RS65504B1

RS65504B1 - Procesi za pripremu fosfordiamidat morfolino oligomera

Info

Publication number: RS65504B1
Application number: RS20240522A
Authority: RS
Inventors: Bao Cai; Mitchell Martini; Ross Shimabuku; Katie Thomas
Original assignee: Sarepta Therapeutics Inc
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2024-06-28
Also published as: HRP20240583T1; IL263033B; SI3464306T1; WO2017205513A1; EP4406600A2; HUE066393T2; CA3024182A1; PT3464306T; EP4406600A3; CN109311920A; US20220340605A1; EP3464306A1; JP2019523754A; AU2017271524B2; IL263033A; CN109311920B; TWI737736B; MA45155A; SA518400462B1; KR20190013844A

Description

Opis

POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava proizilazi iz privremene prijave patenta Sjedinjenih Država br.

62/340,953, podnete 24. maja 2016. godine; i privremene prijave patenta Sjedinjenih Država br. 62/357,134, podnete 30. juna 2016. godine.

POZADINA

[0002] Antisens tehnologija pruža sredstvo za modulaciju ekspresije jednog ili više specifičnih genskih proizvoda, uključujući alternativne splajs proizvode, i jedinstveno je korisna u brojnim terapijskim, dijagnostičkim i istraživačkim primenama. Princip antisens tehnologije je da antisens jedinjenje, npr. oligonukleotid, koji se hibridizuje u ciljnu nukleinsku kiselinu, modulira aktivnosti ekspresije gena kao što su transkripcija, splajsovanje ili translacija kroz bilo koji od brojnih antisens mehanizama. Specifičnost sekvence antisens jedinjenja čini ih atraktivnim kao alate za validaciju cilja i funkcionalizaciju gena, kao i terapiju za selektivnu modulaciju ekspresije gena uključenih u bolest.

[0003] Duchenne mišićna distrofija (DMD) je uzrokovana defektom u ekspresiji proteinskog distrofina. Gen koji kodira protein sadrži 79 eksona rasprostranjenih na više od 2 miliona nukleotida DNK. Svaka eksonska mutacija koja menja okvir za čitanje eksona, ili uvodi kodon za zaustavljanje, ili se karakteriše uklanjanjem celog eksona iz okvira ili eksona, ili duplikacija jednog ili više eksona, ima potencijal da poremeti proizvodnju funkcionalnog distrofina, što rezultira sa DMD.

[0004] Nedavna klinička ispitivanja bezbednosti i efikasnosti oligonukleotida koji preklapaju splajsove (SSO) za DMD tretman zasnivaju se na tehnologiji SSO za izazivanje alternativnog splajsovanja pre-mRNK sternom blokadom splajsosoma (Cirak et al., 2011; Goemans et al., 2011; Kinali et al., 2009; van Deutekom et al., 2007). Međutim, uprkos ovim uspesima, farmakološke opcije dostupne za DMD tretman su ograničene.

[0005] Eteplirsen je fosforodiamidatni morfolino oligomer (PMO) dizajniran da preskoči ekson 51 gena humanog distrofina kod pacijenata sa DMD koji su podložni preskakanju eksona 51 kako bi obnovili okvir za čitanje i proizveli funkcionalni kraći oblik proteina distrofina. Sarepta Therapeutics, Inc., podnela je zahtev za novi lek (nDa) američkoj Upravi za hranu i lekove (FDA) tražeći odobrenje za tretman DMD kod pacijenata koji su podložni preskakanju eksona 51. FDA trenutno razmatra nDa kompanije Sarepta.

[0006] WO2013/082551 A1 opisuje upotrebu antisens jedinjenja za indukovanje inkluzije eksona kao tretman spinalne mišićne atrofije (SMA). Konkretnije, odnosi se na indukovanje uključivanja eksona 7 za vraćanje nivoa proteina motornih neurona za preživljavanje (SMN) kodiranog genom motornih neurona za preživljavanje (SMN). Ovaj dokument dalje podučava procese za proizvodnju morfolino antisens oligonukleotida.

[0007] WO 2014/153240 A2 opisuje antisens molekule koji se mogu vezati za izabrano ciljno mesto u genu humanog distrofina kako bi izazvali preskakanje eksona 53. Ovaj dokument dalje podučava procese za proizvodnju morfolino antisens oligonukleotida.

[0008] WO 2011/150408 A2 obelodanjuje antisens oligonukleotide korisne za tretman bolesti kod kojih inhibicija ekspresije proteina ili korekcija aberantnih mRNK splajs proizvoda proizvodi korisne terapeutske efekte. Ovaj dokument dalje podučava procese za proizvodnju morfolino antisens oligonukleotida.

[0009] Iako je postignut značajan napredak u oblasti antisens tehnologije, u struci i dalje postoji potreba za metodama pripreme fosforodiamidat morfolino oligomera sa poboljšanim antisens ili antigen performansama.

REZIME

[0010] Ovde su navedeni procesi za pripremu fosforodiamidat morfolino oligomera (PMO). Ovde opisani sintetički procesi omogućavaju povećanu sintezu PMO uz održavanje ukupnog prinosa i čistoće sintetizovanog PMO.

[0011] Ovaj predmetni pronalazak se odnosi na proces pripreme oligomernog jedinjenja formule (E):

[0012] U još jednom otelotvorenju, oligomerno jedinjenje obelodanjivanja, uključujući, na primer, neka otelotvorenja oligomernog jedinjenja formule (E), je oligomerno jedinjenje formule (XII):

[0013] Radi jasnoće, strukturne formule koje uključuju, na primer, oligomerno jedinjenje formule (E) i Eteplirsen prikazane formulom (XII), predstavljaju kontinuiranu strukturnu formulu od 5' do 3', a radi lakšeg prikazivanja cele formule u kompaktnom obliku u gornjim strukturnim formulama, podnosioci patentnog zahteva su uključili različite ilustracije sa oznakama „DEO A“, „DEO B“, „DEO C“ i „DEO D“. Kao što bi obučeni stručnjak razumeo, na primer, svaka indikacija „DEO A“ pokazuje nastavak ilustracije strukturne formule u ovim tačkama. Obučeni stručnjak shvata da isto važi za svaku instancu „DEO B“, „DEO C“ i „DEO D“ u strukturnim formulama iznad, uključujući Eteplirsen. Nijedna od ilustracija, međutim, nema za cilj da ukaže, niti bi ih obučeni stručnjak razumeo da znače, stvarni prekid gore navedenih strukturnih formula, uključujući Eteplirsen.

KRATAK OPIS SLIKA

[0014]

Sl. 1 prikazuje reprezentativni analitički hromatogram tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) sintetizovane i nezaštićene sirove supstance Eteplirsen (AVI-4658) (videti primer 4).

Sl. 2 prikazuje reprezentativni analitički HPLC hromatogram prečišćenog rastvora lekovite supstance Eteplirsen (videti primer 5).

Sl. 3 prikazuje reprezentativni analitički HPLC hromatogram desalinizovane i liofilizovane lekovite supstance Eteplirsen (videti primer 5).

DETALJAN OPIS

[0015] Ovde su navedeni procesi za pripremu morfolino oligomera kako je ovde definisano. Ovde opisani morfolino oligomer pokazuje jači afinitet za DNK i RNK bez ugrožavanja selektivnosti sekvence, u odnosu na nativne ili nemodifikovane oligonukleotide. Kao što je ovde opisano, morfolino oligomer obelodanjivanja minimizira ili sprečava cepanje RNaze H. Kao što je ovde opisano, morfolino oligomer obelodanjivanja ne aktivira RNazu H.

[0016] Ovde opisani procesi su povoljni u procesu industrijskih razmera i mogu se primeniti na pripremu količina morfolino oligomera u visokom prinosu i razmerama (npr. oko 1 kg, oko 1-10 kg, oko 2-10 kg, oko 5-20 kg, oko 10-20 kg ili oko 10-50 kg).

Definicije

[0017] U nastavku su navedene definicije različitih termina koji se koriste za opis ovog obelodanjivanja. Ove definicije se primenjuju na termine koji se koriste u celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako nije drugačije ograničeno u određenim slučajevima, bilo pojedinačno ili kao deo veće grupe.

[0018] „Bazno zaštićena“ ili „bazna zaštita“ odnosi se na zaštitu grupa za uparivanje baza, npr. purinskih ili pirimidinskih baza, na morfolino podjedinicama sa zaštitnim grupama pogodnim za sprečavanje reakcije ili interferencije grupa za uparivanje baza tokom stepenaste sinteze oligomera. (Primer bazno zaštićene morfolino podjedinice je aktivirana C podjedinica jedinjenje (C) koja ima CBZ zaštitnu grupu na citozinskoj amino grupi prikazanoj u nastavku.)

[0019] „Aktivirana fosforamidatna grupa“ je tipično hlorofosforamidatna grupa, koja ima supstituciju na azotu koja je poželjna u eventualnoj vezi fosforodiamidata u oligomeru.

Primer je (dimetilamino) hlorofosforamidat, tj. -OP(=O)(NMe2)Cl.

[0020] Termin „vezan za nosač“ odnosi se na hemijski entitet koji je kovalentno povezan sa medijumom nosačem.

