TW200800166A - Inhibitors of AKT activity - Google Patents

Description

200800166 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於作為絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt (亦稱為 PKB，下文稱為"Akt")之一或多種同功異型物之活性抑制 劑的經取代喑啶化合物。本發明亦係關於包含該等化合物 之醫藥組合物及使用本發明化合物治療癌症之方法。 【先前技術】 細胞凋亡（漸進式細胞死亡）在胚胎發育及各種疾病（諸如 鲁 退化性神經元疾病、心血管疾病及癌症）之發病機制中具 有重要作用。近來工作已證實漸進式細胞死亡之調節或執 行中所涉及之各種促細胞凋亡及抗細胞凋亡基因產物。抗 細胞凋亡基因（諸如Bcl2或Bcl-xL)之表現抑制由各種刺激 所誘發之細胞凋亡式細胞死亡。另一方面，促細胞凋亡基 因（諸如Bax或Bad)之表現導致漸進式細胞死亡（Adams等 人，Science，281:1322-1326 (1998))。漸進式細胞死亡之 執行藉由與卡斯蛋白酶-1相關之蛋白酶（包括卡斯蛋白酶- 3、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8及卡斯蛋白酶-9等）來調 節（Thornberry等人，Science，281:1312-1316 (1998))。 磷脂醯肌醇3，-OH激酶（PI3K)/Akt路徑對調節細胞存活/ 細胞死亡而言顯得重要（Kulik等人Mol. Cell· Biol· 17:1595-1606 (1997) ; Franke 等人，Cell，88:435-437 (1997) ; Kauffmann-Zeh等人，Nature 385:544-548 (1997) Hemmings Science，275:628-630 (1997) ; Dudek 等人’

Science，275:661-665 (1997))。存活因子（諸如血小板衍生 114734.doc 200800166 之生長因子（PDGF)、神經生長因子（NGF)及類胰島素生長 因子（IGF-1))藉由誘發PI3K活性來促進各種情況下之細胞 存活（Kulik 等人 1997，Hemmings 1997)。經活化之PI3K 導 致產生（3,4,5)_三磷酸磷脂醯肌醇酯（Ptdlns(3,4,5)-P3)， (3,4,5)-三磷酸磷脂醯肌醇酯又結合至含有激酶底物同源 (PH)結構域之絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt且促進其活化（Franke 等人 Cell, 81:727-736 (1995) ； Hemmings Science, 277:534 (1997) ； Downward, Curr. Opin. Cell Biol. 10:262-267 (1998) ，Alessi等人，EMBO J_ 15: 6541-6551 (1996))。 PI3K之特異性抑制劑或顯性負性Akt突變體消除該等生長 因子或細胞激素之存活促進活性。先前已揭示PI3K之抑制 劑（LY294002或渥曼青黴素（wortmannin))藉由上游激酶阻 斷Akt活性。此外，引入構成上之活性PI3K或Akt突變體在 細胞正常經受細胞凋亡式細胞死亡之條件下促進細胞存活 (Kulik等人 1997，Dudek等人 1997)。 已識別經第二訊息調節之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶之Akt 子族的三名成員且分別稱為Aktl/ΡΚΒα、Akt2/PKB0及 Akt3/PKBY (下文稱為”Aktl”、nAkt2"及 ”Akt3’f)。同功異型 物為同源的，尤其在編碼催化結構域之區域中。藉由對 PI3K信號傳輸響應而發生之磷酸化事件來活化Akt。PI3K 磷酸化膜肌醇磷脂，產生已顯示結合至Akt之PH結構域的 第二訊息3,4,5-三磷酸磷脂醯肌醇酯及3,4-二磷酸磷脂醯肌 醇酯。Akt活化之當前模型提議藉由3’-磷酸化填酸肌醇來 補充酶至膜，其中藉由上游激酶發生Akt之調節性位點的 114734.doc 200800166 填酸化作用（Β·Α· Hemmings，Science 275:628-630 (1997); B.A. Hemmings, Science 276:534 (1997) ； J. Downward, Science 279:673-674 (1998)) o

Aktl之磷酸化作用發生於兩個調節性位點處，催化結構 域活化環之Thr3G8處及接近羧基末端之Ser473處（D· R. Alessi 等人，EMBO J. 15:6541-6551 (1996)及 R. Meier 等 人，J· Biol· Chem· 272:30491-30497 (1997))。等效調節磷 酸化作用位點發生於Akt2及Akt3中。已選殖在活化環位點 _ 磷酸化Akt之上游激酶且將其稱為3，-磷酸肌醇依賴性蛋白 激酶l(PDKl)。PDK1不僅磷酸化Akt，亦磷酸化p70核糖體 S6激酶、p90RSK、血清及糖皮質固醇調節之激酶（SGK)及 蛋白激酶C。.雖然尚未識別磷酸化接近羧基末端之Akt調節 位點之上游激酶，但近來報導暗示對整合素連接之激酶 (ILK-1)、絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶或自體磷酸化之作用。 對人類腫瘤中Akt含量之分析顯示Akt2過度表現於相當 大量之卵巢癌（J· Q. Cheng 等人 Proc. Natl· Acad. Sci. U.S.A. 89:9267-9271(1992))及胰腺癌中（J. Q. Cheng 等人 Proc· Natl. Acad· Sci. U.S.A· 93:3636-3641 (1996))。類似 地，發現Akt3過度表現於乳癌及前列腺癌細胞株中 (Nakatani等人 J· Biol. Chem. 274:21528-21532 (1999))。 腫瘤抑制劑PTEN (其為特異性移除Ptdlns(3,4,5)-P3之3’ 磷酸酯的蛋白質及脂質磷酸酶）為PI3K/Akt路徑之負性調 節劑（Li等人 Science 275:1943-1947 (1997)，Stambolic等人 Cell 95:29-39 (1998)，Sun等人Proc· Natl· Acad. Sci. U.S.A· 114734.doc 200800166 96:6199-6204 (1999))。PTEN之生殖系突變係造成人類癌 症症候群（諸如Cowden疾病）之原因（Liaw等人，Nature Genetics 16:64-67 (1997))。PTEN在大部分人類腫瘤中均 缺失，且無功能性PTEN之腫瘤細胞株顯示高含量之經活 化 Akt (Li 等人，見上文，Guldberg 等人，Cancer Research 57:3660-3663(1997)，Risinger 等人，Cancer Research 57:4736-4738 (1997)) ° 該等觀測證明PI3K/Akt路徑在腫瘤形成中對調節細胞存 活或細胞凋亡具有重要作用。

Akt活化及活性之抑制可藉由以諸如LY294002及渥曼青 黴素之抑制劑抑制PI3K來達成。然而，PI3K抑制具有無差 別地影響不僅所有三種Akt同功酶亦影響其他含PH結構域 之信號傳輸分子（其視Pdtlns(3,4,5)-P3而定，諸如酪胺酸 激酶之Tec家族）的潛力。此外，已揭示Akt可藉由獨立於 PI3K之生長信號來活化。 或者，Akt活性可藉由阻斷上游激酶PDK1之活性來抑 制。尚未揭示特異性PDK1抑制劑。抑制PDK1又導致對多 種蛋白激酶之抑制，該等蛋白激酶之活性視PDK1而定， 諸如非典型PKC同功異型物、SGK及S6激酶（Williams等人 Curr· Biol· 10:439-448 (2000))。 本發明之一目標在於提供作為Akt抑制劑之新穎化合 物。 本發明之一目標亦在於提供包含作為Akt抑制劑之新穎 化合物的醫藥組合物。 114734.doc 200800166 本發明之一目標亦在於提供一插 圾供種用於治療癌症之方法， 其包含投與該等Akt活性抑制劑。 【發明内容】 本發明提供抑制Akt活性之經取代喑啶化合物。詳言 之，所揭*之化合物選擇性抑制—或兩種虛同功異二 物。本發明亦提供包含該等抑制性化合物之組合物及藉由 對而要癌症治療之患者投與化合物來抑制Akt活性之方 法。 【實施方式】 本發明之化合物適用於抑制絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt之活 性。在本發明之第一實施例中，Akt活性之抑制劑由式入說 明：

其中： a為0或1 ; b為0或1 ; 111為〇、1或2; Q係選自：雜環基，其視情況經選自之一或多個取代 基取代； R1係選自：Η、侧氧基、（c=0)a〇b(Cl_Cl(})烷基、 (C=0)a0b-芳基、（C=〇)a〇b(c2·^)、烯基、（C=O)a〇b(C2-C10) 炔基、C02H、鹵基、oh、ojcvCO全氟烷基、 114734.doc -10- 200800166 、（:N 、 （〇〇)a〇b(C3_C8)環烷基 SH、S(〇)m-(Cl-C1G)烷基及（C = 〇)a〇b， 芳基、烯基、炔基、環烷基及雜環基視情 或多個取代基取代； R4及 R5獨立為：H、（Cl-C6)烷基、（C 丨·C6)烯基，（Ci_c6)

炔基，其中該烷基視情況經選自〇H及齒基之多達三個取 代基取代；且其中R4及R5可一起形成（C3-C7)環烷基，其中 該環烷基視情況經選自R6之多達三個取代基取代； R6 為·（0〇)&〇々-(：!〇 烧基 ' (〇0)a〇b芳基、c2-C10：Jf 基、C2-C10炔基、（〇〇)a〇b雜環基、c〇2h、鹵基、CN、 OH、ObCVC,全氟烷基、〇a(C=0)bNR7R8、侧氧基、 CH0、（N=0)R7R8、S(0)mNR7R8、SH、s(〇)『(Ci_Ci〇)烷基 或（C=0)a0bC3-C8環烷基，該烷基、芳基、烯基、炔基、 雜環基及環烧基視情況經選自R6a之一或多個取代基取 代；

(C=0)aNR7R{ S(0)mNR7R8 基，該烧基 經選自R6之- 環 況 R6a係選自：（C=0)a0b(Cl-C1())烷基、〇a(Cl-C3)全氟烷 基、（C〇-C6)伸烷基-S(0)mRa、SH、側氧基、0H、鹵基、 CN、（C2-C1G)烯基、（C2-C1Q)炔基、（C3-C6)環烧基、（C〇-CO伸烷基_芳基、（CVCs)伸烷基-雜環基' (C(rC6)伸烷基-N(Rb)2、C(0)Ra、（C〇-C6)伸烧基-C02Ra、C(0)H及（C〇-C6) 伸烷基-C02H，該烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基及雜 環基視情況經選自Rb、OH、（Cr-C6)烷氧基、鹵素、 C02H、CN、OaCOOKCrQ)烷基、側氧基及N(Rb)2之多達 三個取代基取代； 114734.doc •11- 200800166 R及R8係獨立選自：H、（c=〇)a〇b(c广c一烷基、 (c=o)aob(c3-c8m烧基、（c=0)a〇b芳基、（c=〇)a〇b雜環 基（C2-Cl❹）烯基、（C2-C1())炔基、SH、S〇2Ra 及 (C=〇)aNRb2,該烷基、環烷基、芳基、雜環基、烯基及炔 基視情況經選自R6a之一或多個取代基取代，或可將汉7及 R與其所連接之氮一起形成每一環均具有3_7個成員且除 氮以外視情況含有選自N、〇及S之一或兩個額外雜原子之 單裱或雙環雜環，該單環或雙環雜環視情況經選自之 一或多個取代基取代； R為（CVC6)烷基、（cs_C6)環烷基、芳基或雜環基丨且 R獨立為：H、（(VC6)烷基、芳基、雜環基、（C3_C6)環 烧基、（C = 〇)a〇b(Cl_C6)烷基或 s(〇)mRa; 或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 在第二實施例中，本發明之抑制劑由式B說明：

其中： R為雜裱基，該雜環基視情況經選自烷基、 OH、鹵基及NH2之一至三個取代基取代； 114734.doc R6a係選自

且 或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 -12- 200800166 在第三實施例中，本發明之抑制劑由式B說明： 其中： R1係選自公或❽-； 且所有其他取代基及變數均如第二實施例中所定義； 或其醫樂學上可接受之鹽或立體異構體。 本發明之特定化合物包括： 9-苯基冬(4-{[4_(5·吼咬_2_基-1H-1，2,4_三唑_3_基）娘唆小 • 基]甲基}苯基）f1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6-嗉啶_3_胺（1_4); 9_苯基_8-(4_{[4_(5-吡啶_2_基“Η」，2,4·三唑_3_基）哌啶 基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-£>1，6-喑啶_3_酚（15); 9-苯基-8·(4-{[4-(4-吡啶-2-基-1H-咪唑·i-基）哌啶基]甲 基}苯基）[152,4]三唑并[3,4-幻-1，6-喑啶-3-胺（1_6); 9-苯基·8-(4_{[4-(5-吡啶-2-基-1H-1，2,4-三唑-3-基）哌啶 基]甲基}本基）[1，2,4]三啥并[3,4-f]-l，6-嗜咬-3-硫醇（i_7) · 3_ 甲基 _9·苯基 4·(4-{[4-(5-吡啶·2_基-111_1，2,4_三唑_3-基） • 哌啶-基]曱基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]_i，6-喑啶（2_2); 9_苯基_8_(4-{[4-(5_吡啶-2-基-1H-1，2,4_三唑^基）旅咬小 基]甲基}本基）[1，2,4]三嗤并[3,4_£]_1，6-峰11定（2_3); 3·(氯甲基）-9-苯基-8-(4-{[4-(4•吡啶-2-基-1H-咪唑_丨_基）哌 啶-1-基]甲基}苯基）[U，4]三唑并[3,4-f]-i，6_喑啶（2_4); 3-[(4-甲基哌嗪基）曱基]-9•苯基比啶_2_基_ IH·1，2,4-三唑-3-基）哌啶_卜基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-饮奈咬（2-5); 114734.doc -13- 200800166 2_({[9_ 苯基-8_(4_{[4_(5-吡啶-2-基-1H-1，2,4-三唑-3-基）哌 咬_1-基]曱基}苯基）[152,4]三唑并[3,44]_1，6_嗉啶_3_基]甲 基}胺基）乙醇（2_6); 9-苯基 _8_{4-[4-(5-吡啶-2-基-4H-[1，2,4]三唑-3_基）-哌啶 _1_ 基曱基]•苯基}·[1，2,4]三唑并[3,4-f][l，6]4 啶（8-10); 9-苯基_8-(4-{[4-(5-咄啶_2-基-411-1，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-基]甲基}苯基）-3_(1H_1，2,3_三唑-4-基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6-喑啶（9-4); 春 咪唑 _4_基）-9_ 苯基8-(4-{[4-(5-吡啶_2-基_4H-l，2,4- 三唑_3-基）哌啶_レ基]甲基}苯基）[l，2,4]三唑并[3,4_f]_l，6-喑啶（9-5); [9-苯基-8-(4-{[4_(5-吡啶-2-基-4H-1，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三。坐并[3,4-幻-1，6-嗓唆-3-基]甲基胺 基甲酸第三丁酯（9-6); [9-苯基-8-(4_{[4-(5_°比唆-2_基-411-1，2,4-三嗤-3-基）旅唆-1- • 基]甲基}苯基）[1，2,4]三唆并[3,4-£]-1，6-峰唆-3-基]甲醇（9_ 7); 5-[9 -苯基- 8-(4-(14-(5-111 比 11 定·2 -基-4H-1，2,4 -三嗤-3-基）旅唆-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6·喑啶_3基]-2,4-二氫-3H-l，2,4-三唑-3·酮（9-8); 3-(3_ 甲基-1H-1，2，4-三唆-5,基）-9 -苯基- 8-(4-((4-(5-11比唆- 2， 基_4H_1，2,4-三唑_3_基）哌啶-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-峰咬（9-9); 3-咪唑并[2，14几1，3]噻唑_6-基-9-苯基-8-(4_{[4_(5_吡啶-2- 114734.doc -14- 200800166 基專1,2,4·三唾·3·基）錢-1·基]甲基 > 苯基）Π，2,4]三唾并 [3,4-f]-l，6-嗜咬（9-1〇)，· 9-苯基-8-(M[4_(m2·基-.U，心三哇·3_基）派唆] 基]甲基}苯基卿以]三唾并[15__咬2郁，24]三唾 并[3,4-f]-l，6-4。定（9_11); 3-峰嗤并Π，2_2_基_9_苯基_8_(4娘(5“比咬^基· 4Η_1，2,4-三嗤_3_基）㈣基]甲基}苯基）⑴μ]三唾土并 [3,4-f]-l，6-嗜咬（9-12); 9-苯基-8-(4-{[4-(5“比唆_2_基_4111，2,4三唾_3基冰啶小 基]甲基}苯基㈠-⑽」，2,4·5唑·5·基w，2 4]三唑并[3 4_ f]-l，6-喑咬(9-13); 3_(1H_苯并咪唾并_6_基）·9-苯基-8-(4-{[4-(5“比咬-2-基_4H_ 以，4·三唾·3_基）°辰唆小基]甲基}苯基）[1，2,4]三嗅并[3,4-f]-l，6·喑啶（9-14); 3-(l，5-二甲基-1H“比唑 _3_ 基）-9 苯基 _8_(4_{[4(5〇 比啶 _2· 基-4Η_1，2,4·三唾-3·基）旅咬]基]f基}苯基）⑴以]三唾并 [3,4-f]-l，6_嗉啶（9_15); 3·味嗤并 Ua]嘯咬 _2_基 _9_ 苯基 _8_(4_{[4-(5-^_2_基_ 4H-1，2,4-三峻-3-基）旅咬]_基]曱基}苯基）[12 4]三嗤并 [3,4-f]-l，6-哈咬（9-16); 5-[9-苯基-8-(4-{[4-(5,唆_2•基.12,4三嗅小基）旅唆· 1- 基]曱基}苯基）[1，2,4]三唾并[34斗16嗜咬·3基]β比淀_ 2- 胺（9_17); 9-本基H 4开n，5_a]嘧唆·3•基冬(心⑽(卜比咬冬基_ 114734.doc -15- 200800166 觀’2,4-三峻_3-基）°辰嚏-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-口奈唆（9-18); 3-(5-甲基-1H_吡唾_3_基）9苯基-8(4{[4_(5_吼咬_2基_ 4H-1’2’4-三唾_3_基）娘咬小基]甲基}苯基氾，2 4]三唑并 [3,4-f]-l，6-峰咬（9-19); 3-[9-本基-8_(4·{[4_(5_吼咬_2_基·4HH4·三嗤冬基）旅咬_ 1- 基]甲基}苯基）π，2,4]三嗤并[3,4£]_16峰咬_3基]吼咬_ 2- 胺（9_20); • 4-[9H8_(M[4_(5m基..^4•三嗤 _3 基）派咬 _ 卜基]甲基}苯基）π，2,4]三嗤并[34斗16_嗓咬_3基- 21)； 3普苯基-8<4-{[4-(5“比唆_2备.lv2,心三嗤| 1- 基]曱基}苯基）[1，2,4]三嗤并 22)； 2- [9-苯基 籲1-基]曱基}苯基）[1，2,4]三嗤并[3 + f]]，“奈咬^基- 23)； 9·苯基+ 基]曱基}苯基）[1，2,4]三唑并峰啶（1(M); 9-苯基·8-(4-{[4·(5-嘧啶_2·基“Η」，2,4·三唑_1_基）哌啶 基]甲基}本基）-3-(111-1，2,3-三嗤_4-基）[1，2,4]三嗤并[3 4- f]-l，6_ 喳啶（11-4); 114734.doc -16- 1 (1-曱基·ιH- 口米嗤-4 -基）·9·苯基- 8_(4-{[4-(5 -嘴咬 _2 -美 4H-1，2,4-三唑_3_基）哌啶_1_基]曱基}苯基三唑并 200800166 [3,4-f]-l56_嗉啶（12_”； (甲基1H^米唑-4_基）苯基_8_(4_{[4_(5d比啶基- 4H_1，2,4_三唑_3_基）旅啶小基]甲基丨苯基川，μ]三唑并 [3,4-f]-l，6-嗜咬（13-3); 3-(1-甲基-IH-n米唾+基）9苯基-8 (4 {[4 (5“比嗪_2基_ 4H-1，2,4-三唑_3_基）娘啶基]甲基}苯基们,2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-喑啶（13_4); A本基 β8-(4_{[4-(5“比嗪 _2-基-4H-1，2,4-三唑 _3_基）派啶-p 基]甲基）笨基）[l2,4]三唑并[3,4_f]_lX咬-3-基]甲醇（14- 3) ; [9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶_3•基三唑_3_基）哌啶-卜 基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[u-fjw·峰咬_3_基]甲醇（14_ 7); 1-[9·苯基-8·(4_{[4·(5-吡啶 _2_基-4H-1，2,4-三唑-3-基）哌啶 _ 1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6_喑啶-3-基]甲烷 胺（20-1); 9-苯基-3-(111_1，2,3-三唑_4_基）-8-(4-{[4-(411_1，2,4-三唑-3- 基）哌啶-1-基]甲基}苯基三唑并[3,4_f]-1，6-嗉啶（21_ 4) ； 或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 本發明化合物之實例包括以下化合物之TFA鹽： 9-苯基-8-(4{[4-(5-吡啶-2-基lH-l，2,4-三唑-3-基）哌啶-l一 基]曱基}苯基）[l，2,4]三唑并[3,4_f]_l，6-喑啶_3-胺（l-4); 9 -苯基-8- (4-{[4-(5_°比唆-2 -基-1 Η-1，2,4 -二唆 _3_基）派咬- i_ 114734.doc -17· 200800166 基]甲基}笨基）[1，2,4]三唑并[3,4_幻-1，6_峰啶_3-盼（1-5); 9-苯基-8-(4_{[4-(4-吡啶基-1H-咪唑-i•基）哌啶基]曱 基}苯基）[1，254]三唑并[3,4-幻_1，6^奈啶_3_胺（1_6); 9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-1H-1，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,心f>l，6-峰啶-3-硫醇（1-7); 3-甲基-9-苯基 _8-(‘{[4-(5-吡啶-2_基-1H_1，2,4_三唑-3-基） 旅啶_1_基]甲基}苯基）[H4]三唑并[3,4-f]·!,•喑啶（2_2); 、苯基-8_(4-{[4_(5-吡啶·2_基-1H_1，2,‘三唑-3·基）哌啶-1-基]曱基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-幻_1，6-嗉啶（2-3); 3-(氯甲基）-9-苯基·8-(4-{[4-(4-吡啶-2-基_111-咪唑-1-基）哌 啶-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4_f]-l，6-喑啶（2-4); 3-[(4-甲基哌嗪-1-基）甲基>9_苯基·8_(4_{[心（5^比啶_2-基_ 1H_1，2,4-三唑-3-基）旅啶-1-基]甲基}苯基Mu#]三唑并 [3,4-f]-l，6-嗱啶（2-5); 2- ({[9-苯基-8-(4-{[4-(5_吡啶-2-基-111_152,4-三唑-3-基）哌 φ 啶-1·基]甲基}苯基）Π，2,4]三唑并[3,4·ί>1，6_嗉啶_3_基]甲 基}胺基）乙醇（2_6); 3- (3-甲基-1Η-1，2,4-三唑 _5_基）-9-苯基 _8_(4_{[4-(5•吡啶-2- 基-4Η_1，2,4·二唾-3-基）娘咬·ι_基]甲基丨苯基）[nq三吐并 [3,4-f]-l，6-嘹啶（9_9); 3-咪唑并 R，l_b][l，3]噻唑 _6_基·9-苯基 _8·{[4-(5-，比啶-2-基-4H-1，2,4-三唑-3-基）哌啶_1_基]甲基}苯基）π，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-嗉啶（9-10); 9-苯基-8-(4-{[4-(5_吡啶-2-基 _4H-1，2,4-三唑 _3_基）哌啶-1- 114734.doc -18- 200800166 基]甲基}苯基)_3_π，2,4]三叫叫喷以郁叫三唾 并[3,4-f]-l，6_ 喑啶（9-11); 3-味唾并[1，2-十比咬-2-基-9-苯基_8_(M[4 (5吼啶·2旯 4H-H4·三唾_3_基）娘咬基]甲基}笨基）三料 [3,4-f]-l，6-喹啶（9-12); 3-(1-甲基-1HH4-基）-9-苯基 _8_(Μ[4 (5_β比啶 _2 基 _ .丨，2,4·三唑I基）略啶基]甲基}苯基氾从三:并 [3,4-f]-l，6-喳啶（13-3); 或其立體異構體。 本發明化合物之實例包括以下化合物之甲酸鹽： 9-苯基-8_(4_{[4_(5_吡啶 _2-基-1H-1，2,4-三唑-3_基）哌啶-][_ 基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4_f]-l，6·嗉啶-3-胺（1-4);及 苯基 _8-(4-{[4-(5_吡啶-2-基·1Η-1，2,4-三唑-3-基）哌啶· 基]甲基}苯基）[1，2,4]三唾并[3,4_!]-1，6-嗱啶-3-齡（1_5); 或其立體異構體。 本發明化合物之實例包括以下化合物之HC1鹽： 3-(1Η-咪唑-4-基）_9_ 苯基 _8_(4_{[4_(5-吡啶 _2_基 三唑-3_基）哌啶-1·基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]_l，6-喑啶（9-5); [9-笨基_8-(4_{[4_(5_吡啶_2_基-4111，2，心三唑冬基）痕啶小 基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,444,6-嗉啶·3-基]曱基胺 基甲酸第三丁酯（9-6); [9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶·2-基-4H-l，2,4-三唑·3-基）哌啶·l-基]甲基}苯基）[l，2,4]三唑并[3,4·f]_l，6-峰啶-3-基]甲醇（9_ 114734.doc -19- 200800166 7); 5-[9-苯基 _8-(4_{[4_(5-批啶 1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6-喑啶_3_基]_2,4 二氫-3Η_1，2,4_三唑-3-酮（9-8); 9-苯基-8-(‘{[4-(5_吡啶-2-基-411-152,4-三唑-3-基）哌啶_1_ 基]甲基}苯基）-3·(1Η-1，2,4-三唑_5_基）[1，2,4]三唑并[3，心 f]-l，6_ 嗉啶（9_13);

