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MX2010008989A - Compuestos oligopeptidicos y usos de los mismos. - Google Patents

Compuestos oligopeptidicos y usos de los mismos.

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MX2010008989A
MX2010008989A MX2010008989A MX2010008989A MX2010008989A MX 2010008989 A MX2010008989 A MX 2010008989A MX 2010008989 A MX2010008989 A MX 2010008989A MX 2010008989 A MX2010008989 A MX 2010008989A MX 2010008989 A MX2010008989 A MX 2010008989A
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MX
Mexico
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pcna
seq
oligopeptide compound
interacts
amino acids
Prior art date
Application number
MX2010008989A
Other languages
English (en)
Inventor
Marit Otterlei
Per Arne Aas
Emadoldin Feyzi
Original Assignee
Apim Therapeutics As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Apim Therapeutics As filed Critical Apim Therapeutics As
Publication of MX2010008989A publication Critical patent/MX2010008989A/es

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Abstract

La presente invención provee un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico, para usarse en terapia, en donde el motivo que interactúa con PCNA es X1X2X3X3´X1´- (SEQ ID NO: 1), en donde X1 y X1´ se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3´ se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y en donde el compuesto oligopeptídico se caracteriza además por lo menos por uno de los siguientes: (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R]-F[LIV]-[LIV]-[K/R] (SEQ ID NO. 27). Particularmente, la terapia puede ser el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o un tratamiento que implica terapia citostática v.gr., mieloablación. En ciertos aspectos los compuestos de la invención se pueden usar como agentes citostáticos como tales. En otros aspectos de la invención, los compuestos oligopeptídicos que comprenden el motivo se pueden usar junto con agentes citostáticos o con radioterapia.

Description

COMPUESTOS OLIGOPEPTIDICOS Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a agentes novedosos, composiciones farmacéuticas, y su uso en terapia, particularmente cualquier terapia en donde es deseable o ventajoso reducir o prevenir la proliferación o crecimiento de las células tal como en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas o de hecho cualquier afección que requiera o responda a terapia citostática. La invención se basa en la identificación de interacciones novedosas entre el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) y varias proteínas implicadas en reparación de ADN, mantenimiento y regulación del ciclo celular y la consecuente identificación de un motivo de pentapéptido novedoso responsable de esas interacciones, que los inventores de la presente han denominado API . Por consiguiente, la presente invención muy particularmente se refiere a péptidos o miméticos de los mismos que comprenden el motivo y que son capaces de interactuar con PCNA, composiciones farmacéuticas que comprenden esos agentes, y el uso de esos agentes en terapia, particularmente terapias que implica la reducción o prevención de la proliferación celular, como se indicó anteriormente. También se proveen métodos terapéuticos que comprenden el uso de un agente que comprende un motivo de Ref.213120 interacción de PCNA, preferiblemente en combinación con un agente citostático.
Antecedentes de la Invención Las células humanas y de animales son expuestas a una variedad de causas de daño al ADN tales como especies de oxígeno reactivo, luz UV, rayos X y agentes citostáticos endógenos o exógenos .
Los agentes citostáticos son agentes que inhiben o suprimen el crecimiento celular y/o multiplicación (proliferación/replicación) , por ejemplo al dañar el ADN o al interferir con la maquinaria de replicación celular. Los agentes alquilantes son una clase de agentes citostáticos, algunos de los cuales se usan clínicamente o para propósitos de investigación.
Los agentes alquilantes causan daño al ADN al modificar bases en átomos de N o 0. El tipo de daño depende del tipo de agente, en donde la mayoría de los agentes causan una modificación de ADN específica. El daño al ADN incluye aductos de alquilación y entrelazamientos intercadenas que pueden conducir a codificación errónea durante la replicación y/o bloques de replicación seguido por rompimientos de doble cadena o síntesis de translesión.
Las células humanas y animales poseen varios sistemas de reparación de ADN que incluyen reparación de excisión de base, reparación de excisión de nucleótido y reparación de discordancia. Un ejemplo es la ADN oxidativa demetilasa humana, hABH2 , que reconvierte 3-metil citosina (3meC) a citosina y 1-metiladenina (lmeA) a adenina por desmetilación oxidativa.
La co-ordinación cercana entre la reparación de ADN y la replicación de ADN regulada por ciclo celular es esencial para la integridad del genoma . Es importante que en la presencia de daño, la replicación de ADN sea detenida hasta que el daño haya sido reparado, de otra manera se producen mutaciones y se propagan. Una proteína que se sabe que está implicada tanto en replicación de ADN como en reparación de ADN es antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) .
El PCNA es un miembro de la familia de proteínas de abrazadera deslizante que son funcionalmente conservadas de bacteria a eucariotas superiores, y cuya función principal es proveer polimerasas replicativas con la alta capacidad de procesamiento necesaria para duplicación del genoma. En células de fase S vivas, PCNA etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP) forma distintos focos que representan sitios de replicación. Por lo tanto se puede usar como un marcador de fase S .
Numerosas proteínas implicadas en procesos celulares tales como reparación de ADN, ensamble de cromatina, remodelación epigenética y de cromatina, cohesión de cromátidas hermanas, control del ciclo celular y supervivencia están localizados en las llamadas fábricas de replicación que contienen más de una docena de horquillas de replicación. Muchas de estas proteínas interactúan con PCNA a través de la secuencia de péptido que interactúa con PCNA conservada llamada la caja de PIP (QxxL/I/MxxF/DF/Y) , en donde x puede ser cualquier aminoácido. Un motivo de unión a PCNA alternativo llamado la caja de KAx se identificó mediante el uso de una genoteca de despliegue de péptido, pero no se ha verificado que este motivo sea importante para interacciones de PCNA in vivo.
Varias proteínas interactúan con PCNA y se ha mostrado que algunas de estas proteínas, con la inclusión de hABH2 , co-localizan con PCNA en focos de replicación. Sin embargo, la co- localización en sí misma no implica que haya alguna interacción directa o indirecta entre las proteínas de co-localización. De hecho, la ausencia en hABH2 de motivos de unión a PCNA tales como la caja de PIP o la caja de KAx sugeriría que hABH2 no interactúa con PCNA.
Breve Descripción de la Invención En un trabajo que condujo a la presente invención, los inventores han encontrado sorprendentemente que varias proteínas interactúan con PCNA mediante un motivo que interactúa con PCNA novedoso. En una de estas proteínas, hABH2 , este motivo se localiza en el N-terminal. Los inventores establecieron que este motivo es tanto esencial como suficiente para la interacción con PCNA (véase ejemplo 1) .
Como se explica con más detalle en los ejemplos que se dan más adelante, para explorar la función de este motivo que interactúa con PCNA en la reparación de ADN de daño por alquilación, las líneas de células que expresan un péptido recombinante que comprende el motivo se expusieron a varias dosis de MMS (metansulfonato de metilo) que es un agente alquilante de SN2 que causa la formación de 3 -metilcitosina y 1-metiladenina . Se encontró que la expresión del péptido recombinante que comprende las células sensibilizadas al motivo a daño del ADN causado por MMS, que indica que el péptido recombinante que comprende el motivo competitivamente inhibió la interacción entre PCNA y hABH2.
Otros agentes que incluyen BCNU, temozolomida (TZM) y mitomicina c (MMC) que causan otros tipos de daño al ADN también se probaron y para su gran sorpresa, los inventores encontraron que el péptido recombinante que comprende el motivo también sensibilizó las células al daño causado por estos agentes. Esto fue completamente inesperado, porque BCNU es un agente 06-cloroetilante que conduce principalmente a entrelazamientos intercadena así como algunos aductos cíclicos de mono-base ( 1 , N ( 6 ) etanoadenina) , se reporta que TZM es un agente metilante de 06G, y MMC causa entrelazamientos intercadena mediante N-alquilación de guanina en CpGs, y hABH2 no repara estos tipos de daño al ADN. En vez de ello, hay otras enzimas que reparan este tipo de daño, por ejemplo, el daño por TZM es reparado directamente por O-metilguanina-ADN transferasa (MGMT) . Estos hallazgos indican que el péptido recombinante que comprende el motivo no inhibe simplemente la interacción entre hABH2 y PCNA, y que otras proteínas pueden estar implicadas, a saber que otras proteínas pueden interactuar con PCNA mediante el motivo novedoso.
Los inventores también encontraron que la expresión del péptido recombinante que comprende el motivo incrementó el efecto citotóxico de agentes citostáticos (específicamente MMS) más allá de aquel observado en líneas celulares de ratones modificados genéticamente ABH2 , es decir, ratones que no poseen ABH2 , lo que indica además que el péptido recombinante que comprende el motivo tiene un efecto de espectro más amplio, y probablemente inhibe otras proteínas además de hABH2.
Estos hallazgos sorprendentes han conducido a los inventores a proponer un uso terapéutico para un péptido que comprende un motivo de unión a PCNA.
El motivo de unión a PCNA novedoso de la invención, denominado APIM, ha sido caracterizado y se puede definir como sigue: X1X2X3X3'Xi' (SEQ ID NO: 1) , en donde Xi y ??- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga, preferiblemente no polares.
Un péptido (o compuesto oligopept ídico) capaz de interactuar con PCNA puede contener o comprender ese motivo de péptido (o secuencia) . Por lo tanto, un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA y que comprende ese motivo se describe en la presente y puede representar ciertos aspectos de la presente invención.
Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención puede proveer un compuesto oligopeptídico que es capaz de interactuar con PCNA y que comprende el motivo ???2?3?3??· (SEQ ID NO: 1) , en donde ?? y X^ se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga, preferiblemente no polares, en donde el compuesto oligopeptídico se caracteriza además por lo menos por uno de los siguientes: (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos 11 aminoácidos o subunidades equivalentes; (ii) X2 no es fenilalanina ; (iii) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos un D-aminoácido ; (iv) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal, a saber una secuencia que dirige el compuesto oligopeptídico a un lugar particular, por ejemplo hacia una célula (v.gr., una secuencia penetrante de célula que dirige el compuesto oligopeptídico hacia una célula) y/o hacia un compartimiento celular particular (v.gr., una señal de localización nuclear que dirige el compuesto oligopeptídico hacia el núcleo) ; y (iv) el compuesto oligopeptídico comprende el motivo [K/R] -F- [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO : 27).
En particular, en una modalidad el compuesto oligopeptídico comprende una secuencia de señal de localización de núcleo. En otra modalidad el compuesto oligopeptídico comprende una secuencia penetrante de célula (péptido penetrante de célula). En una modalidad adicional, el compuesto oligopeptídico comprende una secuencia penetrante de célula y una secuencia de localización nuclear.
Por lo tanto, se verá que en esas modalidades el compuesto de la invención pueden adoptar la forma de un constructo que contiene (es decir, que comprende) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA como se definió antes, junto con por lo menos una secuencia de señal. En este aspecto, la invención por consiguiente se puede ver que provee un constructo que comprende un compuesto oligopeptídico que es capaz de interactuar con PCNA y que comprende el motivo XiX2X3X3'Xi-(SEQ ID NO: 1) , en donde Xi y i< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga, preferiblemente no polares, junto con por lo menos una secuencia de señal.
Como se indicó antes, el motivo novedoso de la invención se ha determinado mediar la interacción de un compuesto oligopeptídico (v.gr. , péptido) o proteina que contiene un motivo con PCNA.
La interacción puede ser directa o indirecta, y puede implicar dirigir la unión del motivo al PCNA, o el motivo se puede unir indirectamente, por ejemplo la unión puede ser mediada por otra molécula. Esta referencia a "interacción con PCNA" o "unión a PCNA" por lo tanto puede incluir cualquier forma de interacción, y unión tanto directa como indirecta.
Cualquier referencia en la presente a un "motivo se debe entender que significa ???2?3?3·??· como se define en la presente .
Preferiblemente, Xi y X1( se seleccionan independientemente de lisina (K) , arginina (R) , histidina (H) , ornitina (Om) , metilisina (MeK) y acetilisina (AcK) , y muy preferiblemente K, R y H, o K y R; X2 es preferiblemente un aminoácido aromático, muy preferiblemente se selecciona de fenilalanina (F) , triptofano (W) , tirosina (Y) , ter-butilglicina , ciclohexilalanina , ter-butilfenilalanina , bifenilalanina y tri ter-butiltriptofano (en ciertas modalidades esta lista puede exclir F) , particularmente F, W y Y, o W y Y, F y Y, o F y W o en modalidades específicas X2 puede ser F, o W o Y; X3 y X3' son preferiblemente aminoácidos alifáticos y por ejemplo se pueden seleccionar independientemente de leucina (L) , isoleucina (I), valina (V), alanina (A) metionina ( ) y norleucina (Ñor) ; Preferiblemente, X3 y X3< no son ambos A, muy preferiblemente X3 y X3< se seleccionan de L, I, V y M, muy preferiblemente aún de L, I y V.
La unión del motivo a PCNA en ciertas modalidades puede ser mejorada cuando X2 es W o Y. Por lo tanto, en una modalidad, X2 no es F. Sin embargo, como se indicó anteriormente, en otras modalidades puede ser F.
Por lo tanto, la invención puede proveer un compuesto oligopeptídico que comprende el motivo [K/R] - [F/Y/W] - [L/I/V/A/M] - [L/I/V/A/M] - [K/R] (SEQ ID NO: 28), en donde el compuesto oligopeptídico es capaz de interactuar con PCNA.
En otra modalidad el motivo se puede definir como: [K/R] - [Y/W] - [L/I/V/A/M] - [L/I/V/A/M] - [K/R] (SEQ ID NO: 29) .
En otra modalidad el motivo se puede definir como: [K/R] - [F/Y/ ] - [L/I/V/A] - [L/I/V/A]- [K/R] (SEQ ID NO: 30).
En otra modalidad el motivo se puede definir como: [K/R] - [Y/W] - [L/I/V/A] - [L/I/V/A] - [K/R] (SEQ ID NO: 31).
En otra modalidad el motivo se puede definir como: [K/R] - [F/W] - [L/I/V/A/M] - [L/I/V/A/M] - [K/R] (SEQ ID NO: 32).
En otra modalidad el motivo se puede definir como: [K/R] - [F/W] - [L/I/V/A] - [L/I/V/A] - [K/R] (SEQ ID NO : 33).
En otra modalidad el motivo se puede definir como: [K/R] - [F/W] - [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO : 34).
En otra modalidad el motivo se puede definir como: [K/R] - [F/Y/W] - [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO: 35).
En otra modalidad más, el motivo se puede definir como: [K/R] - [Y/W] - [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO: 36). En otra modalidad más el motivo se puede definir como: [K/R] -F- [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO: 37).
El compuesto oligopeptídico es preferiblemente un compuesto aislado.
En una modalidad preferida, el compuesto oligopeptídico tiene o comprende la secuencia RFLVK (SEQ ID NO: 2) . En otras modalidades preferidas, el compuesto oligopeptídico tiene o comprende una secuencia seleccionada de KFLLR (SEQ ID NO: 3), KYLLR (SEQ ID NO: 4), KWLLR ( SEQ ID NO: 5) , KYILR (SEQ ID NO: 6) , KYVLR (SEQ ID NO : 7) , RFLLR (SEQ ID NO: 8), RYLLR (SEQ ID NO: 9), RWLLR (SEQ ID NO: 10), RYILR (SEQ ID NO: 11), RYVLR (SEQ ID NO : 12), RFLIR (SEQ ID NO: 13), RYLVR (SEQ ID NO: 14) RWLMR (SEQ ID NO: 15), RYVLR (SEQ ID NO: 16), RYVIR (SEQ ID NO: 17), RWLVK (SEQ ID NO: 18), RYLVK (SEQ ID NO: 19), RWLIK (SEQ ID NO: 20), RWIVK (SEQ ID NO: 21), RWVVK (SEQ ID NO: 22), RWAVK (SEQ ID NO: 23), RYVVK (SEQ ID NO: 24), RYLIK (SEQ ID NO: 25) o RYLMK (SEQ ID NO: 26) . Estas secuencias específicas se listan por medio del ejemplo y se pretenden que no limiten el alcance de la presente invención .
En una modalidad preferida, el compuesto oligopeptídico de la invención también comprende una secuencia de señal que dirige el motivo a un tipo de célula específico, facilita la entrada del compuesto hacia una célula, y/o ubica el compuesto a un compartimiento intracelular específico, preferiblemente el núcleo. La secuencia de señal por lo tanto se puede ver como cualquier secuencia que actúa para ubicar, o alternativamente poner, para dirigir, translocar o transportar, el compuesto oligopeptídico a cualquier lugar deseado v.gr. , a cualquier lugar celular o subcelular deseado. En modalidades preferidas, el lugar deseado es una célula (es decir, el interior de una célula) y/o el núcleo de una célula.
Por lo tanto, la secuencia de señal puede ser una secuencia que actúa para transportar el compuesto oligopept ídico hacia una célula, o a través de una membrana celular (es decir, hacia el interior de una célula) . Por lo tanto, puede ser una denominada secuencia "penetrante de célula" (o muy particularmente "péptido penetrante de célula") también conocida en la técnica como un dominio de transducción de proteína (PTD) o secuencia de transducción proteína.
Por consiguiente, como se señaló antes una modalidad preferida de la invención es un constructo que comprende (i) un compuesto ol igopeptídico que comprende un motivo de APIM (es decir, un motivo que interactúa con PCNA) como se define en la presente, y (ii) una secuencia penetrante de célula (muy particularmente un péptido penetrante de célula) .
