TARIFNAME HIZLI TUTULUM IÇIN INSÜLIN FORMÜLASYONLARI Bulus enjekte edilebilir hizli etkili ilaç verme insülin formülasyonlarinin genel alanindadir. ÖNCEKI TEKNIK Diyabete genel bakis Glukoz enerji üretmek ve yasami desteklemek için vücudun tüm hücrelerinin kullandigi basit bir sekerdir. Insanlar hayatta kalabilmek için kanlarinda her zaman minimum seviyede glukoza ihtiyaç duyarlar. Vücudun kan glukozu üretmesinin ilk yolu besinin sindirilmesidir. Kisi bu glukozu besinin sindirilmesiyle elde etmiyorsa, glukoz dokudaki depolardan üretilir ve karacigerden salinir. Vücudun glukoz seviyelerini insülin düzenler. Insülin pankreasin dogal olarak salgiladigi bir peptit hormonudur. Insülin hayati derecede önemli bir enerji kaynagini saglamak için glukozun Vücut hücrelerine girmesine yardimci olur. Saglikli bir birey yemege basladiginda, pankreas birinci-faz insülin salinimi denilen dogal bir insülin artisi salar. Yiyecegin sindirimiyle kana giren glukozu islemek için yeterince insülin saglamaya ek olarak, birinci-faz insülin salinimi yiyecegin sindirimi gerçeklesirken glukoz yapmayi durdurmak için karacigere bir sinyal görevi görür. Karaciger glukoz üretmedigi ve sindirimle glukozu islemek için yeterince ek insülin oldugu için, saglikli bireylerin kan glukozu seviyeleri nispeten sabit kalir ve kan glukozu seviyeleri çok yüksek olmaz. Diyabet anormal sekilde yüksek seviyelerde kan glukozu ve yetersiz seviyelerde insülin ile karakterize edilen bir hastaliktir. Diyabetin baslica iki tipi vardir -Tip 1 ve Tip 2. Tip 1 diyabetinde, vücut hiç insülin üretmez. Tip 2 diyabetinin erken evresinde, pankreasin insülin üretmemesine ragmen, ya Vücut dogru zamanda insülin üretmez ya da Vücut hücreleri insülin direnci olarak bilinen bir durum olan, insülini görmezden gelir. Diger semptomlarin görülmesinden önce bile, Tip 2 diyabetinin ilk etkilerinden biri yiyecek kaynakli birinci-faz insülin saliniminin kaybidir Birinci-faz insülin saliniminin yoklugunda, karaciger glukoz yapmayi durdurmak için sinyalini almayacaktir. Sonuç olarak, vücudun yiyecegin sindirimiyle yeni glukoz üretmeye basladigi sirada karaciger glukoz üretmeye devani edecektir. Sonuç olarak, diyabet, hastalarinin kan glukozu seviyesi yemekten sonra çok yükselecektir, bu hiperglisemi olarak bilinen bir durumdur. Hiperglisemi glukozun dogal olmayan sekilde kandaki belirli proteinlere yapismasina neden olur, bu da proteinlerin küçük kan damarlarinin bütünlügünü korumak için normal islevini yerine getirme yetenegini engeller. Her yemekten sonra görülen hiperglisemi ile, küçük kan damarlari en sonunda parçalanir ve sizinti yapar. Hipergliseminin uzun vadeli yan etkileri körlügü, böbrek islevinin kaybini, sinir zedelenmesini ve duyu kaybini ve periferde zayif dolasimi, potansiyel olarak ekstremitelerde amputasyonu gerektirmeyi içerir. Yemekten sonra iki ve üç saat arasinda, tedavi edilmemis bir diyabetigin kan glukozu o kadar yükselir~ ki pankreas asiri büyük miktarda bir insülin salgilamasi için bir sinyal alir. Erken Tip 2 diyabetli bir hastada, pankreas hala cevap verebilir' ve bu büyük miktardaki insülini salgilar. Bununla birlikte, bu durum sindirimin neredeyse bittigi ve kan glukoz seviyelerinin düsmeye basladigi sirada olusur. Bu asiri büyük miktardaki insülinin iki zararli etkisi vardir. Birincisi, zaten kötü durumda olan pankreasin üzerine uygun olmayan sekilde asiri yüklenir, bu da pankreasin daha hizli sekilde kötülesmesine ve pankreasin insülin üretemez hale gelmesine yol açabilir. Ikincisi, sindirimden sonra çok fazla insülin hastalik durumunun daha da kötülestirebilen, kilo aliminda sebep olur. Diyabete Yönelik Güncel Tedaviler ve Bunlarin Kisitlamalari Tip 1 diyabetli hastalar hiç insülin üretmedikleri için, Tip 1 diyabeti için baslica tedavi günlük yogun insülin tedavisidir. Tip 2 (diyabetinin tedavisi tipik olarak diyet. ve egzersizin yönetimi ile baslar. Kisa vadede yardimci olmasina ragmen, yalnizca diyet ve egzersizle tedavi Tip 2 diyabetli hastalarin çok büyük bir çogunlugu için uzun vadede etkili bir Çözüm degildir. Diyet ve egzersiz artik yeterli olmadiginda, tedavi çesitli insülin-içermeyen oral ilaçlarla baslar. Bu oral ilaçlar pankreasin ürettigi insülin miktarini artirarak, insülin-duyarli hücrelerin duyarliligini artirarak, karacigerin glukoz çiktisini azaltarak ya da bu mekanizmalarin bazi kombinasyonuyla etki ederler. Bu tedaviler hastaligi etkili bir sekilde yönetme yetenekleri bakimindan kisitlidirlar ve genellikle kilo alimi ve hipertansiyon gibi, önemli yan etkileri vardir. Insülin-içermeyen tedavilerin kisitlamalarindan dolayi, Üüg) 2 diyabetli birçok hasta zaman içerisinde kötülesir ve sonunda Hßtabolizmalarini desteklemek için insülin tedavisine gereksinim duyarlar. Insülin tedavisi diyabeti tedavi etmek için 80 yili askin süredir kullanilmaktadir. Bu tedavi genellikle her gün birkaç enjeksiyon uygulamayi içerir. Bu enjeksiyonlar günde bir ya da iki defa uzun-etkili bazal enjeksiyonun ve yemek-saatinde hizli etkili bir enjeksiyonun uygulanmasindan olusmaktadir. Bu tedavi rejimi etkili olarak kabul edilse de, kisitlamalari vardir. Ilk olarak, hastalar ignelerin zorlugundan ve acisindan dolayi kendilerine insülin enjekte etmekten genellikle hoslanmazlar. Sonuç olarak, hastalar reçete edilen tedavi rejimlerine yeterince uymamaya neyillidir ve siklikla yanlis bir sekilde ilaçla tedavi edilirler. Daha önemlisi, dogru sekilde uygulandiginda bile, insülin enjeksiyonlari insülinin dogal zaman-etki profilini tekrarlamaz. Özellikle, diyabeti olmayan. bir kiside birinci- faz insülin saliniminin dogal artisi yiyecekten kana glukoz girdiginde birkaç dakika içinde kan insülin seviyelerinin artmasiyla sonuçlanir. Aksine, enjekte edilen insülin, insülin artis seviyelerinin regüler insan insülinin enjekte edilmesini takiben. 80 ila 100 dakika içinde meydana. gelmesiyle yavasça kana girer. Potansiyel bir çözüm yemek yemeden hemen önce diyabetik hastalarin damarina insülinin dogrudan enjeksiyonudur. Insülinin intravenöz enjeksiyonlarinin çalismalarinda, hastalar yemegi takiben 3 ila 6 saat boyunca kan glukozlarinin daha iyi bir kontrolünü sergilemislerdir. Bununla birlikte, çesitli medikal sebeplerden ötürü, her yemekten önce insülinin intravenöz enjeksiyonu pratik bir tedavi degildir. Insülin tedavilerindeki önemli gelismelerden biri insülin lispro (IL), insülin aspart (IA) ve insülin glulisin (IG) gibi, hizli-etkili insülin analoglarinin 1990'li yillarda tanitilmasiydi. Bununla birlikte, hizli-etkili insülin analoglariyla bile, insülin artis seviyeleri tipik olarak enjeksiyonu takiben 50 ila 90 dakika içinde olusur. Hizli- etkili insülin analoglari birinci-faz insülin salinimini yeterince taklit etmedigi için, insülin tedavisini kullanan diyabetli hastalar bir yemegin baslangicinda yetersiz insülin seviyelerine ve yemeklerin arasinda çok fazla insüline sahip olmaya devam ederler. Insülin verilmesindeki bu gecikme yemek baslangicindan sonra erken hiperglisemiyle sonuçlanabilir. Ayrica, yemekler arasinda asiri insülin hipoglisemi olarak bilinen anormal sekilde düsük kan glukozu seviyesi ile sonuçlanabilir. Hipoglisemi zihin keskinliginin kaybi, konfüzyon, hizli kalp atisi, açlik, terleme ve bayilma ile sonuçlanabilir. Çok düsük glukoz seviyelerinde, hipoglisemi bilinç kaybi, koma ve hatta ölümle sonuçlanabilir. Amerikan Diyabet Birligi ya da ADA'ya göre, insülin-kullanan diyabetik hastalar yilda bir defa ortalama 1.2 siddetli hipoglisemik olay yasamistir, bu olaylarin çogu hastalarin hastane acil servisine gitmesini gerektirmistir. Insülinin kana verilmesi süreci tüm glukoz kontrolünde önemli bir rol oynadigi için, hizli etkili insülin analoglarindan daha hizli bir sekilde kana ulasan enjekte edilebilir bir insülin insülinine önemli ihtiyaç vardir. Bu yüzden, gelismis stabiliteye ve etkinin hizli baslangicina sahip hizli etkili enjekte edilebilir insülin saglamak bulusun bir amacidir. BULUSUN ÖZETI Gelismis stabilite ve etkinin hizli baslangicina sahip enjekte edilebilir insülin bilesimleri burada açiklanmaktadir. Formülasyonlar subkütan, intradermal ya da intramüsküler uygulamaya yönelik olabilir. Tercih edilen düzenlemede, formülasyonlar subkütan enjeksiyon araciligiyla uygulanmaktadir. Formülasyonlar bir selatör ve çözünme ajani, ve tercihen ek yardimci maddeler ile kombinasyon halinde insülin içerir. Tercih. edilen düzenlemede, formülasyon insan insülinini, EDTA gibi bir çinko selatörünü ve sitrik asit gibi bir çözünme ajanini ve sodyum sitrat gibi bir tuzu içerir. Bu formülasyonlar subkütan enjeksiyon ile uygulandiginda hizli bir sekilde kan dolasiminin içine emilir. Örnekler pH'in fizyolojik pH'a artirilabilecegini ve yine de insülinin çözünmesini ve hizli tutulumünu elde edebilecegini göstermektedir. Bir düzenlemede, insülin steril bir flakonda bir kuru toz olarak saglanir. Bu su gibi, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi, ve tercihen EDTA gibi bir çinko selatörü ve/veya sitrik asit gibi bir çözünme ajanini içeren bir seyrelticiyle uygulamadan hemen önce ya da uygulama sirasinda karistirilir. Diger bir düzenlemede, genellikle yaklasik 4 pH'da olan, insülin, çözülmeden sonra kullanima hazir olan, dondurulmus bir karisim halinde saklanir. Tercih edilen düzenlemede, insülin 4°C'de saklanan, pH 7'de bir sulu çözelti olarak saglanir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1 çiplak. yüzey yüklerini gösteren ve yükü maskelemek için uygun boyuttaki moleküllerle ("çözünme ve selatlama ajanlari") üst üste bindirilmis insülinin üç boyutlu bir sematigidir. Sekil. 2 bir verici odacigindan 12 bir 0.1 Inikron filtre 16 üzerinde ölümsüzlestirilmis oral epitel hücrelerin 14 4-5 katmanlari araciligiyla bir alici odaciginin 18 içine insülin emilimini ölçmek için kullanilan transwell cihazinin. 10 bir sematik diyagramidir. Sekil 3a ve 3b çözünme ajani olarak seçilen asitin bir islevi olarak, 0.45 mg EDTA/ml ile ya da olmaksizin, Sekil 2'nin transwell sistemindeki oral epitel hücreler araciligiyla in vitro insülin iletimini (mikroünite cinsinden kümülatif insülin) karsilastiran grafiklerdir. EDTA. 0.45 mg/mL'de sabitken asit konsantrasyonlari asagidaki gibi çesitlilik gösterdi: Sekil 3a, Aspartik asit (0.47 mg/mL), Glutamik asit (0.74 mg/mL), Süksinik asit (0.41 mg/mL), Adipik asit (0.73 mg/mL) ve Sitrik asit (0.29 mg/mL ve 0.56 mg/mL), pH araligi mg/mL) ve Oksalik asit (0.32 mg/mL), pH araligi 2-3. Iki zaman araligi (10 ve 30 dk) karsilastirmali analiz için seçildi. Bulgular ortalama arti ya da eksi standart hata ölçülüdür, Mol) konsantrasyonlarindaki asitler ile ya da olmaksizin, fakli çözünme ajanlarini karsilastiran, Sekil 2'de gösterilen transwell sisteminde oral epitel hücreler araciligiyla in vitro insülin iletiminin (mikroünite cinsinden kümülatif insülin) grafikleridir: Aspartik asit (0.20 mg/mL), Glutamik asit (0.22 mg/mL) ve sitrik asit (0.29mg/mL) (Sekil 4a) ve 1.80 mg/mL'de Citrik asit (Sekil 4b). Iki zaman araligi (10 ve dk) karsilastirmali analiz için seçildi. Sekil 5 farkli selatörlerin etkinligini karsilastirmak için Sekil 2'nin transwell sistemini kullanan oral epitel hücreler araciligiyla in vitro insülin iletiminin bir grafigidir. Sekil ölçülen (kümülatif insülin, mikromoller) oral epitel hücreler araciligiyla ayni molar konsantrasyonundaki (4.84x10"3 Mol) farkli selatörlere eklenen glutamik asit, sitrik asit ya da HCI içeren bir çözeltiden insülin (1 mg/mL) iletiminin bir grafigidir. Selatörler selatör (kontrol), EDTA, EGTA, DMSA, CDTA, ve TSC degildi. Sekil 6 IL (12 U) ve RHI'ye (12 U) kiyasla, ortalama glukoz infüzyon hizi (GIR)/kg olarak ölçülen, sitrik asit ve EDTA (12 U) ile hazirlanmis insülinin, insan denekleri üzerinde in Vivo farmakodinamik etkisinin bir grafigidir. Sekil 7 RHI'ye, zaman içindeki(dakika) insülin konsantrasyonu (mikroÜnite/ml), kiyasla, insanlarda sitrik asit ve EDTA ile hazirlanmis insülinin in vivo farmokinetik etkisinin grafigidir. Ortalama degerler (±SEM, n=lO). Insülin dozu 12 U/denek idi. Sekil 8 RHI ve IL'ye kiyasla, zaman içinde (dakika) kan glukozu (mg/dl) çizen; sitrik asit ve EDTA ile hazirlanmis insülinin 16 diyabetik tip 2 hastalarda in vivo farmakodinamigin grafigidir. Hasta deneyinde kullanilan dozaj mevcut insülin tedavilerine göre her hasta için, hastaya özel hazirlandi. RHI'nin sedimantasyon katsayilarinin bir grafigidir. CElOO-4'ün sedimantasyon katsayilarinin bir grafigidir. RHI'nin sedimantasyon katsayilari için yükleme konsantrasyonuna normalize edilen c(s) dagilimlarinin bir grafigidir. lL'nin sedimantasyon katsayilari için yükleme konsantrasyonun normalize edilmis c(s) dagilimlarinin bir grafigidir. normalize edilmis c(s) dagilimlarinin bir grafigidir. CE100-4'ün sedimantasyon katsayilari için yükleme konsantrasyonuna normalize edilen c(s) dagilimlarinin bir grafigidir. kontrol insülini pH 7'nin sedimantasyon katsayilari için yükleme konsantrasyonun normalize edilmis c(s) dagilimlarinin bir grafigidir. islevi olarak insülin ortalama partikül boyutunun (nm) bir grafigidir. Sekil 13 diyabetik minyatür domuzda zaman içinde (dakika) ELISA ile insülin konsantrasyonunun (uünite/ml)bir grafigidir. BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Burada açiklanan enjekte edilebilir insan insülinin insülin formülasyonlari yemekten hemen önce ya da yemegin sonunda uygulanmaktadir. Tercih edilen düzenlemede, formülasyon rekombinant insan insülinini genellikle FDA tarafindan güvenli olarak görülen belirli içeriklerle birlestirir. Formülasyon halihazirda pazarlanan hizli-etkili insülin analoglarindan daha hizli kana emilmek için tasarlanmistir. Insülin formülasyonunun önemli özelliklerinden biri insülinin alti molekül, ya da heksamerik, insülin formundan insülinin monomerik ya da dimerik formuna ayrismasina, ya da ayrilmasina, olanak saglamasi ve heksamerik forma tekrar- birlesmesini engellemesidir. Monomerik ya da dimerik formu destekleyerek, bu formülasyonun insülin arzu edilen biyolojik etkilerini üretmek için Vücudun içine emilmeden Önce insan Vücudu insülinin tek bir molekülün formunda olmasina gerek duydugunda insülinin kana daha hizli verilmesine olanak sagladigi düsünülmektedir. Enjeksiyon için satilan çogu insan insülini heksamerik formdadir. Bu durum insülin heksameri dimerler ve sonrasinda monomerler olusturmak için ilk önce ayrismak zorunda oldugu için, Vücut için emilimi daha zor hale Burada kullanildigi sekliyle, "insülin", aksi belirtilmedikçe, insan ya da insan-disi, rekombinant, saflastirilmis ya da sentetik insülin ya da insülin analoglarini anlatmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle, "Insan insülini", bir dogal kaynaktan izole edilmis ya da genetik olarak degistirilmis mikroorganizmalar tarafindan yapilmis pankreasin salgiladigi insan peptit hormonudur. Burada kullanildigi sekliyle, "insan-disi insülini" insan insülini ile aynidir fakat domuz ya da inek gibi bir hayvan kaynagindandir. Burada kullanildigi sekliyle, bir insülin analogu, pankreasin salgiladigi insülinden farkli, fakat dogal insülinle ayni islevi gerçeklestirmek için Vücuda uygun olan degistirilmis bir insülindir. Altta yatan DNA'nin genetil mühendisligi araciligiyla, insülinin amino asit dizilisi ADME (emilim, dagilim, metabolizma, ve atilim) özelliklerini degistirmek için kullanilabilir. Örnekler insülin lispro, insülin glarjin, insülin aspart, ünsülin glulisin, insülin detemiri içerir. Insülin ayni zamanda, örnegin, asetilasyonla. kimyasal olarak degistirilebilir. Burada kullanildigi sekilde, insan insülini analoglari insan insülini ile ayni biyolojik etkiyi gerçeklestirebilen degistirilmis insan insülinidir. Burada kullanildigi sekliyle, bir "selatör" ya da "selatlama ajani", çinko iyonlarla. bir ya da daha fazla. bag olusturma yetenegine sahip olan bir kimyasal bilesigi anlatmaktadir. Baglar tipik olarak iyonik ya da koordinasyon baglaridir. Selatör inorganik ya da organik bir bilesik olabilir- Bir selat kompleksi metal iyonun selatlama ajaninin iki ya da daha çok atomuna baglandigi bir komplekstir. Burada kullanildigi sekliyle, "çözme ajani", bir çözücü içindeki materyallerin, örnegin, bir sulu çözelti içindeki insülin, çözünürlügünü artiran bir bilesiktir. Çözme ajanlarinin örnekleri surfaktanlari (TWEENS®); etanol gibi, çözücüyü; oksietilen monostearat gibi, misel olusturan bilesikleri; ve pH-düzenleyici ajanlari içerir. Burada kullanildigi sekliyle, bir "çözünme ajani", asagidaki örneklerde açiklanan epitel hücre transwell plaka tahlili kullanilarak ölçülen, insülin ve EDTA'ya eklendiginde, ayni pH'da HCI ve EDTA'ya göre insülinin iletimini ve emilimini artiran bir asit ya da tuzdur. HCI bir çözünme ajani degildir fakat bir çözme ajani olabilir. Sitrik asit ve sodyum sitrat bu tahlilde ölçüldügünde çözünme ajanlaridir. Buna en azindan kismen, bazilarinin heksamerden ayrismasi sirasinda açiga çiktigi insülin üzerindeki yüklerin maskelenmesi ile ulasildigini düsünülmektedir. Burada kullanildigi sekliyle, bir "yardimci madde", insülin için bir tasiyici olarak kullanilan ya da bir ürünün imal edildigi sürece yardimci olmak için kullanildigi bir selatör ya da çözünme ajani disinda bir inaktif maddedir. Bu gibi durumlarda, aktif madde bir yardimci madde ile çözünür ya da karistirilir. Burada kullanildigi sekliyle, bir "fizyolojik pH" 6.8 ve 7.6 arasinda, tercihen 7 ve 7.5 arasinda, en çok tercih. edilen sekilde yaklasik 7.4'tür. Burada kullanildigi sekliyle, VIAJECTTM bir sitrik asit ve EDTA gibi bir selatör gibi bir çözünme ajaniyla formüle edilmis bir rekombinant insan insülini için bir ticari markadir. Viaject U/mL (CE 25-4) 25 U/mL regüler rekombinant insan insülini, 1.8 mg/mL Sitrik asit, 1.8 mg/mL disodyuni EDTA, O.82% NACI (izotonisite) ve 3 mg/mL m-krezol içerir. Dondurulmus sekilde saklanan bir sulu çözelti olarak, ya da, en azindan birinin sitrik asit ve EDTA içerdigi kuru toz insülini ve seyrelticiden olusan iki parçali bir kit halinde saglanir. Hem sulandirilarak hazirlanmis karisimin hem de dondurulmus çözeltinin pH'i yaklasik olarak pH 4'tür. Vîaject lOOU/mL (CE 100-4) lOO U/mL regüler rekombinant insan insülini, 1.8 mg/mL sitrik asit, 1.8 mg/mL disodyuni EDTA, 22 mg/mL gliserin, 3 mg/mL m-krezol içerir. Bu ayni zamanda. ya dondurulmus bir sulu çözelti ya da kuru tozlu insülin ve seyrelticiden olusan iki parçali kit olarak saglanir. Sulandirilarak hazirlanmis karisimin ve dondurulmus çözeltinin her ikinin pH'i yaklisik olarak 4'tür. Viaject lOOU/mL (CE lOO-7) lOO U/mL regüler rekombinant insan insülini, 1.8 mg/mL sitrik asit, 1.8 mg/mL disodyum EDTA., 22 mg/mL gliserin, 3 mg/mL m-krezol içerir. Bu, 4°C'de saklanabilen yaklasik 7.4 pH'a sahip bir sulu çözelti olarak saglanir. Asit tuzlara sahip VIAject (CSE 100- 7) 1.8 mg/mL hem EDTA hem de trisodyum sitrati suya ekleyerek, sonrasinda lOOU/mL insülin ekleyerek, pH'i 6'ya düsürerek, sonra pH'i 7.4'e çikartarak yapilir. Formülasyonlar Formülasyonlar insülin, bir selatör ve bir çözünme ajan(lar)i ve, tercihen, bir ya da daha çok diger yardimci maddeleri içerir. Tercih edilen düzenlemede, formülasyonlar subkütan uygulamaya uygundur ve yagli subkütan dokunun içine hizli bir sekilde emilir. Çözünme ajani ve selatör tercihi, hem çözünme ajaninin hem de selatörün konsantrasyonu, ve formülasyonun ayarlandigi pH, hepsinin sistemin etkinligi üzerinde büyük etkisi vardir. Çogu kombinasyon etkinlige sahip olsa da, tercih. edilen düzenleme, güvenligi, stabiliteyi, düzenleyici profili, ve performansi içeren pek çok sebepten ötürü seçilmistir. Tercih edilen düzenlemede, formülasyon içeriklerinden en azindan biri aktif ajan üzerindeki yükleri maskelemek için seçilmistir. Bu insülinin transmembran iletimini ve kolaylastirabilir ve böylece hem etkinin baslangicini hem de insülin için biyoyararlanimi artirir. Içerikler ayrica sulu ortamda hizli bir sekilde çözünen bilesimler olusturmak için de seçilmistir. Tercihen insülin, etkinin hizli baslangiciyla (tercihen uygulamayi takiben yaklasik 5 dakika içinde baslayarak ve uygulamayi takiben yaklasik 15-30 dakikada artarak) sonuçlanacak sekilde hizla emilir ve plazmaya tasinir. EDTA. gibi, selatör, insülin çözeltisinden çinkoyu çikararak, insülinin içine çinkoyu selatlar. Bu durum insülinin dimerik ve monomerik formunu almasina sebep olur ve heksamer durumuna tekrar birlesmeyi geciktirir. Örneklerde açiklanan çalismalar ayrisan heksamerin tüm boyutunun çinko kompleks insülin heksamerinden daha büyük oldugunu, sonrasinda daha küçük üniteler olusturdugunu göstermektedir. Heksamerler, dimerler ve nmnomerler bir konsantrasyon-odakli dengede nevcut oldugu için, monomerler emildikçe, daha çok nwnomerler olusturulur. Bu yüzden, insülin monomerleri subkütan dokudan emildikçe, ek dimeler daha Çok monomer olusturmak için gizlenir. Tamamen ayrismis monomerik form, böylece insülin emiliminin hem hizini hem de Iniktarini önemli derecede artiran, heksamerik formun bir-alti molekül agirligindan daha az olan bir agirliga sahiptir. Selatör (EDTA gibi) ve/Veya çözünme ajaninin(sitrik asit gibi) insülinle hidrojen bagi olmasi durumunda, transmembran iletimini kolaylastirarak ve böylelikle hem etkinin baslangicini hem de insülin için biyoyararlanimi artirarak, insülin üzerindeki yükü maskeledigi düsünülmektedir. Insülin Insülin rekombinant ya (ka dogal bir kaynaktan saflastirilmis olabilir. Insülin insan ya da insan-disi olabilir. Insan tercih edilmektedir. En çok tercih edilen düzenlemede, insülin insan rekombinant insülinidir. Rekombinant insan insülini birçok kaynaktan temin edilebilir. Insülin ayni zamanda insan insülinin amino asit dizilisine dayanabilen fakat bir` ya da daha fazla amino asitler farkliliklarina, ya da kimyasal olarak degistirilmis bir insüline ya da insülin analoguna sahip olan bir insülin analogu olabilir. Insülinin dozajlari biyoyararlanimina ve tedavi edilecek hastaya baglidir. Insülin genellikle insan dozu basina 1.5-100 insülin 10 IU flakonlarda saglanir. Çözünme ajanlari Belirli asitlerin, ya da bunlarin tuzlarin, Sekil 1'de gösterildigi üzere, tutulumu ve iletimi artirarak, insülin üzerindeki yükleri maskeledigi görülür. Çözünme ajanlari olarak etkili olan bu asitler, asagidaki örneklerde açiklanan transwell tahlilinde ölçülen, hidroklorik aside kiyasla, asetik asit, askorbik asit, sitrik asit, glutamik, aspartik, süksinik, fumarik, maleik, ve adipik içerir. Örnegin, aktif ajan insülinse, tercih edilen bir çözünme ajani sitrik asittir. Hidroklorik asit. ve sodyuni hidroksit pH ayarlamasi için tercih edilen ajanlardir. HCI formülasyonlarin herhangi biriyle kombinasyon halinde kullanilabilir, fakat bir çözünme ajani degildir. Asitlerin tuzlari sodyum asetat, askorbat, sitrat, glutamat, aspartat, süksinat, fumarat, maleat, ve adipat içerir. Organik asitlerin tuzlari metal hidroksitler, metal oksitler, metal karbonatlar ve bikarbonatalar, metal aminlerin yani sira, amonyum klorür, amonyum. karbonat, Vb. gibi amonyum bazlarini içeren, fakat bununla sinirli olmayan, çesitli bazlar kullanilarak hazirlanabilir. Uygun metaller tek degerli ya da çok degerli metal iyonlari içerir. Örnekleyici metal iyonlari lityum, sodyum, ve potasyum gibi Grup I metalleri; baryum, magnezyum, kalsiyum, ve stronsiyum gibi, Grup II metalleri; ve alüminyuni gibi yari metalleri içerir. Çok degerli metal iyonlari birden fazla karboksilik asit grubunu içeren organik asitleri için arzu edilebilir olabilir çünkü bu iyonlar birden fazla karboksilik asit grubuna eszamanli olarak kompleks olusturabilir. Çözünme ajaninin araligi 9.37 x 10_4 M ila 9.37 X lOQM sitrik asit arasindaki insülin ve EDTA ile kombinasyon halinde olan etkili bir sitrik asit miktarina karsilik gelir. gelatörler Tercih edilen düzenlemede, çinko selatörü insülinle karistirilmistir. Selatör iyonik ya da non-iyonik olabilir. Uygun selatörler etilendiamintetraasetik asit (EDTA), EGTA, aljinik asit, alfa lipoik asit, dimerkaptosüksinik asit (DMSA), CDTA (l,2-diaminosikloheksantetraasetik asit), trisodyum sitrat (TSC) içerir. Hidroklorik asit pH'i ayarlamak için TSC ile birlikte kullanilir, ve islemde, bir çözünme ajani olan sitrik asidin olusumuna yol açar. Tercih edilen düzenlemede, selatör EDTA'dir. Selatör insülinden çinkoyu yakalar, böylelikle insülinin dimerik formunu heksamerik forma tercih eder ve uygulama alanini çevreleyen dokulardan (örnegin, mukoza, ya da yagli doku) insülinin emilimini kolaylastirir. Ek olarak, selatör hidrojeni aktif ajana baglanabilir, böylece insülin monomerlerinin yük maskelenmesine yardim eder ve insülin monomerlerinin transmembran iletimini kolaylastirir. Selatörün araligi 2.42 x 10_4 M ila 9.68 x lOQM EDTA arasindaki insülin ve sitrik asitle kombinasyon halinde olan etkili bir Yardimci maddeler Farmasötik bilesimler aktif bilesiklerin farmasötik olarak kullanilabilen preparatlara islenmesini kolaylastiran yardimci maddeleri ve yardimcilari içeren bir ya da daha fazla fizyolojik olarak kabul edilebilir tasiyicilari kullanan geleneksel bir sekilde formüle edilebilir. Ilaçlarin formülasyonu, örnegin, Remingtan'in Farmasötik Bilimleri, Mack Yayinevi, Easton, Penisilvanya(l975), ve Liberman, H.A. ve Lachman, L., Eds., Farmasötik Dozaj Sekilleri, Marcel Decker, New York, N.Y. (1980) kitaplarinda tartisilmistir. Tercih edilen düzenlemede, bir ya da daha fazla çözme ajani sulu ortamda hizli çözünmeyi artirmak için insülin ajaniyla yer alir. Uygun çözme ajanlari polisorbatlar, gliserin ve poloksamerler, non-iyonik ve iyonik surfaktanlar, gida asitleri ve bazlar (örnegin, sodyum bikarbonat), ve alkoller, ve pH kontrolü için tampon tuzlar gibi islatma ajanlarini Dengeleyiciler, örnek yoluyla, oksidatif tepkimeleri içeren ilaç ayrisim tepkimelerini önlemek ya da geciktirmek için kullanilir. Çok sayida dengeleyici kullanilabilir. Uygun10 dengeleyiciler selüloz ve selüloz türevleri gibi, polisakkaritleri; ve gliserol gibi, basit alkolleri; fenol, m- krezol ve metilparaben gibi bakteri önleyici ajanlari; sodyum klorür, gliserol, ve glukoz gibi, izotonik ajanlari; örnek dogal lesitinler (örnegin yumurta sarisi lesitin ya da soya fasulyesi lesitin) ve sentetik ya da yarisentetik lesintiler (örnegin, distearoil-fosfatidilserin, dipalmitoilfosfatidilserin ve diarakidoilfosfatidilserin; fosfatidilgliseroller; fosfatidilinozitoller; kardiolipinler; spingomyelinler gibi dimiristofilfosfatidilkolin, dipalmitoilfosfatidilkolin ya da distearoil-fosfatidilkolin; fosfatidikasitler; fosfatidiletanolaminler; fosfattidilserinler gibi lesitinleri içerir. Bir örnekte, dengeleyici gliserolün, bakteri önleyici ajanlarin ve izotonik ajanlarin bir kombinasyonu olabilir. Enjekte edilebilir formülasyon insülin, bir selatör, ve bir çözünme ajani içerir. Tercih edilen bir düzenlemede, enjekte edilebilir formülasyonlar insülin, EDTA, Sitrik asit, salin ve/Veya gliserin içerir. Bir düzenlemede, subkütan enjekte edilebilir formülasyon bir çözelti olusturmak ve çözeltiyi sterilize etmek ("seyreltici" olarak anilacaktir) için salini ve gliserini, sitrik asidi ve EDTA'yi karistirarak üretilmistir. Insülin bir çözelti olusturmak için steril bir suya ayri olarak eklenir, süzülür, ve çok sayida ayri steril enjeksiyon siselerinin her birine belirlenmis bir miktari yerlestirilir. Insülin çözeltisi bir toz olusturmak için dondurularak kurutulur ve stabilitesini korumak için seyrelticiden ayri bir sekilde saklanmalidir. Uygulamadan önce, seyreltici insülin enjeksiyon sisesine eklenir. Insülinin önceden belirlenmis bir miktari hastaya deri altindan enjekte edilir, geriye kalan insülin çözeltisi, tercihen sogutmayla, saklanabilir. Baska bir düzenlemede, insülin seyrelticiyle, pH 4, birlestirilir çok-kullanimli enjeksiyon flakonlarina ya da kartuslarina steril olarak süzülür ve kullanimdan Önce dondurulur. Tercih edilen bir düzenlemede, insülin, flakonlarda ya da kartuslarda, pH 7.0'da, bir sulu çözelti olarak hazirlanir ve 4°C'de tutulur. Formülasyonlar subkütan ya da intramüsküler enjeksiyon yoluyla uygulanabilir. Formülasyon hizlica emilmek ve sistemik iletim için plazmaya iletilmek için tasarlanmistir. Aktif ajan olarak insülin içeren formülasyonlar yemekten önce ya da sirasinda tip 1 ya da tip 2 diyabetik hastaya uygulanabilir. Hizli emilimden dolayi, bilesimler glikojenin karacigerdeki glukoza dönüsümünü durdurabilir, böylelikle hiperglisemi, diyabet komplikasyonlarinin ana nedeni ve tip 2 diyabetin ilk semptomu önlenebilir. Insan insülinin halihazirda temin edilebilen, standart, subkütan enjeksiyonlari arzu edilen etkiden daha azini saglamak için yemekten yaklasik yarim ila bir saat önce uygulanmalidir, çünkü insülin karacigerde glukozun üretimini durdurmak için yavas emilmektedir. Ek olarak, hastaligin ilerlemesinde eger yetersince erken verilirse, subkütan insülin bilesimleri tip 2 diyabetinin ilerlemesini yavaslatabilir ya da durdurabilir. Düsük pH formülasyonunun avantaji BYETTA® (eksenatid), SYMLIN® (pramlintid) asetat), ve LANTUS® (uzun etkili insülin analog) ile karistirilabilmesidir, bunlarin hiçbiri karismazlik ve çökelmeden dolayi piyasada mevcut olan diger türdeki insülinlerle karistirilamaz. Daha yüksek pH insülinin avantaji saklama sirasinda daha düsük pH'da olan insülinlerden daha stabil olmasidir. Mevcut bulus asagidaki sinirlayic-olmayan örneklere istinaden daha iyi anlasilaoaktir. Asagidaki insülinler örneklerde kullanildi. HUMULIN® (RHI) rekombinant insan insülinidir. Her mililitre 100 ünite regüler rekombinant insan insülini, 0.22% m-krezol, 1.4-1.8% gliserin, pH 7 içerir. Bu birçok. kaynaktan ticari olarak temin edilebilir. Eli Lilly (IL)'den HUMALOG®, insülin lispro enjeksiyon, insülin B-zinciri üzerinde 28 ve 29 konumlarinda olan amino asitler ters çevrildiginde olusan, bir Lys (B28), Pro(B29) insan insülin analogu olan bir rekombinant insan insülin analogudur. IL enjeksiyonunun her ndlilitresi insülin lispro mg metakrezol, 0.0197 mg çinko iyon saglamak için ayarlanmis çinko oksit içerigi, eser miktarda fenol, ve enjeksiyon için su içerir. Insülin lispro 7.0 ila 7.8 pH'a sahiptir. Hidroklorik asit 10% ve/Veya sodyum hidroksit 10% pH'i ayarlamak için eklenebilir. IL'nin bir ünitesi Regüler insan insülininin bir ünitesiyle ayni glukoz-düsürücü etkiye sahiptir, fakat etkisi daha hizlidir ve daha kisa sürelidir. NOVOLOG® (1A) Novo Nordisk A/S'den temin edilebilen bir rekombinant insülin analogudur. Bu analog B28 konumunda aspartik. asitle amino asit prolininin tek bir degistirimini içerir, ve rekombinant maya tarafindan üretilir. 100 Ünite insülin aspart/ml, 16 mg/ml gliserin, 1.50 mg fenol/ml, 1.72 mg metakrezol/ml, 19.6 mg çinko/ml, 1.25 mg disodyum hidrojen fosfat dihidrat/ml, 0.58 mg sodyum klorür/ml içeren, 7.2 ila 7.6 pH'a sahip olan, 10% HCI ya da NaOH ile ayarlanan bir steril, sulu çözeltide saglanir. VIAJECTTM sitrik asit ve EDTA ile formüle edilen bir rekombinant insan insülinidir. Viaject 25 U/mL (CE 25-4) 25 U/mL regüler rekombinant insan insülinleri, 1.8 mg/mL Sitrik asit, ve 3 mg/mL m-krezol içerir. Dondurulmus sekilde saklanan bir sulu çözelti olarak, ya da, en azindan birinin sitrik asit ve EDTA içerdigi kuru toz insülini ve seyrelticiden olusan iki parçali bir kit halinde saglanir. Hem sulandirilarak hazirlanmis karisimin hem de dondurulmus çözeltinin pH'i yaklasik olarak pH 4'tür. Sulandirilarak hazirlanmis toz örneklerde kullanilan seydir. Viaject lOOU/mL (CE 100-4) 100 U/mL regüler rekombinant insan insülini, 1.8 mg/mL sitrik asit, 1.8 mg/mL disodyum EDTA, 22 mg/mL gliserin, 3 mg/mL m-krezol içerir. Bu ayni zamanda ya dondurulmus bir sulu çözelti ya da kuru tozlu insülin ve seyrelticiden olusan iki parçali kit olarak saglanir. Sulandirilarak hazirlanmis karisimin ve dondurulmus çözeltinin her ikisinin pH'i yaklasik olarak 4'tür. Analitik santrifüj veriler ve malvernde yalnizca dondurulmus sulu çözelti kullanildi. Viaject 100 U/mL (CE 100-7) lOO U/mL regüler rekombinant insan insülini, 1.8 mg/mL sitrik asit, 1.8 mg/mL disodyum EDTA, 22 mg/mL gliserin, 3 mg/mL m-krezol içerir. Bu, 4°C'de saklanabilen yaklasik 7.4 pH'a sahip olan bir sulu çözelti olarak saglanir. Bu domuz çalismasinda kullanildi. Asit tuzlarina sahip olan VIAject (CSE 100-7) su içinde hem EDTA hem de trisodyum sitrat ile, lOOU/mL insülin ve gliserin (22 mg/mL) ile yapilir. Son pH sodyum hidroksitle 7.4'e ayarlanir. Bu malvern bilgisi için son örnekte kullanildi. Örnekler 1: Çözünme Ajaninin Bir islevi Olarak Epitel Hücre Transwell Tahlilini Kullanan Insülinin Tutulumunun ve Iletiminin In Nitro Karsilastirmasi Materyaller ve Metotlar Oral epitel hücreler, Sekil 2'de gösterildigi üzere çoklu (4-5 katman) hücre katmalari olusana kadar iki hafta boyunca transwell insertleri üzerinde büyütüldü. Iletim çalismalari verici kuyucuguna uygun çözeltileri ekleyerek ve 10 dakika sonra alici kuyucugundan numuneleri çikararak yürütüldü. Çözeltiler sudan, +/- EDTA'dan (0.45 mg/ml), NaCI'dan (0.85% w/V), l mg/ml insülinden ve pH'i 3.8'de tutmak için yeterli miktarda asitten olustu. Alici kuyucuklarindaki insülin miktari ELISA kullanilarak test edildi. Bulgular Sekil 3a ve 3b'de gösterilen bulgular epitel hücreler araciligiyla insülin tutulumunu ve iletimini artirmada bazi asitlerin daha etkili oldugunu göstermektedir. Bunlar kolayca test edilebilir ve HCI kullanilarak elde edilen bulgularla kiyaslanabilir, böylelikle test edilebilecek ya da bir çözünme ajani olarak saptanabilecek (yani, HCI'ye göre tutulumu ve iletimi artiran) ya da saptanmayacak herhangi bir aside karsi bir standart saglar. 3.2-3.8 araliginda pH'a sahip asitlerle elde edilen bulgular Sekil 3a'da gruplandirilmistir. Daha güçlü asitler (pH <3) Sekil 3b'de gruplandirilmistir. Bulgular ayni selatör konsantrasyonuna sahip olan asit tercihinin hücre kültürü yoluyla insülinin iletimi üzerinde önemli bir etkiye sahip oldugunu ortaya koymustur. Tercih edilen asit sitrik asittir. Örnek 2: Çözünme Ajaninin Konsantrasyonunun Bir Islevi Olarak Epitel Hücre Transwell Tahlilini Kullanan insülinin Tutulumunun ve Iletiminin In vitro Karsilastirmasi Meteryaller ve Metotlar Örnek l'in materyalleri ve metotlari reaktiflerin farkli konsantrasyonlari ile kullanildi. Çalismada, asidin ve selatörün esmolar konsantrasyonlari eklendi. Çözeltiler sudan, +/- EDTA'dan (0.56 mg/mL), NaCI'dan (O.85% w/V), 1 mg/mL insülinden ve asitten: Aspartik asit (0.20 mg/mL), Glutamik asit (0.22 mg/mL) ya da sitrik asit (0.20 mg/ml) olusur. Sitrik asit selatörle ve selatörsüz 1.8 mg/mL'lik daha yüksek bir konsantrasyonda test edildi. Bu veriler, hücre verici odaciklarinin dozlama sonrasi iki zaman araliginda, 10 ve 30 dakika, gösterilmistir. Bulgular Aspartik asit (0.20 mg/mL), Glutamik asit (0.22 mg/mL) ya da sitrik asitle (0.29 mg/ml) elde edilen bulgular Sekil 4a'da gösterilmektedir. Bu durumda, selatörün eklenmesiyle görülen önemli bir fark yoktu. Aksine, daha yüksek bir konsantrasyonda, 1.80 mg/mL'de, sitrik asit kullanan çalisma selatörün çözeltiye eklenmesi üzerine önemli bir artis (t-testi karsilastirmasi, tek tarafli) göstermistir. Bkz. Sekil 4b. Bu her iki bilesenin konsantrasyonunun tutulumu ve iletimi iyilestirmede önemli oldugunu göstermektedir. Örnek 3: Selatörün bir islevi olarak Epitel Hücre Transwell Tahlili kullanan Insülinin Tutulumu ve Iletiminin In vitro Karsilastirmasi Materyaller ve Metotlar Oral epitel hücreler çoklu (4-5) hücre katmanlari olusana kadar iki hafta boyunca transwell insertlerinin üzerinde büyütüldü. Iletim çalismalari verici kuyucuguna uygun çözeltileri ekleyerek ve 10, 20 ve 30 dakika sonra alicidan numuneler çikarilarak yürütüldü. Çözeltiler asagidaki sekilde transwell deneylerinden hemen önce hazirlandi: 1.8 Hg/ml'de sitrik asit 0.85% w/v salinle çözüldü ve sonrasinda asagidaki selatörlerden biri gösterilen konsantrasyonda bu Çözeltiye eklendi: ve 1.42 mg/ml'de EDTA. CDTA sivi formunda kullanildigi için, sitrik asit dogrudan CDTA'ya eklendi. Bu durumlarin her birinde, selatörün konsantrasyonu 4.84X10_3 molde sabitti. Insülin sonrasinda 1_ mg/ml'de eklendi ve gül gerekirse 3.8'e tekrar-ayarlandi. pH ayarlamasi için yalnizca HCI kullanan numunelerin bir kontrol seti karsilastirma için dahil edildi. Transwell deneyleri her bir çözeltinin 0.2 ml'si verici kuyucuklarina eklenerek yapildi. Alici kuyucuklarindaki insülin miktari ELISA kullanilarak test Bulgular dakika insülin verilerinin bir grafigi Sekil 5'te gösterilmektedir. TSC (trisodyum sitrat) ile elde edilen bulgularla kiyaslandigi zaman disinda, sitrik ;mi da glutamik asit kullanildiginda hücreler araciligiyla iletilen büyük ölçüde daha çok insülin *vardi. TSC durumunda, pH ayarlamasi için HCI kullanildi. pH'in ayarlanmasi, bu bulgulari açiklayacak sekilde sitrik asit olusturdu. Bu bulgularda gösterildigi üzere, tutulumun ve iletimin artirilmasi selatör tercihine baglidir. Örnek 4: Domuzda sitrik asit bazli insülin formülasyonunda selatörlerin preklinik degerlendirmesi Materyaller ve Metotlar Yayinli bir çalismayla ilgili olarak, A. Plum, H. Agerso ve L. Andersen. hizli-etkili insülin analogunun, insülin aspartin, siçanlarda, köpeklerde ve domuzlarda farmakokinetigi, ve domuzlarda insülin aspartin farmakodinamigi. Drug Metab. enjeksiyon alanindan daha yavas emilim anlamina geldigi için, eliminasyon yari ömrünün insülin emiliminin iyi bir belirleyici etkeni oldugu saptandi. Bu yüzden, bir minyatür domuz çalismasinin bir bölmesiz analizi PK ve PD parametrelerini, özellikle eliminasyon yari ömrünü incelemek için. gerçeklestirildi. Diyabetik. domuz insülinin dört formülasyonundan biriyle deri altindan enjekte edildi. Bu formülasyonlar bir selatörü (EDTA, EGTA ya da TSC) içerdi ve dördüncü kontrol yalnizca regüler insan insülinini RHI içerdi, hiç selatör yoktu. Sitrik asit (1.8 mg/ml) tüm selatör formülasyonlarinda asit olarak kullanildi, ve NaCi ve m-krezol tüm durumlarda izotinisite ve formülasyon sterilligi için eklendi. Selatörler 4.84X10_3 molün ayni molar konsantrasyonundaydi. Domuz bir gece aç birakildi, ve içeren insan ünsülini ya da içeren insan insülini deri altindan uygulandi. Yüksek dozla asiri kan glukozu düsürmeden dolayi dozlar azaltildi. Kan glukozu ve insülin seviyeleri tüm zaman noktalarinda, doz sonrasi 8 saate saptandi. Farmakokinetik modelleme, üniform. agirliklandirmayla bir bölmesiz model kullanan, Win Nonlin ile gerçeklestirildi. Eliminasyon yari ömürler Tablo 1'de karsilastirildi: Tablo 1: Selatörün Islevi olarak Domuzda Kan Glukozunun Karsilastirmasi Insülin +/-sd) Son yari ömür RHI/ Selatör yok, 120 Insülin/EDTA 39.1 +/-15.8 Insülin/EGTA 37.5 +/- 8.0 Insülin/TSC 30.1 +/- 9.0 Domuzda bu pilot çalismada regüler insan insülininin eliminasyon yari ömrü (120 dk) literatürde görülen ile tutarliydi ve verileri dogrulamak için ölçme noktasi olarak kullanildi. Bu sonraki intravenöz uygulamadan büyük ölçüde daha uzun oldugu için, bu enjeksiyonu takiben enjeksiyon alanindan devamli yavas emilim oldugunu dogrulamaktadir. Sitrik asit formülasyonundaki selatörler bu parametrede açikça bir azalma göstermistir, bu da bu üç selatörün, farkli derecelerde olsa da regüler insan insülininin emilimini artirmada etkili oldugunu göstermistir. Örnek 5: Insan klinik deneyinde EDTA-sitrik asit insülin formülasyonunun regüler insan insülinine karsilastirmasi. Materyaller ve Metotlar Bu çalismanin amaci sitrik asit ve EDTA, "CE 25-4" ile kombinasyon halinde insülin içeren bir test formülasyonunun farmakodinamik (PD) özelliklerini degerlendirmekti. Bes öglisemik glukoz-kelepçeleri (Biostator; hedef kan glukozu 90 mg/ml) lOaç birakilmis gönüllüde (ortalama yas 40 (20-62 yas araligi); VKI 22.5 (19.2-24.9) kg/HF) gerçeklestirildi. Bir sabit tedavi sirasiyla bir çapraz tasarini kullanarak, 12 IU Regüler insülin CE insülin formülasyonunun 12 IU'su karin bölgesine deri altindan enjekte edildi. Bulgular Bulgular Sekil 6 ve 7'de gösterilmektedir. CE 25-4'ün SC enjeksiyonu glukoz tüketim regüler insan insülininde büyük ölçüde daha hizli bir artis üreten bir zaman-etki profiliyle sonuçlandi. Ortalama farmakokinetik veriler PD bulgularini dogrulamaktadir (Sekil 7). Bu çalisma regüler insan insülinine sitrik asit ve EDTA'nin eklenmesinin maksimal konsantrasyona daha hizli bir zamanla (Sekil 7) ve regüler insan insüline kiyasla daha etkinin daha hizli bir baslangiciyla (Sekil 6) gösterildigi üzere insülinin emilim hizini gelistirmektedir. Örnek 6: Tip 1 Diyabetli Hastalarda Yemekten Hemen Önce Deri Altindan Enjekte Edildiginde CE Insülininin, Insülin Lispronun ve Regüler Insan Insülininin Farmakokinetigi ve Farmakodinamigi Arkaplan ve hedefler: Bu çalismanin amaci Tip 1 diyabetli hastalarda standart bir yemekten sonra tokluk kan glukozu (BG) ekskürsiyonlari üzerinde CE 25-4, RHI, ve IL'nin etkisini saptamakti. Materyaller ve Metotlar 9 hastanin BG'si (5 erkek ve 4 kadin; yas 40±lO yas, VKI 24.0±2.0 kg/m2) yemegin sindiriminden önce bir glukoz kelepçesi (hedef BG 120 mg/dl) araciligiyla stabillestirildi. Glukoz infüzyonu standart yemekten ve insülin dozlamadan önce kapatildi. Sabit tedavi sirasiyla bir çapraz Çalisma tasarimi kullanarak, VlAjectTM (CE25-4) IL ya da RHI'nin ayni hastaya özgü dozu Söyle ki yemekten hemen önce enjekte edildi. Sonrasinda, tokluk glukoz ekskürsiyonlari 8 saat boyunca devamli olarak kontrol edildi ve glukoz infüzyonu BG 60 mg/dl'den daha azsa tekrar baslatildi. Plazma insülin seviyeleri Çalisma boyunca saptandi. Bulgular Ortalama arti ya da eksi standart sapma olarak Tablo 2'de gösterilen bulgular yemekten sonra tir› 2 diyabetik hastalara deri altindan enjeksiyondan sonra insülin Tmax'i, regüler insan insülinini, insülin arti sitrik asidi ve EDTA (CE) ve lisproyu karsilastirmaktadir. Tablo 3'te gösterilen bulgular ayni test denekleri için kan glukozunu karsilastirmaktadir. Tablo 2: Insülin Tmax(dk)'nin Karsilastirmasi *p<.OOl, bagimli t-testi Tablo 3: Insülin Farmakokinetik Kan Glukozunun Karsilastirmasi (tablonun devami) *p<0.05, bagimli t-testi Enjeksiyon sonrasi 1 ila 8 saat hipoglisemik olaylarin toplam sayisi (glukoz infüzyonunu gerektiren saatler) RHI ile l3, IL ile ll ve CE 25-4 formülasyonu ile 4'tü. Bu sürede hipoglisemiyi önlemek için infüze edilen glukozun ortalama toplam miktari CE 25-4 ile oldugundan RHI için alti kat daha fazlaydi ve IL için iki fazlaydi. Grup basina tüm hastalar için toplanan normal glisemik hedef bölgesinin üzerindeki ve altindaki alanlar (BG AUC l40'in yukarisinda ve 80mg/dL'nin10 38,740 mg/dL*dk idi. Ortalama kan glukozu seviyeleri Sekil 8'de gösterilmektedir. CE 25-4 standart yemegi takiben kan glukozundaki artisi tersine çevirmekte en hizliydi. CE 25-4 ile tedavi edilen hastalar azalmis tokluk glukozu ekskürsiyonlari deneyimledi. Aksine, RHI en yüksek glukoz ekskürsiyonuna. sahipti, ki bu da daha düsük emilim. hiziyla tutarlidir. Glukoz seviyelerinin degiskenligi (maksimal minimum degerler arasindaki ortalama fark) CE 25-4 için IL'den büyük ölçüde azdi, bu da bu tip l diyabetli hastalarda CE 25- 4'ün daha iyi glisemik kontrolünü göstermektedir. Örnek 7: Isik Saçilimiyla Insülinlerin Boyutlarinin Karakterizasyonu CE 100-4 hastalarda çok hizli bir ekti baslangicina sahiptir. Hizli emilim profilinin temelini anlamak için, in vitro deneyler piyasada mevcut olan diger rekombinant insan insülinlerine ve hizli etkili insülin analoglarina kiyasla CE 100-4 ile gerçeklestirildi. Isik saçilimi teknikleri sentetik hücre disi akiskan tamponda bir seyreltme dizisinin yani sira orijinal ürünlere uygulandi. Sonuçlar regüler rekombinant insülinin ve hizli etkili analoglarin aksine, CE lOO-4'ün hizli emilini profiliyle tutarli olan, bir lz3 seyrelticiden sonra yaklasik olarak bir dimerinki kadar boyutunda azaldigini göstermektedir. Materyaller ve Metotlar Bu etkinin hizli baslangicinin mekanizmasini açikliga kavusturmak için, in vitro deneyler subkütan enjeksiyonu takiben dogal olarak olusan seyi taklit etmek için bir araç olarak bir sentetik hücre disi akiskan tamponda geleneksel formülasyonun seyrelticisinin etkisini çalismak için tasarlandi. Bir isik saçilim teknigi ortalama boyut dagilimini (nm) degerlendirmek için kullanildi. Bu in vitro deneylerinde karsilastirma için kullanilan ticari hizli etkili ya da prandiyal insülin formülasyonlari: IL, 1A, RHI ve CE lOO-4'tü. Boyut karsilastirmasi için, monomerik (pH 2.0) ve heksamerik çinko insülinlerinin (pH 7) standart preparasyonlari standartlar için kullanildi. Ticari insülinler Zetasizer nano (Malvern Inst, UK) ile boyut için karakterize edildi. Bir mL numuneleri cam küvete yerlestirildi ve çözeltideki insülinin bir ortalama volumetrik boyut dagilimini (nm) saptamak için analiz edildi. 3 numunenin ortalamasi (her numune birkaç çalismaya sahipti) karsilastirma için bir temel olarak kullanildi. Ilk tam mukavemet analizini takiben, bir seyreltici dizisi benzer pH'a ve hücre disi akiskanin tamponluk, kapasitesine (ECF, 0.7 mN Much, 1.2 mM CaCIz, 0.2 mM KCI, 0.5 mM NagKM,lO4 mM NaCI, 28.3 mM NaHCOý sahip olan tamponda l:2 ila 1:16 ile gerçeklestirildi. Ortalama boyut, her bir formülasyon için monomer/dimer/heksamer boyutunu anlamak için piyasada mevcut olan insülinlerin ve CE lOO-4'ün her biriyle tüm seyrelticiler için saptandi. Insülinler RHI, IL, IA, ve CE 100-4. Seyrelticiler Steril suda ECF, 0.7mM MgCIz,l,2mM CaCI2,2mM KH2P04,2mM KCI, Bulgular Boyut ölçüm çalismalarinda, seyreltilmemis CE lOO-4 IL, IA ve RHI'dan daha büyüktür. Bununla birlikte, bir l:3 seyrelticiyle, diger çalisilan insülinler yaklasik 5 nm heksamerik boyutta kalirken CE lOO-4'ün ortalama boyutu 2 nm ile monomerik/dimerik ;boyutai azaltildi. IL, 1A› ve RHI degil fakat CE 100-4 artirilmis seyrelticiyle daha da azaltildi. Seyreltilmemis RHI daha küçük görünür fakat lzl ile seyreltiginde 5 nm'den daha büyük boyuta büyür ve 1:16 oraninda bir seyreltiye bu boyut araliginda kalir. Seyreltilmemis CE 100-4, yüzey yükünü maskeleyerek subkütan alanlardan emilim hizini daha da artirmaya yarayabilecek, muhtemelen sitirk asit ve EDTA zayif bir sekilde yüzeye çekildigi için, çalisilan diger insülinlerden ilk basta daha büyük görünmektedir. Yük emilime bir engel olabilir. Subkütan uygulamadan kisa bir süre sonra, enjekte edilen materyal ECF ile seyreltildigi için, CE 100-4 özdes seyreltilerde hizli etkili insülin analoglarindan ve RHI'den daha küçük bir ortalama boyuta sahiptir. Örnek 8: Insülinin Analitik Ultrasantrifügasyonu Materyaller ve Metotlar Bir dizi deney, yüzme etkili molar agirliga orantili olan agirlik ortalamali sedimentasyon katsayisinin (SvedbergsZO°C, su S(20,w)) bir tahminini saptayan, analitik ultrasantrifügasyon kullanilarak gelistirildi. Bu analize yönelik prosedür isik saçilim boyut saptamasindan biraz farkliydi. Ilk olarak, her numune ticari ürününki ile bilesimde özdes olan bir seyreltici ile seyreltildi. Bunu elde etmek için, bir 3kDa MW ayirma siniri ile Centriprep® Ultracel-3 membran filtre ünitesi(Millipore Inc, MA, USA) insülini seyrelticiden ayirmak için kullanildi. Orijinal seyreltici geri kazanildi ve herhangi bir insülin içeriginin varligi için analiz edildi. Onaylanan insülinsiz seyrelticiler ticari ürünü seyreltmek için kullanildi. Bu birinci veriler dizisi insülini bir stabil tek türler olarak ya da kendi seyrelticisinde heksamerden, dimerden, monomerden degisen biri olarak karakterize etmek için kullanildi. verilerin iki dizisi analitik ultrasantrifügasyon kullanilarak elde edildi. Verilerin birinci dizisi formülasyonun tam seyrelticisiyle seyreltiden elde edildi. Ticari preparasyonlarin durumlarinda, bu insülini ya da analogu seyrelticiden ayiran sentiprep tüplerden elde edildi. Süzüntü protein içerigi için kontrol edildi ve son onay deneylerin birinci asamasinda seyreltici için kullanildi. Numunelerin ikinci dizisi seyreltici yerine ECF tamponunu degistirerek hazirlandi. Bunun Çalismasi için, en çok konsantre edilen numune ilk önce ECF lz2 ile seyreltildi. Baska seyreltiler sonrasinda ECF ile yapildi. CE lOO-4'ün durumunda, izoelektrik noktasinin herhangi bir çöktürülmis maddeyi yok etmek için çaprazladigindan emin olmak için ECF'nin ilk seyreltisi lz4'tü. Bu deneyler subkütan sonrasi enjeksiyon ortamini taklit etmeyi amaçladi. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hiz analizi bir Beckman-Coulter XL-analitik ultrasantrifügasyonla girisim optikleri kullanarak 20°C ve 55,000 RPM'de yürütüldü. Safir pencerelerle donatilmis çift sektör sentetik sinir hücreleri numune ve referans menisküslerini eslestirmek için kullanildi. Rotor 20°C'de vakum altinda dengelendi ve yaklasik 1 saatlik bir süreden sonra 20°C'de rotor 55,000 RPM'ye hizlandirildi. Birçok analitik program her bir numuneye özgü bilgi elde etmek için veriler (DcDt+ vers. 2.1.02, ve Sedfit, vers 11.3b3) üzerinde çalistirildi. Sedfit programindan veriler asagidaki bulgularda gösterilmektedir. DcDt konsantrasyon profilinin zaman türevlerini kullanan bir Hwdel bagimsiz, sedimentasyon katsayisi dagilimidir g(s*). Konsantrasyonda bir artisla S'nin daha yüksek degerlerine kayma yoksa, meydana gelen tersine çevrilebilir tepkimeler (yani monomer, dimer heksamer) yoktur. Boyut ve sekil seyreltinin üzerinde degisirse (heksamerden dimere monomere kayarak), molekül agirliginin tahminini saptamak mümkün degildir, fakat sedimentasyon katsayisi S(w) üzerine Sedfit programinda faydali bilgiler elde edilebilir. Ek olarak, bu program Lamm denklemine bir model bazli sayisal çözüm kullanan bireysel veriler dizisi için bir dogrudan sinir modeli üretir. 3 Çökelti türlerinin nispi boyutlarini açiklayan egriler üretmek için sürekli sedimentasyon katsayisina c(s) karsi sedimentasyon katsayisi (s) çizer. Her bir insülinin insülin-özgül seyrelticiyle seyreltilmesi: RHI sedimentasyon hizi ultrasantrifügasyonla analiz için gönderildi. Tahmini stok konsantrasyonu 3.745 mg/ml'di. Seyreltici yukarida açiklandigi sekildeydi. Sonraki fiziksel degismezler Sednterp programi kullanilarak protein için amino asit bilesimlerinden hesaplandi.5 Seyreltici yogunlugu ve viskozitesi, Sednterp kullanilarak, hesaplandi. Bulgular Sekil 9A jRHlm'nin yükleme konsantrasyonuna. normalize edilmis c(s) dagilimlarinin bir grafigini göstermektedir. Normalize edilmis grafik için gösterilen veri DcDt+'dan g(s*) verileriyle tutarlidir. Konsantrasyonda bir artisla sedimentasyonda S'nin degerlerine belirgin bir kayma vardir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hücre# S(20,w)(Svedbergs) Kons. (mg/ml) 1 3.05 0.168 2 3.00 0.561 3 3.00 1.678 4 2.84 3.624 Bu analizler deney kosullari altinda RHI'nin öncelikle bir heksamer olarak mevcut oldugunu belirtmektedir. Heksamerlerin dimerleri gibi görünen seyin yani sira, düsük konsantrasyon numunelerinde mevcut olan küçük bir miktar yavas çökelti materyali vardir. Materyaller ve metotlar yukarida açiklandigi sekildedir. Bulgular Sekil 9B her bir konsantrasyon için agirlik ortalama sedimentasyon katsayilarinin bir grafigidir. Protein seyreltme üzerine ayrisir. Ek olarak, muhtemelen heksamerin bir dimeri olan daha hizli çökelti türlerinin küçük bir miktari (<5%) oldugu görülmektedir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hücre# S(20,w) (Svedbergs) Kons.(mg/ml) 1 2.78 0.151 2 3.02 0.558 3 3.09 1.755 4 3.10 3.595 Sonuçlar: Bu analizler bu deney kosullari altinda, protein numunesinin, belirtmektedir. Seyreltme üzerine IL'nin. ayrismasinin kaniti vardir, ve mevcut heksamerlerin dimerler olarak görünen seyin küçük bir miktari vardir. Çalisilan konsantrasyonlar yaklasik Materyaller ve Metotlar yukarida açiklandigi sekildedir. Bulgular Sekil 9C yükleme konsantrasyonuna normalize edilen c(s) dagilimlarinin bir grafigini göstermektedir. Normalize edilmis c(s) grafigi için gösterilen veriler DcDt+'dan g(s*) verileriyle tutarlidir. Düsük konsantrasyondaki c(s) egrileri konsantrasyon arttikça azalan daha küçük türelerin (monomer) bir katkisini gösterir. Konsantrasyonda bir artisla sedimentasyondaki S'nin daha düsük degerlerine ayrica hafif bir kayma vardir. Muhtemelen heksamerin bir dimeri olan daha hizli çökelti türlerinin küçük bir miktari (<5%) vardir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. 1 2.72 0.158 2 3.05 0.561 3 3.19 1.655 4 3.14 3.563 Sonuçlar: Bu analizler bu deneyin kosullari atinda, IA'nin öncelikle bir heksamer olarak mevcut oldugunu belirtmektedir. Seyreltme üzerine IA'nin ayrismasinin kaniti vardir, ve menvut heksamerlerin dimerleri olarak görünen seyin küçük bir miktari vardir. Konsantrasyon çalismalari yaklasik olarak 30 um, lûoum, 300um, ve 600um (monomer üniteleri) idi. Materyaller ve Metotlar yukarida açiklandigi sekildedir. Bulgular CE-lOO 4 için veritabanlari Sedfit ve c(s) modeli kullanilarak analiz edildi. Dogrusunu söylemek gerekirse bu model yalnizca etkilesimli olmayan karisimlara uygundur fakat etkilesimli türlerin durumunda çözeltide hangi türlerin mevcut oldugu hakkinda yine de bir fikir verebilir. Sekil 9D yükleme konsantrasyonunda normalize edilmis c(s) dagiliminin bir grafigini göstermektedir. C(s) grafigi seyreltme üzerine daha düsük S degerlerine dogru belirgin bir kayma olmasi açisindan DcDt+'den g(s*) verileriyle tutarlidir. Daha yüksek konsantrasyonlardan c(s) grafikleri CE 100-4'ün bir heksamerden daha büyük olabilecegini açikça gösterilmistir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. S(20,w) Kons. (Svedbergs) (mg/ml) 1 1.85 0.153 2 2.41 0.548 3 3.05 1.722 4 3.56 3.484 Sonuçlar: Bu analizler bu deney kosullari altindaki, protein numunesi, CE 100-4'ün nwnomerler, dimerler, heksamerler, ve Hmhtemelen daha büyük oligomerler arasinda bir dengede mevcut oldugunu belirtmektedir. Konsantrasyonlar çalismalari yaklasik olarak ECF tamponuyla seyreltme Ticari preparasyonlar 1:4 oraninda seyreltilmis, CE 100-4 hariç, ECF ile ilk olarak 1:2 oraninda seyreltildi. Bu pH 4'te basladigi için, izoelektrik noktadan çökelmeyi önlemek için farkli bir sekilde ele alinmalidir. Diger ticari insülinler zaten pH 7'deydi, böylelikle ilk seyreltme l:2 oranindaydi. RHI sedimentasyon hizi ultrasantrifügasyonla analiz için verildi. Tahmin edilen stok konsantrasyonu saglanan ECF'nin esit bir hacmiyle seyreltmeden sonra 1.87'ydi. Sonraki fiziksel degismezler Sednterp programi kullanilarak protein için amino asit bilesimlerinden hesaplandi. Seyreltici yogunlugu ve Viskozitesi, Sednterp kullanilarak, hesaplandi. Analizde kullanilan üç hücre için, stok çözeltisi kullanilarak, seyreltme semasi asagidaki tabloda gösterilmektedir: Hacim StokHacim TamponTahmini Kons. Hücre#(ul) (pl) (mg/m1) 1 45 405 0.19 3 450 -- 1.87 Sedfit, 11.71 versiyonu, Lamm denklemine model bazli sayisal çözümler kullanan bireysel veri dizileri için dogrudan sinir Devamli sedimentasyon katsayi dagilimi, c(s), model hesaplandi. C(s) dagilim grafikleri, diger analiz metotlarina göre, keskinlestirildi çünkü difüzyonun genisleme etkileri sürtünme katsayisi için bir ortalama degerin kullanimiyla kaldirilmistir. Bulgular Sekil 10A yükleme konsantrasyonunda normalize edilmis c(s) dagilimlarinin bir grafigini göstermektedir. Normalize edilmis c(s) grafigi için gösterilen veriler DcDt+'dan g(s*) verileriyle tutarlidir. C(s) grafikleri neredeyse tesadüfidir fakat konsantrasyondaki bir artisla sedimentasyonda S'nin daha düsük degerlerine küçük bir kayma vardir. Iki en düsük konsantrasyonda küçük bir miktar daha yavas çökelti materyalinin (<1%), ve heksamerin muhtemelen bir dimeri olan daha küçük bir miktar hizli çökelti türlerinin (<3%) oldugu görülmektedir. Artan konsantrasyonla. daha. düsük türlerde azalma ve daha hizli türlerde bir artis konsantrasyon araligi çalismalarinda RHI'nin kendiliginden birlesmesinde yalniza çok az bir kayma oldugunu isaret etmektedir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hücre# S(20,w)(Svedbergs)Kons. (mg/ml) 1 3.25 0.176 2 3.24 0.552 3 3.35 1.721 Sonuçlar: Bu analizler' bu deneyin kosullari atinda, RHI'nin. öncelikle bir heksamer olarak mevcut oldugunu belirtmektedir. Heksamerlerin dimerleri olarak görünen seyin yani sira, daha düsük konsantrasyon numunelerinde mevcut olan çok küçük miktarda daha yavas çökelme materyali vardir. Konsantrasyon çalismalari yaklasik olarak 30 uM, lOOuM, ve 300uM (monomer üniteleri) idi. Bulgular Sekil 10B yükleme konsantrasyonunda normalize edilmis c(s) dagilimlarinin bir grafigini göstermektedir. Normalize edilmis c(s) grafigi için gösterilen veriler DcDt+'dan g(s*) verileriyle tutarlidir. Düsük konsantrasyonda c(s) egrileri konsantrasyon arttikça azalan daha küçük türlerin (belki dimer) önemli bir katkisini göstermektedir. Ayni zamanda konsantrasyonda bir artisla sedimentasyonda S'nin daha düsük degerlerine hafif bir kayma vardir. Özellikle iki daha yüksek numunelerde belli olan, küçük bir miktar (<2%) daha hizli çökelti türlerinin oldupu görünmektedir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hücre# S(20,w)(Svedbergs) Kons. (mg/ml) 1 3.17 0.167 2 3.12 0.568 3 3.17 1.820 Sonuçlar: Bu analizler, bu deneyin kosullari altinda, IL'nin öncelikle bir heksamer olarak mevcut oldugunu belirtmektedir. Seyreltme üzerine IL'nin ayrismasinin kaniti vardir, ve mevcut heksamerlerin dimerler olarak görünen seyin küçük bir miktar vardir. Konsantrasyon çalismalari yaklasik olarak 30uM, lOOu, ve 300uM idi (monomer üniteleri). Insülin aspart (IA) Metotlar yukarida açiklandi. Bulgular Sekil lOC yükleme konsantrasyonuna normalize edilmis c(s) dagilimlarinin bir grafigini göstermektedir. Normalize edilmis c(s) grafigi için gösterilen veriler DcDt+'dan g(s*) verileriyle tutarlidir. Düsük konsantrasyonlarda c(s) egrileri konsantrasyon arttikça azalan küçük bir miktar daha küçük türleri (monomer/dimer) göstermektedir. Ayni zamanda konsantrasyonda. bir artisla sedimentasyonda. S'nin. daha düsük degerlerine hafif bir kayma vardir. Grafik seyreltme üzerine proteinin az oranda ayrismasini açikça göstermektedir. Ek olarak, heksamerin bir dimeri olabilecek. küçük miktarda (en yüksek konsantrasyon numunesine yaklasik olarak 3%) bir daha hizli çökelti türlerinin oldugu görülmektedir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hücre# S(20,w)(Svedbergs) Kons. (mg/ml) 1 3.10 0,186 2 3.23 0.544 3 3.24 1.848 Bu analizler, bu deneyin kosullari altinda, IA'nin öncelikle bir heksamer olarak mevcut oldugunu belirtmektedir. Seyreltme üzerine IA'nin ayrismasinin kaniti vardir, ve mevcut heksamerlerin dimerleri olarak görünen seyin küçük bir miktari 100ü, vardir. Konsantrasyon çalismalari yaklasik olarak 30üM, ve 300uM idi (monomer üniteleri). Materyaller Tahmin edilen stok konsantrasyonu saglanan ECF'nin üç hacmiyle çözeltinin bir hacminin seyreltilmesinden sonra 0.936 mg/ml Analiz için kullanilan dört hücre için, stok çözeltisi kullanan, seyreltme semasi asagidaki tabloda gösterilmektedir: Hücre# Hacim StokHacim TamponTahmini Kons. l 90 360 0.19 3 450 -- 0.94 Bulgular CE 100-4 için verisetleri Sedfit ve c(s) modeli kullanilarak analiz edildi. Açikça konusmak gerekirse bu model yalnizca etkilesimli olmayan karisimlara uygulanabilir fakat etkilesimli türlerin durumunda çözeltide hangi türlerin mevcut oldugu hakkinda bir fikir verebilir. Sekil lOD yükleme konsantrasyonuna normalize edilen c(s) dagilimlarinin bir grafigini göstermektedir. C(s) grafigi seyreltme üzerine daha düsük S degerlerine dogru belirgin bir kayma olmasi açisindan DcDt+'dan g(s*) verileriyle tutarlidir. Daha yüksek konsantrasyonlardan c(s) grafikleri CE lOO-4'ün bir heksamerden daha büyük olabilecegini açikça göstermektedir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hücre# S(20,w) (Svedbergs) Kons. (mg/ml) 2 1.95 0.40 3 3.14 0.84 Bu analizler, bu deneyin kosullari altinda, CE 100-4'ün monomerler, dimerler, heksamerler, ve muhtemelen yüksek konsantrasyonda daha büyük oligomerler arasinda dengede mevcut oldugunu belirtmektedir. Çalisilan konsantrasyonlar yaklasik olarak 30uM, 70uM, ve 145uM idi (monomer üniteleri). HCI pH 2 ya da NaOH pH 7 ile ayarlanmis suda kontroller Sonraki fiziksel degismezler Sednterp programi kullanilarak protein için amino asit bilesimleri için hesaplandi.5 Seyreltici yogunlugu ve Viskozitesi, Sednterp kullanilarak, hesaplandi. Iç Kontrol IC pH7 Analizde kullanilan dört hücre için NaOH ile su, seyreltici olarak pH 7 kullanan, seyreltme semasi asagidaki tabloda gösterilmektedir: Hacim StokHacim TamponTahmini Kons. Hücre# (pl) (ul) (mg/ml) l 25 475 0.19 2 75 375 0.62 3 450 -- 3.745 Devamli sedimentasyon katsayi dagilimi, c(s). C(s) dagilim grafikleri, diger analiz metotlarina göre, keskinlestirildi çünkü difüzyonun genisleme etkileri sürtünme katsayisi için bir ortalama degerin kullanimiyla kaldirilmistir. Bulgular lC-pH7 için verisetleri Sedfit ve c(s) modeli kullanilarak analiz edildi. Açikça konusmak gerekirse bu model yalnizca etkilesimli olmayan karisimlara uygulanabilir fakat etkilesimli türlerin durumunda çözeltide hangi türlerin mevcut oldugu hakkinda yine de bir fikir verebilir. Sekil 11 yükleme konsantrasyonuna normalize edilen c(s) dagilimlarinin bir grafigini göstermektedir. c(s) grafigi seyreltme üzerine daha düsük S degerlerine dogru belirgin bir kayma olmasi açisindan DcDt+'dan g(s*) verileriyle tutarlidir. Standart kosullara düzeltilmis, her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler asagidaki tabloda verilmistir. Hücre# S(20,w) (Svedbergs) Kons. (mg/ml) 1 2.43 0.18 2 2.90 0.57 3 3.04 1.74 4 3.10 3.52 Analizler, bu deneyin kosullari altinda, numune, lC-pH7'nin, burada kullanilan üç en yüksek konsantrasyonlarda heksamerik durumu fazlasiyla destekleyen, en düsük seyreltmede bir dimer- heksamer dengesinde mevcut oldugunu belirtmektedir. Konsantrasyonlar çalismalari yaklasik olarak BOuM, 100uM, 305uM, ve 620uM (monomer üniteler) idi. Iç Kontrol IC pH 2 Insülin yukarida açiklandigi üzere 0.01 N HCI ile seyreltildi. Bulgular: iyi bir tahminini elde etmek için Sedfit ve c(s) modeli kullanilarak analiz edildi. Her bir yükleme konsantrasyonu için agirlik ortalama sedimentasyon katsayisi için elde edilen degerler DcDt+ kullanilarak saptanan degerlere oldukça iyi bir sekilde uymustur. Sedfit kullanilarak saptandigi sekliyle Szmw degerlerinin bir tablosu asagida verilmektedir: Hücre# S(20,w) (Svedbergs) Kons. (mg/ml) 1 1.26 0.17 2 1.28 0.56 3 1.28 1.77 4 1.28 3.61 Bu analizler, bu deneyin kosullari altinda, IC-pHZ'nin ayrica kendiliginden birlesmeye egilim göstermeyen tek bir türler olarak (büyük olasilikla insülin monomer) öncelikle mevcut oldugunu belirtmektedir. Çözücü kosullari herhangi bir destek elektrolitinin eksikliginden dolayi oldukça ideal olmayandi. Çalisilan konsantrasyonlar yaklasik olarak 30uM, 97uM, 305uM, ve 620uM idi (monomer üniteleri). Tüm Sonuçlar, Sedimentasyon analizi DcDt yazilimini kullanan, RHI'nin molekül agirliginin tahmini, molekül agirliginin tüm seyreltme araliginda bir heksamerle (35.6±l.6 kDa) tutarli oldugunu ortaya koymustur. Monomerik insülin (2.29 nm) için standart olan, pH 2 insülin için kontrol degerleri, seyreltme dizilerinde büyük ölçüde degismeden kalan 1.28 S(20,w)'lik bir sedimentasyon katsayisi degerine sahiptir, bu da inonomerik durumunu dogrulamaktadir. Tam konsantrasyonda kontrol stabilize edilmemis insülin, pH 7 heksameriktir, fakat pH 7 seyrelticide seyreltme üzerinde boyutta azalmayla gösterildigi üzere, daha küçük dimer formlariyla dinamik denge içindedir. IA ve IL heksamer boyut araliginda baslar ve ECF'de 1:16 oraninda seyreltmeden sonra monomer/dimer formlarinin küçük bir popülasyonuna sahiptir. CE 100-4 ile monomerik/dimerik partiküllerin daha yüksek bir orani daha hizli emilim profiliyle tutarlidir. Örnek 10: Insülin pH 7.4'e sodyum sitrat ve EDTA'nin Eklenmesiyie Insülin Boyutu üzerine Etkisinin Saptanmasi CES lOO-4'ün pH'inda 7'ye yükselme domuz modelinde hizli emilnn ve Malvern tarafindan boyutunda bir azalma gösterdigi için, trisodyum sitrat için sitrik asidin bir yer degistirmesinin ayni zamanda pH 7.4'te çalisip çalismayacagini görmek için alternatif bir metot tasarlanmistir. Materyaller ve Metotlar Disodyum EDTA (1.8 mg/mL) ve trisodyum sitrat (1.8 mg/mL) gliserinle (22 mg/mL) suda çözüldü. Insülin 3.8 mg/mL'lik bir konsantrasyonda çözeltiye eklendi. Sodyum Hidroksit pH'i 7.4'e yükseltmek için damlatilarak eklendi. Seyreltilmemis materyal sonrasinda ortalama partikül boyutu için Malvern üzerinde analiz edildi, ve sonrasinda hücre disi akiskan tamponla (ECF) seyreltildi ve seyreltme dizileri boyunca her bir noktada boyutlandirildi. Bulgular ECF tamponla seyreltilen, CES lOO-7, Sodyum Sitrat Insülin pH 7.4 bir asit ve nötr ortamda bir sitrik asit formülasyonuyla karsilastirildi. Bulgular Sekil 12'de gösterilmektedir. Sekil 12 sitrik asit, pH 7.4'ün yerine sodyum sitrat içeren CE lOO-7 pH 7.5, ve CSE lOO-7 için seyreltmenin bir islevi olarak insülin ortalama partiküller boyutunun (nm) bir grafigidir. Bulgular hizli bir sekilde ayrisan insülinin nötr bir pH'da çözeltide sodyum sitratin, EDTA'nin ve insülinin karistirilmasiyla yaratilabilecegini göstermektedir. Ortalama partikül boyutu ilk olarak tipik bir heksamerden daha büyüktür, bu da büyük ihtimalle heksamerin ayristigini ve insülin moleküllerinin gevsek bir sekilde birlesen multimer formunda oldugunu belirtmektedir. Enjeksiyon sonrasi bir ortamda , insülin daha küçük ünitelere, büyük ihtimalle insülin dimerlere hizli bir sekilde ayrisir. Yeni formülasyon tam olarak ilk olarak pH 4'te yapilan ve sonrasinda pH 7'ye getirilen bir sitrik asit/EDTA insülin formülasyonu olarak davranir. Örnek ll: Diyabetik minyatür domuzda Sitrik asit EDTA insülin Materyaller ve Metotlar Insülin (, Sitrik Asit (1.8 mg/mL), gliserin ve Hhkrezol (3mg/mL) karistirilarak ve HCI ile pH 4'e ayarlanarak insülin hazirlandi. Çözeltinin pH'i sonrasinda NaOH'un eklenmesiyle pH 7'ye yükseltildi. Bu özetle 7.4'lük son pH'a ulasildiginda berraklasan bulanik bir karisim yaratarak insülinin izoelektrik noktasi araciligiyla formülasyonu getirdi. CE 100-7 yemekten önce domuza bir prandiyal insülin olarak verildi. Alti erkek diyabetik minyatür domuza (30-50 kg) ilk Önce 0.25 U/kg test insülini uygulandi, sonrasinda hemen 500g standart domuz yemegi ile beslendi. Kan numuneleri -30, -20, -10, 0 dakikada beslenmeden Iki mL kan numuneleri bir damlasinin bir standart glukoz serit metodu kullanilarak glukoz ölçümünü kontrol etmek için kullanildigi bir juguler ven kateteri araciligiyla elde edildi ve geriye kalan numune KzEDTA ile tedavi edildi ve plazma numunesi gelecekteki analiz için donduruldu. Bulgular pH 7 formülasyonunun farmakokinetik profili Sekil l3'te gösterilmektedir. Bu çok hizli profil Örnek 6'daki diyabetli hastalarda gösterilen verilerle tutarlidir. Sitrik asit ve EDTA içeren asit formülasyonunun pH'nin 7'ye yükselmesi minyatür diyabetik domuzda çok iyi bir performans gösterdi. Bu pH degisimi sitrik asitin sodyum sitrata dönüsmesi ile sonuçlandi. Bu yüzden, asit çalismalarinin tuz formu asit kadar iyi çalismalidir. Insülin formülasyonu eklendi lS numune Kümülatif Insülin AsparIIIJGlutamiESüksinik]AdipikTSitrik Sitrik D EDTA olmadan 10 dk EDTA olmadan 30 dk TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR