[go: up one dir, main page]

TR201807218T4 - Oligopeptit bileşikleri ve bunların kullanımları. - Google Patents

Oligopeptit bileşikleri ve bunların kullanımları. Download PDF

Info

Publication number
TR201807218T4
TR201807218T4 TR2018/07218T TR201807218T TR201807218T4 TR 201807218 T4 TR201807218 T4 TR 201807218T4 TR 2018/07218 T TR2018/07218 T TR 2018/07218T TR 201807218 T TR201807218 T TR 201807218T TR 201807218 T4 TR201807218 T4 TR 201807218T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
seq
pcna
oligopeptidic compound
nucleic acid
acid molecule
Prior art date
Application number
TR2018/07218T
Other languages
English (en)
Inventor
Otterlei Marit
Arne Aas Per
Feyzi Emadoldin
Original Assignee
Apim Therapeutics As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Apim Therapeutics As filed Critical Apim Therapeutics As
Publication of TR201807218T4 publication Critical patent/TR201807218T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • C12Y306/03044—Xenobiotic-transporting ATPase (3.6.3.44)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

Bu buluş, bir PCNA etkileşimli motifi içeren bir oligopeptidik bileşik veya terapide kullanım için söz konusu oligopeptidik bileşiği kodlayan bir sekans içeren bir nükleik asit molekülü sağlamaktadır, burada PCNA etkileşimli motifi X1X2X3X3'X1'- (SEKANS KİMLİK NO: 1), burada X1 ve X1' bazik amino asitler grubundan bağımsız olarak seçilmektedir, X2 bir lipofilik amino asittir ve X3 ve X3' yüksüz, tercihen polar olmayan amino asitler grubundan bağımsız olarak seçilmektedir; ve burada oligopeptidik bileşik ayrıca aşağıdakilerden en az biri ile karakterize edilmektedir: (i) oligopeptidik bileşik en az bir sinyal sekansı içermektedir; (ii) PCNA etkileşimli motif [K/R]-F-{LIV]-[LIV]-[K/R]'dir (SEK KİM NO. 27). Özellikle terapi, örneğin bir hiperproliferatif bozukluk veya örn., miyeloablasyon gibi sitostatik terapiyi içeren bir tedavi gibi hücrelerin büyümesini inhibe etmenin arzu edildiği bir bozukluk veya durumun tedavisi olabilmektedir. Bazı yönlerde, buluşun bileşikleri kendi başına sitostatik maddeler olarak kullanılabilmektedir. Buluşun diğer yönlerinde bu gibi bir motif içeren oligopeptidik bileşikler sitostatik maddeler veya radyoterapi ile birlikte kullanılabilmektedir.

Description

TEKNIK ALAN Mevcut bulus, yeni maddeler, farmasötik bilesimler, ve bunlarlEl terapideki kullanIilÇIdaha özel olarak sitostatik terapi için gerekli veya ona yan[lîl herhangi bir durumda ya da hiperproliferatif hastalüilarl tedavisinde oldugu gibi hücrelerin proliferasyonu veya çogalmaslühzaltmak veya önlemek için talep edilen veya avantajlüalan herhangi bir terapi ile ilgilidir. Bulus, DNA onarnÇlkorunmasEl/e hücre döngüsünün düzenlenmesinde bulunan çesitli proteinler ve çogalan hücre nükleer antijeni (PCNA) arasIaki yeni etkilesimlerin tanllamasElve APIM olarak adlandlîtlllgllilîl bu gibi etkilesimlerden sorumlu bir yeni bir pentapeptit motifinin sonraki tanIiIamasEla dayanmaktadlB Uygun bir sekilde, mevcut bulus, özellikle bu gibi maddeler, ve terapide, özellikle yukarida gösterildigi gibi hücre proliferasyonunun önlenmesi veya azalmaslü içeren terapilerde bu gibi maddelerin kullanIIElçeren farmasötik bilesimler, PCNA ile etkilesime geçebilen ve bir motif ve sinyal sekanslarIEiçeren peptitler veya bunlarItakIitçiIeri ile ilgilidir. Tercihen bir sitostatik madde ile kombinasyon halinde, bir PCNA etkilesimli motif ve sinyal sekanslarEiçeren bir maddenin terapötik kullanIilarIEaglanmaktadlEl ÖNCEKI TEKNIK Insan ve hayvan hücreleri reaktif oksijen türleri, UV EglÇlx-ray ve endojen ya da ekzojen sitostatik maddeler gibi DNA hasarII çesitli nedenlerine maruz kalmaktadIEl Sitostatik maddeler, örnegin, hücresel replikasyon mekanizmasi engel olarak veya DNA'nI hasar görmesi ile hücresel büyüme ve/veya çogalmayEl(proliferasyon/replikasyon) inhibe eden veya durduran maddelerdir. Alkilleyici maddeler, bazilârII klinik olarak veya arastlEma amaçlarlîiçin kullanI[g'EH›ir sitostatik madde sIEEIHllEI Alkilleyici maddeler, N veya 0 atomlarIdaki bazlarüdegistirerek DNA hasar. neden olmaktadB Hasar. türü, belirli bir DNA modifikasyonuna neden olan çogu madde ile maddenin türüne bagIIlEl DNA hasarlZl replikasyon sÜsIa yanllSil kodlamaya ve/veya replikasyon bIoklariEia ve ardIan çift sarmal kopmalar- veya translezyon sentezine neden olabilen alkilleme eklentileri ve çapraz sarmal çapraz baglarEîçermektedir.
Insan ve hayvan hücreleri, baz eksizyon onarIiDnükleotit eksizyonu onarliüle uyumsuzluk onarnIElçeren çesitli DNA onarIi sistemlerine sahiptir. Bir örnek, 3-metilsitosin (3meC) sitosin ve 1-metiladenin (1meA), oksidatif demetilasyon ile adenin Içine yeniden dönüstüren insan DNA oksidatif demetilaslÇlhABHZ'dir.
DNA onarIiEl ve hücre döngüsü düzenlenmis DNA replikasyonu arasIdaki yakI koordinasyon, genom bütünlügü için önemlidir. Hasar durumunda, DNA replikasyonunun hasar onarllâna kadar durdurulmasEönemlidir, aksi halde mutasyonlar ortaya çllZmaktad Eve yayllüiaktadlü Hem DNA replikasyonu hem de DNA onarIiIa yer ald[glElbilinen bir protein, çogalan hücre nükleer antijenidir (PCNA).
PCNA, bakterilerden daha yüksek ökaryotlara kadar fonksiyonel olarak korunan ve ana fonksiyonu, genomun dublikasyonu için gereken yüksek islemsellige sahip replikatif polimerazlar saglamak olan proteinlerin kaylîlîlklamp ailesinin bir üyesidir. CanlEIS-fazlü hücrelerde, PCNA etiketli yesil flüoresan proteini (GFP), replikasyon bölgelerini temsil eden farklßdaklar olusturmaktadlB Bu nedenle bir S-fazllîrsaretleyici olarak kullanllâbilmektedir.
DNA onarim kromatin montajÇl epigenetik ve kromatin yeniden biçimlemesi, kardes- kromatid kohezyonu, hücre döngüsü kontrolü ve hayatta kalma gibi hücresel süreçlerde yer alan çok saylîzlh protein, bir düzineden fazla replikasyon çatallanmalarüçeren replikasyon fabrikalarIa lokalize edilmektedir. Bu proteinlerin birçogu, PIP-kutusu (QxxL/I/MxxF/DF/Y) olarak adlandlîllân korunmus PCNA etkilesimli peptit sekanslZhracMIILla PCNA ile etkilesime girmektedir, burada x herhangi bir amino asit olabilmektedir. Bakim WO 96/35715 veya PCNA baglayüjnotifi, bir peptit görüntüleme kitaplfgllîkullanllârak tanIilanmlgtlîl ancak bu motihn, in w'i/dda PCNA etkilesimleri için önemli oldugu dogrulanmamlgtß Çesitli proteinler PCNA ile etkilesime girmektedir ve hABH2'yi de içeren bu proteinlerin bazllârII replikasyon odaklarIa PCNA ile birlikte lokalize oldugu gösterilmistir. Bununla birlikte, kendi içinde es lokalizasyon, es lokalize proteinler aras-a dogrudan veya dolaylljbir etkilesim oldugunu ima etmemektedir. Aslia, PIP-kutusu veya KAx kutusu gibi PCNA- baglaylEElmotiflerin hABH2'sinde bulunmamaslÇl hABHZ'nIn PCNA ile etkilesmedigini ileri sürmektedir.
BULU UN A IKLAMASI Mevcut bulusa kadar olan çallgtnada, bulus sahipleri sasIlEDair sekilde, çesitli proteinlerin yeni bir PCNA etkilesim motifi vaslüislîla PCNA ile etkilestigini bulmuslardE Bu proteinlerin biri olan hABHZ'de, bu motif N-ucunda bulunmaktadlEl Bulus sahipleri, bu motifin PCNA ile etkilesimi için hem önemli hem de yeterli oldugunu belirlemislerdir (bakIlZÖrnek 1).
Asaglki Örneklerde daha detayllîblarak açlElandlglEgibi, alkilleyici hasarI DNA onarIiIa bu PCNA etkilesimli motifinin fonksiyonunu kesfetmek için, motifi içeren bir rekombinant peptiti ifade eden hücre dizileri, 3- metilsitosin ve 1-metiladenin olusumuna yol açan bir SN2 alkilleyici madde olan çesitli MMS dozlar. (metil metansülfonat) maruz bßklimlStlB Motif içeren rekombinant peptit ifadesinin MMS'den kaynaklanan DNA hasar. hücrelerin duyarlllâstlgillîlbulmustur ve rekombinant peptitin PCNA ve hABH2 arasIaki etkilesimi rekabetçi bir sekilde inhibe eden motifi içerdigini göstermistir.
Diger tür DNA hasarlar. neden olan BCNU, temozolomid (TZM) ve mitomisin c (MMC) içeren diger maddeler de test edilmis ve büyük bir sürprizle karsllâsllfnlSIlB bulus sahipleri motif içeren rekombinant peptidin ayrlEb bu maddelerin neden oldugu hasara hücrelerin duyarlilâstlgillîbrtaya çEIZbrmlgtIEl Bu durum hiç beklenmedik bir durumdu, çünkü BCNU esas olarak çapraz sarmal çapraz baglara hatta bazi] mono-baz siklik eklentilere (1,N(6)etanoadenin) yol açan bir Oö-kloroetilasyon maddesidir, TZM'nin bir OGG metilasyon maddesi ve MMC'nin CpG'Ierdeki guaninin N-alkilasyonu yoluyla çapraz sarmal çapraz baglara neden oldugu ve hABH2'nin bu tip DNA hasarIEbnarmad[g]Ebildirilmektedir. Bunun yerine, bu tür hasarljbnaran baska enzimler de vardlü örnegin TZM'nin verdigi hasar dogrudan 06- metilguanin-DNA transferaz (MGMT) tarafEUan onarllIhaktadlE Bu bulgular, motif içeren rekombinant peptidin, sadece hABH2 ve PCNA arasIaki etkilesimi engellemedigini ve diger proteinlerin de dahil olabilecegini, yani baska proteinlerin, yeni motif araclIigilýla PCNA ile etkilesime girebilecegini göstermektedir.
Bulus sahipleri ayrlîla, motif içeren rekombinant peptidin ifadesinin, ABH2 kobay farelerin, yani ABH2'ye sahip olmayan farelerin hücre dizilerinde gözlemlenin ötesinde sitostatik maddelerin (özellikle de MMS) sitotoksik etkisini arttlElHglllîbulmustur, ayrlîla motif içeren rekombinant peptidin daha genis kapsamlEIbir etkiye sahip oldugunu ve muhtemelen hABH2'ye ek olarak diger proteinleri de inhibe ettigini göstermistir.
Bu saslElilEEbulgular, bulus sahiplerinin bir PCNA baglaylîüinotif içeren bir peptit için terapötik bir kullanl öne sürmesine yol açmlStE Burada açilîlanan, APIM olarak adlandlîlllân yeni PCNA baglaylîülnotif karakterize edilmistir ve asaglöbki gibi tanIiIanabiImektedir: burada X1 ve X1: bazik amino asitler grubundan bagsE olarak seçilmektedir, X2 bir Iipofilik amino asittir ve X3 ve X3› yüksüz, tercihen polar olmayan amino asitler grubundan bag Iisü olarak seçilmektedir.
PCNA ile etkilesime girebilen bir peptit (veya oligopeptidik bilesik), bu gibi bir peptit (veya sekans) motifi içerebilmektedir veya kapsamaktadEl Dolaylîlsîla, PCNA ile etkilesime girebilen ve bu gibi bir motif içeren bir oligopeptidik bilesik burada açiElanmaktadE Mevcut bulus, PCNA ile etkilesime girebilen ve motif RWLVK (SEKANS KIMLIK NO: 18) içeren bir oligopeptidik bilesik saglamaktadlB burada oligopeptidik bilesik 70'ten daha az amino asite sahiptir ve bir nükleer lokalizasyon sinyali sekansÇlKKKRK (SEKANS KIMLIK No:125) ve hücreye nüfuz eden bir sinyal sekansl: RRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) Içermektedir ve buradaki bilesenlerin leisÇlPCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyali sekansElhücreye nüfuz eden sinyal sekansIE Dolaylglýla, bulusun bilesiginin, 70'ten daha az aminoasit içeren ve bir PCNA etkilesimli motif, RWLVK (SEKANS KIMLIK NO: 18) ile birlikte bir nükleer lokalizasyon sinyal dizisi, KKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 125) ve bir hücreye nüfuz eden sinyal sekansÇl RRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) içeren bir oligopeptidik bilesige sahip (yani, içeren) bir yapi. seklini alabilecegi ve burada bilesenlerin sßsII PCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyal sekansElhücreye nüfuz eden sinyal sekanslîildugu görülecektir.
Yukarlâb belirtildigi gibi, burada aç[lZ]anan yeni motif, bir oligopeptidik bilesigin (örn., peptit) veya PCNA ile bu gibi bir motif içeren proteinin etkilesmesine araclIJKl etmek üzere belirlenmistir.
Etkilesme dogrudan veya dolayllZblabilmektedir ve motifin PCNA'ya dogrudan baglanmaslü içerebilmektedir veya motif dolaylEblarak baglanabilmektedir, örnegin baglaylEEbaska bir molekül tarafIan saglanabilmektedir. Bu "PCNA-etkilesimli” veya “PCNA-baglaylEEl referansüdolaylîlýla herhangi bir etkilesim sekli ve hem dogrudan hem de dolaylübaglanma içerebilmektedir.
Aksi belirtilmedikçe, burada “motif” ile ilgili herhangi bir referans burada tanIiland[gll:gibi X1X2X3X3iX1i olarak anlasHBialIlE Tercihen, X1 ve Xli lizin (K), arjinin (R), histidin (H), ornitin (Orn), metillizin (MeK) ve asetillizin (AcK) ve daha tercihen K, R ve H veya K ve R arasIan bagIislîl olarak seçilmektedir; X2 tercihen bir aromatik amino asittir, daha tercihen fenilalanin (F), triptofan (W), tirosin (Y), tert.-butilglisin, sikloheksilalanin, tert-butilfenilalanin, bifenilalanin ve tri tert-butiltriptofan (bazlÃiapllândlElnalarda, bu liste F'yi hariç tutabilmektedir) arasIan, özellikle F, W ve Y veya W ve Y, F ve Y veya F ve W'den seçilmektedir veya özel yapiiândünalarda X2, F, veya W veya Y olabilmektedir; X3 ve X3, tercihen alifatik amino asitlerdir ve örnegin Iösin (L), izolösin (I), valin (V), alanin (A) metionin (M) ve norlösin (Nor) arasIan bagislîiolarak seçilebilmektedir; Tercihen X3 ve X3i'ün ikisi de A degildir, daha tercihen X3 ve X3', L, I, V ve M'den, daha da tercihen L, 1 ve V'den seçilmektedir.
Motifin PCNA'ya baglanmasi: X2, W veya Y oldugunda bazü yapilândßnalarda gelistirilebilmektedir.
PCNA etkilesimli motiflerin özel örnekleri sunlarljisaglkileri içermektedir: Oligopeptidik bilesik tercihen izole edilmis bir bilesiktir. Özel PCNA etkilesimli motifler RFLVK içermektedir (SEKANS KIMLIK NO: 2), KFLLR (SEKANS KIMLIK NO: 3), KYLLR (SEKANS KIMLIK NO: 4), KWLLR(SEKANS KIMLIK NO: 5), KYILR (SEKANS KIMLIK NO: 6), KYVLR (SEKANS KIMLIK NO: 7), RFLLR (SEKANS KIMLIK NO: 8), RYLLR (SEKANS KIMLIK NO: 9), RWLLR (SEKANS KIMLIK NO: 10), RYILR (SEKANS KIMLIK NO: 11), RYVLR (SEKANS KIMLIK NO: 12), RFLIR (SEKANS KIMLIK NO: 13), RYLVR (SEKANS KIMLIK NO: 14) RWLMR (SEKANS KIMLIK NO: 15), RYVLR (SEKANS KIMLIK NO: 16), RYVIR (SEKANS KIMLIK NO: 17), RWLVK (SEKANS KIMLIK NO: 18), RYLVK (SEKANS KIMLIK NO: 19), RWLIK (SEKANS KIMLIK NO: 20), RWIVK (SEKANS KIMLIK NO: 21), RWWK (SEKANS KIMLIK NO: 22), RWAVK (SEKANS KIMLIK NO: 23), RYVVK (SEKANS KIMLIK NO: 24), RYLIK (SEKANS KIMLIK NO: 25) ve RYLMK (SEKANS KIMLIK NO: 26).
Bulusun Oligopeptidik bilesigi, yukari tanilandiglgibi sinyal sekanslarEiçermektedir.
Bir sinyal sekansüoligopeptidik bilesigi herhangi istenen bir konuma, örn., herhangi istenen hücresel veya hücre dlSEIkonuma yerini degistirmek veya tasnak, yönlendirmek için sIiEIlamak veya alternatif olarak koymak üzere hareket eden herhangi bir sekans olarak görülebilmektedir. Istenen konum, bir hücre (yani bir hücrenin içi) ve bir hücrenin çekirdegidir.
Bir sinyal sekansÇlbir Oligopeptidik bilesigi bir hücre içine veya bir hücre membranIan (yani bir hücrenin iç klgn.) tasnak için görev yapan bir sekans olabilmektedir. Dolaylglýla, bir protein transdüksiyon etki alanE(PTD) veya protein transdüksiyon sekanslîblarak da bilinen bir “hücreye nüfuz eden” sekans (veya daha özel olarak “hücreye nüfuz eclen peptit") olarak adlandlElâbiImektedir.
Hücreye nüfuz eden peptit (CPP) teknolojisi son yililarda büyük oranda gelismistir ve çok çesitli hücreye nüfuz eden peptitler teknikte bilinmektedir ve açiKIanmaktadlElve asIIa bu tür peptitler piyasada satilîhaktadlîl Hücreye nüfuz eden peptitler boyut, sekans ve yük bak“dan büyük ölçüde degisiklik gösterebilmektedir ve aslIa kendi fonksiyon mekanizmaletla (simdi bazElpeptitler için bilinmemektedir ve digerleri için tam olarak aydIatHBIamaktadlE), fakat plazma membranElboyunca yer degistirme ve bir hücrenin sitoplazmas. veya hatta bazüdurumlarda çekirdegine eklenen veya birlestirilen (veya paylasabilmektedirler. CPP'Ier bu yüzden peptit-bazllîlagm vektörleridir.
CPP'Ier, HIV-1 transkripsiyonel faktör TAT ve HSV-l'den kapsid proteini VP22 gibi viral proteinler, DrozoÜ/a homeoboks proteini Antennapedia (bir transkripsiyonel faktör) gibi hücre membranIlIl geçmek için yer degistirebilen dogal olarak olusan proteinlerden türetilebilmektedir veya örn., poliarjinin gibi sentetik polipeptitlerden ya da kimerik proteinlerden sentetik olarak türetilebilmektedirler. Yukar- belirtildigi gibi, transdüksiyon etkisinden sorumlu tek bir mekanizma yoktur ve dolaylîlsîla CPP'Ierin tasarIiEllarklEyapllâr ve sekanslara baglßlabilmektedir. Hücreye nüfuz eden peptitler Jarver ve ark. 2006 Biochimica peptitleri asagi Iistelemektedir. US 6,645,501 ayrlEla, çesitli hücreye nüfuz eden peptitleri açlElamaktadlB CPP SEKANS REFERANS Antp SW Penatratin RRMKWKK (SEKANS KIMLIK NO: 39) us 6472507 türevleri NRRMKWKK (SEKANS KIMLIK NO: 40) EP4855781 QNRRMKWKK (SEKANS KIMLIK NO: 41) wo 97/12912 FQNRRMKWKK (SEKANS KIMLIK NO: 42) RREKWKK (SEKANS KIMLIK No: 43) Antp 5MB (standart tek amino asit gösterimi, ornitin (O), diaminobutrik asit (B), norlösin (N)) D-Penetratin rqikiwfqnrrmkwkk (SEKANS KIMLIK NO: 53) Rouselle, C. ve ark (2000) Mol.
Prategr/'n S Pegelin (SynB) RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEKANS KIMLIK NO: 54) Rouselle, C. ve ark (2000) Mol.