[0021] Termin „medijum nosač“ se odnosi na bilo koji materijal, uključujući, na primer, bilo koju česticu, kuglicu ili površinu, na koju se oligomer može pričvrstiti ili sintetizovati, ili se može modifikovati za pričvršćivanje ili sintezu oligomera. Reprezentativne podloge uključuju, ali nisu ograničene na, neorganske nosače i organske nosače kao što su staklo i modifikovano ili funkcionalizovano staklo, plastika (uključujući akril, polistiren i kopolimere stirena i drugih materijala, polipropilen, polietilen, polibutilen, poliuretani, TEFLON, itd.), polisaharidi, najlon ili nitroceluloza, keramika, smole, silicijum dioksid ili materijali na bazi silicijuma, uključujući silicijum i modifikovani silicijum, ugljenik, metale, neorganska stakla, plastiku, snopove optičkih vlakana i niz drugih polimera. Posebno korisni medijumi nosači i čvrste površine za neka otelotvorenja nalaze se unutar aparata protočne ćelije. U nekim otelotvorenjima ovde opisanih procesa, medijum nosač se sastoji od polistirena sa 1% umreženog divinilbenzena.

[0022] U nekim otelotvorenjima, reprezentativni medijum nosač obuhvata najmanje jedno reaktivno mesto za vezivanje ili sintezu oligomera. Na primer, u nekim otelotvorenjima, medijum nosač obelodanjivanja obuhvata jednu ili više terminalnih amino ili hidroksilnih grupa sposobnih da formiraju hemijsku vezu sa dolaznom podjedinicom ili drugom aktiviranom grupom za vezivanje ili sintezu oligomera.

[0023] Neki reprezentativni medijumi nosači koji su podložni ovde opisanim procesima uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: kontrolisano porozno staklo (CPG); oksalil kontrolisano porozno staklo (videti, npr. Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527); čestice koje sadrže silicijum-dioksid, kao što su porozne staklene kuglice i silika gel, kao što je onaj koji nastaje reakcijom trihloro-[3-(4-hlorometil)fenil]propilsilana i poroznih staklenih kuglica (videti Parr and Grohmann, Angew. Chem. Internal. Ed.1972, 11, 314, u prodaji pod zaštitnim znakom "PORASIL E" od strane Waters Associates, Framingham, Mass., USA); mono ester 1,4-dihidroksimetilbenzena i silicijuma (videti Bayer and Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503, u prodaji pod zaštitnim znakom "BIOPAK" od strane Waters Associates);

TENTAGEL (videti, npr. Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373); umreženu kopolimernu kugličastu matricu stirena/divinilbenzena, ili POROS, kopolimer polistirena/divinilbenzena (dostupan od strane Perceptive Biosystems); rastvorljivi medijum nosač kao što je polietilen glikol PEG (videti Bonora et al., Organic Process Research & Development, 2000, 4, 225-231); PEPS nosač, koji je polietilenski (PE) film sa dugolančanim polistirenskim (PS) graftovima (videti Berg, et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8024 i međunarodnu patentnu prijavu WO 1990/02749); kopolimere dimetilakrilamida umrežene sa N,N'-bisakriloiletilendiaminom, uključujući poznatu količinu N-tercbutoksikarbonil-betaalanil-N'-akriloilheksametilendiamina (videti Atherton, et al., J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 6584, Bioorg. Chem.1979, 8, 351, and J. C. S. Perkin I 538 (1981)); čestice stakla obložene hidrofobnim umreženim stirenskim polimerom (videti Scott, et al., J. Chrom. Sci., 1971, 9, 577); fluorisani etilenski polimer na koji je graftovan polistiren (videti Kent and Merrifield, Israel J. Chem.1978, 17, 243 and van Rietschoten in Peptides 1974, Y. Wolman, Ed., Wiley and Sons, New York, 1975, pp.113-116); polipropilenske membrane obložene hidroksipropilakrilatom (Daniels, et al., Tetrahedron Lett.1989, 4345); polietilenske šipke graftovane akrilnom kiselinom (Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998); „vrećicu za čaj“ koja sadrži tradicionalno korišćene polimerne kuglice (Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 5131); i njihove kombinacije.

[0024] Termin „aparat za protočne ćelije“ odnosi se na komoru koja se sastoji od površine (npr. čvrste površine) preko koje može teći jedan ili više tečnih reagenasa (npr. tečnost ili gas).

[0025] Termin „deblokirajuće sredstvo“ odnosi se na kompoziciju (npr. rastvor) koja se sastoji od hemijske kiseline ili kombinacije hemijskih kiselina za uklanjanje zaštitnih grupa. Primeri hemijskih kiselina koje se koriste u deblokirajućim sredstvima uključuju halogenizovane kiseline, npr. hloroacetatnu kiselinu, dihloroacetatnu kiselinu, trihloroacetatnu kiselinu, fluoroacetatnu kiselinu, difluoroacetatnu kiselinu i trifluoroacetatnu kiselinu. U nekim otelotvorenjima, deblokirajuće sredstvo uklanja jednu ili više tricil grupa iz, na primer, oligomera, oligomera vezanog za nosač, podjedinice vezane za nosač ili drugog zaštićenog azotnog ili kiseoničnog dela.

[0026] Termini „halogen“ i „halo“ odnose se na atom izabran iz grupe koja se sastoji od fluora, hlora, broma i joda.

[0027] Termin „sredstvo za prekrivanje“ odnosi se na kompoziciju (npr. rastvor) koja se sastoji od anhidrida kiseline (npr. anhidrida benzojeve kiseline, anhidrida sirćetne kiseline, anhidrida fenoksiocetne kiseline i slično) koji je koristan za blokiranje reaktivnog citata, na primer, medijuma nosača koji formira hemijsku vezu sa dolaznom podjedinicom ili drugom aktiviranom grupom.

[0028] Termin „sredstvo za cepanje“ odnosi se na kompoziciju (npr. tečni rastvor ili gasovitu smešu) koja se sastoji od hemijske baze (npr. amonijak ili 1,8-diazabicikloundek-7-en) ili kombinacije hemijskih baza korisnih za cepanje, na primer, oligomera vezanog za nosač iz medijuma nosača.

[0029] Termin „sredstvo za deprotekciju“ odnosi se na kompoziciju (npr. tečni rastvor ili gasovitu smešu) koja se sastoji od hemijske baze (npr. amonijak, 1,8-diazabicikloundek-7-en ili kalijum karbonat) ili kombinacije hemijskih baza korisnih za uklanjanje zaštitnih grupa. Na primer, sredstvo za deprotekciju, u nekim otelotvorenjima, može ukloniti zaštitu baze od, na primer, morfolino podjedinice, morfolino podjedinice morfolino oligomera, ili njihovih verzija vezanih za nosač.

[0030] Termin „rastvarač“ se odnosi na komponentu rastvora ili smeše u kojoj se rastvor rastvara. Rastvarači mogu biti neorganski ili organski (npr. sirćetna kiselina, aceton, acetonitril, acetil aceton, 2-aminoetanol, anilin, anizol, benzen, benzonitril, benzil alkohol, 1-butanol, 2-butanol, i-butanol, 2-butanon, t-butil alkohol, ugljen disulfid, ugljen tetrahlorid, hlorobenzen, hloroform, cikloheksan, cikloheksanol, cikloheksanon, di-n-butilftalat, 1,1-dihloroetan, 1,2-dihloroetan, dietilamin, dietilen glikol, diglim, dimetoksietan (glim), N,N-dimetilanilin, dimetilformamid, dimetilftalat, dimetilsulfoksid, dioksan, etanol, etar, etil acetat, etil acetoacetat, etil benzoat, etilen glikol, glicerin, heptan, 1-heptanol, heksan, 1-heksanol, metanol, metil acetat, metil t-butil etar, metilen hlorid, 1-oktanol, pentan, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 2-pentanon, 3-pentanon, 1-propanol, 2-propanol, piridin, tetrahidrofuran, toluen, voda, p-ksilen).

[0031] Termini „morfolino oligomer“ i „fosforodiamidat morfolino oligomer“ ili „PMO“ odnose se na oligomer koji ima morfolino podjedinice povezane fosforodiamidatnim vezama, spajajući morfolino azot jedne podjedinice sa 5'-eksocikličnim ugljenikom susedne podjedinice. Svaka morfolino podjedinica se sastoji od dela koji uparuje nukleobaze i koji je efikasan za vezivanje, nukleobazom-specifičnim vodoničnim vezivanjem, za nukleobazu u meti.

[0032] Termin „EG3 rep“ se odnosi na delove trietilen glikola konjugovane sa oligomerom, npr. na njegovom kraju od 3'- ili 5'. Na primer, u nekim otelotvorenjima, „EG3 rep“ konjugovan na 3' kraju oligomera može biti strukture:

[0033] Termini „oko“ ili „približno“ su generalno shvaćeni od strane lica koja su upoznata sa relevantnom predmetnom oblašću, ali u određenim okolnostima mogu značiti u okviru ±10%, ili u okviru ±5%, date vrednosti ili opsega.

Procesi pripreme morfolino oligomera

[0034] Sinteza se generalno priprema, kao što je ovde opisano, na medijumu nosaču.

Generalno, prvi sinton (npr. monomer, kao što je morfolino podjedinica) je prvo vezan za medijum nosač, a oligomer se zatim sintetiše sekvencijalnim spajanjem podjedinica sa sintonom vezanim za nosač. Ovo iterativno izduživanje na kraju rezultira konačnim oligomernim jedinjenjem. Pogodni medijumi nosači mogu biti rastvorljivi ili nerastvorljivi ili mogu imati promenljivu rastvorljivost u različitim rastvaračima kako bi se omogućilo da rastući polimer vezan za nosač bude ili u rastvoru ili van njega po želji. Tradicionalni medijumi nosači su uglavnom nerastvorljivi i rutinski se postavljaju u reakcione sudove dok reagensi i rastvarači reaguju sa i/ili peru rastući lanac dok oligomer ne dostigne ciljnu dužinu, nakon čega se odvaja od nosača i, ako je potrebno, dalje obrađuje kako bi se proizvelo konačno polimerno jedinjenje. Noviji pristupi su uveli rastvorljive nosače uključujući rastvorljive polimerne nosače kako bi se omogućilo taloženje i rastvaranje iterativno sintetizovanog proizvoda na željenim tačkama sinteze (Gravert et al., Chem. Rev., 1997, 97,489-510).

[0035] Ovde su navedeni procesi za pripremu morfolino oligomera.

[0036] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđen proces za pripremu oligomernog jedinjenja formule (A):

pri čemu je n ceo broj od 10 do 40, a svaki R<2>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koja se sastoji od:

1

pri čemu se proces sastoji od kontaktiranja jedinjenja formule (A11):

pri čemu je n ceo broj od 10 do 40, a R<4>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koja se sastoji od:

i sa sredstvom za deprotekciju da bi se formiralo oligomernog jedinjenja formule (A).

[0037] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđen proces za pripremu oligomernog jedinjenja formule (A):

pri čemu se proces sastoji od sekvencijalnih koraka:

1. (a) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A1):

pri čemu je R<1>medijum nosač a R<3>je izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; sa deblokirajućim sredstvom da bi se formiralo jedinjenje formule (II):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(b) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (II) sa jedinjenjem formule (A2):

pri čemu je R<3>izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; da bi se formiralo jedinjenje formule (A3):

1

pri čemu je R<1>medijum nosač, a R<3>je izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil;

(c) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A3) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (IV):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(d) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (IV) sa jedinjenjem formule (A4):

pri čemu je R<3>izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je izabran iz grupe koja se sastoji od:

da bi se formiralo jedinjenje formule (A5):

pri čemu je R<1>medijum nosač, R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>se bira iz grupe koju čine:

1

nja n-1 iteracija sekvencijalnih koraka:

(e1) dovođenja u kontakt proizvoda formiranog neposrednim prethodnim korakom sa sredstvom za deblokiranje; i

(e2) dovođenja u kontakt jedinjenja formiranog neposrednim prethodnim korakom sa jedinjenjem formule (A8):

pri čemu je R<3>izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je, nezavisno za svako jedinjenje formule (A8), izabran iz grupe koja se sastoji od:

1

da bi se formiralo jedinjenje formule (A9):

pri čemu je n ceo broj od 10 do 40, R<1>je medijum nosač, R<3>je izabran iz grupe koja se sastoji od tritila, monometoksitritila, dimetoksitritilai trimetoksitritila, a R<4>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koja se sastoji od:

1

(f) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A9) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (A10):

1

pri čemu je n ceo broj od 10 do 40, R<1>je medijum nosač, a R<4>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koja se sastoji od:

1

7. (g) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A10) sa sredstvom za cepanje da bi se formiralo jedinjenje formule (A11):

2

8. (h) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A11) sa sredstvom za deprotekciju da bi se formiralo oligomerno jedinjenje formule (A).

[0038] U jednom otelotvorenju, korak (d) ili korak (e2) se dalje sastoji od dovođenja u kontakt jedinjenja formule (IV) ili jedinjenja formiranog u neposredno prethodnom koraku, respektivno, sa sredstvom za prekrivanje.

[0039] U drugom otelotvorenju, svaki korak se izvodi u prisustvu najmanje jednog rastvarača.

[0040] U još jednom otelotvorenju, deblokirajuće sredstvo koje se koristi u svakom koraku je rastvor koji se sastoji od halogenizovane kiseline.

[0041] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za deblokiranje koje se koristi u svakom koraku je cijanoacetna kiselina.

[0042] U drugom otelotvorenju, halogenizovana kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od hloroacetne kiseline, dihloroacetne kiseline, trihloroacetne kiseline, fluoroacetne kiseline, difluoroacetne kiseline i trifluoroacetne kiseline.

[0043] U drugom otelotvorenju, halogenizovana kiselina je trifluoroacetatna kiselina.

[0044] U još jednom otelotvorenju, najmanje jedan od koraka (a), (c), (e1) i (f) dalje obuhvata korak kontaktiranja deblokiranog jedinjenja svakog koraka sa neutralizacionim sredstvom.

[0045] U još jednom otelotvorenju, svaki od koraka (a), (c), (e1) i (f) dalje obuhvata korak kontaktiranja deblokiranog jedinjenja svakog koraka sa neutralizacionim sredstvom.

[0046] U drugom otelotvorenju, neutralizaciono sredstvo je u rastvoru koji se sastoji od dihlorometana i izopropil alkohola.

[0047] U još jednom otelotvorenju, neutralizaciono sredstvo je monoalkil, dialkil ili trialkil amin.

[0048] U još jednom otelotvorenju, neutralizaciono sredstvo je N,N-diizopropiletilamin.

[0049] U drugom otelotvorenju, sredstvo za deblokiranje koje se koristi u svakom koraku je rastvor koji se sastoji od 4-cijanopiridina, dihlorometana, trifluoroacetatne kiseline, trifluoroetanola i vode.

[0050] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za prekrivanje je u rastvoru koji se sastoji od etilmorfolina i metilpirolidinona.

[0051] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za prekrivanje je anhidrid kiseline.

[0052] U drugom otelotvorenju, anhidrid kiseline je benzojev anhidrid.

[0053] U drugom otelotvorenju, jedinjenja formule (A4) i formule (A8) su svaka, nezavisno, u rastvoru koji se sastoji od etilmorfolina i dimetilimidazolidinona.

[0054] U drugom otelotvorenju, sredstvo za cepanje se sastoji od ditiotreitola i 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en.

[0055] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za cepanje je u rastvoru koji se sastoji od N-metil-2-pirolidona.

[0056] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za deprotekciju obuhvataNH3.

[0057] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za deprotekciju je u vodenom rastvoru.

[0058] U još jednom otelotvorenju, medijum nosač se sastoji od polistirena sa 1% umreženog divinilbenzena.

[0059] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (A4) je formule (A4a):

pri čemu:

R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a

R<4>se bira između:

2

[0060] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (A5) je formule (A5a):

pri čemu:

R<1>je medijum nosač,

R<4>se bira između:

[0061] U još jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (A8) je formule (A8a):

pri čemu:

R<4>je, nezavisno pri svakoj pojavi jedinjenja formule (A8a), izabran iz grupe koja se sastoji od:

2

[0062] U još jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (A9) je formule (A9a):

pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40,

R<1>je medijum nosač,

R<4>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koju čine:

2

[0063] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (A10) je formule (A10a):

2

pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40,

R<1>je medijum nosač, a

R<4>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koju čine:

[0064] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (A11) je formule (A11a):

2

pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40, a

R<4>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koju čine:

2

[0065] U oligomernom jedinjenju formule (A), n je 30, a R<2>je na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

pri čemu je oligomerno jedinjenje formule (A) jedinjenje formule (E):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0066] Eteplirsen (videti, npr. International Patent Application Publication No. WO 2006/000057) je bio predmet kliničkih studija kako bi se testirala njegova bezbednost i efikasnost, a klinički razvoj je u toku. Eteplirsen je fosforodiamidat morfolino oligomer (PMO). Terapijski distrofin „Eteplirsen“, takođe poznat kao „AVI-4658“ je PMO koji ima baznu sekvencu 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGCATTTCTAG-3' (SEK ID BR.:1).

Eteplirsen je registrovan pod CAS registarskim brojem 1173755-55-9. Hemijski nazivi uključuju: RNK, [P-deoksi-P-(dimetilamino)](2',3'-dideoksi-2',3'-imino-2',3'-seko)(2'→5')(C-m5U-C-C-A-A-C-A-m5U-C-A-A-G-G-A-A-G-A-m5U-G-G-C-A-m5U-m5U-m5U-C-m5U-A-G) (SEK ID BR.:1), 5'-[P-[4-[[2-[2-(2-hidroksietoksi)etoksi]etoksi]karbonil]-1-piperazinil]-N,N-dimetilfosfonamidat] i P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-5'-O-{P-[4-(10-hidroksi-2,5,8- trioksadekanoil)piperazin-1-il]-N,N-dimetilfosfonamidoil}-2',3'-imino-2',3'-sekocitidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekotimidilil- (2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekocitidilil-(2'a→-5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,3'-dideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekotimidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P- (dimetilamino)-

1

2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilarnino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→-5')-P,2',3'-trideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,3'-dideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekotimidilil-(2'a→75')-P,2',3'-trideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-P,3'-dideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekotimidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekotimidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoksi-P- (dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekotimidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekocitidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-sekotimidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoksi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino- 2',3'-sekoadenilil-(2'a→5')-2',3'-dideoksi-2',3'-imino-2',3'-sekogvanozin.

[0067] Eteplirsen ima sledeću strukturu:

C-T-C-C-A-A-C-A-T-C-A-A-G-G-A-A-G-A-T-G-G-C-A-T-T-T-C-T-A-G (SEK ID BR.:1)

2

[0068] Eteplirsen se takođe može prikazati strukturom formule (XII):

[0069] Ovaj predmetni pronalazak se odnosi na proces pripreme jedinjenja formule (E):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0070] U još jednom otelotvorenju, oligomerno jedinjenje formule (E) je oligomerno jedinjenje formule (XII):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0071] U još jednom otelotvorenju, R<3>je, pri svakoj pojavi, tritil.

Procesi pripreme Eteplirsena

[0072] Ovde su navedeni procesi za pripremu Eteplirsena.

4

[0073] U jednom otelotvorenju, ovde je predviđen proces za pripremu oligomernog jedinjenja formule (E):

pri čemu se proces sastoji od sekvencijalnih koraka:

(a) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (I):

pri čemu je R<1>medijum nosač,

sa deblokirajućim sredstvom da bi se formiralo jedinjenje formule (II):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(b) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (II) sa jedinjenjem (B):

da bi se formiralo jedinjenje formule (iii):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(c) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (III) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (IV):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(d) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (IV) sa jedinjenjem formule (C):

da bi se formiralo jedinjenje formule (V):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(e) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (V) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (VI):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(f) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (VI) sa jedinjenjem formule (F):

da bi se formiralo jedinjenje formule (VII):

pri čemu je R<1>medijum nosač;

(g) vršenja 28 iteracija sekvencijalnih koraka:

(g1) dovođenja u kontakt proizvoda formiranog neposrednim prethodnim korakom sa sredstvom za deblokiranje; i

(g2) dovođenja u kontakt jedinjenja formiranog neposrednim prethodnim korakom sa jedinjenjem formule (VIII):

pri čemu jeR<2>, nezavisno za svako jedinjenje formule, izabran iz grupe koja se sastoji od:

pri čemu je, za svaku iteraciju od 1 do 28, R<2>is:

da bi se formiralo jedinjenje formule (IX):

4

pri čemu je R<1>medijum nosač, pri čemu je R<2>, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koja se sastoji od:

i pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

(i) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (X) sa sredstvom za cepanje da bi se formiralo jedinjenje formule (XI):

pri čemu je R<1>medijum nosač,

pri čemu je R<2>, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koja se sastoji od:

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

4

, i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

i

(j) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (XI) sa sredstvom za deprotekciju da bi se formiralo oligomerno jedinjenje formule (E).

[0074] U jednom otelotvorenju, korak (d), korak (f), korak g(2), ili njihove kombinacije dalje obuhvata dovođenje u kontakt jedinjenja formule (IV), formule (VI), ili jedinjenja formiranog neposrednim prethodnim korakom, respektivno, sredstvom za prekrivanje.

[0075] U određenim otelotvorenjima, svaki od koraka (d), koraka (f) i koraka g(2) dalje obuhvata dovođenje u kontakt jedinjenja formule (IV), formule (VI) ili jedinjenja formiranog neposrednim prethodnim korakom, respektivno, sredstvom za prekrivanje.

[0076] U drugom otelotvorenju, svaki korak se izvodi u prisustvu najmanje jednog rastvarača.

[0077] U još jednom otelotvorenju, deblokirajuće sredstvo koje se koristi u svakom koraku je rastvor koji se sastoji od halogenizovane kiseline.

[0078] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za deblokiranje koje se koristi u svakom koraku je cijanoacetna kiselina.

[0079] U drugom otelotvorenju, halogenizovana kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od hloroacetne kiseline, dihloroacetne kiseline, trihloroacetne kiseline, fluoroacetne kiseline, difluoroacetne kiseline i trifluoroacetne kiseline.

[0080] U još jednom otelotvorenju, halogenizovana kiselina je trifluoroacetatna kiselina.

4

[0081] U još jednom otelotvorenju, najmanje jedan od koraka (c), (e1) i (f) dalje obuhvata korak dovođenja u kontakt deblokiranog jedinjenja svakog koraka sa neutralizacionim sredstvom.

[0082] U još jednom otelotvorenju, svaki od koraka (c), (e1) i (f) dalje obuhvata korak dovođenja u kontakt deblokiranog jedinjenja svakog koraka sa neutralizacionim sredstvom.

[0083] U još jednom otelotvorenju, neutralizaciono sredstvo je u rastvoru koji se sastoji od dihlorometana i izopropil alkohola.

[0084] U još jednom otelotvorenju, neutralizaciono sredstvo je monoalkil, dialkil ili trialkil amin.

[0085] U još jednom otelotvorenju, neutralizaciono sredstvo je N,N-diizopropiletilamin.

[0086] U još jednom otelotvorenju, deblokirajuće sredstvo koje se koristi u svakom koraku je rastvor koji se sastoji od 4-cijanopiridina, dihlorometana, trifluoroacetatne kiseline, trifluoroetanola i vode.

[0087] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za prekrivanje je u rastvoru koji se sastoji od etilmorfolina i metilpirolidinona.

[0088] U drugom otelotvorenju, sredstvo za prekrivanje je anhidrid kiseline.

[0089] U još jednom otelotvorenju, anhidrid kiseline je benzojev anhidrid.

[0090] U još jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (VIII), jedinjenje (C) i jedinjenje (F) su, nezavisno, u rastvoru koji se sastoji od etilmorfolina i dimetilimidazolidinona.

[0091] U drugom otelotvorenju, sredstvo za cepanje se sastoji od ditiotreitola i 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en.

4

[0092] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za cepanje je u rastvoru koji se sastoji od N-metil-2-pirolidona.

[0093] U još jednom otelotvorenju, sredstvo za deprotekciju obuhvataNH3.

[0094] U drugom otelotvorenju, sredstvo za deprotekciju je u vodenom rastvoru.

[0095] U još jednom otelotvorenju, medijum nosač se sastoji od polistirena sa 1% umreženog divinilbenzena.

[0096] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (C) je formule (C1):

[0097] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (V) je formule (Va):

4

pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0098] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (F) je formule (F1):

[0099] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (VII) je formule (VIIa):

pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0100] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (VIII) je formule (VIlla):

4

pri čemu je R<2>, nezavisno za svako jedinjenje formule (VIIIa), izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0101] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (IX) je formule (IXa):

4

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač, a R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od:

, i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0102] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (X) je formule (Xa):

1

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0103] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (XI) je formule (XIa):

2

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od:

i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0104] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (VI) je formule (VIa):

pri čemu je R<1>medijum nosač.

4

[0105] U još jednom otelotvorenju, oligomerno jedinjenje formule (E) je oligomerno jedinjenje formule (XII):

[0106] U drugom otelotvorenju, pod uslovom da je ovde jedinjenje formule (A1):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

svaki R<1>je nezavisno medijum nosač; a

svaki R<3>je nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil.

[0107] U drugom otelotvorenju, pod uslovom da je ovde jedinjenje formule (A3):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

svaki R<1>je nezavisno medijum nosač; a

[0108] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (A5):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač, R<3>se bira iz grupe koja se sastoji od tritila, monometoksitrila, dimetoksitrila i trimetoksitrila, a R<4>se bira iz grupe koja se sastoji od:

[0109] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje formule (A5) je formule (A5a):

[0110] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (V):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0111] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje formule (V) je formule (Va):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0112] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (V):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0113] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje formule (VI) je formule (VIa):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0114] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (VII):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0115] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje formule (VII) je formule (VIIa):

1

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač.

[0116] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (IX):

2

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

R<1>je medijum nosač, a

R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od:

i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0117] U jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (IX) je formule (IXa):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač, a

4

R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od:

i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0118] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (A9):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40;

R<1>je medijum nosač;

R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; i R<4>se, nezavisno za svaku pojavu, bira iz grupe koju čine:

[0119] U jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (A9) je formule (A9a):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40;

R<1>je medijum nosač;

[0120] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (A9) je formule (IX), prikazano gore.

[0121] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (X):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>medijum nosač, a

R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od:

i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0122] U jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (X) je formule (Xa):

i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0123] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (A10):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40;

R<1>je medijum nosač;

1

�

[0124] U jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (A10) je formule (A10a):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40;

R<1>je medijum nosač;

[0125] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (A10) je formule (X), prikazano gore.

[0126] U drugom otelotvorenju ovih jedinjenja, medijum nosač se sastoji od polistirena sa 1% umreženog divinilbenzena.

