TW200815458A - Process for purifying Tacrolimus - Google Patents

Description

200815458 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種純化他克莫司之方法。 【先前技術】 他克莫司[3孓[3及[五（1& 4幻]，5及，9五，12i?， 14及，155，16及，18& 19& 26ai^]]_5,6,8，ll，12，13，14，15，16, 17，18，19,24,25,26,26&-十六鼠-5，19-二經基-3_[2-(4-經基-3-甲氧基環己基）-1-甲基乙烯基]-14,16-二甲氧基-4,10,12,18-四甲基-8-(2-丙烯基）_15，19-環氧基-3Η^比啶幷[2，l-c][l，4] 氧氮環三可辛（oxaazacyclotricosine) -1，7,20,21(4H，23H)-四酮單水合物（先前稱為FK506 )具有分子量822.05、式 C44H69NO12H2O及結構式

他克莫司為由築波鏈黴菌（汾repiomycu 似⑷產 生之天然產生大環内酯免疫抑制劑。其以Fujisawa之名稱 PROGRAF^15上市，且可以膠囊（他克莫司膠囊）形式用於口 服。他克莫司藉由抑制T-淋巴細胞活化來延長肝、腎、心 臟、骨髓、小腸及胰腺、肺及氣管、皮膚、角膜及肢體之 119497.doc 200815458 動物移植模型中宿主及所移植之移植物的存活。在動物 中，已證明他克莫司會抑制某些體液免疫性及在很大程度 *. 上會抑制細胞介導之反應，諸如同種異體移植排斥反應、 ·· 遲發型過敏、膠原蛋白誘導之關節炎、實驗性過敏性腦脊 驗炎及移植物抗宿主疾病。 他克莫司首先描述於美國專利第4,894,366號及歐洲專利 ’ 第^ 0 162號中。當製備他克莫司時，亦獲得為雜質 之兩種他克莫司類似物：子囊黴素（Asc〇mycin)，其具有 結構式

