TR201903009T4 - Musküler distrofi tedavisine yönelik ekson atlama bileşimleri. - Google Patents

Abstract

Ekson 53 atlamasını indüklemek üzere insan distrofin genindeki seçilmiş hedef bölgeye bağlanabilen antisens moleküller açıklanır.

Description

TARIFNAME Musküler distrofi tedavisine yönelik ekson atlama bilesimleri BULUSUN SAHASI Mevcut bulus, insan distrofin geninde ekson atlamasini kolaylastirmak için uygun yeni antisens bilesikler ve bilesimler ile ilgilidir. Ayni zamanda bulusun yöntemlerinde kullanilmak üzere adapte edilmis yeni antisens bilesimler kullanilarak ekson atlamasinin indüklenmesine yönelik yöntemleri saglar. BULUSUN ALT YAPISI Antisens teknolojileri, çesitli ekspresyonlarda gen ekspresyonunu etkilemek için bir dizi yapi kullanarak (transkripsiyon, birlestirme, stabilite, translasyon) gelistirilmektedir. Bu arastirmanin çogu, çok çesitli endikasyonlarda anormal veya hastalikla iliskili genleri düzeltmek veya kompanse etmek için antisens bilesiklerin kullanimina odaklanmistir. Antisens molekülleri, gen ekspresyonunu spesifiklikle inhibe edebilir ve bu nedenle, gen ekspresyonunun modülatörleri olarak oligonükleotidlerle ilgili birçok arastirma çalismasi, hedef genlerin ekspresyonunu veya cis-etkili elementlerin fonksiyonunu inhibe etmeye odaklanmistir. Antisens oligonükleotidleri, tipik olarak, bazi viral RNA hedefleri durumunda, sens iplikçik (örnegin, mRNA) veya eksi-iplikçik olan RNA'ya yöneliktir. Spesifik gen asagi yönde regülasyonunun arzu edilen bir etkisini elde etmek için, oligonükleotidler genellikle ya hedeflenen mRNA'nin bozunmasini arttirir, mRNA'nin translasyonunu bloke eder veya cis-etkili RNA elemanlarinin fonksiyonunu bloke eder, böylece hedef proteinin novo sentezini veya viral RNA'nin replikasyonunu etkili bir sekilde önler. Bununla birlikte, bu tür teknikler yararli degildir, burada amaç natif proteinin üretimini yukari dogru regüle etmek veya non-sens veya çerçeve-kaydirma mutasyonlari gibi erken translasyonlarin sonlandirilmasini saglayan mutasyonlari kompanse etmek içindir. Bu durumlarda, defektif gen transkripti, hedeflenen bozunmaya veya sterik inhibisyona maruz birakilmamalidir, bu nedenle antisens oligonükleotid kimyasi, hedef mRNA bozulmasini veya blok translasyonu desteklememelidir. Çesitli genetik hastaliklarda, mutasyonlarin bir genin nihai ekspresyonu üzerindeki etkileri, birlestirme prosesi sirasinda hedeflenen bir ekson atlama prosesi yoluyla modüle edilebilir. Birlestirme prosesi, pre-mRNA'daki bitisik ekson-intron baglantilarini yakin mesafeye getiren ve birbirine birlestirilmesi gereken eksonlar arasindaki reformasyonlari ile intronlarin ucundaki fosfodiester baglarinin ayrilmasini saglayan karmasik çok bilesenli makineler tarafindan yönlendirilir. Bu kompleks ve son derece hassas prosese, mRNA'da bulunan ve daha sonra birlestirme reaksiyonlarinda yer alan çesitli nükleer birlestirme faktörlerinin baglandigi, nispeten kisa yari-korunmus RNA segmentleri olan dizi motifleri aracilik eder. Birlestirme makinesinin, mRNA proseslerinden önceki motifleri okuma veya tanima seklini degistirerek, diferansiyel olarak birlestirilmis mRNA molekülleri olusturmak mümkündür. Ilgili mekanizmalar tanimlanmamasina ragmen, insan genlerinin çogunlugunun normal gen ekspresyonu sirasinda alternatif olarak birlestirildigi artik bilinmektedir. Bennett vd. (U.S. Patent No. 6,210,892), hedef RNA'nin RNase H-aracili klevajini indüklemeyen antisens oligonükleotid analoglari kullanilarak dogal sus hücresel mRNA"nin antisens modülasyonunu açiklar. Bu, membrani kapsayan domenleri kodlayan eksonlardan yoksun olan çözünür TNF süper aile reseptörlerinin olusturulmasi amaciyla spesifik eksonlardan (örnegin (Sazani, Kole, et al. 2007 tarafindan açiklandigi üzere) yoksun olan alternatif olarak birlestirilmis mRNA'Iarin üretiminde kullanilir. Normalde fonksiyonel bir proteinin, buradaki mutasyonlar nedeniyle erken sonlandirildigi durumlarda, bir kisim fonksiyonel protein üretiminin antisens teknolojisi yoluyla geri kazanilmasi için bir araç, birlestirme prosesleri sirasinda müdahale yoluyla gösterimistir ve hastaliklarla iliskili eksonlar varsa mümkün olabilecegi gösterilmistir ve hastaliga neden olan mutasyonlarla iliskili eksonlar bazi genlerden spesifik olarak silinebiliyorsa, bazen natif proteinin benzer biyolojik özelliklerine sahip olan veya ekson ile iliskili mutasyonlarin neden oldugu hastaligi iyilestirmek için yeterli biyolojik aktiviteye sahip olan bir kisaltilmis protein ürünü üretilebilir. (örnegin bakiniz Sierakowska, Sambade et al. 1996; Wilton, Lloyd ve et al., 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout ve et al., 2001; Lu, Mann ve et al., 2003; Aartsma-Rus, Janson ve et al., hedeflenen mRNA'nin bozunmasini azaltmayan modifiye edilmis antisens oligonükleotid analoglari kullanilarak anormal birlesme ile mücadele yöntemlerini açiklar. Bennett et al., (US Patenti No. 6,210,892), hedef RNA'nin RNAse H-aracili ayrilmasini indüklemeyen antisens oligonükleotid analoglarini kullanarak dogal sus hücresel mRNA prosesinin antisens modülasyonunu tarif eder. Hedeflenen ekson atlama prosesinin uzun genlerde özellikle yararli olmasi muhtemeldir, burada birçok ekson ve intron bulunur, burada eksonlarin genetik yapisinda fazlalik vardir veya bir protein bir veya daha fazla özel ekson olmadan islev görebilir. Çesitli genlerdeki mutasyonlarin neden oldugu tepe kesmelerine bagli genetik hastaliklarin tedavisi için gen prosesini yönlendirmeye yönelik çabalar antisens oligonükleotidlerin kullanimina odaklanmistir, burada oligonükleotidler (1) birlestirme prosesinde yer alan elemanlarla tamamen veya kismen örtüsür; veya (2) normal olarak bu elementte meydana gelen belirli bir birlestirme reaksiyonuna aracilik edecek olan birlestirme faktörlerinin baglanmasini ve fonksiyonunu bozmak için elemente yeterince yakin bir konumda pre-mRNA'ya baglanir. Duchenne musküler distrofisine (DMD), protein distrofin ekspresyonundaki bir defekt neden olur. Proteini kodlayan gen, 2 milyondan fazla DNA nükleotidine yayilmis 79 ekson içerir. Eksonun okuma çerçevesini degistiren veya bir durdurma kodonu dahil eden veya bir eksonun bütün bir çerçeve eksonu veya eksonlarindan veya bir veya daha fazla eksonun kopyalarinin çikarilmasiyla karakterize edilen herhangi bir eksonik mutasyon, DMD ile sonuçlanan islevsel distrofin üretimini bozma potansiyeline sahiptir. Daha az siddetli bir muskuler distrofisi olan Becker muskuler distrofisinin (BMD) ortaya çiktigi bulunmustur. burada tipik olarak bir veya daha fazla eksonun delesyonu bir mutasyonun, tüm distrofin transkripti boyunca dogru bir okuma çerçevesi ile sonuçlandir, söyle ki mRNA'nin protein içine translasyonun erken sonlanmaz. Mutasyona ugramis bir distrofin pre-mRNA'nin islenmesinde yukari ve asagi yönde eksonlarin birlestirilmesi durumunda gen dogru okuma çerçevesini koruyorsa, sonuç bir Becker fenotipi ile sonuçlanan bir aktiviteyi tutan kisa bir dahili delesyon prosesine sahip bir proteini kodlayan bir mRNA'dir. Uzun yillardan beri distrofin proteininin okuma çerçevesini degistirmeyen bir ekson veya eksonlarin delesyonlarinin, bir BMD fenotipine yol açarken, bir çerçeve- kaymasina neden olan bir ekson delesyonunun DMD'ye yol açacagi bilinmektedir (Monaco, Bertelson et al., 1988). Genel olarak, nokta mutasyonlari ve okuma çerçevesini degistiren ve böylece uygun protein translasyonunu kesen ekson delesyonlari içeren distrofin mutasyonlari, DMD ile sonuçlanir. Ayrica bazi BMD ve DMD hastalarinin çoklu eksonlari kapsayan ekson delesyonlari oldugu da belirtilmelidir. Antisens oligonükleotidler ile mutant distrofin pre-mRNA birlestirme isleminin modülasyonu, in vitro ve in vi'vo olarak rapor edilmistir (bakiniz örnegin, Matsuo, Masumura et al. 1991; Takeshima, Nishio et al. 1995; Pramono, Takeshima et al. Mdx fare modelinde atlanan spesifik ve yeniden üretilebilir eksonun birinci örnegi Wilton ve et al. tarafindan rapor edilmistir (Wilton, Lloyd ve et al., 1999). Bir antisens molekülü donör birlestirme bölgesine yönlendirerek, kültürlenen hücrelerin tedavisinden 6 saat sonra distrofin mRNA'sinda uygun ve etkili ekson 23 atlama indüklendi. Wilton et al. ayrica, fare distrofin pre-mRNA'nin akseptör bölgesini daha uzun antisens oligonükleotidlerle hedeflemeyi de tarif eder. Intron 23 donör birlestirme bölgesine yönlendirilen birinci antisens oligonükleotidi, primer kültürlenmis miyoblastlarda uygun ekson atlamasini uyarsa da, bu bilesigin daha yüksek distrofin seviyelerini ekprese eden immortalize hücre kültürlerinde çok daha az etkili oldugu bulundu. Ancak gelismis hedefleme ve antisens oligonükleotid tasarimi ile spesifik ekson çikarma isleminin etkinligi, neredeyse bir büyüklük sirasi kadar arttirildi (Mann, Honeyman et al. 2002). Yapilan son çalismalar, distrofin yoklugundan etkilenen dokularda minimal advers etkilerin eslik ettigi sürekli distrofin ekspresyonunun saglanmasindaki zorlugu ele almaya baslamistir. Ekson 51'e (PR0051) hedeflenen antisens oligonükleotidinin, DMD'Ii dört hastada tibialis anterior kasina intramüsküler enjeksiyonu, klinik olarak görünür herhangi bir advers etki olmadan ekson 51'in spesifik atlanmasi ile sonuçlanmistir (Mann, Honeyman et al. 2002; van Deutekom, Janson et al. 2007). mdx farelerde ekson konjuge edilmis antisens fosforodiamidat morfolino oligomerinin sistemin uygulamasini inceleyen çalismalar, saptanabilir toksisite olmadan iskelet ve kalp kaslarinda yüksek ve sürekli distrofin protein üretimi saglamistir (Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008; Yin, Moulton et al. 2008). DMD tedavisine yönelik olarak birlestirmeyi degistiren oligonükleotidlerin (SSO'Iar) güvenligini ve etkinligini test eden son klinik çalismalar, splisisozomun sterik blokaji ile pre-mRNA'Iarin alternatif birlesmesini indüklemek üzere 880 teknolojine dayalidir 2007). Bu basarilara ragmen distrofin eksonlarinin çogaltilmasi için hedeflenen gelismis antisens oligomerlere ve terapötik DMD uygulamalarina yönelik gelismis uygulama bilesimlerine ve yöntemlerine gereksinim vardir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, asagidaki yapiya sahip bir antisens oligonükleotidini veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu saglar: burada ^ :fosfor merkezin stereokimyasi tanimlanmamistir. Mevcut bulus ayni zamanda, mevcut bulusa göre antisens oligonükleotidi ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içeren farmasötik bir bilesimi saglar. Mevcut bulus ayni zamanda, Duchenne musküler distrofisi tedavisinde kullanilmaya yönelik mevcut bulusa göre farmasötik bir bilesimi saglar. Antisens oligomer, bir polietilen glikol molekülüne kimyasal olarak baglanir. Bulus, bir antisens oligomeri saglar, burada oligomer asagidaki yapiya sahiptir: H53A(+36+60). Burada, asagidaki yapilara sahip diger antisens oligomerleri açiklanir: Aiiihii "fm âqiiifinymß Ammiiirllî ûiimia u-.in H53A(+30+57), H53A(+30+55). Bir yöne göre bulus, ekson atlamasini indüklemek üzere insan distrofin pre- mRNA'sinda seçilmis bir hedefe baglanabilen bir antisens molekülü saglar. Mevcut tarifname, asagida tanimlanan, ekson 53'e hedeflenmis antisens dizileri içerir. H53A(+ Antisens oligomeri spesifik olarak tavlama bölgesine H53A(+36+60) hibritlenir ve SEO Mevcut bulusa göre antisens oligonükleotidi, bir polietilen glikol bölümüne kimyasal olarak baglanir. Bir baska yönde bulus, mevcut bulusa göre antisens oligonükleotidleri ve fosfat tamponu içeren bir salin solüsyonunu içeren farmasötik bilesimleri saglar. Bir baska yönde bulus, burada tanimlandigi üzere belirli bir proteini kodlayan bir gende mutasyonun oldugu ve mutasyon etkisinin, ekson atlamasi ile kaldirildigi genetik bir hastaliktan sikayet eden bir hastanin tedavisinde kullanilmaya yönelik antisens molekülü saglar. Tedavi: (a) burada açiklanan yöntemlere göre bir antisens molekülünün seçilmesi ve (b) bu molekülün bu tür bir tedaviye ihtiyaci olan hastaya Baska bir yönde bulus, Duchenne musküler distrofisi tedavisinde kullanilmaya yönelik mevcut bulusa göre farmasötik bir bilesimi saglar. Bu ve diger amaçlar ve özellikler, asagidaki detayli açiklama sekiller ile birlikte okundugunda daha iyi anlasilacaktir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1A, fosforodiamidat bagi olan örnek niteligindeki bir morfolino oligomeri yapisini gösterir. Sekil 18, arjininden zengin bir peptit ve antisens oligomerinin konjugatini gösterir. Sekil 1C, Sekil 1'deki gibi bir konjugati (bulusa göre degildir) gösterir, burada omurga baglari, bir veya birkaç pozitif yüklü grubu içerir. Sekiller 1D-G, D ila G olarak gösterilen, örnek niteligindeki morfolino oligonükelotidlerinin tekrarlayan alt birim segmentini gösterir. Sekiller 2A-2B, kati faz sentezine yönelik bir baglayici ve oligomer sentezine yönelik kati bir destegin hazirlanisina yönelik reaksiyon semasini gösterir. Sekil 3, kültürlenmis primer miyoblastlarda ekson 53 atlamasinin indüklenmesine yönelik örnek niteligindeki antisens oligomerlerinin nispi aktivitelerini gösteren bir grafigi gösterir. Belirtilen oligomerler ile muamele edilen primer miyoblastlardan izole edilen RNA, ekson 53'e spesifik yuvalanmis RT-PCR amplifikasyonuna tabi tutulmustur, akabinde jel elektroforezi ve bant siddeti ölçümü yapilmistir. Veriler, PCR ile degerlendirilen ekson atlama %'si, yani tam uzunluktaki PCR ürününe göre eksonu atlanmis ürünün bant siddeti olarak grafiklenir. Sekil 4, kültürlenmis insan rabdomiyosarkom hücrelerinde ekson 53 atlamasinin indüklenmesine yönelik örnek niteligindeki antisens oligomerlerinin nispi aktivitelerini gösteren bir grafigi gösterir. Belirtilen oligomerler ile muamele edilmis rabdomiyosarkom hücrelerinden izole edilen RNA, ekson 53'e spesifik yuvalanmis RT-PCR amplifikasyonuna tabi tutulmustur, akabinde jel elektroforezi ve bant siddeti ölçümü yapilmistir. Veriler, PCR ile degerlendirilen ekson atlama %'si, yani tam uzunluktaki PCR ürününe göre eksonu atlanmis ürünün bant siddeti olarak grafiklenir. Sekil 5A-B, kültürlenmis primer miyoblastlarda ekson 53 atlamasinin indüklenmesine yönelik örnek niteligindeki antisens oligomerlerinin nispi aktivitelerini gösteren grafikleri gösterir. Belirtilen oligomerler ile muamele edilen primer miyoblastlardan izole edilen RNA, ekson 53'e spesifik yuvalanmis RT- PCR amplifikasyonuna tabi tutulmustur, akabinde jel elektroforezi ve bant siddeti ölçümü yapilmistir. Veriler, PCR ile degerlendirilen ekson atlama %'si, yani tam uzunluktaki PCR ürününe göre eksonu atlanmis ürünün bant siddeti olarak grafiklenir. BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut bulusun uygulamalari, genel olarak, gelistirilmis antisens bilesikleri ve bunlarin, özellikle Insan distrofin geninde ekson atlamasini indüklemek Için tasarlanan kullanim yöntemleri ile ilgilidir. Distrofin kas fonksiyonunda hayati bir rol oynar ve kasla ilgili çesitli hastaliklar bu genin mutasyona ugramis formlari ile karakterize edilir. Bu nedenle, burada tarif edilen gelistirilmis antisens bilesikleri, Duchenne muskuler distrofisinde (DMD) ve Becker muskuler distrofisinde (BMD) bulunan mutasyona ugramis distrofin genleri gibi insan distrofin geninin mutasyona ugramis formlarinda ekson atlamasini indükler. Mutasyonlarin neden oldugu anormal mRNA birlestirme olaylari nedeniyle, bu mutasyona ugramis insan distrofin genleri, ya defektif distrofin proteinini eksprese eder veya çesitli muskuler distrofisi formlarina yol açan bir kosul olarak ölçülebilir hiçbir distrofini eksprese etmez. Bu durumu gidermek için, mevcut bulusun antisens bilesikleri mutasyona ugramis bir insan distrofin geninin önceden islenmis bir RNA'sinin seçilen bölgelerine hibritlesir, aksi takdirde anormal sekilde birlesmis distrofin mRNA'sinda ekson atlama ve diferansiyel birlestirmeye neden olur ve böylece kas hücrelerinin fonksiyonel bir distrofin proteinini kodlayan bir mRNA transkripti üretmesine olanak saglar. Bazi uygulamalarda ortaya çikan distrofin proteini, zorunlu olarak "dogal sus" bir distrofin formu degil, kesilmis, ancak islevsel veya yari fonksiyonel bir distrofin formudur. Kas hücrelerinde fonksiyonel distrofin proteini seviyelerinin arttirilmasiyla, bu ve iliskili uygulamalar, muskuler distrofisinin profilaksisinde ve tedavisinde, özellikle anormal mRNA birlestirilmesi nedeniyle defektif distrofin proteinlerinin ekspresyonu ile karakterize edilen DMD ve BMD gibi muskuler distrofisinin formlarinda yararlidir. Burada tarif edilen spesifik oligomerler ayrica, kullanimdaki diger oligomerlere göre gelistirilmis, distrofin-ekson-spesifik hedefleme saglar ve böylece ilgili muskiler distrofi formlarini tedavi etmenin alternatif yöntemlerine kiyasla önemli ve pratik avantajlar Burada açiklanan antisens oligomer, asagida verilen SEQ ID NO: 1'deki dizi listesine sahiptir: H53A(+ Aksi belirtilmedigi sürece, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, bulusun ait oldugu teknikte siradan uzmanliga sahip kisilerce genel olarak anlasilanlarla ayni anlama sahiptir. Burada tarif edilenlere benzer veya esdeger herhangi bir yöntem ve materyal, mevcut bulusun uygulamasinda veya testinde kullanilabilse de, tercih edilen yöntemler ve materyaller tarif edilir. Mevcut bulusun amaçlarina göre, asagidaki terimler asagida tanimlanmaktadir. seviye, deger, sayi, frekans, yüzde, boyut, boyut, miktar, agirlik veya uzunluk kadar degisen miktar, seviye, deger, sayi, frekans, yüzde, boyut, boyut, miktar, agirlik veya uzunluk anlamina gelir. polinükleotidleri (diger bir deyisle bir nükleotid dizisini) ifade eder. Örnegin, "T-G-A (5'- 3')" dizisi, "T-C-A (5'-3')" dizisine tamamlayicidir. Tamamlayicilik, bazi nükleik asitlerin bazlarinin baz eslestirme kurallarina göre eslestirildigi "kismi" olabilir. Veya nükleik asitler arasinda "tam" veya "toplam" tamamlayicilik olabilir. Nükleik asit iplikçikleri arasindaki tamamlayicilik derecesinin, nükleik asit Iplikçikleri arasindaki hibridizasyonun etkinligi ve gücü üzerinde önemli etkileri vardir. Mükemmel bir tamamlayicilik siklikla istense de, bazi uygulamalar, hedef RNA'ya göre bir veya daha fazla fakat tercihen 6, 5, 4, 3, 2 veya 1 yanlis eslesme içerebilir. Oligomer içindeki herhangi bir yerde varyasyonlar dahil edilmistir. Bazi uygulamalarda, bir oligomerin terminusuna yakin dizideki varyasyonlar genellikle iç kisimdaki varyasyonlara tercih edilir ve eger mevcutsa tipik olarak 5' ve/veya 3' terminuslarinin yaklasik 6, 5, 4, 3, 2 veya 1 nükleotidleri Içinde bulunur. transport peptitleri, tasiyici peptitler veya peptit transdüksiyon domainleri olarak da adlandirilan katyonik hücreye nüfuz eden peptitleri ifade eder. Burada gösterildigi gibi, peptitler, belirli bir hücre kültürü popülasyonunun hücrelerinin %100'ü dahilinde hücre penetrasyonunu indükleme kabiliyetine sahiptir ve sistemik uygulama üzerine in vivo olarak çoklu dokularda makromoleküler translokasyona izin verir. Tercih edilen bir CPP düzenlemesi, asagida ayrica açiklanan arjininden zengin bir peptittir. birbirlerinin yerine kullanilir ve her biri, hedef dizi içinde bir nükleik asitzoligomer heterodupleks olusturmak için baz eslestirme molekül bölümlerinin, bir nükleik asitte (tipik olarak bir RNA), Watson-Crick baz eslemesi ile bir hedef diziye hibritlenmesini saglayan, arabirimlerarasi baglantilarla baglanmis bir baz eslestirme molekül bölümü içerir. Siklik alt birimler, riboz veya baska bir pentoz sekeri veya tercih edilen bir uygulamada, bir morfolino grubuna dayanir (asagidaki morfolino oligomerlerinin tarifine bakiniz). Oligomer, hedef dizi ile tam veya tama yakin dizi tamamlayciligina sahip olabilir; bir oligomerin terminalleri yanindaki dizide bulunan varyasyonlar genel olarak iç kisimdaki varyasyonlara tercih edilir. Bu gibi bir antisens oligomeri, mRNA'nin translasyonunu bloke etmek veya inhibe etmek veya natif mRNA öncesi natif birlesme prosesini inhibe etmek için tasarlanabilir ve hibritlendigi bir hedef diziye "yönelik" veya "hedeflenmis" oldugu söylenebilir. Hedef dizi tipik olarak, Translasyon Baskilayici Oligomer olan bir mRNA'nin AUG baslangiç kodonunu veya Birlestirme Baskilayici Oligomer (880) olan önceden islenmis bir mRNA'nin birlestirme bölgesini içeren bir bölge içerir. Hedef dizi bir ekson içinde veya bir intron içinde olabilir. Bir birlestirme bölgesi için hedef dizi, önceden islenmis bir mRNA'da normal bir birlestirme akseptör birlesim yerinin asagisinda 5' ucu 1 ila yaklasik 25 baz çifti içeren bir mRNA dizisi içerebilir. Tercih edilen bir hedef dizi, bir birlestirme yeri içeren veya tamamen bir ekson kodlama dizisi içinde bulunan veya bir birlestirme akseptör veya donör yerini kaplayan önceden islenmis bir mRNA'nin herhangi bir bölgesidir. Bir oligomerin, hedefin nükleik asidine karsi yukarida tarif edildigi sekilde hedeflendiginde protein, virüs veya bakteri gibi biyolojik olarak ilgili bir hedefe "karsi hedeflendigi" söylenir. Oligomer) terimleri, morfolino alt birim yapilarindan olusan bir oligonükleotid analogunu ifade eder, burada (i) yapilar, bir alt birimin morfolino nitrojenini bir bitisik alt ünitenin 5` ekosiklik karbonuna birlestiren, bir ila üç atom uzunlugunda, tercihen iki atom uzunlugunda ve tercihen yüksüz veya katyonik olan, fosfor içeren baglarla birbirine baglanir ve (ii) her bir morfolino halkasi, bir bazik hidrojen bagiyla bir polinükleotid içindeki bir baza baglanmak için etkili bir pürin veya pirimidin baz eslestirme molekül bölümü tasir. Örnegin Sekil 1A'daki yapiya, tercih edilen bir fosforodiamidat baglanti tipini gösteren yapiya bakiniz. Bu bagda, baglanma veya aktiviteye müdahale etmedigi sürece degisiklikler yapilabilir. Örnegin, fosfora bagli oksijen, sülfür (tiyofosforodiamidat) ile sübstitüe edilebilir. 5' oksijen, amino veya düsük alkil ile sübstitüe edilmis amino ile sübstitüe edilebilir. Fosfora baglanan pendant nitrojen sübstitüe edilmemis, monosübstitüe edilmis veya (istege bagli olarak sübstitüe edilmis) düsük alkil ile sübstitüe edilmis olabilir. Ayrica asagidaki katyonik baglantilarin tartismasina bakiniz. "Morfolino halka yapisi" terimi, "morfolino alt birimi" teriminin yerine kullanilabilir. Fosfora baglanan pendant nitrojen metil ile disübstitüe edilmistir. Pürin veya pirimidin bazini eslestirme kismi adenin, sitozin, guanin veya timindir. Morfolino oligomerlerinin sentezi, yapilari ve baglanma özellikleri, U.S. Patent No. Bir "amino asit alt birimi" veya "amino asit kalintisi", oi-amino kalintisi residue (-CO- CHR-NH-) veya ß- veya diger bir amino asit kalintisina (örnegin, CO-(CH2)nCHR-NH-) refere eder, burada R, yan zincirdir (hidrojen içerebilen) ve n, 1 ila 6, tercihen 1 ila 4'tür. aside refere eder. "Dogal olmayan amino asitler" terimi, dogada bulunan proteinlerde bulunmayan amino asitlere refere eder, örnekleri beta-alanin (ß-Ala), 6- aminohekzanoik asit (Ahx) ve 6-aminopentan0ik asidi içerir. Bir "ekson", bir proteini kodlayan nükleik asidin tanimlanmis bir bölümünü veya önceden islenmis (veya prekürsör) bir RNA`nin her iki bölümününün birlestirilerek çikarilmasindan sonra bir RNA molekülünün matür formunda temsil edilen bir nükleik asit dizisi anlamina gelir. Matür RNA molekülü bir haberci RNA (mRNA) veya rRNA veya tRNA gibi kodlayici olmayan bir RNA'nin fonksiyonel bir formu olabilir. Insan distrofin geninde yaklasik 79 ekson vardir. Bir "intron", bir proteine çevrilmemis olan bir nükleik asit bölgesini (bir gen içinde) ifade eder. Bir intron, bir prekürsör mRNA'ya (pre-mRNA) kopyalanan ve daha sonra olgun RNA olusumu sirasinda birlestirilerek çikartilan kodlama yapmayan bir bölümdür. bir parçasi olarak memeli denege uygulanan antisens oligomeri gibi terapötik bir bilesigin, istenen terapötik etkiyi olusturmada etkili olan bir miktarina refere eder. Bir antisens oligomeri için bu etki tipik olarak, seçilen hedef dizinin translasyonunun veya dogal birlesme prosesinin inhibe edilmesi yoluyla gerçeklestirilir. islenmis bir RNA'dan çikarildigi ve bu nedenle, matür RNA'da bulunmasi durumunun hariç tutuldugu prosese karsilik gelir, söyle ki matür mRNA bir proteine çevrilir. Bu nedenle, atlanan ekson tarafindan baska bir sekilde kodlanan proteinin bölümü, proteinin eksprese edilmis formunda mevcut degildir, tipik olarak proteinin degismis ancak islevsel bir formu olusturur. Bazi uygulamalarda atlanan ekson, insan distrofin geninden, aksi halde anormal birlestirmeye neden olan dizide bir mutasyon veya baska bir degisiklik içerebilen bir anormal eksondur. Belirli uygulamalarda atlanan ekson, distrofin geninin 1-79 eksonlarindan herhangi biri veya daha fazlasidir, ancak insan distrofin geninin ekson 53`ü tercih edilir. hücre disi matrise hücre zari boyunca baglayan protein kompleksinin hayati bir parçasidir. Distrofin çoklu fonksiyonel domainler içerir. Örnegin, distrofin, yaklasik bir merkezi çubuk domaini içerir. Bu büyük merkezi domain, alfa-aktin ve spektrin ile homolojiye sahip yaklasik 109 amino asidin, 24 spektrin-benzeri üçlü-heliksel eleman tarafindan olusturulur. Tekrarlar tipik olarak mentese bölgeleri olarak da adlandirilan dört prolin bakimindan zengin tekrarlanmayan bölüm ile ayrilir. 15 ve 16 nolu tekrarlar, distrofinin proteolitik bölünmesi için majör bir bölge sagladigi görünen 18 amino asitlik bir gerilme ile ayrilmistir. Çogu tekrar arasindaki dizi özdesligi %10-25 arasinda degismektedir. Bir tekrar, üç alfa-heliks içerir: 1, 2 ve 3. Alfa heliksleri 1 ve 3, her biri, bir hidrofobik ara yüz boyunca kivrimli spiral olarak etkilesime giren 7 heliks dönüsle olusturulur. Alfa-heliks 2 daha karmasik bir yapiya sahiptir ve bir Glisin veya Prolin kalintisi ile ayrilmis dört ve üç heliks dönüslü segmentlerden olusur. Her bir tekrar, tipik olarak alfa-heliks 2'nin birinci bölümünde amino asitler 47 ve 48 arasindaki bir intron tarafindan kesilen iki ekson tarafindan kodlanir. Diger intron, tekrar heliks-3'ün üzerine dagilmis, tekrardaki farkli konumlarda bulunur. Distrofin ayrica, civik mantar (Dictyostelium discoideum) alfa aktininin C-terminal domainine homoloji gösteren bir sistein bakimindan zengin segment (diger bir deyisle, 280 amino asitte 15 Sistein) dahil olmak üzere, yaklasik 3080-3360 amino asitinde sistein bakimindan zengin bir alan içerir. Karboksi terminal domaini yaklasik 3361-3685 amino asitlerindedir. Distrofin amino terminusu F-aktin'e baglanir ve karboksi terminus sarkomdaki distrofinle iliskili protein kompleksine (DAPC) baglanir. DAPC, distroglikanlar, sarkoglikanlar, integrinler ve kaveolini içerir ve bu bilesenlerin herhangi birindeki mutasyonlar otozomal kalitsal muskuler distrofisine neden olur. DAPC, distrofin mevcut olmadiginda kararsiz hale gelir, bu da üye proteinlerin seviyelerinin azalmasina neden olur ve sirayla ilerleyici Iif hasari ve membran sizintisina yol açar. Duchenne'in muskuler distrofisi (DMD) ve Becker'in muskuler distrofisi (BMD) gibi çesitli muskuler distrofisi biçimlerinde, kas hücreleri, esasen gen dizisindeki mutasyonlar nedeniyle hiç degismemis ve fonksiyonel olarak defektif bir distrofin formu üretir veya hiç distrofin üretmezler, bu da yanlis birlestirmeye yol açar. Defektif distrofin proteininin baskin eskpresyonu veya tamamen distrofin veya bir distrofin benzeri proteinin eksikligi, yukarida belirtildigi gibi kas dejenerasyonunun hizli ilerlemesine yol açar. Bu baglamda, bir "defektif" distrofin proteini, teknikte bilindigi gibi DMD veya BMD'II bazi deneklerde üretilen veya farkli tespit edilebilir distrofin yoklugu ile üretilen distrofin formlari ile karakterize edilebilir. Bu tarifnamede kullanildigi haliyle, "fonksiyon" ve "islevsel" ve benzerleri terimleri, biyolojik, enzimatik veya terapötik bir islevi ifade etmektedir. distrofin proteininin degistirilmis veya "defektif" formuyla karsilastirildiginda, muskuler distrofisinin karakteristik özelligi olan kas dokusunun ilerleyici bozunmasini azaltmak için yeterli biyolojik aktiviteye sahip bir distrofin proteini anlamina gelir. DMD veya BMD ile bazi konularda mevcuttur. Bazi uygulamalarda fonksiyonel bir distrofin proteini, teknikte rutin tekniklere göre ölçülen dogal sus distrofinin in vitro veya in vivo biyolojik kültürlerinde distrofine bagli aktivite, miyotüp büyüklügüne, miyofibril düzenine (veya düzensizlesmesine), kasilma aktivitesine ve asetilkolin reseptörlerinin spontan kümelenmesine (bakiniz örnegin, Brown ve et al., Journal of Cell Journal Science patogenezini Incelemek için degerli kaynaklardir ve distrofine bagli aktiviteyi test etmek için bir araç saglar. DMD arastirmasi için en yaygin kullanilan hayvan modellerinden ikisi, her ikisi de distrofin negatif olan mdx fare ve golden retriever muskuler distrofisi (GRMD) köpegidir (bakiniz örnegin, Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003). Bu ve diger hayvan modelleri, çesitli distrofin proteinlerinin fonksiyonel aktivitesini ölçmek için kullanilabilir. Mevcut bulusun ekson atlayan antisens bilesiklerinin bazilarinin ürettigi formlar gibi tepesi kesilmis distrofin formlari dahildir. ölçüde veya esasen serbest olan malzeme kastedilmektedir. Örnegin, burada kullanildigi sekliyle "izole edilmis bir polinükleotid", natif olarak olusan bir durumda, örnegin, normal olarak fragmana bitisik dizilerden