[0127] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (XI):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od:

4

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0128] U jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (XI) je formule (XIa):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je

R<2>, nezavisno pri svakom pojavljivanju, izabran iz grupe koju čine:

i

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

[0129] U drugom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje formule (A11):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40;

R<1>je medijum nosač;

[0130] U jednom otelotvorenju, jedinjenje formule (A11) je formule (A11a):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

n je ceo broj od 10 do 40;

R<1>je medijum nosač;

[0131] U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (A11) je formule (XI), prikazano gore.

Oligomeri

[0132] Važna svojstva podjedinica zasnovanih na morfolinu uključuju: 1) sposobnost da budu povezane u oligomernom obliku stabilnim, nenaelektrisanim ili pozitivno naelektrisanim okosnim vezama; 2) sposobnost da podrže nukleotidnu bazu (npr. adenin, citozin, guanin, timidin, uracil, 5-metil-citozin i hipoksantin) tako da se formirani polimer može hibridizovati sa komplementarno-baznom ciljnom nukleinskom kiselinom, uključujući ciljnu RNK; 3) sposobnost oligomera da se aktivno ili pasivno transportuje u ćelije sisara; i 4) sposobnost oligomera i oligomer:RNK heterodupleksa da se odupru razgradnji RNK i RNK H, respektivno.

[0133] U nekim otelotvorenjima, antisenzivni oligomeri sadrže modifikacije baze ili supstitucije. Na primer, određene nukleo-baze se mogu izabrati za povećanje afiniteta vezivanja antisenzivnih oligomera opisanih u ovom dokumentu. Pokazalo se da supstitucije 5-metilcitozina povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0,6-1,2°C i mogu se inkorporirati u antisens oligomere opisane u ovom dokumentu. U jednom otelotvorenju, najmanje jedna pirimidinska baza oligomera sadrži 5-supstituisanu pirimidinsku bazu, pri čemu je pirimidinska baza izabrana iz grupe koja se sastoji od citozina, timina i uracila. U jednom otelotvorenju, 5-supstituisana pirimidinska baza je 5-metilcitozin. U drugom otelotvorenju, najmanje jedna purinska baza oligomera sadrži hipoksantin.

[0134] Oligomeri na bazi morfolina (uključujući antisens oligomere) su detaljno opisani, na primer, u američkim patentima br.

5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,185,444, 5,521,063, 5,506,337, 8,2 99,206, i 8,076,476, publikaciji međunarodne prijave patenta br. WO 2009/064471 i WO 2012/043730, i Summerton et al. (1997, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-195).

[0135] Oligomerna jedinjenja obelodanjivanja mogu imati asimetrične centre, hiralne ose i hiralne ravni (kao što je opisano, na primer, u: E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereo-chemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190, i March, J. , Advanced Organic Chemistry, 3d. Ed., Chap.4, John Wiley & Sons, New York (1985)), i mogu se pojaviti kao racemati, racemske smeše i kao pojedinačni dijastereomeri, sa svim mogućim izomerima i njihovim smešama, uključujući optičke izomere. Oligomerna jedinjenja ovde posebno pomenutog obelodanjivanja, bez ikakvih naznaka njegove stereohemije, imaju za cilj da predstavljaju sve moguće izomere i njihove smeše.

[0136] Konkretno, bez želje da budu vezani bilo kojom određenom teorijom, oligomerna jedinjenja obelodanjivanja se pripremaju, kao što je ovde razmatrano, iz aktiviranih morfolino podjedinica, uključujući takve neograničavajuće primere kao što je jedinjenje formule (VIII):

pri čemu se R<2>, nezavisno za svako jedinjenje formule (VIII), bira iz grupe koja se sastoji od:

1

[0137] Svako od gorenavedenih jedinjenja formule (VIII), može se pripremiti, na primer, iz odgovarajućeg beta-D-ribofuranozila kao što je prikazano u nastavku:

Videti Summerton et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.7:187-195 (1997). Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, stereohemija dva hiralna ugljenika se zadržava pod sintetičkim uslovima tako da se može proizvesti niz mogućih stereo izomera svake morfolino podjedinice na osnovu izbora, na primer, alfa-L-ribofuranozil, alfa-D-ribofuranozil, beta-L-ribofuranozil ili beta-D-ribofuranozil početnog materijala.

[0138] Na primer, u nekim otelotvorenjima, jedinjenje formule (VIII) obelodanjivanja može biti formule (Villa):

pri čemu je R<2>, nezavisno za svako jedinjenje formule (Villa), izabran iz grupe koja se sastoji od:

2

[0139] Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, inkorporacija 10 do 40 jedinjenja formule (VIII), na primer, u oligomerno jedinjenje obelodanjivanja može rezultirati brojnim mogućim stereo izomerima.

[0140] Bez želje da budu vezani bilo kojom određenom teorijom, oligomerna jedinjenja obelodanjivanja obuhvataju jednu ili više intersubjedinica koje sadrže fosfor, koje stvaraju hiralni centar na svakom fosforu, od kojih je svaka označena kao „Sp“ ili „Rp“ konfiguracija kako je shvaćeno u struci. Bez želje da bude vezana bilo kojom određenom teorijom, ova hiralnost stvara stereoizomere, koji imaju identičan hemijski sastav, ali različit trodimenzionalni raspored svojih atoma.

[0141] Bez želje da bude vezan bilo kojom određenom teorijom, konfiguracija svake fosforne intersubunitne veze se javlja nasumično tokom sinteze, na primer, oligomernih jedinjenja obelodanjivanja. Bez želje da bude vezan bilo kojom određenom teorijom, proces sinteze generiše eksponencijalno veliki broj stereoizomera oligomernog jedinjenja obelodanjivanja jer se oligomerna jedinjenja obelodanjivanja sastoje od brojnih fosfornih intersubunitnih veza - pri čemu svaka fosforna intersubunitna veza ima slučajnu hiralnu konfiguraciju. Konkretno, bez želje da bude vezan bilo kojom određenom teorijom, svaka intersubunitna veza dodatne morfolino podjedinice udvostručuje broj stereoizomera proizvoda, tako da je konvencionalna priprema oligomernog jedinjenja otkrivanja u stvari visoko heterogena smeša 2<N>stereoizomera, gde N predstavlja broj fosfornih intersubunitnih veza.

[0142] Stoga, osim ako nije drugačije naznačeno, svi takvi izomeri, uključujući dijastereomerne i enantiomerne smeše, i čisti enantiomeri i dijastereomeri su uključeni, kao što je, na primer, kada je jedna ili više veza iz jednog ili više stereo centara označena sa „-“ ili „∼∼“ ili ekvivalentom kako bi se razumelo u struci.

[0143] Tabela 1 prikazuje različita otelotvorenja morfolino podjedinica predviđenih u ovde opisanim procesima.

4

PRIMERI

[0144] Primeri su navedeni u nastavku u svrhu ilustracije i opisivanja određenih specifičnih otelotvorenja obelodanjivanja. Međutim, obim patentnih zahteva ne sme ni na koji način biti ograničen primerima navedenim u ovom dokumentu. Definicije varijabli u strukturama u šemama ovde su srazmerne onima odgovarajućih pozicija u formulama predstavljenim ovde.

Primer 1: Sinteza NCP2 sredstva za sidrenje

1. Priprema metil 4-fluoro-3-nitrobenzoata (1)

[0146] U tikvicu od 100l napunjeno je 12,7 kg 4-fluoro-3-nitrobenzojeve kiseline, a dodato je 40 kg metanola i 2,82kg koncentrovane sumporne kiseline. Smeša je mešana na refluksu (65°C) 36 sati. Reakciona smeša je ohlađena na 0°C. Kristali formirani na 38°C. Smeša je držana na 0°C tokom 4 sata, a zatim filtrirana pod azotom. Tikvica od 100l je oprana i filter kolač je opran sa 10kg metanola koji je ohlađen na 0°C. Čvrsti filter kolač je sušen na levku 1 sat, prebačen u posude i osušen u vakuumskoj rerni na sobnoj temperaturi do konstantne težine od 13,695kg metil 4-fluoro-3-nitrobenzoata (100% prinos; HPLC 99%).

2. Priprema 3-nitro-4-(2-oksopropil)benzojeve kiseline

A. (Z) -metil 4-(3-hidroksi-1-metoksi-1-oksobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat (2)

[0147]

[0148] U tikvicu od 100l napunjeno je 3,98kg metil 4-fluoro-3-nitrobenzoata (1) iz prethodnog koraka 9,8 kg DMF, 2,81kg metil acetoacetata. Smeša je mešana i ohlađena na 0°C. Ovome je dodato 3,66kg DBU tokom oko 4 sata dok je temperatura održavana na ili ispod 5°C. Smeša je mešana dodatnih 1 sat. U reakcionu tikvicu je dodat rastvor od 8,15 kg limunske kiseline u 37,5 kg prečišćene vode, dok je temperatura reakcije održavana na ili ispod 15°C. Nakon dodavanja, reakciona smeša je mešana dodatnih 30 minuta, a zatim filtrirana pod azotom. Mokri filter kolač je vraćen u tikvicu od 100l zajedno sa 14,8kg prečišćene vode. Suspenzija je mešana 10 minuta, a zatim filtrirana. Mokri kolač je ponovo vraćen u tikvicu od 100l, razmućen sa 14,8kg prečišćene vode tokom 10 minuta i filtriran u sirovi (Z)-metil 4-(3-hidroksi-1-metoksi-1-oksobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat.

