SU1326616A1 - Способ получени иммобилизованной рибозофосфатизомеразы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к технологии получени  иммобилизованных ферментных препаратов. Оно может быть использовано в производстве химических реактивов, дл  биотехнологических целей при создании модельных систем, фиксирующих углекислоту. Цель изобретени  - увеличение стабильности и удельной активности иммобилизованной рибозофосфатизомеразы, а также ускорение процесса. Сущность способа заключаетс  в том, что провод т иммобилизацию данного фермента на амино- этил-целлюлозе, которую предварительно активируют глутаровым альдегидом, причем св зывание фермента осуществл ют в 0,008-0,012 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин. Способ позвол ет получить фермент с повьшенной (в 2 раза) удельной активностью и стабильностью. (Л СлЭ to 05 05

Description

Изобретение относитс  к способам получени  иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в производстве химических реактивов и дл  биотехнологических исследований.

Цель изобретени  - увеличение стабильности и удельной активности им- мобилизрванной рибозофосфатизомера- зы, а также ускорение процесса.

Изобретение заключаетс  в том, что при иммобилизации фермента на аминоэтнл-целлюлозе (АЕ-целлюлоза) используют в качестве попёречно-сши вающего реагента глутаровый альдегид, is Эту смесь инкубируют в течение 1 ч

20

5

35

который добавл ют не к ферменту, а к носителю. Подбор условий иммобилизации (глутарового альдегида, натрий- Фосфатного буфера в концентрации 0,008-0,012 М с рН 7,0-7,2, времени инкубации 50-60 мин) позвол ет по сравнению с известным способом в два раза увеличить удельную активность иммобилизованного фермента, в 9 раз повысить стабильность препарата и в 4 раза ускорить процесс иммобилизации .

Способ иллюстрируетс  следующими примерами осуществлени .

Пример I.Kir АЕ-целлюлозы зо приливают 50 мл 0,5 н. NaOH, перемешивают и через 5 мин сливают. Затем АЁ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой 8-10 раз по 50-100 мл до рН 7-8. Далее к АЕ-целлюлозе приливают 50 мл 0,5 н. НС1, перемешивают и через 2 мин сливают. АЕ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой до рН 4-5 (6-8 раз по 50-100 мл). После этого к АЕ-целлюлозе приливают 50 мл 0,5 н. NaOH, перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20t) . Затем отмьшают АЕ-целлюлозу дистиллированной водой до нейтральной рН (10 раз по 100 мл). Далее к АЕ-целлюло зе приливают 50 мл 0,5 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,0. Через 10 мин раствор сливают.

Активирование АЕ-целлюлозы проводит следующим образом.

К АЕ-целлюлозе приливают 10 мл 2,5%-ного раствора глутаральдегида в О,-5 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0 (к 1 мл 25%-ногб водного раствора глутаральдегида добавл ют 9 мл . 0,5 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,0) и вьщерживают в течение 1 ч при комнатной температуре при слабом периодическом встр хивании. После чего

40

45

50

55

при комнатной температуре, периодически слабо перемешива  или встр хи ва . Затем раствор сливают и иммоби лизованную рибозофо.сфатизомеразу от мывают 2-3 раза по 50 мл 0,01 М нат рий-фосфатным буфером с рН 7,0. При этом конечный буфер (которым промыв ют препарат)не содержит белка, что определ ют по поглощению раствора при 280 нм.

Затем иммобилизованную рибозофос фатизомеразу отмывают 2 раза по 50 м 0,5 М раствором NaCI в 0,01 М натри фосфатном буфере с рН 7,0. Така  пр цедура позвол ет определить количес во фермента, ковалентно св занного носителем. Этот способ позвол ет св зывать до 7-8 мг фермента на 1 г ак тивированной АЕ-целлюлозы. При этом удельна  активность иммобилизованно рибозофосфатизомеразы составл ет 50

60% от удельной активности исходног ферментного препарата рибозофосфатизомеразы . Удельна  активность преп рата составл ет 16 ед./1 мг белка.

Пример 2. Способ осуществл ли как описано в примере 1, но рН буфера дл  иммобилизации составл л 6,5; 6,8; 7,2; 7,5. Удельна  активность иммобилизованного фермента пр этих значени х рН была .равна соотве ственно 6, 12, 15 и 8 ед./мг белка. Следовательно, оптимальна  величина рН буфера равна 7,0-7,2.

Пример 3. Способ осуществл ли как описано в примере 1, варьиру концентрацию буфера - 0,015; 0,012; 0,008; 0,005 и 0,001 М. Удельна  ак тивность фермента в этих услови х составл л а соответственно 10, 13, 1 8 и 6 ед./мг белка, оптимальна  кон центраци  буфера 0,08-0,012 М.

При мер 4. Способ осуществл ли как описано в примере 1, варьиру

носитель промывают 10 раз дистиллированной водой (по 100 мл) дл  удалени  избытка глутдральдегида. Отмытую дистиллированной водой АЕ-целлюлозу забуферивают 0,01 М натрий-фосфатным буфером с рН 7,0 добавлением 50 мл буфера. Буфер сливают и АЕ-целлюлозу еще дважды промывают новыми порци ми того же буфера.

К активированной таким образом АЕ-целлюлозе приливают 3-5 мл ферментного препарата рибозофосфатизоме- разы (концентраци  белка 4-10 мг/мл).

0

5

5

о

0

5

0

5

при комнатной температуре, периодически слабо перемешива  или встр хива . Затем раствор сливают и иммобилизованную рибозофо.сфатизомеразу отмывают 2-3 раза по 50 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером с рН 7,0. При этом конечный буфер (которым промывают препарат)не содержит белка, что определ ют по поглощению раствора . при 280 нм.

Затем иммобилизованную рибозофос- фатизомеразу отмывают 2 раза по 50 мл 0,5 М раствором NaCI в 0,01 М натрий- фосфатном буфере с рН 7,0. Така  процедура позвол ет определить количество фермента, ковалентно св занного с носителем. Этот способ позвол ет св зывать до 7-8 мг фермента на 1 г активированной АЕ-целлюлозы. При этом удельна  активность иммобилизованной рибозофосфатизомеразы составл ет 5060% от удельной активности исходного ферментного препарата рибозофосфатизомеразы . Удельна  активность препарата составл ет 16 ед./1 мг белка.

Пример 2. Способ осуществл ли как описано в примере 1, но рН буфера дл  иммобилизации составл л 6,5; 6,8; 7,2; 7,5. Удельна  активность иммобилизованного фермента при этих значени х рН была .равна соответственно 6, 12, 15 и 8 ед./мг белка. Следовательно, оптимальна  величина рН буфера равна 7,0-7,2.

Пример 3. Способ осуществл -- ли как описано в примере 1, варьиру  концентрацию буфера - 0,015; 0,012;, 0,008; 0,005 и 0,001 М. Удельна  активность фермента в этих услови х составл л а соответственно 10, 13, 14, 8 и 6 ед./мг белка, оптимальна  концентраци  буфера 0,08-0,012 М.

При мер 4. Способ осуществл ли как описано в примере 1, варьиру  .

рем  иммобилизации 45-70 мин. При времени инкубации 50 и 55 мин активность фермента составл ет 15 ед/мг белка, а при 45 и 60 и выше - 13 и 16 ед./мг белка. Оптимальное врем  . инкубации 50-60 мин, так как увеличение длительности инкубации нецелесообразно , поскольку оно не приводит к повышению активности фермента.

Стабильность полученного препарата при хранении4 определенна  как врем , в течение которого тер етс  50% активности, составл ет 60 дней (Т 60 дней). Врем , необходимое дл  проведени  иммобилизации 7 ч.

Таким образом, по сравнению с известным способом предлагаемый позвол ет увеличить стабильность и удельную активность иммобилизованного фермента соответственно в 9 и 2 раза, а также в 4 раза ускорить процесс иммобилизаций .

Предлагаемый способ позвол ет получить -иммобилизованный ферментный

препарат рибозофосфатизомеразы, пригодный дл  использовани  его при создании модельных систем фиксации углекислоты, что имеет важное практическое значение.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  иммобилизованной

   рибозофосфатизомеразы, заключающийс  в иммобилизации фермента на амино- этил-целлюлозе с помощью поперечно- сшивающего реагента в буферном растворе и последующем отмывании несв занного белка, отличающий- с   тем, что, с целью увеличени  . стабильности и удельной активности целевого продукта, а также ускорени  процесса, в качестве поперечно-сшивающего реагента используют глутаровый альдегид, который добавл ют к амино- этил-целлюлозе до внесени  фермента , а иммобилизацию провод т в 0,008- 0,012 М натрий-фосфатном буфере при РН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин.