小鼠乳腺脂肪墊中之腫瘤生長。在MDA-MB-435腫瘤模型中，在腫瘤細胞注射後14天開始治療。對照 組與治療組之間腫瘤生長曲線的差異在給藥六天内明顯， 且隨著治療繼續而變得曰益顯著（圖9d)。 吾人亦用臨床前腫瘤模型研究阻斷‘DLL4及/或VEGF對多 種腫瘤生長的影響（圖9e-9f ; 9i_9p)。在MV-522及WEHI3 異種移植腫瘤模型中，YW26.82治療及/或抗-VEGF治療在 腫瘤形成（腫瘤尺寸2250 mm3)後開始。在MV-522模型中， 丫界26.82與抗-\^£0卩治療均單獨抑制腫瘤生長，但兩種治 療之組合最有效。在WEHI3模型中，抗-VEGF治療表明對 腫瘤生長無效，而用YW26.82治療表明可明顯抑制腫瘤生 長。在 SK-OV-3X1、LL2、EL4、H1299、SKMES-1、MX-1、SW620及LS174T模型中，在腫瘤形成後投與YW26.82 治療劑（5 mg/kg，IP，每週兩次）及/或抗- VEGF治療劑（5 mg/kg，IP，每週兩次）。在該等各模型中，單獨YW26.82 治療抑制腫瘤生長。此外，在對組合進行測試之該等所有 模型中，YW26.82與抗-VEGF之組合展現增強的功效。 121444.doc -167- 200815467 實例11 :用抗-DLL4抗體治療增強腫瘤内皮細胞增殖 對於腫瘤生長抑制，吾人使用EL4小鼠淋巴瘤腫瘤模型 進行血管組織學研究。吾人發現抗-DLL4 Mab治療使内皮 細胞密度顯著增加（圖9g)。相比之下，抗_VEGF具有完全 相反的效應（圖9g)，儘管在此模型中，兩種治療均展現類 似功效。 實例12 ··用抗-0乙14抗體治療抑制腫瘤血管灌注 由於活體外阻斷DLL4/Notch途徑使得EC形成内腔樣結 構削弱（圖8a)，因此研究用抗-DLL4 Mab治療是否會產生 類似腫瘤脈管系統缺陷且影響血液有效流動。用FITC-凝 集素全身性灌注揭示抗-DLL4 Mab治療使得腫瘤血管之凝 集素標記明顯減少（圖9h)。顯然，已證明ALK1缺陷型小鼠 之動靜脈功能失調導致血液循環異常（Urness，L. D.等人， Ge⑽ί 26，328-31 (2000))。鐾於DLL4/Notch信號轉導 在AV分化中的關鍵作用，在胚胎與早期產後視網膜中， 抗-DLL4 Mab均會影響腫瘤EC之細胞命運特化且產生定向 缺陷性血液流動。實際上，在經抗-DLL4 Mab治療之 C〇1〇205腫瘤中存在其中高EC密度與活腫瘤細胞之低含量 相關的區域，其暗示血管功能不良。需要其他利用血管造 影技術之研究以洞察精確的血管缺陷。 實例13 : DLL4/Notch在小鼠腸之體内平衡中並非必需 鑒於Notch信號轉導在調控產後自我更新系統之體内平 衡中的多效性作用，對全面抑制Notch之主要擔心為其可 能有害。舉例而言，Notch信號轉導為維持腸中未分化隱 121444.doc -168 - 200815467 窩細胞所需（van Es，J· Η·等人，iVaare 435，959-63 (2005) ; Fre，S·等人，435，964-8 (2005))。實際 上，在齧齒動物中不加區別地阻斷所有Notch活性之γ-分 泌酶抑制劑由於隱窩腔内杯狀細胞之大量增加而產生不當 副作用（Milano，J·等人，Tbjdco/ 5W 82，341-58 (2004); Wong，G· Τ·等人，C/zem 279，12876-82 (2004))。吾 人藉由免疫組織化學分析檢查經抗-DLL4 Mab治療之小鼠 之小腸。與D B Z治療相比’治療六週後在抗》- D L L 4 M ab組 與對照組之間未鑑別出上皮隱窩細胞分化或增殖概況之差 異（圖10)。此外，抗-DLL4 Mab不改變快速分裂轉運擴增 (TA)群體中Notch靶基因HES-1之表現（圖10)。該等結果支 持DLL4/Notch信號轉導主要侷限於血管系統之觀點。 實例14:用抗-DLL4抗艘治療不影響成體視網膜脈管 系統 儘管阻斷DLL4對新生小鼠之視網膜血管發育具有深刻 的影響，但投與抗-DLL4抗體對成體視網膜脈管系統無明 顯影響（圖8d)。因此，DLL4/Notch信號轉導在、活躍血管生 成期間至關重要，但在正常企管維持中僅起不太重要的作 用。與此觀點一致，在抗-DLL4 Mab治療期間，在具有腫 瘤之小鼠（長達8週每週兩次給藥10 mg/kg)中未觀察到可見 重量下降或動物死亡。在腫瘤模型中，抗-DLL4 Mab及抗-VEGF對腫瘤脈管系統展現相反效應，提示存在不重疊之 作用機制。 儘管為清晰瞭解起見，本發明已於上文中以說明及實例 121444.doc -169- 200815467 之方式加以詳細描述，但該等描述及實例不應理解為限制 本發明之範轉。 【圖式簡單說明】

圖la、lb :抗-DLL4抗體之重鏈及輕鏈HVR環序列。該 荨圖式展示Hi、H2及H3重鍵HVR序列以及LI、L2及L3輕 鏈HVR序列。序列編號係如下：純系i52.26(HVR-H1為 SEQ ID NO:l ; HVR-H2為 SEQ ID NO:3 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:9 ; HVR-L1 為 SEQ ID NO:10 ; HVR-L2 為 SEQ ID NChll ; HVR-L3為 SEQ ID NO:12);純系 152.26.6(HVR-H1 為 SEQ ID NO:l ; HVR-H2為 SEQ ID NO:4 ; HVR-H3為 SEQ ID NO:9 ; HVR-L1 為 SEQ ID NO:10 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:ll ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:13);純系 152.26.14(HVR-H1 為 SEQ ID ΝΟ··2 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:3 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:9 ; HVR-L1 為 SEQ ID ΝΟΠΟ ; HVR-L2為 SEQ ID NO:ll ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:14);純系 152.26.20(HVR-H1 為 SEQ ID NO:l ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:5 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:9 ; HVR-L1 為 SEQ ID NO:1〇 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:ll ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:15);純系 152.26.34(HVR-H1 為 SEQ ID NO:l ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:6 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:9 ; HVR-li 為 SEQ ID NO:1〇 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:ll ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:16);純系 152.26.40(HVR-H1 為 SEQ ID NO:l ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:7 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:9 ; HVlLl 為 SEQ ID N〇:l〇 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:ll ; HVR-L3 為 SEQ ID 121444.doc •170· 200815467 NO:17);及純系 152.26.82(HVR-H1 為 SEQ ID ΝΟ:1 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:8 ; HVR-H3為 SEQ ID NO:9 ; HVR-L1 為 SEQ ID NO:10 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:ll ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:18) 〇 胺基酸位置按照如下所述之Kabat編號系統編號。 圖2及3描繪用於實施本發明之具有如下序列標識符之例 示性受體人類一致框架序列： 重鏈可變區（VH)—致框架（圖2a、2b) _ 欠缺Kabat CDR之人類VH第I子群一致框架（SEQ ID NO: 19) 欠缺擴展之高變區之人類VH第I子群一致框架（SEQ ID NO:20-22) 欠缺Kabat CDR之人類VH第II子群一致框架（SEQ ID NO:23) 欠缺擴展之高變區之人類VH第II子群一致框架（SEQ ID ΝΟ:24·26) 欠缺擴展之人類VH第II子群一致框架 欠缺Kabat CDR之人類VH第III子群一致框架（SEQ ID NO:27) 欠缺擴展之高變區之人類VH第III子群一致框架（SEQ ID NO:28-30) 欠缺Kabat CDR之人類VH受體框架（SEQ ID NO:31) 欠缺擴展之高變區之人類VH受體框架（SEQ ID NO:32-33) 欠缺Kabat CDR之人類VH受體2框架（SEQ ID NO:34) 欠缺擴展之高變區之人類VH受體2框架（SEQ ID NO:35_37) 121444.doc -171 - 200815467 輕鏈可變區（VL) —致框架（圖3) 人類VL κ第I子群一致框架（SEQ ID NO:38) 人類VL κ第II子群一致框架（SEQ ID NO:39) 人類VL κ第III子群一致框架（SEQ ID NO:40) 人類VL κ第IV子群一致框架（SEQ ID NO:41) 圖4 ··描繪huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之框架區序列。上 標/粗體編號指示根據Kabat之胺基酸位置。 圖5描繪huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之經修飾/變異體框架 區序列。上標/粗體編號指示根據Kabat之胺基酸位置。 圖6描繪抗體純系26.20、26.14及26.82之重鏈可變區及 輕鍵可變區。 圖7DLL4介導之NotcM言號轉導調控EC增殖。a-c、f ··於 3-D纖維蛋白凝膠中之HUVEC萌發檢定。抗-DLL4抗體 (YW26.82)或DBZ促進HUVEC萌發（a)。Ki67染色展示抗-DLL4抗體或DBZ使得HUVEC過度增殖（b) 〇在SF條件培養 基存在下，抗-DLL4抗體或DBZ增強HUVEC之萌發（c)。 d、h ··全身性傳遞抗-DLL4抗體使得EC在新生兒視網膜中 大量累積。低倍放大（上圖）及高倍放大（下圖）視網膜維管 結構（同位凝集素染色）之共焦影像（d)。Ki67染色展示經 抗-DLL4抗體治療之新生兒視網膜中EC增殖增強（h)。e : 用經固定之DLL4活化Notch可抑制HUVEC增殖。f :在 DBZ存在或不存在之情況下，抗-VEGF抗體抑制HUVEC萌 發。g ·· Notch對VEGFR2之調控。定量PCR分析回應以下 各情況之VEGFR2表現：抗-DLL4抗體或DBZ對HUVEC之 121444.doc -172 - 200815467 3-D纖維蛋白凝膠培養物中（7天）Notch之阻斷（左圖），或經 固定之DLL4對HUVEC之2-D培養物中（36小時）Notch之活 化（右圖）。抗-DLL4抗體及DBZ分別以5 pg/ml及0.08 μΜ使 用（a-c、e-g)。 圖8DLL4介導之Notch信號轉導調控EC分化。a ··在抗-DLL4抗體或DBZ存在下，由生長於纖維蛋白凝膠中之 HUVEC所形成的内腔樣結構（白色箭頭）消失。取而代之的 是，管腔堆滿大量的細胞（黑色箭頭）。b : Notch對TGFp2 之調控。定量PCR分析回應以下各情況之TGFP2表現：抗-DLL4抗體或DBZ對HUVEC之3-D纖維蛋白凝膠培養物中（7 天）Notch之阻斷（左圖），或經固定之DLL4對HUVEC之2-D 培養物中（36小時）Notch之活化（右圖）。c ··抗-DLL4抗體阻 斷動脈發育。經α平滑肌肌動蛋白（ASMA)及同位凝集素染 色之新生小鼠視網膜之共焦影像。如圖Id中所述處理新生 小鼠。d :經ASMA及同位凝集素染色之成年小鼠視網膜之 共焦影像。將8週齡小鼠用PBS或抗-DLL4抗體（10 mg/kg， 每週兩次）處理兩週。 圖9選擇性阻斷DLL4及/或VEGF可中斷腫瘤血管生成且 抑制腫瘤生長。a-f ··腫瘤模型HM7(a)、Colo205(b)、 Calu6(c)、MDA-MB-435(d)、MV-522(e)及 WEHI3(f)之結 果。呈示SE之平均腫瘤體積。g-h ··腫瘤血管組織學研 究。對來自對照、抗_DLL4抗體及抗-VEGF處理之小鼠之 EL4腫瘤切片的抗-CD3 1進行免疫組織化學研究（g)。EL4 腫瘤切片中之凝集素灌注及抗-CD3 1染色（h)。i-p :腫瘤模 121444.doc -173 - 200815467 型 SK-OV-3Xl(i)、LL2(j)、EL4(k)、H1299(l)、SKMES-l(m)、MX-l(n)、SW620(〇)及 LS174T(p)之結果。 圖10DLL4/Notch對於小鼠腸之内環境穩定並非必要。對 來自對照（a、d、g、j)、抗-DLL4抗體（10 mg/kg，6週每週 兩次）（b、e、h、k)及 DBZ(30 μιηοΐ/kg，5 天每天 1 次）（c、 f、i、1)處理之小鼠之小腸進行免疫組織化學研究。如由 H&E 染色（a、b、c)及阿爾新藍（Alcian blue)染色（d、e、f) 所示，DBZ使得ΤΑ群體被杯狀細胞置換。此變化經抗-DLL4抗體處理後完全不存在。Ki67(g、h、i)及HES-l(j、 k、1)染色進一步證明抗-DLL4抗體未能重現DBZ之效應。 圖11抗-DLL4抗體之表徵。a :抗-DLL4抗體單株抗體 (Mab)YW26.82之抗原決定基圖譜。以C-末端人類胎盤鹼 性磷酸酶（AP)融合蛋白形式表現之一組DLL4突變體之示 意圖。在塗有經純化之抗-DLL4抗體（YW26.82，0.5 pg/ml)之96孔微量滴定板上對含有該等融合蛋白之293T細 胞條件培養基進行測試。使用1步PNPP(Pierce)作為受質以 及OD 405 nm吸光率量測偵測所結合之DLL4.AP。b-d : YW26.82與DLL4之選擇性結合。用所示經純化之重組蛋白 質（1 pg/ml)塗覆 96 孔 Nunc MaxiSorpT!^&。藉由ELISA 檢定 量測YW26.82在所示濃度下之結合。使用TMB作為受質及 OD 450 nm吸光率量測，用抗人類抗體HRP接合物偵測所 結合之抗體。使用抗-HER2及重組ErbB2-ECD作為檢定對 照（b)。對用載體、全長DLL4、Jagl或DLL1瞬間轉染之 293細胞進行FACS分析。YW26.82之明顯結合僅在經DLL4 121444.doc -174- 200815467

轉染之細胞上偵測到（上圖）。Jagl及DLL1之表現可分別藉 由重組大鼠Notchl-Fc(rrNotchl-Fc，中圖）及重組大鼠 Notch2-Fc(rrNotch2-Fc，下圖）之結合來證明。以 2 pg/ml 使用 YW26.82 、rrNotchl-Fc 或 rrNotch2-Fc(R & D system)，繼而使用山羊抗人類 IgG-PE(l :500，Jackson ImmunoResearch)(c)。抗-DLL4 抗體以約 12 nM 之計算值 IC50阻斷DLL4-AP，但不阻斷DLL1-AP與所塗rNotchl之結 合（左圖）。抗-DLL4抗體以約8 nM之計算值IC50阻斷 DLL4-His、但不阻斷Jagl-His與所塗rNotchl之結合（右 圖）(d)。e : YW26.82與内源性表現之DLL4之特異性結合。 對經對照或DLL4-特異性siRNA轉染之HUVEC的FACS分 析。以2 pg/ml使用YW26.82，繼而使用山羊抗人類4〇-PE(1:500，Jackson ImmunoResearch)(e) 〇 圖12Notch活化使DLL4上調。在DBZ不存在或存在之情 況下由經固定之C-末端His標記之人類DLL4(胺基酸1-404) 刺激HUVEC。剌激後36小時，用抗-DLL4抗體藉由FACS 分析來檢測内源性DLL4表現。 121444.doc 175- 200815467 序列表 <101〉美商建南德克公司 <120>抗>01^4抗體及其使用方法 <130> P2336R1 <140〉 096120430 <141〉2007/06/06 <150> l：S 60/811,349 <151〉2()()6善06 <I5()> l：S 60/811,357 <151> 2006-06-06 <150> US 60/B66 J67 <151> 2006-11-21 <150> IJS 60/866,772 <151> 2006-11-21

