TR201904386T4 - Nükleotidleri içeren nükleozomların saptanmasına yönelik yöntem. - Google Patents

Abstract

Buluş, belirli nükleotidleri içeren mono-nükleozomlar ve oligo-nükleozomlar ve nükleozomların varlığının saptanması ve ölçülmesine yönelik bir yöntem ve hastalığın saptanması ve tanısının konulması için bu tür ölçümlerin kullanımı ile ilgilidir. Buluş ayrıca hastalığın saptanması ve tanısı için nükleozom ilişkili nükleotid biyo-belirteçlerinin tanımlanmasına yönelik bir yöntem ve söz konusu yöntem ile tanımlanan biyo-belirteçler ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME NÜKLEOTIDLERI IÇEREN NÜKLEOZOMLARIN SAPTANMASINA YÖNELIK YÖNTEM BULUS SAHASI Bulus, belirli nükleotidleri içeren mono-nükleozomlar ve oligo- nükleozomlarin varliginin saptanmasi ve ölçülmesine yönelik bir yöntem ve hastaligin saptanmasi ve tanisina yönelik olarak bu tür ölçümlerin kullanimi ile ilgilidir. Bulus ayrica hastaligin saptanmasi ve tanisina yönelik nükleozom iliskili nükleotid biyo-isaretçilerin tanimlanmasina yönelik bir yöntem ile ve söz konusu yöntem ile tanimlanan biyo-isaretçiler ile ilgilidir.

BULUSUN ALT YAPISI Insan vücudu bir kaç yüz hücre tipi içerir. Bu hücre tiplerinin tümü, ayni genomu ancak vücut içinde oldukça farkli fenotipleri ve farkli fonksiyonlari içerir. Bu fenotipik çesitlilik, farkli hücre tiplerinin genomun diferansiyel ifadesinden kaynaklanir.

Diferansiyel gen ifadesinin kontrolü bütünüyle anlasilmamistir ancak temel mekanizmalar, kromatini ökromatin veya heterokromatin olarak paketlemenin kontrolünü, nükleozom konumlandirilmasinin ve nükleaz erisilebilir yerlerinin kontrolünü, DNA metilasyonu, hidroksimetilasyonu ve diger modifikasyonlarini ve etrafina DNA sarilan nükleozomlarin yapisindaki varyasyonlari içeren, gen ile iliskili birbirine bagli çok sayida epigenetik sinyal tarafindan gen regülasyonunu içerir.

Nükleozom, kromatin yapisinin temel birimidir ve (H2A, H2B, H3 ve H4 histonlarinin her birinin bir çiftini içeren) sekiz hayli korunmus çekirdek histonunun bir protein kompleksinden olusur.

Bu kompleksin etrafi, yaklasik 146 baz-çiftinden olusan DNA ile sarilir. Bir baska histon, Hl veya HS, bir baglayici görevi görür ve kromatin kompaksiyonuna dâhil edilir. DNA, siklikla "bir ip üzerindeki bilyelere" benzedigi söylenen bir yapi içinde birbirini izleyen nükleozomlarin etrafina sarilir ve bu temel açik veya ökromatin yapiyi olusturur. Kompakt veya heterokromatinde, bu ip sarilir ve kapali veya kompleks bir yapiya süper-sarilir (Herranz ve Esteller, 2007).

Nükleozomlarin yapisi, histon proteinlerinin Post Transkripsiyonel Modifikasyonu (PTM) ile ve varyant histon proteinlerin inklüzyonu ile degiskenlik gösterebilir. Histon proteinlerinin PTM'mi tipik olarak çekirdek histonlarin kuyruklarinda meydana gelir ve yaygin modifikasyonlar lisin kalintilarinin asetilasyonu, metilasyonu veya ubikitinasyonunuve ayrica arjinin kalintilarinin metilasyonu ve serin kalintilarinin ve birçogunun fosforilasyonunu içerir.

Histon modifikasyonlarinin, gen ifadesinin epigenetik regülasyonuna dâhil edildigi bilinir (Herranz ve Esteller, 2007). Nükleozomun yapisi ayrica, alternatif histon izoformlarinin veya farkli gen veya uç-birlestirme ürünleri olan ve farkli amino asit dizilerine sahip olan varyantlarin dâhil edilmesi ile de çesitlilik. gösterebilir. Histon varyantlari, münferit tiplere ayrilan çok sayida familyaya siniflandirilabilir. Çok sayida histon varyantinin nükleotid dizisi bilinir ve örnegin, National Human Genome Research Institute NHGRI Histone DataBase (Marino-Ramirez, L., Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D. ve Landsman, D. The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing' proteins. Database Vol.2011. (Teslim edilmistir) ve http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), GenBank (NIH genetic sequence) DataBase, EMBL Nucleotide Sequence Database ve DNA Data Bank of Japan (DDBJ) kaynaklarinda halka açiktir.

Eriskin insanlarda normal hücre döngüsü, bazi lOll hücrenin günlük olarak. hücre bölünmesi ile olusturulmasini ve benzer sayidaki hücrenin, agirlikli olarak apoptoz ile, ölümünü içerir.

Apoptoz prosesi sirasinda, kromatin mono-nükleozomlara ve hücrelerden serbest birakilan oligo-nükleozomlara ayrilir.

Normal kosullar altinda, saglikli öznelerde dolasimda bulunan nükleozomlarin seviyelerinin düsük oldugu belirtilir. Yükselmis düzeyler, çogu kanseri, oto-immün hastaligi, enflamatuvar rahatsizligi, inmeyi ve miyokard enfarktüsü içeren çesitli rahatsizliklari olan öznelerde bulunur (Holdenreider & Stieber, 2009).

Mono-nükleozomlar ve oligo-nükleozomlar Enzime-Bagli Bagisiklik Analizi (ELISA) ile saptanabilir ve bir kaç yöntem bildirilmistir (Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al, 2003). Bu analizler tipik olarak, yakalama antikoru olarak bir anti-histon antikoru (örnegin, anti-HZB, anti-H3 veya anti-Hl, H2A, HZB, H3 ve H4) ve saptama antikoru olarak bir anti-DNA veya anti-HZA-HZB-DNA kompleks antikoru kullanir. Bu analizler kullanilarak alandaki Çalisanlar, serumdaki nükleozom seviyelerinin, ayni hastalardan alinan plazma numunelerindekinden daha yüksek oldugunu (bir büyüklük sirasina kadar) belirtir. Bu PCR araciligiyla yapilan DNA serum ve plazma ölçümleri için de geçerlidir (Holdenrieder et al, 2005). Bunun nedeni bilinmemektedir ancak yazarlar, bunun pihtilasma prosesi sirasinda ek DNA salimindan kaynaklandigini tahmin eder. Ancak mevcut teknigin nükleozom ELISA analizlerinin sonuçlarinin birbiri ile bagdasmadigi bulunmustur. Dahasi, serumda veya plazmada dolasan çogu DNA'nin mono-nükleozomlar` ve oligo-nükleozomlar olarak var oldugunun bildirilmesine ragmen (Holdenrieder et al, 2001), nükleozomlarin ve DNA'nin serum› veya plazma içinde ölçülen düzeyleri iyi uyusmaz. Gerçek zamanli PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile ölçüldügü üzere, dolasimdaki hücresiz nükleozoni düzeyleri ve dolasimdaki DNA düzeyleri için ELISA sonuçlari arasindaki düzeltme katsayisinin serum içinde r=O,531 ve plazma içinde r=0,350 oldugu bildirilmistir (Holdenrieder et al, 2005).

Mevcut nükleozom ELISA yöntemleri hücre kültürü içinde, primer olarak apoptozu saptamak için bir yöntem olarak (Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al, 2003), kullanilir ve ayrica serum ve plazma içinde dolasan hücresiz nükleozomlarin ölçülmesi için de kullanilir (Holdenrieder et al, 2001). Ölen hücreler tarafindan dolasima salinan hücresiz serum ve plazma nükleozom düzeyleri, bunlarin bir potansiyel biyo- belirteç olarak kullanilmasini degerlendirmek için çok sayida farkli kanser çalismasinda ELISA yöntemleri ile ölçülmüstür (Holdenrieder et al, 2001). Dolasimdaki ortalama nükleozom düzeylerinin tümünde olmasa da çalisilan çogu kanserde yüksek oldugu bildirilir. Dolasimdaki en yüksek nükleozom düzeyleri, akciger kanseri öznelerinde gözlenmistir. En düsük düzeyler, saglikli öznelerin normal araligi içinde olan prostat kanserinde gözlenmistir. Buna ragmen, maligne tümörleri olan hastalarin kayda deger sekilde çesitlilik gösteren serum nükleozom konsantrasyonlarina sahip oldugu bildirilmistir` ve ilerlemis tümör hastaligi olan bazi hastalarin dolasimdaki, saglikli özneler için ölçülen aralik içinde, düsük nükleozom düzeylerine sahip oldugu bulunmustur (Holdenrieder et al, 2001). Yükselmis nükleozom düzeylerinin bu ve çesitli kanser-olmayan nedenlerinden dolayi, dolasimdaki nükleozom düzeyleri, kanserin bir biyo-belirteci olarak klinik olarak kullanilmaz (Holdenrieder ve Stieber, 2009). Sasirtici sekilde, dolasimdaki nükleozom seviyeleri mevcut teknigin bu nükleozom ELISA yöntemleri ile ölçüldügü üzere düsük veya saptanabilir olmayan birçok kanser öznesinin aslinda dolasimdaki hücresiz nükleozomlarin yüksek seviyelerine sahip oldugu gösterilmistir.

Mevcut teknige ait ELISA yöntemleri ile saptanmayan nükleozomlari saptayan nükleozomlar için yeni ELISA yöntemleri tasarlanmis ve gösterilmistir.

Histon PTM'lerinin saptanmasina yönelik ELISA yöntemleri de teknikte bilinir. Serbest histon proteinlerinde (bir nükleozom kompleksinde diger histon ve DNA'ya bagli olmayan) PTM saptanmasina yönelik ELISA yöntemleri, hücre lizatlarindan genellikle asit ekstraksiyonu yoluyla ekstrakte edilmis histonlarda PTM'lerin saptanmasi için kullanilir. Dolasimdaki hücresiz nükleozomlarda PTM'lerin saptanmasina yönelik bir immüno analiz belirtilmistir (Bawden et al,2005). Dogrudan mikrotitre gözlere kaplanan saflastirilmis nükleozomlarda histon PTM'lerin ELISA. saptamasina yönelik. bir yöntem. son zamanda açiklanmistir (Dai et al, 2011). Bu yöntemde kültürlenmis hücrelerden alinan kromatin ekstraktlarinin parçalanmasi ile elde edilen nükleozomlar, dogrudan mikrotitre gözlerine kaplanir ve anti-PTM antikorlari ile reakte edilir. Teknikte uzman kisiler için bu yöntemin nispeten saf nükleozom numunelerine gerek duydugu ve kan, plazma veya serum gibi kompleks biyolojik ortamda histon PTM'lerin dogrudan ölçümü için uygun olmadigi belirgin olacaktir.

Belirli bir DNA dizisi ile iliskili hücresiz nükleozomlarda bir histon PTM'nin (H3K9Me, lisin kalintisi K9'da histon H3 mono metillenmis) saptanmasina yönelik modifiye edilmis bir kromatik immünopresipitasyon (ChIP) yöntemi plazmada belirtilmistir.

Diziye spesifik histon netilasyonunun seviyesinin dolasimdaki nükleozom konsantrasyonundan bagimsiz oldugu belirtilmistir (Deligezer et al, 2008).

Histon varyantlarinin (ayrica histon izoformlari olarak bilinir), gen ifadesinin epigenetik regülatörleri oldugu bilinir (Herranz and Esteller, 2007). Histon varyantlari, belirli bir varyanti kodlayan genin nakavt çalismalari (örnegin RNAi nakavtinin kullanilmasi), kromatin immünopresipitasyonu, amino asitlerin stabil izotip etiketlemesi ve kantitatif kütle spektrometri proteomikleri, immünohistokimya ve Western Blotlama dahil çesitli teknikler kullanilarak in vivo ve in vitro çalisilmistir (Whittle et al, 2008; Boulard et al, 2010; Sporn et al, 2009; Kapoor et al, 2010; Zee et al, 2010; Hua et al, 2008).

Akciger kanseri, meme kanseri ve melanom tanisi konulan öznelerden cerrahi veya biyopsi yoluyla çikarilan doku numunelerinde histon varyantinin ifadesinin immünohistokimya çalismalari belirtilmistir. Bu immünohistokimya çalismalari, rezeke edilmis kanser doku numunelerinde histon macroH2A (mH2A) ve H2AZ varyantlarinin boyanmasinin bu kanserlerde prognostik uygulamaya sahip olabildigini belirtir (Sporn et al, 2009, Hua et al, 2008, Kapoor et al, 2010). Klinik kullanim için immünohistokimyasal yöntemlerin. bir dezavantaji, doku numune koleksiyonunun cerrahi veya biyopsi dahil invazif olmasidir.

Immünohistokimya yöntemlerinin bir diger dezavantaji, bunlarin hastaligin makul bir beklentisinin genellikle bir biyopsi veya doku rezeksiyonu yapilmadan önce nevcut olmasi gerektiginden erken tani veya tarama tanilari için uygun olmamasidir. Minimal invazif kan ELISA testleri, daha genis araliktaki uygulamalar için uygundur ve bu dezavantajlari ortadan kaldirir ve saglik uzmani için daha hizli, daha düsük maliyet ve daha yüksek verimin yani sira hasta için tercih edilebilirdir.

Ancak hücresiz nükleozomlarda hücresiz histon varyantlari, kan veya diger ortamda ölçülmemistir. Kanda hücresiz nükleozomlardaki histon varyantlarinin varligi veya yoklugu ile ilgili herhangi bir çalisma belirtilmemistir. Mevcut durumda intakt hücresiz nükleozomlarda histon varyantlarinin saptanmasi veya ölçümü için herhangi bir yöntem bulunmaz ve ayrica bu tür herhangi bir ölçüm belirtilmemis veya tasarlanmamistir.

Nükleozomr pozisyonu ve nükleozom yapisinin aracilik ettigi (kurucu histon protein varyanti ve PTM yapilari bakimindan) epigenetik sinyallemeye ek olarak hücrelerdeki gen ifadesinin kontrolüne DNA'nin sitozin metilasyon durumu dahil DNA nükleotidlere yönelik modifikasyonlar aracilik eder. Teknikte bazen DNA'nin 5-metilsitozin olusturmak üzere sitozin nükleotidlerin 5 pozisyonunda metillenebildigi bilinmektedir. 5- metilsitozin formunda metillenmis DNA'nin bir sitozin nükleotidinin bir guanin nükleotidine yakin meydana geldigi DNA dizisindeki pozisyonlarda meydana geldigi belirtilir. Bu pozisyonlar, stenografi için "CpG" olarak adlandirilir. CpG pozisyonlarinin %70'ten fazlasinin omurgalilarda netillendigi belirtilir (Pennings et al, 2005). Yüksek bir oranda CpG alani içeren genom bölgeleri genellikle "CpG adalari" olarak adlandirilir ve insan gen promotör dizilerinin yaklasik olarak %60'1 bu tür CpG adalari ile iliskilidir (Rodriguez-Paredes and Esteller, 2011). Aktif genlerde CpG adalari genellikle hipo metillenir. Gen promotör dizilerinin metilasyonu, stabil gen inaktivasyonu ile iliskilidir. DNA metilasyonu ayrica genellikle Alu tekrarlamani elemanlar ve uzun serpistirilmis nükleotid elemanlari dahil tekrarlamali elemanlarda meydana gelir (Herranz and Estellar, 2007; Allen et al, 2004).

Kansere DNA metilasyonunun dâhil edilmesi, 1983 kadar erkenden bildirilmistir (Feinberg ve Vogelstein, 1983). Kanser hücrelerinde gözlenen DNA metilasyon motifleri, saglikli hücrelerinkinden farklilik gösterir. Tekrarli elemanlarin, özellikle peri-sentromerik alanlarin etrafindakilerin, saglikli hücrelere kiyasla kanserde hipo-metillendigi bildirilir ancak spesifik. genlerin promotörlerinin kanserde hiper-metillendigi bildirilir. Bu iki etkinin dengesinin, kanser hücrelerinde global DNA hipo-metilasyonu ile sonuçlandigi bildirilir (Rodriguez-Paredes; Esteller, 2007).

Belirli spesifik genlerin. hiper-metilasyonu, kanserlerin bir tanisal biyo-belirteci olarak kullanilabilir. Örnegin, Septin 9 geninin hiper-metilasyonunun plazmadan ekstrakte edilen DNA'nin PCR amplifikasyonu ile saptanmasi için bildirilen bir yöntemin, %10'luk bir yanlis pozitif orani ile kolon kanserlerinin %72'sini saptadigi bildirilmistir (Grutzmann ve ark, 2008).

Spesifik genlerin veya lokuslarin DNA metilasyon durumu genel olarak, 5-metilsitozinin degil ancak sitozinin urasile, dizileme veya diger araçlar yoluyla saptanabilen bir primer DNA dizisi degisimine yol açan, selektif bisülfit deaminasyonu ile saptanir (Allen et al, 2004).

Küresel DNA hipometilasyonu, kanser hücrelerinin ayirici bir özelligidir (Estellar 2007 and Hervouet et al, 2010). Küresel DNA metilasyonu, immünohistokimya (IHC) teknikleri kullanilarak hücrelerde çalisilabilir. Alternatif olarak DNA, analiz için hücrelerden ekstrakte edilir. Kütle spektrometrisini takiben yüksek performansli sivi kromatografisi, ince katman kromatografisi veya sivi kromatografisi ile analize yönelik olarak tekli nükleotidlerde DNA parçalanmasi ve netillenmemis CpG miktarini hesaplamak üzere tritiyum etiketli S-adenozil metiyonin ile baglantili olarak DNA metiltransferazinin kullanildigi tüm CpG alanlarinin metilasyonu ile inverse belirleme, klorasetaldehitin kullanildigi floresan analizleri, en yakin komsu analizi ve restriksiyon sindirimi dahil olmak üzere hücreler veya diger ortamlardan ekstrakte edilen DNA'da küresel metilasyonun saptanmasina yönelik birkaç yöntem belirtilmistir. Bu yöntemlerin dezavantajlari, bunlarin yogun is gücü gerektirmesi ve/veya büyük miktarlarda iyi kalitede ekstrakte edilmis DNA'ya gerek duymasidir (Allen et al 2004).

Bisülfit deaminasyonu dahil PCR bazli yöntemler, büyükr DNA miktarlarina yönelik ihtiyaci ortadan kaldirir ancak 5- metilsitozinin toplam genom içeriginin göstergesi olarak tipik olarak tekrarlamali diziler olmak üzere spesifik genom bölgelerini çogaltmalidir (Allen et al 2004). Küresel DNA metilasyon ölçümüne yönelik bu yöntemler, çesitli hücreler ve dokulardan ekstrakte edilen DNA'yi çalismak üzere kullanilmistir. Çalisanlarin bazilari, minimal invazif bir sekilde elde edilmesi daha kolay oldugundan tam kanda beyaz kan hücrelerinden ekstrakte edilen DNA ile ilgili çalisma yapmislardir (Moore et al, 2008; Ting Hsiung et al, 2007; Mansour et al, 2010). Kütle spektrometrili Sivi Kromatografisi, küresel DNA metilasyon ölçümü için altin standart olarak düsünülür ancak maliyetlidir ve DNA, analiz öncesinde tekli nükleotid seviyesine parçalanmalidir (Vasser et al, 2009).

Küresel DNA metilasyonunun tahmin edilmesine yönelik son dönemdeki yöntemler, dokudan ekstrakte edilmis hidrolize DNA'nin kütle spektrometrisi ile ultra yüksek basinçli sivi kromatografisini (Zhang et al, 2011) ve netilasyona spesifik dijital bir dizileme (MSDS) yöntemini (Ogoshi et al 2011) içerir. Küresel DNA metilasyonuna yönelik klasik rekabetçi bir immüno analiz (ve ayrica küresel 5-hidroksimetilsitozin metilasyonüna yönelik benzer bir analiz) açiklanmistir. Bu yöntemde hücreler veya dokulardan ekstrakte edilen DNA, bir 5- metillenmis sitidin konjugati ile kaplanmis bir mikrotitre gözüne eklenir, bir anti-5-metilsitidin antikoru eklenir ve ekstrakte edilmis numunede kaplanmis 5-metilsitidin konjugati ile metillenmis DNA arasindaki antikor baglama dagilimi, numunede bulunan küresel DNA metilasyon seviyesini tahmin etmek üzere bilinen standartlarinki ile karsilastirilir (Cell Biolabs, 2011). Bir diger immüno analize benzer yöntemde dokulardan veya plazma veya serum numunelerinden ekstrakte edilen DNA, bir mikrotitre gözüne kaplanir ve metillenmis DNA, bir anti-5- metilsitozin antikor kullanilarak saptanir (Vasser, et al, 2009; Epigentek, 2009). Bu yöntemlerin bir dezavantaji, bunlarin denatürasyon ve DNA'dan tüm nükleozoni ve kromatin yapisinin uzaklastirilmasi dahil DNA ekstraksiyonunu gerektirmesidir.

Bunlar dolayisiyla nükleozoni bagli nükleotidleri ölçemez ve örnegin; bir DNA ekstraksiyona adimi olmaksizin doku lizati, kan, plazma veya serum gibi biyolojik sivilarda küresel DNA metilasyonunun dogrudan ölçümü için uygun degildir.

DNA'da sitozin bazlarinin 5-hidroksimetil modifikasyonu da belirtilmistir. 5-hidroksimetilationin rolü, henüz iyi anlasilamamistir ancak gen regülasyonuna dahil edildigi görünür (Stroud et al, 2011).

Küresel DNA metilasyonunun saptanmasi için mevcut durumlar, DNA ekstraksiyonunu veya saflastirmasini içerir ve hizli, yüksek, verimli, düsük maliyetli, minimal invazif tanisal yöntemler için uygun degildir. Benzer sekilde diger modifiye edilmis ve olagan olmayan bazlar (örnegin urasil, inozin, ksantin, hipoksantin) için DNA analizi sadece büyük ölçüde saf veya ekstrakte edilmis DNA analizi ile arastirilabilir. Bu tür analiz dogrudan doku lizati, kan, plazma veya serum gibi kompleks biyolojik ortamda gerçeklestirilemez. -metilsitozin veya diger herhangi bir belirli nükleotidleri veya modifiye edilmis nükleotidleri içeren hücresiz nükleozomlar kan veya diger herhangi bir ortamda ölçülmemistir. Belirli nükleotidleri içeren hücresiz nükleozomlarin varligi veya yoklugu ile ilgili herhangi bir çalisma belirtilmemistir.

Belirli nükleotidleri içeren hücresiz nükleozomlara yönelik analizler önerilmemis veya tasarlanmamistir. Mevcut durumda hücresiz nükleozom iliskili nükleotidlerin saptanmasi veya ölçümüne yönelik herhangi bir yöntem bulunmaz.

Bu noktada ekstraksiyon olmaksizin biyolojik numunelerde örnegin -metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin dahil nükleozom iliskili nükleotidlerin dogrudan tahmini için basit immüno analiz yöntemleri belirtilir. Sasirtici sekilde nükleozom iliskili nükleotidlerin, nükleozomlarin mevcut teknigin ELISA yöntemleri ile saptanmadigi kan numunelerin saptanabildigi gösterilmistir.

WOZOO5/Ol9826, hastaligi tanilamak üzere modifiye edilmis bir histon proteini ile spesifik olarak baglanan bir antikor kullanilarak hücresiz nükleozomlarin analizini açiklar.

WO99/O47924, tümör terapisinin etkinligini belirlemek üzere serumdaki apoptotik ürünlerin ölçümünü açiklar.

WOZOO5/O408l4, bir kanser durumunu degerlendirmek üzere histon dizileri içerisinde kalintilarin post-translasyonel modifikasyonlarinin ölçümünü açiklar.

BULUSUN KI SA AÇIKLAMASI Bulusun bir birinci açisina göre kanser, kardiyomiyopati, sistemik lupus eritematozus, kolit, kronik obstrüktif pulmoner bozukluk, Crohn hastaligi ve romatoid artritin tanisina yönelik bir vücut sivisi numunesinde bir biyo-belirteç olarak hücresiz bir nükleozom ile iliskili bir DNA bazinin kullanimi saglanir, burada DNA bazi sunlardan seçilirz5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin.

Bulusun ikinci açisina göre bir vücut sivisi numunesinde hücresiz bir nükleozom ile iliskili bir DNA bazinin varliginin saptanmasina yönelik bir yöntem saglanir, bu yöntem asagidaki adimlari içerir: (i) vücut sivisi numunesinin nükleozomlara baglanan bir birinci baglama ajani ile temas ettirilmesi; (ii) adimda (i) baglanan nükleozomlarin DNA bazina baglanan ikinci bir baglama ajani ile temas ettirilmesi ; (iii) söz konusu ikinci baglama ajaninin vücut sivisi numunesinde DNA bazina baglanmasinin saptanmasi veya kantifiye edilmesi; ve (iv) Vücut sivisi numunesinde DNA bazini içeren nükleozomlarin varliginin bir ölçümü olarak bu tür baglanma varliginin veya derecesinin kullanilmasi, burada DNA bazi, asagidakilerden seçilir: S-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin.

Bulusun üçüncü bir açisina göre bir vücut sivi numunesinde hücresiz bir nükleozom ile iliskili bir DNA bazinin varliginin saptanmasina yönelik bir yöntem saglanir, bu yöntem asagidaki adimlari içerir: (i) vücut sivisi numunesinin DNA bazina baglanan bir birinci baglama ajani ile temas ettirilmesi; (ii) adimda (i) baglanan DNA bazinin nükleozomlara baglanan ikinci bir baglama ajani ile temas ettirilmesi; (iii) söz konusu ikinci baglama ajaninin Vücut sivisi numunesinde nükleozomlara baglanmasinin saptanmasi veya kantifiye edilmesi; ve (iv) vücut sivisi numunesinde DNA bazini içeren nükleozomlarin varliginin bir ölçümü olarak bu tür baglanma varliginin veya derecesinin kullanilmasi, burada DNA bazi, asagidakilerden seçilir: 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin.

Bulusun ilave bir açisina göre bir hayvan veya bir insan öznede bir hastalik halinin saptanmasi veya tani konmasina yönelik in vitro bir yöntem saglanir, bu yöntem asagidaki adimlari içerir: (i) bir özneden elde edilen bir vücut sivisinda hücresiz bir nükleozom ile iliskili bir DNA bazinin saptanmasi veya ölçülmesi; ve (ii) öznenin hastalik halini tanimlamak üzere saptanan nükleozom iliskili DNA bazinin seviyesinin kullanilmasi, burada DNA bazi, asagidakilerden seçilir: 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin, burada kanser, sunlardan seçilir: kanser, kardiyomiyopati, sistemik lupus eritematozus, kolit, kronik obstrüktif pulmoner bozukluk, Crohn hastaligi ve romatoid artrit.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1.

Buzagi serumunda seyreltilen MCF7 hücrelerinden ekstrakte edilen çapraz bagli parçalanmis kromatinde hücresiz nükleozomlardaki S-metilsitozin ile metillenmis DNA'nin saptanmasina yönelik ELISA doz yanit egrisi.

Sekil 2.

Buzagi serumunda seyreltilen A375 hücrelerinden ekstrakte edilen çapraz bagli parçalanmis kromatinde hücresiz nükleozomlardaki 5-hidroksimetilsitozinin saptanmasina yönelik ELISA doz yanit egrisi.

Sekil 3.

Mevcut teknigin nükleozom ELISA yöntemleri kullanilarak 20 saglikli gönüllüden alinan serum ve EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan nükleozom seviyeleri.

Sekil 4. saglikli gönüllüden alinan serum ve EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan histon varyanti mH2Al.l'in hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 5. saglikli gönüllüden alinan serum ve EDTA plazma numunelerine yönelik, saptanan histon varyanti mH2A2'nin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 6. saglikli gönülluden alinan serum ve EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan histon varyanti HZAZ'nin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 7. saglikli gönüllüden alinan serum ve EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan histon modifikasyonu P- HZAX(Serl39)'un hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 8.

Bulusa ait ELISA kullanilarak 20 saglikli gönüllüden alinan serum ve EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan 5- metilsitozin ile metillenmis DNA'nin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 9.

Bulusa ait ELISA kullanilarak 20 saglikli gönüllüden alinan serum numunelerine yönelik saptanan 5-hidroksimetilsitozin ile metillenmis DNA'nin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 10. 3 kolon kanserli özneden alinan EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan histon türleri ve nükleotidlerin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 11. 13 akciger kanser öznesinden alinan EDTA numunelerine yönelik saptanan histon türleri ve nükleotidin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 12. 2 pankreatik kanser öznelerinden alinan EDTA numunelerine yönelik saptanan histon türleri ve nükleotidlerin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 13. 1 oral kanser öznesinden alinan EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan histon türleri ve nükleotidlerin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 14.

Bulusun ELISA yöntemleri kullanilarak saptanan nükleozom iliskili 5-metilsitozin aracili DNA seviyelerinin bir orani olarak normallestirilmis 4 farkli kanser hastalarindan alinan EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan histon türleri ve nükleotidlerin hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri. *Holdenrieder et al 2001 yöntemi ile üretilen saglikli gönüllülerden alinan bir numune içeren nükleozomlara yönelik normallestirilmis seviyeler, karsilastirma için gösterilir (mH2A2 ve 5- hidroksimetilsitozin, bu numune için ölçülmemistir).

Sekil 15.

Bulusun ELISA yöntemi kullanilarak saglikli gönüllülerden alinan EDTA plazma, sitrat plazma ve heparin plazma numunelerinde saptanan 5-metilsitozin (Smc), mH2A1.1, HZAZ ve P-H2AX(Ser139)'un hücresiz nükleozom iliskili seviyeleri.

Sekil 16.

Bulusun ELISA yöntemi kullanilarak saptanan 3 saglikli gönüllüden ve 10 kolon kanseri öznesinden alinan serum numuneleri için saptanan hücresiz nükleozoni iliskili 5- metilsitozin seviyeleri.

Sekil 17. 13 saglikli gönüllü ve 55 kanser hastasindan alinan EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan hücresiz nükleozom iliskili 5-metilsitozin seviyeleri. Saglikli numunelerin ortalama degeri arti ortalamada bir veya iki standart sapma olarak tanimlanan esik noktalari gösterilir.

Sekil 18. saglikli gönüllü ve 61 kanser hastasindan alinan EDTA plazma numunelerine yönelik hücresiz nükleozom iliskili 5- metilsitozin seviyeleri. Saglikli numunelerin ortalama degeri arti ortalamadaki iki standart sapma olarak tanimlanan esik noktasi gösterilir.

Sekil 19.

Artan tümör boyutu, evresi ve hastaligin nodal gelisimi olan akciger ve kolon kanseri hastalarindan alinan EDTA plazma numunelerine yönelik saptanan hücresiz nükleozom iliskili 5-metilsitozin seviyeleri.

Sekil 20. 11 saglikli öznede bulunan ortalama oranlara göre ifade edilen ve nükleozom iliskili 5-metilsitozin (Smc) aracili DNA seviyelerinin bir orani olarak normallestirilmis 10 farkli kanser hastasindan alinan EDTA plazma numunelerine yönelik olarak bulusun ELISA yöntemleri kullanilarak saptanan histon türleri ve nükleotidlerin ortalama hücresiz nükleozom iliskili seviyeler.

Sekil 21. ll saglikli öznede bulunan ortalama oranlara göre ifade edilen ve nükleozom iliskili 5-metilsitozin (5mc) aracili DNA, seviyelerinin bir orani olarak normallestirilmis 2 kardiyomiyopati hastasi, lO sistemik lupus eritematozus (lupus) hastasi, 12 ülseratif kolit hastasi, lO kronik obstrüktif pulmoner hastalik (COPD) hastasi, 8 Crohn hastaligi hastasi ve 10 romatoid artrit (RA) hastasindan alinan EDTA plazma numunelerine yönelik bulusun ELISA yöntemleri kullanilarak saptanan histon türleri ve nükleotidlerin ortalama hücresiz nükleozom iliskili seviyeler.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bulusun bir açisina göre kanser, kardiyomiyopati, sistemik lupus eritematozus, kolit, kronik obstrüktif pulmoner bozukluk, Crohn hastaligi ve romatoid artrit tanisina yönelik bir biyo-belirteç olarak hücresiz bir nükleozoni ile iliskili bir DNA. bazinin kullanimi saglanir, burada DNA bazi sunlardan seçilir: 5- metilsitozin veya 5-hidroksimetilsitozin.

Bir düzenlemede nükleozom, bir mono-nükleozom veya oligo- nükleozomdur.

Bahsedilebilen bulusun belirli bir açisina göre hücresiz bir nükleozomr ile iliskili bir DNA› bazinin kullanimi saglanir, burada DNA bazi sunlardan seçilir: kanser tanisina yönelik bir biyo-belirteç olarak S-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin.

Bir düzenlemede kanser, bir mesane, meme, kolon, serviks, özofagus, böbrek, kalin bagirsak, akciger, agiz boslugu, yumurtalik, pankreas, prostat, rektum, Cilt veya mide kanseridir. Bahsedilebilen belirli bir düzenlemede kanser, bir kolon, akciger, agiz boslugu veya pankreas kanseridir.

DNA, bazlari 5-metilsitozin. ve 5-hidroksimetilsitozini içeren nükleozomlarin saptanmasi ve Ölçümü için ELISA testleri gelistirilmistir. Uygun spesifik bir anti-nükleotid antikoru ile kombinasyon halinde bu analizler için yakalama antikoru olarak bir anti-histon antikoru kullanilmistir. Analizler, nükleozomlari içeren spesifik nükleotidlerin, kanserli öznelerden alinan kan numunelerinde ölçülebildigini ve invazif olmayan veya minimal invazif biyo-belirteçler olarak kullanim için ayirt edici oldugunu göstermek üzere kullanilmistir.