及一氣他克莫司（Dihydrotacrolimus)，其具有結構式

119497.doc 200815458 藉由4知方法（諸如結晶）難以將他克莫司自此等雜質中 刀離，因為其結構類似。因此，需要藉由管柱層析法進行 純化。在官柱層析法中，可使用銀離子來改良純化效率。 銀離子與存在於他克莫司中但在側鏈為烷基之子囊黴素及 一氫他克莫司中缺乏的烯丙基側鏈之雙鍵相互作用。在子 囊黴素中，侧鏈為乙基，且在二氫他克莫司中，側鏈為丙 基。結果，他克莫司與固定相之間的結合或與移動相之結 合得以增強，且因此，他克莫司之滯留時間與其類似物之 滯留時間相比之差異增加。 美國專利第6,492,5 13號揭示使用經銀離子預處理之含石黃 酸基之強陽離子交換樹脂及丙酮或乙酸乙酯及甲醇之溶離 劑將他克莫司與雜質分離。因為他克莫司對所揭示之交換 樹脂敏感，所以預計他克莫司將會受到污染。 美國專利第6,576，135及6,881，341號揭示用於分離他克莫 司與雜質、尤其他克莫司-去甲基類似物之兩步管柱層析 法。所揭示之一步驟包括將含有他克莫司之混合物吸至非 離子吸附樹脂，且用含銀離子之水性溶劑溶離。所揭示之 另一步驟包括將混合物吸至驗性活性氧化鋁且用有機溶劑 >谷離以實施分離。溶離劑中使用水會導致他克莫司異構體 形成，藉此污染他克莫司。此外，使用含有游離銀離子之 溶離劑需要在自管柱溶離後將溶離劑之銀離子與他克莫司 分離。 國際專利申請公開案第WO 05/054253號揭示層析分離他 克莫司’其中使用在用氨氣處理以析出雜質後視情況用於 119497.doc 200815458 ►相層4斤1 中或經銀預處理之石夕膠。所揭示之溶離劑係用 於逆相分離Μ π 的丁醇、乙腈與緩衝液之混合物及用於經銀 处理之矽膠分離的乙酸乙酯與己烷之混合物。 國際專利申請公開案第WO 05/098011號揭示藉由矽膠層 法刀離他克莫司與雜質，其中矽膠視情況經銀預處理。 克莫司視情況進一步藉由使用未經處理之二氧化矽之逆 相層析法純化。逆相層析法以c_8管柱為例。所例示之溶 離背丨匕括用於經銀處理之管柱的己烷中之乙酸乙酯及用於 逆相分離的乙腈、正丁醇及緩衝液之混合物。 國際專利申請公開案第WO 05/010015號揭示使用無銀而 具有合有THF或乙腈、水及視情況額外有機溶劑之溶離劑 的非離子吸附樹脂進行分離。 此項技術中需要一種用於尤其自子囊黴素及二氫他克莫 司純化他克莫司之適用於工業規模之方法。本發明提供該 方法。 【發明内容】 在一實施例中，本發明提供一種用於分離他克莫司與雜 質之方法，該方法包含：岭將包含他克莫司及雜質之混合 物裝填於經銀離子預處理之吸附劑床中，其中該吸附劑係 選自由經銀改質之氧化鋁、氧化锆、苯乙烯二乙烯基苯共 聚物、吸附樹脂、陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、^ 相矽膠及氰基矽膠組成之群；及…自該吸附劑樹脂床溶離 混合物以分離他克莫司與存在於混合物中之雜質。 【實施方式】 119497.doc 200815458 本發明係關於一種層析純化他克莫司之方法，該方法使 用經銀離子預處理之吸附劑作為固定相（”經銀改質之吸附 劑"），其中吸附劑為氧化鋁、氧化锆、苯乙烯二乙烯基苯 共聚物、吸附樹脂、陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、 逆相矽膠及氰基矽膠中之一者。本發明之方法尤其適用於 为離他克莫司與子囊械素及二氯他克莫司。 本發明之方法適於工業用途。其可在不含水及/或銀離 +之溶離劑下進行且更有效分離他克莫司與子囊黴素及二 着 a他克莫司。不含水之溶離劑避免了因便於形成他克莫司 異構體而污染他克莫司。亦因避免在溶離劑中使用銀離子 而使得銀離子對最終產物之污染實質上減少。在本發明之 方法中亦可避免他克莫司敏感之強酸樹脂的使用及兩步層 析法之利用。 將存在於含雜質之混合物中之他克莫司裝填至經銀改質 之吸附劑上。例如，可藉由將混合物溶解於溶劑中、較佳 籲料於允許溶解之最小量溶财且將呈濃溶液形式之溶液 裝填至經銀改質之吸附劑上來進行裝填。最小量溶劑可為 關：起始他克莫司質量計算之溶劑混合物體積之約2倍。 混=在其中溶解之溶劑可與溶離期間所用之溶劑相同。 =等命劑之實例提供如下。混合物亦可以其他方式經裝 填，包括自混合物之非$農溶液蒸發獲得之油狀物或固體殘 餘物。 _接著，用來自經銀改質之吸附劑之溶劑溶離包含他克莫 司之此合物。較佳地，溶劑實質上無水。在一實施例中， I19497.doc 200815458 使用含有選自由一直鏈或分支鏈 酯、h直鏈或分支鏈醇、C28直鏈、直鏈或分支鏈 ^猜及其混合物組成之群之極性有機溶刀^鏈選^喊、 鍵、分支鏈或環狀煙、一。芳族煙及其混^；自由〜直 :性有機溶劑與非極性有機溶劑的混合物之二:群之 蜊。溶離劑較佳為無水，亦 7 f '谷離 止他克莫g 1β A 欠或水έ量足夠低以防 :克莫^構體形成。如本文所用之術語 h _不含水，除非可能成為微 .、、' 係^谷 測量之他克莫司異構體。溶心= 更佳少於！重量％、最佳少於〇.〇5重量％之水。、里°、 t直鏈或分支鏈㈣佳為㈣、乙基甲 & 孕又仏之一直鏈或分支鍵醋包括乙酸 二丙醋、、乙酸異丙酯、乙酸正丁酿及丙酸乙酿。較佳2 W直鏈或分支鏈醇包括、乙醇、異㈣、正 正丁醇及異丁醇。較佳之c2.8直鏈、分支鏈 第三丁基甲錢、㈢…y支鏈h狀峻包括 一…丙醚及四氫呋喃。較 w腈為乙Ά8直鏈、分支鏈或環狀烴較佳為己燒、庚 烷、辛烷、環己烷或環庚烷。C61。芳族烴較佳為甲苯。較 佳極性有機溶劑為丙酮。較佳溶離劑包含作為單一溶^戈 與另一溶劑形成混合物之丙酮，且更佳溶離劑包含丙i及 己烷或乙酸乙酯。 汉 當使用丙鲷與己烧之混合物時，可使用至少一種下列、容 劑比率：分別約1:1、約2:3、約1:4或約1:9,視所用之吸 附劑而定。當使用乙酸乙醋與丙，之混合物時，溶劑比率 119497.doc 200815458 較佳為丙鲷佔約5〇,體積 體積：两_體積。他克莫司之^土為、修：70之乙酸乙酉旨 離方法，其使用溶劑混合視情況包含梯度溶 物，較件比率A 較么為丙酮與己烷之混合 )開始溶離 剤，較佳為丙酮溶離。 平岭 溶離方法之類型較 ^ 地，且女 ^應根據管柱之長度來選擇。較佳 件的，、：例如長約10⑽之管柱之短管柱的梯度溶離為較

1太且不使用具有例如長約lm之管柱的較長管柱。 在本發明之—較佳方Μ 1歸改質线 ;;接著用溶離劑洗務。接著，裝填含他克莫司之溶_ 接著自管柱轉他克莫司、子囊黴素及三氫他克莫 司且回收並分析所得樣品。溶離劑較佳益水。 任何純度之他克莫司均可林發明之方法純化且可為粗 製之他克莫司。用本發明之方法純化之他克莫司可含有以 下雜質中之至少-種：子囊黴素(其量通常為約〇至約⑽ HPLC面積）及/或二氫他克莫司（其量通常為約㈣至約 HPLC面積）。已用本發明之方法純化含有約79% 面 積之子囊徽素及/或約3.8% HPLC面積之二氳他克莫司的粗 製之他克莫司。 溶離之次序視吸附劑及溶離劑之性質而定。子囊黴素及 二氫他克莫司通常在他克莫司之前溶離，因為他克莫司對 經銀改質之吸附劑具有更大親和力。 用於製備經銀改質之吸附劑之氧化鋁較佳為酸性活性、 中性活性或鹼性活性氧化鋁或根據Brockmann標準化之活 119497.doc -12- 200815458 性II-III氧化铭。更佳地’使用根據Brockmann標準化之氧 化鋁90或中性活性或酸性活性氧化鋁。 較佳之苯乙烯二乙烯基苯共聚物為非離子苯乙烯二乙烯 基苯共聚物或陰離子苯乙浠二乙烯基苯共聚物。 用於製備經銀改質之氰基矽膠之氰基矽膠可為市售吸附 劑，或其可藉由用三氯-3-氰基丙基石夕烧處理石夕膠，從而導 致矽膠在其表面上共價結合氰基烷基來製備。用於純化他

