TR201900776T4 - Memeli hücre kültürlerinin hasadına ilişkin yöntem. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, memeli hücrelerinin kültürlenmesine ve rekombinant protein toplanmasına ilişkin yöntem ve materyaller sağlar.

Description

TARIFNAME MEMELI HÜCRE KÜLTÜRLERININ HASADINA ILISKIN YÖNTEM BULUS ALANI Mevcut bulus, memeli hücrelerinin kültürlenmesine ve rekombinant protein toplanmasina iliskin yöntem ve materyaller BULUSUN GEÇMISI Daha büyük miktarda terapötik rekombinant protein talebinde artis devam ettikçe, hücre canliligina ve protein geri kazanimina olumlu etkisi olan üretim hücre kültürlerinin yetistirilmesine, beslenmesine ve saglanmasina yönelik yöntem ve stratejiler basta olmak üzere proses optimizasyonuna yönelik büyük çaba harcanmaktadir. Rekombinant proteinlerin üretimine yönelik üretim proseslerinin gelistirilmesi, birçok degiskenin dengelenmesi gereken kompleks bir çalismadir. Bu özellikle, hücre kültürü prosesinin her elemaninin hasat 've akis asagi prosesleme seklinde üretimin sonraki asamalarina büyük etki ettigi akis yukari prosesler açisindan dogrudur. Tipik hücre kültürü, bir büyüme fazina girer ve bu faz, hücre yogunlugunun arttigi üstel gelisme periyodudur. Büyüme fazini, üstel hücre büyümesinin yavasladigi, protein üretiminin ise artmaya basladigi bir geçis asamasi takip eder. Bu, hücre yogunlugunun tipik olarak düzeldigi ve ürün titresinin arttigi duragan fazin, üretim fazinin baslangicini belirtir. Hücre kültürünün belirli sayida güne yönelik saglandigi ve söz konusu islemi tüm kültürün tek seferde toplanmasinin takip ettigi kesikli (batch) hasat sistemlerinde, hücre kültürü tipik olarak en yüksek verimine ulastiginda ürünün büyük bir kismi hasattan önce son birkaç günde üretilebillir. Bu, tekil yüksek titer hasadiyla sonuçlanabilir ancak pik üretime tekrar erisilmesi bir sonraki çalismayi baslatmaya yönelik verimsiz dönüs süresine ve gecikme süresine baglidir. Süzüntü içeren ürünün üretim fazi boyunca sürekli seklide hücre kültüründen hasat edildigi sürekli hasat sistemlerinde, hücre kültürü süresi uzatilir ancak bu, hasat ve purifikasyon asamalari boyunca islenecek düsük ürün titrelerine ve yüksek hacimde Hücre kültürü ve hasat prosesi gelisimi nihai olarak proses optimizasyonunda bir uygulama olup, ürün titresi ve ürün kalitesine yönelik isleme hizi gibi degiskenlerin alisverisidir. Söz konusu zorluklar örnegin hücre canliliginin saglanmasini,islenebilir bir ürün titresi elde edilmesini, hasat ve akis asagi proseslerde islenebileceklerle akis yukari proseslerin veriminin dengelenmesini içerir. Büyük ölçekli hücre kültürü proseslerinin maliyeti ve biyolojik ürünlere yönelik büyük miktarlara ve düsük maliyetlere iliskin artan talep bilindiginden rekombinant protein üretiminde ve gerikazanimindaki kademeli gelismeleri kanitlayan yeni proses yöntemleri dahi degerlidir. Hücre kültürü prosesinde daha büyük ürün gerikazanimi saglayan ve böylece protein terapötiklerinin üretimine iliskin maliyetleri azaltan iyilesmeler gereklidir. Mevcut bulus, protein gerikazanimini artirirken hücre kültürü süresine iliskin yöntemleri ve materyalleri saglayarak bu ihtiyaçlari karsilar. BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, bir biyoreaktörün rekombinant protein ifade eden memeli hücrelerine asilanmasiyla hücre kültürü olusturulmasi, yeni hücre kültürü ortaminin biyoreaktöre sivanmasiyla söz konusu hücre kültürünün saglanmasi, hücre kültürünün bir filtreden geçirilmesi ve süzüntünün hasat islemleriyle bir hücre kültürünün olusturulmasina iliskin uzatilmis periyodik hasada yönelik bir yöntem saglamakta olup, özelligi; bos süzüntünün baslangiçta önceden belirlenen birinci parametre elde edilene kadar toplanmasi, bu süre içinde önceden belirlenen bir süre için toplama süzüntüsü toplanmasi, ikinci önceden belirlenen parametre elde edilene kadar bos süzüntünün alternatif olarak hasat isleminin bu islemi takip etmesi, ardindan önceden belirlenen bir sürede toplama süzüntüsünün toplanmasi, hücre kültürü sonlandirilana kadar bos süzüntünün ve hasat edilen süzüntünün alternatif hasadinin devam etmesidir. Bir düzenlemeye göre önceden belirlenen parametre, zamandan, canli hücre yogunlugundan, sikistirilmis hücre hacminden veya titreden seçilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen birinci parametre, hücre kültürünün olusturulmasini müteakip en az 12 saat ile 25 gün arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen birinci parametre, hücre kültürünün olusturulmasini müteakip en az 24 ile 72 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen birinci parametre, hücre kültürünün olusturulmasini müteakip en az 4 gündür. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen birinci parametre, hücre kültürünün olusturulmasini müteakip en az 5 gün ya da daha uzundur. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen birinci parametre, hücre kültürünün olusturulmasini müteakip en az 25 gündür. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen birinci parametre, hücre kültürünün olusturulmasini müteakip en az 5 ile 25 gün arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen birinci parametre, hücre kültürünün olusturulmasini müteakip en az 10 ile 12 gün arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen ikinci parametre, hasat süzüntüsünün toplanmasini müteakip en az 12 ile 72 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen ikinci parametre, hasat süzüntüsünün toplanmasini müteakip en az 24 ile 72 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen ikinci parametre, hasat süzüntüsünün toplanmasini müteakip en az 24 ile 48 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen süre en az 12 ile 72 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen süre en az 24 ile 72 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen süre en az 24 ile 48 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre bos süzüntü, öncelikle 24 saat ila 25 gün süreyle toplanir, bu sürede 12 ila 72 saat süreyle hasat süzüntüsü toplanir, bu islemi müteakiben en az 24 saat ila 25 gün süreyle bos süzüntü alternatif olarak toplanir ve müteakiben 12 ila 72 saat süreyle hasat süzüntüsü toplanir. Bir düzenlemeye göre bos süzüntü toplandiginda, ilgili filtre biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip bir delikli fiber filtredir. Ilgili bir düzenlemeye göre moleküler agirlik siniri 300 kDa veya daha azdir. Ilgili bir düzenlemeye göre, delikli fiber filtre bir ultrafiltredir. Bir düzenlemeye göre hasat süzüntüsü toplandiginda, ilgili filtre biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip bir delikli fiber filtredir. Ilgili düzenlemeye göre moleküler agirlik siniri en az 500 kDa'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre, delikli fiber filtre bir mikrofiltredir. Bir düzenlemeye göre, söz konusu, filtre tek 'üniteli filtre sistemidir. Ilgili bir düzenlemeye göre, söz konusu tek üniteli filtre sistemi biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip en az bir delikli fiber filtre bileseni ile biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan bir gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip en az bir delikli fiber filtre bileseni ihtiva eder. Ilgili bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutan en az bir delikli fiber filtre bileseninin moleküler agirlik siniri 300 kDa veya daha azdir. Ilgili bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan en az bir delikli fiber filtre bileseninin moleküler` agirlik siniri en az 500 kDa'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant protein tutan en az bir delikli fiber filtre bileseni bir ultrafiltre olup, biyoreaktörde rekombinant. protein tutmayan en az bir delikli fiber filtre bileseni bir Inikrofiltredir. Ilgili bir düzenlemeye göre tek üniteli filtre sistemi bir muhafazada. bulunur. Ilgili bir düzenlemeye göre tek üniteli filtre sistemi ilaveten en az iki delikli fiber filtre bileseninin arasinda bir ara parça ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre bos süzüntü toplandiginda, biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip en az bir delikli fiber filtreden çekilir. Bir düzenlemeye göre hasat süzüntüsü toplandiginda, biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip en az bir delikli fiber filtre bileseninden çekilir. Bir düzenlemeye göre, süzüntü biyoreaktörde rekombinant proetini tutmayan bir gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip bir delikli fiber filtre seklinde bir filtreden toplandiginda yeni hücre kültürü ortami, en az 5 g/l non-iyonik blok kopolimerle formüle edilir veya buna erisecek sekilde tamamlanir. Ilgili bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer bir polioksipropilen-polioksietilen blok kopolimerdir. Ilgili bir düzenlemeye göre non-iyonik blok Bir düzenlemeye göre yukaridak yöntem ilaveten hücre kültürü prosesleri sirasinda numuneler` almayi, rekombinant proteinin ve/veya hücre kültürü prosesinin karakteristik özelliklerini kantitatif ve/Veya kalitatif olarak izlemek üzere numunelerin degerlendirilmesini ihtiva. eder. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu numuneler, proses analitik teknikleri kullanarak kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlenir. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, sürekli perfüzyondur. Bir düzenlemeye göre perfüzyon orani sabittir. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, günlük 1,0 çalisma hacminden az veya bu hacme esit bir hizda gerçeklestirilir. Bir düzenlemeye göre perfüzyona peristaltik pompa, çift diyaframli pompa, düsük kesmeli pompa veya alternatif teget akis eslik eder. Ilgili bir düzenlemeye göre perfüzyon, degisken teget geçisiyle sonlanir. Bir düzenlemeye göre, yukaridaki yöntem. ilaveten hücrelerin a) birinci zaman periyoduna yönelik birinci sicaklikta ve b) ikinci zaman periyoduna yönelik ikinci sicaklikta kültürlendigi bir sicaklik degisimine tabi tutulmasini ihtiva eder. Ilgili bir düzenlemeye göre, sicaklik degisimi büyüme faziyla üretim fazi arasinda geçiste gerçeklesir. Ilgili bir düzenlemeye göre sicaklik degisimi, üretim fazi sirasinda meydana gelir. Ilgili bir düzenlemeye göre sicaklik degisimi, Önceden belirlenen bir parametreye karsilik gerçeklesir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu sicaklik degisimi, önceden belirlenen bir parametreye karsilik olup, özelligi; önceden belirlenen parametrenin elde edilmesinin biyokütle probuna dayali bir kapasitans kullanilarak belirlenmesidir. Bir düzenlemeye göre hücre kültürü, biyoreaktörün en az 0,1 x 106 canli hücre/ml ile asilanmasiyla gerçeklestirilir. Ilgili bir\ düzenlemeye göre asi, alternatif teget akis filtrasyonu kullanilan bir perfüzyon prosesi yoluyla artirilmistir. Bir düzenlemeye göre biyoreaktöre giris öncesinde hücre kültürü ortami nanofiltrasyon, yüksek sicaklik kisa süre (HTST) veya filtrasyonla kombinasyon halinde UV kullanilarak islenir. Bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktör bir üretim biyoreaktörüdür. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az SOOL'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az 500L ila ZOOOL'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az lOOOL ila ZOOOL'dir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami serumsuz hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami serumsuz kimyasal tanimli hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami perfüzyon hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre memeli hücreleri Çin Hamsteri Over (CHO) hücreleridir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein bir insan antikoru, insanlastirilmis antikor, kimerik antikor, rekombinant füzyon proteini veya sitokin içeren gruptan seçilir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein, bir ya da daha fazla sayida flokülasyon, presipitasyon, santrifüjleme, derin filtrasyon, afinite kromatografisi, büyüklük dislanimli kromatografi, iyon degisimli kromatografi, karma› modlu anyon degisimli kromatografi, hidrofobik. etkilesimli kromatografisi ya da hidroksiapatit kromatografiyle hasat süzüntüsünden saflastirilir. Bir düzenlemeye göre yukarida belirtilen yöntem ilaveten purifikasyon prosesi sirasinda numune almayi, rekombinant proteinin ve purifikasyon prosesinin karakteristik özelliklerinin kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlenmesi amaciyla numunelerin degerlendirilmesini ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein, farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyona formüle edilir. Bir düzenlemeye göre yukaridaki yöntemle üretilen bir rekombinant protein saglanir. Mevcut bulusta ayrica bir rekombinant proteinin hasadina iliskin bir rekombinant proteini belirten memeli hücreleriyle biyoreaktörün asilanmasi yoluyla hücre kültürü olusturulmasini, söz konusu hücre kültürünün en az 5 g/L non- iyonik blok kopolimer konsantrasyonu elde edilmesi amaciyla formüle edilen veya ilave edilen yeni hücre kültürü ortamiyla hücre kültürünün perfüzyonuyla hücre kültürü idamesini ve biyoreaktördeki rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip delikli fiber filtreden hücre kültürünün geçirilmesini ve rekombinant proteini ihtiva eden bir süzüntünün toplanmasini içeren bir yöntem de saglanmistir. Bir düzenlemeye göre moleküler agirlik siniri en az 500 kDa'dir. Bir düzenlemeye göre, delikli fiber filtre bir mikrofiltredir. Mevcut bulusta ayrica bir rekombinant proteinin hasadina iliskin bir rekombinant proteini belirten memeli hücreleriyle biyoreaktörün asilanmasi yoluyla hücre kültürü olusturulmasini, söz konusu hücre kültürünün en az 1 g/L non- iyonik blok kopolimer konsantrasyonu elde edilmesi amaciyla formüle edilen veya ilave edilen yeni hücre kültürü ortamiyla hücre kültürünün perfüzyonuyla hücre kültürü idamesini ve biyoreaktördeki rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip delikli fiber filtreden hücre kültürünün geçirilmesini ve bir süzüntünün toplanmasini; önceden belirlenen bir parametre elde edildiginde, en az Sg/l non-iyonik blo kopolimer konsantrasyonu saglamak üzere formüle edilen veya desteklenen yeni hücre kültürü ortamiyla söz konusu hücre kültürünün perfüze edilmesini ve söz konusu hücre kültürünün, biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip delikli bir fiber filtreden geçirmeyi ve rekombinant protein ihtiva eden bir süzüntü toplanmasini içeren bir yöntem saglar. Bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtrenin moleküler agirlik siniri 300 kDa veya daha azdir. Bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre bir ultrafiltredir. Bir düzenlemeye göre, biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya leeküler agirlik sinirina (MWCO) sahip delikli fiber filtrenin moleküler agirlik siniri en az 500 kDa'dir. Bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip delikli fiber filtre bir mikrofiltredir. Bir düzenlemeye göre, biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre ile biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya Hmleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre tek üniteli filtre sisteminin bilesenleridir. Bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer bir polioksipropilen-polioksietilen blok kopolimerdir. Bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer, poloksamer l88'dir. Bir düzenlemeye göre yukaridaki yöntem ilaveten hücre kültürü prosesleri sirasinda numuneler almayi, rekombinant proteinin ve/veya hücre kültürü prosesinin karakteristik özelliklerini kantitatif ve/Veya kalitatif olarak izlemek üzere numunelerin degerlendirilmesini ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre söz konusu numuneler, proses analitik teknikleri kullanarak kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlenir. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, sürekli perfüzyondur. Bir düzenlemeye göre perfüzyon orani sabittir. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, günlük 1,0 çalisma hacminden az veya bu hacme esit bir hizda gerçeklestirilir. Bir düzenlemeye göre perfüzyona peristaltik pompa, çift diyaframli pompa, düsük kesmeli pompa veya alternatif teget akis eslik eder. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, degisken teget geçisiyle sonlanir. Bir düzenlemeye göre, yukaridaki yönteni ilaveten hücrelerin a) birinci zaman periyoduna yönelik birinci sicaklikta ve b) ikinci zaman periyoduna yönelik ikinci sicaklikta kültürlendigi bir sicaklik degisimine tabi tutulmasini ihtiva eder. Ilgili bir düzenlemeye göre, sicaklik degisimi büyüme faziyla üretim fazi arasinda geçiste gerçeklesir. Ilgili bir düzenlemeye göre sicaklik degisimi, üretim fazi sirasinda meydana gelir. Ilgili bir düzenlemeye göre sicaklik degisimi, önceden belirlenen bir parametreye karsilik gerçeklesir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu sicaklik degisimi, önceden belirlenen bir parametreye karsilik olup, özelligi; önceden belirlenen parametrenin elde edilmesinin biyokütle probuna dayali bir kapasitans kullanilarak belirlenmesidir. Bir düzenlemeye göre hücre kültürü, biyoreaktörün en az 0,1 x lO6 canli hücre/ml ile asilanmasiyla gerçeklestirilir. Bir düzenlemeye göre asi, alternatif teget akis filtrasyonu kullanilan bir perfüzyon prosesi yoluyla artirilmistir. Bir düzenlemeye göre biyoreaktöre giris öncesinde hücre kültürü ortami nanofiltrasyon, yüksek sicaklik kisa süre (HTST) veya filtrasyonla kombinasyon halinde UV kullanilarak islenir. Bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktör bir üretim biyoreaktörüdür. Bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az SOOL'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az 500L ila 2000L'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az lOOOL ila ZOOOL'dir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami serumsuz hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami serumsuz kimyasal tanimli hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami perfüzyon hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre memeli hücreleri Çin Hamsteri Over (CHO) hücreleridir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein bir insan antikoru, insanlastirilmis antikor, kimerik antikor, rekombinant füzyon proteini veya sitokin içeren gruptan seçilir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein, bir ya da daha fazla sayida flokülasyon, presipitasyon, santrifüjleme, derin filtrasyon, afinite kromatografisi, büyüklük dislanimli kromatografi, iyon degisimli kromatografi, karma› modlu anyon degisimli kromatografi, hidrofobik. etkilesimli kromatografisi ya da hidroksiapatit kromatografiyle hasat süzüntüsünden saflastirilir. Bir düzenlemeye göre yukarida belirtilen yöntem ilaveten üretim prosesi sirasinda numune almayi, rekombinant proteinin ve purifikasyon prosesinin karakteristik özelliklerinin kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlenmesi amaciyla numunelerin degerlendirilmesini ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein, farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyona formüle edilir. Bir düzenlemeye göre yukaridaki yöntemle üretilen bir rekombinant protein saglanir. Mevcut bulus ayrica farkli gözenek büyüklüklerine ya da moleküler agirlik sinirlarina (MWCO) sahip iki ya da daha fazla sayida delikli fiber filtre bileseni ihtiva eden tek üniteli filtre sistemi saglamakta olup, özelligi; bagimsiz delikli fiberler arasinda steril bir akis yolu saglanacak sekilde seri halde birbirine baglanmasi, farkli gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre bilesenlerinin süzüntünün çekildigi delikr gövde taraflarina iliskin olarak birbirinden izole edilmesi ve böylece süzüntünün her bir ilgili delikli fiber filtre bileseninden çikarilabilmesidir. Bir düzenlemeye göre en az bir delikli fiber filtre bileseninde biyoreaktördeki rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne ya da leeküler agirlik sinirina sahipken, en az bir delikli fiber filtre bileseni biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip delikli bir fiber filtre içeren en az bir delikli fiber filtre bilesenine sahiptir. Ilgili bir düzenlemeye göre en az bir delikli fiber filtre bileseninin moleküler agirlik siniri 300 kDa veya daha az, en az bir delikli fiber filtre bileseninin moleküler agirlik siniri ise en az 500 kDa'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre en az bir delikli fiber filtre bileseni bir ultrafiltre, en az bir delikli fiber filtre bileseni ise mikrofiltredir. Ilgili bir düzenlemeye göre tek üniteli filtre sistemi bir muhafazada bulunur. Bir düzenlemeye göre tek filtre ünitesi ilaveten en az iki delikli fiber filtre bileseninin arasinda bir ara parça ihtiva eder. Mevcut yöntem ilaveten memeli hücreleriyle bir biyoreaktörün asilanmasiyla hücre kültürü olusturulmasini, biyoreaktöre yeni hücre kültürü ortaminin perfüzyonuyla hücre kültürünün idamesini, tek ünite filtre sisteminden hücre kültürünün geçirilmesini ve süzüntü toplanmasini içeren, rekombinant proteini ifade eden hücreleri kültürlemeye yönelik bir yöntem saglamakta olup, özelligi; tek. ünite filtre sisteminin biyoreaktöre takilmasi, hücre kültürünün tek pompalama sistemiyle biyoreaktörden çekilerek tek ünite filtre sistemine alinmasi, hücre kültürünün tek ünite filtre sisteminin delikli fiberlerinin lumen tarafindan geçirilerek tekrar biyoreaktöre alinmasi ve süzüntünün bir* ya da daha fazla sayida delikli fiber filtre bileseninden çekilmesidir. Bir düzenlemeye göre yukaridaki yöntem ilaveten hücre kültürü prosesleri sirasindar numuneler almayi, rekombinant proteinin ve/veya hücre kültürü prosesinin karakteristik özelliklerini kantitatif ve/Veya kalitatif olarak izlemek üzere numunelerin degerlendirilmesini ihtiva eder. Ilgili bir prosese göre söz konusu numuneler, proses analitik teknikleri kullanarak kantitatif ve/Veya kalitatif olarak izlenir. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, sürekli perfüzyondur. Bir düzenlemeye göre perfüzyon orani sabittir. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, günlük 1,0 çalisma hacminden az veya bu hacme esit bir hizda gerçeklestirilir. Bir düzenlemeye göre perfüzyona peristaltik pompa, Çift diyaframli pompa, düsük kesmeli pompa veya alternatif teget akis eslik eder. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, degisken teget geçisiyle sonlanir. Bir düzenlemeye göre, süzüntü biyoreaktörde rekombinant proetini tutmayan bir gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip bir delikli fiber filtre bileseninden toplandiginda yeni hücre kültürü ortami, en az 5 g/l non-iyonik blok kopolimerle formüle edilir veya buna erisecek sekilde tamamlanir. Ilgili bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer bir polioksipropilen- polioksietilen blok kopolimerdir. Ilgili bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer, poloksamer l88'dir. Bir düzenlemeye göre, yukaridaki yöntem ilaveten hücrelerin a) birinci zaman periyoduna yönelik birinci sicaklikta ve b) ikinci zaman periyoduna yönelik ikinci sicaklikta kültürlendigi bir sicaklik degisimine tabi tutulmasini ihtiva Bir düzenlemeye göre, sicaklik degisimi büyüme faziyla üretim fazi arasinda geçiste gerçeklesir. Ilgili bir düzenlemeye göre sicaklik degisimi, üretim fazi sirasinda meydana gelir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu sicaklik degisimi, önceden belirlenen bir parametreye karsilik olup, özelligi; önceden belirlenen parametrenin elde edilmesinin biyokütle probuna dayali bir kapasitans kullanilarak belirlenmesidir. Bir düzenlemeye göre hücre kültürü, biyoreaktörün en az 0,1 x 106 canli hücre/ml ile asilanmasiyla gerçeklestirilir. Ilgili bir düzenlemeye göre asi, alternatif teget akis filtrasyonu kullanilan bir perfüzyon prosesi yoluyla artirilmistir. Bir düzenlemeye göre biyoreaktöre giris öncesinde hücre kültürü ortami nanofiltrasyon, yüksek sicaklik kisa süre (HTST) veya filtrasyonla kombinasyon halinde UV kullanilarak islenir. Bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktör bir üretim biyoreaktörüdür. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az 500L'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az 500L ila ZOOOL'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az lOOOL ila ZOOOL'dir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami serumsuz hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami serumsuz kimyasal tanimli hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami perfüzyon hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre memeli hücreleri Çin Hamsteri Over (CHO) hücreleridir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein bir insan antikorü, insanlastirilmis antikor, kimerik antikor, rekombinant füzyon proteini veya sitokin içeren gruptan seçilir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein, bir ya da daha fazla sayida flokülasyon, presipitasyon, santrifüjleme, derin filtrasyon, afinite kromatografisi, büyüklük dislanimli kromatografi, iyon degisimli kromatografi, karma modlu anyon degisimli kromatografi, hidrofobik. etkilesimli kromatografisi ya da hidroksiapatit kromatografiyle hasat süzüntüsünden saflastirilir. Bir düzenlemeye göre yukarida belirtilen yöntem ilaveten üretim prosesi sirasinda numune almayi, rekombinant proteinin ve purifikasyon prosesinin karakteristik özelliklerinin kantitatif ve/Veya kalitatif olarak izlenmesi amaciyla numunelerin degerlendirilmesini ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein, farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyona formüle edilir. Bir düzenlemeye göre yukaridaki yöntemle üretilen bir rekombinant protein saglanir. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, hücre kültürü sivisinin tek bir açikliktan girdigi ve çiktigi tek bir açikliga sahip tek üniteli filtre sisteminin sematik görünümüdür. Filtreler herhangi bir yerlesimde olabilir, ultrafiltre delikli fiberin takip ettigi mikrofiltre delikli fiber gösterilmektedir. Sekil 2, n=4 olan ultrafiltrasyon prosesine (kapali daire) kiyasla n=2 olan boyuna periyodik hasat prosesinden (açik kare) titrenin görünümüdür. Sekil 3, n=4 olan ultrafiltrasyon prosesine (kapali daire) kiyasla n=2 olan boyuna periyodik hasat prosesinden (açik kare) canli hücre yogunlugunun görünümüdür. Sekil 4, n=4 olan ultrafiltrasyon prosesine (kapali daire) kiyasla n=2 olan uzatilmis periyodik hasat prosesinden (açik kare) canlilik yüzdesinin görünümüdür. Sekil 5, 750 kDa filtreyle donatilmis reaktörlerden (açik daireler) ve 30 kDa filtrelerle donatilmis reaktörlerden (kapali daireler) canlilik yüzdesinin görünümüdür. 750 kDa filtrelerle donatilmis reaktörlerde canlilik yüzdesi 6. günde reaktörlerde canlilik yüzdesi 14 gün süreyle %80 oranda muhafaza edilmistir. Sekil 6, 30 kDa veya 750 kDa delikli fiber filtre ünitesine sahip üst fazda (kapali daire) ve süzüntüde (açik kare) ölçülen Lutrol F68® konsantrasyonlarinin görünümüdür. 30 kDa'lik üst faz, 9-13. günde Lutrol® F68 birikimini göstermektedir. Sekil 7, her Lutrol® F68 konsantrasyonunda (2g/l - 5g/l) A ve B hücre hatlarina iliskin 1 g/L'ye kiyasla normalize canli hücre yogunlugunun görünümü olup, hücre yogunlugu oranini vermektedir. Kiyaslamalar, l g/L'deki verilere kiyasla tüm geçislerdeki veriler arasinda Student t-testleri kullanilarak gerçeklestirilmistir. Istatistiksel anlanu * < 0.0001; ** < Sekil 7B, her Lutrol® F68 konsantrasyonunda (Zg/l - Sg/l) A ve B hücre hatlarina iliskin 1 g/L'ye kiyasla canlilik yüzdesinin görünümüdür. Kiyaslamalar, l g/L'deki verilere kiyasla tüm geçislerdeki veriler arasinda Student t-testleri kullanilarak gerçeklestirilmistir. Istatistiksel anlann * < 0.0001; ** < Sekil 70, l g/L Lutrol® F68'teki hücre çapina kiyasla her Lutrol® F68 konsantrasyonunda A ve B hücre hatlarina yönelik hücre çapidir. Kiyaslamalar, l g/L'deki verilere kiyasla tüm geçislerdeki veriler arasinda Student t-testleri kullanilarak gerçeklestirilmistir. Istatistiksel anlam: * <: 0.0001; ** < Sekil 8, l g/L Lutrol® F68 (açik kareler) ve 5 g/L Lutrol® F68'de (kapali daireler) hücre hatlari A ve B'ye yönelik hücre canliligi yüzdesinin görünümüdür. Canlilik, Lutrol® F68 konsantrasyonu 5 g/L'ye yükseltildiginde 30 gün üzeri için %90 üzerinde muhafaza edilmistir. Sekil 9, lg/L Lutrol® F68 (kapali kare) ya da 5g/L Lutrol® F68 (açik daire) içeren perfüzyon ortami ihtiva eden 750 kDa ATF filtre içeren 2L'lik reaktörlerde yetisen hücrelerin canliligina iliskin pluronik konsantrasyon etkisinin görünümüdür. Sekil 10, 750 kDa ATF filtreye sahip 2L'lik reaktörlerde l g/L Lutrol® F68'de yetisen hücrelerin canlilik gerikazanimina iliskin Lutrol® F68 (5 g/L'ye kadar) konsantrasyonunun artis etkisinin görünümüdür. Ortani A: kapali daire. Ortani B: açik daire. Ok, Lutrol® F68 konsantrasyonunun artirildigi zamani göstermektedir. Sekil 11: Glukoz ve mannozun GCMS kantifikasyonunun görünümüdür. (A) heksozlarin GC ayrisimina iliskin TCI, (B) 12C-heksoz ve 13-C iç standart heksoz içeren heksoz piklerinde bulunan tipik kütle spektrumu fragmentasyonu paternidir. (C) Glukoz ve mannoz kantifikasyonuna iliskin tayin lineerligidir. Sekil 12: IgG'nin yüksek mannoz glikozilasyonunda mannoz etkisinin görünümüdür. (A) artan miktarda mannozla kültürlenen CHO hücreleridir; (B) artan miktarda mannozla ve farkli glukoz konsantrasyonlarinda kültürlenen CHO hücreleridir. Yüksek mannoz glikozilasyonundaki lineer artis, glukoz konsantrasyonundan bagimsizdir. Sekil 13: PAC geri besleme döngüsünün sematik görünümüdür. Önceden tanimlanan ürün kalitesi özelliklerinin gerçeklestirilmesi için gerekli PAC prosesinin önemli elemanlari QTPP, otomatik numune alma ve özellige özgü analitikler, prosesi modifiye etmeye yönelik kontrol modeli ve özellik düzeylerini ayarlamaya yönelik bilinen kumanda bilesenleri içeren bir prosestir. Sekil 14: En küçük kareler regresonuyla model parametrelerin hesaplanmasi için tek reaktör çalismasi kullanilmistir. Söz konusu semboller en küçük kareler regresyonuyla model parametrelerin bulunmasi için kullanilir. Kesik çizgiler ortaya çikan model çiktilaridir. Noktali çizgiler, MPC için kullanilan büyüme parametrelerini kullanan model uyumlaridir. Sekil A ve B'deki kalin kirmizi çizgiler söz konusu egitme verilerini olusturmak için kullanilan mannoz beslemesini gösterir. A) %yüksek mannoz B) Reaktör mannoz konsantrasyonu C) Hücre yogunlugu (rastgele ölçeklenerek hesaplanan hacim) D) Ürün konsantrasyonu Sekil 15: Model Kestirimsel Kontrol üzerinden %yüksek mannoz kontrolünün görünümüdür. Tüm sekillerde, söz konusu semboller ölçülmüs degerlerdir ancak Model Kestirimsel Kontrole yönelik yalnizca açik semboller kullanilmistir. Noktali çizgi, ölçümlerin bilindigi ve kontrol önleminin alindigi model sonucudur. Sekil A ve B'deki kalin kirmizi çizgiler MPC tarafindan belirlenen mannoz beslemesini gösterir. A) %yüksek mannoz B) Reaktör mannoz konsantrasyonu C) Rastgele ölçümlenerek hesaplanmis hacim (SCV) olarak hücre yogunlugu D) Ürün konsantrasyonu Sekil 16: PAC ve non-PAC verilerin kiyaslamasidir. %yüzde mannoz verileri, HILIC tayiniye elde edilmistir. BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut bulus, yüksek titre süzüntüsü elde ederken pik üretimde sürekli hücre kültürü saglanmasi avantajini sunan genisletilmis bir periyodik hasat yöntemi saglamaktadir. Mevcut bulus, bir biyoreaktöre rekombinant protein ürünü ifade eden memeli hücrelerinin asilanmasiyla hücre kültürü olusturulmasini, söz konusu biyoreaktöre yeni hücre kültürü perfüzyonuyla hücre kültürünün idame etirilmesini, hücre kültürünün bir filtreden geçirilmesini ve süzüntünün toplanmasini ihtiva etmekte olup, özelligi; önceden belirlenen birinci parametre elde edilene kadar baslangiçta bos süzüntünün toplanmasini ve bu sürede hasat süzüntüsünün önceden belirlenen bir sürede toplanmasini, bu islemi müteakiben önceden belirlenen ikinci parametre elde edilene kadar alternatif olarak bos süzüntünün toplanmasini ve ardindan önceden belirlenen bir sürede hasat süzüntüsünün toplanmasini ihtiva eden uzatilmis periyodik toplamaya iliskin bir yöntem saglamakta olup, özelligi; bos süzüntünün ve hasat süzüntüsünün alternatif toplanmasinin, hücre kültürü sona erene kadar devam etmesidir. Önceden belirlenen parametreler, canli hücre yogunlugu, sikistirilmis hücre yogunlugu, titre ya da zaman noktasi gibi hücre kültürünün bazi istenen karakteristiklerinin, özelliklerinin veya performans asamalarinin gerçeklestirilmesiyle elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre canli hücre yogunlugu 1 x 106 canli hücre/ml'den büyük ya da bu orana esit oldugunda önceden belirlenen parametre elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre canli hücre yogunlugu en az önceden belirlenen parametre elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre sikistirilmis hücre hacmi %35'in altinda ya da %35'e esit oldugunda önceden belirlenen parametre elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, sikistirilmis hücre hacmi %30 altinda ya da edilebilir. Önceden belirlenen parametre, bir zaman noktasina dayali olabilir. Zaman noktasi, tetikleyici bir` olay ya da aksiyon sonrasinda saat, gün, hafta ya da ay olarak ölçülebilir. Tetikleyici olay ya da aksiyon kültürde saatler` veya günler alabilir, canli hücre yogunlugu, sikistirilmis hücre hacmi, titre, biyoreaktör asilanmasi veya hasat süzüntüsü toplanmasi gibi bir olayi müteakiben saat ya da günler sürebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen parametre, tetikleyici bir olayi veya aksiyonu müteakip 12 saat ila 25 gün içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen parametre, tetikleyici bir olayi veya aksiyonu müteakip 24 ila 72 saat içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen parametre, tetikleyici bir olayi veya aksiyonu müteakip 4 gün içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen parametre, tetikleyici bir olayi veya aksiyonu müteakip› 5 gün içinde ya da daha uzun sürede elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen parametre, tetikleyici bir olayi veya aksiyonu müteakip en az gün içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen parametre, biyoreaktörün asilanmasini müteakip 5 ila 25 gün içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen parametre, biyoreaktörün asilanmasini müteakip 10 ila 12 gün içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen ikinci parametre, hasat süzüntüsünün toplanmasini müteakip 12 ila 72 saat içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen ikinci parametre, hasat süzüntüsünün toplanmasini müteakip 24 ila 72 saat içinde elde edilebilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen ikinci parametre, hasat süzüntüsünün toplanmasini müteakip 24 ila 48 saat içinde elde edilebilir. Önceden belirlenen parametre elde edildiginde, toplama süzüntüsü önceden belirlenen bir sürede toplanabilir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen süre en az 12 ile 72 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen süre 24 ile 72 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, önceden belirlenen süre 24 ile 48 saat arasindadir. Bir düzenlemeye göre, söz konusu filtre tek üniteli filtre sistemidir. Ilgili bir düzenlemeye göre, söz konusu tek üniteli filtre sistemi biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip en az bir delikli fiber filtre bileseni ile biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan bir gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina (MWCO) sahip en az bir delikli fiber filtre bileseni ihtiva eder. Baska bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutan en az bir delikli fiber filtre bileseninin moleküler agirlik siniri 300 kDa veya daha azdir. Baska bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan en az bir delikli fiber filtre bileseninin Hmleküler agirlik siniri en az 500 kDa'dir. Baska bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant protein tutan en az bir delikli fiber filtre bileseni bir ultrafiltre olup, biyoreaktörde rekombinant protein tutmayan en. az bir delikli fiber filtre bileseni. bir Inikrofiltredir. Baska bir düzenlemeye göre tek üniteli filtre sistemi bir muhafazada bulunur. Baska bir düzenlemeye göre tek üniteli filtre sistemi ilaveten en az iki delikli fiber filtre bileseninin arasinda bir ara parça ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre bos süzüntü tek üniteli filtre sistemi kullanilarak toplandiginda, biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip en az bir delikli fiber filtreden çekilir. Bir düzenlemeye göre hasat süzüntüsü tek üniteli filtre sistemi kullanilarak toplandiginda, biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip en az bir delikli fiber filtreden çekilir. Bir düzenlemeye göre, süzüntü biyoreaktörde rekombinant proetini tutmayan bir gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip bir delikli fiber filtre seklinde bir filtreden toplanir, yeni hücre kültürü ortami, en az 5 9/1 non-iyonik blok kopolimerle formüle edilir veya buna erisecek sekilde tamamlanir. Ilgili bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer bir polioksipropilen-polioksietilen blok kopolimerdir. Baska bir düzenlemeye göre non-iyonik blok Mevcut bulusta ayrica bir rekombinant proteini belirtlen memeli hücrelerine sahip bir biyoreaktörle asilama yoluyla hücre kültürü olusturulmasina, hücre kültürünün en az 55 g/l non-iyonik blok kopolimer konsantrasyonu elde etmek üzere formüle edilen veya tamamlanan› yeni hücre kültürü ortamiyla perfüzyonuyla idamesine ve hücre kültürünün biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiver filtreden geçirilmesine ve rekombinant protein içeren süzüntünün toplanmasina iliskin bir yöntem saglanmaktadir Bir düzenlemeye göre moleküler agirlik siniri en az 500 kDa'dir. Bir düzenlemeye göre, delikli fiber filtre bir mikrofiltredir. Mevcut bulus ayrica bir rekombinant protein toplamaya yönelik, rekombinant. protein içeren memeli hücreleriyle biyoreaktörün asilanmasi yoluyla hücre kültürü olusturulmasini, en az 1 g/L non-iyonik blok kopolimer konsantrasyonunun elde edilmesi için formüle edilen ya da ilave edilen yeni hücre kültürü ortamiyla hücre kültürünün perfüzyonu yoluyla söz konusu hücre kültürünün idame ettirilmesini, hücre kültürünün biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtreden geçirilerek bir süzüntü toplanmasini; önceden belirlenen parametre elde edildiginde, en az 5 g/L non-iyonik blok kopolimer konsantrasyonu elde edilmesi amaciyla formüle edilen veya ilave edilen yeni hücre kültürü ortamina hücre kültürü perfüzyonunu ve biyoreaktörde rekombinant protein tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtreden hücre kültürünün geçirilerek rekombinant protein içeren süzüntünün hasadini ihtiva eden bir yöntem saglar. Bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtrenin moleküler agirlik siniri 300 kDa veya daha azdir. Ilgili bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre bir ultrafiltredir. Bir düzenlemeye göre, biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtrenin moleküler agirlik siniri en az 500 kDa'dir. Ilgili bir düzenlemeye göre biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre bir mikrofiltredir. Bir düzenlemeye göre, biyoreaktörde rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre ile biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre tek üniteli filtre sisteminin bilesenleridir. Ilgili bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer bir polioksipropilen-polioksietilen blok kopolimerdir. Baska bir düzenlemeye göre non-iyonik blok kopolimer, poloksamer 188'dir. Mevcut bulus ayrica farkli gözenek büyüklüklerine ya da moleküler agirlik sinirlarina sahip iki ya da daha fazla sayida delikli fiber filtre bileseni ihtiva eden tek üniteli filtre sistemi saglamakta olup, özelligi; bagimsiz delikli fiberler arasinda steril bir akis yolu saglanacak sekilde seri halde birbirine baglanmasi, farkli gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre bilesenlerinin süzüntünün çekildigi delik gövde taraflarina iliskin olarak birbirinden izole edilmesi ve böylece süzüntünün her bir ilgili delikli fiber filtre bileseninden çikarilabilmesidir. Bir düzenlemeye göre en az bir delikli fiber filtre bileseninde biyoreaktördeki rekombinant proteini tutan gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahipken, en az bir delikli fiber filtre bileseni biyoreaktörde rekombinant proteini tutmayan gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip delikli bir fiber filtre içeren en az bir delikli fiber filtre bilesenine sahiptir. Bir düzenlemeye göre en az bir delikli fiber filtre bileseninin moleküler agirlik siniri 300 kDa veya daha az, en az bir delikli fiber filtre bileseninin moleküler agirlik siniri ise en az 500 kDa'dir. Bir düzenlemeye göre en az bir delikli fiber filtre bileseni bir ultrafiltre, en az bir delikli fiber filtre bileseni ise mikrofiltredir. Bir düzenlemeye göre tek üniteli filtre sistemi bir muhafazada bulunur. Bir düzenlemeye göre tek üniteli filtre sistemi ilaveten en az iki delikli fiber filtre bileseninin arasinda bir ara parça ihtiva eder. Ilgili bir düzenlemeye göre mevcut bulus, ilaveten hücrelerin kültürlenmesine ve/veya rekombinant proteinin hasadina yönelik memeli hücreleriyle bir biyoreaktörün asilanmasiyla hücre kültürü olusturulmasini, biyoreaktöre yeni hücre kültürü ortaminin perfüzyonuyla hücre kültürünün idamesini, tek ünite filtre sisteminden› hücre kültürünün. geçirilmesini ve süzüntü toplanmasini, rekombinant proteini ifade edilmesini içeren bir yöntem saglamakta olup, özelligi; tek ünite filtre sisteminin biyoreaktöre takilmasi, hücre kültürünün tek pompalama sistemiyle biyoreaktörden çekilerek tek ünite filtre sistemine alinmasi, hücre kültürünün tek ünite filtre sisteminin delikli fiberlerinin lumen tarafindan geçirilerek tekrar biyoreaktöre alinmasi ve süzüntünün bir* ya da daha fazla sayida delikli fiber filtre bileseninden çekilmesidir. Ilgili bir düzenlemeye göre mevcut bulusa uygun yöntem ilaveten hücre kültürü prosesleri sirasinda numuneler almayi, rekombinant proteinin ve/veya hücre kültürü prosesinin karakteristik özelliklerini kantitatif ve/Veya kalitatif olarak izlemek üzere numunelerin degerlendirilmesini ihtiva eder. Ilgili bir düzenlemeye göre söz konusu numuneler, proses analitik teknikleri kullanarak kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlenir. Mevcut bulusa göre yöntemlerin ilgili bir düzenlemesinde perfüzyon sürekli perfüzyondur. Bir düzenlemeye göre perfüzyon orani sabittir. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, günlük 1,0 çalisma hacminden az veya bu hacme esit bir hizda gerçeklestirilir. Bir düzenlemeye göre perfüzyona peristaltik pompa, çift diyaframli pompa, düsük kesmeli pompa veya alternatif teget akis eslik eder. Bir düzenlemeye göre perfüzyon, degisken teget geçisiyle sonlanir. Ilgili bir düzenlemeye göre, mevcut bulusa uygun yöntem ilaveten hücrelerin a) birinci zaman periyoduna yönelik birinci sicaklikta ve b) ikinci zaman periyoduna yönelik ikinci sicaklikta kültürlendigi bir sicaklik degisimine tabi tutulmasini ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre, sicaklik degisimi büyüme faziyla üretim fazi arasinda geçiste gerçeklesir. Bir düzenlemeye göre sicaklik degisimi, üretim fazi sirasinda meydana gelir. Bir düzenlemeye göre söz konusu sicaklik degisimi, önceden belirlenen bir parametreye karsilik olup, özelligi; önceden belirlenen parametrenin elde edilmesinin biyokütle probuna dayali bir kapasitans kullanilarak belirlenmesidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu sicaklik degisimi, önceden belirlenen bir parametreye karsilik olup, özelligi; önceden belirlenen parametrenin elde edilmesinin biyokütle probuna dayali bir kapasitans kullanilarak belirlenmesidir. Mevcut bulusa uygun yöntemlerle ilgili bir düzenlemeye göre hücre kültürü, biyoreaktörün en az 0.1 x 106 canli hücre/ml ile asilanmasiyla olusturulur. Bir düzenlemeye göre asi, alternatif teget akis filtrasyonu kullanilan bir perfüzyon prosesi yoluyla artirilmistir. Bir düzenlemeye göre biyoreaktöre giris öncesinde hücre kültürü ortami nanofiltrasyon, yüksek sicaklik kisa süre (HTST) veya filtrasyonla kombinasyon halinde UV kullanilarak islenir. Mevcut bulusa uygun yöntemlerin ilgili bir düzenlemesine göre biyoreaktör, bir üretim biyoreaktörüdür. Bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az SOOL'dir. Bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az 5OOL ila ZOOOL'dir. Bir düzenlemeye göre söz konusu biyoreaktörün kapasitesi en az 1000L ila 2000L'dir. Mevcut bulusun yöntemleriyle ilgili bir düzenlemeye göre, hücre kültürü ortami, serumsuz kimyasal tanimli bir hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre söz konusu hücre kültürü ortami perfüzyon hücre kültürü ortamidir. Bir düzenlemeye göre memeli hücreleri Çin Hamsteri Over (CHO) hücreleridir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein bir insan antikoru, insanlastirilmis antikor, kimerik antikor, rekombinant füzyon proteini veya sitokin içeren gruptan seçilir. Mevcut bulusun yöntemleriyle ilgili bir düzenlemeye göre rekombinant protein, bir ya da daha fazla sayida flokülasyon, presipitasyon, santrifüjleme, derin filtrasyon, afinite kromatografisi, büyüklük dislanimli kromatografi, iyon degisimli kromatografi, karma modlu anyon degisimli kromatografi, hidrofobik etkilesimli kromatografisi ya da hidroksiapatit kromatografiyle hasat süzüntüsünden saflastirilir. Bir düzenlemeye göre mevcut bulusa uygun yöntemler ilaveten purifikasyon prosesi sirasinda numune almayi, rekombinant proteinin ve purifikasyon prosesinin karakteristik özelliklerinin kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlenmesi amaciyla numunelerin degerlendirilmesini ihtiva eder. Bir düzenlemeye göre söz konusu numuneler, proses analitik teknikleri kullanarak kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlenir. Bir düzenlemeye göre rekombinant protein, farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyona formüle Hücre Kültürü ya da dokunun disinda hücre yetistirilmesi ve propagasyonu anlamina gelir. Memeli hücrelerine yönelik uygun kültür kosullari teknikte bilinmektedir. Örn. bkz. Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Memeli hücreleri süspansiyon halinde veya kati bir alt katmana baglanmis olabilir. Burada kullanildigi üzere, "hücre kültürleme ortami" ("kültür ortami", "hücre kültür ortami", "doku kültürü ortami" olarak da bilinir) örnegin hayvan ya da memeli hücreleri gibi hücreleri yetistirmeye yönelik olan kullanilan ve bir enerji kaynagi (genellikle glukoz gibi bir karbonhidrat formunda); bir' ya da daha fazla sayida esansiyel aminoasit, genellikle yirmi temel amino asit, ayrica sistein; vitaminler ve/veya tipik olarak düsük konsantrasyonlarda gerekli vitaminler ve/veya diger organik. bilesenler; lipidler* veya serbest yag asitleri; örnegin tipik olarak çok düsük konsantrasyonlarda ve genellikle mikromolar aralikta gerekli inorganik bilesenler ya da dogal meydana gelen elemanlar gibi iz elementler içeren bilesenleri en az bir` ya da daha fazla sayida saglayan her türlü gida solüsyonuyla ilgilidir. Hücrelerin büyümesini optimize etmek üzere gida solüsyonu kültürlenecek hücrelerin gereksinimlerine ve/veya arzu edilen hücre kültürü parametrelerine dayali sekilde opsiyonel olarak hormonlar` ve insülin, transferrin, epidermal. büyüme faktörü, serum ve benzeri gibi diger büyüme faktörleri; kalsiyum, magnezyum ve fosfat gibi tuzlar ve örnegin HEPES gibi tamponlar; adenozin, timidin, hipoksantin gibi nükleosidler ve bazlar; hidrolize bitki veya hayvan proteini gibi protein ve doku hidrolizatlari (hayvan yan ürünlerinden, saflastirilmis jelatinden veya bitki materyalinden elde edilebilen pepton veya pepton karisimlari); gentamisin gibi antibiyotikler; putrescin, spermidin ve spermin gibi poliaminler (bkz. WIPO Yayin No. WO 2008/1540l4) ve piruvat (bkz. ABD Patent No. sipermetrin, siklosporin A, BBMP, Bongkrekik asit, 8-15176 difumerat, siklik pifitrin-a, pifitrin mu, BI-6C9, NSCI, NS3694 ya da Nekrostatin-l (bkz. WIPO Yayin No. WO Non-iyonik yüzey aktif maddeler de hücre kültürü ortamina eklenebilir. Non-iyonik yüzey aktif maddelerin örnekleri polivinil alkol, polietilen glikozil ve non-iyonik blok kopolimer yüzey aktif maddeleri içermekte olup, bunlarla sinirli degildir. Ayrica alkil poli(etilen oksit), poli(etilen oksit) ve poli(propilen oksit) kopolimerleri (EO-PO blok kopolimerler), poli(vinilpirolidon), alkil poliglukosidler (sukroz monostearat, lauril diglusid veya sorbitan monolaurat, oktil glukosid ve desil maltosid gibi), yag alkolleri (setil alkol veya oleil alkol) ya da kokamidler (kokamid MEA, kokamid DEA ve kokamid TEA) dahil edilmistir. Ayrica polioksiproilen-polioksietilen blok kopolimerler olarak bilinen etilen oksit ve propilen oksit bazli blok kopolimerler de dahil edilmistir. Bu moleküller iki hidrofilik polioksietilen. (poli(etilen oksit) ile kusatilan. merkezi bir hidrofobik polioksipropilen (poli(propilen oksit)) ihtiva eden non-iyonik triblok kopolimerlerdir. Özellikle 70 ünite polioksipropilene ve polioksietilen zincirlerinin her birinden üniteye sahip moleküller` dikkat çekicidir. Tercih edilen bir düzenlemeye göre blok kopolimer, Pluronic® F68, Kolliphor® P-188, Lutrol® F68 ve Lutrol® l88 gibi çesitli marka adlariyla satilan poloksamer l88'dir (8.4 kd ortalama moleküler agirliga sahip CAS #. Bu polioksipropilen-polioksietilen blok kopolimerler, hücrelerin reaktörde dagilmasina ve köpürmesine bagli köpükle indüklenen ölümden korunmasi için kullanilir. Burada açiklandigi üzere, tipik olarak hücre kültürü ortaminda (lg/l) kullanilan poloksamer 188 düzeyi, hücre kültürleri mikrofiltrasyona maruz kaldiginda hücreleri alternatif teget akisli (ATF) perfüzyon sisteminde yüksek kesme kuvvetlerinden korumak için yeterli olmayabilir. Burada açiklandigi üzere poloksamer 188 gibi bir polioksipropilen-polioksietilen blok kopolimerin 5 g/L gibi yüksek konsantrasyonlarda eklenmesi hücre canliligina olumlu etki etmis ve bu da ATF perfüzyon kosullari altinda daha uzun kültür sürelerine olanak vermistir. Hücre kültürü ortamlari, tipik olarak kesikli proses, uzatilmis kesikli proses, beslemeli kesikli proses ve/veya hücrelerin perfüzyonu ya da sürekli kültürlemesini içeren ancak bunlarla sinirli olmayan her türlü hücre kültürü prosesinde kullanilan ve/veya bu prosesle kullanimi bilinenleri ihtiva eder. "Baz" (veya kesikli (batch)) hücre kültürü ortami ya da besleme ortami tipik olarak bir hücre kültürünü› baslatmak için kullanilan ve hücre kültürünü desteleyecek yeterlilikte dolu bir hücre kültürü ortamiyla olarak üstel büyüme döneminde hücre kültürlerinde kullanilan bir hücre kültürü ortamiyla veya bir "büyüme asamasiyla" ilgili olup, hücre kültürünü desteleyecek yeterliliktedir. Büyüme hücresi kültürü ortami, konak hücreye dahil edilen seçilebilir markerlere dayaniklilik veya yasama yetisi saglayan seçkin ajanlar içerebilir. Söz konusu seçkin ajanlar genetisin (G4ll8), neomisin, higromisin B, puromisin, zeosin, metionin sulfoksimin, metotreksat, glutamin içermeyen hücre kültürü ortami, glisin içermeyen hücre kültürü ortami, hipoksantin ve timidin veya yalnizca timidin içermekte olup bunlarla sinirli degildir. büyüme biterken gerçeklesen geçis, müteakip geçis ve/Veya protein üretimi gerçeklestiginde hücre kültürlerinde tipik olarak kullanilan bir hücre kültürü ortamiyla ilgilidir. Söz konusu hücre kültürü ortami, bu faz sirasinda istenen hücre yogunlugunu, canliligini ve/Veya ürün titresini idame ettirmek için yeterince tamdir. perfüzyon ya da sürekli kültür yöntemleriyle idame ettirilen hücre kültürlerinde tipik olarak kullanilan ve bu proses sirasinda hücre kültürünü desteklemeye yeterli tamlikta bir hücre kültürü ortamiyla ilgilidir. Perfüzyon hücre kültürü ortami formülasyonlari, tüketilen ortami ortadan kaldirmak için kullanilan yöntemi uyumlastirmaya yönelik baz hücre kültürü ortami formülasyonlarindan daha zengin ya da daha konsantre olabilir. Perfüzyon hücre kültürü ortami, büyüme ve üretim fazlari sirasinda kullanilabilir. Hücre kültürü ortami bilesenleri bir toz ortam formülasyonuna tamamen ögütülebilir; ihtiyaç duyuldugu kadar hücre kültürü ortamina eklenen, sivi katki maddeleriyle kismen ögütülebilir ya da hücre kültürüne tamamen sivi formda eklenebilir. Hücre kültürleri, hücre kültürünün üretini fazi süresince tüketilen besin ve amino asitler gibi bilesenler ihtiva eden konsantre besin ortamiyla artirilabilir. Konsantre hücre kültürü ortami, söz konusu hücre kültürünü idame ettirmek için gerekli besinlerin bir kismini veya tamamini içerebilir; özellikle konsantre ortam, hücre kültürünün üretim asamasinda tüketilmek üzere tanimlanan veya bu asamada tüketildigi bilinen besinler içerebilir. Konsantre ortam, her türlü hücre kültür ortami formülasyonuna dayali olabilir. Konsantre besin ortami örnegin da yaklasik lOOOX kati hücre kültürü ortami bilesenlerinin bazilarini veya tamamini içerebilir. Hücre kültürleri ayrica zor formüle edilen veya hücre kültürlerinde hizla tüketilebilen belirli besinlerin bagimsiz konsantre beslemelerle desteklenebilir. Söz konusu besinler tirosin, sistein ve/veya sistin gibi amino asitler olabilir tirosinin konsantre çözeltisi, tirosin ihtiva eden bir hücre kültüründe büyütülen bir hücre kültürüne, bagimsiz sekilde beslenir ve hücre kültüründeki tirosin konsantrasyonu 8 mm'yi asmaz. Baska bir düzenlemeye göre konsantre tirosin ve sistin çözeltisi, bagimsiz olarak tirosin, sistin ve sistein içermeyen bir hücre kültürü ortaminda büyüyen hücre kültürüne bagimsiz olarak beslenir. Bagimsiz besleme, üretim fazindan önce ya da üretim fazi baslangicinda baslayabilir. Bagimsiz beslemeler, konsantre besleme ortamiyla ayni ya da farkli günlerde hücre kültürü ortamina kesikli beslemeyle gerçeklestirilebilir. Bagimsiz beslemeler perfüze ortamla ayni ya da farkli günlerde perfüze edilebilir. Söz konusu bagimsiz beslemeler bir ya da daha fazla sayida gün geçtikten sonra hücre kültürü ortamina eklenebilir ve ayrica hücre kültürü ortaminda tirosin, sistein ve sistin tüketimi engellendigi sürece üretim fazi sirasinda tekrarli sekilde eklenebilir. Geribesleme kontrolü bulunmayanlar gibi bir memeli hücresi kültürünü sürekli beslemeye yönelik yöntemler uygulanabilir Belirli düzenlemelere göre hücre kültürü ortami serum içermez ve/Veya hayvan kökenli ürünler ya da bilesenler ihtiva etmez. Belirli düzenlemelere göre hücre kültürü ortami kimyasal olarak tanimlanmis olup, tüm kimyasal bilesenler bilinmektedir. Hayvan veya memeli hücreleri, kültürlenen belirli hücrelere uygun olan ve teknikte uzman kisi tarafindan gereksiz deney yapma geregi olmadan belirlenebilen bir ortamda kültürlenir. Ticari olarak mevcut ortamlar kullanilabilmekte olup, Iscove's Modified Dulbecco's Medium, RPMI 1640, Minimal Essential Medium- alpha, (MEM-alpha), Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM), DME/FlZ, alpha MEM, Earle's BSS'yi içeren Basal Medium Eagle, Glutaminli DMEM yüksek Glikoz, Glutaminsiz DMEM yüksek glikoz, Glutaminsiz DMEM düsük Glikoz, Glutaminli DMEMzF12 lzl, GMEM (Glasgow's MEM), glutaminli GMEM, Grace's Complete Insect Medium, FBS'siz Grace's Insect Medium, Glutaminli Ham's F-lO, Glutaminli Ham's F-12, HEPes ve Glutaminli IMDM, HEPES'lI ve Glutaminsiz IMDM, Glutaminsiz Phenol Red, 15 (Leibovitz), Glutaminsiz McCoy's 5A. Modified Medium, Medium , Glutaminli MEM Eagle-Earle's BSS, Glutaminsiz MEM Eagle-Earle's BSS, MEM Glutaminsiz Eagle-Hanks BSS, Glutaminli NCTC-109, Glutaminli Richter's CM Medium, HEPES'li, Glutaminli ve/veya Penisilin- Stretomisinli RPMI 1640, Glutaminli RPMI 1640, Glutaminsiz RPMI 1640, Schneider's Insect Medium veya belirli hücre tiplerine yönelik formüle edilmis olan, teknikte uzman kisilerce bilinen her türlü baska ortamin dahil oldugu söz konusu ortam bunlarla sinirli degildir. Yukarida belirtilen örnek niteligindeki ortamlar, gerektigi veya arzu edildigi üzere, teknikte rutin uzmanliga sahip kisilerce bilindigi ya da uygulandigi sürece uygun konsantrasyonlarda veya miktarlarda opsiyonel bilesenler` de dahil ilave tamamlayici bilesenlere eklenebilir. Ortam Islemleri Hücre kültürü ortami, biyoreaktöre ve/Veya hücre kültürüne ekleme öncesinde ortamlari sterilize 3%) da dezenfekte edecek yöntemler ya da cihazlar kullanilarak islenebilir. Bir düzenlemeye göre hücre kültürü ortami yüksek sicaklik kisa süre (HTST) kullanilarak. islenir (bkz. örn. ABD Patent No. 7.420.183). Bir düzenlemeye göre hücre kültürü ortami filtrasyonla kombinasyon halinde UV kullanilarak islenir hücre kültürü ortami nanofiltrasyona tabidir (bkz., örn., Liu düzenlemeye göre hücre kültürü ortami, solventler, deterjanlar, psoralen ya da beta-propiolakton gibi virüsleri inaktive eden kimyasallarla islenir. Hücreler Mevcut bulusta kullanilan hücre hatlari ("hücreler" veya öneme sahip bir polipeptidi ifade etmek üzere genetik olarak islenmistir. Hücre hatlari tipik olarak süresiz sekilde kültürde idame edilebilen bir primer kültürden kaynaklanan bir kökenden türetilir. Hücreler, kültürleme prosesinde ekspresyon ve üretime yönelik proteinleri kodlayan kodlama sekanslarini veya kisimlarini barindiran plazmidler ve benzeri gibi transformasyon, transfeksiyon, enfeksiyon ya da enjeksiyon, ekspresyon vektörleri (yapilar) üzerinden verilenleri içerebilir. Söz konusu ekspresyon vektörleri, verilen kodlama sekansinin transkripsiyonu veya translasyonu açisindan gerekli elemanlari içerir. Teknikte uzman kisilerce iyi bilinen ve uygulanan yöntemler, üretilen proteinleri ve polipeptitleri kodlayan sekanslari ve ayrica uygun transkripsyion ve translasyon kontrol elemanlarini ihtiva eden ekspresyon vektörlerini olusturmak üzere kullanilabilir. Söz konusu yöntemler in vitro rekombinant DNA tekniklerini, sentetik teknikleri ve in 'vivo genetik rekombinasyonlari içerir. Söz konusu teknikler bu dokümana her türlü amaçla dahil edilen J. Sambrook ve ark., 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4. baski Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y- ya da önceki herhangi bir baskida; F. M. Ausubel ve ark., 2013, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, veya önceki herhangi bir baskida; Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990'da açiklanmaktadir. Hayvan hücreleri, memeli hücreleri, kültürlenmis hücreler, hayvan ya da memeli konak hücreleri, konak hücreler, rekombinant hücreler, rekombinant konak hücreler ve benzeri mevcut bulus proseslerine göre kültürlenebilen hücrelerle ilgilidir. Söz konusu hücreler memelilerden elde edilen veya türetilen tipik hücre hatlari olup, burada tarif edildigi üzere uygun besinleri ve/veya diger faktörleri ihtiva eden ortamdaki tek katmanli kültür ya da süspansiyon kültürüne yerlestirildiginde büyüyebilir ve yasayabilir. Hücreler, tipik olarak proteinleri kültür ortamina tasiyan veya salgilayanlardan, çok miktarda belirli bir proteini tasimak ya da salgilamak üzere moleküler olarak islenenlerden, özellikle bir glikoproteinden seçilir. Bir konak hücre tarafindan üretilen proteinin konak hücreye endojen ya da homolog olabilecegi anlasilacaktir. Alternatif olarak söz konusu protein, örnegin Çin hamster overi (CHO) tarafindan üretilen ve salgilanan bir insan proteini gibi konak hücreye heterolog, yani yabancidir. Ilaveten memeli proteinleri, yani bir aslen bir memeli organizmasindan elde edilen veya türetilenler mevcut bulusa uygun yöntemlerle elde edilebilir ve hücrelerle kültür ortamina salgilanabilir. Çesitli hücreleri kültürlemek için mevcut bulusa göre bilesimler kullanilabilir. Bir düzenlemeye göre kültürlenen hücreler bitki ve/veya hayvan hücreleri gibi ökaryotik hücrelerdir. Hücreler memeli hücreleri, balik hücreleri, böcek hücreleri, amfibi hücreleri veya kus hücreleri olabilir. Kültürde büyümeye uygun çok çesitli memeli hücresi hatlari Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (Manassas, Va.) ve diger saklama kurumlarindan ve ticari saticilardan temin edilebilir. Mevcut bulusa göre proseslerde kullanilabilen hücre, MK2.7 hücreleri, PER-C6 hücrelere, CHO-Kl (ATCC CCL-61), gibi Çin hamsteri over* hücreleri (CHO), DG44'e (Chasin. ve ark. 1986, redüktaz negatif CHO hücreleri (CHO/-DHFR, Urlaub ve Chasin, ve dp12.CHO hücreleri (ABD Pat. No. 5,721,121); maymun böbregi hücreleri (CV1, ATCC CCL-70); SV4O ile dönüstürülmüs maymun böbregi CVl hücreleri (COS hücreleri, CCS-7, ATCC CRL-1651); HEK 293 hücreleri ve Sp2/O hücreleri, 5L8 hibridoma hücreleri, Daudi hücreleri, EL4 hücreleri, HeLa hücreleri, HL- 60 hücreleri, K562 hücreleri, Jurkat hücreleri, THP-l hücreleri, Sp2/O hücreleri, primer epitelyal hücreler (örn., keratinositler, servikal epitelyal hücreler, bronsiyal epitelyal hücreler, trakelyal epitelyal hücreler, böbrek epitelyal hücreler ve retinal epitelyal hücreler) ve olusturulan hücre hatlariyla soylarina (örn., insan embroyonik böbrek hücreleri (örn., süspansiyon kültüründe yetismek üzere alt klonlanmis 293 hücre ya da 293 hücre, Grahani ve ark., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); bebek hamster böbrek hücreleri (BHK, ATCC CCL-10); fare sertoli insan servikal karsinoni hücreleri (HELA, ATCC CCL-2); kanin böbrek hücreleri (MDCK, ATCC CCL-34); insan akciger hücreleri (W; insan hepatom. hücreleri (HEP- G2, HB buffalo siçan akciger hücreleri (BRL 3A, ATCC CRL- 1442); TRI hücreleri; FS4 hücreleri; PER-C6 retinal hücreler, MDBK (NBL-l) hücreleri, 911 hücreleri, CRFK hücreleri, MDCK hücreleri, BeWo hücreleri, Chang hücreleri, Detroit 562 hücreleri, HeLa 229 hücreleri, HeLa S3 hücreleri, Hep-2 hücreleri, KB hücreleri, LS 180 hücreleri, LS 174T hücreleri, hücreleri, WI- 28 VA13, 2RA hücreleri, WISH hücreleri, BS-C-I hücreleri, LLC-MKZ hücreleri, Klon M-3 hücreleri, l-lO hücreleri, RAG hücreleri, TCMK-l hücreleri, Y- ]_ hücreleri, LLC-PKi hücreleri, PK(15) hücreleri, GHi hücreleri, GH3 hücreleri, L2 hücreleri, LLC-RC 256 hücreleri, MHüh hücreleri, XC hücreleri, MDOK hücreleri, VSW hücreleri ve TH-I, B1 hücreleri ya da türevleri), her türlü doku veya organdan fibroblast hücreleri (kalp, karaciger, böbrek, barsak, ince bagirsak, özofagus, mide, sinir doku (beyin, omurilik), akciger, vasküler doku (arter, damar, kapiler), lenfoid hücre (lenf bezi, adenoid, tonsil, ilik ve kan), dalak ve fibroblast ile fibroblast-benzeri hücre hatlari (örn., TRG-2 hücreleri, sitrullinemi hücreleri, Dempsey hücreleri, Detroit 551 hücreleri, Detroit 510 hücreleri, Detroit 525 hücreleri, Detroit 529 hücreleri, Detroit 532 hücreleri, Detroit 539 hücreleri, Detroit 548 hücreleri, Detroit 573 hücreleri, HEL 299 hücreleri, IMR-9O hücreleri, MRG-5 hücreleri, WI-38 hücreleri, WI-26 hücreleri, MiCli hücreleri, CV- l hücreleri, COS-l hücreleri, CCS-3 hücreleri, cos-7 hücreleri, Afrika yesil maymun böbrekr hücreleri (VERO-76, ATCC CRL-l587; VERO, ATCC GOL-81); DBS-Fth-2 hücreleri, BALB/3T3 hücreleri, F9 hücreleri, SV-T2 hücreleri, M-MSV-BALB/3T3 hücreleri, K-BALB hücreleri, BLO-ll hücreleri, NOR-lO hücreleri, C3H/IOTI/2 hücreleri, HSDMNb hücreleri, KLN205 hücreleri, MCCoy hücreleri, Fare L hücreleri, Soy hücreleri, L-M soy (Fare L) hücreleri, L-MTK (Fare L) hücreleri, NCTC hücreleri, Hint muntac hücreleri, SIRC hücreleri, CH hücreleri ve Jensen hücreleri ya da bunlarin her türlü türevi) ya da teknikte uzman kisi tarafindan bilinen her türlü baskaca hücre ihtiva etmekte olup, bunlarla sinirli degildir. Hücreler, komsu, tek katmanli ve/veya süspansiyon kültürü, proteinlerin, örnegin antikorlarin transfeksiyonuna ve ekspresyonuna uygun olabilir. Hücreler, örnegin kesikli, yari kesikli ve perfüzyon ya da sürekli kültür yöntemleriyle kullanilabilir. Hücre Kültürü Tipleri Konunun anlasilmasi açisindan, sinirlandirma olmaksizin hücre kültürlerinin ve protein üretimine iliskin kültürleme islemleri kesikli kültür, kesikli besleme kültürü, perfüzyon kültürü veya bunlarin kombinasyonlarini içermesi uzman hekim tarafindan takdir edilecektir. Kesikli kültürde, hücreler öncelikle ortamda kültürlenir ve söz konusu ortam çikarilmaz, degistirilmez ya da tamamlanmaz, yani hücreler kültürleme islemi sirasinda, öncesinde ya da sonunda yeni ortamla hasat edilir. Kesikli besleme kültürlerine yönelik olarak, kültür ortami periyodik ya da sürekli olarak islem sirasinda yeni ortamla tamamlanarak kültürleme islemi süresi uzatilir, yani hücreler kültürleme islemi sirasinda yeni ortamla ("besleme ortami") asiri, iki günde bir, günde birden fazla ya da günde birden az vb. yukarida tanimlanan çesitli besleme rejimlerini ve sürelerini içerebilir. Ilaveten kesikli besleme kültürleri besleme ortamiyla sürekli beslenebilir. Ardindan istenen ürün, kültürleme isleminin sonunda hasat edilir. Bazen sürekli kültür olarak. bilinen perfüzyon kültürü hücre kültürünün yeni ortam ("perfüzyon ortami") katkisini aldigi ve tüketilen ortamin biyoreaktörden alindigi kültürdür. Perfüzyon, sürekli, asamali, aralikli ya da bunlardan herhangi birinin bir kombinasyonu olabilir. Perfüzyon hizlari, günlük birçok yararli hacme göre bir yararli hacimden daha az olabilir. "Perfüzyon akis hizi" terimi, tipik olarak belirli bir sürede çok sayida yararli hacmin bir kismi seklinde ifade edilen, bir biyoreaktörden geçirilen (eklenen ya da çikarilan) ortam. miktarini ifade eder. "Yararli hacim", hücre kültürü için kullanilan. biyoreaktör* hacmi miktarini ifade eder. Bir düzenlemeye göre perfüzyon akis hizi, günlük bir ya da daha az sayida yararli hacimdir. Perfüzyon besleme ortami, perfüzyon hizini minimuma indirmek üzere perfüzyon besin konsantrasyonunu maksimuma çikarmak için formüle edilebilir. Tercihen söz konusu hücreler, kültürde tutulur, çikarilan tüketilmis ortam büyük ölçüde hücre içermez ya da hücre kültürüne göre büyük ölçüde az hücre içerir. Hücre kültürüne göre ifade edilen rekombinant proteinler, kullanilan tutma sistemine dayali olarak hücre kültüründe tutulabilir ya da kültürden çikarilabilir. Bazen, konak hücrelerine yönelik, ifade edilen rekombinant proteinlerin biyoreaktörde filtre edilmeyen kisimda kalmasi ve süzüntünün büyük ölçüde rekombinant protein ya da konak hücre içermemesi ya da büyük ölçüde az protein ya da konak hücre içermesi ("bos süzüntü") içermesi açisindan tercih edilebilir. Baska zamanlarda hüdrelerin tutulmasi ancak ifade edilen proteinlerin süzüntüden geçmesine olanak verilmesi tercih edilebilir ("toplama süzüntüsü"). Perfüzyon santrifüjleme, sedimentasyon ya da filtrasyon içeren birtakim. yöntemlerle gerçeklestirilebilir, bkz. örn. Voisard Bir düzenlemeye göre bir filtrasyon yöntemi kullanilir. Filtreler, membran filtreler, seramik filtreler ve metal filtreler içermekte olup spiral sargi, boru seklinde ya da levha seklinde olabilir. Bir ya da daha fazla sayida filtre, seri ya da paralel halde bir biyoreaktöre birlikte ya da bagimsiz olarak sivi irtibatiyla baglanabilir. Hücre ve/veya rekombinant protein ürün tutulmasi için memeli hücre perfüzyon kültüründe delikli fiber filtreler kullanilir. Hücre kültürü ortamlari, hücreler (tam ve lize edilmis), çözülebilir sekilde ifade edilen rekombinant proteinler, konak hücre proteinleri, atik ürünler ve benzeri dahil hücre kültürü filtreye aktarildiginda, gözenek büyüklügüne ve moleküler agirlik sinirina (MWCO) dayali olarak delikli fiber materyali lümen tarafinda (iç taraf) belirli hücre kültürü bilesenlerini tutabilir ve delikli fiber Hateryalin gözenek büyüklügüne ve moleküler agirlik sinirina dayali olarak belirli bilesenlerin filtreden geçmesine (süzüntü) olanak verir. Tutulan Hateryal (filtreden geçmeyen) biyoreaktöre geri döner. Yeni perfüzyon hücre kültürü ortami, biyoreaktöre eklenir ve süzüntü önceden belirlenen araliklarla ya da sürekli olarak filtreden çekilerek istenen ya da sürekli biyoreaktör hacmi idame edilir. Süzüntü çikarilarak toplama tanklarinda, posetlerde ya da toplayici kutularda saklanabilir ya da filtrasyon, santrifüjleme ve/veya diger akis asagi saflastirma yöntemleri ya da benzeri gibi baska bir ünite islemine dogrudan transfer edilebilir. Mikrofiltrasyona yönelik delikli fiberlerin gözenek büyüklügü araligi tipik olarak 0.1 1nn ila 5-10 um, moleküler agirlik siniri 500 kDa ya da daha fazla Olabilir söz konusu fiberler proteinin süzüntüye geçmesine olanak. vermek üzere kullanilabilir. Ultrafiltrasyonlu delikli fiberlerin gözenek büyüklügü araligi tipik olarak 0,01 um ila 0,1 um ya da moleküler agirlik siniri 300 kDa ya da daha az olup, söz konusu fiberler filtre edilmeyen kisimda arzu edilen proteinin tutulmasi ve biyoreaktöre geri döndürülmesi için kullanilabilir. Bu, örnegin toplama amaciyla rekombinant protein ürünün konsantre edilmesi için kullanilabilir. Xampler UFP-750-E-4MA, Xampler UFP-30-E-4MA, (GE Healthcare, Pittsburg, PA) ve Midikros TC Modules TOZ-EOBO-IO, TOZ-050-10, Dominguez, CA) gibi filtreler ticari olarak mevcuttur. Mevcut bulus, filtrenin bos süzüntü toplandiginda süzüntüye geçmemesine ancak biyoreaktörde tutulmasina olanak verecek sekilde gözenek büyüklügüne ya da nmleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre olmasini saglar. Mevcut bulus ayrica filtrenin toplama süzüntü toplandiginda rekombinant proteinin delikli fiberden geçmesine olanak verecek gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip bir delikli fiber filtre olmasini saglar. Hücre kültürü, hücre kültürünü delikli fiberin lumen tarafindan geçiren bir pompalama sistemiyle biyoreaktörden çekilerek filtreye verilir. Hücre pompalama sistemlerinin örnekleri peristaltik pompalari, çift diyaframli pompalari, düsük parçalayici pompalari (Levitronix® pompalar, Zurich, Isviçre) ve alternatif teget akis sistemlerini (ATFm, Refine Technology, Pine Brook, NJ, bkz. (7), 62-63.) içerir. Süzüntü, peristaltik pompalarin kullanimiyla filtrelerden çekilebilir. Tek Üniteli Filtre Sistemi Mevcut bulus, tek hücre pompalama cihaziyla çalistirilabilen, opsiyonel olarak bir muhafaza içinde bulunan tek üniteli filtre sisteminde seri halde kombine edilmis farkli gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip iki ya da daha fazla sayida delikli fiber filtre bileseni ihtiva eden tek üniteli filtre sistemi saglar. Bu, ürün tutma modunda (bos süzüntü alinarak) ya da ürün toplama modunda (toplama süzüntüsü alinarak) bir filtre sistemi (Sekil 1) araciligiyla toplama islemine olanak verir. Tek üniteli filtre sistemi, konakçi hücre proteinlerinin veya diger atiklarin toplama döngüleri sirasinda hücre kültüründen çikarilmasi, hücre kültürü süresinin uzatilmasi avantajlari saglar. Tek üniteli filtre sisteminde daha büyük toplama verimliligine yönelik potansiyel olarak daha az filtre kirlenmesi gerçeklesir. Tek üniteli filtre sistemi akis asagi purifikasyon kolonlarinin daha kolay ve verimli sekilde doldurulmasi açisindan çoklu, küçük serilerde süzüntü saglayabilir. Tek üniteli filtre sistemi sürekli imalat prosesinin bir parçasi olarak kullanilabilir. Tek üniteli filtre sistemi konfigürasyonu farkli gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip, seri halde konfigüre edilmis iki ya da daha fazla sayida delikli fiber filtre bileseni içermekte olup, tüm filtrelerin birbirleriyle ve biyoreaktörle sivi irtibati mevcuttur ve filtreler tek pompalama cihazi araciligiyla çalistirilabilir. Söz konusu delikli fiber filtre bilesenleri örnegin GE Healthcare and Spectrum Laboratories, Inc. sirketinden ticari olarak temin edilebilir. Hücre kültürü tüm filtrelerden akarken, süzüntü tek seferde bir ya da daha fazla sayida filtreden seçilerek alinabilir. Süzüntü (bos ya da toplama), gözenek büyüklügüne veya. moleküler agirlik sinirina dayali olarak uygun delikli fiber bilesenden süzüntünün çekilmesiyle alinir. Bos süzüntü ve toplama süzüntü, bagimsiz peristaltik pompalarin kullanimiyla ayri ve bagimsiz olarak alinir. Süzüntü toplama zamanlamasi ve orani, ayri peristaltik pompalar araciligiyla kontrol edilebilir. Bagimsiz delikli fiber filtre bilesenleri uygulamaya uygun her türlü konfigürasyonda hizalanabilir. Bir düzenlemeye göre hücre kültürünün rekombinant protein ürününün hücre kültürü biyoreaktöründeki filtrelenmemis kisimda tutulacagi sekilde gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip delikli fiber filtre bileseni, biyoreaktörden hücre kültürü akisini ilk alacak eleman olarak yerlestirilir. Tek üniteli filtre sistemi konfigürasyonu, toplama süzüntüsünün ve bos süzüntünün ayrilmis sekilde ve ilgili volümetrik oranla alma zamanlamasinin arzu edildigi gibi kontrol edilebilecegi sekilde biyoreaktörden alinabilmesine olanak verir. Süzüntü, tek üniteli filtre sisteminden perfüzyon hiziyla ayni hizda toplanir. Ticari olarak mevcut delikli fiber filtre bileseni kullanmaya ilaveten delikli fiber materyali tekil filtrede bir birlestirme bölgesiyle birbirinden izole edilen iki ayri bölge içerecek sekilde yapilandirilabilir. Ayrica, farkli gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip ayri delikli fiberler, iki süzüntü tarafini izole etmek üzere bir baglanti bölgesiyle orta birlestirme alaninda birlestirilebilir. Delikli fiber uzunlugu boyunca her gözenek büyüklügü alani, diger gözenek büyüklügü kabuk tarafi alanlarindan izole kabuk taraflarina sahip olabilir ve böylece süzüntü, digerlerinden bagimsiz olarak her gözenek büyüklügü kabuk tarafi alanindan çikarilabilir. Filtreler, delikli fiber filtre bilesenleri arasinda sivi iletisimine olanak veren her türlü yöntemle birbirine takilabilir. Filtre bilesenleri birbirine yapistirilabilir ya da kaynaklanabilir. Filtreler üçlü klamp gibi bir klampla ya da filtre ünitelerini birbirine baglayan ve filtreler arasinda sivi akisina olanak veren baskaca mekanik cihazla birbirine baglanabilir. Filtre muhafazasi, dogrudan ya da disli bir kuplör yoluyla filtre ünitelerini birbirine baglamak için kullanilan iç ve dis disli bölgelerle donatilabilir. Filtreler ayrica her türlü kilitleme mekanizmasiyla baglanabilir. Iki filtrenin uç uca dogrudan konumlandirilmasi hücre akisini engelleyerek kesmeye bagli hücre hasarina neden olan delikli fiberler arasinda siki baglanti ya da hafif hizasizlik olusturabilir. Sonuç olarak filtrelerin hizalanmasina dayali olarak canlilikta düsüs yasanabilir. Komsu filtre üniteleri arasinda belirli bir mesafe saglayan, bir filtrenin lumeniyle sonraki delikli fiberin lumeni arasinda hücrelerin daha kolay akisina olanak veren bir ara parça ya da kuplör filtre üniteleri arasinda kullanilabilir. Ara parça, bagimsiz filtre ünitelerini birbirinden ayirarak bagimsiz delikli filtreler arasinda steril akis yoluna olanak verirken süzüntünün çekildigi delikli kabuk taraflarinin izolasyonunu saglar. Söz konusu ara parçalar, filtreler arasinda güvenli ve steril bir baglanti olusturan, filtreler arasinda sivi baglantisina olanak veren her türlü materyalden yapilabilir. Söz konusu ara parçalar filtrelere kendinden sizdirmazlik. saglayabilir. Ara parçalar, birlestirilen filtrelere yapistirilabilir ya da kaynatilabilir. Ara parça, bir klamp gibi söz konusu ara parçayi filtrelere sabitleyen bir mekanik cihazla sabitlenebilir. Ara parça, dogrudan ya da disli bir kuplör vasitasiyla ara parçayi filtrelere sabitlemek için kullanilacak dahili ve harici disli bölgelerle donatilabilir. Ara parça ayrica her türlü kilitleme mekanizmasiyla baglanabilir. Tek üniteli filtre sistemi, özellikle ikiden fazla filtrenin seri halde konfigüre edilmesi halinde kullanim kolayligi saglamak üzere opsiyonel olarak bir dis muhafazayla muhafaza edilebilir. Dis muhafaza, filtre ünitesi içindeki materyale steril bir bariyer saglayacak plastik ya da baskaca uygun materyalden mamul olabilir. Söz konusu muhafaza, ticari olarak mevcut delikli fiber filtrelere takilmak üzere üretilen sekonder muhafaza olabilir ya da söz konusu muhafaza bagli delikli fiber filtrelere yönelik primer yuva olarak üretilebilir. Muhafazada, farkli gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlikr sinirinar sahip her delikli fiber filtreye yönelik olarak besinin, filtre edilmeyen kismin ve ayrica en az bir süzüntünün içeri alinmasina ve toplanmasina olanak veren yeterli sayida açiklik bulunmalidir. Tek üniteli filtre sistemi, hücre kültürünü yukarida açiklandigi üzere sabit akis hizinda delikli fiberin lumen tarafindan geçiren tek hücre pompala sistemiyle birlikte kullanilabilir. Hücre Kültürü Prosesleri Hücre kültürü, hayvan ya da memeli hücre kültürü için geleneksel olarak uygulanan kültür kaplari ve/veya kültür aparatlari kullanarak küçük ila büyük ölçekli rekombinant protein üretimini uyumlastiran kosullar altinda gerçeklestirilebilir. Daha büyük ölçekte kültürlemeye yönelik olarak hücre kültürleme sisesi sistemleri, dolgu yatak tipi kültürleme cihazlari, fermentör tipi tan biyoreaktörler, hava basmali tip biyoreaktörler, akiskan yatakli biyoreaktörler, delikli fiber biyoreaktörler, karistirmali tankli biyoreaktörler, çok asamali biyoreaktörler ya da teknikte uzman kisi tarafindan bilinen her türlü baska uygun bir cihaz kullanilabilir. Tek kullanimlik biyoreaktörler* gibi tek kullanimli biyoislem ekipmani da kullanilabilir. Biyoreaktör sistemleriyle mikrotasiyicilar da kullanilabilir. Sistemler, kesikli, kesikli besleme veya perfüzyon/sürekli modda çalistirilabilir. Ilaveten kültür kaplari filtreler, yer çekimi, santrifüj kuvveti ve benzeri gibi ilave bir aparatla donatilabilir. Bir hücre kültürünün "büyüme fazi" terimi hücrelerin genellikle hizla bölündügü üstsel hücre büyümesi (yani logaritmik faz) periyoduyla ilgilidir. Hücreler, yaklasik bir gün veya yaklasik iki gün veya yaklasik üç gün veya yaklasik dört gün veya dört günden daha uzun bir süre büyüme fazinda idame edilir. Hücrelerin büyüme fazinda idame edildigi süre, Örnegin hücre tipine, hücrelerin büyüme hizina ve/veya kültür kosullarina bagli degisiklik gösterecektir. periyodu ifade eder. Genel olarak. geçis fazi, kültür kosullarinin büyüme fazindan üretim fazina geçisi deskteklemek üzere kontrol edilebildigi süredir. Sicaklik, ozmolalite, bir ya da birden fazla vitamin, amino asit, seker, amonyum, laktik asit ve tuz ile benzeri konsantrasyonu dahil ancak bunlarla sinirli olmayan çesitli hücre kültürü parametreleri, degisikligi kontrol etmek üzere izlenebilir veya manipule edilebilir. ilgilidir. Logaritmik hücre büyümesi tipik olarak bu faz öncesinde ya da sirasinda azalir ve protein üretimi bunun yerine geçer. Kesikli besleme ve perfüzyon hücre kültürü prosesleri, hücre kültürü ortamini destekler veya istenen hücre yogunlugu, canliligi ve/Veya rekombinant protein ürün titresi elde etmek ve/veya idame etmek üzere bu faz sirasinda yeni ortam saglar. Üretim fazi, büyük ölçekte gerçeklestirilebilir. Büyük ölçekli hücre kültürleri, en az idame edilebilir. Tercih edilen bir düzenlemeye göre üretim fazi, 500L, 1000L ve/veya ZOOOL'lik biyoreaktörlerde gerçeklestirilir. Rekombinant proteinlerin üretimi, çoklu fazlarda gerçeklestirilebilir. Çoklu faz prosesinde, hücreler iki ya da daha fazla sayida ayri fazda kültürlenir. Tipik olarak hücreler öncelikle bir ya da daha fazla büyüme fazinda, hücre proliferasyonunu ve canliligini maksimize eden çevre kosullarina tabi olarak kültürlenir, ardindan protein üretimini maksimize eden çevre kosullarina tabi sekilde üretim fazina aktarilir. Memeli hücrelerle rekombinant proteinlerin üretimine iliskin ticari bir proseste örnegin nihai üretim kültüründen önceki farkli kültür kaplarinda (N-x'ten N-l'e) daha fazla sayida olmak üzere yaygin sekilde çok sayida büyüme fazi mevcuttur. Bir ya daha fazla sayida geçis fazi, büyüme ve üretim fazlarindan önce gelebilir veya bu fazlari ayirabilir. Üretim fazi, büyük ölçekte gerçeklestirilebilir. Mevcut bulusa uygun yöntem, hücre kültürünün üretim asamasini uzatmak için kullanilabilir. Bir rekombinant proteinin ticari üretime yönelik hazirlanmasi sirasinda, nihai üretim kültüründen önce gelen hücre kültürleri tipik olarak bir tohum dizisi ve inokulum dizisi olmak üzere iki prosese girer. Tohum dizisi fazi (N-X) hücrelerin hizla sayica çogaldigi küçük ölçekte meydana gelir. inokulum dizisi fazinda (N-l), hücreler üretim biyoreaktörüne yönelik inokulum üretmek üzere ilaveten artirilir. Tohum ve N-l dizileri, tipik olarak kesikli hücre kültürleri olmak üzere her türlü kültürleme yöntemiyle üretilebilir. 15 x 106 hücre/ml seklinde N-l hücre yogunlugu, üretim biyoreaktörlerinin tohumlanmasi açisindan tipiktir. Yüksek N-l hücre yogunluklari ve/veya hücre kültürü ortaminin ayarlanmasi, üretim biyoreaktöründe arzu edilen hücre yogunlugunun elde edilmesi için gerekli süreyi azaltabilir ve hatta ortadan kaldirabilir. Bir düzenlemeye göre yüksek. N-l hücre yogunluklari, alternatif teget akis filtrasyonu kullanilan perfüzyon kültürü yoluyla elde edilir. Alternatif teget akis filtrasyonu kullanilan perfüzyon prosesi yoluyla N- 1 hücre kültürü büyümesi, her türlü istenen yogunlukta hücre saglayabilir, 9O x 106 hücre/ml veya daha fazla hücre yogunlugu gibi yüksek hücre yogunluklari kolaylikla elde edilebilir. N-l hücre kültürü, tekli bolus asilama kültürü üretmek için kullanilabilir 'veya çoklu üretini biyoreaktörünü asilamak. üzere saglanan. bir* döner tohuni stok. kültürü olarak kullanilabilir. Asi yogunlugu, üretilen rekombinant protein düzeyine olumlu etki edebilir. Rekombinant protein ürünü düzeyleri, artan asi yogunluguyla birlikte artma egilimi gösterir. Titredeki iyilesmeyüksek asi yogunluguna bagli olmanin yani sira üretime alinan hücrelerin metabolik ve hücre döngüsü durumundan etkilenme egilimi gösterir. N-l prosesi sirasinda hücre kültürünün, üretim biyoreaktörüne asilama öncesinde bir üretim fazina girmesine olanak verilebilir. Söz konusu asilama, üretimin derhal üretim biyoreaktöründe baslamasina olanak verir. "Hücre yogunlugu" terimi, belirli bir kültür ortami hacmindeki hücre sayisini ifade eder. "Canli hücre yogunlugu", standart canlilik tayinleri ile belirlendigi üzere (tripan mavisi hariç birakma yöntemi gibi) belirli bir kültür ortami hacmindeki canli hücre sayisini ifade eder. hacmin, toplam hücre kültürü hacmine orani olup, yüzde cinsinden ifade edilir (bkz. Stettler, ve ark. (2006) hacmi, hücre yogunlugunun ve hücre çapinin bir fonksiyonudur; sikistirilmis hücre hacmindeki artislar, hücre yogunlugundaki, hücre çapindaki ya da her ikisindeki artislardan kaynaklanabilir. Sikistirilmis hücre hacmi, hücre kültüründeki kati içerigin bir ölçütüdür. Konakçi hücreler, büyüklük açisindan degisiklik gösterdiginden ve hücre kültürleri ölü ya da ölmek üzere olan hücreler ve ayrica baska hücresel kalinti da içerdiginden, sikistirilmis hücre hacmi bir hücre kültüründe kati içerigi daha büyük dogruluk derecesiyle açiklanabilir. Örnegin, 50 x 106 hücre/ml hücre yogunluguna sahip ZOOOL'lik kültürün sikistirilmis hücre hacimleri, hücre büyüklüklerine dayali olarak büyük oranda degisiklik gösterebilir. Ilaveten bazi hücreler örnegin büyümenin durmasi halinde oldugu gibi büyüklük açisindan artis gösterir, böylece büyümenin durmasi öncesinde ve büyümenin durmasi sonrasinda sikistirilmis hücre hacmi hücre büyüklügü artisinin sonucu olarak biyokütledeki artisa dayali olarak farkli olabilir. Üretim fazi sirasinda düsük sikistirilmis hücre hacmi, yüksek hücre yogunlugu perfüzyon kültürlerini engelleyebilen çözünmüs oksijen dagitma sorunlarini hafifletmeye yardimci olur. Düsük sikistirilmis hücre hacmi ayrica, düsük ortam saklama kaplarinin kullanimina olanak veren küçük ortam hacmine olanak verirken yavas akis hizlariyla kombine edilebilir. Düsük sikistirilmis hücre hacminin hasat ve akis asagi prosese etkisi, yüksek hücre biyokütle kültürlerine kiyasla daha azdir. Bunlarin hepsi rekombinant protein terapötikleriyle ilgili maliyetleri azaltir. Bir` düzenlemeye göre, söz konusu yönteni ilaveten. bir üretim fazi sirasinda sikistirilmis hücre hacminin %35'ten az ya da sikistirilmis hücre hacmi %30'dan az ya da %30'a esittir. Bir düzenlemeye göre %35'ten az ya da %35'e esit sikistirilmis hücre hacmindeki memeli hücre kültürünün canli hücre yogunlugu düzenlemeye göre, memeli hücre kültürünün canli hücre hücre/ml'dir. Hücre Kültürü Kontrolleri Mevcut bulus yöntemlerine uygun hücre kültürü kosullari, tipik olarak kullanilan ve hücrelerin kesikli, kesikli besleme ya da perfüzyon (sürekli) kültürlenmesi açisindan bilinen veya söz konusu yöntemlerin kombinasyonu olup, pH, çözünmüs oksijen (02) ve karbon. dioksit (COz), çalkalama. ve neni ile sicaklik bilhassa önemlidir. Rekombinant protein üretimi sirasinda, hücrelerin arzu edilen bir süreyle veya arzu edilen bir yogunluga kadar yetistirildigi ve ardindan söz konusu hücrelerin fizyolojik halinin yine hücrelerin hücre yogunlugunu artirmak üzere rekombinant protein üretmek üzere enerji ve alt katmanlar kullandigi büyüme açisindan sinirli ya da duragan, yüksek verimlilik haline dönüstürüldügü kontrollü bir sistem bulunmasi arzu edilir. Ticari ölçekte hücre kültürü ve biyolojik terapötik. imalatina yönelik. olarak. hücre büyümesini sinirlandirma veya duraganlastirma ile üretim asamasi sirasinda hücreleri büyüme açisindan sinirli ya da duragan halde idame etme yetenegi son derece arzu edilir. Söz konusu yöntemler birlikte veya tek basina örnegin sicaklik degisikliklerini, protein üretimine iliskin kimyasal endükleyicilerin kullanimini, besin sinirlandirma veya yoksun birakma ile hücre döngüsü inhibitörlerini içerir. Büyümeyi sinirlandirmaya ya da yavaslatmaya yönelik bir mekanizma, hücre kültürü sirasinda sicakligin degistirilmesidir. Örnegin, yüksek sicaklikta büyüme fazi gerçeklesebilir, düsük sicakliga geçis üretim fazini baslatabilir ve/Veya devam ettirebilir. Örnegin, yaklasik 35°C ile yaklasik 38°C arasinda birinci sicaklik baslangiç noktasinda büyüme fazi gerçeklesebilirken, yaklasik 29°C ile yaklasik 37°C arasinda, yaklasik 30°C ile yaklasik 36°C arasinda veya yaklasik 30°C ile yaklasik 34°C arasinda ikinci bir sicaklikta üretim fazi gerçeklesebilir. Sicaklik baslangiç noktasinin degistirilmesi manuel olarak ya da biyoreaktör kontrol sistemlerinin kullanimiyla otomatik olarak gerçeklestirilebilir. Sicaklik baslangiç noktasi, önceden belirlenen bir zamanda ya da hücre yogunlugu, titre veya bir ya da daha fazla sayida ortam bilesenin konsantrasyonu gibi bir ya da daha fazla sayida hücre kültürü parametresine yanit olarak degistirilebilir. Söz konusu yöntem, arzu edilen hücre yogunlugu elde edildiginde sicaklik baslangiç degisikligini tetiklemek üzere biyoreaktör kontrol sistemine entegre bir çevrimiçi biyokültle izleme araci kullanir. Örnegin, çevrimiçi hücre yogunlugu hesaplamasina yönelik kapasitans bazli biyokütle probu kullanilabilir çevrimiçi ölçümlerden elde edilen veriler, biyoreaktör sicakliginda bir degisikligi tetiklemek üzere kullanilabilir. Söz konusu kapasitans bazli problar Fogale kapasitans sensörünü (DN12-200) (Nimes, Fransa) içerir. Ilaveten, kafetin, butirat ve/veya heksametilen bizasetamid (HMBA) gibi kimyasal protein üretimi indükleyicileri sicaklik degisimi sirasinda, öncesinde veya sonrasinda eklenebilir. Indükleyicilerin, sicaklik degisimi sonrasinda eklenmesi halinde söz konusu indükleyiciler sicaklik degisiminden bir saat ila bes gün sonra, opsiyonel olarak sicaklik degisiminden bir ila iki gün sonra eklenebilir. Hücre kültürleri, hücreler arzu edilen proteinleri üretmeye devam ederken günler ve hatta haftalar boyu saglanabilir. Arzu edilen fizyolojik halde hücrelerin idamesine iliskin baska bir yöntem, hücre kültürünün düsük L-asparajin kosullarina ve/veya asparajin starvasyonuna maruz birakilmasiyla hücre büyümesi duraganlasmasinin Hücre büyümesi duraganlastirilmasi, L-asparajinin sinirli konsantrasyonunu ve hücre kültüründe düsük konsantrasyonlu L- asparajin saglanmasini içeren bir kültür ortami üzerinden gerçeklestirilebilir ve saglanabilir. L-asparajin konsantrasyonunun 5 mM veya daha az oranda saglanmasi, verimliligin arttigi ve büyümenin duraganlastigi bir durumda hücreleri indüklemek ve saglamak üzere kullanilabilir. Hücre döngüsü