3-(1Η-苯并咪唑并_6·基）_9•苯基_8_(4{[4(5“比啶_2基·. 以，4-三唑·3_基）°辰咬-1·基]曱基}苯基）[1，2,4]三唑并『3 4 f]-l，6-嗉啶（9-14); ’ 土厂+悉口比啶 基三唾_3_基)‘定·i基]甲基} [3,4-f]-l，6-喑啶（9-15) ; J—坐开 3-咪嗤并[l，2_a]喷咬_2_其 # 土 _9_ 本基 _8_(4_{[4-(5-吡啶-2-基- 基--苯-一并 5-[9_苯基 _8_(4-(「4 Μ , 比啶 _2•基_ 二 1- 基]甲基}苯基）Π，2,4 一坐3-基）派嗖· 2- 胺（9-17); —唑开[认叫’“奈。定-3-基]吼〇定_ 9-本基-3 -吼σ坐并f 1 4H-1，2,4_ 三唾 | 基）a 1 W 备 8K[4-(5_*咬-2'基-[3,4-ί>1，6·4唆（9'18);唆小基]甲基}苯基）[H4]三唾并 3-(5-甲基-1Η_吼唾 4Η-1，2,4-三 w 土）_9·苯基-8·(4][4-(5-°比咬·2-基· 基）°辰咬+基]甲基}苯基）π，2,4]三唾并 114734.doc •20« 200800166 [3,4-f]-l，6-喑啶（9-19); 3- [9-苯基-8-(4-{[4_(5_π比咬_2_基 _4H]，2 4 三唾 _3 基冰唆· 1-基]曱基}苯基）[1，2,4]三嗤并[3,4_f]_16•嗓唆_3基]π比唆-2'胺（9-20); 4- [9-苯基-8-(4-{[4-(5-吼啶-2-基-4Η-1，2,4-三唑 _3_基）派咬 _ 1-基]甲基}苯基）⑴以]三唾并[3,4斗16_嗜唆_3基]紛（9_ 21)； 3-[9'苯基 _8-(4_{[4-(5-吼啶-2去4Η-1，2,4_三唑-3-基）旅咬 _ 1- 基]甲基}苯基）以#]三唑并W — 峰啶_3_基]盼⑼ 22)； 2- [9-苯基-8·(4][4-(5-吼 <-2-基-4H-1，2,心三唾 基）派咬_ 1-基]甲基}笨基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6-喑啶_3_基]酚（9· 23)； 3- (1-曱基-1H-咪唑-4-基）_9_ 苯基-8-(4-{〇(5_吡啶-2_基 _ 4H-1，2,4-三唑-3_基）哌啶_1β基]甲基}苯基）[^4]三唑并 [3,4-f]_l，6_喑啶（13-3); 3-(1_ 甲基 _1H_ 咪唑 _4_ 基）·9·苯基-8-(4·{[4_(5-吼嗪 基- 4Η-1，2,4-三唑_3_基）哌啶基]甲基}苯基三唑并 [3,4-f]-l，6-峰唆（13-4); [9_苯基-8_(4-{[4_(5•吡啶_3_基“η]，2〆·三唑_3•基）哌啶-/_ 基]曱基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6-喑啶-3-基]甲醇（14- 7); 9-苯基-3-(1Η-1，2,3-三唑·4_ 基 仁三唑 基）哌啶-1-基]甲基}苯基三唑并喑啶（21_ 114734.doc • 21 - 200800166 4)； 或其立體異構體。 本發明之化合物可具有不對稱中心、對掌性軸及對掌性 面（如 E.L· Eliel及 S.H· Wilen，Stereochemistry of Carbon Compounds，John Wiley & Sons，New York，1994，第 1119· 1190頁中所述），且呈外消旋物、外消旋混合物及呈個別 非對映異構體出現，伴隨其所有可能之異構體及混合物 •(包括光學異構體），所有該等立體異構體均包括於本發明 籲 中。此外，本文所揭示之化合物可呈互變異構體存在，且 即使僅描述一種互變異構體結構’本發明之範轉亦意欲涵 蓋兩種互變異構形式。 當任何變數（例如R1等）在任何組份中出現一次以上時， 其每次出現時之定義均獨立於其在所有其他出現時之定 義。僅若取代基與變數之組合導致穩定化合物，則亦可允 許該等組合。自取代基晝至環系統之線表示所指出之鍵可 φ 連接至任一可取代之環原子。若環系統為雙環，則意欲為 鍵連接至雙環部分之任一環上之任何合適原子。 應瞭解，一般或習此項技術者可選擇本發明化合物上之 取代基及取代類型以提供化學穩定且可易於藉由此項技術 中已知之技術以及下文所述之彼等方法自易得之起始物質 合成之化合物。若取代基本身經一個以上之基團取代，則 應瞭解，只要產生穩定結構，該等多個基團即可位於相同 碳上或位於不同碳上。短語”視情況經一或多個取代基取 代，’應等同於短語"視情況經至少一個取代基取代"，且在 114734.doc -22 - 200800166 該等情況下，較佳實施例將具有零至四個取代基，且更佳 實施例將具有零至三個取代基。 如本文所用之”烷基"意欲包括具有指定數目碳原子之支 鏈及直鏈飽和脂族烴基。例如，如"（Cr-Cio)烧基"中之c” C1 〇疋義為包括以直鍵或支鍵排列之具有1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10個碳之基團。舉例而言，"（CrCu)烷基” 尤其包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁 基、異丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。 籲 術語"環烷基’’意謂具有指定數目碳原子之單環飽和脂族 烴基。舉例而言，•’環烷基”包括環丙基、甲基_環丙基、 2,2-二甲基-環丁基、2-乙基-環戊基、環己基等。 M烷氧基”表示經由氧橋連接之指定數目碳原子之環狀或 非環狀烷基。因此，"烷氧基"包括上文中烷基及環烷基之 定義。 若未指定碳原子數目，則術語"烯基"係指含有2至1〇個 鲁碳原子及至少一個碳碳雙鍵之直鏈、支鏈或環狀非芳族烴 基。較佳存在-個碳碳雙鍵，且可存在多達四個非芳族碳 碳雙鍵。因此，"（C2_ClG)娣基”意謂具有2至1〇個碳原子之 烯，。烯基包括乙稀基、丙稀基、丁稀基、2_甲基丁稀基 及環己烯基。婦基之直鏈、支鏈或環狀部分可含有雙鍵， 且若指出經取代之稀基，則婦基之直鍵、支鍵或環狀部分 可經取代。 術語"炔基"係指含有2至10個碳原子及至少一個碳碳三 鍵之直鏈、支鏈或環狀烴基。可存在多達三個碳碳三鍵。 114734.doc -23- 200800166 因此，（C2_C1())炔基”意謂具有2至1〇個碳原子之炔基。炔 基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、3_甲基丁炔基等。炔基 之直鏈、支鏈或環狀部分可含有三鍵，且若指出經取代之 炔基，則炔基之直鏈、支鏈或環狀部分可經取代。 在某些情況下，取代基可由包括零之一系列碳來定義， 諸如（CcrC6)伸烷基-芳基。若芳基採用苯基，則此定義將 包括苯基本身以及_CH2Pli 、/出⑶孤、 CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph 等。 如本文所用之"芳基"意欲意謂每一環中具有多達7個原 子之任何穩定單環或雙環碳環，其中至少一環為芳族環。 該等芳基7〇素之實例包括苯基、萘基、四氫萘基、二氣節 基及聯苯基。在其巾芳基取代基為雙環且—環為非芳族環 之情況下’應瞭解連接係經由芳環。 如本文所用之術語雜芳基表示每一環中具有多達7個原 子之穩定單環或雙環，#中至少—環為芳族環且含有選自 由Ο、N及S組成之群之1至4個雜原子。在此定義範疇内之 雜芳基包括（但不限於）吖啶基、咔唑基、啐啉基、喹喏啉 基比唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、笨 并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基、噁唑基、異 惡唑基、吲哚基、吡嗪基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡 咯基、四氫喹啉。如同下文雜環之定義，亦應瞭解"雜芳 基b括任何3氮雜芳基之氮氧化物衍生物。在其中雜芳 基取代基為雙環且_環為非芳族環或不含有雜原子之情況 下，應瞭解連接係分別經由芳環或經由含雜原子之環。取 114734.doc -24- 200800166 代基Q之該等雜芳基部分包括（但不限於）2-苯并咪唑基、2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、1-異喹啉基、3-異喹啉基 及4-異喹啉基。 如本文所用之術語π雜環"或"雜環基"意欲意謂含有選自 由Ο、Ν及S組成之群之1至4個雜原子的3員至10員芳族或 非芳族雜環，且包括雙環基團。因此，"雜環基π包括上文 提及之雜芳基以及其二氫及四氫類似物。”雜環基”之其他 實例包括（但不限於）以下各基：苯并嘑唑基、苯并咪唑酮 基、苯并呋喃基、苯并呋吖基、苯并吨唑基、苯并三唑 基、苯并嗟吩基、苯并嗔嗤基、咔嗤基、味琳基、碎琳 基、吱喃基、咪σ坐基、吲哚琳基、吲朵基、吲哚嗪基、吲 唑基、異苯并呋喃基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、 異嚼峻基、萘。比唆基、嗔二唆基、°惡ϋ坐基、°惡σ坐琳、異°惡 σ坐琳、氧雜環丁基、旅喃基、0比嗓基、σ比峻基、璉σ秦基、 °比咬并σ比咬基、嗅ϋ秦基、σ比咬基、嘴咬基、0比11各基、喹峻 琳基、嗜嚇^基、啥嗜琳基、四氫旅喃基、四嗤基、四嗤口比 淀基、嗟二嗤基、售唾基、喧吩基、三嗤基、σ丫丁唆基、 1，4-二嚼烧基、六氫氮雜卓基、旅嗓基、旅淀基、°比淀-2-酮基、吼咯啶基、嗎琳基、硫代嗎琳基、二氫苯并咪唑 基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、二氫苯并噁唑 基、二氫呋喃基、二氫咮唑基、二氫吲哚基、二氫異噁唑 基、二氫異噻唑基、二氫噁二唑基、二氫噁唑基、二氫吡 嗪基、二氫σ比唑基、二氫吡啶基、二氫嘧啶基、二氫吡咯 基、二氫喹琳基、二氫四唑基、二氫噻二唑基、二氫噻唑 114734.doc -25- 200800166 基、二氫噻吩基、二氫三唑基、二氫吖丁啶基、亞曱基二 氧基苄醯基、四氫呋喃基及四氫噻吩基及其氮氧化物。雜 環基取代基之連接可經由碳原子或經由雜原子而發生。 如熟習此項技術者所瞭解，如本文所用之f’鹵基，，或，，齒 素"意欲包括氯（C1)、氟（F)、溴（Br)及碘（I)。 在一實施例中，Q係選自：苯并咪唑基、苯并咪唑酮 基、苯并呋喃基、笨并呋吖基、苯并吨唑基、苯并三唑 基、苯并11塞吩基、苯并惡嗤基、ϋ卡嗤基、味琳基、碎琳 基、咬喃基、味嗤基、,11朵琳基、叫卜朵基、叫I °朵嗪基、t!引 唑基、異苯并呋喃基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、 異噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、異噁 唑啉、氧雜環丁基、哌喃基、吡嗪基、吼唑基、噠嗪基、 °比咬并吡啶基、璉嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑 琳基、啥琳基、啥嗜琳基、四氫旅喃基、四嗤基、四tl坐ϋ比 咬基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、吖丁啶基、 1，4-二噁烷基、六氫氮雜卓基、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基、吼洛咬基、嗎琳基、硫代嗎琳基、二氫苯并味嗤 基、一鼠苯弁咬喃基、二氯苯弁售吩基、·鼠本弁嚼嗤 基、二氫吱喃基、二氫咪唑基、二氫吲哚基、二氫異噁唑 基、二氫異嘆ϋ坐基、二氫緣二u坐基、二氫鳴峻基、二氫吼 嗪基、二氫σ比嗤基、二氫η比咬基、二氫嘴淀基、二氫σ比洛 基' 二氫喧淋基、二氫四峻基、二氫嘆二ϋ坐基、二氫°塞嗤 基、二氫嚷吩基、二氫三唑基、二氫吖丁啶基、亞甲基二 氧基苄醯基、四氫呋喃基及四氫噻吩基及其氮氧化物，其 114734.doc -26 - 200800166 視情況經選自R6a之一至三個取代基取代。雜環基取代基 之連接可經由碳原子或經由雜原子而發生。 在另一實施例中，Q係選自：2·氮呼酮、苯并咪唑基、 苯并咪唑酮基、二氮呼酮、咪唑基、2-咪唑啶酮、吲哚 基、異喹啉基、嗎啉基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡咯 定基、2-派唆酮、2-嘧啶酮、2-吡咯啶酮、喹啉基、四唑 基%四氫呋喃基、四氫異喹啉基及噻吩基，其視情況經選

自 之至一個取代基取代。雜環基取代基之連接可經 由碳原子或經由雜原子而發生。

在又一實施例中，當Q為雜環基時，Q係選自： Η

其視情況經選自R6a之一至三個取代基取代。 在又-實施例中，當Q為雜環基時，q係選自：及 isrN\ ，其視情況經選自R6a之， 在一實施例中，R1係選自：H、 個取代基取代。 側氧基、（C=C〇ac^ei_ 114734.doc •27- 200800166 c10)烧基、（c=o)aob-芳基、（c=o)a〇b(c2-c1())烯基、 (C = O)a〇b(C2-C10)炔基、C02H、鹵基、〇H、 烧基、（C=0)aNR7R8、CN、（c=0)a0b(c3-c8)環烷基、 S(0)2NR7R8、SH、8(0)2-((^-(^0)烧基及（C=〇)a〇b-雜環 基，該烷基、芳基、烯基'炔基、環烷基及雜環基視情況 經R6a取代。 在另一實施例中，R4及R5為Η。

在一實施例中，當Q經R&取代時，該R6a為視情況經選 自 R 〇H、（Ci-C6)烧氧基、鹵素、c〇2fj、CN、

OaCOOMcvC6)烷基、側氧基及N(Rb)2之多達三個取代基 取代之雜環基。 在另一實施例中，當Q經取代時，該R6a係選自：視 情況經選自侧氧基、OH、N(Rb)2、齒素及〇a(Ci_C6)烷基之 1至3個*代基 在一實施例中，Rb係獨立選自h&(Ci_c6)烷基。 本發明包括游離形式之式A化合物以及其醫藥學上可接 文之鹽及立體異構體。纟文例示之某些齡離特定化合物 ^胺化合物之質子化鹽。術語"游離形式"係指非鹽形式之 胺化口物°所包括之醫藥學上可接受之鹽不僅包括針對本 文所述特定化合物所例示之經分離鹽，亦包括游離形式之 :A化合物之所有典型醫藥學上可接受之鹽。所述游離形 ’之特疋鹽化合物可使用此項技術中已知之技術來分離。 ’游_式可藉由將鹽以合適之稀驗性水溶液 =如稀NaOH、^^鉀、碳酸氫錢及礙酸氫納水溶液）處理 114734.doc -28· 200800166 而再生。雖然游離形式在某些物理性質（諸如在極性溶劑 中之溶解性）上可能略微不同於其各自之鹽形式，但為達 成本發明之目❺’在其他方面酉复式鹽及驗式鹽在醫藥學上 等同於其各自之游離形式。 本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方 法自含有鹼性或酸性部分之本發明化合物來合成。一般而 言，驗性化合物之録藉由料交換層料錢由使游離 驗與化學計量之量或過晋夕# 士、 飞里之形成所要鹽之無機或有機酸在 合適溶劑或各種溶劑組合中反應來製備。類似地，酸性化 合物之鹽係藉由與適當無機或有機驗反應而形成。 因此，本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽包括如藉由 使本發明之驗性化合物與無機或有機酸反應所形成之本發 明化合物之習知益奏极臨 血η …、母!·生鹽。舉例而言，習知無毒性鹽包括 自無機酸（諸如氫氣醏、__ 虱溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸、 硝酸及其類似物）衍生之储楚 生之彼等鹽，以及自有機酸（諸如乙 1丙酉夂丁一 I、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒 石酸、檸檬酸、抗壞血酸、雙經酸、順丁稀二酸、經基順 丁稀一酸、苯基乙酸、魅脫辦 楚胺I、本甲酸、水揚酸、對胺基 苯磺酸、2-乙醯氧基_笼 甲fee、反丁烯二酸、甲苯石黃酸、甲 烧磧酸、乙燒二碍酴 钱 > 只酉夂、卓酸、羥乙基磺酸、三氟乙酸 (TFA)及其類似物）製備之鹽。 §本發明之化合物兔酿 古 為酸性時，合適"醫藥學上可接受之 鹽”係指自包括盎撫认 …、機鹼及有機鹼之醫藥學上可接受之益毒 性鹼製備之鹽。自1 …毋 目無機鹼衍生之鹽包括鋁鹽、銨鹽、鈣 114734.doc -29- 200800166 鹽、銅鹽、鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽、亞錳踏、 鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽及其類似物。尤其較佳者為銨鹽、鈣 鹽、鎂鹽、鉀鹽及鈉鹽。自醫藥學上可接受之有機無毒鹼 衍生之鹽包括一級胺、二級胺及三級胺之鹽、包括天然產 生之經取代胺的經取代胺、環狀胺及鹼性離子交換樹脂， 諸如精胺酸、甜菜驗、咖啡鹼、膽驗、二苄某乙一 胺、二乙胺、2-二乙胺基乙醇、2_二甲胺基乙醇、乙醇 胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N—乙基哌啶、還原葡糖胺、葡 糖胺、組胺酸、海卓胺、異丙胺、離胺酸、甲基還原葡糖 胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹脂、普魯卡因 (procaine)、嘌呤、可可豆鹼、三乙胺、三曱胺、二丙 胺、缓血酸胺及其類似物。 上文所述醫藥學上可接受之鹽及其他典型醫藥學上可接 受之鹽的製備由Berg等人之，丨Pharmaceutical Sahs，,，： Pharm· Sci·，1977:66:1-19更全面描述。 亦應注意，本發明之化合物為潛在内鹽或兩性離子，此 係由於在生理條件下化合物中之去質子化酸性部分（諸如 羧基）可為陰離子，且接著此電荷可在$部抵消經質子化 或烷基化之鹼性部分（諸如四級氮原子）的陽離子電荷。 用途 本發明之化合物為Akt活性之抑制劑，且其因此適用於 治療癌症、尤其與Akt活性之不規則及Akt之下游細胞目標 相關聯之癌症。該等癌症包括（但不限於）卵巢癌、胰腺 癌、乳癌及前列腺癌，以及其中腫瘤抑制劑pTEN突變之 114734.doc -30- 200800166 癌症（包括神經膠母細胞瘤）(Cheng等人，Proc· Natl. Acad. Sci. (1992) 89:9267-9271 ; Cheng等人，Proc. Natl. Acad· Sci· (1996) 93:3636_3641 ; Bellacosa等人，Int. J. Cancer (1995) 64:280-285 ; Nakatani等人，J. Biol. Chem. (1999) 274:21528-215 32 ； Graff, Expert. Opin· Ther· Targets (2002) 6(1):103-113 ;及 Yamada及 Araki，J. Cell Science. (2001) 114:2375-2382 ; Mischel及 Cloughesy，Brain Pathol. (2003) 13(1):52-61) 〇 認為本文所提供之化合物、組合物及方法尤其適用於治 療癌症。可由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症 包括（但不限於）心臟：肉瘤（血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌 肉瘤、脂肉瘤）、黏液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤及 畸胎瘤；肺：支氣管癌（鱗狀細胞、未分化之小細胞、未 分化之大細胞、腺癌）、肺泡（細支氣管）癌、支氣管腺瘤、 肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯構瘤、間皮瘤；腸胃：食道G鱗狀 細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤）、胃（癌瘤、淋巴 瘤、平滑肌肉瘤）、胰腺（乳管腺癌、胰島素瘤、井糖素 瘤、胃泌素瘤、類癌、VIP瘤）、小腸（腺癌、淋巴瘤、類 癌、卡波西氏肉瘤（Karposi’s sarcoma)、平滑肌痛、血管 瘤、肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤）、大腸（腺癌、管狀腺 瘤、織毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤）、結腸、結直腸、 直腸；泌尿生殖道：腎（腺癌、威爾斯氏腫瘤（Wilm’s tum〇r)[腎胚細胞瘤]、淋巴瘤、白血病）、膀胱及尿道（鱗狀 細胞癌、移行細胞癌、腺癌）、前列腺（腺癌、肉瘤）、睾丸 114734.doc -31 - 200800166 (精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、絨膜癌、肉 瘤、間質細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤、脂肪 瘤）；肝臟：肝細胞瘤（肝細胞癌）、膽管癌、肝母細胞癌、 血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤；骨：成骨肉瘤（骨肉 瘤）、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文 氏肉瘤（Ewing’s sarcoma)、惡性淋巴瘤（網狀細胞肉瘤）、 多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤脊索瘤、骨軟骨瘤（骨軟骨 外生骨瘐）、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液纖維 瘤、骨樣骨瘤及巨細胞瘤；神經系統··頭骨（骨瘤、血管 瘤、肉芽腫、黃瘤、變形性骨炎）、腦膜（腦膜瘤、腦膜肉 瘤、神經膠瘤病）、腦（星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神 經膠質瘤、室管膜瘤、生殖細胞瘤[松果腺瘤]、多形性膠 質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜胚細胞 瘤、先天性腫瘤）、脊髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質 瘤、肉瘤；婦科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸（子宮頸癌、 腫瘤前子宮頸結構不良）、卵巢（卵巢癌[漿液性囊腺癌、黏 液性囊腺癌、未分類癌瘤]、粒層泡膜細胞瘤、史托利-雷 迪格細胞瘤、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤）、陰門（鱗狀細胞 癌、上皮内層癌 '腺癌、纖維肉瘤、黑素瘤）、陰道（透明 細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄樣肉瘤（胚胎性橫紋肌肉瘤））、 輸卵管（癌瘤）；血液學：血液（骨髓白血病[急性及慢性]、 急性淋包母細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、脊髓增生 病、多發性骨髓瘤、脊髓發育不良症候群）、霍奇金氏症 (Hodgkin’s disease)、非霍奇金氏淋巴瘤[惡性淋巴瘤];皮 114734.doc -32- 200800166 膚：惡性黑素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉 瘤、胎記發育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢 痕瘤、牛皮癖及腎上腺：神經母細胞瘤。因此，如本文所 提供之術語"癌細胞π包括經受任一種上文確定病症折磨之 細胞。

可由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括 (但不限於）乳癌、前列腺癌、結腸癌、結直腸癌、肺癌、 腦癌、睾丸癌、胃癌、膜腺癌、皮膚癌、小腸癌、大腸 癌、喉癌、頭部及頸部癌症、口腔癌、骨癌、肝癌、膀胱 癌、腎癌、甲狀腺癌及血癌。 可由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括： 乳癌、前列腺癌、結腸癌、卵巢癌、結直腸癌及肺癌。 可由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括： 乳癌、結腸癌、（結直腸癌）及肺癌。 可由本發明之化合物、組合物及方法治療之癌症包括： 淋巴瘤及白血·病。

Akt信號傳輸控制血管生成中之多個關鍵步驟。Shiojima 及 Walsh，Circ· Res. (2002) 90:1243-1250。血管生成抑制 劑在癌症治療中之用途在文獻中已知，例如參見J. Rak等 人 Cancer Research, 55:4575-4580，1995 及 Dredge 等人， Expert Opin. Biol· Ther_ (2002) 2(8):953-966 〇 企管生成在 癌症中之作用已在多種類型之癌症及組織中顯示：乳腺癌 (G. Gasparini及 A.L. Harris，J. Clin. Oncol·，1995，13:765-782 ; M. Toi等人，Japan. J. Cancer Res·，1994, 85:1045· 114734.doc -33- 200800166 1049)、膀胱癌（A.J· Dickinson等人，Br. j. ur〇l.，1994 74:762-766)、結腸癌（L.M· Ellis 等人，surgery, 1996, 120(5):871-878)及 α 腔癌（j.k· Williams 等人，Am L Surg·，1994, 168:373-380)。其他癌症包括晚期腫瘤、多毛 細胞白血病、黑素瘤、晚期頭部及頸部癌、轉移性腎細胞 癌、非霍奇金氏淋巴瘤、轉移性乳癌、乳腺癌、晚期黑素 瘤、胰腺癌、胃癌、膠質母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、非小 細胞肺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、各種實體 腫瘤、多發性骨髓瘤、轉移性前列腺癌、惡性神經膠質 瘤、腎癌、淋巴瘤、難治癒之轉移性疾病、難治癒之多發 性骨髓瘤、子宮頸癌、卡波西氏肉瘤、復發性多形性神經 膠質瘤及轉移性結腸癌（Dredge等人，Expen 〇pin Bi〇1

Ther· (2〇02) 2(8):953·966)。因此，本申請案中所揭示之 Akt抑制劑亦適用於治療該等與血管生成相關之癌症。 已經歷新血管生成之腫瘤顯示癌轉移之潛力增加。實際 上血’生成對腫瘤生長及癌轉移而言所必需。（Jg.p.

