TW200405006A - Treatment of liver diseases - Google Patents

Description

ZUU^fU3UU0

發明所屬之技術領域 更特別地，係有關於診 本發明係有關於肝 、吓病之、;Λ底

斷與治療肝病之基因。U 先前技術 肝硬化症已視為肝癌的 顯示，肝硬化症和肝癌係與 化症，停止飲用酒精也無法 月導。有強烈的流行病學證據 酒精消耗有關。一旦發生肝硬 防止肝癌發展的。 發明内容 本發明係有關於將生長停止與DNA損害時誘發的 45石（GADD45 /5)使用於診斷及治療肝病（如硬化症和ς 癌）’以及檢定治療此種疾病的化合物。 、本發明揭露一種檢定一個體是否已罹患肝病或是有發 展為肝病的危險性之方法，上述肝病係如肝硬化或肝癌。χ 於一實施例中，該方法包含提供該個體取得的樣品（肝臟 樣品）’以及測定GADD45万表現量。若檢定量低於正常個 體的樣品，則顯示該個體已罹患肝病或是有發展為肝病的 危險。GADD45 /5的表現量可以藉由測量其訊息RNA(inRNA) 或是蛋白質來得到。GADD45 /3的mRNA量可以由原位雜交技· 術、聚合酶鏈反應、或北方墨點法來分析。GADD45石的蛋 白量可以由西方墨點法測定。於另一實施例，本發明提供 該個體取得的樣品，以及測定GADD45 /?活性程度。若活性 程度低於正常個體的樣品，則顯示該個體已罹患肝病或是

l〇57-5818-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第 5 頁 200405006 發明說明（2) 為肝病的危險性。該GADD45石活性程度可以由抑制 吊：胞生長’及誘導細胞洞零死亡的能力來決定。 及肝方面，本發明揭露一種檢定治療肝病（如肝硬化 及肝癌）的化合物之方法。苴中一竇 化人铷彻主 ^ Υ具虼例，該方法包含使 化口物與表現GADD45 /3基因的細胞接紘 ，人 /9其κι , 也得觸，以及檢定GADD45 A暴因在細胞内的表現量，若表現 的枵口 日丨日- A 里巧於未受化合物處理 1樣σ〇 ’則顯示該化合物具有治療 ^ Η . , , η Α _ 席叶病的潛力。使用的細 月匕了以疋·經由S -腺核甘曱硫胺酸 (S-adenosylmethioni n e )、酒精處理 常值、GADD45 0的轉譯由内含序列識表現罝低於正 導、能表現CCAAT/NF-Y因子或是NF^kR 1的啟動子引| 性的結合。其中的一個例子，使化合*子 '以及上述特 因的細胞接觸，以及檢定GADD45 /5其二表現GADD45召基 若其活性高於未受化合物處理的樣;在細胞内的活性。 有治療肝病的潛力。 π則顯不該化合物具 序列識別號：1係位於GADD45/5Am η 列： Θ基因~87〇到-：!位置之序

1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 200405006 五、發明說明（3) ggtgacagct gatgtgtatt gggctcttac tgtcagccgt attttatgcc atgctctgca aaccagcgag gccggcgctg cagacccatt actcagacgg gaacagagag gccgggagaa gcgaaatcac ccaggggctg gggtcgtcgc agccaggaga gactccggcc ctcaccacca cctgggcgag atcacgctgc aaacggggcc ccttcccggt gcagcccctc cacccccagc agaacttggg aaaggcgcgg tccgggactc tccgcggatc gggaggggat tccaggcccc cccgaaagtc cgggccgcct cgcgcgctgg aaatcccgcg cgcgccccga accgcggctc ggctgccggg aaatcaggag aaaaaaactt ctgctttttt ttcttttctg gcattcgcgg tcacctaccc ggcccccgcg cgccctcc±c ccggttctcg cccccacgtg gggcgccccc gcacgccgct cctccccctc ccctccgtcg gccaaccgca gagctagctg cactcgccct tgtctttcca ccaataggag gggcgaatga ctccactgag gccacgccca atgttcaagt

ctataaaagt cggtgccgga ggctcccagc tcagatcgcc gaagcgtcgg act:accgttg gtttccgcaa cttcctggat tatcctcgcc aaggactttg caatatattt ttccgccttt tctggaagga tttcgctgct tcccgaaggt cttggacgag cgctctagct ctgtgggaag gttttgggct ctctggctcg gattttgcaa tttctccctg gggactgccg tggagccgca tccacrtgtgg attataattg caacatgacg (序列識別號：1)

另一方面，本發明揭露一種用以治療肝病，如肝硬化 或肝癌，之方法。該方法包含檢定一個體是否已罹患肝病 或是有發展為肝病的危險性，並給予該個體一組成物，以 增加GADD45冷基因在該個體内的表現量。組成物可以是能 表現GADD45点蛋白或p53蛋白的一段核酸序列、GADD45 /3 或p53蛋白質、S-腺核普曱硫胺酸，或是上述的組合。上 述GADD45冷蛋白或p53蛋白是為原生態的GADD45 /3蛋白或 ρ 5 3蛋白，亦可以是具有相同生物活性的衍生態（原生態 GADD45 /3蛋白或p53蛋白的片段）。組成物可以直接作用於 該個體的肝細胞内。

1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第7頁 200405006

本發明亦包括 藥學組合物。其含 列，以及藥學上可 /3蛋白，以及藥學 本發明亦揭露 不足的肝病之方法 發明的特色，目的 現0 一種用於治療肝病（如肝硬化及肝癌）的 有一段能表現GADD45 /3蛋白的核酸序 接受之載體。此組成也可以含有GADD45 上可接受的載體。 一種用以診斷及治療與GADD45 $表現量 。其細節及更多的實例將詳載於後。本 ’及優點將於後述與申請專利範圍中顯 實施方式 曰 本毛明疋源於意外的發現，G A D D 4 5召基因在肝硬化或 是=癌病患中受調控而降低，GADD45点的表現量亦受s一腺 核苷曱硫胺酸（S-adenosylmethi〇nine，簡稱SAMe)誘發， 並且依賴p53基因。 本發明揭露一種用以診斷與治療肝病（如肝硬化及肝 癌），以及檢定治療該病之化合物的方法。 本發明之一種診斷方法，是比較位於一個體與正常個 體（如未受肝病影響的人）各自肝臟樣品之間，GADD45点基 因的表現量與活性。若檢定量低於正常個體的樣品，則顯 示該個體已罹患肝病或是有發展為肝病的危險。該方法 以獨立使用或是與其它診斷肝病方法配合使用。 GADD45 β基因的表現量可以由其 — na或是蛋白的表現 量來決定。測量組織中的mRNA量己是熟知的技藝。測量 時，可以將細胞溶解，溶胞内GADD45 /3的mRNA含量，或是

1057-5818-FF(N1);Chiumeow.ptd 第8頁 200405006 五、發明說明（5) 經由純化後GADD45点的mRNA含量，可以利用許多方法來測 量；利用GADD45/3專一性DNA或RNA探針進行雜交實驗，以 及利用GADD45々專一性核苷酸引子，進行定量或半定量的 反轉錄酶聚合酶鏈反應。另外，定量或半定量的定位雜交 方法可以使用組織切片、未溶解的細胞懸浮液、以及可横 測且有標記（螢光或酵素）的DNA或“人引子。其它方法包含 RNA保護測試（RPA)以及SAGE。 匕3 測量組織樣品内的蛋白含量亦是熟知的技藝。其中有 。争夕疋利用抗體（單源或是多源抗體）專一性地與G A D D 4 5冷 蛋白結合。以此方法，抗體本身及與之結合的二次抗體皆 可被標記而偵測。另外，抗體可以與生物素結合，利用標罾 記的親和素（avidiii)(與生物素結合的多肽鍊）可以用來偵 測含有生物素的抗體是否存在。結合上述方法（包含多層 三明治測試法），熟悉此技藝的人士可以增強檢驗的靈敏 度。部份測量蛋白的方法（如ELISA、西方墨點法）可用於 細胞的懸浮液’其它方法（如免疫組織法或螢光流體細胞 儀）可用於組織切片或未溶解的細胞懸浮液。測量己標記 的含量方法，主要是依據標記的特性，也是熟知的技藝。 適當的標記，包含放射性核音酸（如I25 I，m I，35 3，3 η，〇r 32 P )，酵素（如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、螢光酶、厶—· 半乳糖酶），螢光模組或蛋白（如螢光素（f luorescein)、