inhibitörleri, hücre döngüsü ilerlemesini regüle ettigi bilinen ya da bundan süphelenilen bilesik, buna bagli transkripsiyon prosesleri, DNA onarimi, farklilasma, senesans ve apoptoz hücre büyümesi duraganlasmasini indükleme hususunda faydalidir. Siklin bagimli kinazlar (CDK'lar) gibi döngü mekanigiyle irtibat halindeki hücre döngüsü inhibitörleri, AKT, mTOR ya da hücre döngüsünü dogrudan ya da dolayli etkileyen diger yollar gibi baska yollardan proteinlerle etkilesime giren moleküller kadar faydalidir. Hasat ve Purifikasyon Ifade edilen rekombinant proteinler, geri kazanilabilecekleri ve/veya toplanabilecekleri kültür ortamina salgilanabilir. Ardindan rekombinant proteinler uygun farmasötik formülasyona hasat, purifikasyon, endotoksin ve/veya Viral inaktivasyon/filtrasyon, ultrafiltrasyon/diafiltrasyon ve/Veya depolama içeren bir ya da daha fazla sayida isleme asamasina tabi tutulabilir. Belirtilen rekombinant proteinler hasat süzüntüsünde tutulabilir. Proteinler, teknikte bilinen ve/Veya ticari saticilardan elde edilebilen prosesler ve ticari olarak mevcut ürünler kullanilarak hasat süzüntülerinden saflastirilabilir veya kismen saflastirilabilir. Söz konusu yöntemler flokülasyon; santrifüjleme; presipitasyon; derinlik filtrasyonu gibi filtrasyon yöntemleri; diger mevcut yöntemler arasinda afinite kromatografisi, büyüklük dislanimli kromatografi, iyon degisimli kromatografi, karisik modlu anyon degisimli kromatografi, hidrofobik etkilesimli kromatografi ve hidroksiapatit kromatografi dahil kromatografi yöntemleri Ardindan purifiye proteinler "formüle edilebilir" yani tamponla degistirilebilir, sterilize edilebilir, bulk ambalajlanabilir ve/Veya nihai kullanici için ambalajlanabilir. Farmasötik bilesimlere yönelik uygun formülasyonlar Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Basim l995 Mack Publishing Company, Easton, PA'da açiklananlari Proses Analitik Teknikler Rekombinant proteinin ve üretim prosesinin karakteristik özelliklerini kantitatif ve/veya kalitatif olarak izlemek üzere hücre kültürü ve purifikasyon prosesleri sirasinda alinan numuneleri izlemek ve degerlendirmek üzere proses analitik teknolojiler ve yöntemler mevcuttur. Söz konusu gerçek zamanli veya iç bilgiler, zamaninda karar vermek. ve prosesleri gerektigi gibi modifiye etmek. üzere titre, hücre yogunlugu gibi ürün ve üretim parametrelerini, post- translasyon modifikasyonlari gibi ürün kalite özelliklerini; safsizliklar ve benzeri gibi ürün ve proses degiskenligini izlemek ve/Veya kontrol etmek üzere kullanilabilir. Örnegin glikan türlerinin dagilimi gibi ürün kalitesi özellikleri, oksidasyon düzeyleri veya deamidasyon izlenebilir ve/veya kontrol edilebilir. Akis yukari hücre kültürü prosesinin, veya akis asagi purifikasyon prosesinin her asamasi, özel ürün kalitesi özellikleri (PQA) miktarina iliskin bilgileri saglamak ve PQA'yi önceden belirlenen hedef ve aralikta kontrol etmek üzere izlenebilir. Numuneler aralikli olarak, arzu edilen sikliklarda veya sürekli olarak alinabilir. Numuneler gerçek zamanli ya da gerçek zamana yakin analiz edilebilir veya daha sonra analiz edilmek üzere saklanabilir. Bu bilgiler, akis yukari ve akis asagi prosesler sirasinda degisiklik yapmak üzere kullanilabilir. Ürün kalitesi özelliginin tespit edilmesi, kütle spektrometrisi, UV'li sivi kromatografi ve/Veya kütle spektrometrisi tespiti ile kapiler elektroforez ve benzeri kullanilarak gerçeklestirilebilir. Söz konusu prosesler belirli ürün kalitesi özelligi düzeyine göre belirlenen besinler, sicaklik, proses süresi gibi manuel veya otomatik. proses ayarina göre sürekli izlenecek sekilde adapte edilebilir. Amino asit isleme ve glikozilasyon gibi post-translasyonal modifikasyonlarin varligini tespit etmeye yönelik intakt kütle analizi, büyüklük dislanimi modunda ESI-MS bagli çalistirilan polihidroksietil aspartamid kolonu kullanilarak gerçeklestirilebilir (Brady ve ark. (2008) J Am Soc Mass Spectro, 19: 502-509). Iyon degisim kromatografisinden eluatin gerçek zamanli izlenmesi, lazer isik saçilmali detektör ve UV absorbansi kullanilarak her fraksiyona yönelik normalize LS/UV orani izlenerek gerçeklestirilir (bkz. ABD Patent Yayin No. ABD Çoklu özellik yöntemi, çesitli veritabanlari ve Sequest (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA), XlTandem (The Global Proteome Machine Organization) ya da Mascot (Matrix Science, Boston, MA) kullanilarak tandeni MS verilerini arastirmak ve karakterize etmek üzere tekil sivi kromatografisi/kütle spektrometrisinden (LC/MS) faydalanir. Yüksek pH degerinde ya da düsük pH degerinde disülfit izoformlari saglamak ve sukkinimid varyasyonlarini idame ettirmek ve korumak için numuneler denatüre edilebilir. Ardindan numune indirgenir, alkile edilir ve ardindan tiripisinle dijesyona tabi tutulur. Ardindan numune bir MS'e (Q ExactiveTM Hibrit Kuadrupol-Orbitrap Kütle Spektrometrisi, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) enjekte edilir ve Pinpoint yazilimi (Thermo Fischer Scientific) kullanilarak analiz gerçeklestirilir. Tanimlanabilir, miktar belirlenir ve izlenen özellikler izomerizasyon, deaminazyon, disülfit indirgeme, konakçi hücre proteini kontaminasyonu, mutasyonlar, hatali birlestirmeler, hidroksilisin, tioeter, non-glikolize agir zincirler, C-terminal amidasyon, rezidüel protein A içerir, glikanlari karakterize eder ve molekül kimligi saglar. Izlenen her özellige yönelik kütle dogrulugu tahmin edilen kütlenin 5 ppm altinda ayarlanabilir. Peptid/özellik tanimlamasi MS2 fragmentasyon ve ortogonal karakterizasyon yöntemleriyle onaylanir (örnegin glikozilasyon için HILIC-MS). Eksperimental izotopik dagilimin iç çarpimlar skoru, teorik izotopik dagilima kiyasla 0,95'ten iyi olmalidir. Her özellige yönelik bir tutma süresi penceresi olusturulur ve her özellige yönelik tespit edilebilir tüm yük durumlari kantifikasyon açisindan degerlendirilir. Özellikteki degisikligi tespit edecek bir kriter tanimlanir. Örnegin, bir deaminasyon degeri belirlenerek deaminasyon izlenebilir (deamine peptit toplamina bölünen deamine peptit ile 100 ile çarpilan modifiye edilmemis parent peptit. Glikosilasyon, her spesifik glikanin tespit edilebilir tüm glikanlarin toplamina kiyaslanmasiyla izlenebilir. Bazi düzenlemelere göre, proses analitik teknolojiler "ürün özelik kontrolünü" de (PAC) içerebilir. PAC, bir ya da daha fazla sayida CQA'nin gerçek zamanli geri bildirim kontrolünü gerçeklestirmek üzere çoklu PAT elemanlariyla biyoislem modelini kombine eder. Bu yeni pAC prosesi, biyofarmasötiklerin QbD üretiminin uygulanmasinin bir örnegidir. PAC prosesi, CQA'yi etkileyebilen bir kumanda bileseninin kullanimindan faydalanir. Kumanda bileseni, QTPP'de belirtildigi üzere CQA'yi istenen hedefte saglamak için model bazli kontrol döngüsüne yerlesiktir. Spesifik olarak kumanda bileseni, CQA'yi matematik olarak modellenebilen bir sekilde etkileyen proses parametresine iliskin bir ayardir. Örnegin inhibitör veya aktivatör düzeyleri, bir ürünün glikozilasyon profilini regüle etmek amaciyla bir glikozilasyon enzimini regüle etmek amaciyla dinamik olarak ayarlanabilir ancak burada söz konusu düzeylerin etkilerinin matematik olarak modellenebilmesi sarti aranir. Benzer sekilde sicaklik veya pH, bir uygulama sirasinda ayarlanabilir ve burada söz konusu bilesenlerin CQA'lara etkisinin güvenilir sekilde modellenebilmesi sarti Proteinler Burada kullanildigi üzere "peptit", "polipeptit" ve "protein", doküman boyunca birbirinin yerine kullanilabilir ve birbirine peptit baglariyla baglanmis iki veya daha fazla sayida amino asit kalintisi ihtiva eden bir molekülü ifade eder. Peptitler, polipeptitler ve proteinler gikozilasyon, lipit baglama, sulfasyon, glutamik asit kalintilarinin gamma-karboksilasyonu, karboksilasyon ve ADP ribosilasyonu içeren ancak bunlarla sinirli olmayan modifikasyonlari ihtiva eder. Proteinler, protein bazli ilaçlar dahil olmak üzere bilimsel veya ticari alanda olabilir. Proteinler, diger bilesenlerin yani sira antikorlar, füzyon proteinleri ve sitokinler ihtiva eder. Peptitler, polipeptitler ve proteinler, hücre kültürü yöntemleri kullanilarak prokaryot ve ökaryot hücre hatlari tarafindan üretilebilir ve "rekombinant peptit", "rekombinant polipeptit", "rekombinant protein", "rekombinant protein ürünü" ve "ürün" anlamina gelebilir. Belirtilen proteinler intraselüler olarak üretilebiliri ya da geri kazanilabildigi ve/veya toplandigi kültür ortamina salinabilir. Mevcut bulusa uygun yöntemlerle avantajli olarak üretilebilen memeli proteinlerinin sinirlandirici olmayan örnekleri, asagidaki proteinlerden birinin tamamiyla ya da bir kismiyla ayni ya da bunlara büyük ölçüde benzer amino asit sekanslari ihtiva eden proteinler içerir: tümör nekroz faktörü (TNF), flt3 ligand (WO 94/28391), eritropoeitin, trombopoeitin, kalsitonik, IL-2, anjiyopietin-Z (Maisonpierre ve ark. (1997), yönelik ligand (RANKL, WO 01/36637), tümör nekroz faktörüyle (TNF)-ilgili apoptoz-indükleyici ligand (TRAIL, WO 97/01633), timik› stroma-türevli lemfopoietin, granulosit koloni stimule edici faktör, granulosit-makrofaj koloni stimule edici faktör (GM-CSF, Avustralya Patent. No. 588819), mast hücresi büyüme faktörü, kök hücre büyüme faktörü (ABD Patent No.6,204,363), epidermal büyüme faktörü, keratinosit büyüme faktörü, megakaryot büyüme ve gelisme faktörü, RANTES, insan fibrinojen benzeri 2 proteini (FGL2; NCBI erisim no. NM_OO682; RÜegg ve insülinotropin, insülin benzeri büyüme faktörleri, paratiroid hormonu, d-interferonlar, v- interferon ve konsensus interferonlar dahil interferonlar (ABD Patent No. 4,695,623 ve 4,897471), sinir büyüme faktörü, beyin türevli nörotrofik faktör, sinaptotagmin benzeri proteinler (SLP 1-5), neurotrofin-3, glukagon, interlökinler, koloni stimule edici faktörler, lemfotoksin-ß, lösemi inhibe edici faktörler ve onkostatin-M. Mevcut bulusa uygun yöntemlere göre üretilebilen proteinlerin açiklamalari örnegin su yayinlarda incelenebilir, Insan Sitokinleri: Handbook for Basic and Clinical Research, Volumes 1-3 (Aggarwal and Gutterman, baski. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Büyüme Faktörleri: A Practical Approach (McKay and Brown, baski., Oxford University Press Cilt 1 ve 2 (Thompson and. Lotze bask., Academic Press, San Diego, CA, 2003). Ilaveten mevcut bulusun yöntemleri, yukarida belirtilen herhangi bir proteine, sözkonusu reseptöre veya yukarida belirtilen proteinlerin herhangi birine iliskin antagoniste ve/veya söz konusu reseptörlere ya da antagonistlere büyük ölçüde benzer proteinlere yönelik bir reseptörün amino asit sekansinin tamamini veya bir kismini ihtiva eden proteinler üretilmesi açisindan faydali olabilir. Söz konusu reseptörler ve antagonistler sunlari içerir: tümör nekroz faktör reseptörünün her iki formu (TNFR, p55 ve p75 olarak bilinir, ABD Patent No. , antagonistler veya inhibitörler (ABD Patent No. 5,981,713, Patent No. , IL-15 reseptörler, IL-l7 reseptörler, IL-18 reseptörler, Fc reseptörler, granulosit- makrofaj koloni stimüle edici faktör reseptörü, granulosit. koloni stimüle edici faktör reseptörü, onkostatin- M ve lösemi inhibitör faktörü, NF-kappa B reseptör aktivatörü (RANK, WO , osteoprotegerin (ABD. Patent No. 6,015,938), TRAIL ile ilgili reseptörler (TRAIL reseptörleri 1, 2, 3 ve 4 dahil), Fas veya Apoptoz-Indükleyici Reseptör(AIR) gibi ölüm alanlari ihtiva eden reseptörler. Mevcut bulus kullanilarak üretilebilen diger proteinler, farklilasma antijenlerinin (CD proteinleri olarak anilir), bunlarin ligandlarinin veya bunlarin herhangi birine büyük ölçüde benzer proteinlerin amino asit sekanslarinin tamamini veya bir kismini ihtiva eden proteinler içerir. Söz konusu antijenler Leukocyte Typing VI'de açiklanmistir (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani ve ark., bask., Kobe, Japan, 1996). Benzer CD proteinleri müteakip çalistaylarda açiklanmistir. Söz konusu antijenlerin örnekleri CD22, CD27, CD30, CD39, CD4O ve ilgili ligandlardir (CD27 ligandi, CD3O ligandi, vb.). CD antijenlerin birçogu, 41BB ve OX4O da içeren TNF reseptör ailesinin üyeleridir. Ligandlar siklikla, 41BB ligand ve OX4O ligandinda üyesi oldugu TNF ailesinin üyeleridir. Enzimatik olarak aktif proteinler ya da bunlarin ligandlari da mevcut bulus kullanilarak üretilebilir. Örnekler, asagidaki proteinlerin birinin tamamini veya bir kismini ya da bunlarin ligandlarini ya da bunlarin birine büyük ölçüde benzer bir proteini ihtiva eden proteinleri içerir: TNF-alfa Dönüstürücü Enzim, çesitli kinazlar, glukoserebrosidaz, süperoksit dismutaz, doku plazminojen aktivatör, Faktör VIII, Faktör IX, apolipoprotein E, apolpoprotein A-I, globinler, IL-2 antagonisti, alfa-l antitripsin, yukarida belirtilen enzimlerin herhangi birine iliskin ligandlar, diger çesitli enzimler ve bunlarin ligandlari. glikosilatli veya non-glikosilatli immunoglobulinine, bir alt sinifa ya da aksi belirtilmedikçe insan, insanlastirilmis, kimerik, çoklu spesifik, monoklonal, poliklonal dahil ve antikol baglama fragmanlarinin oligomerleri dahil olmak üzere spesifik baglamaya iliskin intakt antikorla rekabet eden bir antijen baglayici bölgeye referans içerir. Ayrica spesifik antijen bagini bir hedef polipeptite aktarmaya yeterli en az bir immunoglobulin kismi ihtiva eden Fab, Fab', F(ab')2, FV, diabodyler, Fd, dAb, maksikorlar, tek zincirli antikor molekülleri, tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) fragmanlari, scFV, diabodyler, triabodyler, tetrabodyler ve polipeptitler gibi antijen baglayici fragran içeren proteinler kapsam dahilindedir. "Antikor" terimi, antikor ekspresyonu amaciyla transfekte olan bir konakçi hücreden izole edilen antikorlar gibi rekombinant yollarla hazirlanan, eksprese edilen, olusturulan ya da izole edilen antikorlari içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Antikor örnekleri, yukarida belirtilen proteinleri ve/Veya asagidaki antijenleri içeren ancak bunlarla sinirli olmayan bir proteini ya da protein kombinasyonunu taniyan antikorlar içermekte olup, bunlarla sinirli degildir. CD2, CD3, CD4, CD8, reseptör, IL-6 reseptör, IL-l3 reseptör, IL-l8 reseptör alt üniteler, FGLZ, PDGF-ß ve ilgili analoglar (bkz. ABD Patent reseptör (bkz. ABD Patent No. 6,235,883) VEGF reseptör, hepatosit. büyüme faktörü, osteoprotegerin ligand, interferon gamma, B lemfosit stimülatörü (BlyS, BAFF, THANK, TALL-l ve zTNF4 olarak da bilinir; bkz. Do ve Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(l): 19-25), C5 komplement, IgE, tümör antijen CA125, tümör antijen MUCl, PEM antijen, LCG (akciger kanseriyle ilgili ifade edilen bir gen ürünü), HER-2, HER-3, tümörle iliskili glikoprotein TAG-72, SK-l antijen, kolon ve/veya pankreas kanseri hastalarda yüksek düzeyde mevcut tümörle ilgili epitoplar, gögüs, kolon, skuamöz hücre, prostat, pankreatik, akciger ve/Veya karaciger kanseri hücreleri ve/veya melanom, gliom ya da nöroblastoma hücrelerinde ifade edilen kansere iliskin epitoplar ya da proteinler, bir tümörün nekrotik çekirdegi, integrin alfa 4 beta 7, integrin VLA-4, B2 integrinler, TRAIL reseptörler 1, 2, 3 ve 4, RANK, RANK ligand, TNF-a, adezyon molekülü VAP-l, epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM), interselüler adezyon molekülü-3 (ICAM-3), lökointegrin adezin, platelet glikoprotein gp llb/Illa, kardiyak myosin agir zinciri, paratiroid hormonu, rNAPcZ (VIIa-doku faktörü inhibitörü), MHC tümör nekroz faktörü (TNF), CTLA-4 (sitotoksik T lemfositiyle ilgili antijen), Fc-y-l reseptör, HLA-DR 10 beta, HLA-DR antijen, sklerostin, L-selektin, Respiratuar Sinsitial Virüs, insan immunoyetmezlik. Virüsü (HIV), hepatit B 'virüsü (HBV), Streptococcus mutans ve Staphlycoccus aureus. Mevcut bulusa göre yöntem kullanilarak üretilebilen, bilinen antikorlarin spesifik örnekleri adalimumab, bevacizumab, infliksimab, absiksimab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliksimab, belimumab, briakinumab, sanakinumab, sertolizumab pegol, setuximab, konatumumab, denosumab, ekulizumab, gemtuzumab ozogamisin, golimumab, ibritu- momab tiuksetan, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab- CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtümomab, pertuzumab, ranibizumab, rituksimab, rovelizumab, tokilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab ve zanolimumab içermekte olup bunlarla sinirli degildir. Mevcut bulus, örnegin yukarida belirtilen proteinlerden herhangi birini içeren rekombinant füzyon proteinleri üretmek üzere de kullanilabilir. Örnegin mevcut bulusa göre yöntemler kullanilarak yukarida belirtilen proteinlerden birini ve ayrica lösin fermuar, sarmal, immunoglobulinin FC kismi ya da büyük ölçüde benzer bir protein gibi multimerizasyon alan içeren rekombinant füzyon proteinleri üretilebilir. Bkz. Örn. 7:255-64. Söz konusu rekombinant füzyon proteinleri arasinda spesifik olarak reseptör kisminin etanersept (p75 TNFRzFc) ve belatasept (CTLA4:Fc) gibi bir antikorun Fc kismina kaynastirildigi proteinler bulunur. Kimerik proteinler ve polipeptitler, ayrica yukarida belirtilen proteinlerden herhangi birinin fragmanlari ya da kisimlari, mutantlari, varyantlari ya da analoglari da mevcut bulusa uygun yöntemlerle üretilebilen uygun proteinler, polipeptitler ve peptitler arasinda bulunur. Bu basvuruda kullanilan terminoloji, teknikte standart bir terminoloji olmasina ragmen belirli terimlerin tanimlari istemlerin anlamsal netligini ve kesinligini pekistirmek üzere saglanmaktadir. Birimler, ön ekler* ve semboller kendi kabul göre SI formunda gösterilebilir. Burada belirtilen nümerik araliklar, ilgili araligi tanimlayan sayilari içermekte olup, tanimlanan araliktaki her bir tam sayiyi destekler. Burada açiklanan yöntemler ve teknikler aksi belirtilmedikçe klasik yöntemlerle birlikte genellikle teknikte iyi bilinen ve mevcut tarifnamede alintilanan ve belirtilen daha spesifik referanslarda açiklandigi üzere gerçeklestirilir. Bkz., Örn., Sambrook ve ark. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Ausubel ve ark., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1995), and Greenfield, Antibodies: A Laboratory Manual 2. baski,, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2013) veya önceki baskilar. ÖRNEKLER Uzatilmis Periyodik Hücre Kültürü Prosesi Bu deney, ultrafiltrasyon kültür prosesine (UF) kiyasla uzatilan periyodik hasada (X-PH) sahip bir hücre kültürü prosesini açiklamaktadir. Uzatilmis periyodik prosese yönelik olarak perfüzyon, ilgili rekombinant proteinin süzüntüde gerçeklestirildigi ve ürün hasadi olarak toplandigi sekilde gözenek büyüklügüne ya da moleküler agirlik sinirina sahip bir mikrofiltreye bagli hücre kültürü biyoreaktörünün filtre edilmeyen kisminda hücre kültürünün rekombinant protein ürününün toplandigi gözenek büyüklügü ya da MWCO ihtiva eden tekli filtre ünitesi sistemi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Perfüzyon, önceden belirlenen bir parametre elde edilene kadar rekombinant protein içermeyen bir süzüntü ya da bos süzüntünün ultrafiltre bileseninden çekilmesiyle gerçeklestirilmis olup, bu durumda süzüntü ya da hasat süzüntüsü ihtiva eden bir rekombinant proteinin önceden belirlenen bir süreyle mikrofiltre bileseninden çekildigi günlerde gerçeklestirilmistir. Önceden belirlenen süre geçtikten sonra proses tekrarlanmistir. Protein tutma ve hasat etme döngüsü, kültür sonlandirilana kadar sürmüstür. Ultrafiltrasyon kültür prosesine yönelik olarak hücreler, hücre kültürünün filtre edilmeyen kisminda rekombinant protein ürününün tutuldugu ve rekombinant protein içermeyen süzüntünün toplandigi sekilde gözenek büyüklügüne veya moleküler agirlik sinirina sahip bir ultrafiltre kullanilarak perfüzyon sisteminde kültürlenmistir. Kültürleme sonlandirildiginda tutulan rekombinant protein ürünü, biyoreaktörden hasat olarak geri kazanilmistir. Uzatilmis Periyodik Hasat Kültürü Prosesi (X-PH) 0. günde, bir rekombinant antikoru gösteren CHO hücreleri serumsuz kimyasal tanimli kesikli ortamda 1500 ml yararli hacimde 1 x 106 canli hücrede iki adet 2l'lik biyoreaktöre (Applikon, Foster City, CA) asilanmistir. Kültürler 36°C, 48.0 mmHg DO kosulunda 350 RPM'de çalkalanarak idame edilmistir. Hücre kültürleri kesikli modda baslatilmis, perfüzyon ise 2. günde 30 cm 750 kDa delikli fiber filtreye (Xampler UFP-750-E- 4MA, GE Healthcare) seri halde bagli 30 cm 30 kDa delikli fiber filtre (Xampler UFP-30-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA) içeren ATP-2TM alternatif teget akis filtrasyonu sistemi (Refine Technologies, Hanover, NJ) kullanilarak baslatilmistir. Filtreler, yaklasik 1 inç uzunlugunda hijyenik klamplar kullanilan konnektör sargi parçasiyla birbirine baglanmistir. Ortam, 1,5 g/l pluronik (Kolliphor Pl88 SAFC Biosciences, ST- Louis, MO) ihtiva eden serumsuz kimyasal tanimli perfüzyon ortamidir. Perfüzyon hizi, hücre kültürü isletimi boyunca kademeli olarak 0,5'ten l,O'e biyoreaktör yararli hacmi/güne yükseltilmis ve filtre ünitesi boyunca üniform olmustur. Bos ve hasat süzüntüler bagimsiz perfüzyon pompalari araciligiyla, perfüzyon hiziyla ayni hizda toplanmistir. Kültürü degerlendirmek üzere biyoreaktörden günlük numuneler alinmistir. Canli hücre yogunlugu (VCD) ve canlilik, Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA) kullanilarak belirlenmistir. Titre, HPLC analiziyle ölçülmüstür. Glikan analizine yönelik olarak protein içeren numuneler Protein A ile toplanmis ve saflastirilmistir. Saflastirilan numuneler N-bagli glikanlarin salinmasi amaciyla PNGase-F ile islenmis ve 37°C sicaklikta 2 saat süreyle asilanmistir. Enzimatik olarak salinan glikanlar 75 dakika süreyle 80°C sicaklikta 2-aminobenzoik asitle (2-AA) etiketlenmistir. Ardindan Glycoclean S kartusla, fazla 2-AA etiket sökülmüstür. Numuneler bir gece bekletilerek buharlastirilmis ve ortaya çikan kuru pelet müteakip HILIC (hidrofilik etkilesim. sivi kromatografisi) analizi için suyla yeniden olusturulmustur. Glikanlar, yüksek organik kosullarda kolona enjekte edilerek baglanmis ve artan gradyanda sulu amonyum format tamponla seyreltilmistir. Glikan elüsyonunu izlemek üzere floresans tespit kullanilmis ve majör ile minör glikan türlerin yüzdesi hesaplanmistir. 11. gün öncesinde bos süzüntü ya da ürün içermeyen süzüntü, söz konusu süzüntünün peristaltik pompa (Watson Marlow lZOU/DV Falmouth, Cornwall, Ingiltere) kullanilarak 750 kDa ultrafiltreden çekilmesiyle sürekli toplanmis ve çikarilmistir. Filtre büyüklügü nedeniyle hücre kültürünün protein ürünü, hücre kültürü biyoreaktörünün filtre edilmeyen kisminda tutulmustur. Hasat süzüntüsü ya da ürün içeren süzüntü Tablo 1'de saglanan plana göre hücre kültürü isletimi sirasinda önceden belirlenen bes ayri isletimde toplanmistir. Hasat süzüntüsü, peristaltik pompa kullanilarak söz konusu süzüntünün 30 kDa mikrofiltreden çekilmesiyle toplanmistir (Watson Marlow lZOU/DV Falmouth, Cornwall, Ingiltere). Hücre kültürünün protein ürünü, süzüntüde gerçeklestirilmis ve hasat süzüntüsünün bir parçasi olarak toplanmistir. Hasat süzüntüsü, yukarida açiklandigi üzere titre ve ürün kalitesi açisindan degerlendirilmistir. Hasat süzüntüsü, süzüntü posetlerinde saklanmistir (RCBB-300, RIM Bio Inc., Seattle, WA). Tablo 1 Hasat süzüntüsü toplama plani Her hasat süzüntüsü toplandiktan sonra derhal bos süzüntü tekrar sürekli olarak 750 kDa ultrafiltreden toplanmis ve çikarilmistir. Kültürleme, 24. gün hasat süzüntüsünün toplanmasi sonrasinda sonlandirilmistir. Ultrafiltre Kültür Prosesi (UF) 0. günde, yukaridakiyle ayni rekombinant antikoru ifade eden CHO hücreleri serümsuz tanimli kesikli ortamin 1500 ml'lik yararli hacminde 1 x 106 canli hücre/ml kosulunda dört adet 2L biyoreaktöre (Applikon, Foster City, CA)) asilanmistir. Kültürler 36°C, 48.0 mmHg DO kosulunda 350 RPM'de çalkalanarak idame edilmistir. Hücre kültürleri kesikli modda baslatilmis, perfüzyon ise 2. günde 60 kDa delikli fiber filtreyle (Xampler UFP- 30-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA) donatilmis ATF-ZTM alternatif teget akis filtrasyonu (Refine Technologies, Hanover, NJ) kullanilarak baslatilmistir. Ortam 1 g/l pluronik (Kolliphor P ihtiva eden serumsuz kimyasal tanimli perfüzyon ortamidir. Perfüzyon hizi, hücre kültürü isletimi sonrasinda 0,5'ten l,0'e kademeli olarak yükseltilmistir. Numuneler, kültürü degerlendirmek üzere günlük alinmistir. Canli hücre yogunlugu (VCD) ve canlilik, Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA) kullanilarak belirlenmistir. Titre, HPLC analiziyle ölçülmüstür. Süzüntü, perfüzyon hiziyla ayni hizda toplanmistir. 15. günde kültür sonlandirildiginda, filtre büyüklügü nedeniyle hücre kültürünün protein ürünü, hasat edilene kadar hücre kültürü biyoreaktörünün filtre edilmeyen kisminda tutulmustur. X-PH prosesindeki titre profili, 11. güne kadar UF kültür prosesindeki titreyle tutarli olmustur (Sekil 2). Birinci 750 kDa'lik hasat döngüsü X-PH prosesine alindiginda titre profilleri ayridir. Canli hücre yogunlugunda (Sekil 3) ve canlilik s'sinde (Sekil 4) benzerlik gözlemlenmistir. Isletimler arasinda üretim biyoreaktörünün ayrilmis üç günlük devriyle X-PH prosesinin UF prosesine kiyaslanmasina olanak vermek üzere elli bir günlük biyoreaktör üretim periyodu kullanilmistir. Bu kriterle, kiyaslanabilir elli bir günlük dönemde iki adet 24 günlük X-PH proses isletimi ve üç adet UF proses isletimi gerçeklestirilebilmistir. X-PH prosesi 51 günlük üretim döneminde UF prosesine kiyasla olarak entegre canli hücre yogunlugunda (IVCD) saglanan %26 artisi ve spesifik verimlilikte saglanan %46 artisi içermistir. X-PH prosesi, UF prosesinin üç isletimine görece iki isletimde %27 fazla ortam kullanmistir ancak bu, UF prosesine kiyasla. X-PH prosesiyle üretilen ürünün bir grami basina ortam gereksiniminin (ortam nßliyeti) -%36 azaltimina dönüstürülür. Tablo 2. 1,5 1 yararli hacimle 21 biyoreaktörde 51 günlük Üretim Periyodunda geri kazanilan ürün Proses an Toplam 51 Geri kazanilan Ürün Günde :VCD (X1 0`i Spesifik Verimlilik X-MF Hasat . [mm (9) Hasadi (:1) (g) 1, __. Isletim Isletim 2605,6 -41,3 161,3 130,2 137,5 X-PH prosesi ürün kalitesi, HILIC glikan haritalamasiyla degerlendirilmis ve günlük prosesi kullanilarak olusturulan bir standartla kiyaslanmistir (Tablo X-PH prosesi glikan haritasi özellikleri, UF prosesi kullanilan standartla tutarlidir. rtalama 6 St 8,2 Mannoz oplam HILIC Glikan Analizi ilinmeyen Bu deneyde bir` perfüzyon kültürü sisteminde düsük 've yüksek konsantrasyonda polioksipropilen-polioksietilen blok kopolimer Lutrol® F68, ve 30 kDa - 750 kDa filtrelerin etkisi karsilastirilmaktadir. 0. günde, rekombinant antikor gösteren CHO hücre hatti, l g/l içeren serumsuz kimyasal tanimli ortam yararli hacminde 2xlO6 canli hücre/ml'de dört adet 2L biyoreaktöre (Applikon Biotechnologyi Foster City, CA) Kültürler 36°C, 350 RPM'de asilanmistir. %48 çözünmüs oksijen konstrasyonu, 6,9 pH, Çalkalama kosulunda idame edilmistir. Hücre kültürü isletimleri kesikli modda baslatilmis; perfüzyon ise hücre yogunluklari 4-5 x 106 hücre/ml'ye ulastiginda 2. günde baslatilmistir. Perfüzyon, ATP-2TM alternatif teget akis perfüzyon ve filtrasyon sistemi (Refine Technologies, Hanover, NJ) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hücre kültürü, üst uçtan giren harici düsey yönlü filtrenin lumen tarafindan sürekli sirküle edilmistir. Süzüntü, peristaltik pompa araciligiyla sürekli çekilmistir. Iki reaktör de 30 kDa delikli fiber filtreyle donatilmistir (Xampler UFP-30-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). Iki reaktör de 750 kDa delikli fiber filtreyle donatilmistir (Xampler UFP-750-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). Perfüzyon hizi, hücre kültürü isletiminde 0,5'ten ml/dakikadan 3 ml/dakikaya kademeli olarak yükseltilmistir. Süzüntü numuneleri, perfüzyon hiziyla ayni hizda toplanmistir. Numuneler biyoreaktörden ve Süzüntü hattindan günlük bir defa alinmistir. Hücre yogunlugu, canliligi ve hücre çapi, <107 hücre/ml hücre yogunlugu elde etmek üzere fosfat tamponlu salinle dilüsyon sonrasinda CEDEX (Roche, Nutley, NJ) kullanilarak ölçülmüstür. COZ (pCO2) ve Oz(p02)'nin pH ve kismi basinci kan gazi analizörü kullanilarak ölçülmüs olup; glukoz, laktat, glutamin, amonyak ve K+ ve Na+ iyon konsantrasyonlari NovaFLEX enstrümaniyla saglanmistir (Nova Biomedical, Waltham, 750 kDa filtreyle donatilan reaktörlerde hücresel canlilik, 6. günde %80'e düsmüstür. Düsüs, canlilik yüzdesinin 14 gün süreyle %8O oranda saglandigi 30 kDa filtrelerle donatilmis reaktörlerde belirtildigi gibi olmamistir. (Sekil 5). kDa delikli fiber filtreyle donatilmis reaktörlerin yüzeyinde 7 g/L Lutrol® F68 birikimi görülmüstür. Bu kosullar altinda Lutrol® F68 Süzüntü numunelerindeki tespit edilebilir düzeylerden daha düsük olmustur 750 kDa filtreyle donatilan reaktörlerde biyoreaktör yüzeyinde ve süzüntüdeki Lutrol® F68 düzeyler nispeten sab,t ve perfüzyon ortamindaki düzeylere benzer olmus, l-l.5 g/l araliginda degisiklik göstermis ve herhangi bir birikim göstermemistir (Sekil 6). Lutrol® F68'in ortalama molar kütlesi 8.400 Da olup, teorik olarak 30 kDa filtreden akmalidir. Lutrol® F68 misel formasyonu, l g/l'nin çok altindaki konsantrasyonlarda gerçeklesebilir (üreticiye göre 20-25°C sicaklikta . Lutrol® F68 konsantrasyonunun, reaktör ve filtrede misel formasyonuna bagli olarak artmasi muhtemeldir. Lutrol® F68 toksisite çalismalari Hücrelerde yüksek Lutrol® F68 konsantrasyonu toksisitesinin etkisini test etmek üzere farkli monoklonal antikorlari gösteren iki CHO hücre hatti (Hücre hatti A ve Hücre hatti B) 1, 2, 3, 4 veya 5 g/l Lutrol® F68 içeren hücre kültürü› ortami içeren 250 ml'lik çalkalama hunilerinde 8 x 105 hücre/ml baslangiç tohumlama yogunlugunda geçis halinde (3 gün/geçis) gerçeklestirilmistir. 3 gün sonra (3.4-6.5 x 106 hücre/ml) hücre yogunlugunda genel bir artis gözlemlenmistir. Farkli Lutrol® F68 konsantrasyonlari arasinda kiyaslamaya olanak vermek üzere canli hücre yogunlugu lg/l kosuluna getirilerek normallestirilmistir. 3, 4 veya 5 9/1 Lutrol® F68 içeren ortamda büyüyen hücreler geçislerin tutarli sekilde üstünde olmus ve burada 1 g/l kosuluna kiyasla hücre yogunlugunda %10 artis ölçülmüstür (p< 0.01) (Sekil 7A). Yüksek Lutrol® F68 kültürlerinde (ortalama %95) canlilik daha büyük olmustur (Sekil 7B). Hücre Çapinin da, lg/L kosuluna ( kiyasla tüm kosullarda kismen arttigi tespit edilmistir (Sekil 7C). Yüksek Lutrol® F68'de canli hücre yogunlugu varyasyonu, canlilik %'si ile çap varyasyonu, sürekli geçise bagli degisen karakteristiklere bagli olmustur. Hücrelerde yüksek Lutrol® F68 konsantrasyonu toksisitesinin etkisi monoklonal antikorlar gösteren iki CHO hücre hatti kullanilarak 21 kesikli besleme kültüründe de gerçeklestirilmistir. Yine canli hücre yogunluguna, canliliga, hücre çapina ya da titreye yüksek Lutrol® F68 etkisi mevcut olmamistir (Sekil 8). ATF perfüzyon kültürlerinin 5 g/L Lutrol® F68 ile tamamlanmasi lg/L ile Sg/L Lutrol® F68'i karsilastiran bir deney yapilmistir. 0. günde rekombinant antikoru belirtilen CHO hücre hatti, 1500 ml yararli hacimde 2 x 106 canli hücre/ml'de 21'lik alti adet biyoreaktöre (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) asilanmistir. Iki reaktör, 1 g/L Lutrol® F68 içeren serumsuz tanimli perfüzyon ortami almis, iki reaktör 5 g/L Lutrol® F68 içeren serumsuz tanimli perfüzyon ortami almistir. Kültürler 36°C, %48 çözünmüs oksijen konstrasyonu, 6,9 pH, 350 RPM'de çalkalama kosulunda idame edilmistir. Hücre kültürü isletimleri kesikli modda baslatilmis; perfüzyon ise 2. günde baslatilmistir. Perfüzyon, 750 kDa delikli fiber filtreyle (Xampler UFP-750-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA) donatilmis ATF-2TM alternatif teget akis filtrasyon sistemi (Refine Technologies, Hanover, NJ) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Perfüzyon hizi günde 3 yararli hacim olmustur. Numuneler biyoreaktörden ve süzüntü hattindan günlük bir defa alinmis ve yukarida açiklandigi üzere test edilmistir. Lutrol® F68 konsantrasyonunun Sg/L'ye çikarilmasi 14 gün süreyle canliligin %95 ve 25 güne kadar canliligin %9O olmasini saglamistir (Sekil 9). Yüksek Lutrol® F68 içeren düsük Lutrol ® F68 konsantrasyonunun geri kazanimi 0. günde, bir rekombinant antikor ifade eden CHO hücre hatti 1500 ml yararli hacimde 2x106 hücre/ml'de dört adet 21 üretim biyoreaktörüne (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) asilanmistir. Hücre kültürü isletimleri kesikli modda baslatilmis; perfüzyon ise 2. günde baslatilmistir. Perfüzyon, 750 kDa delikli fiber filtreyle (Xampler UFP-750-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA) donatilmis ATP-2TM alternatif teget akis filtrasyon sistemi (Refine Technologies, Hanover, NJ) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Söz konusu reaktörler iki bilesenli iki gruba bölünmüs ve her grup farkli bir perfüzyon hücre kültür ortami formülasyonu. almistir (Ortam Z\ ve Ortam B). Her iki ortam formülasyonu 1 g/L Lutrol® F68 içermistir. Kültürler 36°C, %48 çözünmüs oksijen konstrasyonu, 6,9 pH, 350 RPM'de çalkalama kosulunda idame edilmistir. Kültürler, hücre canliligi yüzdesi %80'e düsene kadar bu kosullarda saglanmistir. Bu sürede, her iki gruba iliskin ortam da ilave 4 g/l'lik Lutrol® F68 ile tamamlanmistir (toplam Sg/l için). Kültürler, yüksek pluronik kosullarda 30. güne kadar saglanmistir. Yüksek konsantrasyonda Lutrol® F68 eklenmesiyle hücresel canliligin geri kazanimi Sekil lO'da gösterilmistir. Tamamlama sonrasinda canlilik yüzdeligi %lS'e kadar artis göstermistir. Azalan hücre canliligina sahip bir kültürde yüksek pluronik konsantrasyonunun koruyucu etkisi, hücre kültür ortami formülasyonundan bagimsiz olarak açik olmustur. Bu deney, ön tanimli kaliteli hedef ürün profili (QTPP) elde etmek üzere çoklu tasarimla kalite (QbD) elemaninin bir PAC prosesine basarili pilot ölçekli uygulanmasini göstermektedir. Bu deneydeki kontrollü CQA, monoklonal antikorun Fc bölgesi üzerinde yüksek mannozlu N-bagli glikozilasyon olmustur ("yüksek mannoz"). Üründeki yüksek mannoz düzeyi, hücre kültürü ortamina mannoz eklenmesi veya mannozun çikarilmasiyla kontrol edilmistir (kumanda bileseni). Ancak, metabolit öncüller, metabolik inhibitörler, küçük moleküller, enzimatik esçarpanlar ve indüklenebilir baslaticilar da kullanilabilir. Son çalismalar farkli sekerlerin, antikor ürününde yüksek mannoz düzeyini etkileyebilecegini göstermistir. Spesifik olarak mannoz beslenmesinin, kültür verimliligini etkilemeden yüksek mannoz düzeyini arttirdigi gösterilmistir. Ampirik çalismalarla, hücre kültürü ortamindaki mannoz konsantrasyonunun IgG yüksek mannoz düzeylerine etkisine iliskin bilgiler gelistirilmis ve hücre kültürü prosesiyle iliskisi üzerine çalisilmistir. Küçük ölçekli çalismalardan elde edilen. bilgiler` ve pilot ölçekte yapilan egitim amaçli üretim isletimi, Model Önsezili Kontrol (MPC) prensibine dayali olarak bir PAC algoritmasi gelistirmek üzere birlestirilmistir. MPC, söz konusu prosesin matematik modelinin, prosesin gelecekteki gidisatini tahmin etmek için kullanildigi bir kontrol semasidir. Tipik CHO biyoreaktör proseslerinin geçici niteligi, çoklu CQA'lar ile bunlarin kumanda bilesenleri arasindaki etkilesimler ve kompleks analitiklerle ilgili gecikmelerin tamami MPC'ye yönelik güçlü bir motivasyon olusturmaktadir. MPC için kullanilan modeli bilgilendirmek üzere zamaninda veri saglamak. üzere standart biyoreaktör izlemeyle kombine halde yakin gerçek zamanli kütle spektrometrisi analitigini içeren PAT teknolojileri kullanilmistir. Çoklu tayinlerden elde edilen veriler, hedef aralikta yüksek mannoz CQA'si saglamak üzere biyoreaktöre eklenecek mannoz miktarini belirleyen MPC sistemine dahil edilmistir. Glukozun mannoza hücre kültürü plakasi tayin oranlari: Hücre hatti, monoklonal antikor gösteren bir rekombinant CHO hücre hatti olmustur. Hücreler, derin kutucuklu plakalarda 2 ml'lik yararli hacimde 12 g/l glukoz ihtiva eden kimyasal tanimli (CD) ortamda 7,7e5 hücre/ml'de tohumlanmistir. Hücreler, 220 devir/dakikada 36.0°C, %5 CO2'de bir orbital çalkalayicida inkübe edilmistir (50 mm orbital çap). 