Cunningham等人，Can. Research，61: 3206-3211 (2001))。 因此，本申請案中所揭示之Akt抑制劑亦適用於預防或減 少腫瘤細胞癌轉移。 本發明之範疇中進一步包括治療或預防其中包含血管生 成之疾病的方法，其包含將治療有效劑量之本發明化合物 投與至需要該治療之哺乳動物。眼睛新血管生成性疾病為 病症之實例，其中大部分所得組織損傷可歸因於眼睛中血 官之異常滲透（參見W〇 〇〇/3〇651，2〇〇〇年6月2曰公開）。 114734.doc -34- 200800166 v透可由缺血性視網膜病（諸如由糖尿病性視網膜 病、早產兒視網膜病、視網膜靜脈阻塞等引起之缺血性視 、罔膜病）或#由退化性疾病（諸如在年齡相關性黃斑退化中 所硯察之脈絡臈新生血管）觸發。因此，藉由投與本發明 化口物來抑制a官生長將預防企管之渗透及預防或治療其 中包含血管生成之疾病，諸如眼病（如視網膜血管生成、 糖尿病性視網膜病、年齡相關性黃斑退化及其類似疾 病）。 籲本發明之範蜂中進一步包括治療或預防其中包含血管生 成之非惡性疾病的方法，該疾病包括（但不限於）··眼病（諸 如視、，、罔膜血官生成、糖尿病性視網膜病及年齡相關性黃斑 l化）動脈竭樣硬化、關節炎、牛皮癖、肥胖症及阿茲 海默氏病（Alzheimer’s disease)(Dredge 等人，Εχρ^

Biol. Ther. (2002) 2(8):953_966)。在另一實施例中，一種 治療或預防其中包含血管生成之疾病的方法，該疾病包 籲括：眼病（諸如視網膜血管生成、糖尿病性視網膜病及年 齡相關性黃斑退化）、動脈粥樣硬化、關節炎及牛皮癬。 本發明之範疇中進一步包括治療高增生性病症（諸如再 狹窄、發炎、自體免疫疾病及過敏/哮喘）之方法。 本發明之範疇中進一步包括本發明之化合物塗覆血管支 架之用途，及因此本發明之化合物在用於治療及/或預防 再狹窄之經塗覆血管支架上之用途（w〇 〇3/〇328〇9)。 本發明之範疇中進一步包括本發明之化合物用於治療及/ 或預防骨關節炎之用途（WO 03/035048)。 114734.doc -35 - 200800166 本發明之範疇中進一步包括治療高胰島素症之方法。 本發明之化合物亦適用於製備用於治療上述疾病、尤其 癌症之藥品。 根據標準醫藥實踐，本發明之化合物可單獨或與醫藥學 上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑組合在醫藥組合物中來 才又與至包括人類之哺乳動物。化合物可經口或非經腸投 與，包括靜脈内、肌肉内、腹膜内、皮下、直腸及局部投 藥途徑。

含有活性成份之醫藥組合物可呈適於口服之形式，例如 錠劑、片劑、口含劑、水性或油性懸浮液、分散性粉劑或 顆粒乳液、硬或軟膠囊或糖漿或酒劑。意欲口服之組合 物可根據此項技術中已知之任何方法來製備以供製造醫藥 組合物，且該等組合物可含有選自由甜味劑、調味劑、著 色劑及防腐劑組成之群之一或多種藥劑以提供醫藥學上精 緻且美味之製劑。錠劑含有與適於製造錠劑之醫藥學上可 接受之無毒賦形劑混雜之活性成份。例如，該等賦形劑可 為惰性稀釋劑，諸如碳_、碳_、乳糖、磷酸妈或璘 酸納；成粒劑及崩解劑’例如微晶纖維素、交賴甲基纖 維素鈉、玉米澱粉或褐藻酸；黏合劑，例如澱粉、明膠、 聚乙烯料㈣或阿拉伯膠；及潤滑劑，例如硬脂酸鎮、 硬脂酸或滑石。錠劑可未經塗覆或其可藉由已知技術塗覆 以遮蔽藥物令人不悅之味道武f 木逼或延遲在腸胃道中之崩解及吸 收’且藉此提供歷時更長時間之㈣仙1如，可採用 水溶性味覺遮蔽物質(諸如經丙基甲基纖維素或經丙基纖 114734.doc -36 - 200800166 維素）或時間延遲物質（諸如乙基纖維素、乙酸丁酸纖維 素）。 口服調配物亦可呈現為硬明膠膠囊，其中活性成份與惰 性固體稀釋劑（例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土）混合，或呈 現為軟明膠膠囊，其中活性成份與水溶性載劑（諸如聚乙 二醇）或油性介質（例如花生油、液態石蠟或橄欖油）混合。 水性懸浮液含有與適於製造水性懸浮液之賦形劑混雜之 活性物質。該等賦形劑為懸浮劑，例如鲮甲基纖維素鈉、 甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉 '聚乙烯吡咯 唆酮、頁蓍膠及阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑可為天然產生 之磷脂（例如卵磷脂），或氧化烯與脂肪酸之縮合產物（例如 聚氧乙烯硬脂酸酯），或氧化乙烯與長鏈脂族醇之縮合產 物（例如十七伸乙基氧基十六醇），或氧化乙烯與衍生自脂 肪酸與己醣醇之偏酯的縮合產物（諸如聚氧乙烯山梨糖醇 單油酸酯），或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己醣醇之偏酯 φ 的縮合產物（例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯）。水性 懸洋液亦可含有一或多種防腐劑（例如，對羥基笨甲酸乙酯 或對羥基苯甲酸正丙酯）、一或多種著色劑、一或多種調 味劑及一或多種甜味劑（諸如蔗糖、糖精或阿斯巴甜糖）。 油性懸浮液可藉由將活性成份懸浮於植物油（例如花生 油、撖欖油、芝麻油或椰子油）或礦物油（諸如液態石蠟）中 來調配。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或 十六烷醇。可添加諸如上述彼等之甜味劑及調味劑以提供 美味口服製劑。該等組合物可藉由添加抗氧化劑（諸如; I14734.doc -37 - 200800166 基化輕基甲氧苯或α-生育紛）來保存。 適於藉由添加水來製備水性懸浮液之分散性粉劑及顆粒 提供與分散劑或濕_、懸浮劑及—或多種防腐劑混雜之 活性成份。合適分散劑或濕潤劑及懸浮劑例示為上文已提 及之彼等”亦可存在額外賦形劑，例如甜味劑、調味劑及 著色劑。該#組合物可藉由添加抗氧化劑（諸如抗壞血酸） 來保存。 本發明之醫藥組合物亦可呈水包油乳液之形式。油相可 為植物油（例如撖欖油或落花生油）或礦物油（例如液態石 蠟)或該等之混合物。合適乳化劑可為天然產生之磷脂(例 如大豆㈣脂）及衍生自脂肪酶與己聽㈣之醋或偏脂（例 如脫水山梨糖醇單油酸醋）及該等偏酉旨與氧化乙稀之縮合 產物(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸醋)。乳液亦可含 有甜味劑、調味劑、防腐劑及抗氧化劑。 糖聚及酒劑可由甜味劑(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇 或庶糖）來調配。該等調配物亦可含有緩和劑、防腐劑、 調味劑及著色劑及抗氧化劑。 醫樂組合物可呈益菌可紅 ^ …函了 /主射水溶液之形式。可採用之可 接文媒劑及溶劑為水、林格氏 張氯化鈉溶液。 心雜寧，"相_及等 無菌可注射製劑亦可為無 ^ ^ ^ ^„ 囷了，主射水包油微乳液，其中 活f生成伤/谷解於油相中。 一 絰於士- 4 & J而s，可首先將活性成份溶 解於大旦油與卵磷脂之混合 d, 中。接著將油性溶液引入水 興I /由之此合物中且經虛 處理以形成微乳液。 114734.doc -38- 200800166 可注射溶液或微乳液可藉由局部快速注射引入患者血流 中。或者，可有利地以維持本發明化合物之循環濃度恆定 的方式投與溶液或微乳液。為維持該恆定濃度，可利用連 續靜脈内傳遞裝置。該裝置之實例為Deltec cADD_ plus™模型5400靜脈内泵。 醫藥組合物可呈無菌可注射水性或油性懸浮液形式以供 肌肉内及皮下投藥。根據已知技術，使用上文已提及之彼 等合適分散劑或濕潤劑及懸浮劑來調配該懸浮液。無菌可 注射製劑亦可為在無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之 無菌可注射溶液或懸浮液，例如在丨，3_丁二醇中之溶液。 此外，習知採用無g不揮發性油作為溶劑或料介質。為 達成此目㈤，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成之單 或一甘油酉曰。此外’發現諸如油酸之脂肪酸可用於注射劑 々式A化口物亦可以栓劑形式投與以供直腸投與藥物。^

等組合物可藉由將藥物與合適非刺激性賦形劑混合來集 備’該賦形劑在常溫下為圓雜 卜為口體但在直腸溫度下為液體，卫 因此在直腸中熔融以釋放蘂鉍 ^ ^ ^ 评茂梁物。该等物質包括可可脂、脅 油明膠、氫化植物油、皋鍤 曰 各種刀子置之聚乙二醇混合物及 乙二醇之脂肪酸酯。 對於局部用途而言，可採用含有式A化合物之乳膏 貧、凝膠、溶液或懸浮液等(為達成本申請案之目的 部應用應包括口部洗液及漱口劑）。 、軟 ，局 使用 一般熟習此項技街者熟 知之經皮貼片之彼等形式 114734.doc -39- 200800166 本發明之化合物可以鼻内形式經 »捕、搭壯职 用合適鼻内媒劑 及傳遞#置或經由經皮途徑來投與。為以經皮 形式投與’劑量投藥在整個給藥 ：二之 畊本發明之化合物亦可作為拴劑傳遞，其採用以下主 劑：諸如可可脂、甘油明膠'氫化植物油、各種分子量之 聚乙二醇混合物及聚乙二醇之脂肪酸酯。 里

當根據本發明之組合物投與至人類受檢者中時，每曰劑 量通常由開處方之醫師來確定’其中劑量通常根據個別： 者之年齡、重里及反應以及患者症狀之嚴重程度而變化。 利用本發明化合物之給藥方案可根據多種因素來選擇， 該等因素包括_、種類、年齡、重量、性職所治療癌 症之類型；待治療癌症之嚴重程度（亦即階段投藥途 徑，患者之腎及肝功能；及所使用之特定化合物或其鹽。 一般技術醫師或獸醫可易於確定且開出有效量之所需藥物以 治療（例如）預防、抑制（完全或部分）或阻止疾病之進程。 舉例而言，本發明之化合物可以多達1〇,〇〇〇 mg之每曰 總劑量投與。本發明之化合物可每日投與一次（QD)或分成 母曰多次劑S，諸如每曰兩次（BID)及每曰三次（tid)。本 發明之化合物可以多達1〇,〇〇〇 mg (例如2,〇〇〇 mg、3,〇〇〇 mg、4,000 mg、6,000 mg、8,000 mg或 1〇,〇〇〇 mg)之每曰 總劑量投與，其可每曰一次投與或可分成如上文所述之每 曰多次劑量投與。 舉例而言，本發明之化合物可以多達1，000 mg之每曰總 劑量投與。本發明之化合物可每日投與一次（QD)或分成每 114734.doc -40- 200800166 曰多次劑量，諸如每曰兩次（BID)及每曰三次（tid)。本發 明之化合物可以多達1，〇〇〇 mg (例如200 mg、300 mg、4〇〇 mg、600 mg、800 mg或1，〇〇〇 mg)之每曰總劑量投與，其 可每日一次投與或可分成如上文所述之每日多次劑量投 與。 此外，投藥可連續（亦即每天）或間斷。如本文所用之，，間 斷”意謂以規則或不規則之時間間隔停止及開始。舉例而 言，本發明化合物之間斷投藥可為每週投藥一至六天，咬 其可意謂循環投藥（例如連續兩至八週每曰投藥，接著伴 隨長達一週之不投藥的休息時期），或其可意謂隔日投 藥。 此外，本發明之化合物可根據上述任何時程連續投藥數 週，繼而為休息時期。舉例而言，本發明之化合物可根據 上述任何時程投藥兩至八週，繼而為一週之休息時期或一 週中之二至五天以1〇〇_5〇〇 mg之劑量每日兩次投藥。在另 一特定實施例中，本發明之化合物可連續兩週每日三次投 藥，繼而休息一週。 又 本發明化合物之任一或多種特定劑量及給藥時程均可用 於組合治療中所用之任一或多種治療劑（下文稱I 療劑"）。 一/σ 此外，該第二治療劑之特定劑量及給藥時程 >ί卜，Β具丛4 % 步變 最‘蜊置、給藥時程及投藥途徑將基於所用 二治療劑來確定。 、疋 田然’本發明化合物之投藥途徑與第二治療劑之投藥途 114734.doc -41- 200800166 徑無關。在一實施例中，本發明化合物之投藥為口服投 藥。在另一實施例中，本發明化合物之投藥為靜脈内投 藥。因此，根據該等實施例，本發明之化合物係經口或經 靜脈内投藥，且第二治療劑可經口、非經腸、經腹膜内、 經靜脈内、經動脈内、經皮、經舌下、經肌肉内、經直 腸、經頰、經鼻内、經脂質體、經由吸入、經陰道、經眼 内、經由藉由導管或血管支架之局部傳遞、經皮下、經脂 肪内、經關節内、經鞘内或以慢速釋放劑型來投與。 、此外本發明之化合物及第二治療劑可藉由相同投藥模 式來投與，亦即兩種藥劑均（例如）經口藉由靜脈内注射來 才又-、：、、、:而，藉由一種投樂模式（例如經口）投與本發明之 化&物且藉由另一種投藥模式（例如靜脈内注射或任一其 他上述投藥模式）投與第二治療劑亦在本發明之範疇内。 第一治療程序、本發明化合物之投與可在第二治療程序 (亦卩第一 /σ療劑）之别、以第二治療劑治療之後、與以第 二治療劑治療之同時或其之組合發生。舉例而言，總治療 夺期可針對本發明之化合物來決定。第二治療劑可在以本 發明之化合物治療開始前或以本發明之化合物治療後投 〃此外，抗癌治療可在投與本發明之化合物期間投與， …、翁I工本發明化合物之整個治療時期發生。 人本發明化合物亦適用於與治療劑、化療劑及抗癌劑之組 目前所揭示之化合物與治療劑、化療劑及抗癌劑之組 在本發明之範疇中。該等藥劑之實例可在V T. Devita& Heilman (編者）之 Principles and practice 〇f H4734.doc -42- 200800166

Oncology，第 6版（2001 年 2 月 15 日），Lippincott Williams & Wilkins Publishers中找到。基於藥物及所涉及癌症之特定 特徵，一般熟習此項技術者可確認藥劑之何種組合適用。 該等藥劑包括以下各物：雌激素受體調節劑、雄激素受體 調節劑、類視色素受體調節劑、細胞毒素/細胞生長抑制 劑、抗增生劑、異戊烯基蛋白轉移酶抑制劑、HMG-CoA 還原酶抑制劑及其他金管生成抑制劑、HIV蛋白酶抑制 劑、逆轉錄酶抑制劑、細胞增殖及存活信號傳輸抑制劑、 _ 雙膦酸鹽、芳香酶抑制劑、siRNA治療劑、γ分泌酵素抑制 劑、干擾受體酪胺酸激酶（RTK)之藥劑及干擾細胞週期檢 查點之藥劑。當與放射性治療共投藥時，本發明之化合物 尤其適用。 本發明之化合物與以下治療劑組合亦適用於治療癌症：阿 巴瑞克（abarelix)(Plenaxis depot®)、阿地介白素 (aldesleukin)(Prokine® )、阿地介白素（Proleukin®)、阿倫珠單抗 (Alemtuzumab)(Campath®)、亞利崔托寧（alitretinoin)(Panretin®)、 別 17票呤醇（allopurinol)(Zyloprim⑧）、六曱蜜胺（altretamine) (Hexalen⑧）、阿米福汀（amifostine)(Ethyol⑧）、安美達旋 (anastrozole)(Arimidex®)、三氧化石申（Trisenox®)、天門冬醯胺酶 (Elspar®)、阿紮胞苦（azacitidine)(Vidaza®)、貝伐單抗 (bevacizumab) ( Avastin⑧）、貝瑟羅汀（bexarotene)膠囊 (Targretin® )、貝瑟羅汀凝膠（Targretin® )、博萊黴素 (bleomycin)(Bleiioxane⑧）、硼替佐米（bortezomib)(Velcade®)、靜 脈内白消安（busulfan)(Busulfex®)、口服白消安（Myleran®)、卡 114734.doc -43- 200800166

普睾酮（calusterone)(Methosarb®)、卡西他賓（capecitabine) (Xeloda®)、卡顧（carboplatin)(Paraplatin®)、卡莫司 ί丁（carmustine) (BCNU⑧、BiCNU⑧）、卡莫司汀（Gliadel®)、具有聚苯丙生 (Polifeprosan) 20植入物之卡莫司 ί丁（Gliadel Wafer®)、賽利克西 (celecoxib)(Celebrex®)、西妥昔單抗（cetuximab)(Erbitux⑧）、苯丁 酸氮芥（chlorambucil)(Leukeran®)、順始（cisplatin)、 (Platinol⑧)、克拉屈濱（cladribine)(Leustatin®、2-CdA⑧）、克羅 拉濱（clofarabine)(Clolar®)、環填胺（Cytoxan®、Neosar®)、環 填酿胺（Cytoxan Injection®)、環填醢胺（Cytoxan Tablet®)、阿糖 胞普（cytarabine)(Cytosar-U®)、阿糖胞苦脂質（DepoCyt®)、達 卡巴嗓（dacarbazine)(DTIC-Dome®)、放線菌素 D(dactinomycin、 actinomycin D ) ( Cosmegen® ) ^ 達依泊汀（Darbepoetin) α (Aranesp®)、道諸黴素（daunorubicin)月旨質（DanuoXome⑧）、道諾 黴素、柔毛黴素（daunomycin)(Daunorubicin®)、道諾黴素、柔 毛黴素（Cerubidine®)、地尼介白素（Denileukin diftitox) (Ontak®)、地拉佐生（dexrazoxane)(Zinecard⑧）、多烯紫杉醇 (Taxotere®)、阿黴素（Adr iamy cin P F S ⑧）、阿黴素 (A dr i amy c i η⑧、Rub ex® )、阿黴素（Adriamycin PFS Injection㊣）、阿黴素脂質（Doxil⑧）、屈他胸酮（dromostanolone)丙 酸醋（dromostanolone®)、屈他胸酮丙酸SI (masterone injection㊣）、艾黎特氏B溶液（Elliotfs B Solution®)、表柔比星 (epirubicin)(Ellence⑧）、α依泊 ί丁（Epoetin)(epogen®)、埃羅替尼 (6^〇1111^3)(丁&1^¥&(^)、雌莫司汀（681：瓜111118111^)@1]1〇5^^)、依託泊 普（etoposide)填酸醋（Etopophos ⑧）、依託泊 * VP-16 114734.doc -44- 200800166

(Vepesid⑧）、依西美坦（exemestane)(Aromasin㊣）、非格司亭 (Filgrastim)(Neuρ〇geη⑧）、氟尿苦（f 1 οXuridine)(動脈 内）（FUDR⑧）、篆達拉賓（fludarabine)(Fludara®)、氟尿嘯 口定 5_FU (Adrucil⑧）、氣維司群（fulvestrant)(Faslodex⑧）、吉非替 尼（gefitinib)(IΓessa®)、吉西他濱（gemcitabine)(Gemzar⑧）、吉妥 珠單抗奥 ϋ坐米星（gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg®)、戈舍瑞 林（goserelin)乙酸酉旨（Zoladex Implant®)、戈舍瑞林乙酸醋 (Zoladex®)、組胺瑞林（histrelin)乙酸酉旨（Histrelin implant⑧）、經 基脲（Hydrea®)、替伊莫單抗（Ibritumomab Tiuxetan)(Zevalin®)、 伊達比星（idambicin)(Idamycin⑨）、異環填醯胺（IFEX®)、甲石黃 酸伊馬替尼（imatinib mesylate)(Gleevec®)、α干擾素-2a (Roferon A®)、α干擾素-2b (Intron A®)、伊立替康（irinotecan) (Camptosar⑧）、來那度胺（lenalidomide)(Revlimid⑧）、來曲嗤 (letrozole)(Femara®)、亞葉酸（Wellcovorin®、Leucovorin⑧）、亮 丙瑞林乙酸酉旨（Leuprolide Acetate)(Eligard⑧）、左旋17米嗤 (levamisole)(Ergamisol⑧）、羅莫司丁（lomustine)CCNU(CeeBU⑧）、 莫克胺（meclorethamine)、氮芥（Mustargen®)、曱地孕酮乙酸酯 (megestrol acetate) ( Megace㊣）、美法命（melphalan) L-PAM(Alkeran⑧）、魏 σ票呤 6_MP (Purinethol⑨）、美司鈉（mesna) (Mesnex⑧）、美司鈉（Mesnex tabs⑧）、曱胺鳴呤（Methotrexate®)、 甲氧沙林（methoxsalen)(Uvadex⑧）、絲裂黴素C(Mutamycin®)、 米托坦（mitotane)(Lysodren⑧）、米托蒽酉昆（mitoxantrone) (Novantrone⑧）、苯丙酸諾龍（nandrolone phenpropionate) (Durabolin-5 0⑧）、奈拉濱（nelarabine)(Arranon⑧）、諾弗莫泊 114734.doc -45- 200800166

(Nofetumomab)(Verluma⑧）、奥普瑞白介素（Oprelvekin) (Neumega®)、奥賽力泊（oxaliplatin)(Eloxatin⑧）、紫杉醇 (Paxene®)、紫杉醇（Taxol®)、紫杉醇蛋白結合微粒 (Abraxane㊣）、帕利福明（palifermin)(Kepivance®)、帕米膦酸鹽 (Aredia®)、培力口酶（pegademase) ( Adagen (Pegademase Bovine)®)、培門冬酶（Oncaspar®) '乙醇化非格司亭 (Pegfilgrastim)(Neulasta®)、培美曲塞二納鹽（pemetrexed disodium) (Alimta®)、喷司他丁（pentostatin)(Nipent⑧）、口辰泊漠烧 (pipobroman)(Vercyte⑧）、普卡黴素（plicamycin)、米拉黴素 (mithramycin)(Mithracin®)、外吩姆鈉（porfimer sodium) (Photofrin®)、丙卡巴肼（procarbazine)(Matulane⑧）、米帕林 (quinacrine)(Atabrine®)、拉布立酶（Rasburicase)(Elitek⑧）、利 妥昔單抗（Rituxan®)、沙莫司亭（sargramostim)(Leukine⑧）、沙 莫司亭（Prokine®)、索拉非尼（sorafenib)(Nexavar®)、鏈脲黴素 (streptozocin)(Zanosar®)、順丁烯二酸舒尼替尼（sunitinib maleate) (Sutent®)、滑石（Sclerosol㊣）、他莫昔芬（tamoxifen) (Nolvadex⑧）、替莫 σ坐胺（temozolomide)(Temodar⑨）、替尼泊戒 VM_26 (Vumon⑨）、睾内醋（testolactone)(Teslac⑨）、硫代鳥 11 票呤 6-TG (Thioguanine®)、塞替派（thiotepa)(Thioplex®)、托泊替 康（topotecan)(Hycamtin®)、托瑞米芬（toremifene)(Fareston®)、托 西莫單抗（Tositumomab)(Bexxar®)、托西莫單抗/1-13 1托西莫 單抗（Bexxar®)、曲妥珠單抗（Trastuzumab)(Herceptin®)、維 A酸 (tretinoin)ATRA (Vesanoid®)、尿嘴唆氮芥（Uracil Mustard)(Uracil Mustard Capsules®)、戊柔比星（valrubicin)(Valstar®)、長春花驗 114734.doc -46- 200800166 (Velban )、長春新驗（〇nc〇vin⑧ (NaVelbine® )及唑來臚辦臨 長春舄負（vnu^bine) 膦-夂孤(zoledronate)(Zometa®)。 此，本發明之範轉包括本發明所主張之化合物與選自 :下各物之第二化合物組合的用途··雌激素受體調節劑、 雄激素受體調節劑、類視色 、見色素又體調卽劑、細胞毒素/細 劑、抗增生劑、異戊稀基蛋白轉移酶抑制劑、 HMG-COA還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉錄酶抑

