KR20060015446A

KR20060015446A - 간 질환의 치료 방법

Info

Publication number: KR20060015446A
Application number: KR1020057002734A
Authority: KR
Inventors: 윤 엔
Original assignee: 윤 엔
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2003-08-12
Publication date: 2006-02-17
Also published as: AU2003259795A1; TW200405006A; EP1573063A2; CA2494293A1; JP2006506975A; US20040101916A1; WO2004016744A2; CN1675374A; WO2004016744A3; EP1573063A4

Abstract

본 발명은 피험체가 간 질환을 가지고 있거나 발병 위험이 있는지 여부를 판단하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 피험체로부터 표본을 제공받아 GADD45β 유전자의 발현 정도 또는 단백질 활성 정도를 판단하는 단계를 포함한다 만일 GADD45β 유전자 발현 정도나 단백질 활성 정도가 정상인 피험체로부터 얻은 표본에서의 경우에 비해 낮다면 상기 피험체는 간 질환을 가지고 있거나 발병위험성이 있음을 나타낸다. 또한 본 발명은 간 질환 치료를 위한 화합물을 확인하는 방법과 이러한 질환을 치료하는 방법을 포함한다.

경변, 간암, 간 질환 치료방법, 간 질환 치료화합물, 간 질환 확인방법

Description

간 질환의 치료 방법{TREATMENT OF LIVER DISEASES}

본 발명은 경변과 간암과 같은 간 질환을 진단 및 치료하고 그러한 질환들의 치료를 위한 물질을 확인함에 있어서 성장지연과 DNA-손상 유도성 45베타 유전자(GADD45β)의 용도에 관한 것이다.

경변은 간암의 전구체로 알려져 있다. 경변과 간암은 알코올의 흡수와 관련있다고 제안되는 강력한 역학적 증거가 존재한다. 일단 경변이 나타나면 알코올 흡수를 중단한다 하여도 간암의 진행을 방지할 수 없다.

발명의 요약

한 측면에서, 본 발명은 피험체가 간경화나 간암과 같은 간 질환이 진행될 위험이 있거나 발병되었는지를 판단하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 상기 방법은 피험체로부터 간세포와 같은 표본을 제공받아 그 표본에서 GADD45β유전자의 발현레벨을 측정하는 단계를 포함한다. 만일 표본에서 GADD45β 발현 정도가 정상인 피험체로부터 얻은 표본에서의 정도보다 적다면 그 피험체는 간 질환을 가지고 있거나 발병될 위험이 있음을 나타낸다. 상기 GADD45β 발현 정도는 GADD45β mRNA 또는 GADD45β 단백질 레벨을 측정함으로써 결정할 수 있다. GADD45β mRNA의 정도는 제자리부합법(in situ hybridization), PCR, 또는 노던블랏 분석법에 의하여 측정할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 피험체로부터 표본을 제공받아 표본에서의 GADD45β 단백질 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 만일 표본에서의 GADD45β활성 레벨이 정상 피험체에서의 표본에서보다 낮다면, 이는 피험체가 간질환을 앓거나 발병 위험성이 있음을 나타낸다. GADD45β활성은 비정상적인 간세포에서 세포의 성장을 저지하고 자연세포사멸을 유도하는 능력을 측정함으로써 결정할 수 있다.

다른 측면에서 본 발명은 간경변증이나 간암과 같은 질환을 치료하기 위한 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 일 예로써, 상기 방법은 간세포와 같은 세포와 화합물을 접촉시키고 상기 세포내에서 GADD45β 유전자의 발현정도를 측정하는 단계를 포함한다. 만일 어떠한 화합물이 존재하는 경우 GADD45β 발현정도가 부재시보다 높다면, 상기 화합물은 간 질환 치료를 위한 후보화합물이 될 것이다. 상기 세포는 S-아데노실메티오닌이나 알콜로 처리된 세포일 수 있고 정상 세포에 비하여 p53 유전자의 발현이 낮은 세포일 수도 있으며, GADD45β 유전자의 전사가 SEQ ID NO:1을 포함하는 프로모터에 의해 지시되고 CCAAT/NF-Y 인자나 NF-κB인자를 발현하는 세포일 수도 있다. 또는 이러한 특징들이 조합된 세포일 수도 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 세포와 어떠한 화합물을 접촉시키고 상기 세포내에서 GADD45β 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 만일 GADD45β 단백질의 활성레벨이 상기 화합물이 있는 경우 부재시보다 높게 나타난다면, 상기 화합물은 간 질환 치료를 위한 후보물질이다.