Hastalikli öznelerden alinan serum ve plazma numunelerinde saptanan, diger nükleozom epitoplarinin seviyelerine göre, nükleozom iliskili DNA 5-metilsitozin seviyeleri, saglikli öznelerden alinan numunelerde saptananlardan farklidir. Ek olarak farkli hastaliklardan alinan öznelerden alinan numunelerde nükleozomlarda saptanan nükleotid seviyelerinin paterninin, diferansiyel bir hastalik tanisi mümkün olacak sekilde, özellikle nükleozom iliskili nükleotid paternleri, farkli histon varyantlari ve histon modifikasyonlarini içeren nükleozomlar için belirlenen paternler ile kombinasyon halinde incelendiginde farklilik gösterdigi bulunmustur. Teknikte uzman kisiler için farkli veya ek nükleotidleri içeren nükleozomlar için testlerin dahil edilmesinin muhtemelen bu tür paternler kullanilarak diferansiyel tani ayriminin gelistirecegi belirgin olacaktir.

Mevcut teknige ait yöntemler kullanilarak saglikli öznelerde bulunan nükleozomlarin seviyelerini arastirmak üzere, 20 saglikli öznelerden alinan serum ve plazma numunelerindeki nükleozomlar ölçülmüstür. Mevcut teknigin her iki yöntemi, saglikli öznelerden alinan serum numunelerinde plazma numunelerindekinden daha yüksek sinyaller üretmistir. Sonuçlar, Sekil 3'te gösterilir. Bu, nükleozom seviyelerinin serumda plazmadan daha yüksek olduguna dair yayinlanan veriler ile uyumludur (*Holdenrieder et al, 2001).

Bulus yöntemleri kullanilarak saglikli öznelerde bulunan nükleozomlarin seviyelerini arastirmak üzere 20 saglikli öznenin serumunda ve saglikli bovin serumunda modifiye edilmis nükleotid -metilsitozin içeren nükleozomlar ölçülmüstür. Serum sonuçlari saglikli öznenin tümünde düsüktür veya saptanamaz niteliktedir. Ayrica 20 saglikli özneden alinan EDTA. plazma numunelerinde modifiye edilmis nükleotid 5-metilsitozin içeren nükleozomlar ölçülmüstür ve sasirtici sekilde daha yüksek sinyaller gözlenmistir. Modifiye edilmis nükleotid 5- metilsitozin içeren hücresiz nükleozomlarin yüksek seviyeleri, saglikli insan EDTA plazmasinda mevcut. bulus yöntemleri ile saptanmistir ancak daha düsük seviyeler, Sekil 8'de gösterildigi üzere saglikli insan serumunda saptanmistir. Sekiller 4-9, benzer sonuçlarin diger nükleozom yapilari için elde edildigini gösterir. Bu bulgu, yayinlanan sonuçlar (*Holdenrieder et al, 2001) ve mevcut teknigin nükleozom ELISA yöntemleri için bulunan sonuçlar için beklenmedik. ve farklidir. Dolayisiyla sasirtici sekilde bulus yöntemleri, serum ve EDTA plazma numunelerinde meydana gelen nispi nükleozom` seviyeleri için mevcut teknik yöntemlerine zit sonuçlar üretir.

Nükleozom yapilarinin toplanabilen çesitli yaygin plazma türlerinin tümünde saptanabilir olup olmadigi arastirilmistir.

Hücresiz nükleozom iliskili 5-metilsitozinin yüksek seviyelerinin, EDTA plazmasindar ve daha az ölçüde saglikli öznelerden alinan sitrat plazmasinda bulus yöntemi ile saptanabildigi ancak nükleozom iliskili 5-metilsitozinin, saglikli öznelerden alinan çogu (5'te 3) heparin plazma numunesinde buzagi veya at serum taban deger sinyallerine göre düsük veya saptanamaz oldugu bulunmustur. Sonuçlar Sekil 15'te gösterilir. Kisaca açiklamak üzere hücresiz nükleozomlar, bulus yöntemi kullanilarak saglikli öznelerden alinan çogu veya tüm EDTA plazma ve sitrat plazma numunelerinde nispeten yüksek konsantrasyonlarda bulunur, ancak saglikli öznelerden alinan çogu heparin plazma veya serum numunelerinde düsük seviyededir veya bulunmaz. Bu nedenle numune tipinin kesin seçiminin farkli uygulamalar için kritik olacagi belirgindir.

Belirli nükleotid yapilarini içeren hücresiz nükleozomlarin saptanmasi için numune seçiminin birkaç parametre içerdigi gösterilmistir. Bunlar, genellikle saglikli öznelerden alinan serum ve heparin plazma numunelerinde bulunan hücresiz nükleozomlarin düsük seviyelerini ancak genellikle saglikli öznelerden alinan EDTA ve sitrat plazma numunelerinde bulunan daha yüksek seviyeleri, hücresiz nükleozomlari içeren serum numunelerinin serumun pihtidan ayrilmasindan sonra EDTA ilavesi ile stabilize edilmesi gerektigi tavsiyesini (*Holdenreider et al, 2001) ve serum numune alma protokolünü içerir. Diger stabilize edici ajanlar (örnegin proteaz inhibitörleri) ayrica kullanilabilir. Mümkün oldugunda lOmM EDTA eklenmesi ve numune donmasindan sonra 1 saatlik damar delinmesinde santrifüj edilen serum numuneleri kullanilmistir.

Klinik numuneler için kan numunesi tipi seçimi, belirli test için optimal klinik ayrim temelinde yapilmalidir. Saglikli öznelerin serumunda bulus yöntemi ile tutarli sekilde düsük nükleozom seviyelerine dair bulgular takip edilerek kanserli öznelerden alinan serum numunelerin nükleotid 5-metilsitozin içeren nükleozomlar ölçülmüstür. %lOO'e kadar klinik duyarlilik, kolon kanseri numuneleri için Sekil l6'da gösterilen sekilde gözlenmistir.

Ayrica çesitli hastaliklari olan öznelerden alinan EDTA plazma numunelerine nükleotidler 5-metilsitozin ve 5- hidroksimetilsitozin içeren hücresiz nükleozomlar ve diger nükleozom. yapilarinin. nispi seviyeleri ölçülmüstür. Hücresiz nükleozomlarin seviyeleri, hem saglikli öznelerden hem de hastalikli öznelerden alinan EDTA plazma numunelerinde yüksektir ve EDTA plazma numuneleri bu nedenle hastalikli ve saglikli öznelerin hassas bir ayristiricisi için en iyi numune seçenegi olmasi muhtemel görünmeyecektir. Ancak farkli nükleotidleri içeren nükleozomlarin (ve ayrica diger nükleozom yapilarinin) nispi seviyelerine bakimindan dolasimdaki hücresiz nükleozomlarin seviyelerinin ve bilisiminin hastalikli ve saglikli bireyler arasinda ve ayrica farkli hastaliklar arasinda degiskenlik gösterdigi gösterilmistir. Dolayisiyla öncelikle (i) dolasimdaki nükleozomlarin yüksek seviyelerinin hem saglikli hem de hastalikli öznelerden alinan tüm veya çogu EDTA. plazma numunesinde bulundugu ancak bunun tüm kan numune tipleri için geçerli olmadigi ve ayrica (ii) sasirtici sekilde hastaligin saptanmasi ve hastalik tipinin ayriminin bununla birlikte, hastalikli ve saglikli öznelerin plazmasinda bulunan nükleozom yapilarinin nispi türlerinin bir veya daha fazlasinin seviyelerine ve yapisal profiline bagli olarak bu EDTA plazma nükleozomlarinin analizi ile yapilabildigi belirtilir.

Saglikli öznelerden ve sirasiyla 55 ve 62 kanserli özneden olusan iki deneydeki çesitli kanser tiplerine sahip 117 özneden alinan EDTA plazmasindaki hücresiz nükleozomlar ölçülmüstür. Toplamda %78 (117'den 91'i) kanser numunesi dogru sekilde, saglikli özneler için ortalama sonucun esik degeri + ortalamanin 2 standart sapmasi kullanilarak nükleozom iliskili 5-metilsitozin için bulus yöntemi kullanilarak kanser için pozitif olarak tanimlanmistir.

Bu 2 deneyin birincisinde mide, kalin bagirsak, rektum, akciger (küçük hücreli karsinom çesitli küçük hücreli olmayan karsinomlar), meme, yumurtalik, pankreas, prostat, böbrek ve çesitli oral kanserler (agiz boslugu, damak, yutak ve girtlak) gibi kanserli 55 özneden ve 13 saglikli özneden alinan EDTA plazmasindaki hücresiz nükleozomlar ölçülmüstür. Saglikli özneler ve kanserli hastalardan alinan 13 numunenin tümü, nükleozomlar için pozitiftir. Ancak kanserli öznelerden alinan numunelerde saptanan seviyeler, saglikli öznelerden alinan numunelerde bulunandan daha yüksektir ve sonuçlar, saglikli ve kanserli öznelerin ayirt edilebildigini göstermistir. Örnegin nükleozom iliskili S-metilsitozin için ortalama ± ortalamanin 2 standart sapmasi olarak OD terimleri halinde hesaplanan nöral aralik O-1.41'dir. Bu esik degeri kullanildiginda 13 saglikli numune negatiftir ve 55 kanser numunesinin 30'u (%55'lik genel klinik duyarlilik) %38 (%8'de 3) mide, %6 (5'te 3) kalin bagirsak, %33 (3'te 1) rektal, %33 (6'da 2) küçük hücreli akciger, %64 (l4'te 9) küçük hücreli olmayan akciger, %33 (6'da 2) meme, %100 (1'de 1) yumurtalik, %100 (1'de 1) pankreas, %33 (6'da 2) prostat, %100 (1'de 1) böbrek ve %60 (5'te 3) oran kanser numuneleri dahil pozitiftir. Sonuçlar Sekil 17'de gösterilir.

Benzer sekilde nükleozom iliskili HZAZ analizine yönelik normal aralik O - 0.95'tir. 0.95 olan bu esik degeri kullanildiginda 13 saglikli öznenin tümü, yüksek nükleozom HZAZ seviyeleri için negatiftir. Buna karsin, yüksek nükleozom. HZAZ seviyelerine yönelik pozitif bir sonuç, %100 (8'de 8) mide, %100 (5'te 5) kalin bagirsak, %67 (3'te 2) rektal, %83 (6'da 5) küçük hücreli akciger, %79 (l4'te 11) küçük hücreli olmayan akciger, %50 (6'da 3) meme, %100 (1'de 1) yumurtalik, %100 (1'de 1) pankreas, %80 (5'te 4) prostat, %100 (1'de 1) böbrek ve %100 (5'te 5) oran kanser numuneleri dahil %84 (55'te 46) kanser numunesi (%84'lük genel klinik duyarlilik) için bulunmustur.

Bulusun bir düzenlemesinde bir kontrol numunesi saglanir ve pozitif veya negatif sonuçlar arasinda ayrim yapmak üzere analize yönelik esik seviyesi, kontrol numunesine yönelik sonuca iliskin olarak tanimlanir; Bu, kontrol numunesi sonucu seviyesine esit veya bunun üzerinde veya altinda herhangi bir oran olabilir. Bu seviyenin altindaki hasta sonuçlarinin, negatif oldugu düsünülür ve bu seviyenin üzerindeki hasta sonuçlarinin pozitif oldugu düsünülür. Kararin belirsiz olarak düsünüldügü ve/veya testin tekrarlanmasi gerektigi esik seviyesine çok yakin hasta sonuçlarinin bir “gri alan" araligi olabilir.

Nükleozom iliskili mH2A1.1 analizi için benzer sekilde normal aralik O - 0.91'dir. Bu esik degeri kullanildiginda 13 saglikli numune negatiftir ve %64 (55'te 35) kanser numunesi pozitiftir.

Nükleozom iliskili P-HZAX(Ser139) analizi için normal aralik O - 1.08'dir. Bu esik degeri kullanildiginda 13 saglikli numunenin tümü negatiftir ve %60 (55'te 33) kanser numunesi pozitiftir.

Dolayisiyla bazi nükleozom analizleri, digerlerinden daha iyi klinik duyarlilik sergiler.

Ek olarak bulusun klinik kullanimini gelistirmek üzere nükleozom yapilarin paterninin kullanilmasi mümkündür. Bu, örnegin nükleozom iliskili 5-metilsitozin analizinin esik degerinin l.Ol'e kadar olan bir aralik saglayan ortalama +- 1 standart sapmaya düsürülmesi ile yapilabilir. Bu durumda yanlis negatiflerin sayisi, %0 ila %23 (13'te 3) arasindaki saglikli özneden alinan numuneler' için yanlis pozitif sonuçlarda bir artis pahasina %93 (55'te 51) gelismis klinik duyarlilik saglayan 4'e azaltilir. Sonuçlar Sekil 17'de gösterilir. -metilsitozin iliskili nükleozomlar veya herhangi bir nükleozom için pozitif bulunan numuneler, nükleozoni yapi profili için sorgulanabilir. Nükleozom profili, Sekiller 20 ve 21'de gösterildigi üzere saglikli ve hastalikli hastalar arasinda ayrim yapmak üzere kullanilabilir burada çesitli nükleozom yapilarinin hastalikli hastalardaki nispi oranlarinin, saglikli hastalar ve diger kanser disi hastaliklari olan hastalarda bulunanlara göre ifade edilir. Bu, bir test panelinde Çoklu nükleozom yapilarin arastirilmasinin daha iyi klinik ayrimi kolaylastirabildigini gösterir.

Benzer sekilde bulusun tanisal spesifikligi ve/veya duyarliligi, birden fazla testten elde edilen verilerin oranlar formunda kombine edilmesi ile arttirilabilir. Örnegin nükleozom iliskili P-HZAX:5-metilsitozin oraninin kullanimi, gerçek pozitif kanser vakalarinin saptanmasini tek basina nükleozom iliskili 5- metilsitozine yönelik %55'ten (55'te 30) saglikli öznelerden alinan numunelere yönelik %100 (13'te 13) negatif sonuç sürerken 2 standart sapma esik seviyesinde %67'ye (55'te 37) arttirir.

Kolon kanserli 3 hasta, akciger kanseri olan 13 hasta, pankreas kanseri olan 2 hasta ve oral kanseri olan 1 hastadan alinan EDTA plazma. numunelerinde iki farkli nükleotid. içeren› dolasimdaki hücresiz nükleozomlarin seviyeleri ölçülmüstür ve bunlar, literatürde açiklanan sekilde hazirlanan saglikli öznelerden alinan serum nükleozomlarin yapay olarak üretilen preparatinin yani sira 20 saglikli özneden kan numunesinde bulunan seviyeler ile karsilastirilmistir (*Holdenreider et al, 2001). Ayrica normallestirilmis formda gözlenen seviyeler belirli bir nükleotidi içeren nükleozomlarin seviyesinin orani olarak ifade edilmistir ve bu tür oranlar veya oranlarin paternlerinin genel olarak her iki kanser tanisi için ve spesifik kanser tiplerinin diferansiyel tanisi için faydali oldugu gösterilmistir. Ayrica nükleozom iliskili 5-metilsitozin seviyesinin hastalik ilerlemesi ile degiskenlik gösterip göstermedigi arastirilmistir. 5-metilsitozin içeren hücresiz nükleozomlarin ortalama seviyesinin, hastaligin ciddiyeti ile arttigi ve hastaligin lenf dügümlerine artan sekilde yayilmasi ile yükseldigi gözlenmistir. Bu, saptanan nükleozomlarin tümör iliskili olduguna dair kanit saglar.

Ayrica mevcut teknigin iki nükleozoni ELISA yöntemleri kullanilarak bu 19 kanser numunesinde bulunan nükleozomlar ölçülmüstür. Çalisilan 19 kanser öznesinden çogunun, mevcut teknige ait nükleozom ELISA 1 ve 2 ile belirlendigi üzere düsük EDTA plazma nükleozom seviyelerine sahip oldugu bulunmustur. Bu sonuç, mevcut teknik analizlerinin rutin klinik amaçlar için neden kullanilmadiginin nedenini gösterir.

Ayni l9 numunede 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin nükleotidleri içeren nükleozomlari ölçmek üzere mevcut bulusun ELISA yöntemleri kullanilmistir. Sasirtici sekilde 5- metilsitozin içeren yüksek nükleozom seviyeleri, 19 numunenin tümünde saptanabilir. Dolayisiyla bir düzenlemede bulus, mevcut teknigin nükleozom analizleri ile saptanmayan nükleozomlari saptayabilen yeni bir nükleozom ELISA yöntemi saglar.

Ayrica literatürde açiklanan bir yöntem ile saglikli öznelerden üretilen nükleozomlarin bir numunesinin yani sira kanserli öznelerden alinan ayni 19 numunede 3 farkli histon varyanti ve bir histon PTM'si içeren nükleozomlarin seviyeleri ölçülmüstür (*Holdenrieder et al, 2001). Saglikli öznelerden üretilen nükleozomlar ile ve 4 farkli kanser tipine sahip öznelerden alinan biyolojik sivilarda bulunan Çesitli hücresiz nükleozomlarin bir paneli olarak, burada açiklanan nükleozom iliskili nükleotid ölçümleri ile birlikte bu ölçümler kullanilmistir. Sasirtici sekilde, arastirilan 4 kanser tipinde (akciger, kolon, pankreas ve oral) bulunan nükleozom paterni, saglikli öznelerden üretilen nükleozom numunesinde bulunandan ayirt edilebilirdir. Ayrica farkli kanser tipleri de öznelerin kaninsa saptanabilen hücresiz nükleozomlarin paternine bagli olarak birbirinden ayirt edilebilirdir. Dolayisiyla bulusun bir düzenlemesinde bir öznenin saglik 'veya hastalik. halinin bir göstergesi olarak, farkli DNA bazlarini veya en azindan 5- metilsitozin veya 5-hidroksimetilsitozinden seçilen bir veya daha fazla DNA bazinin bir kombinasyonunu içeren nükleozomlarin iki veya daha fazla ölçümü ve bir veya daha fazla histon varyanti ve/veya bir veya daha fazla histon modifikasyonunu ve/Veya per se nükleozomlarin ölçümlerini veya bunlarin herhangi birinin herhangi bir kombinasyonu veya oranindan olusan farkli nükleozom epitoplarinin bir paneline yönelik bir numunenin test edilmesi ile bir hastaligin varligi, tipi, nüksetmesi veya ciddiyetinin saptanmasi veya tani konulmasina yönelik bir yöntem saglanir.

