[go: up one dir, main page]

TR201816556T4 - Il-1ra agregasyonunun azaltilmasina yöneli̇k yöntemler - Google Patents

Il-1ra agregasyonunun azaltilmasina yöneli̇k yöntemler Download PDF

Info

Publication number
TR201816556T4
TR201816556T4 TR2018/16556T TR201816556T TR201816556T4 TR 201816556 T4 TR201816556 T4 TR 201816556T4 TR 2018/16556 T TR2018/16556 T TR 2018/16556T TR 201816556 T TR201816556 T TR 201816556T TR 201816556 T4 TR201816556 T4 TR 201816556T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
aggregation
arrangements
citrate
polypeptide
molecule
Prior art date
Application number
TR2018/16556T
Other languages
English (en)
Inventor
Raibekas Andrei
Kerwin Bruce
Original Assignee
Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ filed Critical Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ
Publication of TR201816556T4 publication Critical patent/TR201816556T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7012—Compounds having a free or esterified carboxyl group attached, directly or through a carbon chain, to a carbon atom of the saccharide radical, e.g. glucuronic acid, neuraminic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/42—Phosphorus; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, bir agrege olan interlökin-1 reseptör antagonistinin (IL-lra) agregasyonunu azaltma yöntemleri ile ilgilidir. Açıklama ayrıca IL-1ra'nın agregasyonunu azaltmayı içeren ilaç formülasyonlarının iyileştirilmesi için yöntemler sağlar. Tarifnamede, aynı zamanda agregasyonu azaltılmış olan IL-1ra'yı kullanarak hastalıkları tedavi etme yöntemleri yer alır. Son olarak, mevcut tarifname agregasyonu azaltılmış bir IL-1 ra içeren bileşimler ve kitler ile ilgilidir.

Description

TARIFNAMEIL-1RA AGREGASYONUNUN AZALTILMASINA YÖNELIK YÖNTEMLERBulusun AlaniMevcut bulus, bir agrege olan interlökin-l reseptör antagonistinin (IL-lra) agregasyonunu azaltma yöntemleri ile ilgilidir. Tarifname, ayrica IL-lra'nin agregasyonunu azaltmayi içeren, ilaç formülasyonlarinin iyilestirilmesi için yöntemler saglar. Tarifnamede, ayni zamanda agregasyonu azaltilmis olan lL-lra'yi kullanarak hastaliklari tedavi etme yöntemleri yer alir. Son olarak, mevcut tarifname agregasyonu azaltilmis bir IL-1 ra içeren bilesimler ve kitler ileilgilidir.Bulusun Arka PlaniInterlökin-l alfa (IL-lot), interlökin-l beta (IL-lß) ve interlökin-l reseptör antagonistinin (IL- 1ra) her biri, belirli hücre tiplerinin yüzeyinde bulunan 1 IL-l reseptörüne (IL-1RI) baglanir. IL- 10L ve IL-lß, enflamatuar ve immün tepkilerde yer alan belirli hücreler dahil olmak üzere bir dizi farkli hedef hücre üzerinde fizyolojik etkilere sahiptir. Buna karsilik, lL-l ra, IL-1Rl'ye baglanir, ancak asagi akista karsilastirilabilir biyolojik tepkilere yol açmaz. Bunun yerine, IL- 1ra; IL-10i ve IL-1ß'nin IL-1Rl'ya baglanmasini rekabetçi bir sekilde inhibe eder. IL-1ra'nin E. coli tarafindan üretilen bir versiyonu olan Anakinra, romatoid artritin tedavisi içinpazarlanmaktadir.Chang 85. vd., ("Physical factors affecting the storage stability of freeze-dried interleukin-l receptor antagonist: Glass transition and protein conformation", Archives of Biochemistry and Biophysics, New York, A.B.D. Cilt 331, No. 2, 1996, sayfa 249-258, ISSN: 0003-9861) ve Chang 35. vd., (Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-l receptor antagonist, Pharmaceutical Research, New York, A.B.D., Cilt 13, No. 2, 1996, sayfa 243-249, ISSN: 0724-8741) IL-1ra'nin dondurularak kurutulmus, Iiyofilize edilmisformülasyonlarinin stabilize edilmesine yönelik yöntemleri açiklar.30Chang 85. vd., (Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-l receptor antagonist, Pharmaceutical Research, New York, A.B.D., Cilt 13, No. 2,1996, sayfa 243-249)ÖzetMevcut bulusun kapsami istemlerde tanimlanmaktadir. Tarifnamede tedavi yöntemlerine yapilan referanslar, insan (veya hayvan) vücudunun terapi yoluyla tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanim için mevcut bulusa ait bilesikleri, farmasötik bilesimleri ve ilaçlari ifade eder. Mevcut bulus, bir IL-1 ra içeren 5qu bilesimin, sulu bilesimdeki IL-1ra agregasyonunun azaltilmasi veya agregasyon hizinin azaltilmasi için yeterli bir konsantrasyonda en az bir yardimci molekül ile inkübe edilmesi yoluyla sulu bir bilesimde agrege olan bir interlökin-l reseptör antagonistinin (IL-1ra) agregasyonunun azaltilmasi veya IL-lra'nin agregasyon hizinin azaltilmasina yönelik bir yöntemle ilgilidir, burada en az bir yardimci molekülden en az biri 20 °C ve 45 °C arasinda agregasyonu azaltmada etkilidir ve yüzde 1 ila 3 araligindaki bir konsantrasyonda bulunan bir sekerden ve birden fazla yüktasiyan bir anyondan seçilir.Ayni zamanda, bir interlökin-l reseptörü antagonisti (IL-1 ra) ilaç formülasyonunun hazirlanmasi için bir yöntem açiklanmaktadir. Yöntem, agrege olan IL-1 ra'nin en az biryardimci molekül ile inkübe edilmesini içerir. Bazi durumlarda, agregasyon azalir.Bir hastayi tedavi etmek için bir yöntem açiklanmaktadir. Artriti olan bir hastayi tedavi etmek için bir yöntem açiklanmaktadir. Romatoid artriti olan bir hastanin tedavisi için bir yöntem açiklanmaktadir. Osteoartriti olan bir hastanin tedavisi için bir yöntem açiklanmaktadir. Crohn hastaligi, ülseratif kolit, glomerülonefrit veya lösemiden en az birine sahip olan bir hastanin tedavi edilmesi için bir yöntem açiklanmaktadir. IL-1'in advers etkisine sahip bir hastanin tedavisi için bir yöntem açiklanmaktadir. Bir hastanin tedavi edilmesi yöntemi, hastaya asagidakileri içeren bir bilesimin uygulanmasini içerir: (i) bir agrege olan interlökin-l reseptör antagonistinin (lL-1ra) terapötik olarak etkili bir miktari ve (ii) en az bir adetyardimci molekül.30Bazi düzenlemelerde en az bir yardimci molekül, agrege olan bir IL-1ra'nin agregasyonunu azaltan bir konsantrasyondadir. Bazi düzenlemelerde en az bir yardimci molekül, agrege olan bir IL-1ra'nin agregasyon hizini azaltan bir konsantrasyondadir. Bazi düzenlemelerde, en az bir yardimci molekül bir seker ve birden çok yük tasiyan bir anyondan seçilir. Bazi düzenlemelerde en az bir yardimci molekül, birden çok yük tasiyan bir anyondur. Bazi düzenlemelerde en az bir yardimci molekül 1 ila 20 mM pirofosfattir. Bazi düzenlemelerde en az bir yardimci molekülü 1 ila 20 mM sitrattir. Bazi düzenlemelerde en az bir yardimci molekül en az bir sekerdir. Bazi düzenlemelerde adi geçen sekerlerden en az biri gliserol,sorbitol veya sükrozdur. Seker yüzde 1 ila 3 arasinda bir konsantrasyondadir.Bazi düzenlemelerde, en az bir adet yardimci molekül bir lizin reaktif yardimci molekülünden ve bir arginin-reaktif yardimci molekülünden seçilir. Bazi düzenlemelerde en az bir yardimci molekül 6-(N- (7-nitrobenz-2-0ksa-1,3-diazoI-4-il)amino) heksanoik asit (NBD-X), metil asetilfosfattan (MAP) ve sitrakonik anhidritten seçilir.Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1, Örnek 2'de tartisildigi gibi, PSE (10 mM fosfat, pH 6,5, 140 mM NaCI, 0,5 mM EDTA) veya CSE (10 mM sitrat, pH 6,5, 140 mM NaCI, 0,5 mM EDTA) içinde zaman içindeki lL-1ra vahsi tip protein agregasyon profilini gösterir.Sekil 2, Örnek 3'te tartisildigi gibi NBD-X ile türetilmis IL-1 ra vahsi tip proteinin ters fazli yüksek performansli sivi kromatografisini (RP-HPLC) gösterir. Üst panel 215 nm'de NBD-X etiketli IL-1ra'nin absorbansini gösterir. Alt panel, 480 nm'deki uyarimdan sonra 535 nm'de floresan emisyonunu gösterir.Sekil 3, Örnek 4'te tartisildigi gibi fosfat, pirofosfat ve sitrat anyonlarinin artan konsantrasyonlarinin varliginda IL-1 ra vahsi tip proteininin agregasyon hizlarini gösterir.Sekil 4, Örnek 5'de tartisildigi gibi gliserol, sorbitol veya sükrozun artan konsantrasyonlarinin varliginda IL-1 ra vahsi tip proteininin agregasyon hizlarini gösterir.Sekil 5, bir sekretuar lider dizisi içeren, öncü insan IL-lra'nin nükleotit dizisini (SEQ IDNO: 1) ve amino asit dizisini (SEQ ID NO: 2) gösterir.30Sekil 6, insan IL-1 ra'nin sekretuar lider dizisini içermeyen amino asit dizisini (SEQ ID NO: 3) gösterir. Nokta (0), 93 pozisyonundaki lizini gösterir. Arti (+) 97 pozisyonundaki arginini gösterir. Triptofan-16 (A) ve tirozin-34'ün (o) konumlari da belirtilmistir.Sekil 7, IL-1ra'nin örnek bir x-isini kristal yapisini gösterir.Sekil 8, Sekil 1 için tarif edilen x-isini kristal yapisinda, asimetrik lL-1 ra dimerinin iki alt birimi arasindaki ara yüzün bir bölümünü gösterir.Sekil 9, Örnek 6'da tartisildigi gibi dairesel dikroizm tarafindan tespit edilen IL-1ra`nin üre-uyarimli denge açilmasini (unfolding) gösterir.Sekil 10, Örnek 6'da tartisildigi gibi intrinsik floresan tarafindan tespit edilen lL-1ra`nin üre-uyarimli denge açilmasini gösterir.Sekil 11, Örnek 6'da tartisildigi gibi dairesel dikroizm yoluyla IL-1 ra'nin guanidinyum hidroklorür-uyarimli açilimini gösterir.Sekil 12, Örnek 6'da tartisildigi gibi intrinsik floresans yoluyla IL-l ra'nin guanidinium hidroklorür-uyarimli açilimini gösterir.Sekil 13, Örnek 7'de tartisildigi gibi 10 mM sitrat varliginda, pH 6,5'de, metil asetil fosfat (MAP) ile etiketlenmis IL-lra afinitesinin ters faz HPLC'sinI gösterir.Sekil 14, Örnek 7'de tartisildigi gibi 10 mM fosfat varliginda, pH 6,5'de metil asetil fosfat (MAP) ile etiketlenmis IL-1 ra afinitesinin ters faz HPLC'sini gösterir.Sekil 15, Örnek 7'de tartisildigi gibi pH 6,5'te 10 mM sitrat, pH 6,5'te 10 mM fosfat veya pH 6,4'te 10 mM pirfosfat varliginda 4,5 saat (270 dakika) metil asetil fosfat ile etiketlenmis lL-1 ra afinitesinin ters faz HPLC'si profillerini gösterir. Zayif bir sekilde çözülen dört pik 1, 2,3 ve 4 olarak etiketlenmistir.Sekil 16, Örnek 7`de tartisildigi gibi pH 6,5'te 10 mM sitrat varliginda IL-1 ra'nin metil asetil fosfat ile türetilme oranini göstermektedir. Sekil 16A, Sekil 13'teki kromatogramlarin bir reprodüksiyonunu gösterir. Sekil 168, Sekil 16A'daki her bir kromatogramin açilmasinin sonuçlarini gösterir. Sekil 16C, zamana karsi Sekil 16B'den gelen açilmis piklerin her birinin integrallenmesinin bir grafigini göstermektedir.Sekil 17, Örnek 7'de tartisildigi gibi çesitli pH'Iarda çesitli tamponlarin varliginda IL-1 ra'nin MAP ile türetilme oranlarinin bir karsilastirmasini göstermektedir.Sekil 18, Örnek 7'de tartisildigi gibi çesitli pH seviyelerinde 10 mM sitrat veya 10 mM fosfat varliginda 5,5 saat süre ile metil asetil fosfat ile etiketlenmis IL-1 ra afinitesininters fazli HPLC profillerinin üst üste bindirilmesini göstermektedir.30Sekil 19, Örnek 8'de tartisildigi gibi 100 mM NaCI bulunduran pH 6,5'Iik bir tampon içinde çesitli fosfat konsantrasyonlarinda zaman içindeki lL-1ra vahsi tip protein agregasyon profilini göstermektedir.Sekil 20, Örnek 9'da tartisildigi gibi, sitratin artan konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak lL-1 ra'ya sitrat baglanmasini göstermektedir.Sekil 21, Örnek 10'da tartisildigi gibi pirofosfat veya fosfat konsantrasyonlarini arttirarak IL-lra'ya sitrat baglanmasi için rekabeti göstermektedir.Örnek 10`da tarif edildigi gibi Sekil 22, çözelti içinde pirofosfat konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, lL-1 ra'ya sitratin baglanmasi için Kd Lapp'in bir grafigini göstermektedir. IL-l ra'nin anyon baglayan yerine baglanan pirofosfat için Kd x'in 2,994 mM oldugu hesaplanmistir.Sekil 23, örnek bir IL-1ra'nin nükleotit dizisini (SEQ ID NO: 4) ve amino asit dizisini (SEQ ID NO: 5) gösterir.Sekil 24, örnek bir lL-1ra'nin, iclL-lra (SEQ ID NO: 6) olarak anilan amino asit dizisini göstermektedir. SEQ ID NO: 6, N-ucundaki ilave 7 amino asit disinda SEQ ID NO: 3 ileayni diziye sahiptir.BAZI ÖRNEK DÜZENLEMELERIN DETAYLI AÇIKLAMASIBu uygulamada, aksi belirtilmedikçe, tekil kullanimi çogul anlamlari da içerir. Bu uygulamada, aksi belirtilmedikçe "veya", "ve/veya'I anlamina gelir. Ayrica, "içerir" ve "dahil" gibi diger formlarin yani sira "içeren" teriminin kullanilmasi sinirlayici degildir. Ayrica, "eleman" veya "bilesen" gibi terimler, tek bir birim içeren elemanlari ve bilesenleri ve spesifik olarak aksibelirtilmedikçe birden fazla alt birim içeren elemanlari ve bilesenleri kapsar.Çesitli düzenlemelerde, rekombinant DNA, oligonükleotit sentezi, doku kültürü, transformasyon ve transfeksiyon için standart teknikler kullanilabilir. Çesitli düzenlemelerde, enzimatik reaksiyonlar ve saflastirma teknikleri, üreticinin spesifikasyonlarina göre veya teknikte yaygin olarak yapildigi gibi veya burada tarif edildigi gibi gerçeklestirilebilir. Çesitli düzenlemelerde, teknikler ve prosedürler, genellikle teknikte bilinen geleneksel yöntemlere göre ve bu tarifname boyunca alinti yapilan ve tartisilan ve/veya teknikte uzman kisilercebilinen çesitli genel ve daha spesifik referanslarda tarif edildigi gibi gerçeklestirilebilir.30Bakiniz, örnegin Sambrook vd. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Spesifik tanimlamalar saglanmadikça, burada tarif edilen analitik kimya, sentetik organik kimya ve tibbi ve farmasötik kimya ile ilgili laboratuvar prosedürleri ve teknikler ile baglantili olarak kullanilan isimlendirmeler, teknikte bilinen ve yaygin olarak kullanilanlardir. Çesitli düzenlemelerde kimyasal sentezler, kimyasal analizler, farmasötik preparatlar, formülasyon, uygulama ve hastalarin tedavisi için standart teknikler kullanilabilir. Bir amino asidin baska bir amino asit ile "degistirildigi" bazi düzenlemelerde bu degistirme, örnegin kodonu, amino asidi baska bir amino asidi kodlayan kodona kodlayan polinükleotit içinde mutasyona ugratmak suretiyle rekombinant olarak yapilabilir. Bazi düzenlemelerde kodonu mutasyona sokmak, tekniktebilinen herhangi bir yöntemle yapilabilir.TanimlarMevcut açiklamaya uygun olarak kullanildigi haliyle, aksi belirtilmedikçe asagidaki terimlerin,asagidaki anlamlara sahip oldugu anlasilacaktir:"Izole edilmis polinükleotit" terimi, (1) dogada bulunan bir polinükleotitin en azindan bir kismi ile iliskili olmayan veya (2) dogada baglanmadigi bir polinükleotide baglanan veya (3) dogada bulunmayan, genomik, cDNA veya sentetik kökenli bir polinükleotit veya bunlarinbazi kombinasyonlari anlamina gelecektir."islevsel bir sekilde bagli" terimi, amaçlanan sekilde islev görmelerine izin veren bir iliski içinde bulunan bilesenlere atif yapmaktadir. Örnegin, bir kodlama dizisine "islevsel olarak bagli" bir kontrol dizisi, kodlama dizisinin ekpresyonunun, kontrol dizisinin çalismasi ileuyumlu kosullar altinda gerçeklestirilecegi sekilde baglanir."Kontrol dizisi" terimi, baglandiklari kodlama dizilerinin ekspresyonunu ve islenmesini etkileyebilen polinükleotit dizileri anlamina gelir. Bu tür kontrol dizilerinin dogasi, konakçi organizmaya bagli olarak degisebilir. Bazi düzenlemelere göre, prokaryotlar için kontrol dizileri promotörleri, ribozomal baglanma bölgelerini ve transkripsiyon sonlandirma dizileriniiçerebilir. Bazi düzenlemelere göre, ökaryotlar için kontrol dizileri promotörleri ve30transkripsiyon sonlandirma dizisini içerebilir. Bazi düzenlemelerde "kontrol dizileri", liderdizileri ve/veya füzyon ortagi dizilerini içerebilir."Polinükleotit" terimi, dogal olarak olusan ve/veya dogal olarak olusmayan baglar ile birbirine baglanan dogal olarak olusan ve/veya modifiye edilmis ribonükleotitler ve/veya deoksiribonükleotitlere sahip olan nükleotitlerin polimerik formu anlamina gelir. Bazi düzenlemelerde bir polinükleotit, en az 10 baz uzunlugundadir. Terim, DNA/RNA'nin tek veçift iplikçikli formlarini ve DNA/RNA hibritini veya bunlarin degistirilmis formlarini içerir."Oligonükleotit" terimi, dogal olarak olusan ve/veya dogal olarak olusmayan baglar ile birbirine baglanan dogal olarak olusan ve/veya modifiye edilmis ribonükleotitler ve/veya deoksiribonükleotitlere sahip olan polimerleri içerir. Oligonükleotitler bir polinükleotit alt kümesidir ve genellikle yaklasik 200 baz veya daha azini içerir. Bazi düzenlemelerde Oligonükleotitler yaklasik 10 ila yaklasik 60 baz uzunlugundadir. Bazi düzenlemelerde Oligonükleotitler 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veya 21 ila 40 baz uzunlugundadir. Oligonükleotitler tek iplikçikli veya çift iplikçikli olabilir. Oligonükleotitler sense veya antisensoligonükleotitleri olabilir."Dogal olarak olusan nükleotitler" terimi, deoksiribonükleotitleri ve ribonükleotitleri içerir. "Modifiye edilmis nükleotitler" terimi, degistirilmis veya sübstitüe edilmis seker gruplarina ve/veya degistirilmis veya sübstitüe edilmis nükleotit baz gruplarina ve benzerlerine sahip nükleotitleri içerir. "Oligonükleotit bagli" ve "polinükleotit bagi" terimleri fosforotioat, fosforoditiyoat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotiyoat, foforaniiladat, fosforoamidat ve benzeri baglari içerir. Bakiniz örneginLaPlanche vd. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec vd. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein vd. Nucl. Acids Res. 1623209 (1988); Zon vd. Anti-Cancer Drug Design 6539 (1991); Zon vd. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, sayfa 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991));Stec vd. US Pat. No. 5,151,510; Uhlmann ve Peyman Chemical Reviews 902543 (1990). Bazi düzenlemelerde bir oligonükleotit veya polinükleotit bir etiketiçerebilir.Bir nesne Için kullanilan "dogal olarak meydana gelen" terimi, dogada bulunabilen bir30nesneyi ifade eder. Örnegin dogadaki bir kaynaktan izole edilebilen ve laboratuvarda insan tarafindan modifiye edilmemis veya baska sekilde dogal olarak meydana gelen birorganizmada (virüsler dahil) bulunan bir polipeptit veya polinükleotit dizisi."Izole edilmis protein" terimi, sentetik yolla yapilan bir protein veya (1) normal olarak birlikte bulunabilecegi proteinlerin en azindan bazilarini içermeyen veya (2) esasen ayni kaynaktan, örnegin ayni türden gelen diger proteinlerî içermeyen veya (3) farkli bir türden gelen bir hücre tarafindan eksprese edilen; veya (4) dogada bulunmayan, genomik DNA, cDNA, RNA veya diger polinükleotitler tarafindan kodlanan bir protein anlamina gelir. Burada kullanilan polipeptit notasyonunda, özellikle, aksi belirtilmedikçe standart kullanim ve gelenege uygunolarak sol yön amino-uçlu yöndür ve sag yön karboksi-uçlu yöndür.Benzer sekilde, aksi belirtilmedikçe tek iplikçikli polinükleotit dizilerinin sol ucu 5'ucudur, çift iplikçikli polinükleotit dizilerinin sol yönü 5 'yönü olarak anilir. Yeni RNA transkriptlerine 5' ila 3' ilavesinin yönü transkripsiyon yönü olarak adlandirilir; RNA transkriptinin 5' ucu için 5' olan DNA iplikçigi üzerindeki dizi bölgeleri "yukari akis dizileri" olarak adlandirilir ve "kodlama bölgesinin yukari akisinda" bulunur; RNA transkriptinin 3' ucun için 3' olan DNA iplikçigi üzerindeki dizi bölgeleri, "asagi akis dizileri" olarak adlandirilir ve "kodlama bölgesinin asagiakisinda" bulunur.Burada kullanilan "etiket" veya "etiketli" terimleri, saptanabilir bir kismin varligina isaret eder. Bir polinükleotit ya da polipeptidin sentezi sirasinda saptanabilir bir kisim dahil edilebilir ya da sentezden sonra ya kovalent olarak ya da kovalent olmayan sekilde eklenebilir. Etiketleme, örnegin radyoaktif isaretli bir amino asidin dahil edilmesi, etiketli avidin ile tespit edilebilen biyotin parçalarinin baglanmasi (ör. optik veya kolorimetrik yöntemlerle tespit edilebilen bir floresan kisim veya enzimatik aktivite içeren streptavidin) olabilir. Bazi düzenlemelerde, etiket veya tespit edilebilir kisim terapötik olabilir. Polipeptitlerin ve/veya polinükleotidlerin etiketlenmesi için çesitli yöntemler teknikte bilinmektedir. Polipeptitler ve/veya polinükleotitler için etiketlerin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte sunlar bulunur: radyoizotoplar veya radyonüklitler (ör. 3H, 14C,15N,355,9°Y,99Tc,mln,125l,13ul), floresan etiketler (ör. FITC, rodamin, lantanidfosforlari), enzimatik etiketler (ör. yabanturpu peroksidaz, p-galaktosidaz, lusiferaz, alkali30fosfataz), kemilüminesan etiketler, biyotinil gruplari, ikincil bir haberci tarafindan taninan önceden belirlenmis polipeptit epitoplari (ör. lösin fermuar çifti dizileri, sekonder antikorlar için baglanma yerleri, metal baglama alanlari, epitop etiketleri). Bazi düzenlemelerde, etiketler, sterik engelleme potansiyelini azaltmak için çesitli uzunluklardaki aralayici kollarlabaglanir.Bu tarifnamede kullanildigi haliyle, yirmi geleneksel amino asit ve bunlarin kisaltmalari geleneksel kullanimlari takip etmektedir. Bakiniz Immunology--A Synthesis (2. baski, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Yirmi geleneksel amino asidin stereoizomerleri (ör. D-amino asitler), 0i-, a-disübstitüe amino asitler, N-alkil amino asitler gibi dogal olmayan amino asitler, laktik asit ve diger geleneksel olmayan amino asitler de mevcut bulusun polipeptitleri için uygun bilesenler olabilir. Sinirlayici olmayan örnek niteligindeki geleneksel olmayan amino asitler arasinda 4-hidr0ksipr0lin, y- karboksiglutamat, e-N, N, N-trimetillizin, s-N-asetillizin, O-fosfoserin, N-asetilserin, N- formilmetiyonin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, oi-N-metilarginin ve diger benzer aminoasitler ve imino asitler bulunur.Teknikte uzman bir kisi, iyi bilinen tekniklerle bir polipeptidin uygun varyantlarini tanimlayabilecektir. Bazi düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, aktivite için önemli olduguna inanilmayan bölgeleri hedefleyerek bir polipeptidin aktiviteyi bozmadan degistirilebilen uygun bölgelerini belirleyebilir. Bazi düzenlemelerde, benzer polipeptitler arasinda korunan bir polipeptidin kalintilari ve kisimlari belirlenebilir. Bazi düzenlemelerde biyolojik aktivite veya yapi için önemli olabilecek alanlar bile, biyolojik aktiviteyi bozmadan veya polipeptit yapisini ters olarak etkilemeden muhafazakar amino asit sübstitüsyonlari içinuygun olabilir.Ek olarak, bazi düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, yapi-fonksiyon çalismalarini gözden geçirebilir ve aktivite ya da yapi için önemli olan benzer polipeptitlerdeki kalintilari belirleyebilir. Böyle bir karsilastirma göz önüne alindiginda, benzer proteinlerdeki aktivite veya yapi için önemli olan amino asit kalintilarina karsilik gelen bir proteindeki amino asitkalintilarinin önemi tahmin edilebilir. Bazi düzenlemelerde teknikte uzman bir kisi, bu gibi30 tahmin edilen önemli amino asit kalintilari için kimyasal olarak benzer amino asitsü bstitüsyonla rini tercih edebilir.Bazi düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, benzer polipeptitlerdeki bilinen yapilara göre üç boyutlu yapi ve amino asit dizisini analiz edebilir. Ayrica, bazi düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, istenen her amino asit kalintisinda tek bir amino asit sübstitüsyonu içeren test varyantlari olusturabilir. Bazi düzenlemelerde, varyantlar daha sonra teknikte uzman kisilerce bilinen aktivite deneyleri kullanilarak taranabilir. Bu varyantlar, uygun varyantlar hakkinda bilgi toplamak için kullanilabilir. Örnegin bazi düzenlemelerde, belirli bir amino asit kalintisina yapilan bir degisikligin bozulmus, istenmeyen sekilde azaltilmis veya uygun olmayan bir aktivite ile sonuçlandigini kesfederse, böyle bir degisiklige sahip varyantlardan kaçinilabilir. Baska bir deyisle, bu tür rutin deneylerden elde edilen bilgilere dayanarak, teknikte uzman bir kisi, tek basina veya baska mutasyonlarla kombinasyon halinde daha fazlasübstitüsyonun önlenmesinin gerektigi amino asitleri kolaylikla belirleyebilir.Bazi düzenlemelerde silmeler, eklemeler ve/veya sübstitüsyonlar (tek tek veya toplu olarak Burada kullanildigi haliyle "IL-lra vahsi tip protein"i, N-uçlu dizisi MRPSGR... olacak sekilde, N-ucunda istege bagli olarak ek bir metiyonin kalintisi bulunduran SEQ ID NO: 3 amino asit dizisine sahip olan bir proteine karsilik gelir. "Anakinra" jenerik ismine sahip terapötik protein, bu lL-1 ra vahsi tip proteini tanimina girer. Anakinra, bir N-uçlu metiyonin haricinde SEQ ID NO: 3 ile ayni olan SEQ ID NO: 5 dizisine sahiptir. Bazi düzenlemelerde IL-1 ra vahsi tip proteininde yapilan kimyasal veya enzimatik modifikasyon gibi degisiklikler, proteinin translasyonu veya sentezinden sonra yapilir. Bu degistirilmis IL-1 ra proteinleri tek tek veya toplu olarak "türev(ler)" olarak adlandirilir. IL-lra terimi, IL-1 ra vahsi tip proteinlerinin yani sira, dogal olarak olusan ve dogal olarak olusmayan IL-1 ra varyantlarini ve IL-1 ra reseptörüiçin antagonist aktiviteye sahip türevleri kapsar.Bazi düzenlemelerde alanin, sistein, aspartik asit, glutamik asit, fenilalanin, glisin, histidin, izolösin, Iösin, metiyonin, asparagin, prolin, glutamin, serin, treonin, valin, triptofan ve tirozin arasindan "pozitif yüke sahip olmayan bir amino asit" seçilir. Pozitif yüklü olmayan aminoasitler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte pozitif bir yüke sahip olmayan geleneksel olmayan3011amino asitleri de içerir. Teknikte uzman bir kisi, belirli bir amino asit varyantinin birpolipeptide dahil edildiginde pozitif bir yüke sahip olup olmadigini belirleyebilir.Bazi düzenlemelerde alanin, sistein, fenilalanin, glisin, histidin, izolösin, Iösin, metiyonin, asparagin, prolin, glutamin, serin, treonin, valin, triptofan ve tirozin arasindan "yüksüz bir amino asit" seçilir. Yüksüz amino asitler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte yüksüz geleneksel olmayan amino asitleri de içerir. Teknikte uzman bir kisi, belirli bir geleneksel olmayan aminoasit varyantinin bir polipeptide dahil edildiginde bir yüke sahip olup olmadigini belirleyebilir.Bazi düzenlemelerde sistein, glisin, glutamin, asparagin, serin, treonin ve tirozin arasindan "yüksüz bir polar amino asit" seçilir. Yüksüz polar amino asitler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte polar olan, ancak yüksüz geleneksel olmayan amino asitleri de içerir. Teknikte uzman bir kisi, belirli bir geleneksel olmayan amino asit varyantinin polar olup olmadigini ve birpolipeptide dahil edildiginde bir yüke sahip olup olmadigini belirleyebilir.Bazi düzenlemelerde "aromatik olmayan bir amino asit" alanin, arginin, sistein, aspartik asit, glutamik asit, glisin, histidin, izolösin, Iösin, Iizin, metiyonin, asparagin, prolin, glutamin, serin, treonin ve valinden seçilir. Aromatik olmayan amino asitler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte aromatik olmayan geleneksel olmayan amino asitleri de içerir. Teknikte uzman bir kisi, belirli bir geleneksel olmayan amino asit varyantinin, bir polipeptide dahil edildigindearomatik olup olmadigini belirleyebilir."Katyon-pi etkilesimi" terimi, bir katyonik amino asit ve bir aromatik amino asit arasindaki kovalent olmayan bir etkilesime karsilik gelir. Bazi düzenlemelerde katyonik amino asit lizin olabilir. Bazi düzenlemelerde katyonik amino asit arginin olabilir. Bazi düzenlemelerde aromatik amino asit fenilalanin olabilir. Bazi düzenlemelerde aromatik amino asit tirozin olabilir. Bazi düzenlemelerde aromatik amino asit triptofan olabilir. Katyon-pi etkilesimi, tek bir polipeptit (yani molekül içi) içinde olabilir veya katyon-pi etkilesimi iki veya daha fazlapolipeptit (yani moleküller arasi) arasinda olabilir.Bazi düzenlemelerde IL-1ra'nin belirli amino asit kalintilari bir katyon-pi etkilesimi içinde yeralir. Sekil 1, IL-lra'nin bir X-isini kristal yapisini göstermektedir. Kristal yapi 1ILR.pdb dosyasi3012ve Vector NTI 3D Moleküler Görüntüleyici (InforMax) kullanilarak hazirlanmistir. IL-1 ra asimetrik dimer olarak kristallenmistir. Bakiniz, örnegin Vigers vd., J. Biol. Chem., 269: 12874- 12879 (1994). Sekil 2, Sekil 1'in kristal yapisinin bir bölümünü göstermektedir. Bu kristal yapisinda, bir IL-1ra alt birimindeki Iizin-93'ün, diger lL-lra alt birimindeki triptofan-16 ile bir katyon-pi etkilesimi içinde yer aldigi görünmektedir. Benzer sekilde, bir IL-lra alt birimindeki arginin-97'nin, diger IL-lra alt birimindeki tirozin-34 ile bir katyon-pi etkilesimi içinde yeraldigi görünmektedir.Burada kullanilan "polipeptit fragmani" terimi, bir amino ucu ve/veya bir karboksi ucu silinmesine sahip olan bir polipeptide karsilik gelir. Bazi düzenlemelerde fragmanlar, en az 5 ila 201 amino asit uzunlugundadir. Bazi düzenlemelerde, fragmanlarin en az 5, 6, 8, 10, 14, , 50, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 170, 175, 176, 177, 180, 185, 190 veya 200 amino asituzunlugunda oldugu anlasilacaktir.Burada kullanildigi sekliyle "biyolojik numune" terimi, bununla sinirli olmamakla birlikte canlidan veya eskiden yasayan bir canlidan gelen herhangi bir miktardaki maddeyi içerir. Bu gibi canlilar, bunlarla sinirli olmamakla birlikte insanlar, fareler, maymunlar, siçanlar, tavsanlar ve diger hayvanlari içerir. Bu maddeler arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte kan, serum, idrar, hücreler, organlar, dokular, kemik, kemik iligi, lenf dügümleri ve deribulunur.Burada kullanildigi sekliyle "büyük ölçüde saf", söz konusu bir makromoleküler türün mevcut olan baskin makromoleküler tür oldugu anlamina gelir (yani molar bazda, bilesimdeki diger bireysel makromoleküler türlerden daha boldur). Bazi düzenlemelerde, büyük ölçüde saflastirilmis bir fraksiyon, söz konusu makromoleküler türün, mevcut tüm makromoleküler türlerin en az yaklasik %50'sini (agirlik bazinda) olusturdugu bir bilesimdir. Bazi düzenlemelerde, esas olarak saf bir bilesim içinde, söz konusu makromoleküler tür, bilesimde bulunan tüm makromoleküler türlerin agirlikça yaklasik %80, %85, %90, %95 veya %99'undan fazlasini olusturacaktir. Bazi düzenlemelerde söz konusu makromoleküler türler esasen homojenlige kadar saflastirilir (yani kontaminant türler, geleneksel saptama yöntemleri ile bilesimde tespit edilemez). Bazi düzenlemelerde, bilesim esasen tek birmakromoleküler türden olusur.3013Hasta terimi, insan ve hayvan deneklerini içerir.Interlökin-l reseptör antagonisti (IL-lra), interlökin-l aktivitesinin bir inhibitörü olarak görev yapan ve ayni zamanda IL-loi ve lL-lß'yi da içeren lL-1 ailesinin bir üyesi olan bir insan proteinidir. IL-1 reseptör antagonistlerinin münhasir olmayan, sinirlayici olmayan, kapsamli olmayan bir listesi Kineret® (anakinra) (ör. SEQ ID NO: 5 amino asit dizisine sahip bir protein), IL-lra vahsi tip proteini (bunlarla sinirli olmamak üzere SEQ ID NO: 3 dizisine sahip bir protein veya SEQ ID NO: 5 dizisine sahip bir proteini içerir), hücre içi IL-lra (icIL-1ra) (bunlarla sinirli olmamak üzere SEQ ID NO: 6 dizisine sahip bir protein), IL-1 ra ß (bakiniz, ör. PCT Yayin No. WO 99/36541), lL-1 ra varyantlari ve IL-1ra türevlerini içerir. IL-l ra ve bunlarin varyantlari ve türevleri dahil olmak üzere bazi IL-1 ra reseptör antagonistlerinin yani sira bunlari yapma ve kullanma yöntemleri, örnegin U.S. Patent No. 5,075,222; U.S. Patent No. 6,599,873 B1; US Patent No. 5,863,769; US Patent No. 5,858,355; US Patent No. 5,739,282; US Patent No. ,922,573; US Patent No. 6,054,559; WO 91/08285; WO 91/17184; WO 91/17249; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793; WO 96/12022; WO 97/28828; WO 99/36541; WO 99/51744 belgelerinde tarif edilmistir. Bir IL-1 reseptörü antagonisti, glikozileedilebilir veya glikozile edilmeyebilir.