B. 3-nitro-4- (2-oksopropil)benzojeva kiselina

[0150] Sirovi (Z)-metil 4-(3-hidroksi-1-metoksi-1-oksobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat je napunjen u reakcionu tikvicu od 100l pod azotom. Tome je dodato 14,2kg 1,4-dioksana i promešano. Smeši je dodat rastvor od 16,655kg koncentrovanog HCl i 13,33kg prečišćene vode (6M HCl) tokom 2 sata dok je temperatura reakcione smeše održavana ispod 15°C. Kada je dodavanje završeno, reakciona smeša je zagrevana na refluksu (80°C) tokom 24 sata, ohlađena na sobnu temperaturu i filtrirana pod azotom. Čvrsti filter kolač je trituriran sa 14,8kg prečišćene vode, filtriran, ponovo trituriran sa 14,8kg prečišćene vode i filtriran.

Čvrsta materija je vraćena u tikvicu od 100l sa 39,9kg DCM i refluksovana uz mešanje od 1 sat. Dodato je 1,5kg prečišćene vode za rastvaranje preostalih čvrstih materija. Donji organski sloj je podeljen na prethodno zagrejanu tikvicu od 72l, a zatim vraćen u čistu suvu tikvicu od 100l. Rastvor je ohlađen na 0°C, držan 1 sat, zatim filtriran. Čvrsti filter kolač je dva puta opran rastvorom od 9,8kg DCM i 5kg heptana, a zatim osušen na levku. Čvrsta materija je prebačena u posude i osušena do konstantne težine od 1,855kg 3-nitro-4-(2-oksopropil)benzojeve kiseline. Ukupni prinos 42% iz jedinjenja 1. HPLC 99,45%.

3. Priprema N-tritilpiperazin sukcinata (NTP)

[0152] U tikvicu sa omotačem od 72l napunjena je pod azotom sa 1,805kg trifenilmetil hlorida i 8,3 kg toluena (TPC rastvor). Smeša je mešana dok se čvrste materije nisu rastvorile. Reakcionoj tikvici sa omotačem od 100l dodato je 5,61kg piperazina, 19,9 kg toluena i 3,72kg metanola. Smeša je mešana i ohlađena na 0°C. U ovo je polako dodavan TPC rastvor u delovima tokom 4 sata dok se temperatura reakcije održavala na ili ispod 10°C. Smeša je mešana 1,5 sat na 10°C, zatim je ostavljena da se zagreje na 14°C. 32,6kg prečišćene vode je napunjeno u tikvicu od 72l, zatim je prebačeno u tikvicu od 100l dok je unutrašnja temperatura serije održavana na 20+/-5°C. Slojevi su ostavljeni da se razdvoje i donji vodeni sloj je odvojen i uskladišten. Organski sloj je ekstrahovan tri puta sa po 32kg prečišćene vode, a vodeni slojevi su razdvojeni i kombinovani sa uskladištenim vodenim rastvorom.

[0153] Preostali organski sloj je ohlađen na 18°C i rastvor 847g jantarne kiseline u 10,87kg prečišćene vode je polako dodavan u delovima u organski sloj. Smeša je mešana 1,75 sati na 20+/-5°C. Smeša je filtrirana, a čvrste materije su isprane sa 2kg TBME i 2kg acetona, a zatim osušene na levku. Filter kolač je trituriran dva puta sa po 5,7kg acetona i filtriran i ispran sa 1kg acetona između trituracija. Čvrsta materija je osušena na levku, zatim prebačena u posude i osušena u vakuumskoj rerni na sobnoj temperaturi do konstantne težine od 2,32kg NTP. Prinos 80%.

4. Priprema (4-(2-hidroksipropil)-3-nitrofenila)(4-tritilpiperazin-1-il)metanona A.

Priprema 1-(2-nitro-4(4-Tritilpiperazin-1-karbonil)fenil)propan-2-ona

[0155] U tikvicu sa omotačem od 100l napunjeno je 2kg 3-nitro-4-(2-oksopropil)benzojeve kiseline (3), 18,3kg DCM, 1,845kg N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorida (EDC.HCl). Rastvor je mešan dok se nije formirala homogena smeša. 3.048kg NTP je dodato tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi i mešano 8 sati. U reakcionu smešu je dodato 5,44kg prečišćene vode i mešano 30 minuta. Slojevi su ostavljeni da se odvoje i donji organski sloj koji sadrži proizvod je isušen i uskladišten. Vodeni sloj je ekstrahovan dva puta sa 5,65kg DCM. Kombinovani organski slojevi oprani su rastvorom 1,08kg natrijum hlorida u 4,08kg prečišćene vode. Organski slojevi su osušeni preko 1.068kg natrijum sulfata i filtrirani.

Natrijum sulfat je ispran sa 1,3kg DCM. Kombinovani organski slojevi su razblaženi sa 252g silikagela i filtrirani kroz levak filtera koji sadrži sloj od 252g silikagela. Krevet od silikagela je ispran sa 2kg DCM. Kombinovani organski slojevi su isparili na rotovapu.4,8kg THF je dodato u ostatak, a zatim ispario na rotovapu dok nije dostignuto 2,5 zapremine sirovog 1-(2-nitro-4 (4-tritilpiperazin-1-karbonil)fenil)propan-2-ona u THF.

B. Priprema (4-(2-hidroksipropil)-3-nitrofeniI)(4-tritilpiperazin-1-il)metanona (5)

[0156]

[0157] U tikvicu sa omotačem od 100l napunjeno je pod azotom 3600g jedinjenja 4 iz prethodnog koraka i 9800g THF. Mešani rastvor je ohlađen na ≤5°C. Rastvor je razblažen sa 11525 g etanola i 194g natrijum borohidrida je dodato tokom oko 2 sata na ≤5°C. Reakciona smeša je mešana dodatna 2 sata na ≤5°C. Reakcija je ugašena rastvorom oko 1,1kg amonijum hlorida u oko 3kg vode sporim dodavanjem kako bi se održala temperatura na ≤10°C.

Reakciona smeša je mešana dodatnih 30 minuta, filtrirana da bi se uklonili neorganski sastojci i napunjena u tikvicu sa omotačem od 100l i ekstrahovana sa 23kg DCM. Organski sloj je odvojen a vodeni sloj je ekstrahovan dva puta više sa po 4,7kg DCM. Kombinovani organski slojevi oprani su rastvorom od oko 800g natrijum hlorida u oko 3kg vode, a zatim osušeni preko 2,7kg natrijum sulfata. Suspenzija je filtrirana i filter kolač je ispran sa 2kg DCM. Kombinovani filtrati su koncentrovani do 2,0 zapremine, razblaženi sa oko 360g etil acetata i isparili. Sirovi proizvod je napunjen na kolonu silikagela od 4kg silicijuma upakovanog sa DCM pod azotom i eluiran sa 2,3kg etil acetata u 7,2kg DCM. Kombinovane frakcije su isparile, a ostatak je preuzet u 11,7kg toluena. Rastvor toluena je filtriran i filter kolač je ispran dva puta sa po 2kg toluena. Filter kolač je osušen do konstantne težine od 2,275kf jedinjenja 5 (46% prinosa iz jedinjenja 3) HPLC 96,99%.

5. Priprema 2,5-dioksopirolidin-1-il (1-(2-nitro-4-(4-trifenilmetilpiperazin-1-karbonil)fenil) propan-2-il) karbonata (NCP2 sredstvo za sidrenje)

[0158]

[0159] TU tikvicu sa omotačem od 100l pod azotom je napunjeno 4,3 kg jedinjenja 5 (težina prilagođena na osnovu rezidualnog toluena H<1>NMR; svi reagensi ovde nakon toga su skalirani u skladu sa tim) i 12,7kg piridina. Na ovo je napunjeno 3,160kg DSC (78,91 težinskog % po H<1>NMR) dok je unutrašnja temperatura održavana na ≤35°C. Reakciona smeša je odležala oko 22 sata u ambijentu, a zatim filtrirana. Filter kolač je ispran sa 200g piridina. U dve serije od kojih svaka sadrži 1⁄2 zapremine filtrata, ispiranje filtratom se polako puni u tikvicu sa omotačem od 100l koja sadrži rastvor od oko 11kg limunske kiseline u oko 50 kg vode i meša 30 minuta kako bi se omogućila čvrsta precipitacija. Čvrsta materija je sakupljena filterskim levkom, isprana dva puta sa 4,3kg vode po pranju i osušena na filterskom levku pod vakuumom.

Kombinovane čvrste materije su napunjene u tikvicu sa omotačem od 100l i rastvorene u 28 kg DCM i isprane rastvorom 900g kalijum karbonata u 4,3kg vode. Nakon 1 sata, slojevi su ostavljeni da se odvoje i vodeni sloj je uklonjen. Organski sloj je ispran sa 10kg vode, izdvojen i osušen preko 3,5kg natrijum sulfata. DCM je filtriran, isparen i osušen pod vakuumom do 6,16kg NCP2 sredstva za sidrenje (114% prinos).