çikarilmis bir DNA fragmanindan, dogal olarak olusan bir durumda onu çevreleyen dizilerden aritilmis veya uzaklastirilmis olan bir polinükleotid anlamina gelebilir. Burada kullanildigi üzere "yeterli uzunluk", hedef bir distrofin pre-mRNA"sinda en az 8, daha tipik olarak 8-30 bitisik nükleobaza tamamlayici olan bir antisens denekte antisens bilesigi veya bir kontrol bilesiginin neden olmadigi yanitla karsilastirildiginda daha büyük bir fizyolojik yanit üretme veya buna neden olma kabiliyetini ifade eder (diger bir deyisle, asagi yönde etkiler). Ölçülebilir bir fizyolojik yanit, bir distrofin proteininin islevsel bir formunun ekspresyonunun arttirilmasini veya kas dokusunda artmis distrofin ile ilgili biyolojik aktivitenin, teknikte anlayis ve buradaki tarifnameden açikça anlasilan diger yanitlarini içerebilir. Artmis kas islevi, kas islevinde ölçülebilir. Fonksiyonel bir distrofin eksprese eden kas Iiflerinin yüzdesi, yaklasik %1, distrofin ekspresyonu dahil olmak üzere ölçülebilir. Örnegin, liflerin %25-30'unun distrofeni eksprese etmesi durumunda kas fonksiyon iyilesmesinin yaklasik %40 olabilecegi gösterilmistir (bakiniz örnegin, DeIIoRusso ve et al., Proc Natl Acad Sci tüm tamsayilar ve ondalik noktalar dahil), örnegin, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8, vb.) bir artisi içerebilir. antisens bilesiginin, burada tarif edildigi gibi teshis alanindaki rutin tekniklerle ölçülen bir hastalik veya durum semptomu gibi ilgili bir fizyolojik veya hücresel yaniti teknikte uzman kisilerce açikça görülecektir ve muskuler distrofisinin semptomlarinda veya patolojisinde veya degistirilmis DMD veya BMD'II bireylerde eksprese edilen distrofin formlari gibi defektif distrofin formlarinin ekspresyonunda azalma içerebilir. Bir yanitta "azalma", antisens bilesigi veya bir kontrol bilesimi tarafindan üretilen yanit ile karsilastirildiginda istatistiksel olarak anlamli olabilir ve aradaki tüm tamsayilar dahil Bir bireyin (örnegin, bir insan gibi bir memelinin) veya bir hücrenin "tedavisi", bireyin veya hücrenin dogal seyrini degistirme denemesinde kullanilan herhangi bir müdahale tipidir. Tedavi bir farmasötik bilesimin uygulanmasini içerir ancak bununla sinirli degildir ve bir patolojik olayin baslatilmasindan veya bir etiyolojik ajan ile temasin ardindan profilaktik olarak veya takiben yapilabilir. Tedavi, distrofinle iliskili bir hastalik veya durumun semptomlari veya patolojisi üzerinde arzu edilen herhangi bir etkiyi içerir. Bazi muskuler distrofisi formlarinda oldugu gibi protein; örnegin, tedavi edilen hastaligin veya rahatsizligin bir veya daha fazla ölçülebilir marköründe minimal degisiklikler veya iyilestirmeler içerebilir. Ayni zamanda, tedavi edilen hastaligin veya rahatsizligin ilerleme hizini azaltmaya, bu hastaligin veya durumun baslangicini geciktirmeye veya baslangicinin siddetini azaltmaya yöneltilebilecek "profilaktik" tedaviler de dahildir. "Tedavi" veya "profilaksi", mutlaka hastaligin veya durumun tamamen ortadan kaldirilmasini, iyilestirilmesini veya önlenmesini veya bunlarla iliskili semptomlari göstermez. Burada kullanildigi haliyle bir "denek", bir antisens bilesigi ile tedavi edilebilir bir DMD veya BMD semptomu sergileyen veya bu sartlarla iliskili semptomlarin herhangi biri ile ilgili bir semptom (örnegin, kas lifi kaybi) sergileme riski tasiyan herhangi bir hayvani içerir. Uygun denekler (hastalar), laboratuar hayvanlarini (fare, siçan, tavsan veya gine domuzu gibi), çiftlik hayvanlarini ve evcil hayvanlari veya evde beslenen hayvanlari (bir kedi veya köpek gibi) içerir. Insan olmayan primatlar ve tercihen Insan hastalar dahil hidrokarbon radikalini ifade eder. Örnekler, sinirlama olmaksizin metil, etil, propil, izo- propil, bütil, izo-bütil, tert-bütil, n-pentil ve n-heksil içerir. "Düsük alkil" terimi, 1 ila 8 karbon içeren, burada tanimlandigi gibi bir alkil grubunu ifade eder. doymamis düz veya dallanmis zincirli hidrokarbon radikali anlamina gelir. Örnekler, sinirlama olmaksizin etenil, propenil, izo-propenil, bütenil, izo-bütenil, tert-bütenil, n- pentenil ve n-heksenildir. "Düsük alkenil" terimi, burada tanimlandigi gibi 2 ila 8 karbon içeren bir alkenil grubunu ifade eder. düz veya dallanmis zincirli hidrokarbon radikali anlamina gelir. Örnekler, sinirlama olmaksizin etinil, propinil, izo-propinil, butinil, izo-butinil, tert-butinil, pentinil ve heksinili içerir. "Düsük alkinil" terimi, burada tanimlandigi gibi 2 ila 8 karbon içeren bir alkinil grubunu ifade eder. olmamak üzere siklobütil, siklopentil, sikloheksil, sikloheptil ve sikloositildir. aromatik hidrokarbon molekül bölümünü ifade eder. Örnekler sinirlama olmaksizin fenil, benzil, naftil, antrasenil, fenantrasenil ve bifenili içerir. bir alkilen zinciridir ve Rb yukarida tanimlandigi gibi bir veya daha fazla aril radikalidir. örnegin benzil, difenilmetil ve benzeridir. tanimlandigi gibi bir alkil radikalidir. "Düsük tioalkoksi" terimi, 1 ila 8 karbon içeren, burada tanimlandigi gibi bir alkoksi grubunu ifade eder. gibi bir alkil radikalidir. "Düsük alkoksi" terimi, 1 ila 8 karbon Içeren, burada tanimlandigi gibi bir alkoksi grubunu ifade eder. Alkoksi gruplarinin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, metoksi ve etoksi bulunur. Rd, bagimsiz olarak, burada tanimlandigi gibi bir alkil radikalidir. "Düsük alkilamino" terimi, 1 ila 8 karbon içeren, burada tanimlandigi gibi bir alkilamino grubuna karsilik oksijen ve sülfür arasindan seçilen 1 ila 4 heteroatom Içeren 5- ila 7 üyeli monosiklik veya 7- ila 10 üyeli bisiklik, heterosiklik bir halka anlamina gelir ve burada nitrojen ve sülfür heteroatomlari istege bagli olarak oksitlenebilir ve yukarida belirtilen heterosikllerin herhangi birinin bir benzen halkasina kaynasmis oldugu bisiklik halkalar dahil olmak üzere nitrojen heteroatomu istege bagli olarak kuaternize edilebilir. Heterosikl, herhangi bir heteroatom veya karbon atomu yoluyla baglanabilir. Heterosikller asagida tanimlandigi gibi heteroariller içerir. Dolayisiyla, asagida listelenen heteroarillere ilaveten, heterosikller ayrica morfolinil, pirrolidinonil, pirrolidinil, piperidinil, piperizinil, hidatoinil, valerolaktamil, oksiranil, oksetanil, tetrahidrofuranil, tetrahidroiluranil ve benzerlerini içerir. hem de bisiklik halka sistemleri de dahil olmak üzere en az 1 karbon atomu içeren en az bir heteroatom içeren bir aromatik heterosikl halkasi anlamina gelir. Temsilci heteroariller, piridil, furil, benzofuranil, tiyofenil, benzotiofenil, kinolinil, pirrolil, indolil, oksazolil, benzoksazolil, imidazolil, benzimidazolil, tiyazolil, benzotiyazolil, tiazolil kinazolinil. alkenil", "istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkoksi", "istege bagli olarak sübstitüe edilmis tioalkoksi", "istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkil amino", "istege bagli olarak sübstitüe edilmis alt alkil", "istege bagli olarak sübstitüe edilmis alt alkenil", edilmis düsük tioalkoksi , istege bagli olarak sübstitüe edilmis düsük alkil amino" ve bir hidrojen atomunun bir sübstitüent ile sübstitüe edildigi anlamina gelir. Bir okso sübstitüentinde (:0) iki hidrojen atomu yer degistirilir. Bu baglamda, sübstitüentler; döteryum, Istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkil, istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkenil, istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkinil, istege bagli olarak sübstitüe edilmis aril, istege bagli olarak sübstitüe edilmis heterosikl, istege bagli olarak sübstitüe edilmis sikloalkil, okso, halojen, --CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSOZRy, - NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx ve -SomNRxRy içerir, burada m 0, 1 veya 2'dir, RX ve Ry ayni veya farklidir ve bagimsiz olarak hidrojen, istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkil, istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkenil, istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkinil, istege bagli olarak sübstitüe edilmis aril, istege bagli olarak sübstitüe edilmis heterosikl veya istege bagli olarak sübstitüe edilmis sikloalkil ve bahsedilen istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkil, istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkenil, Istege bagli olarak sübstitüe edilmis alkinil, Istege bagli olarak sübstitüe edilmis aril, Istege bagli olarak sübstitüe edilmis heteroarildir ve istege bagli olarak sübstitüe edilmis sikloalkil sübstitüentleri ayrica bir veya daha fazla okso, halojen, -CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSO2Ry, -NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx and -SOmNRxRy ile de sübstitüe edilebilir. Farkli antisens moleküller arasinda ayrim yapilmasi amaciyla bir antisens molekülü isimlendirme sistemi önerilmistir ve yayinlanmistir (bakiniz Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Bu isimlendirme özellikle, asagida gösterildigi üzere tamaminin ayni hedef bölgeye yönlendirildigi çok az farkli birkaç antisens molekül test edilirken söz konusu olmustur: Ilk harf, türü (örnegin H: insan, M, mürin, C: köpek) belirtir. "#", hedef distrofin ekson numarasini belirtir. "A/D", sirasiyla eksonun baslangicindaki ve bitisindeki akseptör veya donör birlestirme bölgesini gösterir. (x y), tavlama koordinatlarini temsil eder, burada "-" veya "+", sirasiyla intronik veya eksonik dizileri gösterir. Örnegin A(-6+18), hedef eksondan önce gelen intronun son 6 bazini ve hedef eksonun ilk 18 bazini gösterecektir. En yakin birlestirme bölgesi, akseptör olacaktir, böylece bu koordinatlar, açiklamasi D(+2-18) olabilir, burada son iki 2 eksonik baz ve ilk 18 intronik baz, antisens molekülünün tavlama bölgesine karsilik gelir. Tamamen eksonik tavlama koordinatlari, A(+65+85), yani eksonun baslangicindan 65. ve 85. nükleotid arasindaki bölge ile temsil edilecektir. Antisens molekül(ler), pre-mRNA dizileri içindeki eksonlarin birlestirilmesinde yer alan nükleotid dizilerine hedeflendiginde eksonun normal birlesmesi inhibe edilebilir, bu da birlestirme mekanizmasinin, olgun mRNA"dan hedeflenen tüm eksonu baypas etmesine neden olur. Birçok gende tüm eksonun silinmesi, önemli fonksiyonel domenlerin kaybi veya okuma çerçevesinin bozulmasi yoluyla fonksiyonel olmayan proteinin üretilmesine neden olacaktir. Ancak bazi proteinlerde okuma çerçevesi bozulmadan ve proteinin biyolojik aktivitesi ciddi ölçüde degistirilmeden protein içinden bir veya birkaç eksonun silinmesi yoluyla proteinin kisaltilmasi mümkündür. Tipik olarak bu tür proteinler, yapisal bir role sahiptir ve/veya uçlarinda fonksiyonel domenlere sahiptir. Duchenne musküler distrofisi, tipik olarak okuma çerçevesinin bozulmasi yoluyla fonksiyonel distrofin gen ürününün sentezini engelleyen mutasyonlardan kaynaklanir. Mutasyonu içeren distrofin geni bölgesinde ekson atlamasini indükleyen antisens oligonükleotidleri kas hücrelerinin, fonksiyonel bir distrofin genini kodlayan olgun bir mRNA transkriptini üretmesini saglayabilir. Elde edilen distrofin proteininin distrofinin "dogal sus" formu olmasina gerek yoktur ancak bunun yerine distrofinin kirpilmis, hala fonksiyonel veya yari-fonksiyonel bir formudur. Mevcut bulus, ekson 53'te belirtilen distrofin pre-mRNA hedeflerine baglanabilen ve bu genin islenmesini yeniden yönlendirebilen antisens molekülleri açiklar. Antisens oligonükleotidi ve hedef RNA, her moleküldeki ilgili pozisyonlarin yeterli sayisi, birbiri ile hidrojen bagi olusturabilen nükleotidler tarafindan dolduruldugunda birbirine tamamlayicidir, böylece oligonükleotid ile hedef arasinda stabil baglanma meydana gelir. Dolayisiyla "spesifik olarak hibritlesebilen" ve "tamamlayici", oligonükleotid ile hedef arasinda stabil ve spesifik baglanma meydana gelecek sekilde yeterli tamamlayicilik veya tam eslesme derecesini belirtmek amaciyla kullanilan terimlerdir. Teknikte bir antisens molekülü dizisinin, spesifik olarak hibritlesebilecek hedef dizisininki ile %100 tamamlayici olmasina gerek olmadigi anlasilir. Bir antisens molekülü, oligonükleotidin hedef moleküle baglanmasinin, hedef RNA'nin normal fonksiyonunu engellemesi ve spesifik baglanmanin istendigi kosullar, yani in vivo analizler veya terapötik tedavi durumundaki fizyolojik kosullar altinda ve in vitro analizler durumunda analizlerin gerçeklestirildigi kosullar altinda antisens oligonükleotidinin hedef disi dizilere spesifik olmayan baglanmasini engellemek üzere yeterli tamamlayicilik derecesinin olmasi durumunda spesifik olarak hibritlesebilir. Ekson silinmesi, kisaltilmis transkribe edilmis mRNA"daki okuma çerçevesi kaymasina yol açmamalidir. Dolayisiyla üç eksonun lineer dizisinde birinci ekson ucunun bir kodondaki üç nükleotidden ikisini kodlamasi ve sonraki eksonun silinmesi halinde lineer dizideki Üçüncü ekson, bir kodona yönelik nükleotid üçlüsünü tamamlayabilen tek bir nükleotid ile baslamalidir. Üçüncü eksonun, tek bir nükleotid ile baslamamasi halinde kirpilmis veya fonksiyonel olmayan protein üretimine neden olacak olan okuma çerçevesi kaymasi olacaktir. Yapisal proteinlerde eksonlarin ucundaki kodon düzenlemelerinin, her zaman kodonun ucunda bitmeyecegi, sonuç olarak mRNA'nin çerçeve içi okumasini saglamak üzere pre-mRNA'dan birden fazla eksonun silinmesinin gerekli olabilecegi anlasilacaktir. Bu tür durumlarda bulusun yöntemi ile birçok antisens oligonükleotidinin seçilmesi gerekebilir, bunlardan her biri, Silinecek eksonlarda birlestirme isleminin indüklenmesinden sorumlu farkli bir bölgeye yönlendirilir. Antisens moleküller ile dupleks olusumu esnasinda pre-mRNAlnin parçalanmasini önlemek amaciyla antisens molekülleri, endojen RNase H ile klevaji minimize edecek veya önleyecek sekilde adapte edilebilir. Bu özellik, RNA`nin metillenmemis oligonükleotidler ile hücre içinde veya RNase içeren ham ekstraktlarda muamelesinin, pre-mRNA: antisens oligonükleotidi duplekslerinin parçalanmasina yol açmasi nedeniyle yüksek oranda tercih edilir. RNA ile dupleks olusturdugunda hücresel RNase H ile klevaj edilmeyen antisens moleküllerinin bir örnegi, 2'-O-metil türevleridir. 2'-O- metiI-oligoribonükleotidler, hücresel ortamda ve hayvan dokularinda oldukça stabildir ve RNA ile olan dupleksleri, ribo- veya deoksiribo-muadillerinden daha yüksek Tm degerlerine sahiptir. 2' hidroksiriboz pozisyonunun metilasyonu ve bir fosforotiyoat omurgasinin eklenmesi, yüzeysel olarak RNA'yi taklit eden ancak nükleaz ile parçalanmaya çok daha dirençli olan moleküllerin üretilmesindeki ortak stratejidir. RNase H'yi aktive etmeyen antisens molekülleri, bilinen tekniklere göre yapilabilir (bakiniz örnegin U.S. Pat. No. 5,149,797). Deoksiribonükleotid veya ribonükleotid dizileri olabilen bu tür antisens molekülleri basit olarak, RNase H'nin bir üyesi olarak oligonükleotidi içeren dupleks moleküle baglanmasini sterik olarak engelleyen veya önleyen herhangi bir yapisal modifikasyonu içerir, bu yapisal modifikasyon, dupleks olusumunu büyük ölçüde engellemez veya bozmaz. Dupleks olusumunda yer alan oligonükleotid parçalarinin, RNase H baglanmasinda yer alan parçalarindan büyük ölçüde farkli olmasi nedeniyle RNase H'yi aktive etmeyen birkaç antisens molekülü mevcuttur. Örnegin bu tür antisens moleküller Oligonükleotidler olabilir, burada nükleotidler arasi köprüleyici fosfat kalintilarinin en az biri veya tamami, modifiye fosfatlar, örnegin metil fosfonatlar, metil fosforotiyoatlar, fosforomorfolidatlar, fosforopiperazidatlar ve fosforamidatlardir. Örnegin nükleotidler arasi köprüleyici fosfat kalintilarinin ikisinden biri açiklanan sekilde modifiye edilebilir. Sinirlayici olmayan bir baska örnekte bu tür antisens molekülleri, nükleotidlerin en az birinin veya tamaminin, 2` düsük alkil bölümü (örnegin, C1-C4, lineer veya dallanmis, doymus veya doymamis alkil, örnegin metil, etil, etenil, propil, 1-pr0penil, 2-propenil ve izopropil) içerdigi moleküllerdir. Örnegin nükleotidlerin ikisinden biri, açiklanan sekilde modifiye edilebilir. Oligonükleotidler ayni zamanda nükleobaz (teknikte genellikle basit olarak "baz" olarak refere edilir) modifikasyonlarini veya sübstitüsyonlarini içerebilir. Pürin bazlari, genel formül ile açiklandigi üzere bir imidazol halkasina kaynasik bir pirimidin halkasini içerir: Adenin ve guanin, nükleik asitlerde en yaygin olarak bulunan iki pürin nükleobazidir. Pirimidin bazlari, genel formül ile açiklandigi üzere alti üyeli bir pirimidin halkasini Piiimldin - Sitozin, urasil ve timin, nükleik asitlerde en yaygin olarak bulunan pirimidin bazlaridir. Antisens oligonükleotidi, oligonükleotidin aktivitesini, hücresel dagilimini veya hücresel alimini arttiran bir bölüme kovalent olarak baglanir. Bu bölüm, bir polietilen glikol zinciridir. Bu bulusa göre kullanilan antisens molekülleri, kati faz sentezinin iyi bilinen teknigi ile uygun sekilde ve rutin olarak yapilabilir. Bu senteze yönelik ekipman, örnegin Applied Biosystems (Foster City, Calif.) da dahil birkaç tedarikçi tarafindan satilir. Oligonükleotidlerin modifiye kati destek üzerinde sentezlenmesine yönelik bir yöntem U.S. Pat. No. 4,458,066'da açiklanir. Teknikte bilinen bu tür senteze yönelik bir baska yöntem ek veya alternatif olarak kullanilabilir. Fosforotiyoatlar ve alkillenmis türevler gibi Oligonükleotidlerin hazirlanmasi amaciyla benzer tekniklerin kullanilacagi iyi bilinmektedir. Bu tür otomatik bir uygulamada dietiI-fosforamiditler baslangiç materyalleri olarak kullanilir ve Beaucage, sentezlenebilir. Bulusun antisens molekülleri, in vitro olarak sentezlenir ve biyolojik kökenli antisens bilesimleri içermez. Bulusun molekülleri ayni zamanda, diger moleküller, molekül yapilari veya alim, dagilim ve/veya absorpsiyona yardim edilmesi amaciyla örnegin gibi bilesiklerin karisimlari ile karistirilabilir, kapsüllenebilir, konjuge edilebilir veya baska sekilde birlestirilebilir. A. Morfolino Oligomerleri Fosfor içeren omurga baglarina sahip morfolino oligomerleri Sekiller 1A-1C'de gösterilir. Sekil 1C'de gösterilen gibi bir fosforodiamidat bagli morfolino oligomeri, omurga baglarinin tercihen %10-%50'sinde pozitif yüklü gruplari içerecek sekilde modifiye edilir. Antisens oligonükleotidler de dahil yüksüz omurga baglarina sahip morfolino oligomerleri örnegin (Summerton and Weller 1997) ve müsterek sahip olunan Yüklü baglar da dahil modifiye baglari olan morfolino oligomerleri, US Patent Morfolino bazli alt birimlerin önemli özellikleri sunlardir: 1) bir oligomerik formda stabil, yüksüz veya pozitif yüklü omurga baglantilari ile baglanma kabiliyeti; 2) olusturulan polimerin tamamlayici bir baz hedef nükleik asit ile hibritlesebilmesi için bir nükleotit bazini (örnegin adenin, sitozin, guanin, timidin, urasil ve inosin) destekleme yetenegi, hedef RNA dahil, nispeten kisa oligonükleotitlerde (örnegin 10-15 bazlar) yaklasik 45 °C`nin üzerindeki Tm degerleri; 3) oligonükleotidin, memeli hücrelerine aktif veya pasif olarak tasinmasi; ve 4) antisens oligonükleotit: RNA heterodupleksinin sirasiyla RNAse ve RNase H bozunmasina karsi direnç gösterme kabiliyeti. Talep edilen konunun antisens oligonükleotidleri için örnek teskil eden omurga yapilari, Sekil 1D-G'de gösterilen morfolino altbirim tiplerini içerir, her biri yüksüz veya pozitif yüklü, fosfor içeren bir alt birim baglantisiyla baglanmistir. Sekil 1D, bes atom tekrar eden birim omurgasini olusturan fosfor içeren bir bagi göstermektedir, burada morfolino halkalari, 1 atomlu bir fosfoamid bagi ile baglanir. Sekil 1E, 6 atomlu bir tekrarlayan birim omurgasi üreten bir baglantiyi göstermektedir. Bu yapida, 5' morfolino karbonu fosfor grubuna baglayan Y atomu sülfür, nitrojen, karbon veya tercihen oksijen olabilir. Fosfordan X molekül bölümü, florin, bir alkil veya sübstitüe edilmis alkil, bir alkoksi veya sübstitüe edilmis alkoksi, bir tiyoalkoksi veya sübstitüe edilmis tioalkoksi veya morfolinler veya piperidinler gibi siklik yapilar da dahil olmak üzere sübstitüe edilmemis, monosübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmis nitrojen olabilir. Alkil, alkoksi ve tioalkoksi, tercihen 1-6 karbon atomu içerir. Z molekül bölümleri sülfür veya oksijendir ve tercihen oksijendir. Sekil 1F ve 1Glde gösterilen baglantilar, 7 atomluk birim uzunluktaki omurgalar için tasarlanmistir. Yapi IF'de, X molekül bölümü, Yapi 1E'deki gibidir ve Y molekül bölümü metilen, sülfür veya tercihen oksijen olabilir. Yapi 1G'de, X ve Y molekül bölümleri Yapi 1E'deki gibidir. Özellikle tercih edilen morfolino oligonükleotidler, Sekil 1E'de gösterilen formun morfolino alt birim yapilarindan olusanlari içerir; burada X=NH2, N(CH3)2 veya 1-piperazinil veya diger yüklü gruptur, Y=O ve Z=O`dur. Büyük ölçüde yüksüz bir oligonükleotid, bulusun bir yönüne göre, örnegin her 2-5 yüksüz bag basina yaklasik 1, örnegin her 10 yüksüz bag basina yaklasik 4-5 olmak üzere yüklü baglar içerecek sekilde modifiye edilebilir. Bazi uygulamalarda antisens aktivitesinde optimal artis, omurga baglarinin yaklasik %25'inin katyonik olmasi durumunda görülebilir. Bazi uygulamalarda artis, az sayida, örnegin %10-20 katyonik bag ile veya katyonik baglarin sayisinin yaklasik %60 gibi %50-80 araliginda olmasi durumunda görülebilir. Tamamen katyonik bagli oligomerler dahil olmak üzere herhangi bir sayida katyonik baglantiya sahip oligomerler saglanir. Bununla birlikte, tercihen, oligomerler, örnegin, yaklasik %10 ila %60'i ve tercihen %20 ila %50'si katyoniktir. Bir uygulamada, katyonik baglantilar omurga boyunca serpistirilir. Kismen yüklü oligomerler tercihen en az iki ardisik yüksüz baglanti içerir; diger bir deyisle, oligomer tercihen tüm uzunlugu boyunca kesin olarak degisen bir modele sahip degildir. Ayrica, katyonik baglanti bloklarina ve yüksüz baglanti bloklarina sahip oligomerler; örnegin, yüksüz baglantilarin merkezi bir blogu, katyonik baglantilarin bloklariyla veya tam tersi ile çevrilebilir. Bir uygulamada oligomer, yaklasik olarak esit uzunlukta 5', 3' ve merkez bölgelere sahiptir ve merkez bölgedeki katyonik baglarin yüzdesi, yaklasik Bazi uygulamalarda antisens bilesikler, yukarida alinti yapilan referanslarda ve asagida bir karisima veya yüksüz ve katyonik omurga baglarina sahip oligonükleotidlerin sentezine iliskin olarak detayli bir sekilde açiklanan yöntemler kullanilarak asamali kati faz sentezi ile hazirlanabilir. Bazi durumlarda örnegin farmakokinetikleri arttirmak veya bilesigin yakalanmasini veya saptanmasini kolaylastirmak üzere antisens bilesige ek kimyasal bölümlerin eklenmesi istenebilir. Bu tür bir bölüm, standart sentetik yöntemlere göre kovalent olarak baglanabilir. Örnegin, bir polietilen glikol kisminin veya baska bir hidrofilik polimerin, örnegin 1-100 monomerik alt birime sahip olan polimerin eklenmesi çözünürlügün arttirilmasinda faydali olabilir. Floresin veya radyoaktif etiketli bir grup gibi raportör bir bölüm saptama amaçlari için baglanabilir. Alternatif olarak oligomere baglanan raportör etiket, etiketli bir antikoru veya streptavidini baglayabilen, antijen veya biyotin gibi bir Iigand olabilir. Antisens bir bilesigin baglanmasina veya modifikasyonuna yönelik bir bölümün seçilmesinde genellikle, biyo-uyumlu olan ve istenmeyen yan etkiler olmadan bir denek tarafindan tolere edilebilecek gruplarin kimyasal bilesiklerinin seçilmesi istenir. Her bir morfolino halkasi yapisi, tipik olarak bir hücrede veya tedavi edilen bir denekte seçilen bir antisens hedefini hibridize etmek için tasarlanmis bir baz eslestirme molekül bölümleri dizisi olusturmak için bir baz eslestirme molekül bölümünü destekler. Baz eslestirme molekül bölümü, natif DNA veya RNA'da (örnegin, A, G, C, T veya U) bulunan bir purin veya pirimidin veya hipoksantin (nükleosid inosinin baz bileseni) veya -metil sitozin gibi bir analog olabilir. Bazi uygulamalarda mevcut bulus, mevcut bulusa göre antisens oligomerlerinin terapötik uygulanmasi için uygun farmasötik bilesimlari sunar. Bu nedenle, bazi uygulamalarda, mevcut bulus, bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici (katki maddesi) ve/veya seyreltici ile birlikte formüle edilmis, mevcut bulusa göre oligomerlerin bir veya birkaçinin terapötik olarak etkili bir miktarini içeren farmasötik olarak kabul edilebilir bilesimler sunar. Mevcut bulusun bir oligomerinin tek basina uygulanmasi mümkün olsa da, bilesigin farmasötik bir formülasyon (bilesim) olarak uygulanmasi tercih edilir. Nükleik asit moleküllerinin uygulanmsi için yöntemler, örnegin Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; ve Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar; Sullivan et al., PCT WO 94/02595ide açiklanmistir. Bu ve diger protokoller, mevcut bulusun izole edilmis oligomerleri de dahil olmak üzere hemen hemen hertürlü nükleik asit molekülünün uygulanmasi için kullanilabilir. Asagida detaylandirildigi gibi, mevcut bulusun farmasötik bilesimleri, asagidakiler için uyarlanmis olanlar dahil, kati veya sivi halde uygulanmak için özel olarak formüle edilebilir: (1) oral uygulama, örnegin, püskürtmeler (sulu veya sulu olmayan çözeltiler veya süspansiyonlar), tabletler, örnegin, dilde uygulama için bukkal, dil alti ve sistemik absorpsiyon, bolus, tozlar, granüller, macunlar için hedeflenenler; (2) örnegin steril bir çözelti veya süspansiyon halinde subkütan, intramuskuler intravenöz veya epidural enjeksiyon yoluyla parenteral uygulama veya sürekli salimli formülasyon; (3) örnegin bir krem, merhem veya cilde uygulanan bir kontrollü salimli yama veya sprey olarak topikal uygulama; (4) intravajinal veya intrarektal olarak, örnegin bir ovül, krem veya köpük olarak; (5) dilalti olarak; (6) oküler olarak; (7) transdermal olarak; veya (8) nazal Burada "farmasötik olarak kabul edilebilir" ifadesi, insanlarin ve hayvanlar tibbi dokulari ile temas halinde kullanim için uygun olan ve asiri toksisite, tahris, alerjik cevap veya diger problem veya komplikasyonlari olmaksizin, makul bir fayda/risk orani ile orantili olarak tibbi degerlendirme kapsaminda, bu bilesiklere, materyallere, bilesimlere ve/veya dozaj formlarini ifade etmek için kullanilir. Burada kullanildigi haliyle "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici" ifadesi, sivi veya kati bir dolgu maddesi, seyreltici, eksipiyan, imalat yardimcisi (örnegin, kayganlastirici, talk magnezyum, kalsiyum veya çinko stearat veya sterik asit) gibi farmasötik olarak kabul edilebilir bir madde, bilesim veya vehikül veya bahsedilen bilesigin bir organdan veya vücudun bir kismindan baska bir organa veya vücudun bir kismina tasinmasi veya iletilmesinde rol alan veya çözücü kapsülleyici malzeme anlamina gelir. Her tasiyici, formülasyonun diger bilesenleriyle uyumlu olmasi ve hastaya zarar vermemesi anlaminda "kabul edilebilir" olmalidir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar olarak hizmet edebilecek bazi madde örnekleri, bunlarla sinirli olmamakla birlikte sunlari içerir: (1) Iaktoz, glikoz ve sukroz gibi sekerler; (2) misir nisastasi ve patates nisastasi gibi nisastalar; (3) selüloz ve sodyum karboksimetil selüloz, etil selüloz ve selüloz asetat gibi türevleri; (4) toz haline getirilmis kitre; (5) malt; (6) jelatin; (7) talk; (8) kakao yagi ve fitil balmumu gibi ekspisiyanlar; (9) yerfistigi yagi, pamuk tohumu yagi, aspir yagi, susam yagi, zeytin yagi, misir yagi ve soya yagi gibi yaglar; (10) propilen glikol gibi glikoller; (11) gliserin, sorbitol, manitol ve polietilen glikol gibi polioller; (12) etil oleat ve etil Iorat gibi esterler; (13) agar; (14) magnezyum hidroksit ve alüminyum hidroksit gibi tamponlama maddeleri; (15) aljinik asit; (16) pirojen içermeyen su; (17) izotonik salin; (18) Ringer çözeltisi; (19) etil alkol; (20) pH tamponlu çözeltiler; (21) polyesterler, polikarbonatlar ve/veya polianhidritler; ve (22) farmasötik formülasyonlarda kullanilan diger toksik olmayan uyumlu maddeler. Mevcut bulusun antisens oligomerleri ile formülasyon için uygun olan maddelerin sinirlayici olmayan ilave örnekleri sunlari içerir: PEG konjuge nükleik asitler, fosfolipid konjuge nükleik asitler, Iipofilik molekül bölümleri içeren nükleik asitler, fosforotiyoatlar, ilaçlarin çesitli dokulara girisini artirabilir P-glikoprotein inhibitörleri (örnegin Pluronic P85); implantasyondan sonra sürekli salimli uygulama için poli (DL-laktid-coglikolid) mikrosferleri gibi biyobozunur polimerler (Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass; ve kan beyin bariyeri boyunca ilaçlari uygulayabilen ve nöronal alim mekanizmalarini degistirebilen polibütilsiyanoakrilattan yapilmis olanlar gibi yüklü nanoparçaciklar (Prog Neuropsychopharmacol Biol Bulus ayrica poli (etilen glikol) Iipidleri içeren (PEG ile modifiye edilmis, dallanmis ve dallanmamis veya bunlarin kombinasyonlari veya uzun süre dolasim halindeki lipozomlar veya gizli lipozomlar) yüzey modifiye Iipozomlari içeren farmasötik bilesimin kullanimini da sunmaktadir. Bulusta kullanilmaya yönelik oligomerler ayrica çesitli moleküler agirliklarda kovalent olarak eklenmis PEG moleküllerini içerebilir. Bu formülasyonlar, ilaçlarin hedef dokularda birikmesini arttirmak için bir yöntem sunar. Bu ilaç tasiyici sinifi, mononükleer fagositik sistemin (MP8 veya RES) opsonizasyonuna ve ortadan kaldirilmasina, böylece daha uzun kari dolasim süreleri ve enkapsüle edilmis ilaç için doku maruziyetinin arttirilmasini mümkün kilar (Lasic et al., Chem. Rev. tür Iipozomlarin, muhtemelen neovaskülarize hedef dokularda ekstravazasyon ve yakalama yoluyla tümörlerde seçici olarak biriktigi gösterilmistir (Lasic ve et al., Science dolasim halindeki lipozomlar, özellikle MPS'nin dokularinda biriktigi bilinen geleneksel katyonik Iipozomlara kiyasla, DNA ve RNA'nin farmakokinetigini ve farmakodinamigini Holland et al., Uluslararasi PCT Yayin No. WO 96/10392); Uzun dolasim halindeki lipozomlarin, karaciger ve dalak gibi metabolik olarak agresif MP8 dokularinda birikmeyi önleme yeteneklerine bagli olarak, ilaçlari katiksiz lipozomlara kiyasla daha büyük oranda nükleaz bozulmasindan korumaktadir. 7,070,807'de tarif edildigi gibi uygulama için hazirlanan farmasötik oligomer bilesimlerini içerir. Bu baglamda, bir uygulamada mevcut bulus, tek basina veya PEG ile kombinasyon halinde (örnegin, dallanmis veya dallanmamis PEG veya her ikisinin bir karisimi), PEG ile kombinasyon halinde ve bir hedefleyioi molekül bölümü veya herhangi birinin bir çapraz baglama maddesi ile kombinasyon halinde Iizin ve histidin 6,692,911'de tarif edildigi üzere) mevcut bulusun bir oligomerini saglar. Bazi uygulamalarda mevcut bulus, glukonik asit ile modifiye edilmis polihistidin veya gIukonlanmis-polihistidin/transferrin-polilisin içeren bilesimlerde antisens oligomerleri saglar. Teknikte uzman bir kisi, His ve Lys'e benzer özelliklere sahip amino asitlerin, bilesim Içerisinde sübstitüe edilebilecegini de bilecektir. Mevcut bulusa göre oligomerlerin bazi uygulamalari, amino veya alkilamino gibi bazik bir fonksiyonel grup içerebilir ve bu nedenle farmasötik olarak kabul edilebilir asitlerle farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar olusturabilirler. Bu baglamda "farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar" terimi, mevcut bulusa ait bilesiklerin nispeten toksik olmayan, inorganik ve organik asit ilave tuzlarini ifade eder. Bu tuzlar, uygulama vehikülünde veya dozaj formu imalat prosesinde yerinde veya bulusa ait bir saflastirilmis bilesigin serbest baz formunda uygun bir organik veya inorganik asit ile ayri ayri reaksiyona sokulmasi ve daha sonra saflastirma sirasinda olusan tuzun izole edilmesi suretiyle hazirlanabilir. Temsilci tuzlar arasinda hidrobromid, hidroklorid, sülfat, bisülfat, fosfat, nitrat, asetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, Iaurat, benzoat, Iaktat, fosfat, tosilat, sitrat, maleat, fumerat, süksinat, tartrat, naftilat, mesitalat, glukoheptonat, Iaktobiyonat ve Iaurilsülfonat tuzlari ve benzerleri bulunur. (Bakiniz örnegin, Berge et al., (1977) Mevcut bulusa göre oligomerlerin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlari, örnegin, toksik olmayan organik veya inorganik asitlerden, bilesiklerin konvansiyonel toksik olmayan tuzlarini veya kuaterner amonyum tuzlarini içerir. Örnegin, bu tür geleneksel toksik olmayan tuzlar, hidroklorid, hidrobromik, sülfürik, sülfamik, fosforik, nitrik ve benzeri gibi inorganik asitlerden türetilenleri; ve asetik, propiyonik, süksinik, glikolik, stearik, laktik, malik, tartarik, sitrik, askorbik, palmitik, maleik, hidroksimaleik, fenilasetik, glutamik, benzoik, salisiklik, sülfanilik, 2-asetoksibenzoik, fumarik, tolüensülfonik, metansülfonik, etan disülfonik, oksalik, izotiyonik ve benzerleri gibi organik asitlerden hazirlanan tuzlari içerir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusa göre oligomerler bir veya daha fazla asidik fonksiyonel grup içerebilir ve bu nedenle farmasötik olarak kabul edilebilir bazlarla farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar olusturabilirler. Bu durumlarda "farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar" terimi, mevcut bulusa ait bilesiklerin nispeten toksik olmayan, inorganik ve organik baz ilave tuzlarini ifade eder. Bu tuzlar da ayni sekilde uygulama vehikülünde veya dozaj formu üretim prosesinde yerinde hazirlanabilir veya saflastirilmis bilesigin serbest asit formunda farmasötik olarak kabul edilebilir bir metal katyonun hidroksit, karbonat veya bikarbonat gibi uygun bir bazla, amonyakla veya farmasötik olarak kabul edilebilir organik primer, sekonder veya tersiyer amin ile ayri ayri reaksiyona sokulmasiyla hazirlanabilir. Temsilci alkali veya alkalin toprak tuzlari, benzerlerini içerir. Baz ilaveli tuzlarin olusumu için yararli olan temsili organik aminler arasinda etilamin, dietilamin, etilendiamin, etanolamin, dietanolamin, piperazin ve benzerleri yer alir (Bakiniz, örnegin, Berge ve et al., yukarida). Sodyum laurii sülfat ve magnezyum stearat gibi islatici maddeler, emülgatörler ve kayganlastiricilar, ayrica renklendirici maddeler, salim maddeleri, kaplama maddeleri, tatlandirici, Iezzetlendiriciler ve koku verici maddeler, koruyucular ve antioksidanlar da bilesimlerde mevcut olabilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir antioksidanlarin örnekleri asagidakileri içerir: (1) askorbik asit, sistein hidroklorid, sodyum bisülfat, sodyum metabisülfit, sodyum sülfit ve benzeri gibi suda çözünür antioksidanlar; (2) askorbil palmitat, bütillenmis hidroksianisol (BHA), bütillenmis hidroksitolüen (BHT), Iesitin, propil gallat, alfa- tokoferol ve benzerleri gibi yagda çözünen antioksidanlar; ve (3) sitrik asit, etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), sorbitol, tartarik asit, fosforik asit ve benzeri gibi metal selatlama maddeleri. Mevcut bulusun farmasötik bilesimleri oral, nazal, topikal (bukkal ve dilalti dahil), rektal, vajinal ve/veya parenteral uygulama için uygun olanlari içerir. Formülasyonlar uygun bir sekilde birim dozaj formunda sunulabilir ve eczacilik alaninda iyi bilinen herhangi bir yöntemle hazirlanabilir. Tek bir dozaj formu üretmek için bir tasiyici malzeme ile birlestirilebilen aktif içerik miktari, tedavi edilen konakçiya, özel uygulama sekline bagli olarak degisecektir. Tek bir dozaj formu üretmek için bir tasiyici madde ile birlestirilebilecek aktif içerik miktari, genellikle terapötik bir etki üreten bilesik miktari olacaktir. Genel olarak, yüzde yüz üzerinden, bu miktar aktif bilesenin yaklasik yüzde 0.1 ila yaklasik yüzde doksan dokuzu, tercihen yüzde 5 ila yaklasik yüzde 70'i, en çok tercihen yüzde 10 ila yaklasik yüzde 30 arasinda degisecektir. Bazi uygulamalarda mevcut bulusun farmasötik bir bilesimi, siklodekstrinler, selülozlar, örnegin, polyesterler ve polianhidritler; ve mevcut bulusun bir oligomerini içerir. Bazi uygulamalarda, yukarida bahsedilen formülasyon, bahsedilen bulusun bir oligomerini oral olarak biyolojik olarak kullanilabilir hale getirir. Bu farmasötik bilesimleri hazirlama yöntemleri, mevcut bulusun bir oligomerini tasiyici ve istege bagli olarak bir veya daha fazla yardimci içerikle bir araya getirme adimini içerir. Genel olarak, farmasötik bilesimler, mevcut bulusun bir bilesiginin sivi tasiyicilar veya ince bölünmüs kati tasiyicilar veya her ikisi ile birlikte birlestirilmesi ve gerektiginde ürünün sekillendirilmesiyle esit ve yakin bir sekilde bir araya getirilmesiyle hazirlanir. Agizdan uygulamaya uygun bulusa ait farmasötik bilesimler, kapsüller, saseler, haplar, tabletler, pastiller (aromali bir baz, genellikle sakaroz ve akasya veya kitre olarak kullanilir), tozlar, granüller veya sulu veya susuz bir sivi içinde bir çözelti veya süspansiyon formunda veya suda yag veya suda yag içinde sivi emülsiyon olarak veya bir iksir veya surup olarak veya pastil olarak (jelatin ve gliserin gibi inert bir baz veya sakaroz ve akasya kullanilarak) ve/veya agizda yikanir ve benzerleri seklinde olabilir, her biri bir aktif içerik olarak mevcut bulusun antisens oligonükleotidinin önceden belirlenmis bir miktarini içerir. Mevcut bulusun antisens oligonükleotidi, bir bolus, elektuar veya macun halinde de verilebilir. Oral uygulama için bulusun kati dozaj formlarinda (kapsüller, tabletler, haplar, drajeler, tozlar, granüller, yassi hap ve benzerleri), aktif içerik, sodyum sitrat veya dikalsiyum fosfat gibi bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici ile ve/veya asagidakilerden herhangi biri ile karistirilabilir: (1) nisastalar, Iaktoz, sukroz, glikoz, manitol ve/veya silisik asit gibi dolgu maddeleri veya genisleticiler; (2) örnegin karboksimetilselüloz, aljinatlar, jelatin, polivinil pirolidon, sukroz ve/veya akasya gibi baglayicilar; (3) gliserol gibi nemlendiriciler; (4) agar-agar, kalsiyum karbonat, patates veya tapyoka nisastasi, aljinik asit, bazi silikatlar ve sodyum karbonat gibi parçalayici maddeler; (5) parafin gibi çözelti geciktirici maddeler; (6) dördüncül amonyum bilesikleri ve poloksamer ve sodyum Ioril sülfat gibi surfaktanlar gibi emilim hizlandiricilari; (7) örnegin setil alkol, gliserol monostearat ve iyonik olmayan surfaktanlar gibi islatici maddeler; (8) kaolin ve bentonit kili gibi emiciler; (9) talk, kalsiyum stearat, magnezyum stearat, kati polietilen glikoller, sodyum Ioril sülfat, çinko stearat, sodyum stearat, stearik asit ve bunlarin karisimlari gibi yaglayicilar; (10) renklendirici maddeler; ve (11) krospovidon veya etil selüloz gibi kontrollü salim maddeleri. Kapsüller, tabletler ve haplar durumunda, farmasötik bilesimler ayrica tamponlayici maddeler içerebilir. Benzer tipteki kati bilesimler, Iaktoz veya süt sekeri gibi eksipiyanlarin yani sira yüksek moleküler agirlikli polietilen glikoller ve benzerleri kullanilarak yumusak ve sert kabuklu jelatin kapsüllerdeki dolgu maddeleri olarak da kullanilabilir. Bir tablet, istege bagli olarak bir veya daha fazla yardimci içerikle birlikte, sikistirma veya kaliplama yoluyla hazirlanabilir. Sikistirilmis tabletler, baglayici (örnegin jelatin veya hidroksipropilmetil selüloz), kayganlastirici, Inert seyreltici, koruyucu, parçalayici (örnegin, sodyum nisasta glikolat veya çapraz bagli sodyum karboksimetil selüloz), yüzey aktif veya dagitici ajan kullanilarak hazirlanabilir. Kaliplanmis tabletler, inert bir sivi seyreltici ile nemlendirilmis toz halindeki bir bilesimin bir karisiminin uygun bir makinede kaliplanmasiyla hazirlanabilir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinin tabletler ve diger kati dozaj formlari, drajeler, kapsüller, haplar ve granüller gibi istege bagli olarak, enterik kaplamalar ve farmasötik formülasyon tekniginde iyi bilinen diger kaplamalar gibi kaplamalar ve kabuklar ile skorlanabilir veya hazirlanabilir. Arzu edilen salim profilini, diger polimer matrisleri, hidroksipropilmetil selüloz kullanilarak, aktif içerigin yavas veya kontrollü salimini saglayacak sekilde formüle edilebilirler. Bunlar hizli salim için, örnegin dondurularak kurutulmus olarak formüle edilebilirler. Örnegin, bakteri tutucu bir filtreden süzülerek veya steril su içinde kullanimdan hemen önce steril su içinde veya baska bir steril enjekte edilebilir ortam içinde çözülebilen steril kati bilesimler seklinde sterilize edilebilirler. Bu bilesimler istege bagli olarak opaklastirici maddeler de içerebilir ve istege bagli olarak, gecikmeli bir sekilde, gastrointestinal sistemin belirli bir bölümünde, aktif içerik(ler)in salimini sagladiklari bir bilesime sahip olabilirler. Kullanilabilecek gömme bilesimlerin örnekleri arasinda polimerik maddeler ve mumlar bulunur. Aktif içerik ayrica yukarida açiklanan eksipiyanlardan biri veya daha fazlasiyla uygun oldugunda mikro kapsüllenmis formda da olabilir. Bulusun antisens oligonükleotidlerinin oral uygulamasi için sivi dozaj formlari, farmasötik olarak kabul edilebilir emülsiyonlari, mikroemülsiyonlari, çözeltileri, süspansiyonlari, suruplari ve iksirleri içerir. Aktif içerige ek olarak, sivi dozaj formlari, teknikte yaygin olarak kullanilan, örnegin su veya diger çözücüler gibi inert seyrelticiler, etil alkol, izopropil alkol, etil karbonat, etil asetat, benzil alkol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol gibi çözündürücü maddeler ve emülsiyonlastiricilar, yaglar (özellikle pamuk tohumu, yer fistigi, misir, tohum, zeytin, hint ve susam yaglari), gliserol, tetrahidrofuril alkol, polietilen glikoller ve yag asidi esterleri sorbitan ve bunlarin karisimlarini içerebilir. Inert seyrelticilerin yani sira, oral bilesimler ayrica islatici maddeler, emülsifiye edici ve süspanse edici maddeler, tatlandirici, lezzet verici, renklendirici, koku verici ve koruyucu maddeler gibi adjuvanlari içerebilir. Süspansiyonlar, aktif bilesiklere ek olarak, örnegin etoksilatli izostearil alkoller, polioksietilen sorbitol ve sorbitan esterler, mikrokristalli selüloz, alüminyum metahidroksit, bentonit, agar-agar ve kitre ve bunlarin karisimlari gibi süspanse edici maddeler içerebilir. Rektal veya vajinal uygulama için formülasyonlar, bir veya daha fazla uygun bilesigi, örnegin kakao yagi, polietilen glikol, bir fitil balmumu veya oda sicakliginda kati olan, ancak vücut sicakliginda sivi olan ve bu nedenle rektumda veya vajinal boslukta eriyecek ve aktif bilesigi serbest birakacak bir salisilat içeren tahris edici olmayan eksipiyanlar veya tasiyicilar ile karistirmak suretiyle hazirlanabilen bir fitil olarak sunulabilir. Burada saglanan bir oligomerin topikal veya transdermal uygulamasi için formülasyonlar veya dozaj formlari arasinda tozlar, spreyler, merhemler, macunlar, kremler, losyonlar, jeller, çözeltiler, yamalar ve inhalanlar bulunur. Aktif oligomerler, steril kosullar altinda, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile ve gerekli olabilecek herhangi bir koruyucu, tampon veya itici ile karistirilabilir. Merhemler, macunlar, kremler ve jeller, mevcut bulusun aktif bir bilesigine ek olarak, hayvansal ve bitkisel yaglar, yaglar, balmumlari, parafinler, nisasta, kitre, selüloz türevleri, polietilen glikoller, silikonlar, bentonitler, silisik asit, talk ve çinko oksit veya bunlarin karisimlari gibi ekspisiyanlari içerebilir. Tozlar ve spreyler, mevcut bulusun bir oligomerine ek olarak, laktoz, talk, silisik asit, alüminyum hidroksit, kalsiyum silikatlar ve poliamid tozu gibi eksipiyanlari veya bu maddelerin karisimlarini içerebilir. Spreyler ayrica kloroflorohidrokarbonlar ve bütan ve propan gibi uçucu sübstitüe edilmemis hidrokarbonlar gibi geleneksel iticileri içerebilir. Transdermal yamalar, mevcut bulusun bir oligomerinin vücuda kontrollü bir sekilde verilmesini saglama avantajina sahiptir. Bu dozaj formlari, oligomeri uygun ortamda çözündürerek veya dagitarak yapilabilir. Absorpsiyon arttiricilar, ajanin cilt boyunca akisini arttirmak için de kullanilabilir. Böyle bir akisin hizi, teknikte bilinen diger yöntemlerin yani