HIV- TA TSM GRKKRRQRRRPPQ (SEKANS KIMLIK NO: 55) Snyder (2004) PLOS 2: 186 47-57 OF HIV-TAT YGRKKRRQRRR (SEKANS KIMLIK NO: 56) Potocky ve ark. (2003) JBC Amfîpat/'k MAP KLALKLALKALKAALKLA (SEKANS KIMLIK NO: 58) Morris MC., Nat Biotechnol. 2001, Transportan-IO AGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEKANS KIMLIK NO: 60) Soomets U, Biochim Biophys Acta KALA WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SEKANS KIMLIK NO: 61) Oehike J., Biochim Biophys Acta 1998, Pep-l KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEKANS KIMLIK NO: 62) Wyman Biochemistry 1997, 36: 3008-3017 Pep-Z KETWFETWFI'EWSQPKKKRKV (SEKANS KIMLIK NO: 63) MPG GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SEKANS KIMLIK NO: 64) Wagstaff KM Curr Med Chem 2006, Vectohücre VKRGLKLRHVRPRVTRMDV (SEKANS ' KIMLIK NO: 65) Coupade (2005) Biochem. J. 407 peptitleri SRRARRSPRHLGSG”< (SEKANS KIMLIK NO: 66) LRRERQSRLRRERQSR* (SEKANS KIMLIK _ NO: 67) GAYDLRRRERQSRLRRRERQSR (SEKANS KIMLIK NO: 68) *kargoya konjugasyon için sis eklenmesini göstermektedir Wr-T tasma] KETWWEI'WWTEWWTEWSQ-GPG-rrrrrrrr (SEKANS KIMLIK NO: Kondo (2004) Mol. Can. Thera 1623 69) r = D-enantiomer aijinin Diger peptit/er R7 RRRRRRR(SEKANS KIMLIK NO:70) Rothbard ve ark., Nat. Med 6 (2000) 1253-1257 Antennapedia türevli CPP'ler (Antp sIIIJID Tablo 2'de gösterildigi gibi, antennapedia proteininin üçüncü döngüsüne karsmß gelen ve proteinin yer degistirmesinden sorumlu oldugu gösterilmis, 16 amino asit Penetratin sekanslîletrafüla dayaIIIIbir sIlEllZltemsil etmektedir. Penetratin, özellikle farmasötik kullanIiEiçeren bir tasma araclJblarak kapsamlü bir sekilde gelistirilmistir ve çok çesitli Penetratin türevleri ve modifiye edilmis sekanslar sekanslZlmodifiye edilebilmektedir ve/veya tepesi klüillâbilmektedir veya peptit kimyasal olarak modifiye edilebilmektedir veya retro-, inverso- veya retro-inverso benzerleri hücreye- nüfuz etme aktivitesini korurken yapüâbilmektedir.
Hücreye nüfuz eden peptitlerin baska grubu, HIV-TAT sekans. ve HIV-TAT ve bunlar. parçalar. dayanmaktadlE Çesitli TAT-bazlElEPP'ler US 5,656,122 sayll]l`ll>atent dokümanIa açEanmaktadlE Asag-ki Örneklerde kullanIiglElgibi bir örnekleyici HIV-TAT peptidi, RKKRRQRRR'dir (SEKANS KIMLIK NO: 71), ancak daha uzun veya daha klgla TAT parçalarII kullanßlßldugu kolaylllZla takdir edilecektir.
Yukarlîzlh deginildigi gibi, tüm CPP'ler Için belirli yaplElal özellikler veya sekans motifleri ortak degildir. Bununla birlikte, çesitli CPP sthrÇl örnegin amfipatik ve net pozitif yüke sahip peptitler gibi belirli özellikler vasltâslýla tannlanabilmektedir. Diger CPP gruplarlZl/üksek oi- sarmal içerigi gösteren bir yaplýla sahip olabilmektedir. Baska grup, yüksek bir bazik amino asit Içerigi ile karakterize edilen peptitler olabilmektedir. CPP'ler, bu yüzden, arjinin gibi bir bazik amino asitin oligomeri olabilmektedir veya bunlarülçerebilmektedir, örn., 5 ila 20, 6 ila veya R11 (SEKANS KIMLIK NO: 73) ya da QSRg (SEKANS KIMLIK NO: 74).
Pirolin bakIiIan zengin amfipatik peptitler, baska bir CPP sIlflüllElve pirolinlerden pirolidin halkalarII varllglEile karakterize edilen bu gibi peptitler, Pujals ve ark. 2008 Advanced Drug Delivery Reviews 60, sayfalar 473-484'de açllZlanmaktadlB Diger basarlIUJJIr sekilde gelistirilmis CPP'ler pVEC (Elmquist ve ark. 2003 Biol. Chem 384, Piyasada satllân CPP'ler, Pep-1 peptite (Aktif Motif, Fransa) baglljkariot, protegrin peptid PG- 1'e (Syntem, Fransa) baglESyn-B vektörleri ve Genospectra, ABD'den MPG peptidine baglEl Express-si Delivery içermektedir.
YaygI bir sekilde temin edilebilen ve bildirilen CPP'lere ek olarak, yeni veya türev CPP peptitleri bilinen veya bildirilmis kriterlere (örn., yukari aç[lZland[gEgibi temel amino asit içerigi, u-sarmal içerigi gibi bilinen CPP sekanslarlIl veya özellikleri) bagll] olarak tasarlanabilmektedir ve sentezlenebilmektedir. Ilave olarak, rastgele tasarlanmlg veya diger peptitler, örnegin, istenen kargoya (mevcut bulusa göre bir oligopeptidik bilesik) bir flüoresan etiket gibi örn., tespit edilebilir bir etiket veya isaret gibi bir raporlaylEEmolekül içeren bir peptitin baglanmasD/eya eklenmesi yoluyla CPP aktivitesi için ve örn. konfokal mikroskop kullanflârak örnegin hücresel ifadenin incelenmesini takip eden canlElhücreIere bu peptitlerin eklenmesiyle yapII hücre membranIan geçip geçmedigini test etmek için taranabilmektedir.
Asi-a, genel olarak bir CPP'nin herhangi bir hücre türüne nüfuz etmesi veya girmesi durumunda olurken, bazlZlJurumlarda, basarIIIB/eya etkili tasIianlEl, kargonun (örn., kargo peptit sekansLIl kesin dogas. ve/veya kullanllân CPP'ye baglEblabilecegi veya buna göre degisebilecegi gözlemlenebilmektedir. En optimum peptit sekanslarEl/e kombinasyonlari. vb. belirlenmesi ve kargo ve/veya CPP sekansElveya yap-[El, vb. test edilmesi ve/veya degistirilmesi için teknikte uzman kisinin rutin becerisi dahilinde iyi olacaktlEl Yukarlîzlh deginildigi gibi, bulusun oligopeptidik bilesikleri (veya yapüârm yukarüh tanIiIandfglElgibi bir nükleer lokalizasyon sinyali sekansIEl(NLS) içermektedir. NLS'Ier, teknikte iyi bilinmektedir ve literatürde genis bir sekilde tarif edilmektedir.
Bir NLS, uzunluk ve/veya sekans bakIiEbIan degisiklik gösterebilmektedir ve çesitli sayida özel bir NLS sekansüçmanmlgtlü Ancak, genel olarak, pozitif yüklü amino asitleri (özellikle lizin (K), arjinin (R) ve/veya histidin (H)) içeren peptitlerin bir NLS olarak görev yapabilecegi amino asit peptiti olabilmektedir, burada en az 4 amino asit (ve daha özel olarak NLS araleUan seçilen, pozitif yüklü amino asitlerdir. Bu gibi bir örnek NLS sekans RKRH'ye (SEKANS KIMLIK NO: 75) sahip olabilmektedir veya içerebilmektedir.
Hem deneysel olarak belirlenmis hem de tahmin edilen veya önerilen NLS sekanslarIZl/e NLS'Ieri tanllamaya yönelik stratejileri içeren nükleer lokalizasyon sinyalleri, Lange ve ark., Klasik bir NLS, bir (tek parçaIDZlveya iki (iki parçalDZIbazik amino asitlerden olusmaktadlB Bir tek parçallllLS, SV40 büyük T antijeni NLS ( tarafIan örneklendirilebilmektedir ve iki parçalElnükleoplazmin NLS (ISSKRPAATKEAGQAKKKK 17° sekansEK-[K/R] -X-[K/R] (SEKANS KIMLIK NO: 78) önerilmistir (burada X, herhangi bir amino Temsili bir iki parçalElNLS, KR-[X], örn., KR-Xlo- KKKK (SEKANS KIMLIK NO: 80) (burada X, herhangi bir amino asittir) sahip olabilmektedir.
Alternatif bir örnek iki parçalEIllLS, RKRH-[X], örn., RKRH-XZ- KK (SEKANS KIMLIK NO: 82), örnegin RKRH-II-KK (SEKANS KIMLIK NO: 83) biçimini alabilmektedir.
Onkoprotein c-myc NLS, sadece 9 amino asit kallEt-dan 3'ünün (PAAKRVKLD [SEKANS KIMLIK NO: 84]) bazik oldugu klasik NLSIerden farklIlîl bu da bir NLS'nin yukar- verilen konsensüs veya klasik sekansa uymaslIIgerekmedigini göstermektedir. Makkerh ve ark., (supra), bir bazik amino asit kümesinin (örn., KKKK [SEKANS KIMLIK NO: 85]) nötr ve asidik kallEtllârla, örnegin PAAKKKKLD (SEKANS KIMLIK NO: 86) ile yandan desteklendigi NLS sekanslarIüçilZlamaktadlE Diger olasENLS sekanslarllsaglkileri içermektedir: PKKKRKVL (SEKANS KIMLIK NO: 87), KKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 88), KKKRVK (SEKANS KIMLIK NO: 89), KKKRKVL (SEKANS KIMLIK NO: 90) ve RKKRKVL (SEKANS KIMLIK NO: 91).
Bir varsayilân, önerilen veya tahmin edilen NLS sekansüteknikte bilinen ve açilZlanan ilkeler ve deneyler kullan [lârak NLS aktivitesi için test edilebilmektedir. Örnegin bir aday NLS sekansEl istenen kargoya (bu durumda burada tanllanan bir oligopeptit) eklenebilmektedir ve yapIZI tespit edilebilir bir raporlaylEEhiolekül (örn., bir flüoresan etiket gibi görsellestirilebilen bir isaret veya etiket) saglanabilmektedir ve bir test hücresi ile temasa geçebilmektedir.
Hücredeki yapII dagmmaha sonra belirlenebilmektedir.
Dolaylîlýla, özetle, hücreye nüfuz eden peptit sekanslarII örnekleri, Antennapedia proteininin homeo etki alani. üçüncü sarmallEh karsUJEl gelen bir 16 amino asit peptiti olan PenetratinT”, R6-Penetratin (burada arjinin kaliEtllârDenetratinin N-ucuna eklenmistir) gibi R bakIiITitlan zengin etiketler, GRKKRRQRRPPQQ (SEKANS KIMLIK NO: 92) gibi HIV Tat proteininin türevlerini içermektedir. Nükleer lokalizasyon sekanslarII örnekleri, SV40 protein türevi KKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 93) içermektedir.
Mevcut bulusa göre bir yapi. ayrElalemanlarEl/eya bilesenleri, APIM oligopeptidik bilesigi- NLS-CPP lelilehla bulunmaktadlElveya gösterilmektedir.
Bulusun bir oligopeptidik bilesigi veya yapEÇl birden fazla PCNA etkilesimli motifi içerebilmektedir. Böylece alternatif olarak, mevcut bulusa göre uygun bir yapü PCNA etkilesimli bir motif içeren birden fazla oligopeptidik bilesik içerebilmektedir. Bir yaplZl/eya oligopeptitik bir bilesik örnegin 1-10, örn., 1-6 veya 1-4 veya 1-3 veya bir ya da iki motif içerebilmektedir. Bu gibi motifler, seçenege göre gruplandEIlâbilmektedir veya örn., motif- NLS-motif-CPP; ya da motif-NLS-motif-motif-CPP; veya motif motifi-NLS-CPP vb gibi sinyal sekansßlemanlarüle ayrllâbilmektedir.
Bulusa göre bir yapi. bilesenleri veya elemanlarüteknikte iyi bilinen yöntemlere göre arzu edilen veya uygun bir sekilde birbirine baglanabilmektedir veya eklenebilmektedir.
Dolaylîlýla, bilesenler veya ayrEbarçalar, örnegin bilinen kimyasal baglama teknolojilerini veya yapllârlîkullanllârak kimyasal olarak baglanabilmektedir veya konjuge edilebilmektedir veya yapllâr örn., füzyon proteinlerinin olusturulmasi yönelik teknikler gibi genetik mühendisligi teknikleri kullanllârak tek bir bütün halinde olusturulabilmektedir veya peptit sentez teknikleri kullan [Iârak bir bütün halinde basitçe sentezlenebilmektedir.
Ayrlîparçalar veya bilesenler dogrudan birbirine baglanabilmektedir veya bir veya daha fazla baglayElJveya aralaymsekans araclIJglsîla dolaylüblarak baglanabilmektedirler. DolayEIýIa, bir baglaylEBekans, bir yapIlEl iki veya daha fazla parçasIIZya da bir oligopeptidik yap-ki ayrlZl'notif elemanlarIEtiralllZl bßkabilmektedir veya birbirinden ayßbilmektedir. BaglaylEEl sekansI kesin dogaslîönemli degildir ve degisken uzunluk ve/veya sekans olabilmektedir, kallEtllârÇlörn., 1, 2 veya 3 ya da daha fazla kallEtlîa sahip olabilmektedir. Temsili örnek sahip olabilmektedir. KalIEtllârI dogaslîönemli degildir ve örnegin herhangi bir amino asit, örn., bir nötr amino asit veya bir alifatik amino asit olabilmektedir veya alternatif olarak hidrofobik veya polar veya yüklü ya da örn. pirolin gibi olusan yapEblabiImektedir. Nötr ve/veya alifatik amino asitlerin klgla (örnegin 1-6) sekanslarEtla dahil olmak Üzere bir dizi farklEliJaglaylEEekansI kullanllgllîgijösterilmistir. Örnekleyici baglaylEIEekanslar, dolaylglgla herhangi bir tek amino asit kallEtElJörn., A, 1, L, V, G, R, Q, T veya W veya bu gibi kallütllârdan olusan bir cli-, tri- tetra- penta- veya hekza- peptit içermektedir. Örnek baglaylEIIBr olarak I, II, IL, R, W, WW, WWW, RIL, RIW, GAQ, GAW, VAT, IILVI (SEKANS KIMLIK NO: 94), IILVIII (SEKANS KIMLIK NO: 95) vb.'ye deginilebilmektedir.
Farklßlemanlar arasIaki baglaylîliâr ayn Üeya farkllîdilabilmektedir.
Bir yapüândünada, Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEK KIM NO: 112) sekans- sahip olan veya bunu içeren bir oligopeptidik bilesik saglanmaktadlEl Burada açilZlanan diger bilesikler (veya daha özellikle yapllâr), MDRWLVKRILVATK (SEKANS KIMLIK NO: 96), MDRWLVKRILKKKRKVATKG (SEKANS KIMLIK NO: 97), MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK (SEKANS KIMLIK NO: 98), MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 99), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG (SEKANS KIMLIK NO: 100), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEKANS KIMLIK No: 101), MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 102), MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 103), MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRR-QRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 104), MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 105), MDRWLVKRIWKKKRKI- (SEKANS KIMLIK NO: 107), MDR-WLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK (SEKANS KIMLIK NO: WLVKWRKRHIRKKRRQRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 110), Ac- MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 111), Ac- MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 112), Ac- MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 113), Ac- MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 114), Ac- MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 115), MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK (SEKANS KIMLIK NO: 116), KRRRQRRKKRIIKRKKKWW-WKVLWRDM (SEKANS KIMLIK NO: 117).
Bu, yapHârEblusturan ayrEbiIesenleri (yani motif içeren sekans, baglaylîlÇl NLS, CPP, vb.) gösteren 98 ila 117 SEK KIM NO'larda belirtildigi gibi sekanslara sahip olan oligopeptidik bilesikler, asagidaki Örnek 6'daki Tablo 3'te gösterilmektedir. Böylece SEK KIM NO'Iar 98 ila 117, en az bir motif içeren sekans, bir NLS ve bir CPP Içeren yapllârü bazEHurumlarda belirtildigi gibi sekansta degisiklik gösterebilen baglaylElEekanslarEile baglantmapllârülemsil etmektedir. SEK KIM NO. , D-amino asitlerden olusan retro-invers bir peptittir. SV40 veya UNG2 NLS sekanslar. dayanan NLS sekanslarül/e Penetratin, HIV-TAT veya R bakIiIan zengin bir peptite baglEoIan CPP sekanslarEkullanüüiaktadlü Baska bir yönüyle bulus, SEKANS KIMLIK NO: 18”e sahip olan veya bunlardan olusan bir peptiti kodlayan bir nükleik asit molekülü ve yukarüia tanIiIandIgiEgibi sinyal sekanslarIlZl saglamaktadlEl AyrIEla, bu gibi bir nükleik asit molekülünün tamamlaylElîElaçiElanmaktadlE Tercihen, nükleik asit molekülü, SEKANS KIMLIK NO: 18'e sahip olan veya bunlarülçeren bir peptiti kodlayan sekansa ve yukari tanIilandlgiEgibi sinyal sekanslar. uygulanabilir bir sekilde baglanmElbir promotör sekansügermektedir. içermektedir. Nükleik asit molekülü tercihen bir izole moleküldür.
Baska bir yön, burada tanIiIand[glÜgibi bir nükleik asit molekülü içeren bir vektör ile ilgilidir.
Vektör ayrüa, bir replîkasyon kaynagÇlantibiyotik direnci gibi bir seçilebilir isaretleyici ve/veya bir çoklu klonlama bölgesi gibi bir vektörde tipik olarak bulunan baska elemanlar da içerebilmektedir. Vektör ayrEla bir ifade vektörü olabilmektedir örn., nükleik asit moleküllerinin ifadesi için transkripsiyon ve/veya translasyon kontrol veya düzenleyici elemanlar gibi baska elemanlar da içerebilmektedir. Bu gibi kontrol elemanlarÇl ör. promotörler, ribozom baglanma bölgeleri, gelistiriciler, sonlandlElEüâr vb. teknikte iyi bilinmektedir ve kapsamIElîiir sekilde açüZlanmaktadlEl Vektör örnegin bir plazmid veya bir virüs olabilmektedir, tercihen bir retrovirüs, bir adenovirüs ve bir adenovirüs ile iliskili virüs araleUan seçilmektedir.
Yukarlâb açlElandkjEgibi bir nükleik asit molekülü ve/veya vektör içeren bir rekombinant konak hücre de burada açlElanmaktadlB Konak hücre, bir hayvan hücresi, tercihen bir memeli hücresi, en çok tercihen bir slgan, murin veya insan hücresidir. kastedilmektedir. Konak hücre, dogal olarak, nükleik asit molekülünün bir endojen kopyasIü içerebilmektedir veya içermeyebilmektedir, ancak nükleik asit molekülünün ve/veya vektörünün bir ekzojen veya baska bir endojen kopyaslBJITJ] uyguland[g]l]ekombinanttE Bir baska yönüyle, buradaki ekli istemlerde tanIiIandlglElgibi bulusun bir oligopeptidik bilesigini, bulusun bir nükleik asit molekülünü ve/veya bulusun bir vektörünü farmakolojik olarak (veya farmasötik olarak) kabul edilebilir yardIlcÜnadde ile birlikte içeren farmasötik bir bilesim saglanmaktadIEl YardIicü madde, teknikte bilinen herhangi bir yardIicEI maddeyi, örnegin, tampon, antioksidan, selatlaylîlgbaglaylagkaplama maddesi, dagllîlElQdolgu maddesi, tatlandlElElQrenk verici, akSkanllEIgüçlendirici, kayganlastlElElZlkoruyucu madde, emici madde gibi herhangi bir tasMEEleya seyreltici veya baska bilesen veya maddeyi Içerebilmektedir.
Yardnclîmadde, örnegin, Iaktik asit, dekstroz, sodyum metabisülfat, benzil alkol, polietilen glikol, propilen glikol, mikrokristal selüloz, laktoz, nisasta, kitosan, önceden jelatinize edilmis nisasta, kalsiyum karbonat, kalsiyum sülfat, dekstratlar, dekstrin, dekstroz, dibazik kalsiyum fosfat dihidrat, tribazik kalsiyum fosfat, magnezyum karbonat, magnezyum oksit, maltodekstrin, mannitol, toz selüloz, sodyum klorür, sorbitol ve/veya talkdan seçilebilmektedir.
Farmasötik bilesim, örnegin bir tablet, kapsül, kaplanmEltablet, sûüsüspansiyon, ince plaka, poset, implant, inhalan, toz, pelet, emülsiyon, liyofilizat, efervesan, sprey, merhem, emülsiyon, balsam, yakü/eya bunlarI herhangi bir karlgEiüalarak teknikte bilinen herhangi bir formda saglanabilmektedir. Bu, örn., gastrik slîlýla dirençli bir preparat olarak ve/veya devamIEhareket eden formda saglanabilmektedir. Oral, parenteral, topikal, rektal, genital, subkutan, transüretral, transdermal, intranazal, intraperitoneal, intramüsküler ve/veya intravenöz uygulama için ve/veya inhalasyon yoluyla uygulanmasEliçin uygun bir form olabilmektedir.
Temsili bir yapllândünada, farmasötik bilesim, lipozomal uygulama Için uygun bir formdadlü bu yüzden tercihen farmasötik bilesim içeren Iipozomlar saglanmaktadlü Lipozomlar kullanIlgllülda, bir baska yardIicElnaddenin olmasEgerekli olmayabilmektedir, bu nedenle burada açllZJandlglÜJIbi bir oligopeptidik bilesik Içeren Iipozomlar, burada tanIiIandlglügiibi bir vektör ve/veya burada tannland [gllgibi bir nükleik asit molekülü, burada açlKlanmaktadlB Bir veri tabanEiarastlElnasEkullanllârak, bulus sahipleri bunlarI birçogunda DNA onarIiÇl bakIiEi/e hücre döngüsü düzenlemesinde, örn., transkripsiyon, replikasyon, fosforilasyon, ubikitinilasyon, translezyon sentezi, kardes kromatid kohezyonu ve hücre döngüsünün düzenlenmesini (bakim Tablo 1 ve Örnek 4) içeren 200'den fazla diger proteinlerdeki yeni PCNA baglaylEl]10tifin varllglIEResfettiler. Bu proteinler, - TFIIS uzama faktöründe bulunan korunmus N-terminal etki alanIIZI(I), durdurulmus transkripsiyonun ilerlemesi için önemli bir protein içeren bilinmeyen bir protein islevi Içermektedir, dolaylîlýla bulus sahipleri buna TFIIS-benzeri protein adIEl/erdiler. Bu protein, 7 N-terminal amino asitleri içindeki motifi içermektedir. - hücre döngüsü kontrolü ve proliferasyon için önemli olan çok fonksiyonlu transkripsiyon faktörü TFII-I. TFII-I'yElaslElZlfade eden hücreler, y-H2AX odaklarlEIE (DNA çift sarmal klîllüialar için bir isaretleyici) devamliHgII artmasIEtagIamlgtlB bu da DNA onarIiIa TFII-I'nI bir rolü oldugunu önermektedir. Bu protein 4 motif içermektedir. - post-replikatif DNA parçalarII bozulmasEl ve DNA ayrnIa görev yapan DNA topoizomeraz II alfa (Topo II on). Bu protein bir motif içermektedir. - sarmal klîrlilarEbelirIeyen anahtar nükleotit eksizyon onarl proteini XPA. Bu protein bir motif içermektedir.