La tecnología de péptido penetrante de célula (CPP) se ha desarrollado mucho en años recientes y una amplia variedad de péptidos penetrantes de célula son conocidos y se describen en la técnica y de hecho una gama de esos péptidos están comerc ialmente disponibles. Los péptidos penetrantes pueden variar mucho en tamaño, secuencia y carga, y de hecho en su mecanismo de función (que actualmente no se conoce para algunos péptidos y no se ha dilucidado por completo para otros) , pero comparten la capacidad común para translocar a través de la membrana plasmática y suministrar una porción unida o asociada (la denominada "cargo") hacia el citoplasma, o incluso en algunos casos el núcleo, de una célula. Los CPPs son por lo tanto vectores de suministro a base de péptidos .
Los CPPs se pueden derivar de proteínas que ocurren naturalmente que son capaces de translocar a través de membranas celulares tales como la proteína Drosophila homeocaja Antenapedia (un factor transcripcional), proteínas virales tales como el factor transcripcional de VIH-I, TAT, y la proteína de cápside VP22 de HSV-I, y o pueden ser sintéticamente derivadas, v.gr. , de proteínas quiméricas o polipéptidos sintéticos tales como poliarginina . Como se indicó antes, no hay un solo mecanismo responsable para el efecto de transducción y por lo tanto el diseño de CPPs se puede haser en diferentes estructuras y secuencias. Los péptidos penetrantes de célula se revisan en Jarver et al. 2006 Biochimica et Biophysica Acta 1758, páginas 260-263 y Tabla 2 siguiente lista varios péptidos representativos. El documento US 6,645,501 además describe varios péptidos penetrantes de célula que se podrían usar.
TABLA 2 CPP SECUENCIA REFERENCIA Clase Antp Penetratin RQIKI FQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 38) Bolton (2000) Eur . J . Neuro . 12 :287 Derivados de RRMKWKK (SEQ ID NO: 39) US 6472507 penetratin NRRMKWKK (SEQ ID NO: 40) EP4855781 QNRRMKWKK (SEQ ID NO: 41) WO 97/12912 FQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 42) RREKWKK (SEQ ID NO 43) RRQK KK (SEQ ID NO 44) KRMKWKK (SEQ ID NO 45) RKMKWKK (SEQ ID NO 46) RROKWKK (SEQ ID NO 47) RR KQKK (SEQ ID NO 48) RRMK FK (SEQ ID NO 49) RORKWKK (SEQ ID NO 50) RRMWKK ( SEQIDNO 51) RRM K K_ .(SEQ ID NO 52) (mediante el uso de notación de aminoácido individual estándar, ornitina (O) , ácido diaminobutírico (B) , norleucina (N) ) D-Penetratin rgikiwfqnrrmkwkk (SEQ ID NO: 53) Rouselle, C. et al. (2000) Mol . Pharm 57 : 679 Clase Protegrin Pegelin RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO: 54) Rouselle, C. (SynB) (SynB) et al. (2000) Mol . Pharm 57 :679 Clase HIV-TAT HIV-TAT GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO : 55) Vives E.J Biol, Chem 1997, 272 : 16010 Snyder (2004) PLOS 2 : 186 47-57 de HIV YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 56) Potocky et (2003) JBC VP22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRVD Elliott (SEQ ID NO: 57) Cell 1997, 88 233 Péptidos anfifáticos MAP KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 58) Morris MC . , Nat Biotechnol . 2001, 19 : 1173-1176 Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID PoogaM, NO: 59) FASEB J 1998, 12:67- 77 Transportan- 10 AGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: Soomets U, 60) Biochim Biophys Acta 2000, 1467 : 165-176 KALA WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA Oehike J . , (SEQ ID NO: 61) Biochim Biophys Acta 1998, 1414 : 127-139 Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV Wyman (SEQ ID NO: 62) Biochemistry 1997 , 36 :3008-3017 Pep-2 KETWFETWFTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 63) MPG GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV Wagstaff KM (SEQ ID NO: 64) Curr Med Chem 2006, 13 : 1371-1387 Péptidos VKRGLKLRHVRPRVTRMDV (SEQ ID NO : 65) Coupade Vectocell SRRARRSPRHLGSG* (SEQ ID NO: 66) (2005) LRRERQSRLRRERQSR* (SEQ ID NO: 67) Biochem. J.
GAYDLRRRERQSRLRRRERQSR 407 (SEQ ID NO: 68) ?indica adición de cys para conjugación a cargo Transportador KETWWETWWTEWWTEWSQ-GPG-rrrrrrrr Kondo (2004) Wr-T (SEQ ID NO: 69) Mol. Can. r = D-enantiómero arginina Thera 1623 Otros péptidos R7 RRRRRRR (SEQ ID NO : 70) Rothbard et al., Nat. Med 6 (2000) 1253-1257 CPPs derivados de Antenapedia (clase Antp) representan una clase de interés particular, con base en secuencia de Penetratin de alrededor de 16 aminoácido como se muestra en la tabla 2, que corresponde al tercer lazo de proteína de antenapedia y se mostró que es responsable de la translocación de la proteína. Penetratin se ha desarrollado extensivamente como un vehículo de suministro, que se incluye particularmente para uso farmacéutico, y una amplia gama de derivados de Penetratin y se han propuesto y descrito secuencias modificadas. Se puede hacer referencia en particular a WO 91/1891, WO 00/1417, WO 00/29427, WO 2004/069279 y US 6,080,724. Por lo tanto, la secuencia de 16 aminoácidos de Penetratin puede ser modificada y/o truncada, o el péptido puede ser químicamente modificado o retro-, inverso- o retro- inverso análogos se pueden hacer mientras se retiene la actividad penetrante de células.
Otro grupo de péptidos penetrantes de células que se pueden usar ventajosamente se basan en la secuencia de HIV-TAT, y HIV-TAT y fragmentos de los mismos representan una clase preferida de CPPs para usarse de conformidad con la presente invención. Varios CPPs a base de TAT se describen en US 5,656,122. Un péptido HIV-TAT ilustrativo como se usa en los ejemplos siguientes es RKKRRQRRR (SEQ ID. No. 71) pero se apreciará fácilmente que se pueden usar fragmentos de TAT más largos o más cortos .
Como se mencionó antes, ninguna característica estructural particular o motivos de secuencia son comunes para todos los CPPs. Sin embargo, varias clases de CPPs pueden ser identificados por características particulares, tales como por ejemplo péptidos que son anfifáticos y sin embargo cargados positivamente. Otros grupos de CPPs pueden tener una estructura que presenta alto contenido OÍ-helicoidal. Otro grupo puede ser péptidos caracterizados por un alto contenido de aminoácidos básicos. Los CPPs por lo tanto pueden ser o pueden comprender oligómeros de aminoácidos básicos tales como arginina v.gr., 5 a 20, 6 a 15 o 6 a 12 residuos R v.gr., R7 (SEQ ID NO: 70), R8 (SEQ ID NO: 72) o Rn (SEQ ID NO : 73) o QSR8 (SEQ ID NO: 74) Los péptidos anfifáticos ricos en prolina son otra clase de CPP y los péptidos caracterizados por la presencia de anillos de pirrolidina de prolinas se describen en Pujáis et al. 2008 Advanced Drug Delivery Reviews 60, páginas 473-484.
Otros CPPs exitosamente desarrollados incluyen pVEC (Elmquist et al. 2003 Biol . Chem 384, páginas 387-393; Holm et al. 2005 Febs Lett . 579, páginas 5217-5222) y péptidos derivados de calcitonina (Krauss et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, páginas 51-54).
Los CPPs comercialmente disponibles incluyen Chariot, con base en el péptido Pep-1 (Active Motif, Francia) , los vectores Syn-B basados en el péptido de protegrina PG-I (Syntem, Francia), y Express-si Delivery basado en el péptido MPG de Genospectra, E.U.A..
Además de los CPPs públicamente disponibles y reportados, los péptidos CPP novedosos o derivados pueden ser diseñados y sintetizados con base en criterios conocidos o reportados (v.gr. , secuencias de CPP conocidas o características tales como contenido de aminoácido básico, contenido -helicoidal, etc., como se describió antes) . Además, los péptidos aleatoriamente diseñados u otros péptidos pueden ser determinados selectivamente para actividad de CPP, por ejemplo, al acoplar o unir el péptido que contiene una molécula reportera, v.gr., un marcador o etiqueta detectable tal como una etiqueta fluorescente al cargo deseado (un compuesto oligopeptídico de conformidad con la presente invención) y al probar para ver si el constructo es translocado a través de la membrana celular, por ejemplo al añadir estos péptidos a células vivas seguido por examinación de importación celular, v.gr., mediante el uso de microscopía confocal .
De hecho, aunque es generalmente el caso que un CPP penetre o entre virtualmente a cualquier tipo de célula, en algunos casos se puede observar que el suministro exitoso o eficiente puede ser dependiente de, o puede variar de acuerdo con, la naturaleza precisa del cargo (v.gr., secuencia de péptido de cargo) y/o el CPP usado. Estaría dentro de la capacidad de rutina del experto en la técnica determinar secuencias de péptido óptimas y combinaciones, etc, y probar y/o modificar cargo y/o secuencia o estructura de CPP, etc.
Como se mencionó antes, la secuencia de señal que puede estar comprendida dentro de los compuestos oligopeptídicos (o constructos) de la invención pueden ser un péptido de señal que dirige el compuesto (o constructo) en un compartimiento subcelular particular, y en particular hacia el núcleo. Las señales de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) son nuevamente bien conocidas en la técnica y se describen ampliamente en la literatura y cualquier NLS conocido o funcional se puede usar.
Por consiguiente, una modalidad preferida adicional de la invención es un constructo que comprende (i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo de APIM (es decir, un motivo que interactúa con PCNA) como se define en la presente, y (ii) una señal de localización nuclear.
Un NLS puede variar en longitud y/o secuencia y una amplia gama de secuencias de NLS específicas se han descrito. En general, sin embargo, se ha encontrado que los péptidos que comprenden aminoácidos positivamente cargados (notablemente lisina (K) , arginina (R) y/o histidina (H) ) pueden funcionar como una NLS. Una NLS ilustrativa por lo tanto puede ser un péptido de, v.gr., 4-20, muy particularmente 4-15, 4-12, 4-10 ó 4-8 aminoácidos, en donde por lo menos 4 aminoácidos (y muy particularmente por lo menos 60, 70, 75, 80, 85 ó 90% de los residuos de aminoácidos en el péptido NLS) son aminoácidos positivamente cargados, preferiblemente seleccionados de K, R o H. El NLS ilustrativo puede tener o comprender, por ejemplo, la secuencia RKRH (SEQ ID NO: 75) .
Las señales de localización nuclear, que incluyen tanto secuencias de NLS experimentalmente determinadas reales como predichas o propuestas, y estrategias para identificar NLSs se describe en Lange et al, J. Biol . Chem. 2007, 282(8), 5101 -5105; Makkerh et al, Current Biology 1996, 6(8), 1025-1027; Leslie et al, Methods 2006, 39, 291-308; y Lusk et al. Nature Reviews MCB 2007, 8, 414-420.
Una NLS clásico consiste ya sea de una (monopartita) o dos (bipartita) extensiones de aminoácidos básicos. Un NLS monopartita puede ser ilustrado por el NLS de antígeno T grande de SV40 (126PKKKRKV132 [SEQ ID NO: 76]) y un NLS bipartita por la NLS de nucleoplasmas (155KRP AATKKAGO AKKKK170 [SEQ ID NO: 77]). La secuencia de consenso de NLS monopartita K- [K/R] -X- [K/R] (SEQ ID NO: 78) se ha propuesto y por consiguiente una NLS de conformidad con la presente invención en una modalidad puede comprender o consistir de esa secuencia de consenso (en donde X es cualquier aminoácido) .
Una NLS bipartita representativa de conformidad con la invención puede tener la secuencia KR- [X] 5-2o-KKKK (SEQ ID NO: 79), v.gr., KR-X10-KKKK (SEQ ID NO: 80) (en donde X es cualquier aminoácido) .
Una NLS bipartita ilustrativa alternativa puede adoptar la forma de RKRH- [X] 2-io- K (SEQ ID NO: 81), v.gr., RKRH-X2-KK(SEQ ID NO: 82) , por ejemplo RKRH- II -KK (SEQ ID NO: 83) .
Las NLS de oncoproteína c-myc difieren de NLSs clásicas en que sólo 3 de 9 residuos de aminoácidos son básicos (P AAKRVKLD [SEQ ID NO: 84]), lo que indica que una NLS no necesariamente tiene que conformarse a las secuencias de consenso o clásicas dadas anteriormente. akkerh et al (supra) describen secuencias de NLS en las cuales un agregado de aminoácidos básicos (v.gr., KKKK [SEQ ID NO: 85]) es flanqueado por residuos neutros y ácidos, por ejemplo PAAKKKKLD (SEQ ID NO : 86) .
Otras posible secuencias de NLS que se pueden dar a manera de ejemplo incluyen: PKKKRKVL (SEQ ID NO: 87), KKKRK (SEQ ID NO: 88), KKKRVK (SEQ ID NO: 89), KKKRKVL (SEQ ID NO: 90) y RKKRKVL (SEQ ID NO: 91) . Cualquier NLS que sea un derivado de una NLS conocida, v.gr., la NLS de SV40, nucleoplasmina, UNG2 o c-myc se puede usar.
Una secuencia de NLS putativa, propuesta o predicha se puede probar para actividad de NLS mediante el uso de principios y ensayos conocidos y descritos en la técnica. Por ejemplo una secuencia de NLS candidata se puede unir al cargo deseado (en este caso, un oligopéptido de conformidad con la invención como se define en la presente) y el constructo se puede proveer con una molécula reportera detectable (v.gr., una etiqueta o marcador que pueda ser visualizado, por ejemplo, un marcador fluorescente) y puesto en contacto con una célula de prueba. La distribución del constructo en la célula entonces se puede determinar.
Por lo tanto, a manera de resumen, el experto en la técnica se percatará de las secuencias de señal adecuadas, pero por medio del ejemplo las siguientes se mencionan aquí. Ejemplos de secuencias de péptido penetrador de célula incluyen Penetratin™, un péptido de 16 aminoácidos correspondiente a la tercera hélice del homeodominio de proteína Antenapedia, etiquetas ricas en tales como R6-Penetratin (en las cuales los residuos de arginina se añadieron al N-terminal de Penetratin) y derivados de la proteína HIV Tat tal como GRKKRRQRRRPPQQ (SEQ ID NO : 92) . Ejemplos de secuencias de localización nuclear incluyen el derivado de proteína SV40 KKKRK (SEQ ID NO: 93) .
Un constructo preferido de conformidad con la presente invención comprende (i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo APIM, como se define en la presente, (ii) una señal de localización nuclear, y (iii) una secuencia de señal penetrante de célula.
Los elementos o componentes separados de un constructo de conformidad con la presente invención pueden estar contenidos o ser presentados en cualquier orden, pero preferiblemente en los órdenes indicados anteriormente (v.gr. , compuesto oligopeptídico APIM -CPP; compuesto oligopeptídico APIM-NLS; compuesto oligopeptídico APIM-NLS-CPP) .
Además, un compuesto oligopeptídico o constructo de la invención puede contener más de un motivo que interactúa con PCNA. Por lo tanto, alternativamente, un constructo de conformidad con la presente invención puede contener más de un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA. Un constructo o compuesto oligopeptídico puede contener, por ejemplo, 1-10, v.gr., 1-6, ó 1-4 ó 1-3 o uno o dos motivos . Dentro de un constructo también que contiene una secuencia de señal, esos motivos pueden ser separados o localizados de conformidad con la elección, v.gr., pueden ser agrupados juntos, o pueden ser separados por elementos de secuencia de señal, v.gr., motivo-NLS-motivo-CPP; o motivo-NLS-motivo-motivo-CPP; o motivo-motivo-NLS-CPP, etc.
Los componentes o elementos de un constructo de conformidad con la invención se pueden unir o enlazar unos a otros de cualquier forma deseada o conveniente de conformidad con técnicas bien conocidas en el campo. Por lo tanto, los componentes o partes separadas pueden ser enlazadas o conjugadas químicamente, v.gr., mediante el uso de tecnologías de acoplamiento químico conocidas o los constructos se pueden formar como un todo mediante el uso de técnicas de ingeniería genética, v.gr., técnicas para formar proteínas de fusión, o simplemente pueden ser sintetizadas como un todo, v.gr., mediante el uso de técnicas de síntesis de péptido.
Las partes o componentes separados pueden ser enlazados directamente unos a otros o pueden ser enlazados indirectamente por medio de uno o más secuencias enlazadoras (o separadoras) . Por lo tanto, una secuencia enlazadora puede interseparar o separar dos o más partes individuales de un constructo o elementos de motivo separados en un constructo oligopeptídico . La naturaleza precisa de la secuencia enlazadora no es crítica y puede ser de longitud y/o secuencia variable, por ejemplo, puede tener 0-40, muy particularmente 0-20, 0-15, 0-12, 0-10, 0-8 ó 0-6, 0-4 ó 0-3 residuos, v.gr., 1, 2 ó 3 o más residuos. A manera de ejemplo representativo, la secuencia enlazadora, si está presente, puede tener 1-15, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6 ó 1-4 residuos, etc. La naturaleza de los residuos no es crítica y pueden ser, por ejemplo, cualquier aminoácido, v.gr., un aminoácido neutro, o un aminoácido alifático, o alternativamente pueden ser hidrofóbicos , o polares o cargados o formadores de estructura, v.gr., prolina. Un intervalo de diferentes secuencias enlazadoras se ha mostrado que son de uso, con la inclusión de secuencias cortas (v.gr., 1-6) de aminoácidos neutros y/o alifáticos.
Secuencias enlazadoras ilustrativas por lo tanto incluyen cualquier residuo de aminoácido individual, v.gr., A, I, L, V, G, R, Q, T o W, o un di-, tri- tetra- penta- o hexa-péptido compuesto de esos residuos.
Como enlazadores representativos se pueden mencionar I, II, IL, R, W, WW, WWW, RIL, RIW, GAQ, GAW, VAT, IILVI (SEQ ID NO: 94), IILVIII (SEQ ID NO: 95) etc.
Los enlazadores entre diferentes elementos pueden ser los mismos o diferentes.
En una modalidad, se provee un compuesto oligopeptídico que tiene o que comprende la secuencia MDRWLVKRILVATK (SEQ ID NO : 96) o MDRWLVKRILKKKRKVATKG (SEQ ID NO: 97) .
Otros compuestos representativos (o muy particularmente constructos) de la invención incluyen MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO : 98), MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO : 99), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG (SEQ ID NO: 100), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 101) , MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 102) , MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 103), MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 104) , MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 105), MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 106), MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 107), MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 108) , MDRWLVKWKKKRKIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 109) , MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 110), Ac-MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO : 111), Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO : 112), Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO : 113), Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO : 114) , Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 115) , MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 116), KRRRQRRKKRIIKRKKKWWWKVLWRDM (SEQ ID NO : 117) .
Los compuestos oligopeptídicos que tienen secuencias como se expone en SEQ ID NOS. 98 a 117 se muestran en la tabla 3 en el ejemplo 6 más adelante, que muestra los componentes separados que constituyen los constructos (es decir, secuencia que contiene motivo, enlazador, NLS, CPP, etc.) Por lo tanto, se verá que SEQ ID NOS. 98 a 117 representan constructos que comprenden por lo menos una secuencia que contiene motivo, una NLS y un CPP, en algunos casos enlazados por secuencias enlazadoras que pueden variar en secuencia, como se especifica. SEQ ID NO. 117 (RI-MDR26-3) es un péptido retro- inverso hecho de D-aminoácidos . Las secuencias de NLS basadas en las secuencias de NLS SV40 o UNG2 se usan, y las secuencias de CPP basadas en Penetratin, HIV-TAT o un péptido rico en R.
En un aspecto adicional, la invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido que tiene o que comprende (v.gr., de) SEQ ID NO: 1 como se definió antes. También se provee el complemento de una molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de promotor operablemente enlazada a la secuencia que codifica un péptido que tiene o que comprende (v.gr., de SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico también codifica una secuencia de señal como se definió antes.
La molécula de ácido nucleico de la invención comprende por lo menos 15 nucleótidos y preferiblemente no más de 800 nucleótidos, muy preferiblemente no más de 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 ó 50 nucleótidos. La molécula de ácido nucleico es preferiblemente una molécula aislada.
Un aspecto adicional se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en la presente. El vector también puede contener elementos adicionales típicamente encontrados en un vector tales como un origen de replicación, un marcador seleccionable tal como resistencia a antibióticos, y/o un sitio de clonación múltiple. El vector puede ser además un vector de expresión, y puede comprender elementos adicionales, v.gr., elementos de control o reguladores transcripcionales y/o translacionales para la expresión de las moléculas de ácido nucleico. Los elementos de control, v.gr., promotores, sitios de unión a ribosoma, incrementadores , terminadores , etc., son bien conocidos y se describen ampliamente en la técnica.
El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un virus, preferiblemente seleccionado de un retrovirus, un adenovirus y un virus asociado a adenovirus.
En otro aspecto, se provee una célula hospedera recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico y/o vector como se describió antes. La célula hospedera es una célula animal, preferiblemente una célula de mamífero, muy preferiblemente, una célula de rata, raurino o humana.
Por "recombinante" se entiende que la molécula de ácido nucleico y/o vector ha sido introducida en la célula hospedera. La célula hospedera puede o no contener naturalmente una copia endógena de la molécula de ácido nucleico, pero es recombinante en que una copia exógena o endógena adicional de la molécula de ácido nucleico y/o vector ha sido introducida.
En un aspecto adicional, se provee una composición farmacéutica que comprende un compuesto oligopeptídico como se define en la presente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente y/o un vector como se define en la presente, junto con un excipiente farmacológicamente (o farmacéuticamente) aceptable.
El excipiente puede incluir cualesquiera excipientes conocidos en la técnica, por ejemplo, cualquier vehículo o diluyente o cualquier otro ingrediente o agente tal como regulador de pH, antioxidante, quelatador, aglutinante, revestimiento, desintegrante, llenador, sabor, color, resbalante, lubricante, conservante, sorbente y/o edulcorante, etc.
El excipiente se puede seleccionar de, por ejemplo, ácido láctico, dextrosa, metabisulf to de sodio, alcohol bencílico, polietilenglicol , propilenglicol , celulosa microcristalina, lactosa, almidón, citosán, almidón pregelatinizado, carbonato de calcio, sulfato de calcio, dextratos, dextrina, dextrosa, fosfato dibásico de calcio dihidratado, fosfato tribásico de calcio, carbonato de magnesio, óxido de magnesio, maltodextrina , manitol, celulosa en polvo, cloruro de sodio, sorbitol y/o talco.
La composición farmacéutica se puede proveer en cualquier forma conocida en la técnica, por ejemplo, como una tableta, cápsula, tableta revestida, líquido, suspensión, dosis en comprimido pequeño, bolsa, implante, inhalante, polvo, comprimido, emulsión, liofilizado, efervescente, aspersión, emplasto, emulsión, bálsamo, yeso o cualesquiera mezclas de los mismos. Se puede proveer, v.gr., como una preparación resistente al fluido gástrico y/o en forma de acción sostenida. Puede ser una forma adecuada para administración oral, parenteral, tópica, rectal, genital, subcutánea, transuretral , transdérmica , intranasal, intraperitoneal, intramuscular y/o intravenosa y/o para administración por inhalación.
En una modalidad representativa, la composición farmacéutica está en una forma adecuada para administración liposomal, por lo que preferiblemente se proveen liposomas que contienen la composición farmacéutica. Cuando se usan liposomas, puede no ser necesario incluir un excipiente adicional, por lo que también se proveen liposomas que contienen un compuesto oligopeptídico como se define en la presente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente y/o un vector como se define en la presente.
Mediante el uso de una búsqueda en base de datos, los inventores descubrieron la presencia del nuevo motivo de unión de PCNA en más de 200 otras proteínas, muchas de las cuales están implicadas en la reparación de ADN, mantenimiento y regulación del ciclo celular, v.gr., transcripción, replicación, fosforilación, ubiquitinilación, síntesis de translesión, cohesión de cromátidas hermanas y regulación del ciclo celular (véase tabla 1 y ejemplo 4) . Estas proteínas incluyen las siguientes - una proteína de función desconocida que contiene el dominio I N-terminal conservado encontrado en factor de alargamiento de TFIIS, una proteína importante para la progresión de transcripción detenida, por lo que los inventores la nombraron proteína similar a TFHS . Esta proteína contiene el motivo dentro de sus 7 aminoácidos N-terminales. - el factor de transcripción multifuncional TFII-I, que es crítico para el control del ciclo celular y la proliferación celular. Las células que sobre-expresan TFII-I tienen persistencia incrementada de focos ?-?2?? (un marcador para rompimientos de doble cadena de ADN) , lo que sugiere un papel para TFII-I en la reparación de ADN. Esta proteína contiene 4 de los motivos.
- ADN topoi somerasa II alfa (Topo II OÍ) , que funciona en la descat enac ion de ADN post - repl i cat iva y segregación de ADN. Esta proteína contiene un mot ivo . la proteína de reparación de excisión de nucleótido XPA que reconoce torcimientos helicoidales. Esta proteína contiene un motivo.
- RAD51 B, una proteína de recombinación homologa que se muestra que es importante para la función de centrosoma apropiada y segregación de cromosomas. Esta proteína contiene un motivo.
Proteína de complejo de núcleo de anemia de Fanconi , FANCC . El complejo de núcleo de FA se muestra que está implicado en la vía de señalización activada por daño a ADN que regula la reparación de ADN de agentes reticulantes . Esta proteína contiene un motivo.
Proteínas adicionales que se ha encontrado que contienen por lo menos un motivo se listan en la tabla 1.
Sin desear estar limitados por la teoría, los hallazgos de los inventores indican que al prevenir PCNA de interactuar con por lo menos una de sus moléculas de enlace usuales, las células pueden ser sensibilizadas al efecto de agentes citostáticos . Por lo tanto, el efecto del agente citostático puede ser modulado. Por ejemplo, la interacción de una proteína de reparación con PCNA puede ser inhibida (v.gr., hABH2) por lo que se inhibe la reparación de ADN, y como consecuencia se incrementa el efecto del agente citostático en el daño al ADN.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, se provee un ' método de tratamiento de un trastorno o afección, particularmente un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o cualquier condición que requiera o responda a terapia citostática, el método comprende administrar (particularmente administrar una cantidad efectiva de) un compuesto de oligopéptido como se define en la presente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente y/o un vector como se define en la presente, a un sujeto que necesita el mismo.
En otro aspecto, se provee un compuesto oligopeptídico como se define en la presente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente y/o un vector como se define en la presente, para usarse en terapia, particularmente para usarse en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o en cualquier tratamiento que involucre terapia citostática (es decir, el uso de un agente citostático) . Por lo tanto el compuesto etc., se puede usar en el tratamiento de cualquier condición que requiera o responda a terapia citostática.
En otro aspecto, se provee el uso de un compuesto oligopeptídico como se define en la presente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente y/o un vector como se define en la presente, en la fabricación de un medicamento para usarse en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o en un tratamiento que implica terapia citostática.
Como se indicó antes, un hallazgo sorprendente que conduce a esta invención es que el efecto de una gama de diferentes fármacos citostáticos se puede incrementar o potenciar mediante el uso de un péptido que tiene un motivo que interactúa con PCNA, por lo que se inhibe la interacción de PCNA con una gama supuestamente amplia de proteínas, por ejemplo proteínas implicadas en la reparación y replicación de ADN y progresión del ciclo celular, etc. Esto conduce a la propuesta general de que cualquier molécula que interactúa con PCNA se puede usar en combinación con un agente citostático, a fin de incrementar el efecto de ese agente citostático, o de sensibilizar las células a su efecto.
Por consiguiente, en otro aspecto adicional, se provee un método de tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o un método de tratamiento que implica terapia citostática, el método comprende la administración de un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA, y la administración separada, simultánea o secuencial de un agente citostático a un sujeto que necesita el mismo.
Alternativamente visualizado, se provee un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el compuesto oligopeptídico para usarse en combinación con un agente citostático en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o en un tratamiento que implica terapia citostática .
Por lo tanto, se provee el uso de un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el compuesto oligopeptídico en la fabricación de un medicamento para usarse en combinación con un agente citostático en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o en un tratamiento que implica terapia citostática.
Por lo tanto, en una modalidad el medicamento puede comprender además un agente citostático.
El medicamento puede estar en forma de una sola composición que comprende tanto el compuesto oligopeptídico o molécula de ácido nucleico como el agente citostático, o puede estar en forma de un kit o producto que los contiene para administración separada (v.gr., simultánea o secuencial) .
Por lo tanto, también se provee el uso de un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el compuesto oligopeptídico en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo , o en un tratamiento que implica terapia citostática, en donde el medicamento se administra separadamente, simultáneamente o secuencialmente con un agente citostático.
En otro aspecto, la invención provee un producto que contiene un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el compuesto oligopeptídico junto con un agente citostático como una preparación combinada para uso separado, simultáneo o secuencial en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o en un tratamiento que implica terapia citostática.
El compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA, preferiblemente el compuesto oligopeptídico que comprende o que tiene SEQ ID NO: 1, se puede usar para modular o potenciar el efecto de un agente citostático.
Los compuestos oligopeptídicos (que incluyen constructos) de conformidad con la invención por lo tanto tienen una utilidad terapéutica en cualquier condición o situación clínica en donde es deseable (o en donde puede ser de beneficio) inhibir el crecimiento de células.
El término "inhibe" se usa ampliamente para incluir cualquier reducción o disminución en crecimiento celular así como la prevención o abolición de crecimiento celular. La "inhibición" por lo tanto incluye la reducción o prevención del crecimiento celular. Esto se puede determinar por cualquier medio apropiado o conveniente, tal como determinar o evaluar el número de células, tamaño (v.gr., tamaño de tejido en el cual las células están contenidas), viabilidad de las células y/o muerte celular, etc., como se puede determinar por técnicas bien conocidas en la técnica.
"Crecimiento" de células como se refiere en la presente también se usa ampliamente para incluir cualquier aspecto de crecimiento celular, que incluye en particular la proliferación de células.
Los compuestos oligopeptídicos por lo tanto se pueden usar en el tratamiento de cualquier condición (usada ampliamente en la presente para incluir cualquier trastorno o cualquier situación clínica) que responde a la reducción de crecimiento celular (particularmente proliferación celular) . Los compuestos oligopeptídicos por consiguiente encuentran utilidad en cualquier terapia (o tratamiento) que dirige crecimiento (o proliferación) celular. En otras palabras, los compuestos se pueden usar en cualquier aplicación terapéutica en la cual es deseable o ventajoso inhibir la proliferación celular .
El término "tratamiento", como se usa en la presente, se refiere ampliamente a cualquier efecto o paso (o intervención) benéfica en el manejo de una condición clínica y por lo tanto incluye tratamientos tanto terapéuticos como profilácticos. El tratamiento puede incluir reducción, alivio, mitigación, desaceleración del desarrollo de, o eliminación de la condición o uno o más síntomas de los mismos, que son tratados, en relación con la condición o síntoma antes del tratamiento, o en cualquier forma que mejora el estado clínico del sujeto. Un tratamiento puede incluir cualquier paso clínico o intervención que contribuya a, o sea parte de, un programa o régimen de tratamiento. Un tratamiento profiláctico puede incluir el retraso, limitación, reducción o prevención de la condición o el inicio de la condición, o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo en relación con la condición o síntoma antes del tratamiento profiláctico. La profilaxis por lo tanto incluye explícitamente tanto la prevención absoluta de ocurrencia o desarrollo de la condición, o síntoma de la misma, y cualquier retraso en el inicio o desarrollo de la condición o síntoma, o reducción o limitación sobre el desarrollo o progresión de la condición o síntoma. El tratamiento de conformidad con la invención por lo tanto incluye matar, inhibir o desacelerar el crecimiento de células, o el incremento en tamaño de un cuerpo o población de células (v.gr., en un tejido, tumor o crecimiento), reducción del número de células o prevención de la diseminación de células (v.gr., a otro sitio anatómico), reducción del tamaño de un crecimiento celular, etc. El término "tratamiento" no implica curar o completar la anulación o eliminación del crecimiento celular, o un crecimiento de células.
Puesto que las aplicaciones terapéuticas y utilidades de la presente invención generalmente pueden implica inhibir la proliferación celular, cualquier célula proliferante puede ser dirigida en las terapias y utilidades descritas y abarcadas en la presente. Esas células proliferantes pueden incluir células sanas o enfermas y células de cualquier tejido en el cual ocurre proliferación. Por ejemplo, esas células pueden incluir en particular células neoplásicas, que incluyen células neoplásicas tanto malignas como no malignas y células del sistema inmunológico (células inmunes) , células del sistema hematopoyético en general, o células de la piel.
Los trastornos o afecciones que implican crecimiento celular anormal o no deseado pueden ser tratados con agentes citostáticos , y agentes citostáticos se pueden usar en cualquier situación en donde se desea reducir o prevenir el crecimiento y proliferación celular, que incluyen situaciones en donde se desea matar o extirpar células. Por consiguiente, alternativamente como se indicó antes, los compuestos oligopeptídicos (que incluyen constructos) de la presente invención se pueden usar en cualquier método de tratamiento que implica (o incluye) el uso de un agente citostático. Este puede incluir el tratamiento de cualquier condición que responde a un agente citostático o cualquier condición que puede ser tratado con o que requiere el uso de un agente citostático.
El tratamiento de trastornos hiperproliferativos representa un aspecto de interés particular. El término "trastorno hiperproliferativo" se usa ampliamente en la presente para incluir cualquier trastorno o afección que implica proliferación de células incrementada, no deseada o no pretendida. Por lo tanto, no se incluyen únicamente condiciones en las cuales la proliferación de células es incrementada, por ejemplo en relación con células normales o sanas, o células en ausencia de la condición en cuestión (v.gr. , comparada o relativa a un sujeto sano o de control, o comparada o relativa a células tomadas de tejido sano o no afectado en el mismo sujeto), sino también condiciones en las cuales la proliferación celular no es incrementada (o no se incrementan en gran medida o significativamente) sobre las normales, pero en la cuales la proliferación que ocurre es no preferida o no pretendida, ya sea generalmente o en un contexto particular. Esto puede incluir por ejemplo una proliferación de células no preferida o no pretendida que puede ocurrir en una respuesta "normal", v.gr., una respuesta inmunitaria o una respuesta inflamatoria, etc. (en otras palabras, una respuesta "normal" que puede ocurrir en un contexto particular (v.gr., normal), pero que sin embargo puede ser no pretendida) . Esa respuesta proliferativa no pretendida puede ser, por ejemplo, la proliferación de células que dan por resultado una respuesta inflamatoria no pretendida, o una respuesta inmunitaria no pretendida tal como una respuesta autoinmune o una reacción alérgica, etc.
Los trastornos hiperproliferativos que pueden ser tratados de conformidad con la presente invención por lo tanto incluyen explícitamente inflamación (muy particularmente trastornos o afecciones inflamatorias, o condiciones que implican, o están asociados con, o caracterizados por, inflamación) y trastornos o afecciones autoinmunitarias , o trastornos o afecciones que tienen un componente autoinmunitario .
Un trastorno hiperproliferativo puede implicar (pero no se limita a) la proliferación de células que tienen la capacidad para crecimiento autónomo, es decir, células que existes y reproducen independientemente de mecanismos reguladores normales. Un trastorno hiperproliferativo por lo tanto puede ser un trastorno neoplásico, y como se indicó antes, este puede ser un trastorno maligno o no maligno.