Benzer sekilde çesitli kanser ve kanser disi hastalikta dolasimdaki hücresiz nükleozomlarin nükleotid, ve histon yapilarindaki degiskenligi saptamak üzere bulusun ELISA yöntemleri kullanilmistir ve bunlar saglikli öznelerde bulunan nükleozomlarin yapisi ile karsilastirilmistir. Nükleozomlarin, arastirilan tüm kanser ve kanser disi hastaliklarda mevcut oldugu bulunmustur ve sagli öznelerinkinden farkli olan profillere sahip oldugu bulunmustur. 2 kardiyomiyopati hastasi, lO sistemik lupus eritematozus (lupus) hastasi, 12 ülseratif kolit hastasi, lO kronik obstrüktif pulmoner hastalik (COPD) hastasi, 8 Crohn hastaligi hastasi ve 10 romatoid artrit (RA) hastasindan alinan EDTA plazma numuneleri çalisilmistir ve ortalama nükleozom iliskili 5- metilsitozin seviyesinin bir orani olarak saptanan çesitli nükleozom yapilarinin seviyeleri normallestirilmistir ve sonuçlar ll saglikli öznede bulunanlara göre ifade edilmistir.

Hastaliklarin, saglikli veya kanserli öznelerinkinden farkli olan nükleozom yapi profilleri ile iliskili oldugu bulunmustur.

Dolayisiyla nükleozom.yapi profilleri, genis çesitlilikte kanser disi hastalikta saptama, prognoz tahmini, izleme ve terapötik etkinlik tahmini için tanilayici bir araç olarak kullanilabilir.

Sonuçlar Sekil 21'de gösterilir.

Ayrica 10 farkli kanser hastaligi olan 55 hastadan alinan EDTA plazma numuneleri için bulusun ELISA yöntemleri kullanilarak saptanan histon tipleri ve nükleotidler bakimindan hücresiz nükleozomlarin yapisindaki çesitlilik çalisilmistir. Saptanan çesitli nükleozom yapilarinin seviyeleri, nükleozom iliskili 5- metilsitozin (5mc) aracili DNA seviyelerinin bir orani olarak normallestirilmistir> ve ll saglikli öznede bulunanr ortalama oranlara göre ifade edilmistir. Kanser hastaliklari, kanser disi hastaliklar ve saglikli özneler arasinda degiskenlik gösteren nükleozom yapi profilleri ve tüm öznelerde mevcut olan nükleozomlar bulunmustur. Dolayisiyla nükleozom yapi profilleri, kanser ve diger hastaliklarda saptama, prognoz tahmini, izleme ve terapötik etkinlik tahmini için tanilayici bir araç olarak kullanilabilir. Sonuçlar Sekil 20 ve 2l'de gösterilir.

Serum veya plazmada dolasimdaki çogu DNA mono-nükleozom ve oligo-nükleozom olarak belirtildiginde (Holdenrieder et al, 2001) teknikte uzman kisiler için mevcut bulus yöntemlerinin ayrica kan, serum ve plazma dahil dogrudan biyolojik sivilardaki per se hücresiz metillenmis DNA'yi (örnegin 5-metilsitozin veya -hidroksimetilsitozin içeren nükleozom iliskili DNA olarak) saptamak veya ölçmek üzere kullanilabilir. Bu sekilde kullanilan bulus yöntemleri, özellikle DNA ekstraksiyonunun dahil edilmemesi veya gerekli olmamasi nedeniyle mevcut teknigin metillenmis DNA'sinin ölçülmesine yönelik yöntemlere göre basitlik ve hiz avantajlarina sahiptir.

Ayrica mevcut tarifname yönteminin, nükleozomlar içerisindeki herhangi bir nükleik asit veya DNA bazi veya nükleik asit analogu veya türevini saptamak veya ölçmek üzere kullanilabildigi belirgin olacaktir. Bu tür bazlar sinirlama olmaksizin adenin, timin, guanin, sitozin, urasil, inozin, ksantin, hipoksantin, 7,8-dihidro-8-okso-guanin ve bunlarin herhangi bir türevi veya analogunu içerir. Teknikte uzman kisiler için yaygin bir nükleotidin (örnegin sinirlama olmaksizin, guanin, sitozin, timin veya adenin), tüm veya çogu nükleozomda meydana gelecegi ve yaygin bir nükleotide yönelik. bir antikorun kullanildigi tarifname yönteminin bir numunedeki tüm nükleozomlari görsel olarak baglamak ve saptamak üzere bir yöntem saglayacagi belirgin olacaktir. Dolayisiyla ayrica yaygin bir nükleotid içeren nükleozomlarin tüm veya çogu nükleozomun saptanmasini saglayacak bir yol olarak ölçüldügü per se nükleozomlarin saptanmasi için yeni bir yöntem açiklanir.

Tarifnamenin ilave bir açisi, yaygin bir nükleotid içeren nükleozomlarin, tüm. veya çogu nükleozom bagli DNA'nin saptanmasini saglayacak bir yol olarak ölçüldügü tüm nükleozom iliskili DNA'nin saptanmasi için yeni bir yöntem saglar. Ayrica iki veya daha fazla DNA bazinin ölçümü, bu DNA bazlarinin nispi DNA içeriginin bir oraninin ölçümü için temel saglayacaktir.

Sekiller 10-14'te numunelerdeki nispi 5-metilsitozin ve 5- hidroksimetilsitozin seviyelerine yönelik bu tür oranlar gösterilir. Veriler, saptanabilir 5-metilsitozin ve 5- hidroksimetilsitozinin nispi seviyelerinin farkli kanser tiplerinde farklilastigini ve bu tr kanserleri ayirt etmek üzere kullanilabildigini gösterir. Diger benzer oranlar da teknikte faydalidir. Örnegin toplam nükleozom bagli DNA için bir metrik olarak uygun bir DNA bazini (veya bazlarini) ölçmek üzere mevcut bulus kullanilarak ve bir diger bazin (örnegin 5-metilsitozin) nispi seviyesi belirlenerek bulus yönteminin, belirli herhangi bir bazi içeren DNA oranini (örnegin bir numunede metillenmis DNA yüzdesi) saptamak üzere kullanilabildigi belirgin olacaktir.

Dolayisiyla mevcut bulus yöntemleri, bir numunede herhangi bir bazin DNA içerik yüzdesinin ölçümü için basit ve hizli bir yöntem saglar. Yöntem, örnegin kan numuneleri olmak üzere birçok numunede hizli ve basit sekilde kullanilabilir. Bulus yöntemleri, örnegin hücrelerden ekstrakte edilen kromatinin parçalanmasi ile elde edilen numuneler dahil bu tür numunelerin meydana geldigi herhangi bir numunedeki nükleozomlarda bulunan DNA bazlarini saptamak ve ölçmek üzere kullanilabilir. Teknikte uzman kisiler için buradaki nükleotid teriminin sinirlama olmaksizin pürinler, pirimidinler veya herhangi bir nükleik asit bazini ve iliskili sekerler ile veya olmaksizin ve fosforilasyon ile veya olmaksizin benzer molekülleri ve bunlarin herhangi bir analogu, türevi veya taklidi dahil içermesi tasarlandigi belirgin olacaktir.

Mevcut bulus yönteminin, belirli nükleotidleri içeren nükleozom iliskili DNA'nin saptanmasi ve ölçümü için basarili bir yöntem oldugu, bu yöntemin ayrica per se nükleozomlarin saptanmasi için bir yöntem olarak basarili sekilde kullanilabildigi ve per se nükleozomlarin saptanmasi için mevcut teknik yöntemlerinden daha üstün bir yöntem oldugu ve bu yöntemin ayrica per se hücresiz DNA'nin dogrudan saptanmasi için ve `per' se hücresiz DNA'nin nükleotid bilesimi için bir yöntem olarak basarili sekilde kullanilabildigi ve nükleozom iliskili DNA ve bunun nükleotid bilesiminin saptanmasi için mevcut teknik yöntemlerinden daha üstün bir yöntem oldugu düsünülür. Yöntem, kompleks biyolojik ortam. ve sivilarda kullanim için hizli, düsük maliyetli ve uygundur. Mevcut bulus yönteminin, nükleozomlari ve kanda metillenmis DNA içeren nükleozomlari saptamak üzere kullanilabildigi ve bunun, kanser için bir biyo-belirteç olarak kullanilabildigi gösterilmistir. Teknikte uzman kisiler için kanser hastalarindan alinan kan numunelerinde bulunan bir biyo- belirtecin, kanser ve dolasimdaki yüksek nükleozomlar ile iliskili diger hastaliklar için genis bir tani ve hastalik tarama amaçlarina yönelik degere sahip oldugu belirgin olacaktir (Holdenrieder et al, 2001).

Yüksek nükleozom seviyelerinin, bulus yöntemleri kullanilarak saglikli öznelerde bulunmadigini dogrulamak üzere 20 saglikli özne serumunda ve saglikli bovin serumundaki nükleotidler 5- metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin içeren nükleozomlar ölçülmüstür. Bulusun her iki ELISA testi için dolasimdaki serum nükleozom sonuçlari, 20 saglikli öznenin tümü için düsük veya saptanamaz niteliktedir. Ayrica ayni 20 saglikli özneden alinan, plazma numunelerinde benzer bir test gerçeklestirilmistir ve sasirtici sekilde daha yüksek sinyaller gözlenmistir. Bu bulgu beklenmediktir* ve mevcut teknigin nükleozoni ELISA. yöntemleri için bulunan sonuçlardan oldukça farklidir.

Bulus, birçok kanser ve kanser disi hastalikta test edilmistir ve test edilen hastaliklarin tümünün saptanmasinda etkili oldugu bulunmustur. Bu, mevcut teknigin nükleozom ELISA testleri ile saptanamayan prostat kanseri vakalarinin saptanmasini içerir (Holdenrieder, 2001). Bulusun, tüm veya çogu kanserin saptanmasi için etkili oldugu› belirgindir. Teknikte uzman kisiler için bulusun klinik performansinin ilave nükleozom yapi testlerinin dahil edilmesi ve mevcut farkli nükleozom yapilarinin oranlarinin incelenmesi ile daha fazla gelistirilebildigi belirgin olacaktir.

Bulusun bir açisina göre bir numunede nükleotidleri içeren hücresiz nükleozomlarin saptanmasi ve ölçülmesine yönelik bir ikili antikor, immünometrik veya sandviç immüno analiz yöntemi saglanir. Bu açinin bir düzenlemesi, asagidaki adimlari içeren bir immüno analizdir: (i) nükleozomlari içerebilen numunenin bir birinci antikor veya nükleozomlara baglanan diger baglayici ile temas ettirilmesi; (ii) nükleozomlar veya numunenin ikinci bir antikor veya bir nükleotide baglanan diger baglayici ile temas ettirilmesi; (iii) söz konusu ikinci antikor veya diger baglayicinin numunedeki bir nükleotide baglanmasinin saptanmasi ve/veya kantifiye edilmesi; ve (iv) numunedeki bir nükleozom iliskili nükleotidin varliginin bir ölçüsü olarak bu tür baglanmanin varliginin veya derecesinin kullanilmasi burada nükleotid sunlardan seçilir: 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin.

Ikinci bir düzenlemeye göre asagidaki adimlari içeren bir immünometrik immünoanaliz ile bir numunedeki nükleotidleri içeren hücresiz nükleozomlarin saptanmasi ve ölçülmesine yönelik bir yöntem saglanir: (i) nükleozomlari içerebilen içerebilen numunenin bir birinci antikor veya bir bükleotide baglanan diger baglayici ile temas ettirilmesi; (ii) nükleozomlar veya numunenin ikinci bir antikor veya nükleozomlara baglanan diger baglayici ile temas ettirilmesi; (iii) söz konusu ikinci antikor veya diger baglayicinin numunedeki nükleozomlara baglanmasinin saptanmasi ve/Veya kantifiye edilmesi; ve (iv) numunedeki bir nükleozom iliskili nükleotidin varliginin bir ölçüsü olarak bu tür baglanmanin varliginin veya derecesinin kullanilmasi burada nükleotid sunlardan seçilir: 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin. Çesitli antikorlar veya diger baglayicilar, bulusta nükleozomlara baglanan bir baglayici olarak kullanilabilir.

Bunlar, intakt nükleozomlarda meydana gelen ve serbest histonlarda meydana gelmeyen epitoplara (örnegin; bir nükleozomda iki histon arasindaki baglanti noktasinda bulunan bir epitop) baglanmaya yönelik baglayicilari ve ayrica yaygin nükleozom protein, histon veya nükleik asit epitoplari dahil herhangi bir nükleozom bilesenine yönelik baglayicilari içerir.

Teknikte uzman kisiler için açiklanan bulus yöntemlerinin örnegin ForteBio Incorporated of USA tarafindan piyasaya sürülen tipte etiketsiz analizler ve biyo-belirteç tipi analizleri dahil çesitli düzenlemeleri içerdigi belirgin olacaktir. Immünometrik immüno analizler, analite baglanmak üzere bir antikor (veya diger baglayici) içerir. bu sekilde baglanan analit, orijinal test numunesindeki seviyesi veya konsantrasyonunun dogrudan ölçümü olarak saptanir. Bunun aksine “rekabetçi” immüno analizler genellikle analitin bir kismini baglamak üzere antikorun (veya diger baglayici) çok küçük bir miktarini kullanir ve etiketli bir analit (veya analit analogu) preparati, bagli ve serbest analit fraksiyonlari (numune analiti ile) arasinda ayrim yapmak üzere kullanilir. Bagli etiketlenmis analit miktari, orijinal numunede analit konsantrasyonunun dolayli bir ölçümü olarak ölçülür. Bir “rekabetçi” immüno analiz tasarim varyantinda etiketlenmis bir antikor, kati fazli bir analit (veya analit analogu) preparati ile birlikte kullanilir.

Etiketlenmis antikorun baglanmasi, numune analiti ile kati fazli analit (veya analit analogu) arasinda dagitilir. Kati fazli analit (veya analit analogu) preparatina baglanan antikor miktari, numunenin analit konsantrasyonunun dolayli bir ölçümü olarak kullanilir.

Tarifnamenin ilave bir açisina göre asagidaki adimlari içeren, etiketsiz bir immünometrik immüno analiz ile bir numunede, bir nükleozom iliskili nükleotid dahil, bir nükleotidin saptanmasi ve ölçülmesine yönelik bir yöntem saglanir: (i) numunenin bir antikor veya bir nükleotide baglanan diger baglayici ile temas ettirilmesi; (ii) söz konusu antikor veya diger baglayicinin numunede bir nükleotide baglanmasinin saptanmasi ve/veya kantifiye edilmesi; ve (iii) numunede bir nükleotid varliginin bir ölçümü olarak bu tür baglanmanin varligi veya derecesinin kullanilmasi.

Tarifnamenin ilave bir açisina göre asagidaki adimlari içeren rekabetçi bir immüno analiz ile bir numunede, bir nükleozom iliskili nükleotid dahil, bir nükleotidin saptanmasi ve ölçülmesine yönelik bir yöntem saglanir: (i) numunenin bir antikor veya bir nükleotide baglanan diger baglayici ile temas ettirilmesi; (ii) söz konusu antikor veya diger baglayicinin numunede bir nükleotide baglanmasinin saptanmasi ve/veya kantifiye edilmesi; and (iii) numunede bir nükleotid varliginin bir ölçümü olarak bu tür baglanmanin varligi veya derecesinin kullanilmasi.

Teknikte uzman kisiler için bulusun bu immüno analiz yöntemlerinin, DNA ekstraksiyonu için herhangi bir gereksinim olmaksizin dogrudan nükleotidleri ve nükleozom iliskili nükleotidleri ölçtügü belirgin olacaktir. Bunun aksine mevcut teknigin nükleotid immüno analiz yöntemleri, bir numuneden DNA ekstraksiyonundan sonra (nükleozom iliskili olmayan) nükleotidleri saptar. Bulus yöntemleri, kan veya türevleri dahil kompleks biyolojik numunelerde dogrudan ölçümler için hiz, basitlik ve uygunluk avantajlarina sahiptir.

Bulusun bir düzenlemesine göre asagidaki adimlar içeren, bir numunedeki belirli bir nükleotidi içeren hücresiz DNA oraninin saptanmasina yönelik bir yöntem saglanir: (i) bir numunedeki hücresiz DNA seviyesinin saptanmasi veya ölçülmesi; (ii) bulusun bir düzenlemesine göre bir nükleozom iliskili nükleotidin seviyesinin saptanmasi veya ölçülmesi; ve (iii) nükleotid içeren DNA oranini belirlemek üzere iki ölçümün kullanilmasi.

Bulusun bu açisinin bir düzenlemesine göre ilgili numune ve nükleotiddeki hücresiz her iki DNA seviyesi, bulus yöntemi kullanilarak ölçülür. Bulusa göre ilgili nükleotid, metillenmis bir sitozin nükleotiddir bu nedenle nükleotidi içeren DNA orani küresel DNA metilasyon ölçümünü saglar. Öznelerden alinan kanda nükleotidleri içeren nükleozomlarin saptanmasi ve ölçümünün, kanserli özneleri tanimlamak ve bunlari saglikli öznelerden ayirt etmek üzere tanisal bir yöntem olarak kullanilabildigi gösterilmistir. ayrica farkli nükleotidler, histon varyantlari ve histon PTM'lerinin bir panelini içeren nükleozom paternlerinin, farkli kanserler arasinda ayrim yapmak üzere kullanilabildigi gösterilmistir. Teknikte uzman kisiler için, bunun öznelerdeki kanseri saptayacak ve kanser pozitif öznelerde kanser tipleri arasinda ayrim yapmak üzere kullanilabilen bir kan kanser testi sagladigi belirgin olacaktir. Bulusun ilave bir yönüne göre, burada bir vücut sivisi içinde hücresiz 5-metilsitozin veya 5-hidroksimetilsitozinden seçilen bir nükleotid içeren nükleozomlarin varligini ve/veya düzeyini veya konsantrasyonunu ölçme veya saptama ve saptanan düzeyi bir öznenin, sinirlandirma olmaksizin, bir hastaligin bir klinik tanisini, hastalik tipinin veya alt-tipinin bir ayirici tanisini veya bir hastalik prognozunu veya bir hastalik relapsini veya tedavi rejimlerine özne duyarliliginin bir tanisini, içeren hastalik durumunun bir biyo-belirteci olarak kullanma ile bir hastaligin varligini saptamak veya tanisini koymak için bir yöntem saglanir. Tanisal testler için kullanilan vücut sivilarinin, sinirlandirma olmaksizin, kani, serumu, plazmayi, idrari, beyin-omurilik. sivisini ve diger` sivilari, içerdigi teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan anlasilacaktir. Tercih edilen bir uygulamada, örnek olarak seçilen vücut sivisi, kandir, serumdur veya plazmadir. Bir Vücut sivisi içindeki bir nükleozom iliskili nükleotidin analiz yaniti, düzeyi, konsantrasyonu 'veya iniktari, mutlak veya bagil terimler hâlinde, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, bulunan toplam nükleozom düzeyinin bir orani olarak veya bir baska nükleotidi veya histonu varyanti veya histon PTM'nin toplam DNA düzeyine orani olarak ifade edilebilir.

Bulusun bir düzenlemesinde nükleozom iliskili nükleotid ölçümü, testlerin bir tanisal panelinin bir üyesi veya bir öznenin, sinirlandirma olmaksizin, bir hastaligin bir klinik tanisini, hastalik tipinin veya alt-tipinin bir ayirici tanisini veya bir hastalik prognozunu veya bir hastalik relapsini veya tedavi rejimlerine özne duyarliliginin bir tanisini, içeren hastalik durumunun saptanmasi veya tanisi için ölçümler olarak kullanilir.

Dolasimdaki hücresiz DNA'nin tümü veya Çogunun, nükleozom iliskili DNA olarak mevcut oldugu belirtildiginden teknikte uzman kisiler için hastalik halinin tanisi veya saptanmasinin nükleozom iliskili nükleotidlere yönelik bir immünoanaliz yerine veya buna ek olarak biyolojik bir sivi içerisinde herhangi bir DNA ekstraksiyon adimi olmaksizin bulusa ait bir dogrudan nükleotid immüno analiz kullanilarak per se nükleotidlerin saptanmasi veya ölçümü ile gerçeklestirilebildigi belirgin olacaktir. Bulusun ilave bir açisina göre bir vücut sivisi içerisinde, 5-metilsitozin veya 5-hidroksimetilsitozinden seçilen bir nükleotid varliginin ve/veya seviyesinin veya konsantrasyonunun ölçülmesi veya saptanmasi yoluyla ve sinirlama olmaksizin bir hastaliginin klinik tanisi, hastalik türü veya alt türünün diferansiyel tanisi veya bir hastalik prognozu veya hastaligin nüksetmesi veya tedavi rejimlerine duyarli öznenin tanisi dahil olmak üzere bir öznenin hastalik halinin bir biyo- belirteci (yalnizca testlerin bir panelinin bir üyesi olarak) saptanmis seviye kullanilarak bir hastaliginin varliginin saptanmasi veya tani koyulmasina yönelik bir non-ekstraksiyon nükleotid immüno analiz yöntemi saglanir. Teknikte uzman kisiler tarafindan tani testine yönelik kullanilan vücut sivilarinin sinirlama olmaksizin kan, serum, plazma, ürin, serebrospinal sivi ve diger sivilari içerdigi kabul edilecektir. Tercih edilen bir düzenlemede numune olarak seçilen vücut sivisi kan, serum veya plazmadir. Bir vücut sivisi içerisinde bir nükleotidin analiz yaniti, seviyesi, konsantrasyonu *veya Iniktari, mevcut toplam nükleozom seviyesinin örnegin sinirlama olmaksizin bir orani olarak veya bir diger nükleotid veya histon varyanti veya histon PTM'nin seviyesine veya toplam DNA'nin seviyesine bir oran olarak mutlak terimler veya bagil terimler hâlinde ifade edilebilir.

Tarifnamenin ilave bir açisina göre asagidaki adimlari içeren, bir hücrede bir nükleotid içeren nükleozomlarin varliginin ve/veya seviyesinin saptanmasi veya ölçülmesine yönelik bir yöntem saglanir: (i) bir hücreden kromatin izole etme; (ii) kromatini mono-nükleozomlar ve/veya oligo- nükleozomlar olusturmak için parçalama; ve (iii) mono-nükleozomlar ve/veya oligo-nükleozomlar içinde bir nükleotid varligini bulusun bir immüno-analiz yöntemi vasitasiyla saptama veya ölçme.

Kromatinden mono-nükleozomlar ve/veya oligo-nükleozomlar üretmek için yöntemler teknikte iyi bilinir ve enzim sindirilmesini veya sonikasyonu içerir (Dai et al, 2011).

Teknikte uzman kisiler tarafindan hücreler veya dokularda nükleozom iliskili nükleotidlerin saptanmasina yönelik açiklanan yöntemin, IHC dahil mevcut durumda kullanilan yöntemlere göre veya restriksiyon sindirimi ve en yakin komsu analizi ile veya kloroasetaldehit kullanilarak florsan analizleri ile veya metillenmemis CpG miktarini hesaplamak üzere tritiyum etiketli S-adenozil metiyonin ile baglantili olarak DNA metiltransferazinin kullanildigi tüm CpG alanlarinin metilasyonu ile inverse belirleme yoluyla veya kütle spektrometrisini takiben› yüksekr performansli sivi kromatografisi, ince katman kromatografisi veya sivi kromatografisi yoluyla analiz için tekli nükleotidlerde DNA sindirimi ile hücrelerden ekstrakte edilen DNA'daki nükleotidlerin saptanmasi avantajlarina sahip oldugu kabul edilecektir. Belirli bir nükleozom iliskili nükleotidin seviyesi, konsantrasyonu veya miktari, örnegin mevcut toplam nükleozomun bir orani olarak veya nükleozomlarin toplam seviyesine veya bir diger nükleotid veya histon varyanti veya histon PTM'i içeren nükleozomlarin seviyesine veya toplam DNA seviyesine bir oran olarak mutlak terimler veya bagil terimler hâlinde ifade edilebilir.

Teknikte uzman kisilerce bulusun herhangi bir açisina göre antikor, baglayici veya ligand terimlerinin bunlarla sinirli olmamak üzere belirli moleküller veya varliklara baglanabilen herhangi bir baglayiciyi içermesi ve bu bulusun yönteminde kullanilabilen herhangi bir baglayiciyi içermesinin tasarlandigi belirgin olacaktir. Ayrica nükleozom teriminin mono-nükleozomlar ve oligo-nükleozomlari ve sivi ortamda analiz edilebilen bu tür herhangi bir kromatik fragmanlarini içermesinin tasarlandigi belirgin olacaktir.

Tarifnamenin bir diger açisina göre, burada tanimlanan yöntemlerin herhangi birine göre kitin kullanima yönelik talimatlar ile birlikte nükleotid veya bunun bir bilesen parçasina spesifik bir ligand veya baglayici veya nükleozom veya bunun bilesen parçasinin yapisal/sekil bakimindan taklidini içeren nükleozomlarin saptanmasi veya ölçülmesine yönelik bir kit saglanir.

Tarifnamenin ilave bir açisina göre, burada tanimlanan yöntemlerin herhangi birine göre kitin kullanima yönelik talimatlar ile birlikte nükleotid veya bunun bir bilesen parçasina spesifik bir ligand veya baglayici içeren bir nükleotid veya nükleotid veya bunun bilesen parçasinin yapisal/sekil bakimindan taklidini içeren nükleozomlarin saptanmasi veya ölçülmesine yönelik bir kit saglanir.

Açiklamanin bir baska yönüne göre, burada hayvanlarda veya insanlarda hastalik durumunu saptamak veya tanisini koymak için bir nükleozom iliskili nükleotid biyo-belirtecini veya bir nükleotid biyo-belirtecini tanimlamak için asagidaki adimlari içeren bir yöntem saglanir: (i) hastalikli öznelerin bir vücut sivisi içinde bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini saptama veya ölçme; (ii) kontrol öznelerinin bir vücut sivisi içindeki bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini saptama veya ölçme; ve (iii) bir nükleotidin bu hastalik için bir biyo-belirteç olarak yararli olup olmadigini tanimlamak için hastalikli öznelerde ve kontrol öznelerinde saptanan düzeyler arasindaki farki kullanma.

Kontrol öznelerinin, örnegin, hastaliksiz oldugu bilinen özneleri içerebilen veya (örnegin; ayirici tani arastirmasi için) farkli bir hastaligi olan özneler olabilen çesitli temellere göre seçilebilecegi teknikte uzmanligi olan kisiler için asikâr olacaktir.

Açiklamanin ilave bir yönüne göre, burada bir hastalikli hayvan veya insan öznenin prognozunu degerlendirmek için bir nükleozom iliskili biyo-belirteci veya bir nükleotid biyo-belirtecini tanimlamak için asagidaki adimlari içeren bir yöntem saglanir: (i) hastalikli öznelerin bir vücut sivi içinde bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini saptama veya ölçme; ve (ii) hastalikli öznelerin bir vücut sivisi içinde saptanan bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini öznelerin hastalik sonucu ile korele etme.

Açiklamanin ilave bir yönüne göre, burada tedaviye ihtiyaci olan bir hastalikli hayvan veya insan özne için bir tedavi rejiminin seleksiyonu amaciyla kullanilacak olan bir bükleotid biyo- belirtecini tanimlamak için asagidaki adimlari içeren bir yöntem saglanir: (i) hastalikli öznelerin bir vücut sivisi içinde bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini saptama veya ölçme; ve (ii) hastalikli öznelerin bir vücut sivisi içinde saptanan bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini bu öznelerde bir tedavi rejiminin gözlenen etkinligi ile korele etme.

Açiklamanin ilave bir yönüne göre, burada bir hastalikli hayvan veya insan öznenin. tedavisini görüntülemek için kullanilacak olan bir nükleozom iliskili biyo-belirteci veya bir nükleotid biyo-belirtecini tanimlamak için asagidaki adimlari içeren bir yöntem saglanir: (i) bir hastalikli öznenin bir Vücut sivisi içinde bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini saptama veya ölçme; (ii) öznenin hastalik progresyonu sirasinda bir veya birden fazla zamanda söz konusu saptamayi veya ölçümü tekrar etme; ve (iii) bir hastalikli öznenin bir vücut sivisi içinde saptanan bir nükleotid içeren hücresiz nükleozomlarin düzeyini öznedeki hastalik progresyonu ile korele etme.

Açiklamanin ilave bir yönüne göre; burada, burada tanimlandigi üzere yöntem ile tanimlanan bir biyo-belirteç saglanir.

Immünoanaliz yöntemleri ile diger kisimlari içeren bir kompleks parçasi olarak olusturulan bir kismin varliginin saptanabildigi teknikte bilinir. Teknikte uzman kisilerce bir nükleotidi içeren hücresiz nükleozomlarin sivi içerisinde nükleotidin dogrudan immünoanalizini içeren bir prosedür yoluyla, kan, plazma, serum ve ürin dahil biyolojik bir sivi içerisinde saptanabildigi belirgin olacaktir. Bu prosedürde bir nükleotid üzerinde bulunan bir epitopa yönelik bir antikoru kullanan bir tekli antikor immünoanalizi veya bir nükleotid üzerinde bulunan iki epitopa yönelik iki antikoru kullanan 2-alanli immüno analiz, bir nükleozom içerisindeki bir nükleotid varligini saptamak üzere kullanilir. Dolayisiyla bulusun bir diger düzenlemesinde bir nükleozom içerisinde bulunan bir nükleotid bir nükleotide yönelik bir immünoanaliz yönteminin kullanimi ile kan, plazma, serum ve ürin dahil biyolojik bir sivida dogrudan saptanir.

Dolayisiyla bulusun bir düzenlemesinde 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozinden seçilen bir nükleozom iliskili nükleotid, nükleotide yönelik bir immünoanaliz kullanilarak kan, plazma, serum ve ürin dahil biyolojik bir sivida ön ekstraksiyon olmaksizin dogrudan saptanir.

Ilave bir yön, biyo-belirteci spesifik baglayabilen, ligandlar veya baglayicilar, örnegin, dogal olusumlu veya kimyasal olarak sentezlenmis bilesikler, saglar. Bir ligand veya baglayici, biyo-belirteci spesifik baglayabilen bir peptit, bir antikor veya bunun bir fragmanini veya bir sentetik ligandi, örnegin, bir plastik antikoru veya bir aptameri veya oligonükleotidi, içerebilir. Antikor, biyo-belirteci spesifik baglayabilen bir monoklonal antikor veya bunun bir fragmani olabilir. Bir ligand, bir saptanabilir belirteç, örnegin, bir lüminesan, flüoresan, enzim veya radyo-aktif belirteç ile etiketlenebilir; alternatif veya ilave olarak bir ligand, bir afinite etiketi, örnegin, bir biyotin, avidin, streptavidin veya His (örnegin, hekza-His) etiketi, ile etiketlenebilir. Alternatif olarak ligand baglama, bir etiketsiz teknoloji, örnegin, ForteBio Inc.'in teknolojisi, kullanilarak belirlenebilir.

Açiklamaya göre bir biyo-sensör, biyo-belirtece karsi bir antikorur spesifik baglayabilen biyo-belirteç veya bunun bir yapisal/sekil taklidini içerebilir. Burada tarif edildigi üzere bir ligand veya mimik içeren bir dizilim de saglanir.

Açiklama ile ayrica, biyo-belirteci saptamak ve/veya kantifiye etmek için, burada tarif edildigi üzere, dogal olusumlu veya kimyasal olarak sentezlenmis olabilen ve uygun bir sekilde bir peptit, antikor veya bunun fragmani, aptamer veya oligonükleotid olan, bir veya birden fazla ligandin kullanilmasi ve açiklamanin bir biyo-sensörünün veya açiklamanin bir diziliminin veya açiklamanin bir kitinin kullanilmasi da saglanir. Bu kullanimlarda, saptama ve/veya kantifikasyon, burada tanimlandigi üzere bir biyolojik örnek üzerinde gerçeklestirilebilir.

Tanisal kitler veya görüntüleme kitleri, açiklamanin yöntemlerini gerçeklestirmek için açiklanir. Bu tarz kitler uygun bir sekilde, burada tarif edildigi üzere, opsiyonel olarak kitin kullanilmasi için talimatlar ile birlikte, biyo-belirtecin saptanmasi ve/veya kantifikasyonu için bir ligand ve/veya bir biyo-sensör ve/veya bir dizilim içerecektir.

Açiklamanin ilave bir yönü, bir hastalik hâlinin varligini saptamak için, burada tanimlandigi üzere biyo-belirteçlerin birini veya birden fazlasini saptayabilen ve/veya kantifiye edebilen bir biyo-sensör içeren bir kittir.

Bir hastaligin varligini saptamak için biyo-belirteçler, bozuklugun progresyonunu geciktiren veya durduran yeni hedeflerin veya ilaç moleküllerinin kesfi için esansiyel hedeflerdir. Biyo-belirtecin düzeyi bozuklugun ve ilaç yanitinin göstergesi oldugundan, biyo-belirteç in vitro ve/Veya in vivo analizlerde yeni terapötik bilesiklerin tanimlanmasi için yararlidir. Bulusun biyo-belirteçleri, biyo-belirtecin aktivitesini modüle eden bilesikler için tarama amaciyla yöntemlerde kullanilabilir.

Böylelikle, açiklamanin ilave bir yönünde, burada biyo- belirtecin üretilmesini arttirabilen ve/Veya baskilayabilen bir maddeyi tanimlamak için, burada tarif edildigi üzere, bir peptit, antikor veya bunun fragmani veya aptamer veya oligonükleotid olabilen bir baglayicinin veya ligandin kullanilmasi veya açiklamaya göre bir biyo-sensörün veya açiklamaya göre bir dizilimin veya açiklamaya göre bir kitin kullanilmasi saglanir.