- RADSIB, uygun sentrozom fonksiyonu ve kromozom ayrnEilçin önemli oldugu gösterilen bir homolog rekombinasyon proteinidir. Bu protein bir motif içermektedir.
- Fanconi anemi çekirdek kompleks proteini, FANCC'dir. FA çekirdek kompleksinin, çapraz baglaylîülnaddelerinin DNA onarIilüiüzenleyen DNA hasarlýla aktive edilen sinyallesme yolagIda yer aldigiljgiösterilmistir. Bu protein bir motif içermektedir.
En az bir motif içerdigi bulunan baska proteinler, Tablo 1'de Iistelenmektedir.
Teori ile sIlElianma istenmeksizin, bulus sahipleri bulgular& PCNA'nI normal ortaklarIan en az biriyle etkilesmesini önleyerek, hücrelerin sitostatik maddelerin etkisine karsEduyarlEl hale getirilebilecegini göstermektedir. Böylece sitostatik maddenin etkisi ayarlanabilmektedir. Örnegin, bir onarIi proteininin PCNA ile etkilesimi inhibe edilmektedir (örn., hABH2), böylece DNA onarIiEinhibe edilebilmektedir ve bunun bir sonucu olarak, sitostatik maddenin DNA'ya hasarII etkisini arttlElnaktadE Dolaylgiýla, hücrelerin büyümesinin örnegin hiperproliferatif bir bozuklugun veya sitostatik terapinin (yani sitostatik bir maddenin kullanüîhasmdahil oldugu herhangi bir tedavide inhibe edilmesinin arzu edildigi özellikle bir bozukluk veya rahatslîl[g]I tedavisinde kullanIi, terapide kullanIi için ekli istemlerde tanIiIandiglElgibi bulusun bir oligopeptidik bilesigi, bulusun bir nükleik asit molekülü ve/veya bulusun bir vektörü saglanmaktadE Böylece bilesik, vb. sitostatik terapiye gereksinim duyan veya buna yaniîiveren herhangi bir durumun tedavisinde kullanllâbilmektedir.
Bir baska yönde, örnegin hiperproliferatif bir bozuklugu veya sitostatik tedaviyi içeren bir tedaviyi inhibe etmenin arzu edildigi bir bozukluk veya durumun tedavisinde kullanIi için bir ilaci üretiminde, ekli istemlerde tanIiIandlgliibi bulusun bir oligopeptidik bilesigi, bulusun bir nükleik asit molekülü ve/veya bulusun bir vektörünün kullannßaglanmaktadlEl YukarlZlla belirtildigi gibi, bu bulusun önünü açan bir sasIEDJulgu, farklEsay-ki sitostatik iIaçIarI etkisinin, PCNA-etkilesimli bir motife sahip bir peptitin kullanIiEile arttlEllâbilecegi ya da güçlendirilebilecegi, böylece örnegin DNA onarIiElve replikasyonu ve hücre döngüsü ilerlemesinde bulunan proteinler gibi tahminen genis yelpazedeki proteinler ile PCNA'nI etkilesimini inhibe ettigidir. Bu, herhangi bir PCNA-etkilesimli molekülün, sitostatik maddenin etkisini arttlElnak ya da hücreyi bu etkiye karsülluyarllîliiale getirmek için bir sitostatik madde ile birlikte kombinasyonunda kullanilâbilecegi genel öneriye yol açmaktadEl Buna göre, ekli istemlerde tanIiIand[g]l]_iibi bulusun bir oligopeptidik bilesigi veya hücrelerin büyümesini örnegin hiperproliferatif bir bozuklugu veya sitostatik tedaviyi içeren bir tedaviyi inhibe etmek için arzu edilen bir bozukluk veya durumun tedavisinde bir sitostatik madde ile kombinasyon halinde kullann için söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir nükleotit sekansEiçeren bir nükleik asit molekülü saglanmaktadE Dolaylâlýla, örnegin hiperproliferatif bir bozuklugu veya sitostatik terapiyi içeren bir tedavide hücrelerin büyümesinin inhibe edilmesinin arzu edildigi bir bozukluk veya durumda bir sitostatik madde ile kombinasyonunda kullanIi için bir ilaci imalatlîikja söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir nükleotit sekansljlçeren bir nükleik asit molekülü veya ekli istemlerde tan Iandlgllîgibi bulusun bir oligopeptidik bilesigi saglanmaktadlB Dolaylîlsîla, bir düzenlemede ilaç ayrlîia bir sitostatik madde içerebilmektedir.
Ilaç, hem oligopeptidik bilesigi hem de nükleik asit molekülü ve sitostatik maddeyi içeren tek bir bilesim formunda olabilmektedir veya ayrüörn., es zamanlEi/eya sülüîl uygulama için bunlarEiçeren bir kit veya ürün formunda olabilmektedir.
Bu nedenle, ekli istemlerde tannlandigilîgibi bulusun bir oligopeptidik bilesiginin veya iIacI ayrüyrües zamanlüleya ardßilg olarak bir sitostatik madde ile uygulandlgißitostatik terapiyi Içeren bir tedavide veya örnegin hiperproliferatif bir bozukluk gibi hücrelerin bozulmasII tedavisi için bir ilaci üretiminde söz konusu oligopeptitik bilesigi kodlayan bir nükleotit sekansEiçeren bir nükleik asitin kullanIlßaglanmaktadlEl Ayni] zamanda, PCNA ile etkilesime girebilen bir oligopeptidik bilesik veya örnegin hiperproliferatif bir bozuklugu veya sitostatik terapiyi bir tedavide hücrelerin büyümesinin inhibe edilmesinin arzu edildigi bir bozukluk veya durumun tedavisinde ayrüyrües zamanlü veya ardlSIKl olarak kombine edilmis bir preparat olarak bir sitostatik madde ile birlikte söz konusu oligopeptidik bilesigi bir nükleotit sekansEiçeren bir nükleik asit molekülü içeren bir ürün açiEianmaktadlEl Ekli istemlerde tanilandkjlügibi bulusun oligopeptidik bilesigi, bir sitostatik maddenin etkisini hafifletmek veya güçlendirmek için kullanilâbilmektedir.
Bulusa göre oligopeptidik bilesikler (yapilâr dahil), dolayisiîla, hücrelerin büyümesinin inhibe edilmesinin istendigi (veya faydaIEblabilecegi) herhangi bir kosulda veya klinik durumda terapötik bir faydaya sahiptir. büyümesinin önlenmesi veya yok edilmesini içerecek sekilde yaygI bir biçimde kullanilmaktadlü “Inhibisyon”, dolaylîlýla hücre büyümesinin azalmasIEhieya önlenmesini içermektedir. Bu, teknikte iyi bilinen yöntemler ile belirlenebildigi gibi hücre say-Çl boyutunu (örn., hücrelerin bulundugu dokunun boyutu), hücre canlMglIIZlve/veya hücre ölümünü vb. belirlemek veya degerlendirmek gibi uygun veya kolay herhangi bir yolla belirlenebilmektedir.
Burada ifade edilen hücrelerin “büyümesi”, özellikle hücrelerin çogalmalellZliçeren hücre büyümesinin herhangi bir yönünü içerecek sekilde genis bir biçimde kullan [IBiaktadlB Bu yüzden oligopeptidik bilesikler, hücre büyümesinin (özellikle hücre proliferasyonu) düsmesine yaniiîlveren herhangi bir durumun (burada genel olarak herhangi bir bozuklugu veya herhangi bir klinik durumu içerecek sekilde kullanilIhaktadlE) tedavisinde kullanllâbilmektedir. Oligopeptidik bilesikler buna göre, hücre büyümesini (veya proliferasyonunu) hedefleyen herhangi bir terapide (veya tedavide) fayda saglamaktadlü Baska bir deyisle, bilesikler, hücre proliferasyonunu inhibe etmek için arzu edilen veya avantajliîilan herhangi bir terapötik uygulamada kullanliâbilmektedir.
Burada kullanIigilgibi “tedavi” terimi, bir klinik durumun yönetiminde faydalüblan herhangi bir etki veya adlilîtveya müdahaleye) genis ölçüde ifade etmektedir ve dolayElýla hem terapötik hem de profilaktik tedavileri içermektedir. Tedavi, tedaviden önceki duruma veya semptomlara göre tedavi edilen durumu ortadan kaldiEinayEi/eya herhangi bir veya daha fazla semptomu azaltmayü veya gelisimini hafifletmeyi, iyilestirmeyi, yavaslatmaylZiveya sujenin klinik durumunun herhangi bir sekilde iyilestirilmesini içerebilmektedir. Bir tedavi, bir tedavi programlîieya rejimine katkßla bulunan veya bunun bir parçasßlan herhangi bir klinik ad! veya müdahaleyi içerebilmektedir. Bir profilaktik tedavi, örnegin profilaktik tedaviden önce durumun veya semptomla ilgili olarak durumun, kosulun baslang-I veya bunlari bir veya daha fazla semptomunu geciktirmeyi, sIlEIiamayÇi azaltmayEi veya önlemeyi içerebilmektedir. Dolayiîlsîla profilaksi, hem durumun hem de durumun gelismesinin veya bunlari semptomunun ve durumunun veya semptomun baslang-a veya gelisiminde herhangi bir gecikmenin veya durumun ya da semptomun gelisimi veya ilerlemesi üzerinde azalman veya sIIiEIiaman açlKça önlenmesini içermektedir. Bulusa göre tedavi, dolayiglýla, hücrelerin büyümesini veya hücrelerin popülasyonu ya da bir gövdenin boyutundaki artiglîi (örn., bir dokuda, tümörde veya büyümede) ortadan kaldiîrinayü inhibe etmeyi veya yavaslatmayÇlhücre say-I azalmasIEi/eya hücrelerin yayiiüiasIEönlemesini (örn., diger anatomik bölgeye), bir hücre büyümesinin vb. boyutunun azalmasIEiçermektedir. “Tedavi" terimi, hücre büyümesinin ya da hücrelerin büyümesinin ortadan kaldlEllüiasÜIa da tamamen yok edilmesi veya tedavi edilmesi anlam. gelmemektedir.
Mevcut bulusun terapötik uygulamalarEl/e faydalari: genel olarak hücre proliferasyonunu inhibe etmeyi içerebildiginden, herhangi bir hücre çogalmasÇiburada açiEianan ve kapsanan terapilerde ve faydalarda hedeflenebilmektedir. Bu gibi çogalan hücreler, sagl[iZ]I:iveya hastaliiZiEihücreleri ve proliferasyonun meydana geldigi herhangi bir dokunun hücrelerini içerebilmektedir. Örnegin, bu gibi hücreler, özellikle hem habis hem de habis olmayan hücreleri içeren neoplastik hücreler ve bagEüZliElsisteminin hücreleri (immün hücreleri), genel olarak hematopoetik sistemin hücreleri veya deri hücrelerini içerebilmektedir.
Anormal veya istenmeyen hücre büyümesi ile ilgili bozukluklar veya durumlar, sitostatik maddelerle tedavi edilebilmektedir ve sitostatik maddeler, hücrelerin öldürülmesi veya kesip çlKlartllIhasII arzu edildigi durumlarüiçeren hücre büyümesini ve proliferasyonunu azaltmak veya önlemek için arzu edilen herhangi bir durumda kullanllâbilmektedir. Uygun bir sekilde, yukar- alternatif olarak belirtildigi gibi, mevcut bulusun oligopeptidik bilesikleri (yapüâr dahil), bir sitostatik maddenin kullaniIElkapsayan (veya içeren) herhangi bir tedavide kullanIi için olabilmektedir. Bu, bir sitostatik bir maddeye ya da bir sitostatik maddenin kullanIiIlIgierektiren veya onunla tedavi edilebilir herhangi duruma yan [Elherhangi bir durum tedavisini içermektedir.
Hiperproliferatif bozukluklar. tedavisi, özellikle ilgi çekici bir yönü temsil etmektedir. veya istenmeyen proliferasyonunu Içeren herhangi bir bozuklugu veya durumu içermesi için kullanllîhaktadlü Bu nedenle, örnegin sadece soru (örn., aynElsüjede sagllKlElveya etkilenmemis dokudan al-n hücrelere göre veya onlarla klýaslandlglütla ya da bir saglllîlü veya kontrol sujeye göre veya onunla klglaslandlglna) durumu yoklugunda hücrelere veya normal veya sagllEiühücrelere göre hücrelerin proliferasyonunun artt-[glîldurumlarlîl içermemektedir, ancak genel veya özel bir baglama bagIEkalmaksElEI, istenmeyen ve arzu edilmeyen durumu meydana getiren proliferasyon, bununla birlikte, normal üzerinde hücre proliferasyonunun arttlEIÜiadlg]l:l(veya büyük oranda veya önemli derecede artmayan) durumlarüla içermektedir. Bu, “normal” bir yanlüa meydana gelebilen, örn., bir immün yanlEl veya bir inflamatuar yanlElgibi (baska bir ifadeyle, özel (örn., normal) bir baglamda meydana gelebilen, ancak buna ragmen istenmeyecek “normal" bir yanii) mesela hücrelerin istenmeyen ve arzu edilmeyen proliferasyonunu içerebilmektedir.
Mevcut bulusa göre tedavi edilebilen hiperproliferatif bozukluklar, dolaylîlsîla, iltihaplanmayEl (daha özel olarak iltihaplEbozukluklar veya durumlar veya iltihapla iliskili veya karakterize edilen durumlar) veya otoimmün rahatslîlllZJarü/eya durumlarüveya bir otoimmün bilesene sahip otoimmün bozukluklarüleya durumlarlîçermektedir.
Hiperproliferatif bir rahatslZIlEi normal düzenleyici mekanizmalardan bagnslîlolarak var olan ve çogalan hücreler gibi, otonom büyüme kapasitesine sahip hücrelerin proliferasyonunu Içerebilmektedir (ancak sadece bunlarla sIlEIllZldegildir). Hiperproliferatif bir bozukluk bu yüzden neoplastik bir bozukluk olabilmektedir ve yukari belirtildigi gibi, bu habis veya habis olmayan bir bozukluk olabilmektedir.
Hiperproliferatif hücreler patolojik (yani normal hücrelerden sapma ve bir hastalllZl durumu ile iliskili) veya patolojik olmayan (yani normalden sapan ancak bir hastal[lîl durumu ile iliskili) olarak sIiflhndlElllâbilmektedir.
Patolojik hiperproliferatif hücreler, asag-ki hastaIIE durumlarEl/eya bozukluklarMa iliskili olabilir veya bunlara eslik edebilir: restenoz, diyabetik nefropati, tiroid hiperplazisi, Grave Hastal[glÇlsedef hastallglüiyi huylu prostat hipertrofisi, Li-Fraumenti sendromu ve kanserler (tümörler veya maligniteler dahil).
Patolojik olmayan hiperproliferatif hücrelerin örnekleri, laktasyonun gelisimi süslia memeli duktal epitel hücrelerini ve ayrlEla yara onarllsîla iliskili baska hücreleri de içermektedir.
Bulusun bilesikleri, diyabetik retinopati ve periferal vasküler hastallKlarEliçeren bu tür bozukluklar. ve hastaliElarI ve digerlerinin tedavisinde faydalßlabilmektedir.
Hiperproliferatif bozukluklar yukarlElla belirtildigi gibi habis veya habis olmayan neoplastik bozukluklar olabilmektedir. Ayrlîla, buna premalign ve neoplastik olmayan rahatslîlllZlar da dahildir. Premalign veya neoplastik olmayan veya habis olmayan hiperproliferatif bozukluklar. örnekleri araleUa miyelodisplastik bozukluklar, yerinde servikal karsinoma, ailesel intestinal polipozlar (örn., Gardner sendromu), oral Iökopoplazyazlar, histiyositozlar, keloidler, hemanjiyomlar, hiperproliferatif arteriyel stenoz, inflamatuar artrit, artrit içeren hiperkeratozlar ve papuloskuamöz püskürmeler de bulunmaktadE AyrlEh, buna sigiller ve EBV'nin neden oldugu hastallE (örn., enfeksiyöz mononükleoz), yara olusumu ve benzerleri gibi viral kaynaklEliiiperproliferatif hastalllîlar da dahildir.
Hiperproliferatif bozukluk, örnegin, kanser, psoriatik artrit, romatoid artrit, inflamatuar baglEak hastallglügibi gastrik hiperproliferatif bozukluklar, sedef hastallglüReiter sendromu, pitiriasis rubra pilaris, keratinizasyon bozukluklar.. hiperproliferatif degiskenleri gibi cilt hastallKlarElgibi neoplastik bozukluklardan seçilen herhangi bir hiperproliferatif bozukluk olabilmektedir.
Kanser, özellikle ilgi çeken bir hiperproliferatif bir bozuklugu ve örn. katEltümörler ve hematolojik kanserlerin dahil edildigi tüm tür kanserleri temsil etmektedir. Temsili kanser türleri arasIda servikal kanser, rahim kanseri, yumurtaliiîi kanseri, pankreas kanseri, böbrek kanseri, safra kesesi kanseri, karaciger kanseri, bas ve boyun kanseri, skuamöz hücreli karsinom, gastrointestinal kanser, meme kanseri, prostat kanseri, testis kanseri, akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, non-Hodgkin IenfomaslZImultipI miyelom, lösemi (akut lenfatik lösemi, kronik lenfatik lösemi, akut miyelojenöz lösemi ve kronik miyelojenöz lösemi), beyin kanseri (örn. astrositom, glioblastom, medulloblastom), nöroblastom, sarkomlar, kolon kanseri, rektum kanseri, mide kanseri, anal kanser, mesane kanseri, pankreas kanseri, endometrial kanser, plazmasitoma, Ienfomalar, retinoblastom, Wilm tümörü, Ewing sarkomu, melanom ve diger cilt kanserlerini kapsamaktadlü AyrlEia sinüs tümörleri, üretral ve genito-üriner kanserler, özofagus kanseri, miyelom, endokrin kanserleri, osteosarkom, anjiyosarkom ve fibrosarkom ve gliomlar ve nöroblastomlarElçeren habis veya habis olmayan periferal veya merkezi sinir sistemlerinin herhangi bir tümöründen de bahsedilebilmektedir.
Otoimmün hastaliElar veya bozukluklar, özellikle ilgi çeken baska bir durumu temsil etmektedir ve örnegin, romatoid artrit, multipl skleroz, sistemik Iupus eritematozus (SLE; Ayrlîla, genel olarak konusmak gerekirse, hematolojik bozukluklar veya kan veya kemik iligi hastalilZlarÇl gerekli bir sekilde habis veya kanserli olmasEigerekmemektedir (örn., çesitli diskraziler veya displaziler, habis olmayan hiperplazi, agranüloma veya MGUS (Bilinmeyen Öneme Sahip Monoklonal Gammopati)). Bu nedenle, istenmeyen veya arzu edilmeyen veya kan veya kemik iligi hücreleri veya onlarI prekürsörlerinin anormal proliferasyonunu içeren herhangi bir durum, mevcut bulusa göre tedavi edilebilmektedir. Özellikle deginilebilecek diger durumlar örn. polisitemi vera (aslEIElklîiinlîElkan hücreleri üretildiginde meydana gelmektedir) neoplastik menenjit ve miyeloproliferatif hastalllZlarD içermektedir.
Inflamasyon veya otoimmün bir hastalllîtan dolayß'a da baska sekilde iltihaplanma ile ortaya çiElabilecek çesitli durumlar da meydana gelebilmektedir. Bu gibi kosullar mevcut bulusa göre de tedavi edilebilmektedir. Belirli ifade sikleromiksödem ve papuler musinoz, amiloidoz ve Wegener granülomatozdan yapllâbilmektedir.
Yukari belirtildigi gibi, bulusun bilesikleri bir sitostatik maddenin etkilerini artßbilmektedir veya güçlendirebilmektedir. Uygun bir sekilde, bir sitostatik maddenin kullanllâbilecegi herhangi bir terapötik uygulamada faydalEbulabilmektedirler. Bu, sadece hastalRlEhücreleri içermeyebilen, hücreleri öldürmek veya kesip çEIZlarmayIZIisteyen herhangi bir durumu Içerebilmektedir. Özellikle, bu gibi bir durum, transplantasyon öncesi kemik iliginin kesilip çlKiarllEnasII arzu edildigi bir durumda ortaya çlEmaktadIB Bulusun bilesikleri bu yüzden miyeloablasyonda ve özellikle bir kemik iligi transplantüveya daha genel olarak bir hemopoetik kök hücre transplantEIHSCT) (ayrlîia kemik iliginden, hemopoetik kök hücreler elde edilebilmektedir veya örn., periferal kari gibi kandan türetilebilmektedir) olabilen bir nakil öncesi miyeloablasyonda kullanllâbilmektedir.
Kök hücre transplantasyonu, nöroblastom, Demoplastik küçük yuvarlak hücreli kanser, Ewing sarkomu ve koriokarsinom gibi katEtümör kanserlerini içeren ve habis veya habis olmayan kan veya kemik iligi (yani hematolojik durumlar veya bozukluklar) hastaIEElarII veya durumlarII tedavisinde kullanllâbilmektedir. Hematolojik habisler arasIa Iösemiler, lenfomalar (Hodgkin ve Hodgkin olmayan) ve miyelomlar bulunmaktadE Habis olmayan hematolojik hastallKlar, fagosit bozukluklarlîaörn., miyelodisplazi), anemiler (örn., ciddi aplazi veya aplastik anemi) ve miyeloproliferatif bozukluklarEKÖm., polisitemi vera ve esansiyel trombositoz) içermektedir. Kök hücre transplantasyonu ile tedavi edilebilen diger edinilmis kosullar amiloidoz gibi metabolik bozukluklarElve radyasyon zehirlenmesi gibi çevreden kaynaklanan hastalüîlarlîliçermektedir. Kök hücre transplantasyonu, örn., anemiler, sitopeniler, hemofagositik sendromlar, hemoglobinopatiler, orak hücre hastaligiüle [3 talasemi majör gibi çesitli lizozomal depo hastallElarü immün yetmezlikler ve habis olmayan hematolojik bozukluklarüçeren konjenital bozukluklar tedavisinde kullanüâbilmektedir.
Radyoterapi (aynEl zamanda radyasyon terapisi ve radyasyon onkolojisi olarak da bilinmektedir), yukar- açlKlanan hiperproliferatif bozukluklarEliçeren çesitli durumlar. tedavisinde kullanllâbilmektedir. “Radyoterapi", DNA zincirini olusturan atomlarEIdogrudan veya dolaylüilarak iyonlastlürak hücrelerin DNA'si zarar verebilen iyonlastEEIJladyasyonun kullanllü'iasgnlamlüla gelmektedir. Dolaylülyonlasma suyun IyonlasmasII bir sonucu olarak meydana gelmektedir ve serbest radikalleri, özellikle de DNA'ya zarar veren hidroksil radikallerini olusturmaktadlü En yaygI radyoterapi türlerinde, radyasyonun çogu etkisi serbest radikallerden geçmektedir.
Radyoterapi, kanser tedavisinde ve patolojik dokularI kesilip çllîlartliiias-a, kaIlEEDNA çift sarmal kIEllB1alarElveya programlanmlgl hücre ölümünün aktivasyonundan kaynaklanan sitotoksik etkilerden dolayEfaydalIlE IyonlastlEEjradyasyon, tümör ve kanser hücreleri gibi hiperproliferatif hücrelerin, hem in vii/o hem de in vitro olarak apoptoz ile hücre ölümüne maruz kalmasi neden olmaktadE Maalesef radyoterapi, kanser hücrelerini bir hastadan tamamen yok etme durumunda genellikle basarEZjIÜ çünkü, çevre normal dokusuna kabul edilemez derecede yüksek bir hasar riski olmakslîlü, tümör hücrelerini öldürmek için yeterince yüksek bir lokal radyasyon dozunun verilmesi çogu zaman mümkün degildir. Ayrlîh hücrelerin radyasyon kaynaklElhücre ölümüne büyük oranda degisen hassasiyet gösterdigi ve IyonlastEEEl radyasyonun fosfatidilinositol 3-kinaz/Akt (PI3K/Akt) ve mitojenle aktive edilmis protein kinaz (MAPK) sinyal transdüksiyon yolaklarül'asüîâislîla hayatta kalma yanlEImekanizmasIIEktive edebildigi bilinmektedir. Dolaylglîla, hücrelerin iyonlastlEED radyasyonun etkilerine duyarlEl hale getirilmesi ile radyoterapinin etkililiginin arttümiaslöla ihtiyaç vardEI Uygun bir sekilde, bulusun bilesikleri, bu gibi bir hassasiastlEEEétki saglamak için, baska bir ifadeyle, radyoterapinin etkilerini güçlendirmek (arttlEinak, çogaltmak veya yogunlugunu arttiElnak için) veya bir sujeyi (veya daha özel olarak bir sujede bulunabilen hücrelerin) radyoterapinin etkilerine daha duyarIE] yapmak için kullanllâbilmektedir. Dolaylîlsîla, radyoterapinin kullanI[gll:herhangi bir terapötik uygulamada faydalEbulabilmektedirler. Bu, sadece hastaIlKlElhücreleri içermeyebilen hücrelerin öldürülmesi veya kesip çlKlartIJB'iasEl istenen herhangi bir durumu içerebilmektedir.
Bulusun bilesikleri, iyonlastlEIEEtadyasyonun DNA'ya zarar verme etkilere karsEhücrelerin hassaslastElElgEblarak kullanllâbilmektedir. “HassaslastlîlElî'J bulusun bilesiklerinin, hücreler üzerinde IyonlastlElEÜadyasyonun DNA'ya zarar verme etkisini arttlElnaleb yönelik kullanIiEl anlam. gelmektedir. Bu, endojen hücresel DNA onari mekanizmalari. inhibe edilmesi yoluyla basarüâbilmektedir.
Dolaylâlýla mevcut bulus, ekli istemlerde tannlandigllîlgibi bir oligopeptidik bilesigi veya radyoterapi ile kombinasyon halinde kullanlßîak üzere söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir sekansElçeren bir nükleik asit molekülünü kapsamaktadB burada bilesik ayrlZl ayrües zamanlEblarak veya slßslýla radyoterapi ile birlikte uygulanmaktadß Radyoterapi, bilesik ile birlikte, radyoterapiye yanüîl veren veya onu gerektiren herhangi bir durumun tedavisinde uygulanabilmektedir. Bulusun bilesikleri veya yapllârü bu nedenle örnegin hiperproliferatif bir bozukluk veya radyoterapiyi içeren herhangi bir tedavideki hücrelerin büyümesini inhibe etmenin arzu edildigi bir rahatslîlllîl veya durumun tedavisinde kullanllâbilmektedir.
Alternatif olarak tanllanan bulus, ekteki istemlerde tannlandlglügibi bir oligopeptidik bilesik veya radyoterapi için bir hassaslastlElEEblarak söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir sekansElçeren bir nükleik asit molekülü saglamaktadlB burada bilesik ayrüayrües zamanllZl veya süslîda radyoterapi ile birlikte uygulanmaktadlEl Bulus Konvansiyonel harici @El radyoterapisi, Stereotaktik Radyoterapi, Sanal simülasyon, 3- boyutlu konformal radyoterapi, yogunlugu ayarlanmlgradyoterapi ve Radyoizotop Terapisini (RIT) içeren ancak bunlarla sIlîllßlmayan her tür radyoterapiyi incelemektedir.
Dolaylîlýla, burada listelenen yönlerin herhangi birinin tercih edilen bir yapilândlElnasEUa, ekli istemlerde tanIiland[gll:gibi oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü ve/veya vektör, bir radyoterapi ile birlikte (es zamanlßlarak, ayrlâyrljleya süslîla) kullanUB1aktadlEl Burada listelenen yönlerin herhangi birinin tercih edilen bir yapllândlElnaleUa, ekli istemlerde tanIiland[g]l:gibi oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü ve/veya vektör, bir sitostatik madde ile birlikte (es zamanlüilarak, ayrüiyrüleya sEisEla) kullanllîhaktadE (replikasyonu/proliferasyonu) inhibe edebilen veya bastEibilen bir madde anlam. gelmektedir.
Sitostatik maddeler, onkolojik veya hematolojik uygulama için gösterilebilen sitotoksik maddeleri, anti-neoplastik maddeleri ve herhangi bir maddeyi içermektedir. DolayElEa, kemoterapötik tedavi protokollerinde kullanllân maddeleri (“kemoterapötik maddeler”) içermektedir.
Sitostatik maddeler tipik olarak, etki mekanizmalarlEb göre farkll3Ilîlhra gruplandlEllhîaktadlEl ve bu sII[fl1ar tümü, burada incelenmektedir. Dolaylîlýla, sitostatik madde, bir alkilleyici madde, bir çapraz baglama maddesi, bir eklenen madde, bir nükleotit analogu, bir ig olusumu inhibitörü ve/veya bir topoizomeraz I ve/veya II inhibitörü olabilmektedir. Diger türler veya madde sI[f[larl:arasIa anti-metabolitler, bitki alkaloidleri ve terpenoidler veya bir anti-tümör antibiyotik bulunmaktadß Tercihen, bu bir alkilleyici maddedir.
Alkilleyici maddeler, DNA'yÇl dogru DNA replikasyonunun önlenmesine neden olan nükleositleri alkilleyerek degistirmektedirler. Nükleotid analoglarüeplikasyon boyunca DNA'ya katliIhaktadE ve DNA sentezini inhibe etmektedir. Ig hücreli karsinom olusmasi. inhibitörleri, ig olusumunu bozmaktadlü ve metafaz süslütla mitoz duraklamaya yol açmaktadlü Eklenen maddeler DNA bazlarDarasIa geçis yapmaktadlBlar ve DNA sentezini inhibe etmektedirler. Topoizomeraz I veya 11 inhibitörleri DNA bükülmesini etkilemektedirler ve DNA replikasyonuna müdahale etmektedirler.
Uygun sitostatik maddeler teknikte bilinmektedir, ancak örnek olarak aktinomisin D, BCNU (karmustin), karboplatin, CCNU, Kampotesin (CPT), kantaridin, sisplatin, siklofosfamid, sitarabin, dakarbazin, daunorubisin, dosetaksel, Doksorubisin, DTIC, epirubisin, Etoposid, gefinitib, gemsitabin, ifosamid, irinotekan, iyonomisin, Melfalan, Metotreksat, Mitomisin C (MMC), mitozantronemerkaptopurin, Oksaliplatin, Paklitaksel (taksol), PARP-l inhibitörü, taksoter, temozolomid (TZM), teniposid, topotekan, treosülfan, vinorelbin, vinkristin, vinblastin, S-Azasitidin, 5,6-Dihidr0-5-azasitidin ve 5-flor0urasil burada isimlendirilmektedir.
Teknikte uzman kisi, herhangi verilen bir sitostatik madde için uygun dozaj aralllZlarII farkIa olacaktlîlve bir yapllândlîilnada, sitostatik madde, farmasötik bilesimde mevcuttur veya tipik doz arallgilEUa sujeye uygulanmaktadlü AvantajlEbir yapilândlülnada, sitostatik maddenin daha düsük bir dozu mevcut olabilmektedir/kullanUâbilmektedir, çünkü bulusun oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü veya vektörü, hücreleri sitostatik maddelere duyarlElhaIe getirmektedir ve bu yüzden bulusun oligopeptidik bilesigi, nükleik asit molekülü veya vektörü ile kombinasyon halinde kullanIEgllEUa, daha düsük sitostatik madde dozu kendi bas. daha yüksek bir sitostatik madde dozu ile aynü/eya karsllâstlîllâbilir olacaktE Bu yüzden bulusun oligopeptitik bilesigi, nükleik asit molekülü veya vektörü, örn., hastalllg yetersiz beslenme ve benzeri yol ile yaslElinsanlar, bebekler veya küçük çocuklar gibi sitostatik maddeler için düsük veya ortalamadan daha düsük bir toleransa sahip olan sujelere uygulanmayüinümkün hale getirmektedir.
Hiperproliferatif bir bozuklugu tedavi etmek için sitostatik maddeler kullanlIIIlken karsllâslßn bir problem, tipik olarak etkilenen tüm hücrelerin öldürülmemesidir. Sitostatik bir madde ve oligopeptidik bilesik bulusun nükleik asit molekülü veya vektörünün birlikte kullanllgilEUa, etkilenen hücrelerin daha yüksek bir yüzdesi öldürülmektedir ve bir yapllândlElnada, sitostatik maddenin tipik dozundan daha yüksek bir miktarda oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü veya bulusun vektörü ile daha yüksek oranda hastalllaühücreyi öldürmeye ulasmak hücrelerin tümünü büyük oranda öldürmek için kullanilBiaktadlEI Yukarlîlla belirtildigi gibi, burada açlKlandlglEgibi oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü ve/veya vektörü, bir sitostatik madde ile birlikte kullan.[g]Ia, ardlEtlan iki farkIElnadde, aynEfarmasötik bilesim içinde bulunabilmektedir veya bunlar ayrüayrljiyguIanabilmektedir.
Ayrüliygulama, esasen aynüamanda, ancak farkIlILliygulama yollarlýla veya farkIEkonumlarda uygulama yolu ile uyguIamayEiçerebilmektedir. Ayrljliygulama farkllîtamanlarda, örn., 1, 2, 3, 4, 5, 6 veya 12 saat arayla uygulamayüçerebilmektedir.
Suje, bir hayvan (yani insan veya insan olmayan bir hayvan), tercihen bir memeli, daha tercihen bir insandlEI Teknikte uzman kisi, oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü ve/veya vektörünü hücrelere uygulamak için uygun yöntemlerin farkIa olacaktlEl Örnek vaslBislýla, birkaç uygun yöntem asaglîlia klgti bir sekilde tartlgllüîaktadß Mikro kapsülleme, çevrelenmis maddeleri veya ürünlerini kontrollü bir sekilde serbest blüakmak ve biyoaktif malzemeleri korumak amaclýla, yarEgeçirgen bir polimerik membran içinde biyoaktif malzemeleri kapsamasüçin basit ve uygun maliyetli bir yol saglamaktadlEl Fotokimyasal internalizasyonda (PCI) hem ilgili molekül hem de lglgla duyarlElbIr bilesik hücre taraflEUan bir Iizozom veya bir endozom içine allElnaktadB Hücreler daha sonra @gh duyarlübilesigi aktive etmek için uygun dalga boyundaki Ega maruz büklßmktadlîl ve @gb duyarlEbilesigin Iizozom veya endozomun membranIEIbozmas- neden olmaktadlîl ve böylece ilgili molekül hücrenin sitozolüne sallrîmaktadE Diger yöntemler mikroenjeksiyon, klEinlîÜkan hücresi hayalet aracHJIiiüzyon, lipozom füzyonu, pinozomlarI ozmotik Iizisi, slîLHEI yükleme, elektroporasyon, kalsiyum fosfat ve virüs aracll]]] transfeksiyon ve kopolimerik tasEIEllârI kullanIiIügermektedir.
Kitosan ve suda çözünebilir kitosan türevleri, özellikle glikoz kitosan, I'n Viva olarak biyouyumluluklarül'e biyobozunabilirlikleri nedeniyle tercih edilen ilaç tasmaiârüilarak ortaya çllîmaktadlü Tercih edilen bir örnek, 5 ß-kolanik asit ile hidrofobik olarak degistirilmis glikol kitosandlE Standart amino asit bir harf kodu burada kullanllîhaktadlîl bu nedenle K, Iizini (Lys) temsil etmektedir, 1, izolösin (Ile) ve benzerini temsil etmektedir.
Bulusun oligopeptidik bilesigi, bir veya daha fazla, örn., burada “kodlanmamlglamino asitler” olarak isimlendirilen standart genetik kod ile kodlanmayan bir yan zincire sahip en az 1, 2, 3, 4 veya 5 amino asit içerebilmektedir. Bunlar, ornitin veya taurin gibi metabolik islemler vasltâlea olusan amino asitlerden ve/veya 9H-flüoren-9-ilmetoksikarbonil (Fmoc), (tert) - (B)util (0)ksi (k) arbonil (Boc) 2,2,5,7,8-pentametiIkroman-6-sülfonil (Pmc) korumallîlamino asitlerden olusan amino asitler veya benziloksi-karbonil (Z) grubuna sahip amino asitlerden seçilebilmektedir. Bu gibi kodlanmamlglamino asitler mevcut oldugunda, bunlar motifin içinde yer almamaktadlEllar.
Bulusun oligopeptidik bilesiginin in vitro ve/veya in V/VO stabilitesi, teknikte bilinen stabilize edici veya koruyucu araçlar. kullanÇl örnegin koruyucu veya stabilize edici gruplar. eklenmesi, amino asit türevleri veya analoglarII dahil edilmesi veya amino asitlerin kimyasal modifikasyonu aracEIgMa gelistirilebilmektedir veya arttlEllâbilmektedir. Bu koruyucu veya stabilize edici gruplar, örnegin N ve/veya C ucuna eklenebilmektedir. Bu gibi bir grubun bir örnegi, bir asetil grubudur veya teknikte bilinen bir peptiti stabilize edebilen diger koruyucu gruplar olabilmektedir.
Bulusun oligopeptidik bilesikleri, tipik olarak L-konfigürasyonuna sahip sadece amino asitleri içerecektir, fakat D konfigürasyonuna sahip bir veya daha fazla amino asit de mevcut olabilmektedir. Tercihen, oligopeptidik bilesik en az 1, 2, 3, 4 veya 5 D-amino asit içermektedir ve bunlar tercihen motifte bulunmaktadlîliar, fakat baska bir yapilândünada, D amino asitleri sadece motifin dlSlBUa mevcuttur. Oligopeptidik bilesik, dogrusal veya siklik olabilmektedir.
Dolaylglýla, özellikle, inverso oligopeptidik bilesikler ve daha belirli bir sekilde inverso peptitler buna dahildir. esdeger alt birimlerden olusan bir bilesik anlam. gelmektedir. Dolaylgîla “oligopeptidik bilesik” terimi, peptitleri ve peptidomimetikleri içermektedir. anlam. gelmektedir. Alt birimin omurga parçasEl standart bir amino asitten farklü olabilmektedir, örn., bir veya daha fazla karbon atomu yerine bir veya daha fazla azot atomu içerebilmektedir. kopyalar- benzer bir üç boyutlu yapmdinebilen, ancak sadece peptit baglarlîla baglanmlgl amino asitlerden olusmayan bir bilesik anlam. gelmektedir. Tercih edilen bir peptidomimetik sIifSl peptoitler, yani /V-ikameli glisinlerdir. Peptoitler, kendi dogal peptid kopyalarEîIe yaklEUan alakallalmr, ancak kendi yan zincirlerinin molekülün omurgasEfboyunca amino asitlerde oldugu gibi a-karbonlarljerine azot atomlar. eklenmesi ile kimyasal olarak farkIIlEllar.
Tercih edilen bir yapllândlülnada, en azlîitlan oligopeptidik bilesigin motif parçaslîlsadece peptit baglarüçermektedir ve tercihen sadece kodlanmg amino asitlerden olusmaktadm En çok tercihen, oligopeptidik bir bilesik peptittir.
Oligopeptidik bilesik, di-amino asitleri ve/veya ß-amino asitleri içerebilmektedir, ancak en azIan motif parçasEtercihen sadece a-amino asitlerden olusmaktadlB En çok tercihen, oligopeptidik bilesik oc-amino asitlerden olusmaktadlü birimden daha azIElbeIirtmek için kullanilîhaktadlîl Alternatif olarak tanIiIanan, 40, 35, 30, Motif dlglEUaki alt birimlerin dogasEbnemli degildir, bu yüzden motif dISlEldaki alt birimler örnegin hABHZ gibi dogal proteinlerde bulunanlar olabilmektedir veya bunlar alanin kallEtiIârEI ya da herhangi bir baska uygun kallütmabilmektedir.
Peptidomimetikler tipik olarak bir hastanI vücudunda daha uzun bir yarEömre sahiptir, bu yüzden daha uzun süreli bir etkinin arzu edildigi yerlerde tercih edilmektedirler. Bu, bilesimin yeniden uygulanmasügereken frekansII azaltllBias. yardncüblabilmektedir. Ancak, biyo- güvenlik nedenlerinden ötürü daha kEla bir yarElömür tercih edilebilmektedir ve böylece peptitler kullanllâbilmektedir.
Bulusa ait oligopeptidik bilesik, daha büyük bir birimin bir parçasIIIrblusturabilmektedir, örn., bir rekombinant füzyon proteini olusturmak için kaynastßllâbilmektedir veya bir peptit aptamer olusturmak için bir yapiZliskeIesine eklenebilmektedir. DolayElîla, bulusun oligopeptidik bilesigini içeren füzyon proteinler veya aptamerler, mevcut bulusun ayrIEla diger yönlerini olusturmaktadE Bununla birlikte, daha baska yönler, yukari tarif edildigi gibi terapide bu tür füzyon proteinleri veya aptamerlerin kullanIiIIJe bu gibi füzyon proteinlerini veya aptamerlerini içeren farmasötik bilesimleri içermektedir.
Teori ile sIlEIlanma istenmeksizin, optimum DNA onarIiÇlbakIi ve/veya hücre döngüsünün düzenlenmesi için, birkaç proteinin PCNA ile etkilesime girmesi gerektigine ve bulusun oligopeptidik bilesiklerinin PCNA ile etkilesim için konsensüs motife sahip proteinlerle yarlgabilecegine inanllfnaktadlü Optimum DNA onarIiIiÇlbakEi/e/veya hücre döngüsünün düzenlenmesi için yeni motif araciügiüla PCNA ile etkilesime girmesi gerekebilen protein örnekleri Tablo 1'de Iistelenmektedir, bu yüzden protein bir DNA polimerazEl DNA Iigazü Topoizomeraz, DNA onarIi proteini, DNA onarIilIlliskili/etkilesime giren proteinler, Kardes kromatid kohezyonunda yer alan bir protein, Kromatin yeniden biçimlenmesi, DNA baglanmasüUbikuitin islemi veya SUMO islemi, E3 ubikuitin ligaz, Transkripsiyon faktörü, Hücre döngüsü düzenleyici, Protein kinaz, Metiltransferaz, AsetiI-transferaz, Kanser ile iliskili antijen, Yaplîal protein veya Sentrozom kinezin olabilmektedir.
Bulusun oligopeptidik bilesiginin yeterli bir seviyesi bir hücre içinde mevcut oldugunda, bu rekabetçi inhibisyondan dolayElbu proteinlerin bir veya daha fazlalellEl aktivitesi azalmaktadlEl veya hatta ortadan kaldlEIEhaktadIEl Burada aç[Eland[g]Üg]ibi oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü veya vektörün, kendi içinde enzimatik aktiviteye sahip olmad[gi- ve hücreler için toksik olmad[gi-inan[lB1aktadlîl (bakIlîl Örnek 2). Dolayßlýla, burada tanllandigllîgibi bir PCNA etkilesimli motif içeren bir peptidin ifadesinin, içinde ifade edildigi hücrenin büyümesi üzerinde hiçbir etkisi olmadigilîl veya sadece az etkisi oldugunu gösterilmektedir. Bu, ifade seviyesine baglEblabilmektedir.
Ancak, bazüjurumlarda, bulusun oligopeptidik bilesiklerinin sitotoksik olabilecegine ve buna uygun olarak kendi baslar. sitotoksik (veya sitostatik) maddeler olarak kullanllâbileceklerine inanlliiaktadlîl Dolaylglýla, bulusun bilesikleri, burada tartlgifllgllîlgibi, tedavi kosullarlEda sitostatik madde olarak kullanüâbilmektedir ve ayrEbir sitostatik madde veya radyoterapi ile birlikte kombinasyon halinde olmak zorunda degildir.
Deneyler, hücrelere uygulanan oligopeptidik bilesiklerin hücre üzerinde bir sitotoksik etkiye sahip olabilecegini göstermistir.
Sitotoksik etki, örnegin bilesigin sekansElveya bilesiminin kesin dogalela baglDolarak degisebilmektedir.
Daha belirli bir sekilde, burada tanllandlgllîgibi birden fazla PCNA-baglaylîünotif Içeren bilesik veya yapllâr ile arttlBIBilgbir Sitotoksik etkinin elde edilebilecegi gözlenmistir.
Bir kit veya bir farmasötik ürün burada açllZlanmakta olup, asaglalakileri içermektedir (i) burada tanIiIandiglEgibi bir oligopeptidik bilesik, burada tanIiIand[glEgibi bir nükleik asit molekülü ve/veya burada tannlandigilîgibi bir vektör; ve (ii) bir sitostatik madde.
Burada açiEJanan diger ürün (1) burada tanIiIandigiEgibi bir oligopeptidik bilesik, burada tanIiland[g]Ügibi bir nükleik asit molekülü ve/veya burada tanIiland[g]ü_L]ibi bir vektör ve (ii) hücrelerin büyümesini, örnegin hiperproliferatif bir bozuklugu veya sitostatik tedaviyi içeren bir tedaviyi inhibe etmenin arzu edildigi bir hastalik] veya durumun tedavisinde es zamanIIZI olarak, süslîda veya ayrEbyrEkullann için bir birlestirilmis preparat olarak bir sitostatik Bir oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü ve/veya burada tanIiIandgEgibi bir vektörün bir hücre veya hücre kültürüne in vitro olarak uygulanmaslîtia burada açiElanmaktadlEl Bu gibi in vitro yöntemler, DNA onarIiÇlbaknEl/e/veya hücre döngüsünün düzenlenmesini incelemek için kullanllâbilmektedir. In vitro yöntem, yeni sitostatik maddeleri tanIilamak için de kullanllâbilmektedir. Bu, sitostatik maddelerin daha hlîlEbir sekilde tanmlanmalela veya kendi baslariEb kullan-@Ha sadece zay[E| bir sekilde sitostatik olan, fakat bulusun oligopeptidik bilesigi, nükleik asit molekülü veya vektörü ile kombinasyon halinde kullanligilülda faydalüsitostatik aktiviteye sahip olan maddelerin tanlllanmas izin verebilmektedir.
Burada tanllandiglügibi yeni PCNA etkilesim motifi, hücrelerin büyümesinin, örnegin hiperproliferatif bir hastaligiElveya sitostatik tedavi veya radyoterapiyi içeren bir tedavinin inhibe edilmesinin arzu edildigi bir hastaliElveya durumun teshisinde veya görüntülenmesinde kullaniiâbilmektedir.
Bulus sahipleri, kanserle iliskili birkaç antijenin, PCNA-baglaylEEImotife sahip oldugunu bulmustur (bakIlZTablo 1). Bu yüzden, yukarldh tartlglalglligibi hiperproliferatif veya diger bozuklugun teshis edilebilecegi veya ilerlemesinin, bir protein içeren bir motifin konumunda ve/veya Ifade seviyesini tespit ederek görüntülenebilecegi planlanmaktadß burada proteinin anormal seviyesi ve/veya konumu bozuklugun örn., hiperproliferatif bir bozuklugun göstergesidir.
Bir “anormal seviye", protein seviyesinin, örn., aynEhücre türüne sahip saglllZJEbir hücrede bulunan protein seviyesi ile karsilâst-@Ia % 10, 20, 30 veya 40'tan daha fazla oldugu artmlgl bir protein seviyesi veya aynElhücre türüne sahip saglllZllilbir hücrede bulunan protein seviyesi ile karsllâst-[gllda % 10, 20, 30 veya 40 daha az oldugu azalmEI bir protein seviyesi anlam. gelmektedir.
Motifi içeren bir proteinin artmlîsl bir seviyesi, bir bozuklugun, örn., hiperproliferatif bozuklugun göstergesi olabilmektedir.
Motif içeren proteinin seviyesi bilinen herhangi bir protein tespit etme yöntemi kullanüârak analiz edilebilmektedir. Motif için özel bir antikor kullanllâbilmektedir. Antikor, bir tespit etme yönteminde kullanllßiak üzere motif için (Sigilîlserum albümini gibi bir referans proteini ile karsilâst-[gllrîha) yeterince özel olmalIB Antikor, bir monoklonal veya bir poliklonal antikor olabilmektedir ve bir tam antikor, örn. IgG, antikor parçaslîolabilmektedir.
Tespit etme deneyi, /n Viva veya in vitro, örn., bir doku veya hücre veya vücut SIEEEI örneginde, örn., bir hücresel lizat, serum veya kanda gerçeklestirilebilmektedir.
Tespit, antikoru tespit edilebilir bir maddeye (yani, antikor etiketleme) baglayarak (yani, fiziksel baglanma) kolaylastIElllâbilmektedir. Tespit edilebilir maddelerin örnekleri, çesitli enzimler, prostetik gruplar, flüoresan malzemeler, Iüminesan malzemeler, biyolüminesan malzemeler, NMR kontrast maddeler ve radyoaktif maddeleri içermektedir. Uygun enzimlerin örnekleri arasIa yabanturpu peroksidaz, alkalin fosfataz, Iusiferaz, beta-galaktosidaz, asetilkolinesteraz, glukoz oksidaz, lizozim, malat dehidrojenaz ve benzeri yer almaktadIEi uygun prostetik grup komplekslerinîn örnekleri arasIa streptavidin/biyotin ve avidin/ biyotin bulunmaktadlîj uygun flüoresan malzemelerinin örnekleri arasIa umbeliferon, flüoresein, flüoresein izotiyosiyanat, rodamin, diklorotriazinilamin flüoresein, dansil klorür veya fikoeritrin bulunmaktadü bir Iüminesan malzemesi örnegi Iuminol içermektedir; biyolüminesan malzemelerin örnekleri arasIa Iusiferaz, Iusiferin ve aekuorin bulunmaktadE ve uygun bir etiket durumunda, bir koloidal metalik veya metalik olmayan parçac[Etan yapllâbilmektedir.
Dolaylâlýla, hücrelerin büyümesini, örnegin hiperproliferatif bir bozuklugu inhibe etmenin arzu edildigi bir bozukluk veya durumdaki bir hastal[g]I ilerlemesini teshis etmek veya takip etmek için burada bir yöntem açmanmaktadlü söz konusu yöntem, asaglEIlaki adIilarEîçermektedir: (1)bir antikor-antijen kompleksinin formülasyonuna izin veren kosullar altIda motife özgü bir antikor ile söz konusu sujeden (örn., memeli) aI-n bir test örneginin temas ettirilmesi; (2)test örnegindeki antikor-antijen kompleksi miktarII ölçülmesi; ve (3)test örnegindeki antikor-antijen kompleksinin miktarII bir kontrol ile karsüâstlîllîhasü Kontrol, aynElsujeden allElan, örnegin; saglllZlEbir fibroblast hücresi gibi saglilZIlIbir hücre olabilmektedir.
Motife özgü antikorlar da burada aç[lZIanmaktadIE Hücrelerin büyümesini inhibe etmenin arzu edildigi örnegin hiperproliferatif bir bozukluk gibi bir bozukluk veya durumun teshisi veya takip edilmesi için bir kit açlKlanmaktadlü söz konusu kit, bozukluk veya kosulu tespit etmeye yönelik kullanIi talimatlarEl/e motife özgü bir antikor içermektedir. Tercihen, antikor, yukari açUZIand[gEgibi tespit edilebilir bir maddeye baglanmaktadlElveya kit bu gibi bir tespit edilebilir madde içermektedir.
Burada açllîlanan alternatif bir tespit etme yöntemi, motifi kodlayan bir nükleik asit molekülünün anormal bir seviyesinin tespit edilmesini içermektedir. Bu yöntemde, nükleik asit seviyesi, uygun sekilde etiketlenmis problar kullanuârak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya hibridizasyon teknikleri gibi uygun bir tespit yöntemi kullanilârak görüntülenmektedir.
Buradaki açllZlamalar, asaglahki Örneklere ve Sekillere referans ile daha detayllîlolarak açllZlanacaktlEl asidinin bu gerekli ve yeterli oldugunu veya es lokalizasyonu gösteren konfokal mikroskop görüntüleri içermektedir. EYFP ile etiketlenmis çesitli hABH2 yapHârlZU-Zöl kallEtHârIElçeren HABH2'nin bir N-terminal parçasLIl ECFP etiketli PCNA ile birlikte es lokalizasyon için test edilmistir (bakIEl Örnek 1). Sol levha, sadece hABH2 ile transfekte edilmis hücreleri gösterirken, kalan üç levha, bir hABH2 yapIQIlIe PCNA ile birlikte es transfekte edilen hücreleri göstermektedir. w, FRET analizinin sonuçlarIEIgösteren bir grafiktir. Normalize FRET (NFRET) ölçümleri, EYFP (sarEfIüoresan protein)/ECFP (camgöbegi flüoresan protein) (Levha 1, etiketlerin dimerizasyonundan dolayüarka plan), EYFP-PCNA / ECFP-PCNA (Levha 2, pozitif kontrol çünkü PCNA, PCNA'ya baglanmaktadlE), hAHBZ-EYFP / ECFP-PCNA (Levha 3) ve araleda gösterilmektedir. w, çesitli sitostatik maddelerin hABHZHO-EYFP ifade eden hücreler üzerindeki etkisini gösteren veya bir kontrol olarak EYFP'yi ifade eden grafikleri içermektedir.
Islemler sol tarafta, islem görmeyenler sag tarafta gösterilmektedir. Islemler, 4 gün boyunca 10 ;M MMS, 40 M BCNU, 1 M MMC ya da 600 ;M TMZ ile gerçeklestirilmistir (slBalea Sekiller 3 a-d). Sunulan veriler en az 3 deneyden birinin temsilcisidir, farklEl dozlarda hücre büyümesi 8 paralel kuyucukta test edilmistir. terminal amino asitlerinin bir sekans hizasElClustal W kullanilârak gösterilmektedir.
Sekanslar, bir kamu veri tabanIan elde edilmistir.
Sekil 5, çesitli farkllîltürlerden Örnek 4'te tanIiIanan proteinlerin sekanslarII hizalanmasIÜgiöstermektedir.
SM, Örnek 7'de tarif edildigi gibi çesitli peptitlerle sitotoksisite deneylerinin sonuçlarIEI gösteren grafikleri göstermektedir (Sekil 6 (a) ila (h)). HeLa hücreleri 96 kuyucuklu plakalara (6000 hücre/kuyucuk) ekildi ve 3 saat süreyle inkübe edildi. Serum olan ortamlarda (dolu elmaslar) veya serumun (dolu kare) yoklugunda oyuklara çesitli dozlarda peptit eklenmistir. 1 saat sonra %10 veya %20 serumla (hacimsiz ortam) esit hacimde ortamlar oyuklara eklenmistir. Hücreler, MTI' deneyi ile hayatta kalan hücrelerin ölçülmesinden önce 48 saat inkübe edildi. Grafikler, peptit konsantrasyonuna (uM) karsEl hücre büyümesini (OD750nm) göstermektedir. Örnekler Örneklerde kullanllân Deneysel Prosedürler Flüoresan etiketli ifade yapilârII ECFP-PCNA ve hABH21.261-EYFP'nin klonlanmasüiaha önce EYFP ve hABH211.261-EYFP, PCR ile üretilmistir. Amplikonlar slBislýla NdeI / AgeI ve AgeI / Eco/?I kullanilarak pEYFP-Nl'e (Clonetech) klonlanmlgtlE EST'nIn PCR ürünü (Görüntü klonu klonlanmlgtE EYFP-XPA yaplgü Dr. Wim Vermeulen (Hücre Biyolojisi ve Genetik Bölümü, Rotterdam) tarafIan cömertçe saglanan His9-HA-EGFP-XPA'da (Rademakers ve ark., 2003) EGFP ile (NheI / BsrGI parçasDJEYFP'nin degistirilmesi ile yapliîhlstß TFII-I-EYFP, Dr. Robert G. Roeder (Biyokimya ve Moleküler Biyoloji LaboratuarÇIRockefeller Üniversitesi, New York) tarafIIan cömertçe saglanan pI3CX-TFII-I'dan (Roy ve ark., 1993) TFII-I'nI PCR amplifikasyonu ve EYFP-N1 (Sad / ApaI) içine klonlanmaslîüe üretildi. EYFP-Topo-IIa, EGFP etiketinin (Eco/?I kör / NheI), William T. Beck (Chicago Üniversitesi, Moleküler Farmakoloji Anabilim DalüMoleküler Genetik Bölümü) taraflEtlan cömert biçimde saglanan EGFP-Top0- yapIlZlF4 mutantlarIEiçeren hABH21.7-EYFP yapllârüATG kodonunda mutasyona ugramlgl EYFP-Nl'e klonlanmaslîl tarafIan takip edilen XhoI / Eco/?I çilîl] ile oligolarI sertlestirilmesi ile yaplE1lStE Tüm nokta mutasyonlarüQuickChange® II kullanIi talimat- göre dogrudan bölge mutojenezi ile yapllBilgtlE Klglflama enzimleri ve Dana Intestinal Alkalin Fosfataz (CIP) New England Biolabs® As.'den ve oligonükleotidler MedProbe, Eurogentech (Oslo, Norveç)'den allBUElTüm yapllâr sekans ile dogrulandlîl Konfokal Görüntüleme ve FRET ölcümleri CanIEHeLa hücreleri, ECFP ve EYFP füzyon yapliârII geçici transfeksiyonundan 16 ila 24 saat sonra (üreticinin tavsiyelerine göre Fugene 6 (Roche Inc.) tarafIan) incelendi.
Flüoresan görüntüleri bir Plan-Apochromate 63x/1.4 optik yag hedefi ile donatilân bir Zeiss LSM 510 Meta lazer tarama mikroskobu kullanilârak edinildi. Arttmlgcamgöbegi flüoresan proteini (ECFP), A = 458 nm'de uyarIEl/e ardlglZltaramalar kullanHârak A = 470 ila 500 nm'de tespit edildi ve arttlîllüilgsarlîlllüoresan proteini (EYFP), A = 514 nm'de uyarIEle A = 530 ila 600 nm'de tespit edildi. PayI kaII[gJ|:1 um idi.
Eger etiketler (EYFP ve ECFP) birbirinden 100 Ã (10 nm) daha küçük ise, flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) meydana gelmektedir. HassaslastlEIBHg emisyon yöntemi kullanarak ve donör (ECFP) uyarllIhasEüzerine allEEllEYFP) emisyonunu ölçerek, FRET'i tespit ettik. ECFP florokromunun uyarilBwasIan sonra EYFP'den yayilân Egil yogunlugu, EYFP ve ECFP proteinler tarafIan yayliân @Etan daha güçlü oldugunda, verilen denklem söyledir: FRET= normallestirildi: NFRET = FRET/ (Il x I3)1/2. NFRET, tüm piksellerin 250'nin altIa yogunluklara sahip oldugu ve ortalama yogunluklarI hem verici hem de allEElyapilâr için 100 ve 200 aralebla oldugu 25'ten fazla piksel içeren bir ilgili bölgesi (ROI) içindeki ortalama yogunluklardan (I) hesaplanmlgtlî] Kanal 1 (ECFP) ve 3 (EYFP), görüntüleme için yukar- saptandElIDi, D2, 03 ve IA1, A2, A3, ECFP ve EYFP yapllârEile transfekte edilen hücreler için, aynEl ayarlarla ve ko-transfekte hücreler (Il ve 13) ile aynEfIüoresan yogunluklarEile belirlendi.
ECFP-PCNA ve EYFP-PCNA, pozitif kontroller olarak dahil edildi ve birlikte ifade edilen etiketlerin dimerizasyonu nedeniyle, bos vektörlerden ifade edilen ECFP ve EYFP proteinleri, tüm deneylerde negatif kontroller olarak dahil edildi.
Hücre dizilerinin kültürü ve hücre ekstraktlarII hazlîllanmasü Ilgili yapllârEkararIDJIr sekilde ifade eden HeLa (servikal kanseri) ve HaCaT (kendiliginden dönüstürülmüs keratinosit) hücreleri, transfeksiyonla (Fugene 6 ile) hazlHlandÇlardIan seyreltme ile hücre aylîilna veya klonlama ve uzun süreli seçici %10 Fetal BuzagEBerumu (FCS), Amfoterisin B (250 ug/ml, Sigma-Aldrich), gentamisin (100 ug/ml, Gibco) ve glutamin (1 mM, BioWhittaker®) takviyeli Dulbecco'nun modifiye edilmis Eagle Orta yüksek glukozu seçici olarak kültürleme (gentisin, G418, 400 ug/ml 37°C'de kültürlendi. HeLa'nI parçalarEla ayrllüig hücre ekstraktlarütampon I (10 mM Tris- HCI, pH ve tampon II'de (10 mM DTT, 1x Tam proteaz inhibitörü (Roche), fosfat inhibitör kokteylinde (PIC I ve PIC II, Sigma) içinde 1x PCV'de hücre peletlerinin yeniden süspanse edilmesiyle hazlElland ElHücreler, 4°C'de 30 dakika boyunca sürekli çalkalama altIa inkübe edildi. Süpernatan (çözünebilir parça) toplandlZlPelet (çekirdek içermektedir) tampon III'ün 1x PCV'sinde (10 mM Tris-HCI, pH ve 1x PCV tampon II içinde yeniden süspanse edildi ve özetle tüm çekirdekler parçalanana kadar ultrasonik banyoda tutuldu. 750 ug nükleol içeren parçaya santrifüj yap-Elle pelet (kromatine baglEbarça), tampon II ve III'de yeniden süspanse edildi. Kromatine bagIÜJarça, DNAz / RNAz kokteyli (2 pl Omnicleave® Endonuclease (200 U/ul, Epicentre® Biotecnologies, WI), 2 |JI DNAz (10 U/ul, Roche As.), 2 ul Bensonaz (250 U/ul, Novagene, Ge), 2 pl Mikrokokal Nükleaz (100-300 U/ul, Sigma-Aldrich) ve 2 pl RNAz (10 mg/ml, Sigma-Aldrich) ile oda slîlakligilîida 30 dakika ve 37 °C'de 1 saat süreyle inkübe edildi. 750 ug çözünebilir parça, IP boyunca 4°C'de bir gece ilave 2 pl Omnicleave® ile inkübe edildi.
Es immünopresigitasyon (es IP) ve western analizi (WB).
EYFP ve ECFP proteinlerini de tanIiIayan GFP proteinine karsEl/ükseltilmis bir dahili afinite saflastlîllfhlgltavsan poliklonal antikoru, New England Biolabs® Inc prosedürüne göre (su andan itibaren a-GFP boncuklarD] protein-A paramanyetik boncuklara (Dynal®) kovalent olarak baglanmlgtlü Her parça, bir gece 4°C'de (IP) sabit dönme boyunca a-GFP boncuklarü (pH 7.5) ile y[lZlandl:l/e aralar-a buz üzerinde 5 dakika inkübe edildi. Boncuklar ardIdan NuPAGE® (Invitrogen) yükleme tamponu ve 1 mM DTT içinde yeniden süspanse edildi, membranlara transfer edildi (Immobilon®, Millipore). Membranlar, PBST'de %5 düsük yagIIII süt tozunda 1 saat boyunca durduruldu (PBS ile %0.1 Tween® 20). Birincil antikorlar, &- PCNA (PC10, Santa Cruz biyoteknoloji As.) ve a-GFP, PBST'de %l'lik süt tozunda seyreltildi ve 1 saat boyunca inkübe edildi, ve daha sonra leislsîla ikincil antikorlar, sûaslýla Poliklonal Tavsan Anti-fare IgG/HRP ve Poliklonal Domuz Anti-tavsan IgG/HRP (DakoCytomation, Danimarka) taraf-an 1 saat boyunca inkübe edildi. Membranlar, kemilüminesans aleicEl (SuperSignal® West Femto Maximum, PIERCE) islem gördü ve proteinler, Kodak Image Sekans analizi Ilk sekans analizi için, Swiss-Prot ve TrEMBL veritabanlarüilgili sekans bölgesi ile benzer alt sekanslara sahip proteinleri bulmak için kullanIEl VeritabanlarEl PROSITE formatlEba motiflerle sorgulandlZIIIgili sekanslarlZlhizalamak için Clustal W kullanEI Ek Dosya 1'de listelenen korunmus motifler, gen ortologlarII karsllâstlîllîhaslýla belirlendi. Inparanoid versiyon 5.1 için veri dosyalarüorganizmalarl temsili bir alt kümesi için Inparanoid ag sunucusundan indirildi. Insan sekanslarlîlreferans olarak kullanIEl/e Inparanoid islenmis fasta dosyasÇllokal bir alet kullanllârak APIM motifi için düzenli bir ifadeyle arast- ElIIe, Val, Leu'ya ek olarak motifin 3 ya da 4 konumunda olup, es zamanlüilarak her iki konumda olmadigiÇlhafif sekilde genisletilmis bir motif tanlükullanIEl Toplam 22218 protein sekanleban, APIM motifine karslZEn az bir vurusa sahip olan 636 sekans vardLîl Bu girisler, eSLDB veritabanlEUa deneysel ve tahmin edilen alt hücresel ve çekirdegi hedefleyen hiçbir gösterge ile 349 giris ortadan kaldiîlllBiadlZlKalan 287 giris için, ilgili Inparanoid ortologlar tanmlandüilgili sekanslar fasta dosyalarIan çiElartIEle sonuçta elde edilen sekans kitaplllZlarEClZlustal W ile hizalandEl tanIilanmaslZlçin paralel olarak iki farklEbrosedür kullanIDIlk prosedürde (Konsensüs), konsensüs sekansEinsan sekansüdaki her vurus konumu için çoklu hizalamadan tahmin edilmistir. Konsensüsün tahmin edilmesi için esdeger semboller olarak uygulanan korunmus APIM motifindeki (Ala olmadan) konsensüs esdeger sembolleri tahmin edildiginde, böylece örn. Ile, Val ve Leu tek bir kaliEtEliürÜ olarak uygulandDVurus konumu kabul edilmeden önce düzenli ifade konsensüse karsIZtekrar test edildi. Alternatif prosedürde (AyrDZl düzenli ifade, insan sekansIaki bir vurus konumuna karslmg gelen her bir ortolog sekansa karsEliest edildi ve sadece ortologlar. en az %50'sinin ifadeyle eslestigi konumlar kabul edildi. Bu tahminde, sadece bosluklardan olusan alt sekanslar harici tutuldu ve örn., alternatif ek varyantlar olarak temsil edilebildigi öne sürülebilmektedir. Bu iki prosedür hemen hemen aynEsonuçlarIZl/erdi ve kombine edilmis çithEEk Dosya 1'de gösterildi. Toplam 37 giris bu prosedür ile ortadan kald-ükalan 226 giris listelendi ve analiz edildi. Çith- kullanllân protein aç[lZlamalar|J html formatIadlElve standart bir ag taraylîlîlle açilâbilmektedir.
Tahmin edilmis PCNA-baGIavIEüieptitlerin nokta-leke analizi 28 nmol peptit (lekeleri görüntülemek için Ponceau ile boyanmE) lekeleri içeren bir Amino- PEG500-UC540 tabakasü (gelistirilmis stabilite ile sertlestirilmis asit), Norveç Oslo Üniversitesi'ndeki Biyoteknoloji merkezinde bulunan peptit sentezi laboratuar-a hazlEIiandD Membran, 2 saat boyunca 1 ug/ml PCNA ile problandÇlardIan birincil antikor (on-PCNA, PC10) ile problandüle yukarlflia tarif edildigi gibi WB için gelistirildi.
Hücre yasam deneyi HeLa ve HaCaT hücreleri, 96 kuyucuklu plakaya (4000 hücre/kuyucuk) ekildi ve 4 saat süreyle inkübe edildi. Çesitli dozlarda MMS (metil metansülfonat, Acros), BCNU (1,3-Bis(2- kloroetil)-1-nitrosuream, Sigma), temozolomid (4-metiI-5-okso-2,3,4,6,8-pentazabisiklo dion karbamat, MMC, Sigma) kuyucuklara ilave edildi. UZOS hücreleri sadece MMS ve TMZ'ye maruz bükIüHücreler toplanana kadar sürekli olarak buna maruz blßkIDHücreler, MTT deneyi kullanilârak 4 gün süresince her gün toplandEKMosmann, 1983). CD 570 nm'de ölçüldü ve hayatta kalan hücreleri hesaplamak için en az 6 kuyucuktan ortalama kullan-ü Sunulan veriler, bir temsili deneyden elde edilen büyümedir ve en az 2 kere yeniden üretilmistir.
Bu Örnekte açlElanan bu çallgma, replikasyon odaklarIa hABH2'nin Iokalizasyonunu incelemektedir ve hABH2 ve PCNA arasIaki dogrudan etkilesimi ve bu gibi bir etkilesimden sorumlu olan hABH2 bölgesini belirlemektedir.
CanIElS-fazlühücrelerde, yesil flüoresan proteini (EGFP) ile etiketli PCNA, replikasyon bölgelerini saglayan farklEbdaklar olusturmaktadlîl ve bu yüzden de bir S-fazlElsaretIeyici olarak kullanüâbilmektedir.
Camgöbegi flüoresan proteini (ECFP) ile etiketlenmis PCNA, sarElllüoresan proteini (EYFP) ile kaynasmlg çesitli hABH2 silinme yapilârüle birlikte es ifade edildi. hABHZ'deki (hABH211-261- EYFP) 10 N-terminal amino asitinin silinmesinin, replikasyon odag Ia PCNA ile es lokalizasyonu tamamen ortadan kaldüllgllîbulunmustur. Önemli biçimde, bu 10 amino asit EYFP'ye (hABHZHO-EYFP olarak adlandlEllân bir yapljl'ermek için) kaynast-lglia, PCNA ile es Iokalizasyon için yeterli idi. (Sekil 1). Özellikle, ECFP-PCNA'n es ifadesi, tek bas. hABH2 yapllârlîl ifade eden hücrelerle karsllâst-Ilgla, hABH21-10-EYFP'nin yanlZIsEa, tam uzunlukta hABH2'nin (hABH lokalizasyonunu arttlElnlgtlE Bu, hABH2'nin 10 N- terminal amino asidi araclÜIlPCNA ve hABH2 arasIda dogrudan bir etkilesimi göstermektedir. hABH2 ve PCNA'nI yakIElZI derecesini incelemek için, flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) ölçülmüstür. Hem tam uzunluktaki hABH2-EYFP hem de hABHZHÜ-EYFP, ECFP-PCNA ile pozitif FRET üretmistir, bu da flüoresan etiketler arasIiaki mesafenin 100 Ã'dan az oldugunu göstermektedir. Bu, hABH2 varyantlarlEllEl ECFP-PCNA olarak aynükomplekste dogrudan etkilestigini veya içinde bulundugunu göstermektedir (Sekil 2). veya EYFP'yi kararlEbir sekilde ifade eden hücrelerden protein ekstraktlarEkullanllârak es immünopresipitasyon çallginalarljürütülmüstür. Anti-GFP-antikorlarÇlilgili füzyon proteinlerini immünopresipitat yapmak için kullanilÜilgtlEl Sonraki western blot analizleri, endojen EYFP ya da EYFP taraflEkjan çekilmedigini ortaya çlKbrmlgtB Birlikte ele allrîtllgllüda, bu sonuçlar, hABHZ'nin dogrudan PCNA ile etkilestigini ve baglaylEElsekansI hABHZIer 10 N- terminal amino asitleri içinde bulundugunu ortaya koymaktadlEl hABH21.10'un hABH2'yi inhibe edebilme kabiliyeti test edilmistir.
Tek bas. hABHZHO-EYFP veya EYFP ifade eden hücre dizileri, alkilleyici maddeler MMS (metil metansülfonat), BCNU (Karmustin), temozolomid (TZM) veya mitomisin C'ye (MMC) maruz bükHRIISIIE MMS, hABH2 taraflEhan onarüân 3-metilsitozin (3meC) ve 1-metiladenine (lmeA) yol açan bir SN2 alkilleyici madde iken, BCNU ise esas olarak çapraz sarmal çapraz baglar. hatta bazlJnono-baz siklik eklenti maddelerine -(1,N(6)etanoadenin) neden olan bir Oö-kloroetilleyici maddedir. TZM'nin bir OöG metilleyici madde oldugu rapor edilirken, MMC, CpG'lerde guaninin N-alkillemesi yoluyla çapraz sarmal çapraz baglarlEb neden olmaktadlü hABH21.1o-EYFP veya EYFP'nin aslElElifadesi, islem görmemis hücrelerin büyüme h- müdahale etmemistir; bununla birlikte, hABHZHÜ-EYFP ifadesinin, MMS ile islem için HeLa hücrelerinin duyarlllâst-[glüiiulunmustun SasIlîEbir sekilde, hABH21-1o-EYFP'nin test edilen tüm diger sitostatik maddelere HeLa hücrelerini duyarlilâstüligllulunmustur (Sekil 3). Bu, artan hassasiyetin sadece 3meC ve 1meA'yEbnardlfjilEla inanllân hABHZ'nin inhibisyonundan kaynaklanmad[gllügöstermektedin Önceki bir çallglnadan, fare Ati/72” hücrelerinin, yani ABH2 kobay hücrelerin, MMS'ye karsEl artmlglbir hassasiyet gösterdigi, ancak BCNU'ya karsügiöstermedigi bilinmektedir. Bu nedenle, hABH21.1o-EYFP'yi ifade eden hücrelerin BCNU gibi sitostatik maddelere olan artle duyarliügllZBadece hABH2'nin inhibe edilmesi ile açiKlanamamaktadlE hABH21.10-EYFP'yi kararlElbir sekilde ifade eden HaCaT (kendiliginden dönüstürülmüs keratinosit) hücreleri de MMS ve TMZ'ye karsüslîlliluyarlüldi.
FarklElaIkilIeyici maddeler uygulandiEtan sonra hücrelerin aklgl ve komet deneyi analizi, ilaçlarI hücre döngüsünü farkll3ekilde etkiledigini ve komet deneyi tarafIEtIan tespit edildigi gibi DNA onarIiElara maddelerinin (abazik bölgeler, SSB, DSB) farkIIZIdüzeylerini ve modellerini uyardiglllîgliöstermistir. MMS, bir S-fazEliutulmalela (gün 1) yol açmlgtlîlve 4 saat sonra en yüksek DNA onarn ara maddelerini vermistir. Bununla birlikte, MMS uygulanmlgl hücreler, normal hücre döngüsü daglIJBiIIZIgöstermis ve 2. günde DNA onarIi ara maddelerinde artigi olmamlgtlü MMS'ye benzer sekilde TMZ, 4 saat sonra en yüksek onarIi ara ürünlerine de yol açmaktadIEJ ancak hücreler G2/M'de 3. güne kadar farklüair hasar ve onarIl modeline isaret ederek tutulmustur. TMZ ayrlîla test edilen diger üç maddeden daha fazla sarmal kopmalela neden olmustur. Bu durum saslîli-IEI çünkü TMZ'nin MGMT tarafIan herhangi bir baz ya da sarmal klElIB'ialarII çllZlarllüiasIEiçermeyen bir dogrudan onarIi olugu esasen Oömetil-G'yi uyard [giüb inanllßiaktadlEl BCNU uygulamasÇl 1'inci günde G2/M'nin tutulmasi ve çok düsük seviyede onarIi ara ürünlerine yol açarak, çapraz baglarEI içeren hücrelerin çogunun öldügünü göstermistir. Bunun yanlis& MMC uygulamasÇII. ve 2. günlerde S-fainiutulmaleb neden olmaktadlee bu, hABHZHO-EYFP ifade eden hücreler için kontrol hücrelerinden daha belirgindi. Hücreler, 3. günde G2/M'de hala tutulmustur. MMC uygulamasßonrasEkomet deneyinde hücre dizileri arasüda önemli farkllIJKJar gözlenemedi, ancak 2. günde onarIi ara maddeleri saylîlîn tepedeydi.
Genel olarak, EYFP ve hABHZHO-EYFP ifade eden hücreler arasIdaki onarIi ara madde miktaria komet deneyi ile anlamlEllarkIarI saptanmaslîilnümkün olmamlStE Komet ve aklgl analizi, kullanllân farklünaddelerin, hem onarIiI farklünodellerini hem de farkIEhücre döngüsü yanlfllarIIEluyard[g]Elgöstermektedir. Yine de tüm maddeler, EYFP ifade eden hücrelerle karslßst.[glIa, APIM ifade eden hücrelerde sitotoksisiteyi arttÜnlgtlÜ bu nedenle onarIi veya hücre ölümü araleUaki düzenlemede birkaç APIM içeren proteinlerin rolünü desteklemistir.
Birkaç farklEtürden veritaban[IsekanslarDiBHZIerin bir hizasÇl7 N-terminal amino asitlerinin yüksek miktarda korundugunu ortaya çllîbrmlîstlîlßekil 4). Bir baglaylîlîsekanslîtanlilamak amaclila, peptit-PCNA etkilesimi için bu amino asitlerin önemi, bir nokta leke deneyi kullanllârak incelenmistir. Digerlerine ilaveten, Arg3 ve Lys7'nin birbirlerini ikame edebildikleri ve Leu5 ve Val6'nlEI, PCNA'ya dogru afinitesini etkilemeden, Ile ve Ala gibi diger alifatik amino asitler ile ikame edilebildigi bulunmustur. Ek olarak, tamamen korunmus aromatik amino asit, Phe4, Tyr ile ikame edilebilmektedir, oysa ki bu konumdaki Ala, PCNA baglanmasIEönemIi ölçüde azaltmaktadlB Ala ile 1-2 ve 8-10 amino asitlerinin ikameleri, PCNA baglanmasIEletkilememistir, bu da çekirdek etkilesimli sekans olarak pentapeptit RFLVK'yEGSEK KIM NO. 2) önermistir.
Diger deneyler, bu pentapeptitin PCNA baglanmasüçin tek bas. yeterli oldugunu ortaya koymustur, ancak ilave komsu amino asitler etkilesimi arttünlgtlîl Daha sonra, hABH2'nin amino asitleri 1-7 ve Phe4'ün Tyr, Trp veya Ala ile yer degistirildigi bu sekanlel varyantlarüEYFP ile füzyon halinde ifade edilmis ve in w'i/o PCNA ile birlikte es lokalizasyon için test edilmistir. Nokta leke deneyinde bulunana benzer olarak, konum 4'te bir aromatik amino asit içeren füzyon proteinleri, ECFP-PCNA ile birlikte es lokalize edilirken, bu konumda Ala ile birlikte olan proteinler lokalize edilmemistir.
Swiss-Prot ve TrEMBL veritabanlarÇlhABHZ'nin PCNA'ya baglanmasIan sorumlu oldugu gibi belirlenmis sekans olarak benzer alt sekanslara sahip proteinleri bulmak için kullanIüSorgu olarak konsensüs [KR]-[FYW]-[LI-VA]-[LIVA]-[KR] (SEK KIM NO. 30) kullanilârak 226 vurus elde edilmistir (bir kigla açilîlama için Tablo 1'e bakIiî), bunlarI birkaç insan proteini analiz için seçilmistir.
Bunlardan biri, 7 N-terminal amino asitleri içinde yukariahki konsensüs sekansIDIçeren hABHZ benzeri bir proteindir. Bu protein ayrIEia, durmus transkripsiyonun ilerlemesi için önemli bir proteindir ve TFIIS uzama faktöründe bulunan korunmus N-terminal etki alanü'yü da içermektedir. Bulus sahipleri bu proteini TFIIS benzeri protein (TFIIS-L) olarak adlandlEHEI Bu proteinin fonksiyonu bilinmemektedir.
Ikinci protein, 4 konsensüs sekansEiçeren çok fonksiyonlu transkripsiyon faktörü TFII-I idi.
TFII-I, hücre döngüsü kontrolü ve proliferasyon için çok önemlidir ve TFII-I'yEiasiElEiifade eden hücreler, y-HZAX odagII (DNA çift sarmal klülimasüçin bir isaretleyici) kaIlEIIJgiIEI arttiîrinlgtiüve DNA onari Ia TFII-I için bir rol ortaya koymustur.
Bir konsensüs sekanslîilçeren DNA topoizomeraz II alfa (Topo II a) da arastlîllüilgtiîi Topo II oc, replikasyon sonrasEiDNA'nI parçalarlEla ayrÜIhaletla ve DNA ayriIIhasiüha görev yapmaktadE Sarmal kiîrlilarEtanigbn anahtar nükleotid eksizyon onarIi proteini (NER) XPA'da dahilen bir konsensüs sekansEbulunmustur.
Uygun sentrozom fonksiyonu ve kromozom ayrIiEHçin önemli olarak gösterilmis bir homolog rekombinasyon proteini olan RADSIB'de bir konsensüs sekansElbulunmustur.
Diger protein, bir konsensüs sekansEiçerdigi bulunmus Fanconi anemi çekirdegi kompleks proteini, FANCC idi. Fanconi anemi (FA), aplastik anemi, artmiglösemi hassasiyeti ve çapraz baglama maddelerine karsEl asßü hassasiyet ile karakterize edilen nadir bir genetik bozukluktur. FA çekirdek kompleksinin, çapraz baglama maddelerinin DNA onarIiIEI düzenleyen DNA hasarlîla aktive edilen sinyallesme yolagIa yer aldigiügösterilmistir.
Tüm bu proteinlerde, varsayilân PCNA_bagIayiEümotifin farkIEltürIer boyunca korunmus oldugu bulunmustur (Sekil 5). Bu bes protein arasia sadece Topo II cx ve FANCC'nI (hasardan sonra) nükleer S-fazlîrbdaglîitla BRCA1 ile es lokalize oldugu bildirilmistir ve Topo 11 at, potansiyel bir PIP kutusu (QttLaFkp, aa 1277-84) içeren tek proteindir. Bulus sahipleri simdi, bu proteinlerin her birinin ve hepsinin EYFP füzyon proteinlerinin S-fazlüadakta ECFP- PCNA ile es lokalize oldugunu göstermistir.
Bulunan proteinleri içeren diger ilginç APIM; replikasyon çatallanmalarIan kaynaklanan topolojik problemlerin çözülmesinde yer alan DNA onarlEIiÇIPARP-l ortag ÇlTopo II a izoform DNA topoizomeraz II beta'ylZlçeren birkaç DNA onarIi isleminde bulunan POIi(ADP-riboz) ailesinin (PARP-l, 2 ve 4) elemanlarIlEI Ayrlîla, APIM, her iki nokta mutajenezinde ve daha büyük ölçekli genom stabilitesinde bulunan translezyon polimerazlEl (Ç) REV3L alt biriminde, hem DNA replikasyonu hem de onarIiIa yer alan DNA Iigaz I ve IV'de, dört E3 ubikuitin- protein ligazIda (UHRF1 ve UHRF2/NIRF, UBRl ve 2) bulunmaktadlîl ve hepsi hücre döngüsünün düzenlenmesinde, genomun korunmasIa ve bütünlügünde, diger birkaç E3 ubikuitin IigazIa (Tablo 1) yer almaktadlEl Ilginç bir sekilde, E3 ubikuitin IigazlEllEl, meme tümörü olusumunda genetik ve ifade olarak sÜZlllZIa degistirildigi gösterilmektedir. AynlZl zamanda APIM içeren protein N-asetiltransferaz ESCOI/EFOl'dir, bu, maya ortologunun kesilmis PIP-kutusu aracHJgilýla PCNA'ya baglandlgllîlhir proteindir ve düzgün kardes kromatid kohezyonunda bulunmaktadlîl ve kromozom proteini 5, hSMCS'in insan yaplgial korumanlEI, HR araciligllýla çift sarmal klElllÜianI DNA onarma ve ALT hücrelerinde telomerlerin korunmas. rol oynadlglElgösterilmistir. Son olarak, genel transkripsiyon faktörleri II ve APIM motifini içerdigi bulunmaktadlEl(Tabl0 1).
Protein tL'irL'i / APIM içeren protein/er DNA polimeraz Pol zeta katalitik alt birim (hREV3L)1 Protein türü / APIM içeren protein/er DNA Iigaz DNA Iigaz Il, DNA ligaz IV Topoizomeraz Topo II alfa ve Topo II beta2 DNA onarI hABH2*, XPA*, PARP-13, 2 ve 4, RADSlB*, FANCC*4 proteini DNA onarIiEl iliskili XPA-baglaylîlîbrotein 2, BRCAl/BRCAZ-içeren kompleks alt birim 45 (prot-BRE), X-ray radyasyon /etkilesimli proteinler direnci iliskili protein 1 Kardes kromatid N-asetiltransferaz ESCOl/EFOli, hSMC55 kohezyonu Kromatin yeniden biçimlendirme ve DNA baglaylîl] proteinler Kromoetki alanDhelikaz-DNA-baglaylEEIprotein 3, 4 ve 5, RSF kromatin yeniden biçimlendirme kompleksi p5 E3 ubikuitin ligazlar UHFR1, UHFR2, UBRl, UBRZ, Yüzük parmaglîiroteinleri' 3, 17 ve 151, Muhtemelen E3 ubikuitin-protein ligaz MYCBP2 Ubikuitin islemi Ubikuitine özgü-islem proteazlIGFAF-X) SUMO islemi Sentrin/SUMO'ya özgü proteaz SENPZ Transkripsiyon faktörleri TFIIS-L*, TFII-I*, TFIIE-alfa, Sterol düzenleyici eleman baglaylaîtranskri'psiyon faktörü 2 (SREBFZ), Transkripsiyon faktörü benzeri protein MRG15 ve X (Ölümlülük faktörü 4-1 ve 2 benzeri protein), E2F transkripsiyon faktörü 7 düzenleyicileri döngüsü Hücre bölünmesi döngüsü iliskili 2, Hücre ölümünün BcIZ-etkilesimli araclîü Testis spermatosit apoptozis-iliskili gen 2 protein Protein kinazlar Serin /T reonin (S/T) -protein kinazlar SRPK1 ve 2, 33 ve MST4, Lösin bakIiIan zengin tekrar S/T- protein kinaz 1, STK23 (S/T protein kinaz 23), S/T protein kinaz PLK3, Mikrotübül- iliskili S/T-protein kinazüMikrotûbül iliskili S/T-protein kinaz 1, P13-kinaz pllO alt birim gama, protein kinaz aktivatörü A'ya baglElInterferon ile uyarllâbi'lir çift sarmal RNA, FYVE parmak içeren fosfoinositid kinazl, Fosfoinositid 3-Kinaz-C2-beta, Fosfatidilinositol-4-fosfat 5-kinaz tip II alfa ve beta, FosfatidilinositoI-4,5- bisfosfat 3-kinaz katalitik alt birim alfa izoformu, MAPKAP kinaz 2 ve 5, Mitojen ile aktive olan protein kinaz 15 (MAP 15) Metiltransferaz H3 Iizin-4'e özgü MLL3, H3-K9 metiltransferaz 5, Va rsayllân rRNA metiltransferaz 3 Asetil-transferaz Diasetilsliserol O-asetil transferaz (DGATl) Kanserle antijenler Melanom iliskili antijen El, MAGE E1, MAGE , Myc- baglaylElIiiirotein iliskili protein, Myb baglaylElIprotein 1A, Hepatoma türevli büyüme faktörü iliskili protein 2 izoform 1, Serolojik olarak tannlanmlgkolon kanseri antijeni 1 Yathl proteinler Lamin-Bl ve 82, Aktin-benzeri protein 2 Proteinler/77 tÜrÜ/ grubu APIM içeren protein/er Sentrozom, kinezinler, Sentrozomal protein 1 10kDA (Cep 110), Sentrozomal protein 192kDa, Mikrotübül artüliç yönlendirilmis kinezin motoru 3 (KIF3A), Kinezin ag @zincir (UKHC), kinetokor-iliskil'i protein 1 Koyu renk: Normal kosullar aItIIa veya DNA hasarlian sonra replikasyon odagIIa lokalize olan proteinler. Örnek 4'te çallgllân proteinlerdeki konsensüs sekansII fonksiyonu deneysel olarak incelenmistir. In i//i/o PCNA ile es Iokalizasyon ve in vitro PCNA etkilesimini bozan Ala ile konsensüs sekansIaki aromatik aminoasit Phe'nin ikamesinden dolayüilgili mutasyonun tam uzunluktaki proteinler üzerinde benzer etkiye sahip olup olmadfglEincelenmistir. Phe4'ün tam uzunluk hABHZ'de Ala'ya mutasyonu, PCNA ile es lokalizasyonu bozmustur. TFII-I'de, olarak Ala'ya ikame edildi. Tek bir mutasyon, PCNA ile es lokalizasyonu azaltmadüancak TFII-I'da tüm konsensüs sekanslarldaki mutasyonlar, replikasyon odagIa PCNA ile es lokalizasyonu güçlü bir sekilde azaltmlgtlü bu, aynEbroteinde bulunan birçok konsensüs sekanslînotiflerinin ideal PCNA etkilesimine katklah bulunabilecegini göstermektedir.