sira, hizi kontrol eden bir membranin saglanmasi veya ajanin bir polimer matrisinde veya jelinde dagilmasiyla kontrol edilebilir. Parenteral uygulamaya uygun farmasötik kompozisyonlar, bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir steril izotonik sulu veya susuz çözeltiler, dispersiyonlar, süspansiyonlar veya emülsiyonlar veya kullanimdan hemen önce steril enjekte edilebilir solüsyonlar veya dispersiyonlar halinde yeniden olusturulabilen ve formülasyonu, hedeflenen alicinin kani ile izotonik yapan veya süspanse eden veya kalinlastirici maddelerle izotonik yapan sekerler, alkoller, antioksidanlar, tamponlar, bakteriyostatlar içerebilir steril tozlar ile kombinasyon halinde bulusa ait bir veya daha fazla oligomer içerebilir. Bulusun farmasötik bilesimlerinde kullanilabilecek uygun sulu ve susuz tasiyicilarin örnekleri arasinda su, etanol, polioller (örnegin gliserol, propilen glikol, polietilen glikol ve benzeri) ve bunlarin uygun karisimlari, örnegin bitkisel yaglar, zeytinyagi ve etil oleat gibi enjekte edilebilir organik esterler bulunur. Uygun akiskanlik, örnegin Iesitin gibi kaplama malzemelerinin kullanilmasi, dispersiyonlar halinde gerekli parçacik boyutunun korunmasi ve surfaktanlarin kullanilmasiyla saglanabilir. Bu bilesimler ayrica koruyucu maddeler, islatici maddeler, emülgatörler ve dagitici maddeler gibi adjuvanlar da içerebilir. Mikroorganizmalarin bahsedilen oligomerler üzerindeki etkisinin önlenmesi, örnegin paraben, klorobutanol, fenol sorbik asit ve benzerleri gibi çesitli antibakteriyel ve antifungal ajanlarin dahil edilmesiyle saglanabilir. Ayrica, sekerler, sodyum klorid ve benzerleri gibi izotonik ajanlarin bilesimlere dahil edilmesi de arzu edilebilir. Ek olarak, enjekte edilebilir farmasötik formun uzun süreli emilimi, alüminyum monostearat ve jelatin gibi emilimi geciktiren ajanlarin dahil edilmesiyle saglanabilir. Bazi durumlarda, bir ilacin etkisini uzatmak için ilacin deri altindan veya kas içi enjeksiyondan emiliminin yavaslatilmasi arzu edilir. Bu, teknikte bilinen diger yöntemler arasinda, suda çözünürlügü zayif olan bir kristalimsi veya amorf malzeme sivi süspansiyonunun kullanilmasiyla gerçeklestirilebilir. Ilacin emilim hizi, daha sonra, kristal boyutuna ve kristal formuna bagli olabilen çözünme hizina baglidir. Alternatif olarak, parenteral olarak uygulanan bir Ilaç formunun gecikmeli olarak emilmesi ilaci bir yag aracinda eriterek veya süspansiyon halinde tutularak gerçeklestirilir. Enjekte edilebilir depo formlari, polilaktid-poliglikolit gibi biyobozunur polimerlerde bahsedilen oligomerlerin mikrokapsül matrislerinin olusturulmasiyla yapilabilir. Oligomerin polimere oranina ve kullanilan belirli polimerin yapisina bagli olarak, oligomer salim hizi kontrol edilebilir. Diger biyobozunur polimerlerin örnekleri arasinda poli(ortoesterler) ve poli(anhidritler) bulunur. Depo enjekte edilebilir formülasyonlar ilaci, vücut dokulariyla uyumlu olan lipozomlara veya mikroemülsiyonlara hapsetmek suretiyle de hazirlanabilir. Mevcut bulusun oligomerleri, farmasötik olarak, insanlara ve hayvanlara uygulandiginda, kendi basina veya örnegin farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile kombinasyon halinde aktif içerigin %01 ila 99'unu (daha tercihen %10 ila 30) içeren farmasötik bir bilesim halinde verilebilir. Yukarida belirtildigi gibi, mevcut bulusun farmasötik bilesimleri oral, parenteral, topikal veya rektal olarak verilebilir. Genellikle her uygulama yoluna uygun formlarda verilirler. Örnegin, tabletler veya kapsül formunda, enjeksiyon, inhalasyon, göz Iosyonu, merhem, fitil vb. enjeksiyon, infüzyon veya inhalasyon; losyon veya merhem ile topikal; ve fitiller ile rektal yolla uygulanir. Burada kullanildigi sekliyle "parenteral uygulama" ve "parenteral olarak uygulanan" ifadeleri, genellikle enjeksiyon yoluyla enteral ve topikal uygulama disindaki uygulama modlari anlamina gelir ve bunlarla sinirli olmaksizin intravenöz, intramüsküler, Intraarteriyal, intratekal, intrakapsüler, Intraorbital, Intrakardiyak, intradermal, intraperitoneal, transtraseal, subkütan, subkutiküler, intraartiküler, subkapsüler, subaraknoid, intraspinal ve intrasternal enjeksiyon ve infüzyonu içerir. Burada kullanilan "sistemik uygulama", "sistematik olarak uygulanan", "periferik uygulama" ve "periferik olarak uygulanan" ifadeleri, bir bilesigin, ilacin veya dogrudan merkezi sinir sistemine olmayan baska bir maddenin uygulanmasi anlamina gelir, söyle ki hastanin sistemine girer ve bu nedenle, örnegin subkütan uygulama gibi metabolizmaya ve diger benzer proseslere tabi tutulur. Seçilen uygulama yolundan bagimsiz olarak, uygun bir hidrat formunda kullanilabilen mevcut bulusun antisens oligonükleotidi velveya mevcut bulusa ait farmasötik bilesimler, teknikte uzman kisilerce bilinen yöntemlerle geleneksel olarak farmasötik olarak kabul edilebilir dozaj formlarinda formüle edilebilir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimlerindeki aktif içeriklerin fiili dozaj seviyeleri, belirli bir hasta, bilesim ve uygulama sekli için arzu edilen tedavi edici yaniti elde etmek üzere hasta için kabul edilemez toksik olmaksizin etkili olan bir miktarda aktif içerik elde edecek sekilde degistirilebilir. Seçilen dozaj seviyesi, mevcut bulusun özel oligomerinin aktivitesi veya bunun ester, tuzu veya amidi uygulama yolu, uygulama süresi, atilma orani veya kullanilan belirli oligomerin metabolizmasi, absorpsiyon orani ve kapsami, tedavi süresi, diger ilaçlar, bilesikler velveya kullanilan belirli oligomer ile kombinasyon halinde kullanilan maddeler, yas, cinsiyet, agirlik, durum, genel saglik ve tedavi edilmekte olan hastanin önceki tibbi öyküsü ve tip alaninda iyi bilinen benzer faktörler içeren çesitli faktörlere bagli olacaktir. Teknikte siradan uzmanliga sahip olan bir hekim veya veteriner, gerekli farmasötik bilesimin etkili miktarini kolayca belirleyebilir ve reçete edebilir. Örnegin, hekim veya veteriner, arzu edilen terapötik etkiyi elde etmek ve arzu edilen etki elde edilinceye kadar dozu kademeli olarak arttirmak için farmasötik bilesimde kullanilan bulusa ait bilesiklerin dozlarini, gerekenden daha düsük seviyelerde baslatabilir. Genel olarak, bulusun bir bilesiginin uygun bir günlük dozu, terapötik bir etki üretmek için etkili olan en düsük doz olan bilesik miktari olacaktir. Böyle etkili bir doz genellikle yukarida tarif edilen faktörlere bagli olacaktir. Genellikle, bir hasta için mevcut bulusa ait bilesiklerin oral, intravenöz, intraserebroventriküler ve subkütan dozlari, belirtilen etkiler için kullanildiginda, günlük vücut agirliginin kilogrami basina yaklasik 0.0001 ila yaklasik 100 mg arasinda degisecektir. Arzu edilirse, aktif bilesigin günlük etkin dozu, istege bagli olarak birim dozaj formlarinda, gün boyunca uygun araliklarla ayri ayri olarak uygulanan iki, üç, dört, bes, alti veya daha fazla alt doz halinde uygulanabilir. Bazi durumlarda, dozlama günde bir defa uygulanir. Bazi uygulamalarda, islevsel bir distrofin proteininin ekspresyonunu , 11, 12 ayda bir veya daha fazla uygulamadir. Nükleik asit molekülleri, lipozomlar içinde kapsüllenme, iyontoforez veya hidrojeller, siklodekstrinler, biyobozunur nanokapsüller ve biyo-yapiskan mikrosferleri gibi diger vehiküllere dahil etme, ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, teknikte uzman kisilerce bilinen çesitli yöntemlerle uygulanabilir. Bazi uygulamalarda, Iipofilik (suda çözünmeyen) farmasötik ajanlarin biyoyararlanimini arttirmak için mikroemülsifikasyon teknolojisi kullanilabilir. Örnekler arasinda Trimetrin (Dordunoo, 8. K., et al., Drug mikroemülsifikasyon, karacigeri bypass eden ve hepatobiliyer dolasimdaki bilesiklerin tahrip edilmesini önleyen dolasim sistemi yerine Ienfatik sisteme absorpsiyonu yönlendirerek tercihen biyoyararlanimi saglar. Bulusun bir yönünde, farmasötik bilesimler burada saglanan bir oligomerden olusturulmus miseller ve misellerin yaklasik 100 nm'den daha düsük bir ortalama çapa sahip oldugu en az bir amfifilik tasiyici içerir. Daha fazla tercih edilen uygulamalar, yaklasik 50 nm'den daha küçük bir ortalama çapa sahip miseller saglar ve daha da çok tercih edilen uygulamalar, yaklasik 30 nm'den daha az veya hatta yaklasik 20 nm'den daha düsük bir ortalama çapa sahip miseller saglar. Bütün uygun amfifilik tasiyicilar tasarlanirken, halihazirda tercih edilen tasiyicilar genellikle Genel Olarak Güvenli Olarak Taninan (GRAS) statüsünde olan ve çözelti karmasik bir su faziyla temas ettiginde (insan gastrointestinal kanalinda bulunanlar gibi), hem mevcut bulusun bilesigini çözebilen hem de daha sonraki bir asamada mikroemülsifiye edebilen tasiyicilardir. Genellikle, bu gereksinimleri karsilayan amfifilik bilesenler, degerlerine sahiptir ve yapilari, C-6 ila C-20 araliginda düz zincirli alifatik radikalleri içerir. Örnekler polietilen-glikolize yagli gliseritler ve polietilen glikollerdir. Amfifilik tasiyicilarin örnekleri arasinda, tamamen veya kismen hidrojenlenmis çesitli bitkisel yaglardan elde edilenler gibi doymus ve tekli doymamis polietilenglikolize edilmis yag asidi gliseritleri bulunur. Bu tür yaglar avantajli bir sekilde karsilik gelen yag asitlerinin tri-, di- ve mono-yag asidi gliseritleri ve di- ve mono-polietilenglikol esterlerini, stearik asit %5-15 içeren özellikle tercih edilen bir yag asidi bilesimini Içerebilir. Bir baska faydali amfifilik tasiyici sinifi, kismen esterlenmis sorbitan ve/veya sorbitol, doymus veya tekli doymamis yag asitleri (SPAN serisi) veya karsilik gelen etoksile edilmis analoglari (TWEEN serisi) içerir. Ticari olarak temin edilebilen amfifilik tasiyicilar özellikle faydali olabilirler, bunlara Gelucire serisi, Labrafil, Labrasol veya Lauroglikol (tümü Gattefosse Corporation, Saint Priest, Fransa tarafindan üretilen ve dagitilan), PEG-mono-oleat, PEG-di-oleat, PEG- mono-Iaurat ve dilaurat, Lecithin, Polysorbate 80, vb (USA ve dünya çapinda bir çok sirket tarafindan üretilmis ve dagitilmistir) dahildir. Bazi uygulamalarda uygulama, mevcut bulusa ait bilesimlerin uygun konakçi hücrelere dahil edilmesi için Iipozomlar, nanokapsüller, mikropartiküller, mikroküreler, lipid partiküller, veziküller ve benzerleri kullanilarak gerçeklestirilebilir. Özellikle, mevcut bulusun farmasötik bilesimleri, bir lipid parçacigi, bir Iipozom, bir vezikül, bir nanosfer, bir nanopartikül veya benzerinde kapsüllenmis olarak uygulama için formüle edilebilir. Bu tür uygulama vehiküllerinin formülasyonu ve kullanimi bilinen ve geleneksel teknikler kullanilarak gerçeklestirilebilir. Mevcut bulusta kullanim için uygun hidrofilik polimerler, hali hazirda suda çözünür, vezikül Olusturucu bir Iipide kovalent olarak tutturulabilen ve toksik etkiler olmadan in vivo olarak tolere edilebilen (diger bir deyisle biyo-uyumlu) olanlardir. Uygun polimerler arasinda polietilen glikol (PEG), polilaktik (polilaktid olarak da adlandirilir), poliglikolik asit (ayrica poliglikolit olarak adlandirilir), bir polilaktik-poliglikolik asit kopolimeri ve polivinil alkol bulunur. Bazi uygulamalarda, polimerler yaklasik 100 veya 120 dalton ila moleküler agirliga sahiptir. Diger uygulamalarda polimer, molekül agirligi yaklasik 100 dalton olan polietilenglikoldur. Bazi uygulamalarda, polimer 750 daltonluk polietilenglikoldür (PEG (750)). Polimerler ayrica, içindeki monomerlerin sayisi ile de tanimlanabilir; mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, en az yaklasik üç monomerden olusan polimerler, örnegin üç monomerden (yaklasik 150 dalton) olusan PEG polimerleri kullanilir. Mevcut bulusta kullanim için uygun olabilecek diger hidrofilik polimerler arasinda polivinilpirrolidon, polimetoksazolin, polietilokzazolin, polihidroksipropil metakrilamid, polimetakrilamid, polidimilasillamid ve hidroksimetilselüloz veya hidroksietilselüloz gibi Bazi uygulamalarda mevcut bulusa ait bir farmasötik bilesim, poliamitler, polikarbonatlar, polialkilenler, akrilik ve metakrilik esterler, polivinil polimerler. poliglikoller, polisiloksanlar, poliüretanlar ve bunlarin ko-polimerleri, selülozlar, polipropilen, polietilenler, polistiren, Iaktik asit ve glikolik asit polimerleri, polianhidritler, poli(orto)esterler, poli(butik asit), poli(valerik asit), poli(Iaktid-ko-kaprolakton), polisakaritler, proteinler, polihitalüronik asit, polycyanoacrylates ve bunlarin harmanlari, karisimlari veya kopolimerlerinden olusam gruptan seçilen biyouyumlu bir polimer Siklodekstrinler, sirasiyla Yunan harfleri oi, ßveya v ile belirtilen 6, 7 veya 8 glikoz biriminden olusan siklik oligosakaritlerdir. Glikoz birimleri d-1,4-glukosidik baglarla baglanir. Seker birimlerinin destek konformasyonunun bir sonucu olarak, tüm sekonder hidroksil gruplari (C-2, C-3'te) halkanin bir tarafina yerlestirilirken, C-6'daki tüm primer hidroksil gruplari diger tarafa yerlestirilir. Sonuç olarak, dis yüzler hidrofiliktir ve siklodekstrinleri suda çözünür hale getirir. Buna karsilik, siklodekstrinlerin bosluklari hidrofobiktir, çünkü bunlar C-3 ve C-5 atomlarinin hidrojeni ve eter benzeri oksijenler tarafindan kaplanmistir. Bu matrisler, örnegin, 17d-estradiol gibi steroid bilesikleri dahil olmak üzere çesitli nispeten hidrofobik bilesiklerle komplekslemeye izin verir (bakiniz Van der Waals etkilesimleri ve hidrojen bagi olusumu ile gerçeklesir. Siklodekstrinlerin kimyasina genel bir bakis için, bakiniz, Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 803- 822 (1994). Siklodekstrin türevlerinin fiziko-kimyasal özellikleri, kuvvetle türüne ve sübstitüe derecesine baglidir. Örnegin, suda çözünürlügü, çözünmeyen (örnegin, triasetiI-beta- siklodekstrin) ila %147 çözünür (w/v) (G-2-beta-siklodekstrin) arasinda degisir. Ek olarak, birçok organik çözücü içinde çözünürler. Siklodekstrinlerin özellikleri, çözünürlüklerini arttirip azaltarak çesitli formülasyon bilesenlerinin çözünürlügü üzerinde kontrol saglar. Çok sayida siklodekstrin ve bunlarin hazirlanmasina yönelik yöntemler tarif edilmistir. Örnegin, Parmeter (l) et al., (U.S. Patenti 3,453,259) ve Gramera, et al., (US Patenti 3,459,731), elektroneutral siklodekstrinleri tarif etmistir. Diger türevler, katyonik özelliklere sahip siklodekstrinleri [Parmeter (Il), U.S. Pat. 3,453,257], çözünmez çapraz bagli siklodekstrinleri (Solms, U.S. 3,420,788) ve anyonik özelliklere sahip siklodekstrinleri [Parmeter (III), ABD Pat. 3,426,011] içerir. Anyonik özelliklere sahip siklodekstrin türevleri arasinda karboksilik asitler, fosfor asitleri, fosfin asitleri, fosfonik asitler, fosforik asitler, tiyofosfonik asitler, tiyosülfinik asitler ve sülfonik asitler ana siklodekstrine eklenmistir [bakiniz, Parmeter (lll), yukarida]. Ayrica, sülfoalkil eter siklodekstrin türevleri Stella et al., (U.S. Patenti No. 5,134,127)'de açiklanmaktadir. Lipozomlar, sulu bir iç bölmeyi çevreleyen en az bir Iipid iki katmanli membrandan olusur. Lipozomlar, membran tipi ve büyüklügü ile karakterize edilebilir. Küçük unilamellar veziküller (SUV'ler) tek bir membrana sahiptir ve tipik olarak çapi 0.02 ile tipik olarak 0,05 pm'den daha büyüktür. Oligolameller büyük veziküller ve çok hücreli veziküller çoklu, genellikle esmerkezli membran katmanlarina sahiptir ve tipik olarak 0.1 pm'den daha büyüktür. Konsantrik olmayan birkaç membran içeren Iipozomlar, diger bir deyisle daha büyük bir vezikül içinde bulunan birkaç küçük vezikül, multivesiküler vezikül olarak adlandirilir. Mevcut bulusun bir yönü, mevcut bulusun bir oligomerini içeren Iipozomlari içeren farmasötik bilesimler ilgilidir, burada Iipozom membrani, artan tasima kapasitesine sahip bir Iipozom saglamak üzere formüle edilir. Alternatif olarak veya ek olarak, mevcut bulusa ait antisens oligonükleotidi, Iipozomun Iipozomun ikili tabakasi içinde bulunabilir veya adsorbe edilebilir. Mevcut bulusun antisens oligonükleotidi bir Iipid surfaktan ile kümelenebilir ve Iipozomun iç alani içinde tasinabilir; bu durumlarda, sekilde formüle edilir. Mevcut bulusun bir uygulamasina göre, bir Iipozomun Iipid ikili tabakasi, polietilen glikol (PEG) ile türetilmis lipidler içerir, söyle ki PEG zincirleri lipid ikili tabakanin iç yüzeyinden, Iipozom tarafindan kapsanan iç alana uzanir ve Iipid çift katmaninin disindan çevre ortama uzanir. Mevcut bulusun Iipozomlari içinde bulunan aktif maddeler çözündürülmüs formdadir. Surfaktan ve aktif maddenin (emülsiyonlar veya ilgili aktif maddeyi Içeren miseller gibi) agregalari, mevcut bulusa göre Iipozomlarin iç alani içine sikisabilir. Bir surfaktan, aktif maddeyi dagitmak ve çözündürmek için etki eder ve degisen zincir uzunluklarinda (örnegin yaklasik 014 ila yaklasik 020) biyolojik olarak uyumlu Iisofosfatidilkolinleri (LPG'Ier) içeren fakat bunlarla sinirli olmayan herhangi bir uygun alifatik, sikloalifatik veya aromatik sürfaktan arasindan seçilebilir. PEG-lipidler gibi polimerden türetilmis lipidler, misel/membran füzyonunu Inhibe etmeye etki edecekleri için ve misel Olusturucu moleküllere bir polimer eklenmesi surfaktan molekülünün CMC'sini düsürdügü ve misel olusumunda yardimci oldugu için misel olusumunda da kullanilabilir. Tercih edilen mikromolar aralikta CMOtlara sahip surfaktanlar; mevcut bulusun Iipozomlari içine sikismis miselleri hazirlamak için daha yüksek CMC surfaktanlari kullanilabilir. Mevcut bulusa göre Iipozomlar, teknikte bilinen çesitli tekniklerden herhangi biriyle hazirlanabilir. Bakiniz, örnegin, U.S. Pat. 4,235,871; Yayinlanmis PCT basvurulari WO pages 33-104; Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. Örnegin, mevcut bulusun Iipozomlari, bir hidrofilik polimer ile türetilmis bir Iipidin önceden olusturulmus Iipozomlarin lipozomda arzu edilen türevlendirilmis Iipidin nihai mol yüzdesine karsilik gelen Iipid konsantrasyonlarinda Iipid asilanmis polimerlerden olusan misellere maruz birakilmasi gibi önceden olusturulmus Iipozomlara dagitilmasiyla hazirlanabilir. Bir hidrofilik polimer içeren lipozomlar, teknikte bilindigi gibi homojenlestirme, Iipid-alan hidrasyonu veya ekstrüzyon teknikleriyle de olusturulabilir. Örnek niteligindeki baska bir formülasyon prosedüründe, aktif madde önce hidrofobik molekülleri kolayca çözen bir Iisofosfatidilkolin veya baska düsük CMC surfaktanda (polimer asilanmis Iipidler dahil) sonikasyon ile dagitilir. Elde edilen misel aktif madde süspansiyonu daha sonra uygun bir mol polimer asilanmis Iipid veya kolesterol içeren kurutulmus bir Iipid numunesinin rehidrati için kullanilir. Lipid ve aktif madde süspansiyonu daha sonra, teknikte bilindigi gibi ekstrüzyon teknikleri kullanilarak lipozomlar halinde olusturulur ve elde edilen lipozomlar, standart kolon ayrimi ile kapsüllenmemis çözeltiden ayrilir. Mevcut bulusun bir yönünde, lipozomlar, seçilen bir boyut araliginda büyük ölçüde homojen boyutlara sahip olacak sekilde hazirlanir. Etkili bir boyutlandirma yöntemi, bir dizi polikarbonat membrandan geçirilmesini içerir; membranin gözenek büyüklügü kabaca ilgili membranin içinden ekstrüzyonla üretilen en büyük lipozom büyüklügüne uygulamalarda DharmaFECT® ve Lipofectamine® gibi reaktifler, polinükleotidleri veya proteinleri hücrelere dahil etmek Için kullanilabilir. Mevcut bulusun bir farmasötik bilesiminin salim özellikleri, kapsülleme malzemesine, kapsüllenmis ilacin konsantrasyonuna ve salim degistiricilerin varligina baglidir. Örnegin, salim, örnegin midede oldugu gibi sadece düsük bir pH'ta veya bagirsakta oldugu gibi daha yüksek bir pH'ta salinan bir pH'a duyarli kaplama kullanilarak pH'a bagimli olacak sekilde manipüle edilebilir. Midenin içinden geçtikten sonra salinimi önlemek için enterik bir kaplama kullanilabilir. Midede bir baslangiç salimi, ardindan bagirsakta salim elde etmek için farkli malzemelerle kaplanmis siyanamid çoklu kaplamalari veya karisimlari kullanilabilir. Salim ayrica, su alimini artirabilen veya ilacin kapsülden difüzyonla salinmasini artirabilen tuzlarin veya gözenek Olusturucu ajanlarin dahil edilmesiyle de manipüle edilebilir. Ilacin çözünürlügünü degistiren eksipiyanlar ayrica salim oranini kontrol etmek için kullanilabilir. Matrisin bozulmasini artiran veya matristen salinan ajanlar da dahil edilebilir. ilaca ilave edilebilirler, ayri bir faz olarak (diger bir deyisle parçaciklar halinde) ilave edilebilirler veya bilesige bagli olarak polimer fazda birlikte çözülebilirler. Çogu durumda, miktar yüzde 0.1 ila yüzde otuz (w/w polimer) arasinda olmalidir. Bozunma arttirici tipleri arasinda amonyum sülfat ve amonyum klorid gibi inorganik tuzlar, sitrik asit, benzoik asit ve askorbik asit gibi organik asitler, sodyum karbonat, potasyum karbonat, kalsiyum karbonat, çinko karbonat ve Inorganik bazlar ve protamin sülfat, spermin, kolin, etanolamin, dietanolamin ve trietanolamin gibi organik bazlar ve Tween® ve Pluronic® gibi surfaktanlar bulunur. Matrislere mikroyapi ekleyen gözenek Olusturucu maddeler (diger bir deyisle inorganik tuzlar ve sekerler gibi suda çözünür bilesikler) partikül halinde eklenir. Aralik tipik olarak yüzde bir ila otuz (w/w polimer) arasindadir. Alim, taneciklerin bagirsakta kalma sürelerini degistirerek de manipüle edilebilir. Bu, örnegin, parçacigi kapsülleyici malzeme olarak bir mukozal yapiskan polimeri ile kaplayarak veya seçerek saglanabilir. Örnekler, kitosan, selülozlar ve özellikle poliakrilatlar gibi serbest karboksil gruplari olan çogu polimeri (burada kullanildigi gibi, poliakrilatlar, akrilat gruplari ve siyanoakrilatlar ve metakrilatlar gibi modifiye akrilat gruplari içeren polimerleri ifade eder) içerir. Bir oligomer, bir cerrahi veya tibbi cihaz veya implant tarafindan salinacak veya kapsanacak sekilde formüle edilebilir. Bazi yönlerde, bir implant bir oligomer ile kaplanabilir veya baska türlü islemden geçirilebilir. Örnegin, hidrojeller veya biyouyumlu ve/veya biyobozunur polimerler gibi diger polimerler, bir implanti mevcut bulusun bilesimleri ile kaplamak için kullanilabilir (diger bir deyisle bilesim bir hidrojel veya baska bir polimer kullanilarak tibbi bir cihazla kullanim için uyarlanabilir). Tibbi cihazlarin bir maddeyle kaplanmasi için polimerler ve kopolimerler teknikte iyi bilinmektedir. Implant örnekleri arasinda bunlarla sinirli olmamakla birlikte, stentler, ilaç salgilayan stentler, sütürler, protezler, vasküler kateterler, diyaliz kateterleri, vasküler greftler, protez kalp kapakçiklari, kalp pilleri, implante edilebilir kardiyoverter defibrilatörler, lV igneler, kemik ayari ve pimler, vidalar, plakalar ve diger cihazlar gibi olusumlar ve yara iyilesmesi için yapay doku matrisleri bulunur. Burada saglanan yöntemlere ek olarak, bulusa göre kullanim için oligomerler, diger farmasötiklere benzer sekilde, insan veya veteriner tibbinda kullanim için herhangi bir uygun sekilde uygulama için formüle edilebilir. Antisens oligomerleri ve bunlara karsilik gelen farmasötik bilesimler, tek basina veya miyoblast transplantasyonu, kök hücre terapileri, aminoglikozid antibiyotiklerinin verilmesi, proteazom inhibitörleri ve yukari yönde regülasyon terapileri (örnegin utrofinin yukari yönde regülasyonu, distrofinin otozomal bir paralogu) ile kombinasyon halinde uygulanabilir. Açiklanan uygulama yollarinin, teknikte uzman bir kisinin, belirli bir hayvana ve duruma yönelik optimum uygulama yolunu ve herhangi bir dozaji kolay bir sekilde belirleyebilecek olmasi nedeniyle sadece örnek olmasi amaçlanir. Fonksiyonel yeni genetik materyalin in vitro ve in vivo olarak hücrelere eklenmesine yönelik birçok eksprese edilecek genin modifiye edilmis retrovirüslere entegrasyonu (Friedmann retrovirüs disi vektörlere (örnegin adeno-iliskili viral vektörler) entegrasyon (Rosenfeld, heterolog promotör-hizlandirici elemana bagli bir transgenin Iipozomlar ile uygulanmasi Molec. Biol., , vektörlerinin kullanimini (Nabel et al. (1990), yukarida); Wolff et al. (1990) Science, ekspresyon olusturur (Rosenfeld (1992) yukarida); Rosenfeld et al. (1991) yukarida; Research (1991) 39 (abstract)), DNA Iipozom kompleksinin intravenöz veya intratekal uygulamasini takiben farelerin sadece akcigerlerinin in vivo transfeksiyonunu bildirmistir. Insan gen terapisi prosedürlerinin inceleme makalesinin bir örnegi: Materyaller ve Yöntemler Hücreler ve Doku Kültürü Muamele Kosullari Insan Rabdomiyosarkom hücreleri (ATCC, GOL-136; RD hücreleri), L-Glutamin (HyClone), %10 fötal bovin serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin antibiyotik solüsyonu (CelGro) içeren 24 mL iIitilmis DMEM içinde 1.5 x 106 hücre/balonda doku kültürü ile muamele edilmis T75 balonlarina (Nunc) tohumlanmistir; 24 saat sonra ortam aspire edilmistir, hücreler iIitilmis PBS Içinde bir kez yikanmistir ve taze ortam eklenmistir. Hücreler, %50 C02'de 37°C'Iik bir inkübatörde %80 konflüansa kadar büyütülmüstür ve tripsin kullanilarak hasat edilmistir. Liyofilize fosforodiamidat morfolino oligomerleri (PMO'lar), nükleaz içermeyen su içinde yaklasik 0.5 ila 2.0 thde yeniden süspanse edilmistir; molariteyi dogrulamak üzere PMO solüsyonlari, NanoDrop 2000 spektrofotometresi (Thermo Scientific) kullanilarak ölçülmüstür. PMO"Iar, üretici talimatlarina göre nükleoporasyon ve SG kiti (Lonza) kullanilarak RD hücrelerine uygulanmistir. PMO'Iar, belirtilen çesitli konsantrasyonlarda (örnegin, 2.5, 5, 10, 12.5, her gözü için yaklasik 2 - 3 X 105 hücrede nükleoporasyon sonrasinda 24 saat inkübe edilmistir ve akabinde asagida açiklanan sekilde RNA ekstraksiyonuna tabi tutulmustur. Primer insan miyoblastlari, standart teknikler kullanilarak Iskelet Kasi Hücresi Büyüme Ortami (PromoCell) içinde kültürlenmistir. PMOllarin çesitli konsantrasyonlarda nükleoporasyonu, yukarida RD hücreleri için açiklanan sekilde yapilmistir. Hücreler akabinde PromoCeII büyüme ortami içinde 12 gözlü bir plakanin üç kopya halindeki gözlerine yerlestirilmistir ve asagida açiklanan RNA ekstraksiyonu öncesinde 24 saat inkübe edilmistir. RNA Ekstraksiyonu ve PCR Amplifikas yonu RNA, GE Healthcarejden elde edilen RNAspin 96 gözlü RNA izolasyon kiti kullanilarak PMO ile muamele edilmis hücrelerden (RD hücreleri veya primer insan miyoblastlari) ekstrakte edilmistir ve standart teknikler ve asagidaki primer çiftleri kullanilarak yuvalanmis RT-PCR islemine tabi tutulmustur. Dis primerler: ileri 5'- CTTGGACAGAACTTACCGACTGG-3' (SEQ ID NO: 22), geri 5'- GTTTCTTCCAAAGCAGCCTCTCG -3'(SEQ ID NO: 23); iç primerler: ileri 5'- GCAGGATTTGGAACAGAGGCG-S'(SEQ ID NO: 25), geri 5*- CATCTACATTTGTCTGCCACTGG-3'(SEQ ID NO: 25). Ekson atlamasi, jel elektroforezi ile veya Caliper LabChip biyoanaliz cihazi kullanilarak ölçülmüstür ve ekson atlama %'si (yani, tam uzunluktaki PCR ürününe göre eksonu atlanmis ürünün bant siddeti), SEKILLER 3-5'te gösterilen sekilde grafiklenmistir. Morfolino Alt Birimleri, PMO ve Modifiye Alt Birimler Arasi Baglari olan PMO Hazirlanisi O 1 NalO. MecH lakoz) HO 3. Boran-uieulamiri N' 4. Metanolik asit [p-TsOH / \ HO OH veya HCI) H H 58 si› sema 1: PMO ve modifiye PMO All Birlmienne yönelik genel sentenk yol B'nin, baz eslesme bölümünü temsil ettigi ve PGlnin koruma grubunu temsil ettigi Reaksiyon Semasi 1'e referans olarak morfolino alt birimleri, gösterilen sekilde ilgili ribonükleozidden (1) hazirlanabilir. Morfolino alt birimi (2) istege bagli olarak, uygun bir koruma grubu prekürsörü örnegin tritil klorid ile reaksiyon yoluyla korunabilir. 