制劑、血管生成抑制劑、PPAR1促效劑、PPAR-δ促效 劑、固有抗多種藥之抑制劑、止吐劑、用於治療貧血之藥 劑:用於治療嗜中性球減少症之藥劑、免疫促進藥物、細 胞增殖及存活信號傳輸抑制劑、雙膦酸鹽、芳香酶抑制 劑、siRNA治療劑、情泌酵素抑制劑、干擾受體路胺酸激 酶（RTK)之藥劑、干擾細胞週期檢查點之藥劑及上文所列 之任何治療劑。 關於本發明化合物之術語"投藥"及其變形（例如"投與，，化 φ 合物）意謂將化合物或化合物之前藥引入需治療之動物系 統中。當本發明之化合物或其前藥與一或多種其他活性劑 (例如’細胞毒素劑等）組合提供時，"投藥，，及其變形各自 應理解為包括化合物或其前藥與其他藥劑同時引入及相繼 引入。 如本文所用之術語"組合物”意欲包括包含指定量之^〜 成份的產物，以及直接或間接源於該等指定量之指定成个、 之組合的任何產物。 如本文所用之術語"治療有效量"意謂在組織、系統、動 114734.doc -47- 200800166 物^人類中引起生物學或醫學反應之活性化合物或醫藥劑 的量’其係藉由研究者、獸醫、醫師或其他臨床醫師來尋 求。 々術語"治療癌症”或”絲之治療,，係指對受癌症折磨之哺 礼動物#又藥’ |係指冑由殺死癌細胞來減輕癌，症之作用， 亦係指導致對於癌症生長及/或轉移之抑制的作用。 申請專利範圍之範疇中亦包括治療癌症之方法，其包含 籲=治療有效量之本發明化合物與放射性治療組合及/或與 k自以下各物之第二化合物組合來投藥··雌激素受體調節 劑、雄激素受體調節劑、類視色素受體調節劑、細胞毒素/ 細胞生長抑制劑、抗增生劑、異戊烯基蛋白轉移酶抑制 劑、HMG_C〇A還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉錄 酶抑制劑、血管生成抑制劑、ρρΑΚ_γ促效劑、ppAR_s促 效劑、固有抗多種藥之抑制劑、止吐劑、用於治療貧血之 藥劑、用於治療嗜中性球減少症之藥劑、免疫促進藥物、 φ 細胞增殖及存活信號傳輸抑制劑、雙膦酸鹽、芳香酶抑制 劑、siRNA治療劑、γ分泌酵素抑制劑、干擾受體酪胺酸激 酶（RTK)之藥劑、干擾細胞週期檢查點之藥劑及上文所列 之任何治療劑。 本發明亦包括用於治療或預防癌症之醫藥組合物，其包 含治療有效量之本發明化合物及選自以下各物之第二化人 物：雖激素受體調節劑、雄激素受體調節劑、類視色素受 體調節劑、細胞毒素/細胞生長抑制劑、抗增生劑、異戊 烯基蛋白轉移酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、HIV蛋 114734.doc -48- 200800166 白_抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、血管生成抑制劑、PPAR-γ 促效劑、PPAR-δ促效劑、細胞增殖及存活信號傳輸抑制 劑、雙膦酸鹽、芳香酶抑制劑、siRNA治療劑、γ分泌酵素 抑制劑、干擾受體赂胺酸激酶（RTK)之藥劑、干擾細胞週 期檢查點之藥劑及上文所列之任何治療劑。 所確定之所有專利、公開案及申請中之專利申請案均以 引用的方式併入本文。 用於化學描述中及以下實例中之縮寫為：AEBSF (對胺 • 基乙基苯磺醯氟）、BSA (牛血清白蛋白）、BuLi (正丁基 鋰）、CDC13 (氯仿-d)、Cul (碘化銅）、CuS04 (硫酸銅）、 DCE (二氣乙烷）、DCM (二氯曱烷）、DEAD (偶氮二羧酸 二乙酯）、DMF (N，N-二曱基曱醯胺）、DMSO (二曱亞砜）、 DTT (二硫蘇糖醇）、EDTA (乙二胺四乙酸）、EGTA (乙二 醇四乙酸）、EtO Ac (乙酸乙酯）、EtOH (乙醇）、HOAc (乙 酸）、HPLC (高效液相層析法）、HRMS (高解析度質譜）、 LCMS (液相層析-質譜儀）、LHMDS (雙（三甲基矽烷基）醯 ® 胺鋰）、LRMS (低解析度質譜）、MeOH (曱醇）、MP-B (CN)H3 (大孔氰基硼氫化物）、NaHC03 (碳酸氳鈉）、 Na2S04 (硫酸鈉）、Na (OAc)3BH (三乙醯氧基硼氫化鈉）、 NH4OAc (乙酸銨）、NBS (N-溴代丁二酸醯胺）、NMR (核 磁共振）、PBS (磷酸鹽緩衝生理食鹽水）、PCR (聚合酶鏈 反應）、Pd(dppf) ([1，Γ-雙（二苯基膦基）二茂鐵]鈀）、 Pd(Ph3)4 (肆-三苯基膦鈀（0))、P0C13 (氧氯化磷）、PS-DIEA (聚苯乙烯-二異丙基乙基胺）、PS-PPh3 (聚苯乙烯-三苯基 114734.doc -49- 200800166

膦）、TBAF (氟化四丁基銨）、(四氯咬喃）、tfa (三氟 乙酸）、TMSCHaN2 (三甲基矽烷基重氨曱烷）及& (乙醯 基）、BOC (第二丁氧基羰基）、Bu (丁基卜㈤（計算值）、 Calc’d(計算值）、DIEA (二異丙基乙基胺）、DMAp(‘二甲 胺基吡啶）、EDC (N-乙基-N，_(3_二甲胺基丙基）碳化二醯亞 胺）、Eq (當量）、Et (乙基）、H〇BT (經基苯并三唾）、IpA (異丙醇）、LC/MS (液相層析_質譜儀）、Me (甲基）、MeCN (乙腈）、NMP (N-甲基吼咯啶酮）、Pr (丙基）、pyr (吼啶）、 Sat (飽和）及Tosic (對甲苯磺酸）。 除文獻中已知或實驗程序中例示之其他標準操作以外， 本發明之化合物可藉由採用以下反應流程中所示之反應來 製備。因此，為達成說明之目的，下文之說明性反應流程 不文限於所列之化合物或所採用之任何特定取代基。反應 流程中所不之取代基編號無需與用於申請專利範圍中之取 代基編號相關，且為清晰起見，通常將單一取代基顯示為 φ 連接至在上文式A定義下允許多個取代基之化合物。 本發明化合物之初始合成顯示於反應流程1-1；^中。用以 產生本發明化合物之最終反應顯示於反應流程χ_χιν中。 反應流程綱要 以下反應流程、反應流程Μχ為製備本發明化合物之雙 環部分提供有用詳情。 /所需中間物纟某些情況下係可購才寻，或可根據文獻程序 來製備。如反應流程[中所說明，經合適取代之苯基乙炔 化物可與峨化銅反應以形成相應乙炔銅（例如參見 114734.doc -50- 200800166

Sonogashira，K.; Toda5 Υ·; Hagihara, Ν· Tetrahedron Lett. 1975, 4467)。中間物1-1接著可與經合適取代之親電子部分 反應以產生經不對稱取代之1-2。與NBS反應繼而水解產生 1-3 (例如參見 Yusybov，M.S.; Filimonov，V.D·; Synthesis 1991，2，131)。各種經取代及未經取代之芳基及雜環基亦 可購得。 反應流程ΙΓ說明以經合適取代之II-1開始製備化合物。 該中間物可與經合適取代之胺反應以提供中間物Π-2，該 中間物II-2可與合適芳基或雜芳基二胺反應以提供通常可 經層析分離之本發明化合物之位向異構混合物。 反應流程III說明另一雙環雜環基之合成。 反應流程IV說明自經合適取代之4-胺基_3_硝基苯曱腈 IV-1開始製備化合物。該中間物接著可經受微波促進之 [3+2]環加成反應以產生四唑IV-II。酸性四唑與親電子試 劑（諸如曱基碘）之烷基化反應產生可藉由管柱層析分離之 烷基化四唑的2-甲基（iv-m)/i-甲基（ιν-ιν)混合物。iv-iii 之Ra-Ni氫化反應產生二胺IV-V。進一步合成係如上文反 應流程中所述般。 反應流程V說明化合物之合成。經合適取代之芳基或雜 芳基胺基酸與經合適取代之酮的弗裏德倫德（Friedlander) 環縮合反應產生式V-1之中間物。羧酸官能基轉化為醛官 能基可產生中間物V-2，且此轉化係藉由熟習此項技術者 熟知之方法完成。以經合適取代之胺的還原性烧基化反應 可提供式V-3之化合物。 114734.doc -51- 200800166 反應流程VI說明中間物V-2之替代合成。 反應流程VII說明自根據文獻（Renault，0·; Dallemagne， Ρ·及 Rault，S. Org. Pirep· Proced. Int·，1999, 31，324)製備之 酮VII-1開始合成化合物。VII-1與N，N二曱基曱醯胺二甲 基縮醛之縮合反應產生酮-烯胺VII-2，該酮-烯胺VII-2與 2-氰基乙醯胺環化以產生吡咬酮VII-3。以氧氯化磷處理 VII- 3產生氯吡啶VII-4。溴化基團，繼而以經合適取代之 胺置換可產生胺VII-5。氯煙鹼腈VII-5與多種雙親核試劑 ® 之後續反應提供環化結構VII-6。 反應流程VIII說明1，6-喑啶-6(5H)__化合物之製備。合 成始於可購得之羧酸（VIII-1)，其轉化為Weinreb醯胺 (VIII-2)。醯胺與經由芳基溴與正丁基鋰之鋰-鹵素交換反 應所產生之芳基鋰試劑反應可提供酮（VIII-3)。該經取代 之酮與4-胺基煙鹼醛在鹼（例如氫氧化鈉或甲醇鈉）存在下 進行縮合反應可產生1，6_嗉啶（VIII-4)。苯基上之R取代基 可為官能基，諸如（矽烷基）受保護之羥甲基、經遮蔽之醛 (亦即縮醛）或羧酸。該物質可轉化為所需醛VIII-4。當R基 為羥甲基時，以諸如活化二氧化錳之試劑氧化產生醛 VIII- 4。當R為縮醛時，溫和酸水解產生醛。經由混合酐 與硼氫化物之還原反應來還原羧酸基團亦產生醛VIII-4。 該醛接著可與多種胺（例如經4-取代之哌啶）及硼氫化物進 行還原性胺化反應以提供1，6-峰啶-5(H)-酮（VIII-5)。在 15 0°C下以氫氯化吡錠處理（VIII-5)產生最終產物（VIII-6)。環Z意謂視情況經取代之芳基或雜環基。 114734.doc -52- 200800166 反應流程IX說明在C3位上引入雜環之替代方案。其妒於 可購得之二氯苯并吡嗪，其可在鈀催化劑存在下偶^至° = 基硼酸上（Suzuki反應）。接著在相同反應條件下與另一= 環硼酸重複該反應以提供最終產物。環2意謂視情況經取 代之芳基或雜環基。

反應流程I

Ra CSC—Η CSC~Cu

X、 ^為芳基或雜環基 C三c

•R 1-2

NBS

DMSO c—c

1-3

反應流程II

〇 為芳基或雜環基

11-1 114734.doc -53- 200800166

反應流程in

114734.doc -54- 200800166

N〇2 IV-I nh2 反應流程ιν

NaN3 (3 當量) ZnBr2(2 當量) 微波 160 °C, 15 min

IV-II ΤΕΑ(0·5 當量）—> K2C〇3 (2當漏 Η3。-％ CH3I(4 當量 f THF,室溫 o/n

iV-lil CH3

IV-IV N〇2 nh2

H3C—N、

Ni/H2 (50 psi)

MeOH/EtOAc 室溫，〇/n

反應流程V

1) iBuOCOCI,TEA,THF,OeC

2) NaBH4, MeOH.RT P比陡-so3

TEA, DMSO

hQ

HOAc, DMF

NaBH(OAc)3 114734.doc -55- 200800166

反應流程VI

反應流程VII

NH〇 NaH, DMF, 90 °C

〇為芳ii雜雜 0

nc、A 1. NBS, CHCI3 過氧化苯甲醯 2. THF/MeOH, q u R 八 NH2 第三丁醇鉀

DMF, 140°C

114734.doc -56- 200800166

反應流程VIII

CDI, (MeO)NHMe 、環z VIIf-2 ηΒυϋ

環2 VHI-3

NHBoc H

1) NaOMe VIII-1

NaBH(OAc)3

2) HCl/THF

VIII-4

反應流程IX

Pd(Ph3P)2CI2l CsC03 dme/h2o/dmf 微波 160 0C, 10 min

反應流程之最終綱要 以下反應流程、反應流程X-XVI及XVIII為製備本發明 化合物之三環部分提供有用詳情。 所需中間物在某些情況下可購得，或可根據文獻程序來 製備。以P0C13處理經合適取代之芳基或雜芳基中間物X-1 -57- 114734.doc 200800166 產生式X-2之中間物。氯官能基轉化為醯肼官能基產生中 間物Χ-3，且此轉化係藉由熟習此項技術者熟知之方法而 完成。以經合適取代之二咪唑前驅物環化提供式Χ-4之化 合物。 反應流程XI說明式Χ-4化合物之替代合成。 反應流程XII說明式ΧΙΙ-2化合物之合成。Χ-3與適當氯 乙酸三曱氧基酯之縮合反應產生氯甲基中間物ΧΙΙ-1，其 經由親核置換而產生結構ΧΙΙ-2。 反應流程XIII說明三唑并峰啶化合物之製備。合成始於 文獻/專利已知之喑啶酮（ΧΙΙΙ-1)，其在回流條件下經 POCl3處理後轉化為氯化< 口定（ΧΙΙΙ-2)。後一化合物與純月序 且在回流條件下反應提供醯肼（XIII-3)，其在合成三唑并 喑啶化合物中充當重要中間物。該醯肼（XIII-4)在指定條 件下轉化為所需三唑并喑啶化合物完成所計劃之合成。三 唑基部分上之R取代基可為官能基，諸如胺基、側氧基或 硫醇基。 反應流程XIV說明在分子之左側部分引入三唑基部分之 替代方案。其姶於先前合成之中間物醯肼(ΧΠΙ_3)，該醯 肼（ΧΙΙΙ-3)可經原乙酸三曱氧基酯處理以產生所要最終產 物三唑基嗱啶化合物（XIV-1)。三唑基部分上之R取代基可 為官能基，諸如質子、簡單烷基、氯曱基或官能化烷基。 反應流程XV說明使用三種不同之還原胺化方法以在节 基位置上引入一級胺來合成式XV-1化合物。該等方法亦可 用於其他醛，諸如式XVII-1之化合物。 114734.doc -58- 200800166 反應流程XVI說明使用反應流程VIII中所示之環縮合反 應之各種條件來合成式XVI-2化合物。使用非質子性溶劑 及鹼使得可生成結構XVI-2之氯喳啶。環Z意謂視情況經取 代之芳基或雜環基。 反應流程XVIII說明式XVIII-2化合物之合成，其為反應 流程XI中所述之三唑合成之變體。在此情況下，將肼 XVIII-1偶合至羧酸，且將中間物醯肼在酸催化下環化為 稠合三唑。環Z意謂視情況經取代之芳基或雜環基。

反應流程X

〇為芳基或雜環基

POCI3 120°C, 5 hr

114734.doc -59- 200800166 反應流程χι C)為芳基或雜環基

反應流程XII

114734.doc •60- 200800166

反應流程XIII

反應流程XIV

反應流程XV

〇

NH2 或 i. (BOC)NH2f Et3SiHt TFA

ii. HCI

反應流程XVI

XVl-1 114734.doc -61- 200800166

反應流程XVIII

XVIII-1

R

r1co2h i. EDC，HOBT ii. AcOH

實例

一步理解本發明。所 步說明本發明且不限 所k供之實例及流程意欲有助於進 用之特定物質、種類及條件意欲進一 制其合理範轉。 流程1

4 hr P0CI3,120 °C,

9-苯基-8-(4-{[4·(5_μ_2基 _1Hl24 基]甲基}苯基）【M，4]三唾并[3 ^冬基）旅啶小 5盡3贫* 唆井i3’4 fM’6-嗜咬-3-胺（1 一 4) 氣-3-本基_2_(4_{【4和比咬_2基 旅咬小基】甲基㈣^州U2) ’，嗤.3_基） 114734.doc -62 - 200800166 在具有攪拌棒之25 mL RB燒瓶中饋入3_苯基-2-(4-{[4-(5-°比咬-2-基-111-1，2,4-三吐-3-基）旅咬-1-基]甲基}苯基）-1，6-嗓咬-5(6H)-酮（0.86 g，1_6 mmol)，繼而饋入無水 p〇ci3 (8 mL)。將混合物加熱至120°C，且在回流下攪拌4小時。 在將反應冷卻至室溫後，將反應混合物小心添加至冷的飽 和NaHC03水溶液（20 mL)與EtOAc (20 mL)之混合物中。在 整個驟冷過程中，將含水層之pH維持在約pH 8-9。將水溶 液進一步以EtOAc (15 mL)萃取兩次，且將殘餘物以MeOH (20 mL)洗滌。將有機相組合且真空濃縮以產生5_氯_3_苯 基 _2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-111-152,4-三唑-3-基）哌啶-1-基]曱 基}苯基）-1，6-喑啶（1-2)(900 mg)。粗物質無需進一步純化 即直接用於下一步驟中。 5-肼基-3-苯基 _2-(4_{[4-(5-吡啶-2-基 _1H-1，2,4-三唑 _3- 基）哌啶-1-基]曱基}苯基）-1，6_嗱啶（1-3) 在具有攪拌棒之25 mL RB燒瓶中饋入5·氯-3-苯基-2-(4-{[4-(5-°比唆-2_基_1H-1，2,4_三嗤_3_基）旅咬_1_基]曱基}笨 基）-1，6_哈咬（1-2) (900 mg，1.6 mmol)，繼而饋入無水 NH2NH2 (8 mL)。將懸浮液加熱至110°C，且在回流下檀摔 5小時。在將反應冷卻至室溫後，將反應混合物真空濃縮 以產生微黃色粉末（900 mg)。粗產物無需進一步純化即用 於下一步驟中。 9-苯基 _8_(4-{[4-(5_吡啶-2-基-111-1，2,4-三唑-3-基）哌啶· 1-基]甲基}苯基）[1，2,4】三唑并[3,44]-1，6_喑啶-3_胺（14) 在 DMF (1.5 mL)中之 5_ 肼基-3-苯基 _2-(4-{[4_(5·吡啶 一2- 114734.doc -63 - 200800166 基-1H-1，2,4-三唑-3-基）痕啶小基]甲基}苯基奈啶（1-3) (7G mg，0.126 mmol)中添加文獻已知之ι，ι_二]Η·味吐-1·基甲烧亞胺（102 mg5 0·633 mmol)。將反應混合物在85°c 下攪拌4小時，真空濃縮，且經層析以產生呈其三敦乙酸 鹽形式之所要9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶-2-基_1H-1，2,4-三唑-3-基）旅啶小基]甲基}苯基川二#]三唑并[3 + f]]，“奈啶_ 3-胺（1-4) (46 mg)。4 NMR: (500 MHz，CDC13) δ 8.76 (s， 1Η)，8.74 (d，J=4.3 Ηζ，1Η)，8·29-8·27 (m，2Η)，8·19 (m， 1H)，7·67 (m，1H)，7.54-7.53 (m，2H)，7.48-7.46 (m，2H)， 7.47 (d，J=7.7 Hz，1H)，7.34-7.26 (m，5H)，4.43 (s，2H)， 3.65 (br d? J=10.9 Hz, 2H)5 3.46 (br s? 1H), 3.27-3.19 (m3 2H)，2.50-2.42 (m，2H)，2.10-2.06 (m，2H)。 以類似於流程1中所示及反應流程中所示之方式製備表i 中之以下化合物。 表1 化合物 結構 名稱 HRMSm/z (M+H) 1-5 9-苯基-8·(4_{[4-(5-吡啶-2·基-1 Η-1，2,4-二σ坐-3 基)哌啶基]曱 基}苯基)[1，2,4] 三唾并[3,4-f]_ 1，6-鳴咬-3-酚 yj.VX A X I 579.3 1-6 9-苯基 (4-吡啶-2-基-1H-咪唑4-基)哌 啶+基]甲基}苯 基)[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l56-口奈咬-3-胺 577.3 114734.doc • 64- 200800166 1-7

9-苯基 595.2 °比 ^定 -2- 基- 1Η-1，2,4-三唑-3- 基)哌啶小基]甲 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]- 1，6-峰咬-3·硫醇

流程2

3-甲基_9-苯基-8-(4_{[4-(5-吡啶-2-基-111-1，2,4-三唑-3_ 基）旅咬-1-基】甲基}苯基）[1，2,4】三唑并[3,4-f]_l，6_喑啶 (2-2) 在 DMF (1.0 mL)中之 5-肼基-3_ 苯基-2-(4-{[4-(5·η 比啶 _2_

基-1Η-1，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-基]甲基}苯基>16•喑啶 1) (55 mg，0.101 mmol)中添加原乙酸三甲酯（〇 63 mL，5 〇4 mmol)。將反應混合物在l〇〇°C下攪拌3小時，且接著真空 濃縮’且經層析以產生呈其三I乙酸鹽形式之所要3 _甲基_ 9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-1^1-152,4_三唑-3_基）哌啶_1_ 基]甲基}苯基）[152,4]三唑并[3,4-巧-156-喑啶（2_2)(28 mg) 〇 lU NMR: (500 MHz, CDC13) δ 8.87 (s5 1H)5 8.65 (d5 J=6.4 Hz，1H)，8.33 (d，J=7.5 Hz，1H)，8·11 (d5 J=7.8 Hz， 1H)，7.92 (t，J=7.8 Hz，1H)，7.49-7.41 (m，3H)，7·36_7·3〇 (m，8H)，3·61 (s，2H)，3·02-3·00 (m，2H)，3.0〇-2·84 (m， 1H)，2.25-2.21 (m，2H)，2·1〇_1·83 (m，4H)，1·97 (s 3h)。 114734.doc -65 - 200800166 以類似於流程2中所示及反應流程中所示之方式製備表1 中之以下化合物。 表2 化合物 結構 名稱 HRMS m/z (M+H) 2-3 9-苯基-8-(4- {[4_ (5-0比咬-2-基-111-1，2,4-三唑-3-基） 旅咬-1·基]甲基} 苯基)[1，2,4]三唑 并[3,4-f]-l，6-喑啶 563.3 2-4 a^jCTCu 3-(氣曱基)-9-苯 基-8-(4-{[4-(4-吼 咬-2-基-1H-味嗤-1-基)旅唆-1-基] 甲基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]-l，6- 610.2 2-5 3·[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-9-苯基-8-(4-{[4-(5-吼啶-2-基-1Η-1，2,4_ 三 唑-3-基)旅咬-1-基]甲基}苯 基)[1，2,4]三唑并 [354-f]-l，6-喊咬 675.4 2-6 2-({[9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶-2_基 lH-l，2,4-三唑-3-基)娘唆-1-基]甲 基}苯基)[I，2,4]三 唑并[3,4-f]-l，6-嗉 啶-3-基]甲基}胺 基)乙醇 636.3 114734.doc 66- 200800166