羅丹明（rhodamine)、藻紅素（phycoerythrin)、綠色螢光 蛋白（GFP)、藍色螢光蛋白（BFP))，或化學螢光模組（如由 Quantum Dot Corposration，Palo Alto，CA 提供的 QdotTM

1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第9頁 200405006 五、發明說明（6) nanoparticles)。其它方法有定量免疫沉澱或互補固定 法0 GADD45 /5活性可以用熟知的技藝來測量，如檢驗抑制 細胞生長的能力以及誘發異常肝細胞的細胞凋零（請參見 Takekawa and Saito (1998) Cell 85, 521-530 ；

Nakayama, et al. (1999) Biol. Chem. 274, 24766-24772 ； Se1vakumaran, et al. (1994) Mol.

Cell Biol. 14， 2352-2360 ;以及 Liebermann and Hoffman (1998) Oncogene 17， 3319-3329) 〇 本發明亦揭露一種檢定化合物（蛋白、胜肽、擬胜肽 (pept idomimet ics)、類胜肽、抗體、或是小分子）的方 法’用以增加G A D D 4 5 /3基因表現量或是蛋白活性予肝細胞 中。以此檢測而得的化合物可用於治療GADD45 0表現或活 性亦常的狀況，如肝硬化或肝癌。 本發明所發現有潛力的化合物，可以用數種已熟知的 組合資料庫方法獲得。這些資料庫包含胜肽、類胜肽 (p e ρ ΐ 〇 i d)(其内的分子含有胜肽的功能部份，但具有非胜 月太的骨架’可防止酵素分解也保持活性）；空間上可修飾 的平行固態或液態資料庫·，由去迴旋（dec〇nv〇luti〇n)或 是親和管柱篩選而得的合成資料庫；以及一粗子-一化合1 物（one-bead 〇ne-Compound)資料庫。請參見Zuckerman口n， (1997) Anticancer Drug Des. 12， 145 〇 et al. (1994) J· Med. Chei 37，2678-85;以及 Lam 合成分子貢料庫的方法，其例子可以在眾多文獻裏發

1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第10頁 200405006 五、發明說明（7) 現，如DeWitt，et al. ( 1 993 ) PNAS USA 90, 690 9;

Erb， et al. (1994) PNAS USA 91, 11422; Zuckermann, et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678; Cho, et al. (1993) Science 261, 1303; Carrell, et al. (1994)

Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059; Carell, et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; and Gallop, et al· (1994) J· Med. Chem· 37,1233 。 資料庫内的化合物可以是在溶液裏（Houghten (1992) Biotechniques 13， 412-421)，在圓珠内（Lam (1991) Nature 354， 82-84)，在晶片上（Fodor (1993) Nature 馨 364， 555-556)，細菌（Ladner， U.S· Patent No. 5，223， 409)，孢子（Ladner，U.S· Patent No· 5, 223, 409)，質 體（Cull，et al· ( 1 9 92 ) PNAS USA 89，1 86 5- 1 86 9 )，或 是嗤菌體裏（Scott and Smith (1990) Science 249， 386-390; Devlin (1990) Science 249， 404-406;

Cwirla， et al· (1990) PNAS USA 87， 6378-6382;

Felici (1991) J· Mol. Biol· 22 2，3(U-310;以及 Ladner supra) o 要檢定能調控細胞内GADD45 β基因表現量或活性的化 合物，細胞（如肝細胞）先與化合物接觸後，比較未受藥物® 處理的細胞内，G A D D 4 5冷基因表現量與活性。上述細胞可 以是不表現GADD45P基因，能表現GADD45/3基因，或是經 修改過可以表現一重組核酸序列，如G A D D 4 5 /3基因的啟動 子融合至一個標示基因。上述細胞也可以是受S -腺苷曱硫

1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第11頁 200405006 五、發明說明（8) 胺酸（S-adenosylmethionine)或是酒精處理、表現較低 p53量、GADD45 /3基因的表現受含有序列識別號：1的啟動 子、表現CCAAT/NF-Y因子或是nf-kB因子、或是這些性質 的組合。GADD45 yS基因與標示基因的表現量或蛋白活性， 可以用刖述方法或是己熟知的其它方法測定。當GADD45泠 基因與標示基因的表現量或各ώ > 人μ老 一 X贫臼活性面於未經化合物處理 的細胞，表示此化合物具右、、Λ。 本發明亦揭露一種治：；，肝病的潛力。 病患，經由測量前述方法所之方法。適合接受治療的 表現量或活性。若表現量皆ς備的樣品内，GADD45沒基因 則符合化合物治療的標準。_於正常人的標準值，該個體n 治療的方式可以為活n 藥物合用。 或活體外，單獨或是與其它 於一活體内的方式中，及· 係將化入^ , za· GADD45 /S基因表現量或活铋ϋ 口物（能調控細胞内 白）給予該個體服用。一趣而士 '初’或是GADD45 /3蛋 可接受的載體（如生理食場水） /化δ物會溶於藥學上 服用；口服、靜脈注射、皮下、、’在以下列方式給予該個體 腔、直腸、陰道、鼻腔、臊、主射、肌肉注射、脊椎、腹 時，化合物可以直接傳入肝 、札&内、肺内。治療肝病碰 「、、且織。 使用的劑量與下列因素# 嚴重程度、病患體積、重量、關’服用方式、組成性質、 它使用的藥物與醫師的判斷。^面面積、年齡、性別，其 0.01-100.0mg/kg。考慮不 &適的範圍在 δ化合物及不同服用方式的效

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200405006 五、發明說明（9) 力，使用的藥劑自會不[51。μ , ^ ^ 口 门例如，口服的劑量比靜脈注射 .,,& 』木取隹化使用的藥劑量，也已是熟知 植入:賢）右叮\ ώ包埋於合適的載體内（如聚微顆粒’可 H 傳輸的效力，尤其針對口服方式。 該個體内，藉由聚合性，以的' =序列也可以傳入 囊，皆是熟知的技藝。 “解的微顆粒或是微膠 另 個促使核甘酸被吸收的古、土 g 宵以罝3®伽、-+你μ 收的方法疋利用脂肪體。載體 細入姊肉 v .L 乂疋一、、且、我專一性的抗體一起被 ^ ，也有人利用靜電力或是妓價鍵，將載體| 與聚離胺酸（P〇ly — L 一 lysine)接合產生一八^鍵將載 離胺酸會與目標細胞上受體的配位二 et al. ( 1 9 9 5 ) J Μ〇1 μ ^ 安口 Uristiano， 夕 J· Mol· Med· 73， 479) 〇 έ曰姚 A —从叮 以利用組織專一性韓钚$ σ 、、且Λ專一性可 ηΜΛ, ^ a / 轉錄调控早兀（TRE)來達到。僂逆禊 D N A (不具有任何載辦）$丨 寻^稞 一個達到活體内表現的方法。 皮下寺疋另 使用相關的聚核苷酸（如表 GADD45/5蛋白的核酸庠列人現載體），將―能表現 子之组合。妗# 姐 接σ到啟動子或增強子-啟動 子之，且口立曰強子提供時間±、位置上助 性。不同於啟動子，辦強 t 私度上的專 的地方。亦可以位於“：上洛；距轉錄起使位置較遠看 / 彳立於轉錄啟使位置的下游。 適當的表現載體包含質 毒、反轉錄病毒、牛产主 /.毋载體，如皰疹病 毒、金絲雀癌病毒、腺二:V了1 11 1 3 ^減弱的牛癌病 腺病t、腺病毋相關病毒等。 1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第13頁 200405006 五、發明說明（10) 聚核苷酸可以利用藥學上可接受的載體服用。該載體 是生物性相容的且適用於人體的服用，如生理食鹽水或微 溶脂粒。能達到治療目的所使用的藥量，是能夠在該個體 上獲得相要的結果（如GADD4 5 /3表現增加）。醫學上己知， 藥劑重與多因子相關，包含個體體積、表面積、年齡、 使用的藥物、性別、服用方式及時間、體質、其它配合的 藥物。使用的藥量可能會改變，但一般建議的量為1 〇6〜丨〇12 組聚核普酸分子。若有須要，藥量可以重複使用。服用方 式可以疋jiij述中任—種。 利用活體外方式來治療與不正常GADD45万活性相關的^ 肝病牯’可以將一個體的細胞轉染或轉導入能表現GADD45 /9蛋白的核酸序列。另外，可以利用同源重組方式將一設 計過之載體於體外轉染一細胞，使該細胞基因體自然存在 的内源GADD45点基因轉錄起始位置上游插入一新的，有活 性的啟，,。藉此，將原本已經寂靜的基因再啟動的方 式，己疋熱知的領域。經由挑選及擴大能表現所需量之 GADD45点的細胞’再將該轉染或轉導過之細胞送回該個 體。該細胞可以是任何錄半 1 j種頰，包括，但不限於，如神經細 胞、造血細胞（如骨髓么田朽 ， 财、、、田胞、巨♦噬細胞、早核球、樹突細 胞、Τ細胞、或Β細胞），输你 V L· y纖維母細胞、上皮細胞、内皮 _ 胞、角質細胞、或肌肉細的 > +細的，> '、、 j、、、田胞。只要這些細胞仍存活於該個

體就可作為GADD45 /3蛋白的才、 1U 曰口采源。 活體外方式包含下列+ _ m ^ _ 幻步驟：從一個體收集細胞，培養 吕亥細胞，轉導一表現载轉认 ^ ΛΑ ^ A该細胞，以及維持該細胞於適

1057-5818-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200405006 五、發明說明（11) 合表現GADD45 Θ的狀況下。這些方法皆已是分子生物 所熟知者。轉導方式係使用任何用於活體外基因治療之ς 準方法，包括磷酸鈣、脂肪體轉染（1 ip〇fecti〇n)，電^^ 孔法（616〇1：1"〇1)01^^〇11)，病毒感染，以及基因搶法基= 轉移。另外，脂肪體或聚性微顆粒皆可以使用。轉導 之細胞可經挑選以用於例如表現GADD45冷基因。細胞^ 以注入或植入該個體。 j、可 外，用於治療肝病的藥學組合物可以含有s ‘胺魷（s-adenosylmethionine)，表現p53蛋白的核苷甲 酸，或P53蛋白本身。這些組合物及前述gadd45沒組入 可以單獨使用或是組合使用。 、口物| —下列的特定實施例僅用於闡釋目的，然其並非 定本發明。任何熟悉此技藝 乂限 摩巳圍内，s可作各種之更動與潤飾。本篇所引用申和 以其整體被併入本說明書中。 、獻亦 人體肝硬化及肝癌的GADD45 β基因係向下碉節 體來分―丄 微陣列的結果經由北方墨點议命 GADD45 p CDNA片段可以經由反轉广貫。一段2l3、bP的 * Ξ ΐ ： ί V/ Μ-0 3 04^ ^ Gapoh „ ；； 制基因。與正常細胞相比較，GADD45々的表現又量入在 1057-5818-PF(Nl)；Chiumeow. ptd 第15頁 200405006 五、發明說明（12) 肝癌組織或細胞（如HepG2、Hep3B)均較低。 免疫組織化學的研究也證實，GADD45冷在酒精肝硬化 及肝癌組織中均低於正常值。慢性肝硬化組織中， /3表現量仍高於肝癌組織。相反地，腸癌、乳癌、前列腺 癌、淋巴癌、鱗狀上皮癌 '或肉瘤組織中，G A D D 4 5石並、、支 有較低，顯示G A D D 4 5 /3的低表現是具有組織專一性。 人類GADD45a與GADD45/3在不同組織中，mRNA的表現 量，已由北方墨點法檢驗。GADD45冷可以在腎、肝、與肺 偵測到，顯示GADD45 /?基因表現在解毒的組織。GADD45 α 分佈情形相似於G A D D 4 5 /3，但在骨骨各肌中更多。二者在 常肝組織中表現量均較高，顯示二者有肝組織專一性。1 經由酒精處理後，以北方末點法測定GADD45 α與 GADD4 5 /3基因在HepG2細胞株的表現量。結果顯示，經酒 精處理後，GADD45 α表現量隨酒精用量增加而上升，但 GADD4 5 /?則沒有改變。這表示二基因在酒精相關的DNA損 害中’扮演不同角色，雖然二者之間序列有8 〇 %的相似程 度。在HepG2細胞内，GADD45 對酒精反應的缺乏，顯示 GADD4 5万損害與肝癌間有關係。 S A M e誘發G A D D 4 5 /5的表現 利用SAMe誘發GADD45/5表現的反應，在cl-48正常細響 胞與HepG2二者之間不同。二者分別加入〇、〇. 、及 2. OmM等SAMe。經72小時後，利用北方墨點法來分析 G A D D 4 5 /3表現量，以1 8 S R N A來做為投入量的控制。結果 顯示，在C L - 4 8細胞株中，G A D D 4 5沒的表現量能被低劑量

1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第16頁 严405006 五、發明說明（13) 的S A M e誘發，而用高劑量S A M e時則維持高水平。在η e p g 2 細胞株，其結果則是仍與使用量呈正相關。此結果表示， SAMe引起的細胞凋零是經由GADD45 /3基因。 GADD45 /3的表現依賴p53 在不同的p53環境下，GADD456經由SAMe誘導的情形 由北方墨點法檢測。在H e p G 2細胞（p 5 3是正常），G A D D 4 5万 的表現會受到S A M e的正調控。相反地，在η e p 3 B細胞（p 5 3 缺乏），GADD45 /5的表現量不受SAMe調控。這顯示GADD45 /5的增加是依賴p53。

GADD45冷启欠動子的分析 GADD45 /3的啟動子近區，所調控蟲螢光素酶 (Luci f erase)活性由/5 -Gal測量且經標準化。在位於 -8 7 0〜-1 b p的區域活性最高。預測該區域之啟動子元件包 括USF/N-Myc，NF-Y，CCAAT盒以及TATAA盒啟動子元素。 利用CCAAT/NF-Y因子的GADD45 /3轉錄調控 核蛋白分別由未經處理的CL-48細胞，及經過2. OmM的 SAMe或是2 0 OmM酒精處理48小時的細胞中萃取。利用能對 應GADD45 Θ啟動子内CCAAT/NF-Y的未端標記核苷酸序列， 與該核蛋白反應，結合的產物經由6%停滯膠體分離。利用 未標記的核苷酸序列或是NF —γ抗體，可以定出GADD45 $啟· 動子Ρ α區内，與蛋白結合的位置。相較於未受SAMe處理 的細胞，結合量會因為SAMe的處理而下降。在 s u p e r - s h i f t測驗中，加入s A M e的細胞其結合的複合體有 上升’與G A D D 4 5 /5表現量增加結果一致。