Primer 2: Sinteza smole sa sredstvom za sidrenje

[0160] Reaktoru za sintezu čvrste faze od 75l sa teflonskim zapornim ventilom napunjeno je oko 52l NMP i 2300g aminometil polistirenske smole. Smola je mešana u NMP-u da nabubri oko 2 sata, a zatim drenirana Smola je isprana dva puta sa oko 4l DCM po pranju, zatim dva puta sa 39l rastvorom za neutralizaciju po pranju, zatim dva puta sa 39l DCM po pranju. NCP2 rastvor za sidrenje je polako dodavan u rastvor smole za mešanje, mešan 24 sata na sobnoj temperaturi i dreniran. Smola je isprana četiri puta sa 39l NMP po pranju, i šest puta sa 39l DCM po pranju. Smola je tretirana i mešana sa 1⁄2 DEDC rastvora za prekrivanje u trajanju od 30 minuta, drenirana i tretirana i mešana sa 2. 1⁄2 DEDC rastvora za prekrivanje u trajanju od 30 minuta i drenirana. Smola je isprana šest puta sa 39l DCM po pranju, a zatim osušena u rerni do konstantne težine od 3573,71g smole sa sredstvom za sidrenje.

Primer 3: Priprema aktiviranog EG3 repa (videti sl. [2])

1. Priprema tritil piperazin fenil karbamata 35

[0162] Ohlađenoj suspenziji NTP u dihlorometanu (6 ml/g NTP) dodat je rastvor kalijum karbonata (3,2 eq) u vodi (4 ml/g kalijum karbonata). Ovoj dvofaznoj smeši je polako dodat rastvor fenil hloroformata (1,03 eq) u dihlorometanu (2 g/g fenil hloroformata). Reakciona smeša je zagrejana na 20° C. Po završetku reakcije (1-2 sata), slojevi su razdvojeni. Organski sloj je ispran vodom i osušen preko bezvodnog kalijum karbonata. Proizvod 35 je izolovan kristalizacijom iz acetonitrila. Prinos=80%

2. Priprema karbamatnog alkohola 36

[0164] Natrijum hidrid (1,2 eq) je suspendovan u 1-metil-2-pirolidinonu (32 ml/g natrijum hidrida). Ovoj suspenziji su dodati trietilen glikol (10,0 eq) i jedinjenje 35 (1,0 eq). Dobijena kaša je zagrejana na 95°C. Po završetku reakcije (1-2 sata), smeša je ohlađena na 20°C. Ovoj smeši je dodat 30% dihlorometan/metil terc-butil etar (v:v) i voda. Organski sloj koji sadrži proizvod je sukcesivno ispran vodenim NaOH, vodenom jantarnom kiselinom i zasićenim vodenim natrijum hloridom. Proizvod 36 je izolovan kristalizacijom iz dihlorometana/metil terc-butil etra/heptana. Prinos=90%.

3. Priprema EG3 repne kiseline 37

[0165]

[0166] Rastvoru jedinjenja 36 u tetrahidrofuranu (7 ml/g 36) dodat je anhidrid jantarne kiseline (2,0 eq) i DMAP (0,5 eq). Smeša je zagrejana na 50°C. Po završetku reakcije (5 sati), smeša je ohlađena na 20°C i podešena na pH 8,5 vodenim NaHCO3. Dodat je metil tercbutil eter, a proizvod je ekstrahovan u vodeni sloj. Dodat je dihlorometan, a smeša je podešena na pH 3 vodenom limunskom kiselinom. Organski sloj koji sadrži proizvod ispran je smešom pH=3 citratnog pufera i zasićenog vodenog natrijum hlorida. Ovaj rastvor dihlorometana jedinjenja 37 je korišćen bez izolacije u pripremi jedinjenja 38.

1

4. Priprema aktiviranog EG3 repa 38

[0167]

[0168] Rastvoru jedinjenja 37 je dodat N-hidroksi-5-norbornen-2,3-dikarboksilna kiselina imid (HONB) (1,02 ekv), 4-dimetilaminopiridin (DMAP) (0,34 eq), a zatim 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDC) (1,1 eq). Smeša je zagrejana na 55°C. Po završetku reakcije (4-5 sati), smeša je ohlađena na 20°C i sukcesivno isprana sa 1: 1 0,2 M limunskom kiselinom/slanim rastvorom i slanim rastvorom. Rastvor dihlorometana je podvrgnut razmeni rastvarača sa acetonom, a zatim sa N,N-dimetilformamidom, a proizvod je izolovan taloženjem iz acetona/N,N-dimetilformamida u zasićeni vodeni natrijum hlorid. Sirovi proizvod je nekoliko puta ponovo pomešan sa vodom da bi se uklonili rezidualni N,N-dimetilformamid i soli. Prinos=70% aktiviranog EG3 repa 38 iz jedinjenja 36.

Primer 4: Sinteza 50l čvrste faze

sirove lekovite supstance Eteplirsen [oligomerno jedinjenje (XII)]

1. Materijali

[0169]

Tabela 2: Polazni materijali

2

Hemijske strukture polaznih materijala:

[0170]

1. A. Aktivirani EG3 rep

2. B. Aktivirana C podjedinica (za pripremu videti američki patent br.8,067,571)

4

5.E. Aktivirana T podjedinica (za pripremu videti WO 2013/082551)

6.F. Smola sa sredstvom za sidrenje

pri čemu je R<1>medijum nosač.

Tabela 3: Opis rastvora za oligomernu sintezu čvrste faze sirove lekovite supstance

Eteplirsen

2. Sinteza Eteplirsen sirove lekovite supstance

A. Oticanje smole

[0171] 750 g smole sa sredstvom za sidrenje i 10,5l NMP napunjeni su u silanizovani reaktor od 50l i mešani 3 sata. NMP je dreniran i smola sa sredstvom za sidrenje je isprana dva puta sa po 5,5l DCM i dva puta sa 5,5l sa po 30% TFE/DCM.

B. Ciklus 0: Spajanje EG3 repa

[0172] Smola sa sredstvom za sidrenje je isprana tri puta sa po 5,5l 30% TFE/DCM i drenirana, isprana sa 5,5l CYFTA rastvora tokom 15 minuta i drenirana, i ponovo isprana sa 5,5l CYTFA rastvora tokom 15 minuta bez dreniranja na šta je napunjeno 122 ml 1:1 NEM/DCM i suspenzija je mešana 2 minuta i drenirana. Smola je dva puta isprana sa 5,5l rastvora za neutralizaciju tokom 5 minuta i drenirana, zatim dva puta sa po 5,5l DCM i drenirana. Rastvor od 706,2g aktiviranog EG3 repa (MW 765,85) i 234ml NEM u 3l DMI napunjen je u smolu i mešan 3 sata na sobnoj temperaturi i dreniran. Smola je isprana dva puta sa po 5,5l rastvora za neutralizaciju u trajanju od 5 minuta po svakom pranju, i jednom sa 5,5l DCM i drenirana. Rastvor od 374,8g benzoičnog anhidrida i 195 ml NEM u 2680ml NMP je napunjen i mešan 15 minuta i dreniran. Smola je mešana sa 5,5l rastvora za neutralizaciju 5 minuta, zatim isprana jednom sa 5,5l DCM i dva puta sa 5,5l 30% TFE/DCM. Smola je suspendovana u 5,5l 30% TFE/DCM i držana 14 sati.

C. Ciklusi spajanja podjedinica 1-30

i. Tretmani pre spajanja

[0173] Pre svakog ciklusa spajanja kao što je opisano u tabeli 4, smola je: 1) isprana sa 30% TFE/DCM; 2) a) tretirana CYTFA rastvorom 15 minuta i drenirana, i b) tretirana CYTFA rastvorom 15 minuta kome je dodat 1: 1 NEM/DCM, promešana i drenirana; 3) mešana tri puta sa rastvorom za neutralizaciju; i 4) dva puta isprana sa DCM. Videti tabelu 4.

ii. Tretmani nakon spajanja

[0174] Nakon što je svaki rastvor podjedinice isušen kako je opisano u tabeli 4, smola je: 1) isprana sa DCM; i 2) isprana dva puta sa 30% TFE/DCM. Ako je smola zadržana u vremenskom periodu pre sledećeg ciklusa spajanja, drugo TFE/DCM pranje nije drenirano i smola je zadržana u navedenom TFE/DCM rastvoru za pranje. Videti tabelu 4.

iii. Ciklusi spajanja aktiviranih podjedinica

[0175] Ciklusi spajanja su izvedeni kako je opisano u tabeli 4.

iv. Završno IPA ispiranje

[0176] Nakon što je izvršen poslednji korak spajanja kao što je opisano u tabeli 4, smola je isprana 8 puta sa po 19,5l IPA i sušena pod vakuumom na sobnoj temperaturi oko 63,5 sati do osušene težine od 5.579,8g.

C. Cepanje

[0177] Gorenavedena Eteplirsen sirova lekovita supstanca vezana za smolu podeljena je u dve serije, a svaka serija je tretirana na sledeći način. Lot smole od 2.789,9g je: 1) mešan sa 10l NMP tokom 2 sata, zatim je NMP dreniran; 2) tri puta ispran sa 10l 30% TFE/DCM; 3) tretiran sa 10l CYTFA rastvora tokom 15 minuta; i 4) 10l CYTFA rastvora tokom 15 minuta u koji je zatim dodato 130ml 1:1 NEM/DCM i mešano 2 minuta i drenirano. Smola je tretirana tri puta sa po 10l rastvora za neutralizaciju, isprana šest puta sa 10l DCM i osam puta sa po 10l NMP. Smola je tretirana rastvorom za cepanje od 1530,4g DTT i 2980 DBU u 6,96l NMP tokom 2 sata da bi se odvojila Eteplirsen sirova lekovita supstanca od smole. Rastvor za cepanje je dreniran i zadržan u posebnoj posudi. Reaktor i smola su isprani sa 4,97l NMP koji je kombinovan sa rastvorom za cepanje.

�

11

D. Deprotekcija

[0178] Kombinovani rastvor za cepanje i NMP ispiranje prebačeni su u posudu pod pritiskom u koju je dodato 39,8l NH4OH (NH3•H2O) koja je ohlađena na temperaturu od - 10° do -25°C u zamrzivaču. Posuda pod pritiskom je zaptivena i zagrejana na 45°C tokom 16 sati, a zatim ostavljena da se ohladi na 25°C. Ovaj rastvor za deprotekciju koji sadrži sirovu lekovitu supstancu Eteplirsen razblažen je 3:1 prečišćenom vodom i pH podešenim na 3,0 sa 2M fosfornom kiselinom, a zatim na pH 8,03 sa NH4OH. HPLC (C18) 73-74% (slika 1).

1 2

Tabela 5. Podaci sa slike 1

Primer 5: Prečišćavanje Eteplirsen sirove lekovite supstance

[0179] Rastvor za deprotekciju iz primera 2, deo D, koji sadrži sirovu lekovitu supstancu Eteplirsen, ubačen je u kolonu ToyoPearl Super-Q 650S anjonske izmenjivačke smole (Tosoh Bioscience) i eluiran sa gradijentom od 0-35% B preko zapremine 17 kolona (pufer A: 10 mM natrijum hidroksida; pufer B: 1 M natrijum hlorida u 10 mM natrijum hidroksida) i frakcije prihvatljive čistoće (C18 i SCX HPLC) su objedinjene u prečišćeni rastvor leka. HPLC (slika 2): 97.74% (C18) 94.58% (SCX).

1

[0180] Prečišćeni rastvor lekovite supstance je desalinizovan i liofilizovan do 1959g prečišćene lekovite supstance Eteplirsen. Prinos 61,4%; HPLC (slika 3): 97.7% (C18) 94.6% (SCX).

Tabela 6. Podaci sa slike 2

Tabela 7. Podaci sa slike 3

Tabela 8. Akronimi

1 4

1

Claims

Patentni zahtevi 1. Proces pripreme oligomernog jedinjenja formule (E):

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu se proces sastoji od sekvencijalnih koraka: (a) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A1):

pri čemu je R<1>medijum nosač, a R<3>je izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; sa deblokirajućim sredstvom za formiranje jedinjenja formule (II):

pri čemu je R<1>medijum nosač; (b) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (II) sa jedinjenjem formule (A2):

pri čemu je R<3>izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; da bi se formiralo jedinjenje formule (A3):

pri čemu je R<1>medijum nosač, a R<3>je izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; (c) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A3) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (IV): 1

pri čemu je R<1>medijum nosač; (d) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (IV) sa jedinjenjem formule (A4):

pri čemu je R<3>izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je:

da bi se formiralo jedinjenje formule (A5):

1 pri čemu je R<1>medijum nosač, R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je:

; (e) vršenja 29 iteracija sekvencijalnih koraka: (e1) dovođenja u kontakt proizvoda formiranog neposrednim prethodnim korakom sa sredstvom za deblokiranje; i (e2) dovođenja u kontakt jedinjenja formiranog neposrednim prethodnim korakom sa

jedinjenjem formule (A8):

pri čemu je R<3>izabran iz grupe koja se sastoji od tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:

1

da bi se formiralo jedinjenje formule (A9):

pri čemu je n 30, R<1>je medijum nosač, R<3>je izabran iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koju čine:

11

(f) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A9) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (A10):

pri čemu je n 30, R<1>je medijum nosač, a R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:

(g) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A10) sa sredstvom za cepanje da bi se formiralo jedinjenje formule (A11):

pri čemu je n 30, a R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:

(h) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (A11) sa sredstvom za deprotekciju da bi se formiralo oligomerno jedinjenje formule (E).
2. Proces iz patentnog zahteva 1, pri čemu je jedinjenje formule (A4) od formule (A4a):

pri čemu: R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je:

11
3. Proces iz patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu je jedinjenje formule (A5) od formule (A5a):

pri čemu: R<1>je medijum nosač, R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je:
4. Proces iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, pri čemu je jedinjenje formule (A8) od formule (A8a):

pri čemu: R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:
5. Proces iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, pri čemu je jedinjenje formule (A9) od formule (A9a): 11

pri čemu: n je 30, R<1>je medijum nosač, R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:
6. Proces iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, pri čemu je jedinjenje formule (A10) od formule (A10a):

pri čemu: n je 30, R<1>je medijum nosač, a R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od: 11
7. Proces iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je jedinjenje formule (A11) od formule (A11a):

pri čemu: n je 30, i R<4>je, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od: 11
8.Proces iz patentnog zahteva 1, pri čemu je oligomerno jedinjenje formule (E) oligomerno jedinjenje formule (XII):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 11
9. Proces iz patentnog zahteva 1, pri čemu se proces sastoji od sekvencijalnih koraka: (a) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (I):

pri čemu je R<1>medijum nosač, sa deblokirajućim sredstvom da bi se formiralo jedinjenje formule (II):

pri čemu je R<1>medijum nosač; (b) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (II) sa jedinjenjem (B):

da bi se formiralo jedinjenje formule (III): 12

pri čemu je R<1>medijum nosač; (c) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (III) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (IV):

pri čemu je R<1>medijum nosač; (d) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (IV) sa jedinjenjem formule (C):

da bi se formiralo jedinjenje formule (V):

pri čemu je R<1>medijum nosač; (e) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (V) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (VI):

pri čemu je R<1>medijum nosač; (f) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (VI) sa jedinjenjem formule (F):

da bi se formiralo jedinjenje formule (VII):

pri čemu je R<1>medijum nosač; (g) vršenja 28 iteracija sekvencijalnih koraka: (g1) dovođenja u kontakt proizvoda formiranog neposrednim prethodnim korakom sa sredstvom za deblokiranje; i 12 (g2) dovođenja u kontakt jedinjenja formiranog neposrednim prethodnim korakom sa

jedinjenjem formule (VIII):

pri čemu je R<2>, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:

pri čemu je, za svaku iteraciju od 1 do 28, R<2>:

da bi se formiralo jedinjenje formule (IX):

pri čemu je R<1>medijum nosač, pri čemu je R<2>, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:

, i 12 pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

(h) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (IX) sa sredstvom za deblokiranje da bi se formiralo jedinjenje formule (X):

pri čemu je R<1>medijum nosač, pri čemu je R<2>, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od: 12

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

(i) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (X) sa sredstvom za cepanje da bi se formiralo jedinjenje formule (XI): 12

pri čemu je R<2>, u zavisnosti od broja pozicije, izabran iz grupe koja se sastoji od:

i pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

12

i (j) dovođenja u kontakt jedinjenja formule (XI) sa sredstvom za deprotekciju da bi se formiralo oligomerno jedinjenje formule (E).
10. Jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od formule (A1):
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: svaki R<1>je nezavisno medijum nosač; a svaki R<3>je nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil.
12 11. Jedinjenje formule (A5):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: R<1>je medijum nosač; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; a R<4>se, nezavisno za svaku pojavu, bira iz grupe koju čine:

1

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: n je ceo broj od 10 do 40; R<1>je medijum nosač; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil; a R<4>se, nezavisno za svaku pojavu, bira iz grupe koju čine: 1 1
13. Jedinjenje iz patentnog zahteva 12, pri čemu je jedinjenje Formula (A9) formule (A9a): 1 2

pri čemu: n je ceo broj od 10 do 40, R<1>je medijum nosač, R<3>se bira iz grupe koju čine tritil, monometoksitritil, dimetoksitritil i trimetoksitritil, a R<4>je, nezavisno za svaku pojavu, izabran iz grupe koju čine:

1
14. Jedinjenje iz patentnog zahteva 12, pri čemu je jedinjenje Formula (A9) formule (IX):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: R<1>je medijum nosač, a R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od: 1 4

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

1
15. Jedinjenje iz patentnog zahteva 14, pri čemu je jedinjenje formule (IX) od formule (IXa):

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. R<1>je medijum nosač, a R<2>je, nezavisno pri svakoj pojavi, izabran iz grupe koja se sastoji od:

1

pri čemu je R<2>na svakoj poziciji od 1 do 30 i 5' do 3':

1