流程3

8-(4-胺基甲基-苯基）-9-苯基-[1，2,4]三唾并[3,4-f】[l，6】^ 啶-3-酚（3-8) 步称A : (2_氣-3-甲醯基w比咬·4-基）胺基甲酸第三丁醋（3-1) 將4-胺基-2-氣η比咬（1.28 gm，10 mmol)與二碳蔽二第三 丁酯（2.21 gm，10.1 mmol)於THF (20 mL)中之溶液冷卻至 0°C，且在維持〇°C以下之溫度下緩慢添加1 Μ雙（三甲基矽 烷基）醯胺鋰於THF (20 mL，20 mmol)中之溶液。使反應溫 至室溫達一小時，且接著藉由添加1.5 N氯化銨水溶液（15 mL)來驟冷。攪拌若干小時後，將反應萃取至乙酸乙酯 中，以鹽水洗滌，將有機層乾燥（Na2S〇4)，過濾且蒸發。 將殘餘物用乙醚濕磨，產生純（2-氯吡啶-4-基）胺基曱酸第 三丁 _。將母液在以25-45%乙酸乙酯/己烷溶離之矽膠上 層析以產生更多產物。 114734.doc -67- 200800166 在惰性氣氛下將（2-氯吡啶-4-基）胺基曱酸第三丁酯（1 · 14 gm，5 mmol)於無水THF (20 mL)中之溶液冷卻至-70°C，且 緩ί艾添加1·7 Μ第三丁基裡/戊院（8 mL，13 ·5 mmol)。將反 應擾拌兩小時，且接著添加無水DMF (1.2 mL，15.5 mmol)。使反應經三小時缓慢溫至室溫。將反應混合物用3 N HC1 (12 mL)驟冷，且用乙醚稀釋。將醚層用NaHC03水 溶液洗滌，乾燥（經Na2S〇4)，過濾且蒸發。將殘餘物用冷 乙鱗濕磨以產生純（2_氣_3_甲醯基吡啶_4_基）胺基甲酸第三 丁醋。將母液在以15-20%乙酸乙酯/己烷溶離之矽膠上層 析以產生額外產物。iH-NMR (500 MHz，CDC13): δ 11.0 (1Η，br s)，1〇·52 (1Η，s)，8·38 (1Η，d，J=6 Ηζ)，8.31 (1Η，d， J=6 Hz)，1·54 (9H，s); m/e (m+1): 257.2。 步驟B : 1_【4-(1，3_二氧戊環-2-基）苯基卜2-苯乙酮（3_2) 在 4-氰基苯甲醛（2〇·〇 g，152.5 mmol)與乙二醇（25.5 mL， 457.5 mmol)於甲苯（250 mL)中之溶液中添加對曱苯磺酸 (300 mg)。燒杯裝配有迪恩_斯達克（Dean-Stark)收集器， 且將混合物加熱至回流。5小時後，濃縮混合物。將殘餘 物吸收於乙酸乙酯中且用飽&NaHC〇3、水（2次）及鹽水洗 滌。將有機層乾燥（MgSCU)，過濾且濃縮以產生呈透明油 狀之4-(1，3-二氧戊環_2_基）苯甲腈，其在真空下固化·· ιΗ_ 丽R (500 MHz，CDC13): δ 7·67 (2H，d，J=8.06 Hz)，7.59 (2H，d，J=8.30 Hz)，5.85 (1H，s)，4.13-4.05 (4H，m)。 在OC下在4-(1，3·二氧戊環_2_基）苯甲腈（5〇 g，28 54 mmol)於無水THF (100 mL)中之溶液中緩慢添加苄基氯化 114734.doc -68 - 200800166 鎂（36 mL ’ THF 中之 20% wt溶液，43 mmol)。一小時後， 將混合物溫至室溫。四小時後，將混合物冷卻至，且 用飽和NHiCl驟冷。將混合物溫至室溫且用乙酸乙酿萃取 (3次）。將經組合之有機層乾燥（MgSCU)，過濾且濃縮。急 驟管柱層析（10%乙酸乙酯/己烷）產生呈淺黃色固體狀之 [4_(1，3_二氧戊環-2-基）苯基]-2-苯乙酮：Α-νμκ (5〇〇 MHz, CDC13): δ 8·02 (2H，d，J=8.30 Hz，)，7.57 (2H，d， J=8.30 Hz，），7.38-7.24 (%H，m)，5.86 (1H5 s)，4·29 (2H, s)， 籲 4.28-4.09 (4H，m)。 步驟C : 5-氣_2_(4_[1，3]二氧戊環_2_基-苯基）-3_苯基七/】 喑啶（3-3) 在室溫下，在（2-氯-3-甲醯基吼咬-4-基）胺基曱酸第三丁 醋（3_1，30.5 g，118.9 mmol)與 1-[4-(1，3·二氧戊環 _2_基）苯 基]-2-苯乙酮（3-2，29.0 g，108.1 mmol)於無水 THF (300 mL)中之溶液中添加LHMDS流（1 Μ於THF中，248 mL)。 φ 將反應混合物在室溫下隔夜·攪拌，且接著將其回流24小 時。將其冷卻且濃縮為漿狀，且用NaHC03 (飽和，50 mL) 與水（300 mL)處理以形成固體，該固體經由過濾來收集。 將固體乾燥，用醚洗滌，且進一步用甲苯共沸乾燥以產生 標題化合物。LRMS m/z (M+1)計算值：389.1，實驗值 389.1 〇 步驟D · [2_(4-[1，3】二氧戊環-2-基-苯基)_3_苯基-[1，6】嗉唆_ 5-基卜肼（3-4) 將5-氯-2-(4-[1，3]二氧戊環-2-基-苯基）-3-苯基-[1，6]喑啶 114734.doc -69- 200800166 (3-3，5·2 g，13·4 mmol)與無水肼（5 mL)於無水 1，4-二鳴烧 (15 mL)中之懸浮液在微波反應器中於1〇(rc下加熱5 min。 將反應混合物冷卻，濃縮且經甲苯共沸乾燥以產生呈固體 狀之標題化合物。LRMS m/z(M+l)計算值：385.2，實驗 值 385.3。 步驟E : 8-(4-[1，3】二氧戊環-2-基苯基）-9-苯基-[1，2,4]三唑 并[3,4-£][1，6】嗜咬-3-紛（3-5) 於〇°C下’在[2-(4-[1，3]二氧戊環-2-基-苯基）-3-苯基- [1，6]鳴唆-5-基]-肼（3-4，5·3 g5 13.8 mmol)於 CH2C12(無 水4〇 mL)中之〉谷液中添加三乙胺（9 7 mL，68.9 mmol)， 繼而快速添加曱苯中之碳醯氯（2 M，7.6 mL)。在室溫下攪 拌10 min後’將混合物濃縮並添加水（3〇 mL)。收集固體且 用甲笨共彿乾燥以產生標題化合物，其無需進一步純化即 用於下一步驟。LRMS m/z (M+1)計算值：411.1，實驗值 411·2。 步驟F : 4-(3_羥基-9_苯基-[1，2,4]三唑并[3,4-f][l，6丨喑啶-8- 基）"苯甲搭（3_6) 於室溫下’將8-(4-[1，3]二氧戊環_2_基-苯基）_9_苯基_ [1，2,4]三唑并 ί3,4-^。，6]喑啶-3·酚（3-5, 2.7 g，6.6 mmol)於 二噁烷（20 mL)與2 N HC1 (20 mL)中之懸浮液攪拌20 min。 在25 C下將其濃縮以移除大部分二噁烷。將殘餘物傾入冰 冷水中以產生標色固體，該棕色固體經由過濾來收集且經 甲苯共沸乾煉以產生標題化合物。LRMS m/z (M+1)計算 值：367.1，實驗值 367.1。 114734.doc 200800166 步驟G : 8_(4-胺基甲基-苯基）-9-苯基_[1，2,4】三唑并[3,4-f] [1，6】嗜咬-3-紛（3-8) 將 4-(3-羥基-9-苯基-[1，2,4]三唑并[3,4-f][l，6]喑啶-8-基）-苯甲醛（3·6, 2.4 g，6.6 mmol)與2-胺基-2,4-二甲基戊酸 (3-7，1.9 g，13.1 mmol)於 DMF (25 mL)中之懸浮液於 150t： 下加熱20 min。將反應混合物冷卻，用二°惡烧（50 mL)及2 N HC1 (50 mL)稀釋，且在100°C下加熱30 min。將混合物 冷卻且經由逆相HPLC (0-60%乙腈/水）純化以經蒸發溶劑 ® 後產生呈黃色固體狀之標題化合物。HRMS m/z (M+1)計 算值：368.15 06，實驗值 368.1504。 ^-NMR (CD3OD) δ 8.72 (s5 1H)? 7.98 (d5 1H)5 7.52 (d? 2H)，7.46 (d，2H)，7.24-7.38 (m，5 H)，7.12 (d，1H)，4.14 (s， 2H)。

114734.doc -71- 200800166 流程8

9-苯基 _8-{4-[4_(5-吡啶-2-基·4Η-[1，2,4】三唑-3-基）-哌啶-1-基甲基卜苯基卜[1，2,4]三唑并[3,4-f][l，6]喑啶（8-10) (2-氣-3-曱醯基吡啶-4-基）胺基曱酸第三丁酯（8-1) 將4-胺基-2-氯吡啶（1.28 g，10 mmol)與二碳酸二第三丁 酯（2.21 g，10·1 mmol)於 THF (20 mL)中之溶液冷卻至 0°G， 且在維持Ot：以下之溫度下缓慢添加1 Μ雙（三甲基矽烷基） 114734.doc -72- 200800166 醯fe鐘於THF (20 mL，20 mmol)中之溶液。使反應溫至室 溫達一小時’且接著藉由添加丨.5 n氯化銨水溶液（15 mL) 來驟冷。將混合物萃取至乙酸乙酯中，用鹽水洗滌，且將 有機層乾燥（Na2S〇4)，過濾且蒸發。將殘餘物用乙醚濕 磨，產生純（2-氯吡啶-4-基）胺基甲酸第三丁酯。將母液在 以25-45%乙酸乙酯/己烷溶離之矽膠上層析以產生更多產 物。 在惰性氣氛下將（2-氯吡啶_4_基）胺基曱酸第三丁酯（1.14 鲁 §m，5 mmol)於無水THF (20 mL)中之溶液冷卻至-70°C，且 緩添加1·7 Μ第三丁基鐘/戊烧（8 mL，13.5 mmol)。將反 應攪拌兩小時，且接著添加無水DMF (1.2 mL，15.5 mmol)。使反應經三小時時間緩慢溫至室溫。將反應混合 物用3 N HC1 (12 mL)驟冷，且用乙醚稀釋。將醚層用 NaHC03水溶液洗滌，乾燥（經Na2S04)，過濾且蒸發。將 殘餘物用冷乙醚濕磨以產生純（2-氣-3-甲醯基吡啶-4-基）胺 _ 基甲酸第三丁酯。將母液在以15-20%乙酸乙酯/己烷溶離 之矽膠上層析以產生額外產物。1H-NMR (500 MHz， CDC13): δ 11_0 (1H，br S)，1〇·52 (1H，S)，8·38 (1H，d，J=6 Hz)，8·31 (1H，d，J=6 Hz)，1·54 (9H，s); m/e (m+1): 257.2。 1_[4-(1，3-二氧戊環-2-基）苯基]-2-苯乙酮（8-2) 在 4-氰基苯曱酸（20.0 g5 152.5 mmol)與乙二醇（25·5 mL， 457.5 mmol)於曱苯（250 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸 (300 mg)。燒杯裝配有迪恩-斯達克收集器且將混合物加熱 至回流。5小時後濃縮混合物。將殘餘物吸收於乙酸乙酯 114734.doc -73· 200800166 中且用飽和NaHCQ3、水（2次）及鹽水洗務。將有機層乾燥 (MgS〇4)，過濾且濃縮以產生呈透明油狀之4_(1，3_二氧戊 環_2-基）苯甲腈，其在真空下固化：1h_nmr CDCI3): δ 7.67 (2Η, d5 J=8.06 Hz)5 7.59 (2H, d5 1=8.30 Hz)! 5·85 (1H，s)，4.13-4.05 (4H，m)。 在〇°C下，在4_(1，3-二氧戊環_2_基）苯曱腈（5〇 g，28 54 mmol)於無水THF (100 mL)中之溶液中緩慢添加节基氯化 鎂（36 mL，於THF中之20% wt溶液，43 mm〇1)。一小時 後，將混合物溫至室溫。四小時後，將混合物冷卻至 0 C，且用飽和NHjCl驟冷。將混合物溫至室溫且用乙酸乙 酯萃取（3次）。將經組合之有機層乾燥（MgS〇4)，過濾且濃 縮。急驟管柱層析（10%乙酸乙酯/己烷）產生呈淺黃色固體 狀之1-[4·(1，3·二氧戊環_2_基）苯基]_2_苯乙酮·· 1h_nmr (500 MHz，CDC13): δ 8·〇2 (2H，d，J=8.30 Hz，），7,57 (2H，d， J=8.30 Hz，），7.38-7.24 (5H，m)，5.86 (1H，s)，4.29 (2H，s)， 4.28-4.09 (4H，m) 〇 2-[4-(l，3-二氧戊環-2-基）苯基】甲氧基-3_苯基‘喑啶 (8-3) 在 1-[4_(1，3-一氧戍 ί辰-2-基）苯基]·2-苯乙酮（997 mg，3.72 mmol)與（2_氣-3-甲醯基吡啶-4-基）胺基曱酸第三丁 g旨（924 mg，3·6 mmol)於無水甲醇（14 mL)中之部分溶液中添加25 wt%之甲醇納/甲醇（2·5 mL，11.4 mmol)。在65°C下將反應 混合物加溫四小時。將經冷卻之反應濃縮以移除甲醇，且 將殘餘物在水與乙酸乙酯之間分溶。將有機層乾燥 114734.doc -74- 200800166 (NazSCU)，過濾且蒸發。將殘餘物用冷醚濕磨以產生純2_ [4-(1，3-二氧戊環-2-基）苯基]_5_曱氧基_3_苯基_i，6_嗉啶。 精由石夕膠上且以20-40%乙酸乙醋/己烧溶離之層析法純化 母液產生額外產物。W-NMR (500 MHz，CDC13>: δ (1Η，s)，8.23 (1Η，d，J=5.9 Ηζ)，7.55 (1Η, d，J=5.9 Ηζ)， 7.48 (2H, d, J=8 Hz)5 7.40 (2H? d, J=8 Hz), 7.29-7.30 (3H, m)，7.22-7.25 (2H，m)，4.16 (3H，s)，4·02-4·11 (4H，2 m)。 m/e (m+1): 385.1。 4-(5-曱氧基-3-苯基-1，6-喳啶-2-基）苯甲醛（8-4)

在2-[4-(l，3-二氧戊環-2-基）苯基]-5-曱氡基-3_苯基-1，6-喑啶（760 mg，1.98 mmol)於THF (8 mL)中之溶液中添加i N HC1(6 mL·)，且將溶液擾拌三小時。添力口乙酸乙酯且將混 合物用NazCO3水溶液製成鹼性。將有機層乾燥（Na2S〇4)， 過濾且蒸發溶劑。將殘餘物用乙醚濕磨以產生純產物。藉 由矽膠上且以10-30%乙酸乙酯/己烷溶離之管柱層析純化 母液產生額外產物。W-NMR (500 MHz，CDC13): δ 10.10 (1Η，s)，8·60 (1Η，s)5 8·26 (1Η，d, J=6 Ηζ)，7·81 (2Η，d， J=8.3 Hz)，7.62 (2H，d，J=8.3 Hz)，7.56 (1H，d，J=6.1 Hz)， 7·30_7·32 (3H，m)，7.21-7.23 (2H，m)，4·17 (3H，s)。m/e (m+1): 341.1 〇 二氫氣化2_(3_哌啶-4-基-1H-1，2,4·三唑·5_基）吡啶（8_5) 將魏基二咪哇（3·57 g，22 mmol)添加至1-(第三丁氧羧 基）_旅咬-4_甲酸（4.59 g，20 mmol)於二氯曱烷（50 mL)中之 溶液中，且攪拌兩小時直至氣體釋放停止。接著將肼（〇·8 114734.doc -75- 200800166 mL ’約26 mmol)添加至反應，且將反應在室溫下再攪拌兩 小時。將反應用更多二氯曱烷稀釋且用飽和NaHC03水溶 液洗滌。將有機層經無水Na2S04乾燥，過濾且蒸發溶劑以 產生黏性殘餘物。用乙醚濕磨產生呈奶白色固體狀之(肼 基羰基）_哌啶_1_甲酸第三丁酯。1H NMR (500 MHz， CDC13): δ 6·77 (1H，br s)，4·15 (2H，br S)，3·90 (2H，V br s)， 2.75 (2H，b s)，2·22 (1H，m)，1_78 (2H，br d，J=11.9 Hz)， 1.66 (2H，br q，J=12.2 Hz，卜27·5 Hz)，1·47 (9H，s)。 將該物質（2.43.g，l〇 mmol)溶解於無水2-乙氧基乙醇（20 mL)中且將2-氰基。比唆（1 14 g，11 mm〇i)添加至溶液。在添 加25 wt· %之曱醇鈉/甲醇（1.1 mL，約5 mmol)後，將混合 物加熱至130它，歷時16小時。將經冷卻之反應用乙酸中 和且在乙酸乙酯與NaHC03A溶液之間分溶。將有機層經 NazSO4乾燥，藉由過濾移除鹽，且在真空下蒸發溶劑。將 該殘餘物用乙醚濕磨以產生呈白色固體狀之4_(5_吼咬-2-基-1H-1，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-曱酸第三丁酯。1H NMR (500 MHz5 CDC13): δ 8.70 (1Η, d5 J=3.9 Hz), 8.19 (1H, d, J=7.9 Hz)，7·87 (1H，d t，J=1.7 Hz，J=8 Hz)，7.40 (1H，m)， 4.20 (2H，br s)，3.03 (1H，m)，2·95 (2H，br s)，2.09 (2H，br d，J=12 Hz)，1.86 (2H，br q，J=4.2 Hz)，1.49 (9H，s); m/e (m+1): 330.2。 將該物質（2·68 g，8_ 14 mmol)懸浮於4 N HCl/二。惡烧中。 將閉塞之反應混合物在室溫下攪拌16小時，且接著用乙醚 稀釋。轉由過濾分離固體，且將吸濕性固體浸潰於乙腈 114734.doc -76- 200800166 中。將該固體藉由過濾分離且部分溶解於熱曱醇中。經冷 卻並添加若干乙醚至溶液，2-(3-哌啶-4-基-1H-1，2,4-三唑-基）°比11定緩慢沉澱為二氫氯化物鹽。1H NMR (500 MHz， DMS〇-d6): δ 9·1〇 (1H，br s)，8.92 (1H，br s)，8·73 (1H，d， J=4.9 Hz)，8.10-8.20 (2H，m)，7.64 (1H，t，J=5.7 Hz)，3·33 (2H，br d，J=12.7 Hz)，3·16 (1H，m)，3·05 (2H，br q，J=ll.9

Hz, J-21.8 Hz), 2.18 (2H, br d5 1=11.5 Hz)5 1.99 (2H, br q5 j = 11.0 Hz，J=22.2 Hz): m/e (m+1): 230.3。 5_ 甲氧基-3-苯基·2-(4·{[4-(5-吡啶 _2_基-1Η·1，2,4·三唑·3· 基）旅啶-1-基】甲基}苯基-Μ-喑啶（8_6) 在二氫氯化2-(3-哌啶-4-基-1Η-1，2,4-三唑-5-基）吡啶（542 mg，1·80 mm〇l)與4_(5-甲氧基_3_苯基-1，6-唓啶-2-基）苯甲 醛（560 mg，1.65 mmol)於無水DMF (6 mL)中之溶液中添加 二乙胺（0.83 mL，6 mmol)。攪拌1〇分鐘後，添加乙酸（1.03 mL，18 mmol)且將混合物在室溫下隔夜攪拌。接著添加一 部分二乙醯氧基硼氫化鈉（367 mg，173 mm〇l)且攪拌六小 時。藉由所測定之LC/MS監控反應未完成後，在隨後之若 干小時内添加額外部分之三乙醯氧基硼氫化鈉（2 X 9〇 mg)，此時反應完成。將混合物用乙酸乙酯稀釋且添加 Na2C〇3水溶液。將有機層分離，且用水洗滌兩次，乾燥 (NaJCU)並蒸發溶劑。將殘餘物用乙腈浸潰且經冷卻，將 固體產物藉由過濾分離。將該固體懸浮於熱乙酸乙酯中且 缓慢添加曱醇直至完全溶解。接著將溶劑煮乾至小體積且 使其冷卻為結晶出之純產物。藉由矽膠上且以曱醇/ 114734.doc -77- 200800166 乙酸乙s旨溶離之管柱層析純化母液產生額外產物。lH NMR (500 MHz, CDC13): δ 8.66 (1Η, d5 1=4.7 Hz)5 8.54 (1H，s)，8.23 (1H，d，J=6 Hz)，8·16 (1H，d，J=7.8 Hz)，7·83 (1H，dt，J=1.7 Hz，J=7.8 Hz)，7·56 (1H, d，J=6 Hz)，7·40 (2H，d，J=8Hz),7,36(lH，dd)57,28-7.30 (3H，m)，7.23-7.25 (2H，m)，4.16 (3H，s)，3·54 (2H，s)，2·96 (2H，br d， J=11.5Hz)，2.85(lH，t，J=3.7Hz)，2.06-2.17(4H，m)，1.92· 2.01 (2H，m)。m/e (m+1): 554.3, 277.9 [(m+2)/2]。 ® 苯基-2-(4-{【4-(5_吡啶_2_基m，2,心三唑_3_基）哌啶·l 基]甲基}苯基）-l，6_嗜咬-5(6H)-酮（8-7) 將 5-曱氧基-3 -苯基-2-(4-{[4-(5 -口比咬-2 -基-1 Η-1，2,4 -三 嗤-3-基）哌啶-1-基]甲基}苯基）-16-嗉啶（725叫，131 mmol)與氫氣化π比咬（6.9 mg，約60 mmol)之混合物在150°C 下加熱十分鐘。將經冷卻之殘餘物溶解於最小量之水中且 用NaHC〇3水溶液中和。將經沉澱之固體藉由過濾收集且 ^ 藉由以1-14%甲醇/乙酸乙酯（飽和NH4OH)溶離之矽膠管柱 層析純化。將經分離之產物浸潰於甲醇/乙腈中以產生純 產物。4 NMR (500 MHz，DMSO-d6): δ 11·58 (1H，d， J=4.8 Hz)，8.68 (1H，br s)，8.39 (lH，s)，8.03 (1H，d，J=7.3 Hz)，7·50 (2H，t，J=6.5 Hz)，7.31-7-33 (5H，m)，7·24-7·25 (4H，m)，6.79 (2H，d，J=7.3 Hz)，3·50 (2H，s)，2·84 (2H，br d，J=10.5 Hz>，2·72 (1H，m)，2.08 (2H，br t5 J=ll Hz)，1.95 (2H，br d5 J=11.6 Hz)，1·77 (2H，m)〇 m/e (m+1): 540.3, 270.9 [(m+2)/2]。 114734.doc -78- 200800166 5-氣-3_ 苯基-2_{4-[4-(5-吡啶-2-基-4H-[1，2,4]三唑-3-基）-哌 啶-1-基甲基卜苯基卜[1，6]峰啶(8-8) 在 130°C 下將 8-7 (5.5 g，1〇·2 mmol)及 P〇Cl3 (50.0 g， 326.1 mmol)及DMF (0.3 g，4·1 mmol)之混合物加熱至回流 達3小時。將反應混合物冷卻並濃縮以移除p〇Cl3。添加40 mL甲苯且濃縮以獲得固體。在該固體中添加5 〇 mL ΗιΟ及 40 mL NaHC03 (飽和）及 20 mL 1 N NaOH以使 pH=9。將混 合物攪拌以沉澱為所要產物8-8之固體’該固體經由過濾 _ 來收集。將其以水及CH3CN洗滌且真空乾燥。 LC/MS: M+l=559.09 (3-苯基-2_{4-[4-(5-啦啶 _2_基-4H-[1，2,4]三唑 _3_基）-哌啶· 1-基甲基]-苯基卜[1，6]喑啶-5-基)-肼（8-9) 將 8-8 (4.3 g，7·7 mmol)於 30 mL 1，4-二噁烷及肼（7.4 g， 231.1 mmol)中之懸浮液在微波反應器中於l〇〇°C下加熱5 min。將混合物冷卻並濃縮以移除溶劑。添加甲苯40 mL (3次）且真空移除以移除殘餘肼。獲得呈固體狀之所要產物 8-9 〇 LC/MS: M+l = 554.4 9-苯基·8·{4_[4·(5-吡啶-2-基_4H-[1，2,4】三唑-3-基）-哌啶-1-基甲基]-苯基}-[1，2,4】三唑并[3,4-f][l，6]嗱啶（8-10) 在8-9 (4·5 g，8·1 mmol)於20 mL甲醇及60 mL曱苯中之溶 液中添加原甲酸三甲氧基酯（3.5 g，32.5 mmol)及甲苯續酸 (0· 1 g，0·8 mmol)。將混合物回流10小時。經移除溶劑， 藉由急驟管柱層析（100% CHC13至50% CHC13及50%甲醇） 114734.doc -79- 200800166 純化殘餘物以產生所要產物8-10。 HRMS: M+1 (計算值）=564.2619 ;實驗值=564.2589 H NMR (500 MHz，CD3OD): δ 9·35 (1H，s)，8_96 (1H，s)， 8·72 (1Η，d)，8·59 (1Η，d)，8.28U0 (2Η，m)，7.68-7.48 (6H，m)，7.40-7.30 (5H，m)，4.40 (2H，s)，3.68-3.20 (5H， m)，2.50-2.10 (4H，m)。 流程9

9-苯基-8〜(4_{[4-(5_ 吡啶-2-基-4H-1，2,4_ 三唑-3_ 基）哌啶-i· 基1甲基}苯基）-3_(1Η-1，2,3-三唑_4-基）三唑并【3,心 嗜咬（9-4) 4-(5-氣_3_苯基-1，6-喑啶-2-基)苯甲醛(9_ι) 在0C 下之 3-3 (16 g，41.1 mMol)於無水 Μ-二噁烷（75 mL)中之經攪拌溶液中添加3 N HC1 (27 mL)。接著使反應 達到室溫且攪拌約3小時。一旦完成，即將反應用飽和 114734.doc -80 - 200800166

NaHC03溶液驟冷以達到大於7之_值。將產物萃取至乙酸 乙酯（3x150 mL)中。將經組合之有機層用鹽水洗滌，經 NaJCU及MgS〇4乾燥，過濾且真空濃縮以產生呈棕褐色固 體狀之4-(5-氯苯基q，心嗉啶-2-基）苯甲醛9βΐ。lc/ms (M+1)計算值：345.8 ;觀測值：345.0 5-氣_3_苯基-2-(4_{[4-(5_,比啶I基·他从心王唑·3·基）哌 啶基】甲基}苯基)-1，6·喑啶(9-2)