1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第17頁 200405006 五、發明說明（14) 利用NF-kB因子的GADD45万轉錄調控 核蛋白的萃取方法如前+、 動子内，NF- /cB因子的未蠕卜^ =對應GADD45万啟 應，結合的產物經由6%停以核甘酸序列與該核蛋白反 CL-48細胞，受過SAMe或酒精處1里=。相較於未受處理的 體會減少，另一個結合體會择、、，、田已，其_中一個結合 調控受SAMe或酒精處理細胞；加:此結果顯示轉錄因子能 其它實施例 &内，GADD45/5的表現量。 本說明書所揭露的任何特 、 每一揭露特徵，於相同，相等，:任何組合下實行。 其匕方法所取代。除非另有說明 了乂， 特徵之系列裏，相同或相似的例子。揭路特徵只是通用 由上述說明，任何熟悉此技藝者，在不脫 精神和範圍内，當可作各種之更動與潤飾。依此，丄j 2發明所做的任何更動’都應該包括於本發明後附的範

1057-5818-PF(N1)；Chiumeow.ptd 200405006 圖式簡單說明

1057-5818-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第19頁

Claims (1)

1. 200405006 六、申請專利範圍 I一種用以檢定是否一個體已 肝病之危險性的方法，該方法包括·〜病或是有發展為 提供由該個體取得之樣品，以及 測心戎樣品中G a D D 4 5沒之表現量· 其中若檢定量低於正常個體取^夕 顯不该個體已罹患肝病或是有發展 樣品的檢定量，則 2·如申請專利範圍第！項所x =病的危險性。 一肝臟組織樣品。 去’其中該樣品為 3·如申請專利範圍第2項所述 病疋肝硬化。 万去’其中該肝臟疾 曰4.如申請專利範圍第2項所述的 i 病疋肝癌。 去’其中該肝臟疾 5· 種用以檢定是否一個體已權电n 肝病之危險性的方法，該方法包含：〜肝病或是有發展為 提供該個體取得的樣品'ί i. 樣品中GADD45 /3活性程度； ’則顯示該個體 其中該樣品為 其中該肝臟疾 其中該肝臟疾 已罹患肝Πίίίί:正常個體的樣品 丙一飞疋有發展為肝病的危險性。 6.如申請專利範圍第5 -肝蹲组織樣品。 貝料]万去， 病是7肝請專利範園第6項所述的方法， 病是8肝：申請專利範圍第6項所述的方法， 1057-5818-PF(Nl);Chiunieow.ptd 第20頁 200405006 六、申請專利範圍 9 · 一種用以檢定治療肝病之化合物的方法， 含： 使化合物與表現以汕“々基因的細胞接觸， 檢定GADD45石基因在細胞内的表現量， 其中若檢定量高於未受化合物處理的樣品， 化合物具有治療肝病的潛力。 1 〇·如申請專利範圍第9項所述的方法，盆中 一肝臟組織樣品。 該方法包 以及 則顯示該 該樣品為 其中該肝臟 其中該肝臟 11 ·如申請專利範圍第1 0項所述的方法 疾病是肝硬化。 1 2 ·如申睛專利範圍第1 0項所述的方法 疾病是肝癌。 13 ·如申請專利範圍第1 〇項所述的方法，其中該細胞 是受s-腺脊曱硫胺酸（s—aden〇sylmethi〇nine)處理。 14·如申請專利範圍第10項所述的方法，其中該細胞 是受酒精處理。 1 5 ·如申請專利範圍第1 0項所述的方法，其中該細胞 的ρ 5 3表現量低於正常細胞。 1 6 ·如申睛專利範圍第1 0項所述的方法，其中該 GADD45 /3基因的轉錄是由含序列識別號：1的啟動子引 ’ 導。 1 7 ·如申睛專利範圍第1 〇項所述的方法，其中該細胞 表現CCAAT/NF-Υ因子或是NF— u因子。 1 8· —種用以檢定治療肝病之化合物的方法，該方法 m

   1057-5818-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第21頁 200405006 六、申請專利範圍 包含： 使化合物與表現GADD45 /3基因的細胞接觸，以及 檢疋GADD45 /3基因在細胞内的活性， 其中若該活性高於未受化合物處理的樣品’則顯示遠 化合物具有治療肝病的潛力。 1 9 ·如申請專利範圍第1 8項所述的方法，其中S樣口口 為一肝臟組織樣品。 2 0 ·如申請專利範圍第丨8項所述的方法，其中該肝臟 疾病是肝硬化。 2 1 ·如申請專利範圍第1 8項所述的方法’其中該肝臟灣 疾病是肝癌。 2 2 ·如申請專利範圍第1 8項所述的方法，其中該細胞 是文s -腺脊甲硫胺酸（s—aden〇sylmethionine)處理。 23·如申請專利範圍第1 9項所述的方法，其中該細胞 是受酒精處理。 24·如申請專利範圍第1 9項所述的方法，其中該細胞 的P53表現量低於正常細胞。 25·如申請專利範圍第1 9項所述的方法，其中該 GADD45/?基因的棘錄. 導。p 〇轉錄疋由含序列識別號·· 1的啟動子引 26·如申請專利範圍第25項述的方 表現CCAAT/NF-Y因子或是肿―κ b因子。 其中该細胞 一種用以治療肝病之方法，該方法包八. 鑑定一個體罹患肝、忘十曰二々^上无包3 · 病或疋有發展為肝病的危險性，以 1057-5818-PF(N1);Chiumeow.ptd 第22頁 200405006 六、申請專利範圍 及 給予該個體一組成物，以增加GADD45 /5基因在該個體 内的表現量。 2 8 ·如申請專利範圍第2 7項所述的方法 疾病是肝硬化。 2 9 ·如申請專利範圍第2 7項所述的方法 疾病是肝癌。 3 0 ·如申請專利範圍第2 7項所述的方法 物是作用於肝細胞内。 3 1 ·如申請專利範圍第2 7項所述的方法 物含有一段能表現G a D D 4 5 /3蛋白的核酸序列。 3 2 ·如申請專利範圍第3 1項所述的方法’其中該組成 物是作用於肝細胞内。 3 3 ·如申請專利範圍第2 7項所述的方法 物包含GADD45 $蛋白。 3 4 ·如申請專利範圍第3 3項所述的方法 物是作用於肝細胞内。 3 5 ·如申請專利範圍第2 7項所述的方法’其中該組成 物包含S-腺苷甲硫胺酸（s —aden〇sy lmethionine)。 3 6 ·如申請專利範圍第3 5項所述的方法，其中該組成 物是作用於肝細胞内。 3 7 ·如申請專利範圍第2 7項所述的方法，其中該組成 物包含一段能表現p53蛋白的核酸序列。 3 8 ·如申請專利範圍第3 了項所述的方法，其中該組成 其中該肝臟 其中該肝臟 其中該組成 其中該組成 其中該組成 其中該組成

   1057- 5818-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第23頁 200405006 六、申請專利範圍 物是作用於肝細胞内。 3 9.如申請專利範圍第2 7項所述的方法，其中該組成 物包含p53蛋白。 4 0.如申請專利範圍第3 9項所述的方法，其中該組成 物是作用於肝細胞内。 41. 一種藥學組合物，其包括一編碼GADD45万蛋白的 核酸，以及一藥學上可接受的載體。 42. —種藥學組合物，其包括一 GADD45/3蛋白，以及 一藥學上可接受的載體。

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