Las células hiperproliferativas pueden ser clasificadas como patológicas (es decir, desviadas de células normales y asociadas con un estado de enfermedad) o no patológicas (es decir, desviadas de células normales pero no asociadas con un estado de enfermedad) .
Las células hiperproliferativas patológicas pueden estar asociadas con, o características de los siguientes estados de enfermedad o trastornos: restenosis, nefropatía diabética, hiperplasia de tiroides, enfermedad de Grave, psoriasis, hipertrofia prostática benigna, síndrome de Li-Fraumenti, y cánceres (que incluyen cualesquiera tumores o malignidades) .
Ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen células epiteliales de conductos mamarios durante el desarrollo de lactación y también células asociadas con reparación de heridas.
Los compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de esos trastornos y enfermedades y otros, que incluyen retinopatía diabética y enfermedades vasculares periféricas .
Los trastornos hiperproliferativos , como se indicó antes, pueden ser trastornos neoplásicos malignos o no malignos. También se incluyen trastornos pre-malignos y no neoplásicos. Ejemplos de trastornos hiperproliferativos pre-malignos o no neoplásicos o no malignos incluyen trastornos mielodisplásicos , carcinoma cervical - in situ, pólipos intestinales familiares (v.gr., síndrome de Gardner) , leucoplasias orales, histiocitosis , queloides, hemangiomas, estenosis arterial hiperproliferativo, artritis inflamatoria, hiperqueratosis , y erupciones papuloescamosas , que incluyen artritis. También se incluyen enfermedades hiperproliferativas inducidas por virus tales como verrugas y enfermedades inducidas por EBV (v.gr., mononucleosis infecciosas), formación de cicatriz y similares.
El trastorno hiperproliferativo por lo tanto puede ser cualquier trastorno hiperproliferativo, por ejemplo, seleccionado de trastornos neoplásicos tales como cáncer, artritis psoriáticos, artritis reumatoide, trastornos hiperproliferativos gástricos tales como enfermedad intestinal inflamatoria, trastornos de la piel que incluyen psoriasis, síndrome de Reiter, pitiriasis rubra pilaris, y variantes hiperproliferativas de los trastornos de queratinización .
Cáncer representa un trastorno hiperproliferativo de interés particular, y todos tipos de cánceres, que incluyen, v.gr., tumores sólidos y cánceres hematológicos se incluyen. Tipos representativos de cáncer incluyen cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de riñon, cáncer de vesícula biliar, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas, cáncer gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, y leucemia mielógena crónica) , cáncer de cerebro (v.gr., astrocitoma, glioblastoma , meduloblastoma) , neuroblastoma, sarcomas, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de estómago, cáncer anal, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer endometrial, plasmacitoma , linfornas, retinoblastoma , tumor de Wilm, sarcoma de Ewing, melanoma y otros cánceres de la piel .
También se puede hacer mención de tumores sinusiodales , cánceres uretrales y genito-urinarios , cáncer esofágico, mieloma, cánceres endocrinos, osteosarcoma, angiosarcoma y fibrosarcoma , y cualquier tumor de los sistemas nervioso periférico o central, malignos o benignos, que incluyen gliomas y neuroblastomas.
Los trastornos o enfermedades autoinmunitarias representan una condición adicional de interés particular, e incluyen por ejemplo artritis reumatoide , esclerosis múltiple, trastornos inmunes tales como lupus eritematoso sistémico (SLE; lupus) o miastenia grave.
También de interés, en términos generales, son trastornos hematológicos , o enfermedades de la sangre o médula ósea, que no necesariamente tienen que ser malignos o cancerosos (v.gr., varias discrasias, o displasias, hiperplasia no maligna, agranuloma o MGUS (gamopatía monoclonal de significado desconocido) . Por lo tanto, cualquier condición que implique una proliferación no pretendida, o no deseada o anormal de células de la sangre o médula ósea, o sus precursores, se puede tratar de conformidad con la presente invención.
Otras condiciones que pueden ser particularmente mencionadas incluyen meningitis neoplásicas y enfermedades mieloproliferativas , v.gr., policitemia vera (que ocurre cuando se producen glóbulos rojos excesivos) .
Varias condiciones también pueden ocurrir como resultado de, o de otra manera pueden estar asociados con, inflamación o con una enfermedad autoinmune. Esas condiciones también pueden ser tratadas de conformidad con la presente invención. Se puede hacer mención particular de escleromixedema y mucinosis papular, amiloidosis y granulomatosis de Wegener.
Como se indicó antes, los compuestos de la invención pueden aumentar o potenciar los efectos de un agente citostático. Por consiguiente, pueden encontrar utilidad en cualquier aplicación terapéutica en donde un agente citostático se puede usar. Esto puede incluir cualquier situación en donde se desea matar o extirpar células, que pueden incluir no sólo células enfermas. En particular, se produce una situación en donde es deseable extirpar médula ósea antes del trasplante. Los compuestos de la invención por lo tanto se pueden usar en mieloablación, y particularmente mieloablación que precede a un trasplante, que puede ser por ejemplo un trasplante de médula ósea, o muy generalmente un trasplante de células madre hemotopoyéticas (HSCT) , (así como de médula ósea, células madre hemotopoyéticas también se pueden obtener o derivar de la sangre, v.gr., sangre periférica) .
El trasplante de células madre se puede usar en el tratamiento de enfermedades o condiciones de la sangre o médula ósea (es decir, condiciones o trastornos hematológicos) , que pueden ser malignas o no malignas, y ciertos otros tipos de cáncer, que incluyen cánceres de tumor sólido tales como neuroblastoma, cáncer de células redondas pequeñas demoplásticas , sarcoma de Ewing y coriocarcinoma . Malignanidades hematológicas incluyen leucemias, linfornas (Hodgkin y no Hodgkin) y mielomas. Los trastornos hematológicos no malignos incluyen trastornos de fagocitos (v.gr., mielodisplasia) , anemias (v.gr., aplasia severa o anemia aplásica) , y trastornos mieloproliferativos (v.gr., policitemia vera y trombocitosis esencial). Otras condiciones adquiridas que pueden ser tratadas por trasplante de células madre incluyen trastornos metabólicos tales como amiloidosis, y enfermedades ambientalmente inducidas tales como envenenamiento por radiación. El trasplante de células madre también se puede usar en el tratamiento de trastornos congénitos, que incluyen varios trastornos de almacenamiento lisozomal, inmunodeficiencias y trastornos hematológicos no malignos, v.gr., anemias, citopenias, síndromes hemofagocíticos , hemoglobinopatías , enfermedad de células falciformes y ß talasemia mayor.
Radioterapia (también conocida como terapia de radiación y oncología de radiación) se puede usar en el tratamiento de varias condiciones que incluyen los trastornos hiperproliferativos descritos anteriormente. Por "radioterapia" se entiende el uso de radiación ionizante que es capaz de dañar el ADN de células al ionizar directamente o indirectamente los átomos que constituyen la cadena de ADN. La ionización indirecta ocurre como resultado de la ionización de agua, formación de radicales libres, notablemente radicales hidroxilo, que entonces dañan el ADN. En la mayoría de las formas de radioterapia, la mayor parte del efecto de radiación es a través de radicales libres.
La radioterapia es útil en el tratamiento de cáncer y para ablación de tejidos patológicos debido a los efectos citotóxicos que resultan de rupturas de doble cadena de ADN persistente o activación de muerte celular programada. La radiación de ionización causa células proliferantes, tales como células tumorales y cancerosas, para que sufran muerte celular por apoptosis, tanto in vivo como in vitro.
Desafortunadamente, la radioterapia es a menudo poco próspera en la erradicación completa de células cancerosas de un paciente porque con frecuencia no es posible suministrar una dosis suficientemente alta de radiación local para matar células tumorales sin un riesgo inaceptablemente alto de daño al tejido normal circundante. También se sabe que las células muestran susceptibilidades ampliamente variables a muerte celular inducida por radiación y la radiación de ionización también puede activar un mecanismo de respuesta de pro-supervivencia a través de vías de transducción de señal de fosfatidilinositol 3-cinasa/Akt (PI3K/Akt) y proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) . Por lo tanto, existe la necesidad de incrementar la eficacia de radioterapia al sensibilizar células a los efectos de radiación ionizante.
Por consiguiente, los compuestos de la invención se pueden usar para proveer un efecto sensibilizador, en otras palabras para incrementar (o alternativamente hacer incrementar, aumentar o potenciar) los efectos de radioterapia, o para hacer a un sujeto (o muy particularmente células, que pueden estar presentes en un sujeto) más susceptible a los efectos de radioterapia. Por lo tanto, pueden encontrar utilidad en cualquier aplicación terapéutica en donde se use radioterapia. Esto puede incluir cualquier situación en donde se desee matar o extirpar células, que puedan incluir no sólo células enfermas.
Los compuestos de la invención por lo tanto se pueden usar como un sensibilizador de células a los efectos dañinos de ADN de radiación ionizante. Por "sensibilizador" se entiende el uso de los compuestos de la invención para incrementar el efecto dañino de ADN de radiación ionizante sobre células. Esto se puede lograr por la inhibición de la reparación celular endógena de mecanismos de ADN.
Por lo tanto, la presente invención abarca un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA (muy específicamente un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA como se define en la presente) , o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica ese motivo que interactúa con PCNA, para usarse en combinación con radioterapia, en donde el compuesto se administra separadamente, simultáneamente o secuencialmente con la radioterapia. La radioterapia, junto con el compuesto, se puede administrar en el tratamiento de cualquier condición que responda a, o que requiera, radioterapia. Los compuestos o constructos de la invención por lo tanto se pueden usar en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o en cualquier tratamiento que implica radioterapia, Alternativamente definida, la invención provee un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA (muy específicamente, un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA como se define en la presente) o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el motivo que interactúa con PCNA, como un sensibilizador para radioterapia, en donde el compuesto se administra separadamente, simultáneamente o secuencialmente con radioterapia .
Estos aspectos de la invención también proveen un método de sensibilización de un sujeto (o muy particularmente células o tejido en el sujeto) a radioterapia, el método comprende administrar al sujeto un compuesto oligopeptídico de la invención como se define en la presente, particularmente una cantidad del compuesto que es efectivo para sensibilizar el sujeto (o las células o tejido) a la radioterapia .
Este aspecto de la invención también se puede ver para proveer un método de tratamiento de un sujeto, el método comprende administrar radioterapia al sujeto, junto con un compuesto oligopeptídico de la invención como se define en la presente. Muy particularmente un método puede ser un método de tratamiento de un trastorno o afección que responde a, o que requiere, radioterapia, o un trastorno o afección en el cual es deseable inhibir el crecimiento de células, o un método de tratamiento que implica radioterapia.
La invención contempla todos los tipos de radioterapia que incluyen, pero no se limitan a radioterapia de haz externo convencional, radioterapia estereotáctica , estimulación virtual, radioterapia conformacional tridimensional, radioterapia modulada por intensidad y terapia de radioisótopo (RIT) .
Por lo tanto, en una modalidad preferida de cualquiera de los aspectos listados en la presente, el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico y/o vector como se define en la presente es/son usados junto con (simultáneamente, separadamente o secuencialmente) una radioterapia .
En una modalidad preferida adicional de cualquiera de los aspectos listados en la presente, el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico y/o vector como se define en la presente es/son usados junto con (simultáneamente, separadamente o secuencialmente) un agente citostático .
Por "agente citostático" se entiende un agente que es capaz de inhibir o suprimir el crecimiento y/o multiplicación (replicación/proliferación) de células animales .
Incluidos como agentes citostáticos son los agentes citotóxicos, agentes anti-neoplásicos y cualquier agente que pueda ser indicado para una aplicación oncológica o hematológica . Por lo tanto, se incluyen agentes usados en protocolos de tratamiento quimioterapéutico ("agentes quimioterapéuticos " ) .
Los agentes citostáticos son típicamente agrupados en diferentes clases de conformidad con su mecanismo de acción y todas estas clases se contemplan en la presente. Por lo tanto, el agente citostático puede ser un agente alquilante, un agente entrelazador, un agente intercalador, un análogo de nucleótido, un inhibidor de formación de huso, y/o un inhibidor de topoisomerasa I y/o II. Otros tipos o clases de agentes incluyen anti-metabolitos , alcaloides de plantas y terpenoides, o un antibiótico anti-tumoral . Preferiblemente, es un agente alquilante.
Los agentes alquilantes modifican ADN al alquilar nucleósidos, que conducen a la prevención de replicación de ADN correcto. Los análogos de nucleótido se incorporan en ADN durante la replicación e inhiben la síntesis de ADN. Los inhibidores de formación de huso, perturbación de formación de huso, que conducen a la detención de mitosis durante la metafase . Los agentes intercaladores intercalan entre las bases de ADN, por lo que se inhibe la síntesis de ADN. Los inhibidores de topoisomerasa I o II afectan la torsión de ADN, con lo que se interfiere la replicación de ADN.
Los agentes citostáticos adecuados son conocidos en la técnica, pero a manera de ejemplo, la actinomicina D, BCNU (carmustina) , carboplatino , CCNU, campotecina (CPT) , cantaridina, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, decarbazina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina , DTIC, epirubicina, etopósido, gefinitib, gemcitabina, ifosamida irinotecan, ionomicina, melfalan, metotrexato, mitomicina C (MMC) , mitozantronemercaptopurina, Oxaliplatino , Paclitaxel (taxol) , inhibidor de PARP-I, taxotere, temozolomida (TZM) , tenipósido, topotecano, treosulfano, vinorelbina, vincristina, vinblastina, 5-Azacitidina, 5 , 6 -Dihidro- 5 -Azacitidina y 5-fluorouracilo se nombran en la presente. El experto en la técnica se percatará que los intervalos de dosis adecuados para cualquier agente citostático dado y en una modalidad, el agente citostático está presente en la composición farmacéutica, o se administra al sujeto, en su intervalo de dosis típico. En una modalidad ventajosa, una dosis más baja del agente citostático puede estar presente/ser usado, debido a que el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico o vector de la invención sensibiliza las células a los agentes citostáticos , etc., cuando se usan en combinación con el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico o vector de la invención, una dosis más baja del agente citostático tendrá el mismo o un efecto terapéutico comparable que una dosis más alta del agente citostático como tal. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico o vector de la invención por lo tanto hace posible tratar sujetos que tienen una tolerancia baja, o promedio más bajo que, para agentes citostáticos , tales como personas de edad avanzada, bebés o niños pequeños, o personas debilitadas, v.gr., por enfermedad, malnutrición y similares.
Un problema encontrado cuando se usan agentes citostáticos para tratar un trastorno hiperproliferativo es que típicamente no todas las células afectadas mueren. Se contempla que cuando un agente citostático y el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico o vector de la invención se usan juntos, un porcentaje más alto de células afectadas mueren y en una modalidad, una dosis más alta que la dosis típica del agente citostático se usa junto con el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico o vector de la invención para lograr matar una proporción muy alta de las células enfermas, v.gr., por lo menos 50, 60 70 ó 80%, preferiblemente por lo menos 85, 90 ó 95%, muy preferiblemente para matar sustancialmente todas las células enfermas.
Como se indicó antes, cuando el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico y/o vector como se define en la presente se usa junto con un agente citostático, entonces los dos agentes diferentes pueden estar presentes en la misma composición farmacéutica, o se pueden administrar separadamente. La administración separada puede incluir la administración sustancialmente al mismo tiempo pero mediante diferentes vías de administración o por administración en diferentes lugares. La administración separada también puede incluir la administración en diferentes tiempos, v.gr., hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 12 horas aparte.
El sujeto es un animal (es decir, cualquier humano o animal no humano) , preferiblemente un mamífero, muy preferiblemente un humano.
El experto en la técnica estará consciente de métodos adecuados para introducir el compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico y/o vector en células. A manera de ejemplo, algunos métodos adecuados se describen brevemente más adelante. Como se describió en detalle anteriormente, los métodos de suministro mediados por péptido se pueden usar, notablemente péptidos penetrantes de células (CPPs) que, como se describió antes, son secuencias cortas, en algunos casos policatiónicas , que pueden facilitar la absorción celular de péptidos, proteínas o moléculas de nucleótido que contienen CPPs o a las cuales CPPs están enlazados, por ejemplo al incrementar la absorción en endosomas de células de mamífero. La microencapsulación provee una forma simple y efectiva en costos para encerrar materiales bioactivos dentro de una membrana polimérica semipermeable para el propósito de proteger los materiales bioactivos y liberar las sustancias encerradas o sus productos de una manera controlada. En internalización fotoquímica (PCI) tanto la molécula de interés como un compuesto fotosensibilizador son absorbidos por la célula en un lisosoma o un endosoma. Las células son entonces expuestas a la luz de longitudes de onda adecuadas para activar el compuesto fotosensibilizador, lo que causa que el compuesto fotosensibilizador altere la membrana del lisosoma o endosoma, por lo que se libera la molécula de interés en el citosol de la célula.
Otros métodos incluyen microinyección, fusión mediada por fantasma de glóbulos rojos, fusión de liposoma, lisis osmótica de pinosomas, carga por raspado, electroporación, fosfato de calcio y transfección mediada por virus y el uso de vehículos copoliméricos .
Citosán y derivados de citosán solubles en agua, en particular citosán glicólico, surgen como los vehículos de fármaco de elección debido a su biocompatibilidad y biodegradabilidad in vivo. Un ejemplo preferido es citosán glicólico hidrofóbicamente modificado con ácido 5 -colánico.
En la presente se usa el código de una letra estándar para aminoácidos, por lo que K representa lisina (Lys) , I representa isoleucina (He), etc.