SEQ ID NO:1는 GADD45β 유전자의 870 내지 1의 뉴클레오티드를 말한다.

ggtgacagct gatgtgtatt gggctcttac tgtcagccgt attttatgcc

atgctctgca aaccagcgag gccggcgctg cagacccatt actcagacgg

gaacagagag gccgggagaa gcgaaatcac ccaggggctg gggtcgtcgc

agccaggaga gactccggcc ctcaccacca cctgggcgag atcacgctgc

aaacggggcc ccttcccggt gcagcccctc cacccccagc agaacttggg

aaaggcgcgg tccgggactc tccgcggatc gggaggggat tccaggcccc

cccgaaagtc cgggccgcct cgcgcgctgg aaatcccgcg cgcgccccga

accgcggctc ggctgccggg aaatcaggag aaaaaaactt ctgctttttt

ttcttttctg gcattcgcgg tcacctaccc ggcccccgcg cgccctcctc

ccggttctcg cccccacgtg gggcgccccc gcacgccgct cctccccctc

ccctccgtcg gccaaccgca gagctagctg cactcgccct tgtctttcca

ccaataggag gggcgaatga ctccactgag gccacgccca atgttcaagt

ctataaaagt cggtgccgga ggctcccagc tcagatcgcc gaagcgtcgg

actaccgttg gtttccgcaa cttcctggat tatcctcgcc aaggactttg

caatatattt ttccgccttt tctggaagga tttcgctgct tcccgaaggt

cttggacgag cgctctagct ctgtgggaag gttttgggct ctctggctcg

gattttgcaa tttctccctg gggactgccg tggagccgca tccactgtgg

attataattg caacatgacg (SEQ ID NO : 1)

또 다른 측면에서 본 발명은 경변증이나 간암과 같은 간 질환 치료방법을 제공한다. 상기 방법은 간 질환을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 피험체를 확인하고 피험체에게 GADD45β활성을 증가시키기 위한 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 조성물은 GADD45β 단백질을 코딩하는 핵산과 p53 단백질을 코딩하는 핵산, GADD45β 단백질, p53 단백질, S-아데노실메티오닌, 또는 그것들로부터의 조합물을 포함한다. "GADD45β 단백질" 또는 "p53 단백질"은 야생형의 GADD45β 단백질이나 야생형의 p53 단백질과 그들의 조각과 같은 동등한 생물학적 작용을 갖는 변형물들 모두와 관련되어 있다. 상기 조성물은 피험체의 간 세포에 직접적으로 투여될 수 있다.

또한 경변증이나 간암과 같은 간 질환의 치료조성물도 본 발명의 범위내에 포함된다. 상기 조성물은 GADD45β 단백질을 코딩하는 핵산과 제약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 또한 GADD45β 단백질 그 차체와 제약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수도 있다.

본 발명은 GADD45β유전자의 불충분한 발현과 관련된 간 질환을 진단하고 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명 실시예의 세부내용은 이하의 서술에 나열되어 있다. 본 발명의 또 다른 특징, 목적, 장점은 상세한 설명과 청구항에 명백하게 나타난다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 GADD45β 유전자가 인간에 있어 간경변증과 간암 발병을 낮게 조절하고 GADD45β 유전자가 S-아데노실메티오닌(SAMe)에 의해 유도되어지고 p53단백질에 의존한다는 예기치 못한 발견에 기초한다.

또한 본 발명은 간 질환(예컨대, 경변과 간암)을 진단하고 치료하는 방법과 이러한 질병들을 치료하는 치료화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 진단방법은 간 질환을 가진 피험체로부터 준비된 표본과 정상인으로부터 준비된 표본(예컨대, 간 표본)에서의 GADD45β 유전자의 발현레벨이나 GADD45β 단백질 활성을 비교하는 것을 포함한다. 낮은 GADD45β 발현레벨이나 활성레벨은 그 피험체가 간 질환을 가지거나 발병할 위험이 있다는 것을 나타낸다. 본 발명의 방법은 적당한 피험체에서 간 질환을 진단하기 위해 단독으로 또는 다른 방법들과 연계하여 이용될 수 있다.

GADD45β 발현정도는 mRNA 레벨 또는 단백질의 레벨로 측정될 수 있다. 표본조직에서의 mRNA레벨을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. mRNA 레벨을 측정하기 위해 세포를 용해시킬 수 있고, 용해질에서의 GADD45β mRNA 레벨 또는 용해질로부터 정제되거나 반-정제된(semi-purified) RNA에서의 mRNA 레벨을 다양한 방법으로 알아볼수 있다. 이는 한정됨없이 탐지가능하게 표지된 GADD45β-특이성 DNA나 RNA 프로브를 이용하는 교배방법 또는 적절한 GADD45β-특이성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하는 정량적 또는 반-정량적(semi-quantitative) RT-PCR측정법을 이용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 정량적 또는 반정량적 제자리부합법(semi-quantitative in situ hybridization)은 조직세포나 용해되지 않은 세포의 부유물 또는 탐지가능하게(예컨대, 형광물질이나 효소로) 표지된 DNA나 RNA 프로브를 이용하여 실행할 수 있다. 또한 mRNA 정량을 위한 부가적인 방법으로는 RNA 보전 측정법(RPA)과 SAGE가 있다.

