[go: up one dir, main page]

TR201903439T4 - İnsanlaştırılmış hafif zincirli fareler. - Google Patents

İnsanlaştırılmış hafif zincirli fareler. Download PDF

Info

Publication number
TR201903439T4
TR201903439T4 TR2019/03439T TR201903439T TR201903439T4 TR 201903439 T4 TR201903439 T4 TR 201903439T4 TR 2019/03439 T TR2019/03439 T TR 2019/03439T TR 201903439 T TR201903439 T TR 201903439T TR 201903439 T4 TR201903439 T4 TR 201903439T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
mouse
human
gene
immunoglobulin
light chain
Prior art date
Application number
TR2019/03439T
Other languages
English (en)
Inventor
Gurer Cagan
J Murphy Andrew
Macdonald Lynn
Stevens Sean
A Hosiawa Karolina
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of TR201903439T4 publication Critical patent/TR201903439T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

İnsan ağır zincir değişken sekansları ile aynı kökten olan insan immünoglobulin &#955#& hafif zincir değişken sekanslarını ekspres eden genetik olarak modifiye edilmiş doğurgan fareler tarif edilmektedir. Genetiği değiştirilmiş fareler, hücreler, embriyolar ve bir fare ADAM6 lokusunda işlevsel bir ADAM6a'yı kodlayan bir nükleik asit sekansı içeren dokular tarif edilmektedir ki burada fareler, hücreler, embriyolar ve dokular, fonksiyonel bir immünoglobulin hafif zincir değişken bölgesi oluşturmak için yeniden düzenlenebilen insan immünoglobülin lambda hafif zincir gen segmentlerini içermektedir. Modifikasyonlar, insan ve / veya insanlaştırılmış immünoglobulin lokuslarını içermektedir. ADAM6 fonksiyonunu içeren fareler, bir ADAM6 proteinini kodlayan ektopik bir nükleik asit sekansını içeren fareler dahil olmak üzere tarif edilmiştir. Erkek fareye doğurganlığı geri kazandıran ektopik bir nükleik asit sekansı içeren fareler dahil olmak üzere, endojen bir fare immünoglobulin VH bölgesi lokusunun genetik bir modifikasyonunu içeren ve ayrıca ADAM6 aktivitesini içeren genetik olarak modifiye edilmiş erkek fareler tarif edilmektedir.

Description

TARIFNAME insanlastirilmis hafif zincirli fareler. BULUSUN ALANI Insan agir zincir degisken sekanslari ile ayni kökten olan insan immünoglobulin A hafif zincir degisken sekanslarini ekspres eden genetik olarak modifiye edilmis dogurgan fareler tarif edilmektedir. Genetigi degistirilmis fareler, hücreler, embriyolar ve bir fare ADAM6 Iokusunda islevsel bir ADAMöa'yi kodlayan bir nükleik asit sekansi içeren dokular tarif edilmektedir ki burada fareler, hücreler, embriyolar ve dokular, fonksiyonel bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi olusturmak için yeniden düzenlenebilen insan immünoglobülin lambda hafif zincir gen segmentlerini içermektedir. Modifikasyonlar, insan ve / veya insanlastirilmis immünoglobulin lokuslarini içermektedir. ADAM6 fonksiyonunu içeren fareler, bir ADAM6 proteinini kodlayan ektopik bir nükleik asit sekansini içeren fareler dahil olmak üzere tarif edilmistir. Erkek fareye dogurganligi geri kazandiran ektopik bir nükleik asit sekansi içeren fareler dahil olmak üzere, endojen bir fare immünoglobulin VH bölgesi lokusunun genetik bir modifikasyonunu içeren ve ayrica ADAM6 aktivitesini içeren genetik olarak modifiye edilmis erkek fareler tarif edilmektedir. Bir endojen ADAM6 geninin ya da bunun homologunun ya da ortologunun bir delesyonunu ya da modifikasyonunu içeren ve tamamen ya da kismen ADAMö'yi (ya da bunun homolog ya da ortologunu) restore eden bir genetik modifikasyon içeren genetigi degistirilmis üreyebilen fareler tarif edilmistir, burada fareler, bir K hafif zincir sabit sekansi baglaminda bir insan immünoglobülin A degisken sekansini ekspres etmektedir. ARKA PLAN Son yirmi yilda antikorlar için farmasötik uygulamalar, insan terapötikleri olarak kullanim için uygun antikorlarin üretilmesi konusunda büyük miktarda arastirmanin yapilmasina önayak olmustur. Fare antikorlarina dayali olan erken antikor terapisi, insan terapötikleri olarak ideal degildi, çünkü fare antikorlarinin insanlara tekrar tekrar uygulanmasi, uzun vadeli tedavi rejimlerini bozabilecek immünojeniklik problemleriyle sonuçlanmaktaydi. Fare antikorlarini daha insan ve daha az fare benzeri görünmelerini saglamak için insanlastirmaya dayali çözümler gelistirilmistir. Antikorlarda kullanim için insan immünoglobulin sekanslarini ekspres etme yöntemleri, çogunlukla faj, bakteri ya da mayadaki insan immünoglobulin kütüphanelerinin in vitro ekspresyonuna dayanarak takip edilmistir. Son olarak, in vitro, insan hematopoetik hücreleri ile asilanmis farelerde ve özürlü endojen immünoglobülin lokuslarina sahip transkromozomal ya da transgenik farelerde insan lenfositlerinden in vitro olarak insan antikorlari yapmaya yönelik girisimlerde bulunulmustur. Transgenik farelerde, rastgele birlestirilmis tamamen insan transgenleri, farede ekspres edilen immünoglobulin sekanslarinin kaynagi olarak görev yapacak sekilde endojen fare immünoglobülin genlerini etkisiz hale getirmek gerekliydi. Bu gibi fareler, insan terapötikleri olarak kullanim için uygun insan antikorlari üretebilmekle birlikte yine söz konusu fareler su problemleri de sergilemektedir: (1) fareleri yeterince çesitli bir antikor repertuarini olusturmak için elverissiz hale getirmektedir, (2) kapsamli yeniden mühendislik düzeltmelerinin kullanilmasini gerektirmektedir, (3) insan ve fare elementleri arasindaki uyusmazliktan dolayi muhtemel bir suboptimal klonal seçim süreci saglamaktadir ve (4) bu farelerin, insan terapötiklerinin yapilmasi için gerçekten yararli olmasi gereken, insan degisken sekanslarinin büyük ve çesitli popülasyonlarinin güvenilir olmayan bir kaynagi olmasini saglamaktadir. Tamamen insan antikor transgenlerini içeren transgenik fareler, insan agir zincir sabit sekanslarina bagli yeniden düzenlenmemis insan immünoglobülin agir zincir degisken sekanslari (V, D ve J sekanslari) ve insan hafif zincir sabit sekanslarina baglanmis yeniden düzenlenmis insan immünoglobülin hafif zincir degisken sekanslari (V ve J) içeren rastgele yerlestirilmis transgenleri içermektedir. Bu nedenle fareler, yeniden düzenlenmis antikor genlerinin tamamen insan oldugu endojen fare Genel olarak, fareler insan agir zincir sekanslari ve insan hafif zincir sekanslari içerir, ancak en azindan bazi insan A sekanslarina sahip fareler de rapor edilmistir. Transgenik fareler genellikle hasar görmüs ve islevsel olmayan endojen immünoglobülin Iokuslarina ya da endojen immünoglobülin Iokuslarinin nakavtlarina sahiptir, ki böylece fareler, endojen bir fare immünoglobülin lokusunda insan antikor sekanslarini yeniden düzenleme yetenegine sahip degildir. Bu tür transgenik farelerin degiskenleri, muhtemelen, en azindan kismen, endojen bir fare seçim sistemi içindeki tamamen insan antikor moleküllerini birbirine baglayan, en alt düzeyde bir klonal seçim süreci nedeniyle farelerde yeterince çesitli bir insan antikor repertuarinin üretilmesi için onlari optimalden daha az dönüstürmektedir. Teknik alanda insan antikor sekanslari da dahil olmak üzere immünoglobulin sekanslarinin üretilmesinde yararli olan ve yeterince çesitli insan antikor repertuarinin üretilmesinde yararli olan genetik olarak modifiye edilmis farelerin yapilmasina ihtiyaç duyulmaktadir. Ayrica, insan A ya da insan K degisken alanlariyla ayni hizadaki insan agir zincir degisken alanlari dahil faydali yeniden düzenlenmis immünoglobulin genlerinin olusturulmasi için immünoglobülin gen segmentlerinin yeniden düzenlenmesi yetenegine sahip olan ya da insan A ve / veya insan K hafif zincir degisken sekanslarinin yeterince çesitli bir seçimini içeren lokuslari içeren degistirilmis immünoglobülin Iokuslarindan proteinlerin üretilmesi yetenegine sahip olan farelere hala ihtiyaç vardir. Hem insan K hem de insan A segmentlerinden antikor degisken bölgeleri üretebilen farelere ihtiyaç vardir ki burada insan K ve insan A segmentleri, insan agir zincir degisken alanlari ile ayni köktendir. Ayrica insan A sekanslarinin genetigi degistirilmis farelerde kullanimin artmasi için de bir ihtiyaç söz konusudur BULUSUN 'OZETI Burada, endojen bir ADAM6 geninin aktivitesini ortadan kaldiran bir modifikasyon içeren genetigi degistirilmis fareler açiklanmakta olup, burada modifikasyon dogurganlik kaybiyla sonuçlanmaktadir ve fareler ayrica kayip ya da azaltilmis ADAMG aktivitesini (ya da homolog ya da ortolog aktiviteyi) tamamlayan ya da kurtarma aktivitesini kodlayan bir sekans içermektedir ve fareler ayrica, insan immünoglobülin A hafif zincir degisken bölgeleri ile birlikte olan insan immünoglobülin agir zincir degisken bölgelerini ekspres etmelerini saglayan modifikasyonlar içermektedir. Dolayisiyla sunlari içeren bir fare saglanmaktadir: (a) farenin endojen bir immünoglobulin kappa hafif zincir Iokusunda bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis insan V A gen segmenti ve bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis insan J A gen segmenti, burada immünoglobülin kappa hafif zincir lokusu bir fare CK bölgesi içermektedir: (b) farenin endojen bir immünoglobulin agir zincir lokusundaki bir ya da daha fazla insan VH gen segmenti, bir ya da daha fazla insan DH gen segmenti ve bir ya da daha fazla insan JH gen segmenti; ve (o) bir immünoglobulin agir zincir Iokusunun bir modifikasyonu olup, burada modifikasyon erkek farelerde fertilitede bir azalma ile iliskili olan endojen ADAM6 fonksiyonunu elimine etmektedir, fare ayrica her biri bir erkek farede dogurganlikta söz konusu azalmayi gelistirmek ya da iyilestirmek için islevsel olan bir fare ADAMBa proteinini ya da bir ortologunu ya da homolog ya da fonksiyonel bir fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi ve her biri, bir erkek farede, dogurganlikta bahsedilen azalmayi gelistirmek ya da iyilestirmek için islevsel olan, bir fare ADAM6b proteinini kodlayan bir nükleik asit sekansi ya da bunun bir ortologu ya da homologu ya da fonksiyonel fragmanini içermektedir, burada ADAM6 proteinlerini, onun ortologlarini, homologlarini ya da fonksiyonel fragmanlarini kodlayan nükleik asit sekanslari insan agir zincir gen segmentlerinde mevcuttur. Insan immünoglobulin A hafif zincir degisken bölgeleri, fare K sabit bölgelerine kaynasmis olarak ekspres edilmektedir. Bulusun çesitli yönlerinde, ADAM6 aktivitesini kodlayan sekans, bir insan immünoglobulin sekansi ile bitisiktir. Bulusun çesitli yönlerinde, ADAM6 aktivitesini kodlayan sekans, bir insan disi immünoglobulin sekansi ile bitisiktir. Sekans, insan agir zincir gen segmentleri içinde mevcut olan, farenin endojen insan disi immünoglobulin agir zincir lokusu ile ayni kromozom üzerinde bulunmaktadir. Bir ADAM6 geninin ya da onun homologunun ya da ortologunun aktivitesini koruyan bir modifikasyon içeren genetik olarak modifiye edilmis fareler tarif edilmekte olup, burada modifikasyon, insan disi bir immünoglobulin agir zincir sabit bölgesinin akis yukari bölümünde bir ya da daha fazla insan imm'ünoglob'ulin agir zincir gen segmentinin insersiyonunu içermektedir ve fareler ayrica, insan immünoglob'ulin agir zincir degisken bölgeleri ile birlikte insan immünoglobülin A hafif zincir degisken bölgelerini ekspres etmelerini saglayan modifikasyonlar içermektedir. Insan immünoglobulin A hafif zincir degisken bölgeleri, fare K sabit bölgelerine kaynasmis olarak ekspres edilmektedir. Ornek niteliginde olan bozulmalar, delesyon ve / veya islevsel olarak susturma modifikasyonlari farenin ADAM6 geni(ler) tarafindan kodlanan ADAM6 proteinin(lerinin) aktivitesinin ortadan kaldirilmasina neden olan herhangi bir modifikasyon içermektedir. Ayrica nükleik asit yapilari, hücreleri, embriyolari, fareleri ve islevsel olmayan bir endojen fare ADAM6 proteini ya da ADAM6 geniyle (örnegin, endojen bir ADAM6 geninde knockout ya da delesyon) sonuçlanan bir modifikasyon içeren fareler yapmak için yöntemler açiklanmaktadir, ki burada fareler, bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6 proteinini ya da ortologunu ya da bunun homologunu ya da bir fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi içermektedir. Ayrica nükleik asit yapilari, hücreleri, embriyolari, fareleri ve endojen bir fare immünoglobülin lokusunun bir modifikasyonunu içeren fareleri yapmak için yöntemler açiklanmaktadir, ki burada fareler, bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6 proteini ya da ortologu ya da homologu ya da bunun fragmanini içermektedir. Endojen fare immünoglobulin Iokusu, bir immünoglobulin agir zincir Iokusudur ve modifikasyon bir erkek farenin bir hücresinin ya da dokusunun ADAM6 aktivitesini elimine etmektedir. Burada ayrica bir fare ADAM6'sini ya da ortologunu ya da bunun homologunu ya da fonksiyonel fragmanini kodlayan bir ektopik nükleotit sekansi içeren fareler açiklanmakta olup, ayrica bir fare ADAMö'sini ya da ortologunu ya da bunun homologunu ya da bunun fragmanini kodlayan endojen bir nükleotit sekansi ve bir agir zincir immünoglobülin lokusunun en az bir genetik modifikasyonunu içeren fareler de açiklanmaktadir. Ayrica endojen bir fare immünoglobülin lokusunun bir modifikasyonunu içeren fareleri yapmak için yöntemler de açiklanmaktadir, ki burada fareler, bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6 proteini ya da ortologu ya da homologu ya da bunun fragmanini içermektedir. Ayrica bir agir zincirli immünoglobulin lokusunun genetik bir modifikasyonunu içeren fareler yapmak için yöntemler de açiklanmaktadir, ki burada yöntemlerin uygulanmasi, modifiye edilmis bir agir zincir immünoglobülin Iokusu (ya da bunun silinmesi) içeren erkek farelere yol açmaktadir ve erkek fareler, çiftleserek yavru üretebilme kapasitesine sahiptir. Bir örnekte, erkek fareler, bir fare uterusundan, bir fare yumurtasini döllemek için bir fare kanali vasitasiyla geçebilen sperm üretmek kapasitesine sahiptir. Ayrica bir immünoglobulin agir zincir lokusunun ve bir immünoglobulin hafif zincir lokusunun genetik bir modifikasyonunu içeren farelerin yapilmasi için yöntemler tarif edilmekte olup burada agir zincir Iokusunu modifiye etme yöntemlerinin uygulanmasi dogurganlikta bir azalma sergileyen erkek farelere yol açmakta ve fareler dogurganliktaki azalmayi tamamen ya da kismen düzelten genetik bir modifikasyon içermektedir. Bulusun çesitli düzenlemelerinde dogurganliktaki azalma erkek farelerin sperminin, bir fare yumurtasini döllemek için bir fare yumurta kanalindan dogru bir fare rahmine geçme konusundaki yetersizligi ile karakterizedir. Çesitli düzenlemelerde, fertilitedeki azalma, in vivo geçis kusuru sergileyen sperm ile karakterize edilmektedir. Çesitli düzenlemelerde, fertilitedeki azalmayi tamamen ya da kismen düzelten genetik modifikasyon erkek bir farede islevsel olan bir fare ADAM6 genini ya da ortologunu ya da homologunu ya da fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansidir. Bir düzenlemede genetik modifikasyon, endojen immünoglobulin agir zincir degisken lokuslarinin, insan immünoglobulin agir zincir degisken Iokuslariyla degistirilmesini içermektedir. Bir düzenlemede, genetik modifikasyon insan immünoglobulin agir zincir degisken lokuslarinin endojen immünoglobulin agir zincir degisken Iokuslarina insersiyonunu içermektedir. Bir düzenlemede, genetik modifikasyon, endojen bir immünoglobulin agir zincir degisken lokusunun tamamen ya da kismen silinmesini içermekte olup burada söz konusu silme islemi endojen ADAM6 fonksiyonunun kaybi ile sonuçlanmaktadir. Spesifik bir düzenlemede, endojen ADAM6 fonksiyonunun kaybi, erkek farelerde fertilitede bir azalma ile iliskilidir. Burada ayrica bir endojen insan disi immünoglobulin agir zincir degisken lokusunun tamamen ya da kismen inaktivasyonunu içeren bir genetik modifikasyon açiklanmakta olup burada inaktivasyon, endojen ADAM6 fonksiyonunun kaybi ile sonuçlanmamaktadir. Inaktivasyon endojen fare gen bölümlerini içeren bir antikorun agir bir zincirini kodlamak için büyük ölçüde yeniden düzenlenemeyen bir endojen fare immünoglobülin agir zincir Iokusu ile sonuçlanan bir ya da daha fazla endojen fare gen segmentinin degistirilmesi ya da silinmesini içerebilir. Inaktivasyon bir antikorun agir zincirini kodlamak için yeniden düzenlenemeyen endojen immünoglobülin agir zincir lokusunu olusturan diger modifikasyonlari içerebilmekte olup burada modifikasyon, endojen gen segmentlerinin degistirilmesini ya da silinmesini içermemektedir. Ornek niteliginde olan degisiklikler, moleküler tekniklerin aracilik ettigi kromozomal inversiyonlari ve / ya da translokasyonlari içermektedir, örnegin bölgeye özgü rekombinasyon bölgelerinin (örnegin Cre-on teknolojisi) kesin yerlesiminin kullanilmasi. Diger örnek niteligindeki modifikasyonlar, fare immünoglobülin degisken gen segmentleri ve insan disi immünoglobülin sabit bölgeleri arasindaki uygulanabilir baglantinin devre disi birakilmasini içermektedir. Bir düzenlemede, genetik modifikasyon bir ya da daha fazla insan VH gen segmenti, bir ya da daha fazla insan DH gen segmenti ve bir ya da daha fazla sabit bölge dizisine (örnegin bir IgM ve / veya bir IgG geni) islevsel olarak baglanmis bir ya da daha fazla insan JH gen segmenti içeren bir DNA fragmaninin fare genomuna insersiyonunu içermektedir. Bir düzenlemede, DNA fragmani bir antikorun bir insan agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir sekans olusturmak için farenin genomunda yeniden düzenleme yapabilme kapasitesine sahiptir. Burada, modifikasyona sahip bir erkek fare azaltilmis bir fertilite sergileyecek (örnegin çiftleserek yavru üretme kabiliyeti düsük olmasi) ya da endojen ADAM6 fonksiyonunun azaltilmasi ya da ortadan kaldirilmasi nedeniyle esasen kisir olacak sekilde endojen bir ADAM6 alelinden fare ADAM6 ekspresyonunu azaltan ya da ortadan kaldiran bir modifikasyon içeren fareler açiklanmakta olup burada fareler ayrica bir ektopik ADAM6 sekansi ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmanini içermektedir. Fare ADAM6 ekspresyonunu azaltan ya da ortadan kaldiran modifikasyon, bir fare immünoglobülin Iokusunda bir modifikasyon (örnegin, bir insersiyon, bir delesyon, bir replasman, vb.) olabilir. Burada, ADAM6 fonksiyonunun azalmasi ya da kaybinin, bir fare yumurtasini döllemek için bir fare uterusundan bir fare yumurta kanalina geçebilen bir sperm üretememesi ya da üretimde büyük ölçüde yetersiz kalmasina sebep olacagi açiklanmaktadir. Farenin ejakülat hacminde üretilen sperm hücrelerinin en az vivo olarak bir yumurta kanali içinden geçemez ve bir fare yumurtasini dölleyemez. Burada, ADAM6 fonksiyonunun azaltilmasi ya da kaybinin, farenin bir sperm hücresinin bir yüzeyinde bir ADAM2 ve / veya ADAM3 ve / veya ADAM6 kompleksi olusturmak için yetersizligi ya da büyük ölçüde yetersizligi içerdigi açiklanmaktadir. Bir düzenlemede, ADAM6 fonksiyonunun kaybi, bir disi fare ile çiftleserek bir fare yumurtasinin döllenmesinde önemli bir yetersizligi ortaya çikarmaktadir. Ayrica islevsel bir endojen ADAM6 geninden yoksun olan ve farede ADAM6 islevselligini saglayan bir protein (ya da bir proteini kodlayan ektopik bir nükleotit sekansi) içeren bir fare açiklanmaktadir. Fare bir erkek fare olabilir ve islevselligi, islevsel bir endojen ADAM6 geninden yoksun bir fareye kiyasla daha yüksek fertilite içermektedir. Protein, farenin germ hattinda bir immünoglobulin lokusu içinde yer alan bir genomik sekans tarafindan kodlanmaktadir. Immünoglobulin lokusu bir agir zincir Iokusudur. Agir zincir Iokusu en az bir insan VH, en az bir insan DH ve en az bir insan JH gen segmentini içermektedir. Bulusun bir düzenlemesinde, fare bir insan ya da kimerik insan /fare ya da kimerik insan / siçan hafif zinciri ('ornegin insan degisken, fare ya da siçan sabiti) ve kimerik bir insan degisken / fare ya da siçan sabiti agir zincirini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, fare, transkripsiyonel olarak aktif bir promotöre, örnegin bir ROSA26 promotörüne islevsel olarak bagli bir kimerik insan degisken / siçan ya da fare sabit hafif zincir geni içeren bir transgeni içermektedir. Bir baska özel uygulamada, kimerik insan / fare ya da siçan hafif zincir transgeni, farenin germ hattinda yeniden düzenlenmis bir insan hafif zincir degisken bölge sekansini içermektedir. Ektopik nükleotit sekansi, farenin germ hattinda bir immünoglobulin Iokusu içinde yer almaktadir. Immünoglobulin lokusu bir agir zincir Iokusudur. Agir zincir Iokusu en az bir insan VH, en az bir insan DH ve en az bir insan JH gen segmentini içermektedir. Ayrica islevsel bir endojen ADAM6 geninden yoksun bir fare açiklanmakta olup burada fare, fare ADAM6 fonksiyonunun kaybini tamamlayan ektopik bir nükleotit sekansi içermektedir. Ektopik nükleotit sekansi fareye, islevsel bir endojen ADAM6 geni içeren karsilik gelen vahsi tip bir fareyle karsilastirilabilir yavrular üretme yetenegi verebilir. Sekans fareye, farenin sperm hücresi yüzeyinde bir ADAM2 ve / veya ADAM3 ve / veya ADAM6 kompleksi olusturma kabiliyeti verebilir. Sekans, fareye, bir fare yumurta kanalindan dogru bir yumurta uterusundan bir fare yumurtasina (yumurtayi d'ollemek üzere) seyahat etme kabiliyeti kazandirabilir. Bir düzenlemede, fonksiyonel endojen ADAMG geninden yoksun ve ektopik nükleotit sekansini içeren bir fare, islevsel endojen ADAM6 geninden yoksun olan ve ektopik nükleotit sekansindan yoksun olan ve ayni süre boyunca yetistirilen bir fareye kiyasla 4- ya da 6 aylik bir üreme döneminde dogum basina ortalama en az yaklasik 2 kat, 3 kat ya da 4 kat daha fazla yavru üretmektedir. Bir düzenlemede, fonksiyonel endojen ADAM6 geninden yoksun olan ve ektopik nükleotit sekansini içeren fare bir erkek faredir ve erkek fare, çiftlesmeden yaklasik -6 saat sonra yumurtaliklardan geri kazanildiginda, islevsel endojen ADAM6 geninden yoksun ve ektopik nükleotit sekansindan yoksun bir fareden en az 10 kat, kanali göçünü yansitacak bir miktarda sperm üretmektedir. Bir düzenlemede, fonksiyonel endojen ADAM6 geninden yoksun olan ve ektopik nükleotit sekansini içeren fare bir disi fare ile çiftlestiginde uterusu geçebilen ve vahsi dogada bulunan bir fareden gelen sperme yaklasik esit bir verimle yaklasik 6 saat içinde yumurta kanali içine girebilen ve geçebilen bir sperm üretmektedir. Bir düzenlemede fonksiyonel endojen ADAM6 geninden yoksun olan ve ektopik nükleotit sekansini içeren fare, karsilastirilabilir bir sürede, islevsel ADAM6 geninden yoksun olan ve ektopik nükleotit sekansindan yoksun olan bir fareye kiyasla yaklasik 1,5 kat, yaklasik 2 kat, yaklasik 3 kat ya da yaklasik 4 kat ya da daha fazla yavru üretmektedir. Bulusun bir görüsüne göre, saglanan fare germ hattinda bir immünoglobulin proteinini kodlayan fare disi bir nükleik asit sekansi saglamakta olup, burada fare disi immünoglobulin sekansi, bir fare ADAM6 geninin ya da bunun homologunun ya da ortologunun ya da fonksiyonel bir fragmaninin eklenmesini içermektedir. Fare disi immünoglobulin sekansi bir insan immünoglobulin sekansi içermektedir. Sekans bir ya da birden fazla insan V geni segmenti, bir ya da daha fazla insan D geni segmenti ve bir ya da daha fazla insan J geni segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, bir ya da daha fazla V, D ve J gen segmenti yeniden düzenlenmemektedir. Bir düzenlemede, bir ya da daha fazla V, D ve J gen segmenti yeniden düzenlenmektedir. Bir düzenlemede, segmentinin yeniden düzenlenmesinin ardindan, fare kendi genomunda bir fare ADAM6 genini ya da bunun homologunu ya da ortologunu ya da fonksiyonel bir fragmanini kodlayan en az bir nükleik asit sekansi içermektedir. Bir düzenlemede, yeniden düzenlemenin ardindan fare, genomunda, bir fare ADAM6 genini kodlayan en az iki nükleik asit sekansi ya da bunun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmanini içermektedir. Bir düzenlemede, yeniden düzenlemenin ardindan fare, genomunda, bir fare ADAM6 genini kodlayan en az bir nükleik asit sekansi ya da bunun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmanini içermektedir. Bir düzenlemede, fare, ADAM6 genini ya da homologunu ya da ortologunu ya da bunun bir B hücresindeki fonksiyonel fragmanini içermektedir. Bir düzenlemede, fare, ADAM6 genini ya da homologunu ya da ortologunu ya da bunun bir B disindaki bir hücredeki fonksiyonel fragmanini içermektedir. Bulusun bir yönünde saglanmis olan fareler, bir endojen fare immünoglobülin agir zincir lokusundan bir insan immünoglobülin agir zincir degisken bölgesini ya da bunun fonksiyonel bir parçasini ekspres etmekte olup burada fareler, bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6 aktivitesini içermektedir. Burada ayrica ADAM6 islevini saglayan bir proteini kodlayan ektopik bir fare ADAM6 sekansi ya da homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmanini içeren erkek fareler açiklanmaktadir. Bir düzenlemede, erkek fareler, fare genomunda endojen fare ADAM6 alelinin (örnegin, bir V gen segmenti sekansinin 3, ve bir ilk D gen segmenti sekansinin 5') konumuna yaklasan bir yerde, bir ADAM6 sekansi ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmanini içermektedir. Burada tarif edilen düzenlemelerde, "ADAM6" referansi "ADAM6 ve ADAMGb" anlamina gelmektedir. Burada bir immünoglobulin degisken gen segmentini kodlayan bir nükleik asit sekansinin yukari akis yönünde, asagi akis yönünde ya da yukari akis yönünde ve asagi akis yönünde (ADAM6 sekansinin transkripsiyon yönüne göre) kusatilmis bir ADAM6 sekansi ya da homolog ya da ortologu ya da bunun fonksiyonel fragmanini içeren erkek fareler açiklanmaktadir. Spesifik bir düzenlemede immünoglobulin degisken gen segmenti bir insan gen segmentidir. Bir düzenlemede immünoglobulin degisken gen segmenti bir insan gen segmentidir ve fare ADAMö'yi ya da onun bir farede islevsel olan ortologunu ya da homologunu ya da fragmanini kodlayan dizi, insan V geni segmentleri arasindadir; bir düzenlemede fare, iki ya da daha fazla insan V geni segmenti içermektedir ve sekans, nihai V gen segmenti ve penultimat V gen segmenti arasinda bir pozisyonda yer almaktadir; bir düzenlemede, sekans, nihai V gen segmentini ve birinci D gen segmentini takip eden bir pozisyonda yer almaktadir. Bir düzenlemede, erkek fareler vahsi tipte bir erkek faredeki ile ayni ya da büyük ölçüde ayni olan endojen bir immünoglobulin lokusunda bir pozisyonda bulunan bir ADAM6 homologu ya da ortologu ya da bunun fonksiyonel bir parçasini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, endojen lokus, bir antikorun agir zincir degisken bölgesini kodlama kapasitesine sahip olmayip burada degisken bölge bir endojen fare gen bölümünden olusmakta ya da ondan türetilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, endojen Iokus, bir antikorun agir zincir degisken bölgesini sifrelemekte yetersiz kalmasini saglayan erkek farenin genomunda bir yere yerlestirilmektedir. Erkek fareler, insan immünoglobulin gen segmentleri ile ayni kromozomda bulunan bir ADAM6 sekansini içermektedir ve ADAM6 sekansi, fonksiyonel bir ADAM6 proteinini kodlamaktadir. Ayrica germ hattinda islevsel olmayan bir endojen ADAM6 geni ya da endojen bir ADAM6 geninin silinmesini içeren bir erkek fare de açiklanmakta olup; burada farenin sperm hücreleri, bir disi farenin bir yumurta kanalini geçebilir ve bir yumurtayi dölleyebilir. Ayrica, islevsel bir endojen ADAM6 geni ve endojen bir immünoglobülin agir zincir lokusunda bir modifikasyon içeren bir erkek fare açiklanmaktadir. Modifikasyon, endojen ADAM6 geninin akis asagi kisminda ya da 3' yönünde yapilabilir. Modifikasyon bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin agir zincir gen segmentinin bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir gen segmenti ile degistirilmesi seklinde olabilir. Modifikasyon, bir endojen immünoglobulin agir zincir sabit bölge geninin yakis yukari yönünde bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir gen segmentinin insersiyonu seklinde olabilir. Ayrica endojen fare ADAM6 fonksiyonunu azaltan genetik bir modifikasyon içeren fareler de açiklanmakta olup, burada fare, tamamen ya da kismen islevsel olan endojen olarak degistirilmemis bir alel (örnegin, bir heterozigot) tarafindan saglanan ya da bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6'yi ya da bir ortologu ya da homologunu ya da fonksiyonel bir parçasini kodlayan ektopik bir sekanstan ekspresyon ile saglanan en azindan bazi ADAM6 islevselliklerini içermektedir. Bir düzenlemede fareler, islevsel bir ADAM6 içermeyen erkek farelere kiyasla, erkek farelere çiftleserek yavru üretme yetenegi vermek için yeterli olan ADAM6 fonksiyonunu içermektedir. Bir erkek farede islevsel olan ADAM6 homologlari ya da ortologlari ya da bunlarin fragmanlari arasinda yeterli endojen fare ADAM6 aktivitesine sahip olmayan (örnegin, bir ADAM6 nakavt farede gözlemlenen yetenek kaybi) bir erkek farede gözlemlenen yavru üretme kabiliyetini tamamen ya da kismen geri kazananlar yer almaktadir. Bu baglamda, ADAM6 nakavt fareler, endojen bir lokus ya da bunun fragmanini içeren, ancak bu fragman ya da Iokusun fonksiyonel olmadigi (yani, ADAM6'yi (ADAM6a ve / veya ADAM6b) hiç ekspres etmiyorsa ya da ADAMG'yi (ADAM6a ve / veya ADAM6b) vahsi tip erkek bir farenin yavrularini üretmek için esasen normal bir yetenegini desteklemek için yetersiz bir miktarda ekspres ediyorsa) fareleri içermektedir. Fonksiyon kaybi, örnegin, Iokusun yapisal geninde (yani, bir ADAMöa ya da ADAM6b kodlama bölgesinde) ya da lokusun düzenleyici bölgesindeki bir modifikasyondan (örnegin, ADAMGa genine 5 burada sekans, tamamen ya da kismen bir ADAM6 geninin transkripsiyonunu, bir ADAM6 RNA'nin ekspresyonunu ya da bir ADAM6 proteininin ekspresyonunu kontrol etmektedir) kaynaklanabilir . Çesitli düzenlemelerde, bir erkek farede fonksiyonel olan ortologlari ya da homologlari ya da bunlarin fragmanlari, bir erkek farenin sperminin (ya da bir erkek farenin menisindeki sperm hücrelerinin çogunlugu) bir fare yumurta kanalini geçmesini ve bir fare yumurtasini döllemesini saglayanlardir. Bir düzenlemede, insan immünoglobülin degisken bölgesini ya da bunun fonksiyonel parçasini ekspres eden erkek fareler erkek farelere disi farelerle çiftleserek yavru üretme kabiliyeti kazandirmak için yeterli ADAM6 aktivitesini içermektedir ve bir düzenlemede, erkek fareler bir disi fare ile çiftlestiklerinde, bir düzenlemede en az % , bir düzenlemede, en az % 30, bir düzenlemede en az % 40, bir düzenlemede en az % 50, bir düzenlemede en az % 60, bir düzenlemede en az % 70, bir düzenleme en az % 80 ve bir düzenlemede tamamen bir ya da iki endojen modifiye edilmemis ADAM6 aleli olan fare ile ayni oranda yavru üretme kabiliyetine sahiptir. Bir düzenlemede erkek fareler, erkek farelerden bir sperm hücresinin bir disi fareyi yumurta kanalini geçip bir fare yumurtasini döllemesini saglamak için yeterli miktarda ADAM6 (ya da onun bir ortologu ya da homologu ya da fonksiyonel fragmani) ekspres etmektedir. Genetik olarak modifiye edilmis fareler ve bir endojen immünoglobülin agir zincir lokusunun bir modifikasyonunu içeren hücreler açiklanmakta olup, burada fareler, bir immünoglobülin agir zincir sekansinin en azindan bir kismini, örnegin bir insan sekansinin en az bir bölümünü ekspres etmektedir, ki burada fareler, bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6 aktivitesini içermektedir. Modifikasyon, farenin bir ADAM6 aktivitesini azaltabilir ya da tamamen ortadan kaldirabilir. Fare, ADAM6 aktivitesini kodlayan her iki alel de mevcut olmayacak ya da erkek bir farede normal ciftlesmeyi desteklemek için büyük ölçüde islev görmeyen bir ADAMG'yi ekspres edecek sekilde modifiye edilebilir. Fare ayrica bir fare ADAMö'sini ya da onun ortologunu ya da homologunu ya da fonksiyonel bir fragmanini kodlayan bir ektopik nükleik asit sekansi içerebilir. Modifikasyon, farenin ADAM6 aktivitesini koruyabilir ve bir antikorun bir agir zincir degisken bölgesini kodlama kapasitesine sahip olmayan endojen bir immünoglobulin agir zincir lokusu olusturur. Bu modifikasyon, bir agir zincir sabit bölgesine islevsel olarak bagli bir antikorun agir zincir degisken bölgesini kodlamak için yeniden düzenlenebilme kapasitesine sahip olmayan endojen immünoglobulin agir zincir degisken gen segmentlerini üreten kromozomal inversiyonlar ve / translokasyonlari içerebilir. Bir endojen immünoglobulin agir zincir lokusunun bir modifikasyonunu içeren modifiye edilmis fareler ve hücreler açiklanmakta olup, burada modifikasyon, Iokusun bir ADAM6 sekansindan ekspres edilen ADAM6 aktivitesini azaltmakta ya da tamamen ortadan kaldirmaktadir, ve burada fareler, bir ADAM6 proteinini ya da onun ortologunu ya da homologunu ya da fonksiyonel bir fragmanini içermektedir. ADAM6 proteini ya da bunun fragmani, bir ektopik ADAMG sekansi tarafindan kodlanabilir. ADAM6 proteini ya da onun fragmani bir endojen ADAMG alelinden ekspres edilebilir. Fare, fonksiyonel bir ADAM6'nin birinci immünoglobulin agir zincir alelinden ekspresyonunu azaltan ya da ortadan kaldiran bir birinci modifikasyon içeren bir birinci immünoglobülin agir zincir alelini içerebilir, ve fare, ikinci bir immünoglobulin agir zincir alelinden fonksiyonel bir ADAM6'nin ekspresyonunu büyük ölçüde azaltmayan ya da ortadan kaldirmayan bir ikinci modifikasyon içeren bir ikinci immünoglobülin agir zincir aleli içerebilir. Modifikasyon, bir endojen immünoglobulin agir zincir sabit bölge geninin yakis yukari, ya da 5' yönünde, bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir gen segmentinin insersiyonu seklinde olabilir. Modifikasyon, endojen immünoglobulin agir zincir Iokusunda yer alan endojen ADAMö genini koruyabilir. Ikinci modifikasyon, son bir fare V gen segmentinin 3, ucuna (fare V gen segmentinin transkripsiyonel yönüne göre) ve bir fare (ya da kimerik insan / fare) immünoglobulin agir zincir sabit geninin 5' ucuna (sabit sekansin transkripsiyonel yönelimi ile ilgili olarak) ya da bunun fragmanina yerlestirilmistir (örnegin, bir insan ve / veya fareyi kodlayan bir nükleik asit sekansi: CH1 ve / veya mentese ve / veya CH2 ve / veya CH3). Modifikasyon, bir birinci ADAMB alelini kodlayan bir birinci Iokustaki bir birinci immünoglobülin agir zincir alelinde olabilir ve ADAM6 fonksiyonu, fonksiyonel bir ADAMG'yi kodlayan ikinci bir Iokusta ikinci bir immünoglobulin agir zincir alelinde endojen bir ADAM6'nin ekspresyonundan kaynaklanmaktadir, ki burada ikinci immünoglobulin agir zincir aleli, bir V, D ve / veya J gen bölümünün en az bir modifikasyonunu içermektedir. V, D ve ya da J gen segmentinde en az bir modifikasyon bir delesyon olabilir, insan V, D ve / veya J geni segmenti ile bir replasman, bir camelid V, D ve / veya J gen segmenti ile bir replasman, insanlastirilmis ya da kamellesmis bir V, D ve I veya J gen segmenti ile bir replasman, bir agir zincir sekansinin hafif zincir sekansiyla resplasmani ve bunlarin bir kombinasyonu olabilir. En az bir modifikasyon bir ya da daha fazla agir zincir V, D ve / veya J gen segmentinin delesyon ve agir zincir Iokusundaki bir ya da daha fazla hafif zincir V ve / veya J gen segmenti (Örnegin bir insan hafif zincir V ve / veya J gen segmenti) ile replasman olabilir. Bir düzenlemede, modifikasyon, bir birinci Iokusta bir birinci imm'ünoglobulin agir zincir alelinde ve bir ikinci Iokusta bir ikinci immünoglobulin agir zincir alelinde yer almaktadir ve ADAM6 fonksiyonu, birinci immünoglobulin agir zincir alelinde bir ektopik ADAM6 sekansinin ekspresyonundan kaynaklanmaktadir. Bir düzenlemede, modifikasyon, bir birinci Iokusta bir birinci immünoglobulin agir zincir alelinde ve bir ikinci lokusta bir ikinci immünoglobulin agir zincir alelinde yer almaktadir ve ADAM6 fonksiyonu ya da aktivitesi, ikinci immünoglobulin agir zincir alelinde bir ektopik ADAM6,nin ekspresyonundan kaynaklanmaktadir. Burada ADAMö'nin bir heterozigoz ya da bir homozigos nakavtini içeren bir fare açiklanmaktadir. Fare ayrica bir insan ya da bir insanlastirilmis immünoglobulin sekansi olan bir modifiye edilmis immünoglobulin sekansi ya da bir camelid ya da kamelize insan ya da fare immünoglobülin sekansi içerebilir. Modifiye edilmis immünoglobulin sekansi, endojen agir zincir immünoglobulin lokusunda mevcut olabilir. Modifiye edilmis immünoglob'ulin sekansi, endojen bir agir zincir immünoglobülin lokusunda bir insan agir zincir degisken gen sekansi içerebilir. Insan agir zincir degisken gen sekansi, endojen immünoglobulin agir zincir Iokusundaki bir endojen agir zincir degisken sekansinin yerini alabilir. Ayrica endojen bir fare ADAM6 lokusundan fonksiyonel bir endojen fare ADAM6'yi ekspres etme kapasitesine sahip olmayan bir fare açiklanmaktadir. Fare, bir ADAMö'yi ya da onun farede fonksiyonel olan fonksiyonel bir fragmanini kodlayan bir ektopik nükleik asit sekansi içerebilir. Ektopik nükleik asit sekansi, bir ADAM6 nakavti için homozigot olan bir erkek fare tarafindan sergilenen yavrulari 'üretme kabiliyetinde meydana gelen bir kaybi gideren bir proteini kodlayabilir. Ektopik nükleik asit sekansi, bir fare ADAM6 proteinini kodlayabilir. islevsel bir endojen ADAM6 lokusundan yoksun olan ve fare ADAM6 fonksiyonunu saglayan bir ektopik nükleik asit sekansi içeren bir fare tarif edilmektedir. Nükleik asit sekansi, endojen bir fare ADAM6 sekansini ya da onun fonksiyonel bir parçasini içerebilir. Endojen fare ADAMB sekansi, vahsi tip bir farede, en fazla 3' fare immünoglobülin agir zincir V gen segmenti (VH) ve en çok 5* fare immünoglobülin agir zincir D gen segmenti (DH) arasinda yer alan ADAM6a- ve ADAM6b kodlama sekanslarini içermektedir. Fare ADAMöa'yi ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi ve / veya fare ADAMöb'yi ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlayan bir sekans tarif edilmekte olup burada ADAMöa ve / veya ADAMöb ya da onlarin fonksiyonel fragmanlari, bir promotere islevsel olarak bagladir. Promotör bir insan promotörü olabilir. Promotör fare ADAMG promotörü olabilir. ADAMG promotörü, fare '-en DH gen segmentine en yakin birinci ADAM6 geninin ilk kodonu ve 5'-en DH gen segmentinin rekombinasyon sinyal sekansi arasina yerlestirilebilen bir diziyi içermektedir, buradaki 5', fare immünoglobulin genlerinin transkripsiyon yönüne göre gösterilmektedir. Promotör bir viral promotör olabilir. Viral promotör, bir sitomegalovirüs (CMV) promotörü olabilir. Promotör bir viral ubikuitin promotör olabilir. Promotör indüklenebilir bir promotör olabilir. Indüklenebilir promotör, üreme disi dokulardaki ekspresyonu düzenleyebilir. Indüklenebilir promotör, üremeyle ilgili dokulardaki ekspresyonu düzenleyebilir. Fare ADAMGa ve / veya ADAMGb sekanslarinin ya da bunlarin fonksiyonel fragmanlarinin ekspresyonu, üreme dokularindaki indüklenebilir promotör tarafindan gelisimsel olarak düzenlenebilir. Bir düzenlemede, fare ADAMBa ve / veya ADAMöb SEKANS ID NO: 1*in ADAMGasindan ve / veya SEKANS ID NO: 2*nin ADAMöbfsinden seçilmektedir. Bir düzenlemede fare ADAM6 promotörü, SEKANS ID NO: 3`ün bir promotörüdür. Spesifik bir düzenlemede, fare ADAMG promotörü ADAMGa'nin ilk kodonunun dogrudan akis yukari yönünde (ADAMöa'nin transkripsiyon yönüne göre) ve ADAMö kodlama bölgesinin üstündeki SEKANS ID NO: 3'ün sonuna kadar uzanan, SEKANS ID NO: Bfün nükleik asit sekansini içermektedir. Bir diger spesifik düzenlemede, ADAMG promotörü ADAM6a baslangiç kodonunun yukarisindaki yaklasik 5 ila yaklasik 20 nükleotit arasindan ADAMöa'nin baslangiç kodonunun yaklasik 0.5kb, 1kb, 2kb ya da 3kb ya da daha fazla akis yukari yönüne kadar uzayan bir fragmandir. Bir düzenlemede, nükleik asit sekansi, kisir olan ya da ADAMG eksikligi nedeniyle fertilitesi düsük olan bir fareye yerlestirildiginde, dogurganligi arttiran ya da dogurganligi vahsi tip bir dogurganlik seviyesine geri getiren bir SEKANS ID NO: 3 ya da onun bir fragmanini içermektedir. Bir düzenlemede, SEKANS ID NO: 3 ya da bunun bir fragmani, bir erkek fareye, bir fare yumurtasini döllemek için bir disi fare yumurta kanalini geçebilen bir sperm hücresi üretme kabiliyeti vermektedir. Bir düzenlemede, nükleik asit sekansi bir ADAM6 genini ya da bunun homologunu ya da ortologunu ya da fonksiyonel bir fragmanini kodlayan herhangi bir sekans olup söz konusu sekans bir fareye yerlestirildiginde yabani tip bir fareyle ayni ya da karsilastirilabilir bir fertilite düzeyi saglamaktadir. Ornek bir dogurganlik seviyesi, bir erkek farenin, bir fare yumurtasini döllemek için bir disi fare yumurta kanalini geçebilen bir sperm hücresi üretme kabiliyeti ile gösterilebilmektedir. Burada ayrica bir ADAMG proteinini kodlayan endojen bir nükleotit sekansinin delesyonunu, bir insan VH gen segmenti ile bir endojen fare VH gen segmentinin replasmanini ve erkek bir farede islevsel olan bir fare ADAM6 proteinini ya da ortologunu ya da homologunu ya da bunun fragmanini kodlayan ektopik bir nükleotit sekansi içeren bir fare açiklanmaktadir. Bir örnekte fare, bir ya da daha fazla insan immünoglobulin gen segmentini kodlayan bir nükleotit sekansi içeren bir endojen ADAM6 geni içeren endojen bir immünoglobulin lokus nükleotit sekansinin delesyonunu içeren bir immünoglobulin agir zincir Iokusu içermekte olup, burada fare ADAM6 proteinini kodlayan ektopik nükleotit sekansi, bir ya da birden fazla insan immünoglobulin gen segmentini kodlayan nükleotit sekansinin içerisinde yer almaktadir ya da söz konusu sekansa bitisiktir. Bir düzenlemede fare, bir ya da birden fazla insan VH gen segmentini kodlayan bir nükleotit sekansiyla birlikte tüm ya da hemen hemen tüm endojen VH gen segmentlerinin bir replasmanini içermektedir, ve fare ADAM6 proteinini kodlayan ektopik nükleotit sekansi, bir ya da birden fazla insan VH gen segmentini kodlayan nükleotit sekansinin içerisinde yer almaktadir. Bir düzenlemede fare ayrica endojen DH gen lokusunda bir ya da birden fazla DH gen segmentiyle birlikte bir ya da birden fazla DH gen segmentinin bir replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede fare ayrica endojen JH gen lokusunda bir ya da birden fazla JH gen segmentiyle birlikte bir ya da birden fazla JH gen segmentinin bir replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede fare endojen VH, DH ve JH gen segmentlerinin tamaminin ya da hemen hemen tamaminin bir replasmanini içermekte ve insan VH, DH ve JH gen segmentleri ile birlikte endojen VH, DH ve JH gen Iokusunda bir replasman içermekte olup, burada fare, bir fare ADAM6 proteinini kodlayan bir ektopik sekans içermektedir. Bir düzenlemede fare, endojen bir immünoglobulin agir zincir Iokusunda insan VH, DH ve JH gen segmentlerinin bir insersiyonunu içermekte olup, buradaki fare, farede islevsel olan bir ADAM6 genini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, fare ADAMö proteinini kodlayan ektopik sekans mevcut insan VH gen bölümlerinin sonda kalan en fazla 3' VH gen segmenti ve Mevcut insan VH gen segmentlerinin nihai 3, VH gen segmenti arasina yerlestirilmistir. Spesifik bir düzenlemede fare, tüm ya da hemen hemen bütün fare VH gen segmentlerinin bir delesyonunu ve tüm ya da hemen hemen tüm insan VH gen segmentlerinin bir replasmanini içermektedir ve fare ADAM6 proteinini kodlayan ektopik nükleotit sekansi, insan gen segmenti VH1-2inin akis asagi yönünde ve insan gen segmenti VH6-1iin akis yukari yönünde yerlestirilmistir. Spesifik bir düzenlemede fare, bir ya da birden fazla insan VH gen segmentini kodlayan bir nükleotit sekansiyla birlikte tüm ya da hemen hemen tüm endojen VH gen segmentlerinin bir replasmanini içermektedir, ve fare ADAMB proteinini kodlayan ektopik nükleotit sekansi, bir ya da birden fazla insan VH gen segmentini kodlayan nükleotit sekansinin içerisinde yer almaktadir. Bir endojen immünoglobulin agir zincir Iokusunun bir modifikasyonunu içeren bir fare tarif edilmekte olup, burada fare, bir agir zincir sabit bölge gen sekansina islevsel olarak bagli yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin sekansi içeren bir B hücresini ekspres etmektedir ve B hücresi, genomunda (örnegin, bir B hücresi kromozomu üzerinde), erkek bir farede fonksiyonel olan ADAM6 ya da ortologu ya da homologu ya da onun fragmanini kodlayan bir gen barindirmaktadir. Yeniden düzenlenmis immünoglobulin sekansi agir zincir sabit bölgesine islevsel olarak baglanmis olabilir; gen sekansi bir insan agir zinciri V, D ve /veya J sekansini; bir fare agir zinciri V, D ve / veya J sekansini; bir insan ya da fare hafif zinciri V ve / veya J sekansini içermektedir. Bir düzenlemede agir zincir sabit bölgesi gen sekansi, bir CH1, bir mentese, bir CH2, bir CH3 ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilen bir insan ya da bir fare agir zincir sekansini içermektedir. Bulusun bir yönünde saglanan fare bir fonksiyonel olarak susturulmus endojen immünoglobulin agir zincir degisken gen lokusu içermekte olup, burada farede ADAM6 fonksiyonu korunmaktadir ve ayrica bir ya da birden fazla fare agir zincir sabit bölgesinin akis yukari yönünde ya da 5! yönünde bir ya da birden fazla insan immünoglobulin gen segmentinin bir insersiyonunu içermektedir. Bir ya da birden fazla insan immünoglobulin gen segmenti, bir ya da daha fazla insan VH gen segmenti, bir ya da daha fazla insan DH gen segmenti ve bir ya da daha fazla insan JH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede fare ayrica fonksiyonel olarak susturulmus bir endojen hafif zincir Iokusu içermekte olup, burada fare, vahsi tip bir fareyle ayni ya da karsilastirilabilir olan bir ADAM6 aktivitesi içermektedir ve ayrica bir fare hafif zincir sabit bölgesinin yukari ya da 5' yönünde bir ya da daha fazla insan A hafif zincir gen segmentinin insersiyonunu içermektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir gen segmentleri 12 insan V A gen segmentini ve bir ya da daha fazla insan J A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir gen segmentleri 12 insan V A gen segmentini ve dört insan J A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir gen segmentleri 28 insan V A gen segmentini ve bir ya da daha fazla insan J A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir gen segmentleri 28 insan V A gen segmentini ve dört insan J A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir gen segmentleri 40 insan V A gen segmentini ve bir ya da daha fazla insan J A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir gen segmentleri 40 insan V )\ gen segmentini ve dört insan J A gen segmentini içermektedir. Çesitli düzenlemelerde, dört insan J A gen segmenti J A1, J A2, J A3 ve J A7'yi içermektedir. Fare hafif zincir sabit bölgesi bir fare CK'dir. Bulusun bir yönünde genetik olarak modifiye edilmis fare saglanmakta olup söz konusu fare fonksiyonel olarak susturulmus bir immünoglobulin hafif zincir geni ve ayrica bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin agir zincir degisken bölge gen segmentinin bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir degisken bölge gen segmenti ile degistirilmesini içermektedir. ki burada fare fonksiyonel bir endojen ADAM6 lokusu içermemektedir, ve burada fare, bir erkek farede islevsel olan bir fare ADAM6 proteinini ya da ortologunu ya da homologunu ya da onun fragmanini ekspres eden ektopik bir nükleotid sekansi içermektedir. Bulusun bir yönünde, saglanan fare, islevsel bir endojen fare ADAM6 Iokusu ya da sekansindan yoksundur ve bir fare ADAM6 lokusunu kodlayan bir ektopik nükleotit sekansini ya da bir fare ADAM6 Iokusunun ya da sekansinin fonksiyonel fragmanini içermekte olup, buradaki fare, ektopik ADAM6 lokusunu ya da sekansini içeren bir neslin üretilmesi için karsi cinsten bir fareyle çiftlesme yetenegine sahiptir. Bir düzenlemede, fare erkektir. Bir düzenlemede, fare disidir. Bulusunun bir görüsünde, saglanmis olan genetigi degistirilmis fare, endojen bir fare immünoglobulin agir zincir degisken bölge gen lokusundaki bir insan immünoglobülin agir zincir degisken bölge gen segmentini içermektedir, fare, endojen fare immünoglobülin agir zincir degisken bölge gen lokusunda bir endojen fonksiyonel ADAM6 sekansindan yoksundur ve burada fare, bir erkek farede islevsel olan bir fare ADAM6 proteinini ya da ortologunu ya da homologunu ya da onun fragmanini ekspres eden ektopik bir nükleotid dizisi içermektedir. Bir düzenlemede, fare ADAM6 proteinini ekspres eden ektopik nükleotit sekansi, bir agir zincir immünoglobülin lokusu olan fare genomunda bir ya da daha fazla lokusta entegre edilmektedir. Burada modifiye edilmis bir endojen fare immünoglobülin agir zincir lokusundan bir immünoglobulin agir zincir sekansini ekspres eden bir fare tarif edilmekte olup, buradaki agir zincir, bir insan V gen segmentinden, bir D gen segmentinden ve bir J gen segmentinden elde edilmektedir, buradaki fare, farede islevsel olan bir ADAM6 aktivitesini içermektedir. Bir düzenlemede fare, çok sayida insan V gen segmenti, çok sayida insan D gen segmenti ve çok sayida insan J gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica bir insanlastirilmis agir zincir sabit bölge sekansi içermekte olup, burada insanlastirma, bir CH1, mentese, CH2, CH3 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir sekansin degistirilmesini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede agir zincir bir insan V gen segmenti, bir insan D gen segmenti, bir insan J gen segmenti, bir insan CH1 sekansi, bir insan ya da fare mentese sekansi, bir fare CH2 sekansi ve bir fare CH3 sekansindan elde edilmektedir. Bir diger spesifik düzenlemede, fare ayrica bir insan hafif zincir sabit sekansi da içermektedir. Bir düzenlemede fare, endojen immünoglobulin agir zincir gen segmentleri tarafindan ' ve 3, yönlerinde çevrelenen bir ADAM6 genini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, endojen immünoglobülin agir zincir gen segmentleri bir antikorun agir zincirini kodlama kapasitesine sahip degildir. Bir düzenlemede V geni segmenti, farede fonksiyonel olan bir ADAM6 aktivitesini kodlayan bir sekans tarafindan 5' yönünde (V gen segmentinin transkripsiyon yönüne göre) çevrelenmektedir. Bir düzenlemede V geni segmenti, farede fonksiyonel olan bir ADAM6 aktivitesini kodlayan bir sekans tarafindan 3' yönünde (V gen segmentinin transkripsiyon yönüne göre) çevrelenmektedir. Bir düzenlemede D geni segmenti, farede fonksiyonel olan bir ADAM6 aktivitesini kodlayan bir sekans tarafindan 51 yönünde (D gen segmentinin transkripsiyon yönüne göre) çevrelenmektedir. Bir düzenlemede, farede islevsel olan ADAM6 aktivitesi modifiye edilmis endojen fare agir zincir immünoglobulin Iokusunun 5'-en D geni segmentinin 5, yönünde ve 3'-en V geni segmentinin 37 yönünde (V gen segmentinin transkripsiyon yönüne göre) yer alan bir nükleotid sekansinin ekspresyonu sonucu ortaya çikmaktadir. Bir düzenlemede, farede islevsel olan ADAM6 aktivitesi, modifiye edilmis endojen fare agir zincir immünoglobülin Iokusunda iki insan V geni segmenti arasinda bulunan bir nükleotid sekansinin ekspresyonunun sonucudur. Bir düzenlemede, iki insan V geni segmenti bir insan VH1-2 gen segmenti ve bir VH6-1 gen segmentidir. Nükleotit sekansi bir fare ADAMöb sekansi ya da onun fonksiyonel bir fragmani ve bir fare ADAMöa sekansi ya da onun fonksiyonel bir fragmani arasindan seçilen bir sekans içermektedir. Bir düzenlemede, iki insan V geni segmenti arasindaki nükleotit sekansi, insan V geni segmentlerine göre ters transkripsiyon oryantasyonunda yerlestirilmistir. Spesifik bir düzenlemede, nükleotid sekanslari ADAM6 genleri ve ADAM6a sekansi ve ardindan bir ADAM6b sekansinin transkripsiyon yönüne göre 5'den 3'e kadar kodlamaktadir Bir düzenlemede fare, insan V geni segmentleri VH1-2 ve VH6-1 arasinda bir insan ADAM6 psödojen sekansinin bir fare ADAM6 sekansi ya da onun fonksiyonel bir fragmani ile bir replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede, farede fonksiyonel olan ADAM6 aktivitesini kodlayan sekans bir fare ADAM6 sekansi ya da onun fonksiyonel bir fragmanidir. Bir endojen fare DFL16.1 gen segmenti (örnegin, modifiye edilmis endojen fare immünoglobülin agir zincir lokusu için bir fare heterozigosunda) ya da bir insan DH1- 1 gen segmenti içeren bir fare açiklanmaktadir. Fare tarafindan ekspres edilen immünoglobulin agir zincirin D geni segmenti bir endojen fare DFL16.1 gen segmenti ya da bir insan DH1-1 gen segmentinden elde edilebilir. Yeniden düzenlenmemis B hücre soyuna ait bir DNA tasiyan hücrede bir fare ADAMö'yi (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani) kodlayan bir nükleik asit sekansi içeren ancak yeniden düzenlenmis immünoglobulin lokuslarini içeren B hücresindeki ADAM6 (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani) faresini kodlayan nükleik asit sekansini içermeyen bir fare tarif edilmektedir. burada fare ADAMG'yi kodlayan nükleik asit sekansi (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani) genomda, bir fare ADAM6 geninin, vahsi tip bir farede göründügü bir konumdan farkli bir pozisyonda ortaya çikmaktadir. Fare ADAMG'yi (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani) kodlayan nükleik asit sekansi, yeniden düzenlenmis B hücresi soyundan olmayan DNA-tasiyan hücrelerin tamaminda ya da büyük ölçüde tamaminda mevcut olabilir; nükleik asit sekansi farenin germ hatti hücrelerinde mevcut olabilir ancak yeniden düzenlenmis B hücrelerinin bir kromozomunda olmaz. Yeniden düzenlenmis immünoglobülin lokuslarini içeren B hücreleri de dahil olmak üzere DNA tasiyan hücrelerin hepsinde ya da çogunda bir fare ADAM6'sini (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani) kodlayan bir nükleik asit sekansi içeren bir fare ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani tarif edilmekte olup, burada fare ADAMö'yi kodlayan nükleik asit sekansi (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani) genomda, bir fare ADAM6 geninin, vahsi tip bir farede göründügü bir konumdan farkli bir pozisyonda ortaya çikmaktadir. Fare ADAMöisini (ya da onun homologunu ya da ortologunu ya da fonksiyonel fragmanini) kodlayan nükleik asit sekansi yeniden düzenlenmis immünoglobulin Iokusu ile bitisik olan bir nükleik asit üzerinde olabilir. Yeniden düzenlenmis lokus ile bitisik olabilen nükleik asit bir kromozomdur. Kromozom vahsi- tipteki bir farede bulunan cinsten bir kromozomdur ve kromozom bir fare immünoglobulin Iokusunun bir modifikasyonunu içermektedir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup, burada fare, genomunda bir ADAMG sekansi ya da ortologu ya da homologu içeren bir B hücresi içermektedir. ADAM6 sekansi ya da ortologu ya da homologu bir immünoglobulin agir zincir lokusunda olabilir. ADAM6 sekansi ya da ortologu ya da homologu bir immünoglobulin Iokusu olmayan bir Iokusta olabilir. ADAM6 sekansi, heterolog bir promotör tarafindan harekete geçirilen bir transgen üzerinde yer alabilir. Heterolog promotör, bir immünoglobülin disi promotör olabilir. Bir ADAM6 proteinini ya da onun ortologunu ya da homologunu ekspres eden bir B hücresi tarif edilmektedir. Farenin B hücrelerinin % 90'i ya da daha fazlasi, farede islevsel olan bir ADAM6 proteinini ya da onun bir ortologunu ya da bir homologunu ya da bir fragmanini kodlayan bir gen içerebilir. Fare bir erkek fare olabilir. ADAM6 sekansi ya da onun ortologu ya da homologunu içeren bir birinci alel ve bir ikinci alel içeren bir B hücresi genomu tarif edilmektedir. B hücresi genomu, ADAM6 sekansi ya da onun ortologu ya da homologunu içeren bir birinci aleli içerebilir ancak bir ikinci aIeI içermez. Bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin agir zincir alelinde bir modifikasyon içeren bir fare tarif edilmekte olup, burada modifikasyon bir ya da birden fazla endojen ADAM6 alelini korumaktadir ve fare ayrica bir ya da daha fazla insan V A gen segmenti ve bir fare hafif zincir sabit bölgesinin yukarisindaki bir ya da daha fazla insan J A gen segmentinin bir insersiyonunu içermektedir. Fare hafif zincir sabit bölgesi bir fare CK'dir. Modifikasyon, en az bir agir zincir alelinden yeniden düzenlenmis endojen agir zincir gen segmentleri içeren ve en az bir endojen immünoglobulin agir zincir alelinde bulunan bir endojen ADAM6 alelini koruyan islevsel bir agir zinciri ekspres edemeyen fare ortaya çikarabilir. Fareler, endojen immünoglobulin agir zincir alellerinin en az birinden yeniden düzenlenmis endojen agir zincir gen segmentlerini içeren fonksiyonel bir agir zincirini ekspres etme kapasitesine sahip olmayabilir ve fareler endojen bir ADAM6 alelinden eksprese eder ve ADAM6 proteinini içerir. Fareler, iki endojen immünoglobülin agir zincir alelinden yeniden düzenlenmis endojen agir zincir gen segmentlerini içeren fonksiyonel bir agir zinciri ekspres etme kapasitesine sahip olmayabilir ve fareler bir ya da daha fazla endojen ADAM6 alelinden bir ADAM6 proteini ekspres edebilir. Fareler, her bir endojen agir zincir alelinden fonksiyonel bir agir zincir ekspres etme kapasitesine sahip olmayabilir ve fare bir fare immünoglobulin agir zincir sabit bölge daha fazla Mbp yukari yönünde (fare agir zincir Iokusunun transkripsiyon yönüne göre) içinde yer alan fonksiyonel bir ADAM6 aleli içermektedir. Fonksiyonel ADAM6 aleli endojen immünoglobulin