在 9-1 (4.9 g，14.2 mMol)及 8-5 (4.2 g，15.6 mMol)於NMP (50 mL)中之經攪拌溶液中添加三乙胺（6 mL，42 6 mM〇i)， 繼而添加乙酸（1.6 mL，28.4 mMol)。在周圍溫度下隔夜攪 拌後’逐份添加三乙醯氧基硼氫化鈉（3.6 g，17 mM〇1)。一 旦元成’即將反應用乙酸乙酯稀釋，且經飽和NaHc〇3， 繼而用水’接著用鹽水洗務。將有機層經Na2S〇4及MgS〇4 乾燥’過濾且真空濃縮。使用二氧化矽（梯度：〇%至1〇0/〇 MeOH於CHCI3中，歷時25 min)上之急驟層析純化粗殘餘 物以產生呈橙色固體狀之9-2。LC/MS (M+1)計算值： 559.1 ;觀測值：559.2 5-肼基-3_苯基-2-(4-{[4-(5-«比啶-2-基-4H-1，2,4-三唑-3-基） 哌啶-1-基]曱基}苯基）_1，6-喑啶(9-3) 在9_2 (5 g，8.9 mMol)於無水1，4_二噁烷(20 mL)中之經 攪拌溶液中添加肼（5.9 mL，188·1 mMol)。將溶液在微波反 應器中加熱至1〇〇。〇，歷時5分鐘。將溶劑真空移除，且用 甲苯共沸乾燥三次。將粗固體用飽和NaHC03溶液濕磨20 分鐘。將懸浮液過濾且用大量水洗滌。將固體用甲苯共沸 114734.doc -81 - 200800166 乾燥三次以產生呈棕褐色固體狀之9-3。LC/MS (Μ+l)計算 值：554.6 ;觀測值：554.2 9-苯基·8-(4_{[4·(5-吡啶-2-基 _4H-1，2,4_ 三唑-3-基）哌啶 基】甲基}苯基）_3-(1Η-1，2,3-三唑-4-基）[1，2,4】三唑并[3,4-嗜咬（9-4) 在 9-3 (2.0 g，3.6 mMol)、HOBT (0.5 g，3.9 mMol)及 1H-i，2,3-二嗤-4-甲酸（〇·4 g5 3·9 mMol)於無水 DMF (20 mL)中 之經攪拌溶液中添加DIEA (1·2 mL, 7·2 mMol)，繼而添加 EDC (〇·76 g，3·9 mMol)。將溶液在周圍溫度下隔夜攪拌。 接著將溶液用2 mL乙酸處理且以3小時加熱至80°C。一旦 冷卻至室溫，即將溶液經由針筒過濾器過濾且在C18逆相 HPLC上純化以產生呈固體狀之9—4。質譜（M+1)計算值： 631.2789觀測值：631.2778 下表（表3)含有使用流程9之程序製備之化合物，以適當 胺代替8_9且以適當甲酸代替三唑·‘曱酸。化合 鲁 物9_5至9-8及9-13至9-25以HC1鹽形式分離。化合物9-9至 9_12以TFA鹽形式分離。 表3 化合物 ^ — 名稱 LRMS m/z (M+H) 9-5 3-(1Η-味嗤-4-基)-9-苯基-8-(4· {[4-(5-吼啶-2·基- 基)派咬-1·基]曱 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]-1,6-峰η定 630.2831 114734.doc -82- 200800166 9-6 [9-苯基-8-(4-{[4-(5 - 口比咬_-2-基-4H-1，2,4-三唑-3-基） 哌啶-1-基]曱基} 苯基）[1，2,4]三唑 并[3,4斗1，6-啥 °定-3-基]曱基胺 基甲酸第三丁酯 693.3394 9-7 Η〇^ζΧχ^°χν^ [9-苯基冬(4-{[4- (5-口比咬_-2-基-411- 1，2,4·三唑-3-基） 派°定-1-基]甲基} 苯基)[I，2,4]三唑 并[3,4-f]_l，6-喑 啶-3-基]曱醇 594.2703 9-8 5-[9-苯基-8-(4-{[4-(5-吼啶-2-基· 4H-1，2,4-三唑-3-基)派。定-1-基]甲 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]-l，6-峰σ定-3-基]-254·二氫-3H-1，2,4-三唑-3-酮 647.2729 9-9 3-(3-甲基-lH-l，2,4-三唑-5- 基)-9-苯基-8-(4-{[4-(5-吼啶-2· 基-4H-1，2,4-三 。坐-3-基)旅。定-1-基]甲基}苯 基)[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-喑啶 645.2948 9-10 3-咪唑并[2,1-bHU] 噻唑-6-基-9-苯基-8-(4-{[4-(5-口比啶-2· 基-4H-1，2,4-三 峻-3-基)旅咬-1-基]曱基}苯 基)[1，2,4]三唑并 [3,4-fH，6·嗉啶 686.2547 114734.doc -83- 200800166 9-11 9-苯基-8-(4-{[4-(5-σ比ϋ定-2-基_ 4Η-1，2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基]曱 基}苯基)-3-[1，2,4]三唑并 [l，5-a]嘧啶-2-基 [1，2,4]三唑并 [3,44-1，6-喳啶 682.2902 9-12 3-咪唑并[l，2-a] 0 比 基-9_>^ 基 旅咬-l-基]曱基} 苯基)[1，2,4]三 唑并[3,4-f]-l，6- 嗉咬 LRMS (M+l)= 680.3 9-13 9-苯基-8-(4-{[4-(5-n 比啶-2-基-4H-1，2,4_ 三唑-3-基） 旅咬-1-基]曱基} 苯基)-3-(1Η· 1，2,4-三唑-5-基)[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-啼啶 631.2792 9-14 3-(1Η-苯并咪唑 并1-6-基)-9-苯基铺 8-(4-{[4-(5』比啶-2-基-4Η·1，2,4-三 °坐-3-基)派咬-1-基]曱基}苯 基)[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-峰啶 680.2988 9-15 3·(1，5-二曱基-1Η-吡唑-3-基)-9-苯基-8-(4_{[4-(5 -σ 比1^-2-基-4Η-1，2,4-三唑-3-基)派咬-1-基]甲 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]-1，6-哈咬 658.3145 114734.doc •84- 200800166

9-16 3-咪唑并[l，2-a] 哺0定-2_基-9-苯 ^.8-(4-{[4-(5-°比^^-2-基-4^1-1，2,4-三唑-3-基） 哌啶-1-基]甲基} 苯基)[1，2,4]三 唑并[3,4-f]-l，6-嚎啶 681.2949 9-17 5-[9-苯基-8-(4-{[4-(5-° 比咬~2-基-4乩1，2,4-三唑-3-基)底淀-1·基]甲 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]-1，6-喑啶-3-基]吡 啶-2-胺 656.2988 9-18 9-苯基-3-°tta坐弁 [1,5-a]^ 咬-3-基-8-(4-{[4·(5-吼啶-2·基-4Η-1，2,4-三 唾-3-基)派淀-1-基]甲基}苯 基)[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-峰咬 681.2951 9·19 3-(5-甲基-1H-吡 °坐-3-基)-9-苯基_ 8-(4-{[4-(5-吼啶-2-基-4H-1，2,4-三 口坐-3-基)口辰咬-1- 基]曱基}苯 基)[I，2,4]三唑并 [3,4-f]-l，6-哈咬 644.2998 9-20 3-[9-苯基-8·(4-{[4-(5_σ 比咬 _2-基_ 4Η-1，2,4-三唑-3-基)σ底咬-1-基]曱 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-fJ-1，6-喑啶-3-基]口比 啶-2-胺 656.298 114734.doc 85- 200800166 9-21 4-[9-苯基-8-(4-{[4-(5-σ 比咬-2-基-4Η-1，2,4-三唑-3-基)派咬-1-基]曱 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]-1，6-嗉啶-3-基]酚 656.288 9-22 3-[9-苯基-8-(4-{[4-(5-°比咬-2-基_ 4H-1，2,4-三唑-3-基)旅咬-1-基]曱 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f]-1，6-啥啶-3-基]酚 656.288 9-23 2-[9-苯基-8-(4-{[4-(5-σ 比咬-2-基-4!14,2,4-三唑-3-基)旅咬小基]甲 基}苯基)[1，2,4] 三唑并[3,4-f|-1，6-啥咬-3-基]齡 656.2894 流程10

9-1

TFA

tO-2 n2h4

1,4二噁烷 100°C

NaHBOAcs AcOH, NEt3

OMe MeO+H OMe對甲苯磺酸

114734.doc -86- 200800166 9-苯基 _8-(4-{[4-(5_°比溱-2_基-4H-1，2,4-三嗤-3-基）u辰 n 基】甲基}苯基）[1，2,4】三唑并丨3,4-f]-l，6-喑啶（10-4) 於室溫下’在1-(第二丁氧基幾基）略a定_4_甲酸（12〇 g 520 mmol)於DCM (250 mL)中之溶液中逐份添加羰基二咪 唾（96 g，590 mmol)。30分鐘後，將反應混合物添加至新鮮 製備之肼（27 g，840 mmol)於DCM (100 mL)中之溶液中。 30分鐘後，將反應用飽和碳酸鈉溶液、鹽水洗滌，經硫酸 鈉乾燥，過濾且濃縮之。將所得固體懸浮於醚中且過據以 產生呈白色固體狀之4-(肼基羰基）哌啶-1-曱酸第三丁 _。 4 NMR (400 MHz，DMSO_d6): δ 9.00 (s，1H)，4·15_4·1〇 (s， 2Η)，3.95-3.90 (m，2Η)，2·80·2·60 (m5 2Η)，2.25-2.20 (m， 1H)，1.62-1.55 (m，2H)，1·40 (s，9H)。 於室溫下，將n比嗪曱腈（2·0 g，19 mmol)於甲醇（20 mL) 中之溶液用曱醇（25 wt%，1 ·3 mL，5 ·7 mmol)中之曱醇鈉處 理。30分鐘後，添加4-(肼基羰基）旅啶-1-曱酸第三丁酯 (4.6 g，19 mmol)於甲醇（20 mL)中之溶液且以19小時將反 應加熱至回流。將反應混合物濃縮，溶解於乙氧基乙醇 (50 mL)中，且以22小時加熱至回流。將反應冷卻至室 溫’用乙酸（0.38 mL，6.6 mmol)驟冷且濃縮之。將殘餘物 懸浮於醚中且過濾以產生呈固體狀之4-(5-吡嗪-2-基-1H-1，2,4_三唑-3-基）哌啶-1-曱酸第三丁酯。HRMS (M+H+):觀 測值=331.1876，計算值=331.1877 ; 4 NMR (400 MHz， CD3〇D): δ 9·29 (d5 J=1.6 Hz，1H)，8·7〇 (dd，J=2.4, 1·6 Hz， 114734.doc -87- 200800166 1H), 8.64 (d5 J^.4 Hz, 2H), 4.19-4.15 (m5 2H)3 3.15-3.09 (m，1H)，2·97 (m，2H)，2.07-2.03 (m，2H)，1.84-1.75 (m， 2H)，1.48 (s5 9H) 〇 於至/jnL下’授拌4-(5-吼σ秦-2-基-1H-1，2,4-三嗤-3-基）略 啶-1-曱酸第三丁酯（6 0 g，18 mmol)於三氟乙酸（25 mL)中 之溶液。1小時後，將反應濃縮。將所得固體懸浮於乙酸 乙酯及曱醇中且過濾產生呈TFA鹽形式之^“。將鹽溶解 於1:1乙腈：水中，將其裝至scx離子交換樹脂上，用乙腈 沖洗，且用乙醇中之10% NH3溶離以產生呈固體狀之ιοί 。 4 NMR (400 MHz， CDCl3): s 9 28_9 26 (m， 1Η)， 8 7〇· 8.68 (m, 1H), 8.60-8.58 (m5 1H), 3.35-3.22 (m5 2H)5 3.15- 3.05 (m5 1H)5 2.90-2.85 (m5 2H), 2.15-2.08 (m3 2H)3 1.95-1.90 (m，2H) 〇 5·氣-3-苯基 _2-(4-{[4-(5-吡嗪-2_基-4H-1，2,4-三唑-3-基）哌 啶-1-基】甲基}苯基）·1，6-喑啶（1〇_2) 在 9·1 (1 g，2.9 mMol)及 10-1 (1.09 g，3.2 mMol)於ΝΜΡ (10 mL)中之經攪拌溶液中添加三乙胺（0·8 mL，5 8 mMol)，繼而添加乙酸（〇·3 mL，5·8 mMol)。在周圍溫度下 隔夜攪拌後，逐份添加三乙醯氧基硼氫化鈉（〇·6 g，2.9 mMol)。一旦完成，即將反應用乙酸乙酯稀釋，且經飽和 NaHC03，繼而水，接著鹽水洗滌。將有機層經Na2S04及 MgS〇4乾燥，過濾且真空濃縮。在二氧化矽（梯度：CHC13 中之0%至10% MeOH，歷時25 min)上利用急驟層析純化粗 殘餘物以產生呈固體狀之1〇-2。LC/MS (M+1)計算值： 114734.doc -88 - 200800166 560.1 ;觀測值：56〇 2 5-骄基_3-苯基_2-(4-{[4_(5-|1比嗓-2-基-411-1，2,4-三唾-3-基） 痕啶基】甲基}苯基)-1，6-峰啶（10-3) 在 10-2 (0.5 g，〇·9 mMol)於無水 1，4-二 σ惡烧（5 mL)中之經 攪拌溶液中添加肼（0.56 mL，17.8 mMol)。將溶液在微波反 應器中加熱至l〇(TC，歷時2〇分鐘。在真空中將溶劑移 除’且用曱苯共沸乾燥三次。將粗固體用飽和NaHC03溶 液濕磨20分鐘。將懸浮液過濾且用大量水洗滌。將固體用 甲苯共沸乾燥三次以產生呈棕褐色固體狀之10_3。LC/MS (M+1)計算值：55 5.6 ;觀測值：55 5.2 9-苯基 _8-(4-{[4-(5-吡嗪-2-基-4H-1，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-基】甲基}苯基）[I，2,4】三唑并[3,4-f】_l，6-喑啶（10-句 在10-3 (0.5 g，0.9 mMol)於16 mL 3:1曱苯：甲醇中之經 攪拌溶液中添加原甲酸三甲酯（0.3 g，2.7 mMol)及對甲苯 石黃酸單水合物（0.017 g，0.09 mMol)。將反應在微波反應器 中加熱至10 0 C，歷時1小時。冷卻至室溫後，減壓下移除 溶劑。將產物在C18逆相HPLC上純化以產生呈固體狀之 10-4。質譜（M+1)計算值：565.2571 觀測值：565.2523 114734.doc -89- 200800166

流程11

OH EDC, HOBT

2) AcOH

9-苯基 _8-(4-{[4-(5-嘧啶-2_基·4Hl，2,4-三唑-3-基）哌啶-l- 基】甲基}苯基）_3-(lH-l，2,3_三唑-4_基）[l，2,4】三唑并【3,4-f]-l，6_ 喑啶（11-4) 2-(3-旅啶-4·基-1H-1，2,4-三唑-5·基）嘧啶（11-1) 將4-(肼基羰基）哌啶-i_甲酸第三丁酯（m g，41.5 mmol) 與2_氰基嘧啶（4·36 g，41.5 mmol)於1-丁醇（20 mL)中之混 合物加熱至回流，歷時48小時。將混合物濃縮，懸浮於醚 中，且過濾以產生呈固體狀之4-(5-嘧啶-2-基-1H-1，2,4-三 唑-3-基）哌啶-1-曱酸第三丁酯。MS (M+H+): 33 I·2觀測 值；1H-NMR (400 MHz，CD3OD): δ 8.92 (d，J=4.0 Hz，2H)， 114734.doc -90- 200800166 7·52 (t，J=4.0 Hz，1H)，4.18-4.15 (m，2H)，3·14'3·08 (m5 1H)，2.98 (br.s，2H)，2·07-2·01 (m，2H)，1.85-1.77 (m，2H)， 1.48 (s，9H) 〇 在4-(5-嘧啶-2·基-1H_1，2,4-三唑-3·基）哌啶-1-甲酸第三 丁酯（13·6 g，41.1 mmol)於甲薄（30 mL)及 DCM (15 mL)中 之溶液中添加無水HC1於乙酸乙酯（60 mL)中之飽和溶液。 2小時後’將反應濃縮。將所得固體懸浮於乙酸乙酯及曱 醇中，且過濾以產生呈HC1鹽形式之11-1。將鹽溶解於1:1 乙腈：水中，將其裝至SCX離子交換樹脂上，用乙腈沖 洗’且用乙醇中之10% NH3溶離以產生呈固體狀之114。 MS (M+H+)： 231.2 5·氣 _3_ 苯基-2-(4-{丨4_(5_ 嘧啶-2-基 _4H-1，2,4-三唑-3·基）旅 咬·1_基]甲基}苯基）-1，6·嗉唆（11-2) 在 9-1 (0.25 g，0.73 mMol)及 11-1 (〇·23 g，0.87 mMol)於 NMP (5 mL)中之經攪拌溶液中添加三乙胺（〇·3 mL，22 mMol)，繼而添加乙酸（0.082 mL，ι·5 ^Μοί)。在周圍溫度 下隔夜攪拌後，添加三乙醯氧基硼氫化鈉（〇18 g，087 mMol)。一旦完成，即將反應用乙酸乙酯稀釋，且經飽和 NaHC03，繼而水，接著鹽水洗務。將有機層經Na2S〇4及 MgSCU乾燥，過濾且真空濃縮以產生11-2。LC/MS計算 值：559.1 ;觀測值：559.3 5·肼基-3-苯基 _2_(4_{[4_(5-喷啶 _2·基-4H-1，2,4-三唑-3_ 基） 旅咬-1-基]甲基}苯基）-1，6_嗜唆（n_3) 在11-2 (0·4 g，0·7 mMol)於無水L4-二噁烷（3 mL)中之經 114734.doc -91- 200800166 授掉/容液中添加肼（0·45 mL，14.5 mMol)。將溶液在微波反 應器中加熱至100°C，歷時5分鐘。將溶劑真空移除，且用 甲苯共沸乾燥三次以產生11_3。LC/MS (M+1)計算值： 555.6 ;觀測值：555 4 9·苯基_8-(4-{[4_(5_嘧啶_2-基·4Η-1，2 4-三唑冬基）旅啶 基】甲基}苯基）_3-(1H_1，2,3_三唑-4-基）[1，2,4]三唑并[3,4-喑啶（11-4) 在 11-3 (〇·2 g，〇·36 mM〇l)、HOBT (0.05 g，0·4 mMol)及 1H-1，2,3-二唾 曱酸（〇 〇5 g，〇 4 ^Μοί)於無水 DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中添加DIEA (0.18 mL，1·1 mMol)，繼 而添加EDC (0.08 g，0.4 mM〇1)。將溶液在微波反應器中於 80°C下加熱30分鐘。接著將溶液用 0.5 mL乙酸處理，且在 微波反應器中加熱至8〇°c，歷時1〇 min。一旦冷卻至室 溫’即使溶液通過針筒過濾器且在C18逆相HPLC上純化以

產生呈固體狀之11-4。質譜（M+1)計算值：632.2742觀測 值：632.274 流程12

3-(1-甲基-1H-咪唑-4-基）-9_ 苯基-8·(4_{[4-(5-嘧啶-2-基· 4Η-1，2,4_三嗤基）哌啶4-基】甲基丨苯基）H4】三唑并 [3,44】-1，6-喑啶（12-1) 114734.doc -92· 200800166 在 11-3 (0·23 g，〇·4 mMol)、HOBT (0.06 g，0·45 mMol)

及1-曱基口米唾-4-甲酸（〇·06 g，〇·45 mMol)於無水DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中添加DIEA (〇.13 0.8 mMol)， 繼而添加EDC (0.09 g，〇·5 mMol)。將溶液在微波反應器中 於80°C下加熱15分鐘。接著將溶液用〇.2 mL乙酸處理，且 在微波反應器中加熱至8〇°C，歷時20 min。一旦冷卻至室 溫’即使溶液通過針筒過濾器且在C18逆相HPLC上純化以 產生呈固體狀之12_1。質譜（]^1+1)計算值：632.2742觀測 值：632.274 流程13

NaHBOACa AcOH, NEt3 3·(1-甲基-1H_咪唑基）_9·苯基_8-(4][4<5_〇比啶小基_ 4H_1，2,4-三唑·3·基）哌啶-1-基]甲基}苯基）u，2,4]三唑并 【3,4-f】-l，6-嗜咬（13-3) 8- [4-(1，3-一氧戊環-2-基）苯基]-3-(1_甲基_ιΗ·咪嗤基）_ 9- 苯基[1，2,4]三嗤并[3,4-幻-1，6-嗓唆（13-1) 在 3-4 (5 g，13 mMol)、ΗΟΒΤ (1·9 g，14·3 mM〇1)及卜甲 114734.doc -93- 200800166 基 咪唑甲酸（2 g，15·6 mMol)於無水 DMF (1〇〇 mL) 中之經攪拌溶液中添加EDC (2·7 g，14·3 mM〇1)。將溶液在 周圍溫度下隔夜攪拌。接著將溶液用24 mL:酸處理，且 在油浴中加熱至8〇 C，歷時5小時。一旦冷卻至室溫，即 添加等體積之水，且將所得懸浮液過濾並用大量水洗滌。 將所收集之固體用甲苯共沸乾燥三次以產生呈棕褐色固體 狀之13-1。質譜（M+1)計算值·· 475 1877觀測值：475 i87i 4-[3-(1-甲基·1Η_咪唑_4_基）-9苯基[1，2,4】三唑基[3,4-f】_ 1，6_哈咬-8-基】苯甲路（13-2) 在13_1 (2 g，4.2 mMol)於THF (32 mL)中之經攪拌溶液中 添加1 N HC1 (32 mL)。當反應在室溫下攪拌1小時時形成 懸浮液。接著將反應用1〇〇 mL飽和NaHC03溶液驟冷。將 懸浮液過濾且用水洗滌。將所收集之固體用甲苯共沸乾燥 三次以產生呈棕褐色固體狀之13_2。質譜（M+i)計算值： 43 1.1615觀測值：431.1616 3-(1-甲基 _1H_ 咪唑-4-基）-9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶 _2_ 基-4H-1，2,4_三唑-3-基）哌啶_1_基】甲基}苯基）[ι，2,4]三唑并 [3,44卜1，6-嗱啶（13-3) 在 13-2 (0.5 g，1.2 mMol)及 8-5 (0.34 g，1.3 mMol)於NMP (1G mL)中之經攪拌溶液中添加三乙胺（〇 33 mL，2.3 mMol) ’繼而添加乙酸（〇· 13 mL，2·3 mMol)。在室溫下隔 夜攪拌後，逐份添加三乙醯氧基硼氫化鈉（0.3 g，1.3 mMol)。攪拌6小時後，將溶液經由針筒過濾器過濾且在 C18逆相HPLC上純化以產生呈固體狀之13-3。質譜（M+1) 114734.doc -94- 200800166 計算值：644.2993觀測值：644.2988 下表（表4)含有使用流程13之程序製備之化合物，以適 當胺代替8-5。化合物13-4以HC1鹽形式分離。 表4 化合物 HRMSm/z (M+H) 13-4 3-(1-甲基-lH-咪唑冰 基)-9-苯基-8-(4-{[4-(5·吡嗪 _2_ 基-4H-1，2,4-三唾-3-基)派咬_ 1-基]甲基}苯 基)[1，2,4]三唑并[3,4- f]-l，6-口奈咬 645.2946 化合物13-4 3·(1-甲基-1H-味嗤-4-基）-9-苯基 |(4-{[4-(5·吼嗪-2-基- 4Η_1，2,4·三唑-3-基）哌啶q•基】甲基}苯基）【υ，4]三唑并 [3,4-f]-l，6-嗓咬（13-4)

在 13-2 (1.5 g，3.5 mMol)及 1〇-1 (ι·4 g，4.0 mMol)於NMP (30 mL)中之經攪拌溶液中添加三乙胺（1 mL，7 mM〇1)，繼 而添加乙酸（0.4 mL，7 mMol)。在室溫下隔夜攪拌後，逐 份添加二乙醯氧基硼氫化鈉（〇·9 g，4·2 mM〇1)。攪拌6小時 後，添加飽和NaHC〇3溶液直至pH值達到7以上。將所得懸 浮液過濾且用水洗滌。將固體用曱苯共沸乾燥三次，且使 甩正常相急驟層析（梯度：1〇〇% CHCl3至CHCl3tl〇%

MeOH，歷時40 min)純化以產生呈白色固體狀之13_4。質 譜（M+1)計算值：645.2946 觀測值：645.2940 114734.doc -95- 200800166 流程14

NaHBOAc3 AcOH, NEt3 [9-苯基-8-(4-{[4_(5_ 吡嗪-2-基·4Η-1，2,4-三唑-3·基）哌啶-1-基]曱基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6·喳啶-3-基]甲 醇（14_3) {8_[4_(1，3_二氧戊環-2-基）苯基】-9-苯基[1，2,4】三唑并 【3,44卜1，6-喑啶-3-基}曱醇（14-1) 在 3-4 (5 g，13 mMol)、HOBT (1.9 g，14·3 mMol)及乙醇 酸（1·2 g，15.6 mMol)於無水DMF (100 mL)中之經攪拌溶液 中添加EDC (2·7 g，14.3 mMol)。將溶液在周圍溫度下隔夜 攪拌。接著將溶液用5 mL冰醋酸處理且在油浴中加熱至 8〇°C，歷時2小時。一旦冷卻至室溫，即將反應用乙酸乙 酯稀釋且用NaHCOK水溶液）、水及鹽水洗滌。將有機層經 MgSCU乾燥，過濾且真空濃縮以產生呈紅色固體狀之 1。LC/MS (M+1)計算值：425.5 ;觀測值：425.6 4·[3-(羥甲基）冬苯基[1，2,4]三唑并[3,4_f]_l，6_喑啶七基] 苯甲醛（14-2) 在14_1 (2.1 g，4.9 mMol)於THF (50 mL)中之懸浮液中添 114734.doc -96- 200800166 加1 N HC1(5() mL)。在室溫下_3q分鐘後，將反應用乙 酸乙醋稀釋並用水洗務兩次，接著用鹽水洗藤。將有機層 經MgSOjNa2S〇4乾燥，過攄且真空濃縮以產生呈紅色固 體狀之14-2。貝譜（M+1)計算值：381 1346觀測值： 381.1346。 L基]曱基}苯基）[1，2,4]三唑并[3 4_f]_16-哈啶冬基]甲 醇（14-3) 在 14-2 (0.05 g，〇·1 mMol)及 1〇4 (〇 〇5 g，〇 15 mM〇1)於 NMP (1 mL)中之經攪拌溶液中添加三乙胺（〇〇4 mL，〇.26 mMol)，繼而添加乙酸（〇 〇1 mL，〇 26 mM〇1)。在室溫下隔 仪檟;摔後，添加二乙醯氧基爛氫化鈉（0 03 g，〇.2 mMol)。 攪拌6小時後，將溶液經由針筒過濾器過濾且在C18逆相 HPLC上純化以產生呈固體狀之14-3。質譜（M+1)計算值： 595.2677觀測值：595.2679 下表（表5)含有使用流程14之程序製備之化合物，以適 當胺代替10-1。化合物14_7以HC1鹽形式分離。 表5 化合物 結構 名稱 HRMSm/z (M+H) 14-7 ^ςχΧ^°χκ> ho n-n [9-苯基·8·(4-{[4_ (5·吡啶-3-基-4Η-1，2,4-三峻-3-基)娘 唆-1-基]甲基}苯 基)[U，4]三唑并 [3，4-f] -1，6-峰 °定-3 -基]甲醇 LRMS (M+l)= 594.2 114734.doc -97- 200800166 流程20

l-[9-苯基-8_(4-{[4_(5_吡啶-2-基-411-1，2,4-三唑-3_基）哌 咬-1_基】甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,44】_1，6-喑啶_3-基】 甲烷胺（20-1) 將 9-6 (0.03 g，〇·〇4 mMol)於30% TFA於二氯甲燒（1 mL， 30體積％)中之溶液在室溫下攪拌30分鐘。將溶劑真空移 除，且將粗殘餘物吸收至曱醇中且在C18逆相HPLC上純化 以產生呈固體狀之20_1。質譜（M+1)計算值：593.2884 ; 觀測值：593.2867。