<160> 78 <210> I <21]> 10 <212> PRT <213>人工序列 <22()> <223〉抗體序列 <40()> 1

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Asn Trp lie Ser 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220〉 <223〉抗體序列 <4()()> 2 (ily Phc Scr Phc Arg Asp Asn Trp lie Ser 5 10

<2K)> 3 <2il> 18 <2I2> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>抗體序列 <40ϋ> 3

Gly Val lie Asn Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly <210〉 4 <21!> 18 <2I2> PRT 〈⑴〉人工序列 <22()> <223>抗體序列 <4()0> 4 (Ily Leu lie Asn Pro Gin Ser Gly Ser vSer Asp Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 121444.doc 200815467

VaJ Lys G!y <21()> 5 <211> 18 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>抗體序列 <400〉 5 (;ly Val lie Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Glu Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly <210〉 6 <21i> 18 <212〉m' <213>人工序列 <220> <223〉抗體序列

Gly Leu He Asn Pro Ί\η Ser Gly Ser Thr lie Tyr Ala Asp Ser I 5 10 15

Val Lys Gly <2I0> 7 <21l> 18 <212> PKT <2丨3>人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 7

Cilv Val Me Asn Ser lie Ser Gly Ala Thr Ala Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly <210> 8 <211> 18 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> 〈⑵〉抗體序列 <400> 8

Gly Tvr lie Scr Pro Asn Ser Gly Phe ITir Tyr Tyr Ala Asp Ser l 5 10 15

Val Lys Gly <210> 9 <21I> 15 <212> PRT <2!3>人工序列 <220〉 <223〉抗體序列 <400> 9

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr I 5 10 15 2- 121444.doc 200815467 <2!0> 10 <21l> 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220> 抗體序列 <400> !0

Ar« Ala Scr Gin Asp Val Ser Thr Ala V'al Ala

5 iO <2I()> Π <211> 7 <2I2> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 11

Scr Ala Scr Phc Ixu Tyr Ser

<21()> 12 <21i> 9 <212> PRT <2〗3>人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 12 (Iln Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr <210> 13 <21l> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 13 (iln Gin Ser Tyr Thr Gly Gin vSer ITir <210> 14 <21)> 9 <2\2> PRT <213〉人工序列 <22()> <223〉抗體序列 <40()> 14 (Πη Gin Ser Val Asn Gly Pro Ala Thr <210> 15 <21I> 9 <212〉 PRT <2 人工序列 <220> 〈切> 抗體序列 <400> 15 (iln Gin Scr Tyr Asn Gly Pro Ser Thr <2I0> 16 <211> 9 121444.doc 200815467

<212> PRT <213>人工序列 <220> <223>抗體序列 <4〇α> 16

Gin Gin Ser Tyr Tlir Gly Pro Ser Thr <2)()> 17 <21I> 9 <212〉 PRT <2丨3>人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 17

Gin Gin Trp Phe Ser Thr Ala Pro Thr

<21()> !8 <2!1> 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 〈出>抗體序列 <4()0> 18

Gin Gin Scr Tyr Tlir Giy Thr Val Thr S <2I0> 19 <21i> 87 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220〉 <223〉抗體序列 <400> 19

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Giy 15 10 15

Ala Scr Val Lys Val Scr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr '20 25 30

Trp Val Ar2 Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Mel Gly Arg 35 40 45

Vul Thr lie Thr Ala Asp rHu vScr Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 50 55 60

Leu Scr vScr l.cu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75

Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <2I0> 20 <211> 81 <2!2> PRT <2丨3>人工序列 <22()> <223>抗體序列 <40()> 20

Gin Val Gin Leu Vat Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly i 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Va! Arg Gin Ala '20 25 30 4- 121444.doc 200815467

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp 35 40 45 i'hr Scr Thr vScr ΊΊίγ Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60 (Jlu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 l,cu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 21 <211> 80 <2I2> PRT <213〉人工序列 <220> <223>抗體序列 <4()0> 21 (；ln Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ahi Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pro (Jly Gin Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp 35 40 45

Tlir vSer ΤΙίγ Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60

Glu Asp Tlir Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75

Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 22 <211> 79 <212> PRT <2 i 3> 乂工序列 <22()> <出>抗體序列 <40()> 22

Gin Val Gin l.eu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala vSer Val Lys Va] Ser Cys Lys Ala Ser 丁rp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp 35 40 45 ΊΊιι* Ser Ihr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75

Thr Val Scr Ser

<210> 23 <21!> 87 <2i2> PRT

> 人工廢U <220> <223〉抗體序列 I21444.doc 200815467 <400〉 23

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15

Gin llir Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30

Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Glv Leu Glu Trp lie Gly Arg 35 40 45

Thr [le Sei· Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys 50 55 60

Leu Scr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75

Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Yal Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 24 <211> 81 <212> PRT <2!3>人工序列 <220>

<223>抗體序列 <400〉 24 (；ln Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15

Ciln Thr Leu Ser Leu Thr Cys ITir Val Ser Trp He Arg Gin Pro 20 25 30

Pro Glv Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Val Tbr lie Ser Val Asp '35 40 45 ΊΙίγ vSer Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Tbr Ala 50 55 60

Ala Asp Tlir Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75

Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <21()> 25 <211> 80 <2!2> PRT <2丨;> 人工序列 <22()> 抗體顔 <4Π0> 25 (ίΐη Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15

Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Me Arg Gin Pro 20 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Val Thr He Ser Val Asp 35 . 40 45

Thr Scr Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60

Ala Asp llir Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75

Val ·Πίγ Val Scr Scr 80 <210> 26 <211> 79 -6- 121444.doc 200815467

<212> PRT <213>人工靜[J <220> <223〉抗體序列 <400> 26

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15

Gin Thr Leu Ser Leu Thr CyK Thr Val Ser Trp lie Arg Gin Pro 20 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He Arg Val Thr lie Ser Val Asp 35 40 45

Thr Scr Lys Asn Gin Phe Ser l.eu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60

Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75

Thr Val Ser Ser

<210> 27 <211> 87 <2!2> PRT <213〉人工序列 <220> <223>抗體序列 <400> 27

Glu Va! Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly ! 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 50 55 60

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75

Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 S5

<2M> 81 <212〉 PRT <2U>人工靜J <220>

<223〉抗體靜J <40()> 28

Cilu Va! Gin Leu Val Glu vSer Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly I 5 10 15 (Hy vSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr He Ser Arg Asp 35 40 45

Asn Scr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 121444.doc 200815467

Leu Va) Thr Val vSer Ser 80 <2H)> 29 <21I> 80 <212> PRT <2!3>人工序列 <220〉 <223>抗體序列 <400> 29

Glu Va! Gin Leu Val G!u Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro G!y 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu G!u Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 35 40 45

Asn Scr Lys Asn ΊΊτγ Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser I.eu Arg Ala 50 55 60 (ilu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu

ValThr Val Ser Ser 80 <210> 30 <211> 79 <2)2> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 30

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly I 5 10 15 C!lv Scr l.cu Are Leu vSer Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30 l)r() (;ly Lys (ίΐγ Leu Glu Trp Val Arg Val Thr Ik Ser Arg Asp • 35 40 45

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75

Thr Val vSer Ser <210> 31 <211> 87 <2!2> FOT <213>人工序列 <220> <切> 抗體序列 <4()0> 3) (ilu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn He Lys 20 25 30

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45 -8 - 121444.doc 200815467

Phe Tlir !le Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 50 55 60

Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 65 70 75

Arg Trp Gly (；In Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 32 <211> 81 <2!2> PRT <2丨3>人工序列 <22()> 悉抗體序列 <>32

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Scr Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pm Clv Lvs Glv Leu Glu Trp Val Atg Phe Thr He Ser Ala Asp 35 40 45

i'hr Scr Las Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 (iiu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75

Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <2I0> 33 <2!1> 80 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>抗體序列 <400> 33 (；lu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 (ϋγ vScr Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala ' 20 25 30 i^O Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr He Ser Ala Asp 35 40 45 l*hr vSer Lvs Asn rFhr Ala Tyr Leu G!n Met Asn Ser Leu Arg Ala * 50 55 60 (IIu Asp Tbr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75

Val Thr Val Ser Ser 80 <210〉 34 <2!1> 87 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220〉 〈⑵〉抗體序列 <40()> 34 iilu Val Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 I21444.doc 200815467

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys 20 25 30

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45

Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 50 55 60

Mcl Asn Scr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75

Arg 丁rp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 35 <211> 8!

<212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉抗體序列 <40()> 35 (ίΐυ Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly ! 5 10 15

Gly vSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pro Gly Lys> Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp 35 40 45 I'hr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60

Glu Asp Tlir Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 l.eu Val Thr Val vSer Ser 80 <210> 36 <2I)> 80 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>抗體序列 <400> 36

Cilu Val Gin Leu Val Glu Scr Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Cilv vSer i.eu Arg I.eu vSer Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pro Glv i-y> Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp ' 35 40 45

Thr vSer Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60

Cilu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75

Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 37 <211> 79 <212> PRT <213>人工序列 -10- 121444.doc 200815467 <400> 37 (.Ίυ Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 ίϊΐν Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp 35 40 45

Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75

Thr Val Ser Ser

<21()> 38 <2!1> 80 <212> PRT (2丨人工序列 <220> 〈奶〉抗體序列 <400> 38

Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Lvs Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 35 40 45 (ily vSer Giv Scr Gly T\u Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu 50 55 60 (iln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75

Lys Val Glu He Lys 80 <21()> 39 <211> 80 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉抗體序列 <4()()> 39

Asp lie Val Mel Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15 (ily Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Gin Scr Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 (ilv Ser Glv Scr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val ' 50 55 60

Ulu Ala (ilu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Giy Thr 65 70 75

Lys Val Glu He Lys 80 •11· 121444.doc 200815467 <210〉 40 <211> 80 <212> PRT <213>人工序列 <220> 〈处抗體序列 <4()0> 40 (ilu !lc Val Leu Thr Gin Scr Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro I 5 10 15

Gly Giu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Gin Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu 50 55 60

Glu Pro Giu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly llir 65 70 75 l.ys Val Glu lie Lys 80

<210〉 41 <211〉 80 <212> PRT <213)人工序列 <220> 〈处抗體序列 <>41

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu ) 5 10 15

Gly Glu Arg Ala Tlir lie Asn Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Gin Pro Pro Lys Leu Leu Me Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 50 55 60 (11 n Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75

Lys Vul Ciiu lie Un 80 <2I0> 42 <211> 25 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>抗體序列 <400> 42

Glu Va! Gin Leu Val G!u Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 (j'ly Ser Ixu Arg I.cu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<21()> 4.3 <211> 13 <212> PRT <213〉人工序列 -12- 121444.doc 200815467 <220〉 <223〉抗體序列 <400> 43 1'rp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu GIu Trp Val 5 10 <2I0> 44 <211> 30 <212> PRT <213〉人工序列 <220> 〈切〉抗體· <4〇{)> 44

Ari1 Phe Thr Me Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 (iln Met Asn Ser l.eu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 45 <211〉 il <2!2> PRT <2丨3>人工賴 <220〉 <切> 抗體賴 <40()> 45

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <21()> 46 <21l> 23 <212> PRT <2丨.)> 人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 46

Asp lie Gin Met ΙΊτγ Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15 (ily Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 47 <211> 15 <>12> PRT <213〉人工序列 <220〉 〈切〉抗體序列 <4()0> 47

Trp Tyr ⑴η (;in Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu l!e Tyr t 5 !0 15 <2U)> 48 <211> 32 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>抗體序列 <400> 48

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 1'hr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 13- 121444.doc 200815467 lyr Cys <2I()> 4V <21!> 10 <2I2> PRT <213>人工序列 <220> <223>抗體序列 <400> 49

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 5 10 <2I0> 50 <21I> 32 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223〉抗體序列 <400> 50

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

I 5 10 15 •Thr Leu Thr 11c Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30

Tyr Cys <210〉 51 <21!> 30 <212〉 PRT <2丨3>人工序列 <220〉 <‘)23>抗體序列 <400〉 51

Arg Phe ΊΤιγ I Ic Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu I 5 10 15 (ίΐη Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>抗體序列 <>52

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 (ily Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn 20 25 30 I'hr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe vSer Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Scr Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90 -14- 121444.doc 200815467

His Tyr Tl*ir Thr Pro Pro Tlir Pbe Giy Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 11c I.ys <210> 53 <211> 107 <212> PRT <2!3>人工序列 <220> 〈奶〉抗體序列 <40()> 53

Asp lie Gin Mel ITir Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15 (ily Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 I.eu Leu Me Tyr vSer Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

Aru Phc Scr Cilv Scr Gly Ser Giy Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 一 * 65 70 75

Scr Scr Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Ser Tyr Tlir Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys <210〉 54 <2H> 114 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>抗體序列 <4()()> 54 iilu Val Gin I.eu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 (My vScr Leu Arg Leu vSer Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30

Asp Asn 丁rp lie Ser Trp Val Arg Gin Aia Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Val lie Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Glu Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Set Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn rHu Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thi· Ala Vul Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe 95 100 105

Asp Tvr Trp CMv Gin Gly Thr Leu Val 110 <2Kb 55 <211> 1()8 -15- 121444.doc 200815467 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>抗體賴 <400> 55

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Cily Asp Arg Val TTir He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Vul Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu l.eu 11c Tyr Scr Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Scr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Scr Scr l.eu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Ser Tyr Asn Gly Pro Ser Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg <2)0> 56 <2ll> 114 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <22域體序列 <4()0> 56 (ilu Val (iln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Giy 15 10 15 (ily Ser Lea Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg 20 25 30

Asp Asn Trp lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Val lie Asn Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Scr V'al Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 l.ys Asn Tlu AU Tyr Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe '95 100 105

Asp Tyr T卬 Gly Gin Gly Thr Leu Val 110

<210> 57 <211> 108 <212〉 PRT <2丨3>人工序列 <220〉 <223〉抗體序列 <400> 57

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val I 5 10 15 -16- 121444.doc 200815467 C；ly Asp Arg Val Thr Ue ITir Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin G!n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phc Scr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin SO 85 90

Ser Val Asn Giy Pro Ala Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 11c Lys Arg <2 Kb 58 <2)1> 114 <212> PR丁 .2丨3>人工序列

<22()> 〈切〉抗體序列 <400> 58

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly I 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 A.sp Asn Trp lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 (ilu Trp Val (Πγ Tyr Ik Ser Pro Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr ' 50 55 60

Ala Asp Scr Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tvr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe 95 100 105