agir zincir lokusundadir (örnegin, intergenik bir V-D bölgesinde, iki V gen segmenti arasinda, bir V ve D gen segmenti arasinda, bir D ve J gen segmenti arasinda, vb.). Spesifik bir düzenlemede, fonksiyonel ADAM6 aleli nihai fare V gen segmenti ve birinci fare D gen segmenti arasinda 90 ila 100 kb'lik bir intergenik sekans içinde bulunmaktadir. Bir ya da daha fazla endojen ADAM6 alelinde bir modifikasyon içeren bir fare tarif edilmektedir. Modifikasyon, fareyi, bir ya da daha fazla endojen ADAM6 alelinden en az birinden fonksiyonel bir ADAM6 proteinini ekspres edemez hale getirebilir. Fare, endojen ADAM6 alellerinin her birinden fonksiyonel bir ADAM6 proteinini ekspres etme kapasitesine sahip olmayabilir. Fareler, her bir endojen ADAM6 alelinden fonksiyonel bir ADAM6 proteinini ekspres etme kapasitesine sahip olmayabilir ve fareler bir ektopik ADAM6 sekansi içermektedir. Fareler, her bir endojen ADAM6 alelinden fonksiyonel bir ADAM6 proteini ekspres etme kapasitesine sahip olmayabilir ve fare bir fare immünoglobulin agir zincir sabit ya da daha fazla kb yukari yönünde (fare agir zincir Iokusunun transkripsiyon yönüne göre) içinde yer alan ektopik bir ADAM6 sekansi içermektedir. Ektopik ADAM6 sekansi endojen agir zincir Iokusunda yer alabilir (örnegin, intergenik bir V-D bölgesinde, iki V gen segmenti arasinda, bir V ve D gen segmenti arasinda, bir D ve J gen segmenti arasinda, vb.). ektopik ADAM6 sekansi nihai fare V gen segmenti ve birinci fare D gen segmenti arasinda 90 ila 100 kb'lik bir intergenik sekans içinde bulunabilir. Endojen 90 ila 100 kb intergenik V-D sekansi çikarilabilir ve ektopik ADAM6 sekansi nihai V ve birinci D geni segmentleri arasina yerlestirilmektedir. Kisir bir erkek fare tarif edilmekte olup, burada fare iki ya da daha fazla endojen ADAM6 alelinin bir delesyonunu içermektedir. Ayrica erkek kisirlik özelliginin bir tasiyicisi olan bir disi fare de tarif edilmekte olup, burada disi fare germ hattina fonksiyonel olmayan bir ADAM6 aleli ya da bir endojen ADAM6 alelinin bir nakavtini içermektedir. Bir antikorun agir bir zincirini kodlamak için yeniden düzenlenemeyen endojen bir immünoglobülin agir zincir V, D ya da J gen segmentini içeren bir fare tarif edilmekte olup, burada farenin B hücrelerinin çogunlugu bir fonksiyonel ADAM6 geni içermektedir. Farenin B hücrelerinin çogunlugu ayrica bir ya da daha fazla insan V A gen segmenti ve bir fare immünoglobulin hafif zincir sabit bölgesinin yukarisindaki bir ya da daha fazla insan J A gen segmenti içerebilir. Fare immünoglobulin hafif zincir Bir düzenlemede fare, bu, bir antikorun fonksiyonel bir agir zincirini kodlamak için yeniden düzenlenebilme kapasitesine sahip olmayan bozulmamis bir endojen immünoglobulin agir zincir V, D ve J gen segmentlerini içermektedir. Bir düzenlemede fare, en az bir ve en fazla 89 V gen segmenti, en az bir ve en fazla 13 D gen segmenti, en az bir ve en fazla dört J gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonunu içermekte olup; burada en az bir ve en fazla 89 V gen segmenti, en az bir ve en fazla 13 D gen segmenti, en az bir ve en fazla dört J gen segmenti bir antikorun bir agir zincir degisken bölgesini kodlamak için yeniden düzenleme yetenegine sahip degildir. Spesifik bir düzenlemede fare, bozulmamis endojen immünoglobülin agir zincir V, D ve J gen segmentleri içinde yer alan fonksiyonel bir ADAM6 geni içermektedir. Bir düzenlemede fare bir endojen ADAM6 lokusu içeren bir endojen agir zincir lokusunu içermekte olup, burada endojen agir zincir lokusu 89 V gen segmenti, 13 D gen segmenti ve dört J gen segmenti içermektedir, burada endojen agir zincir gen segmentleri, bir antikorun agir zincir degisken bölgesini kodlamak için yeniden düzenlenme kapasitesine sahip degildir ve ADAM6 lokusu, farede islevsel olan bir ADAM6 proteinini kodlamaktadir. Bir endojen immünoglobulin agir zincir V, D ve J gen segmenti içermeyen bir fare tarif edilmekte olup, burada farenin B hücrelerinin çogunlugu bir ADAM6 sekansi ya da onun ortologu ya da homologunu içermektedir. Farenin B hücrelerinin çogunlugu bir insan Iambda degisken alani ve bir endojen immünoglobulin hafif zincir sabit bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres edebilir. Bir düzenlemede fare, iki ya da daha fazla V gen segmenti, iki ya da daha fazla D gen segmenti, iki ya da daha fazla J gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilen endojen immünoglobulin agir zincir gen segmentlerinden yoksundur. Bir düzenlemede fare, en az bir ve en fazla 89 V gen segmenti, en az bir ve en fazla 13 D gen segmenti, en az bir ve en fazla dört J gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilen immünoglobulin agir zincir gen segmentlerinden yoksundur. Bir düzenlemede fare, endojen immünoglobulin agir zincir lokusunun yaklasik üç megabazini içeren kromozom 12*den bir genomik DNA fragmanindan yoksundur. Mevcut bulusun spesifik bir düzenlemesinde, fare tüm islevsel endojen agir zincir V, D ve J gen segmentlerinden yoksundur. Spesifik bir düzenlemede fare 89 VH gen segmenti, 13 DH gen segmenti ve dört JH gen segmentinden yoksundur. Farenin germ hattinda bir immünoglobulin agir zincir lokusunun bir modifikasyonunu içeren bir genoma sahip oldugu bir fare tarif edilmekte olup, burada immünoglobulin agir zincir lokusundaki modifikasyon bir ya da daha fazla fare immünoglobülin degisken bölge sekansinin bir ya da daha fazla insan immünoglobülin degisken bölge sekansi ile degistirilmesini içermektedir, ve burada fare, bir fare ADAM6 proteinini kodlayan bir nükleik asit sekansi içermektedir. DH ve JH sekanslari ve immünoglobulin agir zincir Iokusunun en az 3, en az 10, en az 20, en az 40, en az 60 ya da en az 80 VH sekansi insan immünoglobulin degisken bölge sekanslari ile degistirilebilir. Immünoglobulin agir zincir Iokusunun DH, JH ve tüm VH sekanslari insan immünoglobulin degisken bölge sekanslari ile degistirilebilir. Insan immünoglobulin degisken bölge sekanslari yeniden düzenlenmemis olabilir. Insan immünoglobulin degisken bölge sekanslari tam yeniden düzenlenmemis DH ve JH bölgelerini ve insan olan en az 3, en az 10, en az 20, en az 40, en az 60 ya da en az 80 yeniden düzenlenmemis VH sekansini içerebilir. Tercih edilen baska bir düzenlemede, fare disi immünoglobulin degisken bölge sekanslari tüm VH, DH ve JH bölgelerini içeren komple insan degisken bölgesini içermektedir. En az bir insan degisken alan / insan disi sabit alan immünoglobulin polipeptidi içeren bir antikoru ekspres eden bir fare tarif edilmekte olup, buradaki fare, bir immünoglobülin lokusundan baska bir Iokustan bir fare ADAM6 proteinini ya da ortologunu ya da homologunu ekspres etmektedir. ADAM6 proteini ya da onun ortologu ya da homologu farenin bir B hücresinde ekspres edilebilir olup, burada 8 hücresi bir insan degisken sekansi ve bir insan olmayan sabit sekans içeren yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin sekansi içermektedir. Bir düzenlemede insan disi sabit sekansi bir kemirgen sekansidir. Bir düzenlemede kemirgen bir fare, bir siçan ve bir hamster arasindan seçilmektedir. Infertil bir erkek fare yapmak için bir yöntem tarif edilmekte olup söz konusu yöntem bir donör ES hücresinin 20 endojen ADAM6 alelinin islevsiz hale getirilmesini (ya da bahsedilen alelinin nakavtini), donör ES hücresinin bir konak embriyoya sokulmasini, tasiyici bir annenin konak embriyoya hamile kalmasini ve tasiyici annenin, donör ES hücresinden tamamen ya da kismen türetilmis soylari dogurmasina izin verilmesini içermektedir. Yöntem ayrica kisir bir erkek fare elde etmek için üreme soyunu içerebilir. Ilgilenilen bir genetik modifikasyona sahip olan bir fare yapmak için bir yöntem tarif edilmekte olup, buradaki fare kisirdir ve yöntem su adimlari içermektedir: (a) bir genomda ilgilenilen genetik bir modifikasyonun yapilmasi; (b) bir endojen ADAM6 alelini nakavt etmek ya da endojen bir ADAM6 alelini islevsiz hale getirmek için genomun modifiye edilmesi; ve, (c) genomun bir fare yapiminda kullanilmasi. Genom bir ES hücresinden olabilir ya da bir nükleer transfer deneyinde kullanilabilir. Burada tarif edildigi gibi bir hedefleme vektörü, nükleotit yapisi ya da hücre kullanilarak yapilan bir fare tarif edilmektedir. Burada tarif edildigi gibi bir farenin vahsi tip bir fare olan ya da genetigi modifiye edilmis olan ikinci birfare ile çiftlestirilmesinden elde edilen soy tarif edilmektedir. Bir fare susunu korumak için bir yöntem tarif edilmekte olup, burada fare susu, bir fare immünoglobülin agir zincir sekansinin insan immünoglobulin agir zincir sekanslari olan bir ya da daha fazla heterolog immünoglobulin agir zincir sekansi ile degistirilmesini içermektedir. Bir düzenlemede, fare susu bir ya da daha fazla fare VH, DH ve / veya `JH gen segmentinin bir delesyonunu içermektedir. Fare ayrica bir ya da birden fazla insan VH gen segmenti, bir ya da birden fazla insan DH gen segmenti, ve / veya bir ya da birden fazla insan JH gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede fare, en az 3, en insan DH gen segmenti ve en az alti JH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir insan VH segmenti içermektedir, en az 27 insan DH gen segmenti ve en az alti JH gen segmenti sabit bir bölge genine islevsel olarak baglidir. Bir düzenlemede sabit bölge geni bir fare sabit bölgesi genidir. Bir düzenlemede sabit bölge geni bir CH1, bir mentese, bir CH2, bir CH3 ve / veya bir CH4 ya da bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilen bir fare sabit bölge gen sekansi içermektedir. Fare immünoglobulin agir zincir sekansinin degistirilmesi için bir erkek fare heterozigozunun üretilmesi ve heterozigoz erkek fareyi, insan agir zincir sekansi için homozigos ya da heterozigoz olan bir vahsi tip disi fare ya da disi bir fare ile çiftlestirmeyi içeren bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem insan agir zincir sekansi için heterozigot erkekleri vahsi tipte ya da insan agir zincir sekansi için homozigoz ya da heterozigoz olan disilerle tekrar tekrar çiftlestirmek suretiyle susun korunmasini içerebilir. Yöntem insan agir zincir sekansi için homozigos ya da heterozigoz olan erkek ya da disi farelerden hücrelerin elde edilmesini, ve hücrelerin donör hücreler ya da bunlarin çekirdek donörleri olarak kullanilmasi ve konak hücreleri ve / veya tasiyici annelerde hücrelerin ve / veya çekirdeklerin tutulmasi yoluyla genetik olarak modifiye edilmis hayvanlar elde etmek için hücrelerin ya da çekirdeklerin kullanilmasini içerebilir. Bir düzenlemede fare ayrica Endojen bir immünoglobulin hafif zincir Iokusundaki A ve / veya K hafif zincir degisken sekanslarinin heterolog immünoglobulin hafif zincir sekanslari ile degistirilmesini içermektedir. Heterolog immünoglobulin hafif zincir sekanslari insan immünoglobulin A hafif zincir degisken sekanslaridir ve ayrica K hafif zincir degisken sekanslarini da içerebilir. Bir yukari akis homoloji kolu ve bir asagi akis homoloji kolu içeren bir nükleik asit yapisi olup, burada yukari akis homoloji kolu, bir insan immünoglobülin agir zincir degisken bölge sekansiyla ayni ya da büyük ölçüde ayni bir sekans içermektedir, akis asagi homoloji kolu, bir insan ya da fare immünoglobülin degisken bölge sekansiyla ayni ya da büyük ölçüde ayni bir sekans içermektedir ve bir fare ADAM6 proteinini kodlayan bir nükleotit sekansi içeren bir sekans yukari ve asagi homoloji kollarinin arasina yerlestirilmistir. Fare ADAM6 genini kodlayabilen sekans, fare ADAMö'nin vahsi tip bir fareyle baglandigi bir fare promotörü ile islevsel olarak baglantilidir. Bir hedefleme vektörü tarif edilmekte olup söz konusu vektör sunlari içermektedir: (a) bir insan degisken bölge gen segmenti nükleotit sekansi ile özdes ya da büyük oranda özdes olan bir nükleotit sekansi; ve (b) bir farede fonksiyonel olan bir fare ADAMG'yi ya da ortologunu ya da homologunu ya da fragmanini kodlayan bir nükleotit sekansi. Hedefleme vektörü ayrica fare ADAMö'yi kodlayan sekansa islevsel olarak bagli bir promotör içerebilir. Spesifik bir düzenlemede promotör bir fare ADAM6 promotörüdür. Bir fare immünoglobulin agir zincir degisken Iokusunu modifiye etmek için bir nükleotit yapisi tarif edilmekte olup, burada yapi en az bir bölgeye özgü rekombinan tanima sitesi ve bir farede islevsel olan bir ADAM6 proteinini ya da onun ortologunu ya da homologunu ya da fragmanini kodlayan bir sekans içermektedir. Bulusun bir yönünde, burada tarif edildigi gibi genetik modifikasyonlar içeren ES hücreleri, pluripotent hücreler ve indüklenmis pluripotent hücreler dahil ancak bunlarla sinirli olmamak üzere fare hücreleri ve fare embriyolari saglanmaktadir. XX olan hücreler ve XY olan hücreler saglanmaktadir. Burada tarif edildigi gibi bir modifikasyon içeren bir çekirdegi içeren hücreler, örnegin pronükleer enjeksiyonla bir hücreye uygulanan bir modifikasyona sahip olan hücreler de saglanmaktadir. Viral olarak yerlestirilmis bir ADAM6 geni içeren hücreler, embriyolar ve fareler de ayrica tarif edilmektedir, örnegin farede islevsel olan bir ADAM6 geni içeren bir transdüksiyon yapisi içeren hücreler, embriyolar ve fareler de ayrica tarif edilmektedir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare hücresi tarif edilmekte olup, burada hücre, islevsel bir endojen fare ADAM6 Iokusundan yoksundur ve hücre, bir fare ADAM6 proteinini ya da bunun fonksiyonel parçasini kodlayan ektopik bir nükleotit sekansi içermektedir. Hücre ayrica bir endojen immünoglobulin agir zincir degisken gen sekansinin bir modifikasyonunu içerebilir. Endojen immünoglobulin agir zincir degisken gen sekansinin modifikasyonu bir fare VH gen segmentinin silinmesi, bir fare DH gen segmentinin silinmesi, bir fare JH gen segmentinin silinmesi ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilen bir delesyonu içerebilir. Spesifik bir düzenlemede, fare bir ya da birden fazla fare immünoglobulin VH, DH ve / veya JH sekansinin bir insan immünoglobulin sekansi ile degistirilmesini içermektedir. Insan immünoglobulin sekansi bir insan VH, bir insan VL, bir insan DH, bir insan JH, bir insan JL ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilebilir. Bir düzenlemede hücre, bir totipotent hücre, bir pluripotent hücre ya da indüklenmis bir pluripotent hücredir. Spesifik bir düzenlemede, hücre bir fare ES hücresidir. Bulusun bir yönünde bir fare B hücresi saglanmakta olup, burada B hücresi saglanan fareden izole edilmistir, burada fare B hücresi yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin agir zincir geni içermektedir, burada B hücresi, B hücresinin bir kromozomu üzerinde, bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6 proteinini ya da onun ortologunu ya da homologunu ya da fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi içermektedir. Bir düzenlemede fare B hücresi nükleik asit sekansinin iki alelini içermektedir. Bir düzenlemede, nükleik asit sekansi, yeniden düzenlenmis fare immünoglobulin agir zincir Iokusu ile bitisik olan bir nükleik asit molekülü (örnegin bir B hücresi kromozomu) üzerinde yer almaktadir. Bir düzenlemede, fare B hücresi, bir fare ya da insan immünoglobulin sabit bölge genine islevsel olarak baglanmis bir yeniden düzenlenmis fare disi immünoglobulin degisken geni içermekte olup, burada B hücresi, bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAMG proteinini ya da onun ortologunu ya da homologunu ya da fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi içermektedir. Bulusun bir yönünde bir somatik fare hücresi saglanmakta olup, burada hücre saglanmis olan fareden izole edilmistir, hücre modifiye edilmis bir immünoglobulin agir zincir lokusu ve bir erkek farede fonksiyonel olan bir fare ADAMö'yi ya da ortologunu ya da homologunu ya da fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi içeren bir kromozom içermektedir. Nükleik asit sekansi modifiye edilmis immünoglobulin agir zincir Iokusu ile ayni kromozom üzerinde yer almaktadir. Bir düzenlemede somatik hücre nükleik asit sekansinin tek bir kopyasini içermektedir. Bir düzenlemede somatik hücre nükleik asit sekansinin en az iki kopyasini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede somatik hücre bir B hücresidir. Spesifik bir düzenlemede hücre bir germ hücresidir. Spesifik bir düzenlemede hücre bir kök hücredir. Bulusun bir yönünde bir fare germ hücresi saglanmakta olup, burada hücre saglanmis olan fareden izole edilmistir, hücre, germ hücresinin bir kromozomu üzerinde bir fare ADAM6'sini (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmanini) kodlayan bir nükleik asit sekansi içermektedir, burada fare ADAM6'yi kodlayan nükleik asit sekansi (ya da onun homologu ya da ortologu ya da fonksiyonel fragmani) kromozom üzerinde, vahsi tip bir fare germ hücresinin bir kromozomundaki bir pozisyonundan farkli bir pozisyondadir. Nükleik asit sekansi, bir fare agir zincir immünoglobulin lokusunda yer almaktadir. Bir düzenlemede, fare immünoglobulin lokusu en az bir fare immünoglobulin sekansinin en az bir insan immünoglobulin sekansi ile degistirilmesini içermektedir. Bulusun bir yönünde, burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir pluripotent, indüklenmis pluripotent ya da totipotent hücre saglanmaktadir. Spesifik bir düzenlemede, hücre, bir fare embriyonik kök (ES) hücresidir. Bulusun bir yönünde, burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir hücre ya da doku saglanmaktadir. Bir düzenlemede hücre ya da doku, burada tarif edildigi gibi bir farenin dalak, lenf dügümü ya da kemik iliginden elde edilmektedir. Bir düzenlemede hücre bir B hücresidir. Bir düzenlemede hücre bir embriyonik kök hücresidir. Bir düzenlemede hücre bir germ hücresidir. Bir düzenlemede doku bag, kas, sinir ve epitel dokusu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, doku üreme dokusudur. Bir düzenlemede, burada tarif edildigi gibi bir fareden elde edilen hücre ve / veya doku bir ya da birden fazla ex vivo analizde kullanilmak üzere izole edilmektedir. Çesitli düzenlemelerde, bir ya da birden fazla ex vivo analiz fiziksel, termal, elektriksel, mekanik ya da optik özelliklerin ölçümü, cerrahi prosedür, farkli doku tiplerinin etkilesimlerinin ölçümü, görüntüleme tekniklerinin gelistirilmesi ya da bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Bulusun bir yönünde, bir antikor üretmek için burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir hücre ya da dokunun kullanimi saglanmaktadir. Bulusun bir yönünde, bir hibridom ya da kuadrom üretmek için burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir hücre ya da dokunun kullanimi saglanmaktadir. Bulusun bir yönünde, bir farenin bir kromozomunu ya da onun fragmanini içeren bir fare hücresi tarif edilmektedir. Bir düzenlemede fare hücresi burada tarif edildigi gibi bir farenin çekirdegini içermektedir. Bir düzenlemede fare hücresi nükleer aktarimin bir sonucu olarak kromozomu ya da onun fragmanini içermektedir. Burada tarif edildigi gibi bir fareden elde edilen bir çekirdek tarif edilmektedir. Çekirdek, B hücresi olmayan bir diploid hücreden olabilir. Tarif edildigi gibi bir farede yapilan bir immünoglobulin degisken bölgeyi kodlayan bir nükleotit sekansi tarif edilmektedir. Burada tarif edildigi gibi bir farede yapilan bir antikorun bir immünoglobulin agir zincir ya da immünoglobulin hafif zincir degisken bölge amino asit sekansi tarif edilmektedir. Burada tarif edildigi gibi bir farede yapilan bir antikorun bir degisken bölgesini kodlayan bir immünoglobulin agir zincir ya da immünoglobulin hafif zincir degisken bölge nükleotit sekansi tarif edilmektedir. Burada tarif edildigi gibi bir farede yapilan bir antikor ya da onun antijen-baglayici fragmani (örnegin, Fab, F(ab)2, scFv) tarif edilmektedir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare yapmak için bir yöntem tarif edilmekte olup, söz konusu yöntem farenin endojen bir ADAM6 Iokusunun yukarisinda (immünoglobulin agir zincir gen segmentlerinin transkripsiyonu ile ilgili olarak) bir ya da daha fazla immünoglobulin agir zincir gen segmentinin bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir gen segmenti ile degistirilmesini ve farenin ADAM6 transkripsiyonu ile ilgili olarak) bir ya da daha fazla immünoglobulin gen segmentinin bir ya da daha fazla insan immünoglobülin agir zincir ya da hafif zincir gen segmenti ile degistirilmesini içermektedir. Farenin endojen bir ADAM6 lokusunun yukarisinda bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin gen segmentinin yerini alan bir ya da birden fazla insan immünoglobulin gen segmenti V gen segmentlerini içerebilir. Farenin endojen bir ADAM6 lokusunun yukarisinda bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin gen segmentinin yerini alan insan immünoglobulin gen segmenti V ve D gen segmentlerini içerebilir. Bir ya da daha fazla insan immünoglobulin gen segmenti, J gen segmentlerini içeren farenin endojen bir ADAM6 Iokusunun asagi akis yönünde bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin gen segmentinin yerini alabilir. Bir ya da daha fazla insan immünoglobulin gen segmenti, D ve J gen segmentlerini içeren farenin endojen bir ADAM6 Iokusunun asagi akis yönünde bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin gen segmentinin yerini alabilir. Bir ya da daha fazla insan immünoglobulin gen segmenti, V, D ve J gen segmentlerini içeren farenin endojen bir ADAM6 lokusunun asagi akis yönünde bir ya da daha fazla endojen immünoglobulin gen segmentinin yerini alabilir. ADAM6 geninin akis yukari ve / veya akis asagi yönünde yer alan bir ya da daha fazla immünoglobulin agir zincir gen segmenti genetigi degistirilmis bir progenitör hücre olusturmak üzere bir pluripotent, indüklenmis pluripotent ya da totipotent hücrede degistirilebilir; genetik olarak modifiye edilmis progenitör hücre bir konaga yerlestirilmektedir; ve genetik olarak modifiye edilmis progenitör hücreyi içeren konak, genetik olarak modifiye edilmis progenitör hücreden elde edilen bir genomu içeren bir fare olusturmak üzere gebe birakilmaktadir. Bir düzenlemede konak bir embriyodur. Konak bir fare ön-morula (örnegin, 8- ya da 4 hücreli asama), bir tetraploid embriyo, embriyonik hücrelerin bir agregasi ya da bir blastosist arasindan seçilebilir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare yapmak için bir yöntem tarif edilmekte olup, söz konusu yöntem bir fare immünoglobulin gen segmenti ve bir fare ADAM6 (ya da bir erkek farede fonksiyonel olan ortolog ya da homolog ya da bunun fragmani) nükleotit sekansi içeren bir fare nükleotit sekansinin bir birinci kimerik lokus olusturmak için bir insan immünoglobulin gen segmentini içeren bir sekans ile degistirilmesini ve ardindan bir fare ADAMörsi (ya da bir ortologu ya da homolog ya da fonksiyonel fragmanini kodlayan sekans) kodlayan sekans içeren bir sekansin ikinci bir kimerik Iokus olusturmak için insan immünoglobulin gen segmentini içeren sekansa sokulmasini içermektedir. Ikinci kimerik lokus, bir insan immünoglobulin agir zincir degisken (VH) gen segmenti içerebilir. Ikinci kimerik Iokus, bir insan immünoglobulin hafif zincir degisken (VL) gen segmenti içerebilir. Spesifik bir düzenlemede, ikinci kimerik Iokus bir insan VH gen segmenti ya da bir insan DH gen segmentine ve bir insan JH gen segmentine islevsel olarak bagli bir insan VL gen segmenti içermektedir. Ikinci kimerik lokus, bir fare CH2 + CH3 sekansiyla birlestirilmis bir insan CH1 sekansi ya da bir insan CH1 ve insan mentese sekansi içeren üçüncü bir kimerik Iokusa islevsel olarak baglanabilmektedir. Ureyebilen bir erkek fare yapmak için bir fare ADAM6 Iokusu ya da sekansi içeren bir ektopik nükleotit sekansi içeren bir farenin kullanimi tarif edilmekte olup, burada kullanim, fare ADAM6 Iokusu ya da sekansini içeren ektopik nükleotid sekansini içeren farenin islevsel bir endojen fare ADAM6 lokusu ya da sekansindan yoksun bir fareyle çiftlestirilmesini ve ektopik ADAM6 Iokusu ya da sekansina sahip olan yavru üretme yetenegine sahip olan disi ya da ektopik ADAM6 lokusu ya da sekansini içeren bir erkek bir yavrunun elde edilmesini içermektedir ki burada erkek, vahsi tip erkek bir farenin sergiledigi fertilite ile yaklasik olarak ayni bir fertilite sergilemektedir. Bulusun bir yönünde, bir immünoglobulin degisken bölge nükleotit sekansi yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmaktadir. Bulusun bir yönünde, tamamen insan Fab ya da tamamen insan F(ab)2 yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmaktadir. Burada, ölümsüz bir hücre dizisi yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi tarif edilmektedir. Burada, bir hibridom ya da kuadrom yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi tarif edilmektedir. Insan agir zincir degisken bölgelerini ve insan hafif zincir degisken bölgelerini içeren bir faj kütüphanesi yapmak Için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi tarif edilmektedir. Bulusun bir yönünde, bir insan antikorunu yapmak için degisken bir bölge sekansi üretmek üzere burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmakta olup, sunlari içermektedir: (a) bir farenin burada tarif edildigi gibi ilgilenilen bir antijenle immünize edilmesi, (b) (a)'nin immünize edilmis faresinden bir lenfositin izole edilmesi, (c) lenfositin bir ya da daha fazla etiketlenmis antikora maruz birakilmasi, (d) ilgilenilen antijene baglanabilen bir lenfositin tanimlanmasi ve (e) bir ya da daha fazla degisken bölge nükleik asit sekansinin Ienfositten çogaltilmasi ve bu sekilde degisken bir bölge sekansinin üretilmesi. Bir düzenlemede, lenfosit bir farenin dalagindan elde edilmektedir. Bir düzenlemede, lenfosit bir farenin lenf dügümünden elde edilmektedir. Bir düzenlemede, lenfosit bir farenin kemik iliginden elde edilmektedir. Bir düzenlemede etiketlenmis antikor bir florofor konjuge antikordur. Bir düzenlemede, bir ya da birden fazla florofor konjuge antikorlar bir IgM, bir IgG ve / veya bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Bir düzenlemede lenfosit bir B hücresidir. Bir düzenlemede, bir ya da birden fazla degisken bölge nükleik asit sekansi bir agir zincir degisken bölge sekansi içermektedir. Bir düzenlemede, bir ya da birden fazla degisken bölge nükleik asit sekansi bir hafif zincir degisken bölge sekansi içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, hafif zincir degisken bölge sekansi bir immünoglobulin K hafif zincir degisken bölge sekansidir. Bir düzenlemede, bir ya da birden fazla degisken bölge nükleik asit sekansi bir agir zincir ve bir K hafif zincir degisken bölge sekansi içermektedir. Bir düzenlemede, bir insan antikorunu yapmak için bir agir ve bir K hafif zincir degisken bölge sekansi üretmek üzere burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmakta olup, sunlari içermektedir: (a) bir farenin burada tarif edildigi gibi ilgilenilen bir antijenle immünize edilmesi, (b) (a)'nin immünize edilmis faresinden dalagin izole edilmesi, (c) dalaktan elde edilen B lenfositlerinin bir ya da daha fazla etiketlenmis antikora maruz birakilmasi, (d) ilgilenilen antijene baglanabilen (c)'nin bir B Ienfositinin tanimlanmasi ve (e) B lenfositinden bir agir zincir degisken bölge nükleik asit sekansi ve bir K hafif zincir degisken bölge nükleik asit sekansinin çogaltilmasi, bu sayede agir zincir ve K hafif zincir degisken bölge sekanslarinin üretilmesi. Bir düzenlemede, bir insan antikorunu yapmak için bir agir ve bir K hafif zincir degisken bölge sekansi üretmek üzere burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmakta olup, sunlari içermektedir: (a) bir farenin burada tarif edildigi gibi ilgilenilen bir antijenle immünize edilmesi, (b) (a)'nin immünize edilmis faresinden bir ya da birden fazla lenf dügümünün izole edilmesi, (O) bir ya da birden fazla lenf dügümünden elde edilen B lenfositlerinin bir ya da daha fazla etiketlenmis antikora maruz birakilmasi, (d) ilgilenilen antijene baglanabilen (c)'nin bir B Ienfositinin tanimlanmasi ve (9) B lenfositinden bir agir zincir degisken bölge nükleik asit sekansi ve bir K hafif zincir degisken bölge nükleik asit sekansinin çogaltilmasi, bu sayede agir zincir ve K hafif zincir degisken bölge sekanslarinin üretilmesi. Bir düzenlemede, bir insan antikorunu yapmak için bir agir ve bir K hafif zincir degisken bölge sekansi üretmek üzere burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmakta olup, sunlari içermektedir: (a) bir farenin burada tarif edildigi gibi ilgilenilen bir antijenle immünize edilmesi, (b) (a)'nin immünize edilmis faresinden kemik iliginin izole edilmesi, (c) kemik iliginden elde edilen B lenfositlerinin bir ya da daha fazla etiketlenmis antikora maruz birakilmasi, (d) ilgilenilen antijene baglanabilen (c)'nin bir B Ienfositinin tanimlanmasi ve (e) B lenfositinden bir agir zincir degisken bölge nükleik asit sekansi ve bir K hafif zincir degisken bölge nükleik asit sekansinin çogaltilmasi, bu sayede agir zincir ve K hafif zincir degisken bölge sekanslarinin üretilmesi. Çesitli düzenlemelerde bir ya da birden fazla etiketlenmis antikor bir IgM, bir IgG ve / veya bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde, bir insan antikorunu yapmak için bir agir ve K hafif zincir degisken bölge sekansi üretmek üzere burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmakta olup, ayrica çogaltilmis agir ve hafif zincir degisken bölge sekanslarinin insan agir ve hafif zincir sabit bölge sekanslarina birlestirilmesini, bir hücrede, kaynasmis agir ve hafif zincir sekanslarinin ekspres edilmesini ve ekspres edilen agir ve hafif zincir sekanslarinin geri kazanilmasi ve böylece bir insan antikorunun üretilmesini içermektedir. Çesitli düzenlemelerde, insan agir zincir sabit bölgeleri IgM, IgD, IgA, lgE ve IgG arasindan seçilmektedir. Çesitli spesifik düzenlemelerde IgG, bir lgG1, bir IgGZ, bir lgGS ve bir IgG4 arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde, insan agir zincir sabit bölgesi bir CH1, bir mentese, bir CH2, bir CH3, bir CH4 ya da bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Çesitli düzenlemelerde, hafif zincir sabit bölgesi bir immünoglobulin K sabit bölgesidir. Çesitli düzenlemelerde hücre, bir Hela hücresi, bir DU145 hücresi, bir anap hücresi, bir MCP-7 hücresi, bir MDA-MB-438 hücresi, bir PCS hücresi, bir T47D hücresi, bir THP-1 hücresi, bir U87 hücresi, bir SHSY5Y (insan nöroblastomu) hücresi, bir Saos-2 hücresi, bir Vero hücresi, bir CHO hücresi, bir GH3 hücresi, bir PC12 hücresi, bir insan retinal hücresi (örnegin, bir PER.CB TM hücresi) ve bir MC3T3 hücresi arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede hücre bir CHO hücresidir. Bulusun bir yönünde, ilgilenilen bir antijene karsi spesifik bir ters kimerik kemirgen- insan antikoru üretmek için bir yöntem saglanmis olup söz konusu yöntem burada tarif edildigi gibi bir farenin antijen ile immünize edilmesi, antijene karsi spesifik bir ters kimerik fare-insan antikoru üreten fareden en az bir hücrenin izole edilmesi, antijene karsi spesifik ters-kimerik fare-insan antikorunu üreten en az bir hücrenin kültürlenmesi ve sözü edilen antikorun elde edilmesi adimlarini içermektedir. Bir düzenlemede, ters kimerik fare-insan antikoru, ters kimerik fare-insan antikoru, bir fare ya da siçan agir zincir sabit geni ile kaynasmis bir insan agir zincir degisken bölgesi ve bir fare ya da siçan ya da insan hafif zincir sabit geni ile kaynasmis bir insan hafif zincir degisken bölgesi içermektedir. Bir düzenlemede, antijene karsi spesifik ters kimerik kemirgen-insan antikorunu üreten en az bir hücrenin kültürü fareden izole en az bir hücreden üretilen en az bir hibridom hücresinde gerçeklestirilmektedir. Bulusun bir yönünde, ilgilenilen bir antijene karsi spesifik bir tamamen insan antikoru üretmek için bir yöntem saglanmis olup, söz konusu yöntem su adimlari içermektedir: bir farenin burada tarif edildigi gibi antijenle immünize edilmesi, antijene karsi spesifik bir ters-kimerik kemirgen-insan antikoru üreten fareden en az bir hücrenin izole edilmesi, antijene karsi spesifik olan ters-kimerik kemirgen-insan antikorundan türetilmis tam bir insan antikoru üreten en az bir hücre üretilmesi, ve tamamen insan antikorunu üreten en az bir hücrenin kültürlenmesi ve sözü edilen tamamen insan antikorun elde edilmesi. Çesitli düzenlemelerde, antijene karsi spesifik ters kimerik bir kemirgen-insan antikoru üreten fareden izole edilen en az bir hücre bir splenosit ya da B hücresidir. Çesitli düzenlemelerde, antikor bir monoklonal antikordur. Çesitli düzenlemelerde ilgilenilen antijen ile immünizasyon, protein, DNA, bir DNA ve protein kombinasyonu ya da antijeni ekspres eden hücreler ile gerçeklestirilmektedir. Bulusun bir yönünde, bir immünoglobulin degisken bölgesini ya da bunun bir fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmistir. Bir düzenlemede, nükleik asit sekansi bir insan antikoru ya da onun antijen-baglayici fragmanini yapmak için kullanilmaktadir. Bir düzenlemede fare, bir antikor, Çoklu spesifik bir antikor (örnegin bi-spesifik bir antikor), bir scFv, bir bi spesifik scFv, bir diabody, bir triabody, bir tetrabody, bir V- NAR, bir VHH, bir VL, bir F (ab), bir F (ab) 2, bir DVD (yani, çift degiskenli alan antijen baglama proteini), bir SVD (yani, tek degiskenli alan antijeni baglayici protein) ya da bir bispesifik T-hücresi birlestiricisi (BiTE) arasindan seçilen bir antijen baglayici protein yapmak üzere kullanilmaktadir. Islevsel bir endojen fare ADAMG sekansindan yoksun bir fareye bir ektopik ADAMG sekansi sokmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi tarif edilmekte olup burada kullanim burada tarif edildigi gibi farenin islevsel endojen fare ADAMG sekansindan yoksun olan bir fare ile çiftlestirilmesini içermektedir. Ektopik bir ADAM6 sekansina sahip bir fare yapmak için, burada tarif edildigi gibi bir fareden genetik materyalin kullanilmasi tarif edilmektedir. Kullanim, burada tarif edildigi gibi bir farenin bir hücresinin çekirdegini kullanan bir nükleer transferi içerebilir. Kullanim, hücreden elde edilen bir hayvanin üretilmesi için burada tarif edildigi gibi bir farenin bir hücresinin klonlanmasini içerebilir. Kullanim, ektopik ADAMG sekansini içeren bir farenin yapilmasi için bir islemde bir farenin bir sperm ya da yumurtasinin kullanilmasini içerebilir. Modifiye edilmis bir immünoglobulin agir zincir lokusu içeren üreyebilen bir erkek fare yapmak için bir yöntem tarif edilmekte olup söz konusu yöntem sunlari içermektedir: bir endojen immünoglobülin agir zincir Iokusunun bir modifikasyonunu içeren bir birinci fare germ hücresinin bir erkek farede fonksiyonel olan bir ADAM6 geni ya da ortologu ya da bunun homologu ya da fragmanini içeren ikinci bir fare germ hücresi ile döllenmesi; döllenmis bir yumurtanin olusturulmasi; döllenmis yumurtanin bir embriyoya dönüsmesine izin verilmesi; ve bir fare elde etmek için bir tasiyici içinde embriyonun gelismesi. Döllenme, bir erkek fare ile disi bir farenin çiftlesmesiyle gerçeklestirilebilir. Disi fare ADAM6 genini ya da onun ortologunu ya da homologunu ya da bir fragmanini içerebilir. Erkek fare ADAM6 genini ya da onun ortologunu ya da homologunu ya da bir fragmanini içerebilir. Bir immünoglobülin agir zincir lokusunun bir modifikasyonunu içeren bir genomu olan bir farenin fertilitesini eski haline getirmek ya da arttirmak için bir fare ADAM6 proteini ya da bunun bir ortologu ya da homologunu ya da karsilik gelen ADAM6 proteininin fonksiyonel bir fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansinin kullanimi tarif edilmekte olup, burada modifikasyon, endojen ADAM6 fonksiyonunu azaltir ya da ortadan kaldirir. Nükleik asit sekansi, bir agir zincir lokusu olan endojen bir immünoglobülin lokusunda fare genomuna entegre edilmektedir. Burada, bir ilacin (örnegin, bir antijen baglayici protein) üretimi için ya da bir ilacin degisken bir sekansini kodlayan bir sekansin üretilmesi için (örnegin bir antijen baglayici protein), bir insan hastaliginin ya da bozuklugunun tedavisi için, burada tarif edildigi gibi birfarenin kullanimi tarif edilmektedir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare hücresi tarif edilmekte olup, burada hücre, yeniden düzenlenmis endojen immünoglobülin agir zincir gen segmentlerini içeren bir agir zinciri ekspres etme kapasitesine sahip degildir, ve hücre, bir fare ADAM6 proteinini ya da onun fonksiyonel fragmanini kodlayan fonksiyonel bir ADAM6 genini içermektedir. Hücre ayrica, insan immünoglobulin gen segmentlerinin bir insersiyonunu içerebilir. Insan immünoglobülin gen segmentleri yeniden düzenleme üzerine bir insan degisken bölgesi içeren bir antikorun fonksiyonel bir agir zincirini kodlayacak sekilde fare agir zincir sabit bölgelerine islevsel olarak bagli olan agir zincir gen segmentleri olabilirler. Genetik olarak fareler, embriyolar, hücreler, dokular, ayrica fareleri degistirmek için nükleik asit yapilari, ve bunlari yapmak ve kullanmak için yöntemler ve kompozisyonlar tarif edilmektedir. Ayrica bir kappa (K) hafif zincir baglaminda lambda (A) degisken bölgeleri (insan ya da insan disi) üreten fareler ve hücreler tarif edilmekte olup, burada fareler ve hücreler, bir ADAM6 proteininin ya da bunun homologunun ya da ortologunun aktivitesini ortadan kaldiran ya da azaltan bir agir zincir immünoglobulin lokusunun bir modifikasyonunu içermektedir, burada fareler ayrica tamamen ya da kismen ADAM6 aktivitesini (ya da bunun homologunun ya da ortologunun aktivitesini) geri kazandiran genetik bir modifikasyon içermektedir. Ayrica fertile olan ve bir insan agir zincir degisken bölgesi ile soydas olan bir insan A degisken alanini ekspres eden fareler tarif edilmekte olup, burada insan A degisken alani, bir fare K sabit bölgesi ile bitisik olan farede ekspres edilmektedir ve çesitli düzenlemelerde, K sabit bölgesi bir endojen (fare) sabit bölgedir. Ayrica, bir fare hafif zinciri baglaminda, örnegin, bir endojen fare hafif zincir Iokusundan insan A degisken bölgelerini üreten fareler ve hücreler tarif edilmektedir. Ayrica, lambda degisken bölgelerini içeren antikorlari yapma yöntemleri de tarif edilmektedir. Köktes lambda degisken bölgeleri ile ekspres eden agir zincirleri seçme yöntemleri de ayrica tarif edilmektedir. Bir insan V A'sindan türetilmis degisken bir alan içeren hafif zincirlere sahip antikorlar ve bir fare hafif zincir sabit alanina kaynasik bir insan J A gen segmenti içeren somatik mutasyona ugramis degisken bölgeler içeren kimerik ve insan antijen baglayici proteinler (örnegin antikorlar) ve onlari kodlayan nükleik asitler tarif edilmektedir. Bir K sabit bölgesi içeren bir hafif zincir üzerindeki bir insan A degisken bölge sekansini ekspres eden bir fare tarif edilmektedir. Bir endojen fare hafif zincir fare tarif edilmektedir. Bir fare sabit sekansina bagli bir insan A degisken sekansi içeren yeniden düzenlenmis bir hafif zincir genini içeren bir fare tarif edilmektedir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup, burada fare bir yeniden düzenlenmemis insan )\ hafif zincir degisken gen segmenti (hV A) ve bir insan A birlestirici gen segmenti (hJ A) içermektedir. Yeniden düzenlenmemis hV A ve hJ A bir fare K hafif zincir lokusundadir. Fare, yeniden düzenlenmemis bir hV A sekansi ve bir hJ A sekansi ve bir fare hafif zincir sabit bölgesi (CK) nükleik asit dizisinden türetilen bir hafif zincir içeren bir immünoglobulin yapma kapasitesine sahip olabilir. Genetik olarak modifiye edilmis farelerin yapilmasi ve kullanilmasi için yöntemler ve kompozisyonlar da tarif edilmektedir. (a) Bir fare agir zincir sabit bölgesine kaynasmis bir insan agir zincir degisken bölgesi (hVH) ve (b) bir fare CK bölgesine kaynasik bir insan VL'si içeren antikorlar tarif edilmekte olup burada degisken alanlarin biri ya da daha fazlasi, örnegin, bulusun bir faresinde antikor ya da immün hücre seçimi sirasinda somatik olarak mutasyona ugratilmaktadir. Yeniden düzenlenmemis hV A ve yeniden düzenlenmemis hJ A bir fare K sabit bölgesi (CK) ile islevsel olarak baglanmistir. Germ hattinda, bir endojen fare K hafif zincir lokusunda, bir insan A hafif zincir degisken bölge sekansi içeren bir fare tarif edilmekte olup, burada insan Iambda degisken bölge sekansi, bir fare immünoglobulin hafif zincir sabit bölge gen sekansi içeren bir hafif zincir içerisinde ekspres edilmektedir. Bir düzenlemede fare, endojen fare hafif zincir lokusunda bir endojen hafif zincir degisken sekansindan yoksundur. Bir düzenlemede, tüm ya da büyük ölçüde bütün endojen fare hafif zincir degisken bölge gen segmentleri bir ya da daha fazla insan A degisken bölge gen segmenti ile degistirilmektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir degisken bölge sekansi bir insan J A sekansi içermektedir. Bir düzenlemede, insan J A , sekansi, J /\1, J A2, J A3, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilmektedir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir degisken bölge sekansi insan hafif zincir lokusunun A kümesinin bir fragmanini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, insan A hafif zincir lokusunun A kümesinin fragmani hV A3-27 ila hV A3-1 arasinda uzanmaktadir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir degisken bölge sekansi insan hafif zincir lokusunun B kümesinin bir fragmanini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, insan A hafif zincir lokusunun B kümesinin fragmani hV A5-52 ila hV M-40 arasinda uzanmaktadir. Bir düzenlemede, insan A hafif zincir degisken bölge sekansi A kümesinin genomik bir fragmanini ve B kümesinin genomik bir fragmanini içermektedir. Bir düzenlemede, insan )\ hafif zincir degisken bölge sekansi A kümesinin en az bir gen segmentini ve B kümesinin en az bir gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, farenin naif repertuarinin hafif zincirinin % 10'dan fazlasi 2-8, 2-23, 1-40, 5-45 ve 9-49 arasindan seçilen gen segmentleri olan en az iki hV AJdan elde edilmektedir. Bir düzenlemede, farenin naif repertuarinin hafif zincirinin % 20'den hV A'dan elde edilmektedir. Bir düzenlemede, farenin naif repertuarinin hafif zincirinin olan en az dört hV A'dan elde edilmektedir. Bir fare K sabit bölgesi ile kaynasmis bir insan A degisken sekansini içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres eden bir fare tarif edilmekte olup, burada fare yaklasik 1:1ilik bir K kullanimi / A kullanimi orani sergilemektedir. immünoglobulin hafif zinciri, endojen bir fare hafif zincir lokusundan ekspres edilmistir. Bir A hafif zincir degisken bölge sekansi (V A) ve bir fare K hafif zincir sabit bölge sekansi ile bitisik en az bir J sekansi (J) içeren bir fare tarif edilmektedir. Fare, fonksiyonel bir fare VK ve / veya fare JK gen segmentine sahip olmayabilir. V A bir insan V A (hV A)'dir ve J bir insan J Ndir (hJ A). hV A ve hJ i\ yeniden düzenlenmemis gen segmentleridir. Bir düzenlemede fare, çok sayida yeniden düzenlenmemis insan hV A gen segmenti ve en az bir insan hJ A gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, çok sayida yeniden düzenlenmemis hV A gen segmentleri en az 12 gen segmenti, en az 28 gen segmenti ya da en az 40 gen segmentidir. Bir düzenlemede, en az bir hJ A gen segmenti, J A1, J A2, J A3, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilmektedir. Bir düzenlemede, endojen bir fare A hafif zincir lokusu tamamen ya da kismen silinmektedir. Fare K hafif zincir sabit bölgesi dizisi endojen bir fare K hafif zincir Iokusundadir. Bir düzenlemede, farenin B hücrelerinin yaklasik % 10 ila yaklasik % 45ii, bir insan A hafif zincir degisken (V A) alani ve bir fare K hafif zincir sabit (CK) alani Içeren bir hafif zincir içeren bir antikoru ekspres etmektedir. yeniden düzenlenmis bir hV A / M A sekansindan türetilmektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica bir insan K hafif zincir lokusundan bir insan VK-JK intergenik bölgesini içermekte olup, burada insan VK-JK intergenik bölgesi V A sekansi ve J sekansi ile bitisiktir. Spesifik bir düzenlemede, insan VK-JK intergenik bölgesi V A sekansi ve J sekansinin arasina yerlestirilmistir. Asagidaki içeren bir fare tarif edilmektedir: (a) bir endojen fare hafif zincir lokusunda en az 12 ila en az 40 yeniden düzenlenmemis insan )\ hafif zincir degisken bölge gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti; (b) en az 12 ila en az 40 insan hafif zincir degisken bölge gen segmenti ile en az bir insan J A sekansi arasina yerlestirilmis bir insan VK-JK intergenik sekansi; burada fare bir insan V A bölgesi ve bir fare CK bölgesi içeren bir hafif zincir içeren bir antikoru ekspres etmektedir. Burada bir A degisken sekansi ve bir fare K sabit sekansi içeren bir hafif zincir içeren bir antikoru ekspres eden bir fare tarif edilmektedir. Bir düzenlemede fare yaklasik 1:1!lik bir K kullanimi / A kullanimi orani sergilemektedir. Bir düzenlemede farenin kemik iliginden elde edilen olgunlasmamis B hücresi popülasyonu yaklasik 1:1'lik bir K kullanimi / A kullanimi orani sergilemektedir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup, burada fare, bir fare CK geni içeren bir fare K hafif zincir lokusuna islevsel olarak bagli olan yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin V )\ ve bir J A bir gen segmenti içermektedir. V A ve J A gen segmentleri insan gen segmentleridir. Endojen fare hafif zincir lokusu, bir K hafif zincir Iokusudur. Yeniden düzenlenmemis V )\ ve J A gen segmentleri, endojen bir fare K hafif zincir lokusundadir. Bir düzenlemede, fare ayrica bir ya da daha fazla agir zincir V, D ve / veya J gen segmentinin bir endojen fare agir zincir immünoglobülin lokusunda bir ya da daha fazla insan V, D ve /veya J gen segmenti ile bir replasman içermektedir. Bir düzenlemede fare, bir fare CK genini içeren bir endojen fare K hafif zincir lokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin V A ve bir J A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede fare ayrica yeniden düzenlenmemis bir Insan immünoglobülin A hafif zincir degisken gen segmenti (V A) ve bir fare C A geni içeren endojen bir fare A hafif zincir Iokusundaki bir 1\ birlestirme gen segmentini (J )\) içermektedir. Hafif zincir degisken gen Iokusu ("VL lokusu") en az bir insan V /\ (hV A) gen segmenti içermektedir. VL lokusu en az bir insan J A (hJ A) gen segmenti içermektedir. Bulusun bir diger düzenlemesinde, VL lokusu dört hJ /\ gen segmentine kadar segment içermektedir. Bir düzenlemede, VL Iokusu, insan A ve insan K genomik sekansini içeren bitisik bir sekans içermektedir. K hafif zincir degisken gen lokusu ("K lokusu") en az bir insan V A (hV A) gen segmenti içermektedir. K lokusu en az bir insan J A (hJ A) gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, K Iokusu dört hJ A gen segmentine kadar segment içermektedir. Bir düzenlemede K lokusu en az bir insan hV A ve en az bir insan hJ A içermektedir ve kismen ya da tamamen, fonksiyonel bir VK bölgesi gen segmentinden yoksundur ve kismen ya da tamamen, fonksiyonel bir JK bölgesi gen segmentinden yoksundur. Bir düzenlemede, fare fonksiyonel VK bölgesi gen segmenti Içermemektedir. Bir düzenlemede, fare fonksiyonel JK bölgesi gen segmenti içermemektedir. Bir düzenlemede, A hafif zincir degisken gen Iokusu (" A Iokusu") en az bir insan hV A gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, A lokusu en az bir insan J A (hJ A) gen segmenti içermektedir. Bulusun bir diger düzenlemesinde, i\ Iokusu dört hJ A gen segmentine kadar segment içermektedir. Bir düzenlemede, VL Iokusu çok sayida hV A içermektedir. Bir düzenlemede, bir insanda gözlenen V A kullaniminin yaklasik % 10, yaklasik % 20, yaklasik % 30, yaklasik % 90 ya da daha fazlasini yansitan A hafif zincir degisken bölge repertuarinin ekspresyonuyla sonuçlanacak sekilde çok sayida hV A seçilmektedir. bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, VL lokusu V A3-12 ila V A3-1 arasinda uzanan insan A hafif zincir lokusunun bitisik bir sekansini içermektedir. Bir düzenlemede, VL lokusu en az VL lokusu V A3-12 ila V A3-1 arasinda uzanan insan A Iokusunun bitisik bir sekansini içermektedir. Bir düzenlemede, VL lokusu endojen K Iokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL Iokusu endojen K lokusundadir ve endojen A hafif zincir lokusu kismen ya da tamamen silinmistir. Bir düzenlemede, VL Iokusu endojen K lokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL lokusu endojen A Iokusundadir ve endojen K Iokusu kismen ya da tamamen silinmistir. Bir düzenlemede, VL Iokusu 13 ila 28 ya da daha fazla hV )\ içermektedir. Spesifik bir içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, K Iokusu V A3-27 ila V A3-1 arasinda uzanan insan A Iokusunun bitisik bir sekansini içermektedir. Bir düzenlemede, VL lokusu endojen K lokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL Iokusu endojen K lokusundadir ve endojen A hafif zincir Iokusu kismen ya da tamamen silinmistir. Bir diger düzenlemede, VL lokusu endojen A lokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL lokusu endojen A Iokusundadir ve endojen K Iokusu kismen ya da tamamen silinmistir. Bir düzenlemede, VL Iokusu 29 ila 40 arasinda hJ A içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, K lokusu V A3-29 ila V A3-1 arasinda uzanan insan A Iokusunun bitisik bir sekansini ve V A5-52 ila V A 1-40 arasinda uzanan insan A Iokusunun bitisik bir sekansini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, genetigi degistirilmis farede hV A 1-40 ve hV A3-29 arasindaki bütün ya da büyük ölçüde bütün sekanslar esasen, hV A 1-40 gen segmentinin akis asagisindaki (3' çevrilmemis bölümün asagisinda) dogada bulunan (örnegin, insan popülasyonunda) yaklasik 959 bp'lik bir insan A sekansi, bir kisitlama enzim bölgesi (örnegin, PI-Scel), bunu takiben dogada bulunan hV A3-29 gen segmentinin yaklasik 3,431 bp yukari akisindaki bir insan A dizisinden olusmaktadir. Bir düzenlemede, VL Iokusu endojen fare K Iokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL Iokusu endojen fare K Iokusundadir ve endojen fare A hafif zincir lokusu kismen ya da tamamen silinmistir. Bir diger düzenlemede, VL Iokusu endojen fare A Iokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL Iokusu endojen fare A lokusundadir ve endojen fare K lokusu kismen ya da tamamen silinmistir. VL Iokusu en az bir hJ A içermektedir. Bir düzenlemede, VL lokusu çok sayida hJ A içermektedir. Bir düzenlemede, VL Iokusu en az 2, 3, 4, 5, 6 ya da 7 hJ A içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, VL lokusu dört hJ A içermektedir. Spesifik bir düzenlemede dört hJ A, hJ M, hJ A2, hJ A3 ve M A7*dir. Bir düzenlemede, VL Iokusu bir K lokusudur. Spesifik bir düzenlemede, VL lokusu endojen K lokusundadir ve endojen A hafif zincir Iokusu kismen ya da tamamen silinmistir. Bir düzenlemede, VL lokusu bir hJ A içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, o hJ A bir hJ )\1'dir. Bir düzenlemede, VL lokusu endojen K lokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL lokusu endojen K lokusundadir ve endojen A hafif zincir lokusu kismen ya da tamamen silinmistir. Bir diger düzenlemede, VL Iokusu endojen A lokusundadir. Spesifik bir düzenlemede, VL Iokusu endojen A lokusundadir ve endojen K lokusu kismen ya da tamamen silinmistir. VK Iokusu en az bir hV A, en az bir hJ A ve bir fare CK geni içermektedir. Bir düzenlemede fare, endojen fare VK gen segmentlerinin endojen fare K lokusunda bir ya da daha fazla hV A gen segmenti ile bir replasman içermekte olup, burada hV A gen segmentleri, fare insan V A geri segmentlerini yeniden düzenleyecek ve bir insan V A bölgesi ve bir fare CK içeren bir ters kimerik immünoglobülin hafif zinciri ekspres edecek sekilde insan V A gen segmentlerini yeniden düzenlemek üzere endojen bir fare CK bölgesi genine islevsel olarak baglidir. Bir düzenlemede, yeniden düzenlenmemis fare VK gen segmentlerinin % 90-100'ü, en az bir yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile degistirilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, endojen fare VK gen segmentlerinin tamami ya da büyük oranda tamami en az bir yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile degistirilmektedir. Bir düzenlemede, replasman en az 12, en az 28 ya da en az 40 yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir düzenlemede, replasman en az 7 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti, en az 16 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ya da en az 27 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir düzenlemede, fare tüm fare JK gen segmentlerinin en az bir yeniden düzenlenmemis hJ A gen segmenti ile replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede, en az bir yeniden düzenlenmemis hJ A gen segmenti, J A1, J A2, J A3, J A4, J A5, J A6, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, bir ya da daha 51, bir 5-52 hV A gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, en az bir yeniden düzenlenmemis hJ A gen segmenti, J A1, J A2, J A3, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica endojen fare A lokusunda endojen fare V A gen segmentlerinin endojen fare A lokusunda bir ya da daha fazla insan V A gen segmenti ile bir replasmanini içermekte olup, burada hV A gen segmentleri fare hV A gen segmentlerini yeniden düzenleyecek ve bir hV A bölgesi ve bir fare C A'si içeren bir ters kimerik immünoglobülin hafif zinciri ekspres edecek sekilde bir fare C A bölge genine islevsel olarak baglanmaktadir. Spesifik bir düzenlemede, fare C A geni C A2'dir. Spesifik bir düzenlemede, Fare C A geni en az % 60, en az % 70, en az % 80, en az % 90, en az °/o 95 ya da en az % 98 oraninda fare C A2 geni ile özdestir. Bir düzenlemede, yeniden düzenlenmemis fare V A gen segmentlerinin °/o 90-100'ü, en az bir yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile degistirilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, endojen fare V A gen segmentlerinin tamami ya da büyük oranda tamami en az bir yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile degistirilmektedir. Bir düzenlemede, replasman en az 12, en az 28 ya da en az 40 yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir düzenlemede, replasman en az 7 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti, en az 16 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ya da en az 27 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis hV A gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir düzenlemede, fare tüm fare J A gen segmentlerinin en az bir yeniden düzenlenmemis hJ A gen segmenti ile replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede, en az bir yeniden düzenlenmemis hJ A gen segmenti, J A1, J A2, J A3, J A4, J A5, J A6, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, bir ya 1-50, 1-51, bir \ gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, en az bir yeniden düzenlenmemis hJ A gen segmenti, J A1, J A2, J A3, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bulusun bir görüsünde, endojen bir fare K hafif zincir lokusunda bulunan bir insan VK-JK intergenik bölge sekansini içeren, genetik olarak modifiye edilmis bir fare saglanmaktadir. Bulusun bir düzenlemesinde, insan VK-JK intergenik bölge sekansi, bir hV A ve hJ A gen segmentini içeren bir farenin endojen bir K hafif zincir lokusundadir ve insan VK- JK intergenik bölge sekansi, hV A ve hJ A gen segmentleri arasina yerlestirilmistir. Spesifik bir düzenlemede, hV A ve h.] A gen segmentleri, farede fonksiyonel bir insan A hafif zincir degisken bölgesi olusturmak için yeniden birlesebilme kapasitesine sahiptir. Bir düzenlemede, çok sayida hV A ve bir ya da daha fazla hJ A içeren bir fare saglanmaktadir ve insan VK-JK intergenik bölge sekansi transkripsiyona göre proksimalin asagi akis yönünde ya da 3' en hV A sekansinin asagi akis yönünde ve birinci hJ A sekansinin yukari akis yönünde ya da 5' yönünde yerlestirilmistir. Bir düzenlemede, insan VK-JK intergenik bölgesi bir insan VK4-1 gen segmentinin yaklasik 130 bp akis asagi ya da 3* yönünde, insan VK4-1 gen segmentinin 3 JK1 gen segmentinin yaklasik 600 bp akis yukari ya da 5"ine kadar uzanan bir bölgedir. Spesifik bir düzenlemede, insan VK-JK intergenik bölgesi yaklasik olarak 22.8 kb boyutundadir. Bir düzenlemede, VK-JK intergenik bölgesi bir insan VK4-1 gen segmentinin 3* çevrilmemis bölgesinin sonundan bir insan JK1 gen segmentinin yaklasik 600 bp yukarisina kadar uzanan insan VK-JK intergenik bölgesi ile yaklasik daha fazla, % 94 ya da daha fazla ya da yaklasik % 95 ya da daha fazla özdestir. Bir düzenlemede, VK-JK intergenik bölgesi, SEKANS ID NO: 158ii içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, VK-JK intergenik bölgesi, SEKANS ID NO: 158'in fonksiyonel bir fragmanini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, VK-JK intergenik bölgesi, SEKANS ID NO: 158'dir. Intergenik bölge sekansinin ektopik oldugu insan disi bir hayvan, insan disi bir hücre (örn., bir ES hücresi ya da bir aplipipotent hücre) insan disi bir embriyo