流程21

9·苯基-3-(lH-l，2,3d4-基）冬（4-{[4-(4H-1，2,4-三嗤 3基）略咬l-基]曱基}笨基パ1，2,4】三嗤并【3,4f】1，6-嗜 啶（21-4) 114734.doc -98. 200800166 4- (1Η-1，2,4-三唑-3-基）哌啶（21-1) 在室溫下，在4-氰基哌啶甲酸苄基酯（2() g，82 mm〇1) 於甲醇（150 mL)中之溶液中添加甲醇納於甲醇（25心，5·6 mL，25 mmol)中之溶液。3〇分鐘後，添加甲醯肼（4·9 g，82 mmol)於甲醇（20 mL)中之溶液，且將反應加熱至回流，歷 時24小時，在此時間添加甲醇（25 wt%，5.6 mL，25 mmol) 中之甲醇鈉及甲醯肼（4·9 g，82 mmol)。72小時後，將反應 冷卻至室溫，且用乙酸驟冷（3.0 mL，49 mm〇1)並濃縮。將 所得殘餘物溶解於乙酸乙酯中，用水、飽和碳酸氫鈉、鹽 水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。藉由以1-35% IPA/DCM溶離之管柱層析純化殘餘物。將適當溶離份組 合，且真空移除溶劑以產生呈固體狀之4-(m-l，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-曱酸苄基酯。MS (M+H+): 287.2 ; h-NMR (400 MHz，CDC13): δ 11.13 〇, 1H)，8.06 (s，1H)，7·36-7·31 (m，5H)，5·15 (s，2H)，4·24 (br.s，2H)，3.06-2.98 (m，3H), 2.07-2.04 (m，2H)，1.84-1.78 (m，2H)。 在4-(lH-l，2,4-三唑-3-基）哌啶-1_甲酸苄基酯（7.3 g，25 mmol)於乙醇（100 mL)中之溶液中添加10%披鈀木炭（500 mg)，且將反應容器用氫淨化並在氫氣氛下攪拌3小時。將 反應過濾且濃縮以產生呈固體狀之21-1。MS (M+H+): 153-2 ; W-NMR (400 MHz，DMSO-d6): δ 7·99 〇，1H)， 2·98_2·94 (m，2H)，2.82-2.74 (m，1H)，2.57-2.50 (m，2H)， 1.82-1.78 (m，2H)，1.60-1.50 (m，2H)。 5- 氣-3-苯基-2-(4-{【4-(4H-l，2,4-二嗤-3-基）略唆基】甲 114734.doc -99- 200800166 基}苯基)-1，6-4 啶(21-2) 在 9-1 (0·25 g，0.73 mMol)及 21-1 (0.13 g，0.87 mMol)於 NMP (5 mL)中之經攪拌溶液中添加三乙胺（0·3 mL，2·2 mMol)，繼而添加乙酸（0.082 mL，1 ·5 mMol)。在周圍溫度 下隔夜攪拌後，添加三乙醯氧基硼氫化鈉（0.18 g，0.87 mMol)。一旦完成，即將反應用乙酸乙酯稀釋，且經飽和 NaHC03，繼而水，接著鹽水洗滌。將有機層經Na2S04及 MgS04乾燥，過濾且真空濃縮以產生21_2。LC/MS (M+1) ® 計算值：482.0 ;觀測值：482.2 5-肼基-3-苯基-2-(4-{[4_(4Η-1，2,4-三唑-3_基）哌啶-1-基]甲 基}苯基)-1,6-喳啶(21-3) 在 21-2 (0.4 g，0.8 mMol)於無水 1，4-二噁烷（3 mL)中之經 攪拌溶液中添加肼（0.45 mL，14.5 mMol)。將溶液在微波反 應器中加熱至l〇〇°C，歷時5分鐘。將溶劑真空移除，且用 甲苯共沸乾燥三次以產生21-3。LC/MS(M+1)計算值： 477.6 ;觀測值：477.3 • 9-苯基 _3·(1Η-1，2,3-三唑-4-基）·8·(4-{[4_(4Η-1，2,4-三唑- 3-基）哌啶-1-基】甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f】-l，6-4 啶（21-4) 在 21-3 (0.2 g，0.36 mMol) ' ΗΟΒΤ (0·05 g，0.4 mMol)及 1Η-1，2,3·三唑-4-曱酸（0.05 g，0·4 mMol)於無水 DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中添加DIEA (0_18 mL，1·1 mMol)，繼 而添加EDC (0.08 g，0.4 mMol)。將溶液在微波反應器中於 80°C下加熱12分鐘。接著將溶液用0.5 mL乙酸處理，且在 114734.doc -100- 200800166 微波反應器中加熱至80°C，再歷時10分鐘。一旦冷卻至室 溫，即使溶液通過針筒過濾器且在C18逆相HPLC上純化以 產生呈HC1鹽形式之21-4。質譜（Μ+1)計算值：觀測值： LC/MS (Μ+1)計算值：554·6 ;觀測值：554·3。 實例1 人類Akt同功異型物及ΔΡΗ-Akt 1之選殖 如下製備pS2neo載體（作為ATCC PTA_3253寄存於2001 年4月3日之ATCC中）：用Bglll切割PRmHA3載體（如Nucl. • Acid Res. 16:1043-1061 (1988)中所述製備），且分離 2734 bp片段。亦用 Bglll切割 pUChsneo 載體（如 EMBO J. 4:167-171 (1985)中所述製備），且分離4〇29 bp帶。將該兩個經分 離之片段接合在一起以產生稱為pS2neo-l之載體。該質體 含有在金屬硫蛋白促進劑與醇脫氫酶聚A加成位點之間的 多酶切點接頭。其亦具有藉由熱休克啟動子驅動之新抗性 基因。將pS2neo-l載體用Psp5II及BsiWI切割。合成兩種互 補寡核苷酸，且接著黏接（CTGCGGCCGC (SEQ.ID.NO: 1) 及 GTACGCGGCCGCAG (SEQ.ID.NO·: 2))。將所切割之 pS2neo-l與經黏接之寡核苷酸接合在一起以產生第二載體 pS2neo 〇在該轉化中添加Notl位點以有助於在轉染至S2細 胞中之前線性化。 使用 5,引子 5-CGCGAATTCAGATCTACCATGAGCGACGT GGCTATTGTG 3* (SEQ.ID.NO·: 3)及 31 引子 5，CGCTCTAGA GGATCCTCAGGCCGTGCTGCTGGC3’（SEQ.ID NO·: 4)， 藉由人類脾cDNA (Clontech)外部之PCR (Clontech)放大人 114734.doc -101- 200800166 類Aktl基因。5’引子包括EcoRI及Bglll位點。為達成選殖 目的，3’引子包括Xbal及BamHI位點。所得PCR產物經次 選殖為作為EcoRI/Xbal片段之pGEM3Z (Promega)。為達成 表現/純化之目的，使用PCR引子5’GTACGATGCTGAA CGATATCTTCG 3，（SEQ.ID.NO·: 5)將中間 T標記添加至全 長Aktl基因之5’末端。所得PCR產物包括在具有含有昆蟲 細胞表現載體pS2neo之生物素標記的框架内用於次選殖片 段之5’ ΚρηΙ位點及3’ BamHI位點。 為表現Aktl之激酶底物同源結構域（PH)缺失（Aaa 4-129，其包括一部分Aktl鉸鏈區之缺失）形式，使用如模板 之pS2neo載體中之全長Aktl基因進行PCR缺失突變。在2 偭步驟中使用重疊内部引子（5WAATACATGCCGATGGAA AGCGACGGGGCTGAAGAGATGGAGGTG 3f (SEQ.ID.NO.: 6)及 5，CCCCTCCATCTCTTCAGCCCCGTCGCTTTCCATCGG CATGTATTC 3,（SEQ_ID.NO，· 7))進行 PCR，該等弓| 子包括 缺失及包括ΚρηΙ位點及5·末端上之中間T標記的5’及3’兩侧 引子。將最終PCR產物用ΚρηΙ及Smal浸潰，且接合至 pS2neo全長Aktl KpnI/Smal切割載體中，此以所缺失之形 式有效置換純系之51末端。 使用胺基末端寡引子51 GAATTCAGATCTACCATGAGCG ATGTTACCATTGTG 3,（SEQ.ID.NO·: 8)及羧基末端寡弓1 子 5* TCTAGATCTTATTCTCGTCCACTTGCAGAG 3* (SEQ.ID. NO·: 9)，藉由成人腦cDNA(Clontech)之PCR放大人類Akt3 基因。 114734.doc -102- 200800166 為達成選殖之目的，該等引子包括5’ EcoRI/Bglll位點及 3f Xbal/Bglll位點。將所得PCR產物選殖至pGEM4Z (Promega)之EcoRI及Xbal位點中。為達成表現/純化之目 的，使用 PCR 引子 5*GGTACCATGGAATACATGCCGATGG AAAGCGATGTTACCATTGTGAAG 3’（SEQ.ID.NO·: 10)將 中間T標記添加至全長Akt3純系之5’末端。所得PCR產物包 括5’ ΚρηΙ位點，該5’ ΚρηΙ位點使得在框架内以含有昆蟲細 胞表現載體pS2neo之生物素標記進行選殖。 使用胺基末端寡引子5· AAGCTTAGATCTACCATGAATG AGGTGTCTGTC 3，（SEQ.ID.NO·: 11)及羧基末端寡引子 5, GAATTCGGATCCTCACTCGCGGATGCTGGC 31 (SEQ.ID. NO.: 12)，藉由成人胸腺cDNA(Clontech)之PCR放大人類 Akt2基因。為達成選殖之目的，該等引子包括5’ Hindlll/Bglll位點及3’ EcoRI/BamHI位點。將所得PCR產物 次選殖至pGem3Z (Promega)之Hindlll/EcoRI位點中。為達 成表現/純化之目的，使用PCR引子51 GGTACCATGGAATA CATGCCGATGGAAAATGAGGTGTCTGTCATCAAAG 3丨（SEQ· ID.NO·: 13)將中間T標記添加至全長Akt2之51末端。將所 得PCR產物次選殖至上述pS2neo載體中。 實例2 人類Akt同功異型物及ΔΡΗ-Akt 1之表現 將pS2neo表現載體中含有經選殖之Aktl、Akt2、Akt3及 ΔΡΗ-Aktl基因之DNA純化且將其藉由磷酸鈣方法而用於轉 染果蠅（Drosophila) S2細胞（ATCC)。選擇耐抗生素（G418, 114734.doc -103- 200800166 500 pg/ml)細胞池。將細胞擴大至1·0 L體積（約7·〇χ106 / mL)，將生物素及C11SO4分別添加至50 μΜ及50 mM之最終 濃度。使細胞在27°C下生長72 h，且藉由離心作用來收 穫。將細胞漿在-70°C下冷凍直至需要。 實例3 人類Akt同功異型物及ΔΡΗ-Akt 1之純化 藉由在緩衝液A (50 mM Tris pH 7.4、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0·2 mM AEBSF、10 pg/ml苯甲脒、5 pg/ml 亮 ® 抑蛋白酶肽、各抗蛋白酶及胃蛋白酶抑制劑、10%甘油及 1 mM DTT)中用50 mL 1% CHAPS進行超音波處理來溶解 實例2中所述之來自一公升S2細胞之細胞漿。在含有25% 甘油之緩衝液A中，將可溶性溶離份在負載有9 mg/ml抗中 間T單株抗體及以75 μΜ EYMPME (SEQ.ID.NO·: 14)肽溶 離之蛋白G瓊脂糖快速流（Pharmacia)管柱上純化。將含有 Akt/PKB之溶離份彙集，且藉由SDS-PAGE評估蛋白質純 ^ 度。使用標準Bradford實驗方案來量化經純化蛋白質。將 經純化蛋白質在液氮上快速冷凍且在-70°C下儲存。 自S2細胞純化之Akt及Akt激酶底物同源結構域缺失需要 活化。在含有 1〇 nM PDK1 (Upstate Biotechnology，Inc.)、 脂質媒劑（l〇 μΜ 3,4,5-三磷酸磷脂醯肌酵酯-Metreya， Inc、100 μΜ填脂醯膽鹼及100 μΜ磷脂醯絲胺酸-Avanti Polar lipids, inc·)及活化緩衝液（50 mM Tris pH 7.4、1.0 mM DTT、〇」EGTA、1·0 μΜ微囊藻毒素-LR、0.1 mM Ατρ、l〇 mM MgCl2、333 pg/ml BSA及 0.1 mM EDTA) 114734.doc -104- 200800166 之反應中活化Akt及Akt激酶底物同源結構域缺失（Alessi等 人 Current Biology 7:261-269)。將反應在22°C下培育 4小 時。將等分試樣在液氮中快速冷凍。 實例4

Akt激酶檢定 利用GSK衍生之生物素標記肽基質來檢定經活化之Akt 同功異型物及激酶底物同源結構域缺失結構。藉由均相時 差式螢光（HTRF)，使用對磷酸肽具有特異性之經鑭系元素 • 螯合劑（Lance)偶合之單株抗體與抗生蛋白鏈菌素連接之別 藻藍蛋白（SA-APC)螢光團（其結合至肽上之生物素部分）的 組合來測定肽磷酸化之程度。當Lance與APC接近（亦即結 合至相同磷酸肽分子）時，非輻射能量自Lance轉移至 APC，繼而在665 nm時自APC發射光。 檢定所需之材料： A. 經活化之Akt同功酶或激酶底物同源結構域缺失結構。 B. A k t肽基質：G S K 3 a ( S 2 1 )肽# 3 9 2 8生物素 -GGRARTSSFAEPG(SEQ.ID.NO」15)，巨分子源。 C. Lance標記之抗填酸基GSK3a單株抗體（Cell Signaling Technology，純系 #27) 〇 D. SA_APC (Prozyme 目錄號PJ25S批號 896067)。 E· Microfluor® B U底部微量滴定盤（Dynex Technologies， 目錄號7205)。 F. Discovery® HTRF微定量盤式分析器，Packard Instrument Company ° 114734.doc -105- 200800166 G. 100 X蛋白酶抑制劑混合物（PIC) : 1 mg/ml笨曱脒、 0.5 mg/ml胃蛋白酶抑制劑、0.5 mg/mL亮抑蛋白酶肽、0.5 mg/ml抗蛋白酶。 Η. 10X檢定缓衝液：500 mM HEPES pH 7.5、1% PEG、 mM EDTA、1 mM EGTA、1% BSA、20 mM 0-磷酸甘油酯。 I· 驟冷緩衝液：50 mM HEPES pH 7.3、16.6 mM EDTA、0·1% BSA、0.1% Triton Χ·100、0·17 nM Lance標 記之單株抗體純系#27、0.0067 mg/ml SA-APC。 J. ATP/MgCl2工作溶液：IX檢定缓衝液、1 mM DTT、 IX PIC、125 mM Κα、5%甘油、25 mM MgCl2、375 TM ATP 〇 K. 酶工作溶液：IX檢定缓衝液、1 mM DTT、IX PIC、 5%甘油、活性Akt。選擇最終酶濃度以使檢定在線性反應 範圍内。 L. 肽工作溶液：IX檢定緩衝液、1 mM DTT ' IX PIC、 5%甘油、2 TM GSK3生物素標記肽#3928。 藉由將16 TL ATP/MgCl2工作溶液添加至96孔微量滴定 盤之適當孔中來組裝反應。添加抑制劑或媒劑（1.0 T1)，繼 而添加10 T1肽工作溶液。藉由添加13 T1酶工作溶液且混 合來開始反應。使反應進行50 min，且接著藉由添加60 T1 HTRF驟冷缓衝液來停止反應。將所停止之反應在室溫下 培育至少30 min，且接著在Discovery器具上讀數。 抗生蛋白鏈菌素閃爍板檢定之程序： 步驟1 : 114734.doc -106- 200800166 將測試化合物於100% DMSO中之1 μΐ^溶液添加至20 pL 2X 基質溶液（20 μΜ GSK3 肽、300 μΜ ATP、20 mM MgCl2、20 pCi / mL [γ33Ρ] ATP、IX檢定缓衝液、5%甘 油、1 mM DTT、IX PIC、0·1% BSA及 100 mM KC1)中。 藉由添加19 pL 2X酶溶液（6.4 nM活性Akt/PKB、IX檢定溶 液、5%甘油、1 mM DTT、IX PIC及0.1% BSA)起始磷酸 化反應。接著將反應在室溫下培育45分鐘。 步驟2 : 藉由添加170 μί 125 mM EDTA來停止反應。將200 pL經 停止之反應轉移至抗生蛋白鏈菌素閃爍板⑧PLUS (NEN Life Sciences，目錄號SMP103)中。於室溫下，將板於板 震盪器上培育達210分鐘。吸出各孔之内含物，且以每孔 200 μΕ TBS沖洗該等孔2次。接著以每孔200 gL TBS洗滌 該等孔3次，歷時5分鐘，其中在洗滌步驟期間將板於室溫 下於平臺震盪器上培育。 將板以密封帶覆蓋且使用具有適當設置之Packard TopCount進行計數以計數閃爍板中之[33P]。 抗生蛋白鏈菌素過濾板檢定之程序： 步驟1 : 進行如上文抗生蛋白鏈菌素閃爍板檢定之步驟1中所述 之酶反應。 步驟2 : 藉由添加20 pL 7·5 Μ鹽酸胍來停止反應。將50 pL經停 止之反應轉移至抗生蛋白鏈菌素過濾板（SAM2TM Biotin 114734.doc 107- 200800166

Capture Plate，Promega，目錄號V7542)，且在施加真空之 前將反應在過濾器上培育1-2分鐘。 接著使用如下真空歧管來洗滌板：1) 4次每孔200 μΐ之2 M NaCl、2) 6 次每孔 200 μΐ 之具有 1% 113?04之2 M Naa、 3) 2次每孔200 μΐ之二H20及4) 2次每孔100 μΐ之95%乙醇。 接著在添加閃爍體之前使膜進行完全空氣乾燥。 將板之底部用白色襯帶密封，添加每孔30 μΐ之 Microscint 20 (Packard Instruments，目錄號6013621)。將 ® 板之頂部用透明密封帶密封，且接著使用對於[33P]及液體 閃爍體而言具有適當設置之Packard TopCount進行計數。 磷酸纖維素過濾板檢定之程序： 步驟1 : 利用 KKGGRARTSSFAEPG (SEQ.ID.NO·: 16)作為基質代 替生物素-GGRARTSSFAEPG，如（上文）抗生蛋白鏈菌素閃 爍板檢定之步驟1中所述進行酶反應。 步驟2 : ^ 藉由添加20 μΐ 0.75% H3P〇4來停止反應。將50 μΐ經停止 之反應轉移至過濾板（UNIFILTER™，Whatman Ρ81 Strong Cation Exchanger，白色聚苯乙稀 96孔盤，Polyfiltronics， 目錄號7700-33 12)中，且在施加真空之前將反應在過濾器 上培育1-2分鐘。 接著使用如下真空歧管來洗滌板：1) 9次每孔200 μΐ之 0.75% Η3Ρ〇4及2) 2次每孔200 μΐ之二Η20。將板之底部用 白色襯帶密封，接著添加每孔30 μΐ之Microscint 20。將板 114734.doc -108 - 200800166 之頂部用透明密封帶密封，且使用對於[33p]及液體閃爍體 而言具有適當設置之Packard T〇pc〇unt來對板進行計數。 PKA檢定： 各個別PKA檢定由以下組份組成： A. 5X； PKA檢定缓衝液（200 mM Tris pH 7.5、100 mM MgCl2、5mM β-Μ基乙醇、〇·5 mM EDTA)。 Β· 50 μΜ稀釋於水中之Kemptide (Sigma)原料。 C·藉由將 1·0 μΐ 33P-ATP [10 mCi/ml]稀釋至 200 T1 50 μΜ 籲、未標記ATP原料中所製備之33P-ATP。 D. 稀釋於0.5 mg/ml BSA中之10 μΐ 70 nM PKA催化次單 位原料（UBI目錄號14-114)。 E· PKA/ Kemptide工作溶液：等體積之5X PKA檢定缓衝 液、Kemptide溶液及PKA催化次單位。 將反應組裝於96深孔檢定板中。將抑制劑或媒劑（10 T1) 添加至10 T1 33P-ATP溶液中。藉由在各孔中添加30 T1 籲 PKA/Kemptide工作溶液起始反應。將反應混合且於室溫下 培育20 min。藉由添加50 T1 100 mM EDTA及1〇〇 mM焦磷 酸鈉且混合而停止反應。 在p81磷酸纖維素96孔過濾板（Mmipore)上收集酶反應產 物（磷酸化Kemptide)。為製備板，將p81過濾板之各孔填充 以75 mM磷酸。藉由對板底部施加真空，經由過濾器倒空 孔。對各孔添加構酸（75 mM，170 μΐ)。將來自各經停止之 ΡΚΑ反應之30 μΐ等分試樣添加至含有磷酸之過濾板上的相 應孔中。施加真空後，在過濾器上捕獲肽，且將過濾器用 114734.doc -109- 200800166 75 mM磷酸洗滌5次。最終洗滌後，使過濾器進行空氣乾 燥。將閃爍流體（30 μΐ)添加至各孔，且在TopCount (Packard)上計數過濾器。 PKC檢定： 各PKC檢定由以下組份組成：

A. 10X PKC 共活化缓衝液：2.5 mM EGTA、4 mM

CaCU 0 Β· 5Χ PKC活化緩衝液·· 1·6 mg/rnl磷脂醯絲胺酸、0·16 mg/ml二醯基甘油、100 mM Tris pH 7·5、50 mM MgCl2、5 mM 0-魏基乙醇。 C. 藉由將 1·0 μΐ 33P-ATP [10 mCi/ml]稀釋至 100 μΐ 100 μΜ未標記之ATP原料中所製備之33Ρ-ΑΤΡ。 D. 稀釋於水中之髓鞘鹼性蛋白質（350 pg/ml，UBI) Ε·稀釋至 0.5 mg/ml BSA 中之PKC (50 ng/ml，UBI 目錄號 14-115) ° F. PKC/髓鞘鹼性蛋白質工作溶液：藉由將5體積PKC共 活化缓衝液及髓鞘鹼性蛋白質之每一者與10體積PKC活化 缓衝液及PKC之每一者混合來製備。 釋檢定組裝於96深孔檢定板中。將抑制劑或媒劑（1〇 T1) 添加至5.0 μΐ 33P-ATP中。伴隨添加PKC/髓鞘鹼性蛋白質 工作溶液且混合而起始反應。將反應在3 〇 C下培育2 0 min。藉由添加50 T1之1〇〇 mM EDTA及100 mM焦鱗酸納且 混合來停止反應。將磷酸化髓稍驗性蛋白質收集於96孔過 濾板中之PVDF膜上且藉由閃爍體計數量化。 114734.doc -110 - 200800166 將流程及表中所述之本發明化合物在上述檢定中測試， 且發現其具有抗Aktl、Akt2及Akt3之一或多種的$50 μΜ之 IC50。 實例5 基於細胞之檢定以測定Akt/PKB之抑制

將細胞（例如具有活化Akt/PKB之LnCaP或ΡΤΕΝ(·/_)腫瘤 細胞株）塗於100 mM培養皿中。當細胞接近70-80%長滿 時，將細胞重新饋入5 ml新鮮培養基且在溶液中添加測試 化合物。對照組包括未經處理之細胞、經媒劑處理之細胞 及分別經20 μΜ或200 nM之LY294002 (Sigma)或渥曼青黴 素（Sigma)處理之細胞。將該等細胞培育2、4或6小時，且 移除培養基，將細胞用PBS洗滌，刮除且轉移至離心管 中。將其粒化且用PBS再次洗滌。最後，將細胞小球再懸 浮於溶解緩衝液（20 mM Tris pH 8、140 mM NaC卜2 mM EDTA、1% Triton、1 mM焦磷酸鈉、10 mM θ-磷酸甘油 酯、10 mM NaF、0·5 mm NaV04、1 μΜ Microsystine及 lx 蛋白酶抑制劑混合物）中，置於冰上達15分鐘，且輕輕旋 轉以溶解細胞。在4°C下，將溶胞物在100,000 X g下之 Beckman臺式超離心機中旋轉達20 min。藉由標準