El compuesto oligopeptídico de la invención puede incorporar uno o más, v.gr . , por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos que poseen una cadena lateral que no es codificada por el código genético estándar, denominados aquí "aminoácidos no codificados". Estos pueden ser seleccionados de aminoácidos que se forman a través de procesos metabólicos tales como ornitina o taurina, y/o aminoácidos artificialmente modificados tales como aminoácidos protegidos con 9H-fluoren- 9 - ilmetoxicarbonilo (Fmoc) , (ter) - (B) útil (o) xi (c) arbonilo (Boc) , 2 , 2 , 5 , 7 , 8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc) , o aminoácidos que tienen el grupo benciloxi-carbonilo (Z) . Preferiblemente, en donde los aminoácidos no codificados están presentes, no están localizados dentro del motivo, pero en una modalidad uno o más aminoácidos no codificados están presentes dentro del motivo.
La estabilidad in vitro y/o in vivo del compuesto oligopeptídico de la invención puede ser mejorado o incrementado a través del uso de medios estabilizadores o protectores conocidos en la técnica, por ejemplo la adición de grupos protectores o estabilizadores, incorporación de derivados o análogos de aminoácidos o modificación química de aminoácidos. Esos grupos protectores o estabilizadores se pueden añadir, por ejemplo, en el N- y/o C-terminal. Un ejemplo de ese grupo es un grupo acetilo y otros grupos protectores o grupos que podrían estabilizar un péptido son conocidos en la técnica.
Los compuestos oligopeptídicos de la invención típicamente comprenderán sólo aminoácidos que tienen la configuración L, pero uno o más aminoácidos que tienen la configuración D pueden estar presentes. Preferiblemente, el compuesto oligopeptídico contiene por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos D y preferiblemente se encuentran en el motivo, pero en otra modalidad, los aminoácidos D están presentes sólo fuera del motivo. El compuesto oligopeptídico puede ser lineal o cíclico.
Por lo tanto, incluidos particularmente son compuestos oligopeptídicos inversos o análogos inversos de los compuestos oligopeptídicos de la invención (y muy particularmente péptidos inversos) .
También se incluyen compuestos oligopeptídicos retro (o péptidos retro) en los cuales los residuos (v.gr., residuos de aminoácidos) son ensamblados en dirección opuesta al compuesto original o de referencia (v.gr., péptido) .
Los compuestos oligopeptídicos retro-inversos incluyen D-aminoácidos en orden de reversa (opuestos) a la secuencia de compuesto original o de referencia. Un análogo retro- inverso por lo tanto tiene terminales revertidas y orden revertido de v.gr., enlaces peptídicos, mientras mantienen aproximadamente la topología de las cadenas laterales como en la secuencia original o de referencia.
Los compuestos de la invención pueden incluir secuencias inversa parcial, retro o retro- inversa .
Por "compuesto oligopeptídico" se entiende un compuesto que está compuesto de aminoácidos o subunidades equivalentes, que son enlazadas juntas por enlaces peptídicos o equivalentes. Por lo tanto, el término "compuesto oligopeptídico" incluye péptidos y peptidomiméticos .
Por "subunidad equivalente" se entiende una subunidad que es estructuralmente y f ncionalmente similar a un aminoácido. La porción de esqueleto de la subunidad puede diferir de un aminoácido estándar, v.gr., puede incorporar uno o más átomos de nitrógeno en lugar de uno o más átomos de carbono .
Por "peptidomimético" se entiende un compuesto que es funcionalmente equivalente o similar a un péptido y que puede adoptar una estructura tridimensional similar a sus contrapartes de péptido, pero que no está solamente compuesta de aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos. Una clase preferida de peptidomiméticos son peptoides, es decir, glicinas N-sustituidas . Los peptoides están estrechamente relacionados con sus contrapartes de péptido naturales, pero difieren químicamente en que sus cadenas laterales son anexadas a átomos de nitrógeno a lo largo del esqueleto de la molécula, más que a los carbonos a. como están en los aminoácidos .
En una modalidad preferida, por lo menos la parte del motivo del compuesto oligopeptídico comprende sólo enlaces peptídicos y preferiblemente está compuesto solamente de aminoácidos codificados. Muy preferiblemente, el compuesto oligopeptídico es un péptido.
El compuesto oligopeptídico puede incorporar di-aminoácidos y/o ß-aminoácidos, pero por lo menos la parte del motivo está compuesto preferiblemente sólo de a-aminoácidos. Muy preferiblemente, el compuesto oligopeptídico consiste de a-aminoácidos .
El prefijo "oligo" se usa para designar un número relativamente pequeño de subunidades tales como aminoácidos, es decir, menos de 200, preferiblemente menos de 100, 90, 80, 70 60 ó 50 subunidades. El compuesto oligopeptídico de la invención por lo tanto puede comprender por lo menos 5 y no más de 200 subunidades. Preferiblemente, comprende por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 subunidades. Alternativamente defino, comprende no más de 40, 35, 30, 29, 28, 27, 26 ó 25 subunidades. Los intervalos de subunidades representativos por lo tanto incluyen 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10 etc, en donde 5-20 y 5-30 son preferidos.
Cuando el compuesto oligopeptídico comprende más de 5 subunidades, entonces la naturaleza de las subunidades fuera del motivo no es crítica, por lo que las subunidades fuera del motivo pueden ser, por ejemplo, aquellas encontradas en la proteína nativa, tal como hABH2 , o pueden ser residuos de alanina o cualesquiera otros residuos adecuados .
Los peptidomiméticos típicamente tienen una vida media más larga dentro del cuerpo de un paciente, por lo que son preferidos en modalidades en donde se desea un efecto de duración más larga. Esto puede ayudar a reducir la frecuencia a la cual la composición tiene que se re-administrada. Sin embargo, por razones de bio-seguridad, una vida media más corta puede ser preferida en otras modalidades; en esas modalidades los péptidos son preferidos.
El compuesto oligopeptídico de la invención puede formar parte de una unidad más grande, v.gr., puede ser fusionado a un polipéptido para formar una proteína de fusión recombinante o unida a un armazón proteínico para formar un aptámero de péptido. Por lo tanto, las proteínas de fusión o aptámeros que incorporan el compuesto oligopeptídico de la invención forman aspectos adicionales de la presente invención. Aspectos adicionales incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden esas proteínas de fusión o aptámeros y el uso de esas proteínas de fusión o aptámeros en terapia o en un método de tratamiento como se describió antes .
Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que para reparación de ADN, mantenimiento y/o regulación del ciclo celular óptimas, varias proteínas tienen que interactuar con PCNA y que los compuestos oligopeptídicos de la invención son capaces de competir con proteínas que poseen el motivo de consenso para interactuar con PCNA. Ejemplos de proteínas que pueden tener que interactuar con PCNA mediante el motivo novedoso para reparación de ADN, mantenimiento y/o regulación del ciclo celular óptimas se listan en la tabla 1, por lo que la proteína puede ser una ADN polimerasa, ADN ligasa, topoisomerasa , proteína de reparación de ADN, proteínas asociadas que interactúan con reparación de ADN, una proteína involucrada en cohesión de cromátidas hermanas, remodelación de cromatina, unión de ADN, procesamiento de ubiquitina o procesamiento de SUMO, E3 ubiquitina ligasa, factor de transcripción, regulador de ciclo celular, proteína cinasa, metiltransferasa , acetil-transferasa, antígeno asociado con cáncer, proteína estructural o cinesina de centrosoma .
Cuando un nivel suficiente del compuesto oligopeptídico de la invención está presente dentro de una célula, entonces la actividad de una o más de estas proteínas es reducido o incluso anulado debido a esta inhibición competitiva .
El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico o vector como se define en la presente como tal se cree que no tiene actividad enzimática y que es no tóxico para las células (véase ejemplo 2) . Por lo tanto, se ha mostrado que la expresión de un péptido de la invención que comprende un motivo que interactúa con PCNA como se define en la presente no tiene efecto, o sólo tiene efectos menores, sobre el crecimiento de la célula en la cual es expresado. Este puede ser dependiente del nivel de expresión. Sin embargo, en algunas situaciones se cree que los compuestos oligopeptídicos de la invención pueden ser citotóxicos y por consiguiente se pueden usar como agentes citotóxicos (o citostáticos) como tales. Por lo tanto, los compuestos de la invención se pueden usar como agentes citotóxicos en el tratamiento de condiciones como se describe aquí, y no necesariamente siempre en combinación con un agente citostático separado, o con radioterapia.
Los experimentos han mostrado que los compuestos oligopeptídicos administrados a las células pueden tener un efecto citotóxico sobre la célula.
El efecto citotóxico puede variar de acuerdo con de la naturaleza precisa del compuesto, por ejemplo, su secuencia o composición. En particular, el efecto citotóxico se puede obtener con constructos que comprenden un NLS y/o CPP y se ha observado con constructos que contienen tanto NLS como CPP. Fuerte evidencia de citotoxicidad se ha observado con constructor de localización nuclear.
Los compuestos oligopeptídicos que presentan un efecto citotóxico pueden ser inversos, retros o retro- inversos etc .
Muy particularmente, se ha observado además que un efecto citotóxico incrementado se puede obtener con compuestos o constructos que contienen más de unb motivo de unión a PCNA de conformidad con la presente invención.
En un aspecto adicional, aquí se provee un kit, o un producto farmacéutico, que comprende: (i) un compuesto oligopeptídico como se define en la presente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente, y/o un vector como se define en la presente; y (ii) un agente citostático.
En otro aspecto, se provee un producto que contiene (i) un compuesto oligopeptídico como se define en la presente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente, y/o un vector como se define en la presente y (ii) un agente citostático como una preparación combinada para uso simultáneo, secuencial o separado en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o en un tratamiento que implica terapia citostática .
También se contempla la administración in vitro de un compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico y/o un vector como se define en la presente a una célula o cultivo de células. Los métodos in vitro se pueden usar para estudiar la reparación de ADN, mantenimiento y/o regulación del ciclo celular. En un aspecto preferido, el método in vitro se usa para identificar agentes citostáticos novedosos. Esto puede permitir la identificación más rápida de agentes citostáticos, o la identificación de agentes que son sólo débilmente citostáticos cuando se usan como tales, pero que tienen actividad citostática útil cuando se usan en combinación con el compuesto oligopeptídico , molécula de ácido nucleico o vector de la invención.
El de interacción con PCNA novedoso, como se define en la presente, se puede usar en el diagnóstico o monitoreo de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, o un tratamiento que implica terapia citostática o radioterapia.
Los inventores han encontrado que varios antígenos asociados con cáncer poseen el motivo de unión a PCNA (véase tabla 1) . Por lo tanto, se contempla que un trastorno hiperproliferativo u otro trastorno como se describió antes puede ser diagnosticado o su progreso puede ser monitoreado al detectar el nivel de expresión y/o localización de una proteína que contiene el motivo, en donde un nivel aberrante y/o localización de la proteína es indicativo del trastorno, v.gr., un trastorno hiperproliferativo .
Por un "nivel aberrante" se entiende un nivel incrementado de la proteína, v.gr., el nivel es más de 10, 20, 30 ó 40% comparado con el nivel en una célula sana del mismo tipo de célula, o un nivel disminuido de la proteína, v.gr., el nivel es menor que 10, 20, 30 ó 40% comparado con el nivel en una célula sana del mismo tipo de célula.
En una modalidad preferida, un nivel incrementado de una proteína que contiene el motivo es indicativo de un trastorno, v.gr., trastorno hiperproliferativo .
El nivel de la proteína que contiene motivo puede ser analizado mediante el uso de cualquier método de detección de proteína conocido. Preferiblemente, se usa un anticuerpo específico para el motivo.
El anticuerpo debe ser suficientemente específico para el motivo (en comparación con una proteína de referencia tal como albúmina de suero de bovino) para que sea usado en un método de diagnóstico.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal y puede ser un anticuerpo entero, v.gr., IgG, IgA, IgE, IgM o IgD, o un fragmento de anticuerpo tal como Fab, Fab', F(ab' ) 2, scFv, Fv, dsFv, ds-scFv, Fd, dAbs .
El ensayo de detección se puede llevar a cabo in vivo o in vitro, v.gr., en un tejido o célula o muestra de fluido corporal, v.gr., un lisado celular, suero o sangre.
La detección puede ser facilitada por acoplamiento (es decir, enlace físico) del anticuerpo a una sustancia detectable (es decir, marcado con anticuerpo). Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes , materiales bioluminescentes , agentes de contraste de RMN y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, luciferasa, beta-galactosidasa , acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, lisozima, malato deshidrogenasa y similares; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuado incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina ; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína , cloruro de dansilo o ficoeritrina ; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol ; ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 1251 , 131I, 35S o 3H. En el caso de un marcador visual directo, se puede hacer uso de una partícula metálica o no metálica coloidal.
Preferiblemente se provee un método de diagnóstico o monitoreo del progreso en un sujeto de un trastorno o afección en la cual es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo, el método comprende los pasos de: (1) poner en contacto una muestra de prueba tomada del sujeto (v.gr. , mamífero) con un anticuerpo específico para el motivo bajo condiciones que permiten la formulación de un complejo anticuerpo-antígeno; (2) medir la cantidad de complejo anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba; y (3) comparar la cantidad complejo anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba con un control.
El control puede ser una célula sana tomada del mismo sujeto, v.gr., una célula de fibroblasto sana.
En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos específicos para el motivo.
La invención además incluye un kit para diagnosticar o monitorear un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, por ejemplo un trastorno hiperproliferativo .
El kit comprende un anticuerpo específico para el motivo e instrucciones para el uso del mismo para diagnosticar el trastorno o afección. Preferiblemente, el anticuerpo es acoplado a una sustancia detectable como se describió antes, o el kit incluye la sustancia detectable.
Un método alternativo de diagnóstico implica la detección de un nivel aberrante de molécula de ácido nucleico que codifica el motivo. En este método, el nivel del ácido nucleico es monitoreado mediante el uso de un método de detección adecuado tal como las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR)o hibridación mediante el uso de sondas adecuadamente marcadas .
Breve Descripción de las Figuras La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes y figuras en las cuales: La figura 1 contiene imágenes de microscopio confocal que muestran que hABH2 y PCNA co- localizan y que los 10 aminoácidos N-terminales de hABH2 son necesarios y suficientes o esta co- localización . Varios constructos de hABH2 (hAHB2 de longitud completa que tienen residuos 1-261, hABH2 truncados que tienen residuos 11-261 y fragmento N-terminal de HABH2 que consiste de residuos 1-10) marcados con EYFP se probaron para la co-localización con PCNA marcado con ECFP (véase Ejemplo 1) . Las franja de la izquierda muestra células transíectadas con hABH2 solo, mientras que las tres franjes restantes muestran células co-transfectadas con constructo hABH2 y PCNA.
La figura 2 es una gráfica que muestra los resultados de análisis de FRET. Mediciones de FRET normalizado (NFRET) se muestran entre EYFP (proteína fluorescente amarilla) /ECFP (proteína ciano- fluorescente ) (franja 1, fondo debido a dimerización de las etiquetas), EYFP- PCNA / ECFP-PCNA (franja 2, control positivo debido que PCNA se une a PCNA) , hAHB2 -EYFP / ECFP-PCNA (franja 3) y ILION hABH2 -EYFP / ECFP-PCNA (franja 4) .
Las figuras 3A-3D contienen gráficas que muestran el efecto de varios agentes citostáticos sobre células que expresan hABH2i_i0-EYFP, o que expresan EYFP como un control. Los tratamientos se muestran a la izquierda, células no tratadas a la derecha. Los tratamientos se llevaron a cabo · con 10 µ? M S , 40 µ? BCNU, 1 µ M C o 600 µ TMZ durante 4 días (figuras 3A-3D respectivamente) . Los datos presentados son de uno representativo de por lo menos 3 experimentos, el crecimiento de células a diferentes dosis se probó en 8 pozos paralelos .
La figura 4 muestra una alineación de secuencia de los 10 aminoácidos N-terminales de homólogos de ABH2 de Homo sapiens (NP 001001655.1), Bos Taurus (NP 001019687.1), Rattus norvegicus (XP 222273.3), Mus musculus (NP 778181.2), Gallus gallus (XP 415188.2) y Strongylocentrotus purpuratus (XP 797704.1) mediante el uso de Clustal W. Las secuencias se obtuvieron de una base de datos pública.
La figura 5 muestra una alineación de las secuencias de las proteínas identificadas en el ejemplo 4 de varias especies diferentes.
Las figuras 6A-6H presentan gráficas que muestran los resultados de ensayos de citotoxicidad con varios péptidos como se describe en el Ejemplo 7 (Figuras 6A a 6H) .
Células HeLa se sembraron en placas de 96 pozos (6000 células/pozo) y se incubaron durante 3 horas. Varias dosis de 5 se añadieron a los pozos en presencia (diamantes llenados) o ausencia de suero (cuadros llenados) en el medio. Después de 1 hr un volumen igual de medio con 10% o 20% de suero (a un medio libre de suero) se añadieron a los pozos. Las células se incubaron durante 48 horas antes de la medición de supervivencia de células por el ensayo de MTT. Las gráficas muestran el crecimiento celular (DO750nm) contra la concentración de péptido (µ?) .
Descripción Detallada de la Invención Ej emplos Procedimientos Experimentales Usados en los Ej emplos Constructos de Expresión La clonación de los constructos de expresión fluorescentemente etiquetados ECFP-PCNA y hABH2i-26i-EYFP se han descrito previamente (Aas et al., 2003) . Al utilizar hABH21-26i-EYFP como una plantilla, hABH2i-10-EYFP y hABH2ii-26i-EYFP fueron generados por PCR. Los amplicones fueron clonados en pEYFP-Nl (Clonetech) mediante el uso de Ndel/Agel y Agel/EcojRI respectivamente. El producto de PCR de EST (Image clone 5176979 (BC035374) RZPD) se clonó en pEYFP-Cl (ffindIII/Acc651) para dar EYFP-TFIIS-L. El constructo EYFP-XPA se hizo al cambiar EYFP con EGFP (fragmento Nhel/BsrGI) en His9 -HA-EGFP-XPA (Rademakers et al., 2003) generosamente proporcionado por Dr. im Vermeulen (Department of Cell Biology y Genetics, Rotterdam) . TFII-I-EYFP fue geberado por amplificación por PCR de TFII-I de pI3CX-TFII-I (Roy et al., 1993) generosamente proporcionado por Dr. Robert G. Roeder (Laboratory of Biochemistry y Molecular Biology, The Rockefeller University, New York) y clonación en EYFP-N1 (Sacl/Apal). EYFP-Topo- lia se hizo al cambiar la etiqueta EGFP (EcoRI romo/Nhel) por la etiqueta EYFP (Xhol romo/Nhel) a partir de EGFP-????-??a (pT104-l) (Mo y Beck, 1999) generosamente proporcionado por illiam T. Beck (División of Molecular Pharmacology, Department of Molecular Genetics, University of Illinois, Chicago). Los constructos hABH2i-7-EYFP que incluían los mutantes F4 , se hicieron al alinear oligos con saliente de Xhol/EcoR seguido por clonación en EYFP-N1 mutado en el codón ATG . Todas las mutaciones puntuales se hicieron por mutagénesis dirigida al sitio de conformidad con el manual de instrucciones de QuickChange® II. Enzimas de restricción y fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP) fueron de New England Biolabs® Inc. y los oligonucleótidos fueron de MedProbe, Eurogentech (Oslo, Noruega) . Todos los constructos fueron verificados por secuenciación .
Formación de Imagen Confocal y Mediciones de FRET Células HeLa vivas examinadas 16-24 horas después de transfección transitoria (por Fugene 6 (Roche Inc.) de conformidad con las recomendaciones del fabricante) de constructos de fusión ECFP y EYFP . Imágenes fluorescentes fuero adquiridas al usar un microscopio de barrido de láser Zeiss LSM 510 Meta equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 63x71.4 Plan-Apochromate . Proteína ciano-fluorescente incrementada (ECFP) fue excitada a ?= 458 nm y detectada a ?= 470-500 nm y proteína fluorescente amarilla incrementada (EYFP) fue excitada a ?= 514 nm y detectada a ?= 530-600 nm, mediante el uso de escudriñamientos consecutivos. El espesor de la rebanada fue de 1 µ??.
Transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) ocurre en las etiquetas (EYFP y ECFP) y menos de 100 Á (10 nm) aparte. Los inventores de la presente detectaron FRET mediante el uso del método de emisión sensibilizada, al medir la emisión de aceptor (EYFP) bajo excitación del donador (ECFP) . Tuvieron FRET cuando la intensidad de la luz emitida desde EYFP después de la excitación del fluorocromo de ECFP fue más fuerte que le luz emitida por ECFP o proteínas etiquetadas con EYFP solas, después de excitación con los laceres de EYFP y ECFP respectivamente (pasantes) dada por la ecuación: FRET= I2 - Ii (ID2/IDI) - I3 (IA2/IA3) es >0. FRET fue normalizada por niveles de expresión que usaron la ecuación: NFRET = FRET/ (Ix x I3)1/2. NFRE se calculó a partir de la media de intensidades (I) dentro de una región de interés (ROI) que contenía más de 25 píxeles en donde todos los píxeles tenían intensidades por abajo de 250 y las intensidades promedio eran entre 100 y 200 tanto para los constructos del donador como del aceptor. El canal 1 (ECFP) y 3 (EYFP) se midieron como se describió anteriormente para la formación de imagen, y el canal 2 (FRET) fue excitado con ?=458 nm y detectado en ?=530-600 nm. IDi, D2, D3 y IAI, A2# A3 se determinaron para células transíectadas con constructos ECFP y EYFP únicamente, con los mismos valores y las mismas intensidades de fluorescencia que las células co-transfectadas (Ii y I3) . ECFP-PCNA y EYFP-PCNA fueron incluidos como controles positivos y debido a la dimerización de etiquetas co-expresadas , las proteínas ECFP y EYFP expresadas a partir de vectores vacíos se incluyeron como controles negativos en todos los experimentos.
Cultivo de Líneas de Células y Preparación de Extractos Células HeLa (cáncer cervical) y HaCaT (queratinocito espontáneamente transformado) que expresan establemente los constructos de interés se prepararon por transíección (por Fugene 6) seguido por distribución o clonación de células por dilución, y cultivo prolongado en medio de Eagle modificado por Dulbecco selectivo (mediante el uso de genticina, G418, 400 µ9/p?1, Invitrogen) con alto nivel de glucosa de 4.5 g/1 (DMEM) (BioWhittaker®) complementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) , amfotericina B (250 µ9/p?1, Sigma-Aldrich) , gentamicina (100 g/ml, Gibco) y glutamina (1 mM, BioWhittaker®) . Las células se cultivaron a 37° en 5% de dióxido de carbono, atmósfera humidificada . Extractos de células fraccionadas de HeLa se prepararon al resuspender las pastillas de células en lx volumen de células empacadas (PCV) en regulador de pH I (10 mM de Tris-HCl, pH 8.0 y 50 mM de KC1) y lx PCV en regulador de pH II (10 mM de Tris-HCl, 100 mM de KC1, 20% glicerol, 0.5% de Nonidet P-40, 10 mM de EGTA, 10 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, lx de inhibidor de proteasa completo (Roche) , cóctel de inhibidor de fosfatos (PIC I y PIC II, Sigma) . Las células se incubaron bajo agitación constante durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante (fracción soluble) se cosechó. La pastilla (que contenía núcleos) fue resuspendida en lx PCV de regulador de pH III (10 mM de Tris-HCl, pH 8.0 y 100 mM de KCl) y lx PCV regulador de pH II, y brevemente sonicado hasta que todos los núcleos fueron alterados. 750 µg de la fracción que contenía nucléolos fue centrifugada y la pastilla (fracción unida a cromatina) fue resuspendida en regulador de pH II y III. La fracción unida a cromatina fue incubada con cóctel de ADNasa / AR Asa (2 µ? Omnicleave® Endonuclease (200 U/µ?, Epicentre® Biotecnologies , WI) , 2 µ? ADNsa (10 U/µ?, Roche Inc.), 2 µ? de Bensonasa (250 U/µ?, Novagene, Ge), 2 µ? de Micrococcal Nucleasa (100-300 U/µ?, Sigma-Aldrich) y 2 µ? ARNsa (10 mg/ml, Sigma-Aldrich) durante 30 min a temperatura ambiente y 1 hr a 37°C. 750 µg de la fracción soluble se incubó con 2 µ? adicionales de Omnicleave® durante la noche a 4°C durante IP.
Co- Inmunoprecipitación (co-IP) y Análisis Western (WB) Un anticuerpo policlonal de conejo internamente purificado por afinidad producido contra proteína GFP, que también reconoce proteínas EYFP y ECFP, fue covalentemente enlazado a esferas paramagnéticas de proteína A (Dynal®) de conformidad con el procedimiento de New England Biolabs® Inc (de ahora en adelante llamadas esferas oc-GFP) . Cada fracción se incubó con esferas a-GFP (10 µ?) durante rotación constante a 4°C durante la noche (IP) . Después de IP, las esferas fueron lavadas 4 veces con 200 µ? de 10 mM de Tris-HCl , 50 mM de KC1 (pH 7.5), con 5 min de incubación sobre hielo entre las mismas. Las esferas después fueron resuspendidas en regulador de pH de carga NuPAGE® (Invitrogen) y 1 mM de DTT, calentadas, y separadas sobre 10% o 4-12% de Bis-Tris-HCl (NuPAGE®) geles y transferidas a membranas PVDF (Immobilon®, Millipore) . Las membranas fueron bloqueadas durante 1 hr en 5% de leche seca con bajo contenido de grasa en PBST (PBS con 0.1% de Tween® 20). Los anticuerpos primarios, oc-PCNA (PC10, Santa Cruz biotechnology Inc.) y o-GFP se diluyeron en 1% de leche seca en PBST y se incubaron durante 1 hr, seguido por incubación de 1 hr con anticuerpos secundarios, IgG/HRP anti-ratón de conejo policlonal IgG/HRP anti-conejo de cerdo policlonal, respectivamente (DakoCytomation, Dinamarca) . Las membranas se trataron con reactivo de quimioluminiscencia (SuperSignal® West Femto Máximum, PIERCE) , y las proteína se visualizaron en Kodak Image Station 2000R.
Análisis de Secuencia Para análisis de secuencia inicial, las bases de datos Swiss-Prot y TrEMBL se usaron para encontrar proteínas con subsecuencias similares como la región de secuencia de interés. Las bases de datos fueron cuestionadas con motivos en formato PROSITE. Se usó Clustal W para alinear las secuencias de interés. Los motivos conservados listados en el archivo 1 complementario fueron identificados por comparación de ortólogos de gen. Los archivos de datos para Inparanoid versión 5.1 fueron descargados del servidor de red Inparanoid htt : //inparanoid. sbc . su. se/ para un subconjunto representativo de organismos. Las secuencias humanas se usaron como referencia, y el archivo de fasta procesado por Inparanoid se buscó con una expresión regular para el motivo APIM, mediante el uso de una herramienta local. Se usó una definición de motivo ligeramente expandido, en donde Ala fue permitido en ya sea la posición 3 ó 4 del motivo, además de lie, Val y Leu, pero no en ambas posiciones simultáneamente. De un total de 22218 secuencias de proteína hubo 636 secuencias con por lo menos un hit contra el motivo APIM. Estas entradas concordaron contra localización subcelular experimental y predicha en la base de datos eSLDB, descargada del servidor de red <http://gpcr.biocomp.unibo.it/esldb/>, y 349 entradas sin indicación de etiquetado al núcleo fueron removidas. Para las 287 entradas restantes los ortólogos de Inparanoid correspondientes fueron identificados, las secuencias correspondientes fueron extraídas de los archivos fasta y las genotecas de secuencia resultantes fueron alineadas con Clustal W.
Las 24 entradas de secuencia sin ortólogos en Inparanoid fueron removidas del análisis. Dos procedimientos diferentes se usaron en paralelo para la identificación de sitios conservados. En el primer procedimiento (consenso) la secuencia de consenso se estimó a partir de la alineación múltiple para cada posición de hit en la secuencia humana. Cuando se estima el consenso, símbolos equivalentes en el motivo APIM conservativo (sin Ala) fueron tratados como símbolos equivalentes para estimación del consenso, por lo que v.gr. , lie, Val y Leu fueron tratados como un solo tipo de residuo. La expresión regular se probó nuevamente contra el consenso antes de que la posición de hit fuera aceptada. En el procedimiento alternativo (individual) la expresión regular fue probada contra cada subsecuencia ortóloga correspondiente a la posición de hit en la secuencia humana. Y sólo las posiciones en donde por lo menos 50% de los ortólogos concordaron con la expresión fueron aceptadas. En este estimado, las subsecuencias que consistían únicamente de espacios fueron excluidas, con la suposición de que esto podría representar, v.gr., variantes de empalme alternativas. Estos dos procedimientos dieron resultados casi idénticos y la salida combinada se muestra en el archivo complementario 1. En total, 37 entradas fueron removidas por este procedimiento, las 226 entradas restantes fueron listadas y analizadas. Las descripciones de proteína usadas en la salida se tomaron del archivo fasta humano procesado por Inparanoid y Ensembl reléase 45. El archivo de salida está en el formato html y puede ser abierto por un buscador de red estándar.
Análisis Dot-Blot de Péptidos de Unión a PCNA Predichos Una hoja de Amino-PEG500-UC540 (ácido endurecido con estabilidad mejorada) que contenía puntos de péptido de 28 nmoles (teñidos con Ponceau para visualizar las manchas) se prepararon en el laboratorio de síntesis de péptido en el Centro de Biotecnología en 1 Universidad de Oslo, Noruega. La membrana se sondeó 1 yg/ml de PCNA durante 2 hr, seguido por sondeo con anticuerpo primario (a-PCNA, PC10) y se desarrollaron como se describió anteriormente para WB .
Prueba de Supervivencia de Células Células HeLa y HaCaT fueron sembradas en placas de 96 pozos (4000 células/pozo) y se incubaron durante 4 horas. Varias dosis de MMS (metansulfonato de metilo, Acros) , BCNU ( 1 , 3 -Bis (2 -cloroetil ) - 1 -nitrosuream, Sigma) , temozolomida (4-metil-5-oxo-2 , 3 , 4 , 6 , 8 -pentazabiciclo [4.3.0] nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, TZM, Sigma) y mitomicina C (6-Amino-1, la, 2, 8, 8a, 8b-hexahidro- 8 - (hidroximetil ) -8a-metoxi-5-metil-azirino [2' , 3':3,4] pirrólo [1 , 2-a] indol-4 , 7-diona carbamato, MMC, Sigma) se añadieron a los pozos. Las células U20S fueron expuestas a MMS y TMZ únicamente. Las células fueron expuestas continuamente hasta ser cosechadas. Las células fueron cosechadas cada día durante 4 días mediante el uso de ensayo de MTT (Mosmann, 1983) . DO se midió a 570 nm, y el promedio de por lo menos 6 pozos se usó para calcular la supervivencia de células. Los datos presentados son crecimiento de un experimento representativo y ha sido reproducido por lo menos 2 veces.
Ejemplo 1 Este trabajo descrito en este ejemplo investiga la localización de hABH2 en focos de replicación e identifica la interacción directa entre hABH2 y PCNA, y la región de hABH2 responsable de esa interacción.
En células de fase S vivas, PCNA etiquetado con proteína fluorescente verde (EGFP) forma distintos focos que representan sitios de replicación y por lo tanto se puede usar como un marcador de fase S.
PCNA etiquetado con proteína ciano-fluorescente (ECFP) fue co-expresada con varios constructos de deleción de hABH2 fusionados con proteína fluorescente amarilla (EYFP) .
Se encontró que en la deleción de 10 aminoácidos N-terminales en hABH2 (hABH2n-26i-EYFP) anularon totalmente la co- localización con PCNA en focos de replicación.
Remarcablemente, cuando estos 10 aminoácidos se fusionaron a EYFP (para dar un constructo llamado hABH2i-i0-EYFP) , fueron suficientes para la co-localización con PCNA. (Figura 1) .
Notablemente, la co-expresión de ECFP-PCNA incrementó la localización de hABH2 de longitud completa (hABH21-2Si-EYFP) , así como hABH21_10-EYFP, en focos nucleares, comparado con células que expresan constructos hABH2 solos. Esto sugiere una interacción directa entre PCNA y hABH2 mediada por los 10 aminoácidos N-terminales de hABH2.
Para examinar el grado de proximidad de hABH2 y PCNA, la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) se midió. Tantoo hABH2 -EYFP de longitud completa como hABH2i_i0-EYFP generaron FRET positiva con ECFP-PCNA, lo que demuestra que la distancia entre las etiquetas fluorescentes es menor que 100 Á. Esto sugiere que las variantes de hABH2 interactúan directamente con o están en el mismo complejo con ECFP-PCNA (Figura 2) .
Para confirmar una interacción directa, estudios de co- inmunoprecipitación se realizaron mediante el uso de extractos de proteína de células que expresan establemente hABH2 -EYFP, hABH211-261-EYFP , hABH2i-10-EYFP o EYFP. Anticuerpos anti-GFP se usaron para inmunoprecipitar las proteínas de fusión respectivas. Análisis de Western Blot subsecuentes revelaron que el PCNA endógeno fue obtenido por hABH2i-2i6-EYFP y hABH2i-i0-EYFP, pero no por hABH2n-26i-EYFP o EYFP. Tomados juntos, estos resultados sugieren que hABH2 interactúa directamente con PCNA y que la secuencia de unión está contenida dentro de los 10 aminoácidos N-terminales de hABH2s Ejemplo 2 Se probó la capacidad de hABH2i_i0 para inhibir hABH2.
Líneas de células que expresaban hABH2i-i0-EYFP o EYFP solo se expusieron a los agentes alquilantes MMS (metansulfonato de metilo) , BCNU (Carmustina) , temozolomida (TZM) o mitomicina C (MMC) . MMS es un agente alquilante de SN2 que conduce a 3 -metilcitosina (3meC) y 1 -metiladenine (ImeA) que son reparados por hABH2 , mientras que BCNU es un agente 06-cloroetilante que conduce principalmente a entrelazamientos intercadena así como algunos aductos cíclicos de monobase ( 1 , N( 6 ) etanoadenina) . TZM se rporta que es un agente 06G metilante, mientras que MMC causa entrelazamientos intercadena mediante la N-alquilación de guanina en CpG's.
La sobreexpresión de hABH2i.i0-EYFP o EYFP no interfirió con la tasa de crecimiento de células no tratadas; sin embargo, se encontró que la expresión de hABH2i-i0-EYFP sensibilizó las células HeLa para tratamiento con MMS . De manera sorprendente, también se encontró que la expresión de hABH2i-i0-EYFP sensibilizó las células HeLa a todos los otros agentes citostáticos probados (Figuras 3A-3D) . Esto indica que la sensibilidad no sólo fue causada por inhibición de hABH2 , que se cree principalmente que repara 3meC y ImeA.
Se sabe a partir de un estudio previo que las células Abh2~^~ de ratón, es decir, células knockout para ABH2 , despliegan sensibilidad incrementada a MMS, pero no a BCNU. Por lo tanto, la sensibilidad incrementada de las células que expresan hABH2i_i0-EYFP a agentes citostáticos tales como BCNU no se puede explicar únicamente por la inhibición de hABH2.
Células HaCaT (querat inocitos espontáneamente transformados) que expresan establemente hABH2i-i0-EYFP también fueron hipersensibles a MMS y TMZ.
Análisis de flujo y ensayo cometa de las células después de tratamiento con diferentes agentes alquilantes mostraron que los fármacos afectaran el ciclo celular de manera diferente, y niveles diferentes inducidos y patrones de intermediarios de reparación de ADN (sitios abásicos, SSB, DSB) como se detectó por el ensayo cometa. MMS conduce a una detención de la fase S (día 1) y dio los niveles más altos de intermediarios de reparación de ADN después de 4 horas. Sin embargo, las células tratadas con MMS mostraron distribución de ciclo celular normal y no mostraron niveles incrementados de intermediarios de reparación de ADN el día 2. De manera similar a MMS, TMZ también condujo a los niveles más altos de intermediarios de reparación después de 4 horas, sin embargo las células fueron detenidas en G2/M hasta el día 3, lo que indica un daño y patrón de reparación diferentes. TMZ también indujo más rupturas de cadena que todos los otros tres agentes probados. Esto es sorprendente ya que TMZ se cree que induce principalmente 06metil-G que s reparado por un mecanismo de reparación directo por MGMT, que no implica remoción de ninguna base o ruptura de cadena. El tratamiento con BCNU condujo a detención de G2/M transitorio en día 1 niveles muy bajos de intermediarios de reparación, lo que indica que 1 mayoría de las células que contenían entrelazamientos murieron. El tratamiento con MMC por otra parte, condujo a una detención de la fase S el día 1 y 2, y esto fue más pronunciado para células que expresan hABH2i-i0-EYFP que para las células de control. Las células fueron sin embargo detenidas en G2/M el día 3. No se pudieron observar diferencias significativas entre las líneas celulares en el ensayo cometa después de tratamiento con MMC, pero el número de intermediarios de reparación llegó al máximo el día 2.
Generalmente, no fue posible detectar algunas diferencias significativas en la cantidad de intermediarios de reparación entre las células que expresan EYFP y hABH2i-i0-EYFP por el ensayo cometa. El cometa y análisis de flujo muestran que los diferentes agentes usados inducen tanto respuestas de ciclo celular diferentes como patrones de reparación diferentes. Todos los agentes habían incrementado la citotoxicidad en células que expresan APIM comparadas con células que expresan EYFP, lo que soporta una función para varias proteínas que contienen APIM en la regulación entre reparación o muerte celular.
Ejemplo 3 Una alineación de secuencias de base de datos ABH2s de varias especies diferentes reveló que los 7 aminoácidos N-terminales son altamente conservados (figura 4) . Para identificar una secuencia de unión, la importancia de estos aminoácidos para la interacción péptido-PCNA se examinó mediante el uso de un ensayo de transferencia de punto. Entre otras cosas, se encontró que Arg3 y Lys7 podría sustituir uno a otro y que Leu5 y Val6 podrían ser sustituidos uno por otro o o por otros aminoácidos alifáticos tales como He y Ala sin afectar la afinidad aparente hacia PCNA. Además, el aminoácido aromático completamente conservado, Phe4 podría ser reemplazado por Tyr, mientras que Ala en esta posición significativamente redujo la unión a PCNA.
Las sustituciones de aminoácidos 1-2 y 8-10 con Ala no afectaron la unión a PCNA, lo que sugiere que el pentapéptido RFLVK (SEQ ID NO. 2) como la secuencia de interacción con el centro.
Ensayos adicionales revelaron que este pentapéptido fue como tal suficiente para unión a PCNA, pero aminoácidos de flanqueo adicionales incrementaron la interacción.
Enseguida, los aminoácidos 1-7 de hABH2 , y variantes de esta secuencia en los cuales Phe4 fue reemplazado por Tyr, Trp o Ala, fueron expresados en fusión con EYFP y probados para co- localización con PCNA in vivo. Similar a lo que se encontró en el ensayo de transferencia de punto, las proteínas de fusión que contenían un aminoácido aromático en la posición 4 co-localizaron con ECFP-PCNA, mientras que las proteínas con Ala en esta posición no lo hicieron.
Ejemplo 4 Las bases de datos Swiss-Prót y TrEMBL se usaron para encontrar proteínas con sub-secuencias similares como la secuencia que había sido identificada como responsable de la unión de hABH2 a PCNA. Mediante el uso del consenso [KR] - [FYW] - [LIVA] - [LIVA] - [KR] (SEQ ID NO. 30) como la pregunta, se obtuvieron 226 hits (véase tabla 1 para un resumen) , del cual se escogieron varias proteínas humanas para análisis posterior .
Una fue una proteína que igual que hABH2 contiene la secuencia de consenso anterior dentro de sus 7 aminoácidos N- terminales . Esta proteína también contiene el dominio I N-terminal conservado encontrado en el factor de alargamiento de TFIIS, una proteína importante para la progresión de transcripción detenida. Los inventores nombraron a esta proteína similar a TFIIS (TFIIS-L) . La función de esta proteína se desconoce.
La segunda proteína fue el factor de transcripción mult ifunct ional TFII-I, que contiene 4 secuencias de consenso. TFII-I es crítico para el control del ciclo celular y proliferación, y células que sobre -expresan TFII-I han incrementado la persistencia de focos de ?-?2?? (un marcador para rupturas de doble cadena de ADN) , lo que sugiere una función para TFII-I en la reparación de ADN.
La ADN topoisomerasa II alfa (Topo II a) que contiene una secuencia de consenso también se examinó. Topo II o¡ funciona en la descatenación de ADN post-replicativa y segregación de ADN.
Una secuencia de consenso también se encontró internamente en la proteína de reparación de excisión de nucleótido clave (NER) XPA que reconoce retorcimientos helicoidales .
Una secuencia de consenso se encontró en RAD51B, una proteína de recombinación homologa que se ha mostrado que es importante para la función de centrosoma apropiada y segregación de centrosoma.
Otra proteína fue la proteína de complejo de núcleo de anemia de Fanconi , FANCC, que se encontró que contenía una secuencia de consenso. La anemia de Fanconi (FA) es un trastorno genético raro caracterizado por anemia aplásica, susceptibilidad e hipersensibilidad a leucemia incrementadas contra agentes de entrelazamiento. El complejo de núcleo de FA se ha mostrado que está involucrado en la vía de señalización activada por daño a ADN que regula la reparación de ADN de agentes reticulantes .
En todas estas proteínas, el motivo de unión a PCNA putativo se encontró que es conservado a través de diferentes especies (figuras 5) . Entre estas cinco proteínas, sólo Topo H a y FANCC (después de daño) se han reportado que co-localizan con BRCAl en focos de fase S nucleares y Topo II OÍ es la única proteína que contiene una caja de PIP potencial (QttLaFkp, aa 1277-84) . Los inventores ahora mostraron que las proteínas de fusión a EYFP de cada una y todas estas proteínas co-localizan con ECFP-PCNA en focos de fase S.
Otros APIM de interés que contiene proteínas encontradas son miembros de la familia poli (ADP-ribosa) (PARP-1, 2 y 4) involucrados en varios procesos de mantenimiento de ADN que incluyen reparación de ADN, el patrón de PARP-1 y a ADN topoisomerasa II beta de isoforma Topo II involucrada en la resolución de problemas topológicos causados por las horquillas de replicación. Además, APIM se encuentra en la subunidad REV3L de la polimerasa de translesión ?, implicada tanto en mutagénesis puntual como estabilidad de genoma a escala más grande, la ADN ligasa I y IV implicadas tanto en replicación como reparación de ADN, las cuatro E3 ubiquitina-proteína ligasas (UHRF1 y UHRF2/NIRF, UBR1 y 2), todas implicadas en la regulación del ciclo celular, mantenimiento e integridad del genoma, así como algunas otras E3 ubiquitina ligasas (tabla 1) . De manera interesante, E3 ubiquitina ligasa se muestran frecuentemente que son genéticamente y exprésionalmente alteradas en tumorgénesis de mama. También la N-acetiltranferasa ESCOl/EFOl contiene APIM, una proteína cuyo ortólogo de levadura se une a PCNA a través de su caja de PIP truncada y que está implicada en cohesión de cromátidas hermanas apropiada, y el mantenimiento estructural humano de proteína 5 de cromosoma, hSMC5 , que se muestra que está implicada en la reparación de ADN de rupturas de doble cadena a través de HR y en el mantenimiento de telómeros en células ALT. Finalmente, varias subunidades de los factores II y III de transcripción general, subunidades de ARN polimerasa II y serina/treonina proteína cinasas se encuentra que contienen el motivo APIM (tabla 1) .
Tabla 1 Procesamiento de SUMO Proteasa de procesamiento específico de ubiquitina SENP2 Factores de TFIIS-L*, TFII-I*, TFIIE-alfa, transcripción factor de transcripción de unión a elemento regulador de esterol 2(SREBF2), subunidad alfa de TFIIIC, subunidad de TFIID 100 kDa (TAF5), subunidad TFIIIC 102 kDa (TFrC gamma) , proteína similar a factor de transcripción MRG15 y X (proteína 1 y 2 similar a factor de mortalidad 4) , factor 7 de transcripción de E2F Reguladores del Ciclo de división celular asociado celular 2, mediador de muerte celular que interactúa con Bcl2, proteína de gen 2 relacionado con apoptosis de espermatocito de testículo Proteína cinasas Serina/Treonina (S/T) -proteína cinasas SRPK1 y 2, 33 y MST4 , S/T proteína cinasa 1 rica en leucina, STK23 (S/T proteína cinasa23) , S/T proteína cinasa PLK3 , S/T proteína cinasa asociada a microtúbulos , S/T proteína cinasa 1 asociada a microtúbulos, P13-cinasa pllO subunidad gamma, activador A de proteína cinasa dependiente de ARN de doble cadena inducible por interferón, fosfoinositida cinasa que contiene dedo FYVE, fosfoinositida 3 -Cinasa . C2 -beta , Fosfatidilinositol-4-fosfato 5- cinasa tipo II alfa y beta, isoforma de subunidad alfa catalítica de fosfatidilinositol- 4 , 5-bifosfato-cinasa, MAPKAP cinasa 2 y 5, proteína cinasa activada por mitógeno 15 (MAP 15) Metiltransferasa MLL3 específico de H3 lisina- K9 metiltransferasa 5, ARNr metiltransferasa 3 putativa Acetil-transferasa Diacetilglicerol 0-acetil transferasa (DGAT1) Antígenos asociados Antígeno El asociado con melanoma, con cáncer MAGE El, MAGE B18, MAGE-G1, proteína de reconocimiento de tumor NK (N -TR) , proteína asociada con proteína de unión a Myc, proteína 1A de unión a Myb, isoforma 1 de proteína relacionada con factor de crecimiento derivado de hematoma, antígeno 1 de cáncer de colon serológicamente definido Proteínas Lámina-Bl y B2 , proteína similar a estructurales actina 2 Centrosoma, cinesinas Proteína centrosomal HOkDA (CepllO) , Proteína centrosomal 192kDA, microtúbulo más motor 3 de cinesina dirigida al extremo (KIF3A) , cadena pesada de cinesina (UKHC) , proteína 1 asociada a cinetocor Negrillas: proteínas localizadas en focos de replicación bajo condiciones normales o después de daño a ADN . Este estudio* o en otra parte: 1 G. L. Moldovan, B. Pfander, y S. Jentsch, Cell 129 (4) , 665 (2007) . 2 Z. Lou, K. Minter-Dykhouse , y J. Chen, Nat Struct Mol Biol 12 (7) , 589 (2005); A. Ni imi , N .
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Ejemplo 5 La función de la secuencia de consenso en las proteínas estudiadas en el ejemplo 4 se examinó experiment almente . Debido a que la sustitución del aminoácido aromático Phe en la secuencia de consenso con Ala anuló la interacción con PCNA in vitro y la co - 1 oca 1 i z ac ión con PCNA in vivo, se examinó si la mutación correspondiente tenía efecto similar sobre las proteínas de longitud completa. La mutación de Phe4 a Ala en hABH2 de longitud completa anuló la colocalización con PCNA. En TFII-I, que contiene 4 de los motivos, los residuos de Phe (F431A, F536A, F641 A y F803A) fueron sustituidos individualmente y colectivamente a Ala. Ninguna mutación individual redujo la co- local ización con PCNA, pero mutaciones en todas las secuencia de consenso en TFII-I redujeron fuertemente la co - 1 oca 1 i z ac i ón con PCNA en los focos de replicación, lo que muestra que varios motivos de secuencia de consenso presentes en la misma proteína pueden contribuir a interacción óptima con PCNA.
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Ejemplo 6 Preparación y Prueba de Constructos que Contienen un Péptido que Contiene Motivo ("APIM") con Secuencias de Señal Los péptidos de SEQ ID NOS. 98 a 117 fueron sintetizados mediante el uso de técnicas estándares, y etiquetas fluorescentes incorporadas, en donde se indica, nuevamente mediante el uso de técnicas estándares. Los péptidos se muestran en la taba 3, que muestra la secuencia de aminoácidos para cada péptido, y también lista separadamente los componentes individuales que constituyen cada péptido (péptido que contiene motivo ("APIM"), NLS, CPP, y enlazadores, como apropiados, y la etiqueta usada, en donde está contenida) Los péptidos de SEQ ID NOS. 98 a 116 están constituidos por L-aminoácidos . El péptido RI-MDR26-3 de SEQ ID NO. 117 es un péptido retro-inverso constituido por D-aminoácidos . Todos los péptidos mostrados en la tabla 3 tienen por lo menos un péptido APIM, un NLS y un CPP.
Se realizaron varios estudios para mostrar el efecto de los péptidos sobre las células. Por lo tanto, las células fueron incubadas con los péptidos para determinar la localización de los péptidos en las células, mediante el uso de técnicas que se basan en aquellas descritas en los ejemplos anteriores. En resumen, los péptidos indicados para ser marcados con etiquetas fluorescentes fueron incubados con las células (células HeLa) y la importación celular se examinó mediante el uso de microscopía confocal .
Los efectos de los péptidos en la sensibilización de células a los efectos de fármacos citostáticos se investigaron mediante el uso de un ensayo de MTT y un ensayo clonogénico (ensayo CFU) como se describe más adelante.
La citotoxiciad de los péptidos fue investigada por un ensayo de MTT como se describe más adelante, mediante el uso de los péptidos solos, en ausencia de fármacos citostáticos. Los datos de citotoxicidad también se obtuvieron de controles usados en los ensayos de MTT con fármaco citostático (controles con péptido pero sin fármaco citostático) , en donde los péptidos de control fueron seguidos por más tiempo (4 días) .
La toxicidad de membrana se investigó, nuevamente como se describe más adelante.
La estabilidad de los péptidos fue investigada por análisis de EM de los péptidos después de la incubación de los péptidos en medio que contiene suero.
Ensayo de MTT Células HeLa se sembraron en placas de 96 pozos (6000 células/pozo) y se incubaron durante 3 horas. Varias dosis de MMS y Cisplatino se añadieron a los pozos. Después de 24 horas, los péptidos se añadieron a las células en medio libre de suero y se incubaron durante 1 hr . Medio fresco con fármacos citostáticos se añadieron y las células se cosecharon después de 24, 48 y 72 horas adicionales. MTT se añadió a las células (bromuro de 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5 -difeniltetrazolio) y OD se midió a 570 nm [52], y el promedio de por lo menos 6 pozos se usó para calcular la supervivencia de las células. Los datos se presentan como crecimiento de un experimento representativo y han sido reproducidos por lo menos 2 veces.
Ensayo Clonogénico (CFU) 750 células HeLa se sembraron en cajas de cultivo de células de 10 cm en 11 mi de medio de crecimiento que contenía fármacos citostáticos (MMS) . El 2o día las células fueron tratadas con péptidos durante una hora bajo condiciones libres de suero. Medio libre que contenía fármacos citostáticos frescos se añadió a las células para incubación posterior durante 10 días. Las células después se fijaron en 6% de glutaraldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron una vez en PBS y se tiñeron con cristal violeta y las unidades formadoras de colonia se contaron. Sólo las colonias que consistían de por lo menos 50 células fueron incluidas.
Ensayos de Citotoxicidad La citotoxicidad de los péptidos después de 48 horas se mide mediante el uso del ensayo de MTT. Células HeLa se sembraron en placas de 96 pozos (6000 células/pozo) y se incubaron durante 3 horas. Varias dosis de péptidos se añadieron a los pozos en presencia o ausencia de suero en el medio. Después de 1 hr, un medio de volumen igual con IX o 2X (a medio libre de suero) se añadieron y las células se incubaron durante 48 horas antes de la adición de MTT (véase lo anterior) Toxicidad de Membrana por Citometría de Flujo Las células se trataron con diferentes concentraciones (2, 4 y 8 µ?) de péptido durante 1 hora. Enseguida, se añadió yoduro de propidio (PI) (50 µg/ml en PBS) , esto teñirá el ADN si las membranas celulares son permeables. Los análisis se hicieron dentro de los siguientes 10 minutos en un citómetro de flujo FACS Canto (BD-Life Science) .
Los resultados se muestran en la tabla 4. A partir de esto se puede ver que todos los péptidos marcados con etiqueta probados, que son esencialmente constructos de un péptido que contiene APIM con un CPP y un NLS , localizaron al núcleo. Este efecto se vio para péptidos con diferentes secuencias enlazadoras que enlazan los componentes individuales del constructo, enlazadores de longitud variable, y péptidos sin secuencias enlazadoras. Esto muestra que la presencia de secuencias enlazadoras no es esencial y la secuencia enlazadora se puede variar.