Örnek IL-1ra'lar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere SEQ ID NO: 2'de belirtilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptit ve interlökin-l reseptörü için bir antagonist aktiviteye sahip olan bu tür bir polipeptidin fragmanlari, varyantlari ve türevleri; SEQ ID NO: 3'te belirtilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptit ve interlökin-l reseptörü için bir antagonist aktiviteye sahip olan bu tür bir polipeptidin fragmanlari, varyantlari ve türevleri; SEQ ID NO: 5'te belirtilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptit ve interlökin-l reseptörü için bir antagonist aktiviteye sahip olan bu tür bir polipeptidin fragmanlari, varyantlari ve türevleri; SEQ ID NO: 6'da belirtilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptit ve interlökin-l reseptörü için bir antagonist aktiviteye sahip olan bu tür bir polipeptidin fragmanlari, varyantlari vetürevleri bulunur.Bazi düzenlemelerde IL-1 ra terimi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte interlökin-l reseptörüiçin antagonist aktiviteye sahip olan lL-1 ra varyantlarini içerir. Bazi düzenlemelerde IL-l ra3014varyantlari dogal olarak meydana gelen varyantlardir. Bazi düzenlemelerde lL-l ra varyantlari yapay olarak olusturulan varyantlardir. Örnek IL-1 ra varyantlari, bunlarla sinirli olmamak üzere SEQ ID NO: 2, SEQ lD NO: 3, SEQ ID NO: 5 veya SEQ ID NO: 6'ya kiyasla bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu, silinmesi ve/veya eklemesi içeren amino asit dizilerini içerir. Bazi düzenlemelerde IL-1 ra varyantlari, SEQ ID NO: 3'ün amino asit dizisi ile %95 oraninda özdes olan bir amino asit dizisini içerir. Bazi düzenlemelerde IL-1ra varyantlari, SEQ ID NO: 3'ün amino asit dizisi ile %90 oraninda özdes olan bir amino asit dizisini içerir. Bazi düzenlemelerde IL-lra varyantlari, SEO` ID NO: 3'ün amino asit dizisi ile %85 oraninda özdesamino asit dizisi ile %75 oraninda özdes olan bir amino asit dizisini içerir.Bazi düzenlemelerde IL-1ra terimi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte interlökin-l reseptörü için antagonist aktiviteye sahip IL-1 ra fragmanlarini içerir. Bazi düzenlemelerde lL-1ra fragmanlari dogal olarak meydana gelen fragmanlardir. Bazi düzenlemelerde IL-1ra fragmanlari yapay olarak olusturulan fragmanlardir. Örnek lL-1 ra fragmanlari arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 veya SEQ ID NO: 6'da belirtilen dizinin fragmanlari bulunur. IL-1 ra fragmanlari, IL-1 ra varyantlarinin bir altkümesidir.Bazi düzenlemelerde IL-1 ra terimi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte interlökin-l reseptörü için antagonist aktiviteye sahip IL-1 ra türevlerini içerir. Bazi düzenlemelerde IL-l ra türevleri dogal olarak meydana gelen türevlerdir. Bazi düzenlemelerde IL-l ra türevleri yapay olarak olusturulan türevlerdir. Örnek IL-1 ra türevleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 veya SEQ ID NO: 6'da belirtilen dizinin kimyasal olarak veya enzimatik olarak degistirilmis formlari bulunur. Örnek IL-1 ra türevleri arasinda, ayrica bunlarla sinirli olmamakla birlikte SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 veya SEQ ID NO: 6'da belirtilen dizinin varyantlarinin kimyasal olarak veya enzimatik olarakdegistirilmis formlari bulunur.Bazi düzenlemelerde IL-1 ra terimi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte bir sekretuar lider dizisine sahip olan bir IL-l ra'yi içerir. Bazi düzenlemelerde bir sekretuar lider dizisine sahipolan IL-1 ra "öncü IL-lra" olarak adlandirilir. Örnek bir öncü lL-l ra amino asit dizisi SEQ ID3015NO: 2'de belirtilmistir. "Öncü IL-1ra" terimi, SEQ ID NO: 2'nin interlökin-l reseptörü için antagonist aktiviteye sahip bir formda salgilanabilen ve islenebilen fragmanlarini,varyantlarini ve türevlerini içerir.IL-1 ra terimi, hem agrege olan IL-1 ra'yi hem de azaltilmis agregasyona sahip IL-l ra'yi içerir. Agrege olan IL-l ra proteinleri, 93 pozisyonunda bir lizin ve 97 pozisyonunda bir arginine sahiptir, fakat 93 pozisyonunda bir lizin ve 97 pozisyonundaki bir arginin içeren tüm IL-1ra proteinleri agrege olan IL-1ra'lardan degildir. "Agrege olan IL-1 ra", asagidaki analize göre 39 °C'de agrege olan IL-l ra vahsi tip, varyant ve türev proteinlerini içerir. 100 mg/ml'lik bir IL-1 ra çözeltisi, 10 mM fosfat, 140 mM NaCl, 0,5 mM EDTA içinde pH 6,5'te (PSE) 39 °C'de inkübe edilir. Referans olarak, SEQ ID NO: 5'in dizisine sahip 100 mg/ml'lik bir IL-1 ra vahsi tip protein çözeltisi PSE içinde 39 °C'de inkübe edilir. Her çözeltinin optik yogunlugu, 39 °C'de 2 saat inkübasyondan sonra 405 nm'de ölçülür. Eger söz konusu IL-lra, 2 saatlik inkübasyondan sonra, IL-1 ra vahsi tip proteininin 2 saatlik inkübasyondan sonraki optik yogunlugunun en az %60'i olan bir optik yogunluga sahipse, O zaman söz konusu lL-1 ra,agrege olan bir IL-1ra'dir."Azaltilmis agregasyona sahip lL-1ra", yukarida tarif edilen deneyde IL-1 ra vahsi tip proteininin optik yogunlugunun %60'indan az bir optik yogunluga sahip olan IL-l ravaryantini ve türev proteinlerini içerir.Bazi düzenlemelerde "interlökin-l reseptörü için antagonist aktiviteye sahip olan bir IL-1 ra" terimi, Örnek 3'te açiklanan lL-1ra sinyallesme kompleksi olusturma analizinde SEQ ID NO: 'in amino asit dizisine sahip olan bir IL-1 ra vahsi tip proteininin en az %50'si kadar aktif olan bir IL-1 ra vahsi tip, varyant veya türev proteinine karsilik gelir. "En az %50'si kadar aktif olma", IL-1 ra'nin ECSO'sinin IL-1 ra vahsi tip proteininin ECSO'sier karsilastirilmasiylabelirlenir."Arginin-97" terimi, SEQ ID NO: 3'te 97 pozisyonundaki amino asit kalintisina veya SEQ ID NO: 3'te 97 pozisyonundaki amino asit kalintisina karsilik gelen bir IL-1 ra içindeki amino asit pozisyonuna karsilik gelir. Örnegin SEQ ID NO: 3'ün arginin-97'sine karsilik gelen amino asit,SEQ ID NO: 5'in 98 pozisyonunundaki arginindir. Bu arginin hala IL-lra'nin arginin-97'si olarak3016anilir. Bazi düzenlemelerde Arginin-97 "R97" olarak anilir, burada R, arginin için tek harfli koddur ve 97, SEQ ID NO: 3 içindeki pozisyonuna karsilik gelir. Bazi düzenlemelerde, R97 baska bir amino asit ile degistirilirse, mutasyon R97X olarak ifade edilebilir, burada X, yer degistirilen amino asit için tek harfli koddur. Böylece, sinirlayici olmayan bir örnek olarak,R97 alanin ile degistirilirse, mutasyon R97A olarak adlandirilabilir."Lizin-93" terimi, SEQ ID NO: 3'te 93 pozisyonundaki amino asit kalintisina veya SEQ ID NO: 3'te 93 pozisyonundaki amino asit kalintisina karsilik gelen bir lL-1 ra içindeki amino asit pozisyonuna karsilik gelir. Örnegin, SEQ ID NO: 3'ün Iizin-93'üne karsilik gelen amino asit, SEQ ID NO: 5'in 94 posizyonundaki Iizindir. Bu Iizin hala lL-lra'nin Iizin-93'ü olarak anilir. Bazi düzenlemelerde Lizin-93, "K93" olarak adlandirilir, burada K, Iizin için tek harfli koddur ve 93, SEQ ID NO: 3 içindeki pozisyonuna karsilik gelir. Bazi düzenlemelerde, K93 baska bir amino asit ile degistirilirse, mutasyon K93X olarak ifade edilebilir, burada X, yer degistirilen amino asit için tek harfli koddur. Böylece, sinirlayici olmayan bir örnek olarak, K93 alanin iledegistirilirse, mutasyon K93A olarak adlandirilabilir."Triptofan-lß" terimi, SEQ ID NO: 3'te 16 pozisyonundaki amino asit kalintisina veya SEQ lD NO: 3'te 16 pozisyonundaki amino asit kalintisina karsilik gelen bir lL-1 ra içindeki amino asit pozisyonuna karsilik gelir. Örnegin, SEQ ID NO: 3'ün triptofan-lö'sina karsilik gelen amino asit, SEQ ID NO: 5'in 17 pozisyonundaki triptofandir. Bu triptofan hala IL-lra'nin triptofan- 16'si olarak anilir. Bazi düzenlemelerde Triptofan-16, "W16" olarak adlandirilir, burada W, triptofan için tek harfli koddur ve 16, SEQ ID NO: 3 içindeki pozisyonuna karsilik gelir. Bazi düzenlemelerde, W16 baska bir amino asit ile degistirilirse, mutasyon W16X olarak ifade edilebilir, burada X, yer degistirilen amino asit için tek harfli koddur. Böylece, sinirlayici olmayan bir örnek olarak, W16 alanin ile degistirilirse, mutasyon W16A olarakadlandirilabilir."Tirozin-34" terimi, SEQ ID NO: 3'te 34 pozisyonundaki amino asit kalintisina veya SEQ ID NO: 3'te 34 pozisyonundaki amino asit kalintisina karsilik gelen bir IL-1 ra içindeki amino asit pozisyonuna karsilik gelir. Örnegin, SEQ ID NO: 3'ün tirozin-34'üne karsilik gelen amino asit, SEQ ID NO: 5'in 35 pozisyonundaki tirozindir. Bu tirozin hala lL-lra'nin tirozin -35'i olarakanilir. Bazi düzenlemelerde Tirozin-34, "Y34" olarak adlandirilir, burada Y, tirozin için tek3017harfli koddur ve 34, SEQ ID NO: 3 içindeki pozisyonuna karsilik gelir. Bazi düzenlemelerde, Y34 baska bir amino asit ile degistirilirse, mutasyon Y34X olarak ifade edilebilir, burada X, yer degistirilen amino asit için tek harfli koddur. Böylece, sinirlayici olmayan bir örnek olarak,Y34 alanin ile degistirilirse, mutasyon Y34A olarak adlandirilabilir.Bazi düzenlemelerde "azaltilmis agregasyon", (1) B kosulu altindaki polipeptidin agregasyonuna göre azaltilmis olan, A kosulu altindaki bir polipeptidin agregasyonu; ve/veya (2) ayni A kosulu altindaki vahsi tip polipeptidin agregasyonuna göre azaltilmis olan, A kosulu altindaki bir polipeptit varyantinin agregasyonu; ve/veya (3) ayni A kosulu altindaki farkli bir polipeptit varyantinin agregasyonuna göre azaltilmis olan, A kosulu altindaki bir polipeptit varyantinin agregasyonu olarak tanimlanir. Sinirlayici olmayan bir örnek olarak, asagidaki (1) durumu için nispi agregasyon belirlenebilir. A kosulu altindaki bir polipeptidin 405 nm'deki optik yogunlugu çesitli zamanlarda ölçülür. B kosulu altindaki polipeptidin 405 nm'deki optik yogunlugu, daha sonra ayni zamanlarda ölçülür. Her kosul altinda söz konusu polipeptit için agregasyon egrisi, y ekseni üzerinde optik yogunluk ve x ekseni üzerindeki zaman ile grafige geçirilir. A kosulu altindaki polipeptit t zamaninda, ayni t zamaninda B kosulu altindaki polipeptidden daha düsük bir optik yogunluga sahipse, bu durumda A kosulu altindakipolipeptidin, B kosulu altindaki polipeptide göre düsük agregasyona sahip oldugu söylenir.Farkli kosullarin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte tampon bilesimindeki farkliliklar, sicakliktaki farkliliklar, polipeptit konsantrasyonundaki farkliliklar, yardimci moleküllerin varligi ve yoklugu, yardimci molekül konsantrasyonundaki farkliliklar, vb.bulunur."Yardimci molekül" terimi, bir veya daha fazla polipeptidin agregasyonunu azaltan bir molekülü ifade eder. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül spesifik olmayan bir sekilde bir veya daha fazla polipeptidin agrgasyonunu azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, agregasyonu polipeptidin bir veya daha fazla amino asidi ile etkilesime girerek azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, polipeptidin bir veya daha fazla amino asidi ile kovalent olarak etkilesir ve "kovalent bir yardimcci molekül" olarak adlandirilir. Bazidüzenlemelerde bir yardimci molekül, polipeptidin bir veya daha fazla amino asidiyle3018kovalent olmayan sekilde etkilesir ve "kovalent olmayan bir yardimci molekül" olarakadlandirilir.Bazi düzenlemelerde bir polipeptidin agregasyonundaki azalma, yardimci molekülünün konsantrasyonu ile baglantilidir. Bazi düzenlemelerde, bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyonunu önemli ölçüde ortadan kaldirabilir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyonunu en az %10 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %20 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %30 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %40 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %50 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %60 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %70 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %75 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %80 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %85 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu en az %90 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül,bir polipeptidin agregasyonunu en az %95 azaltir.Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini azaltir. Bazi düzenlemelerde bir polipeptidin agregasyon hizindaki azalma, yardimci molekülün konsantrasyonuna baglidir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir polipeptidin agregasyonunu büyük ölçüde ortadan kaldirir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %10 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %20 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %30 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %40 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %50 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %60 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %70 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az%75 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en3019az %80 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %85 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidin agregasyon hizini en az %90 azaltir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir polipeptidinagregasyon hizini en az %95 azaltir.Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, bir veya daha fazla amino asit kalintisinda bir polipeptit ile kovalent olarak veya kovalent olmayan bir sekilde etkilesir. Bazi düzenlemelerde, bir yardimci molekül bir veya daha fazla spesifik amino asit kalintisi ile etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül polipeptidin aktivitesini önemli ölçüde azaltmaz. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül, polipeptidin aktivitesini %10'dan fazla azaltmaz. Bazi düzenlemelerde yardimci moleküller polipeptidin aktivitesini %20'den fazla azaltmaz. Bazi düzenlemelerde yardimci moleküller polipeptidin aktivitesini %30'dan fazla azaltmaz. Bazi düzenlemelerde yardimci moleküller polipeptidin aktivitesini %50'den fazla azaltmaz. Bazi düzenlemelerde yardimci moleküller polipeptidin aktivitesini %75'ten fazlaazaltmaz.Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir amino asit kalintisinda mevcut olan bir yükü ortadan kaldirir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül bir amino asit kalintisini kovalent olarak modifiye ederek bir yükü ortadan kaldirir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül amino asit kalintisi ile kovalent olmayan bir sekilde etkilesime girerek bir yükü ortadankaldirir, böylece yükü "maskeler".Örnek kovalent yardimci moleküller arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere 6-(N-(7- nitrobenz-2-oksa-1,3-diazoI-4-il) amino)heksanoik asit (NBD-X), metil asetil fosfat ( MAP) vesitrakonik anhidrit bulunur.Örnek kovalent olmayan yardimci moleküller arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte sekerler, tek yüklü anyonlar ve birden çok yüklü anyonlar bulunur. Yardimci moleküller olabilecek örnek sekerler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere gliserol, sükroz, mannitol ve sorbitol bulunur. Yardimci moleküller olabilecek örnek tek yüklü anyonlar arasinda,bunlarla sinirli olmamakla birlikte fosfat ve klorür bulunur. Yardimci moleküller olabilecek3020örnek birden çok yüklü anyonlar arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte pirofosfat vesitrat bulunur."Arginin-reaktif yardimci molekül" terimi, spesifik olarak arginin kalintilari ile etkilesime giren bir yardimci molekülü ifade eder. Bazi düzenlemelerde bir arginin-reaktif yardimci molekül sadece arginin ile etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir arginin-reaktif yardimci molekül diger amino asitlere ek olarak arginin ile etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir arginin-reaktif yardimci molekül arginin ile kovalent olarak etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir arginin-reaktif yardimci molekül arginin ile kovalent olmayan sekilde etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir arginin-reaktifyardimci molekül arginin içeren polipeptidin aktivitesini büyük Ölçüde azaltmaz."Lizin reaktif yardimci molekül" terimi, özellikle lizin kalintilari ile etkilesime giren bir yardimci molekülü ifade eder. Bazi düzenlemelerde, bir lizin-reaktif yardimci molekül sadece lizin ile etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir lizin-reaktif yardimci molekül diger amino asitlere ilaveten lizin ile etkilesir. Bazi düzenlemelerde, bir Iizin-reaktif yardimci molekül lizin ile kovalent olarak etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir Iizin-reaktif yardimci molekül lizin ile kovalent olmayan sekilde etkilesir. Bazi düzenlemelerde bir Iizin-reaktif yardimci moleküllizin içeren polipeptidin aktivitesini büyük ölçüde azaltmaz."Birden çok yüklü anyonlar" terimi, pH 6,5 ve 25 °C'de birden fazla negatif yük içeren molekülleri ifade eder. Bazi düzenlemelerde birden çok yüklü anyonlar pH 6,5 ve 25 °C'de ortalama olarak birden fazla, ancak ikiden az negatif yüke sahiptir. Bazi düzenlemelerde birden çok yüklü anyonlar pH 6,5 ve 25 °C'de ortalama iki veya daha fazla negatif yüke sahiptir. Bazi düzenlemelerde birden çok yüklü anyonlar pH 6,5 ve 25 °C'de ortalama iki ila dört negatif yüke sahiptir. Çesitli düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, belirli bir anyonun pH 6,5 ve 25 °C'de birden çok yüklü bir anyon olup olmadigini, örnegin anyon için yayinlanan pKa degerlerinden belirleyebilir. "Tek yüklü anyon" terimi, pH 6,5 ve 25 °C'de ortalama bir veya birden az negatif yüke sahip olan bir anyonu ifade eder. Çesitli düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, belirli bir anyonun pH 6,5 ve 25 °C'de tek yüklü anyon olupolmadigini, örnegin anyon için yayinlanan pKa degerlerinden belirleyebilir."Seker" terimi bir karbonhidrat anlamina gelir. Örnek sekerler arasinda, bunlarla sinirli3021olmamak üzere monosakkaritler, disakkaritler ve trisakkaritler bulunur. Sinirlayici olmayan örnek sekerler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere gliserol, sükroz, mannitol ve sorbitolyer alir.Bir hastalik veya tibbi durum, kendiliginden olan veya deneysel hastalik veya tibbi durum, vücut sivilari veya dokularinda lL-1'in yüksek seviyeleriyle iliskili ise ve/veya vücuttan alinan hücreler veya dokular kültür içinde yüksek IL-1 seviyeleri üretirse bir "interlökin-l aracili hastalik" olarak kabul edilir. Bazi düzenlemelerde bu gibi interlökin-l aracili hastaliklar, asagidaki iki durumun bir veya daha fazlasi ile anlasilabilir: (1) hastalik veya tibbi durumla iliskili patolojik bulgular, lL-l uygulamasi veya IL-l ekspresyonunun yukari regülasyonu yoluyla hayvanlarda deneysel olarak taklit edilebilir; ve/veya (2) hastaligin veya tibbi durumun deneysel hayvan modellerinde uyarilan bir patoloji, IL-1'in etkisini inhibe eden ajanlar ile tedavi edilerek inhibe edilebilir veya ortadan kaldirilabilir. Bazi düzenlemelerde yukaridaki kosullardan bir veya daha fazlasi bir IL-1 aracili hastalikta karsilanir. Bazidüzenlemelerde tüm kosullar bir IL-1 aracili hastalikta karsilanir.Akut ve kronik interlökin-l (IL-1) aracili hastaliklar, bunlarla sinirli olmamak üzere akut pankreatit; amiyotrofik lateral skleroz (ALS veya Lou Gehrig hastaligi); Alzheimer hastaligi; bununla sinirli olmamakla birlikte AIDS kaynakli kaseksi de dahil olmak üzere kaseksi/anoreksi; astim ve diger akciger hastaliklari; ateroskleroz; otoimmün vaskülit; kronik yorgunluk sendromu; bununla sinirli olmamakla birlikte Clostridium ile iliskili diyare de dahil olmak üzere Clostridium ile iliskili hastaliklar; bunlarla sinirli olmamakla birlikte konjestif kalp yetmezligi, koroner restenoz, miyokard enfarktüsü, miyokard disfonksiyonu (ör. sepsis ile iliskili) ve koroner arter baypas grefti de dahil olmak üzere koroner rahatsizliklar ve endikasyonlar; bunlarla sinirli olmamakla birlikte multipl miyelom lösemi ve miyelojen (ör. AML ve CML) ve tümör metastazi da dahil olmak üzere Iösemileri içeren kanser; (bununla sinirli olmamak üzere insüline bagli diyabeti içeren) diyabet; endometriyoz; ates; fibromiyalji; glomerulonefrit; graft versus host hastaligi ve/veya transplant reddi; hemorajik sok; hiperaljezi; enflamatuar barsak hastaligi; bunlarla sinirli olmamakla birlikte osteoartrit, psoriatik artrit ve romatoid artrit de dahil olmak üzere bir eklemin enflamatuar durumlari; bununla sinirli olmamakla birlikte örnegin korneal transplant ile iliskili olanlar da dahil olmaküzere enflamatuar göz hastaligi; bununla sinirli olmamakla birlikte (bunlarla sinirli olmamakla3022birlikte, örnegin her biri nörodejenerasyona yol açabilen travma, epilepsi, hemoraji veya felcin bir sonucu olarak beyin travmasini içeren) serebral iskemi de dahil olmak üzere iskemi; Kawasaki hastaligi; ögrenme bozuklugu; (bunlarla sinirli olmamakla birlikte akut solunum güçlügü sendromu veya ARDS'yi içeren) akciger hastaliklari; multipl skleroz; miyopatiler (ör. bunlarla sinirli olmamakla birlikte sepsisteki kas protein metabolizmasini içeren kas protein metabolizmasi); (bunlarla sinirli olmamak üzere HIV tarafindan uyarilan durumu içeren) nörotoksisite; osteoporoz; bunlarla sinirli olmamakla birlikte kanserle ilgili agrilar dahil olmak üzere agri; Parkinson hastaligi; periyodontal hastalik; erken dogum; sedef hastaligi; reperfüzyon hasari; septik sok; radyasyon terapisinden kaynakli yan etkiler; temporal mandibular eklem hastaligi; uyku bozuklugu; üveit ve örnegin kasilma, burkulma, kikirdak hasari, travma, ortopedik cerrahi, enfeksiyon veya diger hastalik süreçlerinden kaynaklananenflamatuar rahatsizliklari içerir.Bazi Örnek Düzenlemelerin Ayrintili AçiklamasiAgrege olan lL-lra'nin agregasyonunun azaltilmasi için yöntemler saglanir. Bazi düzenlemelerde agregasyonu azaltilacak olan agrege IL-1 ra, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 veya SEQ ID NO: 6'daki amino asit dizisini içerir. Bazi düzenlemelerde agregasyonu azaltilacak olan agrege IL-1ra, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 veya SEQ lD NO: 6'da gösterilen amino asit dizisine sahip bir polipeptidin bir fragmanini, varyantini veya türevini içerir, burada fragman, varyant veya türev interlökin-l reseptörü için bir antagonistaktiviteye sahiptir.IL-1 ra'nin agregasyonu, iki IL-1 ra polipeptidinin yüzey kalintilari arasindaki bir veya daha fazla katyon-pi etkilesimlerinden kaynaklanabilir. Örnegin Sekil 2'de gösterildigi gibi bir IL-1 polipeptidinin Iizin-93'ü ikinci bir IL-1 polipeptidinintriptofan-16'si ile bir katyon-pi etkilesimi olusturabilir. Benzer sekilde, bir polipeptidin arginin-97`si, ikinci bir polipeptidin tirozin-34'ü ile bir katyon-pi etkilesimi olusturabilir. Bu etkilesimler, iki IL-lra polipeptidinin birbirine baglanmasina neden olabilir. Ayrica, bu baglanma asimetrik oldugu için, her iki polipeptit üzerinde ayni yüz arasinda baglanmanin gerçeklesmedigi anlamina gelir, her bir polipeptit ayni anda iki IL-1 ra polipeptidine baglanabilir. Aslinda, IL-1 ra polipeptitleri arasinda ekasimetrik baglanma temaslari mümkün ise, bir lL-l ra polipeptidi ayni anda ikiden fazla lL-13023ra polipeptidine baglanabilecektir. Her bir IL-1 ra polipeptidi, en az iki baska IL-1 ra polipeptidine, örnegin Sekil 8'de gösterilen asimetrik katyon-pi etkilesimi yoluylabaglanabiliyorsa, o zaman bu etkilesimler, çözeltide lL-1 ra agregasyonuna yol açabilir.Bazi düzenlemelerde, agrege olan bir IL-1 ra'nin agregasyonu lizin-93'te arginin-97'de ya da lizin-93 ve arginin-97'nin her ikisinde pozitif yükün azaltilmasiyla azaltilabilir. Bazi düzenlemelerde, bu pozisyonlardan birindeki veya her ikisindeki pozitif yük yeterince azaltilirsa, katyon-pi etkilesimi olusmayabilir veya IL-lra'nin agregasyonuna neden olacak kadar kararli olmayacak sekilde zayiflatilabilir. Bazi düzenlemelerde, agrege olan IL-1 ra'nin agregasyonu diger mekanizmalar ile azaltilabilir. Yöntem, agregasyondaki azalmanin mekanizmasi ile sinirli degildir. Agregasyonu azaltmak için açiklanan yöntemlerden herhangi biri, yukarida tartisilan örnek mekanizma veya açiklanan sonuca ulasan herhangi bir baska mekanizma ile gerçeklesebilir. Agrege olan bir IL-1 ra'nin agregasyonunu azaltabilen moleküller, agregasyonu azaltma mekanizmalarina bakilmaksizin ve kovalent veya kovalent olmayan bir sekilde davranip davranmadiklarina bakilmaksizin, toplu olarak "yardimcimoleküller" olarak adlandirilir.Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül lizin-93 veya arginin-97'nin biri veya her ikisindeki pozitif yükü azaltarak agrege olan IL-1 ra'nin agregasyonunu azaltabilir. Çesitli düzenlemelerde bir yardimci molekül Iizin-93'de, arginin-97'de veya hem IIzin-93 hem de arginin-97'de kovalent olarak ya da kovalent olmayan bir sekilde pozitif yükü azaltabilir. Bu amino asitlerin birinde veya her ikisinde de pozitif yükü azaltmak için kabul edilen bir yardimci molekül, ayni zamanda diger mekanizmalarla agregasyonu azaltabilir veyatamamen baska mekanizmalarla hareket edebilir.Bazi düzenlemelerde agrege olan bir IL-1 ra'nin tek yüklü anyonik veya birden çok yüklü anyonik moleküllerle inkübe edilmesi IL-lra'nin agregasyonunu azaltabilir. Bazi düzenlemelerde azaltilmis agregasyona sahip bir IL-1 ra'nin tek yüklü anyonik veya birden çok yüklü anyonik moleküllerle inkübe edilmesi IL-lra'nin agregasyonunu daha da azaltabilir. Bazi düzenlemelerde agregasyondaki bu azalma, tek yüklü anyonik ya da birden çok yüklü anyonik molekülün, lizin-93'te, arginin-97'de ya da hem Iizin-93 hem de arginin-97'de pozitifyük ile etkilesime girmesinden kaynaklanabilir. Örnek 2'de tarif edilen ve Sekil 1'de gösterilen3024çalismada tartisildigi gibi 10 mM sitrat içeren CSE içinde agrege olan bir IL-1 ra'nin inkübe edilmesi, (405 nm'de optik yogunluk ile ölçüldügü üzere) agrege olan IL-1 ra'nin 10 mM fosfat içeren PSE içinde inkübe edilmesine göre zaman içinde agregasyonu daha fazla azaltmistir. Bu deneyde, PSE içinde agregasyon yaklasik 1,2'Iik OD405'e ulasirken, CSE içinde agregasyon yaklasik 0,55'lik bir CD 405'e ulasmistir. Bu nedenle, CSE içindeki inkübasyon, budeneyde PSE içindeki inkübasyona göre agregasyonu %50'den fazla azaltmistir.Benzer sekilde, Örnek 2'de açiklanan çalismada, agrege olan IL-1ra'nin CSE içindeki agregasyon hizi, agrege olan IL-lra'nin PSE içindeki agregasyon hizindan daha düsük olmustur. Sekil 1'de PSE`deki agregasyon hizi K ag olarak isaretlenen dogrunun egimi ile temsil edilir. Benzer bir dogru, Sekil 1'de CSE için çizilebilir ve bu dogru, agregasyon hizininPSE'ye göre CSE'de azalan hizina isaret edecek sekilde daha sig bir egime sahip olacaktir.Bazi düzenlemelerde sitrat, agregasyonu azaltmada daha etkili olabilir çünkü pH 6,5'te fosfattan daha büyük bir negatif yüke sahiptir. Bazi düzenlemelerde, belirli miktarlarda negatif yük, agregasyonu azaltmada digerlerinden daha etkili olabilir. Ayrica, bazi düzenlemelerde, negatif yükün belirli konfigürasyonlari, örnegin bir yardimci molekül üzerindeki negatif yükler arasindaki mesafe ve bu negatif yüklerin uzayda nasil "sabit" oldugu, yardimci moleküllerin aktivitesini de etkileyebilir. Bu nedenle, bazi düzenlemelerde, çesitli yardimci moleküllerinin etkinligi, negatif yük miktarindan etkilenebilir, ancak negatif yük miktari her zaman belirleyici olmayabilir. Bazi düzenlemelerde birden çok yüklü bir anyon agregasyonu azaltmada tek yüklü bir anyondan daha etkili olabilir. Çesitli düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, yardimci molekülleri seçebilir ve tasarlanan spesifik uygulama için uygun olani belirleyebilir. Örnegin, bazi yardimci moleküller belirli sicakliklarda az veya çok etkili olabilir. Çesitli düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, agrege olan IL- 1ra'nin inkübe edilecegi veya depolanacagi belirli sicaklikta etkili olan bir yardimci molekül seçebilir. Bulusa göre, yaklasik 20 "C ila 45 °C arasinda agregasyonu azaltmada etkili olan bir yardimci molekül seçilir. Bazi düzenlemelerde yaklasik 25 °C ila 45 °C arasinda agregasyonu azaltmada etkili olan bir yardimci molekül seçilir. Bazi düzenlemelerde, yaklasik 30 °C ila 45 °C arasinda agregasyonu azaltmada etkili olan bir yardimci molekül seçilir. Bazi düzenlemelerde, yaklasik 35 °C ila 45 "C arasinda agregasyonu azaltmada etkili olan biryardimci molekül seçilir.3025Bazi düzenlemelerde, bir yardimci molekülün konsantrasyonunun degistirilmesi, agregasyondaki azalmayi veya agrege olan bir lL-lra'nin agregasyon hizindaki azalmayi etkileyebilir. Örnek 4'te tartisilan ve Sekil 3'te gösterilen çalisma, çesitli konsantrasyonlarda fosfat, sitrat veya pirofosfatta inkübe edilmis agrege olan IL-1ra'nin agregasyon hizini dikkate almistir. Bu deneyde sitrat ve pirofosfat, agregasyon hizindaki bir azalma ve yardimci molekülün konsantrasyonu arasinda benzer bir korelasyon göstermistir. Hem sitrat hem de pirofosfat, 10 mM'Iik yardimci molekülde agregasyon hizinda neredeyse %90'Iik bir azalma göstermistir. Bu azalma, 20 mM'de hem sitrat hem de pirofosfat için artmis ve daha sonra 100 mM`nin üzerine kadar sabitlenmistir. Aksine, fosfat 10 mM'Iik agregasyon hizinda sadece %20'Iik bir azalma göstermis ve azalma yaklasik 80 mM'ye kadar sabitlenmemistir. Örnek 4`te tartisilan deneyin sonuçlari, pirofosfat ve sitratin 29 °C'de agrege olan bir IL-1 ra'nin agregasyon hizini azaltmada esas olarak esit derecede etkili oldugunu göstermektedir. Hem sitrat hem de pirofosfat pH 6,5'te fosfattan daha büyük bir negatif yüke sahiptir, bu da bazi düzenlemelerde negatif yük miktarinin bazi yardimci moleküllerin etkinliginietkileyebilecegini göstermektedir.Bazi düzenlemelerde, bir seker bir yardimci molekül olabilir. Yardimci moleküller olabilecek örnek sekerler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere sükroz, gliserol, mannitol ve sorbitol yer alir. Örnek 5, artan konsantrasyonlarda sükroz, gliserol veya sorbitolün agrege olan bir IL- lra'nin agregasyon hizini azalttigi örnek bir deneyi tarif etmektedir (bakiniz Sekil 4). %0 sekerdeki 20 au'dan daha büyük bir agregasyon hizina kiyasla, %3'te üç sekerin her biri agregasyon hizini 5 agregasyon biriminin altina indirmistir (au, 1 au, 200 ul'lik bir hacim ve SpectroMaxTM plakali okuma spektrofotometresi kullanarak 405 nm'de dakikada 1 mili-optikyogunluk birimi artisina esittir).Çesitli düzenlemelerde, teknikte uzman bir kisi, örnegin Örnek 4 veya Örnek 5'in yöntemlerini kullanarak, belirli bir uygulama için kovalent olmayan bir yardimci molekülün uygun konsantrasyonunu belirleyebilir. Bazi düzenlemelerde yardimci bir molekül 1 ila 100 mM'Iik bir konsantrasyonda bulunabilir. Bazi düzenlemelerde yardimci bir molekül 1 ila 50mM'Iik bir konsantrasyonda bulunabilir. Bazi düzenlemelerde yardimci bir molekül 1 ila 203026mM'lik bir konsantrasyonda bulunabilir. Bazi düzenlemelerde yardimci bir molekül 10 mM'likbir konsantrasyonda bulunabilir.Bazi düzenlemelerde yardimci bir molekül %0 ila %10 arasinda bir konsantrasyonda mevcut olabilir. Bazi düzenlemelerde yardimci bir molekül %0 ila %5 arasinda bir konsantrasyonda mevcut olabilir. Bazi düzenlemelerde yardimci bir molekül %1, %2 veya %3'lük birkonsantrasyonda mevcut olabilir.Bazi düzenlemelerde IL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 10 mM'den azdir. Bazi düzenlemelerde lL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 7 mM'den azdir. Bazi düzenlemelerde lL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 5 mM'den azdir. Bazi düzenlemelerde IL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 4 mM'den azdir. Bazi düzenlemelerde IL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 3 mM'den azdir. Bazi düzenlemelerde lL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 0,1 mM ila 5 mM arasindadir. Bazi düzenlemelerde lL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 1 mM ila 5 mM arasindadir. Bazi düzenlemelerde IL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 0,1 mM ila 4 mM arasindadir. Bazi düzenlemelerde lL-1 ra için kovalent olmayan bir yardimci molekülün Kd'si 1 mM ila 4 mM arasindadir. Bazi düzenlemelerde IL-l ra için kovalent olmayan bir yardimcimolekülün Kd'si 2 mM ila 4 mM arasindadir.Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül agrege olmayan bir lL-1ra'yi kovalent olarak modifiye ederek agregasyonu azaltabilir. Bazi düzenlemelerde bir yardimci molekül azalan agregasyona sahip bir IL-1 ra'yi kovalent olarak modifiye ederek agregasyonu daha da azaltabilir. Bazi düzenlemelerde kovalent modifikasyon Iizin-93'de, arginin-97'de ya da hem lizin-93 hem de arginin-97'de pozitif bir yükü ortadan kaldirir. Bazi düzenlemelerde bir kovalent yardimci molekül, örnegin bir veya daha fazla katyon-pi etkilesiminin veya agrege olan IL-1 ra polipeptitleri arasindaki diger etkilesimlerin olusumunu sterik olarak inhibeederek, baska bir mekanizma ile agregasyonu azaltabilir.Bir IL-1ra'yi kovalent olarak modifiye edebilen, sinirlayici olmayan örnek yardimci moleküllerarasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte NBD-X, MAP ve sitrakonik anhidrit yer alir. Bazi3027düzenlemelerde NBD-X, primer aminler ile bir türev olusturur. Örnek 3'te tartisilan ve Sekil 2'de gösterilen çalismada, IL-1ra vahsi tip proteininin NBD-X, SE ile inkübasyonu polipeptidin amino ucundaki amin grubunun ve Iizin-93'ün türetilmesi ile sonuçlanmistir. Bazi düzenlemelerde NBD-X ile türetme, Iizin-93'teki pozitif yükü kaldirabilir ve türetilmis IL- 1ra'nin azaltilmis agregasyonuna yol açabilir. Bazi düzenlemelerde MAP, lizin kalintilarini ve polipeptitlerin N-ucundaki amino gruplarini asetile eder. Örnek 7'de tartisilan ve Sekil 13- 'te gösterilen çalismada, çesitli inkübasyon zamanlarinda IL-1 ra'nin MAP ile inkübasyonu, lL-lra'nin N-ucundaki amino grubunun; lL-1ra'nin N-ucundaki amino grubunun ve Iizin-6'nin türetilmesi; lL-lra'nin N-ucundaki amino grubu, Iizin-6 ve Iizin-93`in türetilmesi veya IL- lra'nin N-ucundaki amino grubu, Iizin-6, Iizin-93 ve Iizin-96'sinin türetilmesi ile sonuçlanmistir. Bazi düzenlemelerde MAP ile türetme, lizin-93'teki pozitif yükü kaldirabilir vetüretilmis IL-1 ra'nin azaltilmis agregasyonuna yol açabilir.Bazi düzenlemelerde diger amin-reaktif moleküller, agrege olan lL-1 ra'nin agregasyonunu bir ya da daha fazla pozitif yükü kaldirarak ya da baska bir mekanizma yoluyla azaltabilir. Bazi düzenlemelerde kovalent bir yardimci molekül ile türetilmis olan lL-lra, benzer sekilde türetilmemis bir lL-lra vahsi tip proteininin en az %90'i kadar aktiftir. Bazi düzenlemelerde kovalent bir yardimci molekül ile türetilmis olan lL-1 ra, benzer sekilde türetilmemis bir lL-1 ra vahsi tip proteininin en az %80'i kadar kadar aktiftir. Bazi düzenlemelerde kovalent bir yardimci molekül ile türetilmis olan IL-l ra, benzer sekilde türetilmemis bir IL-l ra vahsi tip proteininin en az %75'i kadar kadar aktiftir. Bazi düzenlemelerde kovalent bir yardimci molekül ile türetilmis olan lL-1 ra, benzer sekilde türetilmemis bir IL-1 ra vahsi tip proteinininen az %50'si kadar kadar aktiftir.Asagida, IL-1ra'yi ve en az bir yardimci molekülü içeren kitler tarif edilmistir. Kitler istege göre, bilesenler ayri olarak temin edilirse, IL-l ra ve en az bir yardimci molekülün birlestirilmesi için talimatlar içerebilir. Kitler, IL-1 ra ve en az bir yardimci molekülün kullanimi için talimatlar içerebilir. Kitler en az bir kovalent yardimci molekül ve/veya en az bir kovalent olmayan yardimci molekül içerebilir. Kit, en az bir kovalent yardimci molekül içerdiginde, bu kit, ayrica lL-1 ra'nin kovalent yardimci molekül ile inkübasyonunu takiben, türetilmis lL-1 ra'dan geriye kalan herhangi bir reaksiyona girmemis yardimci molekülü uzaklastirmayayönelik talimatlar içerebilir. Kitler, en az bir kovalent yardimci molekül ile daha önce3028türetilmis olan IL-1ra'yi içerebilir. Benzer sekilde, bazi düzenlemelerde bir kit, en az birkovalent olmayan yardimci molekülle birlikte bir bilesimde bulunan bir IL-lra'yi içerebilir.Asagida tarif edildigi gibi, farmasötik olarak kabul edilebilir seyreltici, tasiyici, çözündürücü, emülsiyonlastirici, koruyucu ve/veya adjuvan ile birlikte terapötik olarak etkili bir miktardaIL-lra'yi içeren farmasötik bilesimler saglanmaktadir.Kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda kabul edilebilir formülasyon malzemeleri alicilariçin toksik olmayabilir.Bir farmasötik bilesim, bilesimin örnegin pH, ozmolarite, viskozite, berraklik, renk, Izotonisite, koku, sterillik, stabilite, çözünme veya salim hizi, emilim ve/veya penetrasyonunu modifiye etmek, muhafaza etmek ve/veya korumak için formülasyon malzemeleri içerebilir. Örnek formülasyon malzemeleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte amino asitler (ör. glisin, glutamin, asparagin, arginin ve Iizin); antimikrobiyaller; antioksidanlar (ör. askorbik asit, sodyum sülfit ve sodyum hidrojen-sülfit); tamponlar (ör. borat, bikarbonat, Tris-HCI, sitratlar, fosfatlar ve diger organik asitler); hacim arttirici maddeler (ör. mannitol ve glisinj; selatlama ajanlari (ör. etilendiamin tetraasetik asit (EDTA)); komplekslestirici ajanlar (ör. kafein, polivinilpirolidon, beta-siklodekstrin ve hidroksipropiI-beta-siklodekstrin); dolgu maddeleri; monosakkaritler; disakkaritler ve diger karbonhidratlar (Ör. glikoz, mannoz ve dekstrinler); proteinler (ör. serum albümin, jelatin ve immünoglobulinler); renklendirici, lezzet verici ve seyreltici ajanlar; emülsiyonlastirici ajanlar; hidrofilik polimerler (ör. polivinilpirrolidon); düsük molekül agirlikli polipeptitler; tuz olusturan karsi iyonlar (ör. sodyum); koruyucular (ör. benzalkonyum klorür, benzoik asit, salisilik asit, timerosal, fenetil alkol, metilparaben, propilparaben, klorheksidin, sorbik asit ve hidrojen peroksit), çözücüler (ör. gliserin, propilen glikol ve polietilen glikol), seker alkolleri (ör. mannitol ve sorbitolj; süspansiyonlastirici ajanlar; yüzey aktif maddeler veya islatici ajanlar (ör. pluronikler, PEG, sorbitan esterleri, polisorbat 20 ve polisorbat 80 gibi polisorbatlar, triton, trometamin, lesitin, kolesterol, tiloksapal); stabilite arttirici ajanlar (ör. sükroz ve sorbitol); tonisiteyi arttirici ajanlar (ör. sodyum ve potasyum klorür gibi alkali metal halojenürler, mannitol,sorbitol), iletim araçlari; seyrelticiler; eksipiyanlar ve farmasötik adjuvanlar bulunur. (Bakiniz,3029örnegin Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Baski, A.R. Gennaro, ed., Mack PublishingCompany (1990).Bir IL-1 ra ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik ajan, yari ömrü uzatan bir araca baglanabilir. Örnek araçlar, bunlarla sinirli olmamakla birlikte Fc alani, polietilen glikol ve dekstrani içerir. Bazi örnek araçlar, ör. US Basvuru Seri No. 09/428,082'de tarif edilmis ve PCT Basvuru No. WO 99/25044'de yayinlanmistir.Optimal bir farmasötik bilesim, örnegin amaçlanan uygulama yoluna, iletim formatina ve arzu edilen dozaja bagli olarak, teknikte uzman bir kisi tarafindan belirlenecektir. Örnegin Remington's Pharmaceutical Sciences, yukariya bakiniz. Bazi düzenlemelerde bu gibi bilesimler, IL-1ra'nin fiziksel durumunu, stabilitesini, in vivo salim hizini ve in vivo kleranshizini etkileyebilir.Bir farmasötik bilesimde birincil araç veya tasiyici, 5qu ya da susuz olabilir. Örnegin bazi düzenlemelerde, uygun bir araç veya tasiyici, muhtemelen parenteral uygulama için bilesimlerde yaygin olan diger malzemelerle takviye edilmis enjeksiyon için su, fizyolojik tuzlu su çözeltisi veya yapay beyin-omurilik sivisi olabilir. Nötr tamponlu tuzlu su çözeltisi veya serum albümin ile karistirilmis tuzlu su çözeltisi diger örnek araçlardir. Farmasötik bilesimler, yaklasik pH 7,0-8,5 arasinda bir Tris tamponu veya yaklasik pH 4,0-5,5 arasinda bir asetat tamponu içerebilir, ki bunlar ayrica sorbitol veya bunun yerine uygun bir ikame içerebilir. En az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmaksizin bir IL-lra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik maddeyi içeren bilesim, depolama için istenen saflik derecesine sahip seçilen bilesimin istege bagli formülasyon ajanlari (Remington's Pharmaceutical Sciences, yukariya bakiniz) ile karistirilmasiyla Iiyofilize bir kek veya bir 5qu çözelti formunda hazirlanabilir. Ayrica, en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmaksizin bir lL-1ra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik maddeyi içeren bilesim, sükroz gibi uygun eksipiyanlar kullanilarak birliyofilizat olarak formüle edilebilir.Farmasötik bilesimler parenteral yoldan verilmek üzere seçilebilir. Bilesimler, inhalasyon için veya sindirim yoluyla, örnegin oral yolla iletilmek üzere seçilebilir. Bu gibi farmasötik olarakkabul edilebilir bilesimlerin hazirlanmasi, teknik uzmanligin kapsamindadir.3030Parenteral uygulama düsünüldügünde, terapötik bir bilesim, farmasötik olarak kabul edilebilir bir araç içinde en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan istenen lL- 1ra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik maddeyi içeren pirojensiz, parenteral olarak kabul edilebilir sulu bir çözelti halinde olabilir. Parenteral enjeksiyon için bir araç, en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmaksizin IL-1 ra`nin ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik maddenin uygun sekilde korunmus steril, izotonik bir çözelti halinde formüle edildigi steril damitilmis su olabilir. Preparasyon, istenen molekülün, ürünün kontrollü veya sürekli salimini saglayabilecek enjekte edilebilir mikroküreler, biyolojik olarak asinabilir parçaciklar, polimerik bilesikler (polilaktik asit veya poliglikolik asit gibi), boncuklar veya Iipozomlar gibi bir ajanla formülasyonunu içerebilir, bu daha sonra bir depo enjeksiyonu olarak verilebilir. Hiyalüronik asit de kullanilabilir ve dolasimda sürekliligi destekleme etkisine sahip olabilir. Implant edilebilir ilaç iletim cihazlari, istenen molekülü vermek içinkullanilabilir.Farmasötik bir bilesim, inhalasyon için formüle edilebilir. En az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan bir IL-1ra ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik ajan, inhalasyon için kuru bir toz halinde formüle edilebilir. En az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan bir IL- 1ra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik ajani içeren bir inhalasyon çözeltisi, aerosolün iletilmesi için bir itici ile formüle edilebilir. Çözeltiler nebülize edilebilir. Pulmoner uygulama, ayrica kimyasal olarak degistirilmis proteinlerin pulmoner olarak iletilmesini açiklayan PCTbasvuru no. PCT/U594/001875 belgesinde açiklanir.Ayrica, formülasyonlarin oral yoldan verilebilecegi düsünülmektedir. Bu sekilde uygulanan, en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan bir IL-1ra ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik ajan, tabletler ve kapsüller gibi kati dozaj formlarinin birlestirilmesinde geleneksel olarak kullanilan tasiyicilarla birlikte veya bunlar olmadan formüle edilebilir. Bir kapsül, formülasyonun aktif kismini, biyoyararlanimin en üst düzeye çiktigi ve ön sistemik bozunmanin en aza indigi sindirim sistemindeki noktada serbest birakmak üzere tasarlanabilir. IL-1ra'nin ve/veya herhangi bir yardimci molekülün ve/veya herhangi bir ilaveterapötik maddenin emilimini kolaylastirmak için en az bir ek ajan dahil edilebilir.3031Seyrelticiler, tatlandiricilar, düsük erime noktali mumlar, bitkisel yaglar, kaydiricilar,süspansiyonlastirici ajanlar, tablet dagitici ajanlar ve baglayicilar da kullanilabilir.Bir farmasötik bilesim, tabletlerin üretimi için uygun olan toksik olmayan eksipiyanlarla bir karisim içinde, en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan etkili bir miktarda IL-1ra ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik madde içerebilir. Tabletleri steril su veya uygun baska bir araçta çözerek, birim doz formunda çözeltiler hazirlanabilir. Uygun eksipiyanlar, bunlarla sinirli olmamakla birlikte kalsiyum karbonat, sodyum karbonat veya bikarbonat, laktoz veya kalsiyum fosfat gibi inert seyrelticiler; veya nisasta, jelatin veya akasya gibibaglayici ajanlar; veya magnezyum stearat, stearik asit veya talk gibi kaydirici ajanlari içerir.Ek farmasötik bilesimler, sürekli veya kontrollü olarak verilen formülasyonlarda en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan IL-1ra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik maddeyi içeren formülasyonlar da dahil olmak üzere teknikte uzman kisiler için açik olacaktir. Bazi düzenlemelerde Iipozom tasiyicilar, biyolojik olarak asinabilir mikropartiküller veya gözenekli boncuklar ve depo enjeksiyonlari gibi çesitli diger sürekli veya kontrollü iletim ürünlerinin formüle edilmesine yönelik teknikler, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir. Örnegin farmasötik bilesimlerin verilmesi için gözenekli polimerik mikropartiküllerin kontrollü salinimini açiklayan PCT Basvuru No. PCT/US93/00829 belgesine bakiniz. Sürekli salimli preparatlar, örnegin filmler veya mikrokapsüller gibi sekillendirilmis ürünler formunda yari geçirgen polimer matrisleri içerebilir. Sürekli salim matrisleri arasinda poliesterler, hidrojeller, polilaktitler (bakiniz örnegin U.S. 3,773,919 ve EP 058,481), L-glutamik asit ve gama etil-L-glutamat kopolimerleri (Sidman vd., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2- hidroksietiI-metakrilat) (Langer vd., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) ve Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil asetat (Langer vd., yukariya bakiniz) veya poli-D(- )-3-hidroksibütirik asit (EP 133,988) bulunabilir. Sürekli salim saglayan bilesimler, teknolojide bilinen birkaç yöntemden herhangi biri ile hazirlanabilen lipozomlari içerebilir. Bakiniz, örnegin Eppstein vd., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046ve EP 143,949.Iri vivo uygulama için kullanilacak olan farmasötik bilesim tipik olarak sterildir. Bu, sterilfiltrasyon membranlarindan süzülerek gerçeklestirilebilir. Bilesimin liyofilize edildigi3032durumlarda, bu yöntem kullanilarak yapilan sterilizasyon, Iiyofilizasyon ve sulandirmadan önce veya sonra yapilabilir. Parenteral uygulama için bilesim Iiyofilize formda veya bir çözelti içinde saklanabilir. Parenteral bilesimler genellikle bir steril erisim portuna sahip bir kap, örnegin bir hipodermik enjeksiyon ignesi ile delinebilen bir durdurucuya sahip bir intravenözçözelti torbasi veya flakonu içine yerlestirilir.Farmasötik bilesim formüle edildikten sonra, bir çözelti, süspansiyon, jel, emülsiyon, kati ya da susuz veya Iiyofilize bir toz olarak steril siselerde saklanabilir. Bu tür formülasyonlar, kullanima hazir bir formda veya uygulamadan önce sulandirilan bir formda (Örnegin liyofilize)saklanabilir.Tek dozlu bir uygulama ünitesi üretmek için kitler saglanabilir. Kitlerin her biri hem bir kurutulmus proteine sahip birinci bir kabi hem de bir sulu formülasyona sahip ikinci bir kabi ihtiva edebilir. Tek ve çok hazneli önceden doldurulmus siringalari (ör. sivi siringalari veIiyofizile siringalari) içeren kitler dahil edilebilir.Terapötik olarak kullanilacak en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan bir IL- lra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik maddeyi içeren bir farmasötik bilesimin etkili miktari, örnegin terapötik baglam ve amaçlara bagli olacaktir. Teknikte uzman bir kisi, bazi düzenlemelere göre tedavi için uygun dozaj seviyelerinin, böylece en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan IL-lra'nin ve/veya bir veya daha fazla ilave terapötik ajanin kullanildigina isaret edecek sekilde, kismen, iletilen moleküle, uygulama yoluna ve hastanin büyüklügüne (vücut agirligi, vücut yüzeyi veya organ büyüklügü) ve/veya durumuna (yas ve genel saglik) bagli olarak degisecegini takdir edecektir. Bazi düzenlemelerde klinisyen, en uygun terapötik etkiyi elde etmek için dozaji titre edebilir ve uygulama yolunu degistirebilir. Tipik bir dozaj, yukarida belirtilen faktörlere bagli olarak yaklasik 0,1 ug/kg ila yaklasik 100 mg/kg veya daha fazla olabilir. Dozaj, 0,1 tig/kg ila yaklasik 100 mg/kg; veya 1 ug/kg ila yaklasik 100 mg/kg; veya 5 ug/kg ila yaklasik 100 mg/kg arasinda degisebilir.Dozlama sikligi, lL-lra'nin farmakokinetik parametrelerini ve/veya herhangi bir yardimci molekülü ve/veya kullanilan formülasyondaki herhangi bir ilave terapötik ajani dikkatealabilir. Bir klinisyen, istenen etkiyi gerçeklestiren bir doza ulasilana kadar bilesimi3033uygulayabilir. Bu nedenle bilesim, tek bir doz halinde veya zaman içinde iki veya daha fazla doz (istenen molekülün ayni miktarini içerebilen veya içermeyen) olarak veya bir implantasyon cihazi veya kateter yoluyla sürekli bir infüzyon seklinde uygulanabilir. Uygun dozajin daha da iyilestirilmesi, alaninda uzman kisiler tarafindan rutin olarak yapilir ve bunlar tarafindan rutin olarak gerçeklestirilen görevlerin kapsami dahilindedir. Uygun doza cevapverilerinin kullanilmasiyla uygun dozajlar belirlenebilir.Farmasötik bilesimin uygulama yolu, sürekli salim sistemleri veya implantasyon cihazlari ile gerçeklestirilen, örnegin oral, intravenöz, intraperitonal, intraserebral (intra-parankimal), intraserebroventriküler, intramüsküler, intraoküler, intraarteriyel, intraportal veya intralezyonel yollarla enjeksiyon gibi bilinen yöntemlerle uyumludur. Bilesimler bolusenjeksiyonla veya sürekli olarak infüzyonla veya implantasyon cihazi ile uygulanabilir.Bilesim, arzu edilen molekülün emildigi veya kapsüllendigi bir zar, sünger veya baska bir uygun malzemenin implantasyonu yoluyla lokal olarak uygulanabilir. Bir implantasyon cihazi kullanildiginda, cihaz herhangi bir uygun doku veya organ içine implante edilebilir ve istenenmolekülün iletimi difüzyon, zaman ayarli bolus veya sürekli uygulama yoluyla olabilir.En az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan bir lL-1ra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik maddeyi içeren bir farmasötik bilesimin, ex vivo bir sekilde kullanilmasi arzu edilebilir. Bu gibi durumlarda, hastadan çikarilmis olan hücreler, dokular ve/veya organlar, en az bir yardimci molekülle birlikte veya bu olmadan bir IL-lra'yi ve/veya bir veya daha fazla ek terapötik ajani içeren bir farmasötik bilesime maruz birakilir; hücreler, dokular ve/veyaorganlar daha sonra hastaya geri implante edilir.Belirli durumlarda, azaltilmis agregasyona sahip olan bir IL-1 ra ve/veya herhangi bir yardimci molekül ve/veya herhangi bir ilave terapötik ajan, polipeptidleri ekprese etmek ve salgilamak üzere teknikte bilinen yöntemler kullanilarak genetik olarak tasarlanmis bazi hücrelerin implante edilmesiyle iletilebilir. Bu gibi hücreler, hayvan veya insan hücreleri olabilir ve otolog, heterolog veya ksenogeneik olabilir. Hücreler ölümsüzlestirilebilir. Bir immünolojik yanitin olasiligini azaltmak için, çevre dokularin infiltrasyonunu önlemek için hücrelerkapsüllenebilir. Kapsülleme malzemeleri tipik olarak protein ürünlerinin (ürünlerinin) serbest3034birakilmasina izin veren, ancak hücrelerin hastanin bagisiklik sistemi tarafindan veya çevreleyen dokulardaki diger zararli faktörler tarafindan yok edilmesini önleyen biyolojikolarak uyumlu, yari geçirgen polimerik mahfazalar veya zarlardir.ÖRNEKLERAsagidaki örnekler, gerçeklestirilen deneyler ve elde edilen sonuçlar dahil olmak üzere, örnekamaçli verilmistir.Örnek 1IL-1ra vahsi tip proteininin üretimiSEQ ID NO: 5 dizisine sahip olan insan rekombinant interlökin-l reseptör antagonisti (lL-lra), hücre geri kazanma isleminin opsiyonel oldugu Avrupa Patent No. EP 0 502 956 El belgesinde tartisilan yönteme göre Amgen üretim tesislerinde hazirlanabilir. Alternatif olarak, SEQ ID NO: 5'in amino asit dizisine sahip olan anakinra Amgen Inc., Thousand Oaks, CA'dan temin edilebilir. SEQ ID NO: 5'in amino asit dizisine sahip olan saflastirilmis insan IL-lra, burada tarif edilen örneklerde kullanilmistir.Örnek 2lI.-1 ra agregasyonu39 °C'de, fosfat tamponu ve sitrat tamponu içinde IL-1 ra agregasyonu asagidaki gibi belirlenmistir. 10 ml'lik bir IL-1 ra stok çözeltisi (10 mM sodyum sitrat, 140 mM NaCI, 0,5 mM EDTA, pH 6,5 (CSE) içinde 200-220 mg/ml protein), 2 x 2L'Iik 10 mM fosfat, 140 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, pH 6,5 (PSE) veya 2 x 2L CSE'ye karsi 4 °C'de gece boyunca diyaliz edilmistir. Diyalize edilmis çözelti 0,2 pm 'lik bir filtreden süzülmüs ve IL-l ra protein konsantrasyonu,uygun tampon ile seyreltilerek 140 mg/ml'ye ayarlanmistir.Her tamponda IL-1ra'nin agregasyonu, 96 kuyucuklu bir cam plaka (Zissner) ve bir sicaklik3035kontrollü plaka okuma spektrofotometresi SpectraMax Plus (Molecular Devices) kullanilarak ölçülmüstür. Kuyucuk basina numune miktari180 ulul olmustur. Plakalar, spektrofotometrede 39 °C'de inkübe edilmis ve optik yogunluk, her 1 dakikada bir 405 nm'de ölçülmüstür. Sekil 1, bu deney için zamanin bir fonksiyonu olarak grafige geçirilen, 405 nm'deki optik yogunlugu göstermektedir. Agregasyon orani, SoftMax Pro programi (Molecular Devices) kullanilarak doyma egrisinin baslangiç dogrusal bölgesinin egimi olarak belirlenmistir. CSE'de inkübe edilen lL-l ra'nin agregasyon hizi, PSE'de inkübe edilen lL-1 ra'nin agregasyon hizina göre azalmistir. Ayrica, CSE'de inkübe edilen IL-1ra'nin agregasyonderecesi, PSE'de inkübe edilen IL-1 ra'nin agregasyon derecesine göre azalmistir.Örnek 3IL-1 ra'nin NBD-X ile etiketlenmesiYüzeye-maruz kalan amino gruplari, lL-1 ra'nin NBD-X, SE (süksinimidil 6-(N-(7-nitrobenz-2- 0ksa-1,3-diazoI-4-il) amino)heksanoat, Moleküler Problar) ile etiketlenmesiyle tanimlanmistir. NBD-X, amino gruplari ile türetme üzerine floresan hale gelir. PSE'de yirmi ul'lik 0,2 mM IL-1 ra, 480 ulul PSE ile seyreltilmistir. Dimetil formamid içinde 50 tig/pl NBD-X, SE çözeltisinin sekiz ul'si, oda sicakliginda 2 ulul'lik artislarla lL-1 ra çözeltisine eklenmistir. Reaksiyon, oda sicakliginda bir saat inkübe edilmis, daha sonra 50 ulul 1,5 M hidroksilamin çözeltisinin pH 8,5'de ilave edilmesiyle durdurulmustur. Reaksiyon karisimi, önceden PSE ile dengelenmis olan bir tuz giderme jeli filtreleme kolonundan geçirilmistir. Protein pikitoplanmis ve asagidaki gibi RP-HPLC ve LC-MS/MS ile daha ayrintili analiz edilmistir.Ters fazli HPLC, bir Phenomenex JupiterT'V' Su C4 kolonu (300Ã, 250x4,6 mm) ve on-Iine absorbans ve floresan detektörleri ile donatilmis bir HP1100 HPLC sistemi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Absorbans polipeptidin varligini tespit etmek üzere 215 nm'de ölçülmüstür. Floresan emisyonu, amin türevli NBD-X'in varligini tespit etmek için 480 nm'de uyarimdan sonra 535 nm'de ölçülmüstür. Elüsyon, %0,1 trifloroasetik asit (TFA) ve su (v/v/v) içinde %30-45'Iik bir metanol gradyani ile gerçeklestirilmistir. Sekil 2, 215 nm'de NBD-Xetiketli IL-lra'nin absorbansini ve bu deney için 480 nm'de uyarimdan sonra 535 nm'de NBD-3036X etiketli IL-1ra'nin floresan emisyonunu göstermektedir. Floresan piklerinin kimligi asagidakigibi belirlenmistir.Erken yürüyerek 16,75. dakikada gelen pik ve geç yürüyerek 17,5. dakikada gelen pik olmak üzere iki ana floresan piki belirlenmistir. Sekil 2, alt panele bakiniz. Pikler manuel olarak toplanmis ve Lys-C endoproteinaz ile asagidaki gibi sindirilmistir. Her pik, bes ayri HPLC çalismasindan toplanmistir. Agirlikli olarak 16,75 pikini içeren tüm fraksiyonlar bir araya getirilmistir. Agirlikli olarak 17,5. dakika pikini içeren fraksiyonlarin tümü bir araya getirilmistir. Bir araya toplanan iki örnek daha sonra bir SpeedVac yogunlastirici kullanilarak santrifüj ile kurutulmustur. Bir araya toplanan numunelerin her biri daha sonra pH 8,0'de 10 mM Tris, 0,8 M guinidinium hidroklorür içeren 490 plul'lik sindirim tamponu içinde çözünmüstür. Daha sonra her bir toplanmis numuneye, 5 ug Lys-C proteinazin (dizileme derecesi, Roche Diagnostics) 50 pl sindirim tamponu içinde çözünmesiyle hazirlanan on pl'lik bir Lys-C proteinaz çözeltisi eklenmistir. Numuneler gece boyunca 37 "C'de sindirilmistir. Sindirimden sonra, üretilen peptitler standart üretici protokolüne göre bir Beckman SistemGold HPLC ile donatilmis bir Finnegan LCQ Deca kullanilarak LC-MS/MS'ye tabi tutulmustur.Erken yürüyen pik (16,75. dakika) için sindirim, bir NBD türevinin varligini düsündürecek sekilde 276 amu'luk bir ek kütleyle birlikte IL-l ra'nin bir amino-uçlu peptidine karsilik gelen 1107,8 m/z'lik kütleye sahip benzersiz bir peptidi vermistir. Peptidin MS/MS analizi, amino asit dizisi MRPSGRK arti metionin kalintisi üzerinde ilave bir 276 amu kütlesi ile tutarli fragmanlar üretmistir, bu da IL-1 ra`nin amino-ucu metionininin NBD-X ile türetildiginidüsündürmektedir.Geç yürüyüen pikin (17,5. dakika) sindirimi, bir NBD türevi içeren 72-96 kalintilarina karsilik gelen bir IL-1 ra peptidini düsündüren, 1145,9 m/z'lik bir kütleye sahip benzersiz bir peptidi vermistir. Peptidin MS/MS analizi, 93 pozisyonunda NBD türevli Iizin ile 72-96 kalintilarinakarsilik gelen amino asit dizisiyle tutarli fragmanlar üretmistir.Yukaridaki sonuçlara göre, IL-1ra'nin 93 pozisyonurdaki Iizini, bu deneyde kullanilan kosullaraltinda NBD-X ile türetilebilir. Bu sonuçlar, ayrica 93 pozisyonundaki Iizinin açiga çiktigini ve3037bozulmamis IL-lra proteininde çözücü ile erisilebilen bir kalinti oldugunu da ortayakoymaktadir.Örnek 4Fosfat, sitrat veya pirofosfat varliginda IL-1ra'nin agregasyon hizilL-l ra'nin agregasyon hizi, birkaç farkli tampon bilesiminde belirlenmistir. 10 ml'lik bir lL-1 ra stok çözeltisi (CSE içinde 220 mg/ml), 4 °C'de Pierce Snakeskin diyaliz tüpü (3,5 kDa cut-off) kullanilarak 2 x 4L'Iik 140 mM NaCl'ye karsi diyaliz edilmistir. Diyaliz edilmis lL-1 ra çözeltisinin üst fazlari, her bir örnekte 140 mg/ml'lik nihai bir IL-1 ra konsantrasyonu ile sonuçlanacak sekilde 0,45 M sitrat, 0,5 M fosfat veya 0,45 M pirofosfat stok çözeltileri (hepsi pH 6,5'de) ve uygun bir hacimde 140 mM NaCI eklenerek çesitli sitrat, fosfat veya pirofosfat konsantrasyonlarina getirilmistir. Her örnekte nihai sitrat, fosfat veya pirofosfatkonsantrasyonu 1 ila 125 mM arasindadir.Her bir örnekte lL-1ra'nin agregasyonu, yukarida Örnek 2'de tarif edildigi gibi 29 °C'de bir dakikalik araliklarla 405 nm'deki isik saçilmasi ölçülerek, 4 saat boyunca izlenmistir. Agregasyon hizi, SoftMax Pro programi (Molecular Devices) kullanilarak hesaplanan doyma egrisinin dogrusal bölgesinin egimi olarak belirlenmistir. Sekil 3, bu deneyde, IL-1 ra'nin agregasyon hizinin sitrat, fosfat veya pirofosfatin artan konsantrasyonlari ile azaldigini göstermektedir. Özellikle, IL-1ra'nin sitrat veya pirofosfat tamponundaki agregasyon hizi,fosfat tamponundaki agregasyon hizindan daha hizli düsmüstür.Fosfat üzerindeki üç iyonlasabilir hidrojenin tahmini pKa`si, pH 6,5 ve 39 °C'de 2,148, 7,198 ve 12,35'tir. Sitrat üzerindeki üç iyonlasabilir hidrojenin tahmini pKa'si, pH 6,5 ve 39 °C'de 3,128, 4,761 ve 6,396'dir. Pirofosfat üzerinde dört iyonize edilebilir hidrojenin tahmini pKa'si, pH 6,5 ve 39 °C'de 0,83, 2,26, 6,72 ve 9,46'dir. Bakiniz, örnegin,Goldberg vd., Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data, 31(2):231-370 (2002). Buna göre, yukarida tartisilan literatürde bildirilen pKa'lara görehesaplandigi gibi fosfatin pH 6,5 ve 39 °C'de baskin olarak bir negatif yüke sahip oldugu3038tahmin edilirken, sitratin pH 6,5 ve 39 °C'de üç negatif yüke sahip oldugu ve pirofosfatin pH6,5 ve 39 °C'de iki ila üç negatif yüke sahip oldugu tahmin edilmektedir.Bu nedenle, bu sonuçlar birden çok yüklü anyonlarin IL-1 ra'nin agregasyon hizini belirli bir pH'ta tek yüklü anyonlardan daha etkili bir sekilde azaltabilecegini göstermektedir. Bu sonuca uygun olarak, tek yüklü bir anyon olan NaCl`nin fosfat ile benzer bir agregasyon hiziprofiline sahip oldugu bulunmustur (veriler gösterilmemistir).Örnek 5Sükroz, gliserol veya sorbîtol varliginda lL-1 ra'nin agregasyon hiziIL-l ra'nin agregasyon hizi, birkaç farkli sekerin varliginda belirlenmistir. 10 ml'lik bir lL-1 ra stok çözeltisi (CSE içinde 220 mg/ml), 4 °C'de Pierce Snakeskin diyaliz tüpü (3,5 kDa cut-off) kullanilarak 2 x 4L'Iik 140 mM NaCI'ye karsi diyaliz edilmistir. Diyaliz edilmis IL-1 ra çözeltisinin üst fazlari, her bir örnekte 140 mg/ml'lik nihai bir IL-1 ra konsantrasyonu ile sonuçlanacak sekilde %25 sükroz, %25 gliserol veya %25 sorbitol stok çözeltileri ve uygun bir hacimde 140 mM NaCI eklenerek çesitli sükroz, gliserol veya sorbitol konsantrasyonlarina getirilmistir. Her örnekte son konsantrasyondaki sükroz, gliserol veya sorbîtol %0, %1, %2 veya %3'tür. Agregasyon hizi, her bir IL-1 ra çözeltisinin optik yogunlugunun, Örnek 2'de tarif edilen yöntem kullanilarak, 39 °C'de ölçülmesiyle belirlenmistir. Sekil 4, bu deneyde, artan seker konsantrasyonlarinin lL-l ra'nin agregasyon hizlarinin azalmasiyla sonuçlandigini göstermektedir. %0 Sekerde, bu deneydeki IL-1ra'nin agregasyonu hizi yaklasik 22 agregasyon birimi (au, 405 nm'de dakikada mili-optik yogunluktaki artis olarak ölçülür) olmustur. %3 Sükroz, gliserol veya sorbitolde, IL-1 ra'nin agregasyonu hizi 0 ile 5 au arasindaazalmistir.Örnek 6lI.-1 ra'nin üre ve guanidinium hidroklorür ile uyarilan açilmasi3039IL-1 ra'nin üre-uyarimli açilma dengesi asagidaki gibi gerçeklestirilmistir. Uzak UV dairesel dikroizm çalismalari için, 0,86 mg/ml lL-1 ra'nin 1-1,5 ml örnekleri ve çesitli üre konsantrasyonlari (yaklasik 0 ila 10 M arasinda) isiktan korunmak için folyoya sarilmis ve gece boyunca oda sicakliginda inkübe edilmistir ( 12 saat). Daha sonra 230 nm'deki dairesel dikroizm, 23 °C'de her bir numune için belirlenmistir. Sekil 9, bu deney için çesitli üre konsantrasyonlarinda inkübe edilen IL-1ra için 230 nm'de dairesel dikroizm sinyalini göstermektedir. Veriler grafige geçirilmis ve açilma egrisi 3-durumlu bir modele uydurulmustur: dogal durum <- ara durum <- açilmis durum. Bu modelde, ilk geçisin egimi olan mi ve ilk geçisin orta noktasi olan C m1 kisitlanmistir. Bu parametreler kisitlanmistir, çünkü uzak UV CD'si dogal ve ara durumlar arasinda ayrim yapamaz. m1 ve 0111 için kisitli degerler, dogal durumu ara durumdan ayirabilen birkaç floresan ölçümünün degerlerinin ortalamasi alinarak elde edilmistir. Sekil 9'da gösterildigi gibi, IL-lra, bu deneyde yaklasik 4ila 6 M üre arasinda küresel bir açilma geçisine ugramistir.Floresan çalismalari için, 0,86 mg/ml lL-1 ra'nin 1-1,5 ml örnekleri ve çesitli üre konsantrasyonlari (yaklasik 0 ila 10 M arasinda) isiktan korunmak için folyoya sarilmis ve gece boyunca oda sicakliginda inkübe edilmistir ( 12 saat ). Sekil 10, çesitli üre konsantrasyonlarinda inkübe edilen lL-1 ra'nin 353 nm'deki intrinsik floresanini göstermektedir. Veriler grafige geçirilmis ve açilma egrisi, yukarida tartisilan 3-durum modeline uydurulmustur. Bu deneyde hiçbir kisitlama uygulanmamistir. Sekil 10'da gösterildigi gibi floresan deneyi 0 ile yaklasik 1,5 M üre arasinda bir açilma geçisinin varligini göstermektedir. Uzak UV CD deneyinde bu geçis gözlenmediginden; bu, dogal olana benzer bir ikincil yapiya sahip bir ara durum birikimini yansitabilir. Bu ara durum, yapiya daha fazla lokal degisikligi, ör. yüzey ilmeklerinin destabilizasyonunu içerebilirken, IL-1 ra'nin hidrofobikçekirdegi büyük ölçüde bozulmadan kalabilir.Guanidinium hidroklorür (GuHCI) ile uyarilan denge açilmasi asagidaki gibi gerçeklestirilmistir. Uzak UV dairesel dikroizm çalismalari için, 0,86 mg/ml IL-1 ra'nin 1-1,5 ml örnekleri ve çesitli GuHCI konsantrasyonlari (yaklasik 0 ila 5 M arasinda) isiktan korunmak için folyoya sarilmis ve gece boyunca oda sicakliginda inkübe edilmistir ( 12 saat ). Daha sonra 230 nm'deki dairesel dikroizm, 23 °C'de her bir örnek için belirlenmistir. Sekil 11, çesitlikonsantrasyonlardaki GuHCl'de inkübe edilmis IL-lra için 230 nm'de dairesel dikroizm3040sinyalini göstermektedir. Veriler grafige geçirilmis ve açilma egrisi 3-durumlu bir modele uydurulmustur: dogal durum <- ara durum <- açilmis durum. Bu modelde, dogal durum taban çizgisinin egimi olan m1, Cmi, "ns" ve ara durum taban çizgisinin egimi olan "is" kisitlanmistir. GuHCI ile uyarilan açilma için m1 ve le'in kisitli degerleri, büyük ölçüde üre ile uyarilan açilma için yukarida tarif edildigi gibi belirlenmistir. "NS" ve "is" sifirdan büyük olacak sekilde kisitlanmistir. Bu parametreler kisitlanmistir, çünkü uzak UV CD'si dogal ve ara durumlar arasinda ayrim yapamaz. Sekil 11'de gösterildigi gibi, lL-1 ra bu deneyde yaklasik 1ila 2 M GuHCI arasinda küresel bir açilma geçisine ugramistir.Floresan çalismalari için, 0,86 mg/ml IL-1 ra'nin 1-1,5 ml örnekleri ve çesitli GuHCl konsantrasyonlari (yaklasik 0 ila 5 M arasinda) isiktan korunmak için folyoya sarilmis ve gece boyunca oda sicakliginda inkübe edilmistir ( 12 saat ). Sekil 12, çesitli üre konsantrasyonlarinda inkübe edilen IL-1 ra'nin 353 nm'deki intrinsik floresanini göstermektedir. Veriler grafige geçirilmis ve açilma egrisi, yukarida tartisilan 3-durum modeline uydurulmustur. Bu deneyde hiçbir kisitlama uygulanmamistir. Sekil 12, çesitli GuHCI konsantrasyonlarinda inkübe edilen lL-1ra'nin 353 nm'deki intrinsik floresani göstermektedir. Veriler grafige geçirilmis ve açilma egrisi, yukarida tartisilan 3-durum modeline uydurulmustur. Bu deneyde hiçbir kisitlama uygulanmamistir. Sekil 12'de gösterildigi gibi, floresan verileri yaklasik 0 ila 0,6 M GuHCI arasinda bir açilma geçisinin varligini göstermektedir. Uzak UV CD deneyinde bu geçis gözlenmediginden; bu, dogal olana benzer bir ikincil yapiya sahip bir ara durum birikimini yansitabilir. Bu ara durum, yapida daha fazla lokal degisiklik içerebilirken ve/veya yüzey ilmeklerinin destabilizasyonunuiçerirken, IL-lra'nin hidrofobik çekirdegi büyük ölçüde bozulmadan kalabilir.