SU1059002A1 - Способ иммобилизации @ -лизиндекарбоксилазы - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ L-ЛИЭИНДЕКАРБОКСНЛАЗЫ путем св зывани  фермента с водонерастворимым носителем/ отличающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса, в качестве носител  используют аминопропилсилохром , модифицированный монобромуксусной кислотой и N,N -дициклогексилкарбодиимидом , вз тыми в зквивалентных количествах. а Jo т90ea-j 70W сл со ю JsP Фиг.1

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к способам иммобилизации фермента L-лизиндекарбок силазы, и предназначено дл  исполь зовани  в микробиологической промышленности и в производстве биохи мических реактивов. Известен способ иммобилизации L-лизиндекарбоксилазы путем нанесени  на поверхиоать СО - селектив ных электродов раствора бычьего сывороточного альбумина, растворени  в нем фермента и обработки смеси глутаральдегидом l . Однако такой.способ иммобилизации пригоден только дл  получени  иммобилизованной Ь-лизиндекарбоксил зы, локализованной на поверхность COj - селективного электрода. Полученна  этаким способом иммобилизованна  L-лизиндекарбоксилаза не может быть использована в установках других типов (кроме тех, где исполь зуетс  СО - селективный электрод) это ограничивает область ее применени . Наиболее близким к предлагаемому . по технической сущности  вл етс  способ иммобилизации L-лизиндекарбо силазы путем св зывани  фермента с водонерастворимым носителем, в качестве которого используют внутреннюю поверхчость стекл нной трубки, силанизированную винилтриэтоксисиланом (используетс  смесь вйнилтризтоксисилана , метанола и воды). Иммобилизацию осуществл ют,нанос  на силанизированную поверхность сте л нной трубки раствор фермента, содержащий бензоинизобутиловый эфир {растворенный в полипропиленгликоле и преполимер эмульсионного типа, состо щий из поливинилацетата, поливинилового спирта и гидроксиметил акриламида. Смесь освещают ультрафи летовым светом в атмосфере азота. Слой иммобилизованного фермента еще дважды покрывают смесью бензоинизоб тилового эфира и преполимера, каждый раз повтор   освешение ультрафиолетовым светом в атмосфере азота 2 . Недостатком известного способа  вл етс  то, что он технологически сложен и трудоемок, требует большог ассортимента реактивов, в том числе такого труднодоступного как бензоинизобутилсвый- эфир. Целью изобретени   вл етс  упрощение способа получени  иммобилизованной L-лизйндекарбоксилазы. Указанна  цель достигаетс  способом иммобилизации L-лизиндекарбок силазы путём св зывани  фермента с водонерастворимым носителем, в каче ве носител  используют аминопропилсилохром , модифицированный монобром уксусной кислотой и N,N-дициклогек силкарбодиимидом, вз тыми в эквивалентных количествах В. качестве водонерастворимого носител  использован модифицированный бромацетаьаддными группами силохром и фермент св зывают с таким силохромом .при помощи реакции алкилировани  нуклёофильных групп фермента. Предлагаемый способ  вл етс  достаточно простым по технологии и, кроме того, позвол ет получить иммобилизованную L-лизиндекарбоксилазу с довольно высокой удельной активностью (3000-3500.мк моль/мин-г). Полученный по предлагаемому способу уровень активности значительно превышает средний уровень активности иммобилизованных ферментов (по известному способу 300-500 мк моль/мин получени  иммобилизованного фермента с максимально высокой активностью (фиг,1 и 2) целесообразно осуществл ть процесс при рН 6,6-7,3 и весовом соотношении белок/носитель 45-55 мг/г. При остальных значени х этих пара1иетров процесс имги{обилизации менее эффективен с точки зрени  достигаемого уровн  активности. На фиг.1 изображена зависимость активности иммобилизованной L-лизиндекарбоксилазы от рН иммобилизации; на фиг.2 - зависимость активности иммобиЛИЗрванной L-лизиндекарбоксилазы от исходного весового соотношени  фермент/носитель при рН иммобилизации 7,2, Пример 1. Способ иммобилиза- ции L-лизиндекарбоксилазы. Получение силохрома, модигЪици-. рованного бромацетамидными группами, 10 г аминопропилсилохрома СХ-2,5 суспендируют в 4-0 мл диоксана, содержащего 1,12 г монобромуксусной кислоты, и прибавл ют раствор эквивалентного количества (1,16. г) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 10 мл диоксана. Смесь перемешивают на качалке при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего носитель прозывают путем декантации водой дл  удалени  побочного продукта реакции - дициклогексилмочевины . . Св зывание L-лизиндекарбоксилазы с носителем, К 10 г модифицированного силохрома прибавл ют 100 мл р.аствора L-лизиндекарбоксилазы Escherichia в 0,05 .М фосфатном буфере рН 7,2 и перемешивают на качалке 10-15 ч. Иммобилизованный фермент фильтруют и промывают на фильтре 0,05 М фосфатным буфаром рН 5,7, содержащим 510 М пиридоксильфосфат , 10- М трилон Б и 0,01% меркаптоэтанол . Полученный препарат хран т в холодильнике (+4-б°С). Активность , иммобилизованного фермента 3400 мк моль/мин-г, выход в процессе иммобилизации 55%.

Использование предлагаемого способа получени  иммобилизованной L-лизиндекарбоксилазы обеспечивает по сравнениюс известным способом следующие преимущества: предлагаемый способ технологически проще, поскольку не требует таких трудномасштабируемых операций как силанизаци /стекл нной поверхности, многократное нанэсение смеси реактивов тонким слоем на стекл нную поверхность , исключает необходимость работать в атмосфере азота. Дл  реализации способа не требуетс  большого ассортимента реактивов, в том числе такого труднодоступного и дорогостощего реактива как бензоиниэобутиловый эфир. Предлагаемый носитель и реактивы дл  его активации дешевы и выпускаютс  отечественной промышленностью . Остальные реактивы, а именно L-лизиндекарбоксилаза, пиридоксальфосфат , трилон Б и меркаптоэтанол , используют при любом спосо- бе иммобилизации, так как они необходимы дл  Про влени  и стабилизации ферментивной активности.

Иммобилизованна  L-лизиндекарбоксилаза используетс  дл  определени  концентрации L-лизина при микробиологическом его производстве, а также дл  анализа L-лизина в пищевом и

0 кормовом сырье и продуктах, в научно-исследовательских работах и других област х. Высока  активность иммобилизованного фермента позвол ет достичь полного декарбоксилировани  субстрата в течение нескольких

5 минут. Это существенно ускор ет и упрощает определение концентрации L-лизина, в частности позвол ет исключить термостатирование, которое необходимо при использовании мало0 активных иммобилизованных препаратов , работающих в кинетическом режиме .. .

Л,%

fOO 80504529Ю 20 30 0 , 50

Ферпент носитель, иг/г Фиг.2

Claims (1)

1. СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ L-ЛИЗИНДЕКАРБОКСЦЛАЗЫ путем связывания фермента с водонерастворимым носителем; отличающий с.я тем,' что, с целью упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопропилсилохром, модифицированный монобромуксусной кислотой и Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимидом, взятыми в эквивалентных количествах.