Bradford實驗方案（BioRad)量化上清液蛋白質，且在-70°C 下儲存直至需要。 如下使蛋白質自經清除之溶胞物免疫沉澱（ip):對於 Aktl/PKBI而言，將溶胞物與 Santa Cruz sc-7126 (D-17)在 NETN (100 mM NaCn、20 mM Tris pH 8·0、ImM EDTA、 114734.doc -111- 200800166 0.5% NP-40)中混合，且添加蛋白質A/G瓊脂糖（Santa Cruz sc-2003)。對於Akt2/PKBO而言，將溶胞物與抗Akt2瓊脂 糖（Upstate Biotechnology #16-174)在 NETN中混合，且對 於Akt3/PKBK而言，將溶胞物與抗Akt3瓊脂糖（Upstate Biotechnology #16-175)在 NETN中混合。將 IP 在 4°C下隔夜 培育，洗滌且藉由SDS-PAGE分離。 使用特異性抗體（Cell Signaling Technology)(抗全部Akt (目錄號9272)、抗磷酸基Akt絲胺酸473 (目錄號9271)及抗 ® 磷酸基Akt蘇胺酸308 (目錄號9275))，使用西方墨點法來 分析全部 Akt、pThr308 Aktl、pSer473 Aktl 及 Akt2 與 Akt3 上之相應磷酸化作用位點及Akt之下游標靶。在用稀釋於 PBS+0.5%脫脂奶粉（NFDM)中之適當一級抗體在4°C下隔夜 培育後，將墨點洗滌，用PBS+0.5% NFDM中之辣根過氧 化物酶（HRP)標記之二級抗體於室溫下培育1小時。將蛋白 質用 ECL 試劑（Amersham/Pharmacia Biotech RPN2134)偵 測0 實例6 經黑爾格林（Heregiilin)刺激之Akt活化作用 將MCF7細胞（為PTEN+/+之人類乳癌系）以每100 mM板 IxlO6個細胞來塗覆。當細胞長滿70-80%時，將其再饋入5 ml無血清之培養基中且隔夜培育。次日早晨，添加化合物 且將細胞培育1-2小時，此時間之後以30分鐘添加黑爾格 林（以誘發Akt之活化）且如上所述分析細胞。 實例7 114734.doc -112- 200800166 腫瘤生長之抑制作用 癌細胞生長抑制劑之活體内功效可藉由此項技術中熟知 之右干實驗方案來證實。 在0天時，將展示PI3K路徑（諸如LnCaP、PC3、C33a、 OVCAR-3、MDA-MB-468、A2780或其類似物）失調之人類 腫瘤細胞株經皮下注射至6_ 1〇週大之雌性裸鼠（Harlan)(雄 性小鼠（10-14週大）亦用於前列腺腫瘤異種移植（LnCaP& PC3))之左側腹。將小鼠隨機分配至媒劑、化合物或組合 治療組。每日皮下投藥始於第1天且在實驗期間持續。或 者’抑制劑測試化合物可藉由連續輸液泵來投與。化合 物、化合物組合或媒劑以〇·2 ml之總體積來傳遞。當所有 經媒劑治療之動物展示直徑為〇 ·5 — 1 ·〇 cm之病灶時，一般 在注射細胞後4至5.5週，將腫瘤切除並稱重。計算每一治 療組中各細胞株之腫瘤的平均重量。 實例8 點多重檢定 該程序描述用以偵測96孔格式板之相同孔中多個磷酸化 蛋白質的夾心式免疫檢定。將溶胞物在96孔板中培育，在 該96孔板上相同孔中之空間不同點上置放不同之捕獲抗 體。添加鱗酸化特異性兔多株抗體，且藉由以電化學發光 標記標記之抗兔抗體來偵測錯合物。 96_孔LNCaP板+/-化合物： 在1200 rpm之Beckman J6中旋轉1〇 min，吸入培養基。 每孔添加 50 μΐ : TBS (Pierce #28376-20 mM Tds pH 7.5、 114734.doc -113 - 200800166 150 mM NaC 1)+1 % Triton X-100+蛋白酶及填酸酶抑制劑。 包裹在塑料外殼内，置於-70°C冷凍機中直至完全冷涞。 在每孔150 μΐ之IX Tiris洗滌缓衝液中，用3%阻斷劑A阻斷 複合板（Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)。用板密 封劑覆蓋，在Micromix震盪器上於室溫下培育2 h (最小 值）。用IX RCM 51 (TTBS)洗滌。將解凍溶胞物置於冰 上，對經阻斷板中之每孔添加40 μΐ溶胞物。用板密封劑覆 蓋，在Micromix震盪器上於4°C 0/Ν下培育，用IX RCM 51 _ 洗滌。在IX Tris洗滌缓衝液（單獨或組合之抗磷酸基AKT (T308)、抗磷酸基馬鈐薯球蛋白（T1462))中之1%阻斷劑A 中稀釋二級抗體。每孔添加25 μΐ，用板密封劑覆蓋，在 Micromix震盪器上於室溫下培育3h。用IX RCM 51洗滌。 在IX Tris洗滌缓衝液中之1%阻斷劑A中稀釋Ru-GAR。每 孔添加25 μΐ ’用板密封劑覆蓋，在Micromix震盈器上於室 溫下培育1 h。用IX RCM 51洗滌。用水將4X標明缓衝液T 稀釋至IX，每孔添加200 μΐ經稀釋之標明緩衝液。 在Sector 6000影像器上讀數。 蛋白酶及填酸酶抑制劑： 最終濃度為1 μΜ之微囊藻毒素-LR，Calbiochem # 475815 (原料=500 μΜ)

Calbiochem # 524624, 100X Set I Calbiochem # 524625, 100X Set II Calbiochem # 539134, l〇〇X Set III 抗磷酸基Akt (T308): 114734.doc -114- 200800166

Cell Signaling Technologies # 9275 抗磷酸基馬鈐薯球蛋白（T1462): 經純化之Covance親和性（兔MS 2731/2732)

Ru-GAR=釘化羊抗兔 10X Tris洗滌緩衝液、阻斷劑A及4X標明緩衝液T 10X RCM 51 (10X TTBS，RCM 51) 1X=20 mM Tris pH 7.5、140 mM NaC卜 0.1%吐溫（Tween) 20 實例9 基於細胞之（活體内）檢定 該程序描述針對Akt絲胺酸/蘇胺酸激酶之基於細胞之（活 體内）活性檢定。經活化之内因性Akt可填酸化經生物素標 記之特異性Akt基質（GSK3 p)肽。藉由均相時差式螢光 (HTRF)，使用對磷酸肽具有特異性之氪酸銪[EU(K)]偶合 抗體及抗生蛋白鏈菌素連接之XL665螢光團（其結合至肽上 之生物素部分）進行偵測。當[Eu(K)]與XL665接近（亦即結 合相同磷酸肽分子）時，非輻射能量自[Eu(K)]轉移至 XL665，繼而在665 nm時自XL665發射光。 若存在各同功酶之特異性抗體，則該檢定可用以偵測來 自多種不同種類之所有三種Akt同功酶（Aktl、Akt2及Akt3) 的抑制劑。 材料及試劑 A· 細胞培養物微量滴定平底96孔板，Corning Costar， 目錄號3598。 114734.doc -115- 200800166 Β· 反應結合蛋白Α塗佈之96孔板，Pierce，目錄號15130。 C· 反應結合蛋白G塗佈之96孔板，Pierce，目錄號15131。 D. 微混合5震盪器。 E. Microfluor® B U底部微量滴定板，Dynex Technologies，目錄號7205。 F. 96孔板洗滌器，Bio_Tek Instruments，目錄號EL 404。 G. Discovery® HTRF 微板分析器，Packard Instriiment

Company 〇 ® 緩衝溶液 A· IP激酶細胞溶解缓衝液：IX TBS、0.2%吐溫20、IX 蛋白酶抑制劑混合物III (原料為100X，Calbiochem， 539134)、IX磷酸酶抑制劑混合物I (原料為100X， Calbiochem，524624)及IX磷酸酶抑制劑混合物II (原料為 100X，Calbiochem，524625)。

B. 10X檢定缓衝液：500 mM Hepes pH 7.5、1% PEG、1 mM EDTA、1 mM EGTA及20 mM β-磷酸甘油酉旨。 C. IP激酶檢定缓衝液：IX檢定緩衡液、50 mM KC1、 150 μΜ ATP、10 mM MgCl2、5%甘油、1 mM DTT、每 50 mL檢定緩衝液1錠劑蛋白酶抑制劑混合物及0.1% BSA。 D· GSK3P基質溶液：IP激酶檢定缓衝液及500 nM經生物 素標記之GSK30肽。 E· Lance緩衝液：50 mM Hepes pH 7.5、0.1% BSA及 0.1% Triton X-100 〇 F_ Lance終止緩衝液：Lance緩衝液及33.3 mM EDTA。 114734.doc -116- 200800166 G. Lance偵測緩衝液：Lance缓衝液、13·3 pg/ml SA_APC 及 0.665 nM EuK Ab抗磷酸基（Ser-21) GSK3fl 多步免疫沉澱反應Akt激酶檢定 第1天 A. 接種C33a細胞步驟：於96孔微定量板中之每孔中塗覆 60,000個 C33a細胞。 B. 在37°C下隔夜培育細胞。 第2天 • D. 化合物添加步驟：將新鮮培養基（α-ΜΕΜ/10% FBS， 室溫）中之化合物添加至上文之96孔板中且在組織培養恆 溫箱中培育5小時。 Ε. 細胞溶解步驟：吸入培養基且添加100 μΐ IP激酶細胞 溶解緩衝液。 F. 在-70°C下冷凍96孔微定量板（注意：該步驟可進行最 少1小時或隔夜）。 第3天 G. 塗佈蛋白A/G 96孔板步驟：將100 μΐ PBS中適當濃度 之α-Akt抗體（Aktl、Akt2或Akt3)添加至以下孔中： a-Aktl (每孔 20 ng/100 μΐ) Β2>>>>»Β10/列 B-G/Aktl 板 a-Akt2 (每孔 50 ng/100 μΐ) Β2»>>»Β10/列 B-G/Akt2板 兔-IgG (每孔 150 ngAOO μΐ):每一板(Aktl及Akt2)上之Bll-Gll Η. 在冷室（+4°C)中在Micromix 5 (形式20 ;位置2)上培育 4小時（注意：位置視何種Micromix 5機器而定）。 I. 吸出a-Akt抗體溶液且在各孔中添加100 μΐ PBS。 114734.doc -117- 200800166 J. Akt免疫沉澱步驟：在步驟（I)之100 μΐ PBS中添加 Aktl板之5 μΐ解涞溶胞物及Akt2板之10 μΐ解;東溶胞物。注 意：冰上之解凍溶胞物。在轉移至抗體板之前，藉由上下 吸移10次來混合經解凍溶胞物。將溶胞物板保持在冰上。 在將溶胞物轉移至抗體板後，在-7〇°C下再冷凍溶胞物 板。 K. 在冷室（+4°C)中在Micromix 5震盪器（形式20，位置3) 上隔夜培育。 _第4天 L. 免疫沉澱板洗滌步驟：使用96孔板洗滌器，用TTBS (RCM 51，1X=2次循環）洗滌96孔板1次。以TTBS填充孔且 培育10分鐘。用TTBS洗滌96孔板2次。（注意：在使用前之 初始板洗滌器：1.檢查缓衝液貯器，確保其為滿，且2倒 空廢物容器。） M. 手動板洗滌步驟：添加180 μΐ IP激酶檢定缓衝液。 N. 開始Akt酶促反應：吸取上清液。添加60 μΐ GSK3P基 I質溶液。 0· 在Micromix 5震盪器上於室溫下培育2.5小時。注意： 應調節培育時間以使管柱10/管柱11之比率不大於10。 P. 組合30 μΐ Lance彳貞測緩衝液與30 μΐ Lance終止緩衝液 (每孔總計60 μΐ)且添加至Microfluor U底部96孔黑色板。 Q. 終止Akt酶促反應：自步驟（0)之蛋白A/G 96孔板轉移 40 μΐ Akt酶促反應混合至步驟（P)之Microfluor U底部96孔 黑色板。 114734.doc -118- 200800166 U. 室溫下於Micromix 5震盪器（形式20，位置3)上培育1-2小時，接著使用Akt程式以Discovery HTRF微量滴定板分 析器讀數。 IP激酶細胞溶解緩衝液：

每孔100 μΐ 8 ml (1 板） 45 ml (6板） IX TBS 吐溫20 1X蛋白酶抑制劑混合物III IX填酸酶抑制劑混合物I IX鱗酸酶抑制劑混合物II 微囊藻毒素LR(500X) 7744 μΐ 20 μΐ 80 μΐ 80 μΐ 80 μΐ ΝΑ ΝΑ ΝΑ 450 μΐ 450 μΐ 450 μΐ 90 μΐ IP激酶檢定緩衝液： 每孔100 μΐ 8 ml (1 板） 50 ml (3板） 10Χ檢定缓衝液 800 μΐ 5 ml 1MKC1 400 μΐ 2.5 ml 250 mM ATP 4.8 μΐ 30 μΐ lMMgCi2 80 μΐ 500 μΐ 甘油 400 μΐ 2.5 ml 1MDTT 8 μΐ 50 μΐ 蛋白酶抑制劑混合物 1錠劑/50 ml 1 10%BSA 80 μΐ 500 μΐ 二 dH20 6227.2 μΐ 38.9 ml 114734.doc -119- 200800166 GSK3B基質溶液 每孔60 μΐ 5 ml (1 板） 7 ml IP激酶檢定缓衝液 1 mM GSK3B 肽 5 ml 2.5 μΐ 3.5 μΐ

La nee終止緩衝液 每孔30 μΐ 3 ml (1 板） 5 ml 5 ml IX Lance緩衝液 EDTA0.5M 2800.2 μΐ 199.8 μΐ

Lance偵測緩衝液 每孑L 30 μΐ 3 ml (1 板） 5 ml SA-APC (1 mg/ml 於ddH20 中，在Lance缓衝液中稀釋 為 1/75.2) EuKAb抗磷酸基(Ser 21)GSK3fl(680nM，在 Lance缓衝液中稀釋為 1/1133) 40 μΐ 2.7 μΐ 66.7 μΐ 4.5 μΐ 114734.doc 120- 200800166 序列表 <11〇>美國默克大藥廠 <120>AKT活性之抑制劑

<130> MS0063YS <140> 095140060 <141> 2006-10-30 <150> 60/869,726; PCT/452006/22079 <151> 2005-11-07; 2006-06-07 <160> 16 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA 擊 <213>人工序列 <220> <223>完全合成DNA序列 <400> 1 ctgcggccgc <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉完全合成DNA序列 <400> 2 gtacgcggcc gcag

<210> 3 <211> 39 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉完全合成DNA序列 <400〉 3 cgcgaattca gatctaccat gagcgacgtg gctattgtg <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉完全合成DNA序列 <400> 4 cgctctagag gatcctcagg ccgtgctgct ggc 114734.doc 200800166 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉完全合成DNA序列 <400> 5 gtacgatgct gaacgatatc ttcg <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉完全合成DNA序列 <400> 6 gaatacatgc cgatggaaag cgacggggct gaagagatgg aggtg

<211> 45 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉完全合成DNA序列 <400> 7 cccctccatc tcttcagccc cgtcgctttc catcggcatg tattc <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉完全合成DM序列

<400> 8 gaattcagat ctaccatgag cgatgttacc attgtg <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <2 2 3>完全合成DNA序列 <400> 9 tctagatctt attctcgtcc acttgcagag <210> 10 <211〉 48 <212> DNA <213>人工序列 <22 0> <223>完全合成DNA序列 -2- 114734.doc 48200800166 <400> 10 ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaagc gatgttacca ttgtgaag <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213〉人工序列 <220><223>完全合成DNA序列 <400> 11 aagcttagat ctaccatgaa tgaggtgtct gtc <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 33

<220><223>完全合成DNA序列 <400> 12 gaattcggat cctcactcgc ggatgctggc 30 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>完全合成DNA序列 <400> 13 ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaaat gaggtgtctg tcatcaaag 49 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列

<220><223>完全合成DNA序列 <400> 14 Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220><223〉完全合成DNA序列 <400> 15 Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly 15 10 114734.doc 200800166 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>完全合成DNA序列 <400> 16

Lys Lys Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly 1 5 10 15

-4- 114734.doc

Claims (1)

1. 200800166 十、申請專利範圍： 1_ 一種根據式A之化合物：

   其中： a為0或1，b為0或1，m為〇、1或2; Q係選自·雜¥基’其視情況經選自R6a之一或多個取代 基取代； R1係選自：Η、側氧基、（C=0)a〇b(Cl_ClG)烷基、 (c=o)aob-芳基、（O〇)a〇b(c2-c10)烯基、（c=o)aob(c2-c10)炔基、C02H、鹵基、OH、OJCVCd全氟烷基、 (C=0)aNR7R8、CN、（〇0)a0b(C3-C8)環烷基、 S(0)mNR7R8、SH、SCCOdCVCi。）烷基及（C=0)a0b雜環 基，該烷基、芳基、烯基、炔基、環烷基及雜環基視情 況經選自R6之一或多個取代基取代； R4 及 R5獨立為：Η、（CVC6)烷基、（CVC6)烯基、（CVCd 炔基，其中該烷基視情況經選自011及_基之多達三個取 代基取代；且其中可R4及R5 —起形成（c3-c7)環烧基，其 中該環烷基視情況經選自R6之多達三個取代基取代； R6 為：（OCOaObCi-Cu)烷基、（C=0)a0b 芳基、c2-C10 烯 基、C2-C1()炔基、（C=0)a〇b雜環基、C02H、齒基、CN、 114734.doc 200800166 OH、ObCVQ 全氟烷基、〇a(C==〇)bNR7R8、側氧基、 CHO、（N，r7r8、s⑼mNR7R8、sh、s(〇l(Ck儀 基或（〇0)a〇bC3_C8環烷基，該烷基、芳基、烯基、炔 基、雜環基及環烷基視情況經選自R6a之一或多個取代某 取代； & R6a係選自：（o〇)a〇b(Cl-Cl〇m 基、〇a(CVC3)全氟烷 基（C〇-C6)伸烷基-S(0)mRa、SH、側氧基、〇H '鹵 基、CN、（C2_C1())烯基、（C2-C1G)炔基、（c3_C6)環就基、 (C〇_C6)伸统基_芳基、（Cq_C6)伸烧基_雜環基、（^伸 烧基-N(Rb)2、C(0)Ra、（Cq_C6)伸烷基 _c〇2Ra、c(〇)H& (C〇-C6)伸烧基_c〇2H ’該烧基、浠基、炔基、環烧基、 芳基及雜環基視情況經選自Rb、〇H、（Ci-C6)烷氧基、鹵 素、C02H、CN、OJOOMCVCd烷基、側氧基及 N(Rb)2之多達三個取代基取代； R7 及 R8 係獨立選自·· H、（c=0)a〇b(CVCi())烷基、 φ (C=0)a〇b(C3-C8)環烷基、（C=0)a0b芳基、（C=〇)a〇b雜環 基、（C2-C1G)烯基、（C2-C1G)炔基、SH、S02Ra 及 (C=0)aNRb2，該烷基、環烷基、芳基、雜環基、烯基及 炔基視情況經選自R6a之一或多個取代基取代，或可將R7 及R8與其所連接之氮一起形成每一環均具有3-7個成員且 除該氮以外視情況含有選自N、0及S之一或兩個額外雜 原子之單環或雙環雜環，該單環或雙環雜環視情況經選 自R6a之一或多個取代基取代； R為（Ci_C6)烧基、（C3_C6)i^烧基、芳基或雜環基；且 114734.doc 200800166 Rb獨立為：Η、（Cr-Ce)烷基、芳基、雜環基、（C3-C6)環 烷基、（CsCOaOJCKC^)烷基或 S(0)mRa; 或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 一種根據式B之化合物：

   2. ^ 其中： R1為雜環基，該雜環基視情況經選自（C^CJ烷基、OH、 鹵基及NH2之一至三個取代基取代； R6a係選自:pN; 或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 3.如請求項2之根據式B之化合物， # R1係選Ά或 且所有其他取代基及變數均如請求項2中所定義； 或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。 4· 一種化合物，其係選自： 9-苯基-8-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-1Η-1，2,4·三唑 _3_基）哌啶 _ 1-基]曱基}苯基）[1,2,4]三唑并[3,44]_1，6_喑啶-3-胺； 9-苯基·8·(4_{[4-(54 啶-2-基-1Η]，2,4_三唑 |基）派咬_ 1-基]甲基}苯基）[I，2,4]三唑并[3,4<]-1，6-喑啶_3·酚； 9-苯基-8-(4-{[4-(4-吡啶-2-基-1Η-咪唑-^基）哌啶•基] 114734.doc 200800166 甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-1，6-喑啶-3-胺； 9-苯基-8-(4_{[1 2-(5-吡啶 _2_基-1H-1，2,4-三唑 _3_基）哌啶. 1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6-嗉啶-3_硫醇； 3-甲基-9-苯基 _8-(4_{[4-(3•吡啶 基-1H_1，2,2_ 三唑 基）哌啶_1_基]甲基}苯基）[H4]三唑并 9-苯基-8·(4-{[‘（5-吡啶 _2_基-1H-1，2,4_三唑-3-基）派咬-

   1- 基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-l，6-嗉啶； 3-(氯甲基）_9-苯基_8-(4_{[4_(4-1?比唆-2-基-11^咪唾_1_基） 口辰啶-1-基]甲基}苯基）[H4]三唑并[3,4-^^6-喑唆； 3-[(4-甲基哌嗪_1_基）曱基]·9-苯基-8_(4-{[4_(5-吡啶-2_ 基-1Η-1，2,4-三唑-3-基）哌啶-1-基]甲基}苯基）三唑 并[3,4-f]-l，6-峰咬； 2- ({[9 -本基比唆-2 -基-1H-1，2,4 -三唾-3 -美） 哌啶-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]_l，6_嗉啶_夂 基]甲基}胺基）乙醇； 9·苯基-8-{4-[4_(5·他啶-2-基 _4H-[1，2,4]三唑 _3·基）-哌咬 __ 1-基甲基]苯基}-[1，2,4]三嗤并[3,4-f][l，6]峰咬； 9-苯基-8·(4-{[4·(5·吡啶-2-基_411-1，2,4-三唑-3-基）派。定· 1·基]曱基}苯基）·3-(1Η-1，2,3-三嗤-4-基）[1，2,4]三唾并 [3,4-f]-l，6-喑啶； 114734.doc -4- 1 (1Η-咪。坐 _4_ 基）-9-苯基-8-(4-{[4-(5- nb 淀 _2-基-41^ 2 1，2,4_三唑-3-基）哌啶-1-基]甲基}苯基）[l52,4]三唑并[3,4_ f]-l，6-4 淀； 3 [9-苯基-8·(4_{[4-(5-吡啶-2-基 _4H-1，2,4-三唑 基）哌啶 _ 200800166 1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并[3,4-f]-i，6_喑啶_3_基]甲基 胺基甲酸第三丁酯； [9-苯基·8-(4_{[4_(5-^定 _2Kh-152,4-三唑-3_基）娘咬- 1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并喑啶_3_基]甲 醇； 5-[9-苯基-8-(4_{[4-(5-吡啶-2_基 _4H_1，2,4-三唑基）哌 啶-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并嗉啶·3_基卜 2,4-二氫- 3H-1，2,4-三吐-3_酮；

   3-(3-甲基三唑 _5_基）-9-苯基-8_(4_{[‘（5-吡啶_ 2_基-4H-1，2,4_三唑-3_基）旅啶-1-基]曱基}苯基）H4]三 唑并[3,4_汀_1，6-喑啶； 3-咪唑并噻唑-6-基 苯基 _8_(4_{[4_(5•吡啶 _ 2Ll，2,4-三嗤-3-基）旅咬小基]曱基}苯基）[^⑷三 唑并[3,4-f]-l，6-嘹啶； 9-苯基·8-(4-{[4_(5-吼咬_2_基_4Η·12 4三唾_3基冰唆_ 1-基]甲幻苯基 三唑并[3,4_f]_l，6-喑啶； ’ ’ 3-味唾并[l，2.ap比咬-2-基-9-苯基比咬1基-4H-A4-三嗤-3·基）派咬基]甲基}苯基）三唾土 [3,4_f]-l，6_喑啶； 9-苯基-8-(444-(54^2.^12,4.三唾 _3_基 >辰咬- 1-基]甲基}苯基）-3-(1Η·1，2,4_ 三嗤-5 -義 /μ 丞）以，2,4]三唑并 [3,4-f]_l，6·峰咬； 啶_2-基_ 3-(1Η-苯并咪唑并_6_基）_9_苯基-8_(4_{[4_(5_吡 114734.doc 200800166 4H-1，2,4_ 二 ο垒 宜、 一里L基）哌啶基]曱基}苯基）ti [3,4·ί]_1，6_ 喑啶； ！开 3-(1，5-_甲基.汨“比唾」基）-9_苯基·8_…{[心(5“比啶^ :_购，2,4-三唾-3·基）°底咬-1-基]甲基}苯基m，2,4]三唾 弁[3,4-ί]-ΐ，6_嗉啶； 3 _ 口米唾弁[1，2 _ y峰口令 -_基_9-苯基- 8-(4-{[4-(5-σ比咬-2-基- 4E^l，2,4_三唑4装w 一 ^基）派咬-1-基]甲基}苯基）[1，2,4]三唑并 [3,4-f]-i，6-喑唆；

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