Üre ile uyarilan açilma ve GuHCI`nin neden oldugu açilmanin floresan verileri arasindaki fark,iki denatüranin IL-1ra'nin intrinsik floresani üzerindeki farkli etkilerinden kaynaklanabilir.Ayrica, her denatüran için CD verileri ve floresan verileri arasindaki fark, triptofan intrinsik floresanin protein tersiyer yapisindaki lokal degisiklikleri saptama yetenegine bagli olabilir,diger taraftan CD, protein sekonder yapisindaki degisiklikleri tespit eder.3041Örnek 7lL-1ra'nin metil asetil fosfat (MAP) ile türetilmesiBazi düzenlemelerde metil asetil fosfat (MAP), lizin kalintilarini ve polipeptidlerin N-ucu aminlerini asetile eder. MAP, Kluger vd. (1980) J. Org. Chem., 45: 2723 belgesinde tarifedildigi gibi hazirlanmistir. Ürünün kimligi NMR ve kütle spektrometresi ile dogrulanmistir.IL-1 ra, asagidaki gibi sitrat veya fosfat varliginda MAP ile türevlendirilmistir. Sitrat varligindaki türetme için, 20 iil MAP (su içinde 10 mM stok) ve 20 pl IL-l ra (CSE içinde 10 mM stok), bir HPLC viali içindeki 160 pl'lik 10 mM sitrata pH 6,5'de ilave edilmistir. Reaksiyon 37 °C'de inkübe edilmis ve 25 ul'lik üst fazlar O, 45, 90, 135, 180, 225 ve 270. dakikada bir HPLC otomatik örnekleyici kullanilarak alinmistir. Her bir üst faz, bir Jüpiter 5u C4 300A ters fazli HPLC kolonu (4,6 x 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA), bir 0n-Iine UV detektörü ve bir sicaklik kontrollü 100'Iü örnek tepsisi ile donatilan bir Agilent 110 HPLC kullanilarak ters fazli HPLC ile 37 °C'de analiz edilmistir. Akis hizi 1 mI/dak'ya ayarlanmis ve kolon 50 °C'Iik bir sicaklikta tutulmustur. Kolon 15 dakika boyunca (1 mI/dak'lik akis hizi) %65 tampon A (su içinde %0,1 trifloroasetik asit (TFA)) ve %35 tampon B (su içinde %90 asetonitril, %0,1 TFA) ile önceden dengelenmistir. Yüklemeden sonra, analitler 25 dakika zarfinda %35 ila %50'Iikartan oranda tampon B (%90 asetonitril, %0,1 TFA) kullanilarak yürütülmüstür.Fosfat varliginda türetme için, 20 iil MAP (su içinde 10 mM stok) ve 20 ul IL-1 ra (CSE içinde mM stok), bir HPLC vialindeki 160 ul'lik 10 mM fosfata pH 6,5'te eklenmistir. Reaksiyon 37 °C'de inkübe edilmis ve 25 ul'lik üst fazlar 0,45, 90, 135, 180,225 ve 270. dakikada bir HPLC otomatik örnekleyici kullanilarak alinmistir. Her bir üst faz, sitrat varliginda türetme içinyukarida tarif edildigi gibi ters faz HPLC ile analiz edilmistir. Sitratin varliginda türetmenin sonuçlari Sekil 13'te gösterilmistir. Fosfat varliginda türetmenin sonuçlari Sekil 14'te gösterilmistir. Her iki HPLC profili, bu deneyde MAP iletüretmeden kaynaklanan dört yeni, zayif bir sekilde ayrilan lL-1ra pikini açiga çikarmaktadir.lL-l ra, ayrica 10 mM pirofosfat varliginda pH 6,4'te MAP ile türetilmistir. 20 ul MAP (su3042içinde 10 mM stok) ve 20 ul IL-1 ra (CSE içinde 10 mM stok), bir HPLC vialindeki 160 ul'lik 10 mM fosfata pH 6,4'te eklenmistir. Reaksiyon 37 °C'de inkübe edilmis ve 25 ul'lik üst fazlar 0, 45, 90, 135, 180, 225 ve 270. dakikada bir HPLC otomatik örnekleyici kullanilarak alinmistir. Her bir üst faz, sitrat varliginda türetme için yukarida tarif edildigi gibi ters faz HPLC ile analiz edilmistir. Sekil 15, sitrat varliginda, fosfat varliginda ve pirofosfat varliginda 4,5 saat (270 dakika) boyunca IL-lra'nin MAP ile türetilmesinin ters faz HPLC sonuçlarinin üst üse bindirilmesini göstermektedir. Bu deneyde zayif olarak ayrilmis dört pik tespit edilmis vebunlar Sekil 15`te gösterilmistir.Sekil 15'te gösterilen sitrat varliginda 270. dakikadaki zaman noktasindan elde edilen piklerin her biri, asagidakilerin her birinin kimligini belirlemek için analiz edilmistir. Dört ana pik yukarida tartisilan HPLC isleminden toplanmistir. Örnekler, bir SpeedVac üzerinde 5-10 ul'lik nihai hacme yogunlastirilmistir. Daha sonra her bir örnege doksan ul sindirim tamponu (50 mM tris, 0,8 M guanidinium-HCI, pH 8,0) eklenmis, ardindan 10 ul endoproteinaz Iys-C (10 ul sindirim tamponu içinde 1 ul) eklenmistir. Örnekler 16 saat 37 °C'de inkübe edilmistir. Elde edilen peptitler, bir Finnegan iyon kapani ile bir on-line MS saptamasi ile donatilmis bir Agilent 110 HPLC kullanilarak LC-MS/MS ile analiz edilmistir. Kullanilan HPLC kolonu, bir Jüpiter Su C18 100A ters fazli HPLC kolonudur (2 x 150 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Akis hizi dakikada 0,2 ml'ye ayarlanmis ve kolon 50 °C'lik bir sicaklikta tutulmustur. Kolon, 22 dakika boyunca %98 tampon A ((su içinde %O,1 TFA) ve %2 tampon B (su içinde %90 asetonitril, %0,1 TFA) ile önceden dengelenmistir. Yüklemeden sonra, analitler 50 dakika boyunca %2 ila %45'lik artan oranda tampon B kullanilarak HPLC kolonunda yürütülmüstür. HPLC kolonundan gelen elüentin yüzde onu MS analizine tabi tutulmustur. Bir peptit üzerinde ek bir asetil grubunun varligi, modifiye edilmemis peptide göre MS profilinde 42 m/z'li'k bir artisa neden olmustur. Tespit edilen peptitlerin ve modifiye edilen spesifik aminoasit kalintilarinin kimligi MS/MS ile dogrulanmistir.Pik 1'in IL-1 ra polipeptidi, sadece N-ucundaki aminde türetilmis gibi görünmektedir. Pik 2'nin IL-1 ra polipeptidi, N-ucundaki aminde ve Iizin-6'da türetilmistir. Pik 3'ün IL-1ra polipeptidinin, N-ucundaki aminde, Iizin-Glda ve Iizin-93'de türetildigi görülmüstür. Son olarak, pik 4'ün IL-1 ra polipeptidinin, N-ucundaki aminde, lizin-6'da, Iizin-93'te ve Iizin-96'datüretildigi görülmüstür.3043N-ucundaki amin hariç tüm konumlarda sitrat veya pirofosfat varligindaki türetme seviyesinin, fosfat varligindakine göre daha fazla oldugu görülmüstür. Bu sonuçlar, sitrat ve/veya pirofosfatin, IL-1ra'daki pozitif yüklü Iizin gruplarini, fosfat ile türetilmeye kiyasla MAP ile türetilmeye karsi daha iyi koruyabildigini göstermektedir. Bu sonuçlar, sitrat ve/veya pirofosfatin, pozitif yüklü Iizin kalintilari için fosfattan daha güçlü bir afiniteye sahip oldugunudüsündürebilir.IL-1 ra'nin MAP ile türetme orani, sitrat varliginda IL-1 ra'nin türetilmesi için Sekil 13'te gösterilen veriler kullanilarak (ve Sekil 16A'da yeniden üretilmistir) belirlenmistir. Özellikle, Sekil 16A'daki her bir kromatogram, PeakFit TM (Systat Software Inc.) kullanilarak açilmistir. Daha sonra her zaman noktasinda (0, 45, 90, 135, 180, 225 ve 270 dakika) açilan piklerin (pik 1-4) her birinin altindaki alan birlestirilmistir. Bir zaman noktasi için örnek bir açilmis profil Sekil 16B'de gösterilmistir. Açilmis pik 1-4, Sekil 168'de etiketlenmis ve her birinin altindaki integral alan asagida gösterilmistir. Pik 1, 160.28590'lik bir integral alana sahip olmustur. Pik 2, 190.41964'lik bir integral alana sahip olmustur. Pik 3, 181.76548'lik bir integral alana sahip olmustur. Pik 4, 178.18844'Iik bir integral alana sahip olmustur. Daha sonra 0, 45, 90, 135, 180. dakikadaki zaman noktalarinda açilmis olan pik 4'ün entegre alani, bu piki meydana getiren reaksiyonun inkübasyon zamanina karsi grafige geçirilmistir. Bu grafik, Sekil 16C'degösterilmistir. Elde edilen dogrunun egimi 68,931 saat '1 olmustur.IL-1 ra'nin MAP ile türetme orani, çesitli tamponlar ve çesitli pH'larda, yukarida tartisilan yöntemlere göre çesitli deneyler için hesaplanmistir. Çesitli oranlar daha sonra Sekil 17'de gösterilen bir çubuk grafik üzerinde gösterilmistir. Spesifik olarak, MAP ile IL-1 ra'nin türetilme orani, 10 mM fosfat varliginda pH 6,3'te; 10 mM sitrat varliginda pH 6,3'te; 10 mM pirofosfat varliginda pH 6,3'te; 10 mM fosfat varliginda pH 6,5'te; 20 mM fosfat varliginda pH 6,5'te; 10 mM sitrat varliginda pH 6,5'te; 20 mM sitrat varliginda pH 6,5'te; 10 mM pirofosfat varliginda pH 6,5'te; 20 mM pirofosfat varliginda pH 6,5'te; 10 mM fosfat varliginda pH 6,7'de; 10 mM sitrat varliginda pH 6,7'de; ve 10 mM pirofosfat varliginda pH 6,7'debelirlenmistir.3044IL-1 ra'nin MAP ile türevlendirilmesi orani, her pH'ta, sitrat veya pirofosfat tamponunda fosfat tamponunda oldugundan daha yavas olmustur. Sekil 17'ye bakiniz. Ayrica, 20 mM sitrat veya pirofosfat varliginda türetme orani, 10 mM sitrat veya pirofosfat varliginda türetme hizindan daha yavas olmustur. Bu sonuçlar, fosfata kiyasla sitrat ve/veya pirofosfatin, lL-1ra'nin Iizin kalintilarini MAP ile türetmeden daha etkili bir sekilde koruyabildigini göstermektedir. Dolayisiyla, lL-l ra'nin MAP ile türetilmesi orani, sitrattamponu veya pirofosfat tamponu varliginda fosfat tamponunun varligindan daha yavastir.Son olarak, IL-lra da yukarida tartisilan yöntemlere göre 5,5 saat boyunca 10 mM sitrat varliginda pH 6,3, pH 6,5 veya pH 6,7'de MAP ile veya 10 mM fosfat varliginda pH 6,3, pH 6,5 veya pH 6,7'de türetilmistir. Sekil 18, bu tamponlarin her birinin varliginda 5,5 saat boyunca IL-1 ra'nin MAP ile türetilmesine ait ters faz HPLC sonuçlarinin üst üste bindirilmesini göstermektedir. Bu sekil, IL-1ra'nin test edilen tüm pH seviyelerinde sitrat varligina kiyasla fosfat varliginda daha fazla türetildigini göstermektedir. Bu sonuçlar, fosfata kiyasla sitratin lL-lra'nin lizin kalintilarini MAP ile türetilmeden daha etkili bir sekilde koruyabildiginigöstermektedir.Sekil 18'de gösterilen veriler, lL-1 ra'nin, pH arttikça büyük ölçüde türetildigini degöstermektedir.Örnek 8Çesitli konsantrasyonlarda fosfat varliginda lL-1 ra'nin agregasyonu10 ml IL-1ra stogu (CSE içinde 220 mg/ml), pH 6,5'te toplam 8 L'lik (her biri 2L'lik üç tampon degisikligi ile 2L) 10 mM fosfat, 100 mM NaCl'ye karsi 4 °C'de 48 saat diyalize edilmistir. IL- lra konsantrasyonu, pH 6,5'te 10 mM fosfat, 100 mM NaCI ile 167 mg/ml'ye ayarlanmistir. Uygun miktarda sodyum fosfatin pH 6,5'te 10 mM fosfat, 100 mM NaCI içine çözünmesiyle 1 M'Iik bir fosfat stogu hazirlanmistir. pH 6,5'teki 20 mM, 60 mM, 110 mM, 210 mM, 310 mM, 410 mM, 510 mM, 610 mM, 710 mM, 810 mM, 910 mM ve 1 M'Iik fosfatli çalisma stok çözeltileri 1M stoktan, pH 6,5'teki 10 mM fosfat, 100 mM NaCI ile seyreltilerekhazirlanmistir.3045Çesitli fosfat konsantrasyonlarinda IL-1 ra'nin agregasyonu, 96 kuyucuklu bir cam plaka (Zissner) ve bir sicaklik kontrollü plaka okuma spektrofotometresi, SpectraMax Plus (Molecular Devices) kullanilarak ölçülmüstür. Her bir kuyucuga 167 mg/ml Il-1ra stok çözeltisinin yüz seksen mikrolitresi eklenmistir. Daha sonra, her kuyuya 20 ul fosfatli bir çalisma stok çözeltisi ilave edilmistir (oyuk basina bir çalisma stogu). Kuyucuklardaki son fosfat konsantrasyonu O mM, 2 mM, 6 mM, 11 mM, 21 mM, 31 mM, 41 mM, 51 mM, 61 mM, 71 mM, 81 mM, 91 mM, 100 mM olmustur. Plaka, spektrofotometrede 39 °C'de inkübe edilmis ve optik yogunluk, her 1 dakikada bir 405 nm'de ölçülmüstür. Sekil 19, bu deney için her fosfat konsantrasyonu için zamanin bir fonksiyonu olarak grafige geçirilen, 405 nm'deki optik yogunlugu göstermektedir. Sekil 19'daki veriler, IL-lra'nin agregasyonunun, artanfosfat konsantrasyonu ile azaldigini göstermektedir.Örnek 9lL-1 ra'ya sitratin baglanmasinin ölçülmesiAsagidaki gibi sitrat iyonu baglama yerlerinin sayisi ve IL-1 ra baglanan sitratin Kd'si belirlenmistir. 1 ml'lik 1 mM IL-1ra çözeltileri, uygun tamponlar içinde IL-1 ra stogunu (CSE içinde 220 mg/ml) seyreltmek suretiyle, pH 6,5'te çesitli sitrat konsantrasyonlarina sahip tamponlar içinde hazirlanmistir. Spesifik olarak, pH 6,5'te 5 mM, 10 mM ve 20 mM sitratin her birinde 1 ml'lik 1 mM lL-l ra çözeltileri hazirlanmistir. Her bir çözelti ayrica 70 mM NaCl içerir. Bir Microsep "" -10 döndürme kolonuna (Pall Corporation; kolon basina bir çözelti) her çözeltiden dört yüz mikrolitre konmustur. Kolonlar, 35 dakika boyunca 4000 xg'de 18 °C'de döndürülmüstür. Döndürüldükten sonra IL-1 ra filtre edilmeyen kisimda kalir, sitratin bir kismina baglanir, diger taraftan baglanmamis sitrat içeren tamponun bir kismi filtreden süzüntü olarak geçer. Döndürüldükten sonra, çözeltinin yaklasik yarisi filtreden süzüntüolarak geçirilmistir.Filtre edilmeyen kisim ve süzüntünün her birindeki sitrat miktari asagidaki gibi belirlenmistir. ul Süzüntü veya filtre edilmeyen kisim, bir ters fazli HPLC kolonu (Supelcosil 'M LC-18 kolonu, 15 cm x 4,6 mm, Sigma-Aldrich kat. No 58985) üzerine yüklenmistir. Çalismatamponu (izokratik elüsyon) olarak 0,1 M fosforik asit ile akis hizi dakikada 1 ml olmustur.3046Elüsyon oda sicakliginda gerçeklestirilmistir. Kolondan yürütülen sitrik asit miktari 215 nm'de ölçülmüstür. Test edilen numunedeki sitrat konsantrasyonu (filtre edilmeyen kisim veya süzüntü) 0 ölçümden hesaplanmistir (sistem 0-10 mM sitrat çözeltisi standartlari ile pH 6,5'tekalibre edilmistir).Sekil 20, IL-l ra'ya sitrat konsantrasyonunun (filtre edilmeyen kisim içinde sitrat konsantrasyonu eksi süzüntü içindeki sitrat konsantrasyonu olarak belirlenen) çözelti içindeki toplam sitrat konsantrasyonuna karsi bir grafigini göstermektedir. Bagli sitratin maksimum konsantrasyonu, BmakS verilerden 1,8218 mM olarak ekstrapole edilmistir. Sekil 20 ile ilgili veriler, IL-1 ra'ya baglanan sitratin Kd'sinî belirlemek amaciyla bir Scatchard çizimi olusturmak için kullanilmistir. Kd bu deney için 3,846 mM olarak hesaplanmistir (veriler gösterilmemistir). Bundan baska, IL-lra üzerinde sitrat için baglanma yerlerinin sayisi Scatchard çizimindeki x-kesisiminden belirlenmistir. Bu deney için baglanma yerlerinin sayisi 0,94 olmustur (veriler gösterilmemistir). Bu veriler, lL-1ra'da bir sitrat baglanma yerioldugunu göstermektedir.Örnek 10lL-1 ra anyon baglanma yeri için rekabetlL-lra'daki sitrat baglanma yeri için pirofosfat ile rekabet asagidaki sekilde belirlenmistir. pH 6,5'te 1 mM IL-lra, 10 mM sitrat, 70 mM NaCI ve bir pirofosfat test konsantrasyonunu içeren dört yüz mikrolitrelik bir çözelti bir Microsepm' -10 döndürme kolonuna (Pall Corporation) yerlestirilmis ve 18 oC'de 35 dakika 4000 xg'de döndürülmüstür. Test edilen pirofosfat konsantrasyonlari, O mM, 5 mM, 10 mM ve 20 mM olmustur. Döndürme isleminden sonra, çözeltinin yaklasik yarisi filtreden süzüntü olarak geçirilirken, kalan çözelti filtrenin üzerinde filtre edilmeyen kisim olarak kalmistir. IL-1 ra, sitrat ve/veya pirofosfatin bir kismina baglanan filtre edilmeyen kisimda kalir, diger taraftan baglanmamis sitrat ve pirofosfat içeren tamponun bir kismi filtreden süzüntü olarak geçecektir. Hem filtre edilmeyen kisimda hem de filtratta sitrat konsantrasyonu, yukarida Örnek 9'da tartisildigi gibi belirlenmistir. Fosfatin IL-1 ra üzerinde sitrat baglanma bölgesi için rekabeti, pirofosfat için yukarida tarifedildigi gibi belirlenmistir.47Sekil 21, IL-1 ra tarafindan baglanan sitrat konsantrasyonunun, rekabetçi anyonun toplam konsantrasyonunun (pirofosfat veya fosfat) çözeltideki toplam sitrat konsantrasyonuna oranina karsi bir grafigini göstermektedir. Veriler, pirofosfatin, IL-lra üzerindeki sitrat baglanma yeri için sitratla rekabet etmekte fosfattan daha etkili oldugunu göstermektedir. Hem pirofosfat hem de fosfat, lL-lra baglanma yeri için rekabet edebilecek gibi göründügünden (yani bu yer sitrat için spesifik degildir), anyon baglanma yeri olarak IL-1 rayeri üzerinde sitratin baglanmasindan bahsederiz.Sekil 21'de gösterilen verilerden, IL-1 ra üzerindeki anyon baglama yerine pirofosfatin baglanmasi için Kd asagidaki hesaplamalar kullanilarak belirlenmistir. Bakiniz, örneginStinson ve Holbrook, Biochem. J. (1973) 131: 719-728. Sitrat ve pirofosfat baglanmasi arasindakirekabet iki ayri denklem olarak ifade edilebilir:Burada P = protein, bu durumda IL-1 ra'dir; L = Iigand, bu durumda sitrattir; ve X = rekabetçi anyan, bu durumda pirofosfattir. KdL, proteine baglanan Iigand için Kd'dir ve P (serbest protein) konsantrasyonu çarpi L (serbest Iigand) konsantrasyonu, bölü PL (Iiganda baglanan protein) konsantrasyonuna esittir. Kdx, proteine baglanan rekabetçi anyonun Kd'sidir ve P (serbest protein) konsantrasyonu çarpi X (serbest rekabetçi anyon) konsantrasyonu, bölü PX(rekabetçi anyona baglanan protein) konsantrasyonuna esittir.Sitratin görünen ya da gözlemlenen Kd'si (KdLap) asagidaki gibi ifade edilebilir:(Lser )[(P5er)+(Px)1Kd a = L 9 (PL)Burada Lserbest, serbest Iigandin (sitrat) konsantrasyonu, Pserbest serbest proteinin (IL-1 ra)3048konsantrasyonu, PX rekabetçi anyona (pirofosfat) baglanan proteinin konsantrasyonu ve PL Iiganda baglanan proteinin konsantrasyonudur. (PX) teriminin yukarida gösterilen denge denkleminden türetilen (Xserbest) (Pserbest))/Kdx ile degistirilmesi ile KdLap asagidaki ifadeye indirgenebilir:KdLap = KdL[1+(X !KdxnSETBöylece, Kd Lap, Xserbest'e karsi grafige geçirilirse, y-kesisimi KdL'ye esit olacaktir ve egim KGl L/Kdx'ye esit olacaktir. Yeniden düzenlendiginde, Kdx, egime bölünen y-kesisimine esitolacaktir.Sitrat için KdLap, rekabetçi anyonun her konsantrasyonunda, serbest proteinin (IL-1 ra) konsantrasyonu çarpi serbest ligandin (sitrat) konsantrasyonu, bölü bagli ligandin (IL-lra'ya baglanan sitrat) konsantrasyonu olarak hesaplanir. Serbest proteinin konsantrasyonu, örnek içindeki toplam protein konsantrasyonu eksi bagli proteinin konsantrasyonu (bu da bagli ligandin konsantrasyonuna esittir) olarak hesaplanir. X serbest veya serbest rekabetçi anyonun konsantrasyonu, rekabetçi anyonun toplam konsantrasyonu arttikça (yani IL-1ra'nin anyon baglama yerlerinde sitrat, rekabetçi anyonla degistirildikçe), rekabetçi anyonun toplam konsantrasyonu eksi bagli Iigandin (IL-1 ra'ya baglanan sitrat) konsantrasyonundaki degisimeesit olur. Diger bir deyisle,Xtop amiginda Xser= X - A XbagiitopSekil 22, Sekil 20'den gelen veriler ve yukarida ele alinan hesaplamalar kullanilarak hesaplandigi üzere, serbest pirofosfat miktarina karsi sitrat için KdLap'in bir grafigini göstermektedir. Pirofosfat için Kdx bu deney için 2,994 mM olarak hesaplanmistir. Yukarida belirtildigi gibi y-kesisimi, sitratin Kd'si olan KdL'ye esit olmalidir. Bu deneyde, KdL 3,894 mM olmustur, bu da Örnek 9`da açiklandigi gibi IL-l ra'ya baglanan sitrat için Kd'nin öncekideneysel tespiti, 3,846 ile uyumludur.Benzer bir grafik (veriler gösterilmemistir) Sekil 21'de gösterilen fosfat verileri için çizilmistir.49Bu deneyde, fosfat için Kdx'nin 12,641 mM oldugu hesaplanmistir. Bu deney için grafigin y-kesismesinden belirlenen (veriler gösterilmemistir) sitrat için K dL 4,996 mM olmustur.Bu veriler, sitrat ve pirofosfatin lL-1 ra'nin anyon baglama yeri için daha düsük KdS'ye sahip oldugunu göstermektedir. Ayrica, anyon baglama yeri Için pirofosfat sitrattan biraz daha düsük bir Kd'ye sahip olabilir. Örnek 2 ve 4 'de gösterildigi gibi bu deneyde görülen daha düsük KdS, IL-1 ra agregasyonunu azaltmak için pirofosfat ve sitratin yüksek kabiliyeti ile baglantilidir.DIZI LISTESI<110 Raibekas, Andrei Kerwin, Bruce <120IL-1RA AGREGASYONUNUN AZALTILMASINA YÖNELIK YÖNTEMLER <130 06843.0093-00304<150 &SO/558,879<151 2004-04-02<150 60/559,161<151 2004-04-02<150 60/601,216<151 2004-08-12<150 60/601,229<151 2004-08-12<160 6<170 Patentln sürüm 3.3<210 1<211 600<212 DNA<213 Homo sapiens<400 1<2102<211177 <212PRT<213 Homo sapiens<400 2 <2103<211152 <212PRT<213 Homo sapiens<400 3Arg Pro Ser G`Iy Arg Lys Ser' Ser Lys Met Gîn Aîa Phe Arg I`Ie TrpAsp Vaî Asn G`In Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gîn Leu Va] A1aGîy Tyr Lsu Gîn Gîy Pro Asn 231 Asn Leu Glu G1u Lys Iîe Asp Va] TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

ISTEMLER
1. 5qu bir çözeltide agrege olan bir interlökin-l reseptör antagonistinin (lL-lra) agregasyonunun azaltilmasi veya bir IL-1ra'nin agregasyon hizinin azaltilmasi için bir yöntem olup, özelligi; yöntemin IL-lra'yi içeren sulu çözeltinin sulu çözeltideki IL- 1ra'nin agregasyonunu azaltmak için veya agregasyon hizini azaltmak için yeterli bir konsantrasyonda en az bir yardimci molekül ile inkübe edilmesi yoluyla, sulu bir çözeltideki IL-1 ra'nin agregasyonunu azaltmayi veya agregasyon hizini azaltmayi içermesi, en az bir yardimci molekülden en az birinin 20 °C ila 45 °C arasinda agregasyonu azaltmada etkili olmasi ve yüzde 1 ila 3 araligindaki bir konsantrasyonda bulunan bir sekerden ve birden fazla yük tasiyan bir anyondan seçilmesidir. Istem 1'e göre yöntem olup, özelligi; en az bir yardimci molekülün birden çok yük tasiyan bir anyon olmasidir. Istem 2'ye göre yöntem olup, özelligi; söz konusu birden çok yük tasiyan anyonun 1 ila 20 mM pirofosfat olmasidir. Istem 2'ye göre yöntem olup, özelligi; söz konusu birden çok yük tasiyan anyonun 1 ila 20 mM sitrat olmasidir. Istem 1'e göre yöntem olup, özelligi; en az bir yardimci molekülün bir seker olmasidir. Istem S'e göre yöntem olup, özelligi; söz konusu sekerin gliserol, sorbitol veya sükroz olmasidir. Bir interlökin-l reseptör antagonisti ilaç formülasyonunun hazirlanmasi için bir yöntem olup, özelligi; IL-lra'yi içeren 5qu çözeltinin sulu çözeltideki IL-1ra'nin agregasyonunu azaltmak için veya agregasyon hizini azaltmak için yeterli bir konsantrasyonda en az bir yardimci molekül ile inkübe edilmesi yoluyla, sulu bir çözeltideki agrege olan bir interlökin-l reseptör antagonistinin (IL-lra) agregasyonunu azaltmayi veya bir IL-1ra'nin agregasyon hizini azaltmayi içermesi, en az bir yardimci molekülden en az birinin 20 °C ila 45 °C arasinda agregasyonu azaltmada etkili olmasi ve yüzde 1 ila 3 araligindaki bir konsantrasyonda bulunan bir sekerden ve birden fazla yük tasiyan bir anyondan seçilmesi, agregasyonun azaltilmasidir. istem 7'ye göre yöntem olup, özelligi; en az bir yardimci molekülün birden çok yük tasiyan bir anyon olmasidir. Istem 8'e göre yöntem olup, özelligi; söz konusu birden çok yük tasiyan anyonun 1 ila 20 mM pirofosfat olmasidir. istem 8'e göre yöntem olup, özelligi; söz konusu birden çok yük tasiyan anyonun 1 ila 20 mM sitrat olmasidir. istem 7'ye göre yöntem olup, özelligi; en az bir yardimci molekülün bir seker olmasidir. Istem 11'e göre yöntem olup, özelligi; söz konusu sekerin gliserol, sorbitol veya sükroz olmasidir.
TR2018/16556T 2004-04-02 2005-04-01 Il-1ra agregasyonunun azaltilmasina yöneli̇k yöntemler TR201816556T4 (tr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55887904P 2004-04-02 2004-04-02
US55916104P 2004-04-02 2004-04-02
US60121604P 2004-08-12 2004-08-12
US60122904P 2004-08-12 2004-08-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201816556T4 true TR201816556T4 (tr) 2018-11-21

Family

ID=34964860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/16556T TR201816556T4 (tr) 2004-04-02 2005-04-01 Il-1ra agregasyonunun azaltilmasina yöneli̇k yöntemler

Country Status (17)

Country Link
US (3) US7619066B2 (tr)
EP (1) EP1729810B1 (tr)
JP (3) JP2007531738A (tr)
AU (1) AU2005231822B2 (tr)
CA (1) CA2557910C (tr)
CY (1) CY1120831T1 (tr)
DK (1) DK1729810T3 (tr)
ES (1) ES2694252T3 (tr)
HR (1) HRP20181848T1 (tr)
HU (1) HUE040595T2 (tr)
LT (1) LT1729810T (tr)
PL (1) PL1729810T3 (tr)
PT (1) PT1729810T (tr)
RS (1) RS57852B1 (tr)
SI (1) SI1729810T1 (tr)
TR (1) TR201816556T4 (tr)
WO (1) WO2005097195A2 (tr)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2557785A1 (en) * 2004-03-09 2005-10-06 Merck & Co. Inc. Hiv integrase inhibitors
AU2005231822B2 (en) * 2004-04-02 2011-07-21 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Methods of reducing aggregation of IL-1ra
WO2009025763A2 (en) * 2007-08-16 2009-02-26 Schepens Eye Research Institute Therapeutic compositions for treatment of inflammation of ocular and adnexal tissues
CN101690801B (zh) * 2009-10-26 2012-08-01 上海交通大学 白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物
CA2806438C (en) 2010-07-29 2021-04-13 Eleven Biotherapeutics, Inc. Chimeric il-1 receptor type i agonists and antagonists
ES2582928T3 (es) * 2011-02-11 2016-09-16 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Composiciones farmacéuticas exentas de citrato que comprenden anakinra
MX2013010171A (es) 2011-03-14 2013-11-20 Serodus Asa Antagonistas del receptor de interleucina-1.
SG10201606218WA (en) * 2011-07-29 2016-09-29 Eleven Biotherapeutics Inc Purified Proteins
CA2869674A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Alkermes, Inc. Fusion polypeptides comprising an active protein linked to a mucin-domain polypeptide
KR102236926B1 (ko) * 2013-03-13 2021-04-06 세센 바이오, 아이엔씨. 안구 운반을 위한 키메릭 사이토카인 제제
US20160129112A1 (en) * 2013-05-28 2016-05-12 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical Compositions Comprising Pyrophosphate
CA2983783A1 (en) * 2015-04-28 2016-11-03 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Compositions comprising anakinra
EP3551650A4 (en) * 2016-12-07 2020-07-08 The University of Florida Research Foundation Incorporated IL-1RA ADNC

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4226846A (en) * 1977-04-01 1980-10-07 New England Nuclear Corporation Albumin microaggregates for radioactive scanning of reticuloendothelial systems
EP0569687B1 (en) 1984-05-18 2002-08-21 New England Medical Center Hospitals, Inc. Human IL-1 cDNA sequences encoding biologically-active human IL-1 proteins
US4935343A (en) * 1986-08-08 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Monoclonal antibodies for interleukin-1β
US5359032A (en) 1987-08-26 1994-10-25 Biogen Inc. Interkeukin-1 inhibitor
WO1989004838A1 (en) * 1987-11-25 1989-06-01 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US4968607A (en) * 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US5296592A (en) 1987-11-25 1994-03-22 Immunex Corporation Process for purifying interleukin-1 receptors
US6511665B1 (en) * 1987-11-25 2003-01-28 Immunex Corporation Antibodies to interleukin-1 receptors
US5319071A (en) 1987-11-25 1994-06-07 Immunex Corporation Soluble interleukin-1 receptors
US5081228A (en) * 1988-02-25 1992-01-14 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
US6159460A (en) * 1988-05-27 2000-12-12 Amgen Inc. Method for treating interleukin-1 mediated diseases
CA2010321C (en) 1989-02-21 2004-04-06 Thomas F. Tedder Lymphocyte-associated cell surface protein
BR9007883A (pt) 1989-11-29 1992-09-29 Synergen Inc Producao de inibidor de interleucina-1 humana recombinante
WO1992011359A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education A truncated interleukin-1 receptor gene for the treatment of arthritis
US5980954A (en) 1992-02-07 1999-11-09 Vasogen Ireland Limited Treatment of autoimmune diseases
US5591457A (en) 1992-02-07 1997-01-07 Vasogen Inc Method of inhibiting the aggregation of blood platelets and stimulating the immune systems of a human
HU219445B (hu) * 1992-09-17 2001-04-28 Amgen Inc. Interleukin-1 inhibitorokat tartalmazó, stabil gyógyszerkészítmények és eljárás előállításukra
US6242417B1 (en) * 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
US5756466A (en) * 1994-06-17 1998-05-26 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5580856A (en) * 1994-07-15 1996-12-03 Prestrelski; Steven J. Formulation of a reconstituted protein, and method and kit for the production thereof
PE64396A1 (es) 1995-01-23 1997-01-28 Hoffmann La Roche Proteina accesoria del receptor de la interleucina 1
EP0904112B1 (en) * 1996-02-09 2009-11-18 Amgen Inc., Composition comprising il-1ra as interleukin-1 inhibitor and hyaluronan as controlled release polymer
US6096728A (en) * 1996-02-09 2000-08-01 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
US6416753B1 (en) 1996-03-15 2002-07-09 The General Hospital Corporation Method for modulating apoptosis
AU7011696A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Soluble interleukin-1 receptor accessory molecule
US5780431A (en) 1996-09-20 1998-07-14 Neurobiological Technologies, Inc. Pharmaceutical formulations of corticotropin releasing factor having improved stability in liquid form
US6054559A (en) 1997-01-28 2000-04-25 Smithkline Beecham Corporation Interleukin-1 receptor antagonist beta (IL-1raβ)
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
US6541623B1 (en) 1998-04-03 2003-04-01 Hyseq, Inc. Interleukin—1 receptor antagonist and uses thereof
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU2915801A (en) 1999-09-07 2001-05-10 Colorado State University Research Foundation In vivo treatment of joint disease using interleukin-1 receptor antagonists
JP2003509378A (ja) 1999-09-14 2003-03-11 ファイザー・プロダクツ・インク ＩＬ−１ｒａとＩＬ−１プロセシング・放出阻害化合物の併用療法
US6323311B1 (en) * 1999-09-22 2001-11-27 University Of Utah Research Foundation Synthesis of insulin derivatives
CN1245216C (zh) 1999-10-04 2006-03-15 希龙公司 稳定化的含多肽的液体药物组合物
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
RU2003125640A (ru) * 2001-02-06 2005-03-10 Мерк Патент ГмбХ (DE) Модифицированный антагонист рецептора интерлейкина 1 (1l-1ra) с уменьшенной иммуногенностью
US7572770B2 (en) * 2002-06-27 2009-08-11 University Of Zurich Use of an interleukin 1 receptor antagonist and/or pyrrolidinedithiocarbamate for the treatment or prophylaxis of type 2 diabetes
PL377091A1 (pl) 2002-09-06 2006-01-23 Amgen, Inc. Ludzkie monoklonalne przeciwciało przeciw-IL-1R1, o właściwościach terapeutycznych
EP1592440A4 (en) * 2003-02-10 2007-07-11 Elan Pharm Inc IMMUNOGLOBULIN PREPARATION AND METHOD OF PRODUCING THE SAME
WO2005019259A2 (en) * 2003-08-25 2005-03-03 Compugen Ltd. Variants of interleukin-1 receptor antagonist: compositions and uses thereof
AU2005231822B2 (en) * 2004-04-02 2011-07-21 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Methods of reducing aggregation of IL-1ra

Also Published As

Publication number Publication date
US10765747B2 (en) 2020-09-08
AU2005231822B2 (en) 2011-07-21
JP2007531738A (ja) 2007-11-08
RS57852B1 (sr) 2018-12-31
PT1729810T (pt) 2018-11-22
EP1729810A2 (en) 2006-12-13
US20050271618A1 (en) 2005-12-08
AU2005231822A1 (en) 2005-10-20
WO2005097195A2 (en) 2005-10-20
JP6041843B2 (ja) 2016-12-14
US20210121571A1 (en) 2021-04-29
US20070098684A9 (en) 2007-05-03
CA2557910A1 (en) 2005-10-20
JP2015078195A (ja) 2015-04-23
JP2013136588A (ja) 2013-07-11
PL1729810T3 (pl) 2019-02-28
CY1120831T1 (el) 2019-12-11
LT1729810T (lt) 2018-11-26
HUE040595T2 (hu) 2019-03-28
WO2005097195A3 (en) 2006-08-03
US7619066B2 (en) 2009-11-17
HRP20181848T1 (hr) 2018-12-28
CA2557910C (en) 2012-05-29
SI1729810T1 (sl) 2018-12-31
US20050282752A1 (en) 2005-12-22
JP6181375B2 (ja) 2017-08-16
DK1729810T3 (en) 2018-12-03
ES2694252T3 (es) 2018-12-19
EP1729810B1 (en) 2018-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210121571A1 (en) Methods of reducing aggregation of il-1ra
US12264185B2 (en) Stabilized BCL9 peptides for treatment of aberrant Wnt signaling
BRPI0911385B1 (pt) Polipeptídeo isolado, polipeptídeo de fusão, multímero e composição farmacêutica
EA021425B1 (ru) Мутанты fgf21 и их применение
CN106459218A (zh) 新的重组双功能融合蛋白、其制剂和用途
JP7671739B2 (ja) 治療用融合タンパク質
EP3558342B1 (en) Medical use of interferon-lambda for the treatment of fibrosis
JP2018529729A (ja) 胆汁酸障害の処置
CN110092837A (zh) Uti融合蛋白
US20170096670A1 (en) Dna aptamers specific to cd200r1 and their therapeutic uses
KR20030077950A (ko) 생리활성 복합체
HK1100528A (en) Methods of reducing aggregation of il-1ra
HK1100528B (en) Methods of reducing aggregation of il-1ra
MXPA06010352A (es) Metodos para reducir la agregacion del antagonista del receptor de interleucina 1
RU2837724C2 (ru) Способ комбинаторной терапии при лечении миелопролиферативных новообразований конъюгатом дифтерийного токсина с интерлейкином-3 человека в комбинации с другими агентами
HK40081275B (zh) Il-17ra融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用