Burada ayrica, bir öznede biyo-belirtecin üretilmesini arttirabilen veya baskilayabilen bir maddeyi tanimlamanin, bir test maddesini bir özne hayvana uygulamayi ve özneden elde edilen bir test örneginde bulunan biyo-belirtecin düzeyini saptamayi ve/veya kantifiye etmeyi içeren bir yöntem de saglanir.

"Biyo-belirteç" terimi bir prosesin, olayin veya rahatsizligin ayirici bir biyolojik veya biyolojik olarak türetilmis indikatörü anlamina gelir. Biyo-belirteçler, tani yöntemlerinde, örnegin, klinik taramada ve prognoz degerlendirmesinde ve terapinin sonuçlarini görüntülemede, özel bir terapötik tedaviye yanit vermesi en olasi olan hastalari tanimlamada, ilaç taramada ve gelistirmede, kullanilabilir. Biyo-belirteçler ve bunlarin kullanimlari yeni ilaç tedavilerinin tanimlanmasi için ve ilaç tedaileri için yeni hedeflerin kesfi için degerlidir.

Burada kullanildigi sekliyle, "saptama" ve "tani koyma" terimleri, bir hastalik hâlinin tanimlanmasini, dogrulanmasini ve/veya karakterizasyonunu kapsar. Bulusa göre saptamanin, görüntülemenin veya taninin yöntemleri, bir hastaligin varligini dogrulamak için, hastaligin gelismesini baslangici ve progresyonu degerlendirme ile görüntülemek için veya hastaligin sagaltilmasini veya regresyonunu degerlendirmek için yararlidir.

Saptamanin, görüntülemenin veya taninin yöntemleri ayrica, klinik taramanin, prognozun, terapi seçiminin degerlendirilmesi, terapötik, yani ilaç taramasi ve ilaç gelistirilmesi için, yararin degerlendirilmesi için yöntemlerde de yararlidir.

Etkili tani ve görüntüleme yöntemleri, dogru taniyi olusturma, en uygun tedavinin çabuk tanimlanmasina olanak saglama (böylece, zararli ilaç yan etkilerine gereksiz maruziyeti azaltma) ve relaps oranlarini düsürme ile, iyilestirilmis prognoz için potansiyeli olan çok güçlü "hasta çözümleri" saglar.

Bir düzenlemede söz konusu biyo-belirteçler bir tümörün hücrelerinden salinir. Böylelikle, bulusun ilave bir yönüne göre, burada bir tümör büyümesinin saptanmasi için (i) bir tümör ile iliskili olan veya bir tümörün hücrelerinden salinan bir biyolojik örnek içinde bir* biyo-belirteci ölçme ve (ii) söz konusu biyo-belirtecin düzeyinin tümörün boyutu, evresi, agresifligi veya disseminasyon ile iliskili oldugu gösterme adimlarini içeren bir yöntem saglanir.

Artmis hücre döngüsünün, hücre ölümünün ve apoptozun, hücresiz nükleozomlarin artmis dolasimsal düzeylerine yol açtigi bilinir (Holdenrieder et al, 2001). Dolasimdaki hücresiz nükleozomlarin düzeyi, bir spesifik-olmayan indikatördür ve enflamatuvar hastaliklari, çesitli benign ve maligne rahatsizliklari, otoimmün hastaliklari içeren çesitli rahatsizliklarda, ayni zamanda travmayi veya iskemiyi takiben gerçeklesir (Holdenrieder et al, 2001). Bulusun, öznelerde dolasim içinde nükleozomlar bulunmus olan çesitli hastalik alanlarinda uygulamaya sahip olacagi teknikte uzmanligi olan kisiler için asikar olacaktir.

Bunlar, sinirlandirma olmaksizin, travmayi (örnegin; siddetli yaralanmayi veya cerrahiyi), asiri egzersizi (örnegin, bir maraton kosmayi), inmeyi ve kalp krizini, sepsisi veya baska ciddi enfeksiyonu veya endometriyozisi, içerir. Kardiyomiyopati, sistemik lupus eritematozus, ülseratif kolit, kronik obstrüktif pulmoner hastalik, Crohn hastaligi ve romatoid artrit dahil bu tür çesitli hastaliklardaki nükleozom seviyelerini ölçmek veya bunlarin nükleotid ve histon yapi çesitliligini arastirmak üzere bulusun immünoanaliz yöntemi kullanilmistir ve bunlar saglikli öznelerin sonuçlari ile karsilastirilmistir. Tüm bu hastaliklarda nükleozomlar saptanabilir ve bunlarin nispi yapilari (histon ve nükleotid bilesimi bakimindan) belirlenebilir. Mevcut bulus yöntemleri, mevcut nükleozom ELISA yöntemlerinden daha genis bir aralikta nükleozomlari saptayabildiginden bulus yöntemleri, daha genis araliktaki kanser ve kanser disi hastalik alanlarinda uygulamalara sahiptir.

Bulusun immüno-analizleri, enzim saptama yöntemlerini (örnegin, ELISA) kullanan immünometrik analizleri, flüoresans etiketli immünometrik analizleri, zaman-çözünük flüoresans etiketli immünometrik analizleri, kemilüminesan immünometrik analizleri, immünoturbidimetrik analizleri, partikülat etiketli immünometrik analizleri ve immünoradyometrik analizleri ve radyo-aktif, enzim, flüoresan, zaman-çözünük flüoresan ve partikülat etiketleri içeren çesitli etiket tipleri ile etiketlenmis antijen veya etiketlenmis antikor kompetitif immüno-analiz yöntemlerini içeren kompetitif immüno-analiz yöntemlerini içerir. Söz konusu immüno-analiz yöntemlerinin tümü teknikte iyi bilinir, bakiniz, örnegin, Salgame et al, 1997 ve van Nieuwenhuijze et al, 2003.

Bir düzenlemede söz konusu biyolojik örnek, bir Vücut sivisi içerir. Örnegin, bulusun bir yönteminde test edilebilen biyolojik örnekler, beyin-omurilik sivisini (BOS), tam kani, kan serumunu, plazmayi, menstrüal kani, endometriyal siviyi, idrari, tükürügü veya baska Vücut sivisini (gaitayi, gözyasi sivisini, sinoviyal siviyi, balgami), solugu, örnegin, yogunlasmis soluk olarak veya bunlardan bir ekstrakti veya saflastirmayi veya bunlarin seyreltmesini içerir. Biyolojik örnekler ayrica, bir canli özneden veya. post-morteni alinan numuneleri. de içerir. Örnekler alisilagelmis bir sekilde hazirlanabilir, örnegin, uygun oldugunda, seyreltilebilir veya konsantre edilebilir ve saklanabilir.

Bir düzenlemede bulusun yöntemi, birden fazla kere tekrar edilir. Bu düzenleme, saptama sonuçlarinin bir zaman periyodu boyunca görüntülenmesine olanak sunma avantaji saglar. Bu tarz bir düzenleme, bir hastalik hâlinin tedavisinin etkinligini görüntüleme veya degerlendirme yarari saglayacaktir. Bulusun bu tarz görüntüleme yöntemleri, baslangici, progresyonu, stabilizasyonu, sagaltmayi, relapsi ve/veya remisyonu görüntülemek için kullanilabilir.

Böylelikle, açiklama ayrica, bu tarz bir hastaliga sahip olma süphesi olan bir öznede bir hastalik hâli için bir terapinin etkinligini görüntülemenin, söz konusu özneden alinan bir biyolojik örnekte bulunan biyo-belirteci saptamayi ve/veya kantifiye etmeyi içeren bir yöntem de saglar. Görüntüleme yöntemlerinde, test örnekleri, iki veya daha fazla kere alinabilir. Yöntem ilaveten, test örneginde bulunan biyo- belirtecin (biyo-belirteçlerin) düzeyini bir veya birden fazla kontrol (kontroller) ile ve/veya ayni test öznesinden daha erken, örnegin, terapinin baslangicindan önce, alinan ve/veya ayni test öznesinden terapinin daha erken bir evresinde alinan bir veya birden fazla önceki test örnegi (örnekleri) ile karsilastirmayi içerebilir. Yöntem, farkli zamanlarda alinan test örneklerinde biyo-belirtecin (biyo-belirteçlerin) dogasindaki veya miktarindaki bir degisimi saptamayi içerebilir.

Böylelikle, açiklamanin ilave bir yönüne göre, burada bir insan veya hayvan öznede bir hastalik hâli için terapinin etkinligini görüntülemek amaciyla asagidakileri içeren bir yöntem saglanir: (i) burada tanimlandigi üzere biyo-belirtecin. miktarini kantifiye etme; ve (ii) bir test örnegi içindeki söz konusu biyo-belirteci miktarini bir veya birden fazla kontrolde (kontrollerde) ve/veya ayni test öznesinden daha erken bir zamanda alinan bir veya birden fazla önceki test örneginde (örneklerinde) bulunan miktari ile karsilastirma.

Test örneginde biyo-belirtecin düzeyinde ayni test öznesinden daha erken alinan önceki bir test örnegindeki düzeye kiyasla bir degisim, söz konusu terapinin bozukluk veya süphelenilen bozukluk üzerindeki bir yararli etkisinin, örnegin, stabilizasyonunun 'veya iyilestirmesinin, göstergesi olabilir.

Dahasi, tedavi tamamlandiginda, bulusun yöntemi, bir hastaligin reküransi için görüntülemek amaciyla periyodik olarak tekrar edilebilir.

Bir terapinin etkinligini görüntülemek için yöntemler, insan öznelerde ve insan-olmayan öznelerde (hayvan modellerinde) var olan terapilerin ve yeni terapilerin terapötik etkililigini görüntülemek için kullanilabilir. Bu görüntüleme yöntemleri, yeni ilaç maddeleri ve maddelerin kombinasyonlari için taramalara dâhil edilebilir.

Ilave bir düzenlemede çabuk etki eden terapilerden dolayi daha Çabuk degisimlerin görüntülenmesi, saha kisa saatlik veya günlük araliklarda yürütülebilir.

Açiklamanin ilave bir yönüne göre, burada bir hastalik hâlinin varligini saptamak için bir biyo-belirteci tanimlamak için bir yöntem saglanir. Burada kullanildigi sekliyle, "tanimlama" terimi, biyolojik örnek içinde bulunan biyo-belirtecin varligini dogrulama anlamina gelir. Bir örnekte bulunan biyo-belirtecin miktarini kantifiye etme, örnek içinde bulunan biyo-belirtecin konsantrasyonunu belirlemeyi içerebilir. Tanimlama ve/veya kantifiye etme, örnek 'üzerinde dogrudan bunun bir ekstrakti üzerinde veya. bunun bir seyreltmesi üzerinde dolayli olarak gerçeklestirilebilir.

Açiklamanin alternatif yönlerinde, biyo-belirtecin varligi, biyo-belirtece yanitta öznenin 'vücudu tarafindan üretilen 've böylelikle bir hastalik hâline sahip olan bir özneden alinan bir biyolojik örnek içinde bulunan, biyo-belirteci spesifik baglayabilen antikoru veya bunun fragmanlarini saptama ve/Veya kantifiye etme ile degerlendirilir.

Tanimlama ve/veya kantifiye etme, bir hastadan alinan bir biyolojik örnek veya bir biyolojik örnegin bir saflastirmasi veya ekstrakti veya bunun bir seyreltmesi içindeki spesifik bir proteinin varligini ve/Veya miktarini tanimlamak için uygun herhangi bir yöntem ile gerçeklestirilebilir. Bulusun yöntemlerinde, kantifiye etme, örnek veya örnekler içinde biyo- belirtecin konsantrasyonunu ölçme ile gerçeklestirilebilir.

Bulusun bir yönteminde test edilebilen biyolojik örnekler, burada önceden tanimlananlari içerir. Örnekler, alisagelmis bir sekilde hazirlanabilir, örnegin, uygun oldugunda, seyreltilebilir veya konsantre edilebilir ve saklanabilir.

Biyo-belirteçlerin tanimlanmasi ve/veya kantifikasyonu, biyo- belirtecin veya bunun bir fragmaninin, örnegin, C-ucu kirpilmasi veya N-ucu kirpilmasi olan bir fragmanin saptanmasi ile gerçeklestirilebilir. Fragmanlar uygun bir sekilde, 4 amino asitten daha büyük uzunluktadir, örnegin, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 veya 20 amino asit uzunlugundadir. Özel olarak, bunun peptitlerinin veya histon kuyruklarininki ile ilgili dizinin, histon proteinlerinin özel olarak yararli fragmanlari oldugu bildirilir.

Biyo-belirteç, örnegin, SELDI veya MALDI-TOF ile, dogrudan saptanabilir. Alternatif olarak, biyo-belirteç, biyo-belirteci spesifik olarak baglayabilen bir ligand veya ligandlar, örnegin, bir antikor veya bunun bir biyo-belirteç-baglama fragmani veya baska peptit veya ligand, örnegin, aptamer veya oligonükleotid ile etkilesim yoluyla dogrudan veya dolayli olarak saptanabilir.

Ligand veya baglayici, bir saptanabilir etikete, örnegin, bir lüminesan, flüoresan veya radyoaktif etikete ve/veya bir afinite etiketine, sahip olabilir. Örnegin, saptama ve/Veya kantifiye etme, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla yöntem (yöntemler) ile gerçeklestirilebilir: SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), bir l-D jel- temelli analiz, a 2-D jel-temelli analiz, Kütle spekt (MS), ters faz (RP) LC, boyut geçirgenligi (jel filtrasyon), iyon degisimi, afinite, HPLC, UPLC ve baska LC veya LC MS-temelli teknik. Uygun LC MS teknikleri, ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA) veya iTRAQ® (Applied Biosystems, CA, USA) içerir. Sivi kromatografi (örnegin, yüksek basinçli sivi kromatografi (HPLC) veya düsük basinçli sivi kromatografi (LPLC)), ince-tabaka kromatografisi, NMR (nükleer manyetik rezonans) spektroskopisi de kullanilabilir.

Bulusa göre tani koyma veya görüntüleme yöntemleri, biyo- belirtecin varligini veya düzeyini saptamak için SELDI TOF veya MALDI TOF ile bir örnegi analiz etmeyi içerebilir. Bu yöntemler ayrica, klinik tarama, prognoz, terapinin sonuçlarini görüntüleme, bir özel terapötik tedaviye yanit vermesi en olasi olan hastalari tanimlamak için, ilaç tarama ve gelistirilmesi ve ilaç tedavisi için yeni hedeflerin tanimlanmasi için de uygundur.

Analit biyo-belirteçlerini tanimlamar ve/veya kantifiye etme, biyo-belirteci spesifik baglayabilen bir antikoru veya bunun bir fragmanini içeren bir immünolojik yöntem kullanilarak gerçeklestirilebilir. Uygun immünolojik yöntemler, sandviç immüno-analizlerini, örnegin, sandviç ELISA'yi, burada analit biyo-belirteçlerinin saptanmasi, bir analit biyo-belirteci üzerindeki farkli epitoplari taniyan iki antikor kullanilarak gerçeklestirilir; radyoimmünoanalizleri (RIA), dogrudan, dolayli veya kompetitif enzini bagli bagisiklik analizlerini (ELISA), enzini immüno-analizlerini (EIA), Flüoresans immüno- analizlerini (FIA), western blotlamayi, immüno-çökeltmeyi ve herhangi bir parçacik-temelli (örnegin, altin, gümüs veya lateks parçaciklar, manyetik parçaciklar veya Q-noktalari kullanilan) immüno-analizi, içerir. Immünolojik yöntemler, örnegin, mikro- titre plakada veya serit formatinda, gerçeklestirilebilir.

Bir hastaliga spesifik önemli biyo-belirteçlerin tanimlanmasi, tanisal prosedürlerin veya terapötik rejimlerin entegrasyonu için merkezidir. Kestirimci biyo-belirteçler kullanilarak, uygun tanisal araçlar, örnegin, biyo-sensörler, gelistirilebilir; bu dogrultuda, bulusun yöntemlerinde ve kullanimlarinda, tanimlama veya kantifiye etme, bir biyo-sensör, mikro-analitik sistem, mikro-mühendislik uygulanmis sistem, mikro-ayirma sistemi, immüno-kromatografi sistemi veya baska uygun analitik cihazlari kullanarak gerçeklestirilebilir. Biyo-sensör, biyo-belirtecin (biyo-belirteçlerin) saptanmasi için bir immünolojik yöntemi, elektriksel, termal, manyetik, optik (örnegin, hologram) veya akustik teknolojileri içerebilir. Bu tarz biyo-sensörler kullanilarak, biyolojik örneklerde beklenen konsantrasyonlarda bulunan hedef biyo-belirteci (biyo-belirteçleri) saptamak olasidir.

Burada kullanildigi sekliyle, "biyo-sensör" terimi, biyo- belirtecin varligini saptayabilen herhangi bir sey anlamina gelir. Biyo-sensörlerin örnekleri burada tarif edilir.

Açiklamaya göre biyo-sensörler, burada tarif edildigi üzere, biyo-belirteci spesifik baglayabilen bir ligand baglayici veya ligandlar içerebilir. Bu tarz biyo-sensörler, bulusun bir biyo- belirtecini saptamada ve/Veya kantifiye etmede yararlidir.

Bulusun biyo-belirteci (biyo-belirteçleri), "akilli" hologramlara dayanan bir` biyo-sensör barindiran teknolojiler veya yüksek frekansli akustik sistemler kullanilarak saptanabilir, bu tarz sistemler özel olarak, "barkod" veya dizilim konfigürasyonlarina uyumludur.

Akilli hologram sensörlerinde (Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK), bir holografik görüntü, biyo-belirteç ile spesifik olarak reaksiyona girmesi için sansibilize edilmis bir ince polimer film içinde saklanir. Maruziyet ile, biyo-belirteç hologram ile gösterilen görüntüde bir degisime yol açarak, polimer ile reaksiyona girer. Test sonucu okumasi, görüntünün optik parlakliginda, görüntüsünde, renginde ve/Veya pozisyonunda bir degisim olabilir. Kalitatif veya yari-kantitatif uygulamalar için, bir sensör hologram, göz ile okunabilir, böylece saptama ekipmani için ihtiyaci ortadan kaldirir. Bir basit renk sensörü, kantitatif ölçümler gerekli oldugunda, sinyali okumak için kullanilabilir. Örnegin opasitesi veya rengi, sensörün çalismasina müdahale etmez. Sensörün formati, bir kaç maddenin es-zamanli saptanmasi için sinyal-çogaltilmasina olanak saglar.

Geri-dönüsümlü veya geri-dönüsümsüz sensörler, farkli gereklilikleri karsilamak için tasarlanabilir ve söz konusu özel bir biyo-belirtecin sürekli görüntülenmesi elverislidir.

Uygun bir sekilde, bulusun bir veya birden fazla biyo- belirtecinin saptanmasi için biyo-sensörler, örnek içindeki biyo-belirtecin varliginin veya kantifikasyonunun saptanmasini bir sinyale dönüstürmek için biyo-moleküler tanimayi uygun araçlar ile birlestirir. Biyo-sensörler, örnegin, revirde, `ayakta tedavi edilen hastalar' departmaninda, cerrahide, evde, arazide veya is-yerinde, "alternatif yer" tanisal testleri için uyarlanabilir.

Bulusun bir veya birden fazla biyo-belirtecini saptamak için biyo-sensörler, akustik, plazmon rezonans, holografik, Biyo- Katman Interferometri (BLI) ve mikro-mühendislik uygulanmis sensörleri içerir. Basilmis tanima elemanlari, ince film transistor teknolojisi, manyetik akustik rezonatör cihazlari ve baska yeni akusto-elektriksel sistemler, bulusun bir veya birden fazla biyo-belirtecinin saptanmasi için biyo-sensörlerde kullanilabilir.

Bulusun bir veya birden fazla biyo-belirtecinin tanimlanmasini ve/veya kantifikasyonunu içeren yöntemler, tezgah üstü aygitlar üzerinde gerçeklestirilebilir veya laboratuvar-disi bir ortamda, örnegin, hekimin ofisinde veya hastanin bas ucunda, tek kullanimlik, tanisal veya görüntüleme platformlarina dâhil edilebilir. Bulusun yöntemlerini gerçeklestirmek için uygun biyo-sensörler, optik veya akustik okuyuculari olan "kredi" kartlari içerir. Biyo-sensörler, yorumlama için hekime elektronik. olarak aktarilacak. olan toplanan verilere olanak vermesi için konfigüre edilebilir ve böylelikle e-tip için temel olusturabilir.

Bir hastalik hâlinin varliginin tanisi veya görüntülenmesi için tanisal kitleri burada tarif edilir. Kitler ilave olarak, bir biyo-belirteci tanimlayabilen ve/veya kantifiye edebilen bir biyo-sensör içerebilir. Uygun bir sekilde, bir kit asagidaki gruptan seçilen bir veya birden fazla bilesen içerebilir: opsiyonel olarak burada tanimlanan yöntemlerin herhangi birine uygun bir sekilde kitin kullanilmasi için talimatlar ile birlikte, bir biyo-belirtece veya biyo-belirtecin bir yapisal/sekil taklidine spesifik bir ligand baglayici veya ligandlar, bir veya birden fazla kontrol, bir veya birden fazla reaktif ve bir veya birden fazla sarf malzemesi.

Bir hastalik haline yönelik olarak biyo-belirteçlerin tanimlanmasi, tanisal prosedürler ve terapötik rejimlerin entegrasyonuna izin verir. Bulusa ait bir biyo-belirtecin saptanmasi, klinik denemelerde katilmalarindan önce özneleri taramak üzere kullanilabilir. Biyo-belirteçler, terapötik yanit, yanit verememe, elverissiz yan etki profili, ilaç uyumu derecesi ve yeterli serum ilaç seviyelerinin elde edilmesinin belirtilmesi için yollar saglar. Biyo-belirteçler olumsuz ilaç yaniti ile ilgili bir uyari saglamak üzere kullanilabilir. Yanit degerlendirmesinin dozajda ince ayar yapmak, bir sinyalde numunedeki biyo-belirteç varligini veya miktarini en aza indirmek kullanilabildiginden biyo-belirteçler kisisellestirilmis terapilerin gelistirilmesinde faydalidir.

Biyo-sensörler, örnegin, revirde, ayakta tedavi edilen hastalar departmaninda, cerrahide, evde, arazide veya is-yerinde, "alternatif yer" tanisal testleri için uyarlanabilir.

Bulusun bir veya daha fazla biyo-belirtecini saptamak üzere biyo-sensörler akustik, plazmon rezonans, holografik, Biyo- Katman Interferometre (BLI) ve mikrotasarlanmis sensörleri içerir. Damgalanmis tanima elemanlari, ince film transistor teknolojisi, manyetik akustik rezonatör cihazlari ve diger yeni akustik-elektrik sistemleri, bulusun bir veya daha fazla biyo- belirtercinin saptanmasi için biyo-sensörlerde kullanilabilir.

Bulusun bir veya daha fazla biyo-belirtecinin tanimlanmasini ve/veya kantifikasyonunu içeren yöntemler, tezgah üstü aletlerde gerçeklestirilebilir veya örnegin hekim› ofisinde veya hasta yataginin yaninda laboratuvar disi bir ortamda kullanilabilen tek kullanimlik, tanisal veya gözlemle platformlarina eklenebilir. Bulus yöntemlerinin gerçeklestirilmesi için uygun biyo-sensörler, optik. veya akustik okuyuculari olan “kredi” kartlarini içerir. Biyo-sensörler, hekime yorumlamasi için elektronik olarak iletilmek üzere verilerin toplanmasina olanak tanimak üzere konfigüre edilir ve dolayisiyla bir e-ilaç için temel olusturulabilir.

Bir hastalik halinin varliginin tanisi ve gözlenmesi için tani kitleri burada açiklanir. Bir düzenlemede kitler ek olarak bir biyo-belirteci tanimlayabilen ve/veya kantifiye edebilen bir biyo-sensör içerir. Uygun sekilde bulusa göre bir kit, istege bagli olarak burada tanimlanan yöntemlerin herhangi birine göre kitin kullanimina yönelik talimatlar' ile birlikte, asagidaki gruptan seçilen bir veya daha fazla bilesen içerebilir: bir ligand baglayici veya biyo-belirteç veya biyo-belirtecin yapisal/sekil bakimindan taklidi için spesifik ligandlar, bir veya daha fazla kontrol, bir veya daha fazla kontrol ve bir veya daha fazla sarf malzeme.

Bir hastalik hâli için biyo-belirteçlerin tanimlanmasi için, tanisal prosedürlerin. ve terapötik. rejimlerin entegrasyonuna izin verir. Bulusun bir biyo-belirtecinin saptanmasi, bunlarin klinik çalismalara katilmasindan önce özneleri taramak için kullanilabilir. Biyo-belirteçler, terapötik yaniti, yanit vermemeyi, olumlu olmayan yan-etki profilini, tedaviye uyumun derecesi ve yeterli serum ilaci düzeylerinin basarilmasini göstermesi için araçlar saglar. Biyo-belirteçler, advers ilaç yanitinin uyarisini saglamak için kullanilabilir. Yanitin degerlendirilmesi dozaja ince ayar yapmak, reçete edilmis ilaçlarin sayisini minimuma indirmek, etkili terapi elde etmede gecikmeyi azaltmak ve advers ilaç reaksiyonlarindan kaçinmak için kullanilabildiginden, biyo-belirteçler, kisisellestirilmis terapilerin gelistirilmesinde yararlidir. Böylelikle, bulusun bir biyo-belirtecini görüntüleme ile, hasta bakimi, bozukluk ile belirlenen ihtiyaçlari ve hastanin farmakogenomik profilini eslestirmek için tam olarak uygun hâle getirilebilir, böylelikle biyo-belirteç optimal dozu titre etmek için, bir pozitif terapötik yaniti tahmin etmek ve siddetli yan etkilere yönelik yüksek risk altinda olan hastalari tanimlamak için kullanilabilir.

Biyo-belirteç-temelli testler, 'yeni' hastalarin. bir birinci basamak degerlendirmesini saglar ve güncel ölçümler kullanilarak basarilamayan dogru ve çabuk tani için objektif ölçümler saglar.

Dahasi, tanisal biyo-belirteç testleri, hafif derecede veya asemptomatik hastaligi olan veya semptomatik hastalik gelistirmeye yönelik yüksek risk altinda olabilen aile üyelerini veya hastalari tanimlamak için yararlidir. Bu, uygun terapinin baslatilmasina veya önleyici tedbirlere, örnegin, risk faktörlerini yönetmeye, izin verir. Bu yaklasimlarin sonuçlari iyilestirdigi fark edilir ve bunlar bozuklugun aleni baslangicini önleyebilir.

Biyo-belirteç görüntüleme yöntemleri, biyo-sensörler ve kitler de, hekimin relapsin bozuklugun agirlasmasindan kaynaklanip kaynaklanmadigini belirlemesine olanak saglamasi için, hasta görüntüleme araçlari olarak yararlidir. Farmakolojik tedavinin yetersiz oldugu degerlendirildiginde, akabinde terapi eski hâline getirilebilir veya degistirilebilir; uygun oldugunda terapide bir degisim yapilabilir. Biyo-belirteçler, bozuklugun hâline duyarli oldugundan, bunlar ilaç terapisinin etkisinin bir endikasyonunu saglar.

Bulus simdi asagidaki sinirlayici olmayan örneklere atfen açiklanacaktir. ÖRNEK 1 Nükleozomdaki DNA ve proteinlerin, stabilite için çapraz baglandigi (preparatta bulunan tüm histonlarin intakt nükleozomlara eklenmesi saglanarak) MCF7 hücrelerinden ekstrakte edilen kromatinin parçalanmasi ile üretilen ticari olarak temin edilebilir bir nükleozom preparati, intakt nükleozomlari ve biyotinlenmis bir monoklonal anti-5-metilsitozin saptama antikorunu baglayan kati fazli bir anti-histon yakalama antikoru kullanilarak nükleozom iliskili nükleotid 5-metilsitozin için bir ELISA yöntemi kullanilarak metillenmis DNA. için analiz edilmistir. Nükleozom numunesi fötal buzagi serumunda seri olarak seyreltilmistir ve ELISA'da çift kopya halinde test edilmistir. Saf fötal buzagi serumu ayrica herhangi bir hücresiz nükleozom içermeyen bir kontrol numunesi olarak ELISA'da kullanilmistir. Analiz yöntemi asagidaki gibidir: 0.1M fosfat tamponu içerisinde bir anti-histon antikor solüsyonu, mikrotitre gözlerine (lOO uL/göz) eklenmistir ve gözleri yakalama antikoru ile kaplamak üzere 4°C'de bir gece inkübe edilmistir. Fazla anti- histon antikoru bir kaptan diger kaba aktarilmistir. Bir bovin serum albumin solüsyonu (20g/L), gözlere (200 uL/göz) eklenmistir ve gözlerde fazla protein baglanma alanlarini bloke etmek üzere oda sicakliginda 30 dakika inkübe edilmistir. Fazla bovin serum, albumin solüsyonu bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler, yikama tamponu (200 uL/göz, %l Tween 20 içeren 0.05M TRIS/HCI tamponu pH 7.5) ile üç kez yikanmistir.

Numune (10 uL/göz) ve analiz tamponu (50 uL/göz, %O.9 NaCl, %0.05 sodyum deoksikolat ve %1 Nonidet P4O substitüenti içeren 0.05M TRIS/HCI pH 7.5), hafif çalkalama ile oda sicakliginda 90 dakika inkübe edilen gözlere eklenmistir. Numune ve analiz tamponu karisimi bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler, yikama tamponu (200 uL/göz) ile üç kez yikanmistir. Bir biyotinlenmis anti-5-metilsitozin saptama antikoru solüsyonu eklenmistir (50 uL/göz) ve hafif çalkalama ile oda sicakliginda 90 dakika inkübe edilmistir. Fazla saptama antikoru bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler yeniden yikama tamponu (200 uL/göz) ile üç kez yikanmistir. Bir streptavidin-bayir turpu peroksidaz konjugati eklenmistir (50 uL/göz) ve hafif çalkalama ile oda sicakliginda 30 dakika inkübe edilmistir. Fazla konjugat bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler yeniden yikama tamponu (200 uL/göz) ile üç kez yikanmistir. Renkli bir substrat solüsyonu (100 uL/göz, 2,2'-Azinobis [3-etilbenzotiyazolin-6- sülfonik asit]-diamonyum tuzu) eklenmistir ve hafif çalkalama ile oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir. Gözlerin optik yogunlugu (OD), standart bir mikrotitre plaka okuyucu kullanilarak 405nm'lik bir dalga boyunca ölçülmüstür. Artan nükleozom iliskili anti-S-metilsitozin konsantrasyonu olan artan renk doz yanit egrisi, 5-metilsitozin (fötal buzagi serumu) yoklugunda gözlenen düsük bir arka plan sinyali ile gözlenmistir. Pozitif ELISA sinyali, ELISA ile saptanan 5- metilsitozinin (i) yakalama antikoru, numunedeki histonlara baglandigindan ve (ii) saptama antikoru, DNA'nin 5-metilsitozin bilesenine baglandigindan histon proteini ve DNA'yi içeren bir intakt nükleozom içerisine dahil edildigini gösterir. Sonuçlar Sekil 1'de gösterilir. ÖRNEK 2 Nükleozomdaki DNA ve proteinlerin, stabilite için çapraz baglandigi (preparatta bulunan tüm histonlarin intakt nükleozomlara eklenmesi saglanarak) A375 hücrelerinden ekstrakte edilen kromatinin parçalanmasi ile üretilen ticari olarak temin edilebilir bir nükleozom. preparati intakt nükleozomlari ve biyotinlenmis bir monoklonal anti-S-hidroksimetilsitozin saptama antikorunu baglayan kati fazli bir anti-histon yakalama antikoru kullanilarak nükleozom iliskili nükleotid 5- hidroksimetilsitozin için bir ELISA yöntemi kullanilarak 5- hidroksimetilenmis DNA için analiz edilmistir. Nükleozom numunesi fötal buzagi serumunda seri olarak seyreltilmistir ve ELISA'da çift kopya halinde test edilmistir. Saf fötal buzagi serumu ayrica herhangi bir hücresiz nükleozom. içermeyen bir kontrol numunesi olarak ELISA'da kullanilmistir. Analiz yöntemi asagidaki gibidir: pH 7.4 olan O.lM fosfat tamponu içerisinde bir anti-histon antikor solüsyonu, mikrotitre gözlerine (lOO uL/göz) eklenmistir ve gözleri yakalama antikoru ile kaplamak üzere 4°C'de bir gece inkübe edilmistir. Fazla anti-histon antikoru bir kaptan diger kaba aktarilmistir. Bir bovin serum albumin solüsyonu (ZOg/L), gözlere (200 uL/göz) eklenmistir ve gözlerde fazla protein baglanma alanlarini bloke etmek üzere oda sicakliginda. 30 dakika inkübe edilmistir. Fazla. bovin serum albumin solüsyonu bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler, yikama tamponu (200 uL/göz, %1 Tween 20 içeren 0.05M TRIS/HCI tamponu pH 7.5) ile üç kez yikanmistir. Numune (lO uL/göz) ve analiz tamponu (50 uL/göz, %O.9 NaCl, %0.05 sodyum deoksikolat ve %1 Nonidet P4O sübstitüenti içeren 0.05M TRIS/HCI pH 7.5), hafif çalkalama ile oda sicakliginda 90 dakika inkübe edilen gözlere eklenmistir. Numune ve analiz tamponu karisimi bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler, yikama tamponu (200 uL/göz) ile üç kez yikanmistir. Bir biyotinlenmis anti-5- hidroksimetilsitozin saptama antikoru solüsyonu eklenmistir (50 uL/göz) ve hafif çalkalama ile oda sicakliginda 90 dakika inkübe edilmistir. Fazla saptama antikoru bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler yeniden yikama tamponu (200 uL/göz) ile üç kez yikanmistir. Bir streptavidin-bayir turpu peroksidaz konjugati içeren bir solüsyon eklenmistir (50 uL/göz) ve hafif çalkalama ile oda sicakliginda 30 dakika inkübe edilmistir.

Fazla konjugat bir kaptan diger kaba aktarilmistir ve gözler yeniden yikama tamponu (200 uL/göz) ile üç kez yikanmistir.

Renkli bir substrat solüsyonu (100 uL/göz, 2,2'-Azinobis [3- etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit]-diamonyum tuzu) eklenmistir ve hafif çalkalama ile oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir. Gözlerin optik yogunlugu (OD), standart bir mikrotitre plaka okuyucu kullanilarak 405nm'lik bir dalga boyunca ölçülmüstür. Artan nükleozom iliskili anti-5- hidroksimetilsitozin konsantrasyonu olan artan renk doz yanit egrisi, 5-hidroksimetilsitozin (fötal buzagi serumu) yoklugunda gözlenen düsük bir arka plan sinyali ile gözlenmistir. Pozitif ELISA sinyali, ELISA ile saptanan 5-hisroksimetilsitozinin (i) yakalama antikoru, numunedeki histonlara baglandigindan ve (ii) saptama antikoru, DNA'nin 5-hidroksimetilsitozin bilesenine baglandigindan histon proteini ve DNA'yi içeren bir intakt nükleozom içerisine dahil edildigini gösterir. Sonuçlar Sekil 2'de gösterilir. ÖRNEK 3 saglikli özneden alinan serum ve plazma kan numunelerinin dolasimdaki hücresiz nükleozom içerigini ölçmek üzere mevcut teknigin iki nükleozoni ELISA yöntemi kullanilmistir. Birinci mevcut ELISA yöntemi (ELISA l), Roche Cell Death ELISA'dir ve digeri (ELISA 2), bir anti-histon yakalama antikoru ve bir anti- histon-DNA kompleksi saptama antikorunu kullanan bir ELISA'dir.

Mevcut her iki nükleozom ELISA yöntemi ile saptanan nükleozom seviyeleri, normal plazmada normal serumdakinden daha düsüktür.

Nükleozomlarin serum seviyesine yönelik normal aralik (optik yogunluk birimleri halinde ifade edilir), ELISA 1 için 0 - 4.3 CD birim ve ELISA 2 için 0 - 1.4 olacak sekilde hesaplanmistir (ortalama ± 20 saglikli öznenin serum sonuçlarinin ortalamasinin 2 standart sapmasi). Plazmaya yönelik ilgili araliklar 0 - 0.95 ve 0 - 0.96'dir. Sonuçlar Sekil 3'te gösterilir.

Ayrica saglikli özneden alinan ayni 20 numunede 3 nükleozom iliskili histon varyanti ve bir histon PTM'inin yani sira iki nükleozom iliskili nükleotid içeren nükleozomlarin seviyeleri ölçülmüstür. Sonuçlar, saglikli serum numunelerinin histon varyantlari veya PTM veya nükleotidleri içeren nükleozomlarin düzgün düsük seviyelere sahip oldugunu gösterir. Histon varyantlari, PTM veya nükleotidleri içeren nükleozomlarin serum seviyesine yönelik normal araliklar (optik yogunluk olarak ifade edilir) su sekildedir; (a) mH2A1.1 için O - 0.36, (b) mH2A2 için 0.05 - 0.78, (c) H2AZ için 0.11 - 0.58, (d) P-H2AX(Ser139) için 0.06 - 0.61, (e) 5-metilsitozin için 0.06-O.36 ve (f) 5- hidroksimetilsitrosin için 0.03-0.36. Ölçülen EDTA plazma sonuçlari, 20 saglikli öznenin tümü için daha yüksektir.

Sonuçlar Sekiller 4, 5, 6, 7, 8 ve 9'da gösterilir. ÖRNEK 4 13 saglikli özneden ve mide, kalin bagirsak, rektum, akciger (küçük hücreli karsinom ve çesitli küçük hücreli olmayan karsinomlar), meme, yumurtalik, pankreas, prostat, böbrek ve çesitli oral kanserler (agiz boslugu, damak, yutak ve girtlak) kanseri olan 55 özneden alinan EDTA plazmasinda 5-metilsitozin içeren hücresiz nükleozomlar ölçülmüstür. Saglikli öznelerden alinan 13 numunenin tümü, bir veya daha fazla hücresiz nükleozom tipi için pozitiftir. Kanserli öznelerden alinan 55 numunenin tümü, analiz edilen hücresiz tüm nükleozom tipleri için pozitiftir. Ancak kanserli Öznelerden alinan numunelerde saptanan seviyeler, saglikli öznelerden alinan numunelerde bulunandan daha yüksektir ve sonuçlar, saglikli ve kanserli öznelerin ayirt edilebildigini göstermistir. Örnegin, nükleozom iliskili 5-metilsitozin için ortalama ± ortalamanin 2 sandart sapmasi olarak OD terimleri halinde hesaplanan normal aralik, 0 - 1.41'dir. Bu esik degeri kullanildiginda 13 saglikli numunenin tümü negatiftir ve 55 kanser numunesinden 30'u, (%38 (8'de 5) mide, %60 (6'te 3) kalin bagirsak, %33 (3'te 1) rektal, %33 (6'da 2) küçük hücreli akciger, %64 (14'te 9) küçük hücreli olmayan akciger, %33 (6'da 2) meme, %100 (1'de 1) yumurtalik, %100 (1'de 1) pankreas, %33 (6'da 2) prostat, %100 (1'de 1) böbrek ve %60 (5'te 3) oran kanser numuneleri dahil pozitiftir (%55'lik genel klinik duyarlilik). Sonuçlar Sekil 17'de gösterilir.

Ayrica ayni numunelerdeki çesitli diger nükleozom iliskili yapilari ölçmek üzere bulus yöntemleri kullanilmistir. Bu immünoanalizlerin sonuçlari, 5-metilsitozin içeren nükleozomlarin saptanan seviyelerine göre normallestirilmis kanser hastalarindan alinan numunelerdeki nükleozom yapilarinin profilini saglamak üzere toplanmistir. Ortaya çikan profiller, saglikli öznelerden alinan numunelerin nükleozom yapisi ile karsilastirilmistir. Hücresiz nükleozomlarin nükleozom yapi profilinin saglikli öznelerinkine göre farkli oldugu bulunmustur. Sonuçlar Sekil 20'de gösterilir. Benzer sekilde kanser disi çesitli hastaliklardan alinan numuneler için nükleozom yapi profilleri toplanmistir ve bunlar, kanserli hastalar ve saglikli öznelerden alinan numunelerdeki nükleozomlarin profili ile karsilastirilmistir. Sonuçlar Sekil 21'de gösterilir.

Daha sonra 10 saglikli özneden ve ayrica çesitli kanser tiplerine sahip 62 hastadan alinan numuneler dahil benzer bir diger deney gerçeklestirilmistir. Sonuçlar, birinci deneyinkine benzerdir. Örnegin nükleozom iliskili 5-meti1sitozina yönelik sonuçlar ve ortalama + saglikli öznelere yönelik sonuçlarin ortalamasinin 2 standart sapmasi esik degeri kullanildiginda 10 saglikli öznenin tümü için negatif sonuçlar elde edilmistir ve pozitif sonuçlar, 9'da 9 prostat kanser hastasi, 5'te 5 cilt kanseri hastasi, 8'de 8 özofagus kanseri hastasi, 13'te 12 mesane kanser, hastasi, 2'de 2 serviks kanseri hastasi ve 1'de 1 kolon kanser, hastasi, 4'te 4 meme kanseri hastasi, 7'de 7 yumurtalik kanseri hastasi, 7'de 7 girtlak kanseri hastasi, 3'te 3 akciger kanseri hastasi ve 3'te 3 renal kanser hastasi dahil %95 (62'de 61) kanser hastasi için elde edilmistir. Sonuçlar, Sekil 18'de gösterilir.

Bu sonuç, özellikle 5-metilsitozin dahil olmak üzere serum nükleotid seviyeleri ve nükleozom iliskili nükleotid seviyeleri kanser için klinik olarak duyarli biyo-belirteçlerdir. ÖRNEK 5 Kolon kanserli 3 özne akciger kanserli 13 özne, pankreatik kanserli 3 özne, oral kanserli 1 özneden alinan numunelerin ve Holdenrieder (*Holdenrieder et al, 2001) yöntemine göre saglikli öznelerden üretilen bir nükleozom numunesinin dolasimdaki hücresiz nükleozom içerigini ölçmek üzere mevcut teknigin iki nükleozom ELISA yöntemleri kullanilmistir. Birinci mevcut ELISA yöntemi (ELISA.1) Roche Cell Death ELISA'dir ve digeri, bir anti- histon yakalama antikoru ve bir anti-histon-DNA kompleksi saptama antikorunu kullanan bir ELISA'dir.

Ayrica kanserli öznelerden alinan ayni 19 numunede üç varyant histon ve bir histon PTM'nin yani sira nükleotidler 5- metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin içeren nükleozomlarin seviyeleri ölçülmüstür. Sonuçlar, mevcut teknigin ELISA yöntemlerine yönelik düsük nükleozom sonuçlari çogu özne için, özellikle pankreatik ve oral kanseri hastalari için saptanmasina ragmen bu numunelerin çogunun bir veya daha fazla nükleozom iliskili nükleotid veya varyant histon içeren nükleozomlarin daha yüksek saptanabilir seviyelerine sahip oldugunu gösterir.

Kolon kanserli. 3 özne, akciger kanserli 13 özne, pankreatik kanserli 2 özne ve oral kanserli 1 Özneden alinan numuneler için sonuçlar sirasiyla Sekiller 10, 11, 12, ve 13'te gösterilir. Önemli nükleozom iliskili histon varyant seviyeleri ve histon PTM seviyeleri, 19 kanser numunesinin 16'sinda (3 akciger kanser numunesi disinda hepsinde) saptanmistir. Ek olarak önemli nükleozom iliskili 5-hidroksimetilsitozin seviyeleri, 19 kanser numunesinin 12'sinde saptanmistir. Ayrica önemli nükleozom iliskili 5-metilsitozin seviyesi, 19 kanser numunesinin tümünde saptanmistir.

Ayrica farkli nükleotid, histon varyanti ve histon PTM seviyelerini içeren nükleozom seviyelerinin paterni, tüm özneler için düzgün degildir ancak test edilen farkli kanserler için farkli paternler gösterir. Ayni veya farkli kanserli öznelere yönelik sonuçlar arasinda karsilastirmayi kolaylastirmak üzere nükleozom testlerine yönelik (macroH2A1.1, macroH2A2, HZAZ, P- HZAX(Ser139), 5-metilsitozin, 5-hidroksimetilsitozin içeren nükleozomlar) sonuçlar, S-metilsitozin içeren nükleozomlar için gözlenen OD sinyalinin bir orani olarak normallestirilmistir.

Normallestirilmis sonuçlar (birden fazla özneden alinan numunelerin test edildigi sonuçlarda standart sapmayi gösteren hata çubuklari ile), saglikli öznelerden üretilen nükleozom numunesine yönelik ayni sonuçlarin yani sira Sekil 14'te her bir kanser için gösterilir (mH2A2 ve 5-hidroksimetilsitozin, bu numune için ölçülmüstür). Sekil 14, arastirilan dört kanserin tümünde farkli normallestirilmis nükleotidler, histon varyantlari ve PTM içeren nükleozomlarin dagilini paterninin, saglikli öznelerden hazirlanan numunedeki nükleozomlarin dagilimina göre oldukça önemli derece farklilastigini gösterir. Örnegin saglikli nükleozom numunesinde macroH2A1.1 içeren nükleozomlarin nispi seviyesi, kanser tüplerinin herhangi birine ait numunede saptanandan farklidir. Dolayisiyla mevcut bulus, basit bir kan bazli tarama testinde kanser saptanmasi için bir yöntem olarak kullanilabilir. Teknikte uzman kisiler için bulusun, tümör veya diger hastalik kökenli dolasimdaki hücresiz nükleozomlar arasinda daha fazla veya daha iyi ayrim yapmak üzere diger ilave nükleotidleri ve/veya histon varyantlarini ve/veya histon modifikasyonlarini içeren nükleozomlarin test edilmesini içerdigi belirgin olacaktir.

Ayrica gözlenen nükleozom tiplerinin paterni, farkli kanser tipleri için farklilasir. Örnegin kolon, pankreatik ve oral kanserli öznelerden alinan numuneler, nükleozom iliskili HZAZ ve -hidroksimetilsitozinin farkli normallestirilmis seviyeleri ile ayirt edilebilir. Benzer sekilde oral kanser, varyant macroH2A1.1'i içeren nükleozomlarin farkli nispi bir seviyesine dayanilarak kolon kanserli öznelerden alinan numunelerden ayirt edilebilen pankreatik kanserli öznelerden alinan numuneler ve diger üç kanser tipinin herhangi birinden mH2A2 veya P- HZAX(Serl39) içeren her iki nükleozomun farkli normallestirilmis seviyelerine sahiptir. Dolayisiyla mevcut bulus, genellikle kanser tanisi koymak üzere ve belirli bir kanser tipini ayirt etmek üzere bir yöntem olarak kullanilabilir. Teknikte uzman kisiler için bulusun, farkli spesifik tümör kökenli veya diger hastalik kökenli dolasimdaki hücresiz nükleozomlar arasinda daha fazla veya daha iyi ayrim yapmak üzere diger ilave histon varyantlari ve/veya histon modifikasyonlari ve/veya nükleotidleri içeren. nükleozomlarin. test edilmesini içerdigi belirgin olacaktir. ÖRNEK 6 3 saglikli özneden ve 10 kolon kanserli hastadan alinan serum numunelerinde bulus yöntemi test edilmistir. Bu numunelerde 5- metilsitozin içeren nükleozomlar ölçülmüstür ve kanser sonuçlari, Sekil 16'da gösterildigi üzere saglikli özneler için elde edilen sonuçlara göre düzenli sekilde yüksektir.

Claims (9)

ISTEMLER

1.Kanser, kardiyomiyopati, sistemik lupus eritematozus, kolit, kronik obstrüktif pulmoner bozukluk, Crohn hastaligi ve romatoid artrit tanisinin konulmasina yönelik bir sücut sivisi numunesinde bir biyo-belirteç olarak hücresiz bir nükleozoni ile iliskili bir DNA bazinin kullanimi olup, özelligi DNA bazinin sunlardan seçilmesidir: 5-metilsitozin veya 5-hidroksimetilsitozin.

. Istem l'e göre kullanim olup, özelligi hücresiz nükleozomun bir mono-nükleozom veya bir oligo-nükleozom olmasidir.

. Istem, 1 veya istem Z'ye göre kullanim` olup, özelligi hücresiz bir nükleozom ile iliskili DNA bazinin bir kan numunesinde ölçülmesidir.

.Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre kullanim olup, özelligi kanserin mesane, meme, kolon, serviks, özofagus, böbrek, kalin bagirsak, akciger, agiz boslugu, yumurtalik, pankreas, prostat, rektum, cilt veya mide kanseri olmasidir.

Bir Vücut sivisi numunesinde hücresiz bir nükleozom ile iliskili bir DNA bazinin varliginin tespit edilmesine yönelik bir yöntem olup, özelligi asagidaki adimlari içermesidir: (i) Vücut sivisi numunesinin nükleozomlara baglanan bir birinci baglama ajani ile temas ettirilmesi; (ii) adimda (i) baglanan nükleozomlarin DNA bazina baglanan ikinci bir baglamar ajani ile temas ettirilmesi ; (iii) söz konusu ikinci baglama ajaninin vücut sivisi numunesinde DNA bazina baglanmasinin saptanmasi veya kantifiye edilmesi; ve (iv) vücut sivisi numunesinde DNA bazini içeren nükleozomlarin varliginin bir ölçümü olarak bu tür baglanma varliginin veya derecesinin kullanilmasi, burada DNA bazi sunlardan seçilir: 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin.

6.Bir vücut sivisi numunesinde hücresiz bir nükleozom ile iliskili bir DNA bazinin varliginin tespit edilmesine yönelik bir yöntem olup, özelligi asagidaki adimlari içermesidir: (i) vücut sivisi numunesinin DNA bazina baglanan bir birinci baglama ajani ile temas ettirilmesi; (ii) adimda (i) baglanan DNA bazinin nükleozomlara baglanan ikinci bir baglama ajani ile temas ettirilmesi; (iii) söz konusu ikinci baglama ajaninin vücut sivisi numunesinde nükleozomlara baglanmasinin saptanmasi veya kantifiye edilmesi; ve (iv) vücut sivisi numunesinde DNA bazini içeren nükleozomlarin varliginin bir ölçümü olarak bu tür baglanma varliginin veya derecesinin kullanilmasi, burada DNA bazi sunlardan seçilir: 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin.

7.Istan 5 veya istem 6'ya göre bir yöntem olup, özelligi baglama ajaninin bir antikor olmasidir.

8.Istemler 5 ila 7'den herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi Vücut sivisi numunesinin kan veya serum veya plazma olmasidir.

9. Bir hayvan veya bir insan öznede bir hastalik halinin saptanmasi veya tanisinin konulmasina yönelik in vitro bir yöntem olup, özelligi asagidaki adimlari içermesidir: 5 (i) bir özneden elde edilen bir Vücut sivisinda hücresiz bir nükleozom ile iliskili bir DNA bazinin saptanmasi veya ölçülmesi; ve (ii) öznenin hastalik halini tanimlamak üzere saptanan nükleozom iliskili DNA baz seviyesinin kullanilmasi, 10 burada DNA bazi sunlardan seçilir: 5-metilsitozin veya 5- hidroksimetilsitozin, burada hastalik sunlardan seçilir: kanser, kardiyomiyopati, sistemik lupus eritematozus, kolit, kronik obstrüktif pulmoner bozukluk, Crohn hastaligi ve romatoid artrit.