FI81380B - Foerfarande foer framstaellning av amylas-negativ och moejligen sporfri mutant av bacillus subtilis, som aer anvaendbar som vaerd i vaerd-vektorsystem. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av amylas-negativ och moejligen sporfri mutant av bacillus subtilis, som aer anvaendbar som vaerd i vaerd-vektorsystem. Download PDFInfo
- Publication number
- FI81380B FI81380B FI852038A FI852038A FI81380B FI 81380 B FI81380 B FI 81380B FI 852038 A FI852038 A FI 852038A FI 852038 A FI852038 A FI 852038A FI 81380 B FI81380 B FI 81380B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- strain
- cells
- dna
- vaerd
- subtilis strain
- Prior art date
Links
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 40
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 29
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 13
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 abstract description 7
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 abstract description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007478 blood agar base Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 3
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100074846 Caenorhabditis elegans lin-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100497386 Mus musculus Cask gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- RBHJBMIOOPYDBQ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;propan-2-one Chemical compound O=C=O.CC(C)=O RBHJBMIOOPYDBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229950007919 egtazic acid Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000021433 fructose syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 1
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
1 81380
Menetelmä amylaasinegatiivisen ja mahdollisesti itiöttömän Bacillus subtilis-mutantin valmistamiseksi, joka on käyttökelpoinen isäntänä isäntä-vektori systeemissä 5 Tämä keksintö liittyy uuteen amylaasinegatiiviseen
Bacillus subtilisin mutanttiin, joka on käyttökelpoinen isäntänä, johon voidaan tuoda amylaasia koodaavia geenejä sisältäviä vektoreita yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen.
Suurin osa bakteerin geneettisestä materiaalista on 10 jättiläismäisinä DNA-molekyyleinä, jotka esiintyvät solun kromosomina. Tietty määrä geneettistä materiaalia voi esiintyä myös pienempien, rengasmaisten DNA-molekyylien muodossa, jotka tunnetaan plasmideina. Tiettyyn perinnölliseen ominaisuuteen liittyvää DNA-molekyylin osaa kutsu-15 taan geeniksi.
Geneettiseksi käsittelyksi kutsutuilla menetelmillä on mahdollista siirtää tietyn proteiinin tuotantoa koodaa-va geeni yhdestä mikro-organismista toiseen. Uuden geneettisen materiaalin vastaanottavaa mikro-organismia kutsu-20 taan isännäksi. Lukuisat tutkijat ovat käyttäneet näitä menetelmiä mikro-organismien aikaansaamiseen, jotka ovat erinomaisia tiettyjen spesifisten proteiinien, kuten entsyymien, tuottajia.
On havaittu, että plasmidit, jotka sisältävät sar-25 jän geenejä liittyneinä toisiinsa renkaan muotoon, voidaan poistaa mikro-organismin soluista ja sijoittaa toisen mikro-organismin soluihin suhteellisen helposti. Plasmideja voidaan myös käyttää vektoreina uuden geneettisen materiaalin viemiseksi isäntäorganismiin. Tämä tehdään katkai-30 semalla ensin plasmidi entsyymillä, joka tunnetaan restriktioendonukleaasin nimellä ja joka avaa DNA-renkaan. Vieraan DNA:n fragmentti, joka sisältää halutun geenin, sijoitetaan kohtaan, josta DNA-rengas oli katkaistu. Rengas suljetaan takaisin käsittelemällä DNA-ligaasilla. 35 Yhdistelmäplasmidi, uusi rengasmainen DNA-molekyyli, si- 2 81380 sältää alkuperäisen plasmidin geenit ja siihen sijoitetun DNA-palan mukana tulleen uuden geenin. Tämä plasmidi voidaan pakata isäntämikro-organismiin. Uuden geenin sisältävä plasmidi lisääntyy sitten isäntämikro-organismissa ja 5 tulee osaksi sen geneettistä materiaalia.
Jotta isäntämikro-organismi olisi soveltuva yhdis-telmä-DNA-tekniikassa käytettäväksi, sillä tulee olla kyky ottaa vastaan uusi DNA. Lisäksi tulee tuloksena olla elinkykyinen mikro-organismi, joka ilmentää siihen sijoitetun 10 geenin koodaamia ominaisuuksia. Jotta mikro-organismi tuottaisi käyttökelpoisia määriä proteiinia, tulee sen olla myös kasvatettavissa kaupallisessa mittakaavassa.
Uutta yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttävät kokeellisen työn tekijät ovat olleet huolissaan siitä, että uutta 15 geneettistä materiaalia sisältävät mikro-organismit voisivat tuottaa ihmiselle, eläimille tai kasveille haitallisia aineita. Tämän huolen takia the National Institute of Health (NIH) julkaisi vuonna 1978 ohjeet tutkimuksia varten, joissa käytetään yhdistelmä-DNA -molekyylejä ("Guide-20 Iines for Research Involving Recomibinant DNA Molecules" ). Nämä ohjeet edellyttävät erilaisia fysikaalisten varustusten tasoja laboratorioissa, joissa tehdään geenimanipulaa-tiokokeita. Ne vahvistivat myös biologisten varustusten tasot yhdistelmä-DNA:ta sisältäviä mikro-organismeja var-25 ten.
Biologiseen suojaukseen liittyy sellaisten isäntä-solujen ja vektoreiden käyttö, joilla on rajoitettu kyky pysyä hengissä, jos ne karkaavat laboratorioista luontoon. Itiöitä muodostamattomien mikro-organismien soluilla on 30 tällainen rajoitettu kyky säilyä hengissä.
Tässä kuvataan uutta itiötöntä B. subtilis Bl-109 -mutanttia, joka on käyttökelpoinen isäntänä isäntävektori -systeemissä. Tämän isännän lisäetuna on se, että se on amylaasinegatiivinen mutantti. Tämä mutantti on erityisen 35 hyvin soveltuva isännäksi sellaisille yhdistelmäplasmi- 3 81380 deille, jotka sisältävät spesifisten amylaasien, kuten lämpöstabiilien alfa-amylaasien, tuotantoa koodaavia geenejä. Nämä amylaasit ovat kaupallisesti tärkeitä, sillä niitä käytetään tärkkelyshydrolysaattien, glukoosin ja 5 korkean fruktoosipitoisuuden sisältävien siirappien valmistusprosesseissa .
Tässä kuvattu mukainen mutantti ottaa helposti vastaan lämpöstabiilia alfa-amylaasia vastaavan geenin sisältäviä plasmideja. Tuloksena oleva mikro-organismi on pallo jon parempi lämpöstabiilin alfa-amylaasientsyymin tuottaja kuin isäntävektorisysteemit, jotka on valmistettu aiemmin kuvatuista B. subtilisin amylaasinegatiivisista kannoista, kuten ATCC 39 096:sta, jotka kuvataan julkaistussa EP-ha-kemuksessa n:o 092 235, joka on jätetty 26.10.1983.
15 Tässä kuvataan itiöttömän B. subtilis Bl-109:n vil jelmää, joka on soveltuva käytettäväksi isäntäkomponentti-na isäntä-vektorisysteemissä ja jolle on tunnusmerkillistä se, ettei se sisällä amylaasia koodaavaa geeniä ja että sen muuttumistiheys itiöitä muodostaviksi muodoiksi on 20 pienempi kuin noin 10"7 kasvatettuna ilmastetuissa olosuhteissa ja että se sisältää seuraavat geneettiset markke-rit: spoIlA12, amyE ja sacA321. B. subtilis -kanta, jolla on nämä ominaispiirteet, on talletettu the American Type Culture Collectioniin numerolla ATCC 39 701.
25 Lisäksi kuvataan amylaasinegatiivisen B. subtilis
Bl-20:n viljelmää, joka kanta on soveltuva käytettäväksi isäntäkomponenttina isäntä-vektorisysteemissä ja käyttökelpoinen välivaiheena isäntä-vektorisysteemien amylaasi-negatiivisten isäntäkomponenttien valmistukseen ja jolle 30 on tunnusmerkillistä se, että se sisältää seuraavat geneettiset markkerit: metB5, amyE ja sacA321. B. subtilis -kanta, jolla on nämä luonteenpiirteet on talletettu the American Type Culture Collectioniin numerolla ATCC 39 706.
Keksintö koskee menetelmää B. subtilis -kannan 35 Bl-20 (ATTC 39 706), jolla on geneettiset markkerit metB5, 4 81380 amyE ja sacA321, valmistamiseksi, jossa menetelmässä transformoidaan B. subtilis -kannan 1A289 kompetentit solut B. subtilis -kannan 1A221 DNA:11a ja eristetään solut, jotka eivät tuota alfa-amylaasientsyymiä.
5 Keksintö koskee lisäksi menetelmää B. subtilis -kannan Bl-109 (ATCC 39 701) valmistamiseksi, jolla on geneettiset markkerit spoIIA12, amyE ja sacA321, jossa menetelmässä transformoidaan B. subtilis -kannan Bl-20 kompetentit solut B. subtilis -kannan 1S30 DNA:11a ja eriste-10 tään solut, jotka kasvavat ilman lisättyä metioniinia, eivät tuota alfa-amylaasientsyymiä eivätkä muodosta itiöitä lämpöshokin (90°C, 10 min) jälkeen.
Lisäksi kuvataan menetelmää B. subtilis -kantojen Bl-109 ja Bl-20 käyttämiseksi isäntinä isäntä-vektorisys-15 teemeissä, jossa menetelmässä transformoidaan halutun geneettisen materiaalin sisältävällä plasmidilla yhden tai useamman B. subtilis -kannan kompetentit solut ja kasvatetaan näitä soluja olosuhteissa, joissa plasmidi pysyy solujen sisällä.
20 Keksinnön mukaiset B. subtilis -kannat valmistet tiin sisällyttämällä niihin muiden B. subtilis -kantojen geneettistä materiaalia. Amylaasinegatiivinen B. subtilis -kanta 1A289 (ATCC 39711), joka sisälsi markkerit arol906, metB5, sacA321 ja amyE, muutettiin kannaksi, joka ei enää 25 tarvitse aromaattisia aminohappoja, sisällyttämällä siihen osa B. subtilis -kannan 1A221 (ATCC 39086) DNA:sta.
Kantaa 1A289 ovat kuvanneet Steinmetz et ai. [Mol. Gen. Genet. 148 (1976) 281-285]. Se on saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland 30 numerolla ATCC 39711.
Kantaa 1A221 ovat kuvanneet Dubnau ja Smith [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 65 (1970) 96-103]. Se on saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland, numerolla ATCC 39 086.
35 Tuloksena oleva transformantti, josta käytetään merkintää Bl-20, sisältää markkerit metB5, amyE ja 5 81 380 sacA321. Se on saatavissa the American Type Culture Col-lectionista numerolla ATCC 39706. Tämä amylaasinegatiivi-nen kanta on käyttökelpoinen välituote isäntä-vektorisys-teemien amylaasinegatiivisten isäntäkomponenttien valmis-5 tukseen. Se voi myös itse toimia isäntänä olosuhteissa, joissa itiöitä muodostava isäntä on hyväksyttävissä.
Osa itiöttömän B. subtilis -kannan DNArsta siirrettiin kantaan Bl-20, jolloin saatiin uusi kanta Bl-109. DNA:n luovuttajana käytetty itiötön kanta oli 1S30, jonka 10 luovutti the Bacillus Genetic Stock Center, Dept, of Microbiology, Columbus, Ohio. Tätä kantaa, joka sisältää markkerin spoIIA12, ovat kuvanneet Ionesco ja Schaeffer [Ann. Inst. Pasteur, Paris 114 (1968) 114]. Se on saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rocville, 15 Maryland, numerolla ATCC 39 712.
Tässä kuvatun itiöitä muodostamattoman, amylaasine-gatiivisen kannan Bl-109 muuttumistiheys itiöitä muodostavaksi muodoksi on pienempi kuin noin 10'7. Sitä voidaan kasvattaa teollisissa olosuhteissa, eikä se vaadi kalliita 20 kasvua edistäviä lisäaineita. Sillä on alhainen hengissä-säilymiskyky luonnossa tai karanneena ja hyvin pieni taipumus siirtää plasmideja muihin organismeihin luonnollisen geneettisen siirron kautta. Tämä organismi soveltuu hyvin plasmidien vastaanottamiseen käytettäessä klassisia trans-25 formointimenetelmiä. Erinomaisia transformaatiotuloksia saavutettiin käyttämällä kompetenteille soluille tarkoitettuja transformointimenettelyjä. Se toimii hyvin isäntänä erilaisille plasmidivektoreille, mikä tekee siitä käyttökelpoisen isäntäkomponentin B. subtilis -isäntä-vektori-30 systeemiin. Koska se on amylaasinegatiivinen, se on erityisen hyvin soveltuva käytettäväksi isäntänä yhdistelmä-plasmideille, jotka sisältävät amylaasien tuotantoa koo-daavia geenejä.
B. subtilis -kromosomin yksityiskohtaisen geenikar-35 tan ovat julkaisseet Henner ja Hoch [Microbiological
Reviews 44 (1980) 57-82]. Seuraavassa on lyhyt kuvaus ge- 6 81380 neettisistä markkereista, jotka mainitaan tämän keksinnön yhteydessä: (1) spoIIA12: Tämä on deleetiomutaatio, joka salpaa itiöiden muodostuksen varhaisimpia vaiheita. Tämä mutaatio 5 tuhoaa Bacillusten kyvyn muodostaa itiöitä, jossa muodossa se normaalisti säilyy hengissä luonnossa joutuessaan alttiiksi lämmölle, UV-säteilylle, kemikaaleille ja kuivumiselle.
(2) arol906: Tämä on mutaatio, joka saa mutantit 10 tarvitsemaan fenyylialaniinia, tyrosiinia ja tryptofaania.
Näiden aminohappojen puuttuessa mutantin sisältävä kanta lakkaa kasvamasta.
(3) amyE: Tämä markkeri liittyy puutteellisuuteen alfa-amylaasin tuotantoa koodaavassa rakennegeenissä. Sil- 15 le on luonteenomaista hyvin pieni muuttumistiheys.
(4) lin2: Tämän geneettisen markkerin sisältävät kannat kasvavat, kun vähimmäisalustaa sisältävät maljat täydennetään sopivilla aminohapoilla ja ne sisältävät lin-komysiiniä pitoisuutena 100 pg/ml. Markkeria sisältämättö- 20 mät kannat eivät kasva tällaisilla maljoilla.
(5) metB5: Tämä mutaatio saa mutantit tarvitsemaan metioniinia. Tämän aminohapon puutteessa lakkaavat tämän mutantin sisältävät kannat kasvamasta.
(6) sacA321: Tämä on mutaatio, joka estää mikro-or-25 ganismin sakkaroosimetabolialle välttämättömän entsyymin muodostuksen. Tämä estää isäntää kasvamasta alustalla, joka sisältää sakkaroosia hiililähteenä.
Seuraava esimerkki valaisee tämän keksinnön tiettyjä suoritusmuotoja. Ellei toisin mainita, kaikki osuudet 30 ja prosenttiosuudet ovat painon mukaan laskettuja. Kaikki kannat, joille on annettu ATCC-numero, ovat saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland. Nämä kannat on talletettu Budapestin sopimuksen sääntöjen, jotka koskevat mikro-organismien talletusta patenttitar-35 koituksiin, mukaisesti. Kaikki Difco-nimellä merkityt rea- 7 81 380 genssit ovat saatavissa yhtiöstä Difco Laboratories, Detroit, Michigan.
Esimerkki B. subtilis -kannan 1A289 (ATCC 39 711) muuttaminen 5 kannaksi, joka ei enää tarvitse täydentäviä aromaattisia aminohappoja kasvaakseen, tehtiin sisällyttämällä siihen B. subtilis -kannan 1A221 (ATCC 39 086) DNA:ta seuraavasti .
B. subtilis -kannan 1A289 (ATCC 39 711) soluja kas-10 vatettiin yön yli maljoilla, jotka sisälsivät tryptoosi-veriagaralustaa (Tryptose Blood Agar Base, Difco). Näiltä maljoilta eristetyillä soluilla inokuloitiin Penassay Broth -alusta (Difco) ja kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa ravistellen kierrosnopeudella 200 rpm. Solut erotettiin 15 sentrifugoimalla ja suspendoitiin 5-kertaiseen tilavuuteen kasvualustaa, joka sisälsi 0,5 % glukoosia, 0,6 % KH2P04, 1,4 % K2HP04, 0,1 % natriumsitraattia, 0,2 % (NH4)2S04 ja 0,07 % MgS04 täydennettynä leusiinilla, isoleusiinilla ja metioniinilla (50 pg/ml) ja histidiinillä, tryptofaanilla, 20 arginiinilla, valiinilla, lysiinillä, treoniinilla, gly- siinillä ja asparagiinihapolla (25 pg/ml). Viljelmän optisen tiheyden kasvua seurattiin spektrofotometrillä aallonpituudella 620 nm. Kun viljelmät saavuttivat siirtymävaiheen logaritmisen ja stationäärisen kasvun välillä (opti-25 sen tiheyden muutos alle 5 % 15 niinissä), ne käytettiin transformointiin DNA:11a.
Transformoiva DNA saatiin B. subtilis -kannasta 1A221 (ATCC 39 086) seuraavasti.
Kantaa 1A221 kasvatettiin 100 ml:ssa Penassay Broth 30 -alustaa (Difco). Seosta kasvatettiin 37 °C:ssa, kunnes seoksen optinen tiheys aallonpituudella 660 nm mitattuna oli 0,6. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan liuosta, joka sisälsi 0,005 mol/1 ety-leenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) ja 0,05 mol/1 NaCl:a 35 ja 2 mg lysotsyymiä. Kun solut alkoivat hajota, ne pakas- 8 81 380 tettiin upottamalla astia hiilihappojääasetonihauteeseen. Sitten jäätyneisiin soluihin lisättiin 5 ml puskuriliuosta, joka sisälsi 0,03 mol/1 tris(hydroksimetyyli)aminome-taania (pH 8,0) ja 0,005 mol/1 EDTA:a, ja seos jäädytet-5 tiin ja sulatettiin kahdesti. Lisättiin yhtä suuri tilavuus fenolia ja seosta ravisteltiin 70 min 40°C:ssa. Saostunut proteiini poistettiin sentrifugoimalla. DNA seostettiin kirkkaasta supernatantista lisäämällä 0,12 ml 3 M natriumasetaattia (pH 8,0) ja 0,64 ml isopropanolia yhtä 10 millilitraa kohden liuosta. Saostunut DNA kerättiin kietomalla se lasisauvalle ja pestiin isopropanolilla. DNA liuotettiin takaisin liuokseen, joka sisälsi 0,015 mol/1 natriumkloridia ja 0,0015 mol/1 natriumasetaattia (pH 7) ja säilytettiin 4°C:ssa, kunnes ne käytettiin formointiin. 15 Edellä kuvatulla tavalla preparoidut kompetentit B.
subtilis 1A289 -solut (1,0 ml) sekoitettiin DNA:hän, jonka pitoisuus lopullisessa seoksessa oli 10 pg/ml, ja viljelmää ravisteltiin varovasti (100 rpm) 30 min 37°C:ssa. Sitten viljelmä laimennettiin 2 ml:11a Penassay Broth -alus-20 taa (Difco) ja inkuboitiin vielä 90 min 37 °C:ssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kerran tislatulla vedellä, suspendoitiin uudelleen alkuperäiseen tilavuuteen alustaa ja levitettiin maljoille, jotka sisälsivät Spizizenin vähimmäisalusta-agaria täydennettynä metionii-25 nilla (5 pg/ml). Spizizenin vähimmäisalusta on liuos, joka sisältää (a) 0,2 % ammoniumsulfaattia; (b) 1,4 % kaksi-emäksistä kaliumfosfaattia; (c) 0,6 % yksiemäksistä kaliumfosfaattia; (d) 0,1 % natriumsitraattia; ja (e) 0,02 % magnesiumsulfaattia ja jonka pH on säädetty arvoon 30 7,4. Niistä kahdesta pesäkkeestä, jotka kasvoivat, kun lisättiin 0,5 ml solususpensiota, toinen ei tuottanut amy-laasia. Se valittiin sillä perusteella, että sillä oli kyky kasvaa lisättyjen aromaattisten aminohappojen puuttuessa, ja sille annettiin merkintä Bl-20. Se sisälsi 35 markkerit metB5, amyE ja sacA321. Tämän kannan biologises- 9 81380 ti puhdas viljelmä on talletettuna the American Type Culture Collectionissa numerolla ATCC 39 706.
Kanta Bl-20 (metB5, amyE, sacA321) muutettiin itiöitä tuottamattomaksi kannaksi Bl-109 transformoimalla 5 se donorikannan 1S30 (ATCC 39 712) DNArlla. Transformointi tehtiin käyttämällä kompetentteja Bl-20 soluja.
Donori-DNA saatiin B. subtilis -kannasta IS30 (ATCC 39 712) seuraavasti. Soluja kasvatettiin yön yli 37°C:ssa 100 ml:ssa glukoosia sisältävää trypsiinipilkottu soija-10 alustaa (Tryptic Soy with glukose, TSG, Difco). Sitten lisättiin 40 mg lysotsyymiä ja seosta inkuboitiin 30 min 60°C:ssa. Sferoplastit erotettiin sentrifugoimalla 10 min nopeudella 4500 rpm ja suspendoitiin 40 ml:aan liuosta, joka sisälsi 0,15 mol/1 NaClra ja 0,1 mol/1 EDTA:a (pH 15 10,2). Lisättiin 3 ml 25-%:ista natriumdodekyylisulfaat- tiliuosta ja inkuboitiin 70°C:ssa 1 h. Proteiini seostettiin kahdesti lisäämällä liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/1 NaCl:a ja 0,003 mol/1 natriumsitraattia (pH 7) ja oli kylläinen fenolin suhteen. Supernatanttiin lisättiin 5 ml 3 M 20 natriumasetaattiliuosta. Liuoksen päälle lisättiin isopro-panolikerros. Faasien rajalle muodostunut DNA kiedottiin lasisauvalle. Sauvalla oleva DNA pestiin kahdesti kylmällä isopropanolilla ja liuotettiin liuokseen, joka sisälsi 0,03 mol/1 NaCl:a ja 0,003 mol/1 natriumsitraattia (pH 7). 25 Saatua liuosta dialysoitiin suurta tilavuutta vastaan liuosta, joka sisälsi 0,015 mol/1 NaCl:a ja 0,0015 mol/1 natriumsitraattia (pH 7), vaihtaen liuos tuoreeseen kolmesti 24 h:n aikana, minkä jälkeen tuote käytettiin transformoinein.
30 B. subtilis -kannan Bl-20 soluja kasvatettiin 37 °C:ssa yön yli maljoilla, jotka sisälsivät tryptoosi-veri-agaralustaa (Tryptose Blood Agar Base, Difco). Maljoilta eristetyt solut suspendoitiin sitten pieneen määrään kasvualustaa, ja seoksella inokuloitiin 60 ml kasvu-35 alustaan 500 ml:n erlenmeyerpullossa. Seosta kasvatettiin 10 81 380 33-37 °C:ssa ravistellen. Kasvualusta sisälsi seuraavat aineosat: 0,5 % glukoosia, 0,6 % KH2P04, 1,4 % K2HP04, 0,1 % natriumsitraattia, 0,2 % (NH4)2S04, 0,01 % MgS04, 0,02 % kasaminohappoja (Difco), 0,1 % hiivauutetta (Difco) ja 5 0,02 % L-tryptofaania. Kasvua seurattiin mittaamalla op tista tiheyttä aallonpituudella 620 nm. Kun viljelmät saavuttivat siirtymävaiheen logaritmisen ja stationäärikasvun välillä (optisen tiheyden muuttuminen alle 5 % 15 min:ssa), ne käytettiin transformointiin DNA:11a. Solusus-10 pensio laimennettiin kaksinkertaisella tilavuudella trans-formointiväliainetta, jolla oli muuten sama koostumus kuin kasvualustalla, mutta se sisälsi lisäksi 2 % 0,1 M MgCl2 ja 1 % 0,05 M CaCl2. Laimennus tehtiin esilämmitettyyn trans-formointiväliaineeseen lämpötilassa 33-37 °C. Seosta inku-15 boitiin tässä lämpötilassa 90 min ravistellen kierrosno-peudella 300 rpm. 5 min ennen inkubointijakson loppua lisättiin steriiliä 20 mM etyleeniglykoli-bis(beta-amino-etyylieetteri)-N,N,N',N'-tetraetikkahappoa loppupitoisuu-deksi 1 mmol/1.
20 Transformointi tehtiin sekoittamalla 2 μΐ kannasta IS30 edellä kuvatulla tavalla eristettyä DNA:ta 0,5 ml:aan kannan Bl-20 edellä kuvattuja kompetentteja soluja. Seosta inkuboitiin 30-37 °C:ssa 90 min ravistellen nopeudella 250 rpm. Viljelmät siirrostettiin agarmaljoille steriilil-25 lä vedellä laimentamisen jälkeen. Solut, joilla oli metionii-nipositiiviset, amylaasinegatiiviset ominaisuudet, valikoitiin kasvattamalla viljelmiä agarmaljoilla, jotka sisälsivät Spizizenin vähimmäisalustaa täydennettynä trypto-30 fäänillä (5 mg/ml) ja 1 %:lla Lintner-tärkkelystä. 600 pesäkkeestä tutkittiin itiöttömyysominaisuudet shokkikä-sittelemällä ne lämmöllä (10 min, 90 °C). Yksi pesäke, Bl-109, oli itiöitä muodostamaton. Sillä oli geneettiset markkerit spoIIA12, amyE ja sacA321. Tämän kannan biologi-35 sesti puhdas viljelmä on tallennettuna the American Type il 813 80
Kanta Bl-109 vaatii kasvaakseen mineraalisuoloja, jotka sisältävät ammonium-, kalium-, fosfaatti- ja nat-riumioneja. Se käyttää hyväkseen erilaisia hiililähteitä glukoosi mukaan luettuna. Kanta ei muutu takaisin itiöitä 5 muodostaviksi muodoiksi, kuten seuraava testi osoittaa. Soluja kasvatettiin agarmaljoilla, jotka sisälsivät DSM-alustaa (Difco), 37°C:ssa. Solut suspendoitiin 24 h:n kuluttua trypsiinipilkottuun soija-alustaan, joka sisälsi 0,1 % glukoosia, ja pidettiin 90°C:ssa 10 min. Sitten so-10 lut laskettiin maljoilla, jotka sisälsivät tryptoosi-veri-agaralustaa (Tryptose Blood Agar Base, Difco). Elävien solujen kokonaismäärä määritettiin näillä maljoilla olevien pesäkkeitä muodostavien yksiköiden perusteella. Vertailukohtana käytettiin pesäkkeitä muodostavien yksiköiden 15 lukumäärää millilitrassa, kun laskenta tehtiin kuumentamattomille näytteille. Kuumentamattomat näytteet sisälsivät 1,27 x 108 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä millilitrassa, kun taas kuumennetut solut sisälsivät vain 5 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä millilitrassa. Tämä osoittaa, 20 että kannan muuttumistiheys itiöitä muodostaviksi muodoiksi on alle noin 10~7 kasvatettuna ilmastusolosuhteissa.
Sekä kannalla Bl-20 että Bl-109 on hyvä ynteensopi-vuus plasmidien kanssa klassisissa transformaatioreak-tioissa. Plasmidivektorit pysyvät isäntäsoluissaan, vaikka 25 isäntäsoluja vektoreineen kasvatetaan jopa niin korkeassa lämpötilassa kuin 45 °C.
Kaikki tässä kuvatut tutkimukset tehtiin noudattaen NIH:n ohjeissa määriteltyjä fysikaalisia ja biologisia varusteluja koskevia vaatimuksia.
Claims (2)
1. Förfarande för framställning av Bacillus sub-tilis-stammen Bl-20 (ATCC 39 706) med de genetiska markö-5 rerna metB5, amyE och sacA321, kännetecknat därav, att man transformerar kompetenta celler av B. sub-tilis-stammen 1A289 med DNA frän B. subtilis-stammen 1A221 och isolerar celler som inte producerar enzymet alfa-amy-las. 10
2. Förfarande för framställning av Bacillus sub tilis-stammen Bl-109 (ATCC 39 701) med de genetiska markö-rerna spoIIA12, amyE och sacA321, kännetecknat därav, att man transformerar kompetenta celler av den en-ligt patentkravet 1 framställda B. subtilis-stammen Bl-20 15 med DNA frän B. subtilis-stammen 1S30 och isolerar celler som växer utan tillsats av metionin, inte producerar enzymet alfa-amylas och inte bildar sporer efter en värme-chockbehandling vid temperaturen 90 °C i 10 min.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61787484A | 1984-06-06 | 1984-06-06 | |
| US61787484 | 1984-06-06 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI852038A0 FI852038A0 (fi) | 1985-05-22 |
| FI852038L FI852038L (fi) | 1985-12-07 |
| FI81380B true FI81380B (fi) | 1990-06-29 |
| FI81380C FI81380C (fi) | 1990-10-10 |
Family
ID=24475397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI852038A FI81380C (fi) | 1984-06-06 | 1985-05-22 | Foerfarande foer framstaellning av amylas-negativ och moejligen sporfri mutant av bacillus subtilis, som aer anvaendbar som vaerd i vaerd-vektorsystem. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0164117B1 (fi) |
| JP (1) | JPS611381A (fi) |
| AT (1) | ATE64755T1 (fi) |
| AU (1) | AU4308685A (fi) |
| BR (1) | BR8502586A (fi) |
| CA (1) | CA1288710C (fi) |
| DE (1) | DE3583310D1 (fi) |
| DK (1) | DK251385A (fi) |
| ES (1) | ES8606486A1 (fi) |
| FI (1) | FI81380C (fi) |
| GB (1) | GB2182042B (fi) |
| IE (1) | IE58099B1 (fi) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1244477B (it) * | 1990-12-21 | 1994-07-15 | Eniricerche Spa | Ceppo asporigeno di bacillus subtilis e suo impiego come ospite per la preparazione di prodotti eterologhi |
| WO2007043327A1 (ja) | 2005-10-13 | 2007-04-19 | Kao Corporation | 新規枯草菌変異株 |
| JP6019528B2 (ja) * | 2012-06-05 | 2016-11-02 | 池田食研株式会社 | 発酵調味料の製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4465773A (en) * | 1982-04-21 | 1984-08-14 | Cpc International Inc. | Amylase-negative, asporogenous mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
| US4450236A (en) * | 1982-04-21 | 1984-05-22 | Cpc International Inc. | Asporogenic mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
| US4450235A (en) * | 1982-04-21 | 1984-05-22 | Cpc International Inc. | Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
| ES8608579A1 (es) * | 1983-07-06 | 1986-06-16 | Gist Brocades Nv | Procedimiento para introducir dna en un anfitrion de cepa de microorganismo unicelular |
-
1985
- 1985-04-30 IE IE109385A patent/IE58099B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 CA CA000481232A patent/CA1288710C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-22 FI FI852038A patent/FI81380C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-29 AU AU43086/85A patent/AU4308685A/en not_active Abandoned
- 1985-05-30 BR BR8502586A patent/BR8502586A/pt unknown
- 1985-06-04 DK DK251385A patent/DK251385A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-06-05 EP EP85106994A patent/EP0164117B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-05 AT AT85106994T patent/ATE64755T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-05 DE DE8585106994T patent/DE3583310D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-05 ES ES543920A patent/ES8606486A1/es not_active Expired
- 1985-06-06 JP JP60121627A patent/JPS611381A/ja active Granted
- 1985-10-28 GB GB8526549A patent/GB2182042B/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI852038L (fi) | 1985-12-07 |
| EP0164117A2 (en) | 1985-12-11 |
| GB2182042A (en) | 1987-05-07 |
| GB2182042B (en) | 1989-10-18 |
| FI81380C (fi) | 1990-10-10 |
| DK251385A (da) | 1985-12-07 |
| FI852038A0 (fi) | 1985-05-22 |
| EP0164117A3 (en) | 1987-08-19 |
| AU4308685A (en) | 1985-12-12 |
| ES543920A0 (es) | 1986-04-01 |
| GB8526549D0 (en) | 1985-12-04 |
| EP0164117B1 (en) | 1991-06-26 |
| BR8502586A (pt) | 1986-02-04 |
| DK251385D0 (da) | 1985-06-04 |
| IE851093L (en) | 1985-12-06 |
| ES8606486A1 (es) | 1986-04-01 |
| JPS611381A (ja) | 1986-01-07 |
| DE3583310D1 (de) | 1991-08-01 |
| CA1288710C (en) | 1991-09-10 |
| JPH0579308B2 (fi) | 1993-11-02 |
| ATE64755T1 (de) | 1991-07-15 |
| IE58099B1 (en) | 1993-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4450235A (en) | Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
| US4469791A (en) | Genetically engineered microorganisms for massive production of amylolytic enzymes and process for preparing same | |
| US4493893A (en) | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into Escherichia coli and Bacillus subtilis | |
| US4695546A (en) | Transforming Bacillus stearothermophilus with plasmid vector pTB 19 | |
| FI79139C (fi) | Foerfarande foer klonande av en gen, som kodar foer ett vaermebestaendigt -amylas, in i escherichia coli och bacillus subtilis. | |
| Kawamura et al. | Catabolite-resistant sporulation (crsA) mutations in the Bacillus subtilis RNA polymerase sigma 43 gene (rpoD) can suppress and be suppressed by mutations in spo0 genes. | |
| US5061625A (en) | Process for the preparation of a microorganism which forms α-galactosidase but not invertase, a microorganism thus obtained, and its use | |
| Suzuki et al. | In vitro synthesis of phase-specific flagellin of Salmonella | |
| US4681847A (en) | Novel lysozyme-sensitive microorganism | |
| FI81380B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av amylas-negativ och moejligen sporfri mutant av bacillus subtilis, som aer anvaendbar som vaerd i vaerd-vektorsystem. | |
| JPS6246153B2 (fi) | ||
| US4465773A (en) | Amylase-negative, asporogenous mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
| JP3013008B2 (ja) | 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ | |
| US4450236A (en) | Asporogenic mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
| EP0179025B1 (en) | Method for the production of neutral protease | |
| US7550281B2 (en) | Method for production of alpha-amylase in recombinant Bacillus | |
| CN110305824A (zh) | 展示有机磷水解酶的枯草芽胞及其制备方法 | |
| JPS6253150B2 (fi) | ||
| SU1040794A1 (ru) | Штамм @ @ -4994-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: CPC INTERNATIONAL INC. |