克莫司之最佳吸附劑為經銀改質之氧化鋁或經銀改質之氰 基-矽膠。 所用之吸附樹脂吸附劑較佳具有小粒徑。粒徑可為約Μ μπι至約 35 μιη。 為有效純化，吸附劑較佳具有至少約5〇m2/g、更佳約“ 至約600 m2/g之比表面積。 、二銀改貝之吸附劑較佳藉由混合吸附劑、銀陽離子來源 达自由Cw醇、水及水與水可混溶之溶劑組成之群之溶 劑且乾燥所得混合物來製備。當溶劑為q满時，較佳地 最初合併銀陽離子來源與Ci4醇以獲得溶液， 獲得懸浮液。接著，較佳在旋轉蒸發器中乾燥所 付懸子液，接菩太吉办w #丄 ^ 者在真空烘箱中乾燥約15分鐘至約5小時。 ci·4醇較佳包含單一醇 甲醇。备#之此合物。較佳之（^4醇為 田/月，為心-4醇時，較佳將銀離子來源及 至：：溶劑之回流溫度以獲得溶液。 、、、 :1!為水或水與水可混溶之溶劑之混合 迩相矽膠時，4P雜1十 彳7且及附劑為 銀離子來源較佳在周圍溫度下溶解且在溶解 119497.doc -13· 200815458 之後但在乾燥之前添加氨溶液。接著，較佳在烘箱中且更 佳在約70°C之溫度下及約30 mbar之壓力下乾燥經處理之溶 液。 可使用無機銀鹽或無機銀錯合物鹽。可使鹽或錯合物與 呈溶液狀態之吸附劑接觸。較佳銀鹽包括乙酸銀、硫酸銀 及亞琐酸銀。較佳之銀錯合物包括銀胺基錯合物、銀.氰基 ^ 錯合物及硫代硫酸銀錯合物及乙酸銀。銀來源更佳為硝酸 銀。 _ 吸附劑可包含不同量之銀離子。乾燥後獲得之經銀改質 之吸附劑較佳含有約〇· 1。/。至約15% w/w之銀鹽且更佳含有 約3%至約13% w/w之銀鹽。 經溶離之溶離份較佳藉由收集溶離份之群且蒸發溶劑， 因此提供樣品來回收。接著較佳藉由HPLC來分析經回收 之樣品，從而提供樣品中他克莫司、子囊黴素及二氫他克 莫司之含量。當溶離過程進行時，子囊黴素及二氫他克莫 司之含量通常減少，而他克莫司含量增加。較佳重複該過 ® 程以使最終樣品含有實質上純的他克莫司。最終樣品較佳 含有至少約93% HPLC面積之他克莫司、更佳至少約95% * HPLC面積之他克莫司且甚至更佳地至少約99% HPLC面積 - 之他克莫司。最終樣品較佳亦含有少於約0.20% HPLC面 積之子囊黴素、更佳少於約〇·〇9% HPLC面積之子囊黴素 且甚至更佳地少於約0.06% HPLC面積之子囊黴素。最終 樣品較佳亦含有少於約〇·〇4% HPLC面積之二氫他克莫司 且更佳少於約0.03% HPLC面積之二氫他克莫司。 119497.doc -14- 200815458 可使管柱再生且將其用於另一純化過程。 經溶離之他克莫司可含有離開樹脂之銀離子；該等銀離 子之里貝貝上少於使用含銀離子之溶離劑之情形下的銀離 子之量。經溶離之他克莫司可藉由以下步驟與銀離子分 離：蒸發溶離劑以獲得殘餘物；將殘餘物溶解於有機溶劑 中；與包含沉澱銀離子之試劑之溶液混合；過濾所沉澱之 «。該試劑可為氯化物鹽’諸如氯化納或氯化録，其添 加將導致氯化銀沉澱。用於移除銀離子之另一方法係使溶 離液經過填充有經氯化鈉改質之矽膠之管柱。經氯化鈉改 質之矽膠可易於藉由將矽膠與氯化鈉水溶液混合來製備。 有機溶劑通常為銀鹽在其中不可混溶之溶 較佳係選自由下列各物組成之群：乙酸乙醋、乙= 酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯、丙酸酯、曱 酸酯、丙酮、乙基曱基酮、異丁基甲基酮、乙醇、丙醇、 正丁醇、異丁醇、乙酸乙酯與丙酮之混合物、甲苯與丙酮 之混合物及其與水之混合物。溶劑較佳為乙酸乙酯。 有機溶劑較佳以每公克殘餘物約2體積至每公克殘餘物 約30體積之量、更佳約1〇至約3〇體積之量存在。 沉澱銀離子之試劑通常形成在水及有機溶劑中具有低溶 解度之銀鹽。該試劑較佳包括選自由下列各物組^之群之 抗衡離子：乙酸鹽' 硫酸鹽、亞硝酸鹽、溴酸鹽、水揚酸 鹽、碘酸鹽、鉻酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、氯化 物、硬脂酸鹽、硫化物、溴化物、碘化物、氰化物、苯甲 酸鹽、草酸鹽、亞硫酸鹽及硫氰酸鹽。抗衡離子更佳為碳 119497.doc •15- 200815458 酸鹽、擰檬酸鹽、磷酸鹽、氯化物、硬脂酸鹽、硫化物、 溴化物、碘化物、氰化物、苯甲酸鹽、草酸鹽、亞硫酸鹽 或硫氰酸鹽。抗衡離子最佳為溴化物、硪化物、硬脂酸 鹽、硫化物或氰化物。沉澱試劑較佳為包含抗衡離子之 鹽。沉澱試劑最佳為NH4C1。

沉澱試劑較佳以每莫耳當量銀i至約5莫耳當量之量且更 佳以每莫耳當量銀約1>2至約4莫耳當量之量添加。沉澱銀 離子之試劑之溶液較佳為水溶液。較佳將水溶液添加至殘 餘物於有機溶劑中之溶液中。包含用於沉澱銀之試劑之水 溶液的添加提供具有至少兩相之系統，包括包含有機溶劑 之有機相、水相及銀鹽沉澱物。銀鹽較佳為氯化銀。接著 過濾該鹽且使濾液經受相分離，從而提供包含實質上不含 銀離子之經溶離他克莫司的有機相。提及他克莫司時本文 所用之術語”不含"通常係指含有少於20 ppm銀離子之他克 莫司。不含銀離子之他克莫司較佳含有少於1G PPm之銀離 子。銀離子含量可藉由熟習技工已知之任一方法來測定， 例如藉由US Pharmacopeias中所述之方法。 自管柱直接獲得或分離銀離子後獲得之他克莫司可藉由 結晶方法進—步純化，該方法較佳包含將最終樣品溶^於 2_丙醇與正庚烷之混合物中，接著過遽。接著，較佳將遽 液”水及正庚烧之混合物合併，接著冷卻以獲得沉殺物。 接著，較佳藉由過濾來回收沉澱物且用水洗滌，且接著用 正庚烷洗滌，接著乾燥。 在回收沉殿物之前，與溶劑混合物合併之濾液較佳保持 119497.doc -16 - 200815458 約24小時。 經進一步純化之樣品較佳含有純度高於用層析方法獲得 之他克莫司純度之他克莫司。結晶後，任何剩餘子囊黴素 及二氫他克莫司之含量通常均將進一步減少，而他克莫司 含量將增加。經純化之樣品較佳含有至少97% HPLC面積 之他克莫司、更佳至少約99% HPLC面積或至少99.5% _ HPLC面積之他克莫司且甚至更佳地至少99.9% HPLC面積 之他克莫司。 # 因此，由於已提及尤佳實施例及例示性實例來描述本發 明，此項技術者可瞭解如所述及所例示對本發明進行之修 改並不偏離如說明書中所揭示之本發明精神及範疇。陳述 下列實例以幫助瞭解本發明但不欲且不應理解為以任一方 式限制本發明。 實例

HPLC 管柱： 移動相

Waters Symmetry Ci8 4.6*150 mm 3.5 μιη A :稱量200 ml乙腈至2000 ml量瓶中，用蒸餾 水填充燒瓶，且接著添加100 μΐ 50% CH3COOH(pH=4.0) 〇 B ··添加 100 μΐ 50的 CH3COOH至 2000 ml 乙腈 中〇 119497.doc -17- 200815458

梯度表

乙腈 20°C 分Ot： 47分鐘 他克莫司 24.5 min 稀釋劑： 樣品溫度 管柱溫度 運行時間： 典型滯留時間：

Tac.I·(子囊黴素）RRt==〇 91 Tac.II.(二氫他克莫司）RRt=：1 35 實例1:經硝酸銀改質之氧化鋁之製備 、 將硝酸銀（10.0 g)溶解於熱的甲醇（5〇〇 mi)中，接著添加 氧化鋁（鹼性活性氧化鋁90，63_200 μϊη，活性⑴出，由 Merck製造，100 g)。在旋轉蒸發器上使懸浮液蒸發至乾 燥。在70 C下’於真空（30 mbar)中乾燥殘餘物5小時。銀 含量：10% w/w。 實例2 ··藉由經銀改質之氧化鋁、等濃度溶離來純化粗製 之他克莫司 119497.doc 18- 200815458 用根據實例1製備之經硝酸銀（40 g)改質之氧化鋁填充玻 璃管柱（直徑22 mm，床高100 mm，乾式填充），且用含有 50% (v/v)丙酮及50% (v/v)正己烷之移動相（約200 ml)洗滌 管柱。將根據HPLC分析含有79.7%他克莫司、7.9%子囊黴 素及3.8%二氫他克莫司之粗製之他克莫司（306 mg)溶解於 移動相（10 ml)中，且將溶液裝填於管柱上。藉由移動相 (約20 ml/min)溶離管柱，且收集30 ml溶離份。藉由HPLC 分析溶離份，且重建之層析圖展現於圖1中。將代表已分 離之子囊黴素及二氫他克莫司之首先4個溶離份濃縮至乾 燥。根據HPLC分析，殘餘物（52 mg)含有2.1%他克莫司、 31.7%二氫他克莫司及63.0%子囊黴素。將隨後三個中間溶 離份濃縮至乾燥（15 mg)，且根據HPLC分析，其含有 37.5%他克莫司。使含有經純化之他克莫司之接續溶離份 (15個溶離份）濃縮，產生223 mg殘餘物，藉由HPLC分析殘 餘物且其顯示含有95_54%他克莫司、0.20%子囊黴素及 0.04%二氫他克莫司。 實例3 :藉由經銀改質之氧化鋁、梯度溶離來純化粗製之 他克莫司 用由40% (v/v)丙酮及60% (v/v)正己烷組成之移動相洗 滌實例2使用後之管柱。將粗製之他克莫司（321 mg， 79.7%他克莫司、7.9%子囊黴素及3.8%二氫他克莫司）溶解 於移動相（10 ml)中且接著將其裝填於管柱上。用含有40% 丙酮及60%正己烷（v/v)之移動相（350 ml)實施溶離，且將 溶離液濃縮至乾燥，產生59 mg殘餘物，根據HPLC分析， 119497.doc -19- 200815458 其3有3·3/〇他克莫司、34 5%二氫他克莫司及67 〇%子囊黴 素。接著用丙嗣（250 ml)溶離管柱，且濃縮溶離液以產生 218 mg無水殘餘物，其含有95 7%他克莫司、〇 〇9%子囊黴 素及0.03%二氯他克莫司。 實例4 :藉由用經改f之氧㈣及丙哪離劑置換層析他 克莫司來純化粗製之他克莫司 將他克莫司（3·8 g)溶解於丙酮（15·6 ml)中。使溶液經過 置於直徑為3.2 cm之玻璃管柱中之高85 em的經銀改質之 氧化鋁（含有約1〇% w/w銀）之吸附劑床。接著用丙酮溶離 官柱。溶離速率為30毫升/小時。一溶離份含有〇·3%二氫 他克莫司、0.45%子囊黴素及93·0%他克莫司。 實例5 ·藉由用經改質之氧化鋁及丙酮溶離劑置換層析他 克莫司來純化粗製之他克莫司 將根據HPLC分析含有1.2%子囊黴素及18%二氫他克莫 司之粗製之他克莫司（2 g)溶解於丙酮（2〇 ml)中。使溶液經 過經銀改質之氧化鋁（2〇〇 g，含有約1〇% w/w銀）之吸附劑 床。接著用丙酮溶離吸附劑床，且收集5〇 ml溶離份且藉 由HPLC分析。重建之層析圖展現於圖2中。濃縮含大環内 酯之最初三個溶離份，產生〇·41 g無水殘餘物，根據HpLC 为析’其含有6.1%子囊黴素及9.4%二氫他克莫司。濃縮緊 接之七個溶離份，產生1·53 g無水殘餘物，根據HpLC分 析’其含有0·18%子囊黴素及0·06〇/ο二氫他克莫司。 實例6 ·藉由用經改質之氧化鋁及丙酮：己烷溶離劑混合物 置換層析他克莫司來純化粗製之他克莫司 119497.doc -20 - 200815458 將他克莫司（3·8 g)溶解於丙酮（15·6 ml)中。使溶液經過 置於直徑為3·2⑽之麵管柱中之高85 em的經銀改質之 中f生活〖生氧化鋁（合有約1〇% 銀）之吸附劑床。接著用 丙酮：乙酸乙醋比率為7〇:3〇之丙酮及乙酸乙醋溶離吸附劑 床/合離速率為90毫升/小時。一溶離份含有〇 〇7%二氫他 克莫司、〇·39%子囊黴素及94·7%他克莫司。 實例經硝酸銀改質之活性酸性氧化鋁之製備 將硝酸銀（75.0 g)溶解於熱的甲醇（14〇〇 ml)中，接著添 加氧化鋁（活性酸性氧化鋁9〇，63_2〇〇 μηι，活性！，由

Mercia，750 g)以獲得料液。纟旋轉蒸發器上使懸 >子液瘵發至乾燥。在真空中乾燥殘餘物。殘餘物具有 w/w之銀含量。 實例8 :藉由用經銀改f之活性酸性氧化銘層析來純化他 克莫司 將根據HPLC分析含有丨·03%子囊黴素及丨·85%二氫他克 莫司之他克莫司（6.0 g)溶解於丙酮：乙酸乙酯比率為7〇:3〇 之丙酮與乙酸乙酯溶劑的混合物（24 ml)中。使溶液經過置 於直徑為3·2 cm之玻璃管柱中之高85 em的經銀改質之活 性酸性氧化鋁（含有約10%〜~銀）之吸附劑床。在_5。〇下， 用丙S同：乙酸乙酯比率為70:30之丙酮及乙酸乙酯溶離管 柱。；谷離速率為90¾升/小時。收集溶離份且藉由分 析。蒸發所選擇之主要溶離份且使其結晶。根據HpLC分 析，產物含有96.25%他克莫司、〇·22%子囊黴素及〇〇4%二 氫他克莫司。 119497.doc -21 - 200815458 實例9 :他克莫司之結晶 將藉由在經銀改質之氧化铭上層析後蒸發他克莫司溶離 份所獲得之無水殘餘物（55.3 g)溶解於2-丙醇（150 ml)與正 丙醇（150 ml)之混合物中，接著過濾溶液。接著用水（250 ml)及正庚烷（250 ml)稀釋濾液，且冷卻所得混合物並攪拌 24小時。濾去所沉澱之結晶產物，用水及正庚烷洗滌並乾 ^ 燥。獲得47.8 g結晶他克莫司。根據HPLC分析，產物含有 99.1 %他克莫司、0.33%他克莫司互變異構體II、0.18%他 # 克莫司互變異構體I、0.11%子囊黴素及0.04%二氫他克莫 司。 實例10 :活性氧化鋁之改質 將硝酸銀（20 g)溶解於經加熱之甲醇（650 ml)中。將氧化 銘（750 g)(活性中性，Merck，0.063-0.200 mm，活性階段 I)添加至溶液中以獲得懸浮液。在減壓下濃縮懸浮液直至 乾燥。經乾燥之懸浮液之銀含量為2.5 % w/w。 實例11 :逆相矽膠之改質 • 將硝酸銀（20 g)溶解於經加熱之曱醇（650 ml)中。將逆相 石夕膠（330 g)(LiChroprep RP-18，Merck)添加至溶液中以獲 ^ 得懸浮液。在減壓下濃縮懸浮液直至乾燥。 實例12 :吸附樹脂之改質 將硝酸銀（30 g)溶解於經加熱之甲醇（650 ml)中。將吸附 樹月旨XAD 1180(650 g)添加至溶液中以獲得懸浮液。在減 壓下濃縮懸浮液直至乾燥。 實例13 :吸附樹脂之改質 119497.doc -22- 200815458 將硝酸銀（3 0 g)溶解於經加熱之甲醇（650 ml)中。將吸附 樹脂SP 207(650 g)添加至溶液中以獲得懸浮液。在減壓下 濃縮懸浮液直至乾燥。 實例14 :具有小粒徑之吸附樹脂之改質 將硝酸銀（30 g)溶解於經加熱之甲醇（650 ml)中。將吸附 樹脂Amberchrom CG 3 00 M(650 g)添加至溶液中以獲得懸 浮液。在減壓下濃縮懸浮液直至乾燥。 實例15 :具有小粒徑之吸附樹脂之改質 將瑣酸銀（3 0 g)溶解於在回流溫度下加熱之甲醇（650 ml) 中。將吸附樹脂Amberchrom CG 300 S(650 g)添加至溶液 中以獲得懸浮液。在減壓下濃縮懸浮液直至乾燥。 實例16:陽離子交換樹脂之改質 將硝酸銀（30 g)溶解於經加熱之曱醇（650 ml)中。將陽離 子交換樹脂SK 104(650 g)添加至溶液中以獲得懸浮液。在 減壓下濃縮懸浮液直至乾燥。 實例17 :陰離子交換樹脂之改質 將硝酸銀（3 0 g)溶解於經加熱之甲醇（650 ml)中。將陰離 子交換樹脂IRA 68(650 g)添加至溶液中以獲得懸浮液。在 減壓下濃縮懸浮液直至乾燥。 實例18 :逆相矽膠之改質 在周圍溫度下，將硝酸銀（20 g)溶解於水（500 ml)中。在 330 g 逆相石夕膠（LiChroprep RP-18，Merck)存在下，將40 ml 濃氨溶液分若干份添加至硝酸銀溶液中。在高真空下小心 濃縮溶液直至乾燥。 119497.doc -23 - 200815458 實例19:陰離子交換樹脂之改質 將硝酸銀（30 g)溶解於經加熱之甲醇（65〇 ^1)中。將陰離 子交換樹脂IRA 900(650 g)添加至溶液中以獲得懸浮液。 在減壓下濃縮懸浮液直至乾燥。 實例20 :經硝酸銀改質之氟基發膠 將硝酸銀（10.0 g)溶解於熱的甲醇（5〇〇 ml)中且將氰基矽 膠（石夕膠100 CN，15-35 μπι，Fluka製造，1〇〇 g)添加至溶 液中以獲得懸浮液。在旋轉蒸發器上使懸浮液蒸發至乾 燥。在70°C下，於真空（3〇 mbar)中乾燥殘餘物5小時。 實例21 :藉由經銀改質之氰基矽膠純化粗製之他克莫司 用實例18中製備之吸附劑（54.4 g)填充層析管柱（直徑25 mm，長250 mm)，且用移動相（25:75之丙酮與正己烷的混 合物，1000 ml)洗滌管柱。接著，將粗製之他克莫司（51〇 mg)(79.7/〇他克莫司、7.9%子囊黴素及3.8%二氫他克莫司） 溶解於移動相（25 ml)中，裝填於管柱上，且用移動相溶離 管柱。取各100 ml溶離份且藉由HPLC分析。重建之層析 圖在圖3中。 實例22 :經硝酸銀改質之矽膝 將硝酸銀（10.0 g)溶解於熱的甲醇（5〇〇 ml)中且將矽膠 (矽膠60，15-40 μπι，Merck製造，1〇〇 g)添加至溶液中以 獲得懸浮液。在旋轉蒸發器上使懸浮液蒸發至乾燥。在 7〇°C下’於真空（3〇 mbar)中乾燥殘餘物8小時。 比較實例23:藉由經銀改質之矽膠純化粗製之他克莫司 用實例26中製備之吸附劑（62·6 g)填充層析管柱（直徑乃 119497.doc -24- 200815458 mm，長250 mm)，且用移動相（20:80之丙酮與正己烧的混 合物’ 1000 ml)洗滌管柱。接著，將粗製之他克莫司（5〇〇 mg)(79.7%他克莫司、7.9%子囊黴素及38%二氫他克莫司） 溶解於移動相（25 ml)中’裝填於管柱上，且用移動相溶離 管柱。取各100 ml溶離份且藉由HPLC分析。重建之層析 圖在圖5中。 實例24 :經硝酸銀改質之氧化錯

將硝酸銀（20.0 g)溶解於熱的曱醇〇〇〇〇瓜丨）中且將氧化 锆（Merck製造，200 g)添加至溶液中以獲得懸浮液。在旋 轉蒸發器上使懸浮液蒸發至乾燥。在7〇。〇下，於真空（3〇 mbar)中乾燥殘餘物5小時。 實例25 :藉由經銀改質之氧化鍅純化粗製之他克莫司 用實例20中製備《吸附劑（345 g)(重複製備吸附劑）填充 層析管柱（直徑25 mm，長250 mm)，且用移動相（約難 ml)(10:90之丙酮與正己烷的混合物）洗滌管柱。接著，將 粗製之他克莫司（21G邮)(79 7%他克莫司、7 9%子囊徽素 及3.8%二氫他克冑司）溶解於移動相（25 ml)中，且將其裝 填=官柱上’且用移動相溶離管柱。收集各⑽⑷溶離份 且藉由HPLC分析。重建之層析圖在圖4中。 實例26:分離他克莫司與銀離子 从在減壓下，將根據實例6及8收集之經選擇之主要溶離份 洛發至乾燥。將殘餘物溶料乙酸乙醋（殘餘物體積之⑼ =)中。將(殘餘物重量之13倍）溶解於水（殘餘物體 、之5倍)中’且將鹽溶液添加至乙酸乙酯溶液中。攪拌％ H9497.doc •25· 200815458 分鐘後，過濾沉澱之氯化銀，且分離各相。使大環内酯自 乙酸乙S旨相結晶。 實例27:分離他克莫司與銀離子 發現來自管柱之溶離液含有約80 mg/1之銀。使溶離液經 過填充有經氯化鈉改質之矽膠之管柱。使銀完全留在管柱 上。銀含量少於10 ppm。添加氯化納水溶液至石夕朦中，接 " 著均質化，藉此來製備經改質之矽膠。 【圖式簡單說明】 # 圖1顯示實例2之層析溶離份（mgA)之HPLC分析。 圖2顯示實例5之層析溶離份（mg/1)之HPLC分析。 圖3顯示實例21之層析溶離份（mg/1)之HPLC分析。 圖4顯示實例25之層析溶離份（mg/1)之HPLC分析。 圖5顯示比較實例23之層析溶離份（mg/1)之HPLC分析。

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Claims (1)

1. 200815458 f、申請專利範圍： L· 一種用於分離他克莫司（Tacrolimus)與雜質之方法，該方 法包含： a) 將包含他克莫司及雜質之混合物裝填於經銀離子預 處理之吸附劑床中，其中該吸附劑係選自由經銀改質之 氧化鋁、氧化錘、苯乙烯二乙烯基苯共聚物、吸附樹 脂、陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、逆相矽膠及氰 基石夕膠組成之群；及 b) 自該吸附劑樹脂床溶離該混合物以分離他克莫司與 存在於該混合物中之雜質。 2.如請求項1之方法，其中該混合物用無水溶離劑溶離。 3 · 如晴求項1 - 2中任一 :^苜夕古、、i，甘士斗μ 員之方法其中該專雜質為子囊黴素 (ASC〇myCin)及二氫他克莫司（Dihydrotacrolimus)。 4. 如請求項1之方法’其中該無水溶離劑係選自由極性有 機溶劑及極性有機溶劑與非極性有機溶劑之混合物組成 之群。 5. 如凊求項4之方法，其中該極性有機溶劑係選自由〜直 m鏈_、C37直鏈或分支鏈酯、直鏈或分支鏈 之群。鍵、分支鍵或環狀趟、c2-5腈及其混合物組成 * i 6. 如請求項4$ 士^ 直鏈、分支鍵Γ 非極性有機溶劑係選自由C5-1 2 群。支鏈或環狀烴、〜。芳族烴及其混合物組成之 119497.doc 1 ·如請求項2之太、、土 ^ ^ 2 、-該無水溶離劑具有少於約2體積 200815458 %之水。 8·如請求項2之方法，其中該 … ，μ…、/Ν /合挪-m >丁、史曰田下列各 物，成之群：丙，、乙基甲基酮、異丁基甲基酮、乙酸 ^酯、乙酸正丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、丙酸乙 曰曱醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、 少 基甲基醚、乙_、二異丙_、四氫吱味、乙腈、 甲本及直鏈、分支鏈或環狀己烧、庚烧、辛垸、環己产 及環庚烧。 &

   9·如睛求項8之方法 10 ·如請求項8之方法 乙酯。 其中該無水溶離劑包含丙酮。 其中該無水溶離劑包含己烧或乙酸 11·如明求項10之方法，其中該無水溶離劑包含丙綱及己 烷，其中丙酮及己燒以約1:1、約2:3、約1:4或約Μ之丙 酮：己烧比率存在。 12. 如睛求項9之方法，其中該溶離劑為丙酮與乙酸乙酯之

   此口物且丙S同及乙酸乙酯之含量使得相對於乙酸乙 醋’丙酮佔約50-80體積％。 13. 14. 如明求項2之方法，其中該無水溶離劑為丙酮。 如清求項2之方法，其中他克莫司用梯度溶離進行溶 離·用溶劑之混合物開始該溶離，接著用約100%單一溶 劑溶離。 15·如請求項14之方法，其中該梯度溶離包含用包含丙酮及 己烷之混合物開始該溶離，接著用丙酮溶離。 16.如請求項15之方法，其中丙酮及己烷以約3:2 v/v之丙酮: 119497.doc 200815458 己烷比率存在。 17. 如請求们之方法’其中該混合物採用長約i〇⑽或少於 10 cm之官柱之梯度溶離進行溶離。 18. 如請求項1之方法，直田 八甲該奶合物並不採用長度至少約1 m之管柱之梯度溶離進行溶離。 9·如明求項1之方法，其中該方法包含用該經銀改質之吸 附劑填充管柱，用溶離劑洗條該經銀改質之吸附劑，將 含於該溶離劑中之他克莫司溶液裝填至該管柱上，及自 該管柱溶離他克莫司、子囊黴素及二氫他克莫司。 20·如請求項19之方法，其中子囊黴素及二氫他克莫司之至 少一者在他克莫司之前自該管柱溶離。 21·如請求項19之方法，其中在分離之前他克莫司包含高達 約10% HPLC面積之子囊黴素及/或高達約6% HPLC面積 之二氫他克莫司。 22·如請求項1之方法，其中該吸附劑為氧化鋁。 23 ·如請求項22之方法，其中該氧化鋁吸附劑為選自由酸 性、中性及鹼性氧化鋁組成之群中之活性形式。 24·如請求項23之方法，其中該氧化鋁吸附劑為中性活性氧 化鋁或酸性活性氧化鋁。 25·如請求項1之方法，其中該吸附劑為選自由非離子苯乙 烯二乙烯基苯共聚物及陰離子苯乙烯二乙烯基苯共聚物 組成之群中之苯乙烯二乙烯基苯共聚物。 26·如請求項1之方法，其中該吸附劑係粒徑約35 μηι或約75 |im之吸附樹脂吸附劑。 119497.doc 200815458 27.如請求項1之方 比表面積。 ，、中該吸附劑具有至少約50 mVg之 28·如請求項1之方 # &所 ，/、進一步包含在一過程中製備該經 :貝之吸附劑’該過程包含混合該吸附劑、銀 來源及選自A _ + β 或夕種Cw醇、水及水與水可混溶之溶 诗1的混合物組成之群之溶劑且乾燥。 29.如請求項1之方法’其中該吸附劑為氰基矽膠。 項29之方法’其中該氰基謂包含在表面上共價 結合氰基燒基之石夕膠。 31. 如睛求項28之方法，其中該溶劑為C"醇，且該銀陽離 子來源與該Cw醇合併以形成溶液，且接著添加該吸附 劑以形成懸浮液。 32. 如請求項31之方法，其中扣满為甲醇。 33. 如請求項30之方法’其中該溶劑為。“醇，且將該銀離 子來源及忒（^.4醇加熱至約為該溶劑之回流温度以獲得 溶液。 34·如請求項28之方法，其中該溶劑為水或水與水可混溶之 溶劑之混合物，該吸附劑為逆相矽膠，該銀離子來源在 周圍溫度下溶解，且在乾燥之前，將氨溶液添加至溶劑 與銀陽離子來源之溶液中。 35·如請求項28之方法，其中該銀陽離子來源為銀鹽溶液或 銀錯合物之溶液。 36·如請求項28之方法，其中該銀陽離子來源係選自由硝酸 銀、乙酸銀、硫酸銀、銀氰基錯合物及硫代硫酸銀錯合 119497.doc 200815458 物組成之群。 37·如請求項35之 忠’具中該銀陽離子來源包含硝酸銀及 乙酸銀中之至少_者。 其中該銀陽離子來源包含銀氰基錯 38·如請求項35之方法 合物。 39. 如明求項28之方法’其中在乾燥之後，該經銀改質之吸 附劑包含約ο」至約15% w/w之銀鹽。 、 40. 如請求項1 >古、、+ 、 法，其中該經分離之他克莫司包含至少 力93/〇HPLC面積之他克莫司。 月求項1之方法，其中該經分離之他克莫司包含少於 約〇·20% HPLC面積之子囊黴素。 如明求項1之方法’其中該經分離之他克莫司包含少於 約〇.〇4%HPLc面積之二氫他克莫司。 、 43·如凊求項丨之方法，其進一步包括使與他克莫司一起溶 離之任何銀離子與他克莫司分離。 如明求項43之方法，其包含蒸發該溶離劑以獲得殘餘 物，在有機溶劑中溶解該殘餘物，將所得溶液與包含沉 澱銀離子之試劑之溶液混合，及過濾經沉澱之銀鹽。 45·如明求項43之方法，其中該有機溶劑係選自由下列各物 組成之群：乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丙酯、乙酸 正丁酯、乙酸異丁酯、丙酸酯、甲酸酯、丙_、乙基甲 基_、異丁基甲基酮、乙醇、丙醇、正丁醇、異丁醇、 乙酸乙酯與丙酮之混合物、甲苯與丙酮之混合物及其與 水之混合物。 119497.doc 200815458 46. 如請求項45之方法，其中 47. 如請求項44之 機洛劑為乙酸乙酯。 & 、 ，，、中該試劑包含選自由下列各物組 踏群，抗衡離子.乙酸鹽、硫酸鹽、亞硝酸鹽、溴酸 鹽、水揚酸鹽、碘酸鹽、鉻酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、 秘馱鹽、虱化物、硬脂酸鹽、硫化物、溴化物、碘化 物、氰化物、苯甲酸鹽、草酸鹽、亞硫酸鹽及硫氰酸 鹽。 8·如明求項47之方法，其中該沉殿試劑為。 49.如请求項44之方法，其進一步包含以每莫耳當量銀使用 1至約5莫耳當量之量添加該沉搬試劑。 50·如請求項44之方法，其中該包含使銀離子沉澱之試劑之 溶液為水溶液。 5 1 ·如請求項44之方法，其包含使溶離液經過填充有矽膠與 沉澱劑之混合物之管柱。 52. 如請求項44之方法，其中遠’冗澱試劑為氯化納或氣化 銨。 53. 如請求項1之方法，其進一步包括收集至少一份含有他 克莫司流出液之溶離份。 54. 如請求項53之方法，其進〆步包含使經分離之他克莫司 結晶。 119497.doc 200815458 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明）

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