ya da belirtilen insan VK-.JK intergenik bölge sekansini içeren insan disi bir doku tarif edilmektedir. Ektopik sekans bir insanlastirilmis endojen insan disi immünoglobulin lokusuna yerlestirilmis olabilir. Insan disi hayvan bir faredir. Belirtilen insan VK-JK intergenik bölge sekansini içeren izole edilmis bir nükleik asit yapisi tarif edilmektedir. Nükleik asit yapisi, insan VK-JK intergenik bölge sekansini bir fare hafif zincir lokusuna hedeflemek için hedefleme kollari içerebilir. Fare hafif zincir lokusu bir K lokusu olabilir. Hedefleme kollari insan VK-JK intergenik bölgesini modifiye edilmis bir endojen fare K lokusuna hedefleyebilecek olup, burada hedefleme, bir hV A sekansi ve bir hJ A sekansi arasinda bir pozisyonadir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup, burada fare ikiden fazla hafif zincir aleli içermemektedir, ve burada hafif zincir aleli sunlari içermektedir: (a) bir fare CK genini içeren bir endojen fare K hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin insan V A ve J i\ gen segmenti; ve, (b) bir fare CL genini içeren bir endojen fare hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin insan VL ve JL gen segmenti. Bir baska düzenlemede, bir fare CL geni içeren endojen fare hafif zincir Iokusu bir A lokusudun En fazla iki hafif zincir aleli bir K aleli ve bir A aleli, iki K aleli ve iki A aleli arasindan seçilebilir. Spesifik bir düzenlemede, iki hafif zincir alelinden biri bir C A2 geni içeren bir A alelidir. Fare bir fonksiyonel immünoglobulin hafif zincir Iokusu ve bir islevsel olmayan hafif zincir Iokusu içerebilir, burada fonksiyonel hafif zincir Iokusu, bir fare CK genini içeren bir endojen fare K hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin insan V )\ ve J A gen segmentini içermektedir. Ayrica bir fonksiyonel immünoglobulin hafif zincir lokusu ve bir islevsel olmayan hafif zincir lokusu içeren bir fare açiklanmakta olup, burada fonksiyonel hafif zincir Iokusu, bir fare C )\ genini içeren bir endojen fare A hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin insan V A ve J )\ gen segmentini içermektedir. C A geni C A2 olabilir. Fare C A geni en az % 60, en az % 70, en az % 80, en az °/o 90, en az % 95 ya da en az % 98 oraninda fare C A2 geni ile özdes olabilir. Fare ayrica en az bir immünoglobulin agir zincir aleli içermektedir. Bir düzenlemede, en az bir immünoglobulin agir zincir aleli bir insan /fare agir zincirini ekspres eden bir insan agir zincir genini içeren bir endojen fare agir zincir lokusunda bir insan VH gen segmentini, bir insan DH gen segmentini ve bir insan JH gen segmentini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede fare iki immünoglobulin agir zincir aleli içermektedir ve fare bir insan /fare agir zincirini ekspres etmektedir. Bir düzenlemede fare, endojen bir CK geni içeren bir endojen fare K Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir hVK ve yeniden düzenlenmemis bir hJK içeren bir birinci hafif zincir aleli; ve endojen bir CK geni içeren endojen bir fare K Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir hV A ve yeniden düzenlenmemis bir hJ A içeren bir ikinci hafif zincir aleli içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, birinci ve ikinci hafif zincir alelleri genetik olarak modifiye edilmis farenin tek fonksiyonel hafif zincir alelleridir. Spesifik bir düzenlemede fare, fonksiyonel olmayan bir A lokusu içermektedir. Bir düzenlemede, genetik olarak modifiye edilmis fare bir A sabit bölgesi içeren bir hafif zincir ekspres etmemektedir. Bir düzenlemede fare, endojen bir CK geni içeren bir endojen fare K Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir hVK ve yeniden düzenlenmemis bir hJK içeren bir birinci hafif zincir aleli; ve endojen bir C )\ geni içeren endojen bir fare A lokusunda yeniden düzenlenmemis bir hV A ve yeniden düzenlenmemis bir hJ A içeren bir ikinci hafif zincir aleli içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, birinci ve ikinci hafif zincir alelleri genetik olarak modifiye edilmis farenin tek fonksiyonel hafif zincir alelleridir. Bir düzenlemede endojen C A geni C A2'dir. Spesifik bir düzenlemede, fare C A geni en oraninda fare C A2 ile özdestir. Bir düzenlemede fare alti immünoglobulin aleli içermekte olup, burada birinci alel, bir fare CK genini içeren bir endojen fare K hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin V A ve J A gen segmentini içermektedir, ikinci alel, bir fare CK genini içeren bir endojen fare K hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin VK ve JK gen segmentini içermektedir, üçüncü alel, bir fare C A genini içeren bir endojen fare A hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin V A ve J A gen segmentini içermektedir, d'ordüncü ve besinci alelin her biri birbirinden bagimsiz olarak, bir fare agir zincir genini içeren bir endojen fare agir zincir Iokusunda bir yeniden düzenlenmemis VH ve DH ve JH gen segmentini içermektedir, ve altinci alel, (a) bir fare C A genini içeren bir endojen fare A hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin V A ve J A gen segmentini, (b) islevsel olmayan bir A Iokusunu ya da (0) A Iokusunun tamaminda ya da bir kismindaki bir delesyonunu içermektedir. Bir düzenlemede, birinci alel, yeniden düzenlenmemis bir hV A ve hJ A içermektedir. Bir düzenlemede, ikinci alel, yeniden düzenlenmemis bir hVK ve hJK içermektedir. Bir düzenlemede, üçüncü alel, yeniden düzenlenmemis bir hV A ve hJ A içermektedir. Bir düzenlemede, dördüncü ve besinci alelin her biri bagimsiz olarak bir yeniden düzenlenmemis hVH ve hDH ve hJH içermektedir. Bir düzenlemede, altinci alel, tamamen ya da kismen silinmis bir endojen fare A Iokusu içermektedir. Bir düzenlemede fare alti immünoglobulin aleli içermekte olup, burada birinci alel, bir fare C A genini içeren bir endojen fare A hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin V A ve J A gen segmentini içermektedir, ikinci alel, bir fare C A genini içeren bir endojen fare A hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin V A ve J A gen segmentini içermektedir, üçüncü alel, bir fare CK genini içeren bir endojen fare K hafif zincir Iokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin VK ve JK gen segmentini içermektedir, dördüncü ve besinci alelin her biri birbirinden bagimsiz olarak, bir fare agir zincir genini içeren bir endojen fare agir zincir lokusunda bir yeniden düzenlenmemis VH ve DH ve JH gen segmentini içermektedir, ve altinci alel, (a) bir fare CK genini içeren bir endojen fare K hafif zincir lokusunda yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin VK ve JK gen segmentini, (b) islevsel olmayan bir K Iokusunu ya da (0) K Iokusunun bir ya da daha fazla elemaninin bir delesyonunu içermektedir. Bir düzenlemede, birinci alel, yeniden düzenlenmemis bir hV A ve M A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, ikinci alel, yeniden düzenlenmemis bir hV A ve hJ A gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, üçüncü alel, yeniden düzenlenmemis bir hVK ve hJK gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede, dördüncü ve besinci alelin her biri bagimsiz olarak bir yeniden düzenlenmemis hVH ve hDH ve hJH gen segmentlerini içermektedir. Bir düzenlemede, altinci alel, fonksiyonel olarak susturulmus bir endojen fare K lokusu içermektedir. Bir düzenlemede, genetik olarak modifiye edilmis fare, bir fare CL alanina islevsel olarak baglanmis yeniden düzenlenmis bir hV A bölgesi içeren yeniden düzenlenmis bir antikor geni içeren bir B hücresi içermektedir. Bir düzenlemede kemirgen CL alani, bir fare CK ve bir fare C A bölgesi arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, fare CA alani C A2 geninden elde edilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, fare C A bölgesi, en az % 60, en az % 70, en az °/o 80, en az °/o 90, en az % 95 ya da en az % 98 oraninda fare C A2 ile özdes olan C A bölgesinden elde edilmistir. Bir V /\ bölgesini bir CK olan bir CL üzerinde ekspres eden genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmektedir. Bir hV A bölgesini, bir insan CK, bir insan C A ya da bir fare CK arasindan seçilmis bir CL üzerinde ekspres eden genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmektedir. Bir hV A bölgesini, bir fare CK*si üzerinde ekspres eden genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmektedir. Bir düzenlemede, farenin Splenositlerinin yaklasik % 10-50'si B hücreleridir (yani CD19-pozitif) ya da bunlarin yaklasik % 9-28'i bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede, farenin splenositlerinin yaklasik % 23-34'ü B hücreleridir (yani CD19-pozitif) ya da bunlarin yaklasik % 9-11'i bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede, farenin splenositlerinin yaklasik % 19-31'i B hücreleridir (yani CD19-pozitif) ya da bunlarin yaklasik % 9-17isi bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede, farenin splenositlerinin yaklasik % 21-384 B hücreleridir (yani CD19-pozitif) ya da bunlarin yaklasik % 24-27'si bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede, farenin splenositlerinin yaklasik % 10-14'ü B hücreleridir (yani CD19-pozitif) ya da bunlarin yaklasik % 9-13'ü bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede, farenin splenositlerinin yaklasik % 31-481i B hücreleridir (yani CD19-pozitif) ya da bunlarin yaklasik % 15-21'i bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede, farenin splenositlerinin yaklasik % 30-384 B hücreleridir (yani CD19-pozitif), bunlarin yaklasik % 33-48'i bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Bir düzenlemede, farenin kemik iliginin yaklasik % 52-70'i B hücreleridir (yani CD19- pozitif) ya da bunlarin olgunlasmamis B hücrelerinin yaklasik % 31-47'si (yani, CD19- pozitif / B220-ara pozitif / IgM-pozitif) bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Bir düzenlemede, farenin kemik iliginin yaklasik % 60'i B hücreleridir (yani CD19- pozitif) ya da bunlarin olgunlasmamis B hücrelerinin yaklasik % 38.3'ü (yani, CD19- pozitif / BZZO-ara pozitif / IgM-pozitif) bir fare CK bölgesine kaynasik bir hV A bölgesi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Bir düzenlemede fare, bir insan V ve bir insan J gen segmenti ve bir fare sabit bölge geninden türetilmis bir sabit alandan elde edilmis bir degisken bölgeyi içeren bir hafif zincir içeren bir antikoru ekspres etmektedir. Bir düzenlemede, fare sabit bölgesi bir CK genidir. Bir baska düzenlemede, fare sabit bölge geni bir C A genidir. Spesifik bir düzenlemede, C A bölgesi C A2'dir. Spesifik bir düzenlemede, fare C A geni en az % C A2 ile özdes olan bir C A geninden elde edilmektedir. Spesifik bir düzenlemede antikor ayrica bir insan V, bir insan D ve bir insan J gen segmentinden türetilmis bir degisken alan ve bir fare agir zincir sabit bölge geninden türetilmis bir agir zincir sabit alani içeren bir agir zincir içermektedir. Bir düzenlemede, fare agir zincir sabit bölgesi geni, bir agir zincir sabit alaninin bir mentese-CHZ-CHS sekansini içermektedir. Bir diger düzenlemede, fare agir zincir sabit bölgesi geni, bir agir zincir sabit alaninin bir CH1-mentese-CH2-CH3 sekansini içermektedir. Bir diger düzenlemede, fare agir zincir sabit bölgesi geni, bir agir zincir sabit alaninin bir CH1-CH2-CH3-CH4 sekansini içermektedir. Bir diger düzenlemede, fare agir zincir sabit bölgesi geni, bir agir zincir sabit alaninin bir CH2-CH3-CH4 sekansini içermektedir. Bir düzenlemede fare, yeniden düzenlenmis bir insan V A-J A sekansi ve bir fare CK sekansi içeren bir hafif zincir içeren bir antikoru ekspres etmektedir. Bir düzenlemede arasindan seçilen hV A gen segmentlerinin yeniden düzenlenmesinden elde edilmektedir. Bir düzenlemede yeniden düzenlenmis insan V A-J A sekansi J A1, J A2, J A3, ve bir J A7 gen segmenti arasindan seçilen hJ A gen segmentlerinin yeniden düzenlenmesinden elde edilmektedir. sekansini içeren yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin A hafif zincir degisken bölgesini içeren bir hafif zinciri içeren bir antikoru ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede B hücresi, bir fare agir zincir sabit alani ile kaynasmis bir insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi ve bir fare K hafif zincir sabit alani ile kaynasmis bir insan immünoglobulin A hafif zincir degisken bölgesi içeren bir antikoru ekspres etmektedir. Asagidakileri içeren bir antikoru ekspres eden bir fare tarif edilmektedir: (a) yeniden düzenlenmemis bir insan agir zincir degisken bölge gen segmentinden türetilmis bir agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir, burada agir zincir degisken bölgesi, bir fare agir zincir sabit (CH) bölgesine kaynasmistir; ve, (b) yeniden düzenlenmemis bir hV A ve bir hJ A'dan türetilmis bir hafif zincir degisken bölgesi içeren bir hafif zincir, ki burada hafif zincir degisken bölgesi bir fare CL bölgesine kaynasiktir. Bir düzenlemede, fare sunlari içermektedir: (i) bütün ya da büyük oranda bütün islevsel endojen fare V, D ve J gen segmentlerinin bütün ya da büyük oranda bütün fonksiyonel insan V, D ve J gen segmentleri, bir fare CH geni ile degistirilmesini içeren bir agir zincir lokusu, (ii) bütün ya da büyük oranda bütün islevsel endojen fare VK ve JK gen segmentlerinin bütün, büyük oranda bütün ya da çogunluk sayida fonksiyonel hV A ve hJ A gen segmenti ve bir fare cl geni ile degistirilmesini içeren bir birinci K hafif zincir lokusu, (iii) bütün ya da büyük oranda bütün islevsel endojen fare VK ve JK gen segmentlerinin bütün, büyük oranda bütün ya da çogunluk sayida fonksiyonel hVK ve hJK gen segmenti ve bir fare CK geni ile degistirilmesini içeren bir ikinci K hafif zincir Iokusu. Bir düzenlemede, fare bir C A bölgesini içeren bir antikoru ekspres etmemektedir. Bir düzenlemede fare, bir C A geninin ve / veya bir V A ve / veya bir J A gen segmentinin bir delesyonunu içermektedir. Bir düzenlemede fare, fonksiyonel olmayan bir A hafif zincir Iokusu içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, A hafif zincir Iokusu tamamen ya da kismen silinmektedir. Bir düzenlemede, fare sunlari içermektedir: (i) bütün ya da büyük oranda bütün islevsel endojen fare V, D ve J gen segmentlerinin bütün ya da büyük oranda bütün fonksiyonel insan V, D ve J gen segmentleri, bir fare CH geni ile degistirilmesini içeren bir agir zincir lokusu, (ii) bütün ya da büyük oranda bütün islevsel endojen fare V A ve J A gen segmentlerinin bütün, büyük oranda bütün ya da çogunluk sayida fonksiyonel hV A ve hJ A gen segmenti ve bir fare C A geni ile degistirilmesini içeren bir birinci A hafif zincir lokusu, (ii) bütün ya da büyük oranda bütün islevsel endojen fare V A ve J A gen segmentlerinin bütün, büyük oranda bütün ya da çogunluk sayida fonksiyonel hV A ve hJ A gen segmenti ve bir fare C A geni ile degistirilmesini içeren bir ikinci A hafif zincir lokusu, Spesifik bir düzenlemede, fare C A geni C A2'dir. Spesifik bir düzenlemede, fare C A geni en az % 60, en az % 70, en az % 80, en az geninden elde edilmektedir. Bir düzenlemede fare, bir CK geninin ve / veya bir VK ve / veya bir JK gen segmentinin bir delesyonunu içermektedir. Bir düzenlemede fare, fonksiyonel olmayan bir K hafif zincir Iokusu içermektedir. Bir antikoru ekspres eden genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup, burada fare tarafindan üretilen toplam IgG antikorunun % 10'dan fazlasi, % 15'den fazlasi, % 20'den fazlasi, % 25'den fazlasi, °/o 30'dan fazlasi, % 35'den fazlasi, % fazlasi bir A türevli degisken alan içermektedir, ve burada fare, bir fare CK bölgesi ile kaynasmis bir K-türevli degisken alan içeren antikorlari ekspres etmektedir. Fare 40'i ya da % 35-40'i bir A türevli degisken alan içerebilir. A'dan türetilmis degisken alan bir hV )\ ve bir hJ A'dan türetilmistir. A türevli degisken alan, bir fare CK bölgesi içeren bir hafif zincirdedir. Bir düzenlemede, K-türevli degisken alan bir hVK ve bir hJK'den türetilmistir ve spesifik bir düzenlemede, bir fare CK bölgesi içeren bir hafif zincirde yer almaktadir. Bir yukari akis homoloji kolu ve bir asagi akis homoloji kolu içeren izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup, burada yukari akis ve asagi akis homoloji kollari, yapiyi bir fare K lokusuna hedeflemektedir ve yapi, islevsel bir yeniden düzenlenmemis hV A segmenti ve islevsel bir yeniden düzenlenmemis hJ A segmenti ve bir seçim ya da markör sekansi içermektedir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup sunlari içermektedir: transkripsiyon yönüne göre 5, yönünden 3' yönüne dogru, fare V A2'nin yukari yönünde bir fare A sekansini hedeflemek için bir hedefleme kolu, rekombinaz tanima alanlarina sahip 5< ve 3' ile çevrili bir seçim kaseti, ve fare V A2'nin bir fare A sekansini 3' hedeflemek için bir hedefleme kolu. Bir düzenlemede seçim kaseti bir Frt'ed Hyg-TK kasetidir. 3! hedefleme kolu, fare C A2, J A4, C A4 ve fare arttirici 2.4 içerebilir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup söz konusu yapi, transkripsiyon yönüne göre 5 'den 3' e kadar, V A 1'e göre farenin A Iokus 5' (i hedeflemek için bir hedefleme kolu, rekombinaz tanima alanlarina sahip 5' ve 3' ile çevrili bir seçim kaseti ve fare C A17e göre fare A sekansi 3' <ü hedeflemek için 3' hedefleme kolunu içermektedir. Seçim kaseti, kutulu bir neomisin kaseti olabilir. 3* hedefleme kolu, fare A 3' arttiricisini ve fare A 37 arttiricisi 3.1,i içerebilir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup söz konusu yapi, transkripsiyon yönüne göre 5 'den 3' e kadar, V A2'ye göre farenin A Iokus 5* (i hedeflemek için bir hedefleme kolu, rekombinaz tanima alanlarina sahip 5, ve 3' ile çevrili bir seçim kaseti ve fare J A2iye göre ve fare C A2 göre 5', fare A sekansi 3' (ü hedeflemek için 3' hedefleme kolunu içermektedir. Seçim kaseti bir Frt'ed higromisin-TK kaseti olabilir. 3' hedefleme kolu, fare C A2-J A4-C A4 gen segmentlerini ve fare A arttirici 2.4'ü içerebilir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup sunlari içermektedir: transkripsiyon yönüne göre 51 yönünden 3, yönüne dogru, V A2'ye göre fareyi A Iokusunu 5< hedeflemek için bir hedefleme kolu, rekombinaz tanima alanlarina sahip 5( ve 3' ile çevrili bir seçim kaseti, asagi dogru hV A3-12'den hJ M'in sonuna kadar insan A hafif zincir Iokusunun bitisik bir bölgesini içeren bir insan genomik fragmani, ve fare J A2'ye göre bir fare A sekansini 3' hedeflemek için bir 3' hedefleme kolu. Seçim kaseti bir Frtied neomisin kasetidir. 3* hedefleme kolu, fare C A2-J A4-C A4 gen segmentlerini ve fare A arttirici 2.4'ü içermektedir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup, asagi dogru hV A3-12'den hJ M'in sonuna kadar insan A hafif zincir Iokusunun bitisik bir bölgesini içermektedir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup sunlari içermektedir: transkripsiyon yönüne göre 5' yönünden 3' yönüne dogru, V A2'ye göre fareyi A Iokusunu 5< hedeflemek için bir hedefleme kolu, rekombinaz tanima alanlarina sahip 5( ve 3' ile çevrili bir seçim kaseti ve asagi dogru hV A3-27'den hV A2-8'in sonuna kadar insan A hafif zincir lokusunun bitisik bir bölgesini içeren bir insan genomik fragmani. Seçim kaseti bir Frt'ed higromisin kaseti olabilir. Insan genomik fragmani bir 3, hedefleyici kol içerebilir. 3< hedefleme kolu hV A3-12'den asagi dogru hV A2-8'in sonuna kadar yaklasik 53 kb insan A hafif zincir Iokusu içerebilir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup, hV A3-275den asagi dogru hV A3- 12inin sonuna kadar insan A hafif zincir Iokusunun bir bitisik bölgesini içermektedir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup sunlari içermektedir: transkripsiyon yönüne göre 5' yönünden 3, yönüne dogru, V A2'ye göre fareyi A Iokusunu 5< hedeflemek için bir hedefleme kolu, rekombinaz tanima alanlarina sahip 5( ve 3' ile çevrili bir seçim kaseti, hV A5-52'den asagi dogru hV )\ 1-40'in sonuna kadar insan A hafif zincir lokusunun bitisik bir bölgesini içeren bir birinci insan genomik fragmani, bir kisitlama enzimi bölgesi ve hV i\3-29'den asagi dogru hV A82Krnin sonuna kadar insan A hafif zincir lokusunun bitisik bir bölgesini içeren ikinci bir insan genomik fragmani. Seçim kaseti bir Frt*ed neomisin kaseti olabilir. Kisitlama enzimi bölgesi, bir homing endonükleaz için bir bölge olabilir. Homing endonükleaz, Pl-Scel olabilir. Ikinci insan genomik fragmani bir 3' hedefleyici kol olabilir. 3< hedefleme kolu hV A3- 29,dan asagi dogru hV A82K,nin sonuna kadar yaklasik 27 kb insan A hafif zincir lokusu içerebilir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup, hV A5-52rden asagi dogru hV )\ 1- 40,in sonuna kadar insan A hafif zincir Iokusunun bir bitisik bölgesini içermektedir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup sunlari içermektedir: transkripsiyon yönüne göre 5' yönünden 3› yönüne dogru, endojen VK gen segmentlerine göre fare K Iokusunu 5< hedeflemek için bir hedefleme kolu, iki yan yana rekombinaz tanima bölgesi, yan yana rekombinaz tanima alanlarina bir seçim kaseti 3,, ve K hafif zincir degisken gen segmentlerine göre bir fare K sekansini 5' hedeflemek için bir 3' hedefleme kolu. Yan yana dizilmis rekombinaz tanima alanlari, birbirlerine göre ters yönde olabilir. Rekombinaz tanima siteleri farkli olabilir. Rekombinaz tanima siteleri bir loxP bölgesi ve bir l0x511 bölgesi olabilir. Seçim kaseti bir neomisin kaseti olabilir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup sunlari içermektedir: transkripsiyon yönüne göre 5' yönünden 3, yönüne dogru, fare JK gen segmentlerine göre fare K rekombinaz tanima bölgesi 3, ve fare JK gen segmentlerine ve 57 e göre bir fare K sekansini 3* fare K intronik arttiriciya hedeflemek için bir 3' hedefleme kolu. Seçim kaseti bir higromisin-TK kaseti olabilir. Rekombinaz tanima bölgesi, seçim kaseti ile transkripsiyona göre ayni yönde olabilir. Rekombinaz tanima sitesi bir loxP sitesi olabilir. Izole edilmis bir DNA yapisi tarif edilmekte olup sunlari içermektedir: transkripsiyon yönüne göre 57 yönünden 3' yönüne dogru, endojen fare VK gen segmentlerinin sekansini 5, içeren bir birinci fare genomik fragmani, bir birinci rekombinaz tanima bölgesi, bir ikinci rekombinaz tanima bölgesi ve endojen fare JK gen segmentlerinin sekansini 37 içeren bir ikinci fare genomik fragmani ve fare K intronik arttiricisinin 5'i. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup, burada genetik modifikasyon yukarida ya da burada tarif edilen DNA yapilarindan bir ya da birden fazlasi ile bir modifikasyonu içermektedir. Burada tarif edildigi gibi bir fare yapmak için izole edilmis bir DNA yapisinin kullanimi tarif edilmektedir. Burada tarif edildigi gibi izole edilmis bir DNA yapisinin bir antijen baglayici protein yapmak için bir yöntemde kullanimi tarif edilmektedir. Yukarida ve burada açiklandigi gibi bir DNA yapisi içeren bir hedefleme vektörünü içeren bir insan disi kök hücre tarif edilmektedir. Bulusun bir yönünde, bir insan disi kök hücre saglanmakta olup, burada insan disi kök hücre burada tarif edilmis olan bir fareden elde edilmektedir. Bir düzenlemede insan disi kök hücresi bir embriyonik kök (ES) hücresidir. Spesifik bir düzenlemede, hücre bir fare ES hücresidir. Burada tarif edilmekte oldugu gibi bir fare yapmak için burada tarif edildigi gibi bir insan disi kök hücresinin kullanimi tarif edilmektedir. Bir antijen baglayici protein yapmak için burada tarif edildigi gibi bir insan disi kök hücresinin kullanimi tarif edilmektedir. Bulusun bir yönünde, bir fare embriyosu saglanmakta olup, fare embriyosu burada saglandigi gibi bir genetik modifikasyon içermektedir. Bir düzenlemede, bir donör ES hücresi içeren bir konak fare embriyosu saglanmakta olup, burada donör ES hücresi, burada tarif edildigi gibi genetik bir modifikasyon içermektedir. Bir düzenlemede fare embriyosu, bir ön-morula asamasindaki embriyodur. Spesifik bir düzenlemede, morula öncesi asamadaki embriyo, 4 hücre asamasindaki bir embriyo ya da 8 hücre asamasindaki bir embriyodur. Bir diger spesifik düzenlemede fare embriyosu bir blastosittir. Burada tarif edilmekte oldugu gibi birfare yapmak için burada tarif edildigi gibi bir fare embriyosunun kullanimi tarif edilmektedir. Bir antijen baglayici protein yapmak için burada tarif edildigi gibi bir fare embriyosunun kullanimi tarif edilmektedir. Insan disi bir hücre tarif edilmekte olup, burada, insan disi hücre, burada tarif edildigi gibi genetik olarak modifiye edilmis bir fareden elde edilen bir yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir gen sekansini içermektedir. Hücre bir B hücresi olabilir. Hücreler bir hibridom olabilir. Hücre somatik olarak mutasyona ugramis bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesini ve / veya bir immünoglobulin agir zincir degisken bölgesini kodlayabilir. Insan disi bir hücre tarif edilmekte olup, burada, insan disi hücre, burada tarif edildigi gibi genetik olarak modifiye edilmis bir fareden elde edilen bir yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir gen sekansini içermektedir. Hücre bir 8 hücresi olabilir. Hücreler bir hibridom olabilir. Hücre somatik olarak mutasyona ugramis bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesini ve / veya bir immünoglobulin agir zincir degisken bölgesini kodlayabilir. Burada tarif edilmekte oldugu gibi bir insan disi bir hayvan yapmak için burada tarif edildigi gibi bir insan disi hücrenin kullanimi tarif edilmektedir. Bir antijen baglayici protein yapmak için burada tarif edildigi gibi bir insan disi hücrenin kullanimi tarif edilmektedir. Insan disi hayvan bir faredir. (a) bir hV A gen segmentinden ve bir hJ A gen segmentinden türetilmis bir degisken bölge ve (b) bir fare CK geni içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres eden bir fare B hücresi tarif edilmektedir. Fare B hücresi ayrica (0) bir hVH, bir hDH ve (d) bir hJH segmentinden türetilmis bir degisken bölge içeren bir soydas agir zincir içerebilir. Bir düzenlemede B hücresi, yeniden düzenlenmis bir A geni içermemektedir. B hücresi, yeniden düzenlenmis bir A geni içermeyebilir. Genetik olarak modifiye edilmis insan disi bir hayvanda bir antikor yapmak için bir yöntem tarif edilmis olup söz konusu yontem asagidakileri içermektedir: (a) genetik olarak modifiye edilmis insan disi bir hayvanin bir antijene maruz birakilmasi; burada hayvan, bir endojen fare K hafif zincir lokusunda en az bir hV A ve en az bir hJ A içeren bir genoma sahiptir, burada endojen K hafif zincir Iokusu bir fare CK geni içermektedir; (b) genetigi degistirilmis hayvanin antijene karsi bir immün tepkisi gelistirmesinin saglanmasi; ve (0) (b) hayvanindan, antijeni spesifik olarak taniyan bir antikorun izole edilmesi ya da antijeni spesifik olarak taniyan bir immünoglobulin alani içeren bir hücrenin (b) hayvanindan izole edilmesi, ki burada antikor bir hV A, bir hJ A ve bir fare CK geninden türetilmis bir hafif zincir içermektedir. Insan disi hayvan bir faredir. Genetik olarak modifiye edilmis insan disi bir hayvanda bir antikor yapmak Için bir yöntem tarif edilmekte olup söz konusu yöntem asagidakileri içermektedir: (a) genetik olarak modifiye edilmis bir hayvanin bir antijene maruz birakilmasi; burada hayvan, endojen bir K lokusunda en az bir hV i\ ve K lokusunda en az bir hJ A içeren bir genoma sahiptir, burada K lokusu bir fare CK geni içermektedir; (b) genetigi degistirilmis hayvanin antijene karsi bir immün tepkisi gelistirmesinin saglanmasi; ve (0) (b) hayvanindan, antijeni Spesifik olarak taniyan bir antikorun izole edilmesi ya da antijeni spesifik olarak taniyan bir immünoglobulin alani içeren bir hücrenin (b) faresinden izole edilmesi, ki burada antikor bir hV A, bir hJ A ve bir fare CK geninden türetilmis bir hafif zincir içermektedir. Genetik olarak modifiye edilmis insan disi bir hayvanda bir antikor yapmak için bir yöntem tarif edilmekte olup söz konusu yöntem asagidakileri içermektedir: (a) genetik olarak modifiye edilmis insan disi bir hayvanin bir antijene maruz birakilmasi; burada hayvan A hafif zincir Iokusunda en az bir hV A ve A hafif zincir Iokusunda en az bir J A içeren bir genoma sahiptir, burada A hafif zincir Iokusu, bir insan disi C A geni içermektedir; (b) genetigi degistirilmis hayvanin antijene karsi bir immün tepkisi gelistirmesinin saglanmasi; ve (c) (b) hayvanindan, antijeni spesifik olarak taniyan bir antikorun izole edilmesi ya da antijeni spesifik olarak taniyan bir immünoglobulin alani içeren bir hücrenin (b) hayvanindan izole edilmesi ya da B hayvaninda, antijene baglanan bir agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansinin tanimlanmasi, ki burada antikor bir hV A, bir hJ A ve bir insan disi C A geninden türetilmis bir hafif zincir içermektedir. Insan disi hayvan bir faredir. A hafif zincir sabit geni, bir insan C A geninden ve insan disi bir C A geninden seçilebilir. )\ hafif zincir sabit geni, bir insan C A geni olabilir. Insan C A geni C A1, C A2, C A3 ve C A7 arasindan seçilebilir. A hafif zincir sabit geni bir fare ya da siçan C A geni olabilir. Fare C A geni C M, C A2 ve C A3 arasindan seçilebilir. Fare C A geni C A2 olabilir. Fare C A geni en az % 60, en az % 70, en az % 80, en az °/o 90, en az % 95 ya da en az % 98 oraninda fare C A2 ile özdes olan bir C A geninden elde edilebilir. Genetik olarak modifiye edilmis bir farede yeniden düzenlenmis bir antikor genini yapmak için bir yöntem tarif edilmis olup söz konusu yöntem sunlari içermektedir: (a) genetik olarak modifiye edilmis bir farenin bir antijene maruz birakilmasi; buradaki genetik modifikasyon, endojen bir hafif zincir Iokusunda bir hV A ve bir hJ A içermektedir, ki burada endojen K hafif zincir lokusu, bir fare CK geni ya da onun fonksiyonel bir fragmanini içermektedir; ve, (b) söz konusu farede yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin geninin tanimlanmasi, ki burada yeniden düzenlenmis immünoglobulin geni, bir A hafif zincir degisken bölge gen segmenti ve bir fare CK geni ya da bunun fonksiyonel bir fragmanini içermektedir. Yöntem ayrica fareden bir agir ve / veya hafif zincir degisken bölge kodlayan bir nükleik asit sekansinin klonlanmasini içerebilmekte olup, burada agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesi, bir insan V A ve bir fare CK içeren bir antikordandir. Genetik olarak modifiye edilmis bir farede yeniden düzenlenmis bir antikor genini yapmak için bir yöntem tarif edilmis olup söz konusu yöntem sunlari Içermektedir: (a) genetik olarak modifiye edilmis bir farenin bir antijene maruz birakilmasi, burada genetik modifikasyon, bir hafif zincir Iokusunda bir hV A ve bir hJ A içermektedir, burada K hafif zincir lokusu, bir fare CK geni ya da onun fonksiyonel bir fragmanini içermektedir; ve, (b) söz konusu farede yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin geninin tanimlanmasi, ki burada yeniden düzenlenmis immünoglobulin geni, bir A hafif zincir degisken bölge gen segmenti ve bir fare CK geni ya da bunun fonksiyonel bir fragmanini içermektedir. Yöntem ayrica fareden bir agir ve / veya hafif zincir degisken bölge kodlayan bir nükleik asit sekansinin klonlanmasini içerebilmekte olup, burada agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesi, bir insan V A ve bir fare CK içeren bir antikordandir. Genetik olarak modifiye edilmis bir farede yeniden düzenlenmis bir antikor genini yapmak için bir yöntem tarif edilmis olup söz konusu yöntem sunlari içermektedir: (a) genetik olarak modifiye edilmis bir farenin bir antijene maruz birakilmasi; burada genetik modifikasyon, bir insan disi A hafif zincir Iokusunda bir hV A ve bir hJ A içermektedir, burada A hafif zincir lokusu, bir insan disi C )\ geni ya da onun fonksiyonel bir fragmanini içermektedir; ve, (b) söz konusu farede yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin geninin tanimlanmasi, ki burada yeniden düzenlenmis immünoglobulin geni, bir A hafif zincir degisken bölge gen segmenti ve bir C A geni ya da bunun fonksiyonel bir fragmanini içermektedir. A hafif zincir sabit geni ya da bunun fonksiyonel fragmani, bir insan C A geninden ve bir fare ya da siçan C A geninden ya da onun fonksiyonel bir fragmanindan seçilebilir. A hafif zincir sabit geni bir fare ya da siçan C A geni ya da onun fonksiyonel bir fragmani olabilir. Yöntem ayrica fareden bir agir ve / veya hafif zincir degisken bölge kodlayan bir nükleik asit sekansinin klonlanmasini içerebilmekte olup, burada agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesi, bir insan V A ve bir fare insan disi (örnegin fare ya da siçan) C A içeren bir antikordandir. Bulusun bir görüsünde, bir antikor yapmak için bir yöntem saglanmis olup yöntem sunlari içermektedir: burada tarif edildigi gibi bir farenin bir antijene maruz birakilmasi, farenin, antijeni spesifik olarak baglayan bir antikor yapmayi içeren bir bagisiklik tepkisi olusturmasinin saglanmasi, agir zinciri kodlayan farede yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin ve bir antikorun bir soydas hafif zincir degisken alan dizisini kodlayan farede yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin belirlenmesi, ki burada antikor spesifik olarak antijeni baglamaktadir ve istenen bir antikoru yapmak için insan sabit alanlarina kaynasik agir ve hafif zincir degisken alanlarinin nükleik asit sekanslarinin kullanilmasi, ki burada istenen antikor, bir fare CK bölgesine kaynasmis bir V A bölgesi içeren bir hafif zincir içermektedir. Bulusun bir düzenlemesinde, bir antikor yapmak için bir yöntem saglanmis olup yöntem sunlari içermektedir: burada tarif edildigi gibi bir farenin bir antijene maruz birakilmasi, farenin, antijeni spesifik olarak baglayan bir antikor yapmayi içeren bir bagisiklik tepkisi olusturmasinin saglanmasi, agir zinciri kodlayan farede yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin ve bir antikorun bir soydas hafif zincir degisken alan dizisini kodlayan farede yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin belirlenmesi, ki burada antikor spesifik olarak antijeni baglamaktadir ve istenen bir antikoru yapmak için insan sabit alanlarinin nükleik asit sekanslarina kaynasik agir ve hafif zincir degisken alanlarinin nükleik asit sekanslarinin kullanilmasi, ki burada istenen antikor, bir CK bölgesine kaynasmis bir V A bölgesi içeren bir hafif zincir içermektedir. Bulusun bir düzenlemesinde, bir antikor yapmak için bir yöntem saglanmis olup yöntem sunlari içermektedir: burada tarif edildigi gibi bir farenin bir antijene maruz birakilmasi, farenin, antijeni spesifik olarak baglayan bir antikor yapmayi içeren bir bagisiklik tepkisi olusturmasinin saglanmasi, agir zincir degisken bölgesini kodlayan farede yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin ve bir antikorun bir soydas hafif zincir degisken alan dizisini kodlayan yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin belirlenmesi, ki burada antikor spesifik olarak antijeni baglamaktadir ve insan sekanslarindan türetilmis bir antikor yapmak Için bir insan agir zincir sabit alanini ve bir insan hafif zincir sabit alanini kodlayan nükleik asit sekanslarina kaynasik nükleik asit sekanslarinin kullanilmasi, ki burada antijeni spesifik olarak baglayan antikor, insan disi (örnegin, fare ya da siçan) bir C A bölgesine kaynasik bir insan V A bölgesi içeren bir hafif zincir içermektedir. Bir düzenlemede C A bölgesi faredir ve bir düzenlemede C A1, C A2 ve C A3 arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, fare C A bölgesi C A23dir. Bulusun bir görüsünde, yeniden düzenlenmis bir antikor hafif zincir degisken bölge gen sekansi yapmak için bir yöntem saglanmis olup yöntem sunlari içermektedir: (a) burada tarif edildigi gibi bir farenin bir antijene maruz birakilmasi; (b) farenin bir bagisiklik tepkisi gelistirmesine izin verilmesi; (c) farede bir fare CK bölgesi ile birlestirilmis yeniden düzenlenmis bir insan V A bölgesi dizisini kodlayan bir nükleik asit dizisini içeren bir hücreyi tanimlanmasi, ki burada hücre ayrica bir insan VH alani ve insan disi bir CH alani içeren ve ayni zamanda antijeni baglayan bir antikoru eksprese eden ayni türden bir agir zinciri de kodlamaktadir; (d) hücreden, insan V A bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansinin ve ayni türden insan VH alanini kodlayan bir nükleik asit sekansinin klonlanmasi; ve, (e) insan V A bölgesini kodlayan klonlanmis nükleik asit sekansini ve tam bir insan antikoru olusturmak için ortak insan VH alanini kodlayan klonlanmis nükleik asit sekansinin kullanilmasi. Buiusun bir düzenlemesinde, yeniden düzenlenmis bir antikor hafif zincir degisken bölge gen sekansi yapmak için bir yöntem saglanmis olup yöntem sunlari içermektedir: (a) bu açiklamada tarif edildigi gibi bir farenin bir antijene maruz birakilmasi; (b) farenin bir bagisiklik tepkisi gelistirmesine izin verilmesi; (c) ayni nükleik asit molekülü üzerinde farenin bir CK bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansi ile bitisik olan yeniden düzenlenmis bir insan V A alan sekansini kodlayan bir nükleik asit sekansi içeren faredeki bir hücrenin tanimlanmasi, ki burada hücre ayrica bir insan VH alani ve farenin CH alanini içeren soydas bir agir zinciri de kodlamaktadir, ve burada hücre antijeni baglayan bir antikoru ekspres etmektedir; (d) hücreden, insan V A bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansinin ve ayni türden insan VH alanini kodlayan bir nükleik asit sekansinin klonlanmasi; ve, (e) insan V A bölgesini kodlayan klonlanmis nükleik asit sekansini ve tam bir insan antikoru olusturmak için ortak insan VH alanini kodlayan klonlanmis nükleik asit sekansinin kullanilmasi. Bulusun bir düzenlemesinde, yeniden düzenlenmis bir antikor hafif zincir degisken bölge gen sekansi yapmak için bir yöntem saglanmis olup yöntem sunlari içermektedir: (a) burada tarif edildigi gibi bir farenin bir antijene maruz birakilmasi; (b) farenin antijene karsi bir bagisiklik tepkisi gelistirmesine izin verilmesi; (c) farenin insan disi bir C A bölgesi ile kaynasmis yeniden düzenlenmis bir insan V A bölgesi sekansini kodlayan DNA'yi içeren bir hücrenin farede tanimlanmasi, ki burada hücre ayrica bir insan VH alani ve farenin insan disi CH alanini içeren soydas bir agir zinciri de kodlamaktadir, ve burada hücre antijeni baglayan bir antikoru ekspres etmektedir; (d) hücreden, yeniden düzenlenmis insan V )\ bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansinin ve ayni türden insan VH alanini kodlayan bir nükleik asit sekansinin klonlanmasi; ve, (e) insan V A bölgesini kodlayan klonlanmis nükleik asit sekansini ve tam bir insan antikoru olusturmak için ortak insan VH alanini kodlayan klonlanmis nükleik asit sekansinin kullanilmasi. Bir düzenlemede, insan disi hayvan bir faredir ve C A bölgesi fare C A2'dir. Spesifik bir düzenlemede, fare C A bölgesi en oraninda fare C A2 ile özdes olan bir C A geninden elde edilmektedir. Endojen bir hafif zincir sabit bölgesine (CL) kaynasik bir insan A-türevli hafif zinciri ekspres eden, genetigi degistirilmis bir insan disi hayvan tarif edilmekte olup, burada hayvan, antijen ile immünizasyondan sonra, hayvanin insan disi bir CL alanina kaynastirilmis bir insan V A bölgesi içeren bir antikor yapmaktadir. Insan disi CL alani bir CK bölgesi ve bir C A bölgesi arasindan secilebilir. CL alani bir CK bölgesi olabilir. Hayvan bir faredir. Fare CL alani bir C A bölgesi olabilir. C A bölgesi C A2 olabilir. en az % 98 oraninda fare C A2 ile özdes olan bir C A geninden elde edilebilir. Çok sayida immünoglobulin agir zincirine bagli çok sayida immünoglobulin A hafif zinciri ekspres eden burada tarif edildigi gibi modifiye edilmis endojen K hafif zincir lokusunu içeren genetik olarak modifiye edilmis insan disi bir hayvan tarif edilmektedir. Agir zincir bir insan sekansi içerebilir. Insan sekansi bir degisken sekans, bir CH1, bir mentese, bir CH2, bir CH3 ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilebilir. Çok sayida immünoglobulin A hafif zincir, bir insan sekansi içerebilir. Insan sekansi bir degisken sekans, bir sabit sekans ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilebilir. Hayvan, engelli bir endojen immünoglobülin lokusu içerebilir ve bir transgen ya da ekstrakromozomal epizomdan agir zinciri ve / veya A hafif zincirini ekspres etmektedir. Hayvan endojen insan disi agir zincir gen segmentlerinin (yani, V, D, J), bir kisminin ya da hepsinin endojen (insan disi) bir yerinde, ve /veya bazi ya da bütün endojen insan disi agir zincir sabit sekanslarinda (örnegin, CH1, mentese, CH2, CH3 ya da bunlarin bir kombinasyonu), ve / veya endojen insan disi hafif zincir sekanslarinin bir kismi ya da tamaminda (örnegin, V, J, sabit ya da bunlarin bir kombinasyonu) bir ya da daha fazla insan immünoglobulin sekansi ile bir replasman içerebilir. Insan disi hayvan birfaredir. Insan A türevli bir hafif zincire sahip antikorlari yapmak için uygun insan disi bir hayvan tarif edilmekte olup, burada insan disi hayvanda yapilan antikorlarin tamami ya da büyük oranda tamami bir insan A türevli hafif zincir ile ekspres edilmektedir. Insan A türevli hafif zincir, endojen bir endojen hafif zincir lokusundan ekspres edilebilir. Endojen hafif zincir lokusu bir K hafif zincir Iokusu olabilir. Hayvan bir faredir ve K hafif zincir Iokusu bir fare K hafif zincir Iokusu olabilir. Bulusun bir yönünde, bir insan antikoru için A türevli bir hafif zincir yapmak için bir yöntem saglanmakta olup söz konusu yöntem burada tarif edildigi gibi bir fareden bir hafif zincir sekansi ve bir agir zincir sekansinin elde edilmesini ve bir hafif zincir sekansinin ve agir zincir sekansinin bir insan antikorunun yapiminda kullanilmasini içermektedir. Bulusun bir yönünde bir antijen baglayici proteini yapmak için bir yöntem saglanmakta olup söz konusu yöntem bir farenin burada tarif edildigi gibi bir antijene maruz birakilmasini; farenin bir bagisiklik tepkisi olusturmasina izin verilmesini; ve fareden antijene baglanan bir antijen baglayici proteinin elde edilmesini ya da fareden, antijene baglanan bir antijen baglayici protein yapiminda kullanilacak bir sekansin elde edilmesini içermektedir. Bulusun bir yönünde, burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir hücre saglanmaktadir. Bir düzenlemede hücre, bir embriyonik kök hücre, bir pIuripotent hücre, indüklenmis bir pIuripotent hücre, bir 8 hücresi ve bir hibridoma arasindan seçilmektedir. Bulusun bir yönünde, burada tarif edildigi gibi genetik bir modifikasyon içeren bir hücre saglanmaktadir. Bir düzenlemede hücre bir fare hücresidir. Bir düzenlemede, hücre bir hibridoma ve bir kuadromadan seçilmektedir. Bir düzenlemede, hücre, bir fare K sabit sekansi ile kaynasmis bir insan A degisken sekansini içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ekspres etmektedir. Spesifik bir düzenlemede fare sabit sekansi bir fare K sabit sekansidir. Bulusun bir yönünde, burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir doku saglanmaktadir. Bulusun bir yönünde, bir antijen baglayici protein yapmak üzere bir fare ya da bir hücrenin kullanimi saglanmaktadir. Bir düzenlemede, antijen-baglayici protein, bir insan proteinidir. Bir düzenlemede, insan proteini bir insan proteinidir. Burada tarif edildigi gibi bir fare hayvani, hücresi, dokusu ya da yöntem ile yapilan bir antijen baglayici protein tarif edilmektedir. Antijen-baglayici protein, bir insan proteini olabilir. Insan proteini bir insan antikoru olabilir. Burada tarif edilen düzenlemelerin ve yönlerin herhangi biri, aksi belirtilmedigi sürece ya da baglamdan açikça fark edilmedikçe, birbiriyle baglantili olarak kullanilabilir. Diger düzenlemeler, müteakip tarifnamenin gözden geçirilmesinden sonra teknikte uzman kisiler tarafindan görülecektir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1A bir fare immünoglobulin agir zincir degisken gen Iokusunun yaklasik üç megabazinin (Mb) (kapali semboller) insan immünoglobulin agir zincir degisken gen lokusunun (açik semboller) yaklasik bir megabazi (Mb) ile dogrudan genomik replasmaninin ölçeklendirilmemis bir genel gösterimini sergilemektedir. Sekil 18 bir fare immünoglobülin K hafif zincir degisken gen Iokusunun yaklasik üç megabazinin (Mb) (kapali semboller) insan immünoglobülin hafif zincir degisken gen lokusunun (açik semboller) iki neredeyse ayni tekrarinin birinci ya da proksimalinin yaklasik 0.5 megabazi (Mb) ile dogrudan genomik replasmaninin ölçeklendirilmemis bir genel gösterimini sergilemektedir. Sekil 2A tüm fare VH, DH ve JH gen segmentlerinin silinmesine neden olan bir fare immünoglobülin agir zincir degisken gen Iokusunun dogrudan genomik replasmani ve üç insan VH, tüm insan DH ve JH gen segmentleri ile replasman için üç ilk adimin ölçeklendirilmemis bir genel gösterimini sergilemektedir. Insan immünoglobulin agir zincir gen segmentlerinin birinci insersiyonu için bir hedefleme vektörüi bir 67 kb 5 rekombinasyon bölgesi (açik üçgen), bir 145 kbilik insan genomik fragmani ve bir 8 kbilik 3( fare homoloji kolu ile gösterilmektedir (3hVH BACvec). Insan (açik semboller) ve fare (kapali semboller) immünoglobulin gen segmentleri, ek seçim kasetleri (açik dikdörtgenler) ve daha sonraki hedefleme vektörlerinden eklenen bölgeye spesifik rekombinasyon siteleri (açik üçgenler) gösterilmektedir. Sekil 28, 77 ek insan VH gen segmentinin insersiyonu ve son seçim kasetinin çikarilmasi ile sonuçlanan bir fare immünoglobulin agir zincir degisken gen lokusunun direkt genomik replasmani için alti ek adimin (D-1) ölçeklendirilmemis ayrintili bir gösterimini sergilemektedir. Insan agir zincir gen segmentlerinin (3hVH- CRE Hibrit Allel) ilk insersiyonuna ilave insan VH gen bölümlerinin (18hVH BACvec) insersiyonu için bir hedefleme vektörü, 20 kb 5 'fare homoloji kolu, bir seçim kaseti (açik dikdörtgen), 196 kb'lik bir insan genomik fragmani ve insan gen segmentlerine ' yerlestirilen bölgeye özgü bir rekombinasyon bölgesi (açik üçgen) ile gösterilen insan agir zincir gen segmentlerinin baslangiçtaki 5' ucuyla örtüsen 62 kb'lik bir insan homoloji kolu ile birlikte gösterilmektedir. Insan (açik semboller) ve fare (kapali semboller) immünoglobulin gen segmentleri ve müteakip hedefleme vektörleri tarafindan sokulan ilave seçim kasetleri (açik dikdörtgenler) gösterilmektedir. Sekil 20, tüm fare VK ve JK gen segmentlerinin (IgK-CRE Hibrid Alel) silinmesi ile sonuçlanan bir fare immünoglobulin K hafif zincir degisken gen lokusunun dogrudan genomik replasmani için ilk üç adimin (A-C) ölçeklendirilmemis ayrintili bir gösterimini sergilemektedir. Seçim kasetleri (açik dikdörtgenler) ve hedefleme vektörlerinden yerlestirilen bölgeye spesifik rekombinasyon bölgeleri (açik üçgenler) gösterilmektedir. Sekil 2D, proksimal tekrardaki tüm insan VK ve JK gen segmentlerinin insersiyonu ve son seçim kasetinin delesyonu (40hVKdHyg Hibrid Alel) ile sonuçlanan bir fare immünoglobülin K hafif zincir degisken gen lokusunun direkt genomik replasmani için bes ilave adimin (D-H) ölçeklendirilmemis ayrintili bir gösterimini sergilemektedir. Insan (açik semboller) ve fare (kapali semboller) immünoglobulin gen segmentleri ve müteakip hedefleme vektörleri tarafindan sokulan ilave seçim kasetleri (açik dikdörtgenler) gösterilmektedir. Sekil 3A, insan agir zincir gen sekanslarinin eklenmesini saptamak için kantitatif PCR (qPCR) primer / prob konumlarini ve hedeflenen embriyonik kök (ES) hücrelerinde fare agir zincir gen sekanslarinin kaybini içeren bir tarama stratejisinin (ölçeklendirilmemistir) genel bir gösterimini sergilemektedir. Birinci insan agir gen insersiyonu için ES hücrelerinde ve farelerde tarama stratejisi, silinen bölge ("kayip" sondalari C ve D), degistirilmemis bir fare kromozomu (üstte) ve dogru hedeflenmis bir kromozom (altta) üzerine yerlestirilmis bölge ("hlgH" problari G ve H) ve yan bölgeler ("tutma" problari A, B, E ve F) için qPCR primer / prob setleri ile gösterilmektedir. Sekil SB, insan immünoglobülin agir zincir gen segmentlerinin bir birinci insersiyonu için parental ve modifiye edilmis ES hücrelerinde gözlenen prob kopya sayisinin temsili bir hesaplamasini göstermektedir. A'dan F'ye kadar olan problar için gözlemlenen prob kopya numarasi 2 / 2AACt olarak hesaplanmistir. AACt ave[ACt(numune) - medACt(k0ntrol)] olarak hesaplanmis olup burada ACt, test ve referans problari arasindaki Ct cinsinden farktir (analize bagli olarak 4 ile 6 referans problari arasinda). MedACt (kontrol) terimi, parental ES hücrelerinden gelen çoklu ( 60) hedefli olmayan DNA numunelerinin ortalama ACt'sidir. Her degistirilmis ES hücre klonu sextuplicate içinde analiz edilmistir. Parental ES hücrelerinde IgH problari olan G ve H'nin kopya sayilarini hesaplamak için, bu problarin modifiye edilmis ES hücrelerinde 1 kopya sayisina sahip oldugu varsayilmistir ve herhangi bir amplifikasyon gözlenmese de maksimum 35 Ct kullanilmistir. Sekil SC, sadece D ve H problari kullanilarak hesaplanan her genotipin dört faresi için kopya sayilarinin temsili bir hesaplamasini göstermektedir. Vahsi tip fareler: WT Fareleri; Insan immünoglobulin gen segmentlerinin bir ilk insersiyonu için heterozigoz fareler: HET Fareleri; Insan immünoglobulin gen segmentlerinin ilk insersiyonu için homozigot fareler: Homo Fareler. Sekil 4A, bir 3hVH BACvec'in bakteri homolog rekombinasyonu (BHR) ile yapiminda kullanilan üç adimin (ölçeklendirilmemistir) detayli bir gösterimini sergilemektedir. Insan (açik semboller) ve fare (kapali semboller) immünoglobulin gen segmentleri, seçim kasetleri (açik dikdörtgenler) ve hedefleme vektörlerinden eklenen bölgeye spesifik rekombinasyon siteleri (açik üçgenler) gösterilmektedir. Sekil 48, Notl sindiriminden sonra üç BAC klonunun (B1, 82 ve BS) puls-alani jel elektroforezini (PFGE) göstermektedir. M1, M2 ve MS markörleri sirasiyla düsük aralikli, orta aralikli ve Iambda merdiven PFG markörleridir (New England Biolabs, Sekil 5A, artan miktarda insan immünoglobulin agir zincir gen segmentleri ile fare immünoglobulin agir zincir Iokusunun sirali modifikasyonlarinin sematik gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Homozigot fareler agir zincir humanizasyonunun üç farkli asamasinin her birinden yapilmaktadir. Açik semboller insan sekansini göstermekte; kapali semboller fare sekansini göstermektedir. Sekil SB, artan miktarda insan immünoglobulin K hafif zincir gen segmentleri ile fare immünoglobulin K hafif zincir Iokusunun sirali modifikasyonlarinin sematik gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Homozigot fareler K hafif zincir humanizasyonunun üç farkli asamasinin her birinden yapilmaktadir. Açik semboller insan sekansini göstermekte; kapali semboller fare sekansini göstermektedir. Sekil 6, vahsi tip ve VELOCIMMUNE® insanlastirilmis farelerde B hücre popülasyonlarinin FACS nokta grafiklerini göstermektedir. Vahsi tip (wt), VELOCIMMUNE® 1 (V1), VELOCIMMUNE® 2 (V2) ya da VELOCIMMUNE® 3 (V3) farelerinin dalak (üst sira, üst ve alt siradan üçüncü sira) ya da kasik lenf bezinden (üstten ikinci sira) elde edilen hücreler B hücrelerini ekspres eden yüzey IgM'si (üst sira ve üst siradan ikinci sira), K ya da A hafif zincirleri içeren yüzey immünoglobulin (üstten üçüncü sira) ya da spesifik haplotiplerin (alt sira) yüzey lgM'si ve FACS ile ayrilmis popülasyonlar için boyanmistir. Sekil 7A, baglantisal çesitlilik ve nükleotid ilavelerinin gösterilmesi amaciyla VH-DH- JH (CDR3) baglantisinin etrafindaki rastgele seçilmis VELOClMMUNE® antikorlarinin temsili agir zincir CDR3 sekanslarini göstermektedir. Agir zincir CDR3 sekanslari, germ hatti her grubun üzerinde kalin (bold) olarak saglanan DH gen segmenti kullanimina göre gruplandirilmistir. Her agir zincir CDR3 sekansi için VH gen segmentleri, her sekansin 5< ucunda parantez içinde not edilmistir (örnegin 3-72, insan VH3-72'dir). Her agir zincir CDR3 için JH gen segmentleri, her sekansin 3( ucunda parantez içinde not edilmistir (örnegin 3, insan H3'dür). Gösterilen her dizi için SEKANS ID NO'Iari yukaridan asagiya dogru ilerlerken su sekildedir: SEKANS 38; SEKANS ID NO: 39. Sekil 78, baglantisal çesitlilik ve nükleotid ilavelerinin gösterilmesi amaciyla VK-JK (CDR3) baglantisinin etrafindaki rastgele seçilmis VELOClMMUNE® antikorlarinin temsili hafif zincir CDR3 sekanslarini göstermektedir. Her hafif zincir CDR3 sekansi için VK gen segmentleri, her sekansin 5( ucunda parantez içinde not edilmistir (örnegin 1-6, insan VK1-6tdir). Her hafif zincir CDR3 için JK gen segmentleri, her sekansin 3( ucunda parantez içinde not edilmistir (örnegin 1, insan JK1tdir). Gösterilen her dizi için SEKANS ID NO'Iari yukaridan asagiya dogru ilerlerken su sekildedir: SEKANS ID NO: 40; SEKANS ID NO: 41; SEKANS ID NO: 42; SEKANS Sekil 8, 38 (immünize edilmemis IgM), 28 (immünize edilmemis lgG), 32 (IgG'den imm'ünize edilmemis IgK), 36 (immünize edilmis lgG) ya da 36 (lgG'den immünize edilmis IgK) sekanslari arasinda her bir nükleotit (NT; sol sütun) ya da amino asit (AA; sag s'L'itun) pozisyonunda degistirilen sekanslarin yüzdesi olarak puanlama (karsilik gelen germ hatti sekanslarinin hizalanmasindan sonra) VELOClMMUNE® antikorlarinin agir ve hafif zincirlerinin somatik hipermutasyon frekanslarini göstermektedir. Gölgeli çubuklar, CDR'Ierin yerlerini göstermektedir. Sekil 9A, vahsi tipte (açik çubuklar) ya da VELOClMMUNE® farelerinde (kapali çubuklar) IgM ve IgG izotipleri için serum immünoglob'ulin seviyelerini göstermektedir. Sekil 98, vahsi tipte (açik çubuklar) ya da VELOClMMUNE® farelerinde (kapali çubuklar) lgA izotipi için serum immünoglobülin seviyelerini göstermektedir. Sekil 90, vahsi tipte (açik çubuklar) ya da VELOClMMUNE® farelerinde (kapali çubuklar) IgE izotipi için serum immunoglobülin seviyelerini göstermektedir. Sekil 10A, lL-6R'nin ektodomain ile iki (kanama 1) ya da 'üç (kanama 2) bagisiklama turundan sonra yedi VELOClMMUNE® (VI) ve bes vahsi tip (WT) fareden serumun interlökin-ö reseptör'une (IL-GR) karsi antijene spesifik IgG titrelerini göstermektedir. Sekil fareden IL-6R'ye spesifik IgG izotipine özg'u titreleri göstermektedir. Sekil 11 A, VELOClMMUNE® farelerinde 'üretilen anti-interlökin-G reseptör'u monoklonal antikorlarinin afinite dagilimini göstermektedir. Sekil 11 B, VELOClMMUNE® (VI) ve vahsi tip (WT) farelerde üretilen anti-interlökin- 6 reseptör'u monoklonal antikorlarinin antijene spesifik engellenmesini göstermektedir. Sekil 12, bir fare immünoglob'ulin agir zincir Iokusundaki fare ADAM6a ve ADAM6b genlerinin sematik bir illüstrasyonunu (ölçeklendirilmemistir) göstermektedir. Fare ADAM6a ve ADAM6b'nin insanlastirilmis bir endojen agir zincir Iokusuna insersiyonu için kullanilan bir hedefleme vektörü (mADAMö Hedefleme Vektör'u) 5, ve 3' uçlarindaki tasarim kisitlama bölgeleri de dahil olmak üzere bölgeye özgü rekombinasyon bölgeleri (Frt) ile çevrili bir seçim kaseti (HYG: higromisin) ile gösterilmektedir. Sekil 13, insan agir zincir degisken gen segmentleri arasinda bulunan bir insan ADAM6 psödogeninin (hADAMöW) sematik gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Bir insan ADAM6 psödogenini silmek ve bir insan agir zincir Iokusuna benzersiz kisitlama bölgeleri eklemek üzere bakteriyel homolog rekombinasyon için (hADAMGLIJ Hedefleme Vektörü) bir hedefleme vektörü ' ve 3' uçlarindaki tasarim kisitlama bölgeleri dahil olmak üzere bölgeye özel rekombinasyon bölgeleri (loxP) ile çevrili bir seçim kaseti (NEO: neomisin) ile gösterilmistir. Bölgeye özgü rekombinasyon bölgeleri ile çevrili bir seçim kaseti içeren fare ADAM6a ve ADAM6b genlerini kodlayan bir genomik fragman içeren elde edilen hedeflenmis insanlastirilmis agir zincir Iokusunun bir illüstrasyonu (ölçeklendirilmemistir) gösterilmektedir. Sekil 14A, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen Iokusu (H+ / +K+ ' +) için homozigot olan fareler ve fare ADAMö genlerini (H+ / +A6"33K+/+) içeren yerlestirilmis bir fare genomik fragmanina sahip, insan agir ve insan K için hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot fareler için kemik iliginde lgM ve 8220'nin yüzey ekspresyonu için singletler üzerinde kapili lenfositlerin FACS kontur grafiklerini göstermektedir. Her kontur grafiginde olgunlasmamis (BZZOintIgM+) ve olgun (B220hi9hlgM+) B hücrelerinin yüzdesi not edilmistir. Sekil 14B, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokusu (H+ / +k+ ' +) için homozigot olan fareler ve fare ADAM6 genlerini (H+ ' +A6'feSK+/+) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip, insan agir ve insan K için hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot farelerin kemik iliginden izole edilen olgunlasmamis ( B hücrelerinin toplam sayisini göstermektedir. Sekil 15A, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen Iokusu (H+ / +k+ / +) için homozigot olan fareler ve fare ADAM6 genlerini (H*/*A6resK*/*) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip, insan agir ve insan K için hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot fareler için kemik iliginde c-kit ve CD43'nin yüzey ekspresyonu için CD19+-kapili B hücrelerinin FACS kontur grafiklerini göstermektedir. Pro-B (CD19+CD43+ckit+) ve pre-B (CD19*CD43" ckitr) hücrelerinin yüzdesi her kontur grafiginin sirasiyla sag üst ve alt sol kadranlarinda belirtilmistir. Sekil 15B, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokus u(H+ / +K+ / +) için homozigot farelerin ve fare ADAM6 genlerini içeren ((H+ 1 +AG'ESK+ / +) ektopik bir fare genomik parçasina sahip insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokusu için homozigot farelerin femurlarindan izole edilen kemik iligindeki pro-B hücreleri (CD19*CD43*ckit+) ve pre-B hücrelerinin (CD19+CD43"ckit*) toplam sayisini göstermektedir. Sekil 16A, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen Iokusu (H+ / +K+ ' *) için homozigot olan fareler ve fare ADAM6 genlerini (H+/+A6resK"+) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip, insan agir ve insan K için hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot fareler için kemik iliginde CD19 ve CD43'ün yüzey ekspresyonu için singletler üzerinde kapili lenfositlerin FACS kontur grafiklerini göstermektedir. Olgunlasmamis B (CD19*CD43"), pre-B (CD19+CD43"") ve pro-B (CD19+CD43+) hücrelerinin yüzdesi her bir kontur grafiginde belirtilmistir. Sekil 1GB insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen Iokusu (H+ / +K+ ' +) için homozigot olan ve fare ADAM6` genlerini (H+ / +AGT'EV) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip olan, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokusu için homozigot olan farelerin kemik iliginde olgunlasmamis B (CD19*CD43") ve pre-B (CD19+CD43"") hücrelerinin histogramlarini göstermektedir. Sekil 17A, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokusu (H+ / +K+ ' +) için homozigot olan fareler ve fare ADAM6 genlerini (H+ / +AöresKJ'IJ') kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip, insan agir ve insan K için hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot fareler için splenositlerde CD19 ve CD3'ün yüzey ekspresyonu için singletler üzerinde kapili lenfositlerin FACS kontur grafiklerini göstermektedir. B (CD19+CD3") ve T (CD19"CD3+) hücrelerinin yüzdesi her kontur grafiginde belirtilmistir. Sekil 17B, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokusu (H* / +k+ ' +) için homozigot olan fareler ve fare ADAM6 genlerini (H*/*A6"*'K+ / +) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip, insan agir ve insan K için hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot fareler için dalakta lgA, ve ng hafif zincirinin yüzey ekspresyonu için CD19+-kapili B hücreleri için FAC kontur grafiklerini göstermektedir. lg A* / + (sol üst kadran) ve ngu (sag alt kadran) B hücrelerinin yüzdesi her kontur grafiginde belirtilmistir. Sekil 17C, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokusu (H+ / *K* / +) için homozigot farelerin ve fare ADAM6 genlerini (H+ / +AßresK+ / t) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen göstermektedir. Sekil 18A, insan agir ve insan K hafif zincir degisken gen lokusu (H+ / *k* ' +) için homozigot olan fareler ve fare ADAM6 genlerini (HJ'IJ'AES'QSK+ ' +) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip, insan agir ve insan K için hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot fareler için dalakta lgD ve lgM'nin yüzey ekspresyonu için CD19+-kapili B hücrelerinin FAC kontur grafiklerini göstermektedir. Olgun B hücrelerinin (CD19*lgDhi9hlgMi"t) yüzdesi her kontur grafiginde belirtilmektedir. Sag kontur grafigindeki ok, lgM ve lgD yüzey ekspresyonu ile baglantili olarak B hücrelerinin olgunlasma sürecini göstermektedir. Sekil 188, CD19+IqMhi9hlqDint to CD19+linntlqDhi9h agir ve insan k hafif zincir degisken gen lokusu (H+/+k+") için homozigot farelerin ve fare ADAM6 genlerini (H+ / +A6resK* ' +) kodlayan ektopik bir fare genomik fragmanina sahip insan agir ve insan k hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot farelerin dalaginda B hücrelerinin toplam sayisini göstermektedir. Sekil 19, V A kümeleri, gen segmentleri (A, B ve C) ve J A ve C /\ bölge çiftleri (J-C çiftleri) dahil olmak üzere insan i\ hafif zincir Iokusunun ayrintili bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 20, endojen fare A hafif zincir Iokusunu etkisiz hale getirmek için kullanilan bir hedefleme stratejisinin genel bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 21, endojen fare K hafif zincir Iokusunu etkisiz hale getirmek için kullanilan bir hedefleme stratejisinin genel bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 22A, 12 hV A gen segmentleri ve hJ A1 gen segmentini (12 / 1- A Hedefleme Vektörü) içeren insan A hafif zincir sekanslarina sahip endojen fare A hafif zincir lokusunu hedeflemek için bir ilk hedefleme vektörünün genel bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 228, 12 hV A gen segmenti ve hJ M gen segmenti (12 / 1-K Hedefleme Vektörü), 12 hV A gen segmenti ve hJ A1, 2, 3 ve 7 gen segmenti (12 / 4-K Hedefleme Vektörü), 12 hV A gen segmenti, bir insan VK -JK genomik dizisi ve hJ i\1 gen segmenti (12 (K) 1-K Hedefleme Vektörü) ve 12 hV A gen segmenti, bir insan VK-JK genomik dizilim ve hJ A1, 2, 3 ve 7 gen segmentini (12 (K) 4-K Hedefleme Vektörü) içeren insan A hafif zincir sekanslarina sahip endojen fare K hafif zincir lokusunu hedeflemek için bir dört ilk hedefleme vekt'orünün genel bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 23, 40 hV )\ gen segmentinin ve bir tek hJ A gen segmentinin fare A hafif zincir lokusuna asamali olarak insersiyonu için hedefleme stratejisinin genel bir gösterimini (Ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 238, 40 hV A gen segmentinin ve bir tek hJ A gen segmentinin fare K lokusuna asamali olarak insersiyonu için hedefleme stratejisinin genel bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 24, insan K intergenik sekans, çoklu hJ A gen segmentleri ya da her ikisini içeren bir hibrit hafif zincir lokusunun insasi için benzersiz insan A-K hibrid hedefleme vektörleri yapmak için kullanilan hedefleme ve moleküler mühendislik asamalarinin genel bir gösterimini (blçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 25A, 40 hV A gen segmenti ve endojen C A2 genine islevsel olarak bagli bir tek hJ A gen segmenti içeren modifiye bir fare A hafif zincir lokusu için lokus yapisinin genel bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 258 40 hV A gen segmenti ve endojen CK genine islevsel olarak bagli bir bitisik insan VK-JK genomik sekansi olan ya da olmayan bir ya da dört hJ A gen segmenti içeren döit bagimsiz, modifiye edilmis fare K hafif zincir lokusu için lokus yapisinin genel bir gösterimini (ölçeklendirilmemistir) sergilemektedir. Sekil 26A vahsi tip bir fare (WT), bir insan VK-JK genomik dizisi (12hV A-VKJK-4hJ A) içeren 12 hV A ve dört hJ A gen segmenti için homozigot bir fare ve 40 hV A ve bir hJ A gen segmenti (40hV A-1 hJ A) için homozigot birfareden, CD19 + 'de kapilanan lg A + ve IgK + splenositlerinin kontur grafiklerini göstermektedir. içeren 12 hV A ve dört hJ )\ gen segmenti için homozigot bir fare ve 40 hV A ve bir hJ A gen segmenti (40hV A-1 hJ A) için homozigot bir fareden hasat edilen dalaklarda toplam CD19 + B hücresi sayisini göstermektedir. Sekil 27A, üst panelde, vahsi tip bir fare (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansi da (40hV A-VKJK-4hJ A) dahil olmak üzere 40 hV A ve dört J A gen segmenti için homozigos olan bir fareden B ve T hücreleri için (sirasiyla CD19 + ve CD3 +) singletlerde kapilanan ve boyanan splenositlerin kontur grafikleri gösterilmektedir. Alt panel, vahsi tip bir fare (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansi da (40hV A-VKJK- 4hJ A) dahil olmak üzere 40 hV A ve dört J A gen segmenti için homozigos olan bir fareden lg / A* ve ng+ ekspresyonu için CD19+7de kapilanan ve boyanan splenositlerin kontur grafikleri gösterilmektedir. Sekil 27B, vahsi tip fareler (WT) ve 40 hV A ve bir insan VK-JK genomik sekansi (40hV A-VKJK-4hJ A) içeren d'ort J A gen segmenti için homozigot farelerin dalaklarindan hasat edilen CD19 +, CD19 + IgK + ve CD19 + lg A + B hücrelerinin toplam sayisini göstermektedir. Sekil 27C, vahsi tip bir fare (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansi da (40hV A- VKJK-4hJ A) dahil olmak üzere 40 hV A ve dört J A gen segmenti için homozigos olan bir fareden immünoglobulin D (lgD) ve immünoglobulin M (lgM) için CD19+tde kapilanan ve boyanan splenositlerin kontur grafikleri gösterilmektedir. Olgunlasmis için 22) B hücreleri kontur grafiklerinin her birinde belirtilmistir. Sekil 27D, vahsi tip fareler (WT) ve 40 hV A ve bir insan VK-JK genomik sekansi (40hV A-VKJK-4hJ A) içeren dört J A gen segmenti için homozigot farelerin dalaklarindan hasat edilen CD19 + B hücreleri, geçisli B hücreleri (CD19 + göstermektedir. Sekil 28A, üst panelde, vahsi tip bir fare (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansi da (40hV A- VKJK-4hJ A) dahil olmak üzere 40 hV A ve dört J /\ gen segmenti için homozigos olan bir fareden B ve T hücreleri için (sirasiyla CD19 + ve CD3 +) boyanan kemik iliginin kontur grafikleri gösterilmektedir. Alt panel, vahsi tip bir fare (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansi da (40hV A-VKJK-4hJ A) dahil olmak üzere 40 hV A ve dört J A gen segmenti için homozigos olan bir fareden ckit+ ve co43+ ekspresyonu için co19+tda kapilanan ve boyanan kemik iliklerinin kontur grafikleri gösterilmektedir. Pro ve Pre B hücreleri, alt panelin kontur grafikleri üzerinde belirtilmistir. Sekil 28, vahsi tip farelerin (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansi (40hV A-VKJK- 4hJ A) içeren 40 hV A ve dört J /\ gen segmenti için homozigot farelerin femurundan hasat edilen kemik iligindeki Pro (CD19 + CD43 + ckit +) ve On (CD19 + CD43-ckit-) B hücrelerinin sayisini göstermektedir. Sekil 28C, vahsi tip bir fareden (WT) ve 40 hV A ve bir insan VK-JK genomik dizisi (40hV A-VKJK-4hJ A) içeren dört J A gen segmenti için homozigot olan bir fareden immünoglobulin M (IgM) ve 8220 için boyanmis singletlere kapilanmis kemik iliginin kontur grafiklerini göstermektedir. Olgunlasmamis, olgun ve pro / pre B hücreleri kontur grafiklerinin her birine not edilmektedir. Sekil 28, vahsi tip farelerin (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansi (40hV A-VKJK- 4hJ A) içeren 40 hV A ve dört J A gen segmenti için homozigot farelerin femurundan izole edilen kemik iligindeki olgunlasmamis (BZ20intIgM+) ve olgun (8220hilgM+) B hücrelerinin toplam sayisini göstermektedir. Sekil 28E, vahsi tip bir farenin (WT) ve bir insan VK-JK genomik sekansini (40hV A- VKJK-4hJ A) içeren 40 hV A ve dört `J /\ gen segmenti için homozigot olan bir farenin femurlarindan izole edilen, lg A ve IgK ekspresyonu için boyanmis olgunlasmamis (BZ20intlgM+) ve olgun (8220hilgM+) B hücreleri üzerinde kapilanmis kemik iliginin kontur grafiklerini göstermektedir. Sekil 29, bir endojen fare K hafif zincir lokusunda insan A hafif zincir gen sekanslarini tasiyan farelerin splenosit RNA'sindan çogaltilmis olan onsekiz bagimsiz RT-PCR klonunun V A-J A-CK junksiyonunun bir nükleotit sekans hizalamasini göstermektedir. A6 = SEKANS ID NO: 115; BG = SEKANS ID NO: 116; F6 = 131; 2-7 = SEKANS ID NO: 132. Küçük harfli bazlar, rekombinasyon esnasinda mutasyondan ve / veya N ilavesinden kaynaklanan germ hatti olmayan bazlari göstermektedir. HJ A1 ve fare CK'nin nükleotit sekansi tarafindan kodlanan Çerçeve 4 bölgesi (FWR4) içindeki konsensüs amino asitleri, sekans hizalanmasinin altinda belirtilmistir. Sekil 30, bir endojen fare K hafif zincir lokusunda bitisik insan VK-JK genomik sekansi da dahil olmak üzere insan i\ hafif zincir gen sekanslarini tasiyan farelerin splenosit RNA'sindan çogaltilmis olan oniki bagimsiz RT-PCR klonunun V A-J A-CK junksiyonunun bir nükleotit sekans hizalamasini göstermektedir. 5-2 = SEKANS ID Küçük harfli bazlar, rekombinasyon esnasinda mutasyondan ve / veya N ilavesinden kaynaklanan germ hatti olmayan bazlari göstermektedir. Her insan J A ve fare CK'nin nükleotit sekansi tarafindan kodlanan Çerçeve 4 bölgesi (FWR4) içindeki konsensüs amino asitleri, sekans hizalanmasinin altinda belirtilmistir. Sekil 31, bir endojen fare A hafif zincir Iokusunda insan A hafif zincir gen sekanslarini tasiyan farelerin splenosit RNA'sindan çogaltilmis olan üç bagimsiz RT-PCR klonunun V A-J A-C A junksiyonunun bir nükleotit sekans hizalamasini SEKANS ID NO: 161. Küçük harfli bazlar, rekombinasyon esnasinda mutasyondan ve / veya N ilavesinden kaynaklanan germ hatti olmayan bazlari göstermektedir. HJ A1 ve fare C A2'nin nükleotit sekansi tarafindan kodlanan Çerçeve 4 bölgesi (FWR4) içindeki konsensüs amino asitleri, sekans hizalanmasinin altinda belirtilmistir. AYRINTILI TARIFNAME Bu açiklama belirli yöntemler ve tarif edilen deneysel kosullarla sinirli degildir; bu gibi yöntemler ve kosullar degisebilir. Ayrica, burada kullanilan terminolojinin, sadece belirli düzenlemeleri tarif etmek için oldugu ve bu bulusun kapsami istemlerle tanimlandigi için sinirlama amaci tasimadigi anlasilmalidir. Aksi belirtilmedigi sürece, burada kullanilan tüm terimler ve ifadeler, aksi açikça belirtilmedigi sürece ya da terimin kullanildigi baglamdan açikça anlasilmadigi sürece, terimlerin ve cümlelerin teknik alanda kazanmis oldugu anlamlari içermektedir. Burada tarif edilenlere benzer ya da esdeger herhangi bir yöntem ve materyal, mevcut bulusun uygulamasinda ya da test edilmesinde kullanilabiliyor olsa da simdi belirli yöntemler ve materyaller tarif edilmektedir. kullanildiginda (örnegin, "esasen bütün" V gen segmentleri) hem islevsel hem de islevsel olmayan gen segmentlerini içermektedir ve çesitli düzenlemelerde tüm gen segmentlerinin örnegin % 80 ya da daha fazla,% 85 ya da daha fazla,% 90 ya da ya da daha fazla ya da% 99 ya da daha fazlasini kapsamaktadir; çesitli düzenlemelerde "büyük ölçüde bütün" gen segmentleri, örnegin, fonksiyonel gen segmentlerinin (yani psödojen olmayan) en az % 95,% 96,% 97,% 98 ya da % 99tunu içermektedir. sekansi, genomik sekansin Iokasyonunda bir heterolog sekans (örnegin, bir faredeki insan sekansi) ile degistirecek sekilde yerlestirilmesini içermektedir. Böyle yerlestirilen DNA sekansi, yerlestirilen sekansi elde etmek için kullanilan kaynak DNASnin bir parçasi olan bir ya da daha fazla düzenleyici sekansi içerebilir (örnegin, promotörler, arttiricilar, 5' ya da 3'-çevrilmemis bölgeler, uygun rekombinasyon sinyal sekanslari vb.). Ornegin çesitli düzenlemelerde, yer degistirme, bir gen ürününün bu sekilde yerlestirilen DNA sekansindan üretilmesiyle sonuçlanan bir heterolog dizilim ile bir endojen dizinin bir ikame edilmesidir (heterolog diziyi içerir), fakat endojen bir dizinin ekspresyonu degildir; yer degistirme, endojen genomik sekans tarafindan kodlanan bir protein ile benzer bir isleve sahip olan bir proteini kodlayan bir DNA sekansina sahip bir endojen genomik dizilimdir (örnegin, endojen genomik sekans bir immünoglobulin genini ya da alanini kodlamakta ve DNA fragmani bir ya da daha fazla insan immünoglobulin genini ya da alanini kodlamaktadir). Çesitli düzenlemelerde, bir endojen gen ya da onun bir parçasi karsilik gelen bir insan geni ya da parçasi ile degistirilmektedir. Karsilik gelen bir insan geni ya da onun bir fragmani, degistirilmis endojen gen ya da onun bir parçasinin bir ortologu ya da homologu olan ya da yapi ve / veya fonksiyonda büyük ölçüde özdesi ya da aynisi olan bir insan geni ya da fragmanidir. örnegin iki nükleik asit sekansi ayni nükleik molekül üzerinde yer almalarina ragmen baska bir nükleik asit dizisi tarafindan kesilirlerse "bitisik" kabul edilmektedirler. Ornegin, V(D)J sekansinin son kodonunu sabit bölge sekansinin birinci kodonu tarafindan hemen takip edilmese de, yeniden düzenlenmis bir V(D)J sekansi, bir sabit bölge gen sekansi ile "bitisiktir". Bir diger örnekte, iki V gen segmenti sekansi, V bölgesinin bir kodonunu kodlamayan sekanslarla ayrilabilseler de, örnegin, bir düzenleyici sekans, örnegin bir promotör ya da baska bir kodlayici olmayan sekans ile ayrilabilseler de, ayni genomik fragman üzerinde yer aldiklari sürece "bitisiktirler". Bir düzenlemede, bir bitisik sekans, bir vahsi tip genomda oldugu gibi düzenlenmis genomik sekanslari içeren bir genomik fragmani içermektedir. degisken bölge ile ilgili olarak kullanildiginda, degisken alanini ifade eden bir gen olusturmak üzere yeniden düzenlenmis olan sekansi belirli bir yeniden düzenlenmemis gen segmentine ya da gen segmentlerine geri izleme yetenegini içermektedir (uygulanabilir oldugu durumlarda, farkliliklar ve somatik mutasyonlar için geçerlidir). Bir degisken bir bölge gen segmenti ya da birlestirici gen segmenti ile ilgili olarak kullanildiginda "fonksiyonel" ifadesi, ekspres edilmis bir antikor repertuarinda kullanim anlamina gelmektedir; örnegin insanlarda V A gen segmentleri 3-1, 4-3, 2-8, vs. islevsel iken V A gen segmentleri 3-2, 3-4, 2-5, vb. islevsel degildir. Bir "agir zincir Iokusu" bir kromozom (örnegin bir fare kromozomu) üzerindeki bir konumu içermekte olup, burada, vahsi tip bir fare agir zincir degiskeninde (VH), agir zincir çesitliligi (DH), agir zincir birlesmesi (JH) ve agir zincir sabit (CH) bölgesi DNA sekanslari bulunmaktadir. Bir "K Iokusu" bir kromozom (örnegin bir fare kromozomu) üzerindeki bir konumu içermekte olup, burada vahsi tip bir farede K Degiskeni (VK), K birlesmesi (JK) ve K sabit (CK) bölgesi DNA sekanslari bulunmaktadir. Bir " A Iokusu" bir kromozom (örnegin bir fare kromozomu) üzerindeki bir konumu içermekte olup, burada vahsi tip bir farede A Degiskeni (V A), A birlesmesi (J A) ve A sabit (C A) bölgesi DNA sekanslari bulunmaktadir. Bir sekansin ekspresyonu ile baglantili olarak kullanildiginda "hücre" terimi, bir rekombinant nükleik asit sekansini ekspres etmek için uygun olan herhangi bir hücreyi içermektedir. Hücreler arasinda prokaryotlar ve ökaryotlar (tek hücreli ya da çok hücreli), bakteri hücreleri (örn., E. coli suslari, Bacillus spp., Streptomyces spp., vb.), mikobakteri hücreleri, mantar hücreleri, maya hücreleri (örn., S. cerevisiae , S. pombe, P. pastoris, P. metanolica, vb.), bitki hücreleri, böcek hücreleri (örnegin, SF- 9, SF-21, bakulovirüs ile enfekte edilmis böcek hücreleri, Trichoplusia ni, vb.), insan olmayan hayvan hücreler, insan hücreleri, B hücreleri ya da örnegin hibridomlar ya da kuadromlar gibi hücre füzyonlari yer almaktadir. Bazi düzenlemelerde hücre bir insan, maymun, insansi maymun, hamster, siçan ya da bir fare hücresidir. Bazi düzenlemelerde, söz konusu hücre ökaryotiktir ve asagidaki hücreler arasindan seçilmektedir: CHO (örnegin, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (örnegin, hücresi, miyelom hücresi, tümör hücresi ve yukarida bahsedilen bir hücreden türetilmis bir hücre soyu. Bazi düzenlemelerde, hücre bir ya da birden fazla viral gen içermektedir, örnegin bir viral geni ekspres eden bir retinal hücre (örnegin bir PER.C6TM hücresi). vahsi tip bir hayvanda) bir immünoglobulin molekülünün hafif ya da agir bir zincirinin degisken bir bölgesinde (örnegin bir antikor ya da bir T hücresi reseptörü) iki çerçeve bölgesi arasinda görülen bir organizmanin immünoglobulin genlerinin bir nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan bir amino asit sekansini içermektedir. Bir CDR, örnegin bir germ hatti sekansi ya da yeniden düzenlenmis ya da yeniden düzenlenmemis bir sekans ve örnegin bir saf ya da olgun bir B hücresi ya da bir T hücresi ile kodlanabilir. Bazi durumlarda (örnegin, bir CDR3 için) CDRiler bitisik olmayan (örnegin, yeniden düzenlenmemis bir nükleik asit sekansinda) ancak bir B hücresi nükleik asit sekansinda, örnegin sekanslarin eklenmesi ya da baglanmasi sonucunda (örnegin bir agir zincir CDR3 olusturmak için V-D-J rekombinasyonu) bitisik olan iki ya da daha fazla sekans (örnegin germline sekanslari) ile kodlanabilirler. J sekansi olusturmak için yeniden düzenlemeye (örnegin endojen rekombinazlar aracilik eder) katilabilen immünoglobülin Iokuslarinda (örnegin insanlar ve farelerde) yeniden düzenlenmemis sekanslari içeren bir V (hafif ya da agir) ya da D ya da J (hafif ya da agir) immünoglobulin gen segmentine referans içermektedir. Aksi belirtilmedigi sürece, V, D ve J segmentleri, 12 / 23 kuralina göre V / J rekombinasyonuna ya da V / D / J rekombinasyonuna izin veren rekombinasyon sinyal sekanslarini (RSS) içermektedir. Aksi belirtilmedigi sürece segmentler ayrica dogada iliskili olduklari sekanslari ya da onun fonksiyonel esdegerlerini (örnegin, V segmentleri promotörleri ve liderleri için) içermektedir. olup burada V gen segmentleri ve J gen segmentleri (agir zincirler için, D gen segmentleri de) ayri tutulmakta ancak V(D)J repertuarinin tek bir V,(D),J'sini içeren yeniden düzenlenmis bir V (D) J geni olusturmak üzere birlestirilebilmektedir. aralik" ifadesi 1-999 pikomolari ifade etmeyi amaçlamaktadir. gibi kikirdakli baliklar, amfibiler, Sürüngenler, memeliler ve kuslar gibi insan olmayan hayvanlari içermeyi amaçlamaktadir. Uygun insan disi hayvanlar memelileri içermektedir. Uygun memeliler, insan disi primatlar, keçiler, koyunlar, domuzlar, köpekler, inekler ve kemirgenleri içermektedir. Insan disi uygun hayvanlar, siçan ve fare dahil olmak 'üzere kemirgen ailesinden seçilmektedir. Bulus ile saglanan insan disi hayvanlar farelerdir. Genetik bir model olarak fare, spesifik genlerin yönlendirilen asiri ekspresyon ya da silinme 'üzerindeki etkilerinin çalisilmasina izin veren transgenik ve nakavt teknolojileri ile büyük ölçüde gelistirilmistir. Fare tüm avantajlarina ragmen hala insan hastaliklari için kusurlu bir model ve insan terapötiklerini test etmek ya da bunlari yapmak için onu kusurlu bir platform haline getiren genetik engeller sunmaya devam etmektedir. Ilk olarak, insan genlerinin yaklasik % 99'u bir fare homologuna sahip olmasina ragmen (Waterston, R.H. ve ark. (2002) lnitial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562), potansiyel terapötikler, amaçlanan insan hedeflerinin fare ortologlari ile siklikla çapraz reaksiyona girememekte ya da yetersiz bir biçimde çapraz reaksiyona girmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmek amaciyla seçilen hedef genler "insanlastirilabilir", yani fare geni, and US 7,105,348) elimine edilebilir ve degistirilebilir. Ilk olarak, fare genlerini genin bir silinmesini (yani nakavt) tasiyan bir farenin rastgele entegre edilmis bir insan transgenini tasiyan bir fare ile çaprazlanmasini gerektirmektedir (bakiniz, örnegin, Bril, W.S. ve ark. (2006) Tolerance to factor Vlll in a transgenic mouse expressing human factor Vlll cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution. Thromb characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai, D. ve ark. (2006) A humanized BAC transgenic / knockout mouse model for HbE / beta-thalassemia. Genomics epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3deIta / epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CDSgamma- and boyut sinirlamalari tarafindan engellenmekteydi ve geleneksel nakavt teknolojileri, büyük fare genlerini, büyük insan genomik karsiliklari ile dogrudan degistirmek için yeterli degildi. Bir endojen fare geninin, ayni kesin genetik lokasyonda (yani, endojen fare Iokusunda) insan muadili gen tarafindan dogrudan degistirildigi dogrudan homolog replasmana basit bir yaklasim teknik zorluklar nedeniyle nadiren denenmistir. Simdiye kadar, dogrudan replasman cabalari ayrintili ve külfetli prosedürler içermekteydi ve bu nedenle de kullanilabilecek genetik materyalin uzunlugunu ve manipüle edilebilecegi hassasiyeti sinirlandirmaktaydi. Disaridan sokulan insan immünoglobulin transgenleri farelerde prekürs'or B hücrelerinde yeniden düzenlenmektedir (Alt, F.W., Blackwell, T.K., and Yancopoulos, Bu bulgu, insan antikorlarini ekspres etmek için nakavt arti transgenik yaklasimi kullanan tasarlanmis fareler tarafindan kullanilmaktadir (Green, L.L. ve ark. (1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human lg heavy and light chain YACs. Nat Genet 7, 13-21; Lonberg, N. (2005). Human ark. (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from zinciri ve K hafif zincir Iokuslari, her bir endojen lokusun küçük fakat kritik kisimlarinin hedefli olarak silinmesi ve ardindan insan immünoglobulin gen lokuslarinin yukarida tanimlandigi gibi rastgele bütünlesmis büyük transgenler ya da minikromozomlar olarak dahil edilmesi ile bu farelerde etkisiz hale getirilmistir (Tomizuka, K. ve ark. (2000) Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing lg heavy and kappa Ioci and expression of fully human antibodies. Proc Natl Acad Sci U 8 A 97, 722-727). Bu gibi fareler genetik mühendisliginde önemli bir gelismeyi temsil etmekteydi; bunlardan izole edilen tamamen insan monoklonal antikorlari, çesitli insan hastaliklarinin tedavisi için umut verici bir terapötik potansiyel sunmustur (Gibson, T.B. ve ark. (2006) Randomized phase Ill trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase Il studies in refraotory cutaneous T-cell Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte- associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I / II study. Ann Surg Oncol postmenopausal women with low bone mineral density. N Engl J Med 354, 821-831). Ancak, yukarida da tartisildigi gibi söz konusu fareler, vahsi tip farelere kiyasla riskli bir B hücresi gelisimi ve immün yetmezlikleri sergilemektedir. Bu gibi problemler potansiyel olarak farelerin kuvvetli bir hümoral yanit verme kabiliyetini sinirlandirmakta ve sonuç olarak bazi antijenlere karsi tamamen insan antikorlari üretmektedir. Yetersizlikler sunlardan kaynaklaniyor olabilir: (1) insan immünoglobulin transgenlerinin rastgele uygulanmasindan dolayi verimsiz islevsellik ve bunun sonucunda ortaya çikan yukari ve asagi kontrol elemanlarinin eksikliginden dolayi yanlis ekspresyon (Garrett, F.E. ve ark. (2005) Chromatin architecture near a potential 3' end of the igh Iocus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites. Mol Cell Biol 25, mouse Igh Iocus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with ile B-resept'orü sinyal kompleksinin hücre yüzeyi üzerindeki fare bilesenleri arasinda, B hücrelerinin normal olgunlasmasi, çogalmasi ve yasamasi için gerekli olan sinyal islemlerini olumsuz etkileyebilecek verimsiz türler arasi etkilesimler (Hombach, J. ve ark. (1990) Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the lgM reseptörleri arasinda, afinite seçimini (Rao, S.P. ve ark. (2002) Differential expression of the inhibitory IgG Fe receptor FcgammaRlIB on germinal center cells: immünoglobulin serum konsantrasyonlarini azaltabilecek verimsiz türler arasi etkilesimler (Brambell, F.W. ve ark. (1964). A Theoretical Model of Gamma-Globulin The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing ve ark., 2002; Hjelm, F. ve ark. (2006) Antibody-mediated regulation of the immune response. Scand J Immunol 64, 177-184; Nimmerjahn, F., and Ravetch, J.V. eksiklikler, endojen agir ve hafif zincir lokuslarinda dogal konumlarinda sadece fare immünoglobulin lokuslarinin degisken bölgelerinin in situ hümanizasyonuyla düzeltilebilir. Bu da, tutulan fare sabit bölgelerine dayali olarak fare ortami ile normal etkilesim ve seçim kapasitesine sahip olan "ters kimerik" (yani, insan V: fare C) antikorlari yapan farelerle sonuçlanmaktadir. Ayrica bu gibi ters kimerik antikorlar, terapötik amaçlar için tamamen insan antikorlarina kolayca yeniden biçimlendirilebilirler. Endojen immünoglobulin agir zincir Iokusunda heterolog (örnek olarak, baska bir türden) immünoglobulin sekanslarinda bir replasman içeren genetigi degistirilmis hayvanlar, endojen immunoglobulin hafif zincir lokuslarinda ya da immünoglobulin hafif zincirli transgenlerle baglantili olarak replasmanlarla yapilabilir (örnek olarak, kimerik immunoglobulin hafif zincir transgenleri ya da tamamen insan tamamen fare gibi). Heterolog immünoglobulin agir zincir sekanslarinin türetildigi türler genis ölçüde degisebilir; immünoglobulin hafif zincir sekans degistirmelerinde ya da immünoglobulin hafif zincir transgenlerinde kullanilan immünoglobulin hafif zincir sekanslarinda oldugu gibi. Immünoglobulin degisken bölge nükleik asit sekanslari, örnek olarak V, D ve / veya J segmentleri, bir insandan ya da insan disi bir hayvandan elde edilmektedir. V, D ve/ veya J segmentleri saglamaya uygun insan disi hayvanlar arasinda kemikli balik, köpekbaliklari ve kedi baliklari gibi kikirdakli baliklar, amfibiler, Sürüngenler, memeliler, kuslar (örnek olarak tavuklar) yer almaktadir. Insan disi hayvanlar örnek olarak memelileri içermektedir. Memeliler arasinda örnek olarak insan disi primatlar, keçiler, koyunlar, domuzlar, köpekler, sigirlar (örnek olarak inek, boga, buffalo), geyikler, develer, dag gelincikleri ve kemirgenler ve insan disi primatlar (örnek olarak sempanzeler, orangutanlar, goriller, marmosetler, makaklar, babunlar) yer almaktadir. Uygun insan disi hayvanlar, siçanlar, fareler ve hamsterler dahil olmak üzere kemirgen familyasindan seçilmektedir. Bir düzenlemede, insan disi hayvanlar farelerdir. Metinden açikça anlasildigi üzere, çesitli insan disi hayvanlar degisken alanlarin kaynaklari ya da degisken bölge gen segmentlerinin kaynagi olarak kullanilabilmektedir (örnek olarak köpekbaliklari, kedi baliklari, memeliler (örnek olarak, develer, fareler ve siçanlar gibi kemirgenler). Metinden açikça anlasildigi üzere, insan disi hayvanlar ayrica degisken sekanslar ya da segmentlerle baglantili olarak kullanilacak sabit bölge sekanslarinin kaynagi olarak da kullanilmaktadir, örnek olarak, kemirgen sabit sekanslari, insan ya da insan disi degisken sekanslara islevsel olarak bagli transgenlerde kullanilabilir (örnek olarak kemirgen, örnek olarak fare ya da siçan ya da hamster sabit sekanslara islevsel olarak baglanmis insan ya da insan disi primat degisken sekanslar). Bu nedenle, çesitli düzenlemelerde, insan V, D ve /veya J segmentleri, kemirgen (örnek olarak fare ya da siçan ya da hamster) sabit bölge gen sekanslarina islevsel bir sekilde baglanmaktadir. Bazi düzenlemelerde, insan V, D ve / veya J segmentleri (ya da bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmis VDJ ya da VJ genleri) islevsel olarak içinde bir fare, siçan ya fa hamster sabit bölge gen sekansina baglanir ya da kaynasir, örnek olarak bir endojen immünoglobulin lokusu olmayan bir lokusta entegre bir transgen. Ayrica bir ya da daha fazla insan VH, DH ve JH segmenti olan bir endojen immünoglobulin agir zincir lokusunda VH, DH ve JH gen segmentlerinin replasmanini içeren bir fare açiklanmakta olup, burada bir ya da daha fazla insan VH, DH ve JH segmenti, endojen bir immünoglobulin agir zincir sabit genine islevsel olarak baglanmakta olup; burada fare, endojen bir immünoglobülin lokusundan baska bir lokusta bir transgen içermekte olup; buradaki transgen yeniden düzenlenmemis ya da yeniden düzenlenmis, bir fare ya da siçan ya da insan sabit bölgesine islevsel olarak baglanmis insan VL ve insan JL segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, bir ya da daha fazla insan VH, DH ve JH gen segmentinin bir endojen immünoglobulin agir zincir lokusuna eklenmesini içeren bir fare saglanmaktadir. Bir düzenlemede, insersiyon bir endojen immunoglobulin agir zincir sabit geminin yukari yönündedir; bir düzenlemede insersiyon bir endojen degisken (V) gen segmentinin asagi yönündedir; bir düzenlemede insersiyon bir endojen çesitlilik (D) gen segmentinin asagi yönündedir; bir düzenlemede insersiyon bir endojen birlestirme (J) gen segmentinin asagi yönündedir. Çesitli düzenlemelerde insersiyon, bir ya da daha fazla insan VH, DH ve JH gen segmentinin, bir ya da daha fazla endojen agir zincir sabit geni ile islenebilir baglantida konumlandirildigi sekildedir. Farelerin yavru üretme kabiliyetini korurken, fare germ hatti immünoglobülin degisken gen Iokuslarinin insan germ hatti immünoglobülin degisken gen Iokuslariyla in situ genetik olarak degistirilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Spesifik olarak, fare sabit bölgeleri bozunmadan kalirken, hem fare agir zincirinin hem de K hafif zincir immünoglobülin degisken gen Iokuslarinin alti megabazinin, bunlarin insan benzerleri ile tam olarak replasmani açiklanmaktadir. Sonuç olarak, fare sabit bölgeleri korunurken, tüm germ hatti immünoglobülin degisken repertuarlari esdeger insan germ hatti immünoglobülin degisken sekanslari ile tam olarak degistirilmis olan fareler olusturulmustur. Insan degisken bölgeleri, fizyolojik olarak uygun seviyelerde yeniden düzenleyen ve eksprese eden kimerik insan-fare immünoglobulin Iokuslari olusturmak için fare sabit bölgelerine baglanmaktadir. Eksprese edilen antikorlar "ters kimeralar"dir, yani bunlar insan degisken bölge sekanslari ve fare sabit bölge sekanslari içermektedir. Insan degisken bölgelerine ve fare sabit bölgelerine sahip antikorlari ekspres eden insanlastirilmis immünoglobülin degisken bölgelerine sahip olan bu farelere VELOCIMMUNE® fareleri denilmektedir. VELOCIMMUNE® insanlastirilmis fareler, vahsi tip farelerden esasen ayirt edilemeyen tamamen islevsel bir humoral bagisiklik sistemi sergilemektedir. B hücresi gelisiminin tüm asamalarinda normal hücre popülasyonlari göstermektedir. Normal Ienfoid organ morfolojisi sergilemektedir. VELOCIMMUNE® farelerinin antikor sekanslari, normal V(D)J yeniden düzenlemesi ve normal somatik hipermutasyon frekanslari sergilemektedir. Bu farelerdeki antikor popülasyonlari, normal sinif degisiminden kaynaklanan (örnek olarak normal izotip cis-degisimi) izotip dagilimlarini yansitmaktadir. VELOCIMMUNE® farelerine bagisiklik kazandirma, terapötik adaylar olarak uygun insan immünoglobülin degisken alanlarina sahip büyük, çesitli antikor repertuarlari üreten saglam humoral immün yanitlarla sonuçlanmaktadir. Bu platform, farmasötik olarak kabul edilebilir antikorlar ve diger antijen baglayici proteinler yapmak için bol miktarda dogal afinite ile olgunlastirilmis insan immünoglobülin degisken bölge sekanslari kaynagi saglamaktadir. Fare immünoglobulin degisken sekanslarinin, insan immünoglobulin degisken sekanslari ile tam olarak degistirilmesi, VELOCIMMUNE® farelerinin yapilmasina olanak saglamaktadir. Yine de, agir ve hafif zincir Iokuslarda endojen fare immünoglobulin sekanslarinin, çok büyük insan immünoglobulin sekanslarinin sirali rekombinasyonu ile esdeger insan immünoglobülin sekanslariyla kesin bir replasmani, fare ve insan arasinda immünoglobulin lokuslarinin farkli evrimi nedeniyle belirli zorluklar ortaya çikarabilir. Ornek olarak, immünoglobulin lokuslari içine serpistirilmis intergenik sekanslar fareler ve insanlar arasinda ayni degildir ve bazi durumlarda fonksiyonel olarak esdeger olmayabilir. Fareler ve insanlar arasindaki immünoglobülin lokuslarindaki farkliliklar, özellikle endojen fare immünoglobülin agir zincir lokuslarinin belirli kisimlarini hümanize ederken ya da manipüle ederken, hümanize farelerde anormalliklere neden olabilir. Fare immünoglobulin agir zincir lokuslarindaki bazi modifikasyonlar zararlidir. Zararli modifikasyonlar arasinda örnek olarak farelerin yavru olusturma ve üretme kabiliyetlerinin kaybi yer almaktadir. Çesitli düzenlemelerde, bir farenin genomunda insan immünoglobülin sekanslarinin mühendisligi, modifiye edilmis fare suslarinda mevcut olmadiginda zararli olan endojen sekanslari koruyan yöntemler içermektedir. Ornek niteliginde zararli etkiler, modifiye edilmis suslarin çogaltilmamasini, temel genlerin fonksiyon kaybini, polipeptitleri eksprese etmemeyi ve benzerlerini içerebilir. Bu gibi zararli etkiler, farenin genomunda tasarlanan modifikasyon ile dogrudan ya da dolayli olarak iliskili olabilir. Tüm fare sabit zincir genleri ve lokus transkripsiyonel kontrol bölgeleri dahil komsu fare sekanslarini hibrit Iokuslar içinde saglam ve islevsel birakilirken, farenin agir ve hafif zincir immünoglobulin lokuslarinin (VHDHJH ve VK-JK) degisken bölgelerinin alti megabazinin, karsilik gelen 1.4 megabaz insan genomik sekanslari ile hassas, büyük ölçekli, in situ replasmani yürütülmüstür (Sekil 1A ve Sekil 18). Spesifik olarak, insan VH, DH, JH, VK ve JK gen sekanslari, VELOCIGENE® genetik mühendisligi teknolojisi kullanilarak insan germ hatti degisken lokuslarinin üst üste binen fragmanlarini tasiyan fare ES hücrelerine yerlestirilen 13 kimerik BAC hedefleme vektörünün kademeli olarak yerlestirilmesi yolu ile eklenmistir (bkz, örnek olarak, engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659). Fare immünoglobulin genlerinin insanlastirilmasi, bugüne kadar fare genomunda en büyük genetik modifikasyonu temsil etmektedir. Rastgele entegre edilmis insan immünoglobülin transgenleri ile ilgili önceki çabalar bir miktar basari ile sonuçlanirken (yukarida tartisilmistir), fare immünoglobulin genlerinin insan benzerleri ile dogrudan degistirilmesi, tamamen insan antikorlarinin, baska türlü normal farelerde verimli bir sekilde üretilebilme verimliligini önemli ölçüde arttirmaktadir. Ayrica, bu tür fareler, engelli endojen Iokuslar ve tamamen insan antikor transgenlerini tasiyan farelere kiyasla, hemen hemen her antijen ile immünizasyondan sonra elde edilebilecek tamamen insan antikorlarinin dramatik bir sekilde artmis çesitliligini göstermektedirler. Degistirilen, hümanize lokuslarin çoklu versiyonlari, farklilasma asamalarinda önemli ölçüde azalmis B hücre popülasyonlari sergileyen, rastgele entegre edilmis insan transgenlerine sahip farelerin aksine, normal seviyelerde olgun ve olgunlasmamis B hücrelerinin tam seviyelerini göstermektedirler. Insan transgenik farelerinde insan gen segmentlerinin sayisini arttirma çabalari bu gibi kusurlari azaltmis olsa da, genislemis immünoglobulin repertuarlari, B tipi popülasyonlarda vahsi tip farelere kiyasla tamamen düzeltilmis bir azalmaya sahip degildir. Degistirilmis immünoglobülin Iokuslarina sahip farelerde (yani VELOCIMMUNE® farelerinde) gözlenen neredeyse vahsi tip humoral immün fonksiyonuna ragmen, rastgele olarak entegre edilmis transgenleri kullanan bazi yaklasimlarda karsilasilmayan immünoglobülinin dogrudan replasmani kullanilirken karsilasilan baska zorluklar vardir. Fareler ve insanlar arasinda immünoglobülin Iokuslarinin genetik kompozisyonundaki farkliliklar, degistirilmis immünoglobülin gen segmentleri ile farelerin çogaltilmasi için faydali sekanslarin kesfedilmesine yol açmistir. Spesifik olarak, endojen immünuglobülin Iokus içinde bulunan fare ADAM genleri, fertilite içerisindeki rollerinden ötürü, degistirilmis immünoglobulin Iokuslarina sahip farelerde optimal olarak bulunur. Fare ADAM6,nin Genomik Lokasyonu ve Fonksiyonu Herhangi bir fonksiyonel ADAM6 proteinini eksprese etme kabiliyetine sahip olmayan erkek fareler, sasirtici bir sekilde farelerin çiftlesme ve yavru üretme kabiliyetinde bir kusur sergiler. Fareler, t'um ya da büyük ölçüde bütün fare immünoglobulin degisken bölge gen segmentlerinin insan degisken bölge gen segmentleri ile degistirilmesi nedeniyle fonksiyonel bir ADAM6 proteinini eksprese etme kabiliyetinden yoksundur. ADAM6 fonksiyonunun kaybi, ADAM6 lokusunun, DH gen segmentlerinin yukarisindaki VH gen segmenti lokusunun 3' ucuna yakin olan, endojen fare immünoglobulin agir zincir degisken bölge gen lokusu bir bölgesi içinde bulunmasi nedeni ile sonuçlanmaktadir. Insan agir zincir degisken gen segmentleri ile bütün ya da büyük ölçüde bütün endojen fare agir zincir degisken gen segmentlerinin replasmani için homozigot olan fareleri üretmek amaciyla, replasman için her biri homozigot olan erkekleri ve disileri ayarlamak ve üretken bir çiftlesme beklemek genellikle hantal bir yaklasimdir. Basarili dogumlarin frekansi ve boyutu düsüktür. Bunu yerine, replasman için heterozigoz olan progenleri üretmek üzere, replasman için heterozigot olan erkekler, replasman için homozigot disi eslesmek için kullanildi, ardindan bundan homozigot bir fare üretildi. Bulus sahipleri, erkek farelerde dogurganlik kaybinin muhtemel nedeninin, fonksiyonel bir ADAM6 proteininin homozigot erkek farelerinde bulunmamasi oldugunu tespit etmistir. Birçok anlamda, hasarli (yani, islevsel olmayan ya da marjinal olarak islevsel) bir ADAM6 genini içeren erkek fareler, dogurganlikta bir azalma ya da eliminasyon göstermektedir. Farelerde (ve diger kemirgenlerde), ADAM6 geni, immünoglobulin agir zincir lokusunda bulundugu için, bulus sahipleri fareleri çogaltmak ya da degistirilmis bir immünoglobülin agir zincir Iokusu içeren bir fare susu olusturmak ve sürdürmek için çesitli modifiye edilmis üreme ya da çogaltma semalarinin kullanildigini belirlemistir. Endojen immünoglobülin agir zincir degisken gen lokusunun replasmani için erkek fareler homozigotlarinin düsük dogurganligi ya da kisirligi, bir fare susunda böyle bir modifikasyonun yapilmasini zorlastirir. Susun sürdürülmesi, replasman için erkek fare homozigotunun gösterdigi kisirlik problemlerinden kaçinmayi içermektedir. Burada tarif edildigi gibi bir fare susunun devamliligini saglamak için bir yöntem açiklanmaktadir. Fare susu, bir ektopik ADAM6 sekansi içermez ve çesitli düzenlemelerde, fare susu ADAMG'nin nakavt edilmesi (örnek olarak islevsel bir nakavt) için homozigot ya da heterozigottur. Fare susu, bir erkek farede dogurganlikta azalma ya da kisirlik ile sonuçlanan endojen bir immünoglobülin agir zincir lokusunun bir modifikasyonunu içerebilir. Modifikasyon, bir ADAM6 geninin bir düzenleyici bölgesinin ve / veya bir kodlama bölgesinin delesyonunu içerebilir. Modifikasyon, modifikasyonu içeren bir erkek farenin dogurganligini azaltan ya da ortadan kaldiran bir endojen ADAMG geninin (düzenleyici ve / veya kodlama bölgesi) modifikasyonunu içerebilir; modifikasyon, modifikasyon için homozigot olan erkek bir farenin dogurganligini azaltabilir ya da ortadan kaldirabilir. Fare susu, ADAM6 geninin nakavti (örnek olarak islevsel bir nakavt) ya da delesyonu için homozigot ya da heterozigot olabilir. Fare susu, bir hücrenin modifikasyon için homozigot ya da heterozigot olan bir fareden izole edilmesi ve konakçi embriyosunda donör hücrenin kullanilmasi ve bir tasiyici annenin bir konakçi embriyo ve donör hücresine gestasyonu ve tasiyici anneden genetik modifikasyonu içeren bir neslin elde edilmesi ile muhafaza edilebilir. Bir düzenlemede donör hücresi bir ES hücresidir. Donör hücresi, örnek olarak uyarilmis bir pluripotent hücre gibi bir pluripotent hücre olabilir. Fare susu, modifikasyon içeren bir nükleik asit sekansinin modifikasyon için homozigot ya da heterozigot olan bir fareden izolasyonu ve nükleik asit sekansinin konakçi bir çekirdege sokulmasi ve nükleik asit sekansi ve konakçi çekirdegini içeren bir hücrenin uygun bir hayvanda gestasyonu ile muhafaza edilebilir. Nükleik asit sekansi, bir konakçi oosit embriyosuna sokulabilir. Fare susu, bir çekirdegin modifikasyon için homozigot ya da heterozigot olan bir fareden izolasyonu ve çekirdegin konakçi bir hücreye sokulmasi ve modifikasyon için homozigot ya da heterozigot bir progen elde etmek için çekirdek ve konakçi hücrenin uygun bir hayvanda gestasyonu ile muhafaza edilebilir. Fare susu, genetik modifikasyon içeren bir erkek fareden bir sperm kullanilarak bir disi farenin (vahsi tip, modifikasyon için homozigot ya da modifikasyon Için heterozigot) in vitro fertilizasyonu (IVF) kullanilarak muhafaza edilebilir. Erkek fare, genetik modifikasyon için heterozigot olabilir. Erkek fare, genetik modifikasyon için homozigot olabilir. Fare susu, genetik modifikasyon içeren bir progen elde etmek için bir disi fare ile genetik modifikasyon için heterozigot olan bir erkek farenin çiftlestirilmesi, genetik modifikasyon içeren bir erkek ve bir disi progenin tanimlanmasi ve genetik modifikasyon içeren progen elde etmek için genetik modifikasyon için vahsi tip, homozigot ya da heterozigot olan bir disi ile genetik modifikasyon için heterozigot olan bir erkegin çiftlestirilmesi ile muhafaza edilebilir. Vahsi tip bir disi, genetik modifikasyon için heterozigot bir disi ya da genetik modifikasyon için homozigot bir disi ile genetik modifikasyon için heterozigot olan bir erkegin çiftlestirilme basamagi, fare susunda genetik modifikasyonu muhafaza etmek için tekrar edilebilir. Susta genetik modifikasyonu muhafaza etmek için üretilen heterozigot erkek farelerin elde edilmesi için fare susunun üretilmesini içeren, bir endojen immünoglobülin agir zincir degisken gen lokusu ile bir ya da fazla insan immünoglob'ulin agir zincir sekansinin replasmanini içeren bir fare susunun muhafaza edilmesi için bir yöntem açiklanmaktadir. Susun, bir homozigot erkegin, bir vahsi tip disinin ya da genetik modifikasyon için homozigot ya da heterozigot bir disi ile 'üretilmesi ile muhafaza edilmesine gerek yoktur. ADAM6 proteini, ADAM protein ailesinin bir üyesidir; burada ADAM bir disintregrin ve metalloproteazin kisalmasidir. ADAM protein ailesi, h'ücre adezyonu dahil olmak spermatogenez ve fertilizasyon ile ilgilidir. Ornek olarak ADAM2, sperm-yumurta etkilesimlerinde yer alan protein fertilin alt ünitesini kodlamaktadir. ADAM3 ya da kritestin, zona pellusidatya sperm baglanmasi için gerekli görünmektedir. ADAM2 ya da ADAMßiün olmamasi kisirliga neden olmaktadir. ADAM2, ADAM3 ve ADAMö'nin fare sperm hücrelerinin yüzeyinde bir kompleks olusturdugu tahmin edilmektedir. Normalde insan VH gen segmentleri VH1-2 ve VH6-1 arasinda bulunan insan ADAM6 geni, bir yalanci gen gibi görünmektedir (Sekil 12). Farelerde, fare VH ve DH gen segmentleri arasinda bir intergenik bölgede bulunan ADAM6a ve ADAM6b olmak 'üzere iki ADAMB geni bulunmaktadir ve farede, ADAM6a ve ADAM6b genleri, çevresindeki immünoglobulin gen segmentlerinin ters transkripsiyonel oryantasyonuna yönlendirilmektedir (Sekil 12). Farelerde normal döllenme için islevsel bir ADAM6 Iokusu gerekli görünmektedir. Fonksiyonel ADAM6 Iokus ya da sekansi, bu durumda eksik ya da fonksiyonel olmayan endojen ADAM6 Iokuslarina sahip erkek farelerde sergilenen, büyük ölçüde azaltilmis fertilizasyonu tamamlayabilen ya da kurtarabilen bir ADAM6 Iokusunu ya da sekansini belirtmektedir. ADAMöa ve ADAM6b'yi kodlayan, intergenik sekansin farelerde pozisyonu, endojen bir fare agir zincirini degistirirken modifikasyona duyarli intergenik diziyi olusturmaktadir. VH gen segmentleri silindiginde ya da degistirildiginde ya da DH gen segmentleri silindiginde ya da degistirildiginde, farenin dogurganliginda ciddi bir eksikligin meydana gelme olasiligi yüksektir. Eksikligi telafi etmek için, Fare, endojen fare ADAM6 lokusunun bir modifikasyonundan dolayi ADAM6 aktivitesindeki kaybi tamamlayacak bir proteini kodlayan bir nükleotit sekansi içerecek sekilde modifiye edilmistir. Çesitli düzenlemelerde, tamamlayici nükleotit sekansi, bir fare ADAMöa'yi, bir fare ADAMöb'yi ya da dogurganlik eksikligini düzelten bir homolog ya da ortolog ya da fonksiyonel fragmanini kodlayan sekanstir. Ayrica islevsel bir endojen agir zincir degisken bölgesini kodlamak için yeniden düzenlenemeyen fare ADAM6 lokusunu çevreleyen endojen immünoglobülin agir zincir sekanslari olusturulurken, endojen ADAM6 lokusunu korumak için yöntemler de açiklanmaktadir. Ornek alternatif yöntemler arasinda, endojen immünoglobülin agir zincir degisken bölge lokuslarini endojen agir zincir sabit bir gene islevsel olarak bagli bir fonksiyonel agir zincir degisken bölgesini kodlamak için yeniden düzenlenemeyecek sekilde yerlestiren fare kromozomlarinin büyük bölümlerinin manipülasyonu yer almaktadir. Yöntemler, endojen immünoglobülin agir zincir gen segmentleri içeren fare kromozomal fragmanlarinin inversiyonlarini ve /veya translokasyonlarini içerebilir. Fertiliteyi artiran nükleotid sekansi, uygun hücrelerde ve / veya dokularda, örnek olarak üreme dokularinda en uygun ekspresyonu kolaylastirmak için indüklenebilir bir promotör ile birlestirilebilir. Ornek niteliginde olan indüklenebilir promotörler, fiziksel (örnek olarak isi sok promotörü) ve / veya kimyasal (örnek olarak IPTG ya da Tetrasiklin) tarafindan aktiflestirilen promotörleri içermektedir. Ayrica, nükleotid sekansinin ekspresyonu, spesifik gelisim asamalarinda ya da spesifik dokularda ekspresyonu saglamak için diger genlere baglanabilir. Bu ekspresyon, nükleotit sekansini, gelisimin spesifik bir asamasinda eksprese edilen bir genin promotörü ile islevsel bir baglantiya sokmak suretiyle gerçeklestirilebilir. Ornek olarak, bir konakçi türün genomunda tasarlanan bir türden immünoglobulin sekanslari, konakçi türlerden bir CD19 geninin (bir B hücresine özgü gen) bir promotör sekansi ile uygulanabilir bir baglantida bulunmaktadir. Immünoglobülinlerin eksprese edildigi kesin gelisim asamalarinda B hücresi spesifik ekspresyonu elde edilmektedir. Ayrica, nükleotid sekansinin ekspresyonu, spesifik gelisim asamalarinda ya da spesifik dokularda ekspresyonu saglamak için diger genlere baglanabilir. Bu ekspresyon, nükleotit sekansini, gelisimin spesifik bir asamasinda eksprese edilen bir genin promotörü ile islevsel bir baglantiya sokmak suretiyle gerçeklestirilebilir. Ornek olarak, bir konakçi türün genomunda tasarlanan bir türden immünoglobulin sekanslari, konakçi türlerden bir CD19 geninin (bir B hücresine özgü gen) bir promotör sekansi ile uygulanabilir bir baglantida bulunmaktadir. Immünoglobülinlerin eksprese edildigi kesin gelisim asamalarinda B hücresi spesifik ekspresyonu elde edilmektedir. Yerlestirilen nükleotit sekansinin güçlü ekspresyonunu elde etmek için yine bir baska yöntem, bir kurucu promotör kullanmaktir. Ornek niteliginde olan kurucu promot'orler SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK ve CAGGtyi içermektedir. Benzer bir sekilde, istenilen nükleotit sekansi, nükleotit sekansi tarafindan kodlanan proteinlerin yüksek düzeyde ekspresyonunu saglayan seçilmis bir kurucu promotör ile islevsel baglantiya yerlestirilir. degistirmeyi ya da bir yerlestirmeyi içermesi amaçlanmaktadir (Örnek olarak, bir pozisyondaki nükleik asitin, vahsi tip bir farede bulunan nükleik asit sekansi ile ayni pozisyonda olmamasi). Terim, nesnesinin normal ya da uygun konumundan çikmasi anlaminda kullanilmaktadir. Ornek olarak, "bir ektopik nükleotit sekansi kodlayan..." ifadesi, normal olarak farede karsilasilmayan bir konumda görünen bir nükleotit sekansi anlamina gelmektedir. Ornek olarak, bir fare ADAM6 proteinini kodlayan ektopik bir nükleotit sekansi durumunda (ya da erkek farelerde ayni ya da benzer fertilite faydasini saglayan bir ortologu ya da homologu ya da fragmani), sekans normalde vahsi tip bir farede bulundan farkli bir pozisyonda farenin genomuna yerlestirilebilir. Bu gibi durumlarda, fare sekansinin yeni sekans kavsaklari, sekansi, vahsi tip farede bulunandan daha farkli bir pozisyonda farenin genomuna yerlestirerek olusturulacaktir. Bir fare ADAMö'nin fonksiyonel bir homologu ya da ortologu, bir ADAM6-1 faresinde gözlenen, fertilite kaybinin (örnek olarak, erkek bir farenin çiftlesme yoluyla yavru üretme kabiliyetini kaybetmesi) kurtarilmasini saglayan bir sekanstir. Islevsel homologlar ya da ortologlar, en az yaklasik % 89 benzerlige sahip proteinleri içerir, 'Örnek olarak ADAMöa'nin amino asit sekansina ve /veya ADAMöbtnin amino asit sekansina % 993 kadar benzerlik, ve bu ADAMGa ve / veya ADAMöb'nin delesyonunu ya da nakavtini içeren bir genotipe sahip bir farenin basarili bir sekilde çiftlesme yetenegini tamamlayabilir ya da kurtarma kabiliyetine sahiptir. Ektopik pozisyon herhangi bir yerde (örnek olarak, bir fare ADAM6 sekansini içeren bir transgenin rastgele eklenmesinde oldugu gibi) ya da örnek olarak vahsi tip bir faredeki yerine yaklasan (ancak tam olarak ayni olmayan) bir pozisyonda olabilir (örnek olarak, modifiye edilmis bir endojen fare immünoglobülin Iokusunda, ancak dogal pozisyonunun yukarisinda ya da asagisinda, örnek olarak modifiye edilmis bir immünoglobülin Iokusu içinde ancak farkli gen segmentleri arasinda ya da bir fare V- D intergenik sekansta farkli bir pozisyonda). Ektopik yerlesime bir örnek, normal olarak endojen immünoglobulin agir zincir lokusu içinde bulunan vahsi tip farelerde bulunan pozisyonun korunmasini saglarken, çevreleyen endojen agir zincir gen segmentleri, endojen bir agir zincir sabit bölgesi içeren fonksiyonel bir agir zinciri kodlamak için yeniden düzenlenebilir. Bu örnekte, bu endojen immünoglobülin agir zincir degisken Iokuslarini içeren kromozomal fragmanin ters çevrilmesi ile gerçeklestirilebilir, örnek olarak degisken bölge lokusunu çevreleyen pozisyonlara yerlestirilmis tasarlanmis bölgeye özel rekombinasyon bölgeleri kullanilarak. Böylece, rekombinasyon 'üzerine, endojen agir zincir degisken bölge Iokuslari, endojen agir zincir sabit bölge genlerinden büyük bir uzakliga yerlestirilir, endojen bir agir zincir sabit bölgesi içeren fonksiyonel bir agir zinciri kodlamak için yeniden düzenleme önlenir. Fonksiyonel bir ADAM6 lokusu muhafaza edilirken endojen immünoglobülin agir zincir degisken gen lokusunun fonksiyonel susturulmasinin saglanmasi için diger örnek niteligindeki yöntemler, bu açiklamayi okuduktan sonra ve / veya teknik alanda bilinen yöntemlerle kombinasyon halinde, teknik alanda uzman kisiler tarafindan anlasilir. Endojen agir zincir lokusunun böyle bir yerlesimi ile endojen ADAM6 genleri korunur ve endojen immünoglobulin agir zincir lokusu fonksiyonel olarak susturulur. Ektopik yerlesimin bir baska örnegi, hümanize bir immünoglobülin agir zincir lokusu içindeki yerlesimdir. Ornek olarak, insan VH gen segmentleri ile bir ya da daha fazla endojen VH gen segmentinin degistirilmesini içeren bir fare, ki burada yer degistirmede endojen ADAM6 sekansi çikarilir, insan VH gen segmentlerini içeren sekans içinde yer alan bir fare ADAM6 sekansina sahip olacak sekilde tasarlanabilir. Elde edilen modifikasyon, bir insan gen sekansi içinde bir (ektopik) fare ADAM6 sekansi meydana getirecektir ve insan gen sekansi içine fare ADAM6 sekansinin (ektopik) yerlestirilmesi, insan ADAM6 psödogen pozisyonuna (yani iki V segmenti arasinda) yaklasik ya da fare ADAM6 sekansinin pozisyonuna (yani V-D intergenik bölge içinde) yaklasik olabilir. Fare germ hatti içinde bir insan gen sekansina (örnek olarak bir immünoglob'ulin gen sekansi) ya da bitisigindeki bir (ektopik) fare ADAM6 sekansinin birlestirilmesi ile ortaya çikan sekans kavsaklari, vahsi tip bir farenin genomundaki ayni ya da benzer pozisyonla karsilastirildiginda yeni olacaktir. Eksikligi fareleri kisir kilan ya da farelerin verimliligini büyük ölçüde azaltan, bir ADAM6 ya da ortologu ya da homologu bulunmayan fareler burada tarif edilmektedir. ADAM6 ya da ortologun ya da homologunun bulunmamasi, endojen bir immünoglobülin agir zincir Iokusunun bir modifikasyonundan kaynaklanabilir. Dogurganlikta 'Önemli bir azalma, dogurganlikta (Örnek olarak, üreme sikligi, dogum basina yavru sayisi, yillik yavru sayili ve benzerleri) yaklasik % 50, % 60, °/o 70, % 80, % 90 ya da % 95 ya da daha fazla bir azalmadir. Onemli bir kisim dogurganligin kurtarilmasi, örnek olarak modifiye edilmemis bir agiz zincir Iokusu (yani ADAM6 geni ya da ortologu ya da homologu ile modifikasyon bulunmayan bir hayvan) ile karsilastirildiginda farenin en az % 70, % 80 ya da % 90 ya da daha fazla dogurganlik sergileyebilecegi bir restorasyondur. Bir farede ADAM6 fonksiyonunun kaybi, fareye ADAM6 geninin eklenmesi ile kurtarilabilir. Bir düzenlemede, farede ADAM6 fonksiyonunun kaybi, 'örnek olarak bir kemirgen, örnek olarak farkli bir nesil ya da tür fare, herhangi bir tür siçan, kemirgen gibi fare ile yakindan iliskili bir türün bir ortologunun ya da homologunun eklenmesi ile kurtarilabilir; ortologun ya da homologun fareye eklenmesi, ADAM6 fonksiyonunun kaybi ya da bir ADAM6 geninin kaybi nedeniyle dogurganlik kaybini kurtarir. Çesitli düzenlemelerde, farkli türlerden ortologlar ve homologlar evrimsel olarak iliskili türlerden seçilmekte ve çesitli düzenlemelerde, yaklasik % 80 ya da daha fazla, % 85 fazla ya da % 97 ya da daha fazla endojen ADAM6 (ya da ortolog) ile yüzde bir benzerlik göstermekte ve bu, ADAM6 ile iliskili ya da (fare olmayanda) ADAM6 ortolog ile iliskili dogurganlik kaybini kurtarmaktadir. Ornek olarak, ADAM6 fonksiyonundan yoksun genetigi degistirilmis bir erkek siçanda (örnek olarak, bir insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi ile degistirilmis endojen bir immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi olan bir siçan ya da siçan immünoglobülin agir zincir bölgesinde nakavt), siçandaki dogurganlik kaybi, bir siçan ADAM6 ya da bazi düzenlemelerde, bir siçan ADAM6 ortologunun (örnek olarak, baska bir siçan neslinden ya da türünden ya da bir düzenlemede fareden bir ADAM6 ortolog eklenmesi) eklenmesi ile kurtarilmaktadir. Bir ADAM6 proteinini kodlayan bir nükleik asit sekansinin (ya da ortologun ya da bunun homologunun) ya da nükleik asit sekansi ile islevsel bir sekilde baglanmis bir düzenleyici bölgenin modifikasyonu nedeniyle kisirlik ya da dogurganlikta azalma sergileyen genetik olarak modifiye edilmis fareler, dogurganlik kaybini tamamlayan ya da iyilestiren bir nükleik asit sekansi içermektedir, buradaki dogurganlik kaybini tamamlayan ya da iyilestiren nükleik asit sekansi, ayni türün farkli neslinden ya da evrimsel olarak iliskili bir türden gelmektedir. Tamamlayici nükleik asit sekansi, ADAM6 ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani olabilir. Tamamlayici ADAM6 ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani, dogurganlik kusuru olan genetigi degistirilmis fare ile yakindan iliskili, insan disi bir hayvandan olabilir. Ornek olarak, genetigi degistirilmis hayvan belirli bir neslin bir faresi oldugu durumlarda, bir ADAM6 ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani, farkli bir nesil fareden ya da ilgili bir türün faresinden elde edilebilir. Bir düzenlemede, dogurganlik kusurunu içeren genetigi degistirilmis hayvan bir fare ve dolayisiyla Rodentia takimindan oldugunda, ADAM6 ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonu fragmani Rodentia takimindan baska bir hayvandan gelmektedir. Bir düzenlemede, genetigi degistirilmis fare Muridae familyasinin bir üyesidir ve ADAM6 ortolog ya da homolog, Muridae familyasinin farkli bir türünden gelmektedir. Spesifik bir düzenlemede, ADAM6 ortolog ya da homolog, Muridae familyasindaki siçan, ç'ol faresi, dikenli fare ya da yeleli fareden gelmektedir. Bir ailedeki, bir ya da daha fazla kemirgen ADAM6 ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmaninin, ADAM6 ortolog ya da homolog eksikligi olan ayni familyanin (örnek olarak Cricetidae (örnek olarak, hamsterlar, yeni dünya siçanlari ve fareleri, tarla fareleri); Muridae (örnek olarak gerçek fareler ve siçanlar, çöl fareleri, dikenli fareler, yeleli siçanlar)) genetigi degistirilmis bir kemirgenine dogurganligi geri kazandirdigi tanimlanmaktadir. ADAM6 aktivitesinden yoksun (bir ADAM6 ya da ortologun nakavtini içeren) genetik olarak modifiye edilmis bir erkek fareye ortologun, homologun ya da fragmanin dogurganlik kazandirip kazandirmadigi tespit edilerek, ADAM6 ortolog, homolog ve bunlarin fragmanlari fonksiyonellik açisindan degerlendirilebilir. Çesitli düzenlemelerde, islevsellik, bir endojen ADAM6 ya da ortologu ya da bunun homologundan yoksun genetik olarak modifiye edilmis bir farenin sperminin, genetigi degistirilmis hayvanin ayni türünün yumurta kanalinda geçme ve yumurtayi dölleme yetenegi olarak tanimlanmaktadir. Çesitli yönlerde, fare ADAM65ya (örnek olarak bir erkek farede islevsel olan bir ortolog ya da homolog ya da bunun bir fragmani) benzer dogurganlik yararlari sunan bir proteini kodlayan bir ektopik nükleotid sekansi içeren, endojen agir zincir degisken bölge Iokusunun ya da bunlarin bölümlerinin delesyonunu ya da replasmanini içeren fareler yapilabilir. Ektopik nükleotit sekansi, farkli bir fare susunun ya da farkli bir türün bir ADAM6 homolog ya da ortologu (ya da bunun fragmani) olan bir proteini kodlayan bir nükleotit sekansi içerebilir, örnek olarak dogurganlik açisindan fayda saglayan farkli bir kemirgen türü, örnek olarak, belirli bir zaman periyodu boyunca artan dogum sayisi ve / veya dogum basina artan yavru sayisi ve / veya bir erkek farenin sperm hücresinin fare yumurtasini döllemek için fare yumurta kanalini geçme kabiliyeti. Bir düzenlemede, ADAM6, bir fare ADAM6 proteinine en az % 89 ila % 99 özdes bir homolog ya da ortologtur (örnek olarak fare ADAM6a ya da fare ADAMöb'ye en az % 89 ila % 99 özdes). Bir düzenlemede, bir ya da daha fazla protein kodlayan ektopik nükleotid sekansi bagimsiz bir sekilde, fare ADAMöarya en az °/o 89 oraninda özdes bir proteinden, fare ADAMBb'ye ez az % 89 oraninda özdes bir proteinden ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bir düzenlemede, homolog ya da ortolog, fare ADAM6a ve I veya fare ADAM6b ile yaklasik % 89 ya da daha fazla özdes olacak sekilde ya da modifiye edilmis bir siçan, hamster, fare ya da kobay proteinidir. Bir düzenlemede, homolog ya da ortolog, bir fare ADAMGa ve / veya fare 99 özdestir ya da öyledir. Bulusun bir görüsüne göre, (a) bir fare immünoglobülin K hafif zincir sabit bölgesinin yukarisinda bir ya da daha fazla insan V A ve J A gen segmenti yerlestirilmesi, (b) insan disi bir immünoglobülin agir zincir sabit bölgesinin yukarisinda bir ya da daha fazla insan VH, bir ya da daha fazla insan DH ve bir ya da daha fazla insan JG gen segmenti yerlestirilmesi ve (c) ADAM6 proteini ya da bunun fonksiyonel bir fragmanini kodlayan bir nükleotid sekansini içeren fareler saglanmaktadir. Bir düzenlemede, insan disi agir ve / veya hafif zincir sabit bölgeleri, kemirgen sabit bölgeleridir (örnek olarak fare, siçan ya da hamster sabit bölgelerinden seçilen). Bir düzenlemede fare, en az 12 ila en az 40 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede fare, 12 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede fare, 28 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede fare, 40 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti içermektedir. Çesitli düzenlemelerde, en az bir insan J A gen segmenti, J A1, J A2, J A3 ve J A7*den seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede fare, en az dört insan J A gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, en az dört J A gen segmenti, en az J A1, J Bir düzenlemede, ADAM6 proteinini ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlayan nükleotid sekansi, farede ektopiktir. Bir düzenlemede, ADAM6 proteinini ya da bunun fonksiyonel fragmanini (farede fonksiyonel olan) kodlayan nükleotid sekansi, vahsi tip insan disi ADAMö Iokusu ile karsilastirildiginda ayni lokasyonda bulunmaktadir. Bir düzenlemede, bir fare ADAM6 proteinini ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlayan nükleotid sekansi, farenin genomunda ektopik bir lokasyonda bulunmaktadir. Nükleotid sekansi, bir fare ADAM6 ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlamakta ve insan agir zincir gen segmenti olan immünuglobülin gen segmentlerinde bulunmaktadir. Bir düzenlemede fare, endojen bir immünoglobülin hafif zincir Iokusunda bir endojen immünoblobülin VL ve / veya bir JL gen segmentinden yoksundur. Bir düzenlemede fare, insan disi hayvanda bir immünoglobulin VL alani olusturmak için yeniden düzenleneme yetenegine sahip olmayan endojen immünoglobülin VL ve I veya JL gen segmentlerini içerir. Bir düzenlemede, tüm ya da büyük ölçüde bütün endojen immünoglobülin VK ve JK gen segmentleri, bir ya da daha fazla insan V A ve J A gen segmentleri ile degistirilmistir. Bir düzenlemede, tüm ya da büyük ölçüde bütün endojen immünoglobülin V A ve J A gen segmentleri, bir ya da daha fazla insan V A ve J A gen segmentleri ile degistirilmistir. Bir düzenlemede, tüm ya da büyük ölçüde bütün endojen immünoglobülin VL ve JL gen segmentleri, insan disi hayvanda ve endojen immünoglobulin VL ve / veya JL gen segmentleri ve bir endojen immünoglobülin hafif zincir sabit bölgesi arasina yerlestirilmis bir ya da daha fazla V A gen segmenti ve bir ya da daha fazla J A gen segmenti içeren insan disi bir hayvanda degistirilmemistir. Spesifik bir düzenlemede, degistirilmemis endojen immünoglobülin VL ve JL gen segmentleri, farede bir antikorun bir VL bölgesini olusturmak için yeniden düzenlemeye elverissiz hale getirilir. Çesitli düzenlemelerde, farenin endojen immünoglobülin hafif zincir lokusu, bir immünoglobülin K hafif zincir lokusudur. Çesitli düzenlemelerde, farenin endojen immünoglobülin hafif zincir lokusu, immünoglobülin /\ hafif zincir lokusudur. Çesitli düzenlemelerde endojen immünoglobülin VL ve JL gen segmentleri, VK ve JK gen segmentleridir. Çesitli düzenlemelerde endojen VL ve JL gen segmentleri, V A ve J A gen segmentleridir. Bir düzenlemede, fare ayrica insan K hafif zincir lokusundan bir insan VK-JK intergenik bölgesini içerir, burada insan VK-JK intergenik bölgesi bir ya da daha fazla insan V A ve J A gen segmentine bitisiktir. Spesifik bir düzenlemede, insan VK JK intergenik bölgesi, bir insan V A gen segmenti ile bir insan J A gen segmenti arasina yerlestirilmektedir. Burada tarif edilen farelerden türetilen hücreler ve I veya dokular tanimlanmakta olup, hücreler ve / veya dokular, (a) insan disi immünuglobülin hafif zincir sabit bölgesinin yukarisinda bir ya da daha fazla insan V A ve J A gen segmenti yerlestirmesi, (b) insan disi immünuglobülin agir zincir sabit bölgesinin yukarisinda bir ya da daha fazla insan VH, bir ya da daha fazla DH ve bir ya da daha fazla JH gen segmenti yerlestirmesi ve (c) ADAM6 proteini ya da bunun fonksiyonel bir fragmanini kodlayan bir nükleotid sekansi içermektedir. Insan disi agiz ve / veya hafif zincir sabit bölgesi, fare sabit bölgesi olabilir. Insan disi agir ve / veya hafif zincir sabit bölgesi, siçan sabit bölgesi olabilir. Insan disi agir ve / veya hafif zincir sabit bölgesi, hamster sabit bölgesi olabilir. Bir düzenlemede, ADAMö proteini ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlayan nükleotid sekansi, hücrede ve / veya dokuda ektopiktir. Bir düzenlemede, fare hücresi ve / veya dokusu bir fareden türetilir ve nükleotid sekansi bir fare ADAM6 proteini ya da fonksiyonel fragmani kodlar ve ektopik bir Iokasyonda bulunur. Fare hücresi ve / veya dokusu bir fareden türetilir ve nükleotid sekansi bir fare ADAM6 proteini ya da fonksiyonel fragmani kodlar ve immünoglobülin gen segmentlerinde bulunur. immünuglobülin gen segmentleri, agir zincir gen segmentleridir. Bir antijen baglayici protein yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi açiklanmaktadir, burada fare (a) (i) bir insan V A bölgesi ve bir fare K hafif zincir sabit bölgesi içeren bir immünoglobülin hafif zincir ve (ii) bir insan VH alani ve bir insan disi sabit bölge içeren bir immünoglobülin agir zincir içeren bir antikoru ve (b) bir ADAMG proteini ya da bunun fonksiyonel fragmanini eksprese eder. Antijen baglayici protein, insan olabilir. Insan disi sabit bölgeler, kemirgen sabit bölgeleridir. Bulusun bir görüsüne göre, burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilen bir fare hücresi ya da dokusu saglanmaktadir. Bir düzenlemede, fare hücresi ya da dokusu, bir ya da daha fazla insan immünoglobülin V A gen segmenti ve insan disi immünoglobülin agir zincir sabit bölge genine bitisik bir ya da daha fazla insan VH, bir ya da daha fazla insan DH ve bir ya da daha fazla insan JH gen segmentine ve bir fare immünoglobülin K hafif zincir sabit bölge genine bitisik en az bir insan immünoglobülin K A gen segmenti içermektedir; burada hücre ya da doku bir ADAMö proteini ya da bunun fonksiyonel fragmanini eksprese eder. Bir düzenlemede, insan disi hafif zincir sabit bölge geni, bir fare CK ya da fare CA'dir. Bir düzenlemede, ADAMö proteini ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlayan nükleotid sekansi ektopiktir. Çesitli düzenlemelerde fare hücresi, bir fare B hücresidir. Çesitli düzenlemelerde insan disi hücre, embriyonik kök hücresidir. Bir düzenlemede doku, farenin dalagindan, kemik iliginden ya da lenf nodülünden elde edilmektedir. Bulusun bir yönünde, bir hibridom ya da kuadrom üretmek için burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir hücre ya da dokunun kullanimi saglanmaktadir. Bulusun bir görüsüne göre, burada tarif edildigi gibi modifiye edilmis bir genom içeren bir fare hücresi saglanmakta olup, buradaki fare hücresi bir oosit, bir konak embriyo ya da burada tarif edilen fareden bir hücrenin ve farkli bir fareden bir hücrenin bir füzyonudur. Bulusun bir görüsüne göre, tamamen insan antikoru yapmak için burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir hücre ya da doku kullanilmasi saglanmaktadir. Bir düzenlemede tamamen insan antikoru, burada tarif edildigi gibi insan disi bir hayvandan izole edilmis bir insan VH alani ve bir insan V /\ bölgesi içermektedir. Bulusun bir görüsüne göre, ilgilenilen bir antijene baglanan bir antikoru yapmak için bir yöntem saglanmakta olup, buradaki yöntem, (a) burada tarif edildigi gibi bir fareyi ilgili bir antijene maruz birakmayi içerir, (b) farenin bir ya da daha fazla B lenfositini izole etmeyi içerir; ki buradaki bir ya da daha fazla B Ienfositi, ilgilenilen antijeni baglayan bir antikoru eksprese eder ve (c) ilgili antijeni baglayan antikorun bir immünoglobülin hafif zincirini kodlayan bir nükleik asit sekansini tanimlamayi içerir; ki buradaki immünoglobülin hafif zinciri, bir insan V A bölgesi ve bir insan disi hafif zincir sabit alani içerir ve (d) ilgilenilen antijeni baglayan bir insan antikorunu yapmak için (0) 'nin nükleik asit sekansi ile bir insan immünoglobulin hafif zincir sabit bölge nükleik asit sekansinin ile kullanilmasini içerir. Bir düzenlemede, insan disi hafif zincir sabit bölge alani, bir fare CK'dir. Bir düzenlemede, insan disi hafif zincir sabit alani bir fare CA'dir. Bulusun bir görüsüne göre, bir immünoglobülin agir zincir Iokusunda bir modifikasyon içeren fertil bir erkek fare saglanmakta olup, burada fertil bir erkek fare, erkek farede fonksiyonel olan bir ektopik ADAM6 sekansi içermektedir. Insanlastirilmis Agir Zincir Farelerde Ektopik ADAM6 Gen hedefleme alanindaki gelismeler, örnek olarak bakteriyel yapay kromozomlarin (BAC'ler) gelisimi, simdi nispeten büyük genomik fragmanlarin rekombinasyonunu mümkün kilmaktadir. BAC mühendisligi, farenin ES hücrelerine büyük delesyonlar ve büyük insersiyonlar yapilabilmesine imkan saglamaktadir. Insan antikorlari yapan fareler, bir süredir mevcuttur. Insan terapötik antikorlarinin gelistirilmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmelerine ragmen, bu fareler yararliliklarini sinirlayan bir dizi önemli anormallik sergilemektedir. Ornek olarak, tehlikeli B hücre gelisimi gösterirler. Tehlikeli gelisme, transgenik fareler ve vahsi tip fareler arasindaki çesitli farkliliklardan dolayi olabilir. Insan antikorlari, klonal seçilim sirasinda olgunlasma, çogalma ya da hayatta kalma için sinyal veren fare hücrelerinin yüzeyindeki fare ön B hücresi ya da B hücresi reseptörleri ile en uygun sekilde etkilesime girmeyebilir. Tamamen insan antikorlari, bir fare Fe reseptör sistemi ile en uygun sekilde etkilesime girmeyebilir; fareler, insan Fe reseptörleri ile birebir uyusma göstermeyen Fe reseptörlerini eksprese eder. Son olarak, tamamen insan antikorlari yapan çesitli fareler, örnek olarak vahsi tip B hücre gelisimi için gerekli olabilecek asagi akis arttirici elemanlar ve diger lokus kontrol elemanlari gibi bütün özgün fare sekanslarini içermez. Tamamen insan antikorlari yapan fareler genellikle bir sekilde devre disi birakilan endojen immünoglobulin lokuslarini içerir ve degisken ve sabit immünoglobulin gen segmentlerini içeren insan transgenleri, fare genomunda rastgele bir yere yerlestirilir. Endojen lokus, fonksiyonel bir immünoglobulin geni olusturmak üzere gen parçalarini yeniden düzenlemek için yeterince devre disi birakildigi sürece, böyle bir farede tamamen insan antikorlari yapma hedefi, tehlikeli B hücresi gelisimi ile de olsa gerçeklestirilebilir. Her ne kadar insan transgen Iokusundan tamamen insan antikorlari yapmak zorunda kalinsa da, bir farede insan antikorlari üretmek görünüste tercih edilmeyen bir islemdir. Bazi farelerde islem, trans-degisim mekanizmasi vasitasiyla kimerik insan degisken / fare sabit agir zincirlerinin (ancak hafif zincirlerin degil) olusmasi ile sonuçlanacak kadar tercih edilmemektedir. Bu mekanizma ile tamamen insan antikorlarini kodlayan transkriptler, insan izotipinden bir fare izotipine trans geçisinde izotip degisimine tabi tutulur. Islem trans geçisindedir, çünkü tamamen insan transgeninin, bir fare agir zincir sabit bölge geninin hasarsiz bir kopyasini tutan endojen lokustan baska bir yere yerlestirilmesi gerekmektedir. Her ne kadar bu tür farelerde trans-degisimi kolayca görünse de, bu olgu hala açikça bozulmus olan B hücresi gelisimini kui1armada yetersiz kalmaktadir. Her durumda, bu tür farelerde yapilan trans-anahtarlanmis antikorlar, tamamen insan hafif zincirlerini tutar, çünkü trans-anahtarlama olgusu, görünüste hafif zincirlere göre olusmaz; trans-anahtarlama cis'te normal izotip anahtarlamada kullanilan endojen Iokuslarda (farkli sekilde de olsa) büyük olasilikla anahtar sekanslarina dayanmaktadir. Dolayisi ile tamamen insan antikorlari yapmak üzere tasarlanan fareler, fare sabit bölgeleri olan antikorlari yapmak için bir trans-anahtarlama mekanizmasi seçse bile, strateji normal B hücresi gelisimini kurtarmak için hala yetersizdir. Antikor bazli insan terapötiklerinin yapilmasindaki birincil endise, belirli epitoplari spesifik olarak taniyan ve onlari -her zaman degil ama- genellikle yüksek afinite ile arzu edilen bir afinite ile baglayan, yararli çesitli alanlari tanimlamak için yeteri kadar büyük miktarda insan immünoglobülin degisken bölge sekansi yapmaktir. VELOCIMMUNE® farelerinin (burada tarif edilmektedir) gelistirilmesinden önce, insan degisken bölgelerini fare sabit bölgeleri ile ifade eden farelerin, bir transgenden insan antikorlari yapan farelerden herhangi bir önemli fark göstereceklerine dair bir gösterge yoktu. Ancak, bu varsayim yanlisti. Endojen fare Iokuslarinda fare immünoglobülin degisken bölgelerinin insan immünoglobülin degisken bölgeleri ile hassas bir sekilde degistirilmesini içeren, VELOCIMMUNE® fareleri, B hücresi gelisimine göre vahsi tip farelere sasirtici ve dikkate deger bir benzerlik göstermektedir. Sasirtici ve çarpici bir gelismede, VELOCIMMUNE® fareleri, immünizasyona esasen normal, vahsi tipte bir tepki göstermektedir ki bu durum vahsi tip farelerden sadece bir önemli açidan farklidir- immünizasyona cevap olarak üretilen degisken bölgeler tamamen insandir. VELOCIMMUNE® fareleri, endojen Iokuslarda karsilik gelen insan immünoglobulin degisken bölgeleri ile fare immünoglobülin agir zincirinin (IgH) ve immünoglobülin hafif zincirinin (örnek olarak K hafif zincir, IgK) germ hatti degisken bölgelerinin kesin, büyük ölçekli replasmanini içermektedir. Toplamda yaklasik alti megabazlik fare lokuslari, yaklasik 1.5 megabazlik insan genomik sekansi ile degistirilir. Bu kesin replasman, bir insan degisken bölgesi ve bir fare sabit bölgesi olan agir ve hafif zincirleri yapan hibrit immünoglobülin Iokuslarina sahip bir fareyle sonuçlanmaktadir. Fare VwDwJH ve VK-JK segmenlerinin kesin replasmani, hibrit immünoglobülin lokuslarinda, komsu fare sekanslarinin saglam ve fonksiyonel olmasini saglamaktadir. Farenin hümoral bagisiklik sistemi, vahsi tip bir fareninki gibi islev görmektedir. B hücresi gelisimi belirgin bir sekilde engellenmez ve antijen tehdidi üzerine farede zengin bir insan degisken bölge çesitliligi üretilir. VELOCIMMUNE® fareleri mümkündür, çünkü agir ve K hafif zincirler için immünoglobulin gen segmentleri, insanlarda ve farelerde benzer sekilde yeniden düzenlenir; Iokuslarinin ayni oldugunu ya da neredeyse açikça ayni olmadigini söylemek degildir. Bununla birlikte, Iokuslar yeterince benzerdir ki agir zincir degisken gen Iokusunun insanlastirilmasi, VH, DH ve JH gen parçalarini içeren yaklasik üç milyon baz çift bitisik fare sekansinin, temelde bir insan immünoglobülin lokusundan gelen denk sekansi kapsayan yaklasik bir milyon baz insan bitisik sekans ile degistirilerek gerçeklestirilebilmektedir. Bazi düzenlemelerde, belirli fare sabit bölge gen sekanslarinin insan gen sekanslari ile daha da replasmani (örnek olarak, fare CH1 sekansinin insan CH1 sekansi ile replasmani ve fare CL sekansi ile insan CL sekansinin replasmani), insan degisken bölgelerine ve kismen insan sabit bölgelerine sahip, örnek olarak tamamen insan antikor fragmanlari ve örnek olarak tamamen insan Fab'lari yapmak için uygun antikorlari yapan, hibrit immünoglobülin Iokuslarina sahip fareler ile sonuçlanmaktadir. Hibrit immünoglobulin lokuslu fareler normal degisken gen segmenti düzenlemesi, normal somatik hipermutasyon ve normal sinif degisimi göstermektedir. Bu fareler, vahsi tip farelerden ayirt edilemeyen hümoral bir bagisiklik sistemi sergiler ve farelerin insan degisken bölge gen segmentlerinin tam bir repertuarina sahip olmadigi durumlarda bile B hücresi gelisiminin tüm asamalarinda normal hücre popülasyonlari ve normal lenfoid organ yapilari gösterir. Bu farelere immünizasyon, çok çesitli degisken gen segmenti kullanimi gösteren güçlü hümoral yanitlar ile sonuçlanmaktadir. Fare germ hatti degisken bölge gen segmentlerinin tam olarak replasmani, kismen insan immünoglobülin lokuslarina sahip farelerin yapilmasina izin vermektedir. Kismen insan immünoglobülin lokuslari yeniden düzenlendigi, hiper mutasyona ugradigi ve normal olarak sinif degistirdigi için, kismen insan immünoglobülin lokuslari, insan degisken bölgeleri içeren bir farede antikorlar üretir. Degisken bölgeleri kodlayan nükleotit sekanslari tanimlanabilir ve klonlanabilir, daha sonra, örnek olarak tamamen insan sekanslarindan elde edilen bir antikor ya da antijen baglayici protein ile sonuçlanan, belirli bir kullanim için uygun herhangi bir immünoglobülin izotip gibi herhangi bir tercih edilen sekans ile kaynasabilir (örnek Rekombinasyonlama yöntemleri ile büyük ölçekli insanlastirma, fare embriyonik kök (ES) hücrelerini, temelde bütün fare VH, DH ve JH gen segmentlerini içeren üç fare agir zincir immünoglobulin lokusunun üç megabazi ile bazilarini ya da esasen bütün insan VH, DH ve JH gen segmentlerini içeren, bir megabaza kadar insan genomik sekansi ile esdeger insan gen segmentlerinin tam olarak yerine koymak için modifiye etmek amaciyla kullanilmaktadir. Esas olarak tüm insan VK ve JK gen segmentlerini kodlayan iki tekrardan birini içeren insan genomunun bir buçuk megabazlik bölümüne kadar, esasen tüm fare VK ve JK gen segmentlerini içeren fare immünoglobülin K hafif zincir lokusunun üç megabazlik segmentinin yerine kullanilmistir. Bu tür degistirilmis immünoglobülin lokuslarina sahip fareler, normal olarak fare immünoglobülin agir zincir lokusunda 3'-en VH gen segmenti ile 5'-en DH gen segmenti arasinda bulunan endojen fare ADAM6 lokusunun bir bozulmasini ya da delesyonunu içerebilir. Bu bölgedeki bozulma, endojen fare ADAM6 lokusunun islevselliginin azalmasina ya da eliminasyonuna neden olabilir. Insan agir zincir repertuarinin 3,-en VH gen sengmentleri bir replasmanda kullanilirsa, bir insan ADAM6 yalanci geni gibi görünen bir yalanci gen içeren bir intergenik bölge, bu VH gen segmentleri arasinda, yani insan VH1-2 ve VH1-6 arasinda bulunur. Bununla birlikte, bu insan intergenik sekansini içeren erkek farelerin fertilitesinde bir azalma gözlenir. Yukarida açiklandigi gibi degistirilmis Iokuslari içeren ve ayrica farelerin esasen normal fertilite sergiledigi bir fare ADAMö'yi kodlayan bir ektopik nükleik asit sekansi içeren fareler tarif edilmektedir. Ektopik nükleik asit sekansi, modifiye bir endojen agir zincir lokusunda insan VH1-2 gen segmenti ve insan VH1-6 gen segmenti arasina yerlestirilen, bir fare ADAM6a ve / veya bir fare ADAMGb sekansi ya da bunlarin fonksiyonel fragmanini içerebilir. Ektopik nükleik asit sekansi, modifiye endojen agir zincir lokusunda insan VH1-2 ve VH1-6 arasina yerlestirilmis SEKANS lD No:3 olabilir. SEKANS ID NO: 3'ün ADAM6 genlerinin transkripsiyon yönü, etraftaki insan VH gen segmentlerinin transkripsiyon yönünün zittidir. Her ne kadar buradaki Örnekler belirtilen insan VH gen segmentleri arasina ektopik sekansi yerlestirerek fertilitenin kurtarildigini gösterse de, teknik alanda uzman kisiler, ektopik sekansin, fare genomunda (ya da hatta ekstrakromozomal olarak) uygun herhangi bir transkripsiyonel izin verilen Iokusta yerlestirilmesinin, erkek bir farede benzer sekilde dogurganligi kurtarmasi beklenecegini kabul edecektir. Bir fare ADAM6 geni ya da ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmanini içeren bir ektopik sekansa sahip fonksiyonel bir ADAM6 lokusundan yoksun bir fareyi tamamlama olgusu, fonksiyonel olmayan ya da minimal fonksiyonel olan endojen ADAM6 lokuslari ile herhangi bir farenin kurtarilmasi için geçerli olan genel bir yöntemdir. Bu nedenle, immünoglobülin agir zincir Iokusunun ADAM6- bozucu bir modifikasyonunu içeren birçok fare, bulusa ait kompozisyonlar ve yöntemler ile kurtarilabilir. Buna göre bulus, endojen ADAM6 fonksiyonu içeren Immünoglobülin agir zincir Iokuslarinin çok çesitli modifikasyonlarini içeren fareleri kapsamaktadir. Bazi (sinirlayici olmayan) örnekler, bu tarifnamede verilmektedir. Tarif edilen VELOCIMMUNE® farelerine ek olarak, ADAM6 ile iliskili kompozisyonlar ve yöntemler, örnek olarak bir agir zincir Iokusunun çok çesitli sekillerde modifikasyonu gibi birçok uygulamada kullanilabilir. Fonksiyonel bir ADAM6 proteinini (ya da ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani), bir ya da daha fazla insan VH gen segmenti ile tüm ya da büyük ölçüde bütün fare VH gen segmentlerinin replasmanini, insan DH ve insan JH gen segmentleri ile tüm ya da büyük ölçüde bütün fare DH gen bölümlerinin ve JH gen bölümlerinin replasmanini kodlayan, ektopik bir ADAM6 sekansi içeren bir fare burada tanimlanmakta olup; burada fare CH1 ve / veya mentese bölgesinden yoksundur. Bir düzenlemede fare, asagidakilerden seçilen bir immünoglobulin zincirinin dimer olan tek degiskenli bir alan baglayici proteinini yapar: (a) insan VH - fare CH1 -fare CH2 -fare CH3; (b) insan VH -fare mentese -fare CH2 - fare CH3; ve (o) insan VH -fare CH2 -fare CH3. Bulusun bir görüsüne göre, fertiliteyi kurtaran nükleotit sekansi, bir ya da daha fazla fare immünoglobülin agir zincir degisken gen segmentleri (mVH'Ier, mDH'ler ve / veya mJH'Ier) ile bir ya da daha fazla insan immünoglobulin agir zincir degisken gen segmentlerinin (hVH'Ier, hDH'ler ve /veya hJH'Ier) replasmanina sahip olan ve ayrica bir ya da daha fazla fare immünoglobülin K hafif zincir degisken gen segmentleri (mVK'Iar ve / veya mHKtIar) ile bir ya da daha fazla insan immünoglobülin K hafif zincir degisken gen segmentlerinin (hVK'Iar ve /veya hJK'lar) replasmanini içeren bir farede, insan immünoglobülin agir zincir degisken bölge sekansina (örnek olarak, insan VH1-2 ve VH1-6 gen segmentleri arasina) yerlestirilmektedir. Bir düzenlemede nükleotid sekansi, bir VELOCIMMUNE® faresinde insan VH1-2 gen segmenti ve insan VH1-6 gen segmenti arasina yerlestirilmektedir (ABD 6,596,561 ve ABD 7,105,348). Bir düzenlemede, bu sekilde modifiye edilmis VELOClMMUNE® faresi, tüm ya da büyük ölçüde bütün insan immünoglobülin agir zincir degisken gen segmentleri (tüm hVH'ler, hDH'ler ve hJH'Ier) ve tüm ya da büyük ölçüde bütün insan immünoglobülin hafif zincir degisken gen segmentleri (hVK'Ier ve hjk'S) replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede, bir ya da daha fazla fare immünoglobülin agir zincir degisken gen segmenti, fare immünoglobülin agir zincir lokusunun yaklasik üç megabazini içermektedir. Bir düzenlemede, bir ya da daha fazla fare immünoglobülin agir zincir degisken gen segmenti, fare immünoglobülin agir zincir Iokusunun en az 89 VH gen segmentini, en az 13 DH gen segmentini, en az dört JH gen segmentini ya da bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Bir düzenlemede, bir ya da daha fazla insan immünoglobülin agir zincir degisken gen segmenti, insan immünoglobülin agir zincir Iokusunun yaklasik bir megazini içermektedir. Bir düzenlemede, bir ya da daha fazla insan immünoglobülin agir zincir degisken gen segmenti, insan immünoglobülin agir zincir Iokusunun en az 80 VH gen segmentini, en az 27 DH geri segmentini, en az alti JH gen segmentini ya da bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Bir düzenlemede bir ya da daha fazla fare immünoglobülin K hafif zincir degisken gen segmenti, fare immünoglobülin K hafif zincir Iokusunun yaklasik üç megabazini içermektedir. Bir düzenlemede bir ya da daha fazla fare immünoglobülin K hafif zincir degisken gen segmenti, fare immünoglobulin K hafif zincir Iokusunun en az 137 VK gen segmentini, en az bes JK gen segmentini ya da bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Bir düzenlemede bir ya da daha fazla insan K hafif zincir degisken gen segmenti, bir insan immünoglobülin K hafif zincir lokusunun yaklasik bir buçuk megabazini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede bir ya da daha fazla insan K hafif zincir degisken gen segmenti, insan immünogloblin K hafif zincir lokusunun proksimal tekrarini (immünoglobülin K sabit bölgeye göre) içermektedir. Bir düzenlemede bir ya da daha fazla insan K hafif zincir degisken gen segmenti, insan immünoglobülin K hafif zincir lokusunun en az 40 VK gen segmentini, en az bes JK gen segmentini ya da bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Nükleotid sekansi, insan agir zincir gen segmenleri olan iki insan immünoglobülin gen segmenti arasina yerlestirilmektedir. Endojen fare agir zincir degisken bölge lokusunda bulunan fare gen segmentlerinin ortasinda yer alan fonksiyonel bir fare ADAM6 Iokusu (ya da ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani) tarif edilmektedir; söz konusu lokus, endojen bir agir zincir sabit bölgesi içeren fonksiyonel bir agir zinciri kodlamak için yeniden düzenlenmeye elverissizdir. Endojen fare agir zincir lokusu, en az bir ve en fazla 89 VH gen segmenti, en az bir ve en fazla 13 DH gen segmenti, en az bir ve en fazla dört JH gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonunu içerebilir. Fonksiyonel dare ADAM6 Iokusu (ya da ortolog ya da homolog ya da bunun fragmani) farede fonksiyonel olan bir ya da daha fazla ADAM6 proteinini kodlayabilir, burada bir ya da daha fazla ADAM6 proteini, SEKANS lD NO: 1, SEKANS ID No:2 ve / veya bunlarin bir kombinasyonunu içermektedir. Bulusun bir görüsüne göre, islevsel bir fare ADAM6 lokusu (ya da ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani), endojen fare VH gen segmentlerinin yerini alan insan VH gen segmentlerinin ortasinda bulunmaktadir. Bir düzenlemede, en az 89 fare VH gen segmenti çikarilir ve bir ya da daha fazla insan VH gen segmenti ile degistirilir ve fare ADAM6 lokusu, insan VH gen segmentlerinin 3' ucuna hemen bitisik olarak ya da iki insan VH gen segmentinin arasinda bulunmaktadir. Spesifik bir düzenlemede fare ADAM6 lokusu, yerlestirilen insan VH gen segmentlerinin 3' ucunun yaklasik 20 kilo baz (kb) ila yaklasik 40 kilo baz (kb) içindeki iki VH gen segmenti arasinda bulunmaktadir. Spesifik bir düzenlemede fare ADAM6 lokusu, yerlestirilen insan VH gen segmentlerinin 3' ucunun yaklasik 29 kb ila yaklasik 31 kb içindeki iki VH gen segmenti arasinda bulunmaktadir. Spesifik bir düzenlemede fare ADAM6 lokusu, yerlestirilen insan VH gen segmentlerinin 3' ucunun yaklasik 30 kb içinde bulunmaktadir. Spesifik bir düzenlemede fare ADAM6 lokusu, yerlestirilen insan VH gen segmentlerinin 3! ucunun yaklasik 30,184 bp içinde bulunmaktadir. Spesifik bir düzenlemede replasman, insan VH gen segmentleri VH1- 2 ve VH6-1'i içermektedir ve fare ADAM6 Iokusu, VH1-2 gen segmentinin asagisinda ve VH6-1 gen segmentinin yukarisinda bulunmaktadir. Spesifik bir düzenlemede fare ADAM6 Iokusu, insan VH1-2 gen segmenti ve insan VH6-1 gen segmenti arasinda bulunmakta olup, fare ADAM6 Iokusunun 5* ucu, insan VH1-2 gen segmentinin 37 ucundan yaklasik 13,848 bp ve ADAM6 Iokusunun 3' ucu, insan VH6-1 gen segmentinin 5' ucundan yaklasik 29,737 bd'dir. Spesifik bir düzenlemede fare ADAM6 lokusu, fare hücrelerinde ADAM6 fonksiyonunu saglayan SEKANS ID NO:3,ü ya da bunun fonksiyonel bir fragmanini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, insan VH gen segmentlerinin düzenlenmesi asagidaki gibidir (insan VH gen segmentlerinin transkripsiyon yönüne göre yukaridan asagiya dogru): insan VH1-2 -fare ADAM6 Iokusu - insan VH6-1. Spesifik bir düzenlemede insan VH1-2 ve insan VH6-1 arasindaki ADAM6 yalanci geni, fare ADAM6 Iokusu ile degistirilmektedir. Bir düzenlemede, fare ADAM6 Iokusunun bir ya da daha fazla fare ADAMöa ve fare ADAMöb oryantasyonu, insan VH gen segmentlerinin oryantasyonuna kiyasla, transkripsiyon yönüne karsi zitlik göstermektedir. Alternatif olarak, fare ADAM6 Iokusu, Bt-en çok insan VH gen segmenti ve 5'-en çok DH gen segmenti arasinda intergenik bölgede bulunmaktadir. 5,-en çok DH segmentinin fare ya da insan oldugu bir durum olabilir. Benzer sekilde, tüm ya da büyük ölçüde bütün endojen fare VH gen bölümlerinin yerini alan bir ya da daha fazla insan VL gen segmenti (örnek olarak VK ya da V A segmenti) ile modifiye edilmis bir fare, yukarida tarif edildigi gibi endojen fare ADAM6 ya da bunun fonksiyonel bir fragmanini içeren bir asagi akis homoloji koluna sahip bir hedefleme vektörü kullanilmasi ya da iki insan VL gen segmenti arasina ya da insan VL gen segmenti ve bir DH gen segmenti arasina ya da bir J gen segmenti arasina yerlestirilmis ektopik bir sekans ile hasarli bir fare ADAM6 Iokusunun degistirilmesi. Iki ya da daha fazla insan VL gen segmentlerini ve fare ADAM6 Iokusu ya da bunun fonksiyonel fragmanini içeren replasman, iki 3'-en çok VL gen segmenti arasinda yer almaktadir. Insan VL gen segmentlerinin yeniden düzenlenmesi asagidaki gibidir (insan gen segmentlerinin transkripsiyon yönüne göre yukaridan asagiya dogru): insan VL3r-1 - fare ADAM6 Iokusu - insan VL3'. Fare ADAM6 Iokusunun bir ya da daha fazla fare ADAMGa ve fare ADAM6b*sinin oryantasyonu, insan VL gen segmentlerinin oryantasyonu ile karsilastirildiginda transkripsiyon yönüne zit olabilir. Alternatif olarak, fare ADAM6 Iokusu, 3'-en çok insan VL gen segmenti ve 5,-en çok DH gen segmenti arasindan intergenik bölgede bulunmaktadir. 5'-en çok DH segmentinin fare ya da insan oldugu bir durum olabilir. Bir ya da daha fazla endojen fare VH gen segmentinin replasmani bulunan ve en az bir endojen fare DH gen segmenti içeren bir fare burada tarif edilmektedir. Böyle bir farede, endojen fare VH gen segmentlerinin modifikasyonu, bir ya da daha fazla 3'- en çok VH gen segmentinin bir modifikasyonunu içerebilir ancak 5,-en çok DH gen segmentininkini içermez; bir ya da daha fazla 3'-en çok VH gen segmentinin modifikasyonunun, endojen fare ADAM6 Iokusunun islevselligini bozmamasina ya da islevsiz hale getirmemesine dikkat edilir. Ornek olarak fare, bir ya da daha fazla insan VH gen segmenti ile tüm ya da büyük ölçüde bütün endojen fare VH gen segmentlerinin replasmanini içerebilir ve fare bir ya da daha fazla endojen DH gen segmenti ve fonksiyonel bir endojen fare ADAM6 Iokusu içerebilir. Bir fare ADAMG proteini ya da bir ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmanini kodlayan bir ektopik sekans içeren farelerin kullanilmasi, endojen fare ADAMörnin fonksiyonunu bozdugu durumlarda faydalidir. Endojen fare ADAM6 fonksiyonunu bozma olasiligi, özellikle fare immünoglobülin agir zincir degisken bölgelerini ve etrafindaki sekanslari degistirirken, fare immünoglobülin lokuslarinda modifikasyonlar yaparken yüksektir. Bu nedenle, tamamen ya da kismen silinmis, tamamen ya da kismen insanlastirilmis ya da tamamen ya da kismen degistirilmis (örnek olarak, VK ya da V A sekanslari ile) immünoglobülin agir zincir Iokuslari ile fareler yapilirken, bu tür fareler belirli bir fayda saglamaktadir. Asagida tarif edilen fareler için tarif edilen genetik modifikasyonlarin yapilmasina yönelik yöntemler, teknik alanda uzman kisiler tarafindan bilinmektedir. Bir fare ADAM6 proteininin kodlayan ektopik bir sekansa ya da bir fare ADAM6 proteinin fertilite faydalarini saglayan esasen özdes ya da benzer proteine sahip fareler, endojen fare ADAM6 sekansini bozan ya da silen bir fare immünoglobülin agir zincir degisken gen lokusundaki modifikasyonlar ile birlikte özellikle faydalidir. Her ne kadar öncelikle, insan degisken bölgeleri ve fare sabit bölgeleri olan antikorlari ifade eden fareler ile baglantili olarak tarif edilmis olsa da, bu tür fareler, endojen fare ADAM6 genlerini bozan herhangi bir genetik modifikasyon ile baglantili olarak faydalidir. Teknik alanda uzman kisiler bunun, fare immünoglobülin agir zincir degisken gen lokuslarinin modifikasyonlarini içeren, genetik olarak degistirilmis çok çesitli fareleri içerdigini anlayacaktir. Bunlar, örnek olarak, baska modifikasyonlara bakilmaksizin, fare immünoglobülin agir zincir gen segmentlerinin tamaminin ya da bir kisminin delesyonu ya da replasmani olan fareleri içermektedir. Bir farede fonksiyonel olarak ektopik bir fare, kemirgen ya da baska bir ADAM6 geni (ya da ortolog ya da homolog ya da fragman) ve bir ya da daha fazla insan immünoglobülin degisken ve / veya sabit bölge gen segmentlerini içeren genetigi degistirilmis fareler tarif edilmektedir. Bir farede fonksiyonel olan diger ADAM6 gen ortologlari ya da homologlari ya da fragmanlari, sigir, köpek, primat, tavsan ya da diger insan disi sekanslari içerebilir. Fonksiyonel bir ADAM6 proteini, tüm ya da büyük ölçüde bütün fare VH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan VH gen segmentleri ile replasmanini; tüm ya da büyük ölçüde bütün fare DH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan DH gen segmentleri ile replasmanini ve tüm ya da büyük ölçüde bütün fare JH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan JH gen segmentleri ile replasmanini kodlayan, ektopik bir ADAM6 sekansini içeren bir fare tarif edilmektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica bir insan CH1 nükleotid sekansi ile bir fare CH1 nükleotid sekansinin replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica bir fare mentese nükleotid sekansinin, bir insan mentese nükleotid sekansi ile replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica bir immünuglobülin hafif zincir degisken lokusunun (VL ve JL) bir insan immünoglobülin hafif zincir degisken Iokusu ile replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica bir fare immünoglobülin hafif zincir sabit bölge nükleotid sekansinin, bir insan immünoglobülin hafif zincir sabit bölge nükletoid sekansi ile replasmanini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede VL, JL ve CL, immünoglobülin K hafif zincir sekanslaridir. Spesifik bir düzenlemede bir fare, bir insan mentese ve bir insan CH1 sekansi ile kaynasik bir fare CH2 ve bir fare CH3 immünoglobülin sabit bölge sekansini içermekte olup; öyle ki fare immünoglobülin lokusu, (a) bir insan degisken bölgesi, bir insan CH1 bölgesi, bir insan mentese bölgesi ve bir fare CH2 ve bir fare CH3 bölgesine sahip bir agir zincir ve (b) bir insan degisken alani ve bir insan sabit bölgesi içeren bir immünoglobülin hafif zincir kodlayan bir gen içeren bir baglayici proteini kodlayan bir gen olusturmak üzere yeniden düzenlenir. Bulusun bir görüsüne göre saglanan fare, fonksiyonel bir ADAM6 proteini, tüm ya da büyük ölçüde bütün fare VH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan VL gen segmentleri ile replasmanini ve istege bagli olarak, tüm ya da büyük ölçüde bütün DH gen segmentlerinin ve / veya JH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan DH gen segmentleri ve /veya insan JH gen segmentleri ile replasmanini ya da istege bagli olarak tüm ya da büyük ölçüde bütün DH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan JL gen segmentleri ile replasmanini kodlayan ektopik bir ADAM6 sekansini içermektedir. Fare, tüm ya da büyük ölçüde bütün fare VH, DH ve JH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla VL, bir ya da daha fazla DH ve bir ya da daha fazla J gen segmentleri (örnek olarak JK ya da J A) ile bir replasmanini içerebilir ki, buradaki gen segmentleri, endojen bir fare mentese bölgesine islevsel olarak baglanmakta olup, buradaki fare transkripsiyon yönünde &den &ne dogru insan VL - insan ya da fare DH - insan ya da fare J - fare mentese - fare CH2 - fare CH3 içeren yeniden düzenlenmis bir immünoglobülin zincir geni olusturur. Bir düzenlemede J bölgesi, Insan JK bölgesidir. J bölgesi, bir insan JH bölgesi olabilir. J bölgesi, bir insan J A bölgesidir. Insan VL bölgesi, bir insan V A bölgesinden ve bir insan VK bölgesinden seçilebilir. Fare, bir fare ya da insan sabit bölgeye ve bir insan VK, bir insan DH ve bir insan JK; bir insan VK, bir insan DH ve bir insan JH; bir insan V A, bir insan DH ve bir insan J A; bir insan V A, bir insan DH ve bir insan JH; bir insan VK, bir insan DH ve bir insan J A; bir insan V A, bir insan DH ve bir insan JKrsindan türetilmis bir degisken bölgeye sahip tek bir degisken alan antikorunu eksprese edebilir. Rekombinasyon tanima sekanslari, belirtilen V, D ve J gen segmentleri arasinda ya da belirtilen V ve J gen segmentleri arasinda verimli replasmanlarin yapilmasina izin verecek sekilde modifiye edilebilir. Fonksiyonel bir ADAM6 proteini (ya da ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani), tüm ya da büyük ölçüde bütün fare VH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan VL gen segmentleri ile bir replasmanini, tüm ya da büyük ölçüde bütün fare DH gen segmentinin ve JH gen segmentinin bir ya da daha fazla insan JL gen segmentleri ile bir replasmanini kodlayan ektopik bir ADAM6 sekansi içeren bir fare tarif edilmekte olup, buradaki fare CH1 ve / veya mentese bölgesinden yoksundur. Bir düzenlemede fare, bir CH1 alanini kodlayan bir sekanstan yoksundur. Bir düzenlemede fare, bir mentese bölgesini kodlayan bir sekanstan yoksundur. Bir düzenlemede fare, bir CH1 alanini ve bir mentese bölgesini kodlayan bir sekanstan yoksundur. Spesifik bir düzenlemede fare, bir fare CH3 bölgesine bagli bir fare CH2 bölgesine kaynasik bir insan immünoglobülin hafif zincir degisken bölgesini ( A ya da K) içeren bir baglayici proteini eksprese eder. Fonksiyonel bir ADAM6 proteinini (ya da ortolog ya da homolog ya da bunun fonksiyonel fragmani), tüm ya da büyük ölçüde bütün fare VH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan VL gen segmentleri ile bir replasmanini, tüm ya da büyük ölçüde bütün fare DH ve JH gen segmentlerinin bir ya da daha fazla insan JL gen segmentleri ile bir replasmanini kodlayan bir ektopik ADAM6 sekansini içeren bir fare tarif edilmektedir. Bir düzenlemede fare, bir CH1 bölgesini, bir mentese bölgesini, bir CH1 bölgesi ve bir mentese bölgesini ya da bir CH1 bölgesi ve bir mentese bölgesi ve bir CH2 bölgesini kodlayan bir immünoglobülin agir zincir sabit bölge gen sekansinin delesyonunu içermektedir. Bir düzenlemede fare, asagidakilerden seçilen bir homodimer içeren bir tek degisken alan baglayici protein yapmaktadir: (a) insan VL -fare CH1 -fare CH2 -fare CH3; (b) insan VL -fare mentese -fare CH2 -fare CH3; (o) insan VL -fare CH2 -fare CH3. Bir bozulmus ya da silinmis endojen fare ADAM6 lokusu içeren, etkisiz bir endojen agir zincir immünoglobülin Iokusuna sahip bir fare tarif edilmekte olup, buradaki fare, bir insan ya da fare ya da insan / fare ya da diger kimerik antikoru eksprese eden bir nükleik asit sekansi içermektedir. Bir düzenlemede, fare ayrica etkisiz bir endojen immünoglobülin hafif zincir lokusu içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, endojen immünoglobülin hafif zincir lokusu, bir kappa (K) v bir lambda ( A) hafif zincir Iokusundan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, fare etkisiz bir endojen K hafif zincir lokusu ve etkisiz bir A hafif zincir lokusu içermekte olup, buradaki fare, bir insan immünoglobülin agir zincir degisken bölgesi ve bir insan immünoglobülin hafif zincir alani içeren bir antikoru eksprese etmektedir. Bir düzenlemede, insan immünoglobülin hafif zincir degisken bölgesi, bir insan K hafif zincir alanindan ve bir insan )\ hafif zincir alanindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede fare, etkisiz bir endojen K hafif zincir Iokusu içermekte olup; burada fare, bir insan / fare (yani insan degisken / fare sabit) immünoglobülin agir zinciri ve bir insan V A bölgesi içeren bir insan / fare immünoglobülin hafif zinciri içeren bir antikoru eksprese etmektedir. Bir düzenlemede, insan / fare immünoglobülin hafif zinciri, bir fare CK içermektedir. Bir düzenlemede, insan / fare immünoglobülin hafif zinciri, bir fare CA içermektedir. Spesifik bir düzenlemede fare C A, bir C A27dir. Kimerik bir antikor eksprese eden ve genetigi degistirilmis bir hayvanda fonksiyonel olan bir ADAM6 proteini ya da ortolog ya da homologunu eksprese eden genetigi degistirilmis bir hayvan tarif edilmektedir. Genetik olarak modifiye edilmis hayvan bir faredir. Bir düzenlemede genetik olarak modifiye edilmis hayvan bir faredir, ve ADAM6 proteini ya da onun ortologu ya da homologu genetik olarak modifiye edilmis hayvandan farkli bir sus olan bir fare susundandir. Bir kimerik antikor, bir insan degisken alani ve bir kemirgenin sabit bölge sekansini içerebilir. Kemirgen, Cricetidae ailesinin bir kemirgeninden ve Muridae ailesinin bir kemirgeninden seçilebilir. Cricetidae ailesinden ve Muridae ailesinden olabilen kemirgen bir faredir. Cricetidae ailesinden ve Muridae ailesinden olabilen kemirgen bir siçandir. Kimerik antikor, bir insan degisken alani ve bir fare ya da siçandan seçilen bir hayvandan sabit bir alan içerebilir; fare ya da siçan, Cricetidae ailesinden ve Muridae ailesinden seçilebilir. Kimerik antikor bir insan agir zincir degisken bölgesin, bir insan hafif zincir degisken bölgesi ve bir fare ve siçan arasindan seçilen bir kemirgenden elde edilen bir sabit bölge sekansini içerebilir, burada insan agir zincir degisken bölgesi ve insan hafif zinciri soydastir. Soydas, insan hafif zincir degisken bölgesi ve insan agir zincir degisken bölgesi birlikte ekspres eden ve degisken alanlari birlikte tek bir B hücresinin yüzeyinde sunan tek bir B hücresinden gelen insan agir zinciri ve insan hafif zincir degisken alanlarini içerenlerdir. Kimerik antikor bir immünoglobulin lokusundan ekspres edilebilir. Kimerik antikorun agir zincir degisken bölgesi bir yeniden düzenlenmis endojen immünoglobulin agir zincir lokusundan ekspres edilmektedir. Kimerik antikorun hafif zincir degisken bölgesi bir yeniden düzenlenmis endojen immünoglobulin hafif zincir lokusundan ekspres edilmis olabilir. Bir insanlastirilmis immünoglobulin agir zincir Iokusu içeren bir fare tarif edilmekte olup, burada insanlastirilmis immünoglobulin agir zincir lokusu bir insan disi ADAM6 sekansi ya da onun ortologu ya da homologunu içermektedir. Insan disi hayvan bir fare, bir siçan ve bir hamster arasindan seçilen bir kemirgen olabilir. Insan disi ADAM6 ortologu ya da homologu, bir fare ADAM6 sekansina ortolog ya da / ya da homolog olan bir sekans olabilir, ki burada ortolog ya da homolog, farede islevseldir. Spesifik bir düzenlemede, ADAM6 ortologu ya da homologu farkli bir fare türünden, bir siçandan ve bir hamsterdan seçilen bir hayvandan gelmektedir. Spesifik bir düzenlemede, ADAM6 sekansi Dipodoidea süper ailesinden bir kemirgen ve Muroidea süper ailesinden bir kemirgen arasindan seçilen bir hayvandan alinmaktadir. Spesifik bir düzenlemede fare, Muroidea süper ailesindendir ve ADAM6 ortologu ya da homologu Muroidea süper ailesinden bir fare ya da bir siçan ya da bir hamsterdandir. Insanlastirilmis agir zincir lokusu bir ya da birden fazla insan VH gen segmenti, bir ya da birden fazla insan DH gen segmenti ve bir ya da birden fazla insan JH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, bir ya da birden fazla insan VH gen segmenti, bir ya da birden fazla insan DH gen segmenti ve bir ya da birden fazla insan JH gen segmenti bir ya da birden fazla insan, kimerik ve / veya kemirgen (örnegin fare ya da siçan) sabit bölge genine islevsel olarak baglidir. Bir düzenlemede sabit bölge genleri faredir. Bir düzenlemede sabit bölge genleri siçandir. Bir düzenlemede sabit bölge genleri hamsterdir. Bir düzenlemede, sabit bölge genleri bir mentese, bir CH2, bir CH3 ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilen bir sekans içermektedir. Spesifik bir düzenlemede sabit bölge geni bir mentese, bir CH2, ve bir CH3 sekansi içermektedir. Bir düzenlemede insan disi ADAM6 sekansi bir insan immünoglobulin agir zincir sekansi ile bitisiktir. Insan disi ADAM6 sekansi bir insan immünoglobulin agir zincir sekansi içerisinde konumlandirilmistir. Insan immünoglobulin agir zincir sekansi bir V, D ve J gen segmentini içermektedir. Bir düzenlemede insan disi ADAM6 sekansi bir V geni segmenti ile yan yana yerlestirilmistir. Bir düzenlemede insan disi ADAM6 sekansi iki V geni segmenti arasinda konumlandirilmistir. Bir düzenlemede insan disi ADAM6 sekansi bir V ve bir D gen segmenti arasinda yan yana yerlestirilmistir. Bir düzenlemede fare ADAM6 sekansi bir V ve bir J geni segmenti arasinda konumlandirilmistir. Bir düzenlemede fare ADAM6 sekansi bir D ve bir J geni segmenti arasinda yan yana yerlestirilmistir. Bir immünoglobülin Iokusundan bir insan VL alani ile birlikte bir insan VH alanini ekspres eden bir B hücresini içeren genetik olarak modifiye edilmis bir insan disi hayvan tarif edilmekte olup, burada insan disi hayvan immünoglobulin Iokusundan bir immünoglobulin olmayan insan disi protein ekspres etmektedir. immünoglobulin disi insan disi protein örnegin Muridae ailesinden bir kemirgen proteini olabilir. Insan immünoglobulin sekansi bir ya da daha fazla VH gen segmenti, bir ya da daha fazla DH gen segmenti ve bir ya da daha fazla JH gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, immünoglobulin sekansi, dogal insan repertuvarlarinda yüksek bir frekansa sahip olan bir ya da birden fazla VH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, bir ya da birden fazla VH gen segmentleri en fazla iki VH gen segmenti, en fazla üç VH gen segmenti, en fazla dört VH gen segmenti, en fazla bes VH gen segmenti, en fazla alti VH gen segmenti, en fazla yedi VH gen segmenti, en fazla sekiz VH gen segmenti, en fazla dokuz VH gen segmenti, en fazla 10 VH gen segmenti, en fazla 11 VH gen segmenti, en fazla 12 VH gen segmenti, en fazla 13 VH gen segmenti, en fazla 14 VH gen segmenti, en fazla 15 VH gen segmenti, en fazla 16 VH gen segmenti, en fazla 17 VH gen segmenti, en fazla 18 VH gen segmenti, en fazla 19 VH gen segmenti, en fazla 20 VH gen segmenti, en fazla 21 VH gen segmenti, en fazla 22 VH gen segmenti, en fazla 23 VH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede bir ya da birden fazla VH gen segmenti bes VH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede bir ya da birden fazla VH gen segmenti 10 VH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede bir ya da birden fazla VH gen segmenti 15 VH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede bir ya da birden fazla VH gen segmenti 20 VH gen segmenti içermektedir. arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde VH gen segmentleri VH1-2, VH1-8, ve VH6-1 arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde VH gen segmentleri VH1- seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde VH gen segmentleri VH1-18, VH3-11, VH3-21, arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde VH gen segmentleri VH1-18, VH3- 23 ve VH4-39 arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde VH gen segmentleri VH3-21, VH3-23 ve VH3-30 arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde VH gen segmentleri VH3-23, VH3-30 ve VH4-39 arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin sekansi en az 18 VH gen segmenti, 27 DH gen segmenti ve alti JH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin sekansi en az 39 VH gen segmenti, 27 DH gen segmenti ve alti JH gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin sekansi en az 80 VH gen segmenti, 27 DH gen segmenti ve alti JH gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede fare, endojen fare VH gen segmentlerinin bir ya da birden fazla insan VH gen segmenti ile replasmanini içermekte olup, burada insan VH gen segmentleri fare insan VH gen segmentlerini yeniden düzenleyecek ve bir insan VH alani ve bir fare CH'si içeren bir ters kimerik immünoglobülin agir zinciri ekspres edecek sekilde bir fare CH bölge genine islevsel olarak baglanmaktadir. Bir düzenlemede, yeniden düzenlenmemis fare VH gen segmentlerinin % 90-100'ü, en az bir yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti ile degistirilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, endojen fare VH gen segmentlerinin tamami ya da büyük oranda tamami en az bir yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti ile degistirilmektedir. Bir düzenlemede, replasman en az 19, en az 39 ya da en az 80 ya da 81 yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir düzenlemede, replasman en az 12 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti, en az 25 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti ya da en az 43 fonksiyonel yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir düzenlemede fare, tüm fare DH ve JH segmentlerinin en az bir yeniden düzenlenmemis insan DH segmenti ve en az bir yeniden düzenlenmemis insan JH segmenti ile replasmanini içermektedir. Bir düzenlemede en az bir yeniden düzenlemede, en az bir yeniden düzenlenmemis insan JH segmenti, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, bir segmenti ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmektedir. Çesitli düzenlemelerde, insan immünoglobulin sekansi farenin germ hattindaki bir sabit bölge ile islevsel olarak baglantilidir. Bir düzenlemede sabit bölge bir insan, kimerik bir insan / fare ya da kimerik bir insan / siçan ya da kimerik bir insan / hamster, bir fare, bir siçan ya da bir hamster sabit bölgesidir. Bir düzenlemede sabit bölge bir kemirgen (örnegin fare ya da siçan ya da hamster) sabit bölgesidir. Spesifik bir düzenlemede, kemirgen bir fare ya da siçandir. Çesitli düzenlemelerde, sabit bölge en az bir CH2 alani ve bir CH3 alani içermektedir. Insan immünoglobulin agir zincir sekansi, farenin germ hattinda bir immünoglobulin agir zincir lokusunda yer almaktadir. Fare ayrica, farenin germ hattinda bir ya da birden fazla yeniden düzenlenmemis hafif zincir V ve J sekanslari içeren bir insan immünoglobulin hafif zincir sekansi içermektedir. immünoglobulin hafif zincir sekansi bir immünoglobulin A hafif zincir sekansidir. Insan immünoglobulin hafif zincir sekansi bir ya da birden fazla V A gen segmenti ve bir ya da birden fazla J )\ gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin hafif zincir sekansi en az 12 V A gen segmenti ve bir J A gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin hafif zincir sekansi en az 12 V A gen segmenti ve dört J A gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin hafif zincir sekansi en az 28 V A gen segmenti ve bir J A gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin hafif zincir sekansi en az 28 V A gen segmenti ve dört J A gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin hafif zincir sekansi en az 40 V A gen segmenti ve bir .J A gen segmenti içermektedir. Spesifik bir düzenlemede insan immünoglobulin hafif zincir sekansi en az 40 V A gen segmenti ve dört J A gen segmenti içermektedir. Insan immünoglobulin hafif zincir sekansi insan disi hayvanin ( örnegin, kemirgen, örnegin fare ya da siçan ya da hamster) germ hattindaki bir sabit bölge ile islevsel olarak baglantilidir. Sabit bölge bir fare K sabit (mCK) bölgesidir. Insan immünoglobulin hafif zincir sekansi, farenin germ hattinda bir immünoglobulin hafif zincir Iokusunda yer almaktadir. Farenin germ hattindaki immünoglobulin hafif zincir Iokusu bir immünoglobulin K hafif zincir Iokusudur. Bir insan antikoru yapmak için bir yöntem olup tarif edilmekte olup, burada insan antikoru, burada tarif edildigi gibi insan disi bir hayvanin bir hücresinde kodlanan bir ya da birden fazla degisken bölge nükleik asit sekansindan elde edilen çesitli alanlari içermektedir. Burada tarif edildigi gibi bir fareden izole edilen bir ya da daha fazla degisken bölge nükleik asit sekansindan türetilen antikor ya da antikor fragmani içeren bir polipeptit içeren farmasötik bir kompozisyon tarif edilmektedir. Polipeptid bir antikor olabilir. Polipeptid sadece agir zincirli bir antikor olabilir. Polipeptid tek bir zincir degisken fragmani olabilir (örnegin bir scFv). Bulusun bir yönünde, bir antikor yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmaktadir. Çesitli düzenlemelerde antikor, fareden izole edilen bir ya da birden fazla degisken bölge nükleik asit sekansindan elde edilen bir ya da birden fazla degisken alani içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, degisken bölge nükleik asit sekanslari immünoglobulin agir zincir gen segmentleri içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, degisken bölge nükleik asit sekansi immünoglobulin hafif zincir gen segmentleri içermektedir. Insan A Degisken Alanlarini Ekspres Eden Fareler Bir ADAM protein aktivitesinin kaybi nedeniyle (örnegin, ADAM6'ya bagli) fertiliteyi azaltan bir modifikasyon içeren genetik olarak modifiye edilmis fare, endojen fare sabit hafif genlerinde insan A degisken sekanslarini içeren bir fare ile burada tarif edildigi gibi çiftlestirilebilir. Ornegin, hasarli bir ADAM6 geni (ya da silinmis bir ADAM6 geni) içeren fareler, örnegin insanlastirilmis immünoglobülin agir zincir lokuslarina sahip hayvanlar, fare imm'unoglob'ulin K hafif zincir sabit bölge genlerine bagli insan A segmentlerini ve J A segmentlerini içeren bir hafif zincir Iokusu (endojen ya da transgenik) içeren fareler ile birlestirilmekte olup, burada insan disi hayvanlar, ADAM'ye bagli fertiliteyi geri kazandiran bir aktivite içermektedir. ADAM'ye bagli fertiliteyi geri getiren genetik modifikasyon, insanlastirilmis bir agir zincirli farede ya da insanlastirilmis A degisken segmentli bir farede olabilir. Yavru insanlastirilmis bir agir zincir (yani, bir insan agir zincir degisken bölgesini ekspres etme ile sonuçlanir) ve insanlastirilmis bir hafif zincir Iokusu (yani, bir farenin yöresine kaynastirilmis olan bir insan )\ hafif zincir degisken bölgesini ekspres etmekle sonuçlanir) olusturan genleri içermekte olup, burada hayvanlar, ADAM6 aktivitesinden ya da ADAMö'nin bir ortologunun ya da homologunun aktivitesinden yoksun olan bir fareye kiyasla artan bir fertilite sergilemistir. VELOCIMMUNE® genetik olarak tasarlanmis fareler, Insan V(D)J gene segment ile endojen fare Iokuslarinda bir yeniden düzenlenmemis V(D)J gen segmentinin replasmanini içermektedir. VELOCIMMUNE® fareleri, insan degisken alanlarina ve fare sabit alanlarina sahip kimerik antikorlari ekspres etmektedir (bakiniz örn., ABD Patenti No. 7,605,237). Diger birçok rapor, engelli endojen immunoglobulin lokuslarina sahip olan farelerde tamamen insan transgenlerinden tamamen insan antikorlari ekspres eden fareler ile ilgilidir. Antikor hafif zincirler bir ya da iki ayri Iokus ile kodlanmaktadir: kappa (K) ve lambda ( A). Fare antikor hafif zincirleri büyük oranda K tipidir. Fare antikorlari yapan fareler ve tamamen insan ya da kimerik insan-fare antikorlari yapan modifiye fareler, hafif zincir kullaniminda bir sapma sergilemektedirler. Insanlar da hafif zincir sapmasi sergilerler ancak bu, farelerde oldugu kadar belirgin degildir; K hafif zincirlerinin farelerdeki A hafif zincirlere orani yaklasik 955 iken bu oran insanlarda yaklasik 60:40'tir. Farelerde daha belirgin olan sapmanin, antikor çesitliligini ciddi sekilde etkiledigi düsünülmemektedir, çünkü farelerde A degisken lokusu ilk durumda çok çesitli degildir. Bu insanlarda böyle degildir. Insan /l hafif zincir lokusu çarpici zengin bir çesitlilige sahiptir. Insan A hafif zincir Iokusu 1.000 kb'nin üzerine çikmakta ve degisken (V) ya da birlestirme (J) segmentlerini kodlayan 80'den fazla gen içermektedir (SEKIL 19). Insan A hafif zincir Iokusu içinde, gözlenen tüm V A alanlarinin yarisindan fazlasi, 1- insan V A gen segmentlerinin yaklasik 30 kadarinin (ya da fazlasinin) fonksiyonel olduguna inanilmaktadir. Yedi J A gen segmenti mevcut olup bunlardan sadece dördü genel olarak islevsel J A gen segmentleri-J M, J A2, J A3 ve J A7 olarak kabul edilmektedir. Insanlardaki A hafif zincir Iokusu, hem farelerin hem de insanlarin A lokuslarina yapi olarak benzerdir çünkü insan A hafif zincir Iokusu, fonksiyonel bir hafif zincir proteini olusturmak için yeniden birlesebilen birçok degisken bölge gen segmentine sahiptir. Insan A hafif zincir Iokusu yaklasik 70 V gen segmenti ve 7 J A-C /l gen segmenti çifti içermektedir. Bu J A-C A gen segmenti çiftlerinden sadece dördü fonksiyonel gözükmektedir. Bazi alellerde, bir besinci J A-C A gen segmenti çifti bildirildigi gibi yalanci bir gendir (C A6). 