표본 조직에서의 단백질 레벨의 측정 방법도 당업계에 공지되어 있다. 이런 방법의 대부분은 GADD45β 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체들)를 사용한다. 이런 측정법에서, 항체 자체 또는 그것에 결합하는 이차항체는 탐지가 가능하도록 표지되어 있다. 또 다른 방법으로, 상기 항체들은 바이오틴과 함께 접합될 수 있고, 탐지가능토록 표지된 바이오틴에 결합하는 폴리펩타이드인 아비딘(avidin)을 바이오틴화된 항체의 존재를 탐지하는데 사용할 수 있다. 당업자에게 친숙한 다중층 샌드위치 측정법을 포함하는 이러한 접근의 조합을 분류 방법의 민감도를 향상시키기 위해 이용할 수 있다. 단백질 측정법(예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블랏)중 일부는 세포의 용해질에 사용할 수 있고, 어떤 것들은(예컨대, 면역조직학적 방법 또는 형광물질 흐름 세포측정법(fluorescence flow cytometry)) 조직절편 또는 용해되지 않은 세포의 부유물에 이용할 수 있다. 표지량의 측정 방법은 그 표지의 성질에 의존할 것이고 이는 당업게에 공지되어 있다. 적합한 표지로는 한정함 없이 방사핵(예를 들어, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ³H 또는 ³²P), 효소(예컨대, 알카라인 포스파테이즈, 호스래디쉬 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 루시퍼레이즈, 또는 β-글락토시데이즈), 형광물질 일부 또는 단백질(플루오레신, 로다민, 피코에리트린, GFT, 또는 BFP), 발광물질의 일부(예컨대, CA의 팔로알토에 있는 Quantum Dot사의 Qdot상표 나노입자들와 같은)들이 포함된다. 또 다른 바람직한 분석법으로는 정량 면역 침강법 또는 보충물 고정 분석등을 포함한다.

GADD45β 단백질의 활성은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대, 비정상적인 간 세포에서 세포의 성장을 저지하고 자연세포사멸을 야기시키는 능력을 측정함으로써 알 수 있다.[Takekawa and Saito(1998)Cell 85,521-531;Nakayama,(1999)Biol.Chem.274,24766-24772;Selvakumaran,(1994)Mol.Cell Biol.14,2352-2360;and Liebermann and Hoffman(1998)Oncogene 17,3319-3329].

본 발명은 또한 세포(예컨대, 간세포)내에서 GADD45β 유전자의 발현 또는 GADD45β 단백질 활성레벨을 증가시키는 후보화합물(예컨대, 단백질, 펩타이드, 펩티도미메틱(peptidomimetics), 펩토이드, 항체 또는 작은 분자등)을 확인하는 방법을 목적으로 한다. 이에 따라 확인된 물질은 비정상적인 GADD45β 유전자 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환, 예컨태, 간 견병 및 간암을 치료하기 위하여 이용될 수 있다.

본 발명의 후보화합물은 당업계에 알려진 라이브러리(library) 조합법에 있어 수많은 접근중 임의의 것을 이용하여 얻어질 수 있다. 이러한 라이브러리는 펩타이드 라이브러리, 펩토이드 라이브러리(작용기를 가지나 효소의 분해작용에 견딜수 있는 비-펩타이드 골격을 갖는 분자의 라이브러리); 공간상에서 평행의 고체상 또는 액체상의 라이브러리; 분리 또는 친화 크로마토그래피에 의한 합성 라이브러리; 그리고 "원-비드 원-화합물" 라이브러리를 포함한다. 이는 Zuckermann,(1994)J.Med.Chem.37,2678-85와 Lam(1997) Anticancer Drug Des.12,145등에서 볼 수 있다.

분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 이하의 문헌에서 발견할 수 있다. [De Witt,(1993)PNAS USA 90,6909;Erb,(1994)PNAS USA 91,11422;Zuckermann(1994)J.Med.Chem.37,2678;Cho,(1993)Science 261,1303 ;Carrel,(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33,2059;Carell,(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33,2601 ;Gallop,(1994)J.Med.Chem.37,1233]

화합물 라이브러리는 용액내에[Houghten (1992) Biotechniques 13, 412-421], 또는 비드[Lam (1991) Nature 354, 82-84], 칩[Fodor (1993) Nature 364,555-556], 박테리아 [Ladner, U. S.Patent No. 5,223, 409], 포자 [Ladner, U. S. Patent No. 5,223, 409], 플라스미드 [Cull,(1992) PNAS USA 89,1865- 1869], 또는 파지 상에[Scott and Smith (1990) Science 249,386-390; Devlin (1990) Science 249,404-406 ; Cwirla, (1990) PNAS USA 87,6378-6382 ; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222, 301-310 ; 그리고 Ladner supra] 제공될 수 있다.