3' koruma grubu genellikle, asagida daha detayli olarak açiklandigi üzere kati hal oligomer sentezi esnasinda uzaklastirilir. Baz eslesme bölümü, kati faz oligomer sentezi için uygun sekilde korunabilir. Uygun koruma gruplari, adenin ve sitozin için benzoil, guanin için fenilasetil ve hipoksantin (I) için pivaloiloksimetili içerir. Pivaloiloksimetil grubu, hipoksantin heterosiklik bazinin N1 pozisyonu üzerine eklenebilir. Korunmamis bir hipoksantin alt biriminin kullanilabilmesine ragmen aktivasyon reaksiyonlarindaki verimler, bazi korunmasi durumunda çok daha üstündür. Diger uygun koruma gruplari, buraya tamamiyla referans olarak eklenen U.S. Patent No. 8,076,476"da açiklananlari 3'ün aktive fosfor bilesigi (4a veya 4b) ile reaksiyonu, istenen bag bölümüne (5a veya 5b) sahip morfolino alt birimleri ile sonuçlanir. R1 ve/veya L1 bölümlerinin de, P-O bagi olusumu sonrasinda veya alt birimin oligomere eklenmesinden sonra heterosiklik halkaya Z yerlestirilebilecegi bilinmelidir. Yapinin (4a veya 4b) bilesikleri, örneklerde açiklananlar da dahil teknikte uzman kisilerce bilinen birkaç yöntem kullanilarak hazirlanabilir. Morfolino bölümü ile birlesme, yukarida açiklanan sekilde ilerler. Yapinin (5a veya 5b) bilesikleri, alt birimler arasi baglari içeren oligomerlerin hazirlanisina yönelik kati faz oligomer sentezinde kullanilabilir. bu tür yöntemler teknikte iyi bilinir. Kisaca, yapinin (53 veya 5b) bir bilesigi, 5' uçta kati destege yönelik bir baglayici içerecek sekilde modifiye edilebilir. Desteklendiginde 5a veya 5b`nin koruma grubu (örnegin 3'-uçta tritil) uzaklastirilir ve serbest amin, yapinin (5) (veya analogunun) ikinci bilesiginin aktive fosfor bölümü ile reakte edilir. Bu dizi, istenen uzunluktaki oligo elde edilene kadar tekrarlanir. terminal 3' uçtaki koruma grubu uzaklastirilabilir veya 3' modifikasyonunun istenmesi halinde burada birakilabilir. Oligo, birkaç yöntem veya kati destege yönelik bagi klevaj etmek üzere bir baz ile örnek muamele kullanilarak kati destekten uzaklastirilir. Bulusun genel ve spesifik morfolino oligomerlerindeki morfolino oligomerlerinin hazirlanisi Örneklerde daha detayli olarak açiklanir. Morfolino Oligomerlerinin Hazirlanisi Bulus bilesiklerini hazirlama islemi, asagidaki protokol kullanilarak gerçeklestirilir: Tritil piperazin fenil karbamat (35) hazirlanisi (Sekil 2): Diklorometan (6 mL/g 11) içindeki sogutulmus bilesik (11) süspansiyonuna, su (4 leg potasyum karbonat) içindeki potasyum karbonat (3.2 esdeger) solüsyonu eklenmistir. Bu iki fazli karisima diklorometan (2 9/9 fenil kloroformat) içindeki fenil kloroformat (1.03 esdeger) solüsyonu yavasça eklenmistir. Reaksiyon karisimi 20°C'ye ilitilmistir. Reaksiyonun tamamlanmasi üzerine (1-2 saat) katmanlar ayrilmistir. Organik katman su ile yikanmistir ve anhidröz potasyum karbonat üzerinde kurutulmustur. Ürün (35), asetonitrilden kristalizasyon ile izole edilmistir. Karbamat alkol (36) hazirlanisi: Sodyum hidrit (1.2 esdeger), 1-metil-2- pirolidinon (32 mL/g sodyum hidrit) içinde süspanse edilmistir. Bu süspansiyona trietilen glikol (10.0 esdeger) ve bilesik (35) (1.0 esdeger) eklenmistir. Ortaya çikan sulu karisim 90°C'ye isitilmistir. Reaksiyonun tamamlanmasi üzerine (1-2 saat) karisim 20°C'ye sogutulmustur. Bu karisima %30 diklorometan/met" tert- bütil eter (vzv) ve su eklenmistir. Ürün içeren organik katman, sirasiyla aköz NaOH, aköz süksinik asit ve doymus aköz sodyum klorid ile yikanmistir. Ürün (36), diklorometan/metil tert-bütil eter/heptandan kristalizasyon ile izole edilmistir. Tail asidinin (37) hazirlanisi: Tetrahidrofuran (7 leg 36) içindeki bilesik (36) solüsyonuna süksinik anhidriti ( eklenmistir. Karisim 50°C'ye isitilmistir. Reaksiyonun tamamlanmasi üzerine (5 saat) karisim 20°C'ye sogutulmustur ve aköz NaHC03 ile pH 8.5'e ayarlanmistir. Metil tert-bütil eter eklenmistir ve ürün, aköz katmana ekstrakte edilmistir. Diklorometan eklenmistir ve karisim aköz sitrik asit ile pH 3'e ayarlanmistir. Ürün içeren organik katman, pH=3 sitrat tamponu ve doymus aköz sodyum klorid karisimi ile yikanmistir. 37`nin bu diklorometan solüsyonu, bilesik (38) hazirlanisinda izolasyon yapilmadan kullanilmistir. 38 Hazirlanisi: Bilesik (37) solüsyonuna N-hidroksi-5-norbornen-2,3- dikarboksilik asit imid (HONB) ( (0.34 esdeger) ve akabinde 1-(3-dimetilaminopropiI)-N'-etilkarbodiimid hidroklorid (EDC) (1.1 esdeger) eklenmistir. Karisim 55°Ciye isitilmistir. Reaksiyonun tamamlanmasi üzerine (4-5 saat) karisim 20°C*ye sogutulmustur ve sirasiyla 1:1 0.2 M sitrik asit/tuzlu su ve tuzlu su ile yikanmistir. Diklorometan solüsyonu, aseton ve akabinde N,N-dimetilf0rmamid olarak solvent degisimine ugramistir ve ürün, doymus aköz sodyum kloride aseton/N,N- dimetilformamidden çöktürme yoluyla izole edilmistir. Ham ürün, geri kalan N,- N-dimetilformamid ve tuzlari uzaklastirmak üzere su içinde birkaç kez yeniden sulu karisim haline getirilmistir. Aktive edilmis "Tail" kisminin baglayici yüklü reçine üzerine eklenmesi, kati faz sentezi esnasinda alt birimlerin eklenmesi amaciyla kullanilan prosedür ile dimetil imidazolidinon (DMI) içinde gerçeklestirilmistir. Morfolino Oligomerlerinin Sentezine yönelik Kati Destegin Hazirlanisi: Bu prosedür, iri gözenekli (40-60 um) cam firit, yukaridan asili karistirici ve N2'nin firitten püskürtülmesine veya vakumlu ekstraksiyona izin veren 3 yönlü Teflon muslugu olan silanlasmis, ceketli bir peptit kabinda (ChemGlass, NJ, USA) gerçeklestirilmistir. Asagidaki prosedürdeki reçine muamelesi/yikama adimlari, iki temel islemden olusur: reçine sivilastirma veya karistirici yatakli reaktör ve solvent/solüsyon ekstraksiyonu. Reçine sivilastirma için üç yönlü musluk, N2'nin firitten akmasina olanak saglayacak sekilde konumlandirilmistir ve belirlenen reçine muamele/yikama maddesi reaktöre eklenmistir ve nüfuz etmesi ve reçineyi tamamen islatmasi saglanmistir. Akabinde karistirma islemi baslatilmistir ve reçine sulu karisimi belirlenen süre boyunca karistirilmistir. Solvent/solüsyon ekstraksiyonu için karistirma ve N2 akisi durdurulmustur ve vakumlu pompa baslatilmistir ve akabinde üç yönlü musluk, reçine muamele/yikama maddesinin atik olarak bosaltilmasina izin verecek sekilde konumlandirilmistir. Tüm reçine muamele/yikama hacimleri, aksi belirtilmedikçe 15 mL/g'dir. Silanlanmis, ceketli bir peptit kabi içindeki aminometilpolistiren reçinesine (100-200 göz boyutu; nitrojen sübstitüsyonuna bagli olarak ~1.0 mmol/g yük; 75 g, 1 esdeger, Polymer Labs, UK, part # eklenmistir ve reçinenin, 1-2 saat karistirilarak sismesine olanak saglanmistir. Sisirme solventinin bosaltilmasindan sonra reçine diklorometan (2 x 1-2 dakika), %25 izopropanoI/diklorometan (2 x 3-4 dakika) içindeki %5 diizopropiletilamin ve diklorometan (2 x 1-2 dakika) ile yikanmistir. Nihai yikamanin bosaltilmasindan sonra reçine, 1-metiI-2-pirolidinon (0.17 M; 15 mL/g reçine, -2.5 esdeger) içindeki disülfit baglayici (34) solüsyonu ile muamele edilmistir ve reçine/reaktif karisimi 45°C"de 60 saat isitilmistir. Reaksiyonun tamamlanmasi üzerine isitma islemi durdurulmustur ve baglayici solüsyonu bosaltilmistir ve reçine, 1-metil-2-pir0lidinon (4 x 3-4 dakika) ve diklorometan (6 x 1-2 dakika) ile yikanmistir. Reçine, diklorometan içindeki %10 (v/v) dietil dikarbonat solüsyonu ile muamele edilmistir (16 mL/g; 2 x 5-6 dakika) ve akabinde diklorometan (6 x 1-2 dakika) ile yikanmistir. Reçine (39) (bakiniz Sekil 4), 1- 3 saat boyunca N2 akisi altinda ve akabinde vakum altinda sabit agirliga (±%2) kurutulmustur. Verim: orijinal reçine agirliginin %110-150'si. Aminometilpolistiren-disülfit reçine Yüklemesinin Belirlenmesi: Reçine yüklemesi (potansiyel olarak mevcut olan reaktif bölgelerin sayisi), reçine grami basina düsen trifenilmetil (tritil) gruplarinin sayisina yönelik spektrometrik bir analiz ile belirlenir. Bilinen agirliktaki kurutulmus reçine (25 ± 3 mg), silanlanmis 25 mltlik volumetrik bir balona transfer edilir ve diklorometan Içindeki ~5 mL %2 (v/v) trifloroasetik asit eklenir. Içerikler, hafifçe döndürülerek karistirilir ve akabinde 30 dakika bekletilir. Hacim, diklorometan içindeki ek %2 (v/v) trifloroasetik asit ile 25 mL"ye getirilir ve içerikler iyice karistirilir. Pozitif deplasmanli bir pipet kullanilarak tritil içeren solüsyondan bir alikuot (, 10 mL'Iik volumetrik balona transfer edilir ve hacim, metansülfonik asit ile 10 mL'ye getirilir. Nihai solüsyondaki tritil katyon içerigi, 431.7 nm`de UV absorbansi ile ölçülür ve reçine yüklemesi, uygun hacimler, dilüzyonlar, sönümleme katsayisi (s: 41 umoI-1cm-1) ve reçine agirligi kullanilarak reçine grami basina düsen (pmoI/g) tritil gruplarinda hesaplanir. Analiz, üç kopya halinde gerçeklestirilir ve ortalama yükleme hesaplanir. Bu örnekteki reçine yükleme prosedürü, yaklasik 500 umoI/g'lik bir yüklemesi olan reçineyi saglayacaktir. umoI/g olarak 300-400 olan bir yükleme, disülfit baglayici ekleme adiminin oda sicakliginda 24 saatte gerçeklestirilmesi halinde elde edilmistir. Tail yüklemesi: AminometiIpolistiren-disülfit reçinesinin hazirlanisi ile ayni düzenek ve hacimler kullanilarak Tail kati destege eklenebilir. Baglayici yüklü reçine ilk olarak asidik kosul altinda korumasiz birakilir ve elde edilen materyal baglama öncesinde nötralize edilir. Baglama adimi için 4-etilm0rf0lin (NEM, 0.4 M) içeren DMI içindeki 38 (0.2 M) solüsyonu, disülfit baglayici solüsyonu yerine kullanilmistir. 45°C'de 2 saat bekletildikten sonra reçine (39), %25 izopropanoI/diklorometan içindeki %5 diizopropiletilamin ile iki kez ve DCM ile bir kez yikanmistir. Bu reçineye benzoik anhidrit ( solüsyonu eklenmistir. 25 dakika sonra reaktör ceketi oda sicakligina sogutulmustur ve reçine %25 izopropanol/diklorometan içindeki %5 diizopropiletilamin ile iki kez ve DCM ile sekiz kez yikanmistir. Reçine (40) filtrelenmistir ve yüksek vakum altinda kurutulmustur. Reçineye (40) yönelik yüklemenin, TaiI yüklemesinde kullanilan orijinal amInometilpolistiren-disülfit reçinesinin yüklemesi oldugu tanimlanir. Kati Faz Sentezi: Morfolino Oligomerleri, 2 mL Gilson polipropilen reaksiyon hazirlanmistir. Su akisina yönelik kanallari olan bir alüminyum blok, sentezleme cihazina yerlestirilmeleri nedeniyle kolonlar etrafina yerlestirilmistir. AMS-422 dönüsümlü olarak reaktif/yikama solüsyonlarini ekleyecektir, belirlenen bir süre boyunca bekleyecektir ve vakum kullanarak kolonlari bosaltacaktir. Uzunluk olarak yaklasik 25 alt birime kadar çikabilen aralikta olan oligomerler için yaklasik 500 umol/g reçine yüklemesi olan amInometilpolistiren-disülfit reçine tercih edilir. Daha büyük oligomerler için 300-400 umol/g reçine yüklemesi olan aminometilpolistiren-disülfit reçine tercih edilir. 5'-Tail içeren bir molekülün istenmesi halinde ayni yükleme kilavuzlari ile Tail yüklenmis olan reçine seçilir. Asagidaki reaktif solüsyonlari hazirlanmistir: Detritilasyon Solüsyonu: 4:1 diklorometan/asetonitril içinde %10 Siyanoasetik Asit (w/v); Netralizasyon Solüsyonu: 3:1 diklorometan/izopropanol içinde 55 Diizopropiletilamin; Baglama Solüsyonu: istenen baz ve bag türüne sahip 0.18 M (veya alt birimden daha uzun olan oligomerler için 0.24 M) aktive Morfolino Alt Birimi ve reaktif solüsyonu yikamalarini ayiran geleneksel yikama maddesi olarak kullanilmistir. Sentezleme cihazinda 42°C'ye ayarlanan blok ile 30 mg aminometilpolistiren-disülfit reçinesi (veya Tail reçinesi) içeren her kolona 2 mL 1-metil-2-pir0lidin0n eklenmistir ve oda sicakliginda 30 dakika bekletilmistir. 2 mL diklorometan ile 2 kez yikandiktan sonra asagidaki sentez döngüsü kullanilmistir: Adim Hacim Uygulama Bekleme süresi Detritilasyon 1.5 mL Manifold 15 saniye Detritilasyon 1.5 mL Manifold 15 saniye Detritilasyon 1.5 mL Manifold 15 saniye Adim Hacim Uygulama Bekleme süresi Detritilasyon 1.5 mL Manifold 15 saniye Detritilasyon 1.5 mL Manifold 15 saniye Detritilasyon 1.5 mL Manifold 15 saniye Detritilasyon 1.5 mL Manifold 15 saniye DCM 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye DCM 1.5 mL Manifold 30 saniye Baglama 350-500uL Siringa 40 dakika DCM 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye Nötralizasyon 1.5 mL Manifold 30 saniye DCM 1.5 mL Manifold 30 saniye DCM 1.5 mL Manifold 30 saniye DCM 1.5 mL Manifold 30 saniye Tekli oligomerlerin siralar, her kolon uygun baglama solüsyonunu (A,C,G,T,I) uygun sirada alacak sekilde sentezleme cihazina programlanmistir. Bir kolondaki oligomer nihai alt biriminin eklenmesini tamamladiginda kolon bloktan çikarilmistir ve nihai içeren baglama solüsyonu ile manüel olarak gerçeklestirilmistir. Reçineden klevaj ve bazlarin ve omurga koruma gruplarinin uzaklastirilmasi: Metoksitritilasyon sonrasinda reçine 2 mL 1-metil-2-pirolidin0n ile 8 kez yikanmistir. 1- metiI-pirolidinon içindeki içeren bir mL klevaj solüsyonu eklenmistir, kolon kapatilmistir ve oda sicakliginda 30 dakika bekletilmistir. Bu süre sonrasinda solüsyon, 12 mL'Iik Wheaton sisesine bosaltilmistir. Büyük ölçüde çekmis olan reçine, 300 uL klevaj solüsyonu ile iki kez yikanmistir. Bu solüsyona eklenmistir, sise sikica kapatilmistir (Teflon kapli vidali kapak ile) ve karisim solüsyonu karistirmak üzere döndürülmüstür. Sise, baz ve omurga koruma gruplarinin klevajini gerçeklestirmek üzere 16-24 saat 45°C'Iik etüve yerlestirilmistir. Ham ürün saflastirmasi: Siselere konulan amonoliz solüsyonu etüvden çikarilmistir ve oda sicakligina sogutulmustur. Solüsyon, 20 mL %028 aköz amonyak ile seyreltilmistir ve Macroprep HQ reçine (BioRad) içeren 2.5x10 cm kolondan geçirilmistir. Tuz gradyani (A: %028 amonyak ile B: %028 amonyak içindeki 1 M sodyum klorid; 60 dakikada %0-100 B), metoksitritil içeren piki ayristirmak amaciyla kullanilmistir. Kombine fraksiyonlar toplanmistir ve istenen ürüne bagli olarak ileri isleme tabi tutulmustur. Morfolino Oligomerlerinin Demetoksitritilasyonu: Macroprep saflastirmasindan toplanan fraksiyonlar, pH degerini 2.5'e düsürmek amaciyla 1 M H3PO4 ile muamele edilmistir. Ilk karistirma sonrasinda numuneler oda sicakliginda 4 dakika bekletilmistir, bu sürede ile saflastirilmistir. SPE kolon paketlemesi ve kosullandirmasi: Amberchrome CG-300M (Rohm and Haas; Philadelphia, PA) (3 mL), 20 mL firitli kolonlara (BioRad Econo-Pac Kromatografi Kolonlari (732-1011)) paketlenmistir ve reçine, 3 mL miktarinda asagidaki maddeler ile SPE saflastirmasi: Demetoksitritilasyondan elde edilen solüsyon, kolona yüklenmistir ve reçine, 3-6 mL %028 aköz amonyak ile üç kez durulanmistir. Bir Wheaton sisesi (12 mL), kolon altina yerlestirilmistir ve ürün, %028 aköz amonyak içindeki 2 mL %45 asetonitril ile iki kez yikanarak ayristirilmistir. Ürün izolasyonu: Solüsyonlar kuru buzda dondurulmustur ve siseler, yumusak, beyaz bir toz olusturmak üzere dondurarak kurutma cihazina yerlestirilmistir. Numuneler su içinde çözülmüstür, siringa kullanilarak 0.22 mikronluk filtreden (Pall Life Sciences, Acrodisc 25 mm siringa filtresi, 0.2 mikron HT Tuffryn membran ile) filtrelenmistir ve Optik Yogunluk (OD), analize yönelik dagitim numunesinin yani sira mevcut oligomerin OD birimlerini belirlemek üzere UV spektrofotometresinde ölçülmüstür. Solüsyonlar akabinde liyofilizasyon için tekrar Wheaton siselerine yerlestirilmistir. MALDI ile Morfolino Oligomerlerinin Analizi: MALDI-TOF kütle spektrometrisi, saflastirmalardaki fraksiyonlarin bilesimini belirlemek ve oligomerlerin kimligine (molekül agirligi) yönelik kanit saglamak amaciyla kullanilmistir. Numuneler, matriksler olarak 3,5-dimetoksi-4-hidroksisinnamik asit (sinapinik asit), 3,4,5-trihid0ksiasetofenon (THAP) veya alfa-siyano-4-hidoksisinnamik asit (HCCA) solüsyonu ile dilüzyon sonrasinda isleme tabi tutulmustur. Örnek 1'de açiklanan protokol kullanilarak asagidaki PMO sentezlenmistir, H53A(+ ve Örneklerde kullanilmistir. Bir baska deneyde bulusun antisens oligomeri, yayinlanmis antisens oligonükleotidlerine göre primer insan miyoblastlarinda ekson 53 atlamasi yönünden test edilmistir. Yukarida açiklanan H53A(+a ek olarak US SEQ ID NO: 10, 11 ve 12); W (SEQ (sirasiyla SEQ ID NO: 14 ve 15), bulusun örnek niteligindeki bir oligomeri H53A(+ ile karsilastirilmistir. Sekil 5A ve SB'de gösterildigi üzere en düsük EC50 degeri sergileyen oligomerin H53A(+36+60) SEQ ID NO: 1 oldugu belirlenmistir. Bu, asagidaki tabloda gösterilen EC50 degerlerini olusturmak üzere sonuçlarin GraphPad Prism programi içinde üç parametreli regresyon analizine tabi tutulmasi yoluyla dogrulanmistir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR