SU1040794A1 - Штамм @ @ -4994-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы - Google Patents

Abstract

Штамм Bordetella bronchiseptica-4994 (коллекци  Научно-исследовательского ордена Трудового Красного Знамени института им. акад. И.Ф.Гамалеиt регистрационный номер 15) - продуцент сайт-специфической эндонуклеаэы. (Л с ее

Description

Изобретение относитс  к области микробиологии и генной, инженерии J, в частности к получению сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции BbrI, аналога рестриктазы Hind III.

Известны микроорганизмы-продуценты эндонуклеаз типа Hind III из рода Haeraophilus D,2.

Известен также штамм Bordetella pertussis, продуцирующий рестриктаЗУ Bpel, котора  гидролизует ДНК фагов , Л 989, 641, аденовируса , человека типа 2 и плазмиды pJDB219, так же, как и Hind III Сз.

Однако известные штаты патогенны дл  человека, требовательны к обогащенные питательньм средам и продуцируют другие типы эндонуклеаз, что затрудн ет вьщеление и получение чистого фермента.

Цель изoбpefeни  - вы вление штамма-продзгцента , непатогенного дл  человека , нетребовательного к питательным средам и селективно продуцирующего одну сайт-специфическую эндонуклеазу типа Hind III.

Штамм Bordetella bronchiseptica4994 вьщелен от кролика, клонирован по устойчивости к фагам коклюшного И бронхосептикозного микробов и хранитс  в коллекции научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.акад.Н.Ф.Гамалеи под регистрационн| м номером 15.

Морфологические признаки. Мел-. кие подвижные овоидной формы коккобациллы размером 0,3-0,,8-0,2 мкм При электронно-микроскопическом исследовании вы влены латеральные жгутики .

Культуральные признаки. Среда Борде-Жангу (картофельноглицериновый агар). Колонии серого цвета, блест щие, с гладкими кра ми, через 24 ч достигают 1,0 мм в диаметре . Гемолиз не вы влен.

Среда КУА (.казеиново-угольный агар) Колонии серовато-кремового , цвета, в зкой консистенции, с гладкими кра ми, через 24 ч достигают 1,0 мм в диаметре,Пигмент не вы влен

Пептонный агар Difco. Колонии кремового цвета, в зкой консистенции , через 24 ч достигают 1,5-2,0 мм в диаметре.

Жидка  питательна  среда типа Коен-Уилер . Аэробные услови  выращивани . Растет при покачивании. Среда

не окрашиваетс . Микробна  взвесь серовато-белого цвета.

Физиолого-биохимические признаки . Усваивает органические соединени . Оптимальна  температура роста ЗЗ-Зб С. В качестве источников азота, углерода и энергии используют аминокислоты . .Используют цитраты. Восстанавливают нитраты в нитриты. Характерна быстра  положительна  реакци  на уреазу (в течение 30 мин при комнатной температуре) .

Содержит водоспецифический бронхосептикозный агглютиноген 12. Культура хранитс  в лиофильно-высушенном виде.

Штамм Bordetella bronchiseptica4994 содержит эндонуклеазу BbrI, аналог Hind III.

Пример. Лиофилизированный штамм B.bronchiseptica-4994 высевают на среду КУА с 10% крови человека с последующим однократным пересевом в пробирки с той же средой, но без добавлени  крови. После 24 ч инкубировани  при 35С пересевали на матрицы со средой КУА. Микробнме клетки смывали 0,85%-ньм растворе хлорида натри . Микробную суспензию центрифугировали при 7000 g в течение 20 мин при и промывгши фосфоцеллюлозньм (PC) буфером (10 мМ фосфата кали , рН 7,0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ меркаптоэтанола). Затем 10 г биомассы суспендировали в 10 мл PC буфера, содержащего 0,4 М NaCl и 100 мкг/мл лизоцима и разрушали ультразвуком. Обломки бактерий осаждали центрифугированием (100 000 g, 90 мин при 2-4 С) . Надое адочную жидкость разбавл ли PC буфером в 8 раз и наносили на колонку голубой сефа- . розы (Blue Sepharose Pharmacia, Швеци ), размером 1,,6-10 см, уравновешенную PC буфером с 0,2 М NaCl . Колонку промывали таким же раствором до исчезновени  УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюировали 100 мл градиентом 0,2 М NaCl - 2,0 М NaCl с 30% глицерина в PC буфере. Объем каждой фракции составл л 5 мл. Аликвоту из каждой фракции (2 мкл) инкубировали 1 ч при с 1 мкг ДНК фага Л и анализировали электрофорезом в пеле агарозы. Фракции,,расщепл ющие ДНК фага Л на Hind Ill-специфические фрагменты объедин ли, днализова ги

против PC буфера и наносили на колонку фосфоцел юлозы (PII Whatmanj Англи ) , уравновешенную PC буфером с 0,05 М NaCl, и элюировали 100 мл градиентом 0,05-1,0 М NaCl в PC буфере. Объем каждой.фракции 5 мл. Фракции, содержащие BbrI, определ ли так же, как при хроматографии на голубой сефарозе, фермент элюировалс  в интервале 0,2-0,25 М NaCl. Активные фракции объединили и диалиэовали против PC буфера, содержащего 0,2 М NaCl и 50% глицерина. Полученный препарат (3 мл) имел удельную активность 2000 ед/мл. За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое дл  полного расщеплени  1 мкг фага 7 в течение 1ч.

Дл  идентификации последовательности , узнаваемой BbrJ, проводили гидролиз ею.ДНК фагаЛ, плазмид pBR322 и pSGI (несущей полный геном SVAO). Парадлельно проводили гидролиз указанных тесторных ДНК

эндонуклеазой Hind III, Электрофорез продуктов гидролиза в агароэньЬс и полиакриламидных гел х показал, что BbrI гидролизует каждую из тесторных ДНК на фрагменты, полностью -идентич , ные Hind Ill-специфическим фрагментам . Следовательно, последовательность нуклеотидов, узнаваема  BbrI, идентична последовательности нуклеотидов , узнаваемой Hind III.

В результате обработки Bbrl-фрагментов ДНК , Т4 ДНК-дигазой же, как и в сл:учае Hind Ill-фрагментов ДНК Л, приблизительно 90Z материала превращалось в высокомолекул рную форму. Следовательно, так же, как и в случае Hind Ill-фрагментов , Bbrl-фрагменты ДНК имеют рднонитевые липкие концы.

Таким образом, рестриктаза BbrI имеет сайт узнавани  AAG СТТ, идентичный сайту узнавани  прототипа Hind III, и может полностью заменить прототип во всех генно-инженерных экспериментах.