70 V A gen segmentinde 38 fonksiyonel gen segmenti içermekte gibi görünmektedir. 70 V A sekanslari, hepsi farkli V gen ailesi gruplarinin farkli üyelerini içeren (A, B ve C kümeleri; SEKIL 19) üç kümede düzenlenmistir. Bu, insan disi hayvanlarda insan V bölgeleri ile antikorlar üretmek için potansiyel olarak zengin bir çesitlilikte kullanilmamis çesitlilik kaynagidir. Bunun tam tersine, fare A hafif zincir lokusu sadece iki ya da üç (susa bagli olarak) fare V A bölgesi gen segmenti içermektedir (Sekil 20). En azindan bu nedenle, farelerdeki siddetli K yanliliginin, toplam antikor çesitliligine özellikle zararli oldugu düsünülmemektedir. Fare A hafif zincir lokusunun yayinlanmis haritalarina göre, Iokus büyük oranda, yaklasik 200 kb'lik bir aralik içindeki iki gen segmenti kümesinden meydana gelmektedir (Sekil 20). Iki küme, bagimsiz yeniden düzenleme kapasitesine sahip olan iki V, J ve C gen seti içermektedir: V A2-J A2-C A2-J A4-C A4 ve V A1-J A3-C A3-J A1-C A1. Her ne kadar V A-2'nin tüm J A gen segmentleri ile rekombine oldugu bulunmus olmasina ragmen, V /\1 sadece C A1 ile rekombine olur gibi gözükmektedir. C A4'ün, hatali ayrilma bölgelerine sahip olan bir sahte gen olduguna inanilmaktadir. Fare K hafif zincir Iokusu çarpici biçimde farklidir. Fare K Iokusundan fonksiyonel bir hafif zincir proteinine yol açan rekombinasyon olayinda yer alan gen segmentlerinin yapisi ve sayisi çok daha karmasiktir (SEKIL 21). Bu nedenle fare A hafif zincirleri tipik bir faredeki antikor popülasyonunun çesitliligine büyük ölçüde katkida bulunmamaktadir. Farelerde insan A hafif zincir lokusunun zengin çesitliliginin kullanilmasi, diger seylerin yani sira, muhtemelen hafif zincir V alanlarinin daha eksiksiz bir insan repertuari için bir kaynakla sonuçlanmaktadir. Bu çesitlilikten faydalanmaya yönelik daha önceki girisimler fare genomuna rastgele eklenen insan A hafif zincir lokusunun parçalarini içeren insan transgenlerini kullanmistir (bakiniz, örnegin ABD 6,998,514 ve ABD 7,435,871). Bu rastgele entegre edilmis transgenlere sahip olan farelerin tamamen insan A hafif zincirleri ekspres ettigi, ancak bazi durumlarda endojen hafif zincir Iokuslarindan biri ya da her ikisin de bozulmadan kaldigi bildirilmistir. Insan /\ hafif zincir sekanslari, farenin ekspres edilmis antikor repertuarinda fare hafif zinciriyle (K ya da A) rekabet ettigi için bu durum arzulanan bir durum degildir. Bunun tersine bulusun mucitleri bir endojen fare K hafif zincir Iokusunda replasman da dahil olmak üzere bir ya da daha fazla A hafif zincir nükleik asit sekansini dogrudan bir fare K hafif zincir Iokusundan ekspres etme kapasitesine sahip genetik olarak modifiye edilmis fareleri tarif etmektedir. Insan A hafif zincir sekanslarini endojen bir Iokustan eksprese edebilen genetigi degistirilmis fareler bir insan agir zincir Iokusunu içeren bir fare ile çiftlestirilebilir ki bu sayede tamamen insan olan V bölgelerini (agir ve hafif) içeren antikorlari ifade etmek için kullanilabilir. Çesitli düzenlemelerde, V bölgeleri fare sabit bölgelerini ekspres etmektedir. Çesitli düzenlemelerde, hiçbir endojen fare immünoglobulin gen segmenti mevcut degildir ve V bölgeleri insan sabit bölgelerini ekspres etmektedir. Bu antikorlar hem tanisal ve hem de terapötik bir çok uygulamada faydali olabilirler. Farelerde insan V /\ ve J A gen segmentlerinden türetilen baglayici proteinlerin ekspres edilmesiyle ilgili çesitli düzenlemeler için bir çok avantaj saglanabilir. Insan /\ sekanslarini endojen bir hafif zincir lokusuna, örnegin fare K ya da A Iokusuna yerlestirerek söz konusu avantajlar hayata geçirilebilir. Bu gibi farelerden elde edilen antikorlar bir fare CL bölgesine, özellikle de bir fare CK ya da C /\ bölgesine kaynasmis insan V A alanlarini içeren hafif zincirlere sahip olabilirler. Fareler ayrica insan CL bölgeleriyle, özellikle CK ve /veya C A bölgeleriyle kullanim için tanimlama ve klonlama için uygun olan insan V A bölgelerini de ekspres edecektir. Böyle farelerde B hücresi gelisimi aksi taktirde normal oldugu için, C A ya da CK bölgeleri baglaminda uyumlu V /\ alanlari (somatik olarak mutasyona ugramis V /\ alanlari dahil) üretmek mümkündür. Bir immünoglobulin K hafif zincir lokusunda bir yeniden düzenlenmemis V A gen segmenti içeren genetik olarak modifiye edilmis fareler tarif edilmektedir. Bir fare CK bölgesine kaynasmis bir insan V A bölgesine sahip bir hafif zincir içeren antikorlari ekspres eden fareler tarif edilmektedir. Genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup söz konusu fare sunlari içermektedir: (1) insan disi hayvanin endojen bir immünoglobulin hafif zincir lokusunda bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis insan V A gen segmenti ve bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis insan J A gen segmenti, (2) insan disi hayvanin endojen bir immünoglobulin agir zincir Iokusundaki bir ya da daha fazla insan Vh gen segmenti, bir ya da daha fazla insan Dh gen segmenti ve bir ya da daha fazla insan Dh gen segmenti; ki burada fare bir ADAM6 proteinini ya da onun fonksiyonel bir fragmanini ekspres edebilmektedir, burada ADAM6 proteini insan disi hayvanin bir erkeginde fonksiyoneldir. Insan insan VH alanlarini ve insan disi agir zincir sabit bölgelerini içeren agir zincirler ve insan V A alanlarini ve fare K hafif zincir sabit bölgelerini içeren hafif zincirleri içeren antikorlari ekspres eden genetik olarak modifiye edilmis bir fare tarif edilmekte olup, burada fareler bir ADAM6 proteinini ya da onun fonksiyonel bir fragmanini ek3pres edebilmektedir. Bir düzenlemede ADAM6 proteini ya da onun fonksiyonel fragmani farenin germ hattindaki bir ektopik sekans tarafindan kodlanmaktadir. Bir düzenlemede ADAM6 proteini ya da onun fonksiyonel fragmani farenin bir endojen sekansi tarafindan kodlanmaktadir. Farenin endojen hafif zincir Iokusu bir immünoglobulin K hafif zincir Iokusudur. Bir düzenlemede fare, endojen hafif zincir lokusunda bir endojen VL ve /veya JL gen segmentlerinden yoksundur. Spesifik bir düzenlemede, VL ve / veya JL gen segmentleri bir VK ve / veya JK gen segmentleridir. Spesifik bir düzenlemede, VL ve /veya JL gen segmentleri bir V A ve /veya .J A gen segmentleridir. Bir düzenlemede, farenin VL ve JL gen segmentleri bir ya da birden fazla insan V A ve bir ya da birden fazla insan J A gen segmentleri ile degistirilmektedir. Spesifik bir düzenlemede, farenin VL ve JL gen segmentleri K gen segmentleridir. Spesifik bir düzenlemede, farenin VL ve JL gen segmentleri A gen segmentleridir. Bir düzenlemede, bir ya da birden fazla insan V A gen segmenti insan immünoglobulin A hafif zincir lokusunun A kümesinin bir fragmanindandir. Spesifik bir düzenlemede, A kümesinin fragmani insan V A3-27'den insan V A3-1*e dogru uzanmaktadir. Spesifik bir düzenlemede, A kümesinin fragmani insan V A3-12'den insan J A1'e dogru uzanmaktadir. Bir düzenlemede, bir ya da birden fazla insan V A gen segmenti insan immünoglobulin A hafif zincir lokusunun B kümesinin bir fragmanindandir. Spesifik bir düzenlemede, B kümesinin fragmani insan V A5-52iden insan V A 1-40,a dogru uzanmaktadir. Spesifik bir düzenlemede, bir ya da birden fazla insan V A gen segmenti, burada tarif edildigi gibi insan immünoglobulin A hafif zincir lokusunun A kümesinin bir fragmanindan ve B kümesini bir fragmanindandir. Bir düzenlemede, fare en az 12 insan V /\ gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, fare en az 28 insan V /\ gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, fare en az 40 insan V A gen segmenti içermektedir. Bir düzenlemede, en az bir insan J A gen segmenti, J A1, J A2, J A3, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilmektedir. Ureyebilen bir fare tarif edilmekte olup, burada fertil insan disi hayvan (1) bir insan V A bölgesi ya da bir insan VK alani içeren bir immünoglobulin hafif zincirini ve (2) bir insan VH alani içeren bir immünoglobulin agir zincirini ekspres etmektedir, burada erkek fare bir modifiye edilmis agir zincir degisken bölge lokusunu ve erkek farede fonksiyonel olan bir ektopik ADAM6 genini içermektedir. Bulusun bir yönünde, bir antijen baglayici protein yapmak için burada tarif edildigi gibi bir farenin kullanimi saglanmaktadir. Bir düzenlemede, antijen-baglayici protein insandir. Bir düzenlemede, antijen-baglayici protein bir antikordur. Bir düzenlemede antijen baglayici protein, burada tarif edildigi gibi bir fareden elde edilen bir insan VH alani ve /veya bir insan V A bölgesi içermektedir. Bulusun bir yönünde, burada tarif edildigi gibi bir fareden türetilmis bir hücre ya da doku saglanmaktadir. Bir düzenlemede, doku bir dalak, kemik iligi ya da bir lenf dügümünden elde edilmektedir. Bir düzenlemede hücre bir B hücresidir. Bir düzenlemede hücre bir embriyonik kök (ES) hücresidir. Bir düzenlemede hücre bir germ hücresidir. Burada tarif edildigi gibi genetik olarak modifiye edilmis bir farenin bir diploid genomunu içeren bir oosit tarif edilmektedir. Immünoglobülin K Hafif Zincir Lokusunun Steril Transkriptleri Farelerde insan immünoglobulin A sekanslarini ekspres etme konusundaki varyasyonlar genetik olarak modifiye edilmis farelerin bu gibi ekspresyonlari yapabilen çesitli düzenlemelerinde yansitilmaktadir. Bu nedenle bazi düzenlemelerde genetik olarak modifiye edilmis fareler bir insan lokusundan bazi kodlama yapmayan sekanslari içermektedir. Bir düzenlemede genetik olarak modifiye edilmis fare bir endojen K hafif zincir Iokusunda insan V /\ ve J A gen segmentlerini içermektedir ve ayrica bir insan K hafif zincir genomik fragmanini içermektedir. Spesifik bir düzenlemede, insan K hafif zincir genomik fragmani bir insan VK gen segmenti ile bir insan JK gen segmenti arasinda dogal olarak bulunan bir kodlama yapmayan sekanstir. Insan ve fare K hafif zincir Iokuslari bir baslangiç kodonu ya da açik bir okuma çerçevesi içermeyen ve K hafif zincir lokuslarinin transkripsiyonunu regüle eden elementler olarak kabul edilen steril transkriptleri kodlayan sekanslar içermektedir. Bu steril transkriptler, en proksimal VK gen segmentinin asagi ya da 3* yönünde ve K hafif zincir intronik arttiricinin yukari ya da 5' yönünde, yani K hafif zincir sabit bölge geninin (CK) yukari yönünde yer alan bir intergenik steril sekanstan kaynaklanmaktadir. steril transkriptler bir CKiya kaynasmis bir VKJK1 segmentini olusturmak üzere intergenik sekansin yeniden düzenlenmesinden kaynaklanmaktadir. CK geninin yukari yönünde K hafif zincir Iokusunun bir replasmani steril transkriptleri kodlayan intergenik bölgeyi uzaklastirabilir. Bu nedenle, çesitli düzenlemelerde, fare CK geninin yukari yönünde fare K hafif zincir sekansinin insan A hafif zincir gen segmentleri ile replasmani, insan V A ve J A gen segmentlerini içeren ancak steril transkriptleri kodlayan K hafif zincir intergenik bölgesini içermeyen bir insanlastirilmis fare K hafif zincir lokusu ile sonuçlanabilmektedir. Burada da tarif edildigi gibi endojen fare K hafif zincir lokusunun insan )\ hafif zincir gen segmentleri ile humanizasyonu (ki burada humanizasyon intergenik bölgeyi çikarmaktadir) K hafif zincir Iokusunun kullaniminda büyük bir düsüs ve ona eslik eden, A hafif zincir kullaniminda büyük bir artisla sonuçlanmaktadir. Bu nedenle, her ne kadar intergenik bölgeden yoksun olan insanlastirilmis bir fare insan hafif zincir degisken bölgelerine (örnegin insan A ya da K alanlari) sahip antikorlar üretmesi açisindan kullanisli olsa da lokustan kullanim düsmektedir. Ayrica transkripsiyon ile ilgili olarak, son insan V A gen segmenti ile ilk insan J A gen segmenti arasinda bir K intergenik bölgesi (K intergenik bölgesi içermeyen bir lokustan daha yüksek ekspresyonlu bir B hücre popülasyonu sergiler) içeren bir V A lokusu olusturmak için insan K intergenik bölgenin insersiyonuyla birlestirilmis insan V A ve J A gen segmentleri ile endojen fare K hafif zincir Iokusunun insanlastirilmasi tarif edilmektedir. Bu gözlem, intergenik bölgenin - dogrudan steril transkript yoluyla ya da dolayli olarak - endojen A hafif zincir Iokusundan kullanimi baskiladigi hipotezi ile tutarlilik sergilemektedir. Bu gibi bir hipotezin isiginda, intergenik bölgenin dahil edilmesi endojen A hafif zincir Iokusunun kullaniminda bir düsüse yol açacaktir, ki bu da farenin seçeneklerini sinirlandirarak onu antikor üretmek için modifiye edilmis (KInin içine A) Iokusu kullanmak zorunda birakacaktir. Çesitli düzenlemelerde, fare CK geninin yukari yönündeki fare K hafif zincir sekansinin insan A hafif zincir sekansi ile bir replasmani ayrica, 31 en V /\ gen segmentinin 3' çevrilmemis bölgesi ile birinci insan J A gen segmentine 5 (arasinda transkripsiyon ile ilgili olarak yerlestirilmis bir insan K hafif zincir intergenik bölgesi içermektedir. Alternatif olarak, bu gibi bir intergenik bölge, endojen A hafif zincir lokusunda bir delesyon yaparak degistirilmis endojen K hafif zincir Iokusundan (fare CK geninin yukari yönünde) çikarilabilir. Benzer bir biçimde bu düzenleme altinda fare, insan A hafif zincir sekanslari içeren bir endojen K hafif zincir Iokusundan antikorlar üretmektedir. Insan V A Alanlari Ekspres Edecek Fareler Tasarlamaya Yönelik Yaklasimlar Bir endojen CK bölgesine kaynasik bir insan V /\ bölgesine sahip olan bir hafif zincir içeren antikorlar yapan genetik olarak modifiye edilmis fareler yapmak için çesitli yaklasimlar burada tarif edilmektedir. Çesitli düzenlemelerde endojen hafif zincir lokuslarindan birinin ya da her ikisinin bir delesyonunu içeren genetik modifikasyonlar tarif edilmektedir. Ornegin fare A hafif zincirlerini endojen antikor repertuarindan çikarmak için bir birinci V i\-.J A-C A gen kümesinin silinmesi ve ikinci bir gen kümesinin V A-J A gen segmentlerinin insan V A-J A gen segmentleri ile degistirilmesi (kismen ya da tamamen) gerçeklestirilebilir. Fare, fare embriyosu ve hücreler yapmak için genetik olarak modifiye edilmis fare embriyolari, hücreler ve hedefleyici yapilar da ayrica saglanmaktadir. Çesitli düzenlemelerde, endojen C A genleri bozulmadan kaldigi ve bu nedenle endojen bir agir zincirin sabit bölgesi ile iliski kurma normal fonksiyonelligini ve yetenegini korudugu için bir endojen V A-J A-C A gen kümesinin silinmesi ve baska bir endojen V A-J A-C A gen kümesinin V )\ J A gen segmentlerinin replasmani hayvandaki dogal antikor sabit bölge birlesmesinde ve fonksiyonunda nispeten minimal bir bozulma kullanmaktadir. Dolayisiyla, bu gibi düzenlemelerde, iki agir zincir ve iki hafif zincir içeren fonksiyonel bir antikor molekülünün meydana getirilmesi için modifikasyon, fonksiyonel hafif zincir sabit bölgelerine bagli olan diger endojen agir zincir sabit bölgelerini etkilememektedir. Ayrica, çesitli düzenlemelerde modifikasyon, bir endojen agir zincir ve bir hafif zincir, örnegin bir fare C A bölgesine bagli bir hV A bölgesi içeren fonksiyonel bir membran bagli antikor molekülünün bir araya getirilmesini etkilememektedir. Endojen lokusta en az bir fonksiyonel C A geni tutuldugu için, endojen bir V A-J A-C A gen kümesinin V A-J A gen segmentlerinin insan V A-J )\ gen segmentleri ile bir replasmanini içeren hayvanlar, hayvanin ekspres edilen antikor repertuarinda bulunan insan V A-J A gen segmentleri vasitasiyla bir immün tepkisi sirasinda antijeni baglayabilen normal A hafif Zincirlerini yapabilme kapasitesine sahip olmalidirlar. Silinen bir endojen fare V Ä-J A-C A gen kümesinin sematik bir gösterimi (ölçeklendirilmemistir) sekil 20'de saglanmaktadir. Resmedildigi gibi, fare A hafif zincir lokusu, her ikisi de, bir fonksiyonel fare A hafif zinciri olusturmak için yeniden birlestirilebilen fonksiyonel gen segmentleri içeren iki gen kümesine organize edilmistir. Endojen fare V M-J A3-C A3-J A1-C A1 gen kümesi rekombinasyon bölgeleri ile çevrili bir neomisin kasetli hedefleyici yapi (Hedefleme Vektörü 1) vasitasiyla silinmektedir. Diger endojen gen kümesi (V A2-V AS-J A2-C A2-J A4-C A4) rekombinasyon bölgeleri ile çevrili bir higromisin timidin kinaz kaseti ile bir hedefleme yapisiyla (hedefleme vektörü 2) kismen silinmistir. Bu ikinci hedefleme olayinda, C A2-J A4-C A4 endojen gen segmentleri korunmaktadir. Ikinci hedefleme yapisi (Hedefleme Vektörü 2) ilk hedefleme yapisindakilerden farkli olan (Hedefleme Vektörü 1) rekombinasyon siteleri kullanilarak olusturulmustur, ki bu sayede basarili bir hedefleme elde edildikten sonra seçim kasetinin seçici olarak silinmesine olanak taninmaktadir. Ortaya çikan çift hedefli Iokus fonksiyonel olarak susturulmustur, ki böylece endojen A hafif zincir üretilemez. Bu modifiye edilmis Iokus insan V /\ ve J A gen segmentlerini içeren bir endojen fare A lokusu olusturmak için insan V A ve `J A gen segmentlerinin yerlestirilmesi için kullanilabilir, bu sayede, modifiye edilmis lokusta rekombinasyondan sonra hayvan, endojen bir fare C A gen segmentine bagli yeniden düzenlenmis insan V A ve J A gen segmentlerini içeren A hafif zincirler üretir. Çesitli uygulamalarda, endojen A gen bölümlerini islevsel olmayan hale getirmek için bir farenin genetik olarak degistirilmesi, antikor repertuarinda sadece K hafif zincirler sergileyen bir fare ile sonuçlanmaktadir, ki bu da fareyi A hafif zincirlerinin bagisiklik tepkisindeki rolünün degerlendirilmesinde ve VK alanlarini içeren, fakat V A alanlarini içermeyen bir antikor repertuarinin yapilmasinda faydali hale getirmektedir. Endojen fare A hafif zincir lokusunda rekombine edilmis bir fare C A genine baglanan bir hV A ekspres eden genetik olarak modifiye edilmis bir fare teknikte bilinen herhangi bir yöntemle yapilabilir. Endojen fare V A2-V A3-J A2 gen segmentlerinin insan V A ve J A gen segmentleri ile replasmaninin sematik bir gösterimi (ölçeklendirilmemistir) Sekil 22A'da saglanmistir. Gösterildigi gibi, islevsiz hale getirilen bir endojen fare A hafif zincir Iokusu rekombinasyon bölgeleri ile çevrelenen bir neomisin kaseti içeren bir hedefleyici yapisi (12 / 1-A hedefleme vektörü) ile degistirilmistir. V A2-V A3-J A2 gen segmentleri, 12 hV A gen segmenti ve bir tek hJ A gen segmenti içeren insan A sekansi içeren bir genomik fragman ile degistirilmektedir. Bu nedenle, bu ilk yaklasim, tek bir hJ A gen segmenti ile bitisik olan endojen A hafif zincir lokusunda bir ya da daha fazla hV A gen segmentini konumlandirmaktadir (SEKIL 22A). Modifiye edilmis endojen A hafif zincir lokusunun daha fazla modifikasyonu daha fazla hV A gen segmenti eklemek için benzer teknikler kullanilarak elde edilebilir. Ornegin insan hV A gen bölümlerinin ilavesinin asamali olarak yerlestirilmesi için kullanilan iki ek hedefleme yapisinin sematik gösterimi (+16- A ve +12- A hedefleme vektörleri) Sekil 23A1da verilmektedir. Gösterilmis oldugu gibi, spesifik insan hV A gen segmentlerini içeren ek genomik fragmanlar, insan A hafif zincir sekanslarinin daha önce yerlestirilmis olmasi ile saglanan homoloji kullanilarak ardisik adimlar halinde degistirilmis endojen A hafif zincir lokusuna yerlestirilmektedir. Gösterilmis olan her bir hedefleme yapisi ile rekombinasyonun ardindan, sirasiyla, modifiye edilmis endojen A hafif zincir lokusuna 28 ilave hV A gen segmenti yerlestirilmektedir. Bu da bir fare C A genine bagli insan V A / J A gen segmentlerini içeren bir A hafif zincir proteini üreten kimerik bir Iokus yaratmaktadir. A lokusunda insan A hafif zincir gen segmentlerini yerlestirmeye yönelik yaklasimlar C A2-J A4-C A4 gen segmentlerinin asagi yönünde yerlestirilmis arttiricilari korumaktadir (Sekil 22A ve Sekil 23A'da Enh 2.4, Enh ve Enh 3.1 olarak adlandirilmistir). Bu yaklasim endojen fare A hafif zincir lokusunda tek bir modifiye edilmis alelle sonuçlanmaktadir (Sekil 25A). Bir fare C A gen segmentine islevsel olarak baglanmis hV A ve J A gen segmentlerini içeren bir hafif zinciri ekspres eden bir farenin yapilmasi için kompozisyonlar ve yöntemler saglanmis olup bunlar endojen bir fare A hafif zincir lokusundan bu tür genleri ekspres eden bir farenin yapilmasi için kompozisyonlar ve yöntemleri de içermektedir. Yöntemler, bir hV A bölgesini bir farede ekspres etmek amaciyla, seçici olarak bir endojen fare V A-J A-C A gen kümesinin fonksiyonsuz hale getirilmesini (örnegin, hedeflenen bir silme ile) ve endojen fare A hafif zincir lokusunda bir hV A ve J A gen segmenti kullanilmasini içermektedir. Alternatif olarak ikinci bir yaklasimda insan A hafif zincir gen segmentleri endojen K hafif zincir lokusunda konumlandirilabilir. Çesitli düzenlemelerde genetik modifikasyon endojen K hafif zincir Iokusunun bir delesyonunu içermektedir. Ornegin endojen antikor repertuvarindan fare K hafif zincirlerinin eliminasyonu için fare VK ve JK gen segmentlerinin bir delesyonu gerçeklestirilebilir. Fare, fare embriyosu ve hücreler yapmak için genetik olarak modifiye edilmis embriyolar, hücreler ve hedefleyici yapilarda da ayrica saglanmaktadir. Yukarida belirtilen nedenlerden ötürü, fare VK ve JK gen segmentlerinin delesyonu nispeten minimal bir bozulma kullanmaktadir. Silinen fare VK ve JK gen segmentlerinin sematik bir illüstrasyonu (ölçeklendirilmemistir) Sekil 21'de saglanmaktadir. Endojen fare VK ve JK gen segmentleri her biri bölgeye özgü rekombinasyon bölgeleri kullanan iki kesin konumlandirilmis hedefleme vektörü arasinda konumlandirilmis fare sekanslarinin rekombinaz aracili silinmesi yoluyla silinmistir. Bir birinci hedefleme vektörü (JK Hedefleme Vektörü), fare JK gen segmentlerini silmek için bir birinci hedefleme olayinda kullanilmaktadir. Ikinci bir hedefleme vektörü (VK Hedefleme Vektörü), en distal fare VK gen segmentinin 5! yönünde bulunan bir sekansi silmek için ikinci, sirali hedefleme olayinda kullanilmaktadir. Her iki hedefleme vektörü de bölgeye özel rekombinasyon bölgeleri içermektedir, ki bu sayede basarili bir hedefleme elde edildikten sonra hem seçim kasetlerinin hem de tüm araya giren fare hafif zincir sekanslarinin seçici olarak silinmesine izin vermektedir. Ortaya çikan silinmis lokus fonksiyonel olarak susturulmustur, ki böylece endojen K hafif zincir üretilemez. Bu modifiye edilmis lokus hV A ve J A gen segmentlerini içeren bir endojen fare K lokusu olusturmak için hV )\ ve J )\ gen segmentlerinin yerlestirilmesi için kullanilabilir, bu sayede, modifiye edilmis Iokusta rekombinasyondan sonra hayvan, endojen bir fare CK gen segmentine bagli yeniden düzenlenmis hV A ve J A gen segmentlerini içeren A hafif zincirler üretir. Insan A hafif zincir sekanslarini içeren çesitli hedefleme vektörleri, bir fare CK bölgesi ile islevsel olarak baglanmis insan )\ gen segmentlerini içeren bir hibrid hafif zincir Iokusu olusturmak için bu silinmis fare K Iokusu ile birlikte kullanilabilir. Böylece, ikinci bir yaklasim, bir ya da daha fazla insan V A gen segmentini, tek bir insan J A gen segmenti (12 / 1-K Hedefleme Vektörü, SEKIL 228) ile bitisik fare hafif zincir Iokusunda konumlandirmaktadir. Çesitli düzenlemelerde, insan A hafif zincir sekanslarinin, fare antikor repertuarindaki fare K lokusundan kullanimini optimize etmek için gen segmentleri ve / veya düzenleyici sekanslar eklemek için bu yaklasimda degisiklikler yapilabilir. Bir üçüncü yaklasimda, bir ya da birden fazla hV A gen segmenti, dört hJ A gen sekansi (12 / 4-K Hedefleme Vektörü SEKIL 228) ile bitisik olan fare K hafif zincir Bir üçüncü yaklasimda, bir ya da birden fazla hV A gen segmenti, bir insan K intergenik sekansi ve bir tek hJ A gen sekansiyla (12(K)1-K Hedefleme Vektörü, SEKIL 228) bitisik olan fare K hafif zincir Iokusunda konumlandirilmaktadir. Bir dördüncü yaklasimda, bir ya da birden fazla hV A gen segmenti, bir insan K intergenik sekansi ve dört hJ A gen sekansi (12(K)4-K Hedefleme Vektör'u SEKIL 228) ile bitisik olan fare K hafif zincir Iokusunda konumlandirilmistir. Fare K Iokusuna insan )\ hafif zincir gen segmentlerini yerlestirmeye yönelik yukaridaki yaklasimlarin tümü CK geninin yukarisindaki K intronik arttirici elemani (EKI olarak belirtilmistir, Sekil 228 ve Sekil 238) ve CK geninin asagi yönündeki 3* K arttiricisini (EK3' olarak belirtilmistir, Sekil 228 ve Sekil 238) korumaktadir. Bu yaklasimlar, endojen fare K hafif zincir Iokusunda dört ayri modifiye edilmis alelle sonuçlanmaktadir (Sekil 258). Çesitli düzenlemelerde genetik olarak modifiye edilmis fare endojen fare A hafif zincir lokusunun bir nakavtini içermektedir. Bir düzenlemede, A hafif zincir lokusu V A2 ila J A2'yi kapsayan bölgeyi ve V A1 ila CK1'i kapsayan bölgeyi silen (SEKIL 20) bir strateji ile nakavt edilmektedir. Endojen A hafif zincir lokusunun endojen A alanlarini ekspres etme kabiliyetini azaltan ya da ortadan kaldiran herhangi bir strateji, bu tarifnamedeki düzenlemelerle birlikte kullanima uygundur. Genetik Olarak Modifiye Edilmis Farelerden Lambda Alani Antikorlari Fare K ya da A hafif zincir lokusunda insan A sekanslari içeren fareler, bir fare CL (CK ya da CA) bölgesine kaynasik bir hV i\ bölgesi içeren bir hafif zinciri ekspres edecektir. Bunlar avantajli bir biçimde su fareleri dogurmaktadir (a) islevsel olarak susturulmus bir hafif zincir lokusu (örnegin, endojen fare K ya da A hafif zincir lokusunun bir nakavtini) içerenler (b) bir endojen fare C A genine islevsel olarak bagli hV ve hJ gen segmentlerini içeren endojen bir fare A hafif zincir lokusunu ihtiva edenler; (0) bir endojen fare CK genine islevsel olarak baglanmis hVK ve hJK gen segmentlerini içeren bir endojen fare K hafif zincir lokusu içerenler; ve (d) bir alelinin hVK ve hJK içerdigi bir fare; hV As ve hJ As içeren diger K alelleri; hV A ve hJ A içeren bir A alel ve susturulmus ya da nakavt edilmis bir A alel ya da hV A ve hJ A içeren her iki A alel; ve her biri hVH, hDH ve hJH içeren iki agir zincir aleli. CK ya da C A baglaminda ekspres edilen hV A alanlarini içeren antikorlar hV A alanlarini insan C A kodlayan genleri tasiyan ekspresyon yapilarina kodlayan nükleik asitleri klonlayarak tamamen insan antikorlari yapmak için kullanilmaktadir. Ortaya çikan ekspresyon yapilari, hC A'ya kaynasik bir tamamen hV A bölgesi sergileyen antikorlari ekspres etmek için uygun konak hücrelere transfekte edilmektedir. ORNEKLER Asagidaki örnekler, bulusun yöntem ve kompozisyonlarin nasil hazirlanacagini ve kullanilacagini tarif edecek sekilde saglanmistir ve bulus sahiplerinin buluslari olarak gördükleri seylerin kapsamini sinirlandirma amaci tasimamaktadir. Aksi belirtilmedigi sürece sicakliklar Celcius cinsinden belirtilmektedir ve basinç ise atmosferik ya da ona yakin bir seviyededir. Ornek 1. Fare Immünoglobülin Genlerinin Insanlastirilmasi Insan ve fare bakteriyel yapay kromozomlari (BAC'Ier) fare immünoglobulin agir zincirinin ve K hafif zincir lokuslarinin insanlastirilmasi için 13 farkli BAC hedefleme vektörünü (BACvec) olusturmak için kullanilmistir. Tablo 1 ve 2 sirasiyla, fare immünoglobülin agir zincir ve K hafif zincir Iokuslarinin insanlastirilmasi için kullanilan tüm BACvec'lerin yapimi için atilan adimlarin ayrintili açiklamalarini ortaya koymaktadir. Insan ve fare BAC'Ierinin tanimlanmasi immünoglobulin agir zincir ve 'hafif zincir lokuslarinin 5' ve 3< uçlarini kapsayan fare BAC'leri BAC kütüphanesi ile lekelenmis filtrelerin hibridizasyonu ya da fare BAC kütüphanesi DNA havuzlarinin PCR taramasi ile tanimlanmistir. Filtreler, ilgilenilen bölgelere karsilik gelen problar kullanilarak standart kosullar altinda hibritlestirilmistir. Kütüphane havuzlari, ilgilenilen hedef bölgeyi çevreleyen kendine has primer çiftleri kullanilarak PCR ile taranmaktadir. Ayni primerleri kullanarak ilave PCR, belirli bir kuyunun ters evrisimi ve ilgilenilen BAC'nin izole edilmesi için gerçeklestirilmistir. Hem BAC filtreleri hem de kütüphane havuzlari, 129 SvJ fare ES hücrelerinden (Incyte Genomics / lnvitrogen) üretilmistir. Tüm immünoglobulin agir zincir ve K hafif zincir Iokuslarini kapsayan insan BAC'leri PCR tabanli bir yöntemle insan BAC kütüphanesi havuzlarinin (Caltech kütüphanesi, lnvitrogen) taranmasi yoluyla BAC kütüphanesi (Caltech B, C ya da D kütüphaneleri ve RPCl-11 kütüphanesi, Research Genetics / lnvitrogen) ile belirlenen filtrelerin melezlestirilmesi yoluyla ya da bir BAC uç sekansi veritabani kullanarak (Caltech D kütüphanesi, TlGR) tanimlanmaktadir. Bakteriyel homolog rekombinasyon ve ligasyon yoluyla BACvecs'lerin yapimi Bakteriyel homolog rekombinasyon (BHR) tarif edildigi gibi gerçeklestirilmistir (Valenzuela ve ark., 2003; Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J.P., and Stewart, A.F. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coIi. Nat Genet 20, 123-128). Çogu durumda, Dogrusal fragmanlar PCRrdan elde edilen homoloji kutularinin klonlanmis kasetlere baglanmasi, ardindan da ligasyon ürünlerinin jel izolasyonu ve hedef BAC'i barindiran BHR-kompetan bakterilere elektroporasyonu ile üretilmistir. Uygun antibiyotik petri kaplari üzerinde seçimden sonra, her iki yeni kesisim noktalarinda PCR ile dogru rekombine edilmis BAC'Ier tanimlanmis ve ardindan darbeli alan jelleri üzerindeki kisitlama analizi (Schwartz, D.C., and Cantor, C.R. (1984). Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37, 67-75) ve insan sekanslarina dagitilmis primerleri kullanarak PCR ile nokta kontrolü gerçeklestirilmistir. Immünoglobulin agir zincir Iokusunun insancillastirilmasinin ilk basamagi için üç sirali BHR basamagi kullanilarak bir 3hVH BACvec yapilmistir (Sekil 4A ve Tablo 1). Birinci adimda (Adim 1) fare immünoglobülin agir zincir lokusuna (HB1) bir homoloji bölgesi içeren insan VH1-3 gen segmentinden yukari yönde bir insan parental BAC'sine bir kaset yerlestirilmistir ki söz konusu gen bakterilerde kanamisin direnci ve hayvan hücrelerinde G418 direnci (kanR) ve bölgeye özgü bir rekombinasyon bölgesi (örn., loxP) veren bir gendir. Ikinci adimda (Adim 2), fare immünoglobulin agir zincir lokusuna ikinci bir homoloji bölgesini (HB2) ve bakterilerde spektinomisine direnç saglayan bir geni (specR) içeren son JH segmentinden asagi yönde ikinci bir kaset takilmistir. Bu ikinci adim, `JH6 ve BAC vektör kloramfenikol direnç geninden (cmR) sonraki insan immünoglobulin agir zincir lokus sekanslarinin silinmesini içermektedir. Üçüncü adimda (3. Adim), iki kez modifiye edilmis insan BAC (B1) ilk iki asamada eklenmis ve iki homoloji bölgesi (HBl ve HBZ) boyunca BHR tarafindan bir BAC faresine (B2) entegre edilmis 1 Ceul bölgelerini kullanarak daha sonra dogrusallastirilmistir. Birinci (cm / kan), ikinci (spec / kan) ve üçüncü (cm / kan) adimlar için gerçeklestirilen ilaç seçimleri istenen ürünler için spesifik olacak sekilde tasarlanmistir. Modifiye edilmis BAC klonlari, uygun yapiyi belirlemek için (SEKIL 4B) kisitlama enzimleriyle sindirim sonrasinda darbeli jel elektroforezi (PFGE) ile analiz edilmistir. Benzer bir biçimde, 12 ilave BACvecs agir zincir ve K hafif zincir lokuslarinin humanizasyonu için tasarlanmistir. Bazi durumlarda BAC ligasyonu, BHR yerine, iki büyük BAC'yi birlestirmek için seçilebilir markörlerin dikkatli yerlestirilmesi ile birlikte, BHR tarafindan nadir kisitlama bölgelerinin her iki parental BACveCS'e yerlestirilmesiyle gerçeklestirilmistir. Spesifik ilaç markör kombinasyonlari ile seçim üzerine istenen Iigasyon ürününün hayatta kalmasi için buna izin verilmistir. Nadir kisitlama enzimleriyle sindirim sonrasi Iigasyonla elde edilen Rekombinant BACrler BHR tarafindan elde edilenlere benzer sekilde tanimlanmis ve taranmistir (yukarida tarif edildigi gibi). BACvec Adim Açiklama Proses 3hVH 1 Yukari yönde fare homoloji kutusunu insan proksimal BAC CTD-BHR 257202'ye yerlestir 2 Asagi yönde fare homoloji kutusunu insan proksimal BAC CTD-BHR 257202'ye yerlestir 3 3hVH BACvec 'üretmek için 3hVH / 27hDH / 9hJHiyi fare proksimal BACBHR CT7-302807'ye yerlestir DC 1 Fare BAC CT7-253i20 kullanarak fare IgH lokusunun distal ucunda kasetiBHR yerlestir ucunda specR isaretleyicisini yerlestir 2 3hVH insersiyonunun yukari yönünde puroR'yu çevreleyen l-Ceul ve NotBHR bölgelerini yerlestirin 3 ReI asagi yöndekiBHR 4 Rel yukari yöndekiBHR ucunda l-Ceul bölgesini yerlestir 4. adimdaki 184kb fragmanini 2. adimdaki 153kb vektört'ine bagla Ligasyon homolojiyi 3hVH'ye birak 7 CT7-253i20 BAC'deki fare IgH lokusunun distal ucuna kaset ve NotBHR bölgesi yerlestirin 8 Insan BAC'Ierinden yukari yön insersiyon için fare distal homoloji kolunuLigasyon alt klonla 18hVH BACvec 'üretmek için hng'den neoR'ye seçim kasetini degistir BHR 39hVH 1 Insan BAC CTD-2534n10*nun distal ucuna hng'yi çevreleyen ICeuI veBHR PISceI alanlarini yerlestirin BAC'nin proksimal ucuna CmR yerlestirin yerlestirin 4 RP11 - 72n10 BAC'nin distal ucunda puroR'yi çevreleyen ICeuI ve AscIBHR bölgelerini yerlestirin hng replasmanini saglayacak biçimde 4. adimdaki 161 kb fragmanini 2.Ligasy0n adimin yapisina baglayin 6 CT7-253i20 BAC kullanarak, fare distal homoloji kolunun proksimalBHR ucunda neoR ve Ascl bölgelerini yerlestir 7 Fare distal homoloji kolunun distal ucunda specR ve ICeuI bölgeleriniBHR yerlestir 8 Fare distal homoloji kolunu 5. adimdan insan insersiyonuna bagla Ligasyon 9 39hVH BACvec üretmek için homoloji kutulari olarak UbCp ve pABHR kullanarak seçim kasetini neo'dan hygiye degistir 53hVH 1 Insan CTD-3074b5 BAC'nin proksimal ucunda specRiyi yerlestir BHR 2 Insan CTD-3074b5 BAC'nin distal ucunda Ascl bölgesini yerlestir BHR 3 CT7-253i20 BAC kullanarak, fare distal homoloji kolunun proksimalBHR ucunda hng ve Ascl bölgelerini yerlestir 4 Fare distal homoloji kolunu 2. adimdan yapiya bagla Ligasyon 53hVH BACvec 'üretmek için homoloji kutulari olarak UbCp ve pABHR kullanarak seçim kasetini hyg'den neoiya degistir 70hVH 1 Insan CTD-2195p5 BAC'nin distal ucunda specie bitisik PISceI ve ICeuIBHR bölgelerini yerlestir proksimal sonuna yerlestirin 3 Fare kolunun Iigasyonu için RP11-926p12 BAC'nin distal ucunda PISceIBHR 4 Fare distal homoloji kolunu 3. adimdan yapiya bagla Ligasyon 70 hVH BACvec olusturmak için fare distal homoloji kolu ve hlgHLigasyon 80hVH 1 CTD- 2313e3 BAC'nin distal ucunda hng'yi çevreleyen ICeul ve AscIBHR bölgelerini yerlestirin 2 80hVH BACvec olusturmak için fare distal homoloji kolunu 1. adimdanLigasyon insan CTD-2313e3 BACra baglayin BACvec Adim Açiklama Proses yerlestirin bölgesini yerlestir yerlestirin 2 CTD- 2366] 12 BAC'nin distal ucunda hng'yi çevreleyen ICeuI ve AscIBHR bölgelerini yerlestirin 3 CT7-254m04 BAC kullanarak mJKX'den asagi yönde puroR = xxbp'yiBHR çevreleyen lCeuI ve PI-Seel bölgelerini yerlestirin 4 Adim 3 yapisini kullanarak fare EnhK / CKinin yukari yönünde hIgVK Ligasyon jKiyi yerlestir 4. adimin yapisindaki cmR'yi specR ile degistir BHR 6 CT7-302g12 BAC kullanarak, fare IgK lokusunun distal ucunda NeoBHR seçim kaseti yerlestir 7 6hVK BACvec olusturmak için 6. adimin yapisinda insanLigasyon insersiyonunun yukari yönünde fare distal homoloji kolunu bagla 2 1. adimin yapisindaki cmR'yi specR ile degistir BHR 3 CT7-302912 BAC kullanarak fare IgK lokusunun distal ucuna Hyg seçimBHR kasetini yerlestir 4 16hVK BACvec olusturmak için 2. adimin yapisindan insanLigasyon insersiyonunun yukari yönünde fare distal homoloji kolunu bagla 30hVK 1 RP11 -9996 BACJnin distal ucunda Hng yerlestir BHR 2 1. adimin yapisindaki cmR'yi specR ile degistir BHR 3 CT7-302g12 BAC kullanarak, fare IgK lokusunun distal ucunda NeoBHR seçim kaseti yerlestir 4 30hVK BACvec olusturmak için 2. adimin yapisindan insanLigasyon insersiyonunun yukari yönünde fare distal homoloji kolunu bagla 40hVK 1 CTD-2559d6 BAC'de hlgH lokusunun distal ucunda NeoR yerlestir BHR 2 1. adimin yapisindaki cmR'yi specR ile degistir BHR 3 40hVK BACvec olusturmak için 2. adimin yapisinda hlgH IokusununLigasyon yukari yönünde fare distal homoloji kolunu bagla Embriyonik kök (ES) hücre modifikasyonu ve farenin üretilmesi ES hücresi (F1H4) hedeflemesi, tarif edildigi gibi VELOCIGENE® genetik mühendislik yöntemi kullanilarak gerçeklestirilmistir (Valenzuela ve ark., 2003). Farelerin, blastosist (Valenzuela ve ark., 2003) ya da 8 hücreli enjeksiyon (Poueymirou ve ark., 2007) ile modifiye edilmis ES hücrelerinden türetilmesi tarif edildigi gibi gerçeklestirilmistir. Hedeflenmis olan ES hücreleri ve fareleri, ES bazli hücrelerden ya da farelerden, PCR bazli bir analizde (örn., Sekil 3A, 3B ve 3C) benzersiz prob ve primer kümeleriyle DNA'nin taranmasi ile dogrulanmistir. Tüm fare çalismalari Regeneron's Bakimi ve Kullanimi Komitesi) (lACUC) tarafindan denetlenmis ve onaylanmistir. Karyotip Analizi ve Floresan in situ Hibridizasyon (FISH). Karyotip Analizi Coriell Cell Repositories (Coriell Tibbi Arastirma Enstitüsü, Camden, NJ) tarafindan gerçeklestirilmistir. Hedeflenen ES hücreleri üzerinde FlSH gerçeklestirilmistir (Valenzuela ve ark.,2003). Fare BAC DNA'sina ya da insan BAC DNA'sina karsilik gelen problar floresan etiketli dUTP nükleotitleri spektrum turuncu ya da spektrum yesili (Vysis) ile nick translasyonuyla (invitrogen) etiketlenmistir. Immünoglobulin Agir Zincir Degisken Gen Lokusu. Agir zincir Iokusunun degisken bölgesinin insanlastirilmasi, VELOClGENE® genetik mühendisligi teknolojisi kullanilarak (bakiniz, örnegin, ABD Patent No. 6,586,251 ve Valenzuela ve ark, 2003) esdeger insan gen segmentlerini içeren yaklasik bir Mb bitisik insan genomik sekansi ile (Sekil 1A ve Tablo 1) Tüm VH, DH ve JH gen segmentlerini içeren yaklasik üç milyon baz cift (Mb) bitisik fare genomik sekansinin dogrudan replasmani ile dokuz ardisik adimda gerçeklestirilmistir. JH gen segmentleri ve sabit bölge genleri arasindaki intron (J-C intron) izotip degisimi (Kataoka, T., Kawakami, T., Takahashi, N., and Honjo, T. (1980). Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy- chain class switch. Proc Natl Acad Sci U 8 A 77, 919-923) sirasinda rekombinasyon için gerekli olan basit tekrarlarin bir bölgesini takip eden bir transkripsiyonel arttirici (Neuberger, MS. (1983). Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into Iymphoid cells. Embo J 2, 1373-1378) içermektedir. Insan VHDHJH bölgesi ve fare CH bölgesi arasindaki baglanti (proksimal baglanti) fare agir zincir intronik arttiriciyi korumak ve sirayla farede insanlastirilmis agir zincir lokusunun hem verimli ekspresyonunu hem de sinif degisimi korumak için alani degistirmek üzere seçilmistir. Tüm replasmanlarda bu ve sonraki kesisim noktalarinin tam nükleotid konumu sentezlenmis oligonükleotitler tarafindan indüklenen bakteriyel homolog rekombinasyonunu kullanan VELOCIGENE® genetik mühendislik yöntemi (supra) kullanilarak mümkün olmustur. Bu sayede, proksimal kavsak, son JH gen segmentinden asagi yukari 200 bp asagi yönde yerlestirilmis ve distal kavsak, insan lokusunun en 57 VH gen segmentinin birkaç yüz yukarisina ve J558.55 olarak da bilinen fare VH1-86 gen segmentinin yaklasik 9 kb asagi yönüne yerlestirilmistir. Fare VH gen segmenti, CS7BL / 6 farelerinde bir psödojen oldugu bildirilen, ancak hedeflenen 129 alelinde zayif bir RSS sekansina ragmen potansiyel olarak aktif olan en distal agir zincir degisken gen segmentidir. Bildirildigi gibi fare agir zincir lokusunun distal ucu Iokus ekspresyonunu ve / veya yeniden düzenlemeyi düzenleyen kontrol elemanlari içerebilir (Pawlitzky ve ark., 2006). Insan immünoglobulin DNA sekansinin fareye ilk kez eklenmesi fare lgH lokusunun proksimal ucuna yerlestirilmis olan 3 VH, tümü 27 DH ve 9 JH insan gen segmenti içeren insan agir zincir lokusunun proksimal ucunun 144 kb'sinin kullanilmasi ve bununla birlikte yaklasik 75 kb fare homoloji kolunun kullanilmasi ile fare genomik sekansinin 16.6 kb'sinin silinmesi ile gerçeklestirilmistir (Adim A, SEKIL 2A; Tablo 1 ve 3, 3hVH). 144kb*lik büyük bir insersiyon ve buna eslik eden 16.6 kb'lik silme, % 02'lik bir siklikta meydana gelen tek bir adimda (Asama A) gerçeklestirilmistir (Tablo 3). Dogru hedeflenmis ES hücreleri silinmis fare sekansinin içinde ve yaninda ve yerlestirilen insan sekansinin içinde problar kullanarak dogal alel kaybi (LONA) analizi ile skorlanmistir (Valenzuela ve ark. 2003) ve büyük insan insersiyonunun bütünlügü, bütün yerlestirmeyi kapsayan çoklu problar kullanilarak dogrulanmistir (Sekil 3A, SB ve 3C). Birçok sirali ES hücre hedefleme turu beklendiginden hedeflenen ES hücre klonlari ve daha sonraki adimlarin tümü karyotipik analize tabi (supra) tutulmus ve sonraki basamaklarda sadece 20 yaymanin en az 17'sinde normal karyotipleri gösteren klonlar kullanilmistir. Asama A'dan hedeflenen ES hücreleri, agir zincir lokusunun distal ucunda 19 kb'lik bir delesyon üreten bir BACvec ile yeniden hedeflenmistir (Asama B, SEKIL 2A). B Adiminin BACvecri, A Adiminin BACvec'inde bulunan neomisin direnç geninin (neo) aksine, bir higromisin direnç geni (hyg) içermektedir. Iki BACveC'in direnç genleri, ayni kromozomun basarili bir sekilde hedeflenmesi üzerine, VH1-86 disindaki tüm fare VH gen bölümlerini içeren fare agir zincir degisken gen lokusunun yaklasik üç Mbasi ve Iki direnç geninin yani sira 0052 disindaki tüm DH gen segmentleri loxP bölgeleri ile çevrilecek ve 0052 ve bütün fare JH zinciri gen bölümleri, A adiminda Silinecek sekilde tasarlanmistir. Ayni kromozom üzerinde kez hedef alinan ES hücre klonlari, 3hVH proksimal kasetin yüksek G418*deki (Mortensen, RM. ve ark. (1992) Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct. Mol Cell izlenmesi ile tanimlanmistir. LoxP siteleri tarafindan çevrelenecek sekilde modifiye edilmis dört Mb boyutuna kadar olan fare segmentleri ilaç seçiminin yoklugunda bile yüksek verimde (% 11'e kadar) CRE rekombinazin geçici ekspresyonu ile ES hücrelerinde basariyla silinmistir (Zheng, B. ve ark. (2000) Engineering mouse chromosomes with Cre-onP: range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell Biol 20, 648-655). Benzer bir sekilde, geçici CRE ekspresyonunu takiben ES hücre klonlarinin % 8'inde mucitler üç Mb silme islemi gerçeklestirmistir (Adim C, SEKIL 2A; Tablo 3). Silme, silinen fare sekansinin herhangi bir ucundaki problarin yani sira neo ve hyg kaybi ve tek kalan onP bölgesini içeren silme noktasi boyunca bir PCR ürününün görünüsü kullanilarak LONA tahlili ile skorlandi. Ayrica, silme, in situ hibridizasyondaki floresansla da dogrulanmistir (veriler gösterilmemistir). Insan agir zincir degisken bölgesinin geri kalani VELOCIGENE® genetik mühendisligi yöntemini kullanarak (E-H Basamaklari, Sekil 28), 210 kb'ye kadar insan gen sekansinin kesin olarak eklenmesini içeren her adim ile 5 adimlik bir serideki 3hV H aleline eklenmistir. Her adim için her yeni BACvec'in proksimal ucu önceki adimin en distal insan sekanslarini üst üste getirmek için tasarlanmistir ve her bir yeni BACvec'in distal ucu, A adiminda kullanilanla ayni fare homolojisi distal bölgesini içermektedir. D, F ve H asamalarinin BACvec'leri neo-seçim kasetlerini içermekte iken E ve G adimlarinin BACvecrleri hyg seçim kasetlerini içerdigi için, seçimler G418 ve higromisin arasinda degismistir. D adimindaki hedefleme, 3hVH Hibrid Alelinin distal onP bölgesi boyunca benzersiz PCR ürününün kaybiyla analiz edilmistir. E ile I Adimlari için hedefleme, önceki seçim kasetinin kaybi ile test edilmistir. Son adimda (Adim 1, SEKIL 28), Frt bölgeleriyle çevrili neo-seçim kaseti (Mcleod, M. ve ark. (1986) Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Mol Cell Biol 6, 3357-3367) geçici FLPe ekspresyonu ile çikarilmistir (Buchholz, F. ve ark. (1998) improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 16, 657-662). D, E ve G Adimlari için BACvec'lerin insan sekanslari, iki parental insan BAC'sinden türetilmisken, F ve H adimindan olanlar tek BACidendir. Insan sekanslarinin tutulmasi, yerlestirilen insan sekanslarini kapsayan çoklu problar kullanilarak her adimda dogrulanmistir (yukarida tarif edildigi gibi, örnegin Sekil 3A, 3B ve 3G). Her adimda sadece normal karyotip ve germ hatti potansiyeli olan klonlar ilerletilmistir. Son adimin ES hücreleri dokuz ardisik manipi'ilasyondan sonra germ hattina katkida bulunmaya devam edebilmektedir (Tablo 3). Agir zincir alellerinin her biri için homozigoz olan fareler, canlidir, saglikli görünmektedir ve esasen vahsi tip bir h'ümoral bagisiklik sistemi sergilemektedir (bakiniz Ornek 3). Hibrid Insan Hedefleme Hedefleme % Toplam Fonksiyonel AIIel sekans yapi verimlilik kullanim VH VH 3hVH-CRE 144 kb - % 8 5 3 3 Immünoglob'ülin x: Hafif Zincir Degisken Gen Lokusu. K hafif zincir degisken bölgesi VK ve JK gen segmentlerini içeren yaklasik üç Mb fare sekansi ile proksimal insan VK ve JK gen segmentlerini agir zincirinkine benzer bir sekilde iceren yaklasik 0.5 Mb insan sekansinin dogrudan degistirilmesi ile sekiz ardisik adimda hümanize edilmistir (SEKIL 1B; Tablo 2 ve 4). Insan K hafif zincir Iokusunun degisken bölgesi, 800 kb'lik bir aralikla ayrilmis iki tane hemen hemen 400 kb tekrari içermektedir (Weichhold, G.M. ve ark. (1993) The human immunoglobulin kappa Iocus consists of two copies that are organized in opposite polarity. Genomics 16, 503-511 ). Tekrarlar çok benzer oldugu için, Iokus çesitliliginin neredeyse tamami proksimal tekrar kullanilarak farelerde çogaltilabilir. Ayrica, distal tekrardan yoksun K hafif zincir Iokusunun dogal bir insan aleli rapor edilmistir (Schaible, G. ve ark. (1993) The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoidindividuals. Hum Genet 91, 261-267). Mucitler, tüm fare VK ve JK gen bölümlerini proksimal insan VK ve insan JK gen bölümlerinin tümü ile etkili bir sekilde degistirmek için yaklasik üç Mb fare K hafif zincir degisken gen sekansini yaklasik 0,5 Mb insan K hafif zincir degisken gen sekansi ile degistirmistir (SEKIL 2C ve 20; Tablo 2 ve 4). Agir zincir içeren, fare VK gen bölgesinin tamami herhangi bir insan dizisi eklenmeden önce üç asamali bir islem vasitasiyla silinmistir. Ilk önce, degisken bölgenin proksimal ucuna bir neo-kaset yerlestirilmistir (AsamaA, Sekil 20). Daha sonra, K lokusunun distal ucuna bir hyg kaseti yerlestirilmistir (Adim B, Sekil 2C). LoxP bölgeleri, CRE tedavisi, her iki direnç geniyle birlikte fare VK bölgesinin geri kalan 3 Mb'sinin silinmesine neden olacak sekilde yine her seçim kaseti içine yerlestirilmistir (Asama C, SEKIL Tüm immünoglobulin K hafif zincir degisken bölgesini içeren yaklasik 480 kb boyutunda bir insan genomik fragmani, agir zincir için kullanilanlara benzer yöntemler kullanilarak (bakiniz, Ornek 1), dört ardisik asamada yerlestirildi (SEKIL ; Tablo 2 ve 4), tek bir asamada 150 kb'ye kadar insan K immünoglobulin hafif zincir sekansi yerlestirildi. Son higromisin direnç geni, geçici FLPe ekspresyonu ile çikarildi. Agir zincirde oldugu gibi, hedeflenen ES hücre klonlari, her asamadan sonra bütün insan ekinin bütünlügü, normal karyotip ve germ hatti potansiyeli açisindan degerlendirildi. i< hafif zincir alellerinin her biri için fareler homozigotlari üretildi ve saglikli oldugu ve normal göründügü bulundu. Hibrid Insan Hedefleme Hedefleme % Toplam Fonksiyonel Allel sekansi yapisi verimliligi kullanim VK VK Ornek 2. Çoklu Hümanize immünoglobulin Allellerinin Kombinasyonu ile Tamamen Hümanize Edilmis Farelerin Uretimi Birkaç noktada, Ornek 1'de tarif edildigi gibi insan immünoglobülin agir zincirinin ya da K hafif zincir degisken repertuarlarinin bir bölümünü tasiyan ES hücreleri mikro enjekte edildi ve elde edilen fareler, insan germ hatti immünoglobulin repertuarlarinin (Tablo 5; Sekil 5A ve SB) asamali olarak daha büyük fraksiyonlari ile VELOClMMUNE® farelerinin çoklu versiyonlarini olusturmak üzere büyütüldü. VELOClMMUNE® 1 (V1) fareleri, 18 insan VH gen segmentine ve 16 insan VK gen segmenti ve tüm insan JK gen segmentleri ile kombine edilen tam insan DH ve JH gen segmentlerine sahiptir. VELOClMMUNE® 2 (V2) ve VELOClMMUNE® (V3) fareleri, sirasiyla toplam 39 VH ve 30 VK ve 80 VH ve 40 VK tasiyan artan degisken repertuarlara sahiptir. Fare VH, DH ve JH gen segmentleri ve VK ve JK gen segmentlerini kodlayan genomik bölgeler tamamen degistirildiginden, VELOClMMUNE® farelerinin herhangi bir versiyonu tarafindan üretilen antikorlar, fare sabit bölgelerine bagli insan degisken bölgelerini içermektedir. Fare A hafif zincir lokuslari, VELOClMMUNE® farelerinin tüm versiyonlarinda bozulmadan kalmakta ve çesitli VELOClMMUNE® K hafif zincir Iokuslarinin ekspresyonunun etkinligi için bir karsilastirici görevi görmektedir. Hem immünoglobulin agir zinciri hem de K hafif zincir hümanizasyonlari için ikili homozigot, Ornek 1'de tarif edilen alellerin bir alt kümesinden üretildi. Ikili homozigoz farelerin üretilmesi için üreme sirasinda gözlemlenen tüm genotipler, kabaca Mendel oranlarinda meydana geldi. Insan agir zincir alellerinin her biri için erkek soy homozigotu fertilitenin azaldigini göstermistir. Azalan fertilite, fare ADAM6 etkinliginin kaybolmasindan kaynaklandi. Fare agir zincir degisken gen Iokusu, iki adet gömülü fonksiyonel ADAM6 geni (ADAMGa ve ADAMöb) içerir. Fare agir zincir degisken gen lokusunun hümanize edilmesi sirasinda eklenen insan genomik sekansi bir ADAM6 yalanci gen içermistir. Fertilite için fare ADAM6 gerekli olabilmekte ve bu nedenle hümanize edilmis agir zincir degisken gen lokuslarinda fare ADAM6 genlerinin bulunmamasi, insan yalanci gen varligina ragmen bu farelerde fertilitenin azalmasina yol açabilmektedir. Ornek 7-9, silinmis fare ADAM6 genlerinin hümanize edilmis bir agir zincir degisken gen lokusuna degisimini ve farelerde hümanize edilmis bir agir zincir immünoglobülin Iokusu olan farelerde yabani tip bir fertilite seviyesinin restorasyonunu tarif etmektedir. VELOClMMUNE® Agir Zincir K Hafif Zincir Fare Versiyonu Insan Allel 5' VH Insan Allel 5* VK VH geni VK geni Örnek 3. Hümanize Edilmis Immünoglobulin Genleriyle Farelerde Lenfosit Popülasyonlari VELOCIMMUNE® farelerinin üç farkli versiyonundaki olgun B hücre popülasyonlari, akis sitometrisi ile degerlendirildi. Kisaca, kemik iligi, dalak ve timustan hücre süspansiyonlari standart yöntemler kullanilarak yapilmistir. Hücreler, BO Pharmingen FACS boyama tamponu içerisinde ile bloke edildi, uygun antikor kokteyli ile boyandi ve üreticinin talimatlarina göre BO CytofixT'V' ile sabitlendi. Nihai hücre peletleri, 0.5 ml boyama tamponunda yeniden süspanse edildi ve bir BO FACSCALIBURTM ve BO CELLQUEST PROTM yazilimi kullanilarak analiz edildi. Tüm antikorlar (BO Pharmingen) kütlesel bir seyreltme kokteyli içinde hazirlandi ve 0.5 mg / 105 hücre nihai konsantrasyonuna ilave edildi. Kemik iligi (A-D) boyamasi için antikor kokteylleri asagidaki gibidir: A: anti- fare IgMb- FITC, anti-fare IgMa-PE, anti fare CO45R(-PE, anti- fare CO45R(B- APC; D: anti- fare BP-1-PE, anti- fare CO45R(8220)-APC. Dalak ve inguinal lenf nodu (E-H) boyamak için antikor kokteylleri asagidaki gibidir: E: anti-fare IgMb-FlTC, anti-fare IgMa-PE, anti-fare CO45R(8220)-APC; F: anti-fare lg, L1, L2, L3 Hafif Zincir- FITC, anti-fare IgK Hafif Zincir-PE, anti-fare CO45R(B220)-APC; G: anti-fare LyGG / C-FITC, anti-fare CO49b(OX5)-PE, anti-fare CO11b-APC; H: anti-fare CO4(L3T4)- FITC, anti-fare CO45R(8220)-PE, anti-fare CO8a-APC. Sonuçlar, Sekil 6'da gösterilmektedir. Homozigot VELOCIMMUNE® farelerinin dalak ya da lenf dügümlerinden izole edilen lenfositler, 8220 ve IgM markerlerinin yüzey ekspresyonu için boyandi ve akis sitometrisi kullanilarak analiz edildi (Sekil 6). Test edilen VELOCIMMUNE® farelerinin tüm versiyonlarindaki 8220+ lgM+ olgun B hücre popülasyonlarinin boyutlarii içerdikleri VH gen segmentlerinin sayisina bakilmaksizin, neredeyse yabani tip farelerinkilerle ayniydi. Ek olarak, homozigot hibrit hümanize immünoglobulin agir zincir Iokuslari içeren fareler, sadece 3 VH gen segmentine sahip olan fakat normal fare immünoglobülin K hafif zincir Iokuslari ya da normal fare immünoglobulin agir zincir lokuslu homozigot hibrit hümanize K hafif zincirli Iokus içeren fareler de, periferik bölümlerinde normal sayida 8220+ lgM+ hücrelerine sahipti (gösterilmemistir). Bu sonuçlar, insan degisken gen segmentleri ve fare sabit bölgeleri olan kimerik Iokuslarin, olgun B hücre bölmesini tamamen doldurabildigini gösterir. Ayrica, agir zincir ya da K hafif zincir Iokuslarindaki degisken gen segmentlerinin sayisi ve dolayisiyla antikor repertuarinin teorik çesitliligi, olgun B hücrelerinin yabani tip popülasyonlarini üretme kabiliyeti ile iliskili degildir. Buna karsilik, rastgele entegre edilmis tam insan immünoglobülin transgenleri ve inaktive edilmis fare immünoglobülin Iokuslarina sahip fareler, transgen içinde yer alan degisken gen segmentlerinin sayisina bagli olarak eksikligin ciddiyeti ile, bu bölümlerde düsük sayida B hücresine sahiptir (Green, L.L., and Jakobovits, A. (1998) Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes. J Exp Med 188, 483-495). Bu, "in situ genetik hümanizasyon" stratejisinin, "nakavt- plus- transgenik" yaklasiminda elde edilen rastgele bütünlesmis transgenlerden temel olarak farkli bir islevsel sonuçla sonuçlandigini göstermektedir. Allelik Dislama ve Lokus Seçimi. Alleli dislamayi sürdürme yetenegi, hümanize immünoglobulin agir zincir lokusunun farkli versiyonlari için heterozigot farelerde incelenmistir. Immünoglobulin lokuslarinin hümanize edilmesi, 12986 / SvEvTac ve CS7BL / 6NTac heterozigot embriyolardan türetilen bir F1 ES hattinda (F1H4 (Valenzuela ve ark., 2003)) gerçeklestirildi. Insan agir zincir germ hatti degisken gen sekanslari, lgMa haplotipini tasiyan 12986 aleline yönelik olasina ragmen modifiye edilmemis fare C57GBL / 6N aIIeI, IgMb haplotipini tasir. LgM'nin bu alelik formlari, lgMa ya da lgMb allellerinde bulunan polimorfizmlere özgü antikorlar kullanilarak akis sitometrisi ile ayirt edilebilmektedir. Sekil 6'da gösterildigi gibi (alt sira), insanlastirilmis agir zincir lokusunun her bir sürümü için farelerde heterozigusta tanimlanan B hücreleri, sadece lgMa (hümanize alel) ya da lgMb (vahsi tip allel) olan tek bir aleli ifade eder. Bu, allel dislamanin içerdigi mekanizmalarin VELOCIMMUNE® farelerinde bozulmamis oldugunu göstermektedir. Ek olarak, hümanize alel (lgMa) için pozitif olan nispi B hücrelerinin sayisi, mevcut VH gen segmentlerinin sayisi ile kabaca orantilidir. Hümanize immünoglobülin Iokusu, 18 insan VH gen segmentine sahip VELOCIMMUNE® 1 heterozigot farelerde B hücrelerinin yaklasik % 30'unda ve VELOCIMMUNE® 2 ve 3 (gösterilmemistir) heterozigot farede B hücrelerinin % 50'sinde sirasiyla 39 ve 80 insan VH gen segmentinde eksprese edilmektedir. Ozelliklei hümanize karsi yabani tip fare aleli eksprese eden hücrelerin orani hümanize karsi vahsi tip lokuslarda bulunan degisken gen segmentlerinin sayisinin oranindan daha (VELOCIMMUNE® 1 fareler için 0.2 ve VELOCIMMUNE® 2 fareler için 0.4) büyüktür. Bu, alel seçim olasiliginin bir ya da diger kromozomun rastgele bir seçimi ile herhangi bir belirli V segmenti RSS'in rastgele bir seçimi arasinda orta düzeyde oldugunu gösterebilmektedir. Ayrica, bir B-hücresi fraksiyonu olabilir, fakat hepsi bir degildir, burada bir alel rekombinasyon için erisilebilir hale gelir, islemi tamamlar ve diger alel erisilebilir hale gelmeden önce rekombinasyonu kapatir. Ek olarak, hibrit hümanize agir zincir Iokusundan ya da yabani tip fare agir zincir lokusun normal bir seviyede çalistigini göstermektedir. Buna karsilik, rastgele entegre edilmis insan immünoglobülin transgenleri, yabani tip fare immünoglobülin lokuslariyla zayif rekabet etmektedir (Bruggemann, M. ve ark. (1989) A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy Chains from transgenic mice. PNAS 86, heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu VELOCIMMUNE® fareleri tarafindan üretilen immünoglobulinlerin "nakavt- plus - transgenik" yaklasimlarla yapilan farelerde rastgele bütünlesmis transgenler tarafindan üretilenlerden islevsel olarak farkli oldugunu göstermektedir. Hümanize edilmis ve hümanize edilmemis hafif zincir Iokuslarinin aleli dislanmasini incelemek için, 12986 ya da CSYBL / 6N'de CK bölgelerinin polimorfizmleri mevcut degildir. Bununla birlikte, VELOCIMMUNE® farelerin hepsinde yabani tip fare K hafif zincir lokuslari bulunur, bu nedenle hümanize edilmis A hafif zincir lokuslarinin yeniden düzenlenmesi ve ekspresyonun fare A hafif zincir ekspresyonunu önleyip önleyemedigini gözlemlemek mümkündür. Hümanize zinciri ifade eden hücre sayisinin, fare A hafif zincirini ifade eden hücre sayisina göre orani, A hafif zincir lokusuna yerlestirilen insan VK gen segmentlerinin sayisindan bagimsiz olarak, VELOCIMMUNE® farelerinde yabani tip farelere kiyasla nispeten degismedi (Sekil 6, üstten üçüncü sira). Ek olarak, K hibrit hafif zincir Iokuslarinda üretken rekombinasyonun farenin A hafif zincir Iokuslarinin yeniden birlestirilmesinin uygun sekilde baskilanmasiyla sonuçlandigini gösteren çift pozitif (K arti A) hücre sayisinda bir artis olmamistir. Bunun aksine, inaktive fare K hafif zincir lokuslari olan fakat yabani tip fare A hafif zincir lokuslari olan rastgele entegre edilmis K hafif zincir transgenleri içeren fareler, A / K oranlarinin (Jakobovits, 1998) çarpici biçimde artmasina neden olarak tanitilan K hafif zincir transgenlerinin bu farelerde iyi çalismadigini göstermektedir. Bu ayrica VELOCIMMUNE® farelerinin "nakavt-plus- transgenik" fareler tarafindan yapilanlarla karsilastirildiginda immünoglobülinlerde gözlenen farkli fonksiyonel sonuçlarini göstermektedir. B hücresi Gelisimi VELOCIMMUNE® farelerdeki olgun B hücre popülasyonlari, yabani tip farelerinkine benzer (yukarida tarif edilmistir), erken B hücre farklilasmasindaki kusurlarin, olgun B hücre popülasyonlarinin genislemesi ile telafi edilmesi mümkündür. B hücre farklilasmasinin çesitli asamalari, akis sitometrisi kullanilarak B hücre popülasyonlarinin analizi ile incelenmistir. Tablo 6, VACOCIMMUNE® farelerinde, yabani tipte Iittmatlara kiyasla, spesifik hücre yüzey markerleri kullanilarak, FAC'Ier tarafindan tanimlanan her B hücre soyundaki hücrelerin fraksiyonunun oranini göstermektedir. Erken B hücresi gelisimi kemik iliginde meydana gelmekte ve B hücresi farklilasmasinin farkli asamalari, hücre yüzeyi marker ekspresyonu tiplerinde ve miktarlarindaki degisikliklerle karakterize edilmektedir. Yüzey ekspresyonundaki bu farkliliklar, hücrenin içindeki immünoglobulin Iokuslarinda meydana gelen moleküler degisikliklerle iliskilidir. Pro-B hücre geçisi için pro-B, islevsel agir zincir proteininin basarili bir sekilde yeniden düzenlenmesini ve ekspresyonunu gerekirken, pro B'den olgun B asamasina geçis, bir K ya da A hafif zincirin dogru yeniden düzenlenmesi ve ekspresyonunu tarafindan yönetilmektedir. Böylece, B hücresi farklilasmasinin asamalari arasindaki verimsiz geçis, B hücrelerinin göreceli popülasyonlarindaki belirli bir asamadaki degisikliklerle teSpit edilebilmektedir. Kemik Iligi Dalak VELOCIMMUNE @pro-B pre-B Olgunlasm Olgun Ortaya Olgun Fare Versiyonu CD43hi CD24hi amis 5220hi çikan VELOClMMUNE® farelerinin hiçbirinde B hücre farklilasmasinda büyük bir kusur gözlenmedi. Insan agir zincir gen segmentlerinin tanitilmasi, pro-B'yi pre-B transisyonu etkilemiyor gibi görünmektedir ve insan K hafif zincir gen segmentlerinin uygulanmasi, VELOClMMUNE® farelerinde pre-B'den B'ye transisyonu etkilememektedir. Bu, insan degisken bölgelere ve fare sabitlerine sahip "ters kimerik" immünoglobulin moleküllerinin normal olarak bir B ortaminda sinyalizasyon ve bir fare ortaminda uygun B hücresi farklilasmasina yol açan yardimci reseptör molekülleri baglaminda islev gördügünü göstermektedir. Buna karsilik, B hücre farklilasmasi sirasindaki farkli popülasyonlar arasindaki denge, rastgele entegre edilmis immünoglobülin transgenleri ve inaktive edilmis endojen agir zincir ya da K hafif zincir lokuslari içeren farelerde degisen uzamalara neden olmaktadir (Green and Jakobovits, 1998). Ornek 4. Hümanize Edilmis Immünoglobulin Farelerinde Degisken Gen Repertuari VELOClMMUNE® farelerinin hümanize edilmis antikor repertuarinda insan degisken gen segmentlerinin kullanimi, splenositler ve hibridom hücreleri de dahil olmak üzere birçok kaynaktan insan degisken bölgelerinin ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT PCR) ile analiz edildi. Degisken bölge sekansi, gen segmenti kullanimi, somatik hipermutasyon ve yeniden düzenlenmis degisken bölge gen segmentlerinin birlesimsel çesitliligi belirlendi. hücresinden TRIZOLTM (Invitrogen) ya da Qiagen RNEASYTM Mini Kit (Qiagen) kullanilarak ekstrakte edildi ve SUPERSCRlPTTM Ill One-Step RT-PCR sistemi (Invitrogen) kullanilarak fareye sabit bölgeye spesifik primerler ile prime edildi. Reaksiyonlar, hem agir zincir hem de K hafif zincir için ayri ayri, insan degisken bölgelerinin her bir ailesi için havuzlanmis lider primerler ile eslestirilmis daha önce belirtilen 3' sabit spesifik primerler kullanilarak her numuneden 2-5 uL RNA ile gerçeklestirildi. Ureticinin talimatlarina gore reaktiflerin ve primerlerin hacimleri ve RT-PCR / PCR kosullari gerçeklestirildi. Primer sekanslari çoklu kaynaklara dayandirilmistir (Wang, X. and Stollar, BD. (2000) Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR. J lmmunol Methods 244z217-225; Ig- primer sets, Novagen). Uygun oldugunda, iç içe sekonder PCR reaksiyonlari, havuzlanmis aileye spesifik çerçeve primerleri ve primer reaksiyonda kullanilan ayni fare 3' immünoglobulin sabitine spesifik primer ile gerçeklestirildi. Her reaksiyondan alikotlar (5 uL), agaroz elektroforezi ile analiz edildi ve reaksiyon ürünleri, bir MONTAGETM Jel Ekstraksiyon Kiti (Millipore) kullanilarak agarozdan saflastirildi. Saflastirilmis ürünler, TOPOTM TA Klonlama Sistemi (lnvitrogen) kullanilarak klonlandi ve elektroporasyon ile DH10ß E. coli hücrelerine transforme edildi. Ayri ayri klonlar, her transformasyon reaksiyonundan seçildi ve 37 C`de gece boyunca antibiyotik seçimi ile 2 ml LB sivi besi yeri kültürü içinde yetistirildi. Plazmid DNA, kit tabanli bir yaklasim (Qiagen) ile bakteri kültürlerinden saflastirildi. Immünoglobulin Degisken Gen Kullanimi Hem agir zincir hem de K hafif zincir klonlarin plazmid DNA'si, ABl 3100 Genetik Analizbründe (Applied Biosystems) T7 ya da M13 ters primerleri ile sekanslandi. Ham sekans verileri SEQUENCHERTM (v4.5, Gen Kodlari) içine aktarildi. Her bir sekans, kontiklere monte edildi ve insan VH, DH, JH ve VK, JK segmenti kullanimini tanimlamak için IMGT V-Quest (Brochet, X., Lefranc, MP., and Giudicelli, V. (2008). lMGTN-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Res 36, W503-508) arama fonksiyonunu kullanarak insan immünoglobulin sekanslarina hizalandi. Sekanslar, somatik hipermutasyon ve rekombinasyon birlesme analizi için germline sekanslari ile karsilastirildi. Fareler, RAG tamamlayicisi (Chen, J. ve ark. (1993) RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in Iymphocyte development.Proc Natl CRE Hibrit Allel, SEKIL 2Ainin alti) içeren ES hücrelerinden üretildi, ve cDNA, splenosit RNA'sindan hazirlandi. cDNA, eklenen insan gen segmentleri içinde V(D)J rekombinasyonu ve daha sonra ya fare IgM ya da lgG sabit domainlerine eklenmesi ile ortaya çikacak olan Öngörülen kimerik agir zincir mRNA için spesifik olan primer setleri (yukarida tarif edilmistir) kullanilarak amplifiye edildi. Bu cDNA klonlarindan türetilen sekanslar (gösterilmemistir), insan degisken gen sekanslari içinde uygun V(D)J rekombinasyonunun meydana geldigini, yeniden düzenlenmis insan V(D)J gen segmentlerinin fare sabit domainlerine Çerçeve içinde düzgün bir sekilde eklendigini ve sinif degisim rekombinasyonunun ortaya çiktigini gösterdi. Sonraki hibrit immünoglobulin Iokuslarinin mRNA ürünlerinin daha fazla sekans analizi gerçeklestirildi. Benzer bir deneyde, immünize edilmemis yabani tip ve VELOCIMMUNE® farelerden B hücreleri, 8220 ve IgM ya da IgG'nin yüzey ekspresyonuna dayanan akis sitometrisi ile ayrildi. 8220+ IgM+ ya da yüzey lgG+ (slgG+) hücreleri havuzlandi ve VH ve VK sekanslari, RT-PCR amplifikasyonunu ve klonlamasini takiben elde edildi (yukarida tarif edildi). Immunize edilmemis VELOCIMMUNE® 1 farelerden (Tablo 7) ve VELOCIMMUNE® 3 farelerden (Tablo 8) bir dizi RT-PCR ile amplifiye edilmis cDNA'larda temsili gen kullanimi kaydedildi (* hatali RSS; 1' eksik ya da yalanci gen). K Gözlemlenen H Gözlemlenen Tablo 7 ve 8'de gösterildigi gibi, fonksiyonel insan VH, DH, JH, VK, ve JK gen segmentlerinin hemen hepsi kullanilmaktadir. Bu deneyin VELOCIMMUNE® farelerinde tarif edilen ancak tespit edilmeyen fonksiyonel degisken gen segmentlerinden, birkaçinin hatali rekombinasyon sinyal sekanslarina (RSS) sahip oldugu ve bu nedenle eksprese edilmesinin beklenmeyecegi bildirilmistir (Feeney, A.J. (2000) Factors that influence formation of B cell repertoire. Immunol Res 21, 195-202). Hem saf hem de immünize edilmis repertuarlardan izole edilmis, çesitli VELOCIMMUNE® farelerinden diger birkaç immünoglobulin sekans setinin analizi, daha düsük frekanslarda da olsa (veriler gösterilmemistir), bu gen segmentlerinin kullanimini göstermistir. Agregat gen kullanim verileri, VELOCIMMUNE® farelerinde bulunan tüm fonksiyonel insan VH, DH, JH, VK, ve JK gen segmentlerinin çesitli saf ve immünize edilmis repertuarlarda gözlemlendigini göstermistir (veriler gösterilmemistir). Insan VH7-81 gen segmenti, insan agir zincir Iokus sekanslarinin analizinde tanimlanmis olmasina ragmen (Matsuda, F. ve ark. (1998) The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region yeniden sekanslanmasi ile konfirme edildigi gibi VELOClMMUNE® farelerinde mevcut degildir. Antikorlarin agir ve hafif zincirlerinin sekanslarii özellikle yeniden düzenlenmis degisken domain içindeki kisa polipeptit segmentlerinde ender rastlanan degiskenlik gösterdigi bilinmektedir. Hiper degisken bölgeler ya da tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR'Ier) olarak bilinen bu bölgeler, antikor molekülünün yapisinda antijen Için baglanma bölgesi olusturmaktadir. Araya giren polipeptit sekanslari, çerçeve bölgeleri (FR'Ier) olarak adlandirilmaktadir. Hem agir hem de hafif zincirlerde üç CDR (CDR1, CDR2, CDR3) ve 4 FR (FR1, FR2, FR3, FR4) vardir. Bir CDR, CDR3, bu CDR'nin hem VH, DH, ve JH hem de VK ve `JK gen segmentlerinin rekombinasyonu ile olusturulmasi ve antijene rastlanmadan önce önemli miktarda repertuar çesitliligi üretmesi bakimindan benzersizdir. Bu birlesme, hem eksonükleaz aktivitesi yoluyla nükleotit delesyonlari hem de terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) araciligiyla sablon olmayan kodlanmis eklemeler nedeni ile kesin degildir ve bu nedenle yeni sekanslarin rekombinasyon isleminden kaynaklanmasina izin verir. FR'ler degisken bölgenin bir bütün olarak yüksek degiskenligine bagli olarak önemli somatik mutasyon gösterebilse de, ancak degiskenlik degisken bölge boyunca esit bir sekilde dagilmaz. CDR'Ier, antijen baglanmasina izin veren antikor molekülünün yüzeyinde yüksek degiskenlik gösteren, konsantre ve lokalize bölgelerdir. Birlesimsel çesitliligini gösteren CDR3 birlesimi etrafindaki VELOCIMMUNE® farelerinden seçilen antikorlarin agir zincir ve hafif zincir sekanslari sirasiyla SEKIL ?A ve TB'de gösterilmektedir. Sekil ?A'da gösterildigi gibi, sablon olmayan kodlanmis nükleotit eklemeleri (N- eklemeleri), VELOCIMMUNE® farelerinden alinan antikorlarda hem VH-DH hem de DH-JH ekleminde gözlemlenir ve bu insan segmentleri ile TdT'nin uygun fonksiyonunu gösterir. VH-DH ve JH segmentlerinin germline karsitlarina göre bitis noktalari, eksonükleaz aktivitesinin de ortaya çiktigini gösterir. Agir zincir lokusundan farkli olarak, insan K hafif zincir yeniden düzenlemeleri, VK ve JK segmentlerinin rekombinasyonu ile olusturulan CDR3'te çok az TdT eklemesi sergiler ya da hiç göstermez (SEKIL YB). Bu pre-B ile B hücre geçisinde hafif zincir yeniden düzenlemeleri sirasinda farelerde TdT ekspresyonun eksikligi nedeniyle beklenir. Yeniden düzenlenmis insan VK bölgelerinin CDR3'ünde gözlemlenen çesitlilik, agirlikli olarak rekombinasyon olayi sirasinda eksonükleaz aktivitesi ile ortaya çikar. Somatik hipermutasyon. Ilave çesitlilik, germinal merkez reaksiyonu sirasinda yeniden düzenlenmis immünoglobulin genlerinin degisken bölgelerine somatik hipermutasyon adi verilen bir islem ile eklenir. Somatik olarak mutasyona ugramis degisken bölgeleri eksprese eden B hücreleri, foliküler dendritik hücreler tarafindan sunulan antijene erisim için diger B hücreleri ile rekabet eder. Antijene karsi daha yüksek afiniteye sahip olan bu B hücreleri, daha da genisleyecektir ve çevreye çikmadan önce sinif degisimi geçirecektir. Bu nedenle, degismis izotipleri eksprese eden B hücreleri, tipik olarak antijene rastlamis ve germinal merkez reaksiyonlari geçirmis ve saf B hücrelerine göre artan sayida mutasyona sahip olacaktir. Bundan baska, agirlikli olarak saf slgM+ B hücrelerinden gelen degisken bölge sekanslarinin, antijen seçimine tabi tutulan slgG+ B hücrelerinden gelen degisken sekanslarina göre nispeten daha az mutasyona sahip olmasi beklenir. Immünize edilmemis VELOCIMMUNE® farelerinden alinan slgM+ ya da slgG+ B hücrelerinden ya da immünize edilmis farelerden alinan slgG+ B hücrelerinden rastgele VH ya da VK klonlarindan gelen sekanslar, germline degisken gen segmentleri ve açiklamali germline sekansina göre degisiklikler ile karsilastirildi. Elde edilen nükleotit sekanslari, in silico olarak çevrildi ve amino asit degisikliklerine yol açan mutasyonlar da notlarla açiklandi. Veriler tüm degisken bölgelerden toplandi ve belirli bir pozisyondaki yüzde degisim hesaplandi (SEKIL 8). Sekil 8'de gösterildigi gibi, immünize edilmemis VELOCIMMUNE® farelerinden alinan sIgG+ B hücrelerinden türetilmis insan agir zincir degisken bölgeleri, ayni splenosit havuzlarindan slgM+ B hücrelerine göre çok daha fazla nükleotit sergiler ve immünize farelerden türetilmis agir zincir degisken bölgeleri daha da fazla degisiklik gösterir. Tamamlayicilik belirleme bölgelerinde (CDR'Ier), antijen seçimini gösteren çerçeve bölgelerine göre degisiklik sayisi artmistir. Insan agir zincir degisken bölgelerinden karsilik gelen amino asit sekanslari, ayrica, IgG'ye karsi IgM'de ve hatta immünize edilmis IgG'de önemli ölçüde daha fazla mutasyon sergiler. Bu mutasyonlarin, tekrar CDR'lerde çerçeve sekanslari ile karsilastirildiginda daha sik oldugu görülmekte, bu da antikorlarin in vivo olarak antijen-seçilmis oldugunu göstermektedir. Nükleotit ve amino asit mutasyonlarinin sayisinda benzer bir artis, immünize edilmis farelerden gelen IgG+ B hücrelerinden türetilen VK sekanslarinda VELOCIMMUNE® farelerinde gözlemlenen gen kullanimi ve somatik hipermutasyon, temel olarak mevcut tüm gen segmentlerinin, bu farelerde tamamen islevsel olarak ters kimerik antikorlar olusturmak için yeniden düzenleme yetenegine sahip oldugunu göstermektedir. Ayni zamanda, VELOClMMUNE® antikorlari, hedef antijenlerini etkin bir sekilde nötralize edebilen tamamen olgun insan antikorlari olusturmak için afinite seçimine ve olgunlasmasina maruz kalmak için fare immün sistemine tamamen katilir. VELOCIMMUNE® fareleri, hem yüksek afiniteye sahip olan hem de terapötik kullanim için uygun olan çok çesitli insan antikorlarinin kullanimina yol açan çok sayida antijen sinifina saglam immün yanitlari baglayabilir (veriler gösterilmemistir). Ornek 5. Lenfoid Yapinin ve Serum izotiplerinin Analizi Dalagin gross yapilari, inguinal lenf nodlari, Peyer plakalari ve H&E ile boyanmis yabani tip ya da VELOClMMUNE® farelerin alinan doku numunelerinin timüslari, isik mikroskopisi ile incelendi. Yabani tip ve VELOClMMUNE® farelerden toplanan serumdaki immünoglobulin izotiplerinin seviyeleri, LUMINEXT'V' teknolojisi kullanilarak analiz edildi. Lenfoid Organ Yapisi. Lenfoid dokularin yapisi ve fonksiyonu kismen hematopoetik hücrelerin uygun gelisimine baglidir. B hücresi gelisiminde ya da fonksiyonunda bir kusur, lenfoid dokularin yapisinda bir degisiklik olarak gösterilebilir. Boyanmis doku bölümlerinin analizi üzerine, vahsi tip ve VELOCIMMUNE® fareleri arasinda sekonder lenfoid organlarin görünümünde anlamli bir fark tespit edilmedi (veriler gösterilmemistir). Serum immünoglobulin Seviyeleri. Her izotipin ekspresyon seviyesi, yabani tip ve VELOCIMMUNE® farelerinde benzerdir (SEKIL 9A, 98 ve 90). Bu, degisken gen segmentlerinin hümanizasyonunun, sinif degistirme ya da immünoglobulin ekspresyonu ve sekresyonu üzerinde görünür bir advers etkisinin olmadigini ve bu nedenle bu fonksiyonlar için gerekli tüm endojen fare sekanslarini görünüste korudugunu gösterir. Ornek 6. Hümanize Edilmis Imm'ünoglobulin Farelerinde Immünizasyon ve Antikor Uretimi VELOCIMMUNE® farelerinin farkli versiyonlari, yabanci antijen tehdidine karsi hümoral yaniti incelemek için antijen ile immünize edildi. Immünizasyon ve Hibridom Gelisimi. VELOCIMMUNE® ve yabani tip fareler, protein, DNA, bir DNA ve protein kombinasyonu ya da bir antijeni eksprese eden hücreler seklinde bir antijen ile immünize edilebilir. Hayvanlar, genellikle üç: haftada bir toplam iki ile üç kez desteklenir. Her antijen destegini takiben, her hayvandan alinan serum numuneleri toplanir ve antijene spesifik antikor yanitlari için serum titresi tespiti ile analiz edilir. Füzyondan önce, farelere, intra-peritoneal ve / ya da intravenöz enjeksiyonlar yoluyla, arzu edildigi gibi, 5 pg protein ya da DNA nihai füzyon öncesi bir destek verilmistir. Splenositler toplanir ve üreticinin önerilen protokole göre (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD) bir elektrofüzyon odasindaki Ag8.653 miyelom hücrelerine birlestirilir. Kültürden on gün sonra, hibridomlar, bir ELISA analizi kullanilarak antijen spesifikligi açisindan taranir (Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, New York). Alternatif olarak, antijene spesifik B hücreleri dogrudan immünize edilmis VELOCIMMUNE® farelerinden izole edilir ve ilgilenilen bir antijene spesifik insan antikorlari elde etmek için burada açiklananlar da dahil olmak üzere standart teknikler kullanilarak taranir. Serum Titer Tespiti. Hayvan anti-antijen serum yanitini izlemek için serum numuneleri her destekten yaklasik 10 gün sonra toplanir ve titreler antijene spesifik ELISA kullanilarak belirlenir. Kisaca, Nunc MAXISORPTM 96 kuyucuklu plakalar, 4 °C'de gece boyunca 2 i.ig I mL antijen ile kaplanir v e sigir serum albümini (Sigma, St. Louis, MO) ile bloke edilir. Seri 3 kat dilüsyonlardaki serum numunelerinin oda sicakliginda bir saat boyunca plakalara baglanmasina izin verilir. Plakalar daha sonra konjüge keçi anti-fare Fe (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) ya da sirasiyla izotip spesifik titreler için biyotin isaretli izotip spesifik ya da hafif zincir spesifik poliklonal antikorlar (SouthernBiotech lnc.) kullanilarak tespit edilir. Biyotin isaretli antikorlar için, plaka yikamayi takiben, HRP-konjüge edilmis streptavidin (Pierce, Rockford, IL) ilave edilir. Tüm plakalar, BD OPTEIAT'VI (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) gibi kolorimetrik substratlar kullanilarak gelistirilmistir. Reaksiyon 1 M fosforik asit ile durdurulduktan sonra, 450 nm'de optik absorpsiyonlar kaydedilir ve veriler Graph Pad'den PRISMTM yazilimi kullanilarak analiz edilir. Iki kat arka plan sinyali elde etmek için gereken dilüsyonlar, titre olarak tanimlanir. Bir deneyde, VELOCIMMUNE® fareleri, insan interlökin-ö reseptörü (hIL-6R) ile immünize edildi. hIL-6R ile immünize edilmis VELOCIMMUNE® ve yabani tip fareler için temsili bir serum titresi seti, SEKIL 10A ve 1OB'de gösterilmektedir. VELOCIMMUNE® ve yabani tip fareler, benzer titre araliklar ile lL-6R'ye güçlü yanitlar verdi (SEKIL 1OA). VELOCIMMUNE® ve yabani tip kohortlardan birçok fare, tek bir antijen desteklenmesinden sonra maksimal bir yanita ulasti. Bu sonuçlar, bu antijene karsi immün yanit kuvvetinin ve kinetigin VELOCIMMUNE® ve yabani tip farelerde benzer oldugunu gösterir. Bu antijene spesifik antikor yanitlari, serumlarda bulunan antijene spesifik antikorlarin özel izotiplerini incelemek için ayrica analiz edildi. Hem VELOClMMUNE® hem de yabani tip gruplari, humoral yanit sirasinda sinif geçisinin her tip farede benzer oldugunu düsündüren agirlikli olarak bir lgG1 yanitini ortaya çikardi (SEKIL 1OB). rekabet analizi, tipik olarak antijene antikor baglanma afinitesini belirlemek için tasarlanmistir. Kisaca, sartlandirilmis besiyerindeki antikorlar, 0 ila 10 mg / mL arasinda degisen antijen proteininin seri dilüsyonlari ile önceden karistirilmistir. Antikor ve antijen karisiminin çözeltileri daha sonra, baglanma dengelerine ulasmak için oda sicakliginda iki ila dört saat boyunca inkübe edilir. Karisimlardaki serbest antikor miktarlari, daha sonra kantitatif bir sandwich ELISA kullanilarak ölçülür. Doksan alti kuyucuklu MAXISORBTM plakalari (VWR, West Chester, PA), 4 cC'de gece boyunca PBS çözeltisinde 1 ug / ml antijen proteini ile kaplanir, bunu BSA spesifik olmayan bloklama takip eder. Antikor-antijen karisimi çözeltileri daha sonra bu plakalara aktarilir, ardindan bir saat inkübasyon yapilir. Plakalar daha sonra yikama tamponu ile yikanir ve plakaya bagli antikorlar, bir HRP konjüge keçi anti-fare lgG poliklonal antikor reaktifi (Jackson Immuno Research Lab) ile tespit edildi ve BD OPTEIATM (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) gibi kolorimetrik substratlar kullanilarak gelistirildi. Reaksiyon 1 M fosforik asit ile durdurulduktan sonra, 450 nm'de optik absorpsiyonlar kaydedilir ve veriler Graph Pad'den PRISMTM yazilimi kullanilarak analiz edilir. Sinyallerin çözelti içindeki antijen konsantrasyonlarina bagimliligi, 4 parametreli bir fit analizi ile analiz edilir ve ICSO olarak rapor edilir, antijen konsantrasyonu, çözelti içinde antijen olmadan, antikor numunelerinden gelen sinyalin % 50 oraninda azalmasini saglamak için gerekli olmustur. Bir deneyde, VELOCIMMUNE® fareleri hIL-6R ile immünize edildi (yukarida açiklandigi gibi). SEKIL 11A ve 118, VELOClMMUNE® ve yabani tip farelerden alinan anti-hILöR antikorlari için afinite ölçümlerinin temsili bir setini gösterir. Immünize edilmis fareler üçüncü bir antijen destegi aldiktan sonra, serum titreleri ELISA ile tespit edilir. Splenositler, seçilen yabani tipten ve VELOCIMMUNE® fare kohortlarindan izole edilir ve hibridomlar olusturmak için Ag8.653 miyelom hücreleri ile birlestirilir ve seçim altinda yetistirilir (yukarida tarif edildigi gibi). Üretilen toplam 671 anti-IL-6R hibridomundan 236'sinin antijene spesifik antikorlari eksprese ettigi bulundu. Antijen pozitif kuyucuklarindan toplanan besiyeri, bir çözelti rekabet ELISA kullanilarak antijene baglanmanin antikor afinitesini tespit etmek için kullanildi. VELOCIMMUNE® farelerden türetilmis antikorlar, çözeltideki antijene baglanmada genis bir afinite araligi sergiler (SEKIL 11A). Buna ek olarak, 236 anti-IL-öR hibridomundan 49'unun, lL-ö'nin bir in vitro biyoanalizde reseptöre baglanmasini engelledigi bulundu (veriler gösterilmemistir). Ayrica, bu 49 anti-IL-6R bloke edici antikorlari, yabani tip farelerin paralel immünizasyonundan elde edilen bloke edici antikorlarine benzer bir dizi yüksek çözelti afinitesi sergiledi (SEKIL 11B). Ornek 7. Bir Fare ADAM6 Hedefleme Vektör'i'in'ün Yapilmasi Fare ADAM6a ve ADAMBb genlerinin hümanize edilmis bir agir zincir Iokusuna yerlestirilmesi için bir hedefleme vektörü, Dr. Fred Alt'tan (Havard University) elde edilen bir Bakteriyel Yapay Kromozomu (BAC) 929d24 degistirmek için VELOCIGENE® genetik mühendisligi teknolojisi (yukarida geçen) kullanilarak yapildi. 929d24 BAC DNA, fare ADAM6a ve ADAMöb genlerini içeren genomik fragmanlari ve hümanize bir agir zincir lokusunun insan VH1-2 ve VH6-1 gen bölümleri arasinda yer alan bir insan ADAM6 yalanci genin (hADAMGLP) hedeflenmis delesyonu için bir higromisin kaseti içerecek sekilde tasarlandi (Sekil 12). Ilk önce, fare ADAMGb geni ~ 800 bp yukari akis (5') sekansi ve ~4800 bp asagi akis (3') sekansini içeren bir genomik fragman 929d24 BAC klonundan alt klonlandi. Fare sekansini içeren ikinci bir genomik fragman, 929d24 BAC klonundan ayri olarak alt klonlandi. Fare ADAMöb ve ADAM6a genlerini içeren iki genomik fragman, hedefleme vektör'un'u olusturmak için Frt rekombinasyon bölgeleriyle çevrili bir higromisin kasetine baglandi (Fare ADAM6 Hedefleme Vektör'u, Sekil 20; SEQ ID No:3). Fare ADAMöb genini takip eden hedefleme vektör'L'inL'in 5' ucuna ve humanize edilmis agir zincir Iokusuna ligasyon için fare ADAM6a genini (Sekil 12'nin alt kismi) takip eden 3' ucuna farkli kisitlama enzim alanlari tasarlandi. Fare agir zincir lokusunun, fare ADAM6 hedefleme vektörün'ün takip eden Iigasyonu için hümanize edilmis lokusunun insan VH1-2 ve VH6-1 gen segmentleri arasinda yer alan insan ADAM6 ps'odojeni dahil insan agir zincir lokusuyla degistirilmesini içeren bir BAC klonunda ayri bir modifikasyon yapildi (Sekil 13). Kisaca, loxP rekombinasyon sahalari ile çevrili bir neomisin kaseti, insan VH1-2 gen segmentinin 3' (hADAMGW'e göre 5') ve VH6-1 gen segmentinin 5' (hADAMöLIJ'e göre 3'; bakiniz., SEKIL 13'ün ortasi) pozisyonlarinda insan genomik sekansini içeren homoloji kollarini içerecek sekilde tasarlandi. Bu hedefleme yapisinin sokma sahasinin yeri, insan ADAM6 yalanci geninin yaklasik 1.3 kb 5' ve ~ 350 bp 3' idi. Hedefleme yapisi ayrica insan ADAM6 yalanci geninin ve fare ADAM6 hedefleme vektör'un'un silinmesini içeren modifiye edilmis BAC klonu arasinda takip eden BAC ligasyonuna izin vermek için fare ADAM6 hedefleme vektörüyle ayni restriksiyon bölgelerini içermistir. Her iki yapidan türetilen BAC DNA'nin sindirilmesinin ardindan, genomik fragmanlar, fare ADAM6a ve ADAMGb nükleotit sekanslarini içeren ektopik olarak yerlestirilmis bir genomik sekans içeren bir hümanize agir zincir lokusu içeren bir düzenlenmis BAC klonu olusturmak üzere bir araya getirildi. Hümanize edilmis bir agir zincir lokusu içindeki bir insan ADAM6 geninin silinmesi için nihai hedefleme yapisi ve fare ADAM6a ve ADAMBb sekanslarinin ES hücrelerinde, ~ 13 kb insan genomik sekansi 3' içeren bir 5' genomik fragmani 5' ila 3', insan VH1-2 gen segmenti, fare ADAMöb geninin asagi akisinda ~ 800 hp fare genomik sekansi, fare ADAMöb geni, fare ADAMöb geninin yukarisindaki genomik sekansin ~ 4800 bp, 5 'Frt bölgesi, bir higromisin kaseti, 3' Frt bölgesi, fare ADAM6a geninin asagi akisinda ~ 300 hp fare genomik sekansi, fare ADAM6a geni, fare ADAM6a geninin yukari akisinda fare genomik sekansinin ~ 3400 bp ve insan VH6-1 gen segmentinin (Sekil 13'ün alti) ~ kb insan genomik sekansi 5 'içeren bir 3' genomik fragmani içerir. Tasarlanmis BAC klonu (yukarida tarif edilmistir), hümanize bir agir zincir lokusu içinde fare ADAM6a ve ADAMöb sekanslarini içeren ektopik olarak yerlestirilmis bir fare genomik sekansi içeren modifiye ES hücrelerini olusturmak için hümanize bir agir zincir Iokusu içeren fare ES hücrelerinin elektroporati için kullanilmistir. Hümanize edilmis agir zincir lokusu içindeki ektopik fare genomik fragmanini içeren pozitif ES hücreleri, TACIMANTM problari kullanilarak nicel bir PCR analizi ile tanimlandi (Lie, Y.S. and Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5'nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1):43- 48). Hümanize agir zincir lokusunun modifiye edilmis bölümünün disindaki yukari ve asagi bölgeler, hümanize agir zincir lokusu ve higromisin kaseti içinde ektopik fare genomik sekansinin varligini dogrulamak için modifiye bölge içerisinde bulunan primer ve problar kullanilarak PCR ile dogrulandi. Ekleme noktasinin yukarisindaki insan agir zincir genomik sekansini ve ekleme noktasinda mevcut olan fare genomik sekansina bitisik olarak baglanmis bir l-Ceu I restriksiyon bölgesini (asagidaki parantez içinde bulunur) gösteren yukari akis ekleme noktasi boyunca geçen nükleotit sekansi sunlari içermistir: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA CTGTCAGTGG (SEKANS ID NO: 4). Fare genomik sekansini ve ekleme noktasinin asagisindaki insan agir zincir genomik sekansina bitisik olarak baglanmis bir Pl-See I restriksiyon bölgesini (asagidaki parantez içinde bulunur) gösteren hedeflenen bölgenin 3' ucundaki akis asagi yerlestirme noktasi boyunca geçen nükleotit sekansi asagidakileri içermistir: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEKANS ID NO: 5). Yukarida tarif edilen hedefli ES hücreleri, donör ES hücreleri olarak kullanildi ve VELOCIMOUSE® fare mühendisligi yöntemi ile 8 hücreli asamada bir fare 7,294,754 ). Fare ADAMöa ve ADAM6b sekanslarini içeren ektopik bir fare genomik sekansi içeren hümanize edilmis bir agir zincir Iokusu tasiyan fareler, hümanize edilmis agir zincir lokusunda bulunan fare ADAM6a ve ADAM6b genlerinin varligini tespit eden bir allel analiz modifikasyonu (Valenzuela ve ark., 2003) kullanilarak genotipleme ile tanimlandi. Fare ADAMöa ve ADAMBb genlerini içeren hümanize edilmis bir agir zincir Iokusu tasiyan fareler, çikarilmayan hedefleme vektörünün, örnegin, ES hücre asamasinda ya da embriyoda, soktugu herhangi bir Frt'lenmis higromisin kasetini çikarmak için bir FLPe deletor fare susuna (bakiniz, örnek olarak, Rodriguez, OL ve ark. (2000) High- efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics :139-140) üretilir. Istege bagli olarak, higromisin kaseti farelerde tutulur. Yavrular genotiplendirilir ve fare ADAMöa ve ADAMöb sekanslarini içeren bir ektopik fare genomik fragmani içeren hümanize edilmis bir agir zincir Iokusu için yavru heterozigoz, fare ADAM6 gen ekspresyonunu ve fertilitesini karakterize etmek için seçilir. Ornek 8. ADAM6 Kurtarma Farelerinin Karakterizasyonu Akis Sitometrisi. Insan agir ve insan hafif zincir degisken gen Iokuslari (H / K) için homozigot 25 haftalik üç fare ve ADAMöa'yi kodlayan ektopik fare genomik fragmanina sahip insan agir ve insan hafif zinciri için homozigot 18-20 haftalik üç fare ve insan agir zincir Iokusunun (H / K -A6) her iki alleli içindeki ADAM6b genleri, BO LSR ll Sistemindeki (BO Bioscience) FAC'Ier tarafindan Ienfosit hücre popülasyonlarinin tanimlanmasi ve analizi için sakrifiye edildi. Lenfositler, spesifik hücre soylari için kapildi ve B hücresi gelisiminin çesitli asamalari boyunca ilerlemesi için analiz edildi. Hayvanlardan toplanan dokular kan, dalak ve kemik iligini içeriyordu. EDTA (BO Biosciences) içeren BO microtainer tüplerine kan alindi. Kemik iligi, fetal dana serumu, sodyum piruvat, HEPES, 2-merkaptoetanol, esansiyel olmayan amino asitler ve gentamisin ile takviye edilmis tam RPMI ortami ile yikanarak femurlardan toplandi. Kan, dalak ve kemik iligi preparatlarindan elde edilen kirmizi kan hücreleri, bir amonyum klorür bazli Iizis tamponu (örnegin, ACK Iizis tamponu) ile parçalandi, ardindan tam RPMI ortami ile yikandi. Hücre popülasyonlarinin boyanmasi için, çesitli doku kaynaklarindan 1 X 106 hücre, anti-fare CD16 / CD32 (2.4G2, BD Biosciences) ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi, ardindan buz üzerinde 30 dakika boyunca asagidaki antikor kokteyllerinin biri ya da bir kombinasyonu ile etiketlendi. Kemik iligi: anti-fare FITC-CD43 (1B11, Biolegend), PE-ckit (288, BioLegend), Periferik kan ve dalak: anti-fare FlTC-K (187.1, BO Biosciences), PE- /\ (RML-42, ve % 2 formaldehit içerisinde sabitlendi. Veri toplama, bir LSRII akis sitometresinde gerçeklestirildi ve FlowJo ile analiz edildi. Temsili bir H / K ve H / K -A6 faresinden elde edilen sonuçlar, SEKIL 14 - 18'de gösterilmistir. Sonuçlar, H / K-A6 farelerinin B hücrelerinin, B hücresi gelisim asamalarinda kemik iliginde ve periferik bölmelerdeki H / K farelere benzer bir sekilde Ilerledigini ve perifere girdikten sonra normal olgunlasma modellerini gösterdigini göstermektedir. H / K-A6 fareleri, H / K farelere kiyasla artmis bir CD43intCD19+ hücre popülasyonu göstermistir (Sekil 168). Bu, H / K-Aö farelerinde fare ADAMöa ve ADAM6b sekanslarini içeren bir ektopik fare genomik fragmani içeren hümanize agir zincir lokusundan hizlandirilmis bir IgM ekspresyonunu gösterebilmektedir. Periferde, H / K- A6 farelerinin B ve T hücre popülasyonlari normal ve H / K farelere benzer görünmektedir. Testis Morfolojisi ve Sperm Karakterizasyonu. Hümanize edilmis immünoglobulin agir zincir degisken lokuslarina sahip olan farelerde kisirligin testis ve / ya da sperm üretim hatalarina bagli olup olmadigini belirlemek için, epididimisin testis morfolojisi ve sperm içerigi incelenmistir. Kisacasi, grup basina bes fareden olusan iki gruptan (Grup 1: insan agir ve K hafif zincir degisken gen lokuslari için fareler homozigot, mADAMö-H Grup 2: insan agir zincir degisken gen lokusu için fareler heterozigoz ve K hafif zincir degisken gen lokusu için mADAMö" ') testisler epididim ile bozulmadan kesildi ve tartildi. Ornekler daha sonra sabitlendi, parafine gömüldü, kesitlere ayrildi ve hematoksilen ve eozin (HE) boyasi ile boyandi. Testis segmentleri (fare basina 2 test, toplam 20 adet) morfolojideki kusurlar ve sperm üretiminin kanitlari için incelenirken, epididim bölümleri sperm varligi açisindan incelendi. Bu deneyde, mADAMö- / - fareleri ve mADAM6+ / - fareleri arasinda testis agirligi ya da morfolojisi açisindan bir fark gözlenmedi. Bütün testislerde ve epididimde tüm genotiplerde sperm gözlendi. Bu sonuçlar, fare ADAMöa ve ADAM6b genlerinin yoklugunun, .testis morfolojisinde saptanabilir degisikliklere yol açmadigini ve spermlerin bu iki genin varliginda ve yoklugunda farelerde üretildigini ortaya koymaktadir. Bu nedenle, erkek mADAM6' ' ' farelerin dogurganligindaki kusurlarin, düsük sperm üretiminden kaynaklanmasi muhtemel degildir. Sperm Hareketliligi ve Göç. Diger ADAM gen ailesi üyelerinden yoksun olan fareler, sperm hareketliligi ya da göçteki kusurlar nedeniyle kisirdir. Sperm göçü, spermin uterustan yumurtalik içine geçme kabiliyeti olarak tanimlanir ve normal olarak farelerde döllenme için gereklidir Fare ADAMöa ve ADAMöb'nin silinmesinin bu süreci etkileyip etkilemedigini belirlemek için, sperm migrasyonu mADAMö- / - farelerinde degerlendirildi. Ayrica, sperm hareketliligi de incelendi. Kisaca, sperm, (1) insan agir zincir degisken gen Iokusu için heterozigot ve insan K hafif zincir degisken gen Iokusu (AEJAMES+ / ') için homozigot; (2) insan agir zincir 7 degisken gen lokuslari için homozigot ve insan K hafif zincir degisken gen lokuslari için homozigot (ADAM6" / "); (3) insan agir zincir degisken gen lokusu için fareler homozigot ve yabani tip K hafif zincir için homozigot (ADAM6"' mi<); ve, (4) vahsi tip C57 BL / 6 fare (WT) testislerden elde edildi. Sperm sayisinda ya da genel sperm hareketliliginde muayene ile anlamli bir anormallik gözlenmedi. Tüm fareler için, her bir sperm numunesinin hücreler yiginina nüfuz edebilecegini ve zona pellusidayi in vitroya baglayabildigini gösteren kümülüs dagilimi gözlendi. Bu sonuçlar, ADAM6- / - farelerinin kümülüsü delip zona pellusidayi baglayabilen spermlere sahip oldugunu ortaya koymaktadir. Fare yumurtalarinin in vitro (lVF) döllenmesi, yukarida tarif edildigi gibi farelerden gelen sperm kullanilarak yapildi. ADAMö- / - lVF'den sonraki gün ve yumurtalara baglanan düsük miktarda spermin az miktarda bölünmüs embriyolari mevcuttu. Bu sonuçlar, ADAM6- / - farelerinden gelen, bir zamanlar bir yumurtaya maruz birakilmis olan spermin, kümulus içine girip zona pellusidayi baglayabildigini ortaya koymaktadir. Baska bir deneyde, spermin ADAM6- / - farelerinin uterustan ve yumurta kanali boyunca göç etme kabiliyeti, bir sperm göçü tahlilinde belirlenmistir. Kisacasi, bes adet ADAM6"' erkek ile bes superovüle edilmis disi fareden olusanbir birinci grup olusturulmustur. Bes adet ADAM6+ / - erkek ile ikinci bir superovüle edilmis disi fareler grubu kuruldu. Çiftlesme çiftleri kopülasyon için gözlendi ve uterusun 5 ila 6 saat sonra uterus ve bütün disilerden tutturulmus yumurta kanali çikarildi ve analiz için yikandi. Yikama çözeltileri yumurtlamayi dogrulamak ve bir sperm sayisini elde etmek için yumurtalarda kontrol edildi. Sperm göçü iki farkli sekilde degerlendirildi. Ilk olarak, her iki yumurtalik rahimden çikarildi, salinle yikandi ve belirlenen herhangi bir sperm sayildi. Yumurta mevcudiyeti, yumurtlama kaniti olarak da kaydedilmistir. Ikinci olarak, yumurtaliklar uterusa bagli birakildi ve her iki doku sabitlendi, parafine gömüldü, kesitlendi ve boyandi (yukarida tarif edildigi gibi). Bölümler hem uterusta hem de her iki yumurta kanalinda sperm varligi açisindan incelendi. Bes ADAM6- / - erkek ile eslestirilen bes disi için, yumurta kanalindan çok az miktarda sperm yikama çözeltisinde bulundu. Bes ADAM6+ / - erkek ile eslestirilen bes disinin yumurta kanallarindan gelen yikama çözeltileri, bes ADAMG- / - erkek ile eslestirilen bes disinin dis kanalindan elde edilen yikama çözeltilerinde bulunanlara göre yaklasik 25 ila 30 kat daha yüksek bir sperm seviyesi (ortalama, n = 10 yumurta kanali) sergilemistir. Rahim ve yumurtalik histolojik kesitleri hazirlandi. Kesitler uterusta ve yumurtalikta (kolikulus tubarius) sperm varligi açisindan incelendi. Oviduct ve uterusun histolojik kesitlerinin incelenmesi, ADAM6' / ' fareleri ile eslestirilen disi fareler için, uterusta * sperm bulundugunu ancak yumurtalikta bulunmadigini gösterdi. Ayrica, ADAM6- / - fareleri ile çiftlestirilmis disilerden alinan kesitler, spermin uterus-tübül birlesiminde (UTJ) bulunmadigini ortaya koydu. ADAM6+ / - fareleriyle çiftlestirilen disilerden kesitlerde, UTJ'de ve yumurtalikta sperm tanimlandi. Bu sonuçlar, ADAMGa ve ADAM6b genlerine sahip olmayan farelerin, in vivo bir göç kusuru sergileyen sperm ürettiklerini ortaya koymaktadir. Tüm durumlarda, rahim içinde sperm gözlendi, bu da kopülasyon ve sperm saliminin normal olarak gerçeklestigini gösterir, ancak sperm sayimi ya da histolojik gözlemle ölçüldügü gibi kanülasyondan sonra yumurtaliklarda hiç sperm görülmedi. Bu sonuçlar, ADAMBa ve ADAMBb genlerine sahip olmayan farelerin, uterustan yumurtalik kanalina geçme kabiliyeti göstermeyen sperm ürettigini ortaya koymaktadir. Bu kusur görünüste kisirliga yol açar, çünkü sperm uterus-tübül birlesiminden yumurtalarin döllendigi yumurta kanalina geçemez. Birlikte ele alindiginda, bu sonuçlarin tümü, fare ADAM6 genlerinin, uterus-tübül birlesiminde ve yumurta kanali yoluyla uterustan göç etmek için normal hareket kabiliyetine sahip dogrudan spermi destekledigi ve böylelikle döllenme olayina ulasmak için bir yumurtaya yaklastigi hipotezini desteklemektedir. ADAMö'nin bunu basardigi mekanizma, dogrudan ADAM6 proteinlerinin etkisiyle ya da asagida tarif edildigi gibi Sperm hücresindeki diger proteinlerle, örnegin baska ADAM proteinleriyle koordinat ekspresyonuyla olabilir. ADAM Gen Ailesi Ekspresyonu. ADAM proteinlerinin bir kompleksinin, olgunlasan spermlerin yüzeyinde bir kompleks olarak bulundugu bilinmektedir. Diger ADAM gen ailesi üyelerinden yoksun olan fareler, sperm olgunlugu arttikça bu kompleksi kaybeder ve olgun spermde çoklu ADAM proteinlerinde bir azalma gösterir. ADAM6a ve ADAM6b genlerinin eksikliginin diger ADAM proteinlerini benzer bir sekilde etkileyip etkilemedigini belirlemek için, diger ADAM gen ailesi üyelerinin ekspresyon seviyelerini belirlemek için testis (olgunlasmamis sperm) ve epididimden (olgunlasan sperm) elde edilen protein ekstraktlarinin Western blotu analiz edildi. Bu deneyde, protein ekstreleri dört ADAM6- / - ve dört ADAM6+ / - faresinden analiz edildi. Sonuçlar, ADAM2 ve ADAM3'ün ekspresyonunun testis ekstrelerinden etkilenmedigini gösterdi. Bununla birlikte, hem ADAM2 hem de ADAM3 epididim ekstrelerinde önemli ölçüde azalmistir. Bu, ADAM6- / -farelerin sperminde ADAM6a ve ADAM6b'nin bulunmamasinin, sperm olgunlasmasi olarak diger ADAM proteinlerinin (örnek olarak, ADAM2 ve ADAM3) ekspresyonu ve belki de fonksiyonu üzerinde dogrudan bir etkiye sahip olabilecegini göstermektedir. Bu, ADAMGa ve ADAM6b'nin, sperm yüzeyinde uygun sperm göçü için kritik olabilecek ADAM protein kompleksinin bir parçasi oldugunu göstermektedir. Ornek 9. ADAM6 Kurtarma Farelerinde Insan Agir Zincir Degisken Gen Kullanimi Seçilmis insan agir zincir degisken gen kullanimi, fare ADAMöa ve ADAMöb genlerinden (mADAMö- / -) yoksun _olan ya da TAQMANTM problarini kullanan kantitatif bir PCR deneyi ile (yukarida açiklandigi gibi) fare ADAMGa ve ADAM6b genlerini (ADAM6+ / +; bakiniz Ornek 1) içermeyen ya da ektopik genomik bir fragman içeren insan agir ve K hafif zincir degisken gen Iokuslari için homozigot fareler için belirlendi. Kisaca, CD19+ B hücreleri, fare CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec) kullanilarak, mADAMö- / - ve ADAM6+ / + farelerinin dalaklarindan saflastirildi ve RNEASYT'V' Mini kiti (Qiagen) kullanilarak total RNA saflastirildi. Genomik RNA, kolon uygulamasi (Qiagen) üzerinde RNaz içermeyen bir DNaz kullanilarak çikarildi. Yaklasik 200 ng mRNA, First Stand cDNA Sentez kiti (Invitrogen) kullanilarak cDNA'ya ters kopyalandi ve daha sonra ABl 7900 Sekans Tespit Sistemi (Applied Biosystems) kullanilarak TAQMANTM Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) ile büyütüldü. Her genin bagil ekspresyonu fare K Sabit (mCK) ile normallestirildi. Tablo 9, bu deneyde kullanilan sens / anti-sens / TAQMAN TM MGB prob kombinasyonlarini ortaya koymaktadir. Insan Vh Sekans (5.3,) SEKANS ID NO: Sens: CAGGTACAGCTGCAGCAGTCA 6 VH6-1 Anti-sens; GGAGATGGCACAGGTGAGTGA 7 Sonda: TCCAGGACTGGTGAAGC 8 VH 1-2 Anti-sens: GAGAACACAGAAGTGGATGAGATC 10 Sonda: TGAGTCCAGTCCAGGGA 1 1 VH3-23 Anti-sens: AACCCTGGTCAGAAACTGCCA 13 Sonda: AGAGAAACAGTGGATACGT 14 VH 1-69 Anti-sens: GCTCGTGGATTTGTCCGC 16 Sonda: CAGAGTCACGATTACC 17 Sens: TGAGCAGCACCCTCACGTT 18 mu Anti-sens: GTGGCCTCACAGGTATAGCTGTT 19 Sonda: ACCAAGGACGAGTATGAA 20 Bu deneyde, analiz edilen örneklerde dört insan VH geninin ekspresyonu gözlendi. Ayrica, ekspresyon seviyeleri mADAMö- / - ve ADAM6+ / + fareleri arasinda karsilastirilabilirdi. Bu sonuçlar, hem modifikasyon bölgesinin distali (VH3-23 ve VH1- 69) hem de modifikasyon bölgesine proksimalinde (VH1-2 ve VH6-1) olan insan VH genlerinin, fonksiyonel olarak eksprese edilmis bir insan agir zinciri olusturmak için rekombine edilebildiklerini göstermektedir. Bu sonuçlar, bir insan agir zincir genomik sekansina yerlestirilmis fare ADAMöa ve ADAM6b seanslarini içeren ektopik genomik fragmanin, Iokus içindeki insan agir zincir gen segmentlerinin V(D)J rekombinasyonunu etkilemedigini göstermektedir ve bu fareler, fonksiyonel agir zincir immünoglobulin proteinleri üretmek için insan agir zincir gen segmentlerini normal sekilde yeniden birlestirebilmektedir. Ornek 10. Fare imm'ünoglobulin Hafif Zincir Lokuslarinin Silinmesi Fare K ve A hafif zincir lokuslarini inaktive etmek üzere fare genomik Bakteriyel Yapay Kromozom (BAC) kütüphanelerini modifiye etmek için VELOClGENE® teknolojisi (bakiniz, örnek olarak, US Pat. No. 6,586,251 ve Valenzuela ve ark. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high- resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652- 659) kullanilarak çesitli hedefleme yapilari yapildi. Fare A.hafif zincir Iokuslarinin silinmesi. Fare BAC klonu RP23- 135k15'ten (Invitroge) DNA, V A-J A-C A gen kümelerinin hedeflenen silinmesi yoluyla endojen fare A hafif zincir Iokusunu inaktive etmek için homolog rekombinasyon ile modifiye edildi (SEKIL 20). Kisaca, V A 1-J A3-C AS-J A1-C A1 gen segmentlerini içeren tüm proksimal küme, V i\1 gen segmentinin 5' sekansini içeren 5' fare homoloji kolu ile onP bölgeleriyle çevrili bir neomisin kaseti içeren bir hedefleme vektör'u ve C A1 gen segmentinin 3 tek bir hedefleme olayinda silindi. Hedefleme yapisinin V A2 gen segmentinin 5' sekansini içeren 5' fare homoloji kolu ve endojen C A2 gen segmentine 5' sekansini içeren bir 3' fare homoloji kolu (Sekil , Hedefleme Vektör 2) içermesi disinda, V A2 içeren distal endojen fare V A2-J A2- C A2-J A4-C A4 gen kümesini tam olarak silmek için bir ikinci hedefleme yapisi hazirlanmistir. Böylece, ikinci hedefleme yapisi kesin olarak V A2-J A2'yi silerken, C A2-J A4-C A4'ü endojen fare A Iokusunda bozulmadan birakti. Inaktive edilmis bir endojen A Iokusu içeren ES hücreleri (yukarida tarif edildigi gibi) teknikte bilinen karyotipleme ve tarama yöntemleri (örnegin, TAQMAN®) ile dogrulandi. DNA daha sonra modifiye edilmis ES hücrelerinden izole edildi ve CRE rekombinaz ile isleme tabi tutuldu, böylece neomisin marker genini içeren proksimal hedefleme kasetinin silinmesine aracilik etti, silme noktasinda sadece bir onP bölgesi birakti (SEKIL 20, Fare K'nin silinmesi: hafif zincir Iokusu. Iki asamali bir islemde farenin K hafif zincir lokusunu etkisiz hale getirmek için homolog rekombinasyon yoluyla fare BAC klonlarindan RP23-302g12 ve RP23- DNA'sini degistirmek Için yukarida açiklanan benzer yöntemler kullanilarak birkaç hedefleme yapisi yapildi Kisaca, endojen fare K hafif zincir Iokusunun JK gen segmentleri (1-5), hyg-TK kasetine tek bir loxP bölgesi 3' içeren bir higromisin timidin kinaz (hyg-TK) kaseti (SEKIL 21, JK Hedefleme Vektörü) içeren bir hedefleme vektörü kullanilarak tek bir hedefleme olayinda silindi. Bu hedefleme vektörünü yapmak için kullanilan homoloji kollari, endojen fare JK gen bölümlerinin fare genomik 5' ve 3' sekansini içerdi. Ikinci bir hedefleme olayinda, yukari yönde fare genomik sekansi (5 ') bir kismini en uzak endojen fare VK gen segmentine (SEKIL 21, VK Hedefleme Vektörü) silmek için ikinci bir hedefleme vektörü hazirlandi. Bu hedefleme vektörü, ters çevrilmis bir lox511 bölgesi, bir loxP bölgesi ve bir neomisin kaseti içeriyordu. Bu hedefleme vektörünü yapmak için kullanilan homoloji kollari, en uzak fare VK gen bölümünün yukarisindaki fare genomik sekansini içermistir. Hedefleme vektörleri, ES hücrelerinde DNA'yi hedeflemek için sirali bir sekilde (yani JK sonra VK) kullanildi. Çift hedefli bir kromozom (yani, her iki hedefleme vektörünü hedef alan tek bir endojen fare K lokusu) tasiyan ES, teknikte bilinen karyotipleme ve tarama yöntemleriyle (örnegin, TAQMANTM) teyit edildi. Daha sonra DNA, modifiye ES hücrelerinden izole edildi ve Cre rekombinaz ile isleme tabi tutuldu, böylece endojen fare VK gen segmentlerinin ve her iki seçim kasetinin silinmesine aracilik ederken, birbirine bitisik iki lokoksit on bölgesini zit yönde birakti (Sekil 21, alt; SEQ lD NO:59). Böylece, bozulmamis arttirici ve sabit bölgeler içeren iki modifiye edilmis endojen hafif zincir Iokusu (K ve A) yeniden tanimlanmamis insan A germline gen segmentlerinin, asagida tarif edilen hedefleme vektörleri kullanilarak, kesin bir sekilde asamali olarak sokulmasi için olusturuldu. Ornek 11. Fare Hafif Zincir Lokusun bir Insan A Hafif Zincir MiniLokus ile Degistirilmesi Yukarida tarif edildigi gibi benzer yöntemler kullanilarak insan A gen segmentlerinin endojen fare K ve A hafif zincir lokuslarina asamali olarak yerlestirilmesi için çoklu hedefleme vektörleri tasarlanmistir. Her biri fare hafif zincir sabit genlerine ve arttiricilarina islevsel olarak baglanmis gen segmentleri olan hV A ve J A içeren kimerik bir hafif zincir Iokusu üreten endojen hafif zincir lokuslarinda birçok bagimsiz baslangiç modifikasyonu yapildi. 12 insan V A ve bir insan J A gen segmenti içeren bir insan A minilokusu. Bir dizi baslangiç hedefleme vektörü, RPM-72994 (lnvitrogen) adinda bir insan BAC klonu kullanilarak küme A ve bir hJ A1 gen segmenti ya da dört hJ )\ gen segmenti ihtiva eden ilk 12 ardisik insan V )\ gen segmentini içerecek sekilde tasarlandi. Sekil 22A ve 228, sirasiyla fare A ve K hafif zincir Iokuslarinda insan A hafif zincir gen segmentlerinin baslangiçtaki bir yerlestirmesini yapmak için yapilan hedefleme vektörlerini göstermektedir. Ilk hedefleme vektörlerinin ilk seti için, 12 hV A gen segmentleri ve bir hJ A1 gen homoloji kolunun ligasyonu için hJ A1 gen segmentinin asagi akisinda (3') bir Pl-Scel sitesi 996 bp içerecek sekilde tasarlandi. Bu insan fragmaninin ligasyonu için iki farkli homoloji kolu seti kullanildi; bir homoloji kolu seti, 135k15 BAC klonundan endojen fare A sekanslari içeriyordu (Sekil 22A) ve bir baska küme, sirasiyla fare BAC klonlari sekansini 5 ' ve 3' içeriyordu (Sekil 228). 12/ 1- A Hedefleme Vektörü için (SEKIL 22A), Ornek 10'da tarif edilen modifiye fare A fragmaninin 5' ucunda bir PI-Scel bölgesi tasarlandi. ~ 28 kb fare fragmani, 5 'ila 3' arasinda bir hJ A1 gen segmenti, 996 bp hJ AD gen segmentinin insan A sekansi 3', 1229 bp fare C A2 geni fare sekansi 5', fare C A2 geni ve ~ 28 kb fare fragmaninin kalan kismini içeren 3' bir birlesme noktasi olusturan ~ 124 kb insan A fragmanina baglanarak 3' homoloji kolu olarak kullanildi. Insan V A3-12 gen segmentinden yukari akis (5'), endojen fare A lokusunun 5 'sekansina karsilik gelen 23,792 bp fare genomik DNA'si içeren 5' fare homoloji kolunun baslamasindan önce ilave 1456 bp insan A sekansiydi. 5` homoloji kolu ile insan A sekansinin baslangici arasinda Frt bölgelerinin çevreledigi bir neomisin kaseti vardi. Böylece, 5, ucundan 3' ucuna kadar 12 / 1- A Hedefleme Vektörü endojen A lokusunun ~24 kb fare A genomik sekansi 5! bölgesi, bir neomisin kaseti, 3' Frt bölgesi, ilk 12 ardisik hV A gen segmentini ve bir hJ A1 gen segmentini içeren ~123 kb insan genomik A dizisi, bir PI-Scel bölgesi ve endojen C A2-J A4-C A4 gen segmentlerini içeren ~28 kb fare genomik sekansi içeren bir 3, homoloji kolu, fare arttirici 2.4 sekansi ve arttirici 2.4'ün asagi yönünde (3`) ilave fare genomik sekansi (Sekil 22A) içermektedir. Benzer bir biçimde, 12 / 1-K Hedefleme Vektörü (SEKIL 228), fare K sekansini içeren fare homoloji kollarinin, endojen K Iokusu hedeflemesi homolog rekombinasyonla elde edilebilecek sekilde kullanilmasi ender durumuyla beraber ayni ~124 insan )\ parçasini kullanmistir. Bu iki baslangiç hedefleme vektöründen biriyle homolog rekombinasyon 12 hV A gen segmenti ve rekombinasyon sonrasinda kimerik bir A hafif zincir olusumuna yol açan endojen fare hafif zincir sabit geni ve arttirici (CK ya da C A2 ve EKi / EK3' ya da Enh 2.4 / Enh 3.1) geni ile islevsel olarak bagli bir hJ A1 geni içeren degistirilmis bir fare hafif zincir Iokusu yaratmistir. 12 insan V A ve dört insan J A gene segmenti ile bir insan A mini Iokusu. Kimerik A hafif zincir lokusuna çesitlilik eklemek için bir baska yaklasimda A kümesi ve hJ A1, 2, 3 ve 7 gen segmentinden ilk 12 ardisik insan V A gen segmentini fare K hafif zincir lokusuna (SEKIL 228, 12 / 4-K Hedefleme Vektörü) yerlestirmek için üçüncü bir ilk hedefleme vektörü tasarlanmistir. HJ A1, J A2, J A3 ve J A7 gen segmentlerini içeren bir DNA segmenti her J A gen segmentini ve her J A gen segmentinin hem acil 5< hem de 3' bölgelerinden ~100 bp insan genomik sekansini içeren de nova DNA sentezi (integrated DNA Technologies) ile yapilmaktadir. Bu -1 kb DNA fragmaninin 3! ucuna bir PI-Scel bölgesi tasarlanmis ve bir kloramfenikol kasete baglanmistir. Homoloji kollari, insan BAC klonu 72994"ün hJ A1 gen segmentine göre 5! ve 3' pozisyonlarinda insan A sekansindan PCR ile çogaltilmistir. Bu ara hedefleme vektörü ile homolog rekombinasyon, ayrica bir 1-Ceul bölgesi 5' ucundan 5' Frt bölgesine Frt bölgeleri ile çevrili bir neomisin kaseti ile daha önce insan V A3n n2 gen segmentinin yukari yönünü (5') hedef almis olan modifiye edilmis bir 72994 BAC klonu üzerinde gerçeklestirilmistir. Çifte hedeflenmis 72994 BAC klonu 5* ucundan 3' ucuna kadar bir 1-Ceul bölgesi, bir 5' Frt bölgesi, bir neomisin kaseti, bir 37 Frt bölgesi, birinci 12 hV A gen segmentini içeren bir ~123 kb fragmani, insan J A1, 2, 3 ve 7 gen segmentlerini içeren bir ~1 kb fragmani, bir PI-Scel bölgesi ve bir kloramfenikol kaseti içermektedir. Bu ara hedefleme vektörü 1-Ceul ve PI-Scel ile birlikte sindirilmis ve daha sonra üçüncü hedefleme vektörünü olusturmak için modifiye fare BAC klonuna (yukarida tarif edilmistir) baglanmistir. Bu Iigasyon insan A sekanslarinin endojen K hafif zincir lokusuna yerlestirilmesi için üçüncü bir hedefleme vektörüyle sonuçlanmis olup 5' ucundan 3, ucuna endojen fare K Iokusunun ~23 kb genomik sekansi 5' ucunu içeren bir 5' fare homoloji kolu, 1-Ceul bölgesi, 5( Frt bölgesi, bir neomisin kaseti, 3' Frt bölgesi, birinci 12 hV A gen segmentini içeren bir ~123 kb fragmani, hJ A1, 2, 3 ve 7 gen segmentleri içeren bir ~1 kb fragman, bir Pl-Scel sitesi ve CK endojen fare CK genini içeren ~28 kb fare genomik sekansi içeren bir 3' homoloji kolu, EKI ve EK3' ve EK3'in asagi yönünde (3') ilave fare genomik sekansi (Sekil 228, 12 / 4-K Hedefleme Vektörü) içermektedir. Bu üçüncü hedefleme vektörü ile homolog rekombinasyon üzerine kimerik bir insan A / fare K hafif zincirinin olusumuna yol açan endojen fare CK genine islevsel olarak bagli 12 hV A gen segmenti ve dört hJ A gen segmenti ihtiva eden modifiye edilmis bir fare K hafif zincir lokusu yaratmistir. Entegre bir insan K hafif zincir sekansina sahip bir insan A mini-Iokusu Benzer bir biçimde, insan A gen segmentlerini endojen K hafif zincir lokusuna birinci bir insersiyon yapmak için tasarlananlara benzer iki ek hedefleme vektörü (SEKIL 228, 12 / 1-K ve 12 / 4-K Hedefleme Vektörleri) bitisik insan A ve K genomik sekanslari içeren benzersiz sekilde olusturulmus hedefleme vektörleri kullanilarak insan A hafif zincir gen segmentlerini asamali olarak yerlestirmek için tasarlanmistir. Bu hedefleme vektörleri, insan VK4-1 ve JK1 gen segmentleri arasinda dogal olarak bulunan ~23 kb insan K genomik sekansini içerecek sekilde olusturulmustur. Bu insan K genomik sekansi insan V A ve insan J A gen segmentleri arasinda (SEKIL 228, 12 (K) 1-K ve 12 (K) 4-K Hedefleme Vektörleri) bu iki ek hedefleme vektöründe özellikle konumlandirilmistir. Insan K genomik sekansini içeren her iki hedefleme vektör'L'i, yukarida tarif edilen modifiye RP. Bu modifiye BAC klonu, Notl ve AsiSl sinirlama bölgeleri ile çevrili bir spektinomisin seçim kaseyi ile hedeflenmistir (Sekil 24, sol üst). Spektinomisin kaseti ile homolog rekombinasyon, çift hedefli 72994 BAC klonu ile sonuçlanmis olup, 5"den 3"e kadar, bir 1 -Ceul bölgesi, bir 5, Ftr bölgesi, bir neomisin kaseti, bir 3' Ftr bölgesi, ilk 12 hV A gen segmentlerini içeren bir ~123 kb fragmani, hV A3-1 gen segmentinin amer olmayan sekansina yaklasik 200 bp akis asagi (3') bir Notl bölgesi, bir spektinomisin kaseti ve bir AsiSl bölgesi içermektedir. Insan K sekansi (CTD-2366j12) içeren ayri bir insan BAC klonu, çift hedefli modifiye edilmis 72994 BAC klonunda bulunan hV A gen bölümleriyle Iigasyon için ~ 23 kb'lik bir fragmanin daha sonra klonlanmasina izin vermek için, hVK4-1 ve hJK1 gen segmentleri arasindaki yerlerde, kisitlama alanlarini yapilandirmak için iki bagimsiz kez hedeflenmistir (Sekil 24, sag üst). -2, 4-1 hVK gen segmentlerini, VK gen segmentlerinin asagi akisinda insan K genomik sekansi, 1-5 hJK gen segmentlerini, hCK ve yaklasik 20 kb insan K lokusunun ilave genomik sekansini içermektedir. Bu klon ilk önce, Frt bölgeleri ve 3' Frt bölgesinin asagi akis yönünde (3') bir Notl bölgesi ile çevrili bir higromisin kaseti içeren bir hedefleme vektörü ile hedeflenmistir. Bu hedefleme vektör'ü için homoloji kollari, BAC klonu içindeki VK gen segmentlerinin 57 ve 3, insan genomik sekansini içermektedir, öyle ki bu hedefleme vektörü ile homolog rekombinasyon üzerine, VK gen bölümleri silinmis ve bir Notl bölgesi, hVK4-1 gen segmentinin akis asagisinda - gen segmentlerini, ayni zamanda bir hJ A1 gen segmenti, bir PI-Scel bölgesi ve bir AsiSl bölgesi ya da gör hJ A içeren bir insan A genomik fragmani, gen segmentleri (supra), bir Pl-Scel bölgesi ve bir AsiSI bölgesi içeren bir kloramfenikol kaseti ile silmek için 3' ucunda iki hedefleme vektör'ü ile bagimsiz olarak hedeflenmistir (Sekil 24, sag üst). Bu iki benzer hedefleme vektör'ü için homoloji kollari, hJK gen segmentlerinin 5, ve 3' sekansini içermektedir. Bu ikinci hedefleme vektörleri ve klonu vermistir ki bu, 5"den 3"ne, bir 5' Frt bölgesi, bir higromisin kaset, bir 3" Frt bölgesi, bir Notl bölgesi, VK4-1 ve JK1 gen segmentleri arasinda intergenik bölge içeren insan K lokusunun 22.800 bpilik bir fragmani, bir hJ M gen segmenti ya da hJ M, J A2, J A3 ve J A7 içeren bir insan A genomik fragmani, bir Pl-Scel bölgesi ve bir kloramfenikol kaseti içermektedir (Sekil 24, sag üst). Iki ek modifikasyon yapmak için ligasyon adimiyla gerçeklestirilmistir. içeren bir fragman, ve VK4-1 ve JK1gen segmentleri arasindaki intergenik bölgeyi içeren insan K Iokusunun ~ 23 kb genomik fragmanini içeren baska bir fragman, ya bir hJ A1 gen segmenti ya da sirasiyla hJ M, J A2, J A3 ve J A7 gen segmentlerini, PI- Scel bölgesini ve kloramfenikol kaseti içeren genomik bir fragmani elde edecek sekilde Notl ve AsiSl ile sindirildi, Bu fragmanlarin ligasyonu, 5' ila 3' hV A, gen segmentlerini, VK4-1 ve JK1 gen segmentleri arasindaki insan K genomik sekansi, ya bir hJ M gen segmenti ya da hJ A1, J A2, J A3 ve J A7 gen segmentlerini, PI-Scel bölgesini ve kloramfenikol kaseti içeren genomik bir fragmani içeren iki benzersiz BAC klonu üretti (SEKIL 24, altta). Bu yeni BAC klonlari daha sonra yukari akistaki neomisin kasetini ve bitisik insan A ve K sekanslarini içeren essiz fragmanlari serbest birakmak için I-Ceul ve Pl-Scel ile sindirildi ve endojen K Iokusunun 5' ila 3' fare genomik sekansi 5 ', bir l-Ceul bölgesi, bir 5' Frt bölgesi, bir neomisin kaseti, bir 3' Frt bölgesi, insan VK4-1 ve JK1 gen segmentleri arasinda dogal olarak bulunan ~ 23 kb insan K sekansi, ya bir M M gen segmenti ya da M M, J A2, J A3 ve J A7 gen segmentleri, fare EKI, fare CK geni ve EKS' (Sekil 22, 12hV A-VKJK-hJ A,1 ve 12hV A- VKJK-4hJ A, Hedefleme Vektörleri) içeren genomik fragmani ihtiva eden modifiye edilmis bir fare BAC klonu 302912'ye baglandi. Bu hedefleme vektörlerinin her ikisiyle de homolog rekombinasyon, 12 hV A, gen segmentleri, insan K genomik sekansi ve rekombinasyon sonrasinda kimerik bir insan A / fare K hafif zincirinin olusumuna yol açan endojen fare CK genine islevsel olarak baglanmis ya bir ya da dört hJ A, gen segmentlerini içeren iki ayri degistirilmis fare K hafif zincir Iokuslari Ornek 12. Bir insan A Hafif Zincir Mini-Lokus'una Ilave insan v A Genleri Segment Tasarimi Ilave hV A, gen segmentleri, benzer hedefleme vektörleri ve metotlari kullanilarak Ornek 11'de tarif edilen baslangiçtaki modifikasyonlarin her birine bagimsiz olarak ilave edildi (Sekil 23A, + 16- A Hedefleme Vektör'u ve Sekil 238, +16-K Hedefleme Vektör'u). 16 ek insan V A gen segmentlerinin tanitilmasi. Ornek 11`de tarif edilen modifiye edilmis hafif zincir lokuslarina 16 ilave hV A gen segmenti eklemek için hedefleme vektörlerinin olusturulmasinda kullanilan yukari akis (5') homoloji kollari, ya endojen K ya da A hafif zincir Iokuslarinin fare genomik sekansini 5' içeriyordu. 3' homoloji kollari, tüm hedefleme vektörleri için ayniydi ve Ornek 11'de tarif edilen modifikasyonlarin insan A sekansinin 5' ucu ile örtüsen insan genomik sekansini içeriyordu. Kisaca, iki hedefleme vektörü, Ornek 11'de tarif edilen modifiye edilmis fare hafif zincir lokuslarina 16 ilave hV A, gen segmenti sokulmasi için tasarlandi (Sekil 23A ve SB, +16- A ya da +16-K Hedefleme Vektör'u). 21 ardisik hV A, A kümesinden gen fragmani, ya endojen K ya da A hafif zincir lokuslarina fare genomik sekansi 5' içeren bir 5' homoloji kolu ve insan genomik A sekansini içeren bir 3' homoloji kolu ile tasarlandi. Bu hedef yapilarda kullanilan 5 'fare K ya da i\ homoloji kollari, Ornek 11'de tarif edilen ile ayni 5' homoloji kolu idi (Sekil 23A ve 238). 3' homoloji kolu, Ornek 11'de tarif edilen insan genomik A sekansinin ~ 123 kb'lik fragmaninin esdeger ' ucuna karsilik gelen insan genomik A sekansinin bir 53,057 bp örtus'um'unü içeriyordu. Bu iki hedefleme vektör'u, 5' den 3' e kadar ya endojen fare K hafif zincir lokusunun ~ 23 kb genomik sekansi 5' ya da endojen A hafif zincir Iokusunun ~ 24 kb fare genomik sekansi 5' içeren bir 5' fare homoloji kolunu, bir 5' Frt bölgesi, bir higromisin kaseti, bir 3' Frt bölgesi ve Ornek 12'de tarif edilen insan A sekansinin 5' insan genomik A sekansi içerir ve bu hedefleme yapisi için 3' homoloji kolu olarak görev yapar (SEKIL 23A ve 238, +16- A ya da +16-K Hedefleme Vektörleri). Bu hedefleme vektorleri ile homolog rekombinasyon, her biri 28 hV A, gen segmentleri ve rekombinasyon sonrasinda kimerik bir hafif zincir olusumuna yol açan endojen fare sabit genlerine uygulanabilir bir sekilde baglanmis bir hJ A1 gen segmenti (CK ya da C A2) içeren bagimsiz olarak modifiye edilmis fare K ve )\ hafif zincir Iokuslari olusturdu. Benzer bir sekilde, + 16-K Hedefleme Vektör'u ayni zamanda 16 ilave hV A, gen segmentlerini, entegre bir insan K sekansi olan ve olmayan çoklu hJ A, gen segmentlerini içeren Ornek 11'de tarif edilen diger baslangiç modifikasyonlara dahil etmek için kullanildi (SEKIL 228). Diger baslangiç modifikasyonlarini içeren endojen fare K Iokusunda bu hedefleme vektör'u ile homolog rekombinasyon, rekombinasyon sonrasinda kimerik A-K hafif zincir olusumuna yol açan endojen fare CK genine uygulanabilir bir sekilde baglanmis bir insan VK -JK genomik sekansi olan ve olmayan hJ A1, 2, 3 ve 7 gen segmentlerini ve 28 hV A, gen segmentlerini içeren, fare K hafif zincir Iokuslari olusturdu. 12 ilave insan V A gen segmentinin dahil edilmesi. Ilave hV A, gen segmentleri, benzer hedefleme vektörleri ve metotlari kullanilarak yukarida tarif edilen modifikasyonlarin her birine bagimsiz olarak eklenmistir. Ilave hV A, gen segmentleri içeren hedefleme vektörleri ile homolog rekombinasyondan elde edilen nihai Iokus yapisi, SEKIL 25A ve 258'de gösterilmektedir. Kisaca, bir hedefleme vektörü, yukarida tarif edilen modifiye edilmis fare K ve A hafif zincir Iokuslarina 12 ilave hV A, gen segmentlerinin dahil edilmesi için tasarlandi kümesinden gen segmentlerini içeren insan BAC klonu RP11-22I18'den (lnvitrogen) 93.674 bp DNA fragmani, ya endojen fare K ya da A hafif zincir Iokuslarina fare genomik sekansi 5' içeren bir 5' homoloji kolu ve insan genomik A sekansini içeren bir 3' homoloji kolu ile tasarlandi. Bu hedefleme yapisinda kullanilan 5' homoloji kollari, yukarida tarif edilen 16 hV A, gen segmentlerinin dahil edilmesi için kullanilan ayni 5' homoloji kollari idi (Sekil 23A ve 238). 3' homoloji kolu, BAC klonu RP11- insan V A3- 29P gen segmentine bir PI-Scel bölgesi ~ 3431 bp 5' tasarimi ile yapildi. Bu PI-Scel bölgesi, +16- A ya da +16-K Hedefleme Vektörleri (SEKIL 23A ve 238) kullanilarak önceki modifikasyondaki insan A sekansinin 5' ucu ile çakisan, insan A sekansinin ~27 kb fragmanina ilave insan A sekansinin ~94 kb fragmanini birlestirmek için bir Iigasyon noktasi olarak görev yapti. Bu iki hedefleme vektöru, 5' den 3' e kadar, ya endojen K hafif zincir lokusunun ~ 23 kb genomik sekansi 5' ya da endojen A hafif zincir lokusunun ~ 24 kb fare genomik sekansi 5' içeren bir 5' fare homoloji kolunu, bir 5' Frt bölgesi, bir neomisin kaseti, bir 3' Frt bölgesi ve 16 hV A, ilave hV A, gen segmentlerinin yerlestirmesinden insan A sekansinin 5' ucu ile ört'üsen bir Pl-Scel bölgesi içerir ve bu hedefleme yapisi için 3' homoloji kolu olarak görev yapar (SEKIL 23A ve 238, +12- A ya da +12-K Hedefleme Vektörleri). Bu hedefleme vektörleri ile homolog rekombinasyon, bagimsiz bir sekilde, 40 hV A, gen segmentleri ve rekombinasyon sonrasinda kimerik bir hafif zincir olusumuna yol açan endojen fare sabit genlerine (CK ya da C A2) uygulanabilir bir sekilde baglanmis insan JL1 içeren modifiye edilmis fare K ve A hafif zincir lokuslari olusturdu (Sekil 23A ve 23B'nin alt kismi). Benzer bir sekilde, + 12-K Hedefleme Vektbrü, ayni zamanda 12 ilave hV A, gen segmentini, entegre bir insan K sekansi olan ve olmayan çoklu hJ A gen segmentlerini içeren diger baslangiç modifikasyonlarina dahil etmek için kullanildi (Sekil 228). Diger modifikasyonlari içeren endojen fare K lokusunda bu hedefleme vektorü ile homolog rekombinasyon, rekombinasyon sonrasinda kimerik Â-K hafif zincir olusumuna yol açan endojen fare CK genine uygulanabilir bir sekilde baglanmis bir insan VK -JK genomik sekansi olan ve olmayan hJ M, 2, 3 ve 7 gen segmentlerini ve 40 hV A, gen segmentlerini içeren, bir fare K hafif zincir lokusunu olusturdu. Ornek 13. Insan A Hafif Zincir Gen Segmentleri Tasiyan Hedeflenen ES Hücrelerinin Tanimlanmasi Yukaridaki Orneklere göre yapilan hedefli BAC DNA insan A hafif zincir gen segmentlerini ekspres eden kimerik fareler üretmek için modifiye ES hücreleri olusturmak üzere fare ES hücrelerinin elektroporati için kullanilmistir. Yeniden düzenlenmemis insan A hafif zincir gen segmentlerinin insersiyonunu içeren ES hücreleri, nicel bir TAQMAN® analizi ile tanimlanmaktadir. Spesifik primer setleri ve problari insan A sekanslarinin ve iliskili seçim kasetlerinin yerlestirilmesi (alel kazanci, GOA), endojen fare sekanslari ve herhangi bir seçim kasetinin (alel kaybi, LOA) kaybi ve çevreleyen fare sekanslarinin tutulmasi (alel tutulmasi, AR) için tasarlanmistir. Insan A sekanslarinin ilaveten her eklenmesi için, 'önceki insan setlerinin yani sira ilave insan A sekanslarinin varligini dogrulamak için ek primer setleri ve problari kullanilmistir ve daha önce hedeflenen insan sekanslarinin tutulmasini onaylamak için problar kullanilmistir. Tablo 10, kantitatif PCR analizlerinde kullanilan primerleri ve iliskili problari göstermektedir. Tablo 11, insan A hafif zincir gen segmentlerinin her bir bölümünün ES hücre klonlarina eklenmesinin dogrulanmasi için kullanilan kombinasyonlari ortaya koymaktadir. Insan A hafif zincir gen segmentlerini tasiyan ES hücreleri insan V A5-52 - V /\1-4O gen segmentlerini içeren hedefleme yapisinin sokulmasiyla sokulan Frt'ed neomisin kasetini çikarmak için FLP'yi ekspres eden (SEKIL 23A ve 23B) istege bagli olarak bir yapi ile transfekte edilmektedir. Neomisin kaseti FLP rekombinazini ekspres eden farelerle 'üreme yoluyla istege bagli olarak uzaklastirilabilir (örnegin ABD 6,774,279). Istege bagli olarak, neomisin kaseti farelerde tutulmaktadir. Primer SEKANS ID NO: Sonda SEKANS ID NO: Yukarida tarif edilen hedeflenmis ES hücreleri donör ES hücreleri olarak kullanilmis ve VELOCIMOUSE® metodu ile 8 hücreli evredeki fare embriyosuna yerlestirilmistir generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1 ):91-99. Bagimsiz olarak insan A gen segmentlerini tasiyan VELOCIMICE® (tamamen donör ES hücresinden türetilmis FO fareleri) essiz insan A gen segmentlerinin (supra) varligini tespit eden bir aIIeI analizi modifikasyonu (Valenzuela ve digerleri, yukarida) kullanilarak genotipleme ile tanimlanmistir. Insan A hafif zincir gen segmentleri içeren farelerin K: A hafif zincir kullanimi Tek bir hJ A gen segmentine (SEKIL 23B) sahip hV A gen segmentlerinin art arda üç insersiyonunun her biri Için homozigot fareler ve bir insan VK JK genomik sekansi da dahil (SEKIL 22B) dahil olmak üzere tek bir hJ A gen segmenti ya da dört insan J A gen segmenti ile hV A gen segmentlerinin ilk insersiyonu için homozigos fareler akis sitometrisi kullanilarak splenositlerde K ve A hafif zincir ekspresyonu için analiz edilmistir. Kisaca, dalaklar fare gruplarindan (grup basina üç: ila yedi hayvan arasinda degisen) hasat edilmis ve cam slaytlar kullanilarak ögütülmüstür. Kirmizi kan hücrelerinin (RBC'Ier) ACK Iizis tamponu (Lonza Walkersville) ile parçalanmasinin ardindan, splenositler, fare CD19 (Klon 103; BO Biosciences), fare CD3 (17A2; Biolegend), fare IgK ( için spesifik flüoresan boya konjuge antikorlarla boyanmistir. Veri toplama isi bir 80"" LSR Il akis sitometresi (BO Biosciences) kullanilarak gerçeklestirilmis ve FLOWJOT'VI yazilimiyla (Tree Star, Inc.) analiz edilmistir. Tablo 12, her genetik modifikasyonu tasiyan hayvan gruplarindan splenositlerde gözlemlenen B hücreleri (CD19 +), K hafif zincir (CD19+ng+Ig A -) ve A hafif zincir (CD19+1gK-Ig A +) için ortalama yüzde degerlerini göstermektedir. Benzer bir deneyde, fare CK genine islevsel bir sekilde baglanmis bir insan VK JK genomik sekansi içeren 12 hV A ve dört hJ i\ gen segmentinin bir ilk insersiyonu için homozigot fareler ve 40 hV A ve bir hJ A gen segmenti için homozigot farelerden (SEKIL ZBB'nin alti ya da SEKIL 258'nin üstü) splenik bölmenin B hücresi içerigi akis sitometrisi kullanilarak (yukarida açiklandigi gibi) IgK ve lg A ekspresyonu için analiz edilmistir. Sekil 26A, her gruptan bir temsili fare için CD19+ B hücrelerinde lg A ve IgK ekspresyonunu göstermektedir. Dalak basina CD19+ B hücresi sayisi da her fare için kaydedilmistir (Sekil 26B). Bir baska deneyde, fare CK genine islevsel olarak baglanmis bir insan VK-JK genomik sekansini içeren 40 hV A ve dört hJ A gen segmenti için homozigot farelerden (Sekil 2öB'nin alt kismi) dalak ve kemik iligi bölümlerinin B hücresi içerikleri çesitli hücre yüzey markörlerinin akis sitometrisi kullanilarak B hücresi gelisimi yoluyla ilerleme için analiz edilmistir. Kisaca, vahsi tip ve fare CK genine islevsel olarak baglanmis bir insan VK-JK genomik sekansi içeren 40 hV A ve dört hJ A gen segmenti için homozigot farelerden olusan iki grup (N = 3, 9-12 haftalik, erkek ve kadin) öldürülmüs ve dalaklari ve kemik ilikleri toplanmistir. Kemik iligi, tam RPMI ortami ile akitilarak femurlardan toplanmistir (Fetal dana serumu, sodyum piruvat, Hepes, 2-merkapt0etanol, esansiyel olmayan amino asitler ve gentamisin ile takviye edilmis RPMI ortami). Dalak ve kemik iligi preparatlarindan elde edilen RBC'ler ACK lizis tamponu (Lonza Walkersville) ile parçalanmis ve ardindan tam RPMl ortami ile yikama yapilmistir. buz üzerinde inkübe edilmis ve ardindan buz üzerinde 30 dakika boyunca seçilen bir antikor paneliyle etiketleme yapilmistir. Kemik iligi paneli: anti-fare FlTC-CD43 (1B11, Biolegend), PE-kit (288, BioLegend), ve Pacific BIue-CD3 (17A2, BioLegend). Kemik iligi ve dalak paneli: anti-fare FlTC-ng (187.1, BO), PE-lg A, (RML-42, eBioscience), APC-H7-CD19 (103, BO). Boyamanin ardindan hücreler yikanmis ve % 2 formaldehit içerisinde sabitlenmistir. Veri toplama isi bir FACSCANTOII TM akis sitometresinde (BO Biosciences) gerçeklestirilmis ve FLOWJOTM yazilimiyla (Tree Star, Inc.) analiz edilmistir. Sekiller 27A - 27D, her bir gruptan bir temsili farenin dalak kompartmaninin sonuçlarini göstermektedir. Sekiller 28A - 28E, her bir gruptan bir temsili farenin kemik iligi kompartmaninin sonuçlarini göstermektedir. Tablo 13 çesitli genetik modifikasyonlari tasiyan hayvan gruplarindan splenositlerde gözlemlenen B hücreleri (CD19*), K hafif zincir (CD19+IgK*Ig A'), ve A hafif zincir (CD19+IgK'lg N) ekspresyonu için ortalama yüzde degerleri belirtmektedir. Tablo 14, vahsi tip farelerin ve fare CK genine islevsel olarak baglanmis bir insan VK-JK genomik sekansi içeren 40 hV A ve dört hJ A gen segmenti için homozigot farelerin kemik iliginde gözlenen B hücreleri (CD19+), olgun B hücreleri (B220hilgM+), olgunlasmamis B hücreleri (8220intIgM+), K hafif zincir (8220i"tIgM+IgK+) ekspres eden olgunlasmamis B hücreleri ve A hafif zincir (B220imlgM+lg M) ekspres eden olgunlasmamis B hücrelerinin ortalama yüzde degerlerini ortaya koymaktadir. Bu deney yukarida açiklanan farelerin ilave gruplari ile tekrarlanmis ve benzer sonuçlar elde edilmistir (veriler gösterilmemistir). Genotip B lfIK+ lg A* hücreleri Vahsi Tip 46.2 91.0 3.6 Genotip B IfIK+ lg A* hücreleri Vahsi Tip 49.8 91.2 3.5 Genotip B Olgun BOlgunlasmamisOlgunlasmamis Olgunlasmamis hücreleri hücreleri B hücreleri IgK* B hücreleri lg A* B hücreleri Insan A hafif zincir gen segmentlerini tasiyan farelerde insan V A gen kullanimi. Insan A sekanslarinin (hV A 3-12 - hV A 3-1 ve hJ M Sekil 23B) birinci insersiyonu için heterozigoz fareler ve insan A sekanslarinin üçüncü bir insersiyonu için homozigot fareler (hV A5-52 - hV A 3-1 ve hJ A1, SEKIL 23B) splenositlerden izole edilmis RNA kullanilarak ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile insan A hafif zincir gen kullanimi için analiz edilmistir. Kisacasi dalaklar hasat edilmis ve steril tek kullanimlik torbalarda % 5 HI-FBS ile 10 ml RPMl- ile perfüze edilmistir. Tek bir dalak içeren her torba daha sonra bir STOMACHERTM'e (Seward) yerlestirilmis ve 30 saniye boyunca orta bir ortam ayarinda homojenlestirilmistir. Homojenize dalaklar, 0.7pm'lik bir hücre süzgeci kullanilarak filtre edilmis ve daha sonra bir santrifüjle (10 dakika boyunca 1000 rpm) topak haline getirilmis ve RBC'ler, BO PHARM LYSETM'de (BO Biosciences) üç dakika süreyle parçalanmistir. Splenositler RPMI-1640 ile seyreltilmis ve tekrar santrifüj edilmis ve ardindan 1 ml PBS (Irvine Scientific) içinde tekrar süspansiyon topaklanmis splenositlerden izole edilmistir. haline getirilmistir. teknik alanda bilinen standart teknikler kullanilarak Insan hV A gen segmentleri ve fare CK geni için spesifik primerler kullanilarak splenosit RNArsi üzerinde RT-PCR gerçeklestirilmistir (Tablo 15). PCR ürünleri jel ile saflastirilmis ve pCR klonlanmis ve vekt'orleri çevreleyen konumlarda bulunan M13 (GTAAAACGAC GGCCAG; SEKANS ID NO: 113) ve M13 Tersi (CAGGAAACAG CTATGAC; SEKANS ID NO: 114) primerleri ile dizilmistir. Insan A sekanslarinin birinci ve üçüncü klonlama alanini Ileri insersiyonlarindan elde edilen seksen dort toplam klon hV A gen kullanimini belirlemek için dizilmistir (Tablo 16). Seçilen RT-PCR klonlari için hV A-hJ A1-mCK kesisiminin nükleotit sekansi, Sekil 29*da gösterilmektedir. Buna benzer bir biçimde, endojen fare CK genine islevsel olarak bagli insan A hafif zincir gen sekanslarinin üçüncü bir insersiyonu için homozigoz olan fareler (yani, 40 hV A gen segmenti ve bir insan VK-JK genomik sekansi içeren d'ort hJ A gen segmenti, Sekil 258'nin dibi) splenositlerden izole edilen RNA kullanilarak RT-PCR ile (yukarida açiklandigi gibi) insan A hafif zincir gen kullanimi için analiz edilmistir. Seçilen 26 RT-PCR klonu için insan A hafif zincir gen segmenti kullanimi Tablo 17'de gösterilmektedir. Seçilen RT-PCR klonlari için hV A-hJ A-mCK kesisiminin n'L'ikIeotit sekansi Sekil 30'da gösterilmektedir. Buna benzer bir biçimde, endojen fare C A2 genine islevsel olarak bagli insan A hafif zincir gen segmentlerinin ilk insersiyonu için homozigoz olan fareler (12 hV A gen segmentleri ve hJ A1 SEKIL 22A ve SEKIL 23A) splenositlerden izole edilen RNA kullanilarak RT-PCR ile (yukarida tarif edildigi gibi) insan A hafif zincir gen kullanimi için analiz edilmistir. HV A gen segmentleri için spesifik primerler (Tablo 15), fare C A2 genine spesifik iki primerden biri ile eslestirilmistir; C A H M'e yeniden düzenlenmis çoklu hV A gen segmentleri endojen fare )\ hafif zincir lokusundaki insan A hafif zincir gen segmentlerini tasiyan farelerden RT-PCR klonlarindan gözlenmistir. Seçilen RT-PCR klonlari için hV A-hJ A-mC A2 kesisiminin nükleotit sekansi Sekil 31'd3 gösterilmektedir. ' hV A Primeri Sekans (5i-3') SlgKANS ID VLL-In ATG RCCDGST YYYCTCTCCT 99 VLL-2 CTCCTCACTC AGGGCACA 100 3* Mouse CK Primeri Sekans (si-3,) SEKANS ID hVA Gözlemlenen Klon Sayisi 1-3 1-44 7 1-5 1 -51 3 2-3 9-49 7 2-5 1 -40 1 2-6 1 -40 7 3b-5 3-1 7 4a-1 4-3 7 4a-5 4-3 7 4b-1 1-47 3 -1 3-1 0 3 -2 1-40 7 -3 1 -40 7 -4 7-46 2 -6 1 -40 7 -7 7-43 3 6-1 1-40 1 6-2 1 -40 2 6-7 1 -40 3 7a-1 3-1 0 7 7a-2 9-49 2 Sekil 29 hV A gen segmentlerinin bir tek hJ A gen segmentiyle bir birinci ve üçüncü insersiyon içeren farelerden RT-PCR klonlari için hV A-hJ M-mCK kesisiminin sekansini göstermektedir. Sekil 29'da gösterilmekte olan sekanslar fare CK genine yeniden birlestirilen hJ M ile farkli hV i\ gen segmentlerini içeren benzersiz yeniden düzenlemeleri göstermektedir. 12 hV A gen segmenti ve hJ M içeren tek bir modifiye endojen K Iokusu tasiyan heterozigoz fareler ve 40 hV A gen segmenti ve hJ M içeren iki modifiye edilmis endojen K lokusu tasiyan homozigoz farelerin her ikisi de fare CK genine islevsel olarak bagli insan A gen segmentleri üretme ve insan A hafif Zincirlerini ekspres eden B hücrelerini üretme kapasitesine sahiptir. Bu yeniden düzenlemeler kimerik lokuslarin bu farelerdeki çoklu, bagimsiz B hücrelerinde insan A gen segmentlerini bagimsiz olarak yeniden düzenleyebildigini göstermektedir. Ayrica, endojen K hafif zincir lokusundaki bu degisiklikler, hJ M ile yeniden düzenlendigi görülen 16 farkli hV A gen segmentinde kanitlandigi gibi hV A gen segmentlerinden herhangi birini çalisamaz hale getirmemis ya da kimerik lokusun B hücresi gelisimi sirasinda çoklu hV A ve bir hJ A (J A, 1) gen segmentini yeniden birlestirmesini önlememistir (Tablo 16). Ayrica bu fareler endojen immünoglobulin hafif zincir repertuarinin bir parçasi olarak fare CK genlerine islevsel olarak baglanmis yeniden düzenlenmis insan V A-J /\ gen segmentleri içeren fonksiyonel antikorlar yapmistir. Sekil 30, bir insan VK JK genomik sekansini da içeren 40 hV A ve dört hJ A gen segmenti için homozigot farelerden seçilen RT-PCR klonlari için hV A-hJ A-mCK kesisiminin sekansini göstermektedir. Sekil 30'da gösterilen sekanslar yeniden düzenlenmis ve fare CK genine islevsel olarak baglanmis birçok farkli hJ A gen segmenti ile tüm kimerik Iokusu kapsayan birçok farkli hV A gen segmentini içeren ilave benzersiz yeniden düzenlemeleri göstermektedir. 40 hV A ve dört hJ A gen segmenti içeren modifiye endojen K lokusu tasiyan homozigot fareler ayrica, fare CK genine islevsel olarak bagli insan A gen segmentleri üretebilmekte ve insan A hafif Zincirlerini ekspres eden B hücrelerini üretebilmektedir. Bu yeniden düzenlemeler ayrica kimerik lokuslarin tüm asamalarinin bu farelerdeki çoklu, bagimsiz B hücrelerinde insan A gen segmentlerini bagimsiz olarak yeniden düzenleyebildigini göstermektedir. Ayrica, endojen K hafif zincir lokusundaki bu ilave modifikasyonlar insan )\ gen segmentlerinin her bir insersiyonunun, seçilen 26 farkli RT-PCR klonundan dört hJ A gen segmentiyle (Tablo 17) yeniden düzenlendigi gözlemlenen 12 farkli hV A gen segmenti ile kanitlandigi gibi hV A ve /veya J A gen segmentlerinin hiçbiri çalisamaz hale getirmedigini ya da kimerik Iokusun B hücresi gelisimi sirasinda hV A ve J A gen segmentlerinin yeniden birlesmesini önlemedigini göstermistir. Ayrica yukaridakilerin yanisira bu fareler endojen immünoglobulin hafif zincir repertuarinin bir parçasi olarak fare CK bölgelerine islevsel olarak baglanmis insan V A-J /\ gen segmentleri içeren fonksiyonel antikorlar yapmistir. Sekil 31, 12 hV A gen segmentleri ve hJ A1 için homozigos farelerden üç ayri RT- PCR klonu için hV A-hJ A-mC A2 kesisiminin sekansini göstermektedir. Sekil 31'de gösterilen sekanslar, yeniden düzenlenmis ve fare C A2 genine islevsel olarak baglanmis hJ A1 ile ilk insersiyonun uzunlugunu kapsayan farkli hV A gen segmentlerini içeren ilave benzersiz düzenlemeleri göstermektedir (2D1 = V A2-8J ilavesi nedeniyle üretken olmayan bir yeniden düzenleme oldugunu göstermistir (2D1, Sekil 31). Bu, rekombinasyon sirasinda gen segmentlerinin birlesmesinin kesin olmadigi gösterildiginden V(D)J rekombinasyonunda nadir bir durum degildir. Bu klon, bu farelerin hafif zincir repertuarinda mevcut olan üretken olmayan bir rekombinanti temsil etmesine ragmen bu durum antikor genleri arasindaki birlesme çesitliligine katkida bulunan genetik mekanizmanin bu farelerde normal olarak çalistigini ve daha fazla çesitlilige sahip hafif zincir içeren bir antikor repertuarina yol açtigini göstermektedir. 12 hV A gen segmenti ve M A1 içeren modifiye endojen /\ Iokus tasiyan homozigos fareler ayrica, endojen bir fare C A genine islevsel olarak bagli insan A gen segmentleri üretme ve fare C A bölgelerine bagli hV i\ bölgelerini içeren ters kimerik A hafif zincirlerini ekspres eden B hücrelerini üretme kapasitesine sahiptir. Bu düzenlemeler diger hafif zincir Iokusuna (yani, A Iokusu) yerlestirilmis insan A hafif zincir gen segmentlerinin bu farelerde çoklu, bagimsiz B hücrelerinde insan A gen segmentlerini bagimsiz olarak yeniden düzenleyebilme yetisine sahip oldugunu daha da kanitlamaktadir. Ayrica, endojen A hafif zincir lokusunda gerçeklestirilen modifikasyonlar insan A gen segmentlerinin yerlestirilmesinin, hV )\ ve / veya hJ i\1 gen segmentlerinin hiçbirini çalisamaz hale getirmedigini ya da kimerik lokusun B hücresi gelisimi sirasinda hV A ve hJ M gen segmentlerinin yeniden birlestirilmesini önlemedigini göstermektedir. Ayrica yukaridakilerin yanisira bu fareler endojen immünoglobulin hafif zincir repertuarinin bir parçasi olarak fare CK bölgelerine islevsel olarak baglanmis insan V A-J /\ gen segmentleri içeren fonksiyonel antikorlar yapmistir. Bu örnekte gösterildigi gibi, endojen K ve A hafif zincir Iokuslarinda insan A hafif zincir gen segmentlerini tasiyan fareler insan A hafif zincir gen segmentlerini yeniden düzenleme ve bunlari farenin normal antikor repertuarinin bir parçasi olarak bir fare CK ve / veya C A bölgesi baglaminda ekpres etme kapasitesine sahiptir çünkü hem dalakta hem de kemik iliginde B hücre gelisiminde çesitli kontrol noktalarinda fonksiyonel bir hafif zincire ihtiyaç vardir. Ayrica B hücrelerinin erken alt kümeleri (örnegin, pre-, pro- ve geçis B hücreleri), ayni batinda dogan vahsi tip yavrulara kiyasla bu farelerde normal bir fenotip göstermektedir (Sekil 27D, 28A ve 288). Kemik iliginde ve periferik B hücre popülasyonlarinda oto-reaktif olgunlasmamis B hücrelerinin bir alt kümesinin ve / veya insan agir zinciriyle insan A hafif zincirinin bir suboptimal iliskisinin delesyonuna atfedilebilecek küçük bir defisit gözlenmistir. Bununla birlikte, bu farelerde gözlenen IgK / lg A kullanimi, farelerde gözlenenden daha fazla insan hafif zincir ekspresyonuna benzer bir durum göstermektedir. Ornek 15. Bir Endojen Hafif Zincir Lokusundan Insan A Hafif Zincirlerini Ekspres Eden Farelerin Uretilmesi Bir endojen fare hafif zincir Iokusunda insan A gen segmentlerinin kullanimini optimize etmek için, yeniden düzenlenmemis insan A gen segmentlerini tasiyan fareler, karsi endojen hafif zincir Iokusunda (K ya da A) bir delesyon içeren baska bir fare ile çiftlestirilir. Ornek olarak, endojen K Iokusunda yer alan insan A gen segmentleri, endojen A hafif zincir Iokusunda ayni zamanda bir delesyon tasiyan bir farede bulunan yalnizca fonksiyonel hafif zincir gen segmentleri olacaktir. Bu sekilde elde edilen soy, yukaridaki örneklerde tarif edildigi gibi sadece insan A hafif Zincirlerini ifade eder. Ureme, teknik alanda bilinen standart tekniklerle ve alternatif olarak ticari sirketler tarafindan örnek olarak Jackson Laboratuvari tarafindan gerçeklestirilmektedir. Endojen K lokusundaki insan A hafif zincir gen segmentlerini tasiyan ve endojen A hafif zincir Iokusunun bir delesyonunu içeren fare suslari, benzersiz ters-kimerik (insan-fare) A hafif zincirlerinin varligi ve endojen fare A hafif zincirlerinin yoklugu açisindan taranmaktadir. Yeniden düzenlenmemis bir insan A hafif zincir lokusunu tasiyan fareler ayrica endojen fare agir zincir degisken gen lokusunun insan agir zincir degisken gen Regeneron Pharmaceuticals, the VELOCIMMUNE® genetically engineered mouse). VELOCIMMUNE® fare kismen, fare antijenik stimülasyona cevap olarak bir insan agir zincir degisken bölgesi ve bir fare agir zincir sabit bölgesi içeren antikorlari üretecek sekilde endojen fare sabit bölge lokuslarina islevsel olarak bagli insan agir zincir degisken bölgelerini içeren bir genomu olan kismi üretmektedir. Antikorlarin agir zincirlerinin degisken bölgelerini kodlayan DNA izole edilebilir ve insan agir zincir sabit bölgelerini kodlayan DNA'ya islevsel bir sekilde baglanabilir. DNA daha sonra, antikorun tamamen insan agir zincirini ekspres edebilen bir hücrede ekspres edilebilir. Uygun bir üreme programi sonrasinda, endojen fare agir zincir lokusu ile insan agir zincir lokusunun bir replasmanini ve endojen K hafif zincir lokusundaki yeniden düzenlenmemis bir insan A hafif zincir lokusunu içeren fareler elde edilmistir. Somatik olarak mutasyona ugramis insan agir zincir degisken bölgeleri ve insan A hafif zincir degisken bölgelerini içeren antikorlar, ilgilenilen bir antijen ile immünizasyon sonrasinda izole edilebilirler. Ornek 16. Insan Agir Zincirini ve Insan A Hafif Zincirini Ekspres Eden Farelerden Antikorlarin Uretilmesi Yeniden düzenlenmemis insan A hafif zincir lokusunu içeren farelerin diger endojen lg lokuslarinin modifikasyonlarini ve delesyonlarini içeren çesitli istenen suslarla (yukarida tarif edildigi gibi) çiftlestirilmesinden sonra seçilen fareler, ilgilenilen bir antijen ile immünize edilmistir. Genel olarak, tek yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgeleri içeren bir VELOCIMMUNE® faresi, antijene tabii tutulmustur ve Ienfatik hücreler (B hücreleri gibi), hayvanlarin serumundan geri kazanilmaktadir. Lenfatik hücreler, ölümsüz hibridoma hücre hatlari hazirlamak için bir miyelom hücre hatti ile birlestirilebilir ve bu gibi hibridom hücre hatlari, immünizasyon için kullanilan antijene spesifik insan agir zincir ve insan A hafif zincir içeren antikorlari üreten hibridom hücre hatlarini tanimlamak için taranmak ve seçilmektedir. Agir zincirlerin ve A hafif zincirlerin çesitli bölgelerini kodlayan DNA izole edilebilir ve agir zincir ve hafif zincirin istenilen izotopik sabit bölgelerine baglanabilir. Endojen fare A lokusu ile karsilastirildiginda ilave hV A gen segmenlerinin mevcudiyeti nedeniyle, hafif zincir repertuarinin çesitliligi çarpici sekilde artmakta ve immünizasyon üzerine antijene özgü repertuvarda daha fazla çesitlilik saglamaktadir. Elde edilen klonlanmis antikor sekanslari, daha sonra bir CHO hücresi için bir hücrede üretilebilir. Alternatif olarak, antijene özgü kimerik antikorlari ya da hafif ve agir zincir alanlarinin çesitli alanlarini kodlayan DNA, dogrudan antijene özgü lenfositlerden (örnek olarak B hücreleri) izole edilebilir. Baslangiçta, yüksek afiniteli kimerik antikorlar, bir insan degisken bölgesi ve bir fare sabit bölgesine sahip olarak izole edilmektedir. Yukarida tarif edildigi gibi antikorlar, afinite, seçicilik, epitop ve benzerleri gibi istenilen özellikler için karakterize edilmekte ve seçilmektedir. Fare sabit bölgeleri, bulusun yeniden düzenlenmemis insan A hafif zincir lokusundan türetilmis somatik olarak mutasyona ugramis insan agir zincirini ve insan A hafif zincirini içeren, tam insan antikorunu olusturmak için istenilen insan sabit bölgesi ile degistirilmektedir. Uygun insan sabit bölgeleri arasinda, örnek olarak vahsi tip ya da modifiye IgG1, IgG2, lgGS ya da lgG4 yer almaktadir. Ornek 17. ADAM6 Farelerinin ve Insan It Degisken Farelerinin Uretilmesi Bir endojen ADAM6 geni ya da ortolog ya da bunun homologunun bir modifikasyonunu içeren ve ayrica farede ADAM6 fonksiyonunu saglayan bir geni içeren, burada tarif edilen farelerin herhangi biri, bir insan ya da fare A ya da K sabit genine uygun bir sekilde baglanmis bir insan A degisken segmenti (örnek olarak bir V ve bir J segmenti) içeren bir modifikasyona sahip bir fare ile çiftlestirilmektedir. Insan A degisken segmentini içeren fare, modifiye edilmis A ya da K Iokusunda ya da bir transgende mevcut degisken segmente sahip olabilir. Fareler üretilmekte ve eger gerekirse yavrular ayrica melezlenmekte ve kusak, ADAM6 fonksiyonunu sergileyen ve ayni zamanda oldugu gibi insan ya da fare A ya da K sabit bölgesi baglaminda insan A sekansini ifade eden fertil fareler için taranmaktadir. Ektopik bir ADAM6 sekansi (ya da farede ADAM6 fonksiyonunu saglayan ADAM6,nin bir ortologunun ya da homologunun bir sekansi) içeren insanlastirilmis bir agir zincir degisken lokusu (insan V, D ve J segmenleri, tüm ya da büyük ölçüde bütün fare V, D ve J bölümlerinin yerini alir) içeren bir fare, fare A Iokusunda ve /veya fare K Iokusunda insan A hafif zincir V ve J segmentleri ile tüm ya da büyük ölçüce bütün hafif zincir V ve J segmentlerinin bir replasmanini içeren bir fare ile çiftlestirilmektedir. Yavrular, gerektiginde ayrica çiftlestirilir ve bir agir zincir sabit sekansi ile kaynasmis bir insan VH ve bir A ya da bir K hafif zincir sabit sekansi ile kaynasmis bir sabit insan A VL içeren bir antikoru eksprese eden fareler tanimlanmaktadir. Fareler, ilgilenilen bir antijene maruz birakilmakta ve bir imm'un yanit üretmelerine izin verilmektedir. Ilgili antijene özg'u antikorlar tanimlanmakta ve insan VH sekanslari ve insan A degisken sekanslari (fare K sabit bölgelerine bagli insan A degisken sekanslari dahil) tanimlanmakta ve degisken bölge sekanslarini insan sabit bölge genleri ile kombinasyon halinde imal ederek bir insan antikorunu yapmak için kullanilmaktadir. Bir durumda bir fare, endojen fare agir zincir Iokusunda tüm ya da büyük ölçüde bütün fare agir zincir V, D ve J segmentlerinin insan V, D ve J segmentleri ile bir replasmanini kapsayan ve bir hafif zincir aleli içeren, A sabit bir sekansa islevsel olarak bagli endojen bir fare )\ Iokusunda t'üm ya da büyük ölçüde bütün A hafif zincir degisken sekansinin bir ya da daha fazla insan A degisken sekansi ile bir replasmanini kapsayan ve bir hafif zincir aleli içeren, bir ya da daha fazla insan A degisken sekansi olan endojen bir lokusta tüm ya da büyük ölçüde bütün K hafif zincir sekanslarinin bi replasmanini içeren 'üreme ile olusturulmaktadir. Hayvan, ilgilenilen bir antijene maruz birakilmakta ve bir immün tepkisi olusturmasina izin verilmektedir. Bir fare A ya da fare K sabit bölgesindeki insan A degisken alanlari ile ayni türden insan agir zincir degisken alanlari içeren ilgilenilen antijene baglanan antikorlar tanimlanmaktadir. Degisken alanlari kodlayan nükleik asit sekanslari, degisken sekanslari, insan sabit bölge sekanslari ile kombinasyon halinde imal ederek tamamen insan antikorunu yapmak için kullanilmaktadir. Bu örnekte tarif edilen fareler, buradaki metinde ve sekillerde tarif edilen VK-JK intergenik bölgelerin bir ya da daha fazlarini içermektedir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (12)

ISTEMLER
1. Bir fare olup, Özelligi: (a) farenin endojen bir immünoglobulin kappa hafif zincir lokusunda bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis insan V A gen segmenti ve bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis insan J A gen segmenti içermesi, burada immünoglobulin kappa hafif zincir Iokusunun birfare CK bölgesi içermesi; (b) farenin endojen bir immünoglobulin agir zincir lokusunda bir ya da daha fazla insan VH gen segmenti, bir ya da daha fazla insan DH gen segmenti ve bir ya da daha fazla insan DH gen segmenti içermesi; ve (o) bir immünoglobulin agir zincir Iokusunun bir modifikasyonunu içermesi, burada modifikasyonun erkek farelerde fertilitede bir azalma ile iliskili olan endojen ADAM6 fonksiyonunu elimine etmesi, farenin ayrica her biri bir erkek farede fertilitede söz konusu azalmayi gelistirmek ya da iyilestirmek için islevsel olan, bir fare ADAM6a proteinini ya da bir ortologunu ya da homolog ya da fonksiyonel bir fragmanini kodlayan bir nükleik asit sekansi ve her biri, bir erkek farede, fertilitede bahsedilen azalmayi gelistirmek ya da iyilestirmek için islevsel olan, bir fare ADAMöb proteinini kodlayan bir nükleik asit sekansi ya da bunun bir ortologu ya da homologu ya da fonksiyonel fragmanini içermesi, burada ADAM6 proteinlerini, onun ortologlarini, homologlarini ya da fonksiyonel fragmanlarini kodlayan nükleik asit sekanslarinin insan agir zincir gen segmentlerinde mevcut olmasidir.
2. Onceki istemlere göre fare olup, özelligi; farenin 12 ila 40 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti içermesidir.
3. Istem 2tye göre bir fare olup, özelligi; burada: (a) farenin 12 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti içermesi; (b) farenin 28 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti içermesi; ya da (C) farenin 40 insan V A gen segmenti ve en az bir insan J A gen segmenti içermesidir.
4. Onceki istemlerden herhangi birine göre fare olup, özelligi; burada: (a) en az bir J A gen segmentinin J A1, J A2, J A3, J A7 ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilmesi; ve / veya (b) farenin en az dört insan J A gen segmenti içermesidir.
5. Onceki istemlerden herhangi birine göre fare olup, Özelligi; burada farenin, endojen immünoglobulin kappa hafif zincir lokusunda bir endojen kappa hafif zincir degisken bölgesinden yoksun olmasidir.
6. Onceki istemlerden herhangi birine göre fare olup, özelligi; ayrica bir insan K hafif zincir Iokusundan bir insan VK'JK intergenik bölgesini içermesi, burada insan VK' JK intergenik bölgesinin bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis V A gen segmenti ile ve bir ya da daha fazla yeniden düzenlenmemis J A gen segmenti ile bitisik olmasi, tercih edilen sekliyle burada insan VK'JK intergenik bölgesinin bir V A gen segmenti ve bir J A gen segmenti arasina yerlestirilmis olmasi, ve burada insan VK'JK intergenik bölgesinin SEKANS lD NO: 158'i içermesidir.
7. Onceki istemlerden herhangi birine göre fare olup, özelligi; farenin bir erkek fare olmasidir.
8. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre fareden izole edilmis bir hücre ya
9. Istem 1 ila 7'den herhangi birine göre farenin kullanimi olup, özelligi: (i) bir ters kimerik antikor; (ii) tamamen insan antikor; (iii) tamamen insan Fab fragmani; ya da (iii) tamamen insan F(ab)2 fragmani yapmak için kullanilmasidir.
10. Bir antikor yapmak için bir yöntem olup, özelligi; yöntemin: (a) istem 1 ila 7'den herhangi birine göre farenin bir antijene maruz birakilmasi; (b) farenin antijene karsi bir bagisiklik tepkisi gelistirmesine izin verilmesi; ve (c) (b)'deki fareden spesifik olarak antijeni taniyan bir antikorun izole edilmesini içermesi, burada antikorun bir hV A, bir hJ A ve bir fare CK bölgesinden türetilmis bir hafif zincir içermesi, ya da antijeni spesifik olarak taniyan bir immünoglobulin alani içeren bir hücrenin (b) faresinden izole edilmesi ya da (b) faresinde, antijene baglanan bir agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansinin tanimlanmasini içermesidir.
11. Bir insan antikoru yapmak için bir yöntem olup, özelligi; yöntemin, istem 1 ila 7'den herhangi birine göre farenin bir antijene maruz birakilmasini, farenin, antijeni spesifik olarak baglayan bir antikor yapmayi içeren bir bagisiklik tepkisi olusturmasinin saglanmasini, fareden bir B hücresinde, bir insan agir zincir degisken bölgesini kodlayan yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin ve bir antikorun bir soydas insan hafif zincir degisken alan sekansini kodlayan yeniden düzenlenmis bir nükleik asit sekansinin belirlenmesini içermesi, burada antikorun spesifik olarak antijeni baglamasi ve istenen bir antikoru yapmak için sirasiyla bir insan agir zincir sabit alanini kodlayan bir nükleik asit sekansina ve bir insan hafif zincir sabit alanini kodlayan bir nükleik asit sekansina baglanan insan agir zincir degisken bölgesini ve insan hafif zincir degisken alanlarini kodlayan nükleik asit sekanslarinin kullanilmasini içermesidir.
12. Bir agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansinin elde edilmesi için bir yöntem olup, özelligi: (a) istem 1 ila 7'den herhangi birine göre farenin bir antijene maruz birakilmasi; (b) fareden bir B hücresinde sunlarin tanimlanmasi: (i) yeniden düzenlenmis bir hafif zincir immünoglobulin geni, burada yeniden düzenlenmis hafif zincirli immünoglobulin geni bir fare CK bölgesine bagli en azindan bir insan A hafif zincir degisken bölge gen segmenti içermektedir; ya da (ii)(b)(i)*nin bir yeniden düzenlenmis hafif zincir immünoglobulin geni ve bir yeniden düzenlenmis agir zincir immünoglobulin genii burada yeniden düzenlenmis agir zincir immünoglobulin geni (b)(i)'nin yeniden düzenlenmis hafif zincir immünoglobulin geni tarafindan kodlanan hafif zincirle eslesen bir agir zinciri kodlamaktadir; ve (c) farenin B hücresinden bir agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir nükleik asit sekansinin klonlanmasini içermesi burada agir ve / veya hafif zincir degisken bölgesinin, bir insan V A ve bir fare CK içeren bir antikordan olmasidir.
TR2019/03439T 2011-12-20 2012-12-17 İnsanlaştırılmış hafif zincirli fareler. TR201903439T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161578097P 2011-12-20 2011-12-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201903439T4 true TR201903439T4 (tr) 2019-04-22

Family

ID=47501484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/03439T TR201903439T4 (tr) 2011-12-20 2012-12-17 İnsanlaştırılmış hafif zincirli fareler.

Country Status (29)

Country Link
US (6) US9706759B2 (tr)
EP (2) EP2793567B1 (tr)
JP (6) JP6327750B2 (tr)
KR (5) KR102038974B1 (tr)
CN (1) CN104159444B (tr)
AU (6) AU2012323987B2 (tr)
BR (2) BR112014015238B1 (tr)
CA (1) CA2859408C (tr)
CY (1) CY1121638T1 (tr)
DK (1) DK2793567T3 (tr)
ES (1) ES2720186T3 (tr)
FI (1) FI3527070T3 (tr)
HR (1) HRP20190897T1 (tr)
HU (1) HUE044266T2 (tr)
IL (3) IL233153B (tr)
IN (1) IN2014DN06094A (tr)
LT (2) LT2793567T (tr)
ME (1) ME03477B (tr)
MX (3) MX378871B (tr)
MY (1) MY173936A (tr)
PL (1) PL2793567T3 (tr)
PT (2) PT2793567T (tr)
RS (1) RS58761B1 (tr)
RU (2) RU2664181C2 (tr)
SG (3) SG10201913164YA (tr)
SI (1) SI2793567T1 (tr)
SM (2) SMT202500496T1 (tr)
TR (1) TR201903439T4 (tr)
WO (1) WO2013096142A1 (tr)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK2564695T3 (en) 2009-07-08 2015-05-26 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
US10881084B2 (en) 2010-07-26 2021-01-05 Trianni, Inc Transgenic animals and methods of use
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
NZ707327A (en) 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
LT2578688T (lt) 2011-02-25 2019-11-11 Regeneron Pharma Adam6 pelės
WO2013022782A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized universal light chain mice
AU2012311286B2 (en) 2011-09-19 2018-07-26 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
EP2758534B1 (en) 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
LT2627773T (lt) * 2011-10-17 2017-12-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės iškirpta sunkioji imunoglobulino grandinė
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20180295821A1 (en) * 2011-12-02 2018-10-18 Kymab Limited Transgenic Animals
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
KR102038974B1 (ko) 2011-12-20 2019-10-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 경쇄 마우스
HRP20192218T1 (hr) * 2012-02-01 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi koji izražavaju teške lance koji sadrže vl domene
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
PL2858487T3 (pl) 2012-06-12 2020-06-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizowane zwierzęta inne niż ludzie z ograniczonymi loci łańcucha ciężkiego immunoglobuliny
DK2840892T3 (en) 2013-02-20 2018-07-23 Regeneron Pharma Non-human animals with modified heavy chain immunoglobulin sequences
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
CA2925723A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR102846903B1 (ko) 2014-03-21 2025-08-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
US20150266976A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
IL257411B2 (en) * 2015-08-24 2024-05-01 Trianni Inc Enhanced production of immunoglobulins
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
CN113831407B (zh) 2016-05-20 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
WO2017214089A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
RS66884B1 (sr) * 2016-11-04 2025-07-31 Regeneron Pharma Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca
CA3050715A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-26 Open Monoclonal Technology, Inc. Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci
CA3066569A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
PT3720279T (pt) * 2017-12-05 2022-10-06 Regeneron Pharma Ratinhos tendo uma cadeia leve lambda de imunoglobulina manipulada e seus usos
JP7779653B2 (ja) 2018-02-07 2025-12-03 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療用タンパク質送達のための方法および組成物
DK3772927T3 (da) * 2018-03-24 2025-02-17 Regeneron Pharma Genetisk modificerede mus eller rotter til generering af terapeutiske antistoffer mod peptid¿MHC-komplekser, fremgangsmåde til fremstilling og anvendelser deraf
KR20250140631A (ko) 2018-05-17 2025-09-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-cd63 항체, 콘쥬게이트, 및 이의 용도
CN109359045B (zh) * 2018-10-16 2022-01-04 武汉斗鱼网络科技有限公司 一种测试方法、装置、设备和存储介质
JP2020146303A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146308A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146300A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146310A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146318A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146316A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146297A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146309A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146311A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146307A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146315A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146314A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146317A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146313A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146299A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146304A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146301A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146306A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146298A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146302A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146305A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
AU2020289554A1 (en) * 2019-06-05 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof
DK3993623T3 (da) * 2019-07-01 2025-05-26 Zoetis Services Llc Transgene gnavere og fremgangsmåder til anvendelse deraf
DK3785536T4 (da) * 2019-08-28 2025-10-27 Trianni Inc Adam6-knockin-mus
JP2023535345A (ja) * 2020-07-13 2023-08-17 キソジ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド 重鎖抗体を発現するトランスジェニック動物
IL301137A (en) 2020-09-11 2023-05-01 Regeneron Pharma Identification and production of antigen-specific antibodies
DE112021004173T5 (de) 2020-10-02 2023-06-01 Nichia Corporation Lichtquellenvorrichtung und lichtleiterarrayeinheit
KR20230084157A (ko) * 2020-10-08 2023-06-12 주식회사 휴맵 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물 제조방법
KR20230147048A (ko) 2020-12-16 2023-10-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 Fc 알파 수용체를 발현하는 마우스
BR112023021256A2 (pt) 2021-04-20 2023-12-12 Regeneron Pharma Anticorpos humanos para artemina e métodos de uso dos mesmos
MA71452A (fr) 2022-07-12 2025-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticorps dirigés contre le récepteur du facteur neurotrophique ciliaire (cntfr) et leurs procédés d'utilisation
IL322397A (en) 2023-02-13 2025-09-01 Regeneron Pharma Treating muscle-related disorders with anti-human CACNG1 antibodies
KR20260007578A (ko) 2023-05-02 2026-01-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-인간 m-카드헤린(cdh15) 항체, 접합체, 및 유전자 페이로드를 근육 세포에 전달하기 위한 이들의 용도
WO2025014533A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human cacng1 antibody-drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000906A1 (en) 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) * 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE269401T1 (de) 1991-04-10 2004-07-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
RU2151612C1 (ru) 1992-12-01 2000-06-27 Протеин Дизайн Лэбс, Инк. Гуманизированный иммуноглобулин, специфичный для белка l-селектина человека
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
AU3507297A (en) 1996-06-26 1998-01-14 Baylor College Of Medicine Chromosomal rearrangement by insertion of two recombination substrates
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
CN1203922A (zh) 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
IL138579A0 (en) * 1998-03-30 2001-10-31 Res Dev Foundation Corticotropin releasing factor receptor 1-deficient mice
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
RU10506U1 (ru) 1999-04-08 1999-08-16 Кривулин Виталий Николаевич Ручной культиватор
EP1183344A4 (en) 1999-05-27 2003-06-25 Human Genome Sciences Inc ADAM POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
GB0031284D0 (en) 2000-12-21 2001-01-31 Ks Biomedix Ltd High affinity antibodies
US7034134B2 (en) 2001-04-26 2006-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29
EP1970448A1 (en) 2001-05-11 2008-09-17 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Human artificial chromosome containting human antibody lambda light chain and non-human animal containting the human artificial chromosome capable of genetic transmission
US7473557B2 (en) 2001-06-06 2009-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for targeting transcriptionally active loci
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20030108925A1 (en) 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
DK1461442T3 (en) 2001-11-30 2017-12-04 Amgen Fremont Inc Transgenic animals with human Ig lambda light chain genes
US20030217171A1 (en) 2002-05-17 2003-11-20 Von Stuermer Wolfgang R. Self-replicating and self-installing software apparatus
JP4099646B2 (ja) 2002-06-04 2008-06-11 株式会社安川電機 ボイスコイルモータ
EP1600459A3 (en) 2002-06-28 2005-12-07 Domantis Limited Ligand
CA2872136C (en) 2002-07-18 2017-06-20 Merus B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
GB0230201D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
GB2398784B (en) 2003-02-26 2005-07-27 Babraham Inst Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
MXPA06000562A (es) 2003-07-15 2006-03-30 Therapeutic Human Polyclonals Loci de inmunoglobulina humanizada.
CN1605628A (zh) 2003-09-03 2005-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Cho细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
DK1802193T3 (da) 2004-10-19 2014-06-10 Regeneron Pharma Fremgangsmåde til frembringelse af en homozygot mus til genetisk modifikation
DE602005011421D1 (de) 2005-06-30 2009-01-15 Borealis Tech Oy Überzug-Schicht für Energie- oder Kommunikationskabel
GB0618345D0 (en) 2006-09-18 2006-10-25 Univ Erasmus Binding molecules
CA2638117A1 (en) 2006-01-25 2007-08-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
GB0615327D0 (en) 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
MX2008014804A (es) 2006-06-02 2009-01-27 Regeneron Pharma Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano.
JP2010501165A (ja) 2006-08-22 2010-01-21 ジーツー インフラメイション プロプライエタリー リミテッド 抗体の作製方法
NZ576040A (en) 2006-10-02 2011-06-30 Regeneron Pharma High affinity human antibodies to human il-4 receptor
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
EP3255144A1 (en) 2007-08-10 2017-12-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Recombineering construct for preparing transgenic mice capable of producing human immunoglobulin
US7659842B2 (en) 2007-10-24 2010-02-09 Infineon Technologies Ag Quantization error reduction in PWM full-MASH converters
WO2009129247A2 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
AU2009248834B2 (en) 2008-05-23 2014-10-30 Ablexis Llc Method of generating single VL domain antibodies in transgenic animals
PL2346994T3 (pl) 2008-09-30 2022-04-19 Ablexis, Llc Myszy knock-in do wytwarzania chimerycznych przeciwciał
US20110314563A1 (en) 2008-12-18 2011-12-22 Kingdon Craig R Antibody production
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK2564695T3 (en) * 2009-07-08 2015-05-26 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
JP5909449B2 (ja) 2009-12-10 2016-04-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 重鎖抗体を作製するマウス
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
PL2505654T5 (pl) 2010-02-08 2020-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mysz ze wspólnym łańcuchem lekkim
EP3366125A1 (en) 2010-06-17 2018-08-29 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2011163314A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hybrid light chain mice
NZ707327A (en) 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
EP2638155A1 (en) 2010-11-08 2013-09-18 Kymab Limited Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination
LT2578688T (lt) 2011-02-25 2019-11-11 Regeneron Pharma Adam6 pelės
WO2013022782A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized universal light chain mice
EP2758534B1 (en) 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
AU2012311286B2 (en) 2011-09-19 2018-07-26 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
LT2627773T (lt) 2011-10-17 2017-12-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės iškirpta sunkioji imunoglobulino grandinė
GB2496375A (en) 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR102038974B1 (ko) 2011-12-20 2019-10-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 경쇄 마우스
HRP20192218T1 (hr) 2012-02-01 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi koji izražavaju teške lance koji sadrže vl domene
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140116135A (ko) 2014-10-01
KR20190124339A (ko) 2019-11-04
IL266268B (en) 2020-05-31
IL258561A (en) 2018-05-31
US12433266B2 (en) 2025-10-07
US20140017228A1 (en) 2014-01-16
SG11201403326VA (en) 2014-07-30
BR112014015238A2 (pt) 2020-12-29
BR112014015238B1 (pt) 2022-11-16
SI2793567T1 (sl) 2019-05-31
JP2022180594A (ja) 2022-12-06
IN2014DN06094A (tr) 2015-08-14
KR20180132938A (ko) 2018-12-12
RS58761B1 (sr) 2019-06-28
JP6728308B2 (ja) 2020-07-22
BR122021007339B1 (pt) 2022-11-29
RU2761639C2 (ru) 2021-12-13
MX2021000298A (es) 2022-06-08
SG10201913164YA (en) 2020-03-30
EP3527070B1 (en) 2025-12-03
MX378871B (es) 2025-03-10
CA2859408A1 (en) 2013-06-27
IL233153A0 (en) 2014-07-31
US20170332609A1 (en) 2017-11-23
JP2024113207A (ja) 2024-08-21
US9622459B2 (en) 2017-04-18
RU2018119366A (ru) 2018-11-09
CA2859408C (en) 2020-06-16
SMT202500496T1 (it) 2026-01-12
JP7507823B2 (ja) 2024-06-28
CN104159444B (zh) 2017-09-01
IL266268A (en) 2019-06-30
JP2015502177A (ja) 2015-01-22
US11617357B2 (en) 2023-04-04
SG10201605675WA (en) 2016-09-29
MY173936A (en) 2020-02-27
AU2022221449A1 (en) 2022-11-24
SMT201900296T1 (it) 2019-07-11
AU2020201596A1 (en) 2020-03-19
DK2793567T3 (en) 2019-04-15
US20200221675A1 (en) 2020-07-16
IL258561B (en) 2019-05-30
AU2017251797A1 (en) 2017-11-16
CY1121638T1 (el) 2020-07-31
RU2664181C2 (ru) 2018-08-15
NZ627211A (en) 2016-03-31
KR102038974B1 (ko) 2019-10-31
JP6327750B2 (ja) 2018-05-23
ME03477B (me) 2020-01-20
PT3527070T (pt) 2025-12-19
LT3527070T (lt) 2026-01-26
PL2793567T3 (pl) 2019-09-30
AU2020201596B2 (en) 2022-05-26
AU2012323987B2 (en) 2015-07-09
KR102081657B1 (ko) 2020-02-26
US11612151B2 (en) 2023-03-28
AU2015238803B2 (en) 2017-11-16
EP3527070A1 (en) 2019-08-21
US10561124B2 (en) 2020-02-18
US20130160153A1 (en) 2013-06-20
KR102156139B1 (ko) 2020-09-15
CN104159444A (zh) 2014-11-19
EP2793567A1 (en) 2014-10-29
AU2015238803A1 (en) 2015-10-29
HUE044266T2 (hu) 2019-10-28
WO2013096142A1 (en) 2013-06-27
EP2793567B1 (en) 2019-02-27
JP7152447B2 (ja) 2022-10-12
AU2025202709A1 (en) 2025-05-08
US20230337646A1 (en) 2023-10-26
FI3527070T3 (fi) 2026-01-12
AU2012323987A1 (en) 2013-07-04
HRP20190897T1 (hr) 2019-09-20
LT2793567T (lt) 2019-04-10
RU2014127339A (ru) 2016-02-10
HK1202772A1 (en) 2015-10-09
IL233153B (en) 2018-04-30
JP2019047806A (ja) 2019-03-28
KR101924805B1 (ko) 2018-12-04
RU2018119366A3 (tr) 2021-10-06
PT2793567T (pt) 2019-05-27
MX2014007682A (es) 2015-05-11
JP2020168014A (ja) 2020-10-15
KR20200108113A (ko) 2020-09-16
US20200221676A1 (en) 2020-07-16
US9706759B2 (en) 2017-07-18
KR102186822B1 (ko) 2020-12-04
MX356429B (es) 2018-05-29
ES2720186T3 (es) 2019-07-18
KR20200021552A (ko) 2020-02-28
AU2017251797B2 (en) 2019-12-05
JP2017046722A (ja) 2017-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7507823B2 (ja) ヒト化軽鎖マウス
CN103429746B (zh) Adam6小鼠
NZ627211B2 (en) Humanized light chain mice
HK40013048A (en) Humanized light chain mice
HK1202772B (en) Humanized light chain mice