3-4. günde, glukoz konsantrasyonu Polychem Glukoz Reaktif Plaka Tayini yoluyla (MedTest DX, Canton MI) ölçülmüs ve kültürler, tüketilen ortamin %26'sinin yeni CD ortamiyla degistirilmesi için santrifüjlenmistir. Benzer sekilde 5. günde tüketilen ortamin %lOO'ü glukoz içermeyen yeni CD ortamiyla degistirilmistir. Toplami heksoz konsantrasyonu, konsantre heksoz doygun çözeltilerinden katkiyla farkli glukoz-mannoz oranlari kullanilarak büyük ölçüde 10 g/L'ye ayarlanmistir. Hücrelerin 24 saat süreyle büyümesine olanak verilmistir. Yüzeyler çikarilmis, IgG saflastirilmis ve yüksek mannoz %'si, hidrofilik etkilesim sivi kromatografisi (HILIC) tayiniyle ölçülmüstür. GC-MS Heksoz tayini Glukoz ve mannoz konsantrasyonlarinin miktari, GC-MS ile hücre kültürü ortaminda belirlenmistir. 1 ml'lik hücre kültürü numunesi, pellet hücrelere santrifüjlenmis ve yüzey filtrelenmistir (. Filtrelenen yüzey, DI suya l'e 10 oranda seyrelmis olup, bu seyreltinin 10 ml'lik kismi 1,5 ml santrifüj tüpüne katilmistir. lOmM D-[UL- 13C6]mannoz % ve lOmM D-[U- standart çözeltisinin 5 ml'lik alikuot kismi eklenmistir. Numune 30 dakika süreyle kurutulmustur (SpeedVac). Heksozlar dakika süreyle 40°C sicaklikta inkübe edilen 20 ml anhidroz piridin ve %1 trimetilklorosilan (TMCS) içeren 30 ml N-metil- N-(trimetilsilil)trifloroasetamid (MSTFA) ile derivatize edilmistir. Derivatizasyonun ardindan numuneler derhal Agilent GC 6890N MSD 5973 sisteminde analiz edilmistir. 1 ml'lik X 0.25 um) enjekte edilmistir. Helyum, 1 ml/dakika sabit akista tutulmustur. Firin sicakligi, 2 dakika süreyle 190°C sicaklikta tutulmus ve ardindan dakikada 4°C artirilarak 202°C sicakliga çikarilmistir. Daha sonra sicaklik 60°C/dakika hizla 280°C'ye Çikarilmistir. Toplam isletme süresi 6,3 dakikadir. Her heksoz, açik ve kapali izomerik formlari gösteren iki pik göstermistir. Mannoz, 2,7 dakikada ve 3,34 dakikada ayristirilmis; glukoz ise 3,5 dakikada ve 4,18 dakikada ayristirilmistir (Sekil 11(A)). Mannoz miktarinin belirlenmesi için 3,34 dakikalik pik alani, glukoz miktarinin belirlenmesi için 4,18 dakikalik pik kullanilmistir. Heksoz miktarlari, karakteristik TMS pik alaninin 13 sekerin m/z = 206 pik alanina kiyaslandigi standart izotop seyreltisi kullanilarak belirlenmistir (Sekil 11 (B)). Filtrelenmis hücre kültürü ortami örnekleri, ilave purifikasyon olmaksizin analiz edilmistir. Her numunenin yaklasik 60 mg'lik kismi, 30 dakika süreyle 37°C sicaklikta 60 ünite Ides enzimiyle (fabRICATOR, Genovis, Lünd, Isveç) parçalanmistir. Ardindan parçalanan numuneler, 10 dakika süreyle 55°C sicaklikta 50 mM Ditiotreitolle (DTT) 4M güanidin hidroklorürde azaltilmistir. Ardindan, parçalanan ve azaltilan numuneler RP-HPLC/MS ile analiz edilmistir. RP-HPLC/MS analizi, Agilent MST Uçus Zamani (TOF) kütle spektrometrisine (Santa Clara, CA) bagli Waters Acquity Ultra- Performance sivi kromatografisi (UPLC) (Milford, MA) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hazirlanan numuneler, 80 °C sicaklikta saglanan ters faz Waters BEH fenil kolonda (1.7 mm, 2.1 x 150 mm; Milford, MA) ayristirilmistir. Pikler, 220 nm ve TOF-MS'de UV ile izlenmistir. Kütle verileri, piklerin toplam iyon akimindan (TIC) ekstrakte edilmis ve ardindan Agilent MassHunter yazilimi kullanilarak dekonvolüsyon ve miktar tayini gerçeklestirilmistir. Hidrofilik Etkilesim Kromatografisi (HILIC) Glikan Harita Tayini 100 mg saflastirilmis antikor, PNGase F (New England Biolabs) ve ardindan 0,04 M sodyuni siyanoborohidrit içeren 12 mg/ml 2- aminobenzoik (2AA) asit ihtiva eden 50 ml'lik floresan etiketleme çözeltisinin eklenmesiyle parçalanmistir. Bu karisim 80 °C sicaklikta 75 dakika süreyle inkübe edilmistir. Etiketlenen glikanlar, Floresans Dedektör (Milford, MA) ile donatilmis Acquity UPLC ile analiz edilmistir. Yaklasik 3 ml'lik etiketlenmis glikan Acquity UPLC BEH Glikan Kolonuna (# emisyon, 425 nm'de tespit gerçeklestiren floresans dedektörü kullanilmistir. 2AA etiketli glikan türleri, MS/MS teknigiyle tanimlanmistir. Yüksek mannoz %'sinin kontrolüne yönelik model parametrelerin uygulanmasina ve müteakip MPC demonstrasyonuna iliskin verilerin üretimi biyoreaktörlerde gerçeklestirilmistir. Mannoz (Sigma, M6020), %25 doymus çözelti kullanilan 1 g/l'lik kültür konsantrasyonuna kültürün ilk günü eklenmistir. Perfüzyon, kültürün ikinci günü baslatilmistir. Perfüzyon ortami günlük 0,5 ila 1,0 biyorektör hacminde artan hacimlerde saglanmistir. Biyoreaktör, Delta V otomasyon (Emerson) kullanilarak kontrol edilmistir. Biyoreaktör numunesinin alinmasi titre, heksoz ve ürün glikan ölçümüne yönelik MAST SPZOO otomatik numune alma valfi (Bend Research) kullanilarak dört saatte bir gerçeklestirilmistir. Otomatiklestirilmis numune toplama sonrasinda numuneler manuel olarak santrifüjlenmis ve hücrelerle tortunun alinmasi için 0,2um'ye filtrelenmistir. Büyüme, canlilik, ozmolalite ve laktat büyümesinin ölçümüne iliskin günlük numuneler manuel olarak ya da MAST SPZOO kullanilarak toplanmistir. Canli hücre yogunlugu (VCD) ve kültür canliligi %'si, Nova CDV (Nova Biomedical) kullanilarak ölçülmüstür. Laktat konsantrasyonlari, Nova Bioprofile Basic analiz (Nova Biomedical) kullanilarak belirlenmistir. Model Önsezili Kontrol Model Önsezili Kontrol (MPC) ve model parametrelerinin uygun hale getirilmesine yönelik programlama MATLAB yaziliminda (versiyon R2014a, Mathworks) ve kod tamamlayici materyal olarak mevcuttur. Model parametreleri, tek egitim reaktörü isletiminden model denkliklerinin veriye en küçük kareler regresyonuyla belirlenmistir. Mannoz besinleriyle (MPC üzerinden) yüksek mannozun kontrolüne yönelik olarak her günlük hiz degisikligi, asagidaki asamalarla hesaplanmistir: L Mevcut modeli ofsetinin hesaplanmasi. Günlük ölçülen degerlerle (varsa) kombine reaktör operasyonel geçmis, model diferansiyel denklemlerinin nümerik çözümünü olusturmak üzere girdiler olarak kullanilmistir. Böylece model ile en son ölçüm arasindaki fark hesaplanabilir. Bu fark, gelecekteki ofsetin bir tahmini olarak kullanilmistir. HK - k Zaman noktasindaki model degeri : f(tw H'k = k zaman noktasinda ölçülen deger Hmi = k+l zaman noktasinda ayarlanan beklenen deger =F(th1) z Optimum gelecek hizlarin MPC yoluyla belirlenmesi. Kontrol baslatildiginda her gün standart MPC açilan horizon yöntemi 17 kullanilmistir. Model ile tahmin edilen ürün kalitesi profiliyle hedef baslangiç noktasi arasinda karesi alinmis hata toplaminin minimuma indirilmesiyle optimum bes hiz degisikligi dizisi belirlenmistir. Bes hiz degisikligi hesaplanmis olmasina ragmen yalnizca birincisi kullanilmistir. Bir sonraki hiz degisikligi uygulandiginda yeni veriler` mevcut olup, kul veriler optimuni gelecek hiz dizisini yeniden hesaplamak üzere kullanilmistir. Mannoz besleme hizi, amaç fonksiyonunun minimuma indirilmesinde bagimsiz degisken olarak islenmis ve söz konusu hiz bulunmustur (bu durumda molekülde istenen yüksek inannoz düzeyinin karesiyle yönetici diferansiyel denklemlerin integrallenmesiyle bulunan karelerin farkinin toplamidir). Yukaridaki denklemler yeteri kadar iyi oldugundan MATLAB çözücüleri ile elde edilen çözüm antikor üzerinde +/- %1 yüksek mannoz türlerinin kontrolü açisindan yeterli olmustur. Yüksek mannoz kontrol yöntemi, reaktöre Hannoz eklenmesinin, antikor üzerinde yüksek mannoz %'sini artirmasi açisindan tek taraflidir. Mannoz konsantrasyonunun azaltilmasiyla yüksek mannoz üretimi %'sinin azaltilmasi gerçeklestirilir (mannoz besleme hizi düsürüldukten sonra perfüzyon üzerinden seyreltmeyle). GC-MS Heksoz Miktar Tayini Mannozun gerçek zamanli miktar tayini, MPC açisindan gerekli bir girdi olmustur. GCMS, hücre kültürü ortamindaki heksozlarin (mannoz ve glukoz) ayristirilmasi için kullanilmistir. Heksozlarda, yukarida açiklandigi üzere izotop seyreltme yöntemiyle miktar belirlenmistir. Sekil ll(A), tipik bir isletme sirasinda mannoz GC'sine göre, hücre kültürü ortamindan baslangiç separasyonunu göstermektedir. Sekil ll(B), m/z 204 pik miktarinin 13 etiketli iç standarttan m/z 206 piki kullanilarak belirlendigi heksoz fragmantasyon paternini (mannoz ve glukoz arasinda benzer) göstermektedir. Hem glukoz hem de mannoza yönelik tespit limiti 0,02 g/l olmus ve lineerlik, 6 g/l heksoza kadar miktar tayini açisindan gösterilmistir (Sekil ll(C)). Glukoz-mannoz hücre kültürü _plakasi tayin oranlari Hücreler sabit 10 g/l toplam heksozla kültürlenmis ancak lO:O, 9: l, glukozzmannoz oranlarini bulmak için mannoz konsantrasyonu artmistir. Hücreler, farkli heksoz oranlariyla 24 saat süreyle kültürlenmistir. Yüzeyler çikarilmis, IgG saflastirilmis ve yüksek mannoz %'si, HILIC tayiniyle ölçülmüstür. Sekil 12(A), hücre kültürü ortaminda mannoz konsantrasyonuyla toplam yüksek mannoz düzeyi arasinda lineer bir iliskiyi göstermekte olup, burada yüksek mannoz, yalnizca glukoz içeren ortamda %10 oraniyla en düsük, yalnizca mannoz içeren ortamlarda %37 ile en yüksektir. Yüksek mannozdaki artisin mannoz sekeri konsantrasyonundaki artisa ya da glikoz seker konsantrasyondaki azalmaya bagli olup olmadigini saptamak için ortamin 1, 3, 5, 7 ya da 10 g/l mannoz içeren yeni ortamla degistirildigi 5. gün disinda birinci plaka deneyimine göre hücreler kültürlenmistir. Mannoz içeren kültürlerin her birine bes farkli glikoz konsantrasyonu (1, 3, 5, 7 ve 9 g/l) eklenmistir. Bu, toplam 25 farkli kültürü olusturmakta olup, söz konusu kültürlerde toplam heksozun en düsük. miktari 2 g/l'dir (lgm/l glikoz ve lgm/l mannoz Sekil 12(B)) ve en yüksek 19 g/l (9gm/l glikoz ve 10 gm/l mannoz; Sekil 12(B)). Hücrelerin 24 saat süreyle büyümesine olanak verilmistir. Ardindan yüzeyler çikarilmis, ölçülmüstür. Sekil 12(B), yüksek mannozdaki lineer artisin glikoz konsantrasyonundan bagimsiz oldugunu ve yalnizca ortamdaki mannoz konsantrasyonuna dayali oldugunu göstermektedir. Bu iliski, MPC kontrol döngüsü gelistirmek üzere kullanilmistir. Kentrol Döngüsü Gelisimi: Model Önsezili Kontrol Kontrol döngüsü gelisimi açisindan biyoreaktör, MAST SPZOO otomatik numune alma cihazina ve inannoz çözeltisi besleme pompasina, ilaveten rutin biyoreaktör kontrollerine ve çevrimdisi analitiklere baglanmistir (Sekil 13). 15 günlük perfüzyon biyoreaktör isletimi, mannoz besinleri kullanilarak yüksek mannozun tek tarafli kontrolüne yönelik MPC geri bildirimi gelistirmek üzere egitim verileri olusturmak amaciyla gerçeklestirilmistir. Reaktördeki (Sekil 14(B)) yüksek mannoz birikimine (Sekil 14(D)) iliskin veriler, 9-11. gün boyunca toplanmayan glikan verileri istisna olmak üzere 4 saatlik zaman araliklariyla toplanmistir. MPC modeli, bir hata nedeniyle benzer bir isletimden hesaplanan büyüme parametreleri disinda söz konusu veri dizisinden gelistirilmistir. Her iki büyüme parametresi dizisini kullanan model tahminleri Sekil l4'te gösterilmis olup, görsel olarak aynidir. Kentrol Döngüsü Gelisimi: Model denklemleri Hücre sayisi, ürün, mannoz konsantrasyonu ve yüksek mannoz türlerini açiklamak üzere adi diferansiyel denklemleri yapilandirilmistir. Burada IL hücre yogunlugu, m, maksimüni büyüme hizi, Nm ise maksimuni hücre yogunlugudur. Hücre yogunlugu, hücre/hacim. ya da hücre hacmi/hacim cinsinden olabilir. Bu iste, hesaplanan ve rastgele ölçeklenen hacim hücre sayimindan hesaplanmis olup, çap Nova CDV'de ölçülmüstür. Titre için spesifik verimliligin sabit oldugu farz edilmis ve degisken ürün tutulumu (kullanilan perfüzyon filtresine dayalidir) söyle açiklanmistir: -î-l: :qFN-SDP Ürün konsantrasyonu P olup, qp spesifik verimliliktir. S, perfüzyon filtresinden geçen ürünün fraksiyonu olan eleme katsayisi, D ise reaktör hacimleri/gündeki perfüzyon hizidir. Mannoz degisme hizi E: D(Mi-M)-qu Reaktördeki mannoz konsantrasyonu M'dir, Mr mannozun perfüzyon ortamindaki verimli konsantrasyonu olup qM spesifik mannoz tüketim hizidir. Mannoz tüketim hizinin, Michaelis-Menton kinetiklerine uygun oldugu farz edilir:__ .Vth Maksimum reaksiyon hizi VM ve KM, Michaelis-Menton sabitidir. Hücre kültürü plakalarindan elde edilen veriler, yüksek mannoz türlerinin bagil üretim hizinin, mannoz konsantrasyonuna orantili oldugunu belirtmistir (Sekil 12(B)): Burada H, yüksek mannoz türlerinin konsantrasyonu, FH ise yüksek mannoz oranti faktörüdür. Önceki verilerin (gösterilmemistir) incelenmesi ise Fn'nin hücre yogunluguyla degisiklik gösterdigini belirtmekte olup, FH için asagidaki tamamen ampirik denklem kullanilmistir: F":IG*(KV+N) K1 ve K2 ampirik sabitlerdir. Sonuç olarak yüksek mannoz degisikligi hizi, zincir kurali araciligiyla bulunur: E' 35& Tüm model parametreleri, Sekil l4'te gösterilen egitim verilerinin en küçük kareler regresyonuyla belirlenmistir. Söz konusu parametreler, Sekil 14(C)'de gösterilen hücre büyüklügü profili uygunlugunun saglanmasiyla olusturulmustur. qp degeri, Sekil 14(D)'de gösterilen titre egrisinin uydurulmasiyla bulunmustur. Titredeki düsüs 12 gün sonra ultrafiltrasyon membraninin (elek katsayisi olan S'nin sifir oldugu) mikrofiltrasyon membrani (elek katsayisinin 0,76 ila 0,78 oldugu) ile degistirilmesine baglidir. Kalan parametreler, söz konusu denklemlerin Sekil 14(A) ve Sekil l4(B)'de es zamanli uydurulmasiyla bulunmustur. Modelde kullanilan parametre degerleri ve %95 güven sinirlari Tablo 4'te gösterilmistir. Model parametrelere ve güven sinirlarina yönelik numerik degerler egitim verilerinden elde edilmis olup, MPC için kullanilmistir. Ortaya çikan modelin egitim verilerine uygun grafikleri Sekil l4'te (kesik çizgili A-D) gösterilirken, MPC için kullanilan büyüme parametreleri noktali çizgilerdir. Mannoz Michaelis Menton sabitine uygun parametre, KM, kullanilan konsantrasyonlardan çok daha büyüktür, dolayisiyla mannoz tüketim kinetikleri etkili olarak birinci siradadir. Egitim verileri ve MPC'nin müteakip demonstrasyonu ayni kosullar altinda gerçeklestirilmis olup, yüksek mannoza yönelik kumanda bileseni islevi gören mannoz konsantrasyonu istisnadir. Tablo 4. Model parametrelere ve güven sinirlarina yönelik numerik degerler egitim verilerinden elde edilmis olup, MPC için kullanilmistir. Parametre Deger 9695 Güven Araligi Birimler VM 102,5 N/A 2 g/L/gü KM 1.47 x 103 N/A 2 g/L K2 4,2 [2.57, 5.84] SCV/L NOT: SCV, Ö1çek1enmis Hücre Hacmi olup, hücre yogunlugundan ve ortalama çaptan hesaplanir Yüksek mannoz düzeyini kontrol etmeye iliskin MPC demonstrasyonu Parametre müteakiben, Antikor degerlerinin derivasyonuna A'ya iliskin yüksek mannoz düzeyi %'sini %1 düzeyinde aktif olarak kontrol etmek üzere biyoreaktör isletiminde geri bildirim döngüsü kullanilmistir. Perfüzyon ve mannoz beslemesi, üretim kültürünün 2. gününde baslatilmistir. Baslangiç mannoz beslemesi, mannoz konsantrasyonunu reaktörde genel olarak sabit tutacak hizda ayarlanmistir. Söz konusu baslangiç mannoz besleme hizi, prosesle ilgili önceki deneyime dayali olup kontrol döngüsünün bir parçasi olmamistir. Kontrol döngüsü, üretimin 5. günü baslatilmistir. Numuneler günlük alinip, MPC modeline giren girdileri belirlemek üzere analiz edilmistir. Reaktör numunesiyle hiz degisimi arasindaki gecikme 5 ile 14 saat arasinda degisiklik göstermekte ortalama 8,5 saatle gerçeklesmistir. Gerekli tüm veriler mevcut oldugunda söz konusu veriler manuel olarak MATLAB modeline konularak bir sonraki mannoz besleme hizi hesaplanmistir. ortaya çikan hizlarindan baslatildiginda artmis ve Ölçülen ve beslemesine oldukça izlemistir yüksek mannoz%'si hesaplanmis) modellenen (Sekil 15(B)). Hücre MPC bazli ölçülen ve modellenen yüksek mannoz %'si sapmalar olarak beklendigi Ölçülen modellenen 'te konsantrasyonu büyüklügü büyük ölçüde konsantrasyonlari gösterilmektedir. saglanmistir profilleri artmis 6 ve 12. miktarlar ve Kontrol (Sekil 15(A)). ve azalmistir günlerde lojistik egimi eslesmistir ancak kültürün son birkaç günündeki kesiklikler söz konusu modelin protein üretimini eksik degerlendirdiginin kanitidir (Sekil (D)). MPC model durumunun, ölçümleri eslemek üzere ayarlanmasi, gözlemlenen deviasyonlara ragmen yüksek mannozun iyi kontrolüne olanak vermistir. Sekil 16a'da PAC prosesiyle geçmis pilot tesis isletimleri gösterilmektedir. Geçmis isletimler, aktif kontrol döngüsü içermeyen ancak PAC prosesine benzer tasarim ve performans sergileyen klasik bir proses kullanilarak gerçeklestirilmistir. Bunun yerine klasik proses, arzu edilen ürünü elde etmek üzere her seriye yönelik hata marji dahilinde isletilecek statik proses parametrelerine dayali olup, her serinin tortu birakimina iliskin kalite kontrolü geçmesi gerekir. PAC prosesiyle PQ, üretim isletimi sirasinda aktif kontrole bagli yaklasik gerçek zamanli ölçülür ve dispozisyon öncesinde müteakip analitik karakterizasyon gerektirmez. TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.