Los resultados de los experimentos de MTT y CFU con agentes citostáticos muestran el efecto de péptidos en el incremento de los efectos inhibidores del crecimiento de los agentes citostáticos. Por lo tanto, los péptidos son capaces de sensibilizar las células a los efectos de los agentes citostáticos. Este efecto es análogo al reportado en el ejemplo 2 anterior para líneas celulares transfectadas que expresan un péptido que contiene APIM.
La tabla 4 también muestra un efecto citotóxico de un número de péptidos. El trabajo experimental adicional (no se muestran datos) ha indicado que un efecto citotóxico más alto se observa con péptidos que localizan al núcleo, comparado con los que no lo hacen. Un experimento de toxicidad de membrana llevado a cabo con un péptido (MDR2 ; SEQ ID NO. 98) parece indicar que la toxicidad de membrana es baja, lo que puede sugerir que el efecto citotóxico observado para los péptidos no es debido a un efecto de membrana. Se ha observado que en algunos casos el efecto citotóxico se puede ver sólo con concentraciones de péptido incrementadas (por ejemplo, a 1 µ? puede no verse citotoxicidad de péptido (auque se ve un efecto en sensibilización de células a un agente citostático) , mientras que a 2 µ? de péptido se ve un efecto citotóxico del péptido mismo, así como el efecto de sensibilización) .
Los resultados en la tabla 4 también muestran que los efectos de los péptidos en la introducción de la célula y localización al núcleo, en sensibilización de las células a agentes citostáticos , y en citotoxicidad se pueden obtener con diferentes secuencias de NLS y/o CPP y, mientras que la magnitud o grado del efecto pueden variar, los efectos no parecen ser dependientes de secuencias de NLS y/o CPP particulares .
Ciertos péptidos, como se muestra en las tablas 3 y 4, incorporaron un grupo Ac en el N-terminal. Esto se incluyó con la finalidad de estabilizar los péptidos, tanto en el suero como en el citosol. El péptido MDR26-72-0 (SEQ ID NO. 112) mostró buena estabilidad y buena actividad en los ensayos de CFU y MTT, y las pruebas de citoxicidad. MDR26-72-0 contiene una secuencia rica en R como un CPP. Se cree que se obtendrían resultados igualmente buenos con péptidos equivalentes en los cuales el CPP es reemplazado por un CPP derivado o basado en Penetratin o HIV-TAT, en el cual el NLS puede ser derivado de SV40 o UNG2 ) .
Tabla 3 Tabla 4 5 15 Ejemplo 7 Datos de Citotoxicidad Adicionales En este ejemplo se presentan datos más detallados de pruebas de citotoxicidad. El ensayo de citotoxicidad se realizó como se describe en el ejemplo 6 anterior. Los resultados se presentan en las figuras 6A-6H que muestran los resultados del ensayo de citotoxicidad de MTT para péptidos MDR26-0 (SEQ ID NO. 100) , MDR26-3 (SEQ ID NO. 103) , MDR26-4 (SEQ ID NO. 104), MDR26-8 (SEQ ID NO. 106), MDR26-7 (SEQ ID NO ..105) , MDR26-72-0 (SEQ ID NO. 112), MDR26- 72-01 (SEQ ID NO. 115) y MDR34 (SEQ ID NO. 116) .
Se verá que la citotoxicidad de los péptidos se puede observar, en donde un efecto mayor se ve en ausencia de suero. La citotoxicidad se ve con todos los péptidos de variante de MDR26, que tienen un motivo APIM. La citotoxicidad incrementada se ve con variantes de MDR34 que tiene dos motivos APIM. Resultados similares que muestran la citotoxicidad se obtienen con péptidos correspondientes a MDR34 (SEQ ID NO. 116) que no tienen etiqueta (MDR34-0) , o que son los equivalentes inversos (I-MDR-34) o retroinversos (RI-MDR-34) de MDR34. MDR34-2 que no tiene una secuencia de NLS , y que más bien tenía una secuencia de enlazador extendida IILVIII (SEQ ID. NO. 95) como enlazador 2, muestra citotoxicidad reducida.
Ejemplo 8 Se han hecho experimentos adicionales que soportan la interacción entre PCNA y péptidos que contienen APIM. Los experimentos de co- inmunoprecipitación (co-IP) han mostrado que tanto PCNA endógeno como EYFP-PCNA de células que expresan establemente EYFP-PCNA fueron capaces de reducir hABH2. Más interacción vista entre hABH2 y PCNA en fracciones enriquecidas con cromatina indica modificaciones post- traduccionales sobre PCNA o hABH2. En estos experimentos, la co-IP de hABH2 de células que expresan establemente EYFP-PCNA se demostró mediante el uso de esferas magnéticas acopladas con anticuerpos contra OÍ-EYFP. La membrana se sondeó con -hABH2 y se re-sondeó con anticuerpo a-PCNA. También se demostró Co-IP de hABH2 de células que sólo expresan proteínas endógenas con el uso de esferas magnéticas acopladas con anticuerpos contra OÍ-PCNA. La membrana se sondeó con -hABH2 y se re-sondeó con anticuerpo a-PCNA.
Experimentos adicionales que muestran entrelazamiento in vivo soportan la unión directa entre APIM y PCNA. Proteínas de fusión de FLAG entrelazadas y entrelazadas revertidas de células que expresan establemente hABH21 - 7 - EYFP 3 xFLAG y hABH21-7-F4 A-EYFP 3><FLAG fueron inmunoprecipitadas mediante el uso de gel de afinidad de a-FLAG. Las fracciones de elución de IP fueron analizadas por Western Blots mediante el uso de anticuerpos a-PCNA o a-FLAG.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (38)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.
1. Un compuesto oligopept ídico caracterizado porque comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico, para usarse en terapia, en donde el motivo que interactúa con PCNA es X1X2X3X3'Xi< (SEQ ID NO: 1) , en donde Xi y ?, se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y en donde el compuesto oligopeptídico se distingue además por lo menos por uno de los siguientes: (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] -F- [LIV] - [LIV] - [K/R] (SEQ BD NO. 27) .
2. Un compuesto oligopeptídico caracterizado porque comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico, para usarse en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, o en un tratamiento que implica terapia citostática, en donde el motivo que interactúa con PCNA es X1X2X3X3.X1. (SEQ ID NO: 1) , en donde ? y ? . se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y en donde el compuesto oligopeptídico se distingue además por lo menos por uno de los siguientes: (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] -F- [LIV] - [LIV] - [K/R] (SEQ DD NO. 27) .
3. El uso de un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico, en la fabricación de un medicamento para usarse en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, o en un tratamiento que implica terapia citostática, en donde el motivo que interactúa con PCNA es ?1?2?3?3'??' (SEQ ID NO: 1) , en donde ? y ??. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y ?3' se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y en donde el compuesto oligopeptídico se distingue además por lo menos por uno de los siguientes : (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] -F- [LIV] - [LIV] - [K/R] (SEQ ID NO. 27) .
4. Un método de tratamiento de un trastorno o afección caracterizado porque es deseable inhibir el crecimiento de células, o un método de tratamiento que implica terapia citostática, el método comprende administrar un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico, a un sujeto que necesita el mismo, en donde el motivo que interactúa con PCNA es ???2?3?3·?1' (SEQ ID NO: 1) , en donde Xi y Xi< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y en donde el compuesto oligopeptídico se distingue además por lo menos por uno de los siguientes : (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] -F- [LIV] - [LIV] - [K/R] (SEQ ID NO. 27).
5. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico, junto con por lo menos un vehículo o excipiente farmacológicamente aceptable, en donde el motivo de unión a PCNA es ???2 3?3'??' (SEQ ID NO: 1), en donde Xi y X se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y en donde el compuesto oligopeptídico se distingue además por lo menos por uno de los siguientes: (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] -F- [LIV] - [LIV] - [K/R] (SEQ ID NO. 27).
6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la composición farmacéutica se provee en una forma adecuada para administración oral, parenteral , tópica, rectal, genital, subcutánea, transuretral , transdérmica, intranasal, intraperitoneal , intramuscular y/o intravenosa y/o para administración por inhalación.
7. El compuesto oligopeptídico , uso, método, o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque está en forma de un constructo que comprende además una secuencia de señal de localización de núcleo y/o una secuencia de señal penetrante de célula.
8. El compuesto oligopeptídico, uso, método o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el constructo comprende una secuencia de señal de localización de núcleo y una secuencia de señal penetrante de célula.
9. Un método de detección, diagnóstico o monitoreo de un trastorno o afección, en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, caracterizado porque comprende detectar el nivel de expresión y/o localización de una proteína que contiene un motivo que interactúa con PCNA, en donde un nivel aberrante y/o localización de la proteína es indicativa del trastorno o afección, en donde el motivo que interactúa con PCNA es XiX2X3X3'Xi' (SEQ ID NO: 1) , en donde ?? y Xi< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga.
10. Un kit caracterizado porque comprende (i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el motivo que interactúa con PCNA, en donde el motivo que interactúa con PCNA es XiX2X3X3'Xi. (SEQ ID NO: 1) , en donde Xx y X^ se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y (ii) un agente citostático.
11. Un producto caracterizado porque contiene (i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el motivo que interactúa con PCNA, en donde el motivo que interactúa con PCNA es ?? 2?3?3'??' (SEQ ID NO: 1), en donde i y Xi> se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y (ii) un agente citostático como una preparación combinada para uso simultáneo, secuencial o separado en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, o en un tratamiento que implica terapia citostática.
12. Un compuesto oligopeptídico caracterizado porque comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el motivo que interactúa con PCNA, para usarse en combinación con un agente citostático en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, o en un tratamiento que implica terapia citostática, en donde el motivo que interactúa con PCNA es XiX2 3X3'Xi' (SEQ ID NO: 1) , en donde Xi y ??- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga.
13. Un compuesto oligopeptídico caracterizado porque comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el motivo que interactúa con PCNA, para usarse como un sensibilizador para radioterapia, preferiblemente en el tratamiento de un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, o en un tratamiento que implica radioterapia, en donde el motivo que interactúa con PCNA es X1X2X3X3'Xr (SEQ ID NO: 1), en donde Xi y Xi- se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3* se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga.
14. Un método de análisis in vitro, caracterizado porque comprende la administración de compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el motivo que interactúa con PCNA, a una célula o cultivo de células, en donde el motivo que interactúa con PCNA es XiX2X3X3'Xi' (SEQ ID NO: 1), en donde Xi y Xi< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga.
15. Un liposoma caracterizado porque contiene (i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo que interactúa con PCNA; y/o (ii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el motivo que interactúa con PCNA; en donde el motivo que interactúa con PCNA es ?1?2?3?3·??' (SEQ ID NO: 1), en donde Xx y ??. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga.
16. El compuesto oligopeptídico, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico está comprendida dentro de un vector.
17. Un compuesto oligopeptídico capaz de interactuar con PCNA, caracterizado porque comprende el motivo ???2 3?3' ?· (SEQ ID NO: 1), en donde Xi y Xx. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y 3* se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga, en donde el compuesto oligopeptídico se distingue además por lo menos por uno de los siguientes: (i) el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] -F- [LIV] - [LIV] - [K/R] (SEQ ID NO. 27) y el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos 11 aminoácidos o subunidades equivalentes.
18. Una molécula de acido nucleico que codifica un péptido que tiene o que comprende un motivo que interactúa con PCNA caracterizada porque tiene la secuencia ???2?3?3'??' (SEQ ID NO: 1), en donde Xi y Xi< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3< se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga; y en donde el péptido se distingue además por lo menos por uno de los siguientes: (i) el péptido comprende por lo menos una secuencia de señal; (ii) el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] -F- [LIV] - [LIV] - [K/R] (SEQ ID NO. 27).
19. Un vector caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18.
20. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método de tratamiento, composición farmacéutica, método de diagnóstico, kit, producto, método in vitro o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque X2 es un aminoácido aromático y/o X3 y X3- son aminoácidos alifáticos.
21. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método de tratamiento, composición farmacéutica, método de diagnóstico, kit, producto, método in vitro o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque Xi y ??. se seleccionan independientemente de lisina (K) , arginina (R) , histidina (H) , ornitina (Orn) , metilisina (MeK) y acetilisina (AcK) ; y/o X2 se seleccionada de fenilalanina (F) , triptofano (W) , tirosina (Y) , ter-butilglicina, ciclohexilalanina , ter-butilfenilalanina , bifenilalanina y tri ter-butiltriptofano ; y/o X3 y X3. se seleccionan independientemente de leucina (L) , isoleucina (I) , valina (V) , alanina (A) metionina (M) y norleucina ( or) .
22. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método de tratamiento, composición farmacéutica, método de diagnóstico, kit, producto, método in vitro o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque X2 no es F.
23. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método de tratamiento, composición farmacéutica, método de diagnóstico, kit, producto, método in vitro o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque el motivo que interactúa con PCNA es [K/R] - [F/Y/ ] - [L/I/V/A/M] - [L/I/V/A/ ] - [K/R] (SEQ ID NO: 28); [K/R] - [Y/W] - [L/I/V/A/M] - [L/I/V/A/M] - [K/R] (SEQ ID NO : 29) ; [K/R] - [F/Y/W] - [L/I/V/A] - [L/I/V/A] - [K/R] (SEQ ID O: 30); [K/R] - [Y/W] - [L/I/V/A] - [L/I/V/A] - [K/R] (SEQ ID NO: 31); [K/R] - [F/W] - [L/I/V/A/M] - [L/l/V/A/M] - [K/R] (SEQ ID NO : 32) ; [K/R] - [F/W] - [L/I/V/A] - [L/I/V/A] - [K/R] (SEQ ID NO: 33); [K/R] - [F/W] - [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO: 34); [K/R] - [F/Y/W] - [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO: 35); [K/R] - [Y/W] - [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO: 36); o [K/R] -F- [L/I/V] - [L/I/V] - [K/R] (SEQ ID NO: 37).
24. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método de tratamiento o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque el motivo que interactúa con PCNA tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26.
25. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 9 a 24, caracterizado porque el compuesto oligopeptídico comprende una secuencia de señal.
26. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto, o liposoma de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de señal es una señal de localización nuclear y/o una secuencia de señal penetrante de célula .
27. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 ó 26, caracterizado porque la secuencia de señal penetradora de célula es HIV-TAT o Penetratin o un fragmento o derivado del mismo.
28. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque el compuesto oligopeptídico y/o molécula de ácido nucleico es/son usados en conjunto, simultáneamente, separadamente o secuencialmente , con un agente citostático.
29. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado porque el compuesto oligopeptídico es parte de una proteína de fusión o aptámero.
30. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 D- aminoácidos, por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos no codificados, por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 di -aminoácidos y/o por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 ß -aminoácidos .
31. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el compuesto oligopeptídico comprende por lo menos 5 y no más de 200 subunidades .
32. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico comprende por lo menos 15 nucleótidos y no más de 800, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 ó 50 nucleótidos.
33. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit o producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 ó 20 a 32, caracterizado porque el agente citostático se selecciona de actinomicina D, BCNU (carmustina) , carboplatino , CCNU, campotecina (CPT) , cantaridina, cisplatino, ciclofosfamida , citarabina, decarbazina, daunorubicina , docetaxel, doxorubicina , DTIC, epirubicina, Etopósido, gefinitib, gemcitabina, ifosamida irinotecan, ionomicina, Melfalán, Metotrexato, Mitomicina C (MMC) , mitozantronemercaptopurina, Oxaliplatino, Paclitaxel (taxol) , inhibidor de PARP-I, taxotere, temozolomida ( ZM) , tenipósido, topotecano, treosulfano, vinorelbina, vincristina, vinblastina, 5-Azacitidina, 5 , 6 -Dihidro- 5 -Azacitidina y 5 - fluorouracilo .
34. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit o producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 ó 20 a 32, caracterizado porque el agente citostático es un agente alquilante.
35. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque es para usarse en el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo, o en mieloablación .
36. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el trastorno hiperproliferativo se selecciona de un trastorno maligno, pre-maligno o neoplásico no maligno, inflamación, un trastorno autoinmunitario, un trastorno hematológico, un trastorno de la piel, un trastorno hiperproliferativo inducido por virus, un trastorno mielodiplásico o un trastorno mieloproliferativo .
37. El compuesto oligopeptídico, molécula de ácido nucleico, vector, uso, método, composición farmacéutica, kit, producto o liposoma de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el trastorno hiperproliferativo se selecciona de cáncer, tumores benignos, artritis psoriática, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, psoriasis, síndrome de Reiter, pitiriasis rubra pilaris, variantes hiperproliferativas de los trastornos de queratinización, restenosis, nefropatía diabética, hiperplasia de tiroides, enfermedad de Grave, hipertrofia prostática benigna, síndrome de Li -Fraumenti , retinopatía diabética, enfermedad vascular periférica, carcinoma cervical in situ, pólipos intestinales familiares, leucoplasias orales, histiocitosis , queloides, hemangiomas, estenosis arterial hiperproliferativo, artritis inflamatoria, hiperqueratosis , erupciones papuloescamosas que incluyen artritis, verrugas, y enfermedades inducidas por EBV, formación de cicatriz, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (SLE; lupus), miastenia grave, hiperplasia no maligna, agranuloma, MGUS (gamopatía monoclonal de significado desconocido, meningitis neoplásicas, policitemia vera, escleromixedema, mucinosis papular, amiloidosis y granulomatosis de Wegener.
38. Un kit para diagnosticar un trastorno o afección en donde es deseable inhibir el crecimiento de células, caracterizado porque comprende un anticuerpo específico para un motivo que interactúa con PCNA e instrucciones para el uso del mismo para diagnosticar el trastorno o afección y opcionalmente una sustancia detectable , en donde el motivo que interactúa con PCNA es ???2?3?3'??· (SEQ ID NO: 1), en donde Xx y ? > se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos básicos, X2 es un aminoácido lipofílico y X3 y X3. se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos sin carga.
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