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 110 <210> 59 <211> 108 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉序列係經合成 <‘ioo> A\p lie (Iln Mci Ήιγ Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val I 5 10 15 (;lv Asp Au Val Thr i】e Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 -17- 121444.doc 200815467

Arg Phe Ser Gty Ser Gly Ser Giy Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Scr Tyr Thr Gly Ήίγ Vai Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie l.ys Ar^ <210> 60 <211> 6 <212> DNA <2!3>人工序列 <220> <223>序列係經合成 <220〉 <221〉CAAT一signal modi fied^base <222> 2 -<223〉鹼基為g、a、1:¾¾

<400> 60 cncaat 6 <2I0> 61 <21i> 6 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>序列係經合成 <220> <221〉 PolyA—signal <222〉fuH _ <223>多聚腺苷酸化信號 <400> 61 aataaa 6 <2I()> 62 <211> 21 <212> DNA <2 i 3>人土序列 <220> <223> siRNA <40i)> 62 caacigccci lat^gcttit t 21 <210> 63 <21!> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉 siRNA <400> 63 uaagccaiaa gggcagttgt t 21 <2I0> 64 <2!1> 21 <2I2> DNA <2丨3>人工序列 <220>

<223〉 siRNA 18- 121444.doc 200815467 <400> 64 caactgccct tcaatttcat t 21 <210〉 65 <21i> 21 <2I2> DNA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA <400> 65 tgaaaitgaa gggcagttgi t 21 <21()> 66 <21!> 2i <212> IDNA <2丨3> 乂工序列 <22()> <223> siRNA <400> 66

igaccaagat ctcaactact t 21 <2)0> 67 <21t> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉 siRNA <400> 67 giauttgaga tcttggtcat t 21 <210> 6H <2il> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <22()> <223> siRNA <4{)()> 68 ggccaaciai gctigtgaat t 21 <2I0> 69 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> siRNA <40()> 69 ttcacaagca tagitggcct t 21 <210> 70 <211〉 20 <2I2> DNA 〈⑴〉人工序列 <220〉 <223>寡核苷酸引子 <40()> 70 aagicttgca aatgcagcta 20 <2I0> 71 <211> 25 <2i2> DNA <2!3>人工序列 <220> 121444.doc 200815467 <223>寡核苷酸引子 <400> 71 cat cal cult a tea tea tea ttgtc 25 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22J>寡撕酸探針 <400> 72 aaticttgga aaagtggcaa gaccaaaat 29 <2)0> 73 <2!1> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <22ϋ> <223>寡按酸引子 <400〉 73

clticcacca gcaggaagta g 21 <210〉 74 <21I> !8 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>寡_酸引子 <400> 74 tgeagteega ggtccttt 18 <210> 75 <2!!> 28 · <212> DNA <2!3>人工序列 <220> 〈切〉寡核苷酸探針 <4()0> 75 c^catitgai 11teattteg acaacaga 28 <>!0> 76 ^:211> 20 a\2> DNA <213>人工序列 <220〉 寡核苷酸引子 <400〉 76 gaagatggtg atgggatttc 20 <2!0> 77 <21i> 19 <2)2> DNA 〈川〉人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <40()> 77 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 -20 121444.doc 200815467 <220> <223〉寡核苷酸探針 <400> 78 caagcitccc gttcicagcc 20

121444.doc -21

Claims (1)

1. 200815467 十、申請專利範圍： 1. 一種分離之抗-DLL4抗體，其包含： (a)至少一、二、三、四或五個選自由以下組成之群的 高變區（HVR)序列： (i) 包含序列Α1·Α11之HVR-L1 ，其中A1-A11為 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:10)； (ii) 包含序列B1-B7之HVR-L2 ，其中B1-B7為 SASFLYS(SEQ ID ΝΟ:11)； # (iii)包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1_C9為 QQSYTGTVT(SEQ ID NO: 18)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GFTFTDNWIS(SEQ ID ΝΟ:1)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GYISPNSGFTYYADSVKG(SEQ ID NO:8);及 (vi) 包含序列F1-F15之HVR-H3，其中F1-F15為 VYYCARDNFGGYFDY(SEQ ID ΝΟ··9);及 ® (b)至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含SEQ IDNOs:l-18中所示序列之至少一個殘基的修飾。 2. —種分離之抗-DLL4抗體，其包含： (a)至少一、二、三、四或五個選自由以下組成之群的 高變區（HVR)序列： ⑴包含序列A1-A11之HVR-L1，其中A1-A11為 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO: 10)； (ii)包含序列 B1-B7 之 HVR-L2，其中 B1-B7 為 SASFLYS 121444.doc 200815467 (SEQ ID NO:ll)； (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 QQSYNGPST(SEQ ID NO:15)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GFTFTDNWIS(SEQ ID N0:1)； (v) 包含序列EbE18之HVR-H2，其中E1-E18為 GVINPNSGATEYADSVKG(SEQ ID N0:5);及 (vi) 包含序列F1-F15之HVR-H3，其中F1-F15為 VYYCARDNFGGYFDY(SEQ ID N0:9) ； A (b)至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含SEQ ID NOs: 1-18中所示序列之至少一個殘基的修飾。 3. 如請求項1或2之抗體，其中HVR-L3變異體包含以下位 置之任何組合之1-6(1、2、3、4、5或6)處取代：91(S或 W)、92(Y或 F)、93(T、N或 S)、94(T或 G)、95(P、Q、A 或 T)及 /或 96(P、S、A或 V)。 4. 如請求項1或2之抗體，其中HVR-H2變異體包含以下位 置之任何組合之1-4(1、2、3或4)處取代：50(V、L或 Y)、52(N或 S)、52a(P或 S)或 53(N、Q、T或 I)。 5. 一種分離之抗-DLL4抗體，包含一、二、三、四、五或 六個HVRs，其中各HVR包含，由，或本質上由一個選自 由SEQ ID NOs:l-18組成之群之序列組成，且其中SEQ ID NO:10 對應於 HVR-L1，SEQ ID ΝΟ··11對應於1^11-L2，SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、17 或 18 對應於 HVR-L3，SEQ ID NO:l 或 2對應於HVR-H1，SEQ ID NO: 121444.doc -2- 200815467 3、4、5、6、7或 8對應於HVR-H2，及 SEQ ID NO:9對應 於 HVR-H3 〇 6. 如請求項5之抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、 HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3，其中各依次包 含 SEQ ID NO:10、11、14、2、3及 9。 7. 如請求項5之抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、 HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及 HVR-H3，其中各依次包 含 SEQ ID NO:10、11、15、1、5及 9。 ® 8.如請求項5之抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、 HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3，其中各依次包 含 SEQ ID NO:10、11、16、1、6及 9。 9. 如請求項5之抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、 HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中各依次包 含 SEQ ID NO:10、11、17、1、7及 9。 10. 如請求項5之抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、 HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3，其中各依次包 ^ 含 SEQ ID NO:10、11、18、1、8及 9。 11. 如請求項1、2及5至10中任一項之抗體，其中該框架序 列之至少一部分為人類一致框架序列。 12. 如請求項1或2之抗體，其中該修飾為取代、插入或缺 失。 13. 如請求項1、2及5至10中任一項之抗體，其中該抗體包 含人類κ子群一致框架序列。 14. 如請求項1、2及5至10中任一項之抗體，其中該抗體包 121444.doc 200815467 含重鏈人類第III子群一致框架序列。 15.如請求項14之抗體，其中該抗體包含位置71、73或78中 一-或多處之取代。 16·如請求項15之抗體，其中該取代為R71A、N73T或N78A 之一或多者。 17· —種聚核苷酸，其編碼如請求項1-16中任一項之抗體。 18 · —種載體，其包含如請求項17之聚核苷酸。 19.如請求項18之載體，其中該載體為表現載體。 _ 20. —種宿主細胞，其包含如請求項is或19之載體。 21 ·如請求項20之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞。 22.如請求項20之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。 23·如請求項20之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細 胞。 24· —種製備抗-DLL4抗體的方法，該方法包含：（a)在適當 宿主細胞中表現如請求項19之載體，及（b)回收該抗體。 _ 25· 一種製備抗-DLL4免疫接合物的方法，該方法包含：（a) 在適當宿主細胞中表現如請求項19之載體，及（b)回收該 抗體。 26.如請求項24或25之方法，其中該宿主細胞為原核細胞。 27·如請求項24或25之方法，其中該宿主細胞為真核細胞。 28· —種用於偵測DLL4的方法，該方法包含偵測生物樣本中 之DLL4-抗-DLL4抗體複合物。 29· —種診斷與DLL4表現相關之病症的方法，該方法包含偵 測患有或疑似患有該病症之患者之生物樣本中的DLL4_ 121444.doc 200815467 抗-DLL4抗體複合物。 30.如請求項28-29中任一項之方法，其中該抗_Dll4抗體係 經可偵測標記。 3 1 · —種組合物，其包含如請求項1 _丨6中任一項之抗-Dll4 抗體。 32· —種組合物，包含如請求項17之聚核苷酸。 3 3 ·如請求項3 1或32之組合物，其中該組合物進一步包含載 劑。 34· —種如請求項〗6中任一項之抗體的用途，其係用於製 備供治療腫瘤、癌症或細胞增殖性病症的藥物。 35·如請求項34之用途，其中該腫瘤、癌症或細胞增殖性病 症為結腸癌、肺癌或乳癌。 如明求項3 4或3 5之用途，其中該藥物係與抗企管生成劑 組合投藥。 37·如請求項36之用途，其中該抗血管生成劑為血管内皮生 長因子（VEGF)之拮抗劑。 女明求項37之用途，其中該VEGF拮抗劑為抗_ VEgF抗 體。 如月求項38之用途，其中該抗-VEGF抗體為貝伐單抗 (bevacizumab) 〇 〇 # π I g 34或35之用途’其中該藥物係與化學治療劑組 合投藥。 ’、 =如明求項1-16中任一項之抗體的用途，其係用於製 備供增強抗血管生成劑在患有與血管生成相關之病理病 121444.doc 200815467 狀之個體中功效的藥物。 42.如請求項41之用途，其中該與金管生成相關之病理病狀 為腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。 43·如請求項41之用途，其中該與血管生成相關之病理病狀 為眼内新生企管疾病。

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