세포내 GADD45β 유전자 발현레벨 또는 단백질 활성레벨을 조절하는 화합물을 확인하기 위하여, 간 세포와 같은 세포를 후보화합물과 접촉시키고, GADD45β 유전자 발현 레벨이나 GADD45β 단백질 활성레벨을 후보화합물이 없는 경우와 비교하여 평가한다. 상기 세포는 자연적으로 아직 발현되지 않은 GADD45β 유전자를 가진 세포이거나, 자연적으로 GADD45β를 발현하는 세포, 또는, 예를 들어, 마커 유전자에 융합된 GADD45β 프로모터를 가진 재조합 핵산을 발현하도록 변경된 세포일 수 있다. 상기 세포는 또한 S-아데노실메티오닌 또는 알코올로 처리된 세포, 정상적인 세포보다 낮은 정도로 p53유전자를 발현시키는 세포, GADD45β 유전자의 전사가 SEQ ID NO:1을 포함하는 프로모터에 의해 지시되며 CCAAT/NF-Y 팩터나 NF-κB 팩터를 발현시키는 세포, 또는 상기 특징들이 결합된 세포일 수 있다. GADD45β 유전자 발현 또는 마커 유전자 발현레벨과 GADD45β 단백질 또는 마커 단백질의 활성레벨은 상기 설명된 방법 또는 당업계에서 잘 알려진 다른 방법들로 측정할 수 있다. GADD45β나 마커유전자의 발현레벨 또는 GADD45β나 마커 단백질의 활성레벨이 후보화합물이 없는 때보다 존재시 더 높게 나타날때, 그 후보화합물은 간 질환 치료를 위한 잠재적인 약제로 확인된다.

또한 본 발명은 간 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 치료 대상은, 예를 들어, 상기 방법에 의해 피험체로부터 준비된 표본내에 GADD45β 유전자발현 또는 단백질 레벨을 측정함으로써 확인할 수 있다. 만일 정상인으로부터 추출된 표본보다 피험체로부터 나온 표본에서 GADD45β 유전자 발현레벨이나 단백질의 레벨이 적은 경우, 그 피험체는 GADD45β 레벨을 조절하는 화합물의 유효량으로 치료할 후보가 된다.

상기 치료방법은 생체내 또는 생체외에서 행하여 질 수 있고 다른 약제나 치료법과 조합하여 또는 단독으로 행하여 질 수도 있다.

생체내 접근에서, 치료조성물이(예컨대, GADD45β 단백질이나 세포에서 GADD45β 유전자 발현 또는 GADD45β 단백질 활성을 조절하는 화합물을 포함하는 조성물등) 피험체에 투여되어진다. 일반적으로, 상기 화합물은 생리 식염수와 같이 제약학적으로 허용되는 담체에 현탁될 것이다. 또한 이는 경구투여 또는 정맥내로 주입되거나 피하, 근육내, 경막내, 복막내, 직장내, 질내, 비강내, 위내, 기관지내, 또는 폐내에 주입 또는 삽입될 수 있다. 간 질환의 치료를 위해 상기 화합물은 간 조직에 직접적으로 운반될 수도 있다.

필요한 투여량은 투여방법의 선택; 배합물의 특징; 실험군의 병의 특성; 실험군의 체격, 체중, 표면적, 나이, 성별; 투여중인 다른 약제; 및 주치의의 판단에 의한다. 적절한 투여량은 0.01-100.0 ㎛/㎏범위내이다. 이용가능한 물질의 다양성과 다양한 투여방법의 다른 효율성의 측면에서 요구되는 투여량의 변화가 예상된다. 예를 들어, 경구투여는 정맥주사에 의한 경우보다 많은 양을 요구하는 것으로 기대될 것이다. 이러한 투여량의 다양성은 당업계에서 잘 이해되는 최적성을 위한 표준적 경험상 방법을 이용해 조절될 수 있다. 적절한 운반체에서 물질의 캡슐화는(예컨대, 폴리머 미세입자 또는 이식장치) 전달효율을 증가시킬 것이다.특히 경구투여의 경우 그러하다.

대안적으로, GADD45β 단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 피험체까지, 예를 들어, 당업계에 알려진 폴리머, 생분해성 미세입자 또는 마이크로 캡슐 운반장치를 사용해 도달할 수 있다.

핵산을 업테이크하는 다른 방법은 표준적인 방법으로 준비된 리포좀을 이용하는 것이다. 상기 벡터는 이러한 운반체에 단독으로 편입되거나 조직특이성을 갖는 항체와 함께 투입될 수 있다. 대안적으로, 공유력이나 정전기적인 힘에 의해 폴리-L-라이신에 부착된 다른 매개체나 플라스미드로 구성된 접합분자를 준비할 수 있다. 폴리-L-라이신은 표적 세포에 있는 리셉터에 결합할 수 있는 리간드에 결합한다. [Cristiano, et al. (1995) J. Mol. Med. 73,479]. 다른 방법으로, 당업계에 공지된 조직-특이성 전사조절요소(TRE)의 사용에 의해 조직 특이적 타겟팅을 달성 할 수 있다. 운반베히클이 없는 "naked DNA"의 근육내, 진피내, 또는 피하부위로의 운반은 생체내 발현을 달성하기 위한 다른 방법이다.

예를 들어 발현 벡터와 같은 적당한 폴리뉴클레오타이드내에서, GADD45β 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 프로모터나 인핸서-프로모터 조합에 작동가능하게 연결된다. 인핸서는 시간, 장소 그리고 발현레벨에 연관하여 발현 특이성을 제공한다. 또한 프로모터와 달리 인핸서는 전사시작위치으로부터 다양한 거리에 위치하여 작용할 수 있고 전사시작위치의 뒷부분에 자리할 수도 있다.

바람직한 발현 벡터는 플라스미드와 간염바이러스, 레트로바이러스, 백신바이러스, 약화시킨 백신바이러스, 카나리아발진병바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련바이러스 등과 같은 바이러스 벡터를 포함한다.

폴리뉴클레오타이드는 약제학적으로 허용가능한 담체로 투여될 수 있다. 제약적으로 허용가능한 담체는 생리식염수나 리포좀과 같이 사람에게 투여하기에 적당한 생물학적 융화성 베히클이다. 치료학적으로 유효량은 치료된 피험체내에 의학적으로 바람직한 결과를(예컨대, GADD45β 레벨이 증가되는 것) 생성할 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 양을 말한다. 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 피험체에 대한 투여량은 피험체의 크기, 체면적, 나이, 투여된 특정물질, 성별, 투여시간 및 방법, 체력, 함께 투여된 다른 약제등의 많은 인자에 의존한다. 투여량은 다양할 것이나, 폴리뉴클레오타이드 투약을 위한 바람직한 투여량은 대략적으로 10⁶내지 10

¹²개의 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 이러한 투여는 필요에 따라 반복하여 투여될 수 있고 투여방법은 위에서 언급한 것들 중 하나가 될 것이다.

부적당한 GADD45β단백질 활성과 관련된 간질환을 지닌 피험체의 치료를 위한 생체외에서의 전략은 GADD45β 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 피험체에서 얻은 세포를 트랜스펙션하거나 형질도입하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 세포 게놈에서 자연적으로 발견되는 내생 GADD45β 유전자의 활성 프로모터 윗부분에 동종 재조합에 의해 삽입하도록 고안된 벡터로 세포를 시험관내에서 트랜스펙션시킬수 있다. 그렇지 않으면 사일런트할 유전자를 "스위치-온"시키는 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 원하는 수준으로 GADD45β를 발현시키는 세포를 선택하고 증식시킨 후, 상기 트랜스펙션 또는 형질도입된 세포를 피험체에게 되돌린다. 상기 세포는 한정됨없이 뇌세포, 조혈세포(예컨대, 골수세포, 마이크로파지, 단핵세포, 가지세포, T세포, B세포), 파이브로블라스트, 상피세포, 내피세포, 각질형성세포, 근육세포를 포함하는 넓은 범위중 하나 일 수 있다. 그런 세포들은 그것들이 피험체에서 살아있는 한 GADD45β 단백질의 근원이 된다.

생체 외에서의 방법은 피험체로부터 세포를 수확하여 배양하고, 발현벡터로 형질도입을 하고, GADD45β유전자의 발현에 적합한 조건하에서 세포를 유지시키는 단계들을 포함한다. 이러한 방법은 분자생물학 분야에서 알려져 있다. 형질도입 단계는 인산칼슘, 리포펙션, 전기천공법, 바이러스성 감염, 바이올리스틱 유전자 전달법을 포함하는 생체외 유전자 치료를 위한 일종의 표준적인 수단에 의해 달성된다. 다른 방법으로는, 리포좀이나 폴리머 미세입자들을 이용할 수 있다. 예를 들어, 성공적으로 형질도입된 세포는 GADD45β 유전자의 발현을 위해 선택될 수 있다. 상기 세포는 피험체에 주사되거나 삽입될 수 있다.

부가적으로, 간질환의 치료를 위한 치료학적 조성물은 S-아데노실메티오닌, p53 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 p53 단백질 자체를 포함할 수 있다. 이러한 조성물과 상기 언급한 GADD45β 조성물은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.

이하의 특정예는 어떤 방법으로든 명세서를 한정하는 예가 아니라 단지 실험예로 해석되어져야 한다. 더 많은 상술없이도 당업계에서의 기술은 본원에 설명된 것을 기저로 본 발명에서 넓은 범위로 사용될 수 있다. 본원에 인용된 모든 문헌은 온전히 참조로써 본원에 포함될 것이다.

GADD45β 유전자는 사람에 있어 간경화증과 간암발병을 저하시키는 조절을 한다.

미세정렬로 유전자 발현을 분석함은 간암세포조직(HCC)에서의 12,800개 유전 자와 올리고의 발현 확률과 이에 대응하는 정상 간조직을 분석하는데 이용되었다. 상기 미세정렬 실험은 네번 반복되고 그 결과는 다른 소프트웨어로 분석했다. GADD45β는 정상 간에 비하여 간암종에서는 최소한도로 발현되는 유전자중 하나로 밝혀졌다.

노던블랏은 미세정렬의 결과를 확인하는데 사용된다. GADD45β 엑손 3을 가지고 있는 213-bp GADD45β cDNA프로브는 GenBank에 있는 XM_030487의 GADD45β서열에 따라 RT-PCR에 의해 얻어진다. GAPDH는 RNA로딩을 위한 조절제로 이용된다. 정상 간조직에서 발현에 비해, HepG2와 HepG3 간암세포계와 간암조직에서 GADD45β의 발현은 더 낮게 나타났다.

나아가, 면역조직화학(IHC)실험은 GADD45β이 정상 간조직에서보다 경변과 간암조직에서 더 적게 발현된다는 것을 증명했다. 만성 간경변증 조직에서 GADD45β 발현은 간암조직의 경우보다 높게 나타났다. 반대로 GADD45β는 직장암, 유방암, 전립선암, 림프종, 편평세포암, 육종조직에서 적게 발현되지는 않았고, 이는 GADD45β의 낮은 발현은 간 조직-특이성을 갖는다는 것을 암시한다.

다른 조직에 있어 사람의 GADD45α와 GADD45β mRNA 발현은 노던블랏으로 조사할 수 있다. GADD45β mRNA은 신장, 간, 폐에서 쉽게 발견되고, 이는 GADD45β 유전자가 해독작용을 하는 조직에서 발현됨을 설명한다. GADD45α mRNA는 GADD45β처럼 대부분의 조직에서 발견되지만 이는 골격근육조직에서 많이 발견됨이 밝혀졌다. GADD45α와β 모두 정상적인 간조직에서 최고의 발현정도를 갖는데 이는 그들이 간 조직-특이성 유전자임을 암시한다.

알콜 처리후 GADD45α와 GADD45β의 발현은 HepG2 콜론에서 노던블랏으로 알아냈다. 알콜 자극을 받은후 투여량-의존 방법에 있어서 GADD45β의 발현은 변함이 없음에 비해 GADD45α의 발현정도는 증가됨이 밝혀졌다. 이러한 결과는 상기 두개의 유전자가족간의 80%의 상동성을 가짐에도 불구하고 알콜 관련 DNA 손상에서는 다른 역할을 한다는 것을 암시한다. HepG2 세포에서 알콜 자극에 대해 GADD45β의 반응이 적은 것은 GADD45β 기능장애가 인간의 간암발생과 관련있음을 암시한다.

SAMe는 GADD45β 발현을 유도한다.

SAMe에 의한 GADD45β 유도는 정상적인 CL-48 간세포와 HepG2 세포에서 다른 반응 양식을 보인다. CL-48과 HepG2 세포는 0mM,1.0mM 그리고 2.0mM SAMe로 처리되었다. 처리후 72시간 지난 다음, 내부 로딩 대조군으로 18S RNA를 사용한 GADD45β 발현의 분석을 노던블랏으로 수행했다. 그 결과 GADD45β가 CL-48세포에서는 SAMe의 낮은 투여에 의해 유도되어지고 상기 유도는 SAMe를 많이 투여하는 경우 편평기에 다달았다. 그러나 HepG2 세포에서의 유도는 계속 투여량에 의존한다. 이러한 결과는 SAMe이 GADD45β를 통해 간암세포의 자연사멸을 야기함을 암시한다.

GADD45β의 발현은 p53 단백질에 의존적이다.

각기 다른 p53 조건에서 SAMe를 처리한 후 GADD45β 발현정도의 조사는 노던블랏으로 행해졌다. HepG2에서의(p53 야생형) GADD45β 발현은 다른 투여량에서 SAMe에의해 높게 조절된다. 반대로 Hep3B(p53무표지상태)에서 SAMe의한 GADD45β발현 유도는 되지 않았다. 이런 결과는 SAMe에 의해 유도된 증가한 GADD45β발현는 p53 단백질에 의존적이라는 것을 암시한다.

GADD45β 프로모터의 분석

GADD45β 인접 프로모터에 의해 지시되는 발광제의 활성은 β-Gal활성 대조군에 의해 측정되고 표준화되었다. 유전자의 870 내지 1조각이 가장 높은 프로모터 활성을 보인다. 이 부분에서 예상되는 프로모터 요소는 USF/N-Myc,NF-Y,CCAAT 박스와 TATTA 박스를 포함한다.

CCAAT/NF-Y 인자에 의한 GADD45β 전사조절

핵단백질은 처리되지 않은 CL-48세포와 2.0mM SAMe 또는 200mM 알콜로 처리된지 48시간 지난 CL-48세포로부터 추출되었다. GADD45β 프로모터의 CCAAT/NF-Y박스에 대응하는 끝부분에 표지된 올리고뉴클레오타이드를 추출된 핵단백질과 함께 배양하고, 이들이 결합한 집합체를 6%지연 겔에 의해 다른 것들과 분리했다. GADD45β 프로모터 Pα부분에서 단백질이 결합하는 위치는 표지되지 않은 올리고뉴클레오타이드 경쟁체와 NF-Y 항체를 이용하여 알 수 있다. 상기 처리를 하지 않은 대조군에 비해 SAMe으로 처리를 한 경우 주요 밴드의 양은 감소했다. 수퍼-쉬프트 분석(super-shift assay)에서, 상기의 결합체는 SAMe 처리된 표본으로 이동하고, SAMe으로 처리된 세포에서 GADD45β의 과대발현과도 일치한다.

NF-κB 인자에 의한 GADD45β전사의 조절

핵단백질은 상기 언급한 바와 같이 추출했다. GADD45β 프로모터의 NF-κB 박스에 대응하는 끝부분이 표지된 올리고뉴클레오타이드를 추출된 핵단백질과 함께 배양하고, 이들 결합체를 6%지연 겔에 의해 다른 것들과 분리했다. 처리되지 않은 CL-48 대조군과 비교하여, SAMe이나 알콜로 처리된 세포에서 증가된 특정 결합체와 감소된 또다른 결합체 모두를 보인다.이런 결과는 전사인자가 SAMe이나 알코올의 투여후에 GADD45β 발현을 조절하는 역할을 가지고 있음을 나타낸다.

다른 실시예

본 명세서에 기재된 모든 특징은 어떠한 조합에 있어서도 결합할 수 있을 것이다. 본 명세서에 기술된 모든 특징은 같거나 동등하거나 비슷한 목적을 위해서 다른 다양한 특징으로 치환될 수도 있다. 그러므로 만일 명백하게 다른 방법으로 표현된 것이 아니라면 서술된 각각의 특징은 단지 동등하거나 비슷한 특징의 유전적인 계열들의 예시이다.

당업자는 언급한 설명으로부터 쉽게 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 사상과 범위로부터 이탈됨이 없이 다양한 사용과 조건에 맞게 사용하기 위해 본 발명을 다양하게 변환하거나 수정할 수 있다. 그러므로 다른 양태들 또한 이하의 청구항의 범위에 속한다.

본 발명은 세포내에서 GADD45β 유전자의 발현레벨 또는 단백질 활성레벨이 간 질환(예컨대,경변증 또는 간암)과 관련있음을 이용하여 피험체의 간 질환 발병 또는 발병위험여부를 판단하고, 상기 유전자 또는 단백질의 레벨을 조절함으로써 간 질환을 치료하거나 조절할 수 있는 치료조성물을 판단하는 방법을 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> Yen, Yun <120> TREATMENT OF LIVER DISEASES <130> 14037-003WO1 <140> PCT/US03/25232 <141> 2003-08-12 <150> US 60/404,512 <151> 2002-08-19 <160> 1 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 870 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggtgacagct gatgtgtatt gggctcttac tgtcagccgt attttatgcc atgctctgca 60 aaccagcgag gccggcgctg cagacccatt actcagacgg gaacagagag gccgggagaa 120 gcgaaatcac ccaggggctg gggtcgtcgc agccaggaga gactccggcc ctcaccacca 180 cctgggcgag atcacgctgc aaacggggcc ccttcccggt gcagcccctc cacccccagc 240 agaacttggg aaaggcgcgg tccgggactc tccgcggatc gggaggggat tccaggcccc 300 cccgaaagtc cgggccgcct cgcgcgctgg aaatcccgcg cgcgccccga accgcggctc 360 ggctgccggg aaatcaggag aaaaaaactt ctgctttttt ttcttttctg gcattcgcgg 420 tcacctaccc ggcccccgcg cgccctcctc ccggttctcg cccccacgtg gggcgccccc 480 gcacgccgct cctccccctc ccctccgtcg gccaaccgca gagctagctg cactcgccct 540 tgtctttcca ccaataggag gggcgaatga ctccactgag gccacgccca atgttcaagt 600 ctataaaagt cggtgccgga ggctcccagc tcagatcgcc gaagcgtcgg actaccgttg 660 gtttccgcaa cttcctggat tatcctcgcc aaggactttg caatatattt ttccgccttt 720 tctggaagga tttcgctgct tcccgaaggt cttggacgag cgctctagct ctgtgggaag 780 gttttgggct ctctggctcg gattttgcaa tttctccctg gggactgccg tggagccgca 840 tccactgtgg attataattg caacatgacg 870

Claims

피험체가 간질환을 가지고 있거나 발병 위험성이 있는지 여부를 판단하는 방법으로서,

상기 방법은

상기 피험체로부터 표본을 제공하는 단계; 및

상기 표본에서 GADD45β 유전자의 발현정도를 결정하는 단계

를 포함하며,

상기 표본에서의 GADD45β 유전자 발현정도가 정상적인 피험체로부터의 표본에서보다 낮은 경우 그 피험체는 간 질환을 가지거나 발병 위험이 있음을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표본이 간 조직 표본임을 특징으로 하는 판단방법.
제 2항에 있어서, 상기 간 질환이 경변임을 특징으로 하는 판단방법.
제 2항에 있어서, 상기 간 질환이 간암임을 특징으로 하는 판단방법.
피험체가 간 질환을 가지고 있거나 발병 위험성이 있는지 여부를 판단하는 방법으로서,

상기 방법은

상기 피험체로부터 표본을 제공하는 단계; 및

상기 표본에서의 GADD45β 활성 정도를 결정하는 단계

를 포함하며,

상기 표본에서의 GADD45β 활성 정도가 정상적인 피험체로부터의 표본에서보다 낮은 경우 그 피험체는 간 질환을 가지거나 발병의 위험이 있음을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 표본이 간 조직표본임을 특징으로 하는 판단방법.
제 6항에 있어서, 상기 간 질환이 경변임을 특징으로 하는 판단방법.
제 6항에 있어서, 상기 간 질환이 간암임을 특징으로 하는 판단방법.
간질환 치료 화합물을 확인하는 방법으로서,

상기 방법은

화합물을 GADD45β 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및

상기 세포에서의 GADD45β 유전자의 발현정도를 결정하는 단계

를 포함하고,

상기 화합물이 없는 경우에 비해 존재시 GADD45β 유전자의 발현 정도가 높 은 경우 상기 화합물이 간질환 치료를 위한 후보 화합물임을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 세포가 간세포임을 특징으로 하는 확인방법.
제 10항에 있어서, 상기 간질환이 경변임을 특징으로 하는 확인방법.
제 10항에 있어서, 상기 간 질환이 간암임을 특징으로 하는 확인방법.
제 10항에 있어서, 상기 세포가 S-아데노실메티오닌으로 처리됨을 특징으로 하는 확인방법.
제 10항에 있어서, 상기 세포를 알콜처리함을 특징으로 하는 확인방법.
제 10항에 있어서, 상기 세포가 정상 세포의 경우에 비해 p53 유전자 발현정도가 낮음을 특징으로 하는 확인방법.
제 10항에 있어서, GADD45β 유전자의 전사가 SEQ ID NO:1을 포함하는 프로모터에 의해 지시됨을 특징으로 하는 확인방법.
제 16항에 있어서, 상기 세포가 CCAAT/NF-Y 인자 또는 NF-κB 인자를 발현함을 특징으로 하는 확인방법.
간 질환의 치료를 위한 물질을 확인하는 방법으로서,

상기 방법은

화합물을 GADD45β 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및

상기 세포에서의 GADD45β 단백질 활성레벨을 결정하는 단계

를 포함하고,

기 화합물이 없는 경우에 비해 존재시 GADD45β 활성 정도가 높은 경우 상기 화합물이 간 질환 치료를 위한 후보 화합물임을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 세포가 간세포임을 특징으로 하는 확인방법.
제 19항에 있어서, 상기 간 질환이 경변임을 특징으로 하는 확인방법.
제 19항에 있어서, 상기 간 질환이 간암임을 특징으로 하는 확인방법.
제 19항에 있어서, 상기 세포가 S-아데노실메티오닌으로 처리됨을 특징으로 하는 확인방법.
제 19항에 있어서, 상기 세포가 알콜로 처리됨을 특징으로 하는 확인방법.
제 19항에 있어서,상기 세포가 정상 세포보다 p53 유전자의 발현이 낮음을 특징으로 하는 확인방법.
제 19항에 있어서, GADD45β 유전자의 전사가 SEQ ID NO:1를 포함하는 프로모터에 의해 지시됨을 특징으로 하는 확인방법.
제 25항에 있어서, 상기 세포가 CCAAT/NF-Y인자 또는 NF-κB인자를 발현함을 특징으로 하는 확인방법.
간 질환을 앓거나 발병 위험이 있는 피험체를 확인하는 단계; 및

상기 피험체에 있어 GADD45β 양을 증가시키기 위해 조성물을 투여하는 단계

를 포함하는 간질환 치료방법.
제 27항에 있어서, 상기 간 질환이 경변임을 특징으로 하는 치료방법.
제 27항에 있어서, 상기 간 질환이 간암임을 특징으로 하는 치료방법.
제 27항에 있어서, 상기 조성물을 간 세포내로 투여함을 특징으로 하는 치료방법.
제 27항에 있어서, 상기 조성물이 GADD45β 단백질을 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 치료방법.
제 31항에 있어서, 상기 조성물을 간 세포내로 투여함을 특징으로 하는 치료방법.
제 27항에 있어서, 상기 조성물이 GADD45β 단백질을 포함함을 특징으로 하는 치료방법.
제 33항에 있어서, 상기 조성물을 간 세포내로 투여함을 특징으로 하는 치료방법.
제 27항에 있어서, 상기 조성물이 S-아데노실메티오닌을 포함함을 특징으로 하는 치료방법.
제 35항에 있어서, 상기 조성물을 간 세포내로 투여함을 특징으로 하는 치료방법.
제 27항에 있어서, 상기 조성물이 p53 단백질을 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 치료방법.
제 37항에 있어서, 상기 조성물을 간 세포내로 투여함을 특징으로 하는 치료방법.
제 27항에 있어, 상기 조성물이 p53 단백질을 포함함을 특징으로 하는 치료방법.
제 39항에 있어서, 상기 조성물을 간 세포내로 투여함을 특징으로 하는 치료방법.
GADD45β 단백질을 코딩하는 핵산 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
GADD45β 단백질 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.