Referanslar Aas, P.A., Otterlei, M., Falnes, P.O., Vagbo, C.B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., ve Krokan, H.E. (2003). Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA. Nature 421, 859- M0, Y.Y., ve Beck, W.T. (1999). Association of human DNA topoisomerase IIaIpha with mitotic chromosomes in mammalian cells is independent of its catalytic activity.
Experimental cell research 252, 50-62.
Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cy-totoxicity assays. Journal of immunological methods 65, 55-63.
Rademakers, S., Volker, M., Hoogstraten, D., Nigg, A.L., Mone, M.J., Van Zeeland, A.A., Hoeijmakers, J.H., Hout-smuller, AB., ve Vermeulen, W. (2003). Xeroderma pigmentosum group A protein Ioads as a separate factor onto DNA lesions. Mol Cell Biol Roy, A.L., Malik, S., Meisterernst, M., and Roeder, R.G. (1993). Ari alternative pathway for transcription initiation involving TFII-I. Nature 365, 355-359.
Sinyal sekanslarEile bir motif (“APIM") iceren Deptite sahip Yapllâ'rI HazlHlanmaslZi/e Test Edilmesi SEK KIM NO. 98 ila 117 peptitleri, standart teknikler kullanliârak sentezlendi ve standart teknikler kullanüârak yine belirtilen yerlerde flüoresan etiketler eklendi. Peptitler, her bir peptit için amino asit sekansIlIgösteren Tablo 3'te gösterilmektedir ve ayrEla, SEK KIM NO 98 ila 116 L-amino asitlerinden olusan her bir peptiti (dahil edilen, uygun bir sekilde kullanllân peptit, NLS, CPP ve baglaylîllâr ve etiket içeren motif (“APIM”)) olusturan ayrEl bilesenleri ayrüyrüistelemektedir. SEK KIM NO. 117 olan RI-MDR26-3, D-amino asitlerden olusan bir retro-inverso peptittir. Tablo 3'te gösterilen tüm peptitler, en az bir APIM peptiti, bir NLS ve bir CPP'ye sahiptir.
Peptitlerin hücreler üzerindeki etkisini göstermek için çesitli çallginalar yapllîhlgtlEl Dolaylîlsîla hücreler, yukar-ki Örneklerde aç[lZlananIara dayallIlteknikler kullanilârak, hücrelerdeki peptitlerin lokalizasyonunu belirlemek için peptitlerle inkübe edildi. Klgaca, flüoresan etiketlerle isaretlenmis olarak belirtilen peptitler, hücreler (HeLa hücreleri) ile inkübe edildi ve hücresel anlam, konfokal mikroskop kullanilârak incelendi.
Sitostatik ilaçlarI etkilerine karsElduyarlllâstlBlân hücrelerdeki peptitlerin etkileri, asaglElia aç[lZIand[glgibi bir M'I'I' deneyi ve bir klonojenik deney (CFU deneyi) kullanüârak incelendi.
Peptitlerin sitotoksisitesi, Sitostatik ilaçlar olmadigllEtla, sadece peptitler kullanlßrak, asaglâti tarif edildigi gibi bir MTI' deneyi ile arast-lZISitotoksisite verileri ayrlîla, kontrol peptitlerinin daha uzun süre (4 gün) takip edildigi Sitostatik ilaç MTT deneylerinde (ancak Sitostatik ilaç olmaks- peptit ile kontroller) kullanllân kontrollerden elde edildi.
Membran toksisitesi, asagi aç [Eland [giügibi tekrar incelendi.
Peptitlerin stabilitesi, serum içeren ortamdaki peptitlerin inkübasyonundan sonra peptitlerin MS analizi ile arast-El MTT deneyi HeLa hücreleri 96 kuyucuklu plakaya (6000 hücre/kuyucuk) ekildi ve 3 saat boyunca inkübe edildi. Kuyucuklara çesitli dozlarda MMS ve Sisplatin ilave edildi. 24 saat sonra, peptitler, serumsuz ortamdaki hücrelere ilave edildi ve 1 saat süreyle inkübe edildi. Sitostatik ilaçlar ile yeni ortam eklendi ve hücreler 24, 48 ve 72 saat sonra toplandlZI Hücrelere (3-(4,5- DimetiItiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) MTT eklendi ve CD 570 nm'de [52] Ölçüldü ve hayatta kalan hücreleri hesaplamak için en az 6 kuyucuktan ortalama kullanIlZlVeriler, bir temsili deneyden elde edilen büyüme olarak saglanmaktadlüve en az 2 kere yeniden üretildi.
Klono'enik CFU dene içeren 11 ml'lik büyüme ortamIa 10 cm'lik hücre kültürü kaplar. ekildi. 2. gün hücrelere, serumsuz kosullar altIa bir saat boyunca peptitler uygulandDYeni sitostatik ilaçlar içeren yeni ortam, 10 gün boyunca inkübasyon için hücrelere eklendi. Hücreler daha sonra oda slîlakllgllda 15 dakika süreyle PBS içindeki %6 glutar- aldehit içinde sabitlendi, bir kere daha PBS içinde ylElandEl'e kristal mor ile boyandüle koloni olusturan birimler sayIlZlSadece en az 50 hücreden olusan koloniler dahil edildi.
Sitotoksisite Deneyi 48 saat sonra peptitlerin sitotoksisitesi, MTI' deneyi kullanllârak ölçülmektedir. HeLa hücreleri 96 kuyucuklu plakaya (6000 hücre/kuyucuk) ekildi ve 3 saat süreyle inkübe edildi. Ortamda serum varl[g]Ia veya yoklugunda çesitli peptit dozlarElkuyucuklara eklendi. 1 saat sonra, esit hacimde 1X veya 2X (serumsuz ortama) ile ortam ilave edildi ve hücreler, MTT eklenmesinden önce 48 saat boyunca inkübe edildi (yukarlýla bakIlîp.
Aklglîlliücre ölçümü ile membran toksisitesi Hücrelere, 1 saat boyunca farkiEkonsantrasyonlardaki (2, 4 ve 8 uM) peptit uygulandDDaha sonra, propidyum Iyodür (PI) (PBS içinde 50 ug/ml) ilave edildi, bu, hücre membranlarII geçirgen oldugu durumda DNA'yEIboyayacaktIB Analizler, bir FACS Canto aklgllîhücreölçerde (BD-Life Science) sonraki 10 dakika içinde gerçeklestirildi.
Sonuçlar Tablo 4'te gösterilmektedir. Buradan, çekirdege lokalize olan bir CPP ve bir NLS ile bir APIM Içeren peptitin aleUa yapllârüilan tüm isaretle etiketlenen peptitlerin test edildigi görülebilmektedir. Bu etki, yapII tek tek bilesenlerini, degisen uzunluktaki baglaylîllârIü/e baglaylEIleekanslar olmadan peptitleri baglayan farklEbaglaylEElsekanslar ile peptitler için görülmüstür. Bu, baglayEElsekanslarII varllglII gerekli olmadlglIEl/e baglaylEEsekansII degisebilecegini göstermektedir.
Sitostatik maddelerle yapüân M'I'l' ve CFU deneylerinin sonuçlarü sitostatik maddelerin büyümeyi inhibe edici etkilerini artliînadaki peptitlerin etkisini göstermektedir. Dolaylglsîla, peptitler, hücreleri sitostatik maddelerin etkilerine karsEUuyarllZhale getirebilmektedir. Bu etki, bir APIM içeren peptiti ifade eden transfekte hücre dizileri için yukarlâh Örnek 2'de rapor edilene benzerdir.
Tablo 4 ayrlîb bir dizi peptitin sitotoksik etkisini göstermektedir. Daha fazla deneysel çallglria (veriler gösterilmemektedir), çekirdege lokalize olmayan peptitler ile karsllâst-Ilgla çekirdege lokalize olan peptitler ile daha yüksek bir sitotoksik etkinin gözlemlendigi göstermistir. Bir peptit (MDR2; SEK KIM NO. 98) ile yürütülen bir membran toksisite deneyi, peptitler için gözlenen sitotoksik etkinin membran etkisinden dolayEbImadiglIEönerebilen membran toksisitesinin düsük oldugunu gösterdigi görülmektedir. Bazülurumlarda sitotoksik etkinin sadece artmlg peptit konsantrasyonlarElile görülebildigi (örnegin, 1|JM peptit sitotoksisiteside görülemeyebilirken (bir sitotoksik maddeye karsEduyarlllâstIEllân hücrelerde görülebilmesine ragmen), buna ragmen 2 uM peptitte peptitin kendisinin bir sitotoksik etkisi, hatta hassaslastlElEIEtkisi görülmektedir) gözlemlenmistir.
Tablo 4'teki sonuçlar, aynüamanda, sitostatik maddelere hücrelerin duyarlllâstlEllBiasIa ve sitotoksisitede, hücrelere giren ve çekirdege lokalize olan peptitlerin etkilerinin farkIIZNLS ve/veya CPP sekanslarEliIe elde edilebilecegini göstermektedir, etkinin büyüklügü veya kapsamEdegiskenlik gösterebilirken, etkiler özel NLS ve/veya CPP sekanslarlEla bagllîblarak görülmemektedir.
Tablo 3 ve 4'te gösterildigi gibi belirli peptitler, N-ucunda bir Ac grubunu içerdi. Bu, hem serumda hem de sitosolda peptitlerin stabilize edilmesi amacEile dahil edilmistir. Peptit MDR, CFU ve M'I'T deneylerinde ve sitotoksisite testlerinde iyi stabilite ve iyi aktivite göstermistir. MDR26-72-O, bir CPP olarak R bakmlütlan zengin bir sekans içermektedir. Esit derecede iyi sonuçlarlEl, CPP'nin, NLS'nin SV40 ya da UNG2-türevli olabildigi Penetratin ya da HIV-TAT bazllZlya da bir CPP türevi ile degistirildigi esdeger peptitler ile elde edilebilecegine inan [IBiaktadlEl S_EK Peptit # Toplam Peptit SekansEI APIM sekansEI BaglayIEl. NLS BaglayIEl 98 MDRZ MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK-AhXS-FAM)G MDRWLVK (SEKANS GAQ PKKKRKVL (SEKANS KIMLIK NO: KIMLIK NO: 118) 123) 99 MDR27 MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK-AhxS-FAM) G MDRWLVK (SEKANS GAW KKKRVK(SEKANS KIMLIK NO: 124) 11 KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) G KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 118) (SEKANS KIMLIK NO: (SEKANS KIMLIK NO: (SEKANS KIMLIK NO: 1 'in\ FAM)G KIMLIK NO: 118) KIMLIK NO: 122) S_EK Peptit # Toplam Peptit Sekansü 2. APIM BaglayIE CPP Sekme 98 MDR2 MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK-AhxS- RQIKIWEQNRRMKWK K-Ahx- FAM)G (SEKANS KIMLIK NO: 129) S-F AM)G 99 MDR27 MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK-AhXS-FAM) G RKKRRQRRR (SEKANS K-Ahx- KIMLIK NO: 130) 5-F AM)G 100 MDR26-0 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG RKKRRQRRRG (SEKANS Sekme yol( KIMLIK NO: 131) G RKKRRQRRR (SEKANS K-Ahx- KIMLIK NO: 130) S-F AM)G G RKKRRQRRR (SEKANS K-Ahx- KIMLIK NO: S_EK Peptit # Toplam Peptit Sekansü 2.APIM BaglayIE CPP Sekme G RKKRRQRRR (SEKANS K-Ahx- KIMLIK NO: 130) 5-F G RKKRRQRRR (SEKANS K-Ahx- KIMLIK NO: 130) 5-F RRRR_RRR_RRRR (SEKANS K-Ahx- G KIMLIK NO: 132) 5-F 106 MDR26-8 MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK-AhxS- RQIKIWFQNRRMKWK K-Ahx- FAM)G (SEKANS KIMLIK NO: 129) S-F G RKKRRQRRR (SEKANS K-Ahx- KIMLIK NO: 130) 5-F G RRRRARRR'RRRR (SEKANS K- KIMLIK NO: 132) FAMG G RKKRRQRRR (SEKANS K- KIMLIK NO: 130) FAMG G RKKRRQRRR (SEKANS K- KIMLIK NO: 130) FAMG 111 MDR24-43 MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK-FITC RKKRRQRRR (SEKANS K-FITC KIMLIK NO: 130) 112 MDR26-72-0 Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR RRRRARRR'RRRR (SEKANS Sekme KIMLIK NO: 132) yok 113 MDR26-72-A Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR RRRR'RRRRRRR (SEKANS Sekme KIMLIK NO: 132) yak SSK Peptit # Toplam Peptit SekansEl 2.APIM BaglayIE] CPP Sekme G RRRRRRRRRRR .(SEKANS K-Ahx- KIMLIK NO: 132) 5-F 115 MDR26-72<01 Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRR .(SEKANS Sekme KIMLIK NO: 132) yok 116 MDR34 MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK-AhxS- RWLVK (SEKANS WWW RKKRRQRRR (SEKANS K-Ahx- FAM)G KIMLIK NO: 117 RI-MDR26-3 FITC-KRRRQRRKKRIIKRKKKWWWKVLWRDM RRRQRRKKR (SEKANS K-FITC KIMLIK NO: 133) SEK KIM Peptit # Toplam Peptit Sekansü Lokalizasyon CFU MTI' Stabilite Sitotoksisite Membran NO: Toksisitesi 98 MDR2 MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK-AhxS- çekirdek + +(+) Düsük 99 MDRZ7 MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK-AhXS-FAM) G çekirdek + + G çekirdek + + G çekirdek + + 106 MDR26-8 MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK- çekirdek ++ ++ ++ + Ahx5-FAM)G 112 MDR26-72-Ü Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR bilinmeyen +++ ++ ++ ++ 116 MDR34 MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK - çekirdek - ' ++ ++ AhxS-FAM)G Baska Sitotoksisite Verisi Bu Örnekte Sitotoksisite testlerinden daha ayrlEtlilE'eriler sunulmaktadE Sitotoksisite deneyi, yukar-ki Örnek 6'da açÜZlandlg'llZgibi gerçeklestirildi. Sonuçlar, peptitler MDR26-0 (SEKANS KIMLIK NO: , MDR, MDR26- için MTI' Sitotoksisite deneyinin sonuçlarlügiösteren Sekil 6'da sunulmaktadB Peptitlerin sitotoksisitesinin serum yoklugunda görülen daha büyük bir etki ile gözlenebilecegi görülecektir. Sitotoksisite, bir APIM motifine sahip tüm MDR26 varyant peptitleri ile görülmektedir. Artmlgl Sitotoksisite, iki APIM motifine sahip MDR34 varyantlarlîl ile görülmektedir. Sitotoksisite gösteren benzer sonuçlar, hiçbir etikete sahip olmayan (MDR34- 0) veya MDR34'ün inverso (I-MDR-34) ya da retroinverso (RI-MDR-34) esdegerleri olan MDR34'e (SEK KIM NO. 116) karslIJJZl gelen peptitler ile elde edilmektedir. Bir NLS sekans. sahip olmayan ve bunun yerine baglaylEEI olarak uzatllBiISlbir baglayiEIEekansElILVIII (SEK KIM NO. 95) içermis MDR34-2, azalmlglsitotoksisite göstermektedir.
PCNA ve APIM içeren peptitler arasIaki etkilesimi destekleyen baska deneyler yapIÇles immünopresipitasyon (es IP) deneyleri, EYFP-PCNA'yEl kararIEI bir sekilde ifade eden hücrelerden hem endojen PCNA hem de EYFP-PCNA'nI hABHZ'yi asaglîlçekebildigini göstermistir. Kromatin ile zenginlestirilmis parçalarda hABH2 ve PCNA araletla görülen daha fazla etkilesim, PCNA veya hABH2 üzerinde posttranslasyonal modifikasyonlarl] göstermektedir. Bu deneylerde, EYFP-PCNA'ylZlkararlElbir sekilde ifade eden hücrelerden hABH2'nin es-IP'si, a-EYFP'ye karsllntikorlarla birlestirilmis manyetik boncuklar kullanilarak gösterildi. Membran, a-hABHZ ile problandül'e OL'PCNA antikoru ile yeniden problandüEs-IP, aynElzamanda, a-PCNA'ya karslZlantikorlarla birlestirilmis manyetik boncuklar kullanllârak sadece endojen proteinleri ifade eden hücrelerden hABHZ'ninki gösterildi. Membran, 01- hABH2 ile problandüe a-PCNA antikoru ile yeniden problandü In Viva çapraz baglanmayügösteren diger deneyler, APIM ve PCNA arasIa dogrudan baglanmayülesteklemektedir._hABH21-7-EYFP 3 X FLAG ve hABH21-7-F4A-EYFP 3 X FLAG kararlDJIr sekilde ifade eden hücrelerden çapraz baglanmlg ve ters baglanmgl FLAG füzyon proteinleri, a-FLAG Afinite Jeli kullanilârak immünopresipitatlandIZIIP elüsyon parçalarüoi- PCNA veya a-FLAG antikorlarükullanllârak Western Blotlar taraflEUan analiz edildi.

Claims (4)

ISTEMLER
1. Terapide kullanIi için, söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir sekans içeren bir nükleik asit molekülü veya bir PCNA etkilesimli motif içeren bir oligopeptidik bilesik olup, burada nükleik asit molekülü bir vektörden olusmaktadlîl burada PCNA etkilesimli motif RWLVK'dir (SEKANS KIMLIK NO: 18), oligopeptidik bilesik 70'den daha az amino asite sahiptir ve bir nükleer lokalizasyon sinyal sekansÇl KKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 125) ve bir hücreye nüfuz eden sinyal sekansÇI RRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) içermektedir, ve burada bilesenlerin SESEPCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyal sekansEI hücreye nüfuz eden sinyal sekansIlEl .
Söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir sekans içeren bir nükleik asit molekülü veya bir PCNA etkilesimli motif içeren bir oligopeptidik bilesik olup, tercihen burada nükleik asit molekülü, sitostatik terapiyi Içeren bir tedavide veya hücrelerin büyümesi inhibe etmenin arzu edildigi tedavi veya durumda kullanIi için bir vektörde olusmaktadB burada PCNA etkilesimli motif RWLVK'dir (SEKANS KIMLIK NO: 18), oligopeptidik bilesik 70'den daha az amino asite sahiptir ve bir nükleer lokalizasyon sinyal sekansEKKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 125) ve bir hücreye nüfuz eden sinyal sekansÇl RRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) içermektedir, ve burada bilesenlerin slüisEPCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyal sekansEl hücreye nüfuz eden sinyal sekansIE .
Söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir sekans içeren bir nükleik asit molekülü veya bir PCNA etkilesimli motif içeren bir oligopeptidik bilesigin kullanllîrblup, tercihen burada nükleik asit molekülü, sitostatik terapi içeren bir tedavide veya hücrelerin büyümesi inhibe etmenin arzu edildigi bir durum veya bozuklugun tedavisinde kullanIia yönelik bir ilaci üretiminde, bir vektörde olusmaktadlü burada PCNA etkilesimli motif RWLVK'dir (SEKANS KIMLIK NO: 18), oligopeptidik bilesik 70'den daha az amino asite sahiptir ve bir nükleer lokalizasyon sinyal sekanslZKKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 125) ve bir hücreye nüfuz eden sinyal sekansÇl RRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) içermektedir, ve burada bilesenlerin sEsEPCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyal sekansEI hücreye nüfuz eden sinyal sekansIlEl
4. Söz konusu oligopeptidik bilesigi kodlayan bir sekans içeren bir nükleik asit molekülü veya bir PCNA etkilesimli motif içeren bir oligopeptidik bilesige sahip bir farmasötik bilesik olup, tercihen burada nükleik asit molekülü en az bir farmakolojik olarak kabul edilebilir taslEEJ veya yardIicüInadde ile birlikte bir vektörde olusmaktadlîl burada PCNA baglaylîlînotif RWLVK'dir (SEKANS KIMLIK NO: 18), oligopeptidik bilesik 70'den daha az amino asite sahiptir ve bir nükleer lokalizasyon sinyal sekanslZKKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 125) ve bir hücreye nüfuz eden sinyal sekansü RRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) içermektedir, ve burada bilesenlerin sÜsEPCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyal sekansEl hücreye nüfuz eden sinyal sekansIlÜ tercihen burada farmasötik bilesik oral, parenteral, topikal, rektal, genital, subkutan, transüretral, transdermal, intranazal, intraperitoneal, intramüsküler ve/veya intravenöz uygulama için ve/veya inhalasyon yoluyla uygulanmasi] için uygun bir formda saglanmaktadlE . Tercihen radyoterapi içeren bir tedavide veya hücrelerin büyümesinin inhibe edilmesinin arzu edildigi bir durum veya hastal[g]I tedavisinde, radyoterapi için bir hassaslastlElEEI olarak kullanl için istem 1'e göre oligopeptidik bilesik. . Bilesigin motif RWLVK (SEKANS KIMLIK NO: 18) içerdigi PCNA ile etkilesebilen bir oligopeptidik bilesik olup, burada oligopeptidik bilesik 70'den az amino asite sahiptir ve bir nükleer lokalizasyon sinyal sekansÇl KKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 125) ve bir hücreye nüfuz eden sinyal sekansüRRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) içermektedir, ve burada bilesenlerin süsEPCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyal sekansEl hücreye nüfuz eden sinyal sekansIE . Bilesigin sekans Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 112) içerdigi, istemler 1, 2, 5 veya 6'dan herhangi birine göre oligopeptidik bilesik, istem 3'e göre kullanIi veya istem 4'e göre farmasötik bilesim. . Sekans RWLVK'ye (SEKANS KIMLIK NO: 18) sahip bir PCNA etkilesimli motif içeren veya buna sahip olan bir peptiti kodlayan bir nükleik asit molekülü olup, burada peptit 70'den az amino asite sahiptir ve bir nükleer lokalizasyon sinyal sekansü KKKRK (SEKANS KIMLIK NO: 125) ve bir hücreye nüfuz eden sinyal sekansÇl RRRRRRRRRRR (SEKANS KIMLIK NO: 73) içermektedir, ve burada bilesenlerin süsEPCNA etkilesimli motif-nükleer lokalizasyon sinyal sekansE hücreye nüfuz eden sinyal sekansIlE Istem 8'e göre bir nükleik asit molekülü içeren bir vektör. . Söz konusu oligopeptidik bilesik ve/veya nükleik asit molekülünün bir sitostatik madde ile birlikte, es zamanlljblarak, ayrllyrÜ/eya ardlgllîl bir sekilde kullanIlglÇltercihen burada söz konusu sitostatik madde (i) aktinomisin D, BCNU (karmustin), karboplatin, CCNU, Kampotesin (CPT), kantaridin, Sisplatin, siklofosfamid, sitarabin, dakarbazin, daunorubisin, dosetaksel, Doksorubisin, DTIC, epirubisin, Etoposid, gefinitib, gemsitabin, ifosamid irinotekan, iyonomisin, Melfalan, Metotreksat, Mitomisin C (MMC), mitozantronemerkaptopurin, Oksaliplatin, Paklitaksel (taksol), PARP-l inhibitörü, taksoter, temozolomid (TZM), teniposid, topotekan, treosülfan vinorelbin, vinkristin, vinblastin, 5-Azasitidin, 5,6-Dihidro-5-azasitidin ve 5-florourasilden seçilmektedir; veya (ii) bir alkilleyici madde oldugu, Istemler 1, 2, 5 veya 6'dan herhangi birine göre oligopeptidik bilesik, istem 8'e göre nükleik asit molekülü, istem 9'a göre vektör, istem 3 veya 7'ye göre kullanl veya istem 4 veya 7'ye göre farmasötik bilesim. Söz konusu oligopeptidik bilesigin, bir füzyon protein veya aptamerin bir parçasüildugu, veya burada söz konusu oligopeptidik bilesigin en az 1, 2, 3, 4 veya 5 D-amino asitleri, asitleri ve/veya en az 1, 2, 3, 4 veya 5 ß-amino asitleri içerdigi, istemler 1, 2, 5, 6 veya 10'dan herhangi birine göre oligopeptidik bilesik, istem 8 veya 10'a göre nükleik asit molekülü, istem 9 veya 10'a göre vektör, istemler 3, 7 veya 10'dan herhangi birine göre kullanIi veya istemler 4, 7 veya 10'dan herhangi birine göre farmasötik bilesim. Tercihen burada söz konusu hiperproliferatif bozuklugun; bir habis, premalign veya habis olmayan neoplastik bozukluk, iltihaplanma, bir otoimmün bozukluk, bir hematolojik bozukluk, bir cilt hastallglübir viral kaynaklElhiperproliferatif bozukluk, bir miyelodiplastik bozukluk veya bir miyeloproliferatif bozukluktan seçildigi, ayrlEb tercihen burada söz konusu hiperproliferatif bozuklugun kanser, iyi huylu tümör, psoriatik artrit, romatoid artrit, inflamatuar baglîsak hastallglüsedef hastallglü Reiter sendromu, pitiriasis rubra pilaris, keratinizasyon bozukluklarII hiperproliferatif degiskenleri, restenoz, diyabetik nefropati, tiroid hiperplazisi, Grave HastallglÇliyi huylu prostat hipertrofisi, Li-Fraumenti sendromu, diyabetik retinopati, periferal vasküler hastalllîl in situ servikal karsinoma, ailesel intestinal polipozlar, oral lökopoplazyazlar, histiyositozlar, keloidler, hemanjiyomlar, hiperproliferatif arteriyel stenoz, inflamatuar artrit, hiperkeratozlar; artrit, sigilleri içeren papuloskuamöz püskürme ve EBV-kaynaklÜiastaliEl yara olusumu, multipl skleroz, sistemik Iupus eritematozus (SLE; Iupus), miyastenya gravis, habis olmayan hiperplazi, agranüloma veya MGUS (Bilinmeyen Öneme Sahip Monoklonal Gammopati), neoplastik menenjit, polisitemi vera, sikleromiksödem ve papuler musinoz, amiloidoz ve Wegener granülomatozdan seçildigi, bir hiperproliferatif bozukluk veya miyeloablasyon tedavisinde kullanIi için, istemler 1, 2, 5, 6, 10 veya 11'den herhangi birine göre oligopeptidik bilesik, istem 8, 10 veya 11'den herhangi birine göre nükleik asit molekülü, istem 9 ila 11'den herhangi birine göre vektör, istemler 3, 7, 10 veya 11'den herhangi birine göre kullan! veya istemler 4, 7, 10 veya 11'e göre farmasötik bilesim. Iltihaplanma tedavisinde kullanIi için, istemler 1, 5, 6, 10 veya 11'den herhangi birine göre oligopeptidik bilesik, istemler 8, 10 veya 11'den herhangi birine göre nükleik asit molekülü, istem 9 ila 11'den herhangi birine göre vektör veya istemler 4, 7, 10 veya 11'den herhangi birine göre farmasötik bilesim. Kanser tedavisinde kullanl için, istemler 1, 5, 6, 10 veya 11'den herhangi birine göre oligopeptidik bilesik, istemler 8, 10 veya 11'den herhangi birine göre nükleik asit molekülü, istem 9 ila 11'den herhangi birine göre vektör veya istemler 4, 7, 10 veya 11'den herhangi birine göre farmasötik bilesim. Söz konusu kanserin mesane kanseri, prostat kanseri veya çoklu miyelom veya lösemi gibi bir hematolojik kanserden seçildigi, istem 14'e göre oligopeptidik bilesik, nükleik asit molekülü, vektör veya farmasötik bilesik.
TR2018/07218T 2008-02-22 2009-02-20 Oligopeptit bileşikleri ve bunların kullanımları. TR201807218T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0803352.4A GB0803352D0 (en) 2008-02-22 2008-02-22 Oligopeptidic compounds and uses thereof
US10058408P 2008-09-26 2008-09-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201807218T4 true TR201807218T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=39284467

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/07218T TR201807218T4 (tr) 2008-02-22 2009-02-20 Oligopeptit bileşikleri ve bunların kullanımları.

Country Status (23)

Country Link
US (3) US8871724B2 (tr)
EP (2) EP3338790B1 (tr)
JP (2) JP5863240B2 (tr)
KR (3) KR101653774B1 (tr)
CN (1) CN102015758B (tr)
AU (1) AU2009216567B2 (tr)
BR (1) BRPI0908853B1 (tr)
CA (1) CA2715940C (tr)
DK (2) DK2254904T3 (tr)
ES (2) ES2912122T3 (tr)
GB (1) GB0803352D0 (tr)
HR (3) HRP20180718T1 (tr)
HU (2) HUE037737T2 (tr)
IL (1) IL207384B (tr)
LT (2) LT2254904T (tr)
MX (1) MX2010008989A (tr)
NO (1) NO2254904T3 (tr)
PL (2) PL3338790T3 (tr)
PT (2) PT2254904T (tr)
RU (1) RU2549675C2 (tr)
TR (1) TR201807218T4 (tr)
WO (1) WO2009104001A2 (tr)
ZA (2) ZA201005506B (tr)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0803352D0 (en) * 2008-02-22 2008-04-02 Ntnu Technology Transfer As Oligopeptidic compounds and uses thereof
GB201001602D0 (en) * 2010-02-01 2010-03-17 Cytovation As Oligopeptidic compounds and uses therof
WO2011104309A1 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Compounds for the treatment of inflammation and neutropenia
US10106855B2 (en) 2012-11-09 2018-10-23 The Johns Hopkins University Genetic assay to determine prognosis in Polycythemia Vera patients
JP6894664B2 (ja) 2013-02-13 2021-06-30 イエール ユニバーシティ 病的な石灰化および骨化を治療するための組成物および方法
CN104558119B (zh) * 2013-10-17 2019-03-08 上海宝恒泓康生物技术有限公司 Yap蛋白抑制多肽及其应用
GB201319621D0 (en) 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Antimicrobial agents and their use in therapy
GB201319620D0 (en) * 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Immunosuppressive agents and their use in therapy
CN106459168B (zh) * 2014-04-02 2020-03-24 马歇尔大学科研协会 强心性类固醇拮抗剂和相关方法
US10441628B2 (en) 2014-10-17 2019-10-15 Bao Kang Biomedical Healthcare Inc High activity tumour inhibitor and preparation method and use thereof
GB201507721D0 (en) * 2015-05-06 2015-06-17 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Immunosuppressive agents and their use in therapy
GB201507722D0 (en) * 2015-05-06 2015-06-17 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Anti-bacterial agents and their use in therapy
KR102811896B1 (ko) * 2015-05-19 2025-05-23 예일 유니버시티 병리학적 석회화 병태를 치료하기 위한 조성물, 및 이의 사용 방법
WO2017087936A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Yale University Compositions for treating ectopic calcification disorders, and methods using same
WO2018027024A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Yale University Compositions and methods for stroke prevention in pediatric sickle cell anemia patients
IL269830B2 (en) 2017-04-04 2024-01-01 Avidea Tech Inc Peptide-based vaccines, methods of manufacturing, and uses thereof for inducing an immune response
IL254361A0 (en) * 2017-09-06 2017-11-30 Nat Inst Biotechnology Negev Ltd Compounds to suppress the methyltransferase setd6
CA3096821A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Inozyme Pharma, Inc. Methods of improving cardiovascular function and treating cardiovascular disease using a recombinant ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase (npp1)
AU2019272844B2 (en) * 2018-05-22 2025-05-08 Barinthus Biotherapeutics North America, Inc. Improved methods of manufacturing peptide-based vaccines
AU2019327572B2 (en) 2018-08-31 2025-11-13 Yale University ENPP1 polypeptides and methods of using same
MX2021005313A (es) * 2018-11-08 2021-10-13 Summation Bio Inc Proteínas de núcleo de mininucleosoma y uso en entrega de ácido nucleico.
GB202006699D0 (en) * 2020-05-06 2020-06-17 Therapim Pty Ltd Dosage regimen
KR102483938B1 (ko) * 2020-06-12 2023-01-04 (주)케어젠 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알러지 또는 아토피피부염 개선용 조성물
CN112813042B (zh) * 2021-02-08 2021-08-27 南京市妇幼保健院 乳腺脂肪组织来源的多肽及其抗肿瘤应用
WO2024011300A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-18 L'oreal Modified peptides, composition, method for inhibiting contraction of muscle cells, method for improving the skin and use of a modified peptide

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5433190A (en) 1989-04-10 1990-11-16 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Lytic peptides, use for growth, infection and cancer
EP0497867A1 (en) * 1989-10-23 1992-08-12 Schering Corporation Polypeptide inhibitors of gamma interferon
US5888762A (en) * 1990-06-05 1999-03-30 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Neurotropic growth factors comprising a homeobox peptide
FR2662698A1 (fr) 1990-06-05 1991-12-06 Centre Nat Rech Scient Nouveaux facteurs de croissance neurotropes comprenant un peptide homeoboite.
MX9205293A (es) * 1991-09-20 1993-05-01 Syntex Sinergen Neuroscience J Factores neurotrofico derivado del glial
US5534110A (en) * 1993-07-30 1996-07-09 Lam Research Corporation Shadow clamp
EP0722333B1 (en) 1993-10-05 2004-06-16 XOMA Technology Ltd. Bpi-protein-products for depressed reticuloendothelial system function
GB9422175D0 (en) 1994-11-03 1994-12-21 Univ Dundee Indentification of the p21 waf1-pcna interaction site and therapeutic applications thereof
GB9509557D0 (en) 1995-05-11 1995-07-05 Univ Dundee PCNA binding substance
FR2739621B1 (fr) * 1995-10-05 1997-12-05 Centre Nat Rech Scient Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives
EP0975972B1 (en) 1997-03-14 2007-09-26 Crusade Laboratories Limited Methods for identifying cell cycle regulators
EP1037911A4 (en) * 1997-12-10 2003-07-23 Univ Washington ANTI-PATHOGEN SYSTEM AND METHOD FOR USE THEREOF
TWI227136B (en) * 1998-05-21 2005-02-01 Smithkline Beecham Corp Novel pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of cancer
ES2316188T3 (es) 1998-06-29 2009-04-01 Children's Hospital Los Angeles Tratamiento de transtornos hiperproliferativos.
US6368831B1 (en) * 1998-06-29 2002-04-09 Childrens Hospital Los Angeles Treatment of hyperproliferative disorders
GB9814527D0 (en) * 1998-07-03 1998-09-02 Cyclacel Ltd Delivery system
US6127177A (en) * 1998-09-11 2000-10-03 Massachusetts Institute Of Technology Controlled reversible poration for preservation of biological materials
EP1958961A3 (en) * 1998-11-13 2008-09-03 Cyclacel Limited Transport Vectors
WO2001064835A2 (en) 2000-02-28 2001-09-07 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU5322900A (en) 1999-06-04 2000-12-28 Yale University Modulation of protein levels using the scf complex
US6696263B1 (en) 1999-09-23 2004-02-24 Rigel Pharmaceuticals, Inc. PCNA associated cell cycle proteins, compositions and methods of use
CN1297923A (zh) * 1999-11-29 2001-06-06 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——人含细胞色素c结构域的脂蛋白105和编码这种多肽的多核苷酸
GB9928323D0 (en) 1999-11-30 2000-01-26 Cyclacel Ltd Peptides
AU2001241408A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-07 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
JP4503801B2 (ja) * 2000-09-08 2010-07-14 独立行政法人科学技術振興機構 新規ヒト癌・精巣抗原及びその遺伝子
US6627401B2 (en) * 2000-12-28 2003-09-30 Council Of Scientific And Industrial Research Method for detecting a single nucleotide polymorphism in p21waf1/cip1 gene as an indicator of risk of esophageal cancer
US6875744B2 (en) * 2001-03-28 2005-04-05 Helix Biomedix, Inc. Short bioactive peptides
CA2441562C (en) 2001-03-28 2013-05-14 Helix Biomedix, Inc. Short bioactive peptides and methods for their use
US20030114362A1 (en) 2001-06-08 2003-06-19 Novaspin Biotech Gmbh Penta-or tetrapeptide binding to somatostatin receptors and the use of the same
WO2003042239A1 (en) * 2001-11-12 2003-05-22 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Peptides inhibiting signaling by ras-like gtpases
WO2003051312A2 (en) 2001-12-18 2003-06-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research E2f and cancer therapy
US7517857B2 (en) * 2002-01-29 2009-04-14 Posco Immune-modulating peptide
AU2003213700A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Applied Immune Technologies Immunogens for treatment of neoplastic and infectious disease
WO2004018503A1 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antibacterial activity
WO2004035732A2 (en) * 2002-08-29 2004-04-29 Five Prime Therapeutics, Inc. Human polypeptides encoded by polynucleotides and methods of their use
CA2497794A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation Modified glp-1 receptor agonists and their pharmacological methods of use
EP1567857B1 (en) 2002-10-02 2007-11-14 Theraptosis S.A. Method for screening modulators of mitochondrial functioning
FR2849603B1 (fr) 2003-01-07 2006-09-08 Centre Nat Rech Scient Composition pour le transport intracellulaire de macromolecules ou particules biologiques
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
FR2855178B1 (fr) * 2003-05-20 2005-08-05 Centre Nat Rech Scient Peptides modulateurs de l'activite du facteur de transcription engrailed
US7772367B2 (en) * 2004-01-30 2010-08-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York C-terminal p53 palindromic peptide that induces apoptosis of cells with aberrant p53 and uses thereof
CN1997660A (zh) * 2004-04-21 2007-07-11 芝加哥大学 肌球蛋白轻链激酶抑制剂及其使用
GB0410498D0 (en) 2004-05-11 2004-06-16 Cyclacel Ltd Crystal
WO2006005042A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Cemines, Inc. Methods and compositions for the diagnosis,prognosis,and treatment of cancer
JP5243040B2 (ja) * 2004-12-21 2013-07-24 ムスク・ファウンデイション・フォー・リサーチ・ディベロップメント 創傷治癒および組織再生を促進するための組成物および方法
IN2005CH00851A (tr) * 2005-07-04 2008-01-25
US8168748B2 (en) 2005-08-04 2012-05-01 North Carolina State University Peptide aptamers that bind to the rep proteins of ssDNA viruses
US20090286724A1 (en) * 2005-10-26 2009-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Aggregable glp-1 analogue and sustained-release pharmaceutical composition
CA2638866C (en) 2006-02-17 2015-11-10 Indiana University Research And Technology Corporation Peptide based inhibition of capcna protein-protein interactions in cancer
CU23511B6 (es) 2006-02-28 2010-04-13 Biorec B V Combinación farmacéutica para el tratamiento y/o quimiosensibilización de tumores refractarios a drogas anticancerígenas
CA2653756A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 The University Of British Columbia Secreted protein acidic and rich in cysteine (sparc) as chemotherapeutic sensitizers
JP5490714B2 (ja) 2007-11-28 2014-05-14 メディミューン，エルエルシー タンパク質製剤
GB0803352D0 (en) * 2008-02-22 2008-04-02 Ntnu Technology Transfer As Oligopeptidic compounds and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015180634A (ja) 2015-10-15
HRP20220585T1 (tr) 2022-08-19
EP3338790A2 (en) 2018-06-27
IL207384B (en) 2018-05-31
US20110020437A1 (en) 2011-01-27
ZA201005506B (en) 2011-10-26
CN102015758B (zh) 2017-04-12
ZA201105685B (en) 2012-05-25
PL3338790T3 (pl) 2022-07-11
US20170246248A1 (en) 2017-08-31
PT3338790T (pt) 2022-05-11
EP2254904B1 (en) 2018-04-11
DK2254904T3 (en) 2018-06-06
AU2009216567B2 (en) 2013-11-07
US20150017232A1 (en) 2015-01-15
WO2009104001A2 (en) 2009-08-27
HRP20180718T1 (hr) 2018-07-13
DK3338790T3 (da) 2022-05-09
EP3338790B1 (en) 2022-04-13
EP2254904A2 (en) 2010-12-01
US8871724B2 (en) 2014-10-28
CN102015758A (zh) 2011-04-13
ES2912122T3 (es) 2022-05-24
HUE059174T2 (hu) 2022-10-28
RU2010134786A (ru) 2012-03-27
LT3338790T (lt) 2022-05-25
BRPI0908853A2 (pt) 2017-05-30
AU2009216567A1 (en) 2009-08-27
KR20160038903A (ko) 2016-04-07
BRPI0908853B1 (pt) 2021-05-25
WO2009104001A3 (en) 2010-04-15
MX2010008989A (es) 2010-12-07
US9676822B2 (en) 2017-06-13
ES2670334T3 (es) 2018-05-30
US10213483B2 (en) 2019-02-26
KR20100123728A (ko) 2010-11-24
CA2715940A1 (en) 2009-08-27
KR101758671B1 (ko) 2017-07-17
KR20170018485A (ko) 2017-02-17
JP2011512150A (ja) 2011-04-21
HUE037737T2 (hu) 2018-09-28
PL2254904T3 (pl) 2018-08-31
HRP20220585T3 (hr) 2022-08-19
RU2549675C2 (ru) 2015-04-27
LT2254904T (lt) 2018-06-11
EP3338790A3 (en) 2018-07-11
NO2254904T3 (tr) 2018-09-08
KR101749204B1 (ko) 2017-06-20
KR101653774B1 (ko) 2016-09-05
IL207384A0 (en) 2010-12-30
JP6116614B2 (ja) 2017-04-19
PT2254904T (pt) 2018-06-04
GB0803352D0 (en) 2008-04-02
CA2715940C (en) 2020-06-30
JP5863240B2 (ja) 2016-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201807218T4 (tr) Oligopeptit bileşikleri ve bunların kullanımları.
US10077294B2 (en) Peptide inhibitors of TEAD/YAP-TAZ interaction
US8278278B2 (en) Cell proliferation reducing cancer specific PCNA peptides
CA2732737C (en) Cancer peptide therapeutics